TW419522B - Themostabel non-redycing saccharide-forming enzyme, its production and uses - Google Patents

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4 19522 A7 _______B7_ 五、發明説明（1 ) 發明背景 發明範疃 (請先閲讀背面之注土擧項再填寫本頁) 本發明有關一種新穎之熱安定性之形成非還原醣之酵 素’其製法及用途，尤其有關一種新穎之熱安定之形成非 還原醣之酵素，其對葡糖聚合度3或更高之一或多種還原 性部份澱粉水解物作用時，形成具有海藻糖結構終端單元 之非還原醣，及其製法。本發明另外有關一種具有海藻糖 結構終端單元之非還原醣，其可利用熱安定之形成非還原 醣之酵素製得，且有關含有非還原醣之極低還原性之醣， 以及由該醣所製之海藻糖及含有該非還原醣之組成物。 先前枝藝之描沭 已知海藻糖或α，α -海藻糖係由葡糖單元組成之非 還原醣。如 Advance in Carbohydrate Chemis.try，Vol. 18, pp.201-225(1963), published by Academic Press, USA in Applied and Environmental Microbiology, 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Vol. 56，pp. 3,213-3,215 (1990)所述，海藻糖廣泛存 於微生物、葷類、昆蟲等物中，但含量相當低。因爲海藻 糖爲非還原醣，故既不會誘發與含胺基之物質（諸如胺基 酸及蛋白質）之胺基一羰基反應，亦不改變含胺基酸之物 質因此，預期可使用海藻糖，而不畏造成令人不滿意之 棕化及損壞。是故，極需建立海藻糖之工業量化製法。 習用海藻糖製法中’如日本公開專利第 154，48 5/75號所揭示’利用微生物’或如曰本 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4 - A7 B7 419522 五、發明説明（2 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 公開專利第216，695/83號所述，同時使用麥芽 糖一及海藻糖磷酸化酶可將麥芽糖轉化成海藻糖。然而， 前者不適於工業化量產，因爲充作原料之微生物中海藻糖 含量通常低於1 5w/w% ( 於說明書中簡 稱爲"，除非另有陳述），以乾燥固體計（d.s· b)，且萃取及純化步驟複雜。後者則因下列因素而尙未 工業化量產：（i)充作受質之麥芽糖無法於極高濃度下 使用，因爲經由葡糖磷酸酯形成海藻糖；（i i )標的海 藻糖之產率相當低；（i i i )基本上難以同時保持反應 系統穩定並平穩地保持酶催反應。 至於海藻糖之製法，於"食品化學品'中*澱粉應用 發展及相關問題"章節中題爲、寡醣#之欄中，第6 7_ 7 2頁（1 9 9 2年8月）記錄著a儘管海藻糖有廣泛用 途，但其經由直接醣轉移反應或水解反應之酶催性製法於 此範疇內幾乎是科學上不可能的。#因此，使用澱粉充作 材料之海藻糖酶催性製法確實有科學上之困難》 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 已知由諸如液態澱粉、環糊精及麥芽寡醣等材料澱粉 製備之部分澱粉水解物通常具還原終端基以充作終端單元 且具有還原能力。此類部分澱粉水解物於本發明中稱爲” 非還原部分澱粉水解物"。該還原部分澱粉水解物之還原 能力通常稱爲$葡萄糖當量（DE)值〃，以其乾重計。 已知具有相當高D E值之還原部分澱粉水解物通常具有較 小之分子量粘度和較高之適當甜度及反應性，可輕易與諸 如胺基酸及蛋白質等具有胺基之物質反應，產生無法令人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 4 95 2 2 fmT. __年月 '速方y ""X、發明説明U 」 滿意之棕化，氣味及品質受損。 此類還原部分澱粉水解物之不佳性質視其D E值而定 ，而還原部分澱粉水解物及其D E值間之關係極爲重要》 甚至相信無法取消該範疇內之關係》 打破該關係之唯一方式係於相當高壓氫下氫化還原部 分澱粉水解物，將其還原性終端基轉化成糖醇，而形成非 還原醣。然而，此法需要高壓壓熱器且消耗大量氫及能量 ，同時需要相當高度之控制或安全設置，以防止災害。還 原部分澱粉水解物與形成之產物相異，因爲前著由葡糖單 元組成，而後者，即形成之部分澱粉水解物之糖醇由葡萄 糖及山梨糖醇單元所組成。該糖醇給予體內時具有某些造 成短暫症狀之關係，諸如消化障礙及腹瀉。因此，極需建 立一種降低或其至消除還原部分澱粉水解物之還原能力， 而不改變充作結構醣類之葡糖單元之方法。 考慮上述情況下，本發明者積極研究當作用於澱粉水 解物時，可形成具有海藻糖結構之醣之酵素。結果，本發 明者發現根菌瘤屬之微生物，稱爲、根瘤菌屬Μ —11" 經濟部中央標率局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 及微生物，稱爲〜分節芽朐桿茼屬 Q36"，其如日本專利申請案349，216/93所 揭示地個別由土壤單離，可製造新穎之形成非還原醣之酵 素，其對具有3或更高之葡萄糖聚合度之還原部分澱粉水 解物作用時，形成具有海藻糖結構終端單元之非還原醣， 且發現海藻糖可藉使葡糖澱粉酶或α -配醣酶對由該新穎 酵素可得之具有海藻糖結構終端單元之非還原醣作用而輕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2]〇Χ297公釐}

4 195 2 2 五、發明説明U k 3. 03補无 易製得。 然而’由&瘤菌屬或分節芽朐桿茴鼷夕微生物所衍生 之酵素的熱安定性相當低。因此，若採用該酵素製備具有 海藻糖結構終端單元之非還原醣及海藻糖，則需使該酵素 於低於5 5 °C之溫度下作用。針對酶催反應之溫度，如， Kcso-Ougou-no-Chishiki^ (酵素應用之知識）第1版， 第80-1 29頁（1 986)中 '"有關醣類之酵素及其 應用"章節中提爲 ''有關醣類之酵素〃之欄中所述，，醣 化所用之工業化量產酶催性反應之條件中，反應溫度低於 5 5 °C時’有污染且反應中p η降低之危險# ，於使用澱 粉爲材料之長期酶催性反應中，當酵素於低於5 5 °C.之溫 度下作用時，因爲污染及反應混合物之p Η降低，可能使 該酵素之活性滅能，故需添加溶菌酶，以防止污染並控制 反應混合物之ρ Η。此外，當部分澱粉水解物之水解度相 當低時，因澱粉之逆降解而形成不溶物。另一方面，因爲 熱安定性酵素可於相當高溫下作用，酶催性反應中之污染 較無影響，且幾乎不會使部分澱粉水解物逆降解。因此， 極需建立一種新穎之由該非還原醣，利用可於超過5 5 °C 之溫度下作用之熱安定性之形成非還原醣之酵素製備具有 海藻糖終端單元之非還原醣及海藻糖之方法。 發明概沭 本發明提供一種利用熱安定之形成非還原醣之酵素而 由還原部分澱粉水解物製備非還原醣之方法，以及提供該 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 非還原醣及其用途。 爲達成上述目的，本發明者徹底篩選可製造新穎之熱 安定性之形成非還原醣之酵素的微生物，該酵素對還原部 分澱粉水解物作用時形成具有海藻糖結構之非還原醣。結 果，本發明者發現硫化葉菌屬(Sul f 〇1 nhiis 微生物 ，稱爲酸硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarinw') A TCC 3 3 9 0 9 及 ATCC 4942 6,及硫化葉菌(Su i f nl nbns snl f afar icus ) ATCC 3 5 0 9 1及 ATCC 35092,產生新穎之熱安定 之形成非還原醣之酵素，當對還原部分澱粉水解物作用時 ，形成具有海藻糖結構終端單元之非還原醣，其於高達約 8 5 °C之溫度下亦安定，且發現，當該熱安定酵素對還原 部分澱粉水解物作用時，可於超過5 5 °C之溫度下輕易製 得非還原醣。本發明者亦發現先使該熱安定酵素對還原部 分澱粉水解物作用，隨後形成之非還原醣接·受葡糖澱粉酶 或α —配醣酶作用，可輕易製備海藻糖。因此，本發明者 完成了本發明。而且，本發明者提供一種含有本發明非還 原醣之組成物，諸如食品，化粧品及藥品，含彼者之相當 低還原醣及/或海藻糖之製法，而完成了本發明 附圖簡沭 圖1顯示溫度對本發明熱安定之形成非還原醣之酵素 的活性之影響β 圖2顯示ρ Η對本發明熱安定之形成非還原酿之酵素 之活性之影響。 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2!0Χ297公釐） 一 8 - U1I.-----#裝！ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

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修正I 86年3.% 30補充卜7 ---1^I B7 五、發明説明（6 ) 圖3顯示本發明熱安定之形成非還原醣之酵素之熱安 定性。 圖4顯示本發明熱安定之形成非還原醣之酵素之p Η 安定性》 發明詳沭 本發明有關一種新穎之熱安定之形成非還原醣之酵素 ’其製法及用途。本發明另外有關可製造該酵素之微生物 ’由該酵素製備之非還原醣一含有該非還原醣之相當低還 原醣，由該醣所製之海藻糖，及含有該非還原醣及海藻糖 中之一者或二者之組成物。 本發明者徹底篩選可製造新穎熱安定之形成非還原醣 之酵素，而該酵素對還原部分澱粉水解物作用時形成具有 海藻糖結構之非還原醣之微生物，最後發現了標的微生物 〇 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明說明書中.，.除非另有陳述，否則於超過5 5 °C 之溫度下對還原部分澱粉水解物作用時可形成具有海藻糖 結構終端單元之非還原醣之新穎熱安定之形成非還原醣之 酵素稱爲熱安定之形成非還原醣之酵素。 現在，本發明者發現硫化葉茼牖(Sulfolohns)之 微生物，稱爲酸硫化葉菌（Sulfolobus aciriocaldarius )ATCC 33 9 0 9 及 ATCC 49426,及硫化葉菌(vSnl folobus s〇I.f.at9ricus ) ATCC 350 9 1 及 ATCC 35 0 92可製造新穎之 熱安定之形成非還原醣之酵素。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） —9 一

