TW202423995A - 微粒子製備方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露是關於一種用於製備微粒子的方法。用於製備微粒子的方法可製備具有均一尺寸以及窄密度範圍的微粒子。因此，用於製備微粒子的方法與用於製備微粒子的習用方法相比可展現較高製備產率。微粒子的密度低於水且其範圍極窄，且因此當用作微載體時，其能夠實現高效細胞培養且沒有在細胞培養過程中上浮至培養基表面的問題，且在培養過程之後易於分離以及回收。

Description

微粒子製備方法
[相關申請案的交叉參考]
本申請案主張2022年10月17日在韓國智慧財產局申請的韓國專利申請案第10-2022-0133483號的優先權益，所述申請案的揭露內容以全文引用的方式併入本文中。
本揭露是關於一種用於製備微粒子的方法。
隨著生物製藥學以及再生醫學領域的擴大，對能夠高效生產細胞、組織、微生物以及類似物的大規模細胞培養技術的需求不斷增加。舉例而言，使用微載體培養細胞的技術的開發已變得活躍。
在微載體相關的細胞培養技術中，使用微載體在3D生物反應器中培養貼附型細胞。特別言之，將細胞、培養基以及微載體放入生物反應器中，在攪拌培養基的同時使細胞與微載體彼此接觸，且使細胞貼附至微載體的表面並培養。此時，為了適合細胞的大規模培養，微載體必須具有高的表面積/體積，以便細胞能夠貼附以及增殖。
另一方面，目前市售的微載體具有100微米至300微米的尺寸以及約1.1公克/立方公分至1.3公克/立方公分的密度。貼附至載體後培養的細胞密度為約1.2公克/立方公分。由於微載體以及細胞的密度，在生物反應器中培養細胞的初始階段有利於細胞貼附至微載體，但在培養後分離以及回收細胞時難以應用離心。因此，除了離心之外，亦必須使用可基於微載體以及細胞的尺寸來分離以及回收細胞的單獨過濾方法。然而，基於微載體以及細胞尺寸的過濾方法存在以下問題：隨著過程的重複，過濾器變得更加堵塞，過程需要更長時間，其導致細胞的物理損傷以及污染，且細胞在過濾過程中丟失。為了解決此類問題，可考慮使用密度小於1.0公克/立方公分或大於1.3公克/立方公分的材料(形成微載體骨架的聚合物或聚合組分)的特性來製備微載體。然而，即使在此情況下，可實現的微載體的密度範圍仍有限，且因此微載體與細胞之間的貼附不足，且培養效率亦不佳。舉例而言，當攪拌含有微載體以及細胞的培養基時，若微載體的密度太低，儘管攪拌，大部分微載體仍漂浮在培養基表面，且若微載體的密度太高，儘管攪拌，大部分載體仍沉入培養基底部，導致細胞與載體的貼附不佳且培養效率降低。
因此，需要開發一種可均勻分散在培養基中的微載體相關技術，其有利於細胞貼附以及培養，同時亦允許在培養之後容易地分離以及回收細胞。
[ 技術問題 ]本發明的目的在於提供一種用於製備微粒子的方法。 [ 技術方案 ]根據本發明的特定實施例的用於製備微粒子的方法以及由所述方法製備的微粒子將在下文進行描述。 根據本發明的一個實施例，提供一種用於製備微粒子的方法，包括以下步驟：a）經由細流道將含有可聚合單體的分散相組成物注入連續相組成物中，以在所述連續相組成物內產生由所述分散相組成物構成的液滴；b）使所述液滴光聚合；以及c）使所述光聚合液滴熱聚合。
如本文所使用，術語「微粒子」是指具有微米級尺寸（直徑）的粒子、包含此類粒子的粒子群或由此類粒子組成的粒子群。舉例而言，可提供包含粒子直徑在10微米至500微米範圍內的個別粒子的粒子群。直徑可以與下文所描述相同的方式量測。
如本文所使用，術語「分散相組成物」是指在與連續相組成物混合之後可形成分散相（或液滴）的組成物。
如本文所使用，術語「連續相組成物」是指在與分散相組成物混合之後可形成連續相的組成物。
除非本文另外特別定義或解釋，否則進行製備方法（或各製備步驟）時的溫度或者計算或量測所製備粒子的數值特性時的溫度可為室溫。特別言之，如本文所使用的術語「室溫」是指在不特別升高或降低溫度的條件下的溫度，且可意謂例如15℃至30℃範圍內的溫度。
本發明人經由實驗發現，當經由特定方法製備的尺寸以及形狀均一的液滴持續進行光聚合以及熱聚合時，其具有高形狀以及尺寸均一性，具有比細胞更低的密度特性，具有極窄的密度範圍，且可在高產率下獲得具有極佳表面平坦度的微粒子。
現在，將詳細描述一個實施例的微粒子製備方法。
所述一個實施例的製備方法包括a）經由細流道將含有可聚合單體的分散相組成物注入連續相組成物中，以在所述連續相組成物內產生由所述分散相組成物構成的液滴。
在步驟a）產生液滴中，可藉由特定方法製備具有均一尺寸以及形狀的液滴。
