TW202408483A

TW202408483A - 一種硼酸酯衍生物的可藥用鹽、其結晶形式及用途

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Publication number: TW202408483A
Application number: TW112123488A
Authority: TW
Inventors: 孫龍偉; 侯延婷; 朱嘉俊; 王中利; 謝藍; 羅志陽
Original assignee: 大陸商瑞石生物醫藥有限公司
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2023-06-21
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本揭露關於一種硼酸酯衍生物的可藥用鹽、其結晶形式及用途。具體而言，本揭露提供了式I所示化合物的可藥用鹽、其結晶形式及用途。

Description

一種硼酸酯衍生物的可藥用鹽、其結晶形式及用途

本揭露屬於藥學領域，關於一種硼酸酯衍生物的可藥用鹽、其結晶形式及用途。

磷酸二酯酶(PDEs)為一類裂解在第二信使分子3',5'-環腺苷單磷酸(cAMP)和3',5'-環鳥苷單磷酸(cGMP)上的磷酸二酯鍵的細胞內酶。環核苷酸cAMP和cGMP在各種細胞途徑中充當第二信使。其中，PDE4對cAMP具有高度特異性，有4種亞型：PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D。PDE4參與了促進單核細胞與巨噬細胞活化、嗜中性球浸潤、血管平滑肌的增殖、血管擴張以及心肌收縮等相關生理病理過程，對中樞神經系統功能、心血管功能、炎症/免疫系統、細胞黏附等都有影響。PDE4在促炎介質和抗炎介質的表達中起到主要調節作用，PDE4抑制劑能夠抑制炎症細胞釋放有害介質。

近年發現許多PDE4抑制劑。例如，羅氟司特獲准用於嚴重慢性阻塞性肺病(COPD)以減少突然發作的次數或防止COPD症狀惡化；阿普司特獲批准用於治療患有活動性牛皮癬性關節炎的成人。雖然PDE4抑制劑顯示良好的藥理活性，但這些PDE抑制劑會出現副作用，諸如誘發性胃腸症狀如嘔吐及腹瀉。仍需要開發選擇性PDE4抑制劑，尤其對PDE4B和PDE4D具有親和力的選擇性PDE4抑制劑。

含硼(B)藥物克立硼羅於2016年12月14日經FDA批准為一種輕度至中度特應性皮炎的局部治療藥物。該硼原子有助於皮膚滲透並與磷酸二酯酶4(PDE4)的雙金屬中心結合。另外，其他含硼的PDEs抑制劑小分子已有報導，諸如CN102014927A、WO2020070651。然而本揭露的化合物並沒有在任何文獻中揭露，且該類化合物展現特異性PDE4抑制效果。

PCT/CN2021/141010提供了一類新型的PDE4抑制劑，其化學名為(R)-4-(6-(8-甲氧基-2,2-二甲基苯并二氫吡喃-5-基)吡嗪-2-基)-1,2-氧雜硼雜環戊烷-2-醇，具有式I所示的結構，

作為藥用活性成分的晶型往往影響到藥物的化學穩定性，結晶條件及儲存條件的不同有可能導致化合物的晶型結構的變化，有時還會伴隨著產生其他形態的晶型。一般來說，無定形的藥物產品沒有規則的晶型結構，往往具有其它缺陷，比如產物穩定性較差，析晶較細，過濾較難，易結塊，流動性差等。藥物的多晶型對產品儲存、生產及放大有不同的要求。因此，深入研究前述化合物的晶型，改善前述化合物的各方面性質是很有必要的。

本揭露提供了一種式I所示化合物的可藥用鹽，

在一些實施方案中，該可藥用鹽選自鋰鹽。

在一些實施方案中，該式I所示化合物與鹼分子或陽離子的莫耳配比為1：0.5~1：3，例如1：0.5、1：1、1：2或1：3。

在一些實施方案中，該式I所示化合物與鹼分子或陽離子的莫耳配比為1：1。

在一些實施方案中，該式I所示化合物與酸分子或酸根的化學配比為1：0.5~1：3，例如1：0.5、1：1、1：2或1：3。本揭露還提供一種上述式I所示化合物的可藥用鹽的製備方法，其包括將式I所示化合物與鹼形成鹽的步驟，或者將式I所示化合物與酸形成鹽的步驟。

