TW202028241A - 可三價結合cd40之雙特異性抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於三價結合於CD40及單價結合於目標細胞抗原的新穎雙特異性抗原結合分子，且係關於製造此等分子之方法及其使用方法。

Description

可三價結合CD40之雙特異性抗原結合分子
本發明係關於三價結合CD40於且單價結合於目標細胞抗原，尤其纖維母細胞活化蛋白(FAP)之新穎雙特異性抗原結合分子。本發明亦係關於製造此等分子之方法及其使用方法。
在產生有效適應性免疫反應期間需要多個分子信號。信號1涉及T細胞抗原受體(TCR)與其存在於抗原呈現細胞(APC)之表面上之同源抗原之結合。信號2由協同刺激受體與其在T細胞同APC之間的相應配位體接合組成。最佳研究且最重要的協同刺激效應子之一為腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員CD40及其配位體CD40L (Elgueta R. 等人， Immunol Rev. 2009;229(1):152-72 )。包括CD40功能之若干TNFR家族成員在初始T細胞活化之後用於支持APC及細胞反應，且因此在免疫系統之組構及功能中起關鍵作用(Watts T.H. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23-68)。不同協同刺激TNFR家族成員之組合允許APC及T細胞活化及存活期之連續及暫時調節，導致免疫反應增加，同時維持APC及T細胞功能之緊密控制。視疾病病狀而定，經由協同刺激TNF家族成員之刺激可加重或改善疾病。TNFR家族協同刺激因子之活化或阻斷展現若干治療性應用(包括癌症、傳染病、移植及自體免疫)在多個領域中之前景。
在若干協同刺激分子中，TNFR家族成員CD40藉由誘導APC之協同刺激分子之成熟、存活、抗原呈現、細胞介素製造及表現而在觸發免疫反應中起關鍵作用，APC接著藉由促炎性細胞介素驅動抗原特異性T細胞反應及NK細胞活化。CD40調節針對感染、腫瘤及自身抗原之免疫反應，且已證明其於APC (諸如B細胞、樹突狀細胞(DC)、單核細胞及巨噬細胞以及血小板)及非造血來源之細胞(諸如肌纖維母細胞、纖維母細胞、上皮及內皮細胞)之表面上的表現(Elgueta R. 等人，Immunol Rev. 2009;229(1):152-72 )。CD40配位體CD40L表現於經活化之CD4+ 輔助T細胞、血小板、單核球性細胞、自然殺手細胞、肥大細胞及嗜鹼性球(Carbone E. 等人，J Exp Med. 1997;185(12): 2053-2060 ，或 Elgueta R. 等人， Immunol Rev. 2009;229(1):152-72 )。CD40及CD40L之表現回應於各種免疫刺激信號及APC與CD4+ T細胞之間的CD40-CD40L相互作用而強烈上調，有助於增加APC活化及抗原特異性CD8+ T細胞反應(Bevan MJ., Nat Rev Immunol. 2014;4(8):595-602 )。藉由使用CD40促效性抗體觀測到類似免疫刺激結果(Vonderheide RH 及 Glennie MJ., Clin Cancer Res. 2013;19(5):1035-43 )。
I型跨膜受體CD40藉由其天然配位體CD40L、II型跨膜蛋白質藉由促效抗體之接合促進CD40簇集且誘導銜接子蛋白質募集至細胞質受體域。稱為TNF受體相關因子(TRAF)之此等銜接子蛋白質之募集引起促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)以及典型及非典型核因子κB (NFκB)信號傳導路徑之協同活化(Elgueta R. 等人，Immunol Rev. 2009;229(1):152-72 )。又，此產生APC成熟及活化，其隨後使抗原特異性T細胞反應達到最大。近期研究已顯示促效CD40抗體在利用抗腫瘤免疫性方面之兩種不同作用模式。除其經由激活適應性免疫系統介導腫瘤細胞殺滅的間接作用模式之外，促效CD40抗體可經由誘導表現CD40之實體腫瘤細胞之細胞凋亡來誘導直接腫瘤細胞殺滅(Eliopoulos AG. 等人， Mol Cell Biol. 2000;20(15):5503-15 )。腫瘤細胞之直接CD40抗體介導之殺滅可以提供可藉由APC處理且呈現之腫瘤抗原來源，該APC係藉由經抗CD40抗體之CD40接合同時活化，接著可以誘導腫瘤抗原特異性T細胞，即被稱為內源性疫苗接種之假定機制。鑒於CD40接合可建立高效抗癌免疫反應，已成功地在多種臨床前腫瘤模型中使用促效性CD40抗體，此等腫瘤模型均作為單一藥劑且與化學療法組合使用(Vonderheide RH 及 Glennie MJ., Clin Cancer Res. 2013;19(5):1035-43 )。
迄今為止，在臨床試驗中研究六種CD40 mAb：在臨床1階段研究中研究Chi Lob 7/4 (CD40促效IgG1嵌合mAb；Cancer Research UK；Chowdhury F. 等人,Cancer Immunol Res. 2013;2:229-40 )、ADC1013 (全人類CD40促效性IgG1抗體；Alligator Bioscience 及Johnson & Johnson;Mangsbo SM. 等人,Clin Cancer Res. 2015 年 3 月 1 日 ;21(5):1115-26 )、APX-005 (完全人類化CD40促效IgG1 mAb；Apexigen;Bjorck P. 等人 , J Immunother Cancer. 2015; 3( 增刊 2): P198 )、SEA-CD40 (CD40促效IgG1嵌合mAb; Seattle Genetics;Gardai SJ. 等人AACR 第 106 屆年會； 2015 年 4 月 18-22 日，摘要 2472 )，以及RO7009789 (全人類CD40超促效IgG2 mAb)，且在臨床II階段研究中研究達西珠單抗(dacetuzumab) (CD40部分促效IgG1嵌合mAb；Seattle Genetics;Khubchandani S. 等人,Curr Opin Investig Drugs. 2009;10,579-87 )。此等研究之符合條件的患者具有實體腫瘤、經典霍奇金淋巴瘤(HL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)或惰性淋巴瘤(包括濾泡性淋巴瘤)。已展示此等CD40促效抗體之多樣活性，其範圍係經由補體介導之細胞毒性(CMC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)自CD40+ 腫瘤細胞之Fc依賴性細胞毒性至用以誘導抗腫瘤T細胞反應之APC活化以及用以使腫瘤及腫瘤基質萎縮之巨噬細胞活化。迄今為止，不存在關於此所觀測到之異質性的結論性解釋。然而，近期研究指出，此作用模式多樣性可至少部分地藉由抗原決定基特異性、同型或Fc:FcγR相互作用中之抗CD40抗體之差異來解釋。舉例而言，活體內CD40促效抗體似乎需要將由其於目標細胞上之Fab片段結合之CD40與由其於除目標細胞以外的細胞上之Fc片段結合之Fcγ受體交聯，如關於對TNFR超家族之其他細胞凋亡誘導或免疫調節成員具有特異性之促效抗體所描述(Dahan R., Cancer Cell. 2016 Jun 13;29(6):820-31; Li F. 及 Ravetch J.V. Science, 2011;333, 1030-1034; Teng M.W. 等人, J. Immunol. 2009;183, 1911-1920 )。所提出之機制包括Fcγ受體介導之D40跨膜分子於目標細胞上之簇集及隨後加強的CD40信號傳導以實現強效活體內功效。
促效CD40抗體之臨床開發已提供有前景的初始結果。在第一臨床試驗中，CP-870,893已展示在患有晚期癌症之患者中之臨床功效。29名患有晚期癌症之患者中有四名在接受CP-870,893之單一靜脈內輸注之後示出部分反應(Vonderheide RH., J Clin Oncol. 2007 年 3 月 1 日； 25(7):876-83 )。經9次連續劑量之CP-870,893治療之此等四名患者中有一位在一年半內保持完全緩解超過5年。然而，CP-870,893之最常見副作用為細胞介素釋放症候群及血栓栓塞事件，使得在使用劑量時程及投與途徑之情況下，超過140名患者之1階段臨床研究之組合資料僅指示有限臨床功效且建議局部投與抗體(Vonderheide RH, Glennie M, Clin Cancer Res. 2013, 19(5), 1035-1043 )。缺乏單一藥劑反應部分地由於由廣泛CD40表現所引起之嚴重中靶/脫靶腫瘤效應而發生，由此引起劑量限制毒性(例如細胞介素釋放症候群)。開發在CD40由腫瘤特異性目標交聯時特異性活化APC之促效CD40抗體可減少副作用且減少劑量限制，從而為新的治療選項提供產生高效持久的抗癌免疫性之潛能。
可用臨床前及臨床資料清楚地表明，對能夠誘導及增強對癌症之有效內源免疫反應的CD40之有效促效劑存在較高臨床需求。然而，幾乎從不存在限於單一類型之細胞或經由單一機制起作用之作用，且設計成闡明細胞間及細胞內信號傳導機制之研究已揭露複雜性水準漸增。歸因於諸如細胞介素釋放症候群及凝血細胞/內皮細胞活化之劑量限制性毒性，已知CD40抗體僅可以相對較低劑量投與，導致目標APC之路徑活化不足且治療指數窄。因此，需要較佳地作用於單一類型之細胞的「靶向」促效劑。
本發明係關於能夠特異性結合於CD40及目標細胞抗原之新的雙特異性抗原結合分子。如同其他TNF家族成員，CD40L之活體內及活體外活性需要同源三聚組態，且生長證據表明，生物活性視CD40之高階簇群而定。因此，對於促效CD40抗體，產生包含三個能夠特異性結合之部分且因此展示與三聚CD40配位體類似之生物活性的分子亦可具有優勢。本發明之抗原結合分子將能夠較佳結合於腫瘤特異性目標或腫瘤相關目標之部分與三個能夠促效結合於CD40之部分組合，其中經由CD40活化APC係藉由經由目標細胞抗原(例如表現於腫瘤基質細胞上之FAP)及潛在地經由直接表現於二級淋巴組織中之FAP的交聯提供。雙特異性抗原結合分子之FAP依賴性交聯將CD40表現細胞之活化限制於腫瘤組織且潛在地亦限制於二級淋巴組織，諸如腫瘤引流淋巴結。相比於能夠特異性結合於CD40及經活化T細胞上之免疫檢查點受體的雙特異性抗原結合分子(諸如CTLA-4或PD-1)，靶向諸如FAP之腫瘤目標能夠主要在腫瘤基質及腫瘤引流淋巴結中進行CD40介導之APC活化，其中相較於其他組織，纖維母細胞表現增加之FAP含量。因此，本發明之抗原結合分子可能夠不僅有效地觸發CD40受體，而且在所需位點極具選擇性地觸發CD40受體，同時克服對FcγR交聯之需求，由此減少副作用。
本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其組合三個能夠特異性結合於協同刺激TNF受體家族成員CD40之部分(抗原結合域)與至少一個靶向目標細胞抗原之抗原結合側。此等雙特異性抗原結合分子為有利的，因為歸因於其對於目標細胞抗原之結合能力，其將較佳地在表現目標細胞抗原之位點處活化協同刺激CD40受體。
因此，本發明係關於與CD40三價結合之雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)的VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)的VH-CH1鏈又在其C端融合至第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段融合至該等Fc域次單元中之一者之C端。
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其由以下組成： (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)的VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)的VH-CH1鏈又在其C端融合至該第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段融合至該等Fc域次單元中之一者之C端。
在一個態樣中，雙特異性抗原結合分子由以下組成： (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)的VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)的VH-CH1鏈又在其C端融合至該第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段融合至該第二Fc域次單元之C端。
在一個態樣中，雙特異性抗原結合分子由以下組成： (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端經由肽連接子融合至該第一Fab片段(a)的VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)的VH-CH1鏈又在其C端融合至該第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段經由肽連接子融合至該第二Fc域次單元之C端。
在一個態樣中，能夠特異性結合於CD40之抗原結合域結合於包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或由其組成的多肽。在一個態樣中，能夠特異性結合於CD40之第一、第二及第三Fab片段包含能夠特異性結合於CD40之一致抗原結合域。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域係能夠特異性結合於纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗原結合域。特定言之，能夠特異性結合於FAP之抗原結合域結合於包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列或由其組成的多肽。因此，在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域及至少一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域。
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-L3。
在另一態樣中，提供如上文所定義之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
特定言之，提供如上文所定義之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含：(a)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或 (b)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含選自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28組成之群之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含選自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30組成之群之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之CDR-L3。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (i)重鏈可變區(VH FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36，及 (ii)輕鏈可變區(VL FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:42。
此外，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)， (b)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)， (c)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或 (d)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含重鏈可變區(VH CD40)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之CDR-L3。
在又一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60。
此外，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。
特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (a)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (b)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (c)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (d)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (e)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (f)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (g)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (h)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (i)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (j)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (k)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (l)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (m)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (n)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (o)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (p)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL。
更特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含：VH，其包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (a)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (b)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (c)包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (d)包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (e)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (f)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (g)包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (h)包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (i)包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的VL，或 (j)包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的VL，或 (k)包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的VL，或 (l)包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的VL。
更特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含：包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域包含：包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL。
此外，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (i)三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含：包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)，及 (ii)一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在一個特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含(i)三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含：包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)，及(ii)一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含(i)三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含：包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)，及(ii)一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在一個態樣中，雙特異性抗原結合分子係人類化或嵌合抗體。在另一態樣中，雙特異性抗原結合分子包含IgG Fc區，特定言之，IgG1 Fc區或IgG4 Fc區。特定言之，Fc區包含一或多個降低抗體對Fc受體之結合親和力及/或效應功能的胺基酸取代。在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中Fc區屬於具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)之人類IgG1子類別。
在另一態樣中，提供如上文所定義之雙特異性抗原結合分子，其中根據杵-臼方法，Fc區之第一次單元包含杵且Fc區之第二次單元包含臼。特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中(i) Fc區之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引編號)且Fc區之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)，或(ii) Fc區之第一次單元包含胺基酸取代K392D及K409D (根據Kabat EU索引編號)且Fc區之第二次單元包含胺基酸取代E356K及D399K (根據Kabat EU索引編號)。更特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中Fc區之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引編號)且Fc區之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在另一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之Fab片段中之一或多者包含：在位置123之胺基酸處包含精胺酸(R) (根據Kabat EU索引編號)及/或在位置124之胺基酸處包含離胺酸(K) (根據Kabat EU索引編號)的CL域，及在位置147之胺基酸處包含麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)及/或在位置213之胺基酸處包含麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)的CH1域。
根據本發明之另一態樣，提供一種編碼如上文所描述之雙特異性抗原結合分子的經分離核酸。本發明進一步提供一種載體，特定言之，表現載體，其包含本發明之經分離核酸及包含本發明之經分離核酸或表現載體之宿主細胞。在一些態樣中，宿主細胞為真核細胞，特定言之，哺乳動物細胞。
在另一態樣中，提供一種製造如上文所描述之雙特異性抗原結合分子的方法，其包含：在適合於表現雙特異性抗原結合分子之條件下培養如上文所描述之宿主細胞；及分離雙特異性抗原結合分子。本發明亦涵蓋藉由本發明方法製造的特異性結合於CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含如前文所描述之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。
本發明亦涵蓋如上文所描述之雙特異性抗原結合分子或包含該雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物，其用作藥劑。
在一個態樣中，提供一種如前文所描述之雙特異性抗原結合分子或本發明之醫藥組合物，其用於 (i)藉由表現CD40之抗原呈現細胞(APC)誘導免疫刺激， (ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應， (iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡， (iv)治療癌症， (v)延遲癌症進展， (vi)延長罹患癌症之患者的存活期， (vii)治療感染。
在一特定態樣中，提供如前文所描述之雙特異性抗原結合分子或本發明之醫藥組合物，其用於治療癌症。在另一特定態樣中，本發明提供如前文所描述之用於治療癌症之雙特異性抗原結合分子，其中雙特異性抗原結合分子與化學治療劑、輻射及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。在另一態樣中，提供如前文所描述之雙特異性抗原結合分子或本發明之醫藥組合物，其用於上調或延長細胞毒性T細胞活性。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制個體中腫瘤細胞生長之方法，其包含向該個體投與有效量之如前文所描述之雙特異性抗原結合分子或本發明之醫藥組合物，以抑制腫瘤細胞生長。在另一態樣中，本發明提供一種治療或延遲個體之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之如前文所描述之雙特異性抗原結合分子或本發明之醫藥組合物。
亦提供如前文所描述之雙特異性抗原結合分子的用途，其用於製造供治療有需要之個體的疾病的藥劑，特定言之，用於製造供治療癌症之藥劑，以及提供一種治療個體之疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量之組合物，該組合物包含醫藥學上可接受之形式的本發明的雙特異性抗原結合分子。在一特定態樣中，疾病係癌症。在上述態樣中之任一者中，個體係哺乳動物，尤其人類。
定義 除非以其他方式定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域中通常所使用相同之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下定義且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之亦然。
如本文所用，術語「抗原結合分子 」在其最廣泛的意義上係指特異性結合抗原決定子的分子。抗原結合分子之實例係抗體、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。
如本文所用，術語「能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域 」或「能夠特異性結合於目標細胞抗原之部分」係指特異性結合於抗原決定子之多肽分子。在一個態樣中，抗原結合域能夠經由其目標細胞抗原活化信號傳導。在一特定態樣中，抗原結合域能夠將其所連接之實體(例如，CD40促效劑)引導至目標位點，例如攜帶抗原決定子之特定類型的腫瘤細胞或腫瘤基質。能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域包括如本文進一步定義之抗體及其片段。另外，能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域包括如本文進一步定義之骨架抗原結合蛋白，例如基於所設計之重複蛋白質或所設計之重複域(參見例如WO 2002/020565)之結合域。
關於抗體或其片段，術語「能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域」係指包含特異性結合於部分或全部抗原及與部分或全部抗原互補之區域的分子的一部分。可例如藉由一或多種抗體可變域(亦稱作抗體可變區)提供能夠特異性結合抗原之抗原結合域。特定言之，能夠特異性結合抗原之抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。在另一態樣中，「能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域」亦可為Fab片段或交叉Fab片段。
術語「抗體 」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
如本文所使用之術語「單株抗體 」係指自實質上均質抗體之群體獲得的抗體，亦即包含該群體之個別抗體係相同的及/或結合相同抗原決定基，除例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑之製造期間產生的可能之變異抗體之外，此類變異體一般少量地存在。相比於典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。
如本文所使用之術語「單特異性 」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，該一或多個結合位點中之每一者結合於相同抗原之相同抗原決定基。術語「雙特異性 」意謂抗原結合分子能夠特異性結合於至少兩個不同的抗原決定子。典型地，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其中每一者對不同抗原性決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之，兩個不同細胞上所表現的兩個抗原決定子。如本文所描述之雙特異性抗原結合分子亦可形成多特異性抗體之一部分。
如本申請案中所用的術語「價 」指示存在對抗原結合分子中一個獨特抗原決定子具有特異性的指定數目之結合位點，其對一個獨特抗原決定子具有特異性。因此，術語「二價」、「三價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中對某一抗原決定子具有特異性之兩個結合域、三個結合域、四個結合域及六個結合域之存在。在本發明之特定態樣中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子對於某一抗原決定子可為單價，意謂其具有僅一個針對該抗原決定子之結合位點，或其對於某一抗原決定子可為二價、三價或四價，意謂其針對該抗原決定子分別具有兩個結合位點、三個結合位點或四個結合位點。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，以指代具有與原生抗體結構實質上類似之結構的抗體。「原生 抗體 」係指具有不同結構的天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG類抗體係約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，之後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，之後為輕鏈恆定域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體之重鏈可歸為五種類型中之一者，該五種類型稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1)及α2 (IgA2)。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為卡帕(kappa) (κ)及拉姆達(lambda) (λ)。
「抗體片段 」係指不同於完整抗體，包含完整抗體之一部分，結合完整抗體所結合之抗原的分子。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、交叉Fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及單域抗體。對某些抗體片段之綜述參見Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Plückthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, NewYork, 第269-315頁 (1994)；亦參見WO93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性，參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單域抗體為包含抗體重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)製造，如本文所描述。
完整抗體之番木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自含有重鏈及輕鏈可變域以及輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。因此，如本文所使用，術語「Fab 片段 」係指包含有包含輕鏈的VL域及恆定域(CL)之輕鏈片段，及重鏈的VH域及第一恆定域(CH1)的抗體片段。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸之重鏈CH1域的羧基端處添加幾個殘基。Fab'-SH為其中恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab'片段。胃蛋白酶處理產生F(ab')2 片段，其具有兩個抗原組合位點(兩個Fab片段)及Fc區之一部分。根據本發明，術語「Fab片段」亦包括如下文所定義之「交叉Fab片段」或「互換型Fab片段」。
術語「交叉 Fab 片段 」或「xFab片段」或「交換型Fab片段」係指其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區交換之Fab片段。交換型Fab分子可能有兩種不同之鏈組成且其包含在本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab重鏈及輕鏈之可變區交換，亦即，交換型Fab分子包含作為重鏈之部分的由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈，及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈。此交換型Fab分子亦稱為交叉Fab (VLVH )。另一方面，當Fab重鏈及輕鏈之恆定區交換時，互換型Fab分子包含作為重鏈之部分的由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈，及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈。此互換型Fab分子亦稱為交叉Fab (CLCH1 )。
「單鏈Fab片段」或「scFab 」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該抗體域及該連接子按N端至C端方向具有以下次序中之一者：a) VH-CH1-連接子-VL-CL，b) VL-CL-連接子-VH-CH1，c) VH-CL-連接子-VL-CH1或d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為至少30個胺基酸，較佳32與50個胺基酸之間的多肽。該等單鏈Fab片段經由CL域與CH1域之間的天然二硫鍵穩定化。此外，此等單鏈Fab分子可能藉由經由插入半胱胺酸殘基(例如，根據Kabat編號之可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)產生鏈間二硫鍵而進一步穩定化。
「交換型單鏈Fab片段」或「x-scFab 」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該抗體域及該連接子按N端至C端方向具有以下次序中之一者：a) VH-CL-連接子-VL-CH1，及b) VL-CH1-連接子-VH-CL；其中VH及VL一起形成特異性結合於抗原之抗原結合位點，且其中該連接子為至少30個胺基酸之多肽。此外，此等x-scFab分子可能藉由經由插入半胱胺酸殘基(例如，根據Kabat編號之可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)產生鏈間二硫鍵而進一步穩定化。
「單鏈可變片段 (scFv) 」係用具有十至約25個胺基酸之短連接肽連接的抗體之重鏈(VH )及輕鏈(VL )可變區之融合蛋白。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可連接VH 之N端與VL 之C端，或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保留初始抗體之特異性。scFv抗體例如描述於Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)中。另外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH域(亦即能夠與VL域一起組裝成功能性抗原結合位點)或VL域(亦即能夠與VH域一起組裝成功能性抗原結合位點)之特徵，且由此提供全長抗體之抗原結合特性。