A7 B7 五、發明説明（7 ) 除上述微生物外，硫化葉菌腫（Sulfnlohiis)之其他 菌株及其突變種適用於本發明，先決條件爲其製造本發明 熱安定之形成非還原醣之酵素，而該酵素對還原部分澱粉 水解物作用時形成具有海藻糖結構終端單元之非還原醣。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁〕 任何一種營養培養基皆可用於本發明，先決條件爲該 .微生物可於其中生長且製造本發明之彤成非還原醣之酵素 :例如，合成及天然營養培養基可充作營養培養基。任何 一種含碳物質皆可用於本發明充作碳源，只要微生物可利 用：該碳源實例有醣類，諸如葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖 、甘露糖、山梨糖、糖蜜及還原部分澱粉水解物；及有機 酸，諸如檸檬酸、琥珀酸及其塩。該碳源於營養培養基中 之濃度經適當之選擇。例如，若使用還原部分澱粉水解物 ，則就微生物之生長而言，較佳濃度通常爲2 0%或較低 ，更佳5%或較低，d . s . b .。可用於本發明之氮源 有例如無機氮化合物，諸如銨塩及硝酸塩；及有機含氮物 質，諸如脲、玉米漿、酪蛋白、臃、酵母抽提物及牛肉抽 提物。可用於本發明之無機組份有，例如，鈣塩、鎂塩、 鉀塩、鈉塩、磷酸塩及錳、鋅、鐵、銅、鉬及鈷之其他塩 可用於本發明之微生物係於通常介於4 0 - 9 5 °C間 ，較佳介於5 0 — 9 0 °C間之溫度下；及於介於2 — 7間 ，較佳介於2 - 6間之p Η下，於需氧條件下培養。本發 明所用之培養時間設定於微生物生長開始所需要之時間， 較佳1 0 - 1 0 0小時。營養培養基中溶氧濃度不特別限 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 10 -

4 ^522 A7 ^__B7__ 五、發明説明（8 ) 制，但通常介於0.5-20ppm間。爲保持營養培養 基中之溶氧，可採用控制曝氣、攪拌、曝氧、及增加發酵 器內壓之裝置。分批或連續地進行培養。 完成培養後•由培養物回收現存酵素。發現該酵素之 活性主要於細胞中。較佳以一般方式純化該.細胞，並使用 形成者爲粗酵素製劑。例如，幾乎無污染酵素之部分純化 酵素製劑可藉透析已製得之粗酵素製劑，以硫酸銨塩析粗 酵素製劑，並濃縮形成者而製得；於陰離子交換管柱層析 上使用""DEAE TOYOPEARL® 〃陰離子交換樹脂；使用、 BUTYL TOYOPEARL ® 〃疏水性樹脂之疏水性管柱層析，上 述者皆爲 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan之產物.，連 續純化經透析之溶液。此外，具有電泳單一譜帶之純酵製 劑可藉施加部分純化酵素製劑於使用'"U L TR 0 G E L A c A 4 4 ® "之凝膠過爐層析，一種Sepracor Inc., Marlborough, Massachusetts 0 1 7 5 2, U. S.A.;之 產物，用於凝過濾之樹脂；及使用'ΜΟΝΟ Q® 〃之 陰離子交換管柱層析，一種陰離子交換樹脂，Pharmacis LKB，Uppsala, Sweden之產物，而製備。 所得之熱安之形成非還原醣之酵素具有下列物化性質 (1 )作用 當於一或多種葡糖聚合度爲3或更高之還原部分澱粉 水解物上作用時，形成具有海藻糖結構終端單元之非還原 ---一-________ 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 419522 B7 五、發明説明（9 ) 醣； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2 )分子量 於硫酸十二烷酯鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳（S D S _ PAGE)上約爲69，000至79，000道耳吞； (3 )等電點（P I ) 使用兩性電解質之等電電泳上約5.4至6.4; (4 )最佳溫度 於PH5 . 5培育6 0分鐘時約7 5°C; (5 )最佳P Η 於60°C培育60分鐘時約5 . 0至5 . 5 ; (6 )熱安定性 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 於PH7 . 0培育6 0分鐘時於達約8 5°C之溫度下 仍安定；及 (7 ) p Η安定性 當於25°C培育16小時時，於約4 . 0至9 . 5之 P Η下仍安定。 本發明熱安定之形成非還原醣之酵素的活性如下檢定 :11115酵素溶液添加於4mjZ充作受質之於20mM磷 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4^見格（2!0X297公釐） -12 - 4195 22 at ____B7_ 五、發明説明（10 ) 酸塩緩衝劑（ρΗ5 . 5)中之1 . 2 5w/v%麥芽戊 糖，混合物溶液於6 0°C培育6 0分鐘。反應混合物於 1 0 0°C加熱3 0分鐘以懸浮酶催性反應，反應混合物以 去離子水精確稀釋1 0倍，隨後以Somogyi-Nelson氏法測 定稀溶液之還原能力。對照組，已於1 0 0 °C加熱3 0分 鐘以減活該酵素之酵素溶液如前處理。酵素溶液與酮液混 合以懸浮酶催性反應，隨後以Somogyi-Nelson氏法測定溶 液之還原能力。該測定法中，一單位本發明酵素活性定義 爲每1分鐘消除1微莫耳麥芽戊醣之還原能力的酵素量。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可用爲本發明酵素之受質之還原部分澱粉水解物爲藉 澱粉酶或酸部分水解諸如澱粉、支鏈澱粉及多醣等澱粉性 物質所製者。該還原部分澱粉水解物可使用澱粉酶製備， 包括以澱粉酶、形成麥芽三糖之澱粉酶，形成麥芽四 糖之澱粉酶、形成麥芽五糖之澱粉酶及形成麥芽六糖之澱 粉酶水解澱粉類物質所製備之還原部分澱粉水解物，如日 本東京Pergamon出版社所出版之澱粉酶及相關酵素之手冊 (1 9 8 8 )所揭示者。若製備還原部分澱粉水解物，則 可任意使用脫支酵素，諸如支鏈澱粉酶及異澱粉酶。較佳 使用一或多種麥芽寡醣1諸如麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽 五糖、麥芽六糖及麥芽七糖充作還原部分澱粉水解物。 充作本發明受質之還原部分澱粉水解物之濃度不特別 限制。雖然該酶催性反應可使用0.1%受質溶液進行， 但酶催性反應更佳使用濃度爲2 %或更高之溶液進行，較 佳爲5 — 50%受質濃度，d . s . b .。該濃度下，可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 13 - A7 4 19522 B7 五、發明説明（11 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於令人滿意之高產率下輕易形成具有海藻糖結構之非還原 醣。本發明酶催性反應所用之反應溫度可設定於不使本發 明酵素滅能之溫度，即高達約8 5 °C之溫度，較佳爲介於 5 5 — 7 0 °C間之溫度。本發明酶催性反應中所用之反應 P Η控制在介於3 - 9間，較佳介於約4 — 7間。本發明 酶催性反應中所用之反應時間視酶催性反應之條件適當地 選擇，通常若使用酵素量約0.1—100單/g受質， d . s . b .時，則介於〇 1 — 1 〇 〇小時間。 彤成之含有非還原酿之反應混合物之還原能力大幅低 於以還原部分澱粉水解物充作受質者》例如，若使用麥芽 五糖充作受質，約7 5原始還原能力消失，或該反應混合 物之還原能力相對於原始還原能力降低至約2 5%。 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 形成之反應混合物通常進行過濾並離心以去除不溶物 ，形成之溶液以活性炭脫色，以H -及OH -型形之離子 交換劑脫塩，並離心成糖漿狀產物，可乾燥成粉狀產物》 若需要*該粉狀產物可藉一或多種方法，例如管柱層析分 級’諸如離子交換管柱層析，使用活性炭或矽膠之管柱層 析；使用諸如醇及丙酮等有機酸分離；及使用酵母發酵或 鹼處理分解並去除殘留之還原醣而純化該粉狀產物，輕易 製得具有最高可能純度之非還原醣。 詳言之離子交換管柱層析可用於本發明標的醣之工業 量產中。具改良之純度之標的非還原醣可藉（例如）曰本 公開專利23，799/83及72，598/83所述 之使用強酸性陽離子交換樹脂之管柱層析去除共存之醣類 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14 - A7 B7 4 195 五、發明説明（12 ) 而任意製備。此情況下，可採用固定床、移動床、及擬移 動床中之任一者》 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 若需要，則所得之具有海藻糖結構之非還原醣或含有 該非還原醣之相當低還原醣可藉諸如α-澱粉酶、万一澱 粉酶、葡糖澱粉酶及α _葡糖澱粉酶等澱粉酶水解，以控 制其甜度及還原能力，或降低其粘度；形成之產物可進一 步處理，將殘留之還原糖氫化成糖醇以消除其還原能力。 詳言之，海藻糖可藉使葡糖澱粉酶或α -配醣酶對該 非還原醣或含彼之相當低還原醣作用而輕易製備》使葡糖 澱粉_或^一配醣酶對該醣作用，形成海藻糖及葡萄糖之 混合物，該混合物進行上述純化，諸如離子交換管柱層析 ，以去除葡萄糖，則可得到高海藻糖含量之提份》該高海 藻糖含量之提份可任意純化並濃縮成糖漿狀產物，若需要 ，則將該糖漿狀產物進一步濃縮成過飽和溶液，隨後結晶 成含水一或無水_晶狀海藻糖，並回收形成之結晶。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 製備含水之晶狀海藻糖時，純度約6 0%或較高之約 6 5 — 9 0%海藻糖溶液置入結晶器中，於9 5 °C或較低 溫度下，較佳介於10 — 90 °C溫度下，於0 . 1 — 20 %晶種存在下，於邊攪拌下逐漸冷卻，得到含有含水晶狀 海藻糖之糖膏。而且，於減壓下濃縮海藻糖溶液以連續結 晶製備含水之晶狀海藻糖，有益於本發明。習用方法，諸 如分離、塊狀粉碎、流體化床造粒及噴乾，可用於本發明 中，而由糖膏含水晶狀海藻糖或含彼之晶狀醣製備。 若爲分離，則糖膏通常進行籃式離心，分離含水之晶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15 - 4 195 2 2 A7 _B7__ 五、發明説明（13 ) 狀海藻糖與母液’若需要，則藉少量冷水噴洒洗滌含水之 晶狀海藻糖，以利於製備具有增高之純度之含水晶狀海藻 糖。若爲噴乾，則具有或實質無收濕性之晶狀醣可藉高壓 泵由噴嘴噴洒濃度60 — 8 5%，d . s · b .且結晶百 分比約20 — 60%d s . b .之糖育；以不溶融形成 之粉末之6 0 — 1 0 0 °C熱風乾燥形成之產物；並吹以 3 0 _ 6 0°C熱風約1 一 2 0小時以老化形成之粉末而輕 易製備。若爲塊狀粉碎，則具有或實質無收濕性之晶狀醣 可藉使水含量1 0 — 20%且結晶百分比約1 0 — 60% ，d . s . b .之糖膏放置約數小時至3日以使整體內容 物結晶並固化成塊；並粉碎或裁切形成之塊狀物而輕易製 備。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 雖然無水晶狀海藻糖可藉乾燥含水之晶狀海藻糖使之 轉化成無水者而製備，但通常是提供水含量低於1 0%之 高海藻糖含量之溶液；溶液放置於結晶器中；該溶液保持 於50 — 160 t：間之溫度，較佳80— 140 ΐ溫度， 存有晶種，且於攪拌下得到含有無水晶狀海藻糖之糖膏； 且結晶並藉諸如塊狀粉碎，流體化床造粒及噴乾等習用方 法粉碎無水晶狀海藻糖。 形成之本發明非還原醣及含彼之相當低還原醣與原料 還原部分澱粉水解物比較，具有相當低之還原能力及相當 高之安定性，因爲該種性質，此類醣可與其他物質混合並 加工’尤其是胺酸酸及含胺基酸之物質，諸如寡醣及蛋白 質’而無造成令人不滿意之材料棕化、氣味及損壞之虞。 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ——" ~ — -16 - A7 B7 4 19522 五、發明説明（14 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 與還原部分澱粉水解物不同地，此類醣具有相當低之還原 能力及粘度，而該類醣中，平均葡糖聚合度極低者具有令 人滿意之高品質及較水解物溫和之甜度。 本發明非還原醣藉澱粉酶，諸如由胰臟衍生之α —澱 粉酶，水解成相當低分子量非還原寡醣或麥芽寡醣，而該 寡醣可藉α -配醣酶及腸酵素輕易水解成葡萄糖及海藻糖 分子。形成之海藻糖藉海藻糖酶輕易水解成葡萄糖。因此 ，該非還原醣及含彼之相當低還原醣，及海藻糖苟於經口 給藥時充作人體能源。該醣及海藻糖基本上不被誘發齲齒 之微生物發酵，故可充作防止齲齒之甜味劑。此類醣及海 藻糖具有諸如控制滲透壓之能力、賦予填料之能力、賦予 光澤之能力、保濕性、賦予粘度之能力、防止其他醣結晶 之能力、實質不發酵、及防止膠態澱粉逆降解之能力等性 質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 該海藻糖可就液態哺餵及輸入形式非經腸利用，而無 虞其毒性及副作用，較佳，用爲身體能源。而且，該海藻 糖具有令人滿意之安定性及甜味，而晶狀者可任意與諸如 支鏈澱粉、羥乙基澱粉及聚乙烯基吡咯烷酮等粘合劑組合 充作錠劑之糖塗層材料 無水晶狀海藻糖可任意充作食品、化粧品、藥品及其 原料和中間物之乾燥劑，且可輕易形成具有令人滿意之安 定性及品質之粉狀、顆粒狀及錠狀組成物。 因此’該非還原醣及含彼之相當低還原醣，以及由該 醣所製之海藻糖可任意於各式各樣組成物中充作甜味劑、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ：297公釐） ~ 4 19522 A7 _ _B7_ 五、發明説明（15 ) 風味改善劑、品質改善劑安定劑、輔劑及乾燥劑，諸如 食品、煙草、香煙、飼料、寵物飼料、化粧品及藥品。 本發明非還原醣及含彼之相當低還原醣*及由該醣所 製之海藻糖可原樣充作甜味調味劑。若需要，則可與適量 之一或多種其他甜味劑一起使用，例如粉狀糖漿、葡萄糖 '麥芽糖、蔗糖、異構糖、蜂蜜、槭糖、異麥芽寡醣、半 乳寡醣、果寡醣、乳蔗糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇 、二氫査耳酮、史提維普（stevioside) 、α —葡糖基史 提維登、瑞佰替（rebaudioside)、葛來西嗪（glycyrr-hizin) 、L -天冬胺醯L -苯基丙胺酸甲酯、糖精、甘 胺酸及丙胺酸；及/或填料，諸如糊精、澱粉及乳糖。 該非還原醣及含彼之相當低還原醣，以及由該醣所製 之粉狀或晶狀海藻糖，可原樣使用，或者，若需要，則可 於使用前與輔劑、填料及/或粘合劑摻合而形成顆粒、球 粒、短桿、板、立方塊及錠劑》 經濟部中央標準局負工消费合作杜印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 該非還原醣及含彼之相當低還原醣、及由該醣製備之 海藻糖與具有酸味、酸性、鹼味、澀味、香味及苦味之其 他物質充分相容，且有高度耐酸及耐熱性。因此，通常於 食品中充作甜味劑、風味改善劑及品質改善劑。 該非還原醣，含彼之極低還原醣，及由該醣製備之海 藻糖可用於調味劑中，諸如胺基酸、胜肽、醬油、粉狀豆 醬m i s 〇 〃，^ f η η n a ΐ s u ~ m i s 〇 ” （粉狀 ra i s 〇 )、、 raororai 〃（精煉之 sake) 〃 ，"^hishio 〃（精煉豆醬）、

