TW384223B - Pharmaceutical composition for the treatment of HIV-seropositive individuals - Google Patents

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Α6 Β6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 本申請是1990年8月3日遞交的美國專利申請563,794 的部分繼續申請和美國專利申請417,246的部分繼續申請 。563,794號申請是1988年12月23日遞交的美國專利申請 289, 971的繼續申請，417 , 246號申請是289 > 971號申請 的部分繼續申請。289,971號申請是1988年4月28日遞交的 美國專利申請188,271的部分繼續申請。188,271號申請現 已放棄。所有這些申請均引作本申請的參考。 在本說明書的最後給出12篇參考文章，其内容都可作 為本文的參考。 我們的硏究表明，餵M20g乳清蛋白濃縮物/ 100g食 物的小鼠的液體免疫應答（對綿羊紅血細胞產生形成噬菌 斑細胞數目）比餵以類似營養效能的含20g/ 100g食物的任 何其它市售半純化食物蛋白（如酪蛋白，大豆，小麥，玉 米，蛋清，魚，牛蛋白，最大螺旋藻（Spirulina maxima) 蛋白，綠 Μ (S c e n e d e s m u s a 1 g a e)蛋白，或 P u r i n a 鼠料等） 的小鼠有明顯提高〔1〕。 我們進一步硏究表明，餵食乳清蛋白的動物在淋巴細 胞的需氧抗原驅動的無性增殖過程中，餵食乳清蛋白濃縮 (樣（ίΓρΐ)的免疫增強括性與脾的谷胱甘肽的較高產生有關 〔2〕。這可能反映出食用乳清蛋白食物的小鼠的淋巴細 胞有補償潛在的氧化損傷的能力，因此，有更強的抗原抵 抗能力〔3，4〕事實上，細胞恢復氧化損傷的能力可Μ 由它再生細胞内存谷胱甘呔的能力來’表示〔5〕。 '我們的硏究還表明，给餵食乳清蛋白的小鼠服用S- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨装， 訂· • 1----Ί . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 3 8|5沪〇曰修耳 五、發明説明（） (正丁基）高半胱氨酸磺酰亞胺（該化合物可以將脾的谷胱 甘呔降低一半）將明頴降低它的體液免疫應答。這進一步 證實了谷胱甘肽在食用乳清蛋白的免疫增強括性中的重要 作用〔2〕〇 服用7-谷氨酰基-半胱氨酸可K增加組織谷胱甘肽的 濃度。給小鼠皮下（S.C)注射40〜60分鐘後，其腎臟的谷 胱甘呔的濃度增加约50%，並且在2小時後又回到對照組 的值〔6〕。服用的7-谷氨酰基半胱氨酸Μ完整的分子 在體內輸送，並用作谷胱甘肽合成酶的底物〔7〕。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) *裝’· 0 食物蛋白'質的氨基酸序列的進展使我們可Μ硏究在乳 清蛋白中有谷氨酰基半胱氨酸基圍的存在，並能硏究它與 谷胱甘肽促進作用的關係。事實上，從牛奶中得到的乳清 蛋白濃縮物中含有大量的谷氨酰基半胱氨酸基團，與酪蛋 白不同，當餵Μ小鼠酪蛋白並不能增加組織谷胱甘肽的量 〔1]。谷氨酰基半胱氨酸基画主要位於血清白蛋白部分 中（每分子六傾基画）。谷氨酰基半胱氨酸基圍在動物和植 物的可食用蛋白中含量極少。對可食甩蛋白的氨基酸序列 的有關資料進行廣泛的硏究表明，由二硫鍵連接的穀屌酸 -半胱氨酸基圃只局限於某些乳清蛋白，而蛋清的卵類黏 蛋白部分中，每一個30 , 000分子量大小的分子中含有2 傾這樣的基圍〔8〕。 我們最近的實驗數據還表明〔8〕，小鼠在餵食高溶 解度（非變性型）的食用乳清蛋白濃縮物時有最高的體液免 疫應答，特別是含有較高相對濃度的不耐熱的牛血清白蛋 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 4

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 白（210%)和免疫球蛋白的情況下。另外’食用這種類型 的乳清蛋白濃縮物的小鼠具有較高水平的組織谷胱甘肽。 在血清白蛋白部分中存在的谷氨酰基半胱氨酸基團（在食 物蛋白中的量很少），以及非變性分子構象中的特定分子 内鍵是蛋白質混合物的谷胱甘肽促進活性的關鍵因素。 日本的最近實驗表明〔9〕，BALB/C雄鼠餵食我 們的非變性乳清蛋白濃縮物（WPC，我們稱為免疫卡爾 “Immunocal”），每100 / g 該食物中含 25gWPC’ 共餓 4 星期，其脾細胞在體外對SRBC的免疫應答比對照組鼠有增 加，並且含有較多的L3T4 +細胞（12.58X 106± 0.50)，對 照組小鼠餵食等熱食物25g酪蛋白/100g食物（3.69X 106 ± 0.50)。