「骨架抗原結合蛋白」在此項技術中已知，例如纖維結合蛋白及經設計錨蛋白重複蛋白質(DARPins)已用作抗原結合域之替代骨架，參見例如Gebauer及Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及Stumpp等人，Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，骨架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4 (艾維伯迪(Evibody))；脂質運載蛋白(抗運載蛋白(Anticalin))；蛋白質A衍生之分子，諸如蛋白質A之Z結構域(親和抗體)；A結構域(高親和性多聚體/最大抗體)；血清運鐵蛋白(反式體)；經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPin)；抗體輕鏈或重鏈之可變結構域(單域抗體，sdAb)；抗體重鏈之可變結構域(奈米抗體，aVH)；VNAR 片段；纖維結合蛋白(阿耐克汀(AdNectin))；C型凝集素結構域(四連接素(Tetranectin))；新型抗原受體β-內醯胺酶之可變結構域(VNAR 片段)；人類γ-晶狀體球蛋白或泛素(阿菲林(Affilin)分子)；人類蛋白酶抑制劑之kunitz型結構域，微體，諸如來自knottin家族之蛋白質、肽適體及纖維結合蛋白(阿耐克汀(adnectin))。CTLA-4 (細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)為表現於大部分CD4+ T細胞上之CD28家族受體。其細胞外域具有可變域類Ig摺疊。對應於抗體之CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造成具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為艾維伯迪(Evibody) (例如US7166697B1)。艾維伯迪與抗體(例如域抗體)之經分離之可變區的尺寸大致相同。關於其他細節，參見Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。脂質運載蛋白為細胞外蛋白質之家族，其傳遞小型疏水性分子，諸如類固醇、後色膽素、類視黃素及脂質。其具有剛性β-片狀第二結構，其在圓錐結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以與不同目標抗原結合。抗運載蛋白之大小在160-180個胺基酸之間，且衍生於脂質運載蛋白。關於其他細節，參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1及US20070224633。親和抗體為來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白A之骨架，其可經工程改造以結合至抗原。域由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。關於其他細節，參看Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及EP 1641818A1。高親合性多聚體為來源於A-域骨架家族之多域蛋白質。約35個胺基酸之原生域採用既定二硫鍵鍵結之結構。藉由改組由A-域之家族呈現之天然變化來產生多樣性。關於其他細節，參見Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月)。運鐵蛋白為單體血清傳遞糖蛋白。運鐵蛋白可藉由在允許的表面環中插入肽序列而經工程改造，以結合不同目標抗原。經工程改造之運鐵蛋白骨架之實例包括反式體。關於其他細節，參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPins)來源於錨蛋白，其為介導整合膜蛋白質與細胞骨架之連接的蛋白質之家族。單一錨蛋白重複為由兩個α螺旋及β回旋(beta-turn)組成之33殘基基元。其可藉由隨機化各重複之第一個α螺旋及β回旋中之殘基而經工程改造為結合不同目標抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面(親和力成熟方法)。關於其他細節，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)以及US20040132028A1。單域抗體為由單一單體可變抗體域組成之抗體片段。第一個單域來源於來自駱駝之抗體重鏈之可變域(奈米抗體或VH H片段)。此外，術語單域抗體包括自主人類重鏈可變域(aVH)或來源於鯊魚之VNAR 片段。纖維結合蛋白為可經工程改造以結合於抗原之骨架。纖連蛋白由III型人類纖維結合蛋白(FN3)之15個重複單元之第10個域的天然胺基酸序列之主鏈組成。β-夾層結構之一端處的三個環可經工程改造以使阿耐克汀能夠特異性識別相關治療目標。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、US20080139791、WO2005056764及US6818418B1。肽適體為組合性識別分子，其由恆定骨架蛋白質(通常為硫氧還蛋白(TrxA))組成，該恆定骨架蛋白質含有在活性位點處插入之限制性可變肽環。關於其他細節，參見Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)。微體來源於天然存在之長度為25-50個胺基酸之微型蛋白質，其含有3至4個半胱胺酸橋，微型蛋白質之實例包括KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)及打結素(knottin)。微型蛋白質具有環，其可經工程改造以包括至多25個胺基酸而不影響微型蛋白質之整體摺疊。關於經工程改造之打結素域之其他細節，參見WO2008098796。
至於參考分子，「與相同抗原決定基結合之抗原結合分子 」係指一種抗原結合分子，其在競爭分析中阻斷參考分子與其抗原之結合達50%或超過50%，且相反，參考分子在競爭分析中阻斷抗原結合分子與其抗原之結合達50%或超過50%。
術語「抗原結合域 」或「抗原結合位點」係指包含特異性結合於部分或全部抗原且與部分或全部抗原互補之區域的抗原結合分子的部分。當抗原較大時，抗原結合分子可僅結合於抗原之特定一部分，該部分稱為抗原決定基。抗原結合域可由例如一或多個可變域(亦稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
如本文所用，術語「抗原決定子 」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合、形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如鄰近胺基酸區段或由非鄰近胺基酸之不同區域組成的構形組態)。適用的抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、病毒所感染細胞之表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中。除非另外指示，否則在本文中適用作抗原之蛋白質可以為來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何原生形式之蛋白質。在特定實施例中，抗原係人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」的未經處理之蛋白質，以及由細胞中之處理所產生的任何形式之蛋白質。該術語亦涵蓋天然存在之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
「特異性結合 」意謂結合對抗原具選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合分子與特定抗原結合之能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析) (Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。在一個實施例中，抗原結合分子與不相關蛋白質之結合程度低於如例如藉由SPR量測之抗原結合分子與抗原之結合的約10%。在某些實施例中，結合至抗原之分子之解離常數(Kd)為≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如，10-8 M或更低，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。
「親和力 」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用強度之總和。除非另外指明，否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力一般可由解離常數(Kd)表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別係koff及kon)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由此項技術中已知之常見方法(包括本文所述之方法)量測親和力。一種用於量測親和力之特定方法為表面電漿子共振(SPR)。
「親和力成熟 」抗體係指一或多個互補決定區(CDR)相比於親本抗體存在一或多種變化的抗體，親本抗體不存在該等變化，此類變化引起抗體對抗原之親和力改良。
如本文所用，「目標細胞抗原 」係指目標細胞(特定言之，腫瘤中之目標細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)之表面上所呈現的抗原決定子。因此，目標細胞抗原為腫瘤相關抗原。特定言之，目標細胞抗原不包括經活化T細胞上之免疫檢查點受體，諸如CTLA-4、PD-1或PD-L1。在某些實施例中，目標細胞抗原係腫瘤細胞表面上的抗原。在一個態樣中，腫瘤目標細胞抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、CD19、CD20及CD33。特定言之，目標細胞抗原係纖維母細胞活化蛋白(FAP)。
除非另外指示，否則術語「纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 」，亦稱為脯胺醯基內肽酶FAP或Seprase (EC 3.4.21)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生FAP。該術語涵蓋「全長」的未經處理的FAP以及由細胞中之處理產生的FAP的任何形式。該術語亦涵蓋FAP之天然存在之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，本發明之抗原結合分子能夠特異性結合於人類、小鼠及/或食蟹獼猴FAP。人類FAP之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q12884 (版本149，SEQIDNO:2)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeqNP_004451.2中。人類FAP之細胞外域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置760。His標記之人類FAP ECD之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:92中。小鼠FAP之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P97321 (版本126，SEQ ID NO:93)或NCBI RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP之細胞外域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置761。SEQ ID NO: 94展示His標記之小鼠FAP ECD之胺基酸。SEQ ID NO:95展示His標記之食蟹獼猴FAP ECD之胺基酸。本發明之抗FAP結合分子較佳結合於FAP之細胞外域。
術語「可變區 」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗原結合分子與抗原之結合的域。原生抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域通常具有類似的結構，其中各域包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參看例如Kindt等人, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中的序列高變且決定抗原結合特異性之區(例如「互補決定區 」(「CDR」))中之每一者。
一般而言，抗體包含六個CDR：VH中的三個(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)及VL中的三個(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文之例示性CDR包括： (a)出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處之高變環(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))； (b)出現在胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處之CDR (Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. 美國公共衛生署(Public Health Service), 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991))；及 (c)出現在胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處之抗原觸點(MacCallum 等人J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))。
除非另外指示，否則CDR根據Kabat等人同前文獻測定。熟習此項技術者將理解，CDR名稱亦可根據Chothia同前文獻，McCallum同前文獻，或任何其他科學上可接受的命名法系統確定。
「構架 」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH (或VL)中，CDR及FR序列一般依以下序列呈現：FR1-CDR-H1(L1)-FR2-CDR-H2(L2)-FR3-CDR-H3(L3)-FR4。
術語「嵌合 」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分衍生自不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別 」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類別(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本申請案中所用之術語「衍生自人類來源之恆定區」或「人類恆定區」表示子類別IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之人類抗體之恆定重鏈區及/或恆定輕鏈κ或λ區。該等恆定區在目前先進技術中為熟知的，且例如由Kabat, E.A.,等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)描述(亦參見例如，Johnson, G.,及Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218；Kabat, E.A.,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788)。除非本文中另外規定，否則恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，其亦稱為Kabat之EU索引，如Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242中所描述。
「人類化 」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上所有至少一種及通常兩種可變域，其中所有或實質上所有HVR (例如CDR)對應於非人類抗體之彼等者，且所有或實質上所有FR對應於人類抗體之彼等者。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式 」係指已經歷人類化之抗體。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他形式為其中恆定區已經額外修飾或自原始抗體發生變化以產生根據本發明之特性(尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面)之抗體。
「人類 」抗體係胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人源化人類化抗體。
術語「Fc域」或「Fc 區 」在本文中用於定義抗體重鏈中含有恆定區之至少一部分的C末端區。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3域。人類IgG Fc區之「CH2域」通常自約位置231處之胺基酸殘基延伸至約位置340處之胺基酸殘基。在一個實施例中，碳水化合物鏈連接至CH2域。本文中，CH2域可為原生序列CH2域或變異型CH2域。「CH3域」包含殘基在Fc區中自C端至CH2域之延伸(亦即，自IgG之約位置341處之胺基酸殘基至約位置447處之胺基酸殘基延伸)。在本文中，CH3區可為原生序列CH3域或變異型CH3域(例如，在其一個鏈中具有所引入「隆凸」(「杵」)及在其另一鏈中具有對應引入之「凹穴」(「臼」)之CH3域；參見以引用之方式明確併入本文中之美國專利第5,821,333號)。此類變異型CH3域可用於促進如本文中所描述之兩個非一致抗體重鏈之雜二聚化。在一個態樣中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，宿主細胞所產生的抗體可能在重鏈C端經歷一或多個(特定言之，一或兩個)胺基酸之轉譯後分裂。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子產生的抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之裂解變異體。在重鏈之最末兩個C末端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，EU編號系統)的情況下，情況可為如此。因此，Fc區之C端離胺酸(Lys447)或C端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(K447)可能存在或可能不存在。若不另外指示，則包括Fc區的重鏈之胺基酸序列在本文中表示為無C端甘胺酸-離胺酸二肽。在一個態樣中，包括如本文規定之Fc區、包含於根據本發明之抗體中的重鏈包含另一C末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，EU編號系統)。在一個態樣中，包括如本文規定之Fc區、包含於根據本發明之抗體中的重鏈包含另一C末端甘胺酸殘基(G446，根據EU索引編號)。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, Md., 1991中所描述。
「杵 - 臼 」技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築隆凸。大小與隆凸相同或類似之補償性凹穴係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來形成。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸製造，例如藉由位點特異性突變誘發或藉由肽合成製造。在一特定實施例中，杵修飾包含Fc域之兩個次單元之一者中的胺基酸取代T366W，且臼修飾包含Fc域之兩個次單元中之另一者中的胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一特定實施例中，包含杵修飾之Fc域之次單元另外包含胺基酸取代S354C，且包含臼修飾之Fc域之次單元另外包含胺基酸取代Y349C。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc區之兩個次單元之間形成二硫橋鍵，由此進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
「與免疫球蛋白之Fc區等效之區」意欲包括免疫球蛋白之Fc區之天然存在之對偶基因變異體以及具有變化之變異體，該等變化產生取代、添加或缺失，但不實質上降低免疫球蛋白介導效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)之能力。舉例而言，免疫球蛋白之Fc區之N端或C端可缺失一或多個胺基酸而不實質性損失生物功能。此類變異體可根據此項技術中已知的一般法則選擇以對活性具有最小影響(參見例如Bowie, J. U.等人, Science 247:1306-10 (1990))。
術語「效應功能 」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞噬菌作用(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合物介導之抗原呈現細胞攝入抗原、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。
可藉由抗體Fc區與Fc受體(FcR) (其為造血細胞上之特殊化細胞表面受體)之相互作用介導Fc受體結合依賴性效應功能。Fc受體屬於免疫球蛋白超家族，且已展示介導藉由免疫複合物之噬菌作用移除經抗體塗佈之病原體，及經由抗體依賴性細胞介導之毒性(ADCC)裂解用相應抗體塗佈之紅血球及各種其他細胞標靶(例如，腫瘤細胞) (參見例如，Van de Winkel, J.G.及Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)。FcR由其對免疫球蛋白同型之特異性定義：針對IgG抗體之Fc受體稱為FcγR。在例如Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, P.J.等人, Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M.等人., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；及Gessner, J.E.等人, Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248描述Fc受體結合。
IgG抗體之Fc區(FcγR)的受體交聯觸發多種效應功能，包括噬菌作用、抗體依賴性細胞毒性及炎性介質釋放，以及免疫複合物清除及抗體產量之調節。在人類中，已表徵三種類別之FcγR，其為： - FcγRI (CD64)以高親和力結合單體IgG且在巨噬細胞、單核球、嗜中性球及嗜酸性細胞上表現。在Fc區IgG內至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327及P329 (根據Kabat之EU索引編號)中之一者的修飾減小FcγRI結合。位置233-236處之IgG2殘基(經取代至IgG1及IgG4)減少10³倍FcγRI結合，且消除人類單核球與抗體敏化紅細胞之反應(Armour, K.L.等人, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。 -FcγRII (CD32)以中至低親和力結合複合型IgG，並廣泛表現。此受體可分為兩種亞型：FcγRIIA及FcγRIIB。在許多涉及殺滅之細胞(例如巨噬細胞、單核球、嗜中性球)上發現FcγRIIA，且其似乎能夠活化殺滅過程。FcγRIIB似乎在抑制過程中起一定作用，且在B細胞、巨噬細胞上及肥大細胞及嗜酸性球上發現FcγRIIB。在B細胞上，其作用似乎為進一步抑制免疫球蛋白製造及同型轉換為例如IgE類別。在巨噬細胞上，FcγRIIB用以抑制如經由FcγRIIA介導的吞噬。在嗜酸性球及肥大細胞上，B形式可經由IgE結合至其各別受體而有助於抑制此等細胞之活化。發現對於FcγRIIA結合減小，例如對於包含至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414中之一者處具有突變之IgG Fc區的抗體(根據Kabat之EU索引編號)。 - FcγRIII (CD16)以中至低親和力結合IgG，且以兩種類型存在。FcγRIIIA見於NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性球及一些單核球及T細胞上，且介導ADCC。FcγRIIIB高度表現於嗜中性球上。發現與FcγRIIIA之結合降低，例如對於包含至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376 (根據Kabat之EU索引編號)中之一者處具有突變之IgG Fc-區的抗體。
在人類IgG1上映射Fc受體結合位點、上述突變位點及用於量測FcγRI及FcγRIIA結合之方法描述於Shields, R.L.等人 J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604中。
術語「ADCC 」或「抗體依賴性細胞毒性」為藉由Fc受體結合介導之功能，且係指在效應細胞存在下的情況下藉由如本文所報導之抗體裂解目標細胞。藉由量測其與Fcγ受體表現細胞(諸如以重組方式表現FcγRI及/或FcγRIIA或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA)之細胞)之結合，來研究引起介導ADCC之初始步驟的抗體能力。特定言之，量測NK細胞上與FcγR之結合。
「活化 Fc 受體 」為一種Fc受體，其與抗體之Fc區接合之後，引發信號傳導事件，此刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。特定活化Fc受體為人類FcγRIIIa (參見UniProt寄存編號P08637，版本141)。
除非另外指示，否則如本文所用之術語「CD40 」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD40。該術語涵蓋「全長」的未經處理之CD40以及由細胞中之處理產生的CD40之任何形式。該術語亦涵蓋天然存在之CD40變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類CD40之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:1 (Uniprot P25942，版本200)中且例示性小鼠CD40之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:146 (Uniprot P27512，版本160)中。CD40抗原係屬於腫瘤壞死因子受體(TNF-R)家族之50 kDa細胞表面糖蛋白(Stamenkovic等人，(1989), EMBO J. 8: 1403-10)。CD40在許多正常細胞類型及腫瘤細胞類型中表現，包括B淋巴球、樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞、胸腺上皮、內皮細胞、纖維母細胞及平滑肌細胞。CD40表現於所有B淋巴瘤及70%之所有實體腫瘤中且藉由成熟信號(諸如IFN-γ及GM-CSF)在抗原呈現細胞(APC)中上調。CD40活化亦誘導單核球分化為功能性樹突狀細胞(DC)且經由APC-CD40誘導之細胞介素促進NK細胞之溶胞活性。因此，CD40在藉由誘導APC成熟來起始及促進免疫反應、分泌輔助細胞介素、上調協同刺激分子及增強效應功能方面起至關重要之作用。
如本文所用，術語「CD40 促效劑 」包括促效CD40/CD40L相互作用之任何部分。如在此上下文中所使用之CD40較佳係指人類CD40，因此CD40促效劑較佳為人類CD40之促效劑。通常，該部分將為促效CD40抗體或抗體片段。
術語「抗 CD40 抗體 」、「抗CD40」、「CD40抗體」及「特異性結合於CD40之抗體」係指能夠以足夠親和力結合CD40以使得抗體在靶向CD40時適用作診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個態樣中，抗CD40抗體與不相關非CD40蛋白質之結合程度小於抗體與CD40之結合之約10%，如(例如)藉由放射免疫分析(RIA)或流式細胞量測術(FACS)所量測。在某些實施例中，與CD40結合之抗體的解離常數(KD )為≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-6 M或更小，例如10-68 M至10-13 M，例如10-8 M至10-10 M)。
術語「肽連接子 」係指包含一或多個胺基酸(通常約2至20個胺基酸)的肽。肽連接子在此項技術中已知或描述於本文中。適合的非免疫原性連接肽為例如(G4 S)n 、(SG4 )n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中「n」通常為介於1與10之間、典型地介於2與4之間，特定言之為2之數字，亦即，肽選自由以下組成之群：GGGGS (SEQ ID NO:96)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:97)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:98)及GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:99)，而且包括以下序列：GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:100)、(G4S)3 (SEQ ID NO:101)、(G4S)4 (SEQ ID NO:102)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:103)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:104)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:105)、GGSGSG (SEQ ID NO:106)、GGSG (SEQ ID NO:107)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:108)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:109)及GGNGSG (SEQ ID NO:110)。備受關注之肽連接子係(G4S) (SEQ ID NO:96)、(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:97)、(G4S)3 (SEQ ID NO:98)及(G4S)4 (SEQ ID NO:99)。
如本申請案內所用，術語「胺基酸 」表示天然存在之羧基α-胺基酸之群，其包含丙胺酸(三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。
「經融合 」或「經連接 」意謂組分(例如抗體之Fc域及Fab片段)藉由肽鍵直接地或經由一或多個肽連接子連接。
相對於參考多肽(蛋白質)序列之「胺基酸序列一致性百分比 (%) 」定義為在比對序列且視需要引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比目地之比對可以使用此項技術範圍內的多種方法，例如使用公開可獲得之電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign (DNASTAR)軟體)實現。熟習此項技術者可測定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.設計，且原始程式碼已在U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559申請用戶文檔，其在此註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech, Inc., South San Francisco, California，或可自原始碼編寫。ALIGN-2程式經編譯可用於UNIX作業系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變化。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者，其可表述為與給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的給定胺基酸序列A)如下計算： 100 × 分數X/Y 其中X為在A與B之程式比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%將不相等。除非另外特定陳述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值如緊接前述段落中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
在某些實施例中，涵蓋本文提供之雙特異性抗原結合分子之胺基酸序列變異體 。舉例而言，可能需要改良含有TNF配位三聚體之抗原結合分子之結合親和力及/或其他生物特性。含有TNF配位三聚體之抗原結合分子之胺基酸序列變異體可藉由將適合的修飾引入編碼核苷酸序列之分子或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。用於取代型誘變之所關注位點包括HVR及構架(FR)。保守性取代以標題「較佳取代」提供於表B中且在下文中參考胺基酸側鏈類別(1)至(6)進一步描述。胺基酸取代可經引入至所關注分子且針對所需活性進行篩檢之產物中，以例如保持/改良抗原結合、減少免疫原性或改良ADCC或CDC。 表B
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 正白胺酸 Leu
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將引起此等類別中之一者之成員換成另一個類別。
術語「胺基酸序列變異體 」包括大量變體，其中在親本抗原結合分子(例如，人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基中存在胺基酸取代。一般而言，所選擇用於進一步研究之所得變異體與親本抗原結合分子相比將具有某些生物特性之修飾(例如改良)(例如提高之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保持親本抗原結合分子之某些生物特性。例示性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所描述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變並在噬菌體上呈現變異抗原結合分子，且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。在某些實施例中，一或多個HVR內可存在取代、插入或缺失，只要此類變化不實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守改變(例如如本文所提供之保守取代)。一種適用於鑑別突變誘發可靶向之抗體之殘基或區的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所描述。在此方法中，鑑別出一個殘基或一組目標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且將其置換為中性或帶負電荷胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)以判定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗原結合分子複合物之晶體結構用以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之靶標或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以判定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或多於一百個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入的實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基的本發明之雙特異性抗原結合分子。分子之其他插入型變異體包括N或C端與多肽之融合，此延長雙特異性抗原結合分子之血清半衰期。
在某些態樣中，本文提供之雙特異性抗原結合分子經改變以提高或降低抗體經糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列使得產生或移除之一或多個糖基化位點來便利地獲得分子之糖基化變異體。當含有TNF配位三聚體之抗原結合分子包含Fc區時，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其通常藉由N鍵連接至Fc區之CH2域之Asn297。參見例如Wright等人,TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接於雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc上的海藻糖。在一些實施例中，可進行含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中寡糖之修飾以產生具有某些經改良特性的變異體。在一個態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的變異體，其具有碳水化合物結構且不具有(直接或間接)連接至Fc區的海藻糖。該等海藻糖基化變異體可具有經改良之ADCC功能，參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)或US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。在另一態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的變異體具有對分寡醣，例如其中連接至Fc區的二觸角寡醣經GlcNAc對分。該等變異體可具有降低之海藻糖基化及/或經改良之ADCC功能，參見例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之抗體變異體。該等抗體變異體可具有經改良之CDC功能且描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。
在某些態樣中，可能需要產生本發明之雙特異性抗原結合分子的半胱胺酸工程改造之變異體，例如「thioMAb」，其中分子之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，經取代之殘基存在於分子之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基由此安置於抗體之可達位點處且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生免疫結合物。在某些態樣中，以下殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。半胱胺酸工程改造之抗原結合分子可(例如)如美國專利第7,521,541號中所描述產生。
術語「聚核苷酸 」係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源性RNA或質體DNA (pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。
「經分離 」核酸分子或聚核苷酸意欲係已自原生環境中移除之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組型聚核苷酸視為經分離的。經分離之聚核苷酸的其他實例包括異源宿主細胞中所維持之重組聚核苷酸或溶液中(部分或實質上)經純化之聚核苷酸。經分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或與其天然染色體位置不同之染色體位置處。經分離RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。根據本發明的經分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生之此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