Murilak;〆（經調味之魚肉）、蛋黃醬、調味醬、醋、 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 19522 五、發明説明（16 ) '"sanbai-zu〃（糖調味料、醬油及醋）、^funmatsu-sushi-su〃 （sushi 所用之粉狀醋）、*<；1ηι1^-ηο-ιπο1；ο〃 (中國菜所用之即混物）' '"tentsuyu 〃（日本油炸食品 所用之調味料）、Mnentsuyu"(日本細麵所用之調味 料）.、調味料、果醬、tyakinikn-no-tare〃（日本烤肉 用之調味醬）、咖哩、即時燉混物、即時湯混物、" dashi-n〇-motoff (即時原汁混合物）、核酸佐料、混合 調味劑、Amirin〃（甜 sake) ' Ashin-mirin 〃（合成 mirin )、桌上糖及咖啡糖。 而且，該非還原釀，含彼之相當低還原醣，及由該醣 製備之海藻糖較佳用於甜化"wagashi〃（日本糕餅）， 諸如’senbei"(米臬）'、Harare"(膠粘米栗）、" okoshi"(粟米餅）、Amochr (米麵團）"manju'( 具有豆醬之麵包）、^iro"(甜米凍）、'an〃 （豆醬 )、^ y 〇 k a 〆（甜豆凍）、^ m i z u - y 〇 k a η 〃（軟 a d z u k i 丑凍）、’kingyoku” （yokarn 之一種）、果凍、 paode Castellan及'^amedama*"(日本太妃糖）；西點’ 諸如麵包、比斯吉、脆餅、餅乾、派、布丁、奶油、牛奶 蛋糊、奶油泡芙、鬆餅、海棉蛋糕、甜甜圈、巧克力'口 香糖、牛奶糖 '及糖果；冷凍點心，諸如冰淇淋及冰凍果 子露；糖發，諸如、kajitsu-n〇-syrup-zuke〃（經保存 之水果）及"korimitsu"(刨冰用之糖漿）；糊漿，諸 如麵糊、花生糊、果糊及塗醬；經加工之水果及蔬菜，諸 如果醬、橘類果醬、^syrup-zuke〃（酶漬水果）及’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公鏠） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-19 - 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 419522 A7 _^___ 五、發明説明（17 ) toka 〃 （蜜餞）；醃漬品，諸如f uku j in-zuke (紅色 醃蘿蔔）、"bettara-zuke"(完整新鮮醃蘿蔔之—種） ' ^senmai-zuke〃（切片新鮮醃蘿蔔之一種）及a rakkyo-zuke"(醃青葱）；醃清物及被醃漬品之預混物 ，諸如^ takuan -zuke-no-moto〃（酶蘿蔔之預混物） 及^hakusai-zuke- n〇-moto〃 （新鮮藤白油菜用之預混 物）：肉品，諸如火腿及香膠；魚肉產品，諸如魚肉火腿 ，魚肉香腸、^ k a m a b 〇 k 〇 〃（蒸魚漿）、’ c h i k u w a "( —種魚漿）及'tenpu ra'(—種日本油炸魚漿食品）" ;Vclrimi 〃（佐料）諸如'"uni_n〇-shiokara〃（海膽 之塩漬腸）、^ika-no- shiokara 〃（烏賊之塩漬腸）、 "^su-konbu 〃 （加工海藻）、''saki-surum〆（乾烏賊 條）及Vfugu-no-rarinbos hi〃 （乾燥之經mirin調味之 河膝）；a tsukudani 〃（於醬油中沸煮之食品），諸如 紫菜、食用野菜、乾烏賊、魚及甲殼類；日常菜，諸如A nimame 〃（煮豆）、馬鈴薯沙拉及^konbu-maki 〃（海藻 捲）；乳製品；罐裝及瓶裝產品，諸如肉、魚肉、水果及 蔬菜者；酒精飮料，諸如合成sake、葡萄酒及利口酒；軟 性飲料，諸如咖啡、茶、可可、果汁、碳酸飲料、酸乳飮 料及含乳酸菌之飲料；即食食品，諸如即食布丁混合物、 即食熱蛋糕混合物、''sokuseki-shiruko" (adzuki -豆汁 與米餅之即食混合物）及即食湯混合物；及飮料，諸如嬰 兒食品，治療食品、補充培養之飲料 '胜肽食品及冷凍食 品；以及改善上述食品之風味及品質者。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -20 - 4 ί 95 2 2 Α7 _ Β7 五、發明説明（18 ) (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 該非還原醣，含彼之相當低還原醣，及由該醣製備之 海藻糖可用於動物飼料及寵物食品中，諸如家畜及家禽、 蜜蜂、蠶及魚，以改善其風味特性。此類醣及海藻糖可任 意於其他產品中以糊狀或液狀充作甜味劑、風味改劑、品 質改善劑及安定劑，諸如煙草、香煙、潔牙劑、唇膏、胭 脂、唇霜、內服藥、錠劑、片劑、鱈肝油滴劑、口香片、 口腔清涼劑、漱口樂、化粧品及藥品。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 該非還原醣、含彼之相當低還原醣及由該醣製備之海 藻糖可於其中有效組份及活性易受損之生物活性物質中及 含有該生物活性物質之鍵康食品及藥物中充作品質改善劑 及安定劑。該生物活性物質實例有淋巴細胞活素，諸如干 擾素—α、干擾素—石、干擾素一厂、腫瘤壞死因子 、腫瘤壞死因子-石、巨噬細胞移動抑制因子、菌落刺激 因子、轉移因子及間白素2;激素，諸如胰島素、生長激 素、催乳激素、促紅血球生成素，及促卵泡激素；生物製 劑，諸如BCG疫苗、日本腦炎疫苗、麻疹疫苗、活脊髓 灰白質炎疫苗、天花疫苗、破傷風毒素疫苗、Trimeresu-r us抗毒素及人類免疫球蛋白；抗生素，諸如青黴素、紅 黴素、氨黴素、四環素、鏈黴素及康黴素硫酸酯；維生素 ，諸如硫胺素、核黃素'L-抗壞血酸、鳕肝油、類胡蘿 蔔素、麥角甾醇及生育酚；酵素，諸如脂肪酶、彈性蛋白 酶、尿激酶、蛋白酶、ys —澱粉酶、異澱粉酶、葡聚糖酶 及乳糖酶；抽提物，諸如人參抽提物、似蘢之烏龜之抽提 物、綠藻抽提物、蘆薈抽提物及pr opol is抽提物：及活微 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X2^7公釐） ~ ~ -21 -