藉由將分散相組成物倒入連續相組成物中且以物理方式摻合（諸如攪拌）所述組成物而形成水包油（oil in water，O/W）液滴，其中存在的油組分分散在水內部。然而，此方法產生尺寸不均一的液滴，從而提供不僅尺寸不均一且物理特性亦不均一的微粒子。另一方面，在產生液滴的步驟a）中，當經由細流道將形成液滴的分散相組成物注入連續相組成物中以產生液滴時，有可能製備尺寸均一的液滴。
特別言之，在產生液滴的步驟a）中，可使用包含細流道的微流體裝置。
舉例而言，微流體裝置可包括：第一供應部件，經由所述第一供應部件供應分散相組成物；第一流道，自第一供應部件供應的分散相組成物可流動通過所述第一流道；第二供應部件，經由所述第二供應部件供應連續相組成物；第二流道，自第二供應部件供應的連續相組成物可流動通過所述第二流道；以及多個細流道，所述多個細流道將第一流道以及第二流道的側面彼此連接。流道的側面是指並非流道內流動的流體的流動方向的方向。
更特別言之，參考圖1，微流體裝置可包含：第一供應部件10，經由所述第一供應部件10供應分散相組成物；第一流道11，自第一供應部件供應的分散相組成物可流動通過所述第一流道11；第二供應部件20，經由所述第二供應部件20供應連續相組成物；第二流道21，自第二供應部件供應的連續相組成物可流動通過所述第二流道21；以及多個細流道12，所述多個細流道12將第一流道以及第二流道的側面彼此連接。圖1為具有以下結構的微流體裝置的圖：其中分散相組成物流動通過的第一流道11配置在連續相組成物流動通過的兩個第二流道21之間，且第一流道11的兩個側面經由多個細流道12連接至兩個第二流道21的側面，此為多個細流道12儘可能密集配置的實例。微流體裝置的結構不限於圖1中所示的結構，且可在能夠達成本發明的目的的範圍內參考圖1自由地修改。
第一流道以及第二流道可形成為按具有所需長度的細流道的長度彼此間隔開。細流道的高度以及長度不受特別限制，且可根據所需液滴的尺寸進行適當調整。
在產生液滴的步驟a）中，分散相組成物可供應至微流體裝置的第一供應部件，且連續相組成物可供應至第二供應部件。分散相組成物以及連續相組成物可經由泵分別注入第一供應部件以及第二供應部件中，但不限於此。
供應至第一供應部件的分散相組成物沿第一流道流動，且供應至第二供應部件的連續相組成物沿第二流道流動。此時，分散相組成物的速度可自1微升/分鐘調節至10毫升/分鐘。連續相組成物的速度可自0.1微升/分鐘調節至100毫升/分鐘。
流動通過第一流道的分散相組成物經由多個細流道流動至第二流道且與流動通過第二流道的連續相組成物相遇。
經由多個細流道自第一流道流動至第二流道的分散相組成物在細流道與第二流道之間的邊界處產生液滴，且所得液滴與連續相組成物一起流動通過第二流道。
微流體裝置可更包含排出部件，由分散相組成物形成的液滴可經由所述排出部件排出。此時，微流體裝置可更包含連接第二流道21與排出部件40的第三流道31，如圖1中所示。
分散相組成物為用於形成低密度微粒子的前驅體組成物，且可為不溶於作為水相的連續相組成物中的油相。
特別言之，分散相組成物可包含可聚合單體、交聯劑、低密度油、光起始劑以及熱起始劑。
可聚合單體可為具有一或多個不飽和鍵的單體。在一個實例中，可聚合單體可為具有(甲基)丙烯醯基的(甲基)丙烯酸酯單體或(甲基)丙烯醯胺單體，或具有乙烯基的乙烯基類單體，或其混合物。在一個實例中，可聚合單體可包含苯乙烯類單體作為乙烯基類單體，以形成密度低於水的微粒子。
交聯劑可與可聚合單體或由所述可聚合單體形成的預聚合物形成交聯結構，由此允許微粒子維持球形。當微粒子具有球形時，有可能提供由於大的比表面積而表現出極佳細胞培養效率的用於細胞培養的微載體。舉例而言，具有兩個或多於兩個不飽和鍵的烯系不飽和交聯劑可用作交聯劑。更特別言之，考慮微粒子密度、細胞培養方法以及類似因素，可較佳使用例如二乙烯苯作為交聯劑。
按100重量份的可聚合單體計，分散相組成物含有的交聯劑的量可為10重量份或多於10重量份、50重量份或多於50重量份、100重量份或多於100重量份、200重量份或多於200重量份、250重量份或多於250重量份、或300重量份或多於300重量份，至1000重量份或少於1000重量份、800重量份或少於800重量份、700重量份或少於700重量份、600重量份或少於600重量份、500重量份或少於500重量份、或450重量份或少於450重量份。
在此範圍內，微粒子可具有適合細胞培養以及離心同時穩定維持球形的粒子密度。
低密度油包含在分散相組成物中，使得微粒子具有低於水的密度。如本文所使用，術語「低密度油」是指在室溫下密度低於水的烴油。舉例而言，低密度油是指在21℃下具有0.700公克/立方公分至0.997公克/立方公分的密度的烴油。