類似地，餵食非變性WPC的小鼠的脾L3T4 + /LYt 一 2+比例為1.36 土 0.07，而餵食酪蛋白的對照组為0.55 土 0.07 (P< 0.001) 〇 在實施例中所用的乳清蛋白濃縮物均是非變性的，它 是由很不嚴格方法處理的牛奶製備得到的，但都能達到細 菌污染的安全標準。非常高的寧解度指標表明這種蛋白 質基本上是非變性的，所以超濾過程中有很好的耐受性 〔8〕。雖然其它市售的濃縮物中所含有的蛋白質通常也 大都是非變性的，比如濃縮物有較高的溶解度等，但是， 這些混合物中所含的血清白蛋白和免疫球蛋白的量明顯低 於産生有效的生物活性所必需的量〔.8〕。當用高的巴氏 滅菌溫度處理時，這些非常不耐熱的蛋白質會發生變性而 沈澱.出來，部分從乳清中損失。相反地，我們的WPC由牛 -5 - 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐)~" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 五、發明説明（) ^ ·\Ά 'if -¾ 、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 奶的低溫巴氏滅菌處理製得，含有較高濃度的熱敏感血清 白蛋白和免疫球蛋白，它可以反應出更接近原牛奶的特性 。這些數據支持這樣假設：即不耐熱的含有甘氨酸-半胱 氨酸的蛋白質（如非變性構形的血清白蛋白）是乳清蛋白濃 縮物的生物活性的闘鍵因素。 牛乳清蛋白濃縮物是用St-Hyacinthe， Quebec， Canada—書 “.Service de recherche sur les Aliments du .Ministere de 1 agriculture du Quebec” 中所描 述的方法製備，具有如下特點：純蛋白含量75% (其餘的 主要是乳糖，一些脂肪和水分）；溶解度指數：（pH 4.6) ;99.5%。通過聚丙酰胺凝膠電泳測得的蛋白質組成（以 總的乳清蛋白的％計）〔8〕為：/3 -乳球蛋白59.1 ± 4.0 ;α -乳清蛋白22 士 〇 . 7 ;血清白蛋白9.7 ± 1.0 ;免疫球 蛋白9、.0_ ±1.〇 (平均值土標準差）。溶解度指數最好應當 高於99%。 血清白蛋白的含量約是乳清蛋白總量的10%，幾乎是 已檢測的其它市售乳清蛋白濃縮物的2倍。可以認為’血 清白蛋白的量2 10%將非常有利於改進免疫糸統。 血清白蛋白含有大量的谷氨酰基半胱氨酸，它是體内 谷胱甘肽合成的一個基。谷胱甘肽的作用已在“未變性 食用乳清蛋白的生物活性：谷胱甘肽的作用”丨^^11· Invest. Med. 14 ： 296 〜·309’ 1991) 一文中作了 3羊細 §寸論 ，卽為其第tt8項，該文中的全部内容被列為本文的參考。 免疫球蛋白的含量範圍在乳清蛋白總量的約25〜30% 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） n· ^^^1 1^1 n UK —HI— ^^^1 n^v . m· 1^1^1 i I 方-5 (請先閩讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明（） 時也是非常重要的。72¾進行巴氏滅菌13秒，使免疫球蛋 白的含量是28 士 2%。我們發現將牛奶在721C巴氏滅菌13 秒可以使血清白蛋白的含量逹到14± 1 %。 細菌學分析表明，無論是用“Service de recherche sur les Alimentsdue Ministere de 1 "" agriculture du Quebec”方法製備的WPC，還是在72Ί0進行.13秒巴氏 滅菌的樣品，都未檢出葡萄球菌、沙門氏菌、B仙人掌或 大腸桿菌等。 下文表1用圖示法描述了製備本發明實施例中所用 WPC的方法Γ (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) —裝I' 訂_ 丨#· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） -1 - Α6 Β6 五、發明説明（） 表 1 製備本發明非變性WPC產品的示意圖 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 原料牛奶 35¾脫脂 4乳脂 脫脂牛奶在63¾巴氏滅菌30分鐘 小 在38Ό :加入.粗製凝乳酶（20毫升/ 100千克），低速攪拌 使溶解 I 子凝乳 乳精 用乾酪棉濾去固體碎渣 ' ^ 在40Ό :超濾（Romecon UFSI，聚礙膜，截除50，000，孔 徑0. 06英寸，表面2〜3米2) 在40它：透濾洗去鹽和乳糖 乳清蛋白濃縮液 冷凍乾燥 小 乳清蛋白濃縮物 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝. *?Γ. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 一8 - A6 B6 五、發明説明（） 用30ml肝素化的血液來測定血液中單核細胞中谷胱甘 肽的含量。