WO2023207944A1 - Fgfr4抑制剂的晶型及应用 - Google Patents

Fgfr4抑制剂的晶型及应用 Download PDF

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WO2023207944A1
WO2023207944A1 PCT/CN2023/090492 CN2023090492W WO2023207944A1 WO 2023207944 A1 WO2023207944 A1 WO 2023207944A1 CN 2023090492 W CN2023090492 W CN 2023090492W WO 2023207944 A1 WO2023207944 A1 WO 2023207944A1
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formula
radiation
ray powder
powder diffraction
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彭肖石
张汉承
杨敏
叶向阳
张丹丹
梁鑫磊
闫翠勤
李玉琴
姚雷
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石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司
杭州英创医药科技有限公司
石药集团欧意药业有限公司
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4985—Pyrazines or piperazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00

Definitions

  • the invention belongs to the field of medicinal chemistry, and specifically relates to crystal forms of FGFR4 selective inhibitors and their applications.
  • FGFR fibroblast growth factor receptor
  • FGFR1 FGFR2, FGFR3 and FGFR4
  • FGFR4 FGFR activating mutations can not only promote the proliferation of malignant tumor cells and inhibit apoptosis, but also play an important role in tumor angiogenesis, tumor invasion and metastasis.
  • FGFR is highly expressed in non-small cell lung cancer, liver cancer, breast cancer, bladder cancer and many other cancers. Therefore, FGFR small molecule kinase inhibitors are a promising treatment for patients with tumors that express abnormal FGFR. , the development of selective FGFR small molecule inhibitors has received increasing attention.
  • Liver cancer is one of the malignant tumors with the highest morbidity and mortality. There are 466,000 new liver cancer cases and 422,000 liver cancer deaths in China every year. Studies have shown that the FGFR4-FGF19 signaling system is closely related to hepatocellular carcinomas (HCCs). FGFR4 is a FGFR subtype highly expressed in human liver cells. Multiple FGFR4 mutations have been found in liver cancer patients. Selectively inhibiting FGFR4 without inhibiting other subtypes FGFR1, FGFR2, and FGFR3 can avoid certain toxicity and is likely to become an important target for the treatment of liver cancer. Clinical studies have shown that FGFR inhibitors can be used to treat various cancers, but there is an urgent need to develop selective FGFR4 inhibitors for the treatment of various tumors, especially liver cancer.
  • HCCs hepatocellular carcinomas
  • Example 5 discloses a compound with the following structure:
  • the present invention provides a compound of formula B in crystalline form:
  • the crystalline form of the compound of Formula B is anhydrous.
  • the present invention provides a crystal form I of the compound of formula B, wherein: the crystal form I of the compound of formula B is such that Using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed in 2 ⁇ angle has characteristic peaks at 7.4 ⁇ 0.2° and 25.0 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline Form I of the compound of Formula B using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at 2 ⁇ angle is 7.4 ⁇ 0.2°, 15.9 ⁇ 0.2°, 17.4 ⁇ 0.2°, 20.9 ⁇ 0.2 There are characteristic peaks at 25.0 ⁇ 0.2°.
