TW202411243A - 細胞激素融合蛋白質、多核苷酸、表達載體、宿主細胞、藥學組成物以及融合蛋白質的生產方法 - Google Patents

Abstract

本發明是有關於一種包括可特異性誘導免疫細胞靶向域及免疫細胞的增殖及/或活化的細胞激素作用域的細胞激素融合蛋白質。具體而言，本發明是有關於一種將細胞激素（例如，IL-2或IL-15）特異性傳遞至腫瘤內耗竭的免疫細胞（例如耗竭T細胞），從而誘導及增強免疫細胞的活化的融合蛋白質。本發明的融合蛋白質可將促進免疫細胞的增殖或活化的細胞激素選擇性地傳遞至腫瘤微環境內的效應T細胞等，從而不僅可在腫瘤內誘導強烈的免疫增強及抗癌反應，而且藉由細胞激素作用域的獨特結構可顯著減少由細胞激素引起的全身毒性乃至副作用。

Description

細胞激素融合蛋白質

本發明是有關於一種包括免疫細胞靶向域及可特異性誘導免疫細胞的增殖及/或活化的細胞激素作用域的細胞激素融合蛋白質。具體而言，本發明是有關於一種將細胞激素（例如，IL-2或IL-15）特異性傳遞至腫瘤內耗竭的免疫細胞（例如耗竭的T細胞），進而誘導及增強免疫細胞的活化的融合蛋白質。另外，本發明是有關於一種對所述融合蛋白質進行編碼的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體及宿主細胞。另外，本發明是有關於一種所述融合蛋白質的生產方法、以及使用所述融合蛋白質用於治療哺乳動物的疾病（例如癌症）或增強免疫反應的藥學組成物、方法及其用途。

細胞激素是參與免疫系統的調節的細胞訊號傳遞分子。舉例而言，IL-2是參與T細胞的增殖與活化的必需細胞激素。IL-2刺激T細胞的增殖與分化，誘導細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）的生成，且將末梢淋巴細胞分化成細胞毒性細胞與淋巴激素活化殺手細胞（lymphokine-activated killer cell，LAK），刺激自然殺手細胞（natural killer cell）的增殖與活化。

因IL-2如上所述的作用，期待IL-2免疫療法對治療轉移性癌症有效，經過研究，美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了人類重組IL-2（普留淨（Proleukin®），阿地白介素（aldesleukin））用於轉移性腎細胞癌與轉移性黑色素瘤適應症。然而普留淨引起如微血管滲漏症候群（capillary leak syndrome，CLS）等嚴重的副作用，從而限制了施藥對象患者與可施藥的量。另外，半衰期短於2小時以下，因此存在需要重複進行連續5天每天3次IV施藥的循環的不便。

IL-2受體中存在高親和度、中等親和度、低親和度三種受體。高親和度受體由IL-2受體阿爾法（IL-2Rα，CD25）、貝塔（IL-2Rβ，CD122）及伽馬（IL-2Rγ，CD123）三個次單元組成。中等親和度受體由IL-2Rβ與IL-2Rγ組成，且低親和度受體僅由IL-2Rα組成。雖然由β與γ次單元組成的中等親和度受體與由α、β、γ次單元組成的高親和度受體相比與IL-2的親和度還低約100倍，但在與IL-2結合時可傳遞訊號。α-次單元雖然賦予受體高親和度結合能力，但在傳遞訊號方面不是必須的。

休止期的免疫細胞中僅中等親和度的IL-2受體（IL-2Rβγ）表達。當休止期的T細胞因抗原而活化時，IL-2Rα迅速表達，當IL-2與IL-2Rα結合時，IL-2Rβ與IL-2Rγ參與其中。藉由該IL-2Rαβγ複合物與IL-2的結合發生訊號傳遞，從而促進包括可殺死被病毒感染的細胞或腫瘤細胞的細胞毒性T細胞在內的效應T細胞（T _eff）的生長。

另外，IL-2介導T細胞的活化-誘導細胞死亡（activation-induced cell death，AICD）。AICD是完全活化的T細胞經歷程式性細胞死亡的過程，因此不僅對正常的自身抗原，而且對如腫瘤抗原等持續存在的抗原也會產生免疫寬容。

IL-2亦參與維持末梢CD4 ⁺CD25 ⁺調節T細胞（T _reg）。在調節T細胞中持久地表達IL-2Rα。調節T細胞抑制細胞毒性T細胞攻擊自身抗原或腫瘤細胞的功能。由於此種IL-2的多方面的作用，IL-2不適合展現最佳的腫瘤抑制效果。

為了減少IL-2的毒性並增強腫瘤抑制效果，已經進行了各種嘗試。作為一例，已經嘗試了抑制IL-2與IL-2Rα結合的策略，用於使IL-2可作用於T _eff細胞的中等親和度IL-2Rβγ而並非T _reg細胞的高親和度IL-2Rβγ受體。作為其例子，具有如抗-IL-2單克隆（monoclonal）抗體與IL-2的組合（神村（Kamimura）等人，免疫學雜誌（J Immunol）177，306-14（2006）；博伊曼（Boyman）等人，科學（Science）311，1924-27（2006））、在與IL-2Rα的結合部位引入突變的IL-2變異體（WO2012/107417等）、在IL-2Rα結合部位引入聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）基的IL-2（WO2012/065086）等。

但是迄今為止開發的IL-2變異體仍然作為抗癌劑的治療指數（therapeutic index）是不佳的，且即便以表現出毒性的高容量施藥，抗癌效果亦不明顯。其原因認為是由於IL-2變異體以選擇性地作用於T _eff細胞而非T _reg細胞的方式製成，但主要在末梢表現出此種作用且在腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中的此種作用不充分。

為了克服此種缺點，進行了用於使IL-2變異體可在腫瘤組織中起作用的研究，且嘗試了使腫瘤相關抗原（tumor associated antigen，TAA）-特異性抗體與IL-2結合從而將IL-2帶入腫瘤組織的策略。然而，雖然此種策略可將IL-2誘導至腫瘤部位，但難以在腫瘤內的T _eff細胞中有效地提供IL-2。需要可選擇性地對各種腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrated lymphocyte，TIL）中的T _eff細胞提供IL-2的方法。

不僅IL-2，其他細胞激素（例：IL-15）亦可在腫瘤微環境中起到誘導免疫活性或免疫抑制的重要的媒介作用，且此種細胞激素是在免疫細胞中分泌的物質，大體局部作用於多種靶，從而起到使微環境變化的作用。但是該些細胞激素亦具有局部作用短並消失的特性，從而難以開發成治療劑。

[發明所欲解決之課題]

本發明人欲開發一種有效的細胞激素治療劑，所述細胞激素治療劑使腫瘤微環境中耗竭的免疫細胞選擇性活化，從而在增強抗癌活性的同時亦減少由外源性細胞激素引起的全身副作用。 [解決課題之手段]

本發明是有關於一種包括免疫細胞靶向域及可特異性誘導免疫細胞的增殖及/或活化的細胞激素作用域的融合蛋白質。本發明人為了使促進免疫細胞的增殖或活化的細胞激素不對存在於末梢的其他免疫細胞或內皮細胞等造成影響，同時可選擇性地傳遞至TME環境的T _eff細胞，設計了將細胞激素作用域連接至以免疫細胞為靶的抗體域，兩個域以「順式（in-cis）」方式作用於腫瘤內T _eff細胞的融合蛋白質。

本發明提供一種包括一個以上免疫細胞抗原結合域、由兩個Fc鏈形成的Fc域及細胞激素作用域的融合蛋白質。在本發明的一方面，所述細胞激素作用域是促進免疫細胞的增殖或活化的細胞激素或與所述細胞激素結合的域。所述細胞激素可使用自外部注入的外源性細胞激素或存在於內部的內源性細胞激素。作為此種細胞激素，可使用可與IL-2受體的β-次單元（IL-2Rβ）及共同γ鏈受體（亦可稱為IL-2Rγ）結合並誘導藉由IL-2Rβγ進行的訊號傳遞活化的IL-2多肽及IL-15多肽。

在一方面，本發明提供一種融合蛋白質，所述融合蛋白質包括一個以上免疫細胞抗原結合域、由兩個Fc鏈形成的Fc域及細胞激素作用域，所述細胞激素作用域包括白血球介素-2受體的α-次單元（IL-2Rα）多肽及IL-2多肽，所述IL-2Rα多肽及IL-2多肽彼此間不進行共價鍵結且分別連接至所述Fc域的彼此不同的Fc鏈。

此種結構的本發明的融合蛋白質由於IL-2被IL-2Rα搶佔，因此與表達高親和度IL-2受體（或簡稱為IL-2Rαβγ）的調節T細胞（T _reg）、Foxp3-陰性CD4 T細胞、一部分先天性淋巴細胞或其他內皮（endothelial）細胞的結合力弱化，相比之下，在不存在IL-2Rα時可與表達由IL-2Rβ及IL-2Rγ組成的中等親和度IL-2受體（或簡稱為IL-2Rβγ）的細胞毒性CD8+ T細胞、記憶T細胞、NK-T細胞等T _eff細胞特異性結合，從而可增強抗癌效果且顯著減少全身毒性或副作用。

在一方面，本發明提供一種融合蛋白質，所述融合蛋白質包括一個以上免疫細胞抗原結合域、由兩個Fc鏈形成的Fc域及細胞激素作用域，所述細胞激素作用域為IL-2Rα多肽與IL-2多肽彼此共價鍵結的複合體，且所述複合體藉由IL-2Rα多肽或IL-2多肽與所述Fc域任一側的Fc鏈結合。

在一方面，本發明提供一種融合蛋白質，所述融合蛋白質包括一個以上免疫細胞抗原結合域、由兩個Fc鏈形成的Fc域及細胞激素作用域，所述細胞激素作用域包括白血球介素-15受體的α-次單元（IL-15Rα）多肽及IL-15多肽，所述IL-15Rα多肽及IL-15多肽分別連接至所述Fc域的彼此不同的Fc鏈。

在一方面，本發明提供一種融合蛋白質，所述融合蛋白質包括一個以上免疫細胞抗原結合域、由兩個Fc鏈形成的Fc域及細胞激素作用域，所述細胞激素作用域為IL-15Rα多肽與IL-15多肽彼此共價鍵結的複合體，且所述複合體藉由IL-15Rα多肽或IL-15多肽與所述Fc域任一側的Fc鏈結合。

在一方面，本發明提供一種融合蛋白質，所述融合蛋白質包括一個以上免疫細胞抗原結合域、由兩個Fc鏈形成的Fc域及細胞激素作用域，所述細胞激素作用域不包括IL-2多肽及IL-15多肽而僅包括IL-2Rα多肽或IL-15Rα多肽，從而可與內源性IL-2或IL-15結合並將其誘導至T _eff細胞。

在本發明的一方面，所述IL-2Rα多肽包括具有本說明書隨附序列目錄的SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的野生型成熟IL-2Rα多肽或IL-2Rα多肽的IL-2結合片段、細胞外（extracellular）域或斯世（Sushi）域或其變異體。

在本發明的一方面，所述IL-15Rα多肽包括具有本說明書隨附序列目錄的SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的野生型成熟IL-15Rα多肽或IL-15Rα多肽的IL-15結合片段、細胞外（extracellular）域或斯世（Sushi）域或其變異體。

在本發明的一方面，所述IL-2Rα多肽及IL-15Rα多肽可包括提高與各自的結合配位體、即IL-2多肽及IL-15多肽的結合親和力的一種以上胺基酸修飾（modification），較佳為胺基酸置換。在例示性方面，本發明的融合蛋白質包括IL-2Rα變異體，所述IL-2Rα變異體包括以SEQ ID NO: 3的胺基酸序列號為基準以下中的一個以上的胺基酸置換：L2D、L2E、L2Q、M25L、M25I、N27A、N27T、N27I、N27Y、S39K、L42F、L42I、L42A、L42V、L45R、N57E、I118R、H120A、H120D、H120K、H120Y、H120L、H120W、H120R及K153G。在較佳的方面，本發明的融合蛋白質包括IL-2Rα變異體，所述IL-2Rα變異體包括以SEQ ID NO: 3的胺基酸序列號為基準L42I胺基酸置換。

在本發明的一方面，所述IL-2多肽包括具有本說明書隨附序列目錄的SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的野生型成熟IL-2多肽或其C125S變異體（SEQ ID NO: 2）或循環置換的（循環排列的（circular permutated））變異體。在本發明的一方面，所述IL-15多肽包括具有本說明書隨附序列目錄的SEQ ID NO: 6的野生型成熟IL-15多肽或其循環置換的變異體。在本發明的一方面，所述IL-2多肽或IL-15多肽可包括提高與各自的結合受體的α-次單元的結合親和力的一種以上胺基酸修飾。在較佳的方面，本發明的融合蛋白質包括IL-2變異體，所述IL-2變異體包括以SEQ ID NO: 1的胺基酸序列號為基準T37K胺基酸置換。

在本發明的一方面，所述免疫細胞抗原結合域包含與一種以上T細胞靶抗原特異性結合的抗體的Fab分子或其抗原結合片段。在本發明的一方面，所述免疫細胞抗原結合域包含與在腫瘤微環境內的T _eff細胞中表達的免疫查核點（immune checkpoint）蛋白質（例：程式性細胞死亡-1（programmed death-1，PD-1）蛋白質）特異性結合的抗體的Fab分子或抗體的抗原結合片段。在本發明的一方面，所述免疫細胞抗原結合域可為可與可對腫瘤微環境內T _eff細胞賦予結合特異性的CD8+效應T細胞的表面標記結合的成分、抗體或其抗原結合片段。在較佳的方面，本發明的所述免疫細胞抗原結合域為抗PD-1抗體的Fab分子或抗體的抗原結合片段。在例示性方面，本發明的免疫細胞抗原結合域為帕博利珠單抗（pembrolizumab）或納武單抗（nivolumab）抗體的Fab分子或其抗原結合片段、或者為與和該些抗體或抗原結合片段相同的抗原決定區（epitope）結合或與該些抗體或抗原結合片段競爭的抗體的Fab分子或其抗原結合片段。較佳為本發明的融合蛋白質包括免疫細胞抗原結合域，所述免疫細胞抗原結合域包括包含以下的抗PD-1抗體的Fab分子或其抗原結合片段：包含本說明書隨附序列目錄的SEQ ID NO: 38、40、42或44的胺基酸序列的重鏈可變區的互補性決定區（complementarity determining region，CDR）1、CDR2及CDR3；以及包含SEQ ID NO: 39、41、43或45的胺基酸序列的輕鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3。

在本發明的一方面，所述免疫細胞抗原結合域可為包括2個以上不同的T細胞靶抗原結合域的多特異性結合域。在本發明的一方面，本發明的融合蛋白質可包括與一種以上腫瘤細胞靶抗原特異性結合的抗體的Fab分子或其抗原結合片段作為額外的抗原結合域。

在本發明的一方面，所述Fc域可為第一鏈與第二鏈彼此相同的同二聚體或彼此不同的異二聚體。在本發明的一方面，所述Fc域為人類IgG類Fc域。在本發明的一方面，所述Fc域為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類Fc域。在本發明的一方面，於所述Fc域為IgG4 Fc域的情況，較佳為包括S228P的胺基酸置換（以卡巴（Kabat）文獻的EU編號系統為基準）。在本發明的一方面，所述Fc域缺少CH2域而可僅由CH3域組成。另外，本發明的所述Fc域可包括使與Fc受體的結合或效用功能（effector function）降低的一種以上的胺基酸修飾。在例示性方面，此種Fc域的修飾包括在選自E233、L234、L235、G236、G237、N297、L328、P329及P331中的一個以上位置（以卡巴文獻的EU編號系統為基準）處的胺基酸修飾，但不限定於此。