一種核酸或聚核苷酸的核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列至少例如95%「一致」意指該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，不同之處在於該聚核苷酸序列相對於參考核苷酸序列可每100個核苷酸中包括至多五個點突變。換言之，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致的聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可插入佔參考序列核苷酸總數至多5%的多個核苷酸。參考序列之此等改變可發生於參考核苷酸序列之5'或3'端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地穿插於參考序列殘基中或參考序列內的一或多個鄰近基團中。根據實際情況，習知地可使用已知電腦程式，諸如上文關於多肽所論述之電腦程式(例如ALIGN-2)測定任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
術語「表現卡匣 」係指以重組或合成方式產生之聚核苷酸，其具有容許特定核酸在目標細胞中發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現卡匣可併入至質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄之核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「載體 」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入特定基因且引導該基因表現的DNA分子，該DNA分子與該基因在目標細胞中可操作地連接。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入目標細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞 」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生之子代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本文中包括針對原始轉型細胞篩選或選擇的具有相同功能或生物活性之突變後代。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子之任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所含的細胞。
藥劑之「有效量 」係指在所投與之細胞或組織中產生生理變化所需的量。
試劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量 」係指在達成所要治療性或預防性結果所需之劑量及時段下有效的量。舉例而言，治療有效量之藥劑可消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之副作用。
「個體 (individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體(individual/subject)為人類。
術語「醫藥組合物 」係指所呈形式以允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮且不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑 」係指醫藥組合物中之除活性成分之外的對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)緩衝劑、穩定劑或防腐劑。
術語「藥品說明書 」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。
如本文所用，「治療 (treatment) 」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat/treating)」係指臨床介入以試圖改變所治療個體之自然病程，且可以為實現預防或在臨床病理學病程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性結果、預防癌轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病發展或減慢疾病之進展。
如本文所用，術語「癌症 」係指增生性疾病，諸如淋巴瘤、淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭癌或頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任何上述癌症之難治癒形式，或上述癌症中之一或多者的組合。
如本文所用之術語「化學治療劑 」係指適用於治療癌症之化合物。在一個態樣中，化學治療劑為抗代謝物。在一個態樣中，抗代謝物選自由以下組成之群：胺基喋呤、甲胺喋呤、培美曲塞(Pemetrexed)、雷替曲塞(Raltitrexed)、克拉屈濱(Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、氟達拉賓(Fludarabine)、巰基嘌呤、噴司他丁(Pentostatin)、硫鳥嘌呤、卡培他濱(Capecitabine)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷(Floxuridine)及吉西他濱(Gemcitabine)。在一個特定態樣中，抗代謝物為卡培他濱(capecitabine)或吉西他濱。在另一態樣中，抗代謝物為氟尿嘧啶。在一個態樣中，化學治療劑為影響微管形成之藥劑。在一個態樣中，影響微管形成之藥劑係選自由以下組成之群：太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞辛(vinorelbin)、紫杉德(taxotere)、依託泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide)。在另一態樣中，化學治療劑為烷基化劑，諸如環磷醯胺。在一個態樣中，化學治療劑為細胞毒性抗生素，諸如拓樸異構酶II抑制劑。在一個態樣中，拓樸異構酶II抑制劑為小紅莓(doxorubicin)。
本發明之雙特異性抗體 本發明提供具有尤其有利特性(諸如可製造性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率、降低之毒性、可給予患者的延伸之劑量範圍及從而可能增強之功效)之新穎雙特異性抗原結合分子。
例示性雙特異性抗原結合分子 本發明提供三價結合於CD40之雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，及 (b)一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域，及 (c)由能夠穩定結合之第一次單元及第二次單元構成的Fc區。
在一個態樣中，提供一種三價結合於CD40之雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈又在其C端融合至該第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段融合至該等Fc域次單元中之一者之C端。
在一特定態樣中，此等雙特異性抗原結合分子之特徵在於靶向促效結合於CD40。特定言之，雙特異性抗原結合分子為針對腫瘤相關目標細胞抗原靶向之CD40促效劑。在另一特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成的Fc區，其包含降低效應功能之突變。使用包含減弱或消除效應功能之突變的Fc區將藉由經由Fc受體交聯而阻止非特異性促效作用且將防止CD40+ 細胞之ADCC。由於雙特異性抗原結合分子共價結合於CD40，如同天然CD40配位體呈同源三聚組態結合，故其應具有最佳生物活性。
在一個態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其由以下組成： (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈又在其C端融合至該第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段融合至該等Fc域次單元中之一者之C端。
特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其由以下組成： (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端經由肽連接子融合至該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈又在其C端融合至該第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段經由肽連接子融合至該等Fc域次單元中之一者之C端。在一個態樣中，能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段為交叉fab片段，其中CH1域及CL域經交換且其中VH-CL鏈經由肽連接子融合至Fc域次單元中之一者的C端。
在另一態樣中，能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段為交叉fab片段，其中VH域及VL域交換且其中VL-CH1鏈經由肽連接子融合至Fc域次單元中之一者之C端。
此外，如本文所描述之雙特異性抗原結合分子具有優於能夠特異性結合於CD40之習知抗體的優勢，在於其選擇性誘導目標細胞(通常為癌細胞或腫瘤基質)處之免疫反應。在一個態樣中，腫瘤相關目標細胞抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相關軟骨素硫酸鹽蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20及CD33。
在一特定態樣中，腫瘤相關目標細胞抗原為FAP。因此，在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域結合於包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列或由其組成的多肽。
此等雙特異性抗原結合分子之特徵為FAP靶向之促效結合至CD40。在FAP表現細胞存在下，雙特異性抗原結合分子能夠活化抗原呈現細胞(APC)，從而活化人類B細胞(實例5.1.2)、人類道迪細胞(實例5.1.1)及人類單核細胞衍生之樹突狀細胞(moDC)。
FAP結合部分已經描述於WO 2012/02006中，其以全文引用之方式包括在內。在一個態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-L3。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在一個態樣中，雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，該抗原結合域包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，該抗原結合域包含：包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP0)及包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含選自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28組成之群之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含選自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30組成之群之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (i)重鏈可變區(VH FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36，及 (ii)輕鏈可變區(VL FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:42。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)， (b)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)， (c)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或 (d)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在一個特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，該抗原結合域包含：包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段、第二Fab片段及第三Fab片段，其中第一、第二及第三Fab片段包含能夠特異性結合於CD40之一致抗原結合域。
在一個態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含重鏈可變區(VH CD40)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含：包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)。
在一個態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (i) 重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56，及 (ii) 輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (i) 重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66，及 (ii) 輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。
在一個態樣中，能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (a) 包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (b) 包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (c) 包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (d) 包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (e) 包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (f) 包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (g) 包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (h) 包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (i) 包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (j) 包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (k) 包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (l) 包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (m) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (n) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (o) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (p) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL。
在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含VH，其包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列。
在又一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (a) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (b) 包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (c) 包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (d) 包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (e) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (f) 包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (g) 包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (h) 包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (i) 包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的VL，或 (j) 包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的VL，或 (k) 包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的VL，或 (l) 包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的VL。
在一特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含：VH，其包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列；或其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含VH，其包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列。
結合於 CD40 及 FAP 之雙特異性抗原結合分子 在另一態樣中，提供如上文所定義之雙特異性抗原結合分子，其中 (i) 三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56，及輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60，且其中 (ii) 一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (i).三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含：重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66，及輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70，及 (ii).一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其包含 (i) 三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56，及輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60，及 (ii) 一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含重鏈可變區(VH FAP)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36，及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:42。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其包含 (i)三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含：重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66，及輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70，及 (ii)一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含重鏈可變區(VH FAP)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36，及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:42。
在一特定態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其包含 (i)三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)，及 (ii) 一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
呈頭對尾型式 (3+1) 之雙特異性抗原結合分子 在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)重鏈，其包含：能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段的VH-CH1鏈，該第一Fab片段之VH-CH1鏈在其N端視情況經由肽連接子融合至能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段的VH-CH1鏈；及Fc區次單元， (b)重鏈，其包含能夠特異性結合於CD40之Fab片段的VH-CH1域、Fc區次單元及能夠特異性結合於FAP之Fab片段之VH-CH1鏈，該Fab片段之VH-CH1鏈視情況經由肽連接子融合至該Fc區次單元之C端， (c)三個輕鏈，各輕鏈包含能夠特異性結合於CD40之Fab片段之VL及CL域，及 (d)輕鏈，其包含能夠特異性結合於FAP之Fab片段的VH及CL域。
在一個特定態樣中，肽連接子係選自GGGGS (SEQ ID NO:96)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:97)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:98)、GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:99)、GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:100)、(G4S)3 (SEQ ID NO:101)、(G4S)4 (SEQ ID NO:102)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:103)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:104)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:105)、GGSGSG (SEQ ID NO:106)、GGSG (SEQ ID NO:107)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:108)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:109)及GGNGSG (SEQ ID NO:110)。備受關注之肽連接子係(G4S) (SEQ ID NO:96)、(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:97)、(G4S)3 (SEQ ID NO:98)及(G4S)4 (SEQ ID NO:99)。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)重鏈，其包含：能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段之VH-CH1鏈，該第一Fab片段之VH-CH1鏈在其N端融合至能夠經由肽連接子特異性結合於CD40之第二Fab片段之VH-CH1鏈，該肽連接子具有SEQ ID NO: 96或SEQ ID NO: 97之胺基酸序列；及Fc區次單元， (b)重鏈，其包含能夠特異性結合於CD40之Fab片段的VH-CH1域、Fc區次單元及能夠特異性結合於FAP之Fab片段之VH-CH1鏈，該Fab片段之VH-CH1鏈經由SEQ ID NO:99之肽連接子融合至該Fc區次單元之C端， (c)三個輕鏈，各輕鏈包含能夠特異性結合於CD40之Fab片段之VL及CL域，及 (d)輕鏈，其包含能夠特異性結合於FAP之Fab片段的VH及CL域。
特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含；包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列的第二重鏈、各自包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列的三個輕鏈及包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列的輕鏈。
在另一態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)重鏈，其包含：能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段的VH-CH1鏈，該第一Fab片段之VH-CH1鏈在其N端視情況經由肽連接子融合至能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段的VH-CH1鏈；及Fc區次單元， (b)重鏈，其包含能夠特異性結合於CD40之Fab片段的VH-CH1域、Fc區次單元及能夠特異性結合於FAP之Fab片段之VH-CL鏈，該Fab片段之VH-CL鏈視情況經由肽連接子融合至該Fc區次單元之C端， (c)三個輕鏈，各輕鏈包含能夠特異性結合於CD40之Fab片段之VL及CL域，及 (d)輕鏈，其包含能夠特異性結合於FAP之Fab片段的VL及CH1域。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)重鏈，其包含：能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段之VH-CH1鏈，該第一Fab片段之VH-CH1鏈在其N端融合至能夠經由肽連接子特異性結合於CD40之第二Fab片段之VH-CH1鏈，該肽連接子具有SEQ ID NO: 96或SEQ ID NO: 97之胺基酸序列；及Fc區次單元， (b)重鏈，其包含能夠特異性結合於CD40之Fab片段的VH-CH1域、Fc區次單元及能夠特異性結合於FAP之Fab片段之VH-CL鏈，該Fab片段之VH-CL鏈經由SEQ ID NO:99之肽連接子融合至該Fc區次單元之C端， (c)三個輕鏈，各輕鏈包含能夠特異性結合於CD40之Fab片段之VL及CL域，及 (d)輕鏈，其包含能夠特異性結合於FAP之Fab片段的VL及CH域。
特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含；包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列的第二重鏈、各自包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的三個輕鏈及包含SEQ ID NO:81之胺基酸序列的輕鏈。
降低 Fc 受體結合及 / 或效應子功能之 Fc 域修飾 本發明之雙特異性抗原結合分子進一步包含由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域。
在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入至本文所提供之抗體的Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其包含在一或多個胺基酸位置處之胺基酸修飾(例如，取代)。
Fc域賦予本發明之雙特異性抗體有利的藥物動力學特性，包括長血清半衰期，其促進目標組織中之良好聚集及有利的組織-血液分佈率。然而，其同時可引起本發明之雙特異性抗體不合需要地靶向表現Fc受體之細胞而非靶向較佳的攜帶抗原之細胞。因此，在特定實施例中，本發明之雙特異性抗體與原生IgG Fc域(特定言之，IgG1 Fc域或IgG4 Fc域)相比展現降低之對Fc受體的結合親和力及/或降低之效應功能。更特定言之，Fc域係IgG1 Fc域。
在一個此類態樣中，Fc域(或包含該Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)與原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)相比展現低於50%，較佳低於20%，更佳低於10%且最佳低於5%的與Fc受體之結合親和力，及/或與原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)相比低於50%、較佳低於20%、更佳低於10%且最佳低於5%效應功能。在一個態樣中，Fc域(或包含該Fc域之本發明之雙特異性抗原結合分子)不會實質上結合於Fc受體及/或誘發效應功能。在一特定態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體係人類Fc受體。在一個態樣中，Fc受體為活化Fc受體。在特定態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更具體言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體言之，人類FcγRIIIa。在一個態樣中，Fc受體為抑制Fc受體。在一特定態樣中，Fc受體為抑制人類Fcγ受體，更具體言之人類FcγRIIB。在一個態樣中，效應功能係CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌中之一或多者。在特定態樣中，效應功能為ADCC。在一個態樣中，Fc域對新生兒Fc受體(FcRn)展現的結合親和力與原生IgG1 Fc域相比實質上類似。當Fc域(或包含該Fc域之本發明之雙特異性抗原結合分子)展現比原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之本發明之雙特異性抗原結合分子)大於約70%、特定言之大於約80%、更特定言之大於約90%的與FcRn的結合親和力時，實現實質上類似的與FcRn之結合。
在特定態樣中，相較於未經工程改造之Fc域，Fc域經工程改造，從而對Fc受體之結合親和力減小及/或效應功能降低。在特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域包含一或多個降低Fc域與Fc受體之結合親和力及/或效應功能的胺基酸突變。典型地，Fc域之兩個次單元中之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。在一個態樣中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力減小。在另一態樣中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體之結合親和力減小至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一個態樣中，包含經工程改造之Fc域之本發明之雙特異性抗原結合分子與包含未經工程改造之Fc域的本發明的雙特異性抗體相比展現小於20%，尤其小於10%，更尤其小於5%的對Fc受體的結合親和力。在一特定態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在其他態樣中，Fc受體為人類Fc受體。在一個態樣中，Fc受體為抑制Fc受體。在一特定態樣中，Fc受體為抑制人類Fcγ受體，更具體言之人類FcγRIIB。在一些態樣中，Fc受體係活化Fc受體。在特定態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更具體言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體言之，人類FcγRIIIa。較佳地，與此等受體中之每一者的結合減少。在一些態樣中，對補體組分之結合親和力，具體言之，對C1q之特異性結合親和力，亦減小。在一個態樣中，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力未減小。當Fc域(或包含該Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)對FcRn展現的結合親和力大於Fc域之未經工程改造形式(或包含該Fc域之未經工程改造形式的本發明之雙特異性抗原結合分子)之結合親和力的約70%時，對FcRn達成實質上類似的結合，亦即保持Fc域對該受體的結合親和力。Fc域或包含該Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子可以展現大於約80%且甚至大於約90%的該親和力。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域經工程改造以具有與非工程改造之Fc域相比降低之效應功能。降低之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、降低之細胞介素分泌、降低之免疫複合物介導之抗原呈現細胞攝入抗原、降低之與NK細胞之結合、降低之與巨噬細胞之結合、降低之與單核球之結合、降低之與多形核細胞之結合、降低之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞激活。
效應功能減小之抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的彼等抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。描述具有改良或減弱之FcR結合的某些抗體變異體。(例如美國專利第6,737,056號；WO2004/056312，及Shields, R.L.等人, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。
在本發明之一個態樣中，Fc域包含在位置E233、L234、L235、N297、P331及P329處之胺基酸取代。在一些態樣中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A(「LALA」)。在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代。在更特定態樣中，胺基酸取代係P329A或P329G，特定言之，P329G。在一個實施例中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代及選自由以下組成之群的另一胺基酸取代：E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在更特定實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」)。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全破壞人類IgG1 Fc域之Fcγ受體結合，如PCT專利申請案第WO 2012/130831 A1號中所述。該文獻亦描述製備此類突變Fc域之方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)的方法。此類抗體為具有突變L234A及L235A或具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1 (根據Kabat等人之EU索引編號, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD, 1991)。
在一個態樣中，Fc域係IgG4 Fc域。在一更特定實施例中，Fc域係包含位置S228 (Kabat編號)處之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。在一更特定實施例中，Fc域為IgG4 Fc域，其包含胺基酸取代L235E及S228P及P329G。此胺基酸取代減少活體內IgG4抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。
半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer, R.L.等人, J. Immunol. 117 (1976) 587-593；及Kim, J.K.等人, J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)之結合改良之抗體描述於US 2005/0014934中。彼等抗體中包含具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn的結合。此類Fc變異體包括以下Fc區殘基中之一或多者發生取代之彼等變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。Fc區變異體之其他實例亦參看Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US5,648,260；US5,624,821；及WO94/29351。
可以例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)容易測定與Fc受體的結合，且可諸如藉由重組表現來獲得Fc受體。適合的此類結合分析法描述於本文中。或者，Fc域或包含Fc域之細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體的結合親和力可使用已知表現特定Fc受體的細胞株(諸如表現FcγIIIa受體的人類NK細胞)評價。可藉由此項技術中已知之方法量測Fc域、或包含Fc域之本發明之雙特異性抗原結合分子的效應功能。適用於量測ADCC之分析描述於本文中。用於評定所關注分子之ADCC活性的活體外分析之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)；及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型中活體內評定所關注分子之ADCC活性。