在先前技術中，使用發泡劑來製備發泡苯乙烯粒子，以降低微載體粒子的密度，但當使用發泡劑時，粒子直徑以及密度的分佈範圍變得過寬，且因此不易以足夠的產率獲得具有適合細胞培養目的的直徑以及密度的微載體。然而，在所述一個實施例的製備方法中，藉由使用含有低密度油的分散相組成物，無需發泡過程便可提供低密度微粒子。亦即，藉由上述製備方法製備的微粒子為非發泡粒子。
低密度油在聚合過程期間可逸出液滴，且低密度油的一部分被捕獲在聚合物內，此有助於降低微粒子的密度。此外，使用低密度油獲得的微粒子不會沉入培養基底部或漂浮在培養基表面，且可維持均勻分散在培養基中的狀態。因此，當微粒子用作細胞培養的微載體時，微載體於培養基中的懸浮程度可改良，微載體與細胞之間的貼附可增加，且培養效率亦可增加。
可包含在分散相組成物中的低密度油的類型不受特別限制，但可考慮製備方法實施的容易性或確保下文所描述的微粒子的特性來選擇。舉例而言，可使用密度上限為0.800公克/立方公分或低於0.800公克/立方公分、或0.790公克/立方公分或低於0.790公克/立方公分的低密度烴油。此時，低密度烴油的密度下限不受特別限制，但可為例如0.750公克/立方公分或高於0.750公克/立方公分、或0.760公克/立方公分或高於0.760公克/立方公分。
在一個實例中，低密度油可包含一或多種具有8至50個碳原子的直鏈或分支鏈飽和烴化合物。特別言之，低密度油可包含例如具有8至16個碳原子的正烷烴、具有8至16個碳原子的異烷烴或其混合物。作為一特定實例，具有12個碳原子的十二烷、具有16個碳原子的十六烷或Isopar M（具有12至14個碳原子的異烷烴與具有13至16個碳原子的異烷烴的混合物）可用作低密度油。
按100重量份的可聚合單體計，分散相組成物含有的低密度油的量可為5重量份或多於5重量份、10重量份或多於10重量份、20重量份或多於20重量份、30重量份或多於30重量份、40重量份或多於40重量份、或50重量份或多於50重量份，至100重量份或少於100重量份、97重量份或少於97重量份、95重量份或少於95重量份、94重量份或少於94重量份、93重量份或少於93重量份、或92重量份或少於92重量份。
當在此範圍內用作細胞培養的微載體時，其可維持均勻分散於培養基中的狀態而不會沉入培養基底部或漂浮在培養基表面，由此提供表現出高細胞貼附率以及培養效率的具有適當密度的微粒子，且可在培育細胞之後藉由離心容易地分離以及回收。
所述一個實施例的製備方法經由連續光聚合過程以及熱聚合過程來製備微粒子。因此，分散相組成物包含光起始劑以及熱起始劑兩者。
光起始劑以及熱起始劑的類型不受特別限制，且可使用本領域中已知的各種起始劑，只要其不妨礙獲得上文所描述的微粒子的粒子特性即可。
舉例而言，可使用由下述者所組成的族群中選出的一或多者作為光起始劑：安息香醚、二烷基苯乙酮、羥基烷基酮、乙醛酸苯酯、苯甲基二甲基縮酮、醯基膦以及α-胺基酮。另一方面，作為醯基膦的特定實例，可使用市售IRGACURE 819，亦即雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)-苯基膦氧化物。
按100重量份的可聚合單體計，所含有的光起始劑的量可為0.1重量份或多於0.1重量份、1重量份或多於1重量份、3重量份或多於3重量份、5重量份或多於5重量份、10重量份或多於10重量份、或15重量份或多於15重量份，至30重量份或少於30重量份、27重量份或少於27重量份、25重量份或少於25重量份、23重量份或少於23重量份、20重量份或少於20重量份、或18重量份或少於18重量份。
在此範圍內，微粒子可以適當速率聚合且可展現所需特性。
此外，作為熱起始劑包含，例如可使用由下述者所組成的族群中選出的一或多種起始劑：過硫酸鹽類起始劑、偶氮類起始劑、過氧化氫以及抗壞血酸。
特別言之，過硫酸鹽類起始劑的實例包含過硫酸鈉（Na 2S 2O 8）、過硫酸鉀（K 2S 2O 8）、過硫酸銨（(NH 4) 2S 2O 8）以及類似者。偶氮類起始劑的實例包含2,2-偶氮雙-(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽、2,2-偶氮雙-(N,N-二亞甲基)異丁脒二鹽酸鹽、2-(胺甲醯基偶氮)異丁腈、2,2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽、4,4-偶氮雙-(4-氰基戊酸)、2,2-偶氮雙(2,4-二甲基戊腈；商品名：V-65)以及類似者。