在一些實施方案中，成鹽反應所用的溶劑選自乙腈、甲醇、乙醇、四氫呋喃、丙酮和二噁烷中的一種或多種。

在一些實施方案中，成鹽反應所用溶劑的體積(μl)為該式I化合物質量(mg)的1-200倍，在非限制性實施方案中為1、5、10、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、200或任意兩數之間的值。

在一些實施方式中，該製備方法還包括離心、洗滌或乾燥步驟。

本揭露還提供了式I所示化合物的鋰鹽的晶型α，其以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在13.913°、17.884°、19.894°、21.182°、33.454°處有特徵峰，

在一些實施方案中，該晶型α，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在11.855°、13.913°、14.383°、17.884°、19.894°、21.182°、22.148°、29.948°、30.310°、33.454°處有特徵峰。

在一些實施方案中，該晶型α，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在11.855°、13.913°、14.383°、17.884°、19.894°、21.182°、22.148°、23.910°、29.948°、30.310°、33.454°、36.812°處有特徵峰。

在一些實施方案中，該晶型α，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在8.859°、11.855°、13.913°、14.383°、14.863°、17.884°、19.894°、21.182°、22.148°、23.910°、29.948°、30.310°、31.609°、33.454°、34.721°、36.812°處有特徵峰。

在一些實施方案中，該晶型α，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖如圖6所示。

本揭露還提供了一種上述晶型α的製備方法，其包括以下步驟：(a)將式I所示化合物、氫氧化鋰和溶劑混合，攪拌；(b)析晶；

在一些實施方案中，步驟(a)中的溶劑選自乙腈、甲醇、乙醇、四氫呋喃、丙酮和二噁烷中的一種或多種。

在一些實施方案中，步驟(a)中的溶劑所用體積(μl)為式I所示化合物質量(mg)的1-200倍，在非限制性實施方案中為1、5、10、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、200或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，步驟(a)中，該氫氧化鋰的品質為式I所示化合物質量的0.5-3倍，在非限制性實施方案中為0.5、0.7、1、1.5、2、2.5、3或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，步驟(a)中，該攪拌的溫度為10-70℃，在非限制性實施方案中為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，步驟(a)中，該攪拌的溫度為50℃。

在一些實施方案中，步驟(b)中，該析晶為冷卻析晶，該冷卻析晶的溫度較佳為0℃。

在一些實施方案中，該析晶之後，還包括過濾、洗滌或乾燥步驟。

本揭露還提供了一種藥物組成物，其包括上述式I所示化合物的可藥用鹽和視需要地藥學上可接受的賦形劑。

本揭露還提供了一種藥物組成物，其包括上述晶型α或由上述製備方法製得的晶型α，和視需要地藥學上可接受的賦形劑。

本揭露還提供了一種上述藥物組成物的製備方法，其包括將上述式I所示化合物的可藥用鹽或上述晶型α或由上述製備方法製得的晶型α，與藥學上可接受的賦形劑混合的步驟。

本揭露還提供了一種上述式I所示化合物的可藥用鹽或上述晶型α、或由上述製備方法製得的晶型α、或上述藥物組成物在製備用於預防和/或治療與PDE相關疾病的藥物中的用途。

在一些實施方案中，該與PDE相關疾病為氣喘、阻塞性肺病、敗血病、腎炎、糖尿病、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、潰瘍性腸炎或風濕病。

本揭露還提供了一種上述式I所示化合物的可藥用鹽或晶型α、或由上述製備方法製得的晶型α、或上述藥物組成物在製備用於預防和/或治療氣喘、阻塞性肺病、敗血病、腎炎、糖尿病、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、潰瘍性腸炎或風濕病的藥物中的用途。

本揭露所述的「2θ或2θ角度」是指繞射角，θ為布拉格角，單位為°或度；每個特徵峰2θ的誤差範圍為±0.2(包括超過1位元小數的數位經過四捨五入後的情況)，可以為-0.20、-0.19、-0.18、-0.17、-0.16、-0.15、-0.14、-0.13、-0.12、-0.11、-0.10、-0.09、-0.08、-0.07、-0.06、-0.05、-0.04、-0.03、-0.02、-0.01、0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20。

依據《中國藥典》2015年版四部中「9103藥物引濕性指導原則」中引濕性特徵描述與引濕性增重的界定，

潮解：吸收足量水分形成液體；

極具引濕性：引濕增重不小於15%；

有引濕性：引濕增重小於15%但不小於2%；

略有引濕性：引濕增重小於2%但不小於0.2%；

無或幾乎無引濕性：引濕增重小於0.2%。

本揭露中所述的「差示掃描量熱分析或DSC」是指在樣品升溫或恆溫過程中，測量樣品與參考物之間的溫度差、熱流差，以表徵所有與熱效應有關的物理變化和化學變化，得到樣品的相變資訊。