以下部分描述本發明之雙特異性抗原結合分子的較佳態樣，其包含降低Fc受體結合及/或效應功能之Fc域修飾。在一個態樣中，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)至少一個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，(b)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域，及(c)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中該Fc域包含一或多個降低抗體與Fc受體，特定言之對Fcγ受體之結合親和力的一或多個胺基酸取代。在另一態樣中，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，(b)至少一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，及(c)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中該Fc域包含一或多個降低效應功能之胺基酸取代。在特定態樣中，Fc域係具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)的人類IgG1子類別。
促進雜二聚化之 Fc 域修飾 本發明之雙特異性抗原結合分子包含融合至Fc域之兩個次單元中之一個或另一個的不同抗原結合位點，因此Fc域之兩個次單元可包含於兩個不一致多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及後續二聚化產生兩種多肽之若干種可能的組合。為改良重組生成中本發明之雙特異性抗原結合分子的產量及純度，因此將適宜在本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域中引入促進所需多肽結合之修飾。
因此，在特定態樣中，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，(b)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域，及(c)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中Fc域包含促進Fc域之第一與第二次單元締合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個次單元之間的最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點位於Fc域之CH3域中。因此，在一個態樣中，該修飾存在於Fc域之CH3域中。
在特定態樣中，該修飾為所謂的「杵臼」修飾，其包含Fc域之兩個次單元中之一者中的「杵」修飾及Fc域之兩個次單元之另一者中的「臼」修飾。因此，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，(b)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域，及(c)由能夠穩定締合的第一及第二次單元構成的Fc域，其中根據杵臼方法，Fc域之第一次單元包含杵，且Fc域之第二次單元包含臼。在一特定態樣中，Fc域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
杵臼技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築隆凸。大小與隆凸相同或類似之補償性凹穴係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來形成。
因此，在一個態樣中，在本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域的第一次單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第一次單元之CH3域內產生隆凸，其可位於第二次單元之CH3域內的凹穴中，且在Fc域之第二次單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第二次單元之CH3域內產生凹穴，第一次單元之CH3域內的隆凸可位於該凹穴中。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸製造，例如藉由位點特異性突變誘發或藉由肽合成製造。在特定態樣中，在Fc域之第一次單元之CH3域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基(T366W)置換，且在Fc域之第二次單元之CH3域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基(Y407V)置換。在一個態樣中，在Fc域之第二次單元中，位置366處之蘇胺酸殘基另外經絲胺酸殘基(T366S)置換且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基(L368A)置換。
在又一態樣中，在Fc域之第一次單元中，位置354處之絲胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基(S354C)置換，且在Fc域之第二次單元中，位置349處之酪胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基(Y349C)置換。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc域之兩個次單元之間形成二硫橋鍵，從而進一步穩定二聚體(Carter (2001), JImmunolMethods248, 7-15)。在一特定態樣中，Fc域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在替代性態樣中，促進Fc域之第一與第二次單元之締合的修飾包含介導靜電轉向作用之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域次單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成變成在靜電上不利的，但雜二聚在靜電上為有利的。
如本文所報導之雙特異性抗體之重鏈的C端可為以胺基酸殘基PGK結束之完整C端。重鏈之C端可為縮短C端，其中已移除一或兩個C端胺基酸殘基。在一個較佳態樣中，重鏈之C端為以PG結束之縮短C端。在如本文所報導之所有態樣之一個態樣中，如本文所規定之包含包括C端CH3域之重鏈的雙特異性抗體包含C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之全部態樣中之一個實施例中，如本文所規定之包含包括C端CH3域之重鏈的雙特異性抗體包含C端甘胺酸殘基(G446，根據KabatEU索引編號)。
Fab 域之修飾 在一個態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包含(a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合於目標細胞抗原之第二Fab片段，及(c)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中在Fab片段之一中，可變域VH及VL或恆定域CH1及CL經交換。根據交叉單抗(Crossmab)技術製備雙特異性抗體。
在一個結合臂中具有域置換/交換的多特異性抗體(CrossMabVH-VL 或CrossMabCH-CL )詳細描述於WO2009/080252及Schaefer, W.等人, PNAS, 108 (2011) 11187-1191中。其明顯地減少由針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈失配(與沒有此類域交換之方法相比較)而造成的副產物。
在一個態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包含(a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合於目標細胞抗原之第二Fab片段，及(c)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中在Fab片段中之一者中，恆定域CL及CH1經彼此置換，使得CH1域係輕鏈之部分且CL域係重鏈之部分。更特定言之，在能夠特異性結合於目標細胞抗原之第二Fab片段中，恆定域CL及CH1經彼此置換，使得CH1域係輕鏈之部分且CL域係重鏈之部分。
在特定態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包含(a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合於目標細胞抗原之第二Fab片段，其中恆定域CL及CH1經彼此置換，使得CH1域係輕鏈之部分且CL域係重鏈之部分。此類分子稱為單價雙特異性抗原結合分子。
在另一態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)包含能夠特異性結合於CD40之兩個Fab片段及Fc域的抗體之兩個輕鏈及兩個重鏈，及(b)兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之額外Fab片段，其中該等額外Fab片段各自經由肽連接子連接至(a)之重鏈的C端。在一特定態樣中，額外Fab片段係Fab片段，其中可變域VL及VH經彼此置換，使得VH域係輕鏈之部分且VL域係重鏈之部分。
因此，在特定態樣中，本發明包含雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)包含能夠特異性結合於CD40之兩個Fab片段及Fc域的抗體之兩個輕鏈及兩個重鏈，及(b)兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之額外Fab片段，其中該兩個能夠特異性結合於目標細胞抗原之額外Fab片段係互換型Fab片段，其中可變域VL及VH經彼此置換且VL-CH鏈各自經由肽連接子連接至(a)之重鏈的C端。
在另一態樣中，且為進一步改良正確配對，雙特異性抗原結合分子可含有不同帶電胺基酸取代(所謂的「帶電殘基」)，該雙特異性抗原結合分子包含：(a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合於目標細胞抗原之第二Fab片段，及(c)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成的Fc域。將此等修飾引入交叉或非交叉CH1及CL域中。在一特定態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其中在CL域中之一者中，位置123 (EU編號)處之胺基酸已經精胺酸(R)置換，及/或位置124 (EU編號)處之胺基酸已經離胺酸(K)取代，且其中在CH1域中之一者中，位置147 (EU編號)及/或位置213 (EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代。
聚核苷酸 本發明進一步提供編碼如本文所描述之雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離核酸。
編碼本發明之雙特異性抗原結合分子之經分離聚核苷酸可表現為編碼整個抗原結合分子之單個聚核苷酸或共表現的多個(例如兩個或更多個)聚核苷酸。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可經由例如雙硫鍵或其他手段締合，以形成功能性抗原結合分子。舉例而言，免疫球蛋白之輕鏈部分可由來自免疫球蛋白之重鏈部分的單獨聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽結合以形成免疫球蛋白。
在一些態樣中，經分離聚核苷酸編碼如本文所描述的根據本發明之雙特異性分子中所包含之多肽。
在一個態樣中，本發明係有關一種編碼雙特異性抗原結合分子之經分離聚核苷酸，該雙特異性抗原結合分子包含：(a)至少一個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，(b)至少一個能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域，及(c)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成的Fc域。
在某些實施例中，該聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸係RNA，例如呈信使RNA (mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。
重組方法 本發明之雙特異性抗原結合分子可例如藉由重組生成獲得。對於重組生成，提供一或多個編碼雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸。該一或多個編碼雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸經分離且插入至一或多個載體中用於進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此類聚核苷酸可使用習知程序容易地分離及定序。在本發明之一個態樣中，提供包含本發明之聚核苷酸中之一或多者的載體，較佳表現載體。可使用熟習此項技術者熟知的方法構築雙特異性抗原結合分子(片段)之編碼序列與適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)中所描述之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現卡匣，編碼雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸(亦即編碼區)以與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件之可操作締合方式選殖於該表現卡匣中。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'未轉譯區及類似序列)不為編碼區之部分。兩個或更多個編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體上，例如單一載體上，或存在於單獨多核苷酸構築體中，例如單獨(不同)載體上。此外，任何載體可含有單個編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一或多個多肽，其經由蛋白水解裂解以後轉譯或共轉譯方式分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，其融合或未融合至編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的聚核苷酸，或其變異體或衍生物。異源編碼區包括但不限於專用元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。可操作締合為如下狀況：基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列締合，以此方式將基因產物之表現置於調節序列之影響或控制下。若誘導啟動子功能導致編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合的啟動子)為「可操作地締合」。因此，若啟動子能夠實現該核酸轉錄，則啟動子區域與編碼多肽之核酸可操作地締合。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子以外的其他轉錄控制元件(例如強化子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與導引細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地締合。
適合之啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多個轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及強化子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猴病毒40 (例如早期啟動子)及逆轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔â-血球蛋白)之區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclin))。類似地，多種轉譯控制元件為一般熟習此項技術者已知的。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關聯病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽的其他編碼區結合，從而導引由本發明之聚核苷酸編碼的多肽之分泌。舉例而言，若需要分泌雙特異性抗原結合分子或其多肽片段，則編碼信號序列之DNA可置於編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的核酸上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有信號肽或分泌性前導序列，一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網之輸出已起始，該信號肽或分泌性前導序列自成熟蛋白質裂解。一般熟習此項技術者認識到，脊椎動物細胞分泌的多肽通常具有與多肽之N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯之多肽裂解而產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或該序列之保持導引可操作地與其結合之多肽之分泌的能力的功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。
編碼可用於促進隨後純化(例如組胺酸標記)或幫助標記融合蛋白之短蛋白質序列之DNA可包括於編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸的末端內或末端處。
在本發明之另一態樣中，提供包含一或多種本發明之聚核苷酸的宿主細胞。在某些態樣中，提供包含一或多種本發明之載體的宿主細胞。聚核苷酸及載體可單獨或組合地併有本文分別與聚核苷酸及載體相關描述之任一特徵。在一個態樣中，宿主細胞包含(例如已轉型或轉染有)載體，該載體包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子(的一部分)的聚核苷酸。如本文所用，術語「宿主細胞」係指任何類型之可經工程改造以產生本發明之融合蛋白或其片段的細胞系統。適用於複製及支援抗原結合分子之表現的宿主細胞為此項技術中熟知。此類細胞可視需要經特定表現載體轉染或轉導，且可生長含有大量載體之細胞以用於接種大型醱酵槽，以獲得足量的抗原結合分子以用於臨床應用。適合的宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌(E. coli)，或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可在細菌中產生多肽，尤其在不需要糖基化時。在表現之後，可自可溶性部分之細菌細胞糊狀物分離出多肽且可將該多肽進一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之多肽的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及Li等人, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。
適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞的實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型的猴腎CV1株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人, J Gen Virol 36, 59 (1977)中所描述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cells)(TM4細胞，如例如Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)中所描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cells)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人, Annals N. Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所描述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質生成之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷(B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁 (2003)。宿主細胞包括經培養細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞，較佳係哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在此等系統中表現外來基因之標準技術為此項技術中已知的。表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽的細胞可經工程改造，以便亦表現免疫球蛋白鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈及輕鏈的免疫球蛋白。
在一個態樣中，提供製造本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的方法，其中該方法包含在適於表現本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的條件下培養如本文所提供的包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的聚核苷酸的宿主細胞，及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段。
如本文所述製備的本發明之雙特異性分子可藉由此項技術中已知的技術(諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和力層析、尺寸排阻層析等)純化。用於純化特定蛋白質的實際條件將部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。對於親和力層析純化，可使用雙特異性抗原結合分子所結合之抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，關於本發明之融合蛋白之親和力層析純化，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可使用序列蛋白A或G親和層析及尺寸排阻層析來分離基本上如實例中所描述之抗原結合分子。雙特異性抗原結合分子或其片段之純度可藉由多種眾所周知的分析方法中之任一者測定，包括凝膠電泳、高壓液相層析等。舉例而言，如實例中所述表現之雙特異性抗原結合分子顯示為完整的且如還原及非還原SDS-PAGE所證實適當地組裝。
分析 本文中提供之抗原結合分子可藉由此項技術中已知之各種分析表徵其結合特性及/或生物活性。特定言之，其藉由該等實例中更詳細地描述之分析表徵。
1. 結合分析 本文提供之雙特異性抗原結合分子與相應目標表現細胞的結合可例如藉由使用表現人類纖維母細胞活化蛋白(FAP)之鼠類纖維母細胞株及流式細胞測量術(FACS)分析來評估。本文所提供之雙特異性抗原結合分子與CD40之結合可藉由使用如實例2.2.8中所描述之Raji細胞測定。
2. 活性分析 測試本發明之雙特異性抗原結合分子之生物活性。生物活性可包括雙特異性抗原結合分子之功效及特異性。功效及特異性係藉由顯示在結合目標抗原時經由CD40受體之促效信號傳導的分析證明。此外，使用已與雙特異性抗原結合分子一起培育之樹突狀細胞(DC)進行活體外T細胞激活分析。
醫藥組合物、調配物及投與途徑 在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之雙特異性抗原結合分子中之任一者的醫藥組合物，其例如用於以下治療方法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文提供之雙特異性抗原結合分子中之任一者及至少一種醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含本文提供之雙特異性抗原結合分子中之任一者及至少一種例如下文所述之額外治療劑。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種雙特異性抗原結合分子，其溶解或分散於醫藥學上可接受之賦形劑中。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般為無毒性的，亦即當適當時投與動物(諸如人類)時，不會產生有害的過敏反應或其他不良反應。含有至少一種根據本發明之雙特異性抗原結合分子及視情況選用之額外活性成分之醫藥組合物之製備將根據本發明為熟習此項技術者已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版Mack Printing Company, 1990所例示，其以引用之方式併入本文中。特定言之，組合物係凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)、等張劑、鹽、穩定劑及其組合，如一般熟習此項技術者所已知。
非經腸組合物包括為藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投與所設計的彼等組合物。注射時，本發明之雙特異性抗原結合分子可於水溶液中調配，較佳於生理上相容的緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。替代地，雙特異性抗原結合分子可呈用於在使用之前用適合之媒劑(例如無菌無熱原質水)復原的粉末形式。無菌可注射溶液藉由將所需量之本發明之抗原結合分子視需要與下文列舉的多種其他成分一起併入適當溶劑中來製備。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。一般而言，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其由活性成分加任何額外所要成分的預先無菌過濾之液體介質得到該活性成分加任何額外所要成分之粉末。視需要，液體介質宜經緩衝，且在與足量生理食鹽水或葡萄糖一起注射之前，首先使液體稀釋劑呈等張性。該組合物在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。適合的醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物溶解性之試劑以允許製備高度濃縮之溶液。另外，活性化合物之懸浮液可視需要製備成油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。
活性成分可包覆於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包覆於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack Printing Company, 1990)中。可以製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。
本文中之例示性醫藥學上可接受之賦形劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶，諸如軟骨素酶組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利案第6,171,586號及WO 2006/044908中所述之調配物，後一者中之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
除了先前描述的組合物之外，抗原結合分子亦可調配為儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，融合蛋白可用適合的聚合或疏水性材料(例如呈可接受之油中的乳液形式)或離子交換樹脂調配，或調配成微溶性衍生物，例如微溶性鹽。
包含本發明之雙特異性抗原結合分子的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾法製造。醫藥組合物可使用有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的一或多種生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習知方式調配。適當調配物視所選擇之投與途徑而定。
雙特異性抗原結合分子可以調配成游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保留游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、乙二酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與自由羧基形成的鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於相應的游離鹼形式，醫藥鹽傾向於更可溶於水性及其他質子溶劑中。
本文中之組合物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性成分。此類活性成分宜以有效達成預期目的之量的組合存在。
用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。
治療方法及組合物 本文提供之雙特異性抗原結合分子中之任一者可用於治療方法中。為了用於治療方法中，本發明之雙特異性抗原結合分子可以符合良好醫學實踐的方式調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。
在一個態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子，其用作藥劑。
在其他態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子，其用於(i)藉由 CD40+抗原呈現細胞(APC)誘導免疫刺激，(ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應，(iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡，(iv)治療癌症，(v)延遲癌症進展，(vi)延長罹患癌症之患者的存活期，(vii)治療感染。在一特定態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子，其用於治療疾病，尤其用於治療癌症。
在某些態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子，其用於治療方法中。在一個態樣中，本發明提供如本文所描述之雙特異性抗原結合分子，其用於治療有需要之個體的疾病。在某些態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其用於治療患有疾病之個體的方法中，該方法包含向該個體投與治療有效量之雙特異性抗原結合分子。在某些態樣中，待治療之疾病為癌症。需要治療之個體、患者或「個體(individual)」通常係哺乳動物，更具體言之係人類。
在一個態樣中，提供一種方法，其用於(i)藉由CD40+抗原呈現細胞(APC)誘導免疫刺激，(ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應，(iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡，(iv)治療癌症，(v)延遲癌症進展，(vi)延長罹患癌症之患者的存活期，或(vii)治療感染，其中該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之雙特異性抗原結合分子。
在另一態樣中，本發明提供本發明之雙特異性抗原結合分子的用途，其用於製造或製備供治療有需要之個體中的疾病用的藥劑。在一個態樣中，藥劑用於治療疾病之方法中，該方法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥劑。在某些態樣中，待治療之疾病為增生性病症，尤其癌症。癌症的實例包括(但不限於)膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌。癌症之其他實例包括癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。可使用本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體治療的其他細胞增殖病症包括(但不限於)定位於以下部位中之贅瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺體(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼部、頭部及頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部以及泌尿生殖系統。亦包括癌前病狀或病變及癌症轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。熟習此項技術者容易認識到，在多數情況下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體可能不提供治癒但可提供益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理學變化亦視為治療上有利的。因此，在一些態樣中，提供生理學改變的本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體之量視為「有效量」或「治療有效量」。
為了預防或治療疾病，本發明之雙特異性抗原結合分子之適當劑量(在單獨地或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視以下而定：待治療疾病之類型、投與途徑、患者體重、特異性分子、疾病之嚴重程度及病程、是否為了預防性或治療性目的投與本發明之雙特異性抗原結合分子、先前或同時發生的治療性干預、患者之臨床病史及對雙特異性抗原結合分子之反應，及主治醫師之判斷。負責投與的從業者將在任何情況下確定組合物中活性成分之濃度及適用於單獨個體的劑量。本文涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、快速投藥(bolus administration)及脈衝式輸注。
本發明之雙特異性抗原結合分子適合一次性或經一連串治療向患者投與。視疾病之類型及嚴重程度而定，雙特異性抗原結合分子之約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg至10 mg/kg)可為初始候選劑量以用於向患者投與，例如無論是否藉由一或多次獨立投與抑或藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一個典型的日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更大之範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投與，視病狀而定，治療通常將持續至疾病症狀之所需抑制發生為止。本發明之雙特異性抗原結合分子的一個例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。在其他實例中，劑量亦可包含每次投與約1 μg/kg體重、約5 μg/kg體重、約10 μg/kg體重、約50 μg/kg體重、約100 μg/kg體重、約200 μg/kg體重、約350 μg/kg體重、約500 μg/kg體重、約1 mg/kg體重、約5 mg/kg體重、約10 mg/kg體重、約50 mg/kg體重、約100 mg/kg體重、約200 mg/kg體重、約350 mg/kg體重、約500 mg/kg體重至約1000 mg/kg體重或更多，及其中可衍生之任何範圍。在來自本文中列舉之數值之可衍生範圍之實例中，基於上文所述之數值，可投與約0.1 mg/kg體重至約20 mg/kg體重、約5 μg/kg體重至約1 mg/kg體重等之範圍。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週投與(例如以使得患者接受約二至約二十或例如約六個劑量之融合蛋白)。在一特定態樣中，將每三週投與雙特異性抗原結合分子。可投與初始較高起始劑量，接著可投與一或多種較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程容易藉由習知技術及分析來監測。
本發明之雙特異性抗原結合分子一般將以有效實現預期目的之量使用。為了用於治療或預防疾病病狀，本發明之雙特異性抗原結合分子或其醫藥組合物係以治療有效量投與或施用。治療有效量之判定完全在熟習此項技術者之能力範圍內，尤其係根據本文所提供之詳細揭示內容。關於全身性投與，可首先自活體外分析(諸如細胞培養分析)評估治療有效劑量。可隨後在動物模型中調配劑量以達成循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中所測定之IC50 。此類資訊可用於更準確地判定適用於人類之劑量。亦可使用此項技術中熟知的技術由活體內資料(例如動物模型)評估初始劑量。一般熟習此項技術者可容易基於動物資料而使向人類投與最佳化。
可以獨立地調節劑量及間隔以提供足以維持治療作用的本發明之雙特異性抗原結合分子的血漿含量。常見的患者注射投與劑量在約0.1至50毫克/公斤/天，通常約0.1至1毫克/公斤/天之範圍內。治療有效血漿含量可藉由每日投與多次劑量來達成。血漿含量可藉由例如HPLC量測。在局部投與或選擇性攝入之情況下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。熟習此項技術者將能夠最佳化治療有效局部劑量而無需過度實驗。
本文所描述的本發明之雙特異性抗原結合分子的治療有效劑量一般將提供治療益處而不引起實質毒性。可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥學程序測定融合蛋白質之毒性及治療功效。可使用細胞培養分析及動物研究來測定LD50 (50%群體致死劑量)及ED50 (50%群體治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數，其可表示為比率LD50 /ED50 。較佳為展現大治療指數的雙特異性抗原結合分子。在一個態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體展現高治療指數。自細胞培養分析法及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類的劑量範圍。劑量較佳在循環濃度範圍內，其包括毒性極小或無毒性之ED50 。劑量可視多種因素而在此範圍內變化，該等因素例如所用劑型、所用投與途徑、個體病狀及其類似因素。可由個別醫師根據患者病狀選擇確切調配物、投與途徑及劑量(參見例如Fingl等人, 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第1章，第1頁，其以全文引用之方式併入本文中)。