A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 419522 五、發明説明（l9 ) 生物，諸如病毒、乳酸菌及酵母；及其他生物活性物質* 諸如皇家膠凍。使用該非還原醣，含彼之相當低還原醣， 及由該醣所製之海藻糖，上述生物活性物質可任意製成具 有令人滿意之高安定性及品質之健康食品及藥品，而無虞 損失或減活其活性組份及活性。 如前述者，於上述組成物中摻入該非還原醣，含彼之 極低還原醣及/或由該醣所製之海藻糖之方法包括習用方 法，例如，混合、捏和、溶解、熔融 '浸漬、滲入，撒佈 、施加、塗覆、噴洒、注射、結晶及固化》該醣及海藻糖 通常摻入上述組成物之量爲0 · 1%或更高，較佳1%或 更高，d · s , b » 茲以下述實驗更詳細地說明本發明。 實驗 由酸硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius) ATCC 33 9 0 9製傭熱安定之形成非澴原醣之酵素 製備由O.lw/v%臃、O.lw/v%酵母抽提物、 0.2评/乂％硫酸銨、〇.〇55'^/¥%磷酸鉀、〇.〇2%/ v%硫酸鎂、〇 · 〇2w/v%氯化鉀及水所組成之液體 營養培養基。約1 0 Omj營養培養基置入5 0 Om义 Erlenmeyer燒瓶中，於1 2 0°C下加壓加熱20分鐘以進 行滅菌，冷卻並添加硫酸塩調至pH3 . 0，隨後接種酸 硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius) ATCC 33909 之 元株培養物，並於7 0°C下1 3 0 r pm攪拌狀況下培育 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

一 22 - A7 B7 4 J9522 五、發明説明（20 ) 2 4小時。收集形成之培養物並充作第一個種子培養物。

約5升同於第一個種子培養物之營養培養基的新鮮配 方置入1 0升發酵瓶、滅菌、冷卻至75 °C並調至pH 3 . 0，隨後接種1 v/v%之第一個種子培養物，並於 5 0 〇m)2/m i η曝氣條件下，於7 5°C攪拌約4 8小 時，得到第二個種子培養物。 約2 5 0升同於第一個種子培養物所用之營養培養基 之新鮮配方置入3 0 0升發酵器中，滅菌、冷卻至7 5 °C 並調至PH3 . 0，隨後接種1 v/v%第二個種子培養 物，並於75°C下，於100m5/mi η曝氣條件下， 攪拌培育約42小時。以SF膜過濾約170升形成之培 養物，離心回收約2 5 8 g濕細胞。所回收之細胞懸浮於 3 0 0 m 52 10mM磷酸塩緩衝劑（pH7 . 〇)中並 以 ’U.S 3 Ο Ο Λ 處理，其係 Nippon Seiki，Co.，Ltd ,Niigate，Japan所市之超音波細胞分裂裝置，以分裂細 胞。形成之混合物於10，OOOrom離心30分鐘， 得到3 0 OmJ?上清潔。於上清液中添加硫酸銨並溶解產 生0 · 7飽和度，形成之溶液於4 °C放置2 4小時，並離 心得沈澱。形成之沈澱溶於1 OmM Tris-HCi?緩衝劑（ PH8.5)中，對相同塩酸緩衝劑之新鮮配方透新24 小時，離心去不溶物。形成之透新液（約6 0 OmJ?)分 成2份，個別使用填有約35〇111又'0£及瓦一 TOYOPEARL®,5f Tosoh Corporation, Tokyo, Japan所售之離子交換劑，進行管柱層析。吸附於離子交 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -23 - (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 419522 五、發明説明（21 ) 換劑之標的酵素使用補充0 . 3 Μ至0M氯化鈉之直線梯 度緩衝劑由管柱洗提，隨後回收約於0 . 1 Μ氯化鈉下由 管柱提出之具有酵素活性之提份。形成之提份相對於含 1Μ硫酸銨之1 OmM Tr i s-HCj?緩衝劑（pH 8 . 5 )新鮮配方透析。所得之透析溶液離心去除不溶物 ，形成之上清液使用填有3 5 Οιηβ "BUTYL — TOYOPEARL®^ > Tosoh Corporation, Tokyo, Japan所售之疏水性凝膠之管柱進行疏水性管柱層析。吸 附於凝膠之酵素以含1 Μ至〇 Μ硫酸銨之直線梯度緩衝劑 由管柱洗提，隨後回收含於由約補充0 . 8Μ硫酸銨之管 柱提出之提份中之約4 4 0單元酵素活性》所得之部分純 化酵素配方之比活性約2 0單元/mg蛋白質。 該部分純化酵素配方相對於含0.2M氯化鈉之10 m M Tris— HCj?緩衝劑（ρΗ8.5)之新鮮配 方透析，經透析之溶液離心去除不溶物。形成之上清液使 用 'ULTROGEL AcA 44®' —種Sepraco-r Inc., Marlborough, Massachusetts 01752， U.S.A.所 售之凝膠過濾用之樹脂，進行凝膠過濾層析，回收具有酵 素活性之提份，形成之提份相對於lOmM T r i s -HCj?緩衝劑（pH8 . 5)之新鮮配方透析，並離心去 除不溶物。形成之上清液使用填有1 Omj? MONO Q®〃--種 Pharmac i s LKB，Uppsa 1 a,