  • the crystal form I of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at 2 ⁇ angle is at 7.4 ⁇ 0.2°, 9.8 ⁇ 0.2°, 15.9 ⁇ 0.2°, 17.4 ⁇ There are characteristic peaks at 0.2°, 20.9 ⁇ 0.2°, and 25.0 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form I of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at 2 ⁇ angle is 7.4 ⁇ 0.2°, 9.8 ⁇ 0.2°, 15.9 ⁇ 0.2°, 17.4 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2°, 20.9 ⁇ 0.2°, 22.4 ⁇ 0.2°, and 25.0 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form I of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction in 2 ⁇ angles is 7.4 ⁇ 0.2°, 9.8 ⁇ 0.2°, 11.7 ⁇ 0.2°, 12.0 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2°, 14.6 ⁇ 0.2°, 15.9 ⁇ 0.2°, 17.4 ⁇ 0.2°, 20.9 ⁇ 0.2°, 22.4 ⁇ 0.2°, and 25.0 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form I of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction in 2 ⁇ angles is 7.4 ⁇ 0.2°, 9.8 ⁇ 0.2°, 11.7 ⁇ 0.2°, 12.0 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2°, 14.6 ⁇ 0.2°, 15.9 ⁇ 0.2°, 17.4 ⁇ 0.2°, 19.7 ⁇ 0.2°, 20.9 ⁇ 0.2°, 22.4 ⁇ 0.2°, 23.6 ⁇ 0.2°, and 25.0 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form I of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction in 2 ⁇ angles is 7.4 ⁇ 0.2°, 9.8 ⁇ 0.2°, 11.7 ⁇ 0.2°, 12.0 ⁇ 0.2°, 14.6 ⁇ 0.2°, 15.5 ⁇ 0.2°, 15.9 ⁇ 0.2°, 17.4 ⁇ 0.2°, 18.8 ⁇ 0.2°, 19.7 ⁇ 0.2°, 20.9 ⁇ 0.2°, 22.0 ⁇ 0.2°, 22.4 ⁇ 0.2°, 23.6 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2°, 25.0 ⁇ 0.2°, and 27.8 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form I of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction in 2 ⁇ angles is 7.4 ⁇ 0.2°, 9.8 ⁇ 0.2°, 11.7 ⁇ 0.2°, 12.0 ⁇ 0.2°, 14.6 ⁇ 0.2°, 15.5 ⁇ 0.2°, 15.9 ⁇ 0.2°, 17.4 ⁇ 0.2°, 18.5 ⁇ 0.2°, 18.8 ⁇ 0.2°, 19.7 ⁇ 0.2°, 20.9 ⁇ 0.2°, 22.0 ⁇ 0.2°, 22.4 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2°, 23.6 ⁇ 0.2°, 25.0 ⁇ 0.2°, and 27.8 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form I of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction in 2 ⁇ angles is 7.4 ⁇ 0.2°, 9.8 ⁇ 0.2°, 11.7 ⁇ 0.2°, 12.0 ⁇ 0.2°, 14.6 ⁇ 0.2°, 15.5 ⁇ 0.2°, 15.9 ⁇ 0.2°, 17.4 ⁇ 0.2°, 18.8 ⁇ 0.2°, 19.7 ⁇ 0.2°, 20.9 ⁇ 0.2°, 22.0 ⁇ 0.2°, 22.4 ⁇ 0.2°, 23.6 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2°, 25.0 ⁇ 0.2°, 26.0 ⁇ 0.2°, and 27.8 ⁇ 0.2°.
  • Form I of the compound of Formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction in 2 ⁇ angles is at 7.4°, 9.8°, 11.7°, 12.0°, 14.6, 15.5° There are characteristic peaks at , 15.9°, 17.4°, 18.5°, 18.8°, 19.6°, 20.9°, 22.0°, 22.4°, 23.6°, 24.8°, and 27.7°.
  • Form I of the compound of Formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, expressed in 2 ⁇ angles X-ray powder diffraction at 7.5°, 9.9°, 11.8°, 12.1°, 14.7°, 15.6°, 16.1°, 17.6°, 19.0°, 19.9°, 21.1°, 22.2°, 22.6°, 23.8°, 25.2° There are characteristic peaks at , 26.0° and 28.0°.
  • Form I of the compound of Formula B has an X-ray powder diffraction pattern (XRPD) substantially as shown in Figure 1 or Figure 3 using Cu-K ⁇ radiation.