將已計數的單核細胞懸浮在磷酸鹽緩衝的鹽水 中，調至每管含有107個細胞。離心後加入900 W 1水至沈 澱中，使細胞全都溶解。向每份中加入30%的磺基水楊酸 至終濃度為每1 ml含有3%。保溫15分鐘後，離心樣品， 上清液按照Anderson〔 11〕的方法進行生化試驗。所測值 K納摩爾（nMol)GSH(谷胱甘肽）/ 107細胞表示。血液淋巴 細胞亞群可由流式細胞光度術測得。 血清蛋白總量，包括白蛋白和免疫球蛋白可Μ用 Biuret方法測得。免疫球蛋白A(IgA>，免疫球蛋白G(IgG) 和免疫球蛋白M(IgM)可由免疫比濁法測定。 在血液中有兩個重要的淋巴細胞亞群；（1)CD4,也叫做 T-助細胞，因為它們有助於免疫應答；（2) CD8，也叫做 T-抑制細胞，因為它們起相反的作用，也就是它們抑制 免疫應答。在HIV-血清陽性的個體中，CD4細胞數量少，也 就是説，CD4/CD8的比例下降。 本發明的目的就是提高T助細胞對T抑制細胞的比例 。這一目的可Μ通過服用未變性的乳清蛋白濃縮物來實 現。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 服用劑量應當在每天8〜40克的範圍內，最好是每天 20〜40克。對谷胱甘肽量特別有利的劑量是每天服用30〜 40克。而谷胱甘肽量的提高有利於免疫条統，這在美國專 利申請號No. 563，794 (1990年8月3'日呈遞）中有更完善 的描述，可作為本文的參考。 9 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) i裝 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） A6 B6 五、發明説明（） 實施例1 : 選擇3痼HIV-血清陽性的男性患者服用上文中所述的 乳清蛋白有濃縮物，在表2中分別標記爲A、B和C。該 產品每天冷衝服，衝服用液體可由患者自選。另外還包括 第四個患者D，但是他只是偶爾服用wpc，沒有任何規律 ，並且在硏究的最後幾天沒有服用。因此，他在表2中被 列爲對照。其它的對照體還有E和F。 WPC的日服入量是逐步增加的。在第一艏三周期間每 日服用8.4克，第二個三周内每日19.6克，第三傾三周内 每日28克，最後三周內每日服用39.2克。 觀察結果列在下面表2中： (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝-- *ΤΓ, 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張冬度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（21〇 X 297公釐） 10 五、發明説明（） (s)w2 2400 100 22G0 116 1400 s

78 26 PS k 7-S27 864°46 12-s s 76 24-2 0·39 10.38 (32) (35) 12 1870 s 2035Is 2100 138 76-t2 P24 p-2 7-5 E 532°28 9~ 7-2 73--s5°22 S.22 12 A6 B6 1800 106 2111 100 108 ^ so°.41-- 1°5 26 26 0.45 sk 2180.· 86 S2.5 23 s 3S P3Q·- 难卧(g) (kg) (1) -淬$ (+斗) (令琴) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 80 50 1-8-8°7

Sr 49 1-9^s PS 82 52 12-3.S Q-g 72 50 16.9 5.2°s 79 5 二·2 °.7g 82 50 42.3 ，38 0.75 SO 亡 20,1 1.61 1.05 74 39 r56 1.16 11 20.3 r s rl4 "微穽"34沴忽^^旧 GSH 详蛑(-) (2) M^KtcD8 n mol-loM^^Alb I°G IgA IgM (3) (4) (5) 深冲 m2 丨裝_ 訂· Α'^^έ?1^今^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 11 五、發明説明（） 2|1£璉滕画：35-55 3丨闬砷雞画：5S?1250 4IIE瑯攤画：1.4213.565IGSH :樾玆&皆錶书3氓薄坩萍_。益鹇拼隳S躕JtsHIV ώι21阵窗雕SIE31®®凾： 17.05屮2_4-书迹疏屮-) (37) 12 2200 108 2100 120 2300 110 72 12.5 230 8°42 (3S- 73 12 222 1P3 83 43 74 74