Sweden所售之離子交換劑-之管柱進行管柱層析B吸附 於離子交換劑上之酵素以由0.2M至0M氯心鈉之直線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） l·::—-l·-----— (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -L)r 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -24 - 419522 A7 B7 五、發明説明（22 ) 梯度緩衝劑由管柱提出，於約0 . 1 Μ氯化鈉下管柱提出 之提份中回收約4 0單元酵素活性。 上述純化法所得之熱安定之形成非還原醣之酵素之純 配方的比活性約81單元/mg蛋白質，使用10% S D S _聚丙烯醯胺凝膠之電泳上測定純度之結果具有單 一蛋白質譜帶，顯示該配方爲具有極高純度之電泳均勻性 酵素。 眚驗2 熱安定之形成非還原醣之酵素之物化性質 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 製備含有1Ow/v%葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、 麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖或麥芽七糖充作受質之水 溶液，摻以2單元/g受質d,s,b.之實驗1方法所 得之純酵素配方，形成之混合物於6 0 °C及pH5 . 5下 進行酶催性反應4 8小時。反應混合物使用填有^ ffAKOBEADS WB-T-330 ® ^ — Wako Pure Chemical Indust-ries Ltd.，Tokyo, Japan之產物—之管柱進行高效液體 層析（HP L C )而脫塩並分析。 HPLC程序於室溫及充作洗提劑之水流速〇.5 mJ2/mi η 下進行。使用 'RI— 801 2®， _Tosho Corporation, Tokyo, Japan所售之差示折射計 -分析反應產物。結果列於表1。 表1之結果顯示，該純酵素對葡糖聚合度爲3或更高 之包含麥芽三糖至麥芽七糖之部澱粉水解物作用時，形成 本紙張尺度適用中國國家楼準（CNS } A4規格（210X297公釐） -25 - 卜 19F ^ ^ 195 22 A7B7 五、發明説明（23 ) 具有海藻糖結構終端單元之非還原醣 海藻糖至α -麥芽五糖基海藻糖。 其包含 葡糖基 受質 反應混合物中之醣 醣組成（％) 葡萄糖 葡萄糖 10 0.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 麥芽糖 麥芽糖 10 0.0 麥芽三糖 葡萄糖 麥芽糖 麥芽三糖 α -葡糖基海藻糖 18 4 2 3 0 -2 .4 .2 .2 訂 Ό 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 麥芽四糖 葡萄糖 6 , ，7 麥芽糖 2 . .7 麥芽三糖 9 - ，0 麥芽四糖 16 .2 α -葡糖基海藻糖 8 . .2 α -麥芽糖基海藻糖 5 7 ‘ .2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -26 ™ 419522 A7 B7 五、發明説明（24 ) (續） 受質 反應混合物中之醣 醣組成（％ ) 麥芽五糖 葡萄糖 麥芽四糖 麥芽五糖 麥芽糖基海藻糖 麥芽三糖基海藻糖 0 · 2 . 2 2 . 0 . 7 3 . 7 0 麥芽六糖 葡萄糖 麥芽五糖 麥芽六糖 α -麥芽三糖基海藻糖 α -麥芽四糖基海藻糖 0 2 2 3 5 6 8 9 2 1 6 2 經濟k^中央標準局員工消費合作社印裝 麥芽七糖 葡萄糖 麥芽六糖 麥芽七糖 α _麥芽四糖基海藻糖 α -麥芽五糖基海藻糖 2 3 4 7 0 .0 .4 .4 .2 .0 而且，亦顯示除了殘留受質及可於不改變葡糖聚合度下再 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2[〇Χ；297公釐） -27 - A7 B7 419522 五、發明説明（25 ) 製之非還原醣外，反應混合物中另有極少量之受質水解物 葡萄糖及低分子量麥芽寡醣，以及由彼製得之非還原醣， 而本發明純酵素之水解活性對形成非還原醣之活性而言微 不足道。本發明純酵素對該受質作用所製之非還原醣及由 水解物製備之還原醣之產率當使用麥芽三糖爲受質時個別 爲30·2%及27.6%，麥芽四糖爲654%及 1 8 . 4%，葡糖聚合度4至5之麥芽五糖及麥芽七糖約 74_7 5%及2-3%，顯示由葡糖聚合度5或更高之 麥芽寡醣形成非還原醣之產率極高，亦形成少量水解物》 而且，顯示未從葡萄糖及麥芽糖所形成醣。 實驗2 - 2 分子量 本發明酵素根據U. K. Laemmli”A自然"，第 227 冊，pp · 680-685 (1970)所記錄之 方法S D S —聚丙烯醯胺凝膠電泳測量分子量時具有對應 於約69，000 — 79，000道耳吞之電泳單一譜帶 。該電泳中，使用肌球蛋白（200，〇〇〇道耳吞）、 泠一半乳糖替酶（116，250道耳吞）、磷酸化酶（ 97，400道耳吞）、血清清蛋白（66，200道耳 吞）及卵清蛋白（45，000道耳吞）充作標記/蛋白 質。 窗驗2 — 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ί請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂' SX. 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 -28 -

A7 B7 Η 如圖 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 五、發明説明（26 等雷點（Ρ ί 本發明酵素於含有2%由pharmacia LKB，Uppsala, Sweden所售之兩性電解質之聚丙烯醯胺凝膠中等電電泳。 而且’形成之凝膠之pH調至，且測定酵素之ρ I ，得到 Ρ I 約 5 . 4 — 6 . 4。 賨驗2 - 4 最佳襯縻 以一般方武於2 〇 mM乙酸塩緩衝劑（ρ — „ 中培育6 0分鐘時，本發明酵素最佳溫度約7 1所示。 實驗2 - 5 最佳ρ Η . 以一般方式於6 〇°C下於具不同ρ η之Mcllvaine 緩衝劑中培育6 Q分鐘時，本發明酵素產生最佳Ρ Η 5.〇~5·5 ，如圖2所示。 實驗2 ~ ft 熱安定性 以一般方式於1 〇mM磷酸塩緩衝劑（PH7 . 〇 中培育6 0分鐘時’本發明酵素於高達約8 5 ΐ之溫度 皆安定*如圖3所示。 本紙張尺度適用中國國格_(21()Χ297^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-29 - 4 195 2 ΓΡ‘.Vi充i $ 五、發明説明（27 ) 實驗2 — 7 D Η安定悴 於2 5 °C下以一般方式於具不同ρ η之Mcllvaine氏 緩衝劑或碳酸鈉_碳酸氫鈉緩衝劑中培育1 6小時，本發 明酵素於約4 · 5 — 9 . 5之pH下保持安定，如圖4所 示。 眚驗2 - 8 含有N終端之胺基酸序列 藉實驗1之方法所得之純熱安定之形成非還原醣之酵 素配方對蒸餾水透析•使用形成之配方之約8 0 # g蛋白 質充作測定含N終端之胺基酸序列之試樣。於Perkin_ Elmer Corp. , Instrument D iv. , Norwalk，U.S.A.所售 之，MODEL 473A"蛋白質定序機上分析胺基酸 序列’顯示由N端開始之1 〇個胺基酸殘基。含n終端之 部分胺酸序列如下： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 訂 -丨線. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Μ A

S

L 1 e

S G T h T y 眚驗3 由硫化葉菌屬（Su 1 f o 1 ohn s )之其他微牛物製備$忠$ + 形成菲還原醣之酵素的方法 製備營養培養基，接種微生物，並於發酵器中藉實_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） -30 - 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 195 2 2 跳充 A7 B7 五、發明説明（28 ) 1之方法培育4 2小時，不同處係使用酸硫化葉菌（ Snlfolnhns acidocaldarius) (ATCC 49426),硫化葉菌（ Snlfnlnhiis solfataricus) ( A TCC 3 5 0 9 1 )及硫化葉菌（ Snlfolohns solfataricus) (ATCC 35092)充作微生物 取代酸硫化葉菌（S11 lfolobus acidocaldarius) (ATCC 33909)。由約1 7 0升個別形成之培養物回收細胞.，以超 音波分裂得到上清液，形成之上清液以硫酸銨塩析、透析 並進行離子交換管柱及疏水性管柱層析，得到部分純化之 酵素配方，隨後研究其性質。結果列於表2。 根據實驗2 - 1之方法，使用該部分純化酵素配方製 備非還原醣，研究其結構後發現，與來自酸硫化葉菌（ S u 1 f ο 1 〇 b u r acidocal darius ) (ATCC 3 3 9 0 9 )之熱安定之 形成非還原醣之酵素相同，每一種酵素配方對葡萄糖聚合 度爲3或更高之還原部分澱粉水解物作用時，皆形成具有 海藻糖結構終端單元及3或更高之葡萄糖聚合度之非還原 醣。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

31 419522 年月曰 H 03 修正補充 A7 B7 五、發明説明（29 ) 表 2 微生物 來 白 離 子 最 佳 最佳 交 換 管 柱 溫 度 pH 提 出 物 之 酵 素 活 性 ( 單 元 ) 熱安定性pH安 (°C ) 定性 酸硫化葉菌 (Sulfolobiis ac i doca1dar i us (ATCC 33909) 440 約75 °C 約5.0-高達約約4.5- 5.5 85 〇C 9.5 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 酸硫化葉菌（ Sulfolobiis 3 7 0 acidocaldariiis) (ATCC 49426 ) 約75 °C 約5.0-高達約約4.5-5.5 8 5 〇C 9.5 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 硫化葉菌 C S u 1 f ο 1 〇 b U s snlfataricns) (ATCC 35091) 210 約75 °C 約5.0-高達約約4.0- 5.5 85〇C 8. 5 線 硫化葉菌（ S u 1 f ο 1 o b u s solfataricns (ATCC 35092) 95 約75 °C約5.0-高達約約4.0- 5. 5 8 5 〇C 8. 5 f紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -32 - 4 2 2