  • XRPD X-ray powder diffraction pattern
  • the present invention provides a crystal form II of the compound of formula B, wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at a 2 ⁇ angle has characteristic peaks at 7.6 ⁇ 0.2° and 14.0 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form II of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at 2 ⁇ angle is 7.6 ⁇ 0.2°, 14.0 ⁇ 0.2°, 15.2 ⁇ 0.2°, 20.4 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2° and 24.8 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form II of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at 2 ⁇ angle is at 7.6 ⁇ 0.2°, 9.5 ⁇ 0.2°, 14.0 ⁇ 0.2°, 15.2 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2°, 16.3 ⁇ 0.2°, 20.4 ⁇ 0.2°, 21.6 ⁇ 0.2°, 21.9 ⁇ 0.2°, 23.2 ⁇ 0.2°, 23.5 ⁇ 0.2°, and 24.8 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form II of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at 2 ⁇ angle is 7.6 ⁇ 0.2°, 9.5 ⁇ 0.2°, 10.2 ⁇ 0.2°, 12.7 ⁇ 0.2°, 14.0 ⁇ 0.2°, 15.2 ⁇ 0.2°, 16.3 ⁇ 0.2°, 16.8 ⁇ 0.2°, 18.3 ⁇ 0.2°, 20.4 ⁇ 0.2°, 21.6 ⁇ 0.2°, 21.9 ⁇ 0.2°, 23.2 ⁇ 0.2°, 23.5 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2° and 24.8 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form II of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at 2 ⁇ angle is 7.6 ⁇ 0.2°, 9.5 ⁇ 0.2°, 10.2 ⁇ 0.2°, 12.7 ⁇ 0.2°, 14.0 ⁇ 0.2°, 15.2 ⁇ 0.2°, 16.3 ⁇ 0.2°, 16.8 ⁇ 0.2°, 17.9 ⁇ 0.2°, 18.3 ⁇ 0.2°, 20.4 ⁇ 0.2°, 21.6 ⁇ 0.2°, 21.9 ⁇ 0.2°, 23.2 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2°, 23.5 ⁇ 0.2°, 24.8 ⁇ 0.2°, 26.8 ⁇ 0.2°, 27.7 ⁇ 0.2°, and 28.2 ⁇ 0.2°.
  • Form II of the compound of Formula B has an X-ray powder diffraction pattern (XRPD) substantially as shown in Figure 4 using Cu-K ⁇ radiation.
  • XRPD X-ray powder diffraction pattern
  • the present invention provides a crystal form III of the compound of formula B, wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction expressed at an angle of 2 ⁇ has a characteristic peak at 4.4 ⁇ 0.2°.
  • the crystalline form III of the compound of formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, X-ray powder diffraction in 2 ⁇ angles is 4.4 ⁇ 0.2°, 10.4 ⁇ 0.2°, 13.4 ⁇ 0.2°, 25.3 There are characteristic peaks at ⁇ 0.2° and 25.8 ⁇ 0.2°.
  • Form III of the compound of Formula B wherein: using Cu-K ⁇ radiation, expressed in 2 ⁇ angles
  • Form III of the compound of Formula B has an X-ray powder diffraction pattern (XRPD) substantially as shown in Figure 5 using Cu-K ⁇ radiation.
  • XRPD X-ray powder diffraction pattern
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition, which contains the aforementioned compound of formula B in crystalline form, or one or more of the crystal form I, crystal form II, and crystal form III of the aforementioned compound of formula B. mixture.
  • the pharmaceutical composition comprises a crystalline form of the compound of Formula B, or a mixture of one or more of the crystalline Form I, the crystalline Form II, the crystalline Form III of the aforementioned compound of Formula B, and a mixture containing a one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the present invention also provides the aforementioned crystalline form of the compound of formula B, or the aforementioned crystal form I, crystal form II, crystal form III or the aforementioned pharmaceutical composition for the preparation and treatment of diseases related to FGFR4 activity or expression. pharmaceutical applications.