本揭露中所述的乾燥溫度一般為25℃~100℃，較佳為40℃~70℃，可以常壓乾燥，也可以減壓乾燥，壓力強度<-0.08MPa。

本揭露中所述的「室溫」一般為25℃±5℃。

本揭露中所述的「賦形劑」包括但不限於任何已經被美國食品和藥物管理局批准對於人類或家畜動物使用可接受的任何助劑、載體、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增香劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、穩定劑、等滲劑或乳化劑。

本揭露所述的「打漿」是指利用物質在溶劑中溶解性差，但雜質在溶劑中溶解性好的特性進行純化的方法，打漿純化可以去色、改變晶型或去除少量雜質。

本揭露晶型製備方法中所用的起始原料可以是任意形式的化合物，具體形式包括但不限於：無定形、任意晶型、水合物、溶劑合物等。

本揭露中的數值，例如，有關物質含量為測定計算的數據，不可避免存在一定程度的誤差。一般而言，±10%均屬於合理誤差範圍內。隨其所用之處的上下文而有一定程度的誤差變化，該誤差變化不超過±10%，可以為±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%，較佳為±5%。

本揭露式I化合物(R)-4-(6-(8-甲氧基-2,2-二甲基苯并二氫吡喃-5-基)吡嗪-2-基)-1,2-氧雜硼雜環戊烷-2-醇(以下簡稱化合物I)參照PCT/CN2021/141010中方法製備獲得，本文本引用相關內容以示說明。

圖1：測試例4中各組化合物在疾病模型的臨床評分比對圖。

圖2：測試例4中各組化合物在紅斑疾病模型的臨床評分比對圖。

圖3：測試例4中各組化合物在銀屑疾病模型的臨床評分比對圖。

圖4：測試例4中各組化合物對皮膚厚度增加的抑制作用比對圖。

圖5：測試例4中各組化合物對脾臟體重占比影響的比對圖。

圖6：晶型α的XRPD譜圖。

圖7：晶型α的DSC譜圖。

圖8：晶型α的TGA譜圖。

在圖1至圖6中，*表示與模型組相比p<0.05，**表示與模型組相比p<0.01，***表示與模型組相比p<0.001，▼、●、◆、和#這些符號僅用於區分組別。

以下將結合實施例更詳細地說明本揭露內容，本揭露中的實施例僅用於說明本揭露中的技術方案，並非限定本揭露中的實質和範圍。

本揭露所用到的縮寫的解釋如下：

本揭露中實驗所用儀器的測試條件：

1、X-射線粉末繞射儀(X-ray Powder Diffraction,XRPD)

儀器型號：Malver Panalytical Aeris X-射線粉末繞射儀

射線：單色Cu-Kα射線(λ=1.54188)

掃描方式：θ/2θ，掃描範圍(2θ範圍)：3.5~50°

電壓：40kV，電流：15mA。

2、差示掃描量熱儀(Differential Scanning Calorimeter,DSC)

儀器型號：TA DSC250

吹掃氣：氮氣；氮氣吹掃速度：50mL/min

升溫速率：10℃/min

溫度範圍：25℃-300℃。

3、熱重分析儀(Thermogravimetric Analysis，TGA)

儀器型號：TA TGA550

吹掃氣：氮氣；氮氣吹掃速度：20ml/min

升溫速率：10℃/min

溫度範圍：30℃-350℃。

4、動態水分吸附(DVS)

檢測採用SMS Intrinsic PLUS，在25℃，濕度從50%-0%-90%，步進為10%，判斷標準為每個梯度品質變化dM/dT小於0.0002%，TMAX 360min，迴圈兩圈。

5、本發明穩定性測試中該高效液相色譜法(HPLC)在Agilent 1260 Infinity II上採集，HPLC條件：色譜柱：Agilen XDB C18 5μm 4.6*250mm；流動相：A-0.05%TFA(水中)，B-ACN；流速：1.0ml/min；波長：220nm。

6、化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或/和質譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d ₆)，氘代氯仿(CDCl₃)，氘代甲醇(Methanol-d ₄)，內標為四甲基矽烷(TMS)。