用本發明之融合蛋白質治療之患者之主治醫師將知曉如何及何時由於毒性、器官功能不全及其類似原因而終止、中斷或調節投與。反之，主治醫師亦已知在臨床反應不充足(排除毒性)時將治療調節至較高水準。管理所關注病症時所投與之劑量的量值將隨待治療之病狀的嚴重程度、投與途徑及其類似因素而變化。病狀之嚴重程度可例如部分地藉由標準預後評估方法來加以評估。此外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變。
其他藥劑及治療 本發明之雙特異性抗原結合分子可在療法中與一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體可與至少一種額外治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋可投與以用於治療需要此類治療之個體之症狀或疾病的任何藥劑。此類額外治療劑可包含適於正治療之特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的彼等活性成分。在某些實施例中，額外治療劑為另一抗癌劑，例如微管中斷劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化因子或抗血管生成劑。在某些態樣中，額外治療劑為免疫調節劑、細胞抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性或細胞生長抑制劑、細胞凋亡活化因子或提高細胞對細胞凋亡誘導劑之靈敏度的藥劑。
因此，提供本發明之雙特異性抗原結合分子或包含該等雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物，其用於治療癌症，其中雙特異性抗原結合分子與化學治療劑、輻射及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。
此類其他藥劑宜以可有效用於預定目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所使用之融合蛋白之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體一般以相同劑量及如本文所述之投與途徑，或約1至99%本文所述的劑量，或經驗上/臨床上判定為適當的任何劑量及任何途徑使用。
上文提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中相同或單獨組合物中包括兩種或更多種治療劑)以及分別投與，在此情況下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的投與可在額外治療劑及/或助劑投與之前、同時及/或之後進行。
製品 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上文所描述之病症之製品。製品包含容器及容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器容納單獨組合物或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性劑為本發明之雙特異性抗原結合分子。
標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中該組合物包含本發明之雙特異性抗原結合分子；及(b)其中含有組合物的第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中的製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。
或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 表B (序列)：
SEQ ID NO: 名稱 序列
1 hu CD40 UniProt no. P25942, version 200 MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ
2 hu FAP UniProt no. Q12884, version 168 MKTWVKIVFG VATSAVLALL VMCIVLRPSR VHNSEENTMR ALTLKDILNG TFSYKTFFPN WISGQEYLHQ SADNNIVLYN IETGQSYTIL SNRTMKSVNA SNYGLSPDRQ FVYLESDYSK LWRYSYTATY YIYDLSNGEF VRGNELPRPI QYLCWSPVGS KLAYVYQNNI YLKQRPGDPP FQITFNGREN KIFNGIPDWV YEEEMLATKY ALWWSPNGKF LAYAEFNDTD IPVIAYSYYG DEQYPRTINI PYPKAGAKNP VVRIFIIDTT YPAYVGPQEV PVPAMIASSD YYFSWLTWVT DERVCLQWLK RVQNVSVLSI CDFREDWQTW DCPKTQEHIE ESRTGWAGGF FVSTPVFSYD AISYYKIFSD KDGYKHIHYI KDTVENAIQI TSGKWEAINI FRVTQDSLFY SSNEFEEYPG RRNIYRISIG SYPPSKKCVT CHLRKERCQY YTASFSDYAK YYALVCYGPG IPISTLHDGR TDQEIKILEE NKELENALKN IQLPKEEIKK LEVDEITLWY KMILPPQFDR SKKYPLLIQV YGGPCSQSVR SVFAVNWISY LASKEGMVIA LVDGRGTAFQ GDKLLYAVYR KLGVYEVEDQ ITAVRKFIEM GFIDEKRIAI WGWSYGGYVS SLALASGTGL FKCGIAVAPV SSWEYYASVY TERFMGLPTK DDNLEHYKNS TVMARAEYFR NVDYLLIHGT ADDNVHFQNS AQIAKALVNA QVDFQAMWYS DQNHGLSGLS TNHLYTHMTH FLKQCFSLSD
3 FAP(4B9)  CDR-H1 SYAMS
4 FAP(4B9)  CDR-H2 AIIGSGASTYYADSVKG
5 FAP(4B9)  CDR-H3 GWFGGFNY
6 FAP(4B9)  CDR-L1 RASQSVTSSYLA
7 FAP(4B9)  CDR-L2 VGSRRAT
8 FAP(4B9)  CDR-L3 QQGIMLPPT
9 FAP(4B9)  VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
10 FAP(4B9)  VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
11 FAP (28H1) CDR-H1 SHAMS
12 FAP (28H1) CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG
13 FAP (28H1) CDR-H3 GWLGNFDY
14 FAP (28H1) CDR-L1 RASQSVSRSYLA
15 FAP (28H1) CDR-L2 GASTRAT
16 FAP (28H1) CDR-L3 QQGQVIPPT
17 FAP(28H1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS
18 FAP(28H1) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
19 FAP (212) CDR-H1 DYNMD
20 FAP (212) CDR-H2 DIYPNTGGTIYNQKFKG
21 FAP (212) CDR-H3 FRGIHYAMDY
22 FAP (212) CDR-L1 RASESVDNYGLSFIN
23 FAP (212) CDR-L2 GTSNRGS
24 FAP (212) CDR-L3 QQSNEVPYT
25 FAP (212) VH EVLLQQSGPELVKPGASVKIACKASGYTLTDYNMDWVRQSHGKSLEWIGDIYPNTGGTIYNQKFKGKATLTIDKSSSTAYMDLRSLTSEDTAVYYCTRFRGIHYAMDYWGQGTSVTVSS
26 FAP (212) VL DIVLTQSPVSLAVSLGQRATISCRASESVDNYGLSFINWFQQKPGQPPKLLIYGTSNRGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSNEVPYTFGGGTNLEIK
27 FAP (VH1G3a) CDR-H2 DIYPNTGGTIYAQKFQG
28 FAP (VH2G3a) CDR-H2 DIYPNTGGTIYADSVKG
29 FAP (VL1G3a) CDR-L1 RASESVDNYGLSFLA
30 FAP (VL2G3a) CDR-L1 RASESIDNYGLSFLN
31 FAP (VH1G1a) 參見表10
32 FAP (VH1G2a) 參見表10
33 FAP (VH1G3a) 參見表10
34 FAP (VH2G1a) 參見表10
35 FAP (VH2G2a) 參見表10
36 FAP (VH2G3a) 參見表10
37 FAP (VL1G1a) 參見表10
38 FAP (VL1G2a) 參見表10
39 FAP (VL1G3a) 參見表10
40 FAP (VL2G1a) 參見表10
41 FAP (VL2G2a) 參見表10
42 FAP (VL2G3a) 參見表10
43 hu CD40  CDR-H1 GYYIH
44 hu CD40  CDR-H2 RVIPNAGGTSYNQKFKG
45 hu CD40  CDR-H3 EGIYW
46 hu CD40  CDR-L1 RSSQSLVHSNGNTFLH
47 hu CD40  CDR-L2 TVSNRFS
48 hu CD40  CDR-L3 SQTTHVPWT
49 hu CD40 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSS
50 hu CD40 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIK
51 CD40 (S2C6) VH EVQLQQSGPD LVKPGASVKI SCKASGYSFT GYYIHWVKQS HGKSLEWIGR VIPNNGGTSY NQKFKGKAIL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCAREG IYWWGHGTTL TVSS
52 CD40 (S2C6) VL DVVVTQTPLS LPVSLGAQAS ISCRSSQSLV HSNGNTFLHW YLQKPGQSPK LLIYTVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQTTHVP WTFGGGTKLE IQ
53 VH1a (CD40) 參見表17
54 VH1b (CD40) 參見表17
55 VH1c (CD40) 參見表17
56 VH1d (CD40) 參見表17
57 VL1a (CD40) 參見表17
58 VL1b (CD40) 參見表17
59 VL1c (CD40) 參見表17
60 VL1d (CD40) 參見表17
61 VH2a (CD40) 參見表18
62 VH2b (CD40) 參見表18
63 VH2c (CD40) 參見表18
64 VH2d (CD40) 參見表18
65 VH2ab (CD40) 參見表18
66 VH2ac (CD40) 參見表18
67 VL2a (CD40) 參見表18
68 VL2b (CD40) 參見表18
69 VL2ab (CD40) 參見表18
70 VL2ac (CD40) 參見表18
71 P1AE0400重鏈 參見表20
72 P1AE0400輕鏈 參見表20
73 P1AE0403重鏈 參見表20
74 P1AE0403輕鏈 參見表20
75 P1AE0817重鏈 參見表20
76 P1AE0817輕鏈 參見表20
77 (P1AE1689)輕鏈交叉VH-Cκ 參見表24
78 VL1a (CD40)輕鏈(帶電) 參見表24
79 VH1a (CD40) (VHCH1帶電) Fc杵_PGLALA_(P1AE1689) (VL-CH1) 參見表24
80 VH1a (CD40) (VHCH1帶電)_ VH1a (CD40) (VHCH1帶電)_ Fc臼_PGLALA 參見表24
81 (4B9)輕鏈交叉VL-CH1 參見表24
82 VL1a (CD40)輕鏈 參見表24
83 VH1a (CD40) (VHCH1) Fc 杵_PGLALA_(4B9) (VH-Cκ) 參見表24
84 VH1a (CD40) (VHCH1)_VH1a (CD40) (VHCH1)_Fc臼_PGLALA 參見表24
85 VH1a (CD40) (VHCH1帶電) Fc臼_PGLALA 參見表24
86 VH1a (CD40) (VHCH1帶電_VH1a (CD40) (VHCH1帶電)-Fc 杵_PGLALA_(P1AE1689) (VL-CH1) 參見表24
87 VH1a (CD40) (VHCH1) Fc 杵_PGLALA_4B9 (VH-Cκ) 參見表24
88 VH1a (CD40) (VHCH1) Fc 臼_PGLALA 參見表24
89 VH1a (CD40) (VHCH1) _VH1a (CD40) (VHCH1)-Fc杵_PGLALA_(4B9) (VH-Cκ) 參見表24
90 IgG1 Fc杵鏈 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
91 IgG1 Fc臼鏈 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
92 hu FAP胞外域+聚離胺酸標記+his6 標記 RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
93 小鼠FAP UniProt no. P97321
94 鼠類FAP胞外域+聚離胺酸標記+his6 標記 RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTYFPNWISEQEYLHQSEDDNIVFYNIETRESYIILSNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLQNGEFVRGYELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRVFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSDYYFSWLTWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWHAWECPKNQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFSQDATSYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAIYIFRVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRISIGNSPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPISTLHDGRTDQEIQVLEENKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNWITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDKFLHAVYRKLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASIYSERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGILSGRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
95 食蟹獼猴FAP胞外域+聚離胺酸標記+his6 標記 RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPFVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEDYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
96 肽連接子(G4S) GGGGS
97 肽連接子(G4S)2 GGGGSGGGGS
98 肽連接子(SG4)2 SGGGGSGGGG
99 肽連接子G4(SG4)2 GGGGSGGGGSGGGG
100 肽連接子 GSPGSSSSGS
101 (G4S)3 肽連接子 GGGGSGGGGSGGGGS3
102 (G4S)4 肽連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
103 肽連接子 GSGSGSGS
104 肽連接子 GSGSGNGS
105 肽連接子 GGSGSGSG
106 肽連接子 GGSGSG
107 肽連接子 GGSG
108 肽連接子 GGSGNGSG
109 肽連接子 GGNGSGSG
110 肽連接子 GGNGSG
111 接受體構架IGHJ6*01/02 YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
112 接受體構架IGKJ4*01/02 LTFGGGTKVEIK
113 接受體構架1 IGHJ6*01/02 YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
114 接受體構架1 IGKJ4*01/02 LTFGGGTKVEIK
115 接受體構架2 IGHJ6*01/02 YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
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以下編號段落(段)描述本發明之態樣。 1. 一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈又在其C端融合至該第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段融合至該等Fc域次單元中之一者之C端。 2. 如第1段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段融合至第二Fc域次單元之C端。 3. 如第1段或第2段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之抗原結合域係能夠特異性結合於纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗原結合域。 4. 如第1段至第3段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-L3。 5. 如第1段至第4段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 6. 如第1段至第3段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含：重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含選自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28組成之群之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含選自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30組成之群之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之CDR-L3。 7. 如第1段至第3段或第6段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (i)重鏈可變區(VH FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36，及 (ii)輕鏈可變區(VL FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:42。 8. 如第1段至第3段或第6段或第7段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)， (b)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)， (c)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或 (d)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 9. 如第1段至第8段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含：重鏈可變區(VH CD40)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之CDR-L3。 10. 如第1段至第9段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60。 11. 如第1段至第9段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。 12. 如第1段至第10段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (a)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (b)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (c)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (d)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (e)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (f)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (g)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (h)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (i)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (j)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (k)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (l)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (m)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (n)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (o)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (p)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL。 13. 如第1段至第10段或第12段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含：包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之VL。 14. 如第1段至第9段或第11段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含 (a)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (b)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (c)包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (d)包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (e)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (f)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (g)包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (h)包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (i)包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的VL，或 (j)包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的VL，或 (k)包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的VL，或 (l)包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的VL。 15. 如第1段至第9段或第11段或第14段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域中之每一者包含：包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或其中能夠特異性結合於CD40之抗原結合域包含：包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL。 16. 如第1段至第9段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其包含 (i)三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含：包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)，及 (ii)一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。 17. 如第1段至第16段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區為IgG，特定言之，IgG1 Fc區或IgG4 Fc區，且其中該Fc區包含一或多個降低抗體對Fc受體之結合親和力及/或效應功能的胺基酸取代。 18. 如第1段至第17段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區屬於具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU編號)之人類IgG1子類別. 19. 如第1段至第18段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中根據杵臼方法，該Fc區之第一次單元包含杵且該Fc區之第二次單元包含臼。 20. 如第1段至第19段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat之EU編號)且該Fc區之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat之EU編號)。 21. 一種經分離核酸，其編碼如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子。 22. 一種表現載體，其包含如第21段之經分離核酸。 23. 一種宿主細胞，其包含如第21段之經分離核酸或如第22段之表現載體。 24. 一種產生雙特異性抗原結合分子之方法，其包含在適於表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如第23段之宿主細胞，及分離該雙特異性抗原結合分子。 25. 一種醫藥組合物，其包含如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。 26. 如技術方案1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子或如第25段之醫藥組合物，其用作藥劑。 27. 如技術方案1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子或如第25段之醫藥組合物，其係用於 (i)藉由表現CD40之抗原呈現細胞(APC)誘導免疫刺激， (ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應， (iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡， (iv)治療癌症， (v)延遲癌症進展， (vi)延長罹患癌症之患者的存活期， (vii)治療感染。 28. 如技術方案1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子或如第25段之醫藥組合物，其用於治療癌症。 29. 一種如技術方案1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子或如第25段之醫藥組合物之用途，其係用於製造供治療癌症用之藥劑。 30. 一種治療患有癌症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之如技術方案1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子或如第25段之醫藥組合物。 31. 如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子或如第25段之醫藥組合物，其係用於治療癌症，其中該雙特異性抗原結合分子係與化學治療劑、輻射及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。
實例 以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文所提供之一般描述，可實踐各種其他實施例。
重組 DNA 技術 使用標準方法操縱DNA，如Sambrook等人, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所描述。根據製造商說明書，使用分子生物學試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的總體資訊係給出於：Kabat, E.A.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH公開案第91-3242號中。
DNA 定序 藉由雙股定序法測定DNA序列。
基因合成 所需基因區段係使用適當模板藉由PCR產生，或藉由自動化基因合成法，藉由Geneart AG (Regensburg, Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物合成。在無法獲得確切基因序列的情況下，基於來自最近同源物的序列來設計寡核苷酸引子且藉由RT-PCR自來源於適當組織之RNA分離基因。將側接有單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖至標準選殖/定序載體中。自經轉型之細菌純化質體DNA且藉由UV光譜法來測定濃度。藉由DNA定序來確認經次選殖之基因片段之DNA序列。基因區段經設計具有允許次選殖入各別表現載體中的適合限制位點。所有構築體經設計具有5'-端DNA序列，該序列編碼靶向真核細胞中分泌之蛋白質的前導肽。
蛋白質純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體施用於蛋白A瓊脂糖凝膠管柱(GE Healthcare)且用PBS洗滌。在pH 2.8下實現抗體之溶離，接著立即中和樣本。在PBS或20 mM組胺酸、150 mM NaCl pH 6.0中藉由尺寸排阻層析(Superdex 200，GE Healthcare)自單體抗體分離聚集之蛋白質。合併單體抗體部分，必要時使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)離心濃縮器濃縮，冷凍且儲存在-20℃或-80℃下。提供部分樣本用於例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析(SEC)或質譜分析進行後續蛋白質分析及分析表徵。
SDS-PAGE 根據製造商說明書使用NuPAGE®預製凝膠系統(Invitrogen)。特定言之，使用10%或4%至12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS預製凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES (還原性凝膠，具有NuPAGE® Antioxidant操作緩衝液添加劑)或MOPS (非還原性凝膠)操作緩衝液。
CE-SDS 使用微流LabChip技術(Caliper Life Science, USA)，藉由CE-SDS分析雙特異性抗體及對照抗體之純度、抗體完整性及分子量。使用HT蛋白表現套組根據製造商說明書製備5 µl蛋白質溶液，且使用HT蛋白表現晶片在LabChip GXII系統上分析。使用LabChip GX軟體分析資料。
分析性尺寸排阻層析 藉由HPLC層析進行用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之尺寸排阻層析(SEC)。簡言之，將蛋白質A純化抗體施用於Agilent HPLC 1100系統上300 mM NaCl、50 mM KH2 PO4 /K2 HPO4 ，pH 7.5中之Tosoh TSKgel G3000SW管柱或Dionex HPLC系統上2×PBS中之Superdex 200管柱(GE Healthcare)。藉由UV吸光度及峰面積之積分來定量溶離之蛋白質。將BioRad凝膠過濾標準151-1901用作標準。
質譜分析 此部分描述具有VH/VL或CH/CL交換(交叉單抗)之多特異性抗體之表徵，其中強調其正確組裝。藉由去糖基化完整交叉單抗及去糖基化/FabALACTICA消解或以其他方式去糖基化/GingisKHAN消解交叉單抗之電噴霧電離質譜法(ESI-MS)來分析預期主要結構。
在蛋白質濃度為1 mg/ml下，交叉單抗在磷酸鹽或Tris緩衝液中，在37℃下用N-糖苷酶去糖基化至多17 h。在由供應商供應之緩衝液中用100 µg去糖基化交叉單抗執行FabALACTICA或GingisKHAN (Genovis AB; Sweden)消解。在質譜分析之前，在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上經由HPLC將樣本去鹽。在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上經由ESI-MS測定總質量。
實例1 產生抗纖維母細胞活化蛋白(FAP)之新抗體
1.1 小鼠免疫接種 使用Balb/c及NMRI小鼠進行免疫接種。動物係根據附件A「動物收容及護理指南」圈養在AAALACi所認可之動物設施中。所有動物免疫接種方案及實驗均經Upper Bavaria政府審批通過(許可證號55.2-1-54-2531-19-10)且係根據德國動物福利法及歐洲議會及理事會之指令2010/63進行。6至8週齡的Balb/c及NMRI小鼠(n=5)接受四輪免疫接種，其中人類纖維母細胞活化蛋白質α (胺基酸27-759；寄存編號NP_004451)之重組製造的細胞外域共價連接至His標記(SEQ ID NO:93)。每次免疫接種之前，用氧氣與異氟醚之氣體混合物麻醉小鼠。對於第一次免疫接種，將溶解於PBS (pH 7.4)中之30 µg蛋白質與等體積之CFA (BD Difco, #263810)混合且經腹膜內(i.p.)投與。在第6週經皮下(s.c.)投與在阿金科(Abisco)佐劑中乳化之另一10 µg蛋白質。在第10週經腹膜內投與第三劑量之不含佐劑的5 µg蛋白質。最後，在使用融合瘤技術製備用於抗體研發之脾細胞之前三天，對小鼠進行靜脈內(i.v.)增強免疫接種50 µg蛋白質。藉由ELISA測試血清之抗原特異性總IgG抗體產生。在最終免疫接種之後三天，將小鼠安樂死，且無菌分離脾臟且準備用於融合瘤產生。分離小鼠淋巴球且使用基於PEG之標準方案與小鼠骨髓瘤細胞株融合以產生融合瘤。將所得融合瘤細胞在平底96孔微量滴定盤中以大致104 塗鋪，隨後在選擇性培養基中培養約兩週，且接著篩選以用於產生抗原特異性抗體。一旦發生大量融合瘤生長，即對分泌抗體之融合瘤再塗鋪。藉由ELISA篩選融合瘤上清液與重組人類纖維母細胞活化蛋白α (huFAP)特異性結合，隨後使用Biacore量測評估與重組huFAP之動力學結合參數。
融合瘤之培養：在37℃及5% CO2 下在補充有以下之RPMI 1640 (PAN-目錄號(Cat. No.) PO4-17500)中培養產生的muMAb融合瘤：2 mM L-麩醯胺酸(GIBCO-目錄號35050-038)、1 mM丙酮酸鈉(GIBCO-目錄號11360-039)、1× NEAA (GIBCO-目錄號11140-035)、10% FCS (PAA-目錄號A15-649)、1× 鏈黴素(Pen Strep) (Roche-目錄號1074440)、1× Nutridoma CS (Roche-目錄號1363743)、50 µM巰基乙醇(GIBCO-目錄號31350-010)及50 U/ml IL 6小鼠(Roche-目錄號1 444 581)。
1.2 抗huFAP抗體與FAP純系4B9及28H1之競爭性細胞結合 相較於FAP純系4B9，測試所得純系之結合特性。FAP純系4B9及28H1之產生及製備描述於WO 2012/020006 A2中，其以引用之方式併入本文中。為了判定鼠類FAP純系是否將不同抗原決定基識別為純系4B9及28H1，進行與經轉染HEK細胞上表現之人類FAP的競爭性結合。
簡言之，用細胞解離緩衝液採集目標細胞，用FACS緩衝液(PBS +2% FCS + 5 mM EDTA + 0.25%疊氮化鈉)洗滌且接種於96-U形底盤(1×105 個細胞/孔)中。將未標記之初級抗人類FAP抗體(mu IgG1)添加至細胞中(最終濃度為60 µg/ml至0.2 µg/ml；1:3稀釋)且在4℃下培育20 min，之後添加AlexaFluor647-標記之抗FAP抗體4B9或28H1 (最終濃度20 µg/ml)。在4℃下培育30 min之後，洗滌細胞，固定且使用Miltenyi MACSQuant量測AF647標記之純系4B9及28H1之螢光信號強度。
如圖 2A 及圖 2B 中可見，鑑別不與抗FAP抗體4B9或28H1競爭結合的10種源自融合瘤之鼠類抗體(命名為純系209、210、211、212、213、214、215、216、217及218)。
1.3 抗huFAP鼠類抗體之目標結合特異性 纖維母細胞活化蛋白(FAP、FAP-α、牽引酶)為II型跨膜絲胺酸蛋白酶，屬於脯胺醯基寡肽酶家族。此家族包含優先在脯胺酸殘基之後裂解肽之絲胺酸蛋白酶。在人類蛋白質組中表現之此家族之其他重要成員為脯胺醯基寡肽酶(PREP)及二肽基肽酶(DPP)。DPP-IV為FAP之最接近同源物。相比於FAP，DPP-IV經普遍表現且在諸如T細胞協同刺激、趨化因子生物學、葡萄糖代謝及腫瘤形成之各種生物過程中起作用，且因此所需抗人類FAP抗體不應結合於人類DPP-IV。
藉由流式細胞測量術使用人類FAP或人類DPPIV-轉染HEK細胞測定與人類FAP及人類DPP-IV之結合。簡言之，用細胞解離緩衝液採集目標細胞，用FACS緩衝液(PBS + 2% FCS + 5 mM EDTA + 0.25%疊氮化鈉)洗滌且接種於96-U形底盤(1×105 個細胞/孔)中。將未標記之初級抗體添加至細胞(最終濃度10 µg/ml)中且在4℃下培育30 min。洗滌之後，在4℃下在暗處將細胞與山羊抗小鼠IgG-PE F(ab')2 (Serotec)一起培育30min。隨後，洗滌細胞，固定且使用BD FACS Canto™ II量測。對於10種源自融合瘤之抗人類FAP抗體中之任一者未偵測到與人類DPP-IV之非特異性結合。