  • the present invention also provides the aforementioned crystalline form of the compound of formula B, or the crystal form I, crystal form II, crystal form III or the aforementioned pharmaceutical composition of the aforementioned compound of formula B, which is used for treating patients with FGFR4 activity or expression-related diseases.
  • the present invention also provides a method for treating diseases related to FGFR4 activity or expression, which includes administering to a subject in need thereof an effective amount of the aforementioned crystalline form of the compound of formula B, or a compound of the aforementioned compound of formula B. Crystal Form I, Crystal Form II, Crystal Form III or the aforementioned pharmaceutical composition.
  • the disease associated with FGFR4 activity or expression is selected from cancer, such as lung cancer, bladder cancer, breast cancer, gastric cancer, liver cancer, salivary gland sarcoma, ovarian cancer, prostate cancer, cervical cancer, epithelial cell cancer, Multiple myeloma, pancreatic cancer, lymphoma, chronic myelogenous leukemia, lymphocytic leukemia, cutaneous T-cell lymphoma, etc.; the lung cancer is preferably non-small cell lung cancer.
  • cancer such as lung cancer, bladder cancer, breast cancer, gastric cancer, liver cancer, salivary gland sarcoma, ovarian cancer, prostate cancer, cervical cancer, epithelial cell cancer, Multiple myeloma, pancreatic cancer, lymphoma, chronic myelogenous leukemia, lymphocytic leukemia, cutaneous T-cell lymphoma, etc.
  • the lung cancer is preferably non-small cell lung cancer.
  • the disease associated with FGFR4 activity or expression is selected from bone-related diseases, such as osteoplasia, achondroplasia, dwarfism, Crouzon syndrome, and the like.
  • the disease associated with FGFR4 activity or expression is selected from T cell-mediated inflammatory and autoimmune diseases, such as rheumatoid arthritis, collagen II arthritis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, Psoriasis, juvenile diabetes, Sjogren’s syndrome, thyroid disease, sarcoidosis, inflammatory bowel disease, celiac disease, and more.
  • T cell-mediated inflammatory and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, collagen II arthritis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, Psoriasis, juvenile diabetes, Sjogren’s syndrome, thyroid disease, sarcoidosis, inflammatory bowel disease, celiac disease, and more.
  • the drug is administered to a "subject” or “patient” in an effective dose.
  • subject and patient include all members of the animal kingdom, including, but not limited to, mammals (eg, mice, rats, cats, monkeys, dogs, horses, pigs, etc.) and humans.
  • the crystalline form of the compound of formula B mentioned in this application includes the anhydrous and solvent-free form, hydrate form, solvate form and co-crystal form of the compound of formula B.
  • the term “substantially” or “substantially as shown” refers to a crystalline form that is substantially pure, with at least 50%, or at least 60%, of the powder X-ray diffraction pattern. , or at least 70%, or at least 80%, or at least 90%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% of the peaks appear in the given spectrum. Furthermore, when the content of a certain crystalline form in a product gradually decreases, some of the diffraction peaks attributed to that crystalline form in its X-ray powder diffraction pattern may become smaller due to the detection sensitivity of the instrument.
  • tumor includes benign tumors, malignant tumors and borderline tumors, with malignant tumors collectively referred to as cancer.
  • prevention means that when used for a disease or condition (e.g., cancer), the compound or drug (e.g., a combination product as claimed herein) is less effective than in a subject who is not administered the compound or drug (e.g., a combination product as claimed herein).
  • a drug reduces the frequency or delays the onset of symptoms of a medical condition in a subject.
  • treatment means alleviating, alleviating or ameliorating the symptoms of a disease or condition, ameliorating underlying metabolically induced symptoms, inhibiting a disease or condition, e.g. preventing the progression of a disease or condition, ameliorating a disease or condition, causing a disease or resolution of a condition, alleviation of a condition caused by a disease or condition, or prevention of symptoms of a disease or condition.