IS 263 lrg 80 43 12 2500 s 2600 13° 2480 1°8 s 18 359 ·°·8 rol 44 6-5 21 371 11 82 44 70 69·5 17 10.3 81 44 A6 B6 ,ϋ$ sf(->尊) 2940 .S7 250° 118 85 25 6S0 0.42m59 73 办2 15 95·5 27 540 0.47 1-36 詻·3： 闼资 CD4沴 (斗 i s (ks) (2) 难竺0) (-).(1) 容贫^旧 GSH ^'"HiLCS n mol-lo】^" (3) (4) (5) m2 (懿) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .1 裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 • 5-19 75 47 15-1·63r34 J6L^^la-N今♦ Alb IgG IgA Ι·°Μ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)曱4規格（210 X 297公釐〉 -12 - A6 B6 五、發明説明（ 在表2中： πμ%表示CD4 (助細胞）佔血液中淋巴細胞總量的百分 率 助 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 細胞絕對值表示每單位血液中CD4的實際數量〔X 103每 ^ 升 U 1)〕。 CD4/CD8表示血液中兩種淋巴細胞型的比例，即Τ -助細胞和Τ -抑制細胞的比例。 總量表示血清中的蛋白總量，包括白蛋白和免疫球蛋 白。

IgA表不免疫球蛋白A IgG表示免疫球蛋白G IgM表示免疫球蛋白Μ 、言 表2給出的數據及實驗過程中得到的其它的信息具有 下列含意。 三個患者每天服用未變性的WPC三値月後，未觀察到 任何有害的副作用。所有這些患者的體重都逐漸增加（2 〜7千克）；並且有兩個（Β和C )達到了理想體重。血清 蛋白（包括白蛋白）保持不變，並在正常範圍之内，這說明 蛋白補充本身並不是體重增加的原因。 經濟部中央標準局3工消費合作社印製 在所有的這三個患者中，在硏究中血液Τ -助細胞的 濃度和τ-助細胞/抑制細胞的比例都適中地、但一致地 高於服用未變性WPC前時的值。 正像所預料的那樣〔10〕，在硏_究開始時所有患者的 血液單核細胞中谷胱甘呔的含量都低於正常值。但是，經 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -13 - A6 B6 五、發明説明（） 過三個月後，谷胱甘呔的水平都有增加，並且有一例（B) 增加70%，從而達到正常值。 在文獻〔10〕的1297頁中提出了沒有症狀的HIV-血清 陽性個體的条統性谷胱甘肽缺乏使谷胱甘肽正常的細胞外 濃度的恢復成為尚未解決的難題。因為靜脈注射的谷胱甘 呔的半衰期只有1〜6分鐘。但是，根據本發明的方法， 通過服用未變性的WPC可以解決這一難題。 在所有這三個患者中，這些症狀的變化都伴隨著健康 狀況的明顯改善。 * 值得注意的是，有一位患者過分擔心體重的有益增加 會妨礙其苗條外形，他在第三値硏究階段中急劇減少能量 和未變性WPC的攝入量（C，表2)。在這時期內，體重的 增加降低，並且谷胱甘肽和T-助細胞也不再増加。 正像早期指出的那樣，患者D由於對實驗方案缺乏認 識，而作爲對照體，他在第6周末表現出體重、T-助細 胞/ T-抑制細胞比例及谷胱甘肽量的下降，並且在預定 的12周内沒有上升趨勢。其它的兩個對照體（E和F)的體 重下降，谷胱甘肽水平沒有變化。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂· 這些實例表明，如果患者基本上保持其能量攝入量在 硏究前的水平上而對上述WPC的攝入量只有少量降低，則 在服用WPC期間，他的體重增加，並且特定的Η IV指標（如 ，血細胞谷胱甘肽、Τ-肋細胞濃度、Τ-助細胞/Τ-抑 制細胞比例）都有適當的提高。 : 如果結合在大量動物通過服用我們的WPC後表現出細 本紙張適用中國國家標準（CNS)甲4規格(210 X 297公釐） A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 胞谷胱甘肽和免疫應答增加〔1，2, 8, 9〕的實驗基礎上 一起考慮，則在這很有限的HIV-血清陽性患者中所觀察到 的未變性WPC的正療效，是具有很大的價值的。動物硏究 強調的事實是未變性WPC的免疫增強效應與較大的糸統性 營養效能無關，因為其它幾個具有相似營養效能的蛋白源 都沒有明顯的生物活性。餵食未變性WPC的小鼠的身體生 長並沒有增加，血清蛋白水平也沒有變化。類似地，在我 們的患者中，未變性WPC在血清蛋白中沒有產生任何變化 ，整個硏究過程中血清蛋白的量保持不變。在硏究過程中 所觀察到的患者體重的增加與能量或蛋白攝入量的增加沒 有關聯，但與身體健康狀況的改善和HIV特定的血液參數 有關。通過未變性的WPC所攝入的多餘蛋白通常通過降低 其它來源蛋白的攝入量來抵償。 認為在乳清蛋白濃縮物的血清白蛋白組分中存在有谷 氨酰基半胱氨酸基團是未變性WPC蛋白混合物的谷胱甘肽 促進活性和免疫增強活性的關鍵因素。