五、發明説明（3〇 ) 茲以下列實例A說明本發明非還原醣I含彼之相當低 還原醣及海藻糖之製法；實例B說明含有一或多種該醣及 海藻糖之組成物。

實施例A 1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 酸硫化葉菌（Sulfolobus anidocaldarius) (ATCC 33909)之種子培養物接種於營養培養基中，根據實驗1之 方法藉發酵器培育約4 2小時。培育完成後，形成之培養 物以S F —膜濃縮並離心回收細胞。所得細胞以超音波分 裂，由該懸浮液製備上清液，以硫酸銨塩析、透析，並進 行離子交換管柱及疏水性管柱層析，得到含1 8 · 0單元 部分純化酵素配方之酵素溶液，比活性約2 0單元 /m g蛋白質。濃度6 w/v%之洋芋粉懸浮液藉加熱膠 化，調至PH4 . 5及50°C，摻以2 · 500單元/ g 澱粉之 Hayash i bara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan所售之異澱粉酶，並進行酶催性反應2 0 小時。形成之混合物調至PH6 . 5，於120°C下加熱 加壓1 0分鐘 > 冷卻至6 0°C，摻以3 0單元/g澱粉之 '"'TERMAMYL 6 0 L ^ — Novo Industri A/S, Copenhagen, Denmark所售之a —澱粉酶—並進行酶催性 反應2 4小時。反應混合物於1 2 0°C下加壓加熱2 0分 鐘，冷卻至65°C，調至pH5 . 5 ，摻以1單元/ g澱 粉之上述熱安定之形成非還原醣之酵素，並進行酶催性反 應9 6小時。形成之混合物保持9 7 °C經3 0分鐘，冷卻 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -33 - 419522 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、 發明説明（31 ) 並 過 濾 0 形 成 之 濾 液 依 -~~- 般 方 式 以 活 性 炭 脫 色 9 並 以 Η — 及 0 Η — 型 離 子 交 換 樹 脂 脫 塢 純 化 〇 形 成 之 溶 液 濃 縮 成 濃 度 約 7 0 W / V % 之 糖 m 產 率 約 9 0 % 產 物 之 D Ε 爲 2 4 • 6 且 含 有 1 2 * 0 % a — 葡 萄 糖 基 海 藻 糖 5 * 5 % a — 麥 芽 糖 基 海 藻 糖 、 2 9 9 9 % a — 麥 芽 三 糖 基 海 藻 糖 s 1 - 5 % a — 麥 芽 四 糖 基 海 藻 糖 及 2 2 % a 一 麥 芽 五 糖 基 海 澡 糖 d " S • b 等 非 還 原 醣 〇 產 物 具 有 溫 和 之 高 品 質 甜 味 * 以 及 適 當 粘 度 及 保 持 性 > 該 性 質 促. 使 其 可 隨 意 應 用 於 食 品 Λ 心 粧 品 及 藥 品 中 充 件 作 甜 味 劑 - 風 味改 善 劑 、 品 質 改 善 劑 安 定 劑 及 填 料 〇 實 施 例 A — 2 實 例 A — 1 方 法 所 得 之 充 作 進 料 溶 液 之 醣 溶 液 於 填 有 X Τ 一 1 0 1 6 ( 聚 合 度 4 % N a +型） -日本東京 有 機 化 學 工 業 股 份有 限 公 司 所 售 之 強 酸 性 陽 離 子 交 換 r-^r 樹 脂 — 之 管 柱 上 分 級 以 增 加 非 還 原 醣 之 含 量 〇 方 法 如 下 樹 脂 填 入 內 徑 5 - 4 C m 之 4 隻 不 銹 /asa 鋼 套 管 中 » 該 管 柱 階 式 串 聯 產 生 2 0 m 之 凝 膠 床 總 深 度 〇 管 柱 加 熱 使 管 柱 內 溫 爲 5 5 °c 保 持 該 溫 度 下 於 樹 脂 中 餵 入 5 V / V % 醣 溶 液 9 醣 溶 液 藉 於 管 柱 中 餵 入 S V 0 • 1 3 之 5 5 °C 熱 水 而 洗 提 富 含 葡 萄 糖 及 麥 芽 糖 之 提 份 > 隨 後 回 收 虽 含 非 還 原 醣 之 提 份 〇 收 集 虽 含 非 還 原 醣 之 提 供 * 純 化 、 濃 縮 於 真 空 中 乾 燥 9 並 粉 碎 得 到 含有 非 還 原 醣 之 粉 狀 產 物 產 率 約 6 4 % 9 d • S • b • 〇 產 物 D E 4 8 含 有 1 8 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐） 經濟部中央揉準局員工消費合作社印製 4 ^522 A7 B7 五、發明説明（32 ) —葡糖基海藻糖、7 9%α —麥芽糖基海藻糖、 46 _ 6%α —麥芽三糖基海藻糖' 2 . 3%α_麥芽四 糖基海藻糖及3 . 4%〇: -麥芽五糖基海藻糖，d . s · b .等非還原醣。與實例A- 1之產物相同地，產物具有 溫和且高品質之甜味’以及適當粘度和保濕性，而該性質 使其可於食品、化粧品及藥品中充作甜味劑、風味改善劑 、品質改善劑、安定劑及填料。 眚施例A _ 3 3 3%玉米粉懸浮液，（1.3.1).，摻和碳酸鈣產 生最終濃度0 · 1%，d · s . b .，形成之混合物調至 DH6 5，摻以每 g 澱粉 〇 . 2%，d . s b .之" TERMAMYL 6 0 ~ Novo Industri A/S, Copenhagen,

Denmark所售之α -澱粉酶-並於9 5 °C下進行酶催性反 應1 5分鐘。形成之混合物於1 2 0°C下加壓加熱1 0分 鐘，冷卻至5 5 °C，摻以5單元/ g澱粉之形成麥芽四糖 之澱粉酶（如日本公開專利240，78 3/6 3所揭示 5 Hayash i bar a Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan所售），進行酶催性反應6小時e形成之 混合物摻以3 0單元/g澱粉之—澱粉酶2 A， _Ueda Chemical Co·, Ltd.，Osaka, Japan所售之 α — 澱粉酶-並於6 5 °C下進行酶催性反應4小時》形成之混 合物於1 20°C下加壓加熱1 0分鐘，冷卻至45°C，調 至PH5 . 5，摻以2單元/g澱粉之由實例A—1方法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -35 - 4 19522__ 五、發明説明（33 )

所得之熱安定之形成非還原醣之酵素，並進行酶催性反應 4 8小時。形成之混合物保持9 7 °C 3 0分鐘，冷卻並過 濾得到濾液，隨後以活性炭依一般方式脫色，藉H-及 Ο Η型離子交換樹脂脫墙純化，之後濃縮形成之溶液，得 到7 0 %糖漿，產率約90%，d.s.b, 。產DE 17 . 1 ，含有8 . 9%α—葡糖基海藻糖、2 9 . 3% α —麥芽糖基海藻糖、0 · 8%α.-麥芽三糖基海藻糖、 0 . 7%麥芽四糖基海藻糖及0 . 7%α_麥芽五糖基海 藻糖，d . s · b .，等非還原醣。產物具有溫和且高品 質之甜味，以及適當粘度及保濕性，而該性質使其可於食 品、化粧品及藥品中充作甜味劑、風味改善劑、品質改善 劑、安定劑及填料。 眚施例A — 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例A - 3方法所得之充作進料溶液之醣溶液根據實 例A - 2之方法進行管柱層析，不同處係使用>5 0W/ X 4 ( M g ++型）’ -D 〇 w Chemical Co·， Midland ， Michigan, USA所售之強酸性陽離子交換樹脂-充作分級 用樹脂，以增加ce -麥芽糖基海藻糖含量，並得到富含α -麥芽糖基海藻糖之提份。該提份經純化、濃縮並噴乾得 到富含非還原醣之粉狀產物，產率約41%，d . s . b .。該產物含有10 · —葡糖基海藻糖、61 . 3

麥芽糖基海藻糖及1.—麥芽三糖基海藻糖 等非還原醣，DE2 . 5且具相當低之還原性。與實例A 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - A7 B7 4 19522 五、發明説明（34 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) - 3中之產物相同地，產物具有溫和且高級之甜度，以及 適當粘度及保濕性，而該保濕性使其可於食品、化粧品及 藥品中充作甜味劑、風味改善劑、品質改善劑、安定劑及 填料。

實施例A — FS 4 0重量份數¾PINE-DEX#4Λ^-Matsuta-ni Chemical Ind·, Tokyo, Japan所售之部分殿粉水解物

-溶於6 0重量份數水中，形成之溶液加熱至6 5 °C，調 至PH5 · 5，摻以1單元/g部分澱粉水解物之實例A - 1方法所製之熱安定之形成非還原醣之酵素，並進行酶 催性反應9 6小時。隨後，反應混合物於9 7 °C加熱3 0 分鐘，以使殘留酵素滅能，稀釋至濃度約20%，d . s 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 .b .，摻以1 0單元/g澱粉水 m i c a 1 s, L t d.，K y o t 〇，J a p a η 所售之葡糖澱粉酶'^ GLUCOZYME"，並進行酶催性反應10小時，隨 後加熱形成之混合物，以使殘留酵素滅能。所得混合物依 一般方式以活性炭脫色，以離子交換樹脂脫塩，並濃縮產 生約60%，d . s . b .之濃度。所得之醣溶液含有 30 . 1%海藻糖，d . s . b · »該醣溶液根據實例 A — 2之方法管柱層析，不同處係使用"CG6000 ( Na+型）"——種日本東日本有機股份有限公司所售之 強酸性陽離子交換樹脂-充作分級用之樹脂，隨後回收富 含海藻糖之提份。該提份含有約9 7%海藻糖，d . s . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -37 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4ί9522 : u日修正i :i33.〇3 補充 A7 ___---B7 五、發明説明（35 ) b .濃縮成約7 5%溶液，隨後置入結晶器中，摻入晶種 ’緩緩冷卻得到糖膏，結晶度約4 5%。該糖膏由裝於噴 塔頂部之噴嘴於1 5 0 k g / c in2壓力下噴洒。噴洒步 驟中’糖膏同時以8 5 °C熱空氣由噴洒塔頂換氣，形成之 結晶粉末收集於位於噴塔基底之金屬線網输送帶上，逐漸 輸送離開該塔’而4 0°C氣向上通經金屬線網。形成之結 晶粉末注入老化塔中，於輸送熱風下老化1 〇小時，而完 成結晶及乾燥，隨後回收粉狀無水晶狀海藻糖。產物實質 無收濕性’且具有令人滿意之操作性，此類性質使其可於 食品、化粧品及藥品中充作甜味劑、風味改善劑、品質改 善劑、安定劑及填料。 實施例A — β 硫化葉菌(Sul folobus S ο 1 f a t a r i cii s ) (ATCC 35091)之種子培養物接種於營養培養基中並根據實驗3 之方法藉發酵韹培育4 2小時。培育完成後，形成之培養 物以S F膜濃縮並離心回收細胞，隨後以超音皮破裂得到 上清液。彤成之上清液以硫酸銨塩析、透析、並離子交換 管柱及疏水性管柱層析，得到含19 . 0單元/ mj?之部 分純化酵素配方的酵素溶液，比活性約1 8單元/mg蛋 白質。根據實例A-3之方法，濃度30%之洋芋粉懸浮液以 'TERMAMYL 6 0 L ^ — Novo Industri A/ S, Copenhagen, Denmark 所售之 α —澱粉酶.’Hayashibara Biochemical Laboratories， Inc., Okayama, Japan 戶斤售 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ —38 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· ，1Τ 卜線. 41952 2 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（36 ) 之形成麥芽四糖之澱粉酶，及澱粉酶2A" — Ueda Chemical Co., Tokyo，Japan所售之激粉酶處理，於 1 20 °C加壓加熱，冷卻至6 5 °C，摻以2單元/ g澱粉 之上述熱安定之形成非還原醣之酵素，並進行酶催性反應 6 4小時。形成之混合物保持9 7 °C 3 0分鐘，使殘留之 酵素滅能。根據實例A - 5之方法，形成之溶液接受" G L U C 0 Z YM E Nagase Biochemicals, Ltd.所 售之葡糖澱粉酶—作用，脫色、脫塩並濃縮成約6 0%溶 液。所得之醣溶液含有約23%海藻糖，d . s . b . « 根據實例A — 5之方法，醣溶液於使用強酸性陽離子交換 樹脂之管柱層析上分級，得到富含海藻糖之提份。收集含 有約9 5%海藻糖，[1.8.13.之提份，置入容器中並 於減壓下沸煮成水含量約4.0%之糖漿。該糖漿置入結 晶器中並與相對於糖漿爲1 %之充作晶種之無水晶狀海藻 糖摻和，d . s . b .，隨後於95°C攪拌下結晶該糖漿 5分鐘。形成物移入鋁容器中並於1 0 0°C老化6小時而 形成塊狀。形成之塊狀物藉切割機粉碎*進行流體化床乾 燥而得水含量約0.3w/w%之粉狀無水晶狀海藻糖。 該產品任意以無水形式於食品、化粧品及藥品，其材料及 中間物中充作乾燥劑，以及具有高品質及溫甜度之白色粉 狀甜味劑》 實施例B — 1 甜味劑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2[0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