  • pharmaceutically acceptable carrier or “pharmaceutically acceptable carrier” or “pharmaceutically acceptable excipient” refers to those carriers or excipients that have no obvious irritating effect on the organism and do not impair the biological activity and performance of the active compound. .
  • the present invention provides crystalline Form B compounds.
  • the inventor unexpectedly discovered that the compound of formula B has better pharmacokinetic effects than its enantiomeric isomers or racemates, and its crystalline form, especially the preferred crystalline form, has stable quality and thermodynamic stability. Easy to prepare medicine.
  • Figure 1 is the XRPD spectrum of crystal form I of the compound of formula B.
  • Figure 2 is a single crystal PLM diagram of Form I of the compound of formula B.
  • Figure 3 is a calculated XRPD spectrum of a single crystal of Form I of the compound of formula B.
  • Figure 4 is the XRPD spectrum of crystal form II of the compound of formula B.
  • Figure 5 is the XRPD spectrum of crystal form III of the compound of formula B.
  • the detection conditions of the spectra are as follows:
  • the program performs data restoration and empirical absorption correction, and uses the SHELXT program to analyze the result using the dual dual space algorithm.
  • the coordinates of all non-hydrogen atoms are determined based on the difference Fourier diagram, and the hydrogen atoms are relatively fixed to their parent atoms.
  • the obtained crystal form I shows good crystallinity, and its XRPD characterization spectrum is basically as shown in Figure 1, and the characterization data is shown in Table 2.
  • the sample hardly absorbs moisture, and the weight gain after moisture absorption is about 0.24% under the condition of 0-90% RH, and the crystal form of the sample does not change after the DVS test.
  • the compound of Formula B (20 mg) obtained in Preparation Example 1 was dissolved in different solvents to prepare a solution of 4-10 mg/mL.
  • the anti-solvent was slowly added at room temperature or 60°C until a large amount of solid precipitated.
  • the obtained solid was characterized by XRPD and found to be crystalline form II.
  • Example 1 The crystal form I sample (3-5 mg) obtained in Example 1 was ground in a solvent, or the solid was ground directly for 5 minutes. The remaining solids were collected and characterized by XRPD, and the results are shown in Table 15.
  • Test drug compound of formula B obtained in Preparation Example 1
  • Caliper mobility shift assay was used to measure FGFR4 protein kinase activity.
  • the compound was dissolved in DMSO and diluted with kinase buffer, and 5 ⁇ L of the compound (10% DMSO) at 5 times the final reaction concentration was added to a 384-well plate.
  • DMEM+2mM Glutamine+10% FBS medium to adjust the Huh7 cell suspension to 5x10e4/ml or 2x10e4/ml.
  • the final treatment concentrations of each compound were 3000nM, 1000nM, 333.3nM, 111.1nM, 37.04nM, 12.35nM, 4.12nM, and 1.37nM, respectively.
  • the final concentration of DMSO in each well was 0.5%. Place in a 37°C, 5% CO2 incubator for 72 or 168 hours. After 72 or 168 hours of drug treatment, according to the CTG operating instructions, add 100 ⁇ L of CTG solution that has been melted and equilibrated to room temperature per well, mix with a microplate shaker for 2 minutes, let it stand at room temperature for 10 minutes, and then measure with an EnSpire plate reader. Chemiluminescence signal value.
  • V sample is the reading of the drug treatment group
  • Vvehicle control is the average value of the solvent control group
  • V blank is the average value of the blank control well.
  • Test Example 6 Study on pharmacokinetics of compound of formula B in rats
  • Test drug compound of formula B obtained in Preparation Example 1.