7、化合物I製備實施例中HPLC的測定使用Agilent1100高壓液相色譜儀，GAS15B DAD紫外檢測器，Water Vbridge C18 150*4.6mm 5μM色譜柱。

8、MS的測定用Agilent6120三重四極桿質譜儀，G1315D DAD檢測器，Waters Xbridge C18 4.6*50mm，5μM色譜柱，以正/負離子模式掃描，品質掃描範圍為80~1200。

9、製備HPLC條件：水；柱：Sunfire(Prep C18 OBD 19*250mm 10μm)。

10、手性柱拆分條件：柱：Chiralpak IG 5μm 30 * 250mm；流動相：Hex：EtOH=35：65，15mL/min；溫度：30℃；波長：254nm。

11、薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用矽膠板採用規格是0.2mm±0.03mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm-0.5mm。

12、快速柱純化系統使用Combiflash Rf150(TELEDYNE ISCO)或者Isolara one(Biotage)。

13、正向柱層析色譜法一般使用煙臺黃海矽膠200~300目或300~400目矽膠為載體，或者使用常州三泰預填超純正相矽膠柱(40-63μm，60g，24g，40g，120g或其它規格)。

本揭露中的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自上海泰坦科技、ABCR GmbH & Co.KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、畢得醫藥等公司。

實施例中無特殊說明，反應均能夠在氮氣氛下進行。

氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氮氣氣球。

氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。

氫氣是由上海全浦科學儀器公司QPH-1L型氫氣發生儀製得。

氮氣氛或氫氣氛通常抽真空，充入氮氣或氫氣，反覆操作3次。

實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。

實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫，為20℃~30℃。

實施例中的反應進程的監測採用薄層色譜法(TLC)，反應所使用的展開劑，純化化合物採用的柱層析的沖提劑的體系和薄層色譜法的展開劑體系，溶劑的體積比係根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等鹼性或酸性試劑進行調節。

實施例1：化合物I的製備

步驟1)：化合物1a(2.0g，14.6mmol)和三乙胺(1.8g，17.8mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(30mL)，溶液冷卻至0℃。氮氣氛下，將三級丁基二苯基氯矽烷(4.0g，14.6mmol)滴加至反應體系。升至室溫繼續攪拌至TLC檢測反應完成，將反應液倒入水中，以乙酸乙酯萃取(100mL×3)。有機相用水洗(50mL×2)，以無水硫酸鈉乾燥，濃縮，殘餘物經矽膠柱層析色譜法純化(乙酸乙酯/石油醚)，得到化合物1b(5.1g)，直接用於下一步反應。

步驟2)：氮氣氛下，將化合物1b(5.1g，13.6mmol)、雙(品納醇)二硼酸酯(4.2g，16.3mmol)、[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(512mg，0.7mmol)、乙酸鉀(2.0g，20.4mmol)和二噁烷(100mL)混合物升溫至80℃，並且攪拌過夜。將反應液倒入水中，以乙酸乙酯萃取(100mL×2)。用水洗滌(30mL×2)，以無水硫酸鈉乾燥，濃縮，殘餘物經矽膠柱層析色譜法純化(石油醚/乙酸乙酯)，得到化合物1c(2.0g)，LCMS：m/z 423.2(M+H)⁺。

步驟3)：室溫下，向2000mL單口瓶中依次加入化合物a(100g,492mmol)、DMF(1000mL)、碘化鉀(92.6g，837mmol)、碘化亞銅(3.13g，9.85mmol)、碳酸鉀(136g,985mmol)。氮氣氛下，滴加3-氯-3-甲基-1-丁炔(100mL，886mmol)。70℃攪拌16小時。冷卻至室溫，加入水(1000mL)，以石油醚(1000mL×3)萃取。以無水硫酸鈉乾燥，過濾。減壓濃縮，殘餘物經柱層析色譜法(石油醚/乙酸乙酯)純化，得到化合物b(50g)。

¹ H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.57(d,J=2.4Hz,1H),7.15(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),6.76(d,J=8.8Hz,1H),3.79(s,3H),2.58(s,1H),1.65(s,6H)。

步驟4)：室溫下，向500mL單口瓶中依次加入化合物b(20.0g,74.4mmol)、正己烷(200mL)、鈀碳酸鈣(1.95g 18.8mmol)。氫氣氛下，室溫攪拌16小時。過濾，減壓濃縮，得到化合物c(19g)。