• Efl* HJM Λ1 ftwf nn TJH tl n ^ϋ4 ft tn I —39 - 4 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（37 ) 於1重量份數實例A - 4之方法所得之富含非還原醣 之粉狀產物中均均添加〇 _ 〇 1重量份數AaG Sweet ® ’ -Toyo Sugar Refining Lo.，Ltd·，Tokyo，Japan所售 之a _葡糖基史提維苷一及0 _ 0 1重量份數"阿司巴甜 及—Ajinomoto Co.，Ltd.所售之L —天冬胺權—L —苯 基丙胺酸甲酯-混合物送入造粒機中，得得粒狀甜味劑。 該產物具有令人滿意之甜性及蔗糖之2倍高之甜化能力， 而熱量值降低至約蔗糖之1/2。具有令人滿意之安定性 之產物與其他相當高甜性之甜味劑混合時，既不影響亦不 分解彼者，因此適於充作受限降低熱量攝取之肥胖者及糖 尿病者所用之低熱量食品之低熱量甜味劑。該產品受誘發 齲齒之微生物作用時極少形成酸及不可溶之葡聚糖，故可 用於甜化防止齲齒之食品。 眚施例B — 2 硬糖 1 0 0重量份數5 5%蔗糖溶液與3 0重量份數實例 A — 3所得之含有非還原醣之糖漿混合，形成之混合物於 真空中加熱濃縮直至水含量降低於低於2%。該濃縮溶液 與1重量份數檸檬酸及適量檸檬調味料及著色劑摻和*形 成之混合物以一般方式成型得到所需產物。該產物係具有 令人滿意之風味及咀嚼性之高品質硬糖，且無懼於改變其 形式及造成蔗糖結晶。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -40 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 ^ *95 2 2 a? B7 五、發明说明（38 ) 實施例B — 3 口香糖 3重量份數粘膠基質藉加熱至軟化而熔融，形成者與 4重量份數蔗糖及3重量份數實例A - 5所得之含水晶狀 海藻糖粉摻和’再與適量調味料及著色劑摻和。形成之混 合物以一般方式藉滾筒捏和、成型並包裝得到所需產物 該產物爲具有令人滿意之質地及風味之口香糖* 窨施例B — 4 甜化之濃縮牛乳 3重量份數之含有實例A - 1之方法所得之非還原醣 之糖漿及1重量份數蔗糖溶於1 0 0重量份數鮮乳中，形 成之溶液藉加熱板加熱而殺菌，濃縮成7 0 %溶液，隨後 將形成物無菌裝罐成爲所需產物。該具有溫和甜味及令人 滿意之風味之產物可隨意充作嬰兒食品、果汁、咖啡、可 可及茶之調味劑。 寳施例B _ 5 含乳酸茼之飲料 1 7 5重量份數脫脂牛乳、8 0重量份數之實例A — 2方法所製之高非還原醣含量之粉末、及5 0重量份數之 日本公開專利2 8 1 ，79 5 / 9 2所揭示之高乳蔗糖含 量之粉末溶於1，20 0重量份數之水中，形成之溶液藉 於6 5°C下加熱3 0分鐘而滅菌，冷卻至4 0°C，以一般 本紙^尺度適用中國國家標準（<：]^)八4規格<210\297公釐） ~' ' -41 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫4頁)