按100重量份的可聚合單體計，所含有的熱起始劑的量可為0.1重量份或多於0.1重量份、0.5重量份或多於0.5重量份、1重量份或多於1重量份、1.5重量份或多於1.5重量份、2重量份或多於2重量份、2.5重量份或多於2.5重量份、或3重量份或多於3重量份，至30重量份或少於30重量份、25重量份或少於25重量份、20重量份或少於20重量份、15重量份或少於15重量份、10重量份或少於10重量份、8重量份或少於8重量份、或6重量份或少於6重量份。
在此範圍內，微粒子可以適當速率聚合且可展現所需特性。
除上文所描述的組分以外，分散相組成物可在不損害本發明的目的的範疇內包含本領域中已知的各種添加劑。
另一方面，連續相組成物可為水相。特別言之，連續相組成物可為含有界面活性劑以及水的水溶液。
水不受特別限制，但可為蒸餾水或去離子水。
界面活性劑可為離子界面活性劑或非離子界面活性劑。舉例而言，離子界面活性劑可為十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），且非離子界面活性劑可為吐溫（Tween）20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、曲拉通（Triton）X-100、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）以及類似者。
按總體連續相組成物計，連續相組成物含有的界面活性劑的量可為0.01重量%或多於0.01重量%、0.05重量%或多於0.05重量%、0.1重量%或多於0.1重量%、0.2重量%或多於0.2重量%、或0.3重量%或多於0.3重量%，至5重量%或少於5重量%、4重量%或少於4重量%、3重量%或少於3重量%、2重量%或少於2重量%、或1重量%或少於1重量%。在此範圍內有利於製備具有所需特性的微粒子。
另一方面，可將在產生液滴的步驟a）中製備的液滴引入至使液滴光聚合的步驟b）中。此時，液滴可在被引入至光聚合過程中之前與另外的連續相組成物混合。
在一個實例中，含有在微流體裝置的排出口處排出的液滴的懸浮液可與另外的連續相組成物混合，且隨後引入至光聚合過程中。經由此過程，可均勻地控制微粒子的形狀。
所述另外的連續相組成物可具有與在產生液滴的步驟a）中使用的連續相組成物相同的組成，或可具有不同組成。舉例而言，在產生液滴的步驟a）中，十二烷基硫酸鈉水溶液用作連續相組成物，且含有液滴的懸浮液可與聚乙烯醇水溶液混合。然而，不限於此，在產生液滴的步驟a）中產生的液滴可直接轉移至光聚合過程中。
在光聚合步驟b）中，使在步驟a）中製備的液滴光聚合以製備預製微粒子。在光聚合步驟b）中，可使用紫外線燈用UV照射液滴以誘導液滴的光聚合。參考下文所描述的比較例3，即使在光聚合步驟b）中照射足夠的UV，亦沒有達成液滴的完全聚合以及交聯，使得無法獲得固化粒子。可確認，完全聚合以及交聯是經由後續的熱聚合步驟c）達成。
可將已經歷光聚合步驟b）的光聚合液滴引入至熱聚合步驟c）中，由此可達成完全聚合以及交聯。舉例而言，熱聚合可在40℃或高於40℃、45℃或高於45℃、50℃或高於50℃、55℃或高於55℃、或60℃或高於60℃，至100℃或低於100℃、90℃或低於90℃、80℃或低於80℃、75℃或低於75℃、或70℃或低於70℃下進行。此外，熱聚合時間可控制在1小時或多於1小時、2小時或多於2小時、2.5小時或多於2.5小時、3小時或多於3小時、3.5小時或多於3.5小時、或4小時或多於4小時，至48小時或少於48小時、36小時或少於36小時、24小時或少於24小時、12小時或少於12小時、10小時或少於10小時、或8小時或少於8小時。當熱聚合溫度以及時間控制在上文所提及的範圍內時，可提供具有均一形狀以及尺寸的微粒子而沒有粒子聚結。
在根據所述一個實施例的製備微粒子的方法中，液滴製備步驟、光聚合步驟以及熱聚合步驟是在連續過程中進行，從而使製備方法變得容易且展現極佳生產率。
當上述微粒子用作微載體時，一個實施例的製備方法可更包括在微粒子的表面上形成底塗層及/或細胞貼附誘導層。
底塗層使得有可能將功能性聚合物引導至不具有官能基的微粒子表面上，且充當所謂的貼附層。舉例而言，細胞貼附誘導層或細胞可經由底塗層穩定維持在粒子上。
儘管不受特別限制，但可誘導水相貼附的兒茶酚衍生物可用作可形成底塗層的化合物。舉例而言，由下述者所組成的族群中選出的一或多者可用於形成底塗層：L-二羥基苯丙胺酸（L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA）、多巴胺（dopamine）、去甲腎上腺素、腎上腺素、表沒食子兒茶素以及其衍生物。所形成的包含上述化合物的底塗層賦予粒子表面親水性，藉此進一步增強粒子在作為連續相組成物的水性分散液中的分散性。