在本發明的一方面，所述Fc域可包括用於促進兩個Fc鏈間的異二聚體形成的修飾。在例示性方面，此種Fc域的修飾可包括杵入臼（knob-into-hole）修飾、杵入臼二硫化物（knob-into-hole disulfide）修飾等。在較佳的方面，本發明的融合蛋白質包括所述杵入臼（knob-into-hole）修飾或杵入臼二硫化物（knob-into-hole disulfide）修飾，以及任一Fc鏈更包括K360E的胺基酸置換且另一Fc鏈更包括Q347R的胺基酸置換，或者任一Fc鏈更包括K360E及Q347E的胺基酸置換且另一Fc鏈更包括Q347R的胺基酸置換或K360R及Q347R的胺基酸置換的Fc域變異體。

在本發明的一方面，所述免疫細胞抗原結合域及細胞激素作用域可直接連接至Fc域或藉由連接子（linker）連接至Fc域。在本發明的一方面，所述免疫細胞抗原結合域連接至Fc域的N-末端，細胞激素作用域連接至Fc域的C-末端，或者可採取與之相反的結構。在本發明的一方面，所述連接子較佳為肽連接子，但不限定於此。

本發明的又一方面提供對所述融合蛋白質或其各區進行編碼的多核苷酸（polynucleotide）、包括所述多核苷酸的載體、或引入所述載體的轉化細胞。本發明的又一方面提供一種包括所述載體的宿主細胞，且提供一種培養所述宿主細胞來生產本發明的融合蛋白質的方法。

本發明的又一方面提供一種包含所述融合蛋白質作為有效成分的用以預防、改善或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症或感染性疾病的藥學組成物。本發明的又一方面提供一種方法，所述方法藉由向需要預防、改善或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症或感染性疾病的個體施用所述融合蛋白質來預防、改善或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症或感染性疾病。 [發明的效果]

根據本發明，可提供一種有效的抗癌細胞激素治療劑，所述抗癌細胞激素治療劑在腫瘤微環境中使細胞毒性效應T細胞選擇性活化，從而在增強抗癌活性的同時減少全身副作用。

在本發明中，「蛋白質」或「多肽」解釋為包括作為利用至少兩個共價鍵附著的胺基酸的寡肽（oligopeptide）的概念。在本發明中，「A蛋白質」或「A多肽」可解釋為包括作為親本的A蛋白質或A多肽的全部或一部分、其類似體及突變體的概念。另外，「突變」、「修飾」及「變異體」是包括胺基酸殘基的置換、插入及/或缺失的含義，較佳為本發明的突變體可包括胺基酸殘基的置換。胺基酸殘基的置換可按照作為親本的野生型蛋白質中存在的胺基酸殘基、胺基酸殘基的編號及經置換的胺基酸殘基的順序表示。

在本發明中，「融合蛋白質」可解釋為包括兩個以上蛋白質彼此結合的形態或包括所述形態的複合體的含義。

在本發明中，用語「程式性細胞死亡-1」、「PD-1」、「PD-1蛋白質」相互交換地使用，包括變異體、同型、人類PD-1的物種同源物、及具有與至少一個PD-1共同的抗原決定區的相似物。

在本發明中，用語「抗體」包括整個抗體及任意的「抗原結合部分（portion）」或其單鏈。「抗體」指包括藉由二硫鍵（disulfide bond）相互連接的至少兩個重鏈及兩個輕鏈的蛋白質或其抗原結合部分。各重鏈由重鏈可變區及重鏈恆定區形成。重鏈恆定區由三個域、即CH1、CH2及CH3形成。各輕鏈由輕鏈可變區及輕鏈恆定區形成。輕鏈恆定區由一個域、即CL形成。重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）可額外地細分化為被稱為互補性決定區（CDR）的超變異性（hypervariability）區，該區配置於更保守的被稱為架構區（framework regions）（FR）的區之間。各VH及VL由三個CDR及四個FR形成，且自胺基末端至羧基末端按照以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區含有與抗原進行相互作用的結合域。

在本發明中，「抗體」包括多克隆性、單克隆性、單特異性、多特異性、非特異性、人源化、單鏈、嵌合體、合成的、重組、雜交（hybrid）、突變的、及移植（grafted）抗體，但不限定於此。所述用語「抗原結合部分」包括任意抗體片段且包括保持抗原結合功能、即與抗原特異性結合的能力的所有抗體片段。典型地，此種抗原結合部分包括抗原結合片段。

本發明的用語「抗原結合域」是可與靶抗原結合的任意域的總稱，包括肽、蛋白質、抗體、適配體（aptamer）、化學殘基等。於本發明的融合蛋白質包括抗體作為抗原結合域的情況，不僅可包括整個抗體，而且可包括其抗原結合部分、Fab分子或抗原結合片段作為抗原結合域。所述用語「Fab分子」是在重鏈及輕鏈中分別具有各一個恆定區與可變區的部位，可部分包括樞紐區或部分變形。本發明中使用的用語「Fab分子」包括Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fab'-SH等且定義為包括所有抗體可能的抗原結合部位的含義。

在本發明中，抗體的「抗原結合部分」、「抗原識別部位」、「抗原結合域」、「抗原結合片段」、及「結合片段」指包括作為抗體與抗原之間特異性結合的原因的胺基酸的抗體分子的一部分。例如，於抗原大的情況下，抗原結合片段可僅結合至抗原的一部分。將成為與抗原分子的抗原結合片段特異性相互作用的原因的部分稱為「抗原決定區」或「抗原決定位（antigenic determinant）」。在本發明中可使用的「抗原結合部分」、「抗原識別部位」、「抗原結合域」、「抗原結合片段」及「結合片段」的例子中存在Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fab'-SH、Fd、Fv、單鏈可變區片段（single chain variable fragment，scFv）、(scFv) ₂、scFv-Fc、(scFv) ₂-Fc、二硫鍵穩定性Fv片段（disulfide-stabilized Fv fragment，dsFv）、(dsFv) ₂、dsFv-dsFv'、VL、VH、雙抗體（diabody）、雙鏈（double strands，ds）雙抗體、三抗體（triabody）、四抗體（tetrabody）、微型抗體（(scFV-CH ₃) ₂）、奈米抗體、域抗體、單域抗體（sdAb）、二價域抗體、IgG德爾塔CH2、飛諾莫（Fynomer）、與抗體融合的飛諾莫（fynomers fused to antibodies，FynomAbs）、雙親和再靶向（dual-affinity re-targeting，DART）、白蛋白結合域抗體（albumin-binding domain antibodies，AlbudAbs）、雙特異性T細胞銜接器（bispecific T-cell engager，BiTE）、串聯雙功能抗體（tandem diabodies，TandAbs）、雙重作用Fab（dual acting Fab，DAF）、二合一抗體（two-in-one antibodies）、小型模組化免疫藥物（small modular immunopharmaceutical，SMIP）、抗鈣素（anticalins）、FN3單體（monobody）、預設計錨蛋白重複蛋白（designed ankyrin repeat protein，DARPin）、親和體（Affibodies）、Affilins、黏合素（Affimers）、Affitins、阿爾法抗體（Alphabodies）、Avimers、Im7、可變淋巴細胞受體（variable lymphocyte receptor，VLR）、可變新抗原受體（variable new antigen receptor，VNAR）、Trimab、交叉單克隆抗體（Cross monoclonal antibody，CrossMab）、三叉戟（TRIDENT）、雙奈米抗體（binanobodies）、雙-sdFv、雙可變域免疫球蛋白（dual variable domain immunoglobulin，DVD-Ig）、CovX-bodies（肽修飾抗體（peptide modified antibodies））、杜歐抗體（Duobody）及triomAbs等，但不限定於此。

雖然所述抗原結合片段可包括抗體輕鏈可變區（VL）及抗體重鏈可變區（VH），但並非必須包括兩者全部。例如，雖然所謂Fd抗體片段僅由VH域形成，但仍然稍微保持完整的抗體的抗原結合功能。

融合蛋白質本發明的融合蛋白質包括一個以上免疫細胞抗原結合域、由兩個Fc鏈形成的Fc域及細胞激素作用域。在本發明中，一個以上免疫細胞抗原結合域是與具有抗腫瘤作用的如CD8+效應T細胞等期望的靶免疫細胞上的表面標記結合並使細胞激素區傳遞至靶細胞的融合蛋白質的構成成分。在本發明中，免疫細胞抗原結合域較佳為抗PD-1抗體或抗PD-1抗體的抗原結合片段。本發明的融合蛋白質因免疫細胞抗原結合域的存在，可使細胞激素選擇性地傳遞至表達相應靶的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrated lymphocyte），從而可將對末梢血液的NK細胞或T細胞的影響最小化。另外，所述免疫細胞抗原結合域可為與例如NKG2a、CD8a、FcRL6、CRTAM、LAG3、TIM3、CTLA4、TIGIT等選擇性結合的成分、抗體或其抗原結合片段。

本發明的融合蛋白質如圖1a及圖1b所示可具有一個或兩個Fab臂。或者如圖1c所示，兩個Fab臂可針對彼此不同的靶。舉例而言，於免疫細胞抗原結合域為一個抗PD-1抗體或抗PD-1抗體的抗原結合片段的情況，可更包括針對選自由NKG2a、CD8a、FcRL6、CRTAM、LAG3、TIM3、CTLA4及TIGIT組成的群組中的一種以上靶的Fab臂。或者本發明的融合蛋白質可更包括將腫瘤細胞作為靶的Fab臂作為抗原結合域。

在本發明的一實例中，細胞激素作用域被設計成與T _reg細胞相比可優先使細胞毒性T _eff細胞活化。在本發明的一實例中，細胞激素作用域包括藉由在耗竭的T _eff細胞中持久表達的IL-2Rβγ進行的訊號傳遞活化部分，例如IL-2多肽或IL-15多肽。在本發明的一實例中，細胞激素作用域亦包括IL-2Rα及IL-2，以阻礙由IL-2帶來的在末梢血的免疫細胞或內皮細胞中表達的高親和度IL-2受體（IL-2Rαβγ）結合。被IL-2Rα預先搶佔的形態的IL-2無法與高親和度IL-2受體結合。在本發明的一實例中，細胞激素作用域包括IL-2蛋白質與IL-2Rα蛋白質，且IL-2與IL-2Rα如圖1a至圖1c所示分別連接至兩個Fc鏈且彼此間不進行共價鍵結。IL-2與IL-2Rα藉由連接子連接至Fc鏈或直接連接至Fc鏈。在一實例中，連接子可為肽連接子，例如可為(GGGX)n、(XGGG)nXGG、(GGGGX)n、(GX)n（X=A或S，n=1,2,3或4）、SGGGSGGGSGGGSGG、GGGSGGGSGGGSGG等，但不限定於該些。在一實例中，連接子可為由大約5至20個胺基酸形成的肽連接子，但不限定於此，可使用合適地保持細胞激素作用域的搶佔結構並保持將細胞激素作用域傳遞至靶細胞的功能的一個任意的結構及長度的連接子。在一實例中，所述肽連接子可由選自由G、S、A、P、E、T、D及K組成的群組中的一種以上的胺基酸組成。

在本發明的一實例中，細胞激素作用域可包括IL-15與IL-15Rα。圖2b是細胞激素作用域包括IL-15與IL-15Rα的複合體的情況的例子。在本發明的一實例中，細胞激素作用域亦可包括共價鍵結的IL-2/IL-2α複合體（圖2a）或共價鍵結的IL-15/IL-15α複合體（圖2b）。

在本發明的一實例中，細胞激素作用域可不包括IL-2及IL-15而僅包括IL-2Rα蛋白質或IL-15Rα蛋白質（圖3a至圖3d）。在該實例中，IL-2Rα蛋白質與內源性IL-2結合，將IL-2輸送至表達靶向的細胞（例：表達PD-1的T細胞），但與始終表達IL-2Rα的T _reg細胞相比，優先使表達IL-2Rβ與γ的T _eff細胞增殖及活化。在該實例中，IL-2Rα或IL-15Rα可均與兩個Fc鏈結合並形成同二聚體（homodimer），亦可僅與一個Fc鏈結合並形成異二聚體（heterodimer）。

在本發明的一實例中，細胞激素作用域較佳為利用其自身無法進行充分的細胞激素訊號傳遞，但在與免疫細胞抗原結合域結合的融合蛋白質的形態下選擇性地靶向期望的細胞（表達靶的細胞），從而使細胞活化。相比之下，不使表達細胞激素受體但不表達靶的細胞活化或使其活化程度變弱。舉例而言，在本發明的一實例中，包括IL-2與IL-2Rα的細胞激素作用域在不表達PD-1的T細胞中與野生型IL-2相比，對IL-2Rβγ受體的結合力弱，且實質上不具有對IL-2Rα受體的結合力。但是，在與抗PD-1抗體結合的融合蛋白質的形態下，在對同時表達PD-1與IL-2Rβγ受體的細胞毒性CD8+ T細胞靶向後，藉由充分的訊號傳遞刺激細胞的增殖及活化，從而表現出優異的抗癌活性。但是，對於不表達PD-1的細胞而言，活性弱或幾乎沒有活性，從而可減少在末梢血液中由細胞激素的活性引起的副作用（例如毛細血管滲漏症候群）、由過度活化的NK細胞引起的全身毒性等。

IL-2 蛋白質在本發明中，除非另有說明，否則「白血球介素-2」、「IL-2」、「IL-2蛋白質」、或「IL-2多肽」包括來自包含哺乳動物（例如靈長類（例：人類））及囓齒類（例：小鼠及大鼠）的脊椎動物的IL-2。此情形不僅包括未加工（unprocessed）的IL-2，而且包括在細胞中經加工的（processing）的任意形態的IL-2。此用語亦包括自然產生的變異體或以下定義的「IL-2突變體」。全長人類IL-2意指成熟的自然長度的人類IL-2，是具有SEQ ID NO: 1的133個胺基酸的分子。未加工的人類IL-2更包括在成熟IL-2分子中不存在的20個N-末端胺基酸。

用語「IL-2突變體」包括各種形態的IL-2分子的突變形態，所述IL-2分子的突變形態包括全長IL-2、截斷形態的IL-2、或IL-2連接至其他分子的形態。IL-2突變體可包括對與IL-2Rα多肽的相互作用造成影響或增加對IL-2Rα多肽的結合的一種以上的胺基酸變形。該突變可包括野生型胺基酸殘基的置換、缺失、截斷或修飾。可列舉以SEQ ID NO: 1的胺基酸序列號為基準T37K的胺基酸置換作為增加對IL-2Rα多肽的結合的胺基酸修飾的例子。

在本發明中，IL-2蛋白質可為全長人類IL-2（SEQ ID NO: 1）。另外，舉例而言，為了防止生成不準確的二硫鍵，可包括將SEQ ID NO: 1的IL-2的125號位置的半胱胺酸換成絲胺酸的突變（C125S，SEQ ID NO: 2）。另外，為了縮短連接子的長度，亦可為更換IL-2的N-末端與C-末端位置的循環置換的形式（circular permutated form）。

在本發明中，「IL-2多肽」包括具有與SEQ ID NO: 1的人類IL-2序列序列同一性為約90%以上、約91%以上、約92%以上、約93%以上、約94%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上的胺基酸序列的IL-2蛋白質。