¹ H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.15(d,J=2.4Hz,1H),7.09(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),6.73(d,J=8.8Hz,1H),6.12(dd,J=17.6,10.8Hz,1H),5.14(dd,J=20.0,9.2Hz,2H),3.79(s,3H),1.46(s,6H)。

步驟5)：室溫下，向50mL單口瓶中依次加入化合物c(10.0g，36.9mmol)，二乙基苯胺(10mL，62.5mmol)。210℃下攪拌1小時。冷卻至室溫，用1M HCl溶液調節pH調至中性，以乙酸乙酯萃取(200mL×3)，水洗(200mL×3)。減壓濃縮，得到化合物d(9.1g)。

¹ H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 8.97(s,1H),6.97(d,J=8.8Hz,1H),6.77(d,J=8.8Hz,1H),5.14-5.01(m,1H),3.78(s,3H),3.40(d,J=6.8Hz,2H),1.74(s,3H),1.63(s,3H)。

步驟6)：室溫下，向100mL單口瓶中依次加入化合物d(5.00g，18.5mmol)、甲苯(25mL)、Amberlyst^® 15(5.00g，15.9mmol)。氮氣氛下，100℃下攪拌2小時。冷卻至室溫，過濾。減壓濃縮，得到化合物e(3.89g)。

¹ H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.04(d,J=8.8Hz,1H),6.75(d,J=8.8Hz,1H),3.71(s,3H),2.63(t,J=6.8Hz,2H),1.78(t,J=6.8Hz,2H),1.26(s,6H)。

步驟7)：室溫下，向500mL單口瓶中依次加入化合物e(28.4g，105mmol)、二噁烷(300mL)、雙(品納醇)二硼酸酯(31.9g，126mmol)、醋酸鉀(20.6g，209mmol)、[1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(7.66g，10.5mmol)。氮氣氛下，105℃下攪拌16時。冷卻至室溫，過濾。減壓濃縮，殘餘物經柱層析色譜法(石油醚/乙酸乙酯)純化，得到化合物f(28.4g)。

LCMS：m/z 319(M+H)⁺。

步驟8)：室溫下，向250mL單口瓶中依次加入化合物f(6.20g，19.5mmol)、1,4-二噁烷(80mL)、水(16mL)、2,6-二氯吡嗪(2.90g，39.0mmol)、碳酸鉀(5.39g，39.0mmol)、[1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(1.43g，1.95mmol)。氮氣氛下，110℃攪拌16小時。冷卻至室溫，過濾。減壓濃縮，殘餘物經柱層析色譜法(石油醚/乙酸乙酯)純化得到化合物g(5.7g)。

LCMS：m/z 305(M+H)⁺。

步驟9)：室溫下，向100mL單口瓶中加入化合物g(35.0g，115mmol)、化合物1c(44.5g，149mmol)、碳酸鉀(23.8g，172mmol)、醋酸鉀(16.9g，172mmol)和[1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(8.41g，11.5mmol)於1,4-二噁烷(250mL)與水(5mL)混合溶劑中。攪拌至溶解，氮氣置換3次，110℃下攪拌16小時。冷卻至室溫，加水(500mL)，乙酸乙酯(300mL×3)萃取，以無水硫酸鈉乾燥。過濾，減壓濃縮，殘餘物經柱層析色譜法(石油醚/乙酸乙酯)純化，得到化合物h(37g)。

LCMS：m/z 441.1(M+H)⁺。

步驟10)：室溫下，向250mL三口瓶中加入1,2-雙(二苯基膦)乙烷(1.81g，4.54mmol)、(1,5-環辛二烯)甲氧基銥(I)二聚體(1.50g，2.27mmol)和無水1,2-二氯乙烷(100mL)。室溫攪拌10分鐘，加入化合物h(10.0g，22.7mmol)。升溫至70℃，滴加品納可硼烷(20.3g，159mmol)。95℃下反應4小時。降溫到0℃，滴加甲醇(50mL)淬滅。濃縮，殘餘物經柱層析色譜法(石油醚/乙酸乙酯)純化，得到化合物i(1.4g)。

LCMS：m/z 569.3(M+H)⁺。

步驟11)：室溫下，在50mL單口瓶中加入化合物i(9.00g，15.8mmol)和四氫呋喃(30mL)。冷卻至0℃，加入2M鹽酸(50mL)。50℃下攪拌16小時。減壓濃縮，加入乙酸乙酯(300mL×3)萃取，無水硫酸鈉乾燥，過濾。減壓濃縮，殘餘物經反相柱層析色譜法(乙腈/水/三氟乙酸)純化，得化合物I-A(3.82g)。