  • LC-MS/MS-13 TQ5500, Triple quad
  • operating software is Xcalibur2.0.7 (Thermo Fisher Scientific, USA)
  • LC-10ADvp Shimadzu Corporation, Japan liquid chromatography system
  • Shimadzu LC-20AD liquid phase Pump Shimadzu CBM-20A system controller
  • Shimadzu CTO-20A column oven Shimadzu CTO-20A column oven
  • SIL-20AC automatic sampler Shiadzu Corporation, Japan
  • Chromatographic column Agilent Zorbax SB-CN 3.5u 100*2.1mm; column temperature 40°C; mobile phase A is 0.1% formic acid aqueous solution, mobile phase B is 0.1% formic acid in acetonitrile solution, flow rate is 0.60 ml/min, gradient washing is used Dehydration, 0 to 0.5 min, increase from 1% mobile phase B to 90% mobile phase B, 0.5 to 1.2 min, maintain 90% B, from 1.21 min, change to 1% mobile phase B, 1.60 min Stop elution.
  • mice 6 male SD rats were provided by Shanghai Sipur-Bika Experimental Animal Co., Ltd. The weight range is 180-220 grams. After purchase, it is raised in the laboratory of the Experimental Animal Center for 2 days before use. Food is fasted 10-14 hours before administration and 4 hours after administration. Drinking water is free during the test. The rats were randomly divided into two groups, with 3 rats in each group, one group was used for intravenous injection, and the other group was used for gastric administration.
  • Preparation of solution for intragastric administration Precisely weigh the compound of formula B (4.85 mg), add a mixed aqueous solution (9.70 ml) containing 0.5% methylcellulose and 0.4% Tween-80 to each, and ultrasonic at room temperature to prepare 0.5 mg. /ml of suspension.
  • Preparation of intravenous injection solution Precisely weigh the compound of formula B (2.79 mg), add DMSO (21 ⁇ l), PEG200 (2.79 ml) and physiological saline (4.164 ml) to prepare a 0.4 mg/ml solution.
  • blood was collected at approximately 0.25 hours before administration and at 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, and 24 hours after administration; Collect blood at 0.25 hours and 0.083, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 8, 12, and 24 hours after administration. Collect 0.25mL/time point of blood via jugular vein or other venipuncture, EDTA-K2 or EDTA-K3 Anticoagulate and place on ice after collection. After the blood samples are collected, the plasma is separated by centrifugation (centrifugation conditions: 6800g/min, 6 minutes, 2-8°C). The collected plasma samples were stored in a -80°C refrigerator for testing before analysis.
  • the compound of formula B is accurately weighed and prepared into different concentrations, and quantitative analysis is performed on a mass spectrometer to establish a standard curve. Then the concentration of the compound of formula B in the plasma is tested to obtain the concentration of the compound of formula B at different time points. All measurement data are collected and processed by relevant software, and pharmacokinetic parameters are calculated using the statistical moment method (mainly including kinetic parameters T max , T 1/2 , C max , AUC 0-t , etc.).
  • the AUC 0-t of the compound of Formula B after intravenous injection at a dose of 2.0 mg/kg was 3978.65h*ng/mL, the half-life was 1.88 hours, the volume distribution was 0.883L/kg, and the clearance rate was 517.78mL/h/kg. ;
  • the AUC 0-t is 4835.41h*ng/mL, reaching the peak plasma concentration after 2.67 hours, C max is 1218.83ng/mL, the half-life is 1.95 hours, and the absolute bioavailability is 48.61 %.
  • Test Example 7 Study on pharmacokinetics of compound of formula C in rats
  • Test drug compound of formula C obtained in Preparation Example 2.
  • Test Example 6 The same method as in Test Example 6 was used to study the pharmacokinetics of the compound of formula C in rats.
  • the AUC 0-t was 2553.74h*ng/mL, the half-life was 1.23 hours, the volume distribution was 0.973L/kg, and the clearance rate was 803.23mL/h/kg.
  • the AUC 0-t is 2254.69h*ng/mL, reaching the peak plasma concentration after 2.5 hours, C max is 596.53ng/mL, the half-life is 1.24 hours, and the absolute bioavailability is 35.32 %.