1.4 產生呈huIgG1_LALA_PG型式之抗huFAP抗體 使用標準定序方法測定新的抗huFAP抗體之DNA序列。基於VH及VL域，新的抗FAP抗體以具有效應沉默Fc (P329G；L234、L235A)之huIgG1抗體形式表現，以根據WO 2012/130831 A1中所描述之方法取消與Fcγ受體之結合。詳言之，藉由用編碼不同肽鏈之表現載體短暫轉染懸浮生長之HEK293-F細胞來表現抗體。在無血清FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen)中，根據細胞供應商說明書，使用Maxiprep (Qiagen, Germany)抗體載體製劑、F17基礎培養基(Invitrogen, USA)、PEIpro (Polyscience Europe GmbH)及1至2百萬活細胞/ml的初始細胞密度來進行轉染成HEK293-F細胞(Invitrogen, USA)。在藉由於14000 g下離心30分鐘而在搖瓶或攪拌醱酵槽中培養7天之後採集細胞培養上清液，且經由0.22 µm過濾器過濾。
藉由親和層析，使用MabSelectSure-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden)層析自細胞培養上清液純化抗體。簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養上清液，用平衡緩衝液洗滌且用25 mM檸檬酸鹽(pH 3.0)溶離。在用1 M Tris pH 9.0中和之後，在20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)中藉由尺寸排阻層析(Superdex 200, GE Healthcare)將聚集之蛋白質自單體抗體物質分離。合併單體蛋白質溶離份，必要時使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO)離心濃縮器濃縮且儲存在-80℃下。使用樣本等分試樣以供例如藉由CE-SDS、尺寸排阻層析法、質譜分析及內毒素測定進行後續分析表徵。
1.5 抗huFAP抗體之細胞結合 使用經人類FAP轉染之HEK細胞，藉由流式細胞測量術測定具有人類IgG1 P329G LALA Fc之抗FAP抗體與人類FAP之結合。簡言之，用細胞解離緩衝液採集目標細胞，用FACS緩衝液(PBS + 2% FCS + 5 mM EDTA + 0.25%疊氮化鈉)洗滌且接種於96-U形底盤(1×105 個細胞/孔)中。將未標記之初級抗體添加至細胞中(最終濃度為10 µg/ml至0.64 ng/ml；1:5稀釋)且在4℃下培育30 min。洗滌之後，將細胞與Fcγ特異性的PE結合之AffiPure F(ab)2 片段羊抗人IgG (Jackson Immunoresearch)一起在4℃下在暗處培育30 min。隨後，洗滌細胞，固定且使用BD FACS LSR FortessaTM 量測。
如先前所見，所有抗FAP抗體示出與人類FAP之類似結合。所選黏合劑之EC50 值展示於下表1中。 表1：抗FAP抗體與huFAP表現細胞之細胞結合
樣本ID 純系 EC50 [µg/ml] 與經FAP轉染之HEK細胞之細胞結合
   4B9 0.089
P1AD9427 209 0.145
P1AD9436 210 0.125
P1AD9437 211 0.198
P1AD9438 212 0.118
P1AD9440 214 0.086
1.6 抗huFAP抗體之細胞內化 FAP黏合劑之內化係使用經人類FAP轉染之HEK細胞作為目標來測定。簡言之，用細胞解離緩衝液採集目標細胞，用低溫FACS緩衝液(PBS + 2% FCS + 5 mM EDTA + 0.25%疊氮化鈉)洗滌且以1.5×106 個細胞/ml再懸浮於低溫FACS緩衝液中。將細胞分佈於15 ml試管中(各試管含有3×106 個細胞於2 ml中)。將2 ml抗人類FAP抗體溶液添加至細胞(最終濃度20 µg/ml)中且在4℃下培育45 min。隨後，洗滌細胞，將其再懸浮於低溫FACS緩衝液中，且緊接著將時間點「0」之細胞接種至96-U形底盤(1.5×106 個細胞/孔)中且保持在4℃下，而將所有其他細胞離心，再懸浮於含有10 % FCS及1 % Glutamax (1.5×106 個細胞/ml)之溫熱RPMI1640培養基中，並在含濕氣培育箱(5 % CO2 )中變為37℃。在各指示時間點之後，將100 µl/試管之細胞懸浮液轉移至培養盤，緊接著用低溫FACS緩衝液冷卻且儲存於冰箱中，直至已收集到所有時間點為止。在收集所有時間點之後，用低溫FACS緩衝液洗滌細胞且與經PE標記之二級抗體一起在4℃下培育30 min。隨後，洗滌細胞，固定且使用BD FACS Canto™ II量測。
由經標記二級抗體引起之信號隨時間推移保持幾乎不變，此意謂隨時間推移未觀測到抗體損失，所測試之抗huFAP抗體中無一者被內化。
1.7 抗huFAP抗體之結合動力學 為了評估人類FAP結合動力學，根據製造商說明書將經生物素標記之人類FAP固定在S系列Biacore CAPture晶片(GE Healthcare 28-9202-34)上，產生約20個共振單位(RU)之表面密度。作為操作及稀釋緩衝液，使用HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05%界面活性劑P20)。依次注射抗huFAP Fab之稀釋系列(3.7至300 nM，1:3稀釋)，各自持續120 s，在30 µl/min之流動速率(單循環動力學)下監測解離，持續1800s。藉由注射6 M 胍-HCl、0.25 M NaOH達120秒而使表面再生。藉由減去空白注射且藉由減去不含捕捉的人類FAP之對照流槽獲得之反應來校正整體折射率差異。在Biacore評估軟體內使用1:1朗格繆爾(Langmuir)結合模型進行曲線擬合。親和力資料展示於下表2中。. 表2：如藉由Biacore所量測的抗FAP Fab對人類FAP之親和力
樣本ID 純系 ka (1/Ms) kd (1/s) KD
   4B9_Fab 1.82E+06 7.80E-04 430 pM
P1AD9427_Fab 209 3.50E+06 1.77E-03 510 pM
P1AD9436_Fab 210 1.87E+06 ＜ E-06 ＜ 10 pM
P1AD9437_Fab 211 8.13E+05 4.61E-05 60 pM
P1AD9438_Fab 212 1.06E+06 ＜ E-06 ＜ 10 pM
P1AD9440_Fab 214 1.99E+06 ＜ E-06 ＜ 10 pM
1.8 抗huFAP純系之型式依賴性結合 為了在抗FAP純系於C端融合至Fc域時判定其結合特性是否丟失，製備包含Fc杵鏈及Fc臼鏈之構築體，其中VH域融合至Fc杵鏈之C端且VL域融合至Fc臼鏈之C端(圖3A，C項VH/VL融合)及包含Fc杵鏈及Fc臼鏈之構築體，其中完整Fab與其VH域一起融合至Fc杵鏈之C端(圖3B，C項Fab融合)。Fc杵鏈具有SEQ ID NO:90之胺基酸序列且Fc臼鏈具有SEQ ID NO:91之胺基酸序列。
相較於抗體，構築體對經生物素標記之重組人類FAP及經生物素標記之重組食蟹獼猴FAP之親和力展示於下表3中。 表3：如藉由Biacore所量測之對人類FAP及食蟹獼猴FAP之親和力
   對人類FAP 之親和力 KD [nM] 對食蟹獼猴FAP 之親和力 KD [nM]
純系 游離 Fab C 項 Fab 融合 C 項VH/VL 融合 IgG C 項 Fab 融合 C 項VH/VL 融合
209 0.31 1.52 42.40 0.33 1.60 50.00
210 0.07 0.17 3.95 0.12 0.20 3.44
211 0.28 1.20 10.90 0.32 1.30 11.40
212 0.12 0.62 5.72 0.14 0.64 6.19
214 0.06 0.19 2.49 0.09 0.21 2.77
如前所述，亦已測定構築體與經FAP轉染之HEK細胞之細胞結合。EC50 值展示於表4中。所有抗FAP抗體之C端融合構築體能夠結合於人類及食蟹獼猴FAP，然而其中完整Fab與其VH域一起融合至Fc杵鏈之C端的構築體優於其中VH域融合至Fc杵鏈之C端且VL域融合至Fc臼鏈之C端的構築體。 表4：與huFAP表現細胞之細胞結合
   與人類FAP 之細胞結合 EC50 [µg/ml] 與食蟹獼猴FAP 之細胞結合 EC50 [µg/ml]
純系 IgG C 項 Fab 融合 C 項VH/VL 融合 IgG C 項 Fab 融合 C 項VH/VL 融合
209 0.15 1.2 5.7 0.4 1.1 7.9
210 0.13 1.8 9.0 0.4 1.3 7.1
211 0.20 3.7 9.3 0.3 2.9 6.7
212 0.12 2.8 8.8 0.3 2.3 11.1
214 0.09 1.7 9.4 0.3 1.3 3.6
1.9 如藉由Biacore所測定之抗人類FAP純系之競爭性結合 在Biacore T200儀器上使用基於表面電漿子共振(SPR)之分析進行抗原決定基分組。藉由固定的抗His抗體捕捉FAP抗原。在第一步驟中，注入FAP結合子直至飽和。隨後注射第二FAP結合子。分析設計示意性地展示於圖3C中。添加第二抗體之後的結合信號增加指示其與不同於第一抗體之抗原決定基的結合。無額外結合指示第一及第二抗體識別相同抗原決定基區。
藉由胺偶合(GE Healthcare套組BR-1000-50)將濃度為20 µg/ml之抗His抗體(GE Healthcare套組28-9950-56)固定至CM5感測器晶片(GE Healthcare BR-1005-30)之表面。注射時間在10 µl/min之流動速率下為600秒以在兩個流槽上得到12000個反應單位(RU)，該兩個流槽一個用作參考且一個用作作用中流槽。操作緩衝液為HBS-N (GE Healthcare BR-1006-70).。為了量測，將PBS-P+ (GE Healthcare 28-9950-84)用作操作及稀釋緩衝液。將流槽溫度設定為25℃，樣本隔室設定為12℃。整個操作之流動速率設定為10 µl/min。
在作用中流槽中捕捉濃度為20 µg/ml之His標記之FAP抗原，持續180秒。經兩個流槽依次注射第一及第二抗體(FAP結合劑)，各持續120秒，濃度為10 µg/ml。在各循環之後，用10 mM甘胺酸(pH 1.5)使表面再生60秒(GE Healthcare BR-1003-54)。
結果展示於下表5中： 表5：抗FAP抗體與4B9之競爭性結合
   4B9 209 210 211 212 214
4B9 競爭性結合 同時結合 同時結合 同時結合 同時結合 同時結合
209 同時結合 競爭性結合 同時結合 同時結合 同時結合 同時結合
210 同時結合 同時結合 競爭性結合 競爭性結合 競爭性結合 競爭性結合
211 同時結合 同時結合 競爭性結合 競爭性結合 競爭性結合 競爭性結合
212 同時結合 同時結合 競爭性結合 競爭性結合 競爭性結合 競爭性結合
214 同時結合 同時結合 競爭性結合 競爭性結合 競爭性結合 競爭性結合
因此，鑑別三個抗原決定基組。如所請求，抗FAP抗體中無一者與抗體4B9 (抗原決定基組1)競爭結合。抗體210、211、212及214彼此競爭結合且因此形成一個基團(抗原決定基組3)，而抗體209不與抗體中之任何其他者競爭結合(抗原決定基組2)。
1.9 抗FAP抗體之熱穩定性評估 在20 mM組胺酸/組胺酸氯、140 mM NaCl (pH 6.0)中製備濃度為1 mg/mL之樣本，經由0.4 µm過濾盤藉由離心轉移至光學384孔培養盤中且用石蠟油覆蓋。藉由動態光散射在DynaPro盤式讀取器(Wyatt)上重複量測流體動力學半徑，同時以0.05℃/min之速率將樣本自25℃加熱至80℃。或者，將樣本轉移至10 µL微光析槽陣列中，且用Optim1000儀器(Avacta Inc.)記錄靜態光散射資料以及在266 nm雷射下激發後之螢光資料，同時以0.1℃/min之速率將樣本自25℃加熱至90℃。聚集起始溫度(Tagg )經定義為流體動力學半徑(DLS)或散射光強度(Optim 1000)開始增加之溫度。解鏈溫度經定義為展示螢光強度對波長之圖中的拐點。所選抗FAP抗體之聚集起始溫度展示於表6中。 表6：抗FAP抗體之聚集起始溫度
   4B9 209 210 212 214
Tagg (℃) 60 66 61 67 61
選擇抗FAP純系212進行人類化，因為其係以與抗體4B9相當的親和力結合於人類FAP且展示出開發之有利特性。其序列之電腦模擬分析僅指示一個預測降級熱點(位置401處之Trp)。鼠類純系212之序列展示於表7中。 表7：鼠類抗FAP純系212之可變域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
FAP(212) VH EVLLQQSGPELVKPGASVKIACKASGYTLTDYNMDWVRQSHGKSLEWIGDIYPNTGGTIYNQKFKGKATLTIDKSSSTAYMDLRSLTSEDTAVYYCTRFRGIHYAMDYWGQGTSVTVSS 25
FAP(212) VL DIVLTQSPVSLAVSLGQRATISCRASESVDNYGLSFINWFQQKPGQPPKLLIYGTSNRGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSNEVPYTFGGGTNLEIK 26
1.10 抗FAP純系212之人類化 1.10.1方法 藉由查詢鼠類輸入序列之人類V區及J區序列之BLASTp資料庫來鑑別適合之人類接受體構架(削減至可變部分)。用於選擇人類接受體構架之選擇性準則為序列同源性、相同或類似CDR長度及人類生殖系之估計頻率，以及在VH-VL域界面處保守某些胺基酸。在生殖系鑑別步驟之後，將鼠類輸入序列之CDR移植至人類接受體構架區上。評定此等初始CDR移植物與親本抗體之間的各胺基酸差異對各別可變區之結構完整性有可能的影響的等級，且只要認為適合，即引入針對親本序列之「回復突變」。結構評定係基於親本抗體及人類化變異體兩者之Fv區同源性模型，其利用使用17R2版Biovia Discovery Studio Environment實施之內部抗體結構同源性建模工具形成。在一些人類化變異體中，包括「正向突變」，亦即，出現在親本結合子之既定CDR位置處之原始胺基酸變成在人類接受體生殖系之等效位置處發現之胺基酸的胺基酸交換。目的為增加人類化變異體之總體人類特徵(除構架區以外)以進一步降低免疫原性風險。
使用內部開發之電腦模擬工具預測成對VH及VL人類化變異體之VH-VL域取向(參見WO 2016/062734)。將結果與親本結合子之經預測VH-VL域取向比較，以選擇幾何形狀上與原始抗體接近之構架組合。基本原理為偵測VH-VL界面區中可能的胺基酸交換，其可能導致兩個域之配對的分裂性變化，該等變化又可能對結合特性具有不利影響。
1.10.2接受體構架及其適應性之選擇 選擇以下接受體構架：表 8 ： 接受體構架
   鼠類V區生殖系 移植物變異體 人類接受體V區生殖系之選擇 移植之後與人類V區生殖系之一致性(BLASTp)：
FAP (212) VH IGHV1-18*01 VH1 IGHV1-46*01 87.8 %
VH2 IGHV3-23*03 82.7 %
FAP (212) VL IGKV3-2*01 VL1 IGKV3-11*01 85.1 %
VL2 IGKV1-39*01 82.8 %
後CDR3構架區係自人類IGHJ生殖系IGHJ6*01/02 (YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS) ( SEQ ID NO:111)及人類IGKJ生殖系IGHJ4*01/02 (LTFGGGTKVEIK) ( SEQ ID NO:112)調適。與接受體構架相關之部分係以粗體字表示。
基於結構考量，在以下位置處引入自人類接受體構架至親本結合子中之胺基酸的回復突變：H43 (Q＞K)、H44 (G＞S)、H48 (M＞I)、H71 (R＞I)、H73 (T＞K)、H93 (A＞T) [VH1]、H49 (S＞G)、H71 (R＞I)、H73 (N＞K)、H78 (L＞A)、H93 (A＞T)、H94 (K＞R) [VH2]、L36 (Y＞F)、L43 (A＞P)、L87 (Y＞F) [VL1]及L36 (Y＞F)、L42 (K＞Q)、L43 (A＞P)、L85 (T＞M)、L87 (Y＞F) [VL2]。
此外，將位置H60 (N＞A)、H64 (K＞Q) [VH1]、H60 (N＞A)、H61 (Q＞D)、H62 (K＞S)、H63 (F＞V) [VH2]、L33 (I＞L)、L34 (N＞A) [VL1]及L27b (V＞I)、L33 (I＞L) [VL2]鑑別為用於前向突變之有前景的候選。所有位置均在Kabat EU編號方案中給出。表 9 ：變異體之清單
變異體名稱 回復 / 前向突變 與人類 V 區生殖系之一致性 ( BLASTp )
VH1G1a bM48I, bR71I, bA93T 84.7 %
VH1G2a bQ43K, bG44S, bM48I, bR71I, bT73K, bA93T 81.6 %
VH1G3a bM48I, fN60A, fK64Q, bR71I, bA93T 86.7 %
VH2G1a bS49G, bA93T, bK94R 79.6 %
VH2G2a bS49G, bR71I, bN73K, bL78A, bA93T, bK94R 76.5 %
VH2G3a bS49G, fN60A, fQ61D, fK62S, fF63V, bA93T, bK94R 83.7 %
VL1G1a bY36F, bY87F 83 %
VL1G2a bY36F, bA43P, bY87F 81.9 %
VL1G3a fI33L, fN34A, bY36F, bY87F 85.1 %
VL2G1a bY36F, bY87F 80.8 %
VL2G2a bY36F, bK42Q, bA43P, bT85M, bY87F 77.8 %
VL2G3a fV27bI, fI33L, bY36F, bY87F 82.8 %
注意：回復突變以b為前綴，前向突變以f為前綴，例如bM48I係指在位置48 (Kabat)自甲硫胺酸至異白胺酸之回復突變(人類生殖系胺基酸至親本抗體胺基酸)。
基於接受體構架之人類化FAP抗體之所得VH及VL域可見於下表10中。 表10：人類化FAP抗體之VH及VL域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
VH1G1a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYNMD WVRQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTIYNQKFKG RVTMTIDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRFRGIHYAMDY WGQGTTVTVSS 31
VH1G2a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYNMD WVRQAPGKSLEWIGDIYPNTGGTIYNQKFKG RVTMTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRFRGIHYAMDY WGQGTTVTVSS 32
VH1G3a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYNMD WVRQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTIYAQKFQG RVTMTIDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRFRGIHYAMDY WGQGTTVTVSS 33
VH2G1a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTLTDYNMD WVRQAPGKGLEWVGDIYPNTGGTIYNQKFKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRFRGIHYAMDY WGQGTTVTVSS 34
VH2G2a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTLTDYNMD WVRQAPGKGLEWVGDIYPNTGGTIYNQKFKG RFTISIDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRFRGIHYAMDY WGQGTTVTVSS 35
VH2G3a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTLTDYNMD WVRQAPGKGLEWVGDIYPNTGGTIYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRFRGIHYAMDY WGQGTTVTVSS 36
VL1G1a EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGLSFIN WFQQKPGQAPRLLIYGTSNRGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNEVPYT FGGGTKVEIK 37
VL1G2a EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGLSFIN WFQQKPGQPPRLLIYGTSNRGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNEVPYT FGGGTKVEIK 38
VL1G3a EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGLSFLA WFQQKPGQAPRLLIYGTSNRGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNEVPYT FGGGTKVEIK 39
VL2G1a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGLSFIN WFQQKPGKAPKLLIYGTSNRGS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSNEVPYT FGGGTKVEIK 40
VL2G2a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGLSFIN WFQQKPGQPPKLLIYGTSNRGS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAMYFCQQSNEVPYT FGGGTKVEIK 41
VL2G3a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESIDNYGLSFLNWFQQKPGKAPKLLIYGTSNRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSNEVPYTFGGGTKVEIK 42
1.10.3 新人類化抗FAP Fab 基於VH及VL之新的人類化變異體，表現新的抗FAP Fab。 表11：表現為Fab之VH/VL組合之命名法
   VL1G1a VL1G2a VL1G3a VL2G1a VL2G2a VL2G3a
VH1G1a P1AE1689               
VH1G2a P1AE1690 P1AE1693            
VH1G3a                  
VH2G1a                  
VH2G2a             P1AE1702   
VH2G3a                  
相較於抗FAP抗體4B9，分析基於純系212之新人類化抗FAP變異體之親和力。此外，計算人類化變異體之人類化，且量測其聚集起始溫度。 表12：如藉由Biacore所量測之純系212之人類化變異體的親和力
樣本ID ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) T 1/2 (min) 與hu V生殖系之一致性 Tagg [℃]
P1AE1689 _Fab 4.43E+05 4.21E-05 95 274 83/84.7 72.7
P1AE1690 _Fab 5.51E+05 6.30E-05 114 183 83/81.7 75.4
P1AE1693 _Fab 5.30E+05 7.18E-05 135 161 81.9/81.7 75.4
P1AE1702 _Fab 5.02E+05 1.07E-04 213 108 77.8/76.5 71.6
4B9_Fab 7.47E+05 2.08E-04 279 55    60
1.11 FcRn/肝素結合及電腦模擬電荷分佈 在電腦模擬模型中計算抗體4B9及P1AE1689於PBS (pH 7.4)中之電荷分佈。根據該模型，4B9具有有時與增加之肝素結合相關之大陽性斑塊(patch)。另一方面，P1AE1689展示可指示弱肝素相互作用之大負電荷斑塊。
此等預測係藉由使用FcRn親和力管柱及pH梯度以及肝素親和力管柱及pH梯度對兩種抗體進行層析來確認。WO 2015/140126揭示一種基於在FcRn親和層析管柱上所測定之滯留時間預測抗體之活體內半衰期的方法，而肝素結合與細胞表面結構之非特異性相互作用相關。
實例2 抗CD40抗體S2C6之人類化變異體之產生及製造 2.1 抗CD40抗體S2C6之人類化變異體之產生
2.2.1 方法 為了鑑別包含SEQ ID NO:51之VH及SEQ ID NO:52之VL的抗CD40結合子S2C6在人類化期間之適合人類接受體構架，使用兩種方法之組合。一方面，藉由搜尋具有高序列同源性之接受體構架、CDR在此構架上之移植及評估可設想哪些回復突變來進行經典方法。更明確而言，判斷所鑑別之構架與親本抗體之各胺基酸差異對結合子之結構完整性之影響，且在適當時引入對親本序列之回復突變。結構評定係基於親本抗體及其人類化版本兩者之Fv區同源性模型，其利用使用4.5版Biovia Discovery Studio Environment實施之內部抗體結構同源性建模工具形成。
另一方面，內部研發之電腦模擬工具用於預測人類化版本之VH及VL域對彼此之取向(參見WO 2016062734，其以引用之方式併入本文中)。將結果與親本結合子之經預測VH-VL域取向比較，以選擇幾何形狀上與起始抗體接近之構架組合。基本原理為偵測VH-VL界面區中可能的胺基酸交換，其可能導致兩個域之配對的分裂性變化。 2.2.2 接受體構架及其適應性之選擇
如下表 16 及表 18 中所描述選擇兩個不同接受體構架。表 13 ： 接受體構架 1 ： 「 IGHV1-IGKV2D 」
   鼠類V區生殖系 人類接受體V區生殖系之選擇 移植之後與人類V區生殖系之一致性(BLASTp)：
S2C6 VH IGHV1-26*01 IGHV1-2*05 91.8 %
S2C6 VL IGKV1-110*01 IGKV2D-29*02 88.0 %
後CDR3構架區係自人類IGHJ生殖系IGHJ6*01/02 (YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS ) (SEQ ID NO:113)及人類IGKJ生殖系IGKJ4*01/02 (LTFGGGTKVEIK ) (SEQ ID NO:114)調適。與接受體構架相關之部分係以粗體字表示。
基於結構考量，在以下各處引入自人類接受體構架至親本結合子中之胺基酸的回復突變：VH區之位置H43 (Q＞K)、H44 (G＞S)、H69 (M＞L)、H71 (R＞V)、H73 (T＞K)、H88 (V＞A)及H105 (Q＞H) 及VL區之位置L2 (I＞V)、L4 (M＞V)、L87 (Y＞F)及L104 (V＞L)。在一個變異體中，包括突變T70S (VH)以研究略微更具親水性之殘基在此位置之作用。
所有變異體包括N54A突變(VH)以解決推定之可發展性熱點(天冬醯胺去醯胺化)。所有位置均在Kabat EU編號方案中給出。
在下表 14 中展示人類化變異型VH-VL配對基質：
      VL1a VL1b VL1c VL1d
      bY87F bM4V, bY87F bI2V, bM4V, bY83F bI2V, bM4V, bY783F, bV104L
VH1a bG44S, bM69L, bR71V, bT73K, bV88A x x x x
VH1b bQ43K, bG44S, bM69L, bR71V, bT73K, bV88A x x x x
VH1c bG44S, bM69L, bR71V, bT73K, bV88A, bQ105H x x x x
VH1d bG44S, bM69L, bR71V, bT73K, bV88A, xT70S x x x x
突變N54A適用於所有VH變異體且未明確提及。回復突變以b 為前綴，前向突變以f 為前綴，且其他突變以x 為前綴表 15 ： 接受體構架 2 ： 「 IGHV3-IGKV1 」
   鼠類V區生殖系 人類接受體V區生殖系之選擇 移植之後與人類V區生殖系之一致性(BLASTp)：
S2C6 VH IGHV1-26*01 IGHV3-23*02 79.6%
S2C6 VL IGKV1-110*01 IGKV1-39*01 79.0%
後CDR3構架區係自人類IGHJ生殖系IGHJ6*01/02 (YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS ) (SEQ ID NO:115)及人類IGKJ生殖系IGKJ4*01/02 (LTFGGGTKVEIK ) (SEQ ID NO:116)調適。與接受體構架相關之部分係以粗體字表示。
基於結構性考量，在以下各處引入自人類接受體構架至親本結合子中之胺基酸的回復突變：VH區之位置H44 (G＞S)、H49 (S＞G)、H71 (R＞V)、H78 (L＞A)、H94 (K＞R)及H105 (Q＞H)及VL區之位置L42 (K＞Q)、L43 (A＞S)及L87 (Y＞F)。此外，CDR-H2中之四個位置經鑑別為用於前向突變之有前景的候選，亦即，自親本結合子與人類接受體生殖系之胺基酸交換以便增加總體人類特徵，即H60 (N＞G)、H61 (Q＞D)、H62 (K＞S)及H63 (F＞V)。
所有變異體包括N54A突變(VH)以解決推定之可發展性熱點(天冬醯胺去醯胺化)。所有位置均在Kabat EU編號方案中給出。
在下表 16 中展示人類化變異型VH-VL配對基質：
      VL2a VL2b
bY87F bK42Q, bA43S, bY87F
VH2a bS49G, bR71V, bL78A, bK94R x x
VH2b bG44S, bS49G, bR71V, bL78A, bK94R x x
VH2c bS49G, bR71V, bL78A, bK94R, bQ105H x x
VH2d bS49G, fN60G, fQ61D, fK62S, fF63V, bR71V, bL78A, bK94R x x
回復突變以b 為前綴，前向突變以f 為前綴。
2.2.3 所得人類化CD40抗體之VH及VL域 基於接受體構架1之人類化CD40抗體之所得VH及VL域可見於下表17中，且基於接受體構架2之人類化CD40抗體之所得VH及VL域列於下表18中。 表17：基於接受體構架1之人類化CD40抗體之VH及VL域的胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
VH1a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYW WGQGTTVTVSS 53
VH1b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGKSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYW WGQGTTVTVSS 54
VH1c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQ KFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYW WGHGTTVTVSS 55
VH1d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLSVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYW WGQGTTVTVSS 56
VL1a DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWT FGGGTKVEIK 57
VL1b DIVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWT FGGGTKVEIK 58
VL1c DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWT FGGGTKVEIK 59
VL1d DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWT FGGGTKLEIK 60
表18：基於接受體構架2之人類化CD40抗體之VH及VL域的胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
VH2a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKG RFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTTVTVSS 61
VH2b EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKSLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKG RFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTTVTVSS 62
VH2c EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKG RFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGHGTTVTVSS 63
VH2d EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKG RFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTTVTVSS 64
VH2ab EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYMH WVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKG RFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTTVTVSS 65
VH2ac EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKVKG RFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTTVTVSS 66
VL2a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWT FGGGTKVEIK 67
VL2b DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGQSPKLLIYTVSNRFS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWT FGGGTKVEIK 68
VL2ab DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWT FGGGTKVEIK 69
VL2ac DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWT FGGGTKVEIK 70
2.2.4 呈huIgG1_LALA_PG型式之新人類化CD40抗體 基於VH及VL之新人類化變異體，新CD40抗體以具有效應沉默Fc (P329G；L234、L235A)之huIgG1抗體形式表現，以根據WO 2012/130831 A1中所描述之方法取消與Fcγ受體之結合。 表19：表現為huIgG1_LALA_PG抗體之VH/VL組合之命名法
   VL1a VL1b VL1c VL1d VL2a VL2b VL2ab VL2ac
VH1a P1AE0817 P1AE1001 P1AE0993 P1AE0996            
VH1b P1AE1002 P1AE1003 P1AE1004 P1AE1005            
VH1c P1AE0997 P1AE1006 P1AE0818 P1AE0998            
VH1d P1AE0999 P1AE1007 P1AE1000 P1AE0819            
VH2a             P1AE0400 P1AE0404      
VH2b             P1AE0401 P1AE0405      
VH2c             P1AE0402 P1AE0406      
VH2d             P1AE0403 P1AE0407      
VH2ab                   P1AE 1125 P1AE 1126
VH2ac                   P1AE 1134 P1AE 1135
人類化CD40抗體作為人類IgG1_LALAPG抗體之例示性全長序列可見於表20中。表 20 ： 人類化 CD40 IgG1_LALAPG 抗體之胺基酸序列
抗體 序列 Seq ID No
P1AE0400重鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 71
P1AE0400輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 72
P1AE0403重鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKGRFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 73
P1AE0403輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 74
P1AE0817重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 75
P1AE0817輕鏈 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 76
2.2.5 呈huIgG1_LALA_PG型式之新人類化CD40抗體之製造 藉由用編碼不同肽鏈之表現載體短暫轉染懸浮生長之HEK293-F細胞來表現抗體。在無血清FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen)中，根據細胞供應商說明書，使用Maxiprep (Qiagen, Germany)抗體載體製劑、F17基礎培養基(Invitrogen, USA)、PEIpro (Polyscience Europe GmbH)及1至2百萬活細胞/ml的初始細胞密度來進行轉染成HEK293-F細胞(Invitrogen, USA)。在藉由於14000 g下離心30分鐘而在搖瓶或攪拌醱酵槽中培養7天之後採集細胞培養上清液，且經由0.22 µm過濾器過濾。