在一個說明性實例中，微粒子的半徑與底塗層的厚度之間的比值可為1:0.00001至1:0.01、或1:0.0001至1:0.001。若微粒子的半徑與底塗層的厚度之間的比值過低，則底塗層相較於微粒子過薄，且因此將微粒子表面改性為親水性的效果很小。若比值過高，則底塗層相對於微粒子變得較厚，使得在細胞培養期間細胞與微粒子的貼附效率可能降低。
細胞貼附誘導層由細胞貼附材料構成，所述細胞貼附材料用於提供可結合細胞跨膜蛋白的位點。由此，貼附型細胞可穩定貼附、擴散以及培養。儘管不受特別限制，但由下述者所組成的族群中選出的一或多者可用作用於形成細胞貼附誘導層的化合物：明膠、膠原蛋白、纖維結合蛋白、殼聚醣、聚多巴胺、鞣酸、多酚、聚L-離胺酸、玻璃體結合蛋白、肽（包含RGD）、木質素、陽離子聚葡萄糖以及其衍生物。另外，所形成的包含上述化合物的細胞貼附誘導層可將微粒子表面改性為親水性的且改良微粒子的水分散性。
根據所述一個實施例的製備微粒子的方法可更包含熱聚合步驟c）之後的清潔步驟。與微粒子無關的雜質可藉由清潔移除。清潔方法不受特別限制，且可使用任何已知的清潔方法。舉例而言，清潔可藉由將微粒子添加至醇（諸如乙醇）中並攪拌混合物來進行。儘管不受特別限制，但此清潔可重複例如三次或多於三次。在一個實例中，可在微粒子表面上形成底塗層及/或細胞貼附誘導層之後進行清潔。
根據所述一個實施例的製備微粒子的方法可更包含清潔之後的乾燥步驟。殘餘溶劑以及類似物可經由乾燥移除。乾燥方法不受特別限制，且可使用任何已知的乾燥方法。舉例而言，乾燥可使用烘箱或在室溫下進行。此外，儘管不受特別限制，但乾燥可在真空下進行。
一個實施例的製備方法可製備具有均一尺寸以及形狀且具有窄密度範圍的微粒子。在用於製備微粒子的習用方法的情況下，由於在粒子形成後，將具有所需形狀以及物理特性的粒子與具有非所需形狀以及物理特性的粒子進行分類，因此製備產率較低，但本發明的用於製備微粒子的方法無需經過此類分類工作即可獲得具有所需形狀以及物理特性的微粒子，且可展現高製備產率。
由所述一個實施例的製備方法製備的微粒子具有微米級尺寸。在一個實例中，微粒子的直徑可為10微米或大於10微米、15微米或大於15微米、20微米或大於20微米、22微米或大於22微米、25微米或大於25微米、27微米或大於27微米、30微米或大於30微米、或35微米或大於35微米，至500微米或小於500微米、400微米或小於400微米、300微米或小於300微米、200微米或小於200微米、100微米或小於100微米、80微米或小於80微米、60微米或小於60微米、或50微米或小於50微米。可藉由經由光學顯微鏡測定粒子的二維（2D）平面面積，然後反向計算與平面面積相關的公式（S=πr 2）來計算直徑。此時，直徑可為至少100個粒子直徑值的算術平均值。由於微粒子的直徑在上述範圍內，因此其具有適合細胞培養的表面積且可展現良好的細胞培養效率。
由於微粒子具有非常均一的尺寸以及形狀，因此直徑的變異係數可具有非常小的值。舉例而言，微粒子直徑的變異係數可為10%或小於10%、8%或小於8%、6%或小於6%、或5%或小於5%。此時，直徑的變異係數可為針對至少100個或多於100個粒子計算的值。均一的粒子尺寸提供用於細胞生長的最佳表面且可有助於提高培養效率。微粒子直徑的變異係數的下限不受特別限制，但可為例如0%或大於0%。
密度為約1.2公克/立方公分的用於細胞培養的習知市售微載體的密度在約1.1公克/立方公分至1.3公克/立方公分的水準上。儘管具有此類密度的微載體有利於初始細胞貼附，但存在培養後難以經由離心進行細胞分離以及回收的問題。
由所述一個實施例的製備方法製備的微粒子的密度低於水。因此，當自用作微載體的微粒子分離以及回收所培養細胞時，由於重力引起的沉降速率的差異可比使用習知微載體時更大，且因此有可能更容易地分離微粒子與細胞。
另一方面，若微載體的密度太低，則細胞在細胞培養的初始階段難以貼附至微載體，且在細胞培養過程中，微載體漂浮在培養基中，此降低培養效率。
由所述一個實施例的製備方法製備的微粒子在15℃至25℃下的密度可為0.985公克/立方公分或高於0.985公克/立方公分且低於0.998公克/立方公分。微粒子的密度可藉由以下方式確認：製備具有預定密度的溶液（例如去離子水或乙醇水溶液），混合待確認的粒子，且判定所述粒子是否漂浮。特別言之，在15℃至25℃下密度為0.985公克/立方公分或高於0.985公克/立方公分且低於0.998公克/立方公分意謂在15℃至25℃下密度為0.985公克/立方公分的乙醇水溶液中沒有漂浮的粒子，且在15℃至25℃下密度為0.998公克/立方公分的去離子水中沒有粒子沉降。