IL-2Rα 蛋白質在本發明中，除非另有說明，否則「IL-2Rα蛋白質」、「IL-2Rα多肽」、「IL-2Rα」、「CD25」或「白血球介素-2受體α-次單元」意指來自包括哺乳動物（例如靈長類（例：人類））及囓齒類（例：小鼠及大鼠）的脊椎動物的IL-2受體的α-次單元。該用語不僅包括未加工IL-2Rα，而且包括在細胞內經加工的任意形態的IL-2Rα。該用語亦包括自然產生的變異體或以下定義的「IL-2Rα的突變體」。在本發明中，作為基準的人類IL-2Rα多肽具有由272個胺基酸組成的蛋白質資料庫（Universal Protein，UniProt）P01589的22號至272號胺基酸序列（SEQ ID NO: 3）。在本發明中，「IL-2Rα多肽」可為具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的IL-2Rα多肽或IL-2Rα多肽的IL-2結合片段、對應於UniProt P01589的22號至240號位置的細胞外域（SEQ ID NO: 4）或其一部分、或斯世（Sushi）域。本發明的用語「IL-2Rα多肽的IL-2結合片段」意指作為在IL-2Rα多肽的細胞外域中自C-末端向N-末端方向截斷的（truncated）任意長度的片段，將對IL-2Rα多肽的結合配位體、即IL-2的結合活性與原本的完全結合活性相比保持至少90%以上的片段。

在本發明中，「IL-2Rα突變體」意指在包括IL-2Rα的細胞外域（SEQ ID NO: 4）、截斷形態的IL-2Rα、或IL-2Rα連接至其他分子的形態在內的各種形態的IL-2Rα分子中在對與IL-2的相互作用造成影響的一個以上位置處包括突變的IL-2Rα蛋白質。該突變可包括野生型胺基酸殘基的置換、缺失、截斷或修飾。

在本發明中，「IL-2Rα突變體」可將突變包含於IL-Rα的胺基酸序列中，以藉由提高IL-Rα與IL-2的親和度來穩定複合體。在本發明中，IL-2Rα的突變的位置以SEQ ID NO: 4的序列為基準。舉例而言，本發明的IL-2Rα突變體可在SEQ ID NO: 4的IL-2Rα的細胞外域或其截斷形態下在L2、M25、N27、S39、L42、L45、N57、I118、H120及K153中的一個以上位置處包括胺基酸置換。在本發明中，IL-2Rα突變體可包括L2D、L2E、L2Q、M25L、M25I、N27A、N27T、N27I、N27Y、S39K、L42F、L42I、L42A、L42V、L45R、N57E、I118R、H120A、H120D、H120K、H120Y、H120L、H120W、H120R及K153G中的一種以上的胺基酸置換。另外，本發明的IL-2Rα突變體可包括F121A、V122A及A114D中的一個以上的突變。

在本發明中，例示性的IL-2Rα突變體可為在IL-2Rα的細胞外域的截斷形態下具有L42I胺基酸置換的SEQ ID NO: 5的突變體，但不限定於此。

IL-15/IL-15RαIL-15在感染病毒後由包括單核吞噬細胞在內的免疫細胞分泌。IL-15誘導NK細胞與免疫系統的其他細胞的增殖且參與殺死被病毒感染的細胞及癌細胞。IL-15亦與中等親和度IL-2Rβγ受體結合，但以高得多的親和度與IL-15Rα受體結合。IL-15Rα與IL-2βγ結合並形成功能性的高親和度受體αβγ。

在本發明中，除非另有說明，否則「白血球介素-15」、「IL-15」、「IL-15蛋白質」、或「IL-15多肽」包括來自包含哺乳動物（例如靈長類（例：人類））及囓齒類（例：小鼠及大鼠）的脊椎動物的IL-15。在本發明中，IL-15多肽可為具有Uniprot P40933的49號至162號胺基酸序列的人類IL-15多肽（SEQ ID NO: 6）或至少一部分保持IL-15的活性的IL-15多肽的變異體。另外，IL-15多肽可包括增加對IL-15Rα多肽的結合的一種以上的胺基酸修飾或進行循環置換（circular permutated）。

在本發明中，除非另有說明，否則「IL-15Rα蛋白質」、「IL-15Rα多肽」、「IL-15Rα」、「CD215」或「白血球介素-15受體α」意指來自包括哺乳動物（例如靈長類（例：人類））及囓齒類（例：小鼠及大鼠）的脊椎動物的IL-15受體的α-次單元。在本發明中，IL-15Rα蛋白質可為至少一部分保持人類IL-15Rα或IL-15Rα的活性的截斷形態或突變體。在本發明中，作為基準的人類IL-15Rα多肽具有UniProt Q13261的31號至267號胺基酸序列（SEQ ID NO: 7）。在本發明中，IL-15Rα多肽可為具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的IL-15Rα多肽或IL-15Rα多肽的IL-15結合片段、細胞外（extracellular）域（SEQ ID NO: 8）或斯世（Sushi）域，且可包括增加對結合配位體IL-15多肽的結合的一種以上的胺基酸修飾。本發明的用語「IL-15Rα多肽的IL-15結合片段」意指作為在IL-15Rα多肽的細胞外域中自C-末端向N-末端方向截斷的（truncated）任意長度的片段，將對IL-15Rα多肽的結合配位體、即IL-15的結合活性與原本的完全結合活性相比保持至少90%以上的片段。

抗 PD-1 抗體或其抗原結合片段在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段意指可與PD-1、特別是細胞表面表達的PD-1多肽結合的抗體或其抗原結合片段。在一部分實例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段以KD值10 ^-7M以下結合至PD-1；在一部分實例中，以KD值10 ^-8M、10 ^-9M、10 ^-10M或10 ^-11M以下結合至PD-1。在一部分實例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段即便於低pH環境下亦以KD值10 ^-9M以下，較佳為KD值10 ^-10M以下、更佳為KD值10 ^-11M以下結合至PD-1。在一部分實例中，本發明的抗PD-1抗體或其抗原結合片段於pH 6.0下以9×10 ^-10M以下的KD結合至PD-1。

在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，較佳為重鏈可變區包括：重鏈互補性決定區1（heavy chain complementarity-determining region 1，HCDR1），包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列；HCDR2，包含選自由SEQ ID NO: 10至15組成的群組的任一胺基酸序列；以及HCDR3，包含選自由SEQ ID NO: 16至31組成的群組的任一胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸置換或三個以下的胺基酸突變的HCDR變異體；輕鏈可變區包括：輕鏈互補性決定區1（LCDR1），包含選自由SEQ ID NO: 32至35組成的群組的任一胺基酸序列；LCDR2，包含SEQ ID NO: 36的胺基酸序列；以及LCDR3，包含SEQ ID NO: 37的胺基酸序列，或者包括與該些序列相比具有保守胺基酸置換或三個以下的胺基酸突變的LCDR變異體。

在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，較佳為重鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 38、40、42或44的胺基酸序列的重鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3，或者輕鏈可變區包括包含SEQ ID NO: 39、41、43或45的胺基酸序列的輕鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3。

確定特定的VH區或VL區內的CDR序列的方法在相關領域是公知的，包括卡巴（Kabat）編號系統、柯西亞（Chothia）編號系統、馬丁（Martin）編號系統、蓋爾範德（Gelfand）編號系統及國際免疫遺傳學資訊系統（international immunogenetics information system，IMGT）編號系統等（參照唐德林格（Dondelinger）等人， 免疫學前沿（ Front. Immunol.）（2018） 9:2278等）。根據本發明的較佳實例的抗體或其功能性片段可包括根據卡巴編號系統的CDR序列，但不限定於此。SEQ ID NO: 38至45的可變區序列中包括可根據公知的CDR確定方法定義的CDR序列的抗體或其功能性片段全部包括在本發明的範疇內。

在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，較佳為重鏈可變區包括如由SEQ ID NO: 38、40、42或44表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下胺基酸突變的變異體；輕鏈可變區包括如由SEQ ID NO: 39、41、43或45表示的序列，或者包括與該些序列相比具有1至10個以下胺基酸突變的變異體。

在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區可具有與SEQ ID NO: 38、40、42或44的胺基酸序列序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上的胺基酸序列。

在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區可具有與SEQ ID NO: 39、41、43或45的胺基酸序列序列同一性至少為75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上的胺基酸序列。

所謂「保守胺基酸置換」是胺基酸殘基被具有具有相似的化學特性（例：電荷或疏水性）的側鏈（R基團）的又一胺基酸殘基置換。一般而言，保守胺基酸置換實質上不會使蛋白質的功能特性變化。於兩個以上的胺基酸序列因保守置換彼此不同的情況下，可向上調整相似率或相似度以對置換的保守性質進行修正。用於進行此種調整的手段為相關領域技術人員所熟知。例如，參照作為參照包含於本案的文獻（參照：皮爾遜（Pearson）（1994）分子生物學方法（Methods Mol. Biol.）24：307-331）。具有具有相似的化學特性的側鏈的胺基酸基團的例子包括：1）鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；2）酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；3）非電荷極性側鏈：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及半胱胺酸；4）非極性側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；5）含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸；6）脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸及脯胺酸；7）脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；8）含醯胺側鏈：天冬醯胺酸及麩醯胺酸；及9）芳香族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及組胺酸。較佳的保守胺酸置換基團為纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺酸-麩醯胺酸。作為代替方案，保守替代是在作為參照包含於本案的文獻（參照：貢內特（Gonnet）等人（1992）科學（Science）256：1443 45）所揭示的可接受點突變（point accepted mutation，PAM）250對數可能性矩陣（log-likelihood matrix）中具有正值的任意變化。「中度（moderately）保守」替代是在PAM250對數可能性矩陣中具有非負的（nonnegative）值的任意變化。在本發明中，限定為特定序列的抗體或其抗原結合片段的範圍定義為亦包括具有相應序列的保守置換的序列。

在一部分實例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段可為重組抗體，較佳為鼠類（murine）抗體、嵌合（chimeric）抗體、人源化（humanized）抗體或人類抗體。

在一部分實例中，嵌合或人源化抗PD-1抗體的重鏈恆定區源自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或該些的突變體序列，輕鏈恆定區可源自人類k、λ鏈或其突變體序列。舉例而言，重鏈恆定區為包括S228P突變的人類IgG4重鏈恆定區（SEQ ID NO: 46）且/或輕鏈恆定區可為人類免疫球蛋白k恆定區鏈（SEQ ID NO: 47）。

抗PD-1抗體或其抗原結合片段的一部分實例中，抗體為嵌合抗體，抗體的恆定區（constant region）源自人類抗體的恆定區或其突變體。

在抗PD-1抗體或其抗原結合片段的一部分實例中，抗體為人源化抗體，抗體的輕鏈架構區（framework region，FR）及重鏈架構區分別源自人類生殖腺（germline）輕鏈及重鏈或其突變體序列。

在抗PD-1抗體或其抗原結合片段的一部分實例中，抗體為人類抗體，整個序列源自人類生殖腺輕鏈及重鏈或其突變體序列。

在本發明中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段亦可源自與人類PD-1（SEQ ID NO: 48）結合的公知的抗PD-1抗體。舉例而言，可為帕博利珠單抗（pembrolizumab，可瑞達（Keytruda®））、納武單抗（nivolumab，歐狄沃（Opdivo®））、替雷利珠單抗（tislelizumab）（百濟神州及諾華（BeiGene and Novartis））、西米普利單抗（cemiplimab）（利比他歐（Libtayo®），再生元（Regeneron））、多斯利單抗（dostarlimab）（傑姆珀利（Jemperli®），葛蘭素史克（Glaxo Smith Kline，GSK））、BCD-100、坎立珠單抗（camrelizumab）、傑諾珠單抗（genolimzumab）、MED10680（AMP-514）、薩善利單抗（sasanlimab）（PF-06801591）、辛替單抗（sintilimab）（IBI-308）、斯巴達珠單抗（spartalizumab）（PDR-001）或STI-A1110、或包括其重鏈及輕鏈或包括互補性決定區（CDR）的抗體或其抗原結合片段，或者可為可與和該些抗體相同的抗原決定區結合或和該些抗體競爭的抗體或其抗原結合片段。

其他抗原結合域作為抗PD-1抗體之外的其他免疫細胞抗原結合域，可為與例如NKG2a、CD8a、FcRL6、CRTAM(CD355)、LAG3、TIM3、CTLA4、TIGIT等選擇性結合的成分、抗體或其抗原結合片段。

作為所述其他免疫細胞抗原結合域的例子，具有BMS-986315（抗NKG2a，WO 2020/102501）、莫納利珠單抗（monalizumab）（抗NKG2a）；mAbs OKT8或51.1（抗CD8a抗體，美國專利第10,428,155號，WO 2020/060924）、WO 2019/023148或美國專利第10,072,080號中揭示的抗CD8a抗體；在文獻[施瑞德（Shreeder）等人，（2010）免疫學雜誌（J. Immunol.）185:23]及[施瑞德（Shreeder）等人，（2008）歐洲免疫學雜誌（Eur. J. Immunol.）38:3159]或WO 2019/094743中揭示的抗FcRL6抗體1D8或7B7；WO 2019/086878或WO 2009/029883中揭示的抗CRTAM抗體5A11；瑞拉利單抗（relatlimab）（BMS-986016，抗LAG-3）、US 2011/0150892及WO 2014/008218中揭示的抗LAG-3抗體25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5、或US 2011/007023中揭示的抗LAG-3抗體IMP731；伊匹單抗（ipilimumab）或曲美木單抗（tremelimumab）（抗CTLA-4）；TSR-022、MBG453或LY3321367（抗TIM3）；韋博妥單抗（vibostolimab）或替拉格魯單抗（tiragolumab）（抗TIGIT）等，但不限定於此。

本發明的融合蛋白質在免疫細胞抗原結合域之外，更包括將腫瘤細胞作為靶的抗原結合域且可由雙特異性作用蛋白質形成。

Fc 區在本發明中，用語「Fc域」或「Fc區」意指在抗體的重鏈恆定區中包括CH2域及CH3域（或CH2域、CH3域及CH4域）的C-末端區，且以涵蓋野生型（wild-type）Fc區及其變異體的含義使用。雖然IgG重鏈的Fc區的邊界可能略有變化，但通常人類IgG重鏈Fc區可意指自Cys226或Pro230至重鏈的C-末端的區、或者在所述區中更包括樞紐的區。Fc區中胺基酸殘基的編號根據定義人類免疫球蛋白重鏈內的殘基編號的卡巴文獻（卡巴等人，免疫學的蛋白質序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest），第五版，美國國家衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）出版社，1991）的亦稱為EU索引的EU編號系統。

在本發明中，用語「野生型Fc區」包括與自然中發現的免疫球蛋白的Fc區的胺基酸序列一致的胺基酸序列。

在本發明中，用語「Fc區的變異體」包括與野生型Fc區不同的一種以上的胺基酸殘基，可簡稱為「Fc變異體」。

在本發明中，所述Fc變異體可與作為親本的野生型Fc區序列具有約80%以上、較佳為約90%以上的相同性。

本發明的融合蛋白質包括由第一Fc鏈及第二Fc鏈兩個鏈形成的免疫球蛋白的Fc區。舉例而言，IgG的Fc域為由兩個鏈形成的二聚體，且各鏈包括CH2及CH3 IgG重鏈恆定區。