利用MabSelectSure-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden)層析，藉由蛋白A親和層析法而自細胞培養上清液中純化雙特異性抗體。簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養上清液，用平衡緩衝液洗滌且用25 mM檸檬酸鹽(pH 3.0)溶離。在用1 M Tris pH 9.0中和之後，在20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)中藉由尺寸排阻層析(Superdex 200, GE Healthcare)將聚集之蛋白質自單體抗體物質分離。合併單體蛋白質溶離份，必要時使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO)離心濃縮器濃縮且儲存在-80℃下。使用樣本等分試樣以供例如藉由CE-SDS、尺寸排阻層析法、質譜分析及內毒素測定進行後續分析表徵。
不同人類化CD40抗體之製造產量在表21中展示為效價值，該等效價值係使用MabSelectSure-SepharoseTM 層析自製備型親和層析之後的產量計算。
藉由CE-SDS分析，在還原劑存在及不存在下分析分子在最終純化步驟之後的純度及分子量。根據製造商說明書使用測徑規LabChip GXII系統(Caliper lifescience)。
在25℃下，在25 mM磷酸鉀、125 mM氯化鈉、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v) NaN3 、pH 6.7操作緩衝液中使用TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析分子聚集物含量。
為了直接比較全部抗體，藉由靜態光散射(SLS)且藉由量測回應於施加之溫度應力的內源蛋白質螢光來監測熱穩定性。將蛋白質濃度為1 mg/ml之30 μg經過濾蛋白質樣本一式兩份地施加至Optim 2儀器(Avacta Analytical Ltd)。溫度以0.1℃/min自25℃勻速升至85℃，收集半徑及總散射強度。在測定內源蛋白質螢光時，樣本在266 nm下激發且收集275 nm與460 nm之間的發射。對於所有抗體，聚集溫度(Tagg)在64℃與69℃之間且提供於下表21或表22中。
具有不同構架之人類化CD40抗體之製造產量展示於下表21或表22中。 表21：基於接受體構架2之人類化CD40抗體之製造效價、人性化及聚集溫度
抗體 VH /VL 效價[μg/ml] 人性化(以%為單位之VH/VL) Tagg
P1AD4470 對照 140 77.6 / 78 68
P1AE0400 VL2a/VH2a 219 77.6 / 78 69
P1AE0401 VL2a/VH2b 162 76.5 / 78 69
P1AE0402 VL2a/VH2c 196 77.6 / 78 69
P1AE0403 VL2a/VH2d 137 80.6 / 78 67
P1AE0404 VL2b/VH2a 165 77.6 / 76 69
P1AE0405 VL2b/VH2b 128 76.5 / 76 69
P1AE0406 VL2b/VH2c 154 77.6 / 76 69
P1AE0407 VL2b/VH2d 102 80.6 / 76 67
表22：基於接受體構架1之人類化CD40抗體之製造效價、人性化及聚集溫度
抗體 VH /VL 效價[μg/ml] 人性化(以%為單位之VH/VL) Tagg
P1AE0816 對照 8.5 84.7 / 84 64
P1AE0817 VH1a/VL1a 62 86.7 / 87 67
P1AE0818 VH1c/VL1c 47 86.7 / 85 66
P1AE0819 VH1d/VL1d 90 85.7 / 85 67
P1AE0993 VH1a/VL1c 34 86.7 / 85 67
P1AE0996 VH1a/VL1d 16 86.7 / 85 67
P1AE0997 VH1c/VL1a 44 86.7 / 87 66
P1AE0998 VH1c/VL1d 24 86.7 / 85 66
P1AE0999 VH1d/VL1a 34 85.7 / 87 67
P1AE1000 VH1d/VL1c 16 85.7 / 85 66
P1AE1001 VH1a/VL1b 34 86.7 / 86 65
P1AE1002 VH1b/VL1a 46 85.7 / 87 67
P1AE1003 VH1b/VL1b 49 85.7 / 86 66
P1AE1004 VH1b/VL1c 60 85.7 / 85 67
P1AE1005 VH1b/VL1d 7 85.7 / 85 65
P1AE1006 VH1c/VL1b 24 86.7 / 86 65
P1AE1007 VH1d/VL1b 34 85.7 / 86 67
2.2.6 重組型人類及食蟹獼猴CD40細胞外域蛋白質之產生
以下構築體經選殖且藉由HEK293細胞中之短暫表現來表現： 1)具有C端His-AviTagTM 標記(SEQ ID NO:266)之人類CD40細胞外域(SEQ ID NO:1之胺基酸21-193，NCBI寄存編號NP_001241) 2)具有C端His-AviTagTM 標記(SEQ ID NO:267)之食蟹獼猴(長尾獼猴(macaca fascicularis)) CD40細胞外域(胺基酸21-193，即食蟹獼猴CD40細胞外域序列，係獲自Roche食蟹獼猴cDNA資料庫，未公開資料)
藉由基因合成(Eurofins Genomics GmbH service, Germany)產生用於結合分析之CD40細胞外域抗原，使用標準選殖程序經由獨特限制位點選殖至羅氏內部表現載體中。藉由定序檢驗所有構築體之選殖。所有抗原均在CMV啟動子之控制下表現。為了短暫表現CD40細胞外域構築體，懸浮調適之HEK293-F細胞(Life Technologies, USA)經各別質體轉染。一般而言，根據製造商說明書，將約2×106 個細胞/ml之1L HEK293-F細胞經藉由PEIpro轉染試劑(Polysciences Europe GmbH, Germany)複合之總計500 μg質體DNA轉染。在轉染之後，培育HEK293-F細胞6天。隨後藉由離心收集細胞且使用0.22 μm真空過濾系統(Millipore)過濾含蛋白質上清液。藉由IMAC親和層析，使用完整-His標記樹脂(Roche Diagnostics)純化His-AviTagTM 標記之蛋白質。在用50 mM Na2 PO4 、300 mM NaCl (pH 8.0)洗滌之後，使用補充有500 mM咪唑(pH 7.0)之洗滌緩衝液溶離His-AviTagTM 融合蛋白。在20 mM Tris、150 mM NaCl pH 7.4中藉由尺寸排阻層析(Superdex 75, GE Healthcare)自單體融合蛋白分離聚集之蛋白質。合併單體蛋白質溶離份，必要時使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (10KD MWCO)離心濃縮器濃縮且儲存在-80℃下。使用樣本等分試樣以供例如藉由CE-SDS、尺寸排阻層析法及質譜分析進行後續分析表徵。
CD40 細胞外域之生物素標記： 根據製造商說明書，藉由使用BirA生物素蛋白連接酶套組(Avidity LLC, USA)進行含有C端AviTagTM 之人類或食蟹獼猴CD40細胞外域構築體的酶促位點特異性生物素標記。簡言之，將1/10體積之BiomixA (10×濃度：0.5M二甘胺酸緩衝液，pH 8.3)及BiomixB (10×濃度：100mM ATP、100mM MgOAc、500μM d-生物素)添加至含有AviTagTM 之蛋白質中，隨後每10 nmol蛋白質添加2.5 µg BirA接合酶。反應混合物在30℃下培育1h且藉由尺寸排阻層析法在Superdex75製備級預填充HiLoad管柱(GE Healthcare, Sweden)上純化。
2.2.7 人類/食蟹獼猴CD40結合表面電漿子共振光譜分析 藉由使用GE Healthcare所供應之胺偶合套組在pH 5.0下於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶合捕捉系統(10 μg/ml山抗人F(ab)'2 ；命令碼：28958325；GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)之約12000個共振單位(RU)。該樣本及系統緩衝液為PBS-T (10 mM磷酸鹽緩衝鹽水，包括0.05% Tween20) pH 7.4。將流槽設定為25℃，且將樣本區塊設定為12℃，且用操作緩衝液預塗佈兩次。藉由以5 µl/min之流量注射50 nM溶液30秒來捕捉抗體。藉由呈1:3稀釋之300 nM為起始物質，以30 µl/min之流量在溶液中注射各種濃度之人類CD40細胞外域或食蟹獼猴CD40細胞外域持續300秒來量測締合。解離階段經監測長達1200秒且藉由自樣本溶液轉換為操作緩衝劑來觸發。以30 µl/min之流動速率，用甘胺酸pH 2.1溶液洗滌60秒使表面再生。藉由減去自羊抗人F(ab')2 表面獲得之反應來校正整體折射率差異。亦減去空白注射(=二次參考)。為計算表觀KD 及其他動力學參數，使用朗格繆爾1:1模型。. 使用BiacoreTM B4000評估軟體(版本1.1)計算表觀Kd。
2.2.8 用於表徵CD40特異性人類化抗體之細胞結合分析 使用胰蛋白酶自培養瓶分離CD40陽性細胞(Raji細胞)且使用Casy細胞計數器計數。在4℃下粒化之後，使細胞再懸浮於FACS緩衝液(含2.5% FCS之PBS)中，調節至2.0E+06個細胞/mL，且分配至96孔PP V形底盤(25 µL/孔 = 5.0E+04Zellen/孔)。
在FACS緩衝液中將CD40特異性抗體調節至20 µg/mL，產生10 µg/mL之最終濃度。將20µl添加至25µl細胞懸浮液中且在4℃下培育1h。隨後在FACS緩衝液中洗滌細胞兩次。在洗滌之後，使細胞再懸浮於50 µL含有二級抗體(＜huIgG＞-Alexa488, c=10 µg/mL)之FACS緩衝液中且在大約4℃培育1h。接著將細胞在FACS緩衝液中洗滌兩次且再懸浮於70 µl/孔FACS緩衝液中以使用FACS Canto (BD, Pharmingen)進行量測。
在表23中，展示人類化CD40抗體之親和力(藉由Biacore量測)及與CD40表現細胞(Raji細胞)之細胞結合。 表23：人類化CD40抗體對CD40表現細胞的親和力及細胞結合
ID VH /VL 親和力[nM] Ka (1/Ms) Kd (1/s) EC50 [µg/ml]細胞結合(Raji)
P1AD4470 對照 4.6 1.69E+06 7.81E-03 0.09
P1AE0400 VL2a/VH2a 4.2 1.68E+06 6.99E-03 0.12
P1AE0401 VL2a/VH2b 4.6 1.69E+06 7.87E-03 0.13
P1AE0402 VL2a/VH2c 4.2 1.67E+06 7.09E-03 0.13
P1AE0403 VL2a/VH2d 29 1.40E+06 4.07E-02 0.12
P1AE0404 VL2b/VH2a 4.2 1.63E+06 6.93E-03 0.11
P1AE0405 VL2b/VH2b 5.1 1.61E+06 8.14E-03 0.09
P1AE0406 VL2b/VH2c 4.2 1.67E+06 7.09E-03 0.09
P1AE0407 VL2b/VH2d 30 1.19E+06 3.55E-02 0.12
P1AE0816 對照 8.7 2.53E+06 2.19E-02 0.09
P1AE0817 VH1a/VL1a 2.5 2.40E+06 5.93E-03 0.09
P1AE0818 VH1c/VL1c 3.2 2.63E+06 8.47E-03 0.14
P1AE0819 VH1d/VL1d 3.4 2.59E+06 8.77E-03 0.11
P1AE0993 VH1a/VL1c 3.4 2.68E+06 8.98E-03 0.13
P1AE0996 VH1a/VL1d 3.5 2.59E+06 9.08E-03 0.12
P1AE0997 VH1c/VL1a 2.3 2.59E+06 6.03E-03 0.12
P1AE0998 VH1c/VL1d 3.3 2.70E+06 8.96E-03 0.12
P1AE0999 VH1d/VL1a 2.4 2.45E+06 5.92E-03 0.15
P1AE1000 VH1d/VL1c 3.2 2.68E+06 8.62E-03 0.14
P1AE1001 VH1a/VL1b 2.7 2.56E+06 6.81E-03 0.08
P1AE1002 VH1b/VL1a 2.2 2.54E+06 5.57E-03 0.13
P1AE1003 VH1b/VL1b 2.5 2.46E+06 6.06E-03 0.13
P1AE1004 VH1b/VL1c 3 2.63E+06 7.95E-03 0.14
P1AE1005 VH1b/VL1d 3.2 2.58E+06 8.16E-03 0.11
P1AE1006 VH1c/VL1b 2.6 2.53E+06 6.51E-03 0.14
P1AE1007 VH1d/VL1b 2.7 2.50E+06 6.62E-03 0.12
2.2.9 藉由UHR-ESI-QTOF質譜分析表徵抗體 藉由HPLC在葡聚糖凝膠G25 5×250 mm管柱(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)上使用40%乙腈以及2%甲酸(v/v)將樣本去鹽。藉由在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion, Ithaca, NY)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik, Bremen, Germany)上之UHR-ESI-QTOF MS測定總質量。以900至4000 m/z (ISCID：0.0 eV)進行資料獲取。使用內部開發之軟體工具評估原始質譜且將其轉化成個別相對莫耳質量。
2.2.10 抗體之熱穩定性評估 在20 mM組胺酸/組胺酸氯、140 mM NaCl (pH 6.0)中製備濃度為1 mg/mL之樣本，經由0.4 µm過濾盤藉由離心轉移至光學384孔培養盤中且用石蠟油覆蓋。藉由動態光散射在DynaPro盤式讀取器(Wyatt)上重複量測流體動力學半徑，同時以0.05℃/min之速率將樣本自25℃加熱至80℃。或者，將樣本轉移至10 µL微光析槽陣列中，且用Optim1000儀器(Avacta Inc.)記錄靜態光散射資料以及在266 nm雷射下激發後之螢光資料，同時以0.1℃/min之速率將樣本自25℃加熱至90℃。聚集起始溫度經定義為流體動力學半徑(DLS)或散射光強度(Optim1000)開始增加之溫度。解鏈溫度經定義為展示螢光強度對波長之圖中的拐點。
實例3 呈3+1型式之靶向CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子之產生及製造
3.1 靶向CD40及纖維母細胞活化蛋白(FAP)之雙特異性抗原結合分子之產生 如下製備呈3+1型式之雙特異性CD40-FAP抗體：第一重鏈包含結合至CD40之兩個Fab片段之兩個VH-CH1片段，該兩個VH-CH1片段連接至Fc域之N端。第二重鏈包含：結合至CD40之第三Fab片段之VH-CH1片段，其連接至Fc域之N端；及結合至FAP之交叉Fab片段之VH-Cκ或VL-CH1片段，其連接至Fc域之C端。分子進一步包含結合至CD40之三個輕鏈及以交叉型式結合至FAP之另一輕鏈(圖 1C 及 1D )。為了比較，雙特異性CD40-FAP抗體係以由兩個CD40結合部分與一個FAP結合部分在Fc之C端處組合組成之2+1型式(圖 1A 及圖 1B )或以由四個CD40結合部分與一個FAP結合部分在Fc之C端處組合組成之4+1型式(圖 1E 及圖 1F )製備。雙特異性CD40-FAP抗體包括新抗FAP純系212 (圖1A、圖1C及圖1E)或FAP純系4B9 (圖1B、圖1D及圖1F)。FAP結合子28H1及4B9之產生及製備已描述於WO 2012/020006 A2中，其以引用之方式併入本文中。為產生3+1、4+1及2+1分子，使用杵-臼技術達成雜二聚化。S354C/T366W突變經引入第一重鏈HC1 (Fc杵重鏈)中且Y349C/T366S/L368A/Y407V突變經引入第二重鏈HC2 (Fc臼重鏈)中。獨立於雙特異性形式，在所有情況下，根據WO 2012/130831 A1中所描述之方法，使用效應沉默Fc (P329G；L234、234A)取消與Fcγ受體之結合。雙特異性分子之序列展示於表 24 中。
所有基因在嵌合MPSV啟動子控制下短暫表現，該啟動子由MPSV核心啟動子與CMV啟動子強化子片段之組合組成。表現卡匣亦在cDNA之3'端處含有合成polyA信號。表現載體亦含有針對含有EBNA (埃-巴二氏病毒核抗原)之宿主細胞中游離型複製之oriP區。 表24：雙特異性抗原結合分子之胺基酸序列
構築體 序列 Seq ID No
P1AE3377 CD40 (P1AE0817) × FAP (P1AE1689) (3+1) C端交叉單抗融合
(P1AE1689)輕鏈交叉VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTIYNQKFKGRVTMTIDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRFRGIHYAMDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 77
VL1a (CD40)輕鏈(帶電) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 78
VH1a (CD40) (VHCH1帶電) Fc杵_PGLALA_(P1AE1689) (VL-CH1) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGLSFINWFQQKPGQAPRLLIYGTSNRGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNEVPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 79
VH1a (CD40) (VHCH1帶電)_ VH1a (CD40) (VHCH1帶電)_ Fc臼_PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 80
P1AE3378 CD40 (P1AE0817) × FAP (4B9) (3+1) + C端交叉單抗融合
(4B9)輕鏈交叉VL-CH1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGLSFINWFQQKPGQAPRLLIYGTSNRGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNEVPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 81
VL1a (CD40)輕鏈 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 82
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc杵_PGLALA_(4B9) (VH-Cκ) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 83
VH1a (CD40) (VHCH1)_VH1a (CD40) (VHCH1)_Fc臼_PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 84
P1AE2423 CD40 (P1AE0817) × FAP (P1AE1689) (2+1)  C端交叉單抗融合
(P1AE1689)輕鏈交叉VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTIYNQKFKGRVTMTIDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRFRGIHYAMDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 77
VL1a (CD40)輕鏈(帶電) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 78
VH1a (CD40) (VHCH1帶電) Fc杵_PGLALA_(P1AE1689) (VL-CH1) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGLSFINWFQQKPGQAPRLLIYGTSNRGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNEVPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 79
VH1a (CD40) (VHCH1帶電) Fc臼_PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 85
P1AE2424 CD40 (P1AE0817) × FAP (P1AE1689) (4+1)  + C端交叉單抗融合
(P1AE1689)輕鏈交叉VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDIYPNTGGTIYNQKFKGRVTMTIDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRFRGIHYAMDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 77
VL1a (CD40)輕鏈(帶電) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 78
VH1a (CD40) (VHCH1帶電_VH1a (CD40) (VHCH1帶電)-Fc杵_PGLALA_(P1AE1689) (VL-CH1) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGLSFINWFQQKPGQAPRLLIYGTSNRGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNEVPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 86
VH1a (CD40) (VHCH1帶電)_VH1a (CD40) (VHCH1帶電)-Fc臼_PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 80
P1AE2487 CD40 (P1AE0817) × FAP (4B9) (2+1)  C端交叉單抗融合
4B9輕鏈交叉 VL-CH1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 81
VL1a (CD40)輕鏈 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 82
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc杵_PGLALA_4B9 (VH-Cκ) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 87
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc臼_PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 88
P1AE2895 CD40 (P1AE0817) × FAP (4B9) (4+1)  C端交叉單抗融合
4B9輕鏈交叉VL-CH1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 81
VL1a (CD40)輕鏈 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 82
VH1a (CD40) (VHCH1) _VH1a (CD40) (VHCH1)-Fc杵_PGLALA_(4B9) (VH-Cκ) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 89
VH1a (CD40) (VHCH1)_VH1a (CD40) (VHCH1)-Fc臼_PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 84
3.2 靶向FAP及CD40之雙特異性抗原結合分子之製造
靶向纖維母細胞活化蛋白(FAP)及CD40之雙特異性抗原結合分子係藉由用編碼4種不同肽鏈之表現載體短暫轉染懸浮生長之HEK細胞來表現。在無血清FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen)中，根據細胞供應商說明書，使用Maxiprep (Qiagen)抗體載體製劑、F17培養基(Invitrogen, USA)、Peipro (Polyscience Europe GmbH)及1至2百萬活細胞/ml的初始細胞密度來進行轉染成HEK293-F細胞(Invitroge)。在藉由於14000 g下離心30分鐘而在搖瓶或攪拌醱酵槽中培養7天之後採集細胞培養上清液，且經由0.22 µm過濾器過濾。
藉由親和層析，使用MabSelectSure-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden)層析自細胞培養上清液純化抗體。簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養上清液，用平衡緩衝液洗滌且用25 mM檸檬酸鹽(pH 3.0)溶離，隨後用1 M Tris (pH 9.0)中和。取決於在蛋白質A純化後得到的產品品質，包括使用丁基瓊脂糖凝膠4FF (GE Healthcare, Sweden)樹脂之疏水相互作用層析(HIC)純化步驟。在HIC純化之前，相對於HIC平衡緩衝液透析蛋白質。使用40 mM乙酸鹽、1.5 M硫酸銨(pH 5.5)作為平衡/洗滌緩衝液及40 mM乙酸鹽(pH 5.5)作為溶離緩衝液進行HIC純化且應用線性梯度進行純化。隨後，在20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)中藉由尺寸排阻層析(Superdex 200, GE Healthcare)自單體抗體物質分離聚集之蛋白質。合併單體蛋白質溶離份，必要時使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO)離心濃縮器濃縮且儲存在-80℃下。使用樣本等分試樣以供例如藉由CE-SDS、尺寸排阻層析法、質譜分析及內毒素測定進行後續分析表徵。所製備之雙特異性抗體之製造產量及品質展示於下表25中。 表25：雙特異性CD40-FAP抗原結合分子之製造產量
樣本 在來自短暫HEK 表現之ProtA 捕捉步驟之後的產量 ProtA 之後藉由 SEC 所得之單體 % ProtA 之後藉由CE-SDS 所得之產物峰值% 製備型HIC 及製備型SEC 後之產量[mg/L] 製備型HIC 及製備型SEC 之 後藉由SEC 得到之 單體%
P1AE3377 5.3 mg/0.3 l 90 ＞95 3.3 ＞95
P1AE3378 3.0 mg/0.3 l 80 75 1.8 ＞95
P1AE2423 16.5 mg/0.9 l 92 ＞95 11.25 ＞95
P1AE2424 10.4mg/0.9 l 93 ＞95 6.4 ＞95
P1AE2487 14 mg/0.9 l 93 82 4.8 ＞95
P1AE2895 14.4 mg/ 0.9 l 94 91 4.1 ＞95
實例4 靶向CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子的表徵
4.1 結合於表現人類FAP之鼠類纖維母細胞 使用表現人類纖維母細胞活化蛋白(huFAP)之NIH/3T3-huFAP純系19測試與細胞表面FAP之結合。藉由用表現載體pETR4921轉染小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3細胞株(ATCC CRL-1658)以在1.5 μg/mL嘌呤黴素選擇hFAP下表現來產生NIH/3T3-huFAP純系19。
使用補充有10%胎牛血清(FBS) (life technologies, 目錄號16140，批號1797306A)之1×達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM) (gibco, 目錄號42430-025)培養NIH/3T3-huFAP細胞。將1.5 µg/mL嘌呤黴素(gibco, 目錄號A11138-03)添加至用於選擇FAP表現細胞的培養基中。藉由使用無酶細胞解離緩衝液(gibco, 目錄號13151014)自培養燒瓶移除NIH/3T3-hFAP細胞。將0.3×105 個NIH/3T3-hFAP純系19細胞添加於具有10% FBS之200 µl 1×DMEM中，到達圓底96孔培養盤之各孔中(greiner bio-one, cellstar, 目錄號650185)。在1700 rpm下將培養盤離心5分鐘且拂去上清液。用200 µL 4℃低溫FACS緩衝液(eBioscience, 目錄號00-4222-26)洗滌細胞一次。將所有樣本以指定濃度範圍(一式兩份)再懸浮於50 µL/孔的含有雙特異性抗原結合分子(初級抗體)或同型對照抗體DP47之4℃低溫FACS緩衝液中且在4℃下培育120分鐘。然後用200 µL 4℃低溫FACS緩衝液洗滌細胞三次。將細胞用25 µL/孔的含有R-藻紅素(PE)結合之AffiniPure F(ab')2 片段羊抗人IgG、Fcγ片段特異性(Jackson ImmunoResearch, 目錄號109-116-098)二級抗體的4℃低溫二級抗體溶液(二級抗體之1:50稀釋)進一步染色且在4℃下在暗處培育60分鐘。將細胞用200 µl FACS緩衝液洗滌且再懸浮於85 µL/孔的含有0.2 μg/mL DAPI (Roche,目錄號10236276001)之FACS緩衝液中，且使用5-雷射LSR-Fortessa (具有DIVA軟體之BD Bioscience)在同一天採集。使用FlowJo版本10軟體(FlowJo LLC)進行資料分析。
如圖 4 中所示，對FAP為單價之雙特異性抗體結合於表現人類FAP之目標細胞。因此，經FAP靶向之抗CD40抗原結合分子展示直接腫瘤靶向特性。C端FAP (212)或FAP (4B9)結合子與四價、三價及二價抗CD40構築體之人類FAP的結合親和力係相當的。觀測到2+1型式與FAP (4B9)結合部分(P1AE2487)的最強FAP結合。未偵測到同型對照抗體DP47與NIH/3T3-hFAP細胞之結合。如針對不同雙特異性抗體所量測之EC50 值展示於下表26中。表 26 ： 呈不同雙特異性抗體型式之 212 及 4B9 的人類 FAP 結合表徵
分子 EC50 [nM]
P1AE2423 CD40 × FAP (212) 2+1交叉單抗 5.19
P1AE2487 CD40 × FAP (4B9) 2+1交叉單抗 3.70
P1AE3377 CD40 × FAP (212) 3+1交叉單抗 4.94
P1AE3378 CD40 × FAP (4B9) 3+1交叉單抗 5.53
P1AE2424 CD40 × FAP (212) 4+1交叉單抗 7.52
P1AE2895 CD40 × FAP (4B9) 4+1交叉單抗 5.27
4.2 與表現人類CD40之初級B細胞之結合 使用自末梢血液單核細胞(PBMC)分離之人類初級B細胞來測試與細胞表面CD40之結合。為了分離PBMC，自Stiftung Zürcher Blutspendedienst SRK獲得白血球層。在相同體積之PBS (gibco, 目錄號10010023)中稀釋50 mL白血球層。向50 mL聚丙烯離心管(TPP，目錄號91050)供應15 mL LymphoprepTM (STEMCELL Technologies，目錄號07851)及25 mL白血球層/PBS溶液，每個試管小心層疊於LymphorepTM 上方。在低加速度及無斷裂情況下，使試管於室溫在2000 rpm下離心24分鐘。然後，自界面收集PBMC，用PBS洗滌三次，再懸浮於10 mL PBS中且用Beckman Coulter細胞計數器Ac·T™ 5diff OV (Beckman Coulter，目錄號6605580)分析細胞之細胞類型及數目。在自PBMC分離B細胞之前，藉由利用CD14微珠(Miltenyi，目錄號130-050-201)磁性標記CD14陽性細胞及利用autoMACS® Pro分離器(Miltenyi，目錄號130-092-545)進行後續分離來移除CD14陽性溶離份。CD14陰性溶離份係用於利用Miltenyi B細胞分離套組II (目錄號130-091-151)及autoMACS® 分離進行之後續B細胞分離。在由洛斯維帕克紀念研究所培養基(Roswell Park Memorial Institute medium; RPMI) 1640 (gibco, 目錄號31870-025)組成之200 µl R10培養基中將0.3×105 個B細胞添加至圓底96孔培養盤(greiner bio-one, cellstar, 目錄號650185)之各孔中，該RPMI 1640經供應有10 % (v/v) FBS、1 % (v/v)青黴素鏈黴素(gibco, 目錄號15070-063)、1 % (v/v) L-麩醯胺酸(gibco, 目錄號25030-024)、1 % (v/v)丙酮酸鈉(gibco, 目錄號11360-039)、1 % (v/v) MEM非必需氨基酸(gibco, 目錄號11140-035)及50 µM β-巰基乙醇(gibco, 目錄號31350-010)。在1700 rpm下將培養盤離心5分鐘且拂去上清液。用200 µL 4℃低溫FACS緩衝液(eBioscience, 目錄號00-4222-26)洗滌細胞一次。將所有樣本以指定濃度範圍(一式兩份)再懸浮於50 µL/孔的含有雙特異性抗原結合分子(初級抗體)或同型對照抗體DP47之4℃低溫FACS緩衝液中且在4℃下培育120分鐘。然後用200 µL 4℃低溫FACS緩衝液洗滌細胞三次。將細胞用25 µL/孔的含有R-藻紅素(PE)結合之AffiniPure F(ab')2 片段羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性(Jackson ImmunoResearch, 目錄號109-116-098)二級抗體的4℃低溫二級抗體溶液(二級抗體之1:50稀釋)進一步染色且在4℃下在暗處培育60分鐘。將細胞用200 µl FACS緩衝液洗滌且再懸浮於85 µL/孔的含有0.2 μg/mL DAPI (Roche, 目錄號10236276001)之FACS緩衝液中，且使用5-雷射LSR-Fortessa (具有DIVA軟體之BD Bioscience)在同一天採集。使用FlowJo版本10軟體(FlowJo LLC)進行資料分析。
如圖 5 中所示，所有所描繪之純系均結合至CD40，但其與CD40陽性B細胞之結合強度(EC50 值以及信號強度)不同。與其FAP結合部分無關，相較於藉由每抗體佔據較多CD40結合位點及相對於二價CD40型式之四價親合力增益解釋的四價抗CD40抗體，二價抗CD40抗體展示較高EC50 水平且達到較高結合平穩程度。三價抗CD40抗體相較於二價抗CD40抗體達到較低結合平穩程度，但相較於四價抗CD40抗體達到較高結合平穩程度。未偵測到陰性對照抗體與B細胞之結合。如針對不同雙特異性抗體所量測之EC50 值展示於下表27中。表 27 ： 呈不同雙特異性抗體型式之 CD40 抗體之人類 CD40 結合表徵
分子 EC50 [nM]
P1AD4470 CD40 IgG1 0.333
P1AE2423 CD40 x FAP (212) 2+1交叉單抗 0.095
P1AE2487 CD40 x FAP (4B9) 2+1交叉單抗 0.086
P1AE3377 CD40 x FAP (212) 3+1交叉單抗 0.038
P1AE3378 CD40 x FAP (4B9) 3+1交叉單抗 0.085
P1AE2424 CD40 x FAP (212) 4+1交叉單抗 0.036
P1AE2895 CD40 x FAP (4B9) 4+1交叉單抗 0.049
實例 5 FAP靶向之抗人類CD40結合分子之功能特性
5.1 FAP靶向之抗人類CD40結合分子對人類B細胞進行的CD40介導之活化 CD40之接合誘導B細胞及樹突狀細胞(DC)成熟以及活化且促進此等細胞類型之存活。在CD40信號傳導後，B細胞及DC之表面上之細胞介素產生及協同刺激分子表現增加(S. Quezada等人，Annu Rev Immunol. 2004, 22, 307-328；S. Danese等人，Gut. 2004, 53, 1035-1043；G. Bishop等人，Adv Exp Med Biol. 2007, 597, 131-151)。
為了測試不同FAP依賴性抗CD40抗體之促效特性及FAP特異性，在經FAP塗佈之珠粒存在下將獲自人類白血球層之道迪細胞或初級B細胞與FAP依賴性促效抗人類CD40抗體一起培育且藉由FACS量測B細胞活化。
5.1.1. 藉由FAP靶向之抗人類CD40結合分子使用經FAP塗佈之Dynabeads® 作為抗原來源來活化人類道迪細胞 將1×105 個道迪細胞(一種具有高表現量之人類CD40 (ATCC CCL-213)的人類B淋巴母細胞細胞株)添加於100 µl的1×達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM) ((gibco, 目錄號42430-025)，其補充有96孔平底培養盤每孔10%胎牛血清(FBS) (life technologies, 目錄號16140，批號1797306A)。將抗生蛋白鏈菌素Dynabeads® (ThermoFisher Scientific, 目錄號11205D)根據製造商說明書用經生物素標記之人類FAP (內部產生) (6.5×104 個珠粒之結合能力: 0.01 µg蛋白質)塗佈且在具有10% FBS之50 µl 1×DMEM中以2: 1之珠粒與細胞比率添加至道迪細胞中。作為對照，將未經塗佈之珠粒添加至道迪細胞。在具有10% FBS培養基之50 µl 1×DMEM中將FAP靶向之抗人類CD40抗體添加至濃度在6.7 nM至0.003 nM範圍內之道迪細胞(3×稀釋系列)。作為陽性對照，使用FAP非依賴性促效抗人類CD40抗體SGN-40 (IgG1，INN：達西珠單抗)。對於CD40，抗體為二價的。因為文獻中描述SGN-40抗體需要Fc受體交聯以得到生物活性(C. Law等人，Cancer Res 2005, 65, 8331-8338)，故將抗體與交聯羊抗人IgG Fcγ片段特異性F(ab')2 片段(Jackson ImmunoResearch, 目錄號109-006-008)一起培育30分鐘，隨後將該抗體添加至道迪細胞中。在48小時之後，將細胞轉移至96孔圓底培養板中，用PBS洗滌一次且與50 µl的3 µg/mL Fc受體阻斷小鼠IgG同型對照(ThermoFisher Scientific，目錄號10400C)/PBS一起培育。在4℃下培育15分鐘之後，用PBS洗滌細胞且將50 µl經螢光標記之抗體於PBS中之混合物添加至細胞。使用以下經螢光標記之抗體：抗人類CD83 BV421 (Biolegend, 純系HB15e，目錄號305324)、抗人類CD80 BV605 (BD Biosciences, 純系L307.4，目錄號563315)、抗HLA-ABC FITC (BD Biosciences, 純系G46-2.6，目錄號555552)、抗人類CD14 PerCP-Cy5.5 (Biolegend, 純系HCD14，目錄號325622)、抗人類CD3 PerCP-Cy5.5 (Biolegend, 純系UCHT1，目錄號300430)、抗人類CD70 PE (Biolegend, 純系113-16，目錄號355104)、抗人類CD86 PE-CF594 (BD Biosciences, 純系FUN-1，目錄號562390)、抗HLA-DR APC (BD Biosciences, 純系G46-6，目錄號559866)及抗人類CD19 APC-H7 (BD Biosciences, 純系SJ25C1，目錄號560177)。為了區分活細胞與死亡細胞，將存活染料Zombie AquaTM (Biolegend，目錄號423102)添加至抗體混合物。在4℃下培育30分鐘後，用PBS洗滌兩次細胞且再懸浮於200 µl PBS中。同一天使用5-雷射LSR-Fortessa (具有DIVA軟體之BD Bioscience)分析細胞。使用FlowJo版本10軟體(FlowJo LLC)進行資料分析。分析對CD14及CD3陰性及對CD19陽性之活(溶液陰性)細胞之CD70、CD80、CD83及CD86表現。