我們實驗室的硏究 表明，其它來源的乳清蛋白濃縮物不能產生明顯的生物活 性，但具有類似的營養效能。這些產品中的血清白蛋白的 百分濃度（平均值土檫準差）分別是：prom〇d(Ross實驗室） ，4士 1; Alacen 855(新西蘭乳品店），4土； Lacprodan-80 (1980年由〇8111113犷1'：蛋白生產）4.8土；53?犷3(53?11七〇，蒙 特利爾），4.8± 0.1;.Savorpr〇-75(Golden Cheese，CA), 4土 1; Bioisolate(Lesueur Isolates，明尼那波利斯） 〔8〕 ，5士 1 ; Promix(Dumex，魁北克〉，4_3 士 1。類似 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝-- 、ΤΓ. 饔 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） A6 B6 五、發明説明（） 地，其它的不耐熱蛋白含量，免疫球蛋白，大約是本發明 所用的未變性WPC中含量的一半。 這些結果表明，未變性乳清蛋白通過為在免疫細胞補 充谷胱甘肽提供特定燃料，可以作為其它治療形式的輔助 劑。 在歴史上，並直到現在.，通過加熱處理（巴氐滅菌）來 降低牛奶中的細菌和穿胞。為了有效滅菌，這種方法不可 避免地會產變性，從而使大部分最不耐熱並推測有生物栝 性的血清白蛋白和免疫球蛋白Μ凝乳形式沈澱而損失。 我們的目的就是得到一種乳清蛋白濃縮物（w . P . C)， 它儘可能地含有與原料奶相近的蛋白組成比例和構形，並 且細菌含量逹到允許的安全檫準。為了保持不耐熱的乳清 蛋白，到目前為止我們已採用了最低的可允許的熱處理牛 奶。今後我們將採用一種基於膜撤過濾的新方法逹到這一 目的。 選用 Bactocatch (Alfa-Laval Ltd. Scarborough， Ontario (安大略）），我們將脫脂奶經過特殊的膜徹過 濾後，所得透濾液的細菌含量已降低至不足原水平的0.5 % ° 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) •丨裝. 然後將這種透濾液用粗製乳酶處理，乳清上清液中的 蛋白質經過濃縮後即可得到所需的未變性乳清蛋白濃縮物 。我們相信膜撒過濾原理取代加熱方法處理牛奶在將來將 提供一個合適的途徑來保持不耐熱的‘乳清P白' 雖然在技 術和設備方面可以隨後改進。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -16 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 S84223 A6 _____B6_ 五、發明説明（） 參考文獻 1 .Bounous G， Kongshavn PAL, Gold P:食用乳清蛋 白濃縮物的免疫增強性質，Clin. Invest. Med. 11: 271- 8，1988 ° 2 .Bounous G，Batist G，Gold P :食用乳清蛋白在小鼠 中的免疫增強性質：谷胱甘肽的作用，Clin. Invest. Med· 12 : 154- 61，1989。 3 .Fidelus Μ，Tsan MP :細胞內谷胱甘肽的增強促進分 裂素對淋巴細胞的活化，Cel 1 . Immunol . 97 : 155-63 > 1986 〇 4.Gougerot-Pocidalo MA, Fay M，Roche S:氧化性損 傷抑制人淋巴細胞對植物凝集素的增殖反應機理，巯 基化合物2 -窥基乙醇的作用。Immunology 64: 281— 8 ，1988。 5 .Noelle RJ，Laurence DA:淋巴細胞中谷胱甘呔的測 定及氧化還原狀態與淋巴細胞增殖能力的可能關係。 Biochem. J. 198: 571 ~9，1981。. 6.Anderson ME, Meister A:在谷胱甘呔合成過程.中7-谷氨跌基半胱氨酸的轉蓮和直接利用，Proc. Natl. Acad. Sci. » 80 ： 707 - 11 > 1983 ° 7 Me is ter A : 5-羥脯氨酸尿和其它的谷胱甘狀生物合 成的棄亂。在：S t r a n b u r y J B， W y m g a a r d e n J B， Frederikson DS，著，遣傳性疾病的代謝基礎（第四 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） _ 17 - (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂

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Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 修正‘ ...,本，平..月田 .87. S： f 第咖2661號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正日期：87年5月 1·:種用以治療HIV_血清陽性個體的藥學組成物，其包 含有一種未經變性的乳清蛋白濃縮物該未經變性的 乳=蛋白濃縮物實質上包含所有含在該來源乳中之熱 不安定乳清蛋白中的谷氨酰基半胱胺酸，且其數量足 以提高該等HIV~血清陽性個體體内的τ_輔助細胞濃度 以及Τ，輔助細胞/τ_抑制細胞之比例的，其中該未經變 性的孔清蛋白濃縮物中之未經變性的量係在95_1〇〇% ]其中該未經變性的乳清蛋白濃縮物具有一大於99〇/^ 的溶解度指數（pH 4,6)，其中該未經變性的乳清蛋白濃 縮物之蛋白組成包含有：沒-乳球蛋白為59.1±4.0，α- 札m蛋白為22±0·7以及平衡之血清蛋白與免疫球蛋 白。 2. 如申請專利範圍第i項之藥學組成物，其中該未經變 性的乳清蛋白濃縮物之日服量範圍係為每天8至4〇克。 3. 如申4專利範圍第3項之藥學组成物，其中該日服量 範圍係為20至40克。 4. 如申叫專利範圍第4項之藥學組成物，其中該日服量 範圍係為30至40克。 5. 如申請專利範圍第丄項之藥學組成物，其中該未經變 性的乳清蛋白濃縮物具有95%或更高的血清白蛋白含 量。 6. 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其任擇地包含 有一藥學上可接受的載體或賦形劑。 本^•張A娜(加二公羹)

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   申請專利範圍 7.如申請專利範圍第丄項之藥學組成物，其中該未經變 性的乳清蛋白濃縮物係以一包含下列步驟的方法予以 製得者，該方法包含在35°C下將原料牛奶脫脂以得到 一脫脂乳，在足夠低的溫度下巴氏滅菌該得到的脫脂 乳一段足夠短的時間，以保持該最終產物之血清蛋白 含量至少為9.5%並使其實質上不具有葡萄球菌、沙門 氏菌、蠟狀胞芽桿菌與大腸桿菌，而後再予以過濾與 濃縮’並可任擇地冷凍乾燥之以形成粉末。 8·如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該脫脂乳係 在足夠低溫下作短時間滅菌，即在不低於63t：滅菌至 多30分鐘且在不高於72它下滅菌至多13秒之範圍内進 行巴氏滅菌。 9·如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該方法進一 步在滅菌與過濾的步驟間包含一加入凝乳酶以去除凝 乳的步驟。 10. —種用以治療HIV-血清陽性個體的藥學組成物，其包 含有一數量足以提高該等HIV_血清陽性個體體内的τ_ 輔助細胞濃度以及丁_輔助細胞/τ_抑制細胞之比例的未 經變性的乳清蛋白濃縮物’該未經變性的乳清蛋白濃 縮物係以一包含下列步驟的方法加以製得，該方法包 含在35 C下將原料牛奶脫脂以得到—脫脂乳，在足夠 低的溫度下巴氏滅菌該得到的脫脂乳一段足夠短的時 間，以保持該最終產物之血清蛋白含量至少為9.5%並 使其貫質上不具有葡萄球菌、沙門氏菌、蠛狀胞芽桿 囷與大腸桿菌，而後再予以過濾與濃縮，並可任擇地 本紙張纽適用中國國家標準（CNS ) Α4胁~ (請先間讀背面之注意事jf：再填寫本頁j ί裝· :---1 訂----- S84223 "" — 申請專利範圍 A8 B8 C8 D8

   冷象乾燥之以形成粉末，其中該未經變性的乳清蛋白 濃縮物具有—大於"％的溶解度指數(pH 4.6)，以及兑 中該未經變性的乳清蛋白濃縮物之蛋白組成包含有： 沒-乳球蛋白為59.1±4.〇，α _乳清蛋白為··7以及平 衡之血清蛋白與免疫球蛋白。 U·如申，專利範圍第10項之藥_物，其令該未經變 性的乳清蛋白濃縮物之日服量範圍係為每天8〜4 〇克。12. 如申請專利範圍第⑽之藥學組成物，其中該日服量 範圍係為20至40克。 13. 如申咕專利範圍第12項之藥學組成物，其中該日服量 範圍係為30至40克。 14..如申請專利範圍第1〇項之藥學組成物，其中該未經 性的乳清蛋白濃縮物具有9.5%或更高的血清白蛋白 變 含 -I - ------ -HI I! 1 I _ 一 卜一 ! — (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 量 15.如申請專利範圍第1〇項之藥學組成物，其任擇地包含 有一藥學上可接受的_載劑或賦.形劑.。 •16.如申請專利範圍第10項之藥學組成物，其中該脫脂乳 係在足夠低溫下作短時間滅菌，即在不低於63滅菌 至夕30分鐘且在不面於72C下滅菌至多13秒之範圍内 進行巴氏滅菌。 17·如申請專利範圍第1〇項之藥學組成物，其中該方法進 一步在滅菌與過滤的步驟間包含一加入凝乳酶以去除 凝乳的步驟。 -3 .本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐）

   經濟部中央擦隼苟員!.肖芽V k: 公告本 申請曰期 案 號 t f 類 別 (以上各欄由本局填註）