利用手性分離(柱：Chiralpak IG 5μm 30 * 250mm；流動相：Hex：EtOH=35：65；流速：15mL/min；溫度：30℃；波長：254nm)，得到化合物I。

LCMS：m/z 355.0(M+H)⁺。

¹ H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 8.62(s,1H),8.48(s,1H),6.98(d,J=8.4Hz,1H),6.90(d,J=8.4Hz,1H),4.29(dd,J=8.8,7.6Hz,1H),3.96(dd,J=8.8,6.8Hz,1H),3.77(s,3H),3.74-3.62(m,1H),2.93-2.67(m,2H),1.68(t,J=6.8Hz,2H),1.38-1.24(m,7H),1.21-1.08(m,1H)。

實施例2：化合物I的鋰鹽的製備

將化合物I(15mg，42.3490μmol)溶解於0.2ml甲醇中，加入氫氧化鋰(10.7mg)，將溶液於1小時升溫至50℃，50℃恆溫攪拌4小時後，於6小時內程式降溫至0℃，0℃下攪拌48小時持續反應，真空乾燥，得到化合物I的鋰鹽。

¹ H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.75-8.12(m,1H),7.13-6.45(m,1H),3.76(d,J=2.9Hz,3H),3.35(s,2H),2.97-2.63(m,1H),2.10(d,J=13.2Hz,0H),1.66(t,J=7.2Hz,1H),1.41-1.02(m,3H)。

實施例3：化合物I的鋰鹽的晶型α的製備

將化合物I(15mg，42.3490μmol)溶解於0.2ml良溶劑(表1)中，加入氫氧化鋰(10.7mg)，將溶液於1小時升溫至50℃，50℃恆溫攪拌4小時後，於6小時內程式降溫至0℃，0℃下攪拌48小時，過濾，真空乾燥，所得固體經 XRPD檢測定義為晶型α。其XRPD譜圖如圖6所示，其特徵峰位置如表2所示，其DSC譜圖如圖7所示，其TGA譜圖如圖8所示。

表1、化合物I的鋰鹽的晶型α的製備用溶劑及XRPD檢測結果

表2、晶型α的XRPD特徵繞射峰資料

生物學評價

以下結合測試例進一步描述本揭露，但這些測試例並非意味著限制本揭露中的範圍。

化合物A的結構為：

化合物A是採用專利申請「WO2020070651A中說明書第181頁的實施例4」所揭露的方法製備而得的。

測試例1、體外PDE4B酶活性檢測實驗

1、實驗材料

2、實驗步驟

先在試管中以90%的DMSO(10%的水)配製濃度為10mM的化合物儲備溶液，並用其製備稀釋梯度為1：5的系列稀釋液，終濃度從100uM開始，低至0.05nM。

將0.2ul化合物溶液轉入384孔反應板中，陰性對照和陽性對照均轉入0.2ul的100% DMSO。然後向孔中加入10ul的2倍濃度PDE4B1酶溶液(終濃度為0.04nM)，對於無酶活性的對照孔，用10ul的1倍反應緩衝液(50mM HEPES，pH 7.5,0.0015% Brij-35)替代酶溶液。1000rpm離心1min，室溫孵育15分鐘。接著向384孔反應板每孔中加入10ul的2倍FAM-cAMP受質溶液(受質終濃度為0.1uM)，以1000rpm離心1min，25℃下反應30分鐘。反應結束後向384孔反應板每孔中加入60ul的反應終止液來終止反應，室溫下搖床600rpm振盪避光孵育60分鐘。