微粒子可具有較窄範圍的密度分佈。舉例而言，微粒子在15℃至25℃下的密度可為0.985公克/立方公分或高於0.985公克/立方公分或0.990公克/立方公分或低於0.990公克/立方公分，且低於0.998公克/立方公分、0.995公克/立方公分或低於0.995公克/立方公分、或0.990公克/立方公分或低於0.990公克/立方公分。作為更特定實例，微粒子在15℃至25℃下的密度可為0.985公克/立方公分或高於0.985公克/立方公分至0.990公克/立方公分或低於0.990公克/立方公分，或0.990公克/立方公分或高於0.990公克/立方公分至0.995公克/立方公分或低於0.995公克/立方公分，其可具有窄範圍的密度分佈。
由所述一個實施例的製備方法製備的微粒子可具有球形。球形通常意謂具有接近球體的形狀，且可用肉眼確認，但例如，其可意謂藉由下方公式1計算的球度值為約0.80或大於0.80。若粒子具有球形，則可得到大的表面積，且可提高用作微載體時的細胞貼附效能。 [公式1] 球度 = (其中在公式1中，V p為粒子的體積，且A p為粒子的表面積。)
由所述一個實施例的製備方法製備的微粒子可用作用於細胞培養的微載體。此時，細胞的類型不受特別限制。舉例而言，細胞可為貼附型動物細胞，特別言之諸如纖維母細胞、軟骨細胞、間葉幹細胞、CHO、HEK 293、Vero細胞、BHK21或MDCK的細胞。
細胞可藉由貼附至培養基中的微粒子來培養。培養基可含有接近基於體液（諸如血漿或淋巴）的活有機體的條件的營養物，以及充分滿足環境條件（諸如pH、溫度以及滲透壓）的各種添加劑。作為此類添加劑，可不受限制地使用細胞培養相關技術領域中廣泛已知的各種材料。
並且，微粒子以及細胞的密度可小於培養基。特別言之，微粒子在15℃至25℃下的密度可為0.985公克/立方公分或高於0.985公克/立方公分且低於0.998公克/立方公分，且細胞的密度可在1.10公克/立方公分至1.25公克/立方公分範圍內(約1.2公克/立方公分)。因此，注入培養基中的微粒子可漂浮在培養基中，且隨著貼附至漂浮微粒子的表面的細胞數目逐漸增加，貼附有細胞的微粒子的密度亦逐漸增加，且可沉入含有培養基的容器底部。並且，在培養細胞之後，可經由離心自微粒子-細胞複合物分離細胞來獲得所培養細胞。
[ 有利效果 ]
根據本發明的一個實施例的用於製備微粒子的方法可製備具有均一尺寸以及窄密度範圍的微粒子。因此，所述用於製備微粒子的方法與用於製備微粒子的現有方法相比可展現較高製備產率。微粒子的密度低於水且其範圍極窄，且因此當用作微載體時，其能夠實現高效細胞培養且沒有在細胞培養過程中上浮至培養基表面的問題，且在培養過程之後易於分離以及回收。 [ 圖式簡單說明 ]圖1為能夠實現根據一實施例的微粒子製備方法的裝置的示意圖。 圖2為實例1中製備的微粒子的SEM影像。 圖3為實例2中製備的微粒子的SEM影像。 圖4為比較例1中製備的微粒子的SEM影像。 圖5為比較例3中製備的微粒子的SEM影像。 圖6以及圖7為經拍攝以觀測在將實例1以及實例2中製備的微粒子與密度為0.998公克/立方公分的去離子水以及密度分別為0.995公克/立方公分、0.990公克/立方公分以及0.985公克/立方公分的乙醇水溶液混合之後粒子的懸浮程度的照片。圖6以及圖7中的照片上方的數字指示密度，且單位為公克/立方公分。 [ 符號說明 ]10:第一供應部件 11:第一流道 12:細流道 20:第二供應部件 21:第二流道 31:第三流道 40:排出部件
[ 實施例的詳細描述 ]
在下文中，將參考本發明的特定實例更詳細地描述本發明的作用以及效果。然而，僅出於說明性目的而給出此等實例，且本發明的範疇不以任何方式限制於此。
實例1：微粒子的製備
按100重量份的苯乙烯計，將400重量份的二乙烯苯以及68重量份的Isopar M（低密度油）混合以製備混合物。按100重量份的苯乙烯計，將17重量份的IRGACURE 819（光起始劑）以及5.7重量份的V-65（熱起始劑）添加至所得混合物中以製備分散相組成物。
將十二烷基硫酸鈉（SDS）以0.5重量%的濃度溶解於去離子水中以製備連續相組成物。
經由泵將先前所製備的分散相組成物以及連續相組成物分別注入微流體裝置的第一供應部件10以及第二供應部件20中，如圖1中所示。注入第一供應部件10中的分散相組成物沿第一流道11流動，且經由細流道12供應至第二流道21中以在連續相組成物內形成液滴。含有液滴的懸浮液經由排出部件40排出。
隨後將含有液滴的懸浮液供應至混合區，且與由單獨的泵經由T形連接器供應的4重量%的聚乙烯醇（PVA）水溶液混合。在混合區中使用靜態混合器。