在與促效抗CD40抗體一起培育2天之後分析之道迪細胞展示所有所描繪之抗體之CD70表現增加(參見圖 6A 及圖 6B )。在不同FAP靶向抗體之情況下，此活化標記物之上調視FAP而定。與FAP結合部分無關，相較於由呈3+1或4+1型式的雙特異性FAP-CD40抗體誘導之上調，由呈2+1型式的雙特異性FAP-CD40抗體進行之CD70上調較高。在不存在FAP (未塗佈珠粒)的情況下，在所描繪之雙特異性抗體對CD40為二價的情況下，未觀測到CD70增加，而三價及四價CD40結合分子誘導CD70上調，但相比在FAP存在下誘導程度較低，表明在道迪細胞中存在三價及四價CD40結合子之低但可偵測到之FAP非依賴性CD40活化。
5.1.2 使用FAP塗佈之Dynabeads® 作為抗原來源，藉由FAP靶向之抗人類CD40結合分子對人類B細胞的活化 自如部分0中所描述之白血球層分離B細胞且96孔平底培養盤每孔添加100 µl R10培養基中之1×105 個B細胞。將抗生蛋白鏈菌素Dynabeads® (ThermoFisher Scientific, 目錄號：11205D)根據製造商說明書用經生物素標記之人類FAP (內部產生) (6.5×104 個珠粒之結合能力: 0.01 µg蛋白質)塗佈且在50 µl R10培養基中以2:1之珠粒與細胞比率添加至B細胞中。作為對照，將未經塗佈之珠粒添加至B細胞。在50 µl R10培養基中添加FAP靶向之抗人類CD40抗體(部分0中所描述)至B細胞。在2天之後，在實例5.1.1中指定之染色及分析程序之後，藉由FACS分析B細胞。
在與促效抗CD40抗體一起培育2天之後分析的B細胞展示所有所描繪之抗體的CD86表現增加(參見圖 7A 及圖 7B )。CD86之上調視不同FAP靶向抗體之FAP而定。由不同的所描繪抗體誘導的最大CD86表現量為相當的。與具有FAP (212)或FAP (4B9)結合部分之2+1型式相比，在較低抗體濃度下，3+1型式及4+1型式(無關於其FAP結合部分)誘導略微較高的B細胞活化。
5.2. FAP靶向之抗CD40結合分子對DC之CD40介導之活化及隨後對T細胞的激活 為了展現藉由FAP依賴性抗人類CD40抗體活化之DC有效激活T細胞之能力，建立活體外T細胞激活分析。對於此等分析，分離來自表現人類CD40受體之轉殖基因小鼠(huCD40tg小鼠；具有類似人類及鼠類CD40受體表現模式之小鼠；C57BL/6背景；由Taconic產生)之脾臟的DC，用SIINFEKL肽或用卵白蛋白(OVA；DEC-205受體介導之抗原攝入)脈衝且與不同的促效抗人類CD40抗體一起培育。經由FAP塗佈之Dynabeads®提供FAP，以展示雙特異性抗原結合分子之FAP依賴性。24小時後，自OT1小鼠之脾臟分離CD8陽性T細胞（此等小鼠之CD8陽性T細胞在H2-Kb之情形中均具有識別SIINFEKL之轉殖基因TCR；C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/Crl, Charles River)、經羧基螢光素丁二醯亞胺基酯(CFSE)標記且添加至脈衝DC中。在實驗第4天，藉由FACS分析T細胞增殖。
5.2.1. 經由藉由FAP靶向之抗CD40結合分子活化之OVA脈衝DC進行T細胞激活 自huCD40tg小鼠之脾臟分離DC。為了分離脾DC，將huCD40tg小鼠的脾放入6孔培養盤之一個孔中，該培養盤含有具有鈣2+ (gibco, 目錄號14025-05)之2.25 mL漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)、250 µl 10 mg/mL膠原蛋白酶D溶液(最終濃度1 mg/mL) (Sigma-Aldrich, 目錄號11088866001)及12.5 µl 10 mg/mL脫氧核糖核酸酶溶液(最終濃度0.05 mg/mL) (Sigma-Aldrich, D5025-150KU, 批號SLBR0535V)。使用具有21G針頭(Braun, 目錄號4657527)之3 mL注射器(BD，目錄號309658)使脾臟膨脹，且隨後藉助於剪刀將其撕裂成小塊。在37℃下培育25分鐘之後，添加50 µL 0.5 M乙二胺四乙酸(EDTA) (Applichem, 目錄號A4892.1000)，隨後在37℃下進行第二培育步驟五分鐘。將含有脾細胞及小塊脾組織之溶液經由40 µm過濾器(Corning, 目錄號352340)過濾至50 mL聚丙烯離心管中。經由過濾器使用3 mL注射器塞子末端粉碎剩餘脾組織塊。在下一步驟中，在室溫下以1500 rpm將50 mL試管離心5分鐘，丟棄上清液且將1 mL 1×細胞溶解緩衝液(用蒸餾水1:10稀釋) (BD，目錄號555899)添加至脾細胞以便溶解紅血球。在室溫下培育四分鐘之後，添加20 mL R10，接著進行在室溫下以1500 rpm離心5分鐘的步驟。移除上清液，將脾細胞再懸浮於30 mL R10中且藉由自動化EVE細胞計數器(VWR, 目錄號734-2675)測定細胞數目以及成活力。根據製造商說明書使用小鼠CD11c超純微珠粒(Miltenyi, 目錄號130-108-338)以藉由autoMACS® 分離DC。隨後，將0.25×105 個DC以96孔平底培養盤每孔接種於50 µl R10中。
DC隨後用1 ng/ml SIINFEKL (卵白蛋白殘基257-264，Eurogentec, 目錄號AS-60193-5, 批號1360618)脈衝，作為陽性對照其不需要DC攝入及處理，抑或裝載有作為抗原之OVA蛋白。為了促進以鐸樣受體(TLR)刺激非依賴性方式之OVA攝入(額外TLR刺激可能導致DC之高總體活化，使得由於用促效性抗CD40抗體刺激而偵測到不同活化狀態不可能)，根據製造商的方案使用OVA抗原遞送試劑(Miltenyi, 目錄號130-094-663)與經生物素標記之抗小鼠DEC205抗體(Miltenyi, 純系NLDC-145, 目錄號130-101-854)之組合。簡言之，將DC與結合於DEC205受體之經生物素標記之抗體一起培育，該受體在CD8陽性交叉呈現DC上高度表現(M. Lahoud等人，Int Immunol. 2000, 12(5), 731-735)。然後，將OVA遞送試劑(偶合至FITC及OVA之抗生物素抗體)添加至細胞中，引起OVA之DEC205受體介導之攝入。為了提供陰性對照，DC僅在不添加OVA的情況下用抗DEC205抗體標記。另外，在50 µL R10中以2:1之珠粒與細胞比率將人類FAP塗佈或未經塗佈之Dynabeads® 添加至DC中，如部分0中所描述。在下一步驟中，在50 µL R10中添加濃度在6.7 nM至0.01 nM範圍內的不同促效性抗CD40抗體(10×稀釋系列)。在此實驗配置中，比較含有一個212或4B9 FAP結合位點之雙特異性2+1、3+1及4+1抗人類CD40抗體與交聯SGN40。
次日，分離來自OT1小鼠之脾CD8-陽性細胞。為如此做，經由40 µm過濾器，使用3 mL注射器塞子之末端將OT1小鼠之脾粉碎至50 mL試管中。用R10洗滌過濾器且在室溫下以1500 rpm離心脾細胞5分鐘。將1 mL 1×細胞溶解緩衝液(用蒸餾水1:10稀釋)添加至細胞中且在室溫下培育四分鐘之後，添加20 mL R10。在室溫下以1500 rpm離心試管5分鐘且棄去上清液。將脾細胞再懸浮於30 mL R10中且藉由自動化EVE細胞計數器測定細胞計數以及成活力。根據製造商說明書，使用小鼠CD8a+ T細胞分離套組(Miltenyi, 目錄號130-104-075)及autoMACS® 分離在陰性選擇過程中分離CD8-陽性細胞。隨後用預溫熱之PBS洗滌在分離之後在陰性部分中發現之CD8陽性細胞，用EVE細胞計數器計數，且在預溫熱之PBS中將細胞數目調節至2×107 個細胞/mL。將10 mM CFSE溶液(CellTrace™ CFSE細胞增殖套組, ThermoFisher, 目錄號C34554)在預溫熱之PBS中稀釋5000倍且以1:1比率(CFSE最終濃度1 µM)添加至再懸浮於PBS中之細胞。在短渦旋之後，在室溫下培育細胞五分鐘。藉由向細胞中添加40 mL預溫熱之R10培養基來停止標記反應。在用PBS進行兩個洗滌步驟之後，使CD8陽性細胞再懸浮於R10中且將0.5×105 個細胞添加於100 µl R10至經脈衝DC。在實驗之第四天，藉由流式細胞測量術分析T細胞增殖。因此，將細胞自96孔平底培養盤轉移至96孔圓底培養盤中，用PBS洗滌一次且與50 µl含3 µg/mL的阻斷小鼠IgG同型對照之Fc受體之PBS一起培育。在4℃下培育15分鐘之後，用PBS洗滌細胞且將50 µl經螢光標記之抗體於PBS中之混合物添加至細胞。使用以下抗體：抗小鼠CD4 BV421 (Biolegend, 純系GK1.5, 目錄號100438)、抗小鼠CD86 BV785 (Biolegend, 純系GL-1, 目錄號105043)、抗I-A/I-E PerCp-Cy5.5 (Biolegend, 純系M5/114.15.2, 目錄號107626)、抗小鼠CD70 PE (eBioscience, 純系FR70, 目錄號12-0701-82)、抗小鼠CD3 PE-CF594 (BD Biosciences, 純系145-2C11, 目錄號562286)、抗小鼠CD25 PE-Cy7 (eBioscience, 純系PC61.5, 目錄號25-0251-82)、抗小鼠CD11c APC (BD Biosciences, 純系HL3, 目錄號561119)、抗小鼠CD44 Alexa Fluor 700 (BD Biosciences, 純系IM7, 目錄號560567)及抗小鼠CD8 APC-Cy7 (Biolegend, 純系53-6.7, 目錄號100714)。為了區分活細胞與死亡細胞，將存活染料Zombie AquaTM 添加至抗體混合物。在4℃下將細胞與50 µl染色抗體混合物一起培育30分鐘。隨後，用PBS洗滌細胞兩次，再懸浮於200 µl PBS中且使用5-雷射LSR-Fortessa分析。使用FlowJo版本10軟體進行資料分析。針對CFSE信號以及CD25及CD44表現分析活的CD3及CD8陽性細胞。
圖 8A 及圖 8B 展示DC與OVA傳遞試劑一起培育且用靶向人類CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子刺激高度增強CD8陽性OT1 T細胞增殖。此等效應為FAP依賴性的。所描繪之FAP依賴性抗體誘導之T細胞增殖增加與交聯CD40抗體(P1AD4470)誘導之增加相比略微較低。經具有一個FAP (212)或FAP (4B9)結合部分之2+1、3+1或4+1雙特異性抗CD40抗體刺激之DC誘導的增殖水平相當。
圖 1A 至圖 1F 展示特異性結合於人類CD40及FAP之雙特異性抗原結合分子的示意性表示。圖 1A 展示呈由兩個CD40結合部分與一個FAP (212)結合部分組合作為互換型fab片段組成之2+1型式的雙特異性FAP-CD40抗體之示意性表示，其中VL-CH1鏈在Fc杵鏈之C端融合(對於CD40為二價且對於FAP為單價)。圖 1B 展示呈由兩個CD40結合部分與一個FAP (4B9)結合部分組合作為互換型fab片段組成之2+1型式的雙特異性FAP-CD40抗體之示意性表示，其中VH-Cκ鏈在Fc杵鏈之C端融合(對於CD40為二價且對於FAP為單價)。圖 1C 展示呈由三個CD40結合部分與一個FAP (212)結合部分組合作為互換型fab片段組成之3+1型式的雙特異性FAP-CD40抗體之示意性表示，其中VL-CH1鏈在Fc杵鏈之C端融合(對於CD40為三價且對於FAP為單價)。圖 1D 展示呈由三個CD40結合部分與一個FAP (4B9)結合部分組合作為互換型fab片段組成之3+1型式的雙特異性FAP-CD40抗體之示意性表示，其中VH-Cκ鏈在Fc杵鏈之C端融合(對於CD40為三價且對於FAP為單價)。圖 1E 展示呈由四個CD40結合部分與一個FAP (212)結合部分組合作為互換型fab片段組成之4+1型式的雙特異性FAP-CD40抗體之示意性表示，其中VL-CH1鏈在Fc杵鏈之C端融合(對於CD40為四價且對於FAP為單價)。圖 1F 展示呈由四個CD40結合部分與一個FAP (4B9)結合部分組合作為互換型fab片段組成之4+1型式的雙特異性FAP-CD40抗體之示意性表示，其中VH-Cκ鏈在Fc杵鏈之C端融合(對於CD40為四價且對於FAP為單價)。
圖 2A 及圖 2B 展示免疫接種衍生之FAP純系與FAP純系4B9及28H1競爭同經轉染HEK細胞上表現之人類FAP進行細胞結合。圖 2A 展示所有測試的源自融合瘤之鼠類純系(命名為209、210、211、212、213、214、215、216、217及218)不與抗FAP抗體4B9競爭結合且圖 2B 展示相同純系不與抗FAP抗體28H1競爭結合。藉由流式細胞測量術量測MFI。x-軸展示FAP抗體之濃度。
圖 3A 及圖 3B 展示抗體構築體之示意性表示，該等抗體構築體經製得以判定抗FAP純系之結合特性是否在其C端融合至Fc域時不損失。圖 3A 展示包含Fc杵鏈及Fc臼鏈之構築體，其中VH域融合至Fc杵鏈之C端且VL域融合至Fc臼鏈之C端(C項VH/VL融合)。圖 3B 展示包含Fc杵鏈及Fc臼鏈之構築體，其中完整Fab與其VH域融合至Fc杵鏈之C端(C-術語Fab融合)。圖 3C 展示抗原決定基分組之設定，其使用基於表面電漿子共振(SPR)之分析在Biacore T200儀器上進行(參見實例1.9)。
圖 4 展示呈FAP (212)或FAP (4B9)靶向單價型式之人類四價、三價或二價抗CD40抗體與人類FAP-陽性NIH/3T3細胞之結合。轉殖基因修飾之小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3-hFAP細胞株表現高含量之人類纖維母細胞活化蛋白(huFAP)。所有所描繪的具有FAP結合部分之抗CD40抗原結合分子有效結合於NIH/3T3-hFAP細胞，但在其與NIH/3T3-huFAP細胞之結合強度(EC50 值以及信號強度)方面稍微變化。將結合展示為藻紅素(PE)標記之抗人類IgG Fcγ特異性山羊IgG F(ab')2片段之螢光強度之中值(MFI)，該片段用作二級偵測抗體。藉由流式細胞測量術量測MFI且藉由減去空白對照之MFI來校正基線。x軸展示抗體構築體之濃度。
圖 5 展示呈FAP(212)或FAP (4B9)靶向單價型式之人類四價、三價或二價抗CD40抗體與具有高表面表現量之人類CD40的初級人類B細胞的結合。所有所描繪之構築體均結合至CD40，但其與CD40-陽性B細胞之結合強度(EC50 值以及信號強度)不同。與四價抗CD40抗體相比，二價抗CD40抗體達到較高結合平穩程度，與其FAP結合部分無關。三價抗CD40抗體之結合平穩程度相比二價抗CD40抗體較低，但與四價抗CD40抗體相比較高。使用FACS分析，用結合於藻紅素(PE)之抗人類IgG Fcγ-特異性山羊IgG F(ab`)2片段偵測抗CD40抗體與細胞表面蛋白質之結合。藉由流式細胞測量術量測MFI且藉由減去空白對照之MFI來校正基線。x軸展示抗體構築體之濃度。
圖 6A 及圖 6B 展示在培育2天後在FAP塗佈之Dynabeads® (圖 6A )或未經塗佈之Dynabeads® (圖 6B )存在下藉由單價FAP (212)或FAP (4B9)靶向之人類四價、三價或二價抗CD40構築體進行的人類道迪細胞之活體外活化。在經FAP塗佈之珠粒情況下，所有經描繪之針對FAP為單價之雙特異性抗體誘導B細胞活化標誌物表現CD70增加。與藉由呈3+1或4+1型式之雙特異性FAP-CD40抗體誘導的上調相比，藉由呈2+1型式之雙特異性FAP-CD40抗體進行之B細胞活化標誌物上調較高，與其FAP結合部分無關。在不存在FAP (未經塗佈之珠粒)的情況下，在所描繪的針對CD40為二價之FAP靶向雙特異性抗體下，未觀測到CD70增加，而三價或四價CD40結合分子誘導CD70上調，但在程度上比在FAP存在下更小。展示在與所指示滴定抗體一起培育2天之後CD70-陽性活道迪細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。
圖 7A 及圖 7B 展示在培育2天後在FAP塗佈之Dynabeads® (圖 7A )或未經塗佈之Dynabeads® (圖 7B )存在下藉由單價FAP (212)或FAP (4B9)靶向之人類四價、三價或二價抗CD40構築體進行的人類B細胞之活體外活化。在經FAP塗佈之珠粒情況下，所有經描繪之針對FAP為單價之雙特異性抗體誘導B細胞活化標誌物表現CD86增加。在較低抗體濃度下，與藉由呈3+1或4+1型式之雙特異性FAP-CD40抗體誘導的上調相比，藉由呈2+1型式之雙特異性FAP-CD40抗體進行之B細胞活化標誌物上調較低，與其FAP結合部分無關。在不存在FAP (未經塗佈之珠粒)的情況下，在雙特異性抗原結合分子下未觀測到或幾乎未觀測到CD86表現增加。展示在與所指示滴定抗體一起培育2天之後CD86-陽性活B細胞之百分比。x軸展示抗體構築體之濃度。
圖 8A 及圖 8B 展示在FAP存在下(圖 8A )或在FAP不存在的情況下(圖 8B )藉由FAP靶向之抗CD40結合分子活化的OVA-脈衝式DC之T細胞激活。自huCD40轉殖基因小鼠分離，用DEC205-OVA結合物處理且用FAP依賴性雙特異性抗CD40抗體以及經FAP塗佈之珠粒刺激之DC誘導抗原特異性T細胞之強增殖。相比之下，在不存在FAP (未塗佈珠粒)的情況下，藉由FAP靶向之抗CD40抗體刺激之DC未誘導T細胞增殖。經具有兩個、三個或四個CD40及一個FAP (212)或FAP (4B9)結合部分之人類雙特異性抗原結合分子刺激之DC誘導的T細胞增殖相當。用大量SIINFEKL而非DEC205-OVA結合物脈衝之DC誘導強T細胞增殖。展示增殖與huCD40 tg DC共培養之(CFSE-低)活CFSE標記之鼠類CD3+ CD8+ OT-1 T細胞之百分比，huCD40 tg DC在OVA存在下(圖 8A 及圖 8B )與所指示之經滴定抗體一起預培育。x軸展示抗體構築體之濃度。
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Claims (28)

  1. 一種雙特異性抗原結合分子，其由以下組成 (a)能夠特異性結合於CD40之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合於CD40之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合於CD40之第三Fab片段， (d)由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在VH-CH1鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之VH-CH1鏈之N端，該第一Fab片段(a)之該VH-CH1鏈又在其C端融合至第一Fc域次單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至第二Fc域次單元之N端，及 (e)能夠特異性結合於目標細胞抗原之交叉fab片段，其中該交叉fab片段融合至該等Fc域次單元中之一者之C端。
  2. 如請求項1之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之該交叉fab片段融合至該第二Fc域次單元之該C端。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於目標細胞抗原之該抗原結合域係能夠特異性結合於纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗原結合域。
  4. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之該抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-L3。
  5. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之該抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  6. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之該抗原結合域包含重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含選自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28組成之群之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含選自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30組成之群之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之CDR-L3。
  7. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之該抗原結合域包含 (i)重鏈可變區(VH FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36，及 (ii)輕鏈可變區(VL FAP)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:42。
  8. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於FAP之該抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)， (b)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)， (c)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或 (d)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
  9. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之該等抗原結合域中之每一者包含重鏈可變區(VH CD40)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-H2及(iii)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD40)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L1、(v)包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之CDR-L2及(vi)包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之CDR-L3。
  10. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之該等抗原結合域中之每一者包含 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60。
  11. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之該等抗原結合域中之每一者包含 (i)重鏈可變區(VH CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66，及 (ii)輕鏈可變區(VL CD40)，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。
  12. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之該等抗原結合域中之每一者包含 (a)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (b)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (c)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (d)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (e)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (f)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (g)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (h)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (i)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (j)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (k)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (l)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL，或 (m)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL，或 (n)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的VL，或 (o)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的VL，或 (p)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VL。
  13. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之該等抗原結合域中之每一者包含：包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL。
  14. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之該等抗原結合域中之每一者包含 (a)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (b)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (c)包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (d)包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或 (e)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (f)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (g)包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (h)包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的VL，或 (i)包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的VL，或 (j)包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的VL，或 (k)包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的VL，或 (l)包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的VL。
  15. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合於CD40之該等抗原結合域中之每一者包含：包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL，或其中能夠特異性結合於CD40之該抗原結合域包含：包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的VL。
  16. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其包含 (i)三個能夠特異性結合於CD40之抗原結合域，其各自包含：包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD40)及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD40)，及 (ii)一個能夠特異性結合於FAP之抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
  17. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區為IgG，特定言之，IgG1 Fc區或IgG4 Fc區，且其中該Fc區包含一或多個降低該抗體對Fc受體之結合親和力及/或效應功能的胺基酸取代。
  18. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區屬於具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU編號)之人類IgG1子類別。
  19. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中根據杵臼方法，該Fc區之該第一次單元包含杵且該Fc區之該第二次單元包含臼。
  20. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc區之該第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat之EU編號)且該Fc區之該第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V( 根據Kabat之EU編號)。
  21. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子。
  22. 一種表現載體，其包含如請求項21之經分離核酸。
  23. 一種宿主細胞，其包含如請求項21之經分離核酸或如請求項22之表現載體。
  24. 一種製造雙特異性抗原結合分子之方法，其包含在適於表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如請求項23之宿主細胞，及分離該雙特異性抗原結合分子。
  25. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。
  26. 一種如請求項1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子或如請求項25之醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑，該藥劑係用於 (i)藉由表現CD40之抗原呈現細胞(APC)誘導免疫刺激， (ii)刺激腫瘤特異性T細胞反應， (iii)引起腫瘤細胞之細胞凋亡， (iv)治療癌症， (v)延遲癌症進展， (vi)延長罹患癌症之患者的存活期， (vii)治療感染。
  27. 一種如請求項1至20中任一項之雙特異性抗原結合分子或如請求項25之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療癌症用之藥劑。
  28. 如請求項27之用途，其中該雙特異性抗原結合分子係用於與化學治療劑、輻射及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3559034T3 (pl) 2016-12-20 2021-04-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona dwuswoistymi przeciwciałami anty-CD20/anty-CD3 i agonistami 4-1BB (CD137)
CN110461873B (zh) 2017-01-03 2023-05-12 豪夫迈·罗氏有限公司 包含抗4-1bb克隆20h4.9的双特异性抗原结合分子
EP3601345A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
PE20211863A1 (es) * 2018-10-01 2021-09-21 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 212 anti-fap
WO2020127618A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
UY38995A (es) 2019-12-20 2021-06-30 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecíficos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores sólidos
AR121706A1 (es) * 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
EP4244254A1 (en) 2020-11-16 2023-09-20 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy with fap-targeted cd40 agonists
WO2022243261A1 (en) * 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
WO2024062092A1 (en) * 2022-09-22 2024-03-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Anti-cd40 antibody constructs with high intrinsic agonism

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
ATE419355T1 (de) 1992-02-06 2009-01-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2359067C (en) 1999-01-15 2017-03-14 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
DE60140474D1 (de) 2000-09-08 2009-12-24 Univ Zuerich Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten
HUP0700103A3 (en) 2001-08-03 2012-09-28 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP3263596A1 (en) 2002-12-16 2018-01-03 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CA2531238C (en) 2003-07-04 2015-02-24 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for her2
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
DK2348051T3 (en) 2003-11-05 2019-03-18 Roche Glycart Ag CD20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
TW200531979A (en) 2003-12-05 2005-10-01 Compound Therapeutics Inc Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2006249305B2 (en) * 2005-05-26 2012-10-18 Genentech, Inc. Humanized anti-CD40 antibodies and their methods of use
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US8551485B2 (en) * 2008-01-23 2013-10-08 Xencor, Inc. Anti-CD40 antibodies and methods of inhibiting proliferation of CD40 expressing cells
JP5803913B2 (ja) 2010-06-29 2015-11-04 コニカミノルタ株式会社 超音波診断装置及びプログラム
MX358859B (es) 2010-08-13 2018-09-05 Roche Glycart Ag Anticuerpos anti-fap y métodos de utilización.
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
MX2016010174A (es) * 2014-02-06 2016-11-15 Hoffmann La Roche Proteinas de fusion de interleucina-10 y usos de las mismas.
BR112016023417A2 (pt) 2014-03-21 2019-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag predição in vitro de meia-vida in vivo
BR112017005451A2 (pt) 2014-10-24 2018-01-02 Hoffmann La Roche anticorpo humanizado e métodos para a seleção de um ou mais fragmentos fv de anticorpo variantes e para a produção de um anticorpo
KR20180053674A (ko) * 2015-10-02 2018-05-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 공자극 tnf 수용체에 특이적인 이중특이성 항체
AU2016334623A1 (en) * 2015-10-07 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory TNF receptor
US20170342169A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins
GB201611530D0 (en) * 2016-07-01 2016-08-17 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides
CN110461873B (zh) * 2017-01-03 2023-05-12 豪夫迈·罗氏有限公司 包含抗4-1bb克隆20h4.9的双特异性抗原结合分子
EP3576782A4 (en) * 2017-02-02 2020-12-30 Silverback Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS OF RECOMBINATION PRODUCT-PEPTIDE AND THEIR METHODS OF USE

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