  • the compound of formula B of the present invention has excellent FGFR4 kinase inhibitory activity and Huh-7 tumor cell proliferation inhibitory activity. Compared with its enantiomers or racemates, the pharmacokinetic effect is better, and its crystalline
  • the form, especially the preferred crystal form has good solubility, stable quality, thermodynamic stability, and is easy to be made into medicine.

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Abstract

本发明涉及FGFR4抑制剂的晶型及应用。本发明提供了一种结晶形式的式B化合物，本发明的式B化合物具有优良的FGFR4激酶抑制活性和Huh-7肿瘤细胞增殖抑制，相对于其对映光学异构体或消旋体，药代动力学效果更好，其结晶形式尤其是其优选晶型溶解性好、质量稳定、热力学稳定，易于成药。

Description

FGFR4抑制剂的晶型及应用 技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及FGFR4选择性抑制剂的晶型及其应用。
背景技术
FGFR(成纤维细胞生长因子受体)是一种受体型蛋白酪氨酸激酶，共有4种受体FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，对维持细胞的生长、增殖、凋亡、迁移等起关键作用。FGFR激活突变不仅可以促使恶性肿瘤细胞增殖和抑制凋亡，还能在肿瘤新生血管生成、肿瘤的侵袭与转移等过程中也发挥重要作用。在非小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌及其它多种癌症等都存在FGFR的高表达，因此对于表达FGFR异常的肿瘤患者，FGFR小分子激酶抑制剂是一种很有前途的治疗方法，选择性FGFR小分子抑制剂的研发受到越来越多的关注。
肝癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，在中国每年就有46.6万新发肝癌病例和42.2万肝癌死亡病例。研究表明，FGFR4-FGF19信号系统与肝细胞癌(HCCs)紧密相关，FGFR4是在人的肝细胞高度表达的FGFR亚型，在肝癌病人中发现多种FGFR4的变异。选择性抑制FGFR4而不抑制其他亚型FGFR1、FGFR2、FGFR3可以避免一定的毒性，很有可能成为治疗肝癌一个重要的靶点。临床研究已经表明FGFR抑制剂可以用于多种癌症的治疗，但迫切需求开发选择性FGFR4抑制剂用于多种肿瘤的治疗，尤其是肝癌的治疗。
中国专利CN108948004A公开了如下式(I)所示的FGFR4抑制剂：
其中实施例5公开了如下结构的化合物：
发明内容
式A化合物存在两个异构体：S-异构体(如下式B所示)和R-异构体(如下式C所示)。本发明人发现，相对于式A化合物或者式C化合物，式B化合物具有更好的药代动力学性质，更利于成药。在此基础上，发明人对式B化合物晶型进行了系统研究，以发现可用于后续开发的稳定晶型。
为解决上述问题，第一方面，本发明提供一种结晶形式的式B化合物:
在一些实施方案中，所述结晶形式的式B化合物，其为无水物。
第二方面，本发明提供一种式B化合物的晶型I，其中：所述式B化合物的晶型I，使 用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、20.9±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰。
一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、20.9±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、20.9±0.2°、22.4±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、11.7±0.2°、12.0±0.2°、14.6±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、20.9±0.2°、22.4±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、11.7±0.2°、12.0±0.2°、14.6±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、19.7±0.2°、20.9±0.2°、22.4±0.2°、23.6±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、11.7±0.2°、12.0±0.2°、14.6±0.2°、15.5±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、18.8±0.2°、19.7±0.2°、20.9±0.2°、22.0±0.2°、22.4±0.2°、23.6±0.2°、25.0±0.2°、27.8±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、11.7±0.2°、12.0±0.2°、14.6±0.2°、15.5±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、18.5±0.2°、18.8±0.2°、19.7±0.2°、20.9±0.2°、22.0±0.2°、22.4±0.2°、23.6±0.2°、25.0±0.2°、27.8±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、11.7±0.2°、12.0±0.2°、14.6±0.2°、15.5±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、18.8±0.2°、19.7±0.2°、20.9±0.2°、22.0±0.2°、22.4±0.2°、23.6±0.2°、25.0±0.2°、26.0±0.2°、27.8±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4°、9.8°、11.7°、12.0°、14.6、15.5°、15.9°、17.4°、18.5°、18.8°、19.6°、20.9°、22.0°、22.4°、23.6°、24.8°、27.7°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示 