在本發明中，Fc區可為同二聚體（homodimer）或異二聚體（heterodimer）。在Fc區的第一鏈與第二鏈連接彼此不同的蛋白質分子（例：IL-2與IL-2Rα）的結構中，為了以高產率獲得期望的融合蛋白質分子，重要的是設計成與相同的蛋白質分子連接的Fc鏈之間不形成鍵，而與不同的蛋白質分子連接的Fc鏈之間形成鍵。因此，較佳為使用將修飾引入Fc區的Fc異二聚體，以可提高同一鏈間的排斥力及不同鏈間的結合力。

在本發明中，Fc異二聚體由彼此不同的第一Fc鏈與第二Fc鏈形成。所述第一Fc鏈及第二Fc鏈可形成三級結構，可藉由如二硫鍵等共價鍵、或氫鍵、離子鍵、凡得瓦（Van der Waals）鍵、如疏水性相互作用等非共價相互作用而彼此相互作用。

本發明中的Fc異二聚體為了促進不同的兩個鏈間的結合亦可使用將變異引入CH3區的公知的技術。舉例而言，存在使用杵入臼（knob-into-hole，KiH）方式的技術。在所述KiH方式中，在CH3域的疏水性相互作用區中在一側的鏈處將分支大小大的胺基酸置換成分支大小小的胺基酸，且在另一側的鏈處將小的胺基酸置換成大的胺基酸的變異。例如，如WO 96/27011或文獻[瑞奇維（Ridgway），J.B.等人，蛋白質工程（Protein Eng）9（1996）617-621；麥錢特（Merchant），A.M.等人，國家生物科技（Nat Biotechnol）16（1998）677-681]等中記載所示可使用將一個鏈的T366（以EU編號為基準，以下相同）置換成Y、W的大的殘基，且將相反鏈的Y407、T394、T366等置換成T、A、S等小的殘基的形態的異聚多肽（heteromeric polypeptide）。在本發明的一實施態樣中，Fc的CH3域可在各CH3的相應位置引入半胱胺酸（C）並進一步變形以可在兩個CH3域之間形成二硫交聯（KiHs-s）。

舉例而言，杵（knob）鏈的CH3域中可包括T366W突變，臼（hole）鏈的CH3域中可包括T366S、L368A、Y407V突變（以EU編號為基準）。另外，藉由將E356C突變或S354C突變引入杵鏈的CH3域並將Y349C突變引入臼鏈的CH3域，可在CH3域之間額外形成二硫交聯（麥錢特（Merchant），A.M.等人，自然生物技術（Nature Biotech）16（1998）677-681）。例如，本發明中使用的Fc異二聚體可使用KiHs-s。

另外，在本發明中，所述杵鏈及臼鏈中的任一鏈更包括K360E的胺基酸置換，另一鏈更包括Q347R的胺基酸置換，或者任一鏈更包括K360E及Q347E的胺基酸置換，另一鏈可更包括Q347R的胺基酸置換或K360R及Q347R的胺基酸置換。

本發明中使用的較佳的Fc異二聚體包括第一Fc鏈及第二Fc鏈，所述第一Fc鏈包括T366處的胺基酸置換，所述第二Fc鏈包括T366、L368及Y407中一個以上處的胺基酸置換，所述第一Fc鏈及第二Fc鏈中的一個鏈更包括K360處的胺基酸置換，另一鏈更包括Q347處的胺基酸置換。另外，所述第一Fc鏈及第二Fc鏈中包括K360處的胺基酸置換的鏈更包括Q347處的胺基酸置換且（或者）包括Q347處的胺基酸置換的另一鏈可更包括K360處的胺基酸置換。

在本發明中，較佳為Fc異二聚體中， （A1）所述第一Fc鏈包括T366W及K360E的胺基酸置換，所述第二Fc鏈包括T366S、L368A、Y407V及Q347R的胺基酸置換，或者 （A2）所述第一Fc鏈包括T366W及Q347R的胺基酸置換，所述第二Fc鏈包括T366S、L368A、Y407V及K360E的胺基酸置換，或者 （A3）所述第一Fc鏈包括T366W、K360R及Q347R的胺基酸置換，所述第二Fc鏈包括T366S、L368A、Y407V、K360E及Q347E的胺基酸置換，或者 （A4）所述第一Fc鏈包括T366W、K360E及Q347E的胺基酸置換，所述第二Fc鏈可包括T366S、L368A、Y407V、K360R及Q347R的胺基酸置換。

另外，在本發明中，Fc域可源自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突變體序列，且可更包括用於改變Fc域的結構穩定化或對Fc受體的結合親和性的其他突變。舉例而言，於Fc區源自IgG4的情況，可更包括S228P突變。S228P突變使在兩個IgG4抗體之間在Fab區中發生交換的Fab臂交換減少。舉例而言，於Fc區來自IgG的情況，為了減少效應器（effector）功能（以EU編號為基準），可在選自E233、L234、L235、G236、G237、N297、L328、P329及P331中的位置包括胺基酸置換。舉例而言，Fc區可在選自由L234、L235及P329組成的群組的位置包括胺基酸置換。或者Fc區可包括L234A及L235A的胺基酸置換，或者包括L234A、L235A及P329G的胺基酸置換。另外，在本發明中，Fc區可能缺少CH2域。

本發明中使用的例示性Fc鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 49及SEQ ID NO: 50所示。

融合蛋白質的製造方法本發明的融合蛋白質可藉由使包括對融合蛋白質進行編碼的多核苷酸序列的表達載體在宿主細胞中表達來獲得。

在本發明中，用語「多核苷酸」意指由單股或雙股形態的脫氧核苷酸（deoxyribonucleotide）或核糖核苷酸（ribonucleotide）組成的分離的核酸分子或結構，例如訊息核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）、質體（plasmid）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、病毒衍生的RNA。所述多核苷酸可藉由根據本發明的融合蛋白質構成或改變形成融合蛋白質的各域的野生型序列來生成，且可更包括本發明的融合蛋白質的表達所需的要素（例如，訊號肽）。另外，可藉由聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）聚合反應合成對本發明的融合蛋白質的整個胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列來使用。

在本發明的一實例中，於本發明的融合蛋白質採取異二聚體結構的情況，所述表達載體可包括第一表達載體及第二表達載體，所述第一表達載體包括對連接IL-2的第一單體鏈的胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列，所述第二表達載體包括對連接IL-2Rα的第二單體鏈的胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列。在本發明的例示性實施態樣中，所述第一表達載體包括對SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 57的胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列，第二表達載體包括對SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 58的胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列。

在本發明的一實例中，本發明的融合蛋白質在使所述第一表達載體及所述第二表達載體分別各別地在宿主細胞中表達後混合獲得的蛋白質來製造，或者使所述第一表達載體及所述第二表達載體在同一宿主細胞中同時表達而在單個細胞中製造。較佳為，本發明的融合蛋白質在單個細胞中製造。

治療性施藥及劑型在一方面，本發明提供根據本發明的融合蛋白質及包括在藥學上可允許的賦形劑、載體的藥學組成物。所述藥學組成物可在例如腫瘤、癌症、轉移性腫瘤或轉移性癌症的治療中用作免疫治療劑。所述藥學組成物亦可用於治療感染性疾病。

在一方面，本發明提供在所述藥學組成物中更包括第二治療劑的藥學組成物。在一實施態樣中，第二治療劑為增強細胞對免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞附著抑制劑、細胞毒性劑、細胞死亡活性劑或細胞死亡誘導劑的敏感性的作用劑。在特定的實施態樣中，所述額外的治療劑可為抗癌劑，例如微管崩解劑、代謝拮抗物質、拓撲異構酶（topoisomerase）抑制劑、DNA插入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗物質、腫瘤細胞細胞死亡活性劑、或血管形成抑制劑。

在本發明中，腫瘤、癌症、轉移性腫瘤或轉移性癌症可為非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腎癌、肝癌、骨癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑色素瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈狀肉芽腫瘤、默克爾（Merkel）細胞癌及經典霍奇金淋巴瘤（classic hodgkin's lymphoma，CHL）、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、T細胞/組織細胞豐富的B細胞淋巴瘤、人類皰疹病毒（Epstein-Barr virus，EBV）-陽性及-陰性移植後淋巴增生性疾病（post transplant lymphoproliferative disorder，PTLD）、或EBV-相關的彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）、漿母細胞淋巴瘤、外源性NK/T細胞淋巴瘤、鼻咽癌、或人類皰疹病毒8（human herpes virus 8，HHV8）-相關的原發性滲出性淋巴瘤、包括霍奇金淋巴瘤的其他血癌、包括原發性中樞神經系統（central nervous system，CNS）淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤的中樞神經系統的新生物，且不限定於此。

在本發明中，感染性疾病可為選自包含如下的慢性病毒感染的疾病：B型肝炎、C型肝炎的病毒感染、皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus）、人類免疫缺乏病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、巨細胞病毒（cytomegalovirus）、單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒2型、人乳頭瘤病毒、腺病毒（adenovirus）、與皰疹病毒傳染相關的卡波西氏（Kaposi）肉瘤、細環病毒（托克泰諾病毒（Torque teno virus））、JC病毒或BK病毒感染，且不限定於此。

根據本發明的藥學組成物可用於治療癌症的早期階段或後期階段症狀。在一態樣中，根據本發明的藥學組成物可用於治療轉移癌症。根據本發明的藥學組成物在減少或抑制或收縮固體腫瘤及血癌（blood cancer）兩者的腫瘤生長方面有用。在特定態樣中，根據本發明的藥學組成物的處理在受試者中引起減少腫瘤的50%以上、減少60%以上、減少70%以上、減少80%以上、減少90%以上。在特定態樣中，所述藥學組成物可用於預防腫瘤的復發。在特定態樣中，所述藥學組成物在患有癌症的受試者中在延長整體存活方面有用。在一部分態樣中，所述藥學性組成物在患有癌症的患者中在保持長時間存活並減少化學療法或放射線療法帶來的毒性方面有用。

在本發明的又一態樣中，根據本發明的藥學組成物可與在治療癌症中有用的對相關領域技術人員而言公知的任意其他製劑或任意其他療法一同用作輔助療法。

根據本發明的藥學組成物可與包含於劑型內的其他製劑一同施用，以提供適合的載體、賦形劑、及經提高的搬運、傳遞、耐受性等。多個適當的劑型可在對所有製藥化學家（pharmaceutical chemist）而言公知的處方集（參照：雷明頓製藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences），麥克出版公司（Mack Publishing Company），伊斯頓（Easton），賓夕法尼亞州（PA））中進行確認。該些劑型包括：例如，粉末、漿（paste）、軟膏、凝膠、蠟、油、液體、含有囊泡（vesicle）的液體（陽離子或陰離子）（例：轉染試劑（LIPOFECTIN™））、DNA偶聯物、無水吸收漿、水包油及油包水乳液、乳液卡波蠟（多種分子量的聚乙二醇）、半固體凝膠、及含有卡波蠟的半固體混合物（參照：鮑威爾（Powell）等人「腸胃外製劑賦形劑綱要（Compendium of excipients for parenteral formulations）」PDA醫藥科技雜誌（PDA J Pharm Sci Technol）（1998）52:238-311）。

融合蛋白質的用量可根據要施用的受試者的年齡及體重、靶向疾病、病情、施用途徑等是可變的。本發明的融合蛋白質經過一次或一系列的治療以適合的方式施用給患者。融合蛋白質的初期預備施用量根據疾病的類型及重症度可為約1微克/千克至15毫克/千克（例如0.1毫克/千克至10毫克/千克），無論是一次以上的分開施用還是連續注入。典型的一日施用量根據所述提及的因數可為約1微克/千克至100毫克/千克或100毫克/千克以上的範圍。經過數日以上重複施用，根據患者的狀態，通常可持續至出現期望程度的疾病症狀抑制為止。例示性的施用量可為約0.005毫克/千克至約10毫克/千克。在另一非限制性例子中，用量亦可包括每次施用約1微克/千克、約5微克/千克、約10微克/千克、約50微克/千克、約100微克/千克、約200微克/千克、約350微克/千克、約500微克/千克、約1毫克/千克、約5毫克/千克、約10毫克/千克、約50毫克/千克、約100毫克/千克、約200毫克/千克、約350毫克/千克、約500毫克/千克至約1000毫克/千克以上及所述中可推導出的任意範圍。因此，可對所述患者施用約0.5毫克/千克、2.0毫克/千克、5.0毫克/千克或10毫克/千克（或該些的任意組合）的一次以上的用量。可間歇性地、例如每週或每三週施用如上所述的用量（例如使所述患者接受約2次至約20次、或例如約6次用量的所述融合蛋白質）。繼初期的較高負荷用量之後，亦可施用一次以上的較低用量。

本發明的藥學組成物可利用多種傳遞系統例如脂質體內膠囊化、微粒、微膠囊、可表達突變病毒的重組細胞、受體傳播的內吞作用（endocytosis）來施用（參照：例如，吳等人（1987）生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）262:4429-4432）。導入方法包括皮內、經皮、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻腔內、硬膜外及口服途徑，但不限定於此。所述組成物可藉由任意通常的途徑、例如藉由注入或單次快速（bolus）注射、通過上皮或黏膜皮膚內層（lining）（例：口腔黏膜、直腸及腸黏膜等）的吸收來施用，且可與其他生物學活性劑一同施用。施用可為全身施用或局部施用。

本發明的藥學組成物亦可藉由囊泡、特別是脂質體傳遞（參照：例如，蘭格（Langer）（1990）科學249:1527-1533）。亦可考慮使用傳遞本發明的融合蛋白質的奈米粒子。抗體偶聯的奈米粒子可用於治療及診斷用途兩者全部。抗體偶聯的奈米粒子及製備方法及用途詳細記載於作為參照包括在本案中的文獻（參照：阿魯埃博（Arruebo, M.）等人2009，在奈米材料雜誌（J.Nanomat）合訂本（Volume）2009中的「用於生物醫學應用的抗體偶聯奈米粒子（Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications）」，論文（Article）ID 439389，第24頁，doi: 10.1155/2009/439389）。開發奈米粒子並與藥學組成物所含有的抗體偶聯，從而可對腫瘤細胞或自身免疫組織細胞或病毒感染的細胞進行靶向化。用於藥物傳遞的奈米粒子亦記載於例如各全文包含於本案的US 8257740或US 8246995中。

在特定狀況下，本發明的藥學組成物可利用受控制的釋放系統傳遞。在一態樣中，可使用幫浦。在又一態樣中，可使用聚合物性物質。在又一態樣中，受控制的釋放系統可配置於組成物的靶附近，且僅需要全身用量的一部分。可注射的製劑可包括用於進行靜脈內、皮下、皮內、顱內、腹膜內及肌肉內注射、滴注（drip infusion）等的施用型。該些可注射的製劑可利用正式公知的方法來製備。可注射的製劑可藉由例如使所述記載的抗體或其鹽溶解或懸浮或乳化於滅菌水溶性培養基或通常用於注射的油性培養基中來製備。作為注射用水溶性培養基，具有可與適當的增溶劑等一同使用的例如生理鹽水、含有葡萄糖的等張溶液及其他輔助劑等，所述增溶劑例如醇（例：乙醇）、多元醇（例：丙二醇、聚乙二醇）、非離子性介面活性劑[例：聚山梨醇酯80、氫化蓖麻油的HCO-50（聚氧乙烯（50莫耳）添加物）]。作為油性培養基，可利用可與例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶劑一同使用的例如芝麻油、大豆油等。因此，製備的注射液較佳為裝入適當的安瓿中。