41952 2 A7 B7 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 五、發明説明（39 ) 方式摻以3 0重量份數之充作起始劑之乳酸菌，並於3 7 °C下培育8小時，得到含有乳酸菌之飮料。該產物爲具有 令人滿意之味道及氣味之含乳酸菌飲料。含有寡醣之產物 穩定地保持乳酸菌並促進歧化菌之生長。. 實施例B - 6 粉狀果升 3 3重量份數藉噴乾製備之粉狀柳橙果汁於攪拌條件 下與5 0重量份數富含實例A - 2方所得之非還原醣之粉 末、10重量份數蔗糖、0 . 65重量份數無水檸檬酸、 0 _ 1重量份數蘋果酸、0 · 1重量份數L 一抗壞血酸' 0 . 1重量份數檸檬酸鈉、0 . 5重量份數支鏈澱粉、及 適量之粉狀調味劑混合均勻。形成之混合物經粉碎•送入 流體化床造粒機中，並於噴洒1 5 0m 3流量之4 0°C空 氣下，噴洒含有實例A — 1方法所得之充作粘合劑之非還 .原醣之糖漿，而造粒3 0分鐘。形成之顆粒稱重並包裝得 到所需產物。該產物含有3 0%柳橙汁，d . s . b .。 該產物於相當長時間下保持安定，而不產生令人不滿之味 道及氣味。 實施例B — 7 軟凍 1 0 0重量份數玉米粉、1 0 0重量份數含實例八_ 3方法所得之非還原醣之糖漿、8 0重量份數麥芽糖、 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-42 - 4 19ζ 2 2 Α7 __Β7_ _ 五、發明説明（40 ) 2 0重量份數蔗槺 '及1重量份數塩混合均勻。形成之混 合物與2 8 0重量份數蛋摻和，並緩緩添加1 ，0 0 〇重 量份數之沸騰牛乳。所得之混合物於加熱下持續攆拌，當 混合物中之玉米粉完全膠凝化時停止加熱，使整體內容物 成爲半透明，隨後冷卻形成物並添加適當之香草調味劑。 形成之混合物經稱重、注射並包裝得到所需產物。該產物 具有平滑表面及光澤，以及溫和之味道及甜味。 實施例B _ 8 A η (豆糊） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 1 0重量份數充作材料之adzuki豆以一般方式添加水 而沸煮，隨後去除豆子之澀味及硬度，以及水溶性雜質， 得到約2 1 k g ^adzuki-tsubu-anA 。形成物中添加 14重量份數蔗糖、5重量份數之含有實例A — 4方法所 得之非還原醣之糖漿、及4重量份數之水，形成之混合物 經沸煮，摻以少量沙拉油，並仔細捏和而不糊化該豆。因 此，得到所需產物，產量約3 5 k g。不因沸煮變色之產 物具有令人滿意之風味，故可充作豆將麵包，具有豆餡之 麵包、麵糰布丁、豆餡鬆餅、冰凍果子露及冰淇淋所用之 材料a η。 實施例Β — 9 麵包 1 0 0重量份數麵粉、2重量份數酵母、5重量份數 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -43 - 4 195 2 2 A7 _______B7___ 五、發明説明（41 ) 糖、1重量份數含有實例A - 2方法所得之非還原醣之粉 末、0 . 1重量份數無機酵母食品以一般方式與水捏和’ 於2 6°C發酵2小時，再老化3 0分鐘，隨後烘烤形成物 。該產物爲具有令人滿意之色澤及膨脹度，以及令人滿意 之彈性及溫和之甜味。 實施例B _ 1 0 火腿 於1 0 0 0重量份數火腿肉切片中添加1 5重量份塩 及3重量份數硝酸鉀並研磨均勻，形成之切片堆疊並於冷 房中放置過夜。隨後，形成之切片先於冷房中浸漬於由 5 0 0重量份數水、1 0 0重量份數塩、3重量份數硝酸 鉀、4 0重量份數富含實例A - 4方法所製之非還原醣之 粉末，及適量胡椒所組成之塩溶液中經7日，根據一般方 式以冷水洗滌、綁紮、煙燻、烹煮、冷卻並包裝得到所需 產物。該產物爲具有令人滿意之色澤、及風味之高品質火 腿。 . _ 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 眚施例B — 1 1 * 粉狀胖肽 1 重量份數 4 0% *Hinu1:e S" -Fuji Oil Co.， Ltd., Tokyo, Japan,所售之可食性大豆之胜肽溶液與2 重量份數含有實例A - 5方法所製之含水之晶狀海藻糖之 粉末，形成之混合物置入塑膠容器中，於5 0°C真空中乾 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Λ4規格（210X297公釐) ~~一 —44 一 4 19522 A7 B7 五、發明説明（42 ) 燥，並粉碎得到粉狀胜肽。具有令人滿意之風味之產物可 任意充作西點用之材料’諸如預混物、冰凍果子露及冰淇 淋，以及嬰兒食品經口及插管哺餵形式之治療營養劑。 實施例B — 1 2 蛋薈粉 由新鮮雞蛋製備之蛋黃於6 0 — 6 4°C下藉板式加熱 器滅菌 > 形成之液體與相對於1重量份數液體有4重量份 數之實例A — 6方法所製之粉狀無水晶狀海藻糖摻和》形 成之混合物移入容器中，放置過夜形成塊狀，而無水晶狀 海藻糖轉化成含水之晶狀海藻糖。所形成之塊狀物藉裁切 機粉碎得到蛋黃粉。該產物可隨意充作西點預混物、冰凍 果子露、冰淇淋及乳化劑之材料，以及嬰兒食品和經口及 插管哺餵形式之治療營養劑之材料。該產物亦可充作皮虜 精質劑及頭髮活化劑。 實施例Β — 1 3 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 化粧乳霜 2重量份數聚氧化乙二醇單硬脂酸酯、5重量份數甘 油單硬脂酸酯、自身乳化、2重量份數富含實例Α - 2方 法所製非還原醣之粉末、1重量份數at -葡糖基芸香素、 1重量份數液體石油、1〇重量份數甘油三_ 2 _乙基己 酸酯、及適量防腐劑以一般方式藉加熱溶解。形成之溶液 與2重量份數L_乳酸、5重量份數1，3_ 丁二醇及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 45 _ A7 B7 幻 952g 五、發明説明（43 ) {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 6 6重量份數精煉水摻和，形成之混合物藉均質器乳化， 於攪拌下摻和適量調味劑，得到化粧乳霜。該產物具有抗 氧化活性且具有相當高之安定性，故可任意充作高品質遮 陽、皮膚精質劑及皮膚白化劑。 眚施例B — 1 4 固體藥物 固定化抗人類干擾素一 α抗體之管柱中以一般方式送 入天然人類干擾素配方一Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc·, Okayama，Japan 所售—以吸附干擾 素- α，並送入含有充作安定劑之牛血清蛋白之緩衝劑， 隨後去除量蛋白。隨後，以含有5%實例Α — 5方法所得 之粉狀含水晶狀海藻糖，d · s _ b _ ，之生理食塩水， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 同時變化生理食塩水之p Η。形成之提出物藉薄膜過濾， 濾液藉約2 0倍體積之I NETOSE®# — Hayashibara Shoji Inc., +0kayama， Japan 所售之無水 晶狀麥 芽糖粉-脫水，隨後粉碎形成之脫水產物，藉造錠機將形 成製成每錠含約1 5 0單元天然人類干擾素- α之錠劑， 2 0 Omg重。該產物可依舌下錠形式經口給予患者，劑 量爲1 — 1 0錠/成人/日，並隨意用於治療病毒疾病、 過敏' 風濕症、糖尿病及惡性腫瘤。詳言之，該產物適於 充作A I D S及肝炎之療劑，而明顯增加患者數目。摻於 產物中之海藻糖及無水晶狀麥芽糖充作安定劑，故天然人 類干擾素一α即使於室溫下仍充分保持相當長時間之活性 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Α4規格（210Χ297公釐） -46 - 419522 A7 B7 五、發明説明（44 ) 〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 窨施例B — 1 5 __ 糖衣綻 1 5 Omg重之充作核心之粗錠塗以由4 0重量份數 實例A - 5方法所得之粉狀含水晶狀海藻糖、2重量份數 平均分子量200 ’ 000之支鏈澱粉、30重量份數水 、2 5重量份數滑石及3重量份數氧化鈦所組成之溶液， 直至總重達約2 3 Omg ’形成者再塗上由6 5重量份數 相同粉狀無水晶狀海藻糖之新鮮配方'1重量份數支鏈澱 粉、及3 4重量份數水所組成之溶液，以液態躐製造光澤 ，得到具有令人滿意之光澤及外觀之糖衣錠。該產物具有 相當髙之耐震性且長期保持高品質。 眚施例B - 1 6 插管餵晡法 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 製備由5 0 0重量份數實例A — 5方法所得之粉狀含 水晶狀海藻糖、2 7 0重量份數乾燥蛋黃、2 0 9重量份 數脫脂牛乳、4 . 4重量份數氯化鈉、1 . 8重量份數氯 化鉀、4重量份數硫酸鎂、0 . 01重量份數硫胺素、 0 . 1重量份數抗壞血酸鈉、0 . 6重量份數維生素E乙 酸酯及0 . 0 4重量份數菸鹼醯胺所組成之組成物，組成 物以小型防濕性層積鋁包成2 5 G小份，隨後加熱密封。 1包產物溶於約1 5 0 - 3 0 Omj?水中，形成之溶液可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -47 - A7 B7 五、發明説明（45 ) 充作非經易地給予鼻腔、胃或腸之液體補充營養。 實施例B — 1 7 外傷軟眘 2 0 0重量份數實例A - 5之方法所得之粉狀含水晶 狀海藻糖及3 0 0重量份數晶狀麥芽糖與2 0 0重量份數 之1 Ow/v%支鏈澱粉混合得到具有適當延伸性及粘著 性之外傷軟膏β該產物縮短治療期間並治療外傷而不留病 痕，因爲摻入產物中之碘具有殺菌效果，而摻入產物中之 海藻糖則補充傷口之營養。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如前述者，本發明新穎之熱安定非還原醣可於超過 5 5 °C之溫度下輕易進行酶催性反應，其中部分澱粉水解 物於令人滿意之高產率下轉化成具有同於該部分澱粉水解 物者之葡糖聚合度之非還原醣，而不懼污染。可輕易分離 並純化之非還原醣，及含彼之相當低還原醣，以及由該醣 製備之海藻糖具有令人滿意之安定性、品質及溫和甜度。 該非還原醣，、含彼之相當低還原醣、及由該醣製備之海 藻糖可任意於諸如食品、化粧品及藥品等組成物中充作甜 味劑、風味改善劑、品質改善劑、安定劑及填料。 因此，本發明提供一種工業量化且相當低成本地製備 具有海藻糖結構終端單元之非還原醣的新穎技術，該醣雖 需求極大，但無法使用由澱粉製備之還原部分澱粉水解物 充作便宜且豐富之來源，且提供製備含有該非還原醣之相 當低還原醣及由該醣製備海藻糖之方法。本發明對諸如食 本紙張尺度適用5Γ國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -48 - 419522 A7 B7 五、發明説明（46 ) 品、化粧品及藥品工業，以及林業、漁業、及農業'畜牧 業和化學工業具有極大之影響。因此，本發明對此類範疇 之影響深不可測β 雖已就本發明較佳實例描述本發明，但已知仍可於其 中作各式各樣之改良，而介於本發明真實精神及範疇內之 改良包含於申請專利範圍中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -49

Claims (1)

1. 4195 2 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 附件（A) 修正 年片曰乂89.10. 0 6¾¾.¾ 公告本 第84105768號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國89年10月呈 經濟部智S財產局員工消費合作社印製 1 . 一種熱安定酶，其係可獲得自硫化葉菌屬（ SlLl—folobus)之微生物且其係作用於還原性部份澱粉水解 物以生成終端單元具海藻糖結構之非還原糖|該酶於p Η 7 · 0下培育達6 0分鐘時，可於溫度達至約8 5 °C下安 定，該非還原糖係由海藻糖及葡萄糖所組成，且該還原性 部份澱粉水解物係爲一種或多種具有葡萄糖聚合度爲3或 3以上之還原性部份澱粉水解物，其中該熱安定酶具有如 下所述之理化性質： (1 )作用 作用於一種或多種具有葡萄糖聚合度爲3或3以上之 還原性部分澱粉水解物以生成具有終端單元爲海藻糖結構 之非還原糖； (2 )分子量 以硫酸十二烷酯鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（S D S — PAGE)分析約爲69 ，000至79，000道耳吞 本纸張尺度適用中國國家標牟（CNS〉Α4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) ._P,J裝· ,:·Γνν^ 訂 2 2 5 9 ABCD 六、申請專利範圍 (3 )等電點（p I ) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用兩性電解質之等電電泳分析約爲5 · 4至6 · 4 (4 )最佳溫度 於pH5 . 5下培育6 0分鐘時，約爲7 5°C; (5 )最佳p Η 於60°C下培育60分鐘時，約爲5 . 0至5 · 5 ; (6 )熱安定性 . 於pH7 . 0下培育6 0分鐘時，可於溫度達約8 5 °C下安定；及 (7 ) P Η安定性 於2 5°C下培育1 6小時時，可於pH約4 · 0至 9 . 5下安定。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 .—種製備申請專利範圍第1項之酶的方法，其係 包含於營養培養基中培養可產製該酶之硫化葉菌靥微生物 .，並自所生成之培養物回收該酶。 3.—種製造具有終端單元爲海藻糖結構且由海藻糖 及葡萄糖所組成之非還原糖的方法，其係包含： (a )令申請專利範圍第1項之酶作用於含有還原性 部分澱粉水解物之溶液以生成該非還原糖，該還原性部份 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 4 ^95 22 cs D8 六、申請專利範圍 澱粉水解物係爲一種或多種具有葡萄糖聚合度爲3或3以 上之還原性部份澱粉水解物；及 (b )回收所生成之含有該非還原糖及未經作用之還 原性部分澱粉水解物之溶液。 4 .如申請專利範圍第3項之方法，其中該還原性部 分澱粉水解物係可藉由澱粉之部分水解而獲得》 5 _如申請專利範圍第3項之方法，其中步驟（b) 中所生成之溶液係進一步利用強酸性陽離子交換樹脂之管 柱層析加以處理，以增加該非還原糖之含量。 6 .—種製備海藻糖之方法，其係包含： (a )令申請專利範圍第1項之酶作用於含有還原性 部分澱粉水解物之溶液，以生成具有終端單元爲海藻糖結 構且由海藻糖及葡萄糖所組成之非還原糖，該還原性部份 澱粉水解物係選自具有葡萄糖聚合度爲3或3以上之還原 性部份澱粉水解物： (b )令葡糖澱粉酶或α -配醣酶作用於所形成之非 還原糖以生成海藻糖；及 經濟部智慧財4局員工消費合作社印¾ (c )回收所生成之含有海藻糖及未經作用之還原性 部分澱粉水解物之溶液。 7 .如申請專利範圍第6項之方法1其中該海藻糖係 爲含水之結晶海藻糖、無水之結晶海藻糖、或其混合物。 8 .如申請專利範圍第6項之方法，其中步驟（c ) 中所生成之溶液係進一步利用強酸性陽離子交換樹脂之管 柱層析加以處理，以增加海藻糖之含量。 夂纸張尺度適用中國國家標搫（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 3 22 5 9 A BCD 六、申請專利範圍9 .如申請專利範圍第6項之方法，其中所獲致之海 藻糖係用於製備食品，化粧品及藥品。 經濟部智.¾时/i局員工消費合作社印製

   本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2丨0X 297公釐} 4