將在混合區中混合的混合物轉移至光聚合區。在光聚合區中，使用UV燈用UV光照射液滴以誘導光聚合反應，且使液滴光聚合約10分鐘。
隨後，將光聚合液滴轉移至熱聚合區。在熱聚合區中，使光聚合液滴在65℃下熱聚合4小時。
在熱聚合之後，所製備的粒子用去離子水洗滌三次且再用乙醇洗滌三次以獲得微粒子。 實例2：微粒子的製備
以與實例1中相同的方式製備微粒子，不同之處在於在實例1中，按100重量份的苯乙烯計，使用400重量份的二乙烯苯、89重量份的Isopar M、17.7重量份的IRGACURE 819（光起始劑）以及5.9重量份的V-65（熱起始劑）。 比較例1：微粒子的製備
按100重量份的苯乙烯計，將33重量份的二乙烯苯以及34重量份的Isopar M混合以製備混合物。
按100重量份的苯乙烯計，將3.5重量份的過氧化苯甲醯以及0.5重量份的過氧化苯甲酸三級丁酯添加至所得混合物中以製備分散相組成物。
將2.5公克重量平均分子量在85,000至125,000範圍內且水解率為87%至89%的聚乙烯醇（PVA）溶解於250公克蒸餾水中以製備連續相組成物。
將50公克的1重量%聚乙烯醇（PVA）水溶液與分散相組成物混合，且在油浴中攪拌混合物直至獲得均勻分散液。特別言之，將油浴在室溫下逐漸加熱同時以800轉/分鐘進行攪拌，且懸浮液聚合在85℃至88℃的溫度下且以600轉/分鐘至800轉/分鐘的速度進行。聚合在氮氣吹掃下進行。
在反應6小時之後，經由100微米篩回收所製備的粒子，用乙醇洗滌5次，且在室溫下乾燥。 比較例2：製備微粒子的方法
以與實例1中相同的方式製備微粒子，不同之處在於其不經歷實例1中的光聚合過程。 比較例3：製備微粒子的方法
以與實例1中相同的方式製備微粒子，不同之處在於其不經歷實例1中的熱聚合過程。 測試實例：微粒子的形狀以及物理特性的評估 （1）粒子形狀的評估
經由掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察微粒子的形狀。
如經由SEM影像所確認，實例1以及實例2提供了表面均勻且尺寸非常均一的球形粒子（參見圖2以及圖3），但比較例1提供了粒子尺寸不均一且粒子表面不均勻的粒子（參見圖4）。在比較例2中，由於聚合溫度突然升高而出現液滴聚集在一起（聚結）的現象，且在比較例3中，沒有形成固化粒子（參見圖5）。 （2）直徑以及其變異係數的評估
經由光學顯微鏡量測100個粒子的直徑，且確定所量測直徑的算術平均值。特別言之，藉由經由光學顯微鏡測定粒子的二維（2D）平面面積，然後反向計算與平面面積相關的公式（S=πr 2）來計算各個別粒子的直徑。此外，由100個粒子的直徑確定變異係數。
在實例1的情況下，粒子直徑為42.3 ± 1.9微米，且直徑的變異係數為約4.4%，但在比較例1的情況下，粒子直徑為130 ± 33微米，且直徑的變異係數為約25.4%。 （3）密度的評估
在室溫（約21℃）以及環境壓力（1標準大氣壓）條件下，將實例1以及實例2中製備的微粒子分別添加至密度為0.998公克/立方公分的去離子水以及密度為0.995公克/立方公分、0.990公克/立方公分以及0.985公克/立方公分的乙醇水溶液中。在添加之後，將含有各溶液的小瓶蓋上，劇烈振盪，且在約5分鐘之後，確認粒子是否漂浮。
在實例1的情況下，如圖6中所示，在密度為0.998公克/立方公分的去離子水中，所有粒子均漂浮，沒有粒子沉降；在密度為0.995公克/立方公分的溶液中，大量粒子漂浮且一些粒子分散；在密度為0.990公克/立方公分的溶液中，大部分粒子沉降且一些粒子分散；且在密度為0.985公克/立方公分的溶液中，所有粒子均沉降。因此，確認實例1的微粒子具有0.990公克/立方公分至0.995公克/立方公分的極窄密度分佈。
在實例2的情況下，如圖7中所示，在密度為0.998公克/立方公分的去離子水以及密度為0.995公克/立方公分的溶液中，所有粒子均漂浮，沒有粒子沉降；在密度為0.990公克/立方公分的溶液中，大部分粒子懸浮且一些粒子分散；且在密度為0.985公克/立方公分的溶液中，所有粒子均沉降。因此，確認實例2的微粒子具有0.985公克/立方公分至0.990公克/立方公分的極窄密度分佈。
另一方面，在比較例1的微粒子的情況下，確認微粒子在密度為0.990公克/立方公分的溶液中漂浮且在密度為0.950公克/立方公分的溶液中沉降，其產生0.950公克/立方公分至0.990公克/立方公分的極寬密度分佈。
經由上述測試實例，確認根據本發明的一個實施例的微粒子製備方法製備的微粒子的表面均勻且具有非常均一的尺寸以及形狀，且具有極窄密度範圍。特別言之，由於尺寸以及形狀的高度均一性以及極窄的密度範圍，可以高產率獲得所需低密度粒子。