孵育結束後讀取RLU資料並計算抑制率，根據濃度和抑制率擬合曲線計算出IC₅₀值，其中最大值是指DMSO對照的讀值，最小值是指無酶活性的對照的讀值。

本揭露的化合物I在體外對PDE4B1酶活性抑制藉由以上的試驗進行測定，測得的IC₅₀值見表3。

表3

測試例2、化合物對周邊血單核細胞(PBMC)促炎細胞因子的釋放的抑制作用

解凍冷凍保存的PBMC，台盼藍染色檢測細胞存活率和數目。用RPMI1640完全培養基(RPMI1640+10%FBS+1%PS)清洗解凍後的PBMC，離心後棄去上清液。用RPMI1640完全培養基重新懸浮PBMC，將細胞密度調至2×10⁶個細胞/mL。鋪2×10⁵ PBMC細胞於96孔細胞培養板中，加入不同濃度的待測化合物，從化合物最大濃度100μM開始，按照1：5的比例做9個濃度的梯度稀釋，雙複孔檢測。加入終濃度為0.1ng/mL的LPS，總體積為200μL。設置陰性和陽性對照，陰性對照孔內只加入LPS和終濃度為DMSO，陽性對照孔內除細胞和LPS之外，還加入1μg/mL的地塞米松作為陽性對照。將細胞於37℃培養箱孵育24小時。孵育完成後，收集100μL細胞培養上清液，用ELISA檢測TNF-α的水準。向每孔剩餘的細胞中加入100μL CellTiter-Glo，檢測細胞活力水準。計算化合物抑制TNF-α釋放的IC₅₀值。

本揭露的化合物I在體外對PBMC促炎細胞因子釋放的抑制藉由以上的試驗進行測定，測得的IC₅₀值見表4。

表4

測試例3、化合物於體外抑制人單核細胞分化的DC細胞所分泌IL-23的實驗

第0天：從新鮮人周邊血中分離純化單核細胞並重新懸浮於完全的RPMI-1640培養液內，分化DC細胞時，在培養液內加入濃度為50ng/ml的IL-4和100ng/ml的GM-CSF，以1×10⁶個細胞/mL的密度在直徑為100mm的培養皿中進行分化培養，培養箱溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%。第3天：將一半體積的完全RPMI培養液替換為新鮮的完全RPMI培養液，保持IL-4的濃度為50ng/ml，GM-CSF的濃度為100ng/ml。第6天：收集培養皿內未貼壁的細胞(為DC細胞)並用PBS清洗，清洗後的DC細胞用完全RPMI培養液進行重新懸浮，重新懸浮的細胞密度為1×10⁶個細胞/mL。然後向96孔細胞培養板中每孔加入1×10⁵個DC細胞，並加入不同濃度梯度的待測化合物(或同等濃度的DMSO空白陰性對照)預處理孵育1小時，而後加入200ug/ml TLR2激動劑酵母聚糖(Zymosan)刺激DC細胞24小時。第7天：酵母聚糖刺激DC細胞24小時後，收集96孔板中各孔的上清液，用ELISA檢測IL-23的濃度。

本揭露的化合物在體外對人單核細胞分化的DC細胞所分泌IL-23的抑制藉由以上的試驗進行測定，測得的IC₅₀值見表5。

表5

測試例4、咪喹莫特誘導的銀屑病抑制實驗

取適量化合物I配製成下述成分的軟膏：0.1%的化合物I，9%的己二醇，78.8%的白凡士林，5%的石蠟，7%的單雙硬脂酸甘油酯，0.1%的二羥基丁基甲苯，機械攪拌至成為軟膏。

1)造模和給藥

選用7週齡Balb/c雌性小鼠，實驗前一天進行背部剃毛，剃毛面積為2cm×3cm；實驗第1-7天在皮膚塗抹受試物6小時後，將咪喹莫特(IMQ)軟膏(Aldara(5%))連續塗抹於小鼠背部皮膚7天，構建銀屑病小鼠模型，對照組給予同等劑量的凡士林軟膏；第3、5、7天評估皮膚炎症的嚴重程度，包括測量皮膚厚度，結痂，紅斑情況，採用5分制(0-5)分別進行打分。總評分用於評估皮膚炎症嚴重程度。實驗第7天取脾臟稱重，計算脾臟占體重百分比用於評估藥物免疫抑制作用程度。

本實驗設正常對照組，模型對照組，化合物I的低、中、高劑量組(0.01%，0.03%和0.1%)，以及0.03%參考比對化合物A組。

2)評價指標

皮膚炎症程度的總評分為臨床評分，指標相對主觀，評分越高代表疾病越嚴重。皮膚厚度增加程度為客觀評價指標，厚度增加越大代表疾病越嚴重。脾臟占體重比重為客觀評價指標，脾臟體重占比越小代表藥物免疫抑制作用越強。

3)實驗結果

3.1)臨床評分

化合物A以及化合物I各劑量在實驗終點顯著降低了臨床評分。(圖1至圖4)。從單項評分看，化合物I各劑量組主要改善模型的銀屑結痂情況以及減少皮膚厚度。在皮膚厚度評分中，化合物I低高劑量組均顯著抑制皮膚厚度增加，化合物A無顯著作用。0.03%的化合物I對皮膚厚度增加的抑制作用顯著高於相同劑量的化合物A(圖4)。結果顯示化合物I在改善銀屑病表徵上顯著優於參考比對化合物A。各具體評分資料見表6。