的X射线粉末衍射在7.5°、9.9°、11.8°、12.1°、14.7°、15.6°、16.1°、17.6°、19.0°、19.9°、21.1°、22.2°、22.6°、23.8°、25.2°、26.0°、28.0°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，使用Cu-Kα辐射，具有基本上如图1或图3所示的X射线粉末衍射谱图(XRPD)。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型I，其单晶使用CuKα辐射，属单斜晶系，P21空间群，其单胞参数为：α＝90°,β＝117.360(2)°,γ＝90°,}。
第三方面，本发明提供一种式B化合物的晶型II，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、14.0±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型II，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、14.0±0.2°、15.2±0.2°、20.4±0.2°、24.8±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型II，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、9.5±0.2°、14.0±0.2°、15.2±0.2°、16.3±0.2°、20.4±0.2°、21.6±0.2°、21.9±0.2°、23.2±0.2°、23.5±0.2°、24.8±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型II，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、9.5±0.2°、10.2±0.2°、12.7±0.2°、14.0±0.2°、15.2±0.2°、16.3±0.2°、16.8±0.2°、18.3±0.2°、20.4±0.2°、21.6±0.2°、21.9±0.2°、23.2±0.2°、23.5±0.2°、24.8±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型II，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、9.5±0.2°、10.2±0.2°、12.7±0.2°、14.0±0.2°、15.2±0.2°、16.3±0.2°、16.8±0.2°、17.9±0.2°、18.3±0.2°、20.4±0.2°、21.6±0.2°、21.9±0.2°、23.2±0.2°、23.5±0.2°、24.8±0.2°、26.8±0.2°、27.7±0.2°、28.2±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型II，使用Cu-Kα辐射，具有基本上如图4所示的X射线粉末衍射谱图(XRPD)。
第四方面，本发明提供一种式B化合物的晶型III，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在4.4±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型III，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在4.4±0.2°、10.4±0.2°、13.4±0.2°、25.3±0.2°、25.8±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型III，其中：使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表 示的X射线粉末衍射在4.4±0.2°、10.4±0.2°、13.4±0.2°、14.0±0.2°、18.1±0.2°、18.5±0.2°、20.5±0.2°、24.3±0.2°、25.3±0.2°、25.8±0.2°处具有特征峰。
在一些实施方案中，所述式B化合物的晶型III，使用Cu-Kα辐射，具有基本上如图5所示的X射线粉末衍射谱图(XRPD)。
第五方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含前述结晶形式的式B化合物，或包含前述式B化合物的晶型I、晶型II、晶型III中的一种或几种的混合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含结晶形式的式B化合物，或包含前述式B化合物的晶型I、晶型II、晶型III中的一种或几种的混合物，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
第六方面，本发明还提供了前述结晶形式的式B化合物、或前述式B化合物的晶型I、晶型II、晶型III或前述药物组合物在制备治疗与FGFR4活性或表达相关的疾病的药物上的应用。
在一些实施方案中，本发明还提供了前述结晶形式的式B化合物、或前述式B化合物的晶型I、晶型II、晶型III或前述药物组合物，其用于治疗与FGFR4活性或表达相关的疾病。
在一些实施方案中，本发明还提供了治疗与FGFR4活性或表达相关的疾病的方法，其包括对有需要的受试者施用有效量的前述结晶形式的式B化合物、或前述式B化合物的晶型I、晶型II、晶型III或前述药物组合物。
在一些实施方案中，所述的与FGFR4活性或表达相关的疾病选自癌症，例如肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、唾