本發明的藥學組成物可藉由標準針（standard needle）及注射器傳遞至皮下或靜脈內。另外，對於皮下傳遞，筆傳遞裝置（pen delivery device）容易用於傳遞本發明的藥學組成物。此種筆傳遞裝置可重複使用或可為一次性的。可重複使用的筆傳遞裝置一般使用含有藥學組成物的可替換藥筒（cartridge）。若施用藥筒內的所有藥學組成物，使藥筒變空，則空的藥筒容易廢棄並可替換為含有藥學組成物的新的藥筒。筆傳遞裝置之後可重複使用。於一次性筆傳遞裝置中，沒有可替換的藥筒。相反，一次性筆傳遞裝置中預先填充有收容於所述裝置內的存放處的藥學組成物。若所述存放處中藥學組成物耗盡，則將整個裝置廢棄。多個可重複使用的筆及自動注射器（autoinjector）傳遞裝置用於本發明的藥學組成物的皮下傳遞。

有利地，用於所述記載的口服或非口服使用的藥學組成物被製備成適於匹配活性成分的用量的單位用量的施用型。此種單位用量的施用型包括例如片劑、丸藥、膠囊、注射液（安瓿）、栓劑等。含有的融合蛋白質的量一般每單位用量、特別是注射形態的施用型為約5毫克至約500毫克，且較佳為含有約5毫克至約100毫克的抗體及相對於其他施用型含有約10毫克至約250毫克的抗體。

本發明亦提供在個體中預防、改善或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括對需要預防、改善或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症或感染性疾病的所述個體施用本發明的融合蛋白質。

實施例以下，藉由實施例對本發明更詳細地進行說明。該些實施例僅是為了更具體地對本發明進行說明作為例示提供的，本發明的權利範圍並非限定於該些實施例。對相關領域技術人員不言而喻的是可在本發明的權利範圍內對實施例進行各種變形。

本案中使用的分子生物學試劑根據製造商的指示使用。重組DNA技術如文獻[薩姆布魯克（Sambrook）等人，分子克隆：實驗室手冊，美國冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press），冷泉港（Cold Spring Harbor），紐約，1991]中記載所示，使用標準方法來實施。針對免疫球蛋白分子或抗體分子特定的胺基酸殘基的編號表示為以由文獻[卡巴等人，免疫學蛋白質序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest），第五版，NIH出版社，1991]得出的EU索引為基準自N-末端開始的胺基酸位置。

實施例 1. 細胞激素融合蛋白質的製造 實施例 1.1 融合蛋白質的結構設計為了增加腫瘤特異性耗竭的效應T細胞（exhausted T _eff）的特異性活性，重要的是將特異性地誘導T _eff細胞的增殖及/或活化的細胞激素選擇性地傳遞至腫瘤內的T _eff細胞。為此，將細胞激素融合蛋白質的結構設計成將促進T _eff細胞的增殖及/或活化的細胞激素與T _eff細胞靶向域彼此連接，並以「順式（in-cis）」在T _eff細胞中起作用。作為可誘導T _eff細胞的增殖及/或活化的細胞激素，考慮藉由在T _eff細胞中表達的白血球介素-2受體的βγ-次單元（IL-2Rβγ）傳遞訊號的白血球介素-2（以下簡稱為IL-2或IL2）及白血球介素-15（以下簡稱為IL-15或IL15），且作為一實施態樣選擇IL-2。將IL-2作為T _eff細胞靶向域，使其連接至抗PD-1免疫抗癌抗體的Fc，從而構成雙功能性融合蛋白質。

已知存在於血液中的免疫蛋白質、即IL-2等細胞激素在包括免疫細胞在內的各種細胞中，對細胞內訊號傳遞起到重要的作用。因此，需要增加選擇性的策略以減少由外源性細胞激素引起的毒性或副作用的問題同時僅對腫瘤內的T _eff細胞起特異性作用。

本發明人藉由將IL-2連接至抗PD-1抗體的第一Fc鏈的C-末端，另一方面將IL-2受體的α-次單元（IL-2Rα或CD25）連接至第二Fc鏈的C-末端，藉由誘導分別連接至抗PD-1抗體的第一Fc鏈及第二Fc鏈末端的IL-2與IL-2Rα之間的相互作用，從而構成IL-2被IL-2Rα搶佔的形態。所述IL-2蛋白質及IL-2Rα蛋白質分別僅與抗PD-1抗體的Fc末端連接，而在IL-2與IL-2Rα彼此間不以共價鍵連接（參照圖1）。

於圖1至圖3示出本發明的「順式」融合蛋白質的例示性結構。如圖2所示，在藉由連接子將IL-2與IL-2Rα共價鍵結形成複合體後，亦可達成藉由IL-2及IL-2Rα中的任一側將所述細胞激素複合體連接至抗PD-1抗體的Fc的結構。另外，作為可解決由外源性細胞激素引起的毒性或副作用問題的方案，亦研究出僅將IL-2Rα或IL-15Rα作為細胞激素作用域連接至抗PD-1抗體以使得可使用內源性細胞激素的融合蛋白質的結構。

在本發明人設計的結構中，由於IL-2被IL-2Rα搶佔，因此對表達IL-2受體的α-次單元、β-次單元（IL-2Rβ或CD122）及γ-次單元（IL-2Rγ或CD132）均表達的高親和度IL-2受體（或簡稱為IL-2Rαβγ）的調節T細胞（T _reg）、Foxp3-負CD4 T細胞、一部分先天性淋巴細胞或其他內皮（endothelial）細胞的結合力弱化，相比之下，可與表達由IL-2Rβ及IL-2Rγ組成而不具有IL-2Rα的中等親和度IL-2受體（或簡稱為IL-2Rβγ）的細胞毒性CD8+ T細胞、記憶T細胞、NK-T細胞等T _eff細胞進一步特異性結合。

實施例 1.2 融合蛋白質的序列構成及表達載體的製作 抗 PD-1 結合域本發明人使用在之前研究中開發的人源化抗PD-1抗體1G1-h70的Fab域作為抗PD-1結合域。本研究中使用的抗PD-1 1G1-h70的Fab域胺基酸序列如下所示。

輕鏈VL-CL（SEQ ID NO: 51） DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSQGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（下劃線部分表示輕鏈可變區。）

重鏈VH-CH1（SEQ ID NO: 52） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV（下劃線部分表示重鏈可變區。） 連接子設計

以連接至抗PD-1免疫抗癌抗體的二聚體Fc域的各鏈末端的形態保持IL-2/IL-2Rα之間的相互作用，同時，亦為了分析所述IL-2用於與細胞表面表達的IL-2Rβγ結合的結構，進行結晶結構分析，以在Fc域的C-末端與IL-2及IL-2Rα各自的N-末端之間的連接部位確定合適的長度。

在人類PD-1(hPD-1)/1G1-h70的Fab域結晶結構疊加公知的抗PD-1抗體、即可瑞達（Keytruda）的整體結晶結構，以模擬抗PD-1抗體與hPD-1結合的方式。將抗PD-1抗體的Fc域的C-末端定位為最接近IL-2及IL-2Rα各自的N-末端而不與IL-2四級複合物碰撞，之後對自Fc域的C-末端至IL-2及IL-2Rα各自的N-末端的距離進行測定。因此，將Fc域的C-末端與IL-2及IL-2Rα各自的N-末端之間的連接部位的長度分別確定為59.2A及53.6A（圖4）。藉由基於此種結構的製模，設計適當長度的連接子以分別將IL-2及IL-2Rα連接至抗PD-1抗體的Fc末端。

經改善的異二聚體（ heterodimeric ） Fc 區為了提高本發明的融合蛋白質的製造產率，利用異二聚體Fc製作抗PD-1抗體的Fc區，以使IL-2連接的Fc鏈與IL-2Rα連接的Fc鏈之間的異二聚體結合與具有相同序列的Fc鏈間的同二聚體結合相比佔優勢。為此，將杵入臼（knob-into-hole，KiH）變異與電荷/疏水性胺基酸變異一同導入至Fc區。

在第一Fc鏈（SEQ ID NO: 49）中包括T366W及Q347R的胺基酸置換，且在第二Fc鏈（SEQ ID NO: 50）中包括T366S、L368A、Y407V及K360E的胺基酸置換。該些異二聚體Fc變異體將異二聚體融合蛋白質的製造產率明顯提高至約90%以上。 IL-2Rα 的高親和度變異體

為了增強IL-2與IL-2Rα的結合力，使用高親和度IL-2Rα變異體。將IL-2Rα蛋白質的42號位置的白胺酸胺基酸置換成異白胺酸的IL-2Rα L42I變異體（SEQ ID NO: 5）與野生型IL-2Rα相比可以進一步提高的親和度（KD）值與IL-2結合。下表1示出使用對蛋白質間相互作用進行即時觀察的表面電漿子共振（surface plasmon resonance，SPR）比亞科（Biacore）8K測定的結合親和度與動力學（Kinetics）。

[表1]

配位體	穩定狀態親和力K D（M）	結合k a（1/Ms）	k d（1/s）	K D（M）
野生型IL-2Rα	2.83E-8	1.95E+7	2.16E-1	1.11E-8
IL-2Rα L42I	1.98E-8	1.08E+7	4.70E-2	4.36E-9

表達載體的製作基於表達人類IgG4恆定區（S228P）（SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 47）的pTRIOZ_hIgG4（S228P）（因威沃根（InvivoGen））以使IL-2 C125S（SEQ ID NO: 2）或CD25 L42I（SEQ ID NO: 5）基因進入Fc區的C-末端的方式製作表達載體。IL-2的C125S變異如在FDA批准的IL-2產品、即普留淨（阿地白介素）中所示是為了防止大腸桿菌（ Escherichia Coli ， E. coli）中的半胱胺酸錯誤配對（mispairing）而引入的，不會影響生物學活性（參照王A等人，人類白細胞介素-2基因的定點突變：半胱胺酸殘基的結構功能分析（Site-specific mutagenesis of the human interleukin-2 gene: structure-function analysis of the cysteine residues）， 科學（ Science），224:1431-1433，1984）。本案中，用語「野生型IL-2」不僅包括天然或重組人類IL-2，而且包括以在使具有C125S變異的IL-2或阿地白介素、或天然人類IL-2的結合特性不變形的同時具有新的N-末端及C-末端的變形的循環置換形式的IL-2全部。作為循環置換IL-2的非限制性例子，具有利用連接子連接現有的N-末端部（Ser4）與C-末端部（Thr133），並進行截斷以形成新的N-末端部（Ser75）與C-末端部（Gln74），IL-2螺旋（helix）以C-D-A-B的順序連接等。

在所述表達載體的重鏈恆定區與輕鏈恆定區前包括老鼠免疫球蛋白訊號肽來製作各自的可變區。基本上根據載體製造商的指示事項製作載體。利用交疊PCR（overlapping PCR）連接訊號肽與抗體的VH或VL序列並置於pTRIOZ_hIgG4（S228P）載體中。於VH序列的情況，使用Mlu I / Nhe I限制酶切斷載體後插入，且於VL序列的情況，使用Asc I / BsiW I限制酶切斷載體後插入。

此時，第一鏈（杵（Knob））表達載體以在Fc區中誘發T366W及Q347R突變的方式改變核苷酸序列來製作，且第二鏈（臼（Hole））表達載體利用PCR技法製作在Fc區中誘發T366S、L368A、Y407V及K360E突變的核苷酸序列。

第一鏈（杵（Knob））表達載體在利用Avr II限制酶切斷C-末端部分後，利用PCR技法擴增IL-2 C125S基因以包括15個長度的胺基酸連接子，之後利用NE建造師HiFi DNA組裝試劑盒（NEBuilder HiFi DNA Assembly Kit）來製作。第二鏈（臼（Hole））表達載體在利用Avr II限制酶切斷C-末端部分後，利用PCR技法擴增CD25 L42I基因以包括20個胺基酸連接子，之後利用NE建造師HiFi DNA組裝試劑盒來製作。此時使用的引體如下表所示。

	引體	序列	Tm
IL-2 C125S	正向	CCCTCTCCCCCGGCAAGTCAGGAGGTGGATCTGGTGGAG （序列ID編號53）	53
反向	GCCCGAATTCGGCGGCCGCTTTATCAGGTCAGCGTAGAGATG （序列ID編號54）	54
CD25 L42l	正向	Tctccctgtctccgggtaaaggaggtggaggttctggtggaggtggatctggt ggaggaggttctggtggaggtggatctGAGCTGTGTGATGATGATC（序列ID編號55）	59.9
反向	gtcattggggaaacctgctcctaggTTTAGCCGGTACAGATCAG （序列ID編號56）	60.9

各表達載體編碼的胺基酸序列如下所示。

輕鏈：VL-CL（SEQ ID NO: 51） DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSQGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

重鏈1_杵_具有_IL2C125S：VH – CH1 – 樞紐（ Hinge） – CH2 – CH3 – 連接子（ Linker） - IL2C125S（SEQ ID NO: 57） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP RVYTLPPSQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SGGGSGGGSGGGSGG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT

重鏈2_臼_具有_CD25L42I：VH – CH1 – 樞紐（ Hinge） – CH2 – CH3 – 連接子（ Linker） – CD25L42I（SEQ ID NO: 58） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT ENQVSL SC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGS IYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG

實施例 1.3 融合蛋白質的表達及純化（融合蛋白質 A ）將實施例1.2中記載的第一鏈（杵）表達載體（連接IL2C125S的第一重鏈及輕鏈表達）與第二鏈（臼）表達載體（連接CD25L42I的第二重鏈及輕鏈表達）一同在艾斯匹科（ExpiCHO™）細胞進行轉染（Transfection），以暫時表達各蛋白質。

所述轉染在初期細胞密度為6×10 ⁶細胞/毫升及表達載體濃度為0.8微克DNA/毫升的條件下進行，在此過程中根據製造商指南使用艾斯匹科（ExpiCHO™）表達媒介（Expression Medium）、OptiPRO™ SFM及艾斯匹弗他明（ExpiFectamine™）轉染試劑盒（吉比科（Gibco））。

在將經過轉染過程的細胞在二氧化碳培養箱中培養至細胞生存率75%後，藉由離心分離分離成含有各蛋白質的細胞培養液與細胞。

為了將目標蛋白質自包含各個重組蛋白質的培養液分離，實施使用海萊普（HiTrap）MabselectXtra（思拓凡（Cytiva））柱的親和層析法（affinity chromatography）。

具體而言，在利用AKTA先鋒（avant）25快速蛋白液相層析（fast protein liquid chromatography，FPLC）進行純化，利用磷酸鹽緩衝液（Phosphate Buffered Saline，PBS）（3毫莫耳/升Na ₂HPO ₄，1.1毫莫耳/升KH ₂PO ₄，0.16莫耳/升NaCl，pH 7.2）使海萊普MabselectXtra柱平衡後，利用0.22微米過濾器對藉由離心分離獲得的培養液進行過濾並加入。在與培養液反應結束後，利用PBS（5CV～10CV），50毫莫耳/升NaOAc pH 5.2（5CV～10CV）依序對柱進行清洗，之後利用洗脫緩衝液（0.1莫耳/升甘胺酸pH 3.0）洗脫蛋白質。向洗脫的蛋白質添加3莫耳/升NaOAc pH 5.2緩衝液以使最終濃度達到50毫莫耳/升～100毫莫耳/升後，藉由離心分離一起去除提取的色素。在去除色素後，利用阿米康管（Amicon tube）（截留分子量（molecular weight cut off，MWCO）：50 K）進行濃縮並利用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（acrylonitrile butadiene styrene，ABS）（0.1莫耳/升NaOAc，0.15莫耳/升NaCl，pH 5.2）或PBS進行緩衝液替換。