   384223 II專利説明書 發明々r 一、纪w名稱 新型 中 文 用Μ治療HI V血清陽性個體的藥學組成物 英 文 Pharmaceutical Composition for the Treatment of HIV-Seropositive Individuals 姓 名 ⑴菲爾*哥德 ⑵加斯泰佛·包納斯 國 籍 加拿大 人 發明 創作 住、居所 ⑴加拿大魁北克省西山林蔭大道3225號 (2)加拿大魁北克蒙特婁公寓1504C克地迪斯尼吉斯4858號 裝 訂 姓 名 (名稱） 加拿大商*免疫技術硏究股份有限公司 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 線 國 籍 住、居所 (事務所） 代表人 姓 名 加拿大 加拿大魁北克羅織宜爾-多利•安迪恩怕他那迪292 麥可L，加爾梅玆 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 8|5沪〇曰修耳 五、發明説明（） (正丁基）高半胱氨酸磺酰亞胺（該化合物可以將脾的谷胱 甘呔降低一半）將明頴降低它的體液免疫應答。這進一步 證實了谷胱甘肽在食用乳清蛋白的免疫增強括性中的重要 作用〔2〕〇 服用7-谷氨酰基-半胱氨酸可K增加組織谷胱甘肽的 濃度。給小鼠皮下（S.C)注射40〜60分鐘後，其腎臟的谷 胱甘呔的濃度增加约50%，並且在2小時後又回到對照組 的值〔6〕。服用的7-谷氨酰基半胱氨酸Μ完整的分子 在體內輸送，並用作谷胱甘肽合成酶的底物〔7〕。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) *裝’· 0 食物蛋白'質的氨基酸序列的進展使我們可Μ硏究在乳 清蛋白中有谷氨酰基半胱氨酸基圍的存在，並能硏究它與 谷胱甘肽促進作用的關係。事實上，從牛奶中得到的乳清 蛋白濃縮物中含有大量的谷氨酰基半胱氨酸基團，與酪蛋 白不同，當餵Μ小鼠酪蛋白並不能增加組織谷胱甘肽的量 〔1]。谷氨酰基半胱氨酸基画主要位於血清白蛋白部分 中（每分子六傾基画）。谷氨酰基半胱氨酸基圍在動物和植 物的可食用蛋白中含量極少。對可食甩蛋白的氨基酸序列 的有關資料進行廣泛的硏究表明，由二硫鍵連接的穀屌酸 -半胱氨酸基圃只局限於某些乳清蛋白，而蛋清的卵類黏 蛋白部分中，每一個30 , 000分子量大小的分子中含有2 傾這樣的基圍〔8〕。 我們最近的實驗數據還表明〔8〕，小鼠在餵食高溶 解度（非變性型）的食用乳清蛋白濃縮物時有最高的體液免 疫應答，特別是含有較高相對濃度的不耐熱的牛血清白蛋 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 4

   經濟部中央標準局員工消費合作社印製 白（210%)和免疫球蛋白的情況下。另外’食用這種類型 的乳清蛋白濃縮物的小鼠具有較高水平的組織谷胱甘肽。 在血清白蛋白部分中存在的谷氨酰基半胱氨酸基團（在食 物蛋白中的量很少），以及非變性分子構象中的特定分子 内鍵是蛋白質混合物的谷胱甘肽促進活性的關鍵因素。 日本的最近實驗表明〔9〕，BALB/C雄鼠餵食我 們的非變性乳清蛋白濃縮物（WPC，我們稱為免疫卡爾 “Immunocal”），每100 / g 該食物中含 25gWPC’ 共餓 4 星期，其脾細胞在體外對SRBC的免疫應答比對照組鼠有增 加，並且含有較多的L3T4 +細胞（12.58X 106± 0.50)，對 照組小鼠餵食等熱食物25g酪蛋白/100g食物（3.69X 106 ± 0.50)。類似地，餵食非變性WPC的小鼠的脾L3T4 + /LYt 一 2+比例為1.36 土 0.07，而餵食酪蛋白的對照组為0.55 土 0.07 (P< 0.001) 〇 在實施例中所用的乳清蛋白濃縮物均是非變性的，它 是由很不嚴格方法處理的牛奶製備得到的，但都能達到細 菌污染的安全標準。非常高的寧解度指標表明這種蛋白 質基本上是非變性的，所以超濾過程中有很好的耐受性 〔8〕。雖然其它市售的濃縮物中所含有的蛋白質通常也 大都是非變性的，比如濃縮物有較高的溶解度等，但是， 這些混合物中所含的血清白蛋白和免疫球蛋白的量明顯低 於産生有效的生物活性所必需的量〔.8〕。當用高的巴氏 滅菌溫度處理時，這些非常不耐熱的蛋白質會發生變性而 沈澱.出來，部分從乳清中損失。相反地，我們的WPC由牛 -5 - 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐)~" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   A7 B7 五、發明説明（) ^ ·\Ά 'if -¾ 、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 奶的低溫巴氏滅菌處理製得，含有較高濃度的熱敏感血清 白蛋白和免疫球蛋白，它可以反應出更接近原牛奶的特性 。這些數據支持這樣假設：即不耐熱的含有甘氨酸-半胱 氨酸的蛋白質（如非變性構形的血清白蛋白）是乳清蛋白濃 縮物的生物活性的闘鍵因素。 