在經由懸浮液聚合過程製備的比較例1的情況下，存在在細胞培養過程中具有極低密度的粒子上浮至培養基表面的問題。另一方面，確認在實例1中製備的粒子具有0.990公克/立方公分至0.995公克/立方公分的密度，在實例2中製備的粒子具有0.985公克/立方公分至0.990公克/立方公分的密度，其實現高效細胞培養且沒有在細胞培養過程中上浮至培養基表面的問題，且可提供可在培養過程之後容易分離以及回收的微載體。

Claims (13)

  1. 一種用於製備微粒子的方法，包括以下步驟： a）經由細流道將含有可聚合單體的分散相組成物注入連續相組成物中，以在所述連續相組成物內產生由所述分散相組成物構成的液滴； b）使所述液滴光聚合；以及 c）使所述光聚合液滴熱聚合。
  2. 如請求項1所述的用於製備微粒子的方法，其中所述a）產生液滴利用微流體裝置，所述微流體裝置包括：第一供應部件，經由所述第一供應部件供應所述分散相組成物；第一流道，自所述第一供應部件供應的所述分散相組成物可流動通過所述第一流道；第二供應部件，經由所述第二供應部件供應所述連續相組成物；第二流道，自所述第二供應部件供應的所述連續相組成物可流動通過所述第二流道；以及多個細流道，所述多個細流道將所述第一流道以及所述第二流道的側面彼此連接。
  3. 如請求項1所述的用於製備微粒子的方法，其中所述分散相組成物包括可聚合單體、交聯劑、低密度油、光起始劑以及熱起始劑。
  4. 如請求項3所述的用於製備微粒子的方法，其中按100重量份的所述可聚合單體計，所含有的所述交聯劑的量為10重量份至1000重量份。
  5. 如請求項3所述的用於製備微粒子的方法，其中按100重量份的所述可聚合單體計，所含有的所述低密度油的量為5重量份至100重量份。
  6. 如請求項3所述的用於製備微粒子的方法，其中按100重量份的所述可聚合單體計，所含有的所述光起始劑的量為0.1重量份至30重量份。
  7. 如請求項3所述的用於製備微粒子的方法，其中按100重量份的所述可聚合單體計，所含有的所述熱起始劑的量為0.1重量份至30重量份。
  8. 如請求項1所述的用於製備微粒子的方法，其中所述連續相組成物包括界面活性劑以及水。
  9. 如請求項1所述的用於製備微粒子的方法，更包括在所述c）產生所述液滴之後將所述液滴與另外的連續相組成物混合。
  10. 如請求項1所述的用於製備微粒子的方法，其用作用於細胞培養的微載體。
  11. 如請求項1所述的用於製備微粒子的方法，其製備直徑為10微米至500微米的微粒子。
  12. 如請求項1所述的用於製備微粒子的方法，其中直徑的變異係數為10%或小於10%。
  13. 如請求項1所述的用於製備微粒子的方法，其製備在15℃至25℃下密度為0.985公克/立方公分或高於0.985公克/立方公分且低於0.998公克/立方公分的微粒子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101443981B1 (ko) * 2012-11-29 2014-10-14 포항공과대학교 산학협력단 미세액적 제어를 위한 구조 및 이를 기반으로 제조된 미세액적/미세입자
EP3592787A4 (en) * 2017-03-10 2021-01-20 University of Florida Research Foundation MICROGEL PARTICLES FOR USE IN 3D PRINTING AND 3D CELL GROWTH MEDIA, AND RELATED COMPOSITIONS, SYSTEMS, AND METHODS
US11166920B2 (en) * 2017-10-05 2021-11-09 Auburn University Microfluidics device for fabrication of large, uniform, injectable hydrogel microparticles for cell encapsulation
KR102425901B1 (ko) * 2019-05-02 2022-07-28 숙명여자대학교산학협력단 액적화된 하이드로겔 및 이의 제조방법
JP2021151210A (ja) * 2020-03-25 2021-09-30 東洋インキＳｃホールディングス株式会社 マイクロキャリアおよびそれを用いた細胞の培養方法

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