表6

3.2)脾臟體重占比

在IMQ作用下，模型組及各給藥組動物體重無顯著區別，而模型組脾臟占總體積比顯著增加(圖5)，提示脾腫大。化合物A對脾臟體重占比無顯著影響，化合物I的三個劑量組皆顯著降低脾臟體重占比。提示各化合物有免疫抑制作用，且化合物I的作用呈劑量反應關係。同劑量下(0.03%)，化合物I對脾臟占體重比作用與化合物A有顯著差異，結果提示化合物I的免疫作用強於化合物A。具體資料見表7。

表7

Claims

一種式I所示化合物的可藥用鹽，其中該可藥用鹽選自鋰鹽，
如請求項1所述的式I所示化合物的可藥用鹽，其中，該式I所示化合物與鹼分子或陽離子的莫耳配比為1：0.5至1：3，較佳為1：0.5、1：1、1：2或1：3。
一種如請求項1或2所述的式I所示化合物的可藥用鹽的製備方法，其包括將式I所示化合物與鹼形成鹽的步驟，
如請求項3所述的製備方法，其中，成鹽反應所用的溶劑選自乙腈、甲醇、乙醇、四氫呋喃、丙酮和二噁烷中的一種或多種。
一種式I所示化合物的鋰鹽的晶型α，其以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在13.913°、17.884°、19.894°、21.182°、33.454°處有特徵峰；較佳為在11.855°、13.913°、14.383°、17.884°、19.894°、21.182°、22.148°、29.948°、30.310°、33.454°處有特徵峰；更佳為在11.855°、13.913°、14.383°、17.884°、19.894°、21.182°、22.148°、23.910°、29.948°、30.310°、33.454°、36.812°處有特徵峰；進一步較佳為在8.859°、11.855°、13.913°、14.383°、14.863°、17.884°、19.894°、21.182°、22.148°、23.910°、29.948°、30.310°、31.609°、33.454°、34.721°、36.812° 處有特徵峰；更進一步較佳為以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖如圖6所示，
如請求項5所述的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α，其中，該2θ值誤差範圍為±0.2°。
一種如請求項5或6所述的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α的製備方法，其包括以下步驟：

(a)將式I所示化合物、氫氧化鋰和溶劑混合，攪拌；

(b)析晶，
如請求項7所述的製備方法，其中，該溶劑選自乙腈、甲醇、乙醇、四氫呋喃、丙酮和二噁烷中的一種或多種。
如請求項7所述的製備方法，其中，在步驟(a)中，該攪拌的溫度為10-70℃，例如10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，較佳為50℃。
如請求項7所述的製備方法，其中，在步驟(b)中，該析晶為冷卻析晶，該冷卻析晶的溫度較佳為0℃。
一種藥物組成物，其包含如請求項1或2所述的式I所示化合物的可藥用鹽、或如請求項5或6所述的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α、或由如請求項7至10中任一項所述的製備方法製得的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α，和視需要地藥學上可接受的賦形劑。
一種如請求項11所述的藥物組成物的製備方法，其包括將如請求項1或2所述的式I所示化合物的可藥用鹽、或如請求項5或6所述的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α、或由如請求項7至10中任一項所述的製備方法製得的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α，與藥學上可接受的賦形劑混合的步驟。
一種如請求項1或2所述的式I所示化合物的可藥用鹽、或如請求項5或6所述的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α、或由如請求項7至10中任一項所述的製備方法製得的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α、或如請求項11所述的藥物組成物在製備用於預防和/或治療與PDE相關疾病的藥物中的用途；較佳地，該與PDE相關疾病為氣喘、阻塞性肺病、敗血病、腎炎、糖尿病、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、潰瘍性腸炎或風濕病。
一種如請求項1或2所述的式I所示化合物的可藥用鹽、或如請求項5或6所述的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α、或由如請求項7至10中任一項所述的製備方法製得的式I所示化合物的鋰鹽的晶型α、或如請求項11所述的藥物組成物在製備用於預防和/或治療氣喘、阻塞性肺病、敗血病、腎炎、糖尿病、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、潰瘍性腸炎或風濕病的藥物中的用途。