為了確認生成融合蛋白質，分別在6%及10%丙烯醯胺-雙丙烯醯胺（29:1）凝膠中執行非還原及還原條件的SDS-PAGE，並利用考馬斯藍（瞬藍（InstantBlue）考馬斯蛋白質染色劑（艾博抗（Abcam），ab119211））進行染色。圖5是確認經純化的融合蛋白質（融合蛋白質A）的SDS-PAGE結果。確認融合蛋白質A為IL-2與IL-2Rα分別連接至抗PD-1抗體的Fc區且具有兩個抗PD-1 Fab臂的形態（圖1a）的異二聚體結構且可以高產率製造。

實施例 2. 各種融合蛋白質設計及製造 實施例 2.1 具有一個抗 PD-1 Fab 臂的融合蛋白質的製造（融合蛋白質 B ，圖 1b ）利用與實施例1中相同的方法進行結構設計及載體的製作，使用實施例1的表達載體作為一級載體，此時使用PCR自重鏈第一鏈（杵）載體去除VH-CH1部分來使用。融合蛋白質B中重鏈第一鏈（杵）載體編碼的胺基酸序列如下所示。

Fc_杵_具有_IL2C125S： 樞紐– CH2 – CH3 – 連接子- IL2C125S（SEQ ID NO: 59） KYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP RVYTLPPSQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SGGGSGGGSGGGSGG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT

作為最終表達載體，使用以自pcDNA3.1包括三個多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）的方式構成的自身製作載體、即pG3.1。各MCS均具有相同的啟動子（巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV））、增強子（CMV）及加尾訊號（polyadenylation signal，Poly A signal）（牛生長激素（bovine growth hormone，BGH））。在三個MCS中分別放入一級載體中克隆的輕鏈、重鏈第一鏈（杵）及重鏈第二鏈（臼）基因來製作表達載體。在艾斯匹科（ExpiCHO™）細胞中將所述表達載體轉染，利用與實施例1中相同的方法表達各蛋白質，並利用與實施例1相同的方法對目標蛋白質進行分離、純化。

實施例 2.2 不包括 IL-2 而包括一個 IL-2Rα 蛋白質的異二聚體融合蛋白質的製造（融合蛋白質 C ，圖 3c ）利用與實施例2.1中相同的方法進行結構設計、載體的製作以及蛋白質的表達及純化，但使用未將IL-2 C125S基因連接至重鏈第一鏈（杵）載體的C-末端者。輕鏈及重鏈第二鏈（臼）與實施例1中相同，重鏈第一鏈（杵）的胺基酸序列如下所示。

重鏈1_杵_不具有_IL2C125S： VH – CH1 – 樞紐– CH2 – CH3（SEQ ID NO: 60） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP RVYTLPPSQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

實施例 2.3 不包括 IL-2 而包括兩個 IL-2Rα 蛋白質的同二聚體融合蛋白質的製造（融合蛋白質 D ，圖 3a ）利用與實施例1中相同的方法進行結構設計、表達載體的製作及蛋白質的表達及純化，但利用實施例1的表達載體製作僅將CD25 L42I（SEQ ID NO: 5）基因連接至Fc區的C-末端而不具有用於提高異二聚體製造產率的Fc區的變異的同二聚體形態的融合蛋白質D。融合蛋白質D的輕鏈胺基酸序列與實施例1中相同（SEQ ID NO: 51），重鏈胺基酸序列如下所示。

重鏈_具有_CD25L42I: VH – CH1 – 樞紐– CH2 – CH3 – 連接子– CD25L42I（SEQ ID NO: 61） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGS IYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG

為了確認在實施例2.1至實施例2.3中製造、純化的融合蛋白質，在4%～15% TGX預製膠（伯樂（Biorad），BR4561086）中執行SDS-PAGE，將其結果示出於圖6。

實施例 3. 對 IL-2 受體蛋白質的結合選擇性分析為了確認由本發明的融合蛋白質的IL-2/IL-2Rα異二聚體Fc區引起的與IL-2受體的結合選擇性，執行分別對IL-2Rα及IL-2Rβγ的結合ELISA。向96孔板（賽默飛世爾科技（ThermoFisher scientific））分別注入100微升/孔的IL-2Rα-His（百普賽斯（Acrobiosystems））及IL-2Rβγ-His（百普賽斯），密封後在4℃下徹夜塗佈。在阻斷及清洗後，將融合蛋白質A與對照組抗體（Fc-IL2，自身製作）稀釋至0至1000奈莫耳/升濃度並分別注入100微升/孔，在室溫下孵化兩小時。在清洗後，添加二級抗體（辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase，HRP）-結合抗-His抗體），在室溫下避光孵化30分鐘。在清洗後，添加四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）基質溶液（艾博抗），利用終止液（艾博抗）終止顯色反應。使用微盤讀取儀（microplate reader）（賽默飛世爾（ThermoFisher））測定於450奈米下的吸光度。

將結果分別示出於圖7a及圖7b。融合蛋白質A未顯示出對IL-2Rα蛋白質的結合力（圖7a），相比之下，對於IL-2Rβγ蛋白質，展示出與野生型IL-2相比略弱但優異的結合力（圖7b）。該情形表現出本發明的融合蛋白質因IL-2被IL-2Rα搶佔的獨特結構而表現出與IL-2Rα相比對IL-2Rβγ的出色的選擇性。

實施例 4. 對 PD-1 表達的 IL-2 受體表達細胞的結合選擇性分析由於本發明的融合蛋白質具有與抗PD-1結合域融合的IL-2/IL-2Rα複合體結構，因此藉由所述抗PD-1結合域對存在於腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）的耗竭PD-1 ⁺T _eff細胞中的IL-2Rβγ訊號傳遞是否發生變化進行分析。利用海克藍（HEK-Blue ^TM）報告基因檢測系統（因威沃根）來執行分析。

首先，分別在表達IL-2Rβγ的海克藍（HEK-Blue ^TM）CD122/CD132細胞（因威沃根）與表達IL-2Rαβγ全部的海克藍（HEK-Blue ^TM）IL-2細胞（因威沃根）中將pCMV3-hPD1（HG10377-CF）載體轉染來製作PD-1表達細胞。作為對照組，在所述兩個細胞中分別將pCMV3-Empty載體（對照組DNA）轉染來使用。將所述經轉染的細胞以50,000細胞/孔的濃度分別注入至96孔板並在37℃、5% CO ₂腔室中培養。接著，在去除細胞培養上清液後，向100微升杜皮克氏改進愛哥爾氏媒介（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）培養基添加0至20奈莫耳/升濃度的融合蛋白質A、重組人類IL-2（rIL2，西格瑪（Sigma））、異二聚體Fc-IL2（Fc-IL2，自身製作）及異二聚體Fc-IL2/IL2Rα（IL-2及IL-2Rα分別連接至異二聚體Fc的結構，Fc-IL2/IL2Rα；自身製作），分別注入至細胞並在37℃下培養8小時。在向新的96孔板添加20微升/孔所述細胞培養上清液後，利用180微升/孔的比色計分析法試劑、即匡蒂藍（QUANTI-Blue ^TM）溶液（因威沃根）進行處理並在37℃培養箱中避光孵化約1小時以上。利用微盤讀取儀在620奈米至655奈米下對分泌的鹼性磷酸酶（分泌型胚胎鹼性磷酸酶（secreted embryonic alkaline phosphatase，SEAP））活性測定光密度（optical density，OD）。將結果示出於圖8。

將以上程序重複兩次並求出平均值。將根據是否表達PD-1及IL-2R表達類型的本發明的融合蛋白質的EC ₅₀值記載於下表2。

[表2]

EC 50（nM）	PD-1表達
PD-1（+）	PD-1（-）
IL-2Rβγ	一級	0.01774	7.274
二級	0.0392	12.16
平均±標準差	0.028±0.015	9.72±3.45
IL-2Rαβγ	一級	0.0348	0.9630
二級	0.0578	3.075
平均±標準差	0.046±0.016	2.02±1.49

如表2所示，令人驚訝的是，本發明的融合蛋白質在表達PD-1的IL-2Rβγ細胞中表現出較不表達PD-1的細胞高約340倍以上的IL-2反應性（參照表2及示出二級結果的圖8a及圖8b）。另一方面，本發明的融合蛋白質對不表達PD-1的IL-2Rβγ細胞表現出弱的IL-2反應性（圖8b），此被認為源於本發明的融合蛋白質具有不具有α但具有減弱的βγ親和力的特性，亦如實施例3中對IL-2Rβγ蛋白的結合力試驗（圖7b）中確認所示。雖然不受理論約束，但看出利用此種減弱的βγ親和力在不表達PD-1的IL-2Rβγ表達細胞中不能實現充足的細胞內訊息傳遞（intracellular signaling）。然而，應理解，在PD-1同時表達的細胞（例如TME的PD-1 ⁺T _eff細胞）中，本發明的融合蛋白質的IL-2在抗PD-1結合域的幫助下以「順式」結構黏附在一起且可與IL-2Rβγ強力地結合（「接通（switch-on）」效應），從而可以顯著的水準引起細胞內訊息傳遞。

本發明的融合蛋白質具有的不具有α但具有減弱的βγ親和力的特性暗示，雖然永久表達IL-2Rβγ，但不會很好地與PD-1表達率低的末梢血的NK細胞等結合，因此在減少先前IL-2蛋白質所具有的NK細胞過度活性引起的全身毒性乃至副作用的方面具有非常有利的優勢。

另外，本發明的融合蛋白質對於IL-2Rαβγ表達細胞，即使在PD-1表達存在的情況下，對IL-2的反應性差異與IL-2Rβγ表達細胞相比亦為甚微的水準（340倍vs 44倍；參照表2及示出二級結果的圖8c及圖8d）。於如IL-2Rαβγ般以表達各種受體次單元的方式製作的細胞的情況，考慮到次單元的表達形式可為多樣的且亦可部分接受一定程度IL-2Rβγ受體的表達，IL-2Rαβγ表達細胞與IL-2Rβγ表達細胞之間對IL-2的實際反應性差異更加顯著。該情形意味著本發明的融合蛋白質對永久表達IL-2Rαβγ的T _reg細胞或引起毛細血管滲漏症候群（vascular leak syndrome）的嗜伊紅白血球（eosinophil）及其他內皮細胞的IL-2反應性相當低，因此可解決因外源性IL-2蛋白質的出現而可能發生的全身毒性乃至嚴重副作用的問題，同時表現出與存在於TME的耗竭的T _eff細胞特異性結合來誘導突出的免疫抗癌反應。

實施例 5. 小鼠腫瘤模型中的體內（ in vivo ）抗癌功效評估 實施例 5.1 單獨施用抗 PD-1 或 Fc-IL2/IL2Rα 對比抗癌功效試驗

為了評估本發明的融合蛋白質將IL-2選擇性地傳遞至腫瘤內表達PD-1的T _eff細胞以及使其活化來抑制腫瘤生長的能力，利用MC38大腸癌同基因小鼠腫瘤模型實施本發明的融合蛋白質的抗癌功效評估試驗。在圖9中簡要概括實驗程序。

使用DMEM（+10%胎牛血清（foetal bovine serum，FBS），1%鏈黴素-青黴素（streptomycin-penicillin），1%非必需胺基酸（non-essential amino acid，NEAA））培養基在37℃、5% CO ₂腔室中培養MC38癌細胞。將達到通道9的MC38癌細胞移植用於小鼠。在8週齡C57BL/6雌性小鼠的中背與右肋之間（右背部分）利用1毫升胰島素注射器進行皮下注射注入1×10 ⁶MC38癌細胞。此時，小鼠使用異氟醚（isoflurane）保持麻醉狀態。對皮下注射MC38癌細胞的小鼠經過7天觀察。所有小鼠均購自東方生物（Orient Bio），並在無特異病原條件動物設施（無特異病原（specific-pathogen-free，SPF）設施）中飼養。

7日後，測定腫瘤大小並將達到100立方毫米大小（±30）的小鼠單獨分類用於實驗。獲得總共28只移植有MC38癌細胞的小鼠，並分為四組。各組包括本發明的融合蛋白質A處理組、具有與融合蛋白質A相同的抗PD-1結合域的抗體處理組、異二聚體Fc-IL2/IL2Rα處理組以及作為對照組的PBS處理組。將各試驗物質以相同用量（140皮莫耳）混合於100微升杜氏磷酸鹽緩衝液（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline，DPBS）中，自到第7天開始，每週兩次（BIW），共向小鼠尾靜脈注射四次（PBS處理組僅靜脈注射100微升DPBS）。自到第7天開始每週兩次測定並記錄腫瘤大小及體重。於腫瘤大小達到2000立方毫米的情況進行安樂死。

圖10測定並示出各組隨時間的腫瘤大小變化（圖10a）、小鼠存活期（圖10b）及小鼠體重變化（圖10c）。如圖10a及圖10b所示，本發明的融合蛋白質表現出與單獨使用抗PD-1結合抗體或單獨使用Fc-IL-2/IL-R2α相比明顯優異的腫瘤生長抑制活性及延長小鼠存活期。確認本發明的融合蛋白質達成高達98%的腫瘤生長抑制率（TGI），在總共7只小鼠中，6只保持無腫瘤的（tumor-free）狀態。另一方面，未觀察到由於施用本發明的融合蛋白質而導致的小鼠體重下降（圖10c）。

實施例 5.2 抗 PD-1 及 Fc-IL2/IL2Rα 聯合施用對比抗癌功效試驗使用所述實施例5.1中使用的同一小鼠腫瘤模型來評估本發明的融合蛋白質是否因其獨特的融合結構而表現出改善的抗癌功效。根據所述實施例5.1中記載的程序實施實驗，獲得共21只移植有MC38癌細胞的小鼠，分為本發明的融合蛋白質A處理組、聯合施用具有與融合蛋白A相同的抗PD-1結合域的抗體及異二聚體Fc-IL2/IL2Rα的聯合處理組、以及作為對照組的PBS處理組的三個組來執行。將結果示出於圖11。

令人驚訝的是確認，與將包括相同抗PD-1結合域的抗PD-1抗體和Fc-IL2/IL2Rα聯合施用的組相比，本發明的融合蛋白質發揮出明顯優異的腫瘤生長抑制及去除效果（圖11a），且顯著延長小鼠存活期（圖11b）。此種結果表明，本發明的融合蛋白質可將IL-2有效地傳遞至腫瘤內表達PD-1的T _eff細胞，從而誘導T _eff細胞的增殖及活化，因此發揮出優異的抗癌功效。

實施例 5.3 長期記憶免疫反應試驗為了確認本發明的融合蛋白質是否形成長期記憶免疫從而在中斷施用後亦表現出長期效果，在MC38癌細胞移植（第一次移植）後，藉由施用本發明的融合蛋白質確保處於無腫瘤狀態（tumor-free）的C57BL/6小鼠，實施長期記憶免疫反應試驗。為此，根據實施例5.1中記載的程序，以每週一次（QW）或每週兩次（BIW）的頻率將75皮莫耳至280皮莫耳的融合蛋白質A施用共一次至四次後，將共26只至第一次移植後第60天為止保持無腫瘤的狀態的小鼠（tumor-free mouse）用於實驗（75皮莫耳BIW四次：6只，140皮莫耳BIW四次：6只，150皮莫耳BIW四次：5只，280皮莫耳BIW四次：4只，150皮莫耳QW一次：2只，150皮莫耳QW兩次：3只）。