牛乳清蛋白濃縮物是用St-Hyacinthe， Quebec， Canada—書 “.Service de recherche sur les Aliments du .Ministere de 1 agriculture du Quebec” 中所描 述的方法製備，具有如下特點：純蛋白含量75% (其餘的 主要是乳糖，一些脂肪和水分）；溶解度指數：（pH 4.6) ;99.5%。通過聚丙酰胺凝膠電泳測得的蛋白質組成（以 總的乳清蛋白的％計）〔8〕為：/3 -乳球蛋白59.1 ± 4.0 ;α -乳清蛋白22 士 〇 . 7 ;血清白蛋白9.7 ± 1.0 ;免疫球 蛋白9、.0_ ±1.〇 (平均值土標準差）。溶解度指數最好應當 高於99%。 血清白蛋白的含量約是乳清蛋白總量的10%，幾乎是 已檢測的其它市售乳清蛋白濃縮物的2倍。可以認為’血 清白蛋白的量2 10%將非常有利於改進免疫糸統。 血清白蛋白含有大量的谷氨酰基半胱氨酸，它是體内 谷胱甘肽合成的一個基。谷胱甘肽的作用已在“未變性 食用乳清蛋白的生物活性：谷胱甘肽的作用”丨^^11· Invest. Med. 14 ： 296 〜·309’ 1991) 一文中作了 3羊細 §寸論 ，卽為其第tt8項，該文中的全部内容被列為本文的參考。 免疫球蛋白的含量範圍在乳清蛋白總量的約25〜30% 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） n· ^^^1 1^1 n UK —HI— ^^^1 n^v . m· 1^1^1 i I 方-5 (請先閩讀背面之注意事項再填寫本頁) 四，中文發明摘要（發明之名稱： S842S3 A5 B5 修正 +月曰 用κ治療η π血清陽性 組成物 將未變性的乳清蛋白濃縮物對HIV-血清_性偏髏給藥 ，Μ提高他們的血液單核細胞，谷胱甘狀（GSH)水平，體 ...V: ' , ； -. .重和健康狀況。另外，痼體的τ -助細胞濃度和傾體的Τ -助細胞/ Τ -抑制細胞比例也有少量的提高。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁各棚) 英文發明摘要（發明之名稱： ） Pharmaceutical Composition for the Treatment of HIV-Seropositive Individuals Undenatured whey protein concentrate is administered to HIV-seropositive individuals to elevate their blood mononuclear cells, glutathione (GSH) level, body weight and sense of well being. In addition Τ' helper cells concentration and tiieir T-helper cells /T-； suppressor cells ratio are slightly elevated. j 經濟部中央揉準曷Λ工消费合作杜即製 附註:本案已向美 國（地區）中請專利、申請日期： 案號： 1992.4.10. 866,756 本紙張尺度逋用t國國家標準（cns)甲4規格（210 x 297公着）-2 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 修正‘ ...,本，平..月田 .87. S： f 第咖2661號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正日期：87年5月 1·:種用以治療HIV_血清陽性個體的藥學組成物，其包 含有一種未經變性的乳清蛋白濃縮物該未經變性的 乳=蛋白濃縮物實質上包含所有含在該來源乳中之熱 不安定乳清蛋白中的谷氨酰基半胱胺酸，且其數量足 以提高該等HIV~血清陽性個體體内的τ_輔助細胞濃度 以及Τ，輔助細胞/τ_抑制細胞之比例的，其中該未經變 性的孔清蛋白濃縮物中之未經變性的量係在95_1〇〇% ]其中該未經變性的乳清蛋白濃縮物具有一大於99〇/^ 的溶解度指數（pH 4,6)，其中該未經變性的乳清蛋白濃 縮物之蛋白組成包含有：沒-乳球蛋白為59.1±4.0，α- 札m蛋白為22±0·7以及平衡之血清蛋白與免疫球蛋 白。 2. 如申請專利範圍第i項之藥學組成物，其中該未經變 性的乳清蛋白濃縮物之日服量範圍係為每天8至4〇克。 3. 如申4專利範圍第3項之藥學组成物，其中該日服量 範圍係為20至40克。 4. 如申叫專利範圍第4項之藥學組成物，其中該日服量 範圍係為30至40克。 5. 如申請專利範圍第丄項之藥學組成物，其中該未經變 性的乳清蛋白濃縮物具有95%或更高的血清白蛋白含 量。 6. 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其任擇地包含 有一藥學上可接受的載體或賦形劑。 本^•張A娜(加二公羹)