在MC38第一次移植後第67天，將所述26只小鼠分為兩組，利用皮下注射將1×10 ⁶個MC38癌細胞（14只）或B16F10黑色素瘤細胞（12只）移植至右背部（第二次移植，第二個挑戰），並觀察腫瘤生長。作為對照組，將14只未進行MC38第一次移植與融合蛋白質施用的小鼠（原始態（naïve））分成兩組，利用與以上相同的方法移植MC38或B16F10癌細胞。至第一次移植後第85天為止觀察腫瘤大小變化。實驗程序在圖12簡要概括。

在MC38第一次移植及施用融合蛋白質A後，第二次移植MC38癌細胞的14只小鼠至觀察結束時為止全部保持無腫瘤的狀態，反之，在其他組的小鼠中觀察到腫瘤生長（圖13及圖14）。其中於第二次移植B16F10黑色素瘤細胞的小鼠的情況，儘管沒有額外施用融合蛋白質A，但與原始態小鼠相比，觀察到腫瘤生長受到抑制（圖13）。此種結果意味著本發明的融合蛋白質誘導腫瘤特異性長期免疫反應，即使在中斷施用後亦長期保持對同一癌種的抑制效果（後天性免疫反應），且一部分亦保持對其他癌種的（腫瘤非特異性）抗癌效果（先天性免疫反應）。

實施例 5.4 由單次施用帶來的用量依賴性抗癌效果評估為了確認本發明的融合蛋白質的抗癌效果是否發生用量依賴性變化，使用MC38大腸癌同基因小鼠腫瘤模型進行實驗。

利用與實施例5.1中相同的方法進行實驗，以移植後第7天腫瘤大小100立方毫米±30為基準，將小鼠分為共7個組（每組5只或6只），以0（PBS）、50皮莫耳、150皮莫耳、300皮莫耳、600皮莫耳、1200皮莫耳及3000皮莫耳的用量對各組單次施用融合蛋白質A。一週測定兩次腫瘤大小及體重並記錄，於腫瘤大小達到2000立方毫米的情況進行安樂死。實驗程序在圖15中簡要概括。

如圖16a所示，本發明的融合蛋白質A在0至150皮莫耳區間內與用量成正比地增加腫瘤抑制功效，在300皮莫耳以上的用量下，所有用量中TGI為99%至100%。因此，在單次施用時，對MC38產生抗癌效果飽和的用量判斷為150皮莫耳至300皮莫耳。在體重變化方面，在3000皮莫耳下施用後第10天出現體重下降的現象但重新恢復，除此之外的所有用量均未觀察到體重下降（圖16b）（圖中* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001；使用圖基（Tukey）事後檢驗進行與PBS對照組對比的多種比較（各組對比），二元方差分析（二因數變異數分析（two-way analysis of variance，two-way ANOVA）））。

實施例 5.5 B16F10 黑色素瘤同基因模型中的抗癌效果評估利用與實施例5.1中相同的方法進行實驗，對在移植7.5×10 ⁵B16F10細胞而非MC38癌細胞的9週齡C57BL/6J小鼠中融合蛋白質的功效進行評估。

移植第7天，當腫瘤大小達到平均96立方毫米時，將小鼠分為三組，對各組單次施用PBS（10只）、融合蛋白質A 300皮莫耳（5只）、融合蛋白質A 600皮莫耳（5只）。一週測定兩次腫瘤大小及體重並記錄。

圖17示出各組隨時間的腫瘤大小變化（圖17a）及腫瘤生長抑制率（TGI %）（圖17b）。如圖17a及圖17b所示，融合蛋白質A處理組與PBS處理對照組相比，在統計學上表現出有意義的腫瘤生長抑制效果（以施藥後第13天為基準，與PBS處理組相比，TGI為70.2%（300皮莫耳）及89.2%（600皮莫耳）；圖中* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001，使用圖基事後檢驗的二元方差分析）。

實施例 5.6 Pan02 胰腺癌同基因模型中的抗癌效果評估利用與實施例5.1中相同的方法進行實驗，對在移植3×10 ⁶Pan02癌細胞而非MC38癌細胞的小鼠中融合蛋白質的功效進行評估。

移植第7天，當腫瘤大小達到平均71立方毫米時，將小鼠分為本發明的融合蛋白質A處理組（5只）與PBS處理組（5只）兩組進行施用。將融合蛋白質A混合於100微升DPBS中，以每只小鼠75皮莫耳一週兩次（BIW）的頻率對小鼠尾靜脈注射共四次（PBS處理組僅靜脈注射100微升DPBS）。自移植的第7天開始至第40天為止一週測定兩次腫瘤大小及體重並記錄。

圖18對各組隨時間的腫瘤大小變化（圖18a）、小鼠存活期（圖18b）及小鼠體重變化（圖18c）進行測定並示出。融合蛋白質A自第三次施用時開始至觀察結束日為止表現出5只小鼠全部保持無腫瘤狀態（tumor-free）的優異的抗腫瘤活性（圖18a；TGI 100%，施藥後第17日*** p＜0.001，施藥後第21日～第28日**** p＜0.0001；使用圖基事後檢驗進行與PBS對照組對比的二元方差分析），至觀察結束日為止小鼠全部存活（圖18b）。在體重變化方面，在施用一次融合蛋白質A時暫時觀察到體重降低，但此後重新恢復，未觀察到進一步的體重降低（圖18c）。

實施例 5.7 根據抗 PD-1 Fab 臂個數的抗癌效果的比較評估為了確認本發明的融合蛋白質如何根據抗PD-1 Fab臂的個數改變抗癌效果，使用MC38大腸癌同基因小鼠腫瘤模型進行實驗。利用與實施例5.1相同的方法進行實驗，移植MC38癌細胞第7天，以450皮莫耳的用量施用一次融合蛋白質A（2個PD-1 Fab臂）與融合蛋白質B（1個PD-1 Fab臂）（每組5只），作為對照組，對7只小鼠施用PBS。

直至施藥後第17日，每週兩次測定並記錄腫瘤大小與體重。圖19示出各組隨時間的腫瘤大小變化（圖19a）及腫瘤生長抑制率（TGI %）（圖19b）。如圖19a及圖19b所示，融合蛋白質A處理組及融合蛋白質B處理組與PBS處理對照組相比，在統計學上表現出有意義的腫瘤生長抑制效果（以施藥後第17天為基準，與PBS處理組相比，TGI為100%（融合蛋白質A）及76%（融合蛋白質B）；圖中* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001，使用鄧尼特（Dunnett）事後檢驗的二元方差分析）。

實施例 6 根據 pH 的抗原結合力比較評估已知血液（大約pH 7.4）與腫瘤微環境（tumor microenvironment）（大約pH 5.6～6.8）存在pH差異。因此，在腫瘤微環境的弱酸性pH下的抗體結合力對免疫抗癌抗體的治療功效具有重要影響。在本發明人之前的研究中確認，本發明的融合蛋白質中用作抗PD-1結合域的1G1-h70在腫瘤微環境的低pH值（6.0）下與代表性的抗PD-1抗體藥物、即可瑞達及歐狄沃相比，對人類PD-1表現出更強的結合親和度（PCT/KR2022/001714）。因此，為了確認本發明的融合蛋白質A是否在腫瘤微環境中保持優異的結合親和度，藉由SPR（比亞科8K，思拓凡）分析對與人類PD-1的結合動力學（Kinetics）進行測定。作為用於比較的對照組，自新元藥品購入並使用抗人類PD-1抗體可瑞達（Keytruda，MSD）與歐狄沃（Opdivo，BMS）作為人體用醫藥品。

根據製造商的指南使用胺基偶聯試劑盒（思拓凡）在CM5晶片（思拓凡）中使1微克/毫升濃度的人類PD-1（百普賽斯，貓#PD1-H5221）固定。將7個濃度（0～100奈莫耳/升）的對照抗體（可瑞達、歐狄沃）與1G1-h70以及融合蛋白質A以30微升/分的流速匯合（association）180秒並解離（dissociation）1200秒，流至CM5晶片。在每個濃度循環中，在各個實驗後，利用pH 1.5的甘胺酸（glycine）將晶片再生。此時，電泳緩衝液（running buffer）使用pH 7.4或pH 6.0的HBS-EP+緩衝液（0.1莫耳/升的羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），1.5莫耳/升NaCl，0.03莫耳/升的乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）及0.5% v/v表面活性劑（Surfactant）P20），實驗蛋白質在電泳緩衝液中被稀釋。

比亞科評估軟體3.0版中使用1:1結合模型來執行分析，將其結果的動力學常數（ka及kd）及親和度（KD）值記載於下表3中。

[表3]

	pH 7.4	pH 6.0
ka（1/Ms）	kd（1/s）	KD（M）	ka（1/Ms）	kd（1/s）	KD（M）
可瑞達	7.43E+5	3.61E-4	4.86E-10	1.04E+6	7.75E-4	7.42E-10
歐狄沃	5.63E+5	3.65E-4	6.48E-10	6.60E+5	5.12E-4	7.75E-10
1G1-h70	1.48E+5	3.51E-5	2.37E-10	2.86E+5	1.38E-5	4.81E-11
融合蛋白質A	1.37E+5	7.27E-5	5.30E-10	4.86E+5	2.31E-5	4.76E-11

如表3所示，本發明的融合蛋白質A及1G1-h70抗體在pH 7.4（血液）下表現出與可瑞達及歐狄沃相似水準的結合親和度（KD），但在pH 6.0（腫瘤微環境）下，與可瑞達及歐狄沃相比表現出約15倍至16倍更強的結合親和度。因此，確認，本發明的融合蛋白質在抗PD-1抗體1G1-h70具有的腫瘤微環境的低pH下保持優異的結合親和度。

實施例 7. PD-1 介導的 IL-2 訊號傳遞確認分析為了驗證本發明的融合蛋白質是否表現出PD-1介導的IL-2訊號傳遞，使用海克藍（HEK-Blue ^TM）報告基因檢測系統（因威沃根（Invivogen））分析根據有無利用抗PD-1抗體進行預先處理的IL-2訊號傳遞活性。

在表達IL-2Rβγ的海克藍（HEK-Blue ^TM）CD122/CD132細胞（因威沃根（Invivogen））將pCMV3-hPD1載體或pCMV3-Empty載體（對照組）轉染。以大約50,000細胞/孔的濃度將所述經轉染的細胞分別注入至96孔板並在37℃、5% CO ₂腔室中培養。接著，在去除細胞培養上清液後，每孔每20微升添加1微莫耳/升的抗PD-1抗體（所述實施例6中使用的1G1-h70抗體）或對照組同型（人類IgG4）抗體，並孵化40分鐘。之後，對1奈莫耳/升濃度的重組人類IL-2（rhIL-2）或融合蛋白質A進行處理並在37℃下培養8小時。在將20微升/孔的所述細胞培養上清液添加至新的96孔板中後，利用180微升/孔的比色計分析法試劑、即匡蒂藍（QUANTI-Blue ^TM）溶液（因威沃根（Invivogen））進行處理，並在37℃的培養箱中避光孵化約1小時以上。在反應開始後，以30分鐘間隔使用微盤讀取儀並在620奈米下測定OD。將結果示出於圖20。

如圖20所示，本發明的融合蛋白質在不表達PD-1的細胞（PD-1 ^-CD122 ⁺CD132 ⁺細胞）中表現出與IL-2相比更弱的訊號傳遞反應性（減弱的IL-2Rβγ結合特性），相比之下，在表達PD-1的細胞（PD-1 ⁺CD122 ⁺CD132 ⁺細胞）中表現出與IL-2相比明顯突出的反應性，由此可知本發明的融合蛋白質對PD-1表達細胞是特異性的且選擇性地起作用。另外，在處理本發明的融合蛋白質之前利用抗PD-1抗體進行預先處理以預先阻斷細胞的PD-1的情況下，確認本發明的融合蛋白質的IL-2反應性完全中和。該情形暗示本發明的融合蛋白質表示的IL-2訊號傳遞是由PD-1介導的。

以上為了明確理解本發明詳細記述了例示性的特定實施態樣，但所述說明及實施例不應解釋為限制本發明的範圍。本發明的權利範圍由所附申請範圍及其均等物定義。本案引用的所有專利及科學文獻的揭示內容明確地整體引用作為參考。

序列列表

[表4]

序列編號	說明	序列
1	人類IL-2（UniProt P60568位置21-153）	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
2	人類IL-2（C125S）	APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT
3	人類IL-2Rα（UniProt P01589位置22-272）	ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI
4	人類IL-2Rα細胞外域（UniProt P01589位置22-240）	ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQ
5	人類IL-2Rα突變體 （UniProt P01589 位置22-186，L42I）	ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGS IYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
6	人類IL-15 （UniProt P40933 位置49-162）	NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
7	人類IL-15Rα （UniProt Q13261 位置31-267）	ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
8	人類IL-15Rα細胞外域（UniProt Q13261位置31-205）	ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
9	HCDR1胺基酸	GYWMH
10	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTTYNEKFKN
11	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTVYNEKFKN
12	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTIYNEKFKN
13	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTTYNWKFKN
14	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTVYNWKFKN
15	HCDR2胺基酸	MIHPNSDTTIYNWKFKN
16	HCDR3胺基酸	TDQAAWFAF
17	HCDR3胺基酸	TDQEAWFAF
18	HCDR3胺基酸	TDQAAWAAF
19	HCDR3胺基酸	TDQAAWMAF
20	HCDR3胺基酸	TDQAAWHAF
21	HCDR3胺基酸	TDQAAWFGF
22	HCDR3胺基酸	TDQEAWAAF
23	HCDR3胺基酸	TDQEAWMAF
24	HCDR3胺基酸	TDQEAWHAF
25	HCDR3胺基酸	TDQEAWFGF
26	HCDR3胺基酸	TDQAAWAGF
27	HCDR3胺基酸	TDQAAWMGF
28	HCDR3胺基酸	TDQAAWHGF
29	HCDR3胺基酸	TDQEAWAGF
30	HCDR3胺基酸	TDQEAWMGF
31	HCDR3胺基酸	TDQEAWHGF
32	LCDR1胺基酸	RSSQNIVHSNGDTYLE
33	LCDR1胺基酸	RSSQNIVHSQGDTYLE
34	LCDR1胺基酸	RSSQNIVRSNGDTYLE
35	LCDR1胺基酸	RSSQNIVRSQGDTYLE
36	LCDR2胺基酸	KVSKRFS
37	LCDR3胺基酸	FQGSHVPWT
38	HCVR胺基酸	EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYWMH WVKQRPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRATLTVDKSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTGTDQAAWFAFWGQGTLVTVSA
39	LCVR胺基酸	DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK
40	人源化抗體，1G1-h61 VH胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWMGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSS
41	人源化抗體，1G1-h61 VL胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIK
42	人源化抗體，1G1-h68 VH胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSS
43	人源化抗體，1G1-h68 VL胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIK
44	人源化抗體，1G1-h70 VH胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSS
45	人源化抗體，1G1-h70 VL胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSQGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIK
46	人類IgG4（S228P） 恆定區，重鏈胺基酸	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
47	人類IgG4恆定區，卡帕鏈胺基酸	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
48	人類PD-1蛋白質，全胺基酸	MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL （斜體部分表示訊號序列。 下劃線部分表示細胞外域部分。）
49	Fc突變體鏈1 IgG4 216~447 S228P/Q347R/ T366W	ESKYGPPCP PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP RVYTLPPSQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
50	Fc突變體鏈2 IgG4 216~447 S228P/ K360E/ T366S/ L368A/ Y407V	ESKYGPPCP PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT ENQVSL SC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
51	人源化抗-PD-1，VL-CL胺基酸	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNIVHSQGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（下劃線部分表示可變區。）
52	人源化抗-PD-1，VH-CH1胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV（下劃線部分表示可變區。）
53	正向引體	CCCTCTCCCCCGGCAAGTCAGGAGGTGGATCTGGTGGAG
54	反向引體	GCCCGAATTCGGCGGCCGCTTTATCAGGTCAGCGTAGAGATG
55	正向引體	TctccctgtctccgggtaaaggaggtggaggttctggtggaggtggatctggtggaggaggttctggtggaggtggatctGAGCTGTGTGATGATGATC
56	反向引體	gtcattggggaaacctgctcctaggTTTAGCCGGTACAGATCAG
57	人源化抗-PD-1，IgG4重鏈1，具有IL-2 C125S的杵Fc	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP RVYTLPPSQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SGGGSGGGSGGGSGG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT
58	人源化抗-PD-1，IgG4重鏈2，具有CD25 L42I的臼Fc	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT ENQVSL SC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGS IYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
59	Fc_杵_具有_IL-2C125S	KYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP RVYTLPPSQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SGGGSGGGSGGGSGG APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT
60	人源化抗-PD-1，IgG4重鏈1，不具有IL-2 C125S的杵Fc	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP RVYTLPPSQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
61	人源化抗-PD-1，具有CD25 L42I的IgG4重鏈	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSDTTTYNEKFKNRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAGTDQAAWFAFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGS IYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG

無

圖1a至圖1c概略性地示出包括IL-2與IL-2Rα的根據本發明一實施形態的融合蛋白質的結構。 圖2a及圖2b概略性地示出包括IL-2與IL-2Rα的複合體或IL-15與IL-15Rα的複合體的根據本發明一實施形態的融合蛋白質的結構。 圖3a至圖3d概略性地示出不包括IL-2及IL-15而包括IL-2Rα或IL-15Rα的根據本發明一實施形態的融合蛋白質的結構。 圖4是示出為基於結構設計連接子、根據本發明一實施形態的融合蛋白質與hPD-1及IL-2Rβγ結合的方式的結晶結構分析結果。 圖5是確認根據本發明一實施形態的融合蛋白質A的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）結果。 圖6a及圖6b是確認根據本發明一實施形態的融合蛋白質B、C及D的SDS-PAGE結果。 圖7a及圖7b是利用酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）對是否與根據本發明一實施形態的融合蛋白質的IL-2Rα蛋白質（圖7a）及IL-2Rβγ蛋白質（圖7b）進行選擇性結合進行試驗的結果。 圖8a至圖8d是示出是否表達根據本發明一實施形態的融合蛋白質的PD-1及根據IL-2受體表達種類的IL-2訊號傳遞反應性差異的一系列海克藍（HEK-Blue）試驗結果曲線圖。 圖9示出用於確認在MC38小鼠腫瘤模型中根據本發明一實施形態的融合蛋白質的生物體內抗癌效果的動物實驗日程。 圖10a至圖10c是將在MC38小鼠腫瘤模型中施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的隨時間的腫瘤大小變化（圖10a）、生存率（圖10b）及體重變化（圖10c）與根據單獨施用抗PD-1抗體及單獨施用異二聚體（heterodimeric）Fc-IL2/IL2Rα的結果進行比較的曲線圖。 圖11a至圖11c是將在MC38小鼠腫瘤模型中施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的隨時間的腫瘤大小變化（圖11a）、生存率（圖11b）及體重變化（圖11c）與根據聯合施用抗PD-1抗體及異二聚體Fc-IL2/IL2Rα的結果進行比較的曲線圖。 圖12示出用於確認根據本發明一實施形態的融合蛋白質的長期記憶免疫反應的動物實驗日程。 圖13是示出在長期記憶免疫反應實驗中施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的隨時間的腫瘤大小變化的曲線圖。 圖14是示出在長期記憶免疫反應實驗中施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的腫瘤大小變化的動物模型照片。 圖15示出用於評估在MC38小鼠腫瘤模型中單次施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的容量依存性抗癌效果的動物實驗日程。 圖16a及圖16b是示出在MC38小鼠腫瘤模型中單次施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的隨時間的腫瘤大小變化（圖16a）及體重變化（圖16b）的曲線圖。 圖17a及圖17b是在B16F10小鼠黑色素瘤模型中施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的隨時間的腫瘤大小變化（圖17a）及腫瘤生長抑制率（TGI %）（圖17b）的曲線圖。 圖18a至圖18c是示出在Pan02小鼠胰腺癌模型中施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的隨時間的腫瘤大小變化（圖18a）、生存率（圖18b）及體重變化（圖18c）的曲線圖。 圖19a及圖19b是對MC38小鼠腫瘤模型中單次施用根據本發明一實施形態的融合蛋白質A與B的隨時間的腫瘤大小變化（圖19a）及腫瘤生長抑制率（TGI %）（圖19b）進行比較並示出的曲線圖。 圖20是海克藍（HEK-Blue）試驗結果的圖表，示出依據是否利用根據本發明一實施形態的融合蛋白質的抗PD-1抗體進行預先處理的IL-2訊號傳遞反應性差異。

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Claims (38)

1. 一種融合蛋白質，包括一個以上免疫細胞抗原結合域、由兩個Fc鏈形成的Fc域及細胞激素作用域，其中所述細胞激素作用域包括白血球介素-2受體的α-次單元（α-subunit of interleukin-2 receptor，IL-2Rα）多肽或白血球介素-15受體的α-次單元（α-subunit of interleukin-15 receptor，IL-15Rα）多肽。
2. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述細胞激素作用域包括IL-2Rα多肽及IL-2多肽，所述IL-2Rα多肽及所述IL-2多肽彼此間不進行共價鍵結且分別連接至所述Fc域的彼此不同的Fc鏈。
3. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述細胞激素作用域為包括IL-2Rα多肽及IL-2多肽的複合體，所述複合體內的所述IL-2Rα多肽與所述IL-2多肽彼此共價鍵結，且所述複合體藉由IL-2Rα多肽或IL-2多肽連接至所述Fc域的所述Fc鏈中的一者。
4. 如請求項1至3中任一項所述的融合蛋白質，其中所述IL-2Rα多肽為具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的IL-2Rα多肽或IL-2Rα多肽的IL-2結合片段、細胞外（extracellular）域或斯世（Sushi）域，且所述IL-2Rα多肽可包括增加對結合配位體IL-2多肽的結合的一種以上胺基酸修飾。
5. 如請求項4所述的融合蛋白質，其中所述IL-2Rα多肽包括以SEQ ID NO: 3的胺基酸序列號為基準的選自以下中的一個以上的胺基酸置換：L2D、L2E、L2Q、M25L、M25I、N27A、N27T、N27I、N27Y、S39K、L42F、L42I、L42A、L42V、L45R、N57E、I118R、H120A、H120D、H120K、H120Y、H120L、H120W、H120R及K153G。
6. 如請求項4所述的融合蛋白質，其中所述IL-2Rα多肽包括以SEQ ID NO: 3的胺基酸序列號為基準的L42I的胺基酸置換或包括SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
7. 如請求項2或3所述的融合蛋白質，其中所述IL-2多肽包括以SEQ ID NO: 1的胺基酸序列號為基準的C125S的胺基酸置換或增加對所述IL-2Rα多肽的結合的一種以上胺基酸修飾，或者所述IL-2多肽進行循環置換（circular permutated）。
8. 如請求項7所述的融合蛋白質，其中所述IL-2多肽包括以SEQ ID NO: 1的胺基酸序列號為基準的T37K的胺基酸置換。
9. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述細胞激素作用域包括IL-15Rα多肽及IL-15多肽，且所述IL-15Rα多肽及所述IL-15多肽分別連接至所述Fc域的彼此不同的Fc鏈。
10. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述細胞激素作用域為包括IL-15Rα多肽及IL-15多肽的複合體，所述複合體內的所述IL-15Rα多肽與所述IL-15多肽彼此共價鍵結，且所述複合體藉由IL-15Rα多肽或IL-15多肽連接至所述Fc域的所述Fc鏈中的一者。
11. 如請求項1、9及10中任一項所述的融合蛋白質，其中所述IL-15Rα多肽為具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的IL-15Rα多肽或IL-15Rα多肽的IL-15結合片段、細胞外（extracellular）域或斯世（Sushi）域，且所述IL-15Rα多肽可包括增加對配位體IL-15多肽的結合的一種以上胺基酸修飾。
12. 如請求項9或10所述的融合蛋白質，其中所述IL-15多肽包括增加對所述IL-15Rα多肽的結合的一種以上胺基酸修飾或者所述IL-15多肽進行循環置換（circular permutated）。
13. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述免疫細胞抗原結合域包含與一種以上T細胞靶抗原特異性結合的抗體的Fab分子或所述抗體的抗原結合片段。
14. 如請求項13所述的融合蛋白質，更包含與一種以上腫瘤細胞靶抗原特異性結合的抗體的Fab分子或所述抗體的抗原結合片段。
15. 如請求項13所述的融合蛋白質，其中所述免疫細胞抗原結合域包含與程式性細胞死亡-1（programmed cell death-1，PD-1）蛋白質特異性結合的抗體的Fab分子或所述抗體的抗原結合片段。
16. 如請求項15所述的融合蛋白質，其中所述免疫細胞抗原結合域為帕博利珠單抗（pembrolizumab）或納武單抗（nivolumab）抗體的Fab分子或其抗原結合片段、或者為與和帕博利珠單抗或納武單抗抗體或抗原結合片段相同的抗原決定區結合或與帕博利珠單抗或納武單抗抗體或抗原結合片段競爭的抗體的Fab分子或其抗原結合片段。
17. 如請求項15所述的融合蛋白質，其中所述免疫細胞抗原結合域為包含以下的抗PD-1（anti-PD-1）抗體的Fab分子或其抗原結合片段： 重鏈互補性決定區1（heavy chain complementarity-determining region 1，HCDR1），包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列， 重鏈互補性決定區2，包含選自由SEQ ID NO: 10至15組成的群組中的任一者的胺基酸序列， 重鏈互補性決定區3，包含選自由SEQ ID NO: 16至31組成的群組中的任一者的胺基酸序列， 輕鏈互補性決定區1（light chain complementarity-determining region 1，LCDR1），包含選自由SEQ ID NO: 32至35組成的群組中的任一者的胺基酸序列， 輕鏈互補性決定區2，包含SEQ ID NO: 36的胺基酸序列，以及 輕鏈互補性決定區3，包含SEQ ID NO: 37的胺基酸序列。
18. 如請求項15所述的融合蛋白質，其中所述免疫細胞抗原結合域包括包含以下的抗PD-1抗體的Fab分子或其抗原結合片段：包含SEQ ID NO: 38、40、42或44的胺基酸序列的重鏈可變區的互補性決定區（complementarity determining region，CDR）1、互補性決定區2及互補性決定區3；以及包含SEQ ID NO: 39、41、43或45的胺基酸序列的輕鏈可變區的互補性決定區1、互補性決定區2及互補性決定區3。
19. 如請求項17或18所述的融合蛋白質，其中所述免疫細胞抗原結合域為包含以下的抗PD-1抗體的Fab分子或其抗原結合片段：包含與SEQ ID NO: 38、40、42或44的胺基酸序列序列同一性至少為75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%以上的胺基酸序列的重鏈可變區；以及包含與SEQ ID NO: 39、41、43或45的胺基酸序列序列同一性至少為75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%以上的胺基酸序列的輕鏈可變區。
20. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述Fc域為IgG類Fc域或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類Fc域，且於為IgG4 Fc域的情況能夠包括S228P的胺基酸置換（以卡巴（Kabat）文獻的EU編號系統為基準）。
21. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述Fc域包括使與Fc受體的結合或效用功能降低的一種以上的胺基酸修飾，或者所述Fc域缺少CH2域。
22. 如請求項21所述的融合蛋白質，其中所述Fc域包括在選自E233、L234、L235、G236、G237、N297、L328、P329及P331中的一個以上位置（以卡巴（Kabat）文獻的EU編號系統為基準）處的胺基酸修飾。
23. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述Fc域包括促進所述兩個Fc鏈間的異二聚體的形成的修飾。
24. 如請求項23所述的融合蛋白質，其中所述修飾為在所述Fc域的任一Fc鏈中包括杵（knob）修飾且在另一Fc鏈中包括臼（hole）修飾的杵入臼（knob-into-hole）修飾。
25. 如請求項24所述的融合蛋白質，其中所述杵修飾包括以卡巴（Kabat）的EU編號系統為基準T366W的胺基酸置換，且所述臼修飾包括T366S、L368A及Y407V的胺基酸置換。
26. 如請求項25所述的融合蛋白質，其中所述Fc域的杵鏈更包括S354C的胺基酸置換，且所述Fc域的臼鏈更包括Y349C的胺基酸置換。
27. 如請求項24至26中任一項所述的融合蛋白質，其中 所述Fc域的任一Fc鏈更包括K360E的胺基酸置換，且另一Fc鏈更包括Q347R的胺基酸置換，或者 所述Fc域的任一Fc鏈更包括K360E及Q347E的胺基酸置換，且另一Fc鏈更包括Q347R的胺基酸置換或K360R及Q347R的胺基酸置換。
28. 如請求項1所述的融合蛋白質，其中所述細胞激素作用域藉由連接子與所述Fc域結合。
29. 如請求項28所述的融合蛋白質，其中所述連接子為肽連接子。
30. 如請求項29所述的融合蛋白質，其中所述連接子為一般式(GX)n、(GGGX)n、(XGGG)nXGG或(GGGGX)n的肽，此處X為A或S，且n為1至4的自然數。
31. 如請求項13至19中任一項所述的融合蛋白質，其中所述抗原結合片段為單鏈可變區片段、(scFV) ₂、雙單鏈可變區片段、二硫鍵穩定性Fv片段、(dsFv) ₂、Fv、dsFv-dsFv'、雙抗體（diabody）、雙鏈雙抗體、三抗體（triabody）、四抗體（tetrabody）、奈米抗體、域抗體、單域抗體（sdAb）或二價域抗體。
32. 一種多核苷酸，對如請求項1至3、請求項9及請求項10中任一項所述的融合蛋白質進行編碼。
33. 一種表達載體，包括如請求項32所述的多核苷酸。
34. 一種宿主細胞，包含如請求項32所述的多核苷酸或包括所述多核苷酸的表達載體。
35. 一種如請求項1至3、請求項9及請求項10中任一項所述的融合蛋白質的生產方法，包括以下步驟：培養包括包含多核苷酸的表達載體的宿主細胞，所述多核苷酸對如請求項1至3、請求項9及請求項10中任一項所述的融合蛋白質進行編碼。
36. 如請求項35所述的融合蛋白質的生產方法，其中所述表達載體包括： 第一表達載體，包括對SEQ ID NO: 51的胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列及對SEQ ID NO: 57的胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列，以及 第二表達載體，包括對SEQ ID NO: 51的胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列及對SEQ ID NO: 58的胺基酸序列進行編碼的多核苷酸序列。
37. 如請求項36所述的融合蛋白質的生產方法，其中在宿主細胞中同時表達所述第一表達載體及所述第二表達載體，以獲得所述融合蛋白質。
38. 一種藥學組成物，包含如請求項1至3、請求項9及請求項10中任一項所述的融合蛋白質，用以預防、改善或治療腫瘤、癌症、轉移性腫瘤、轉移性癌症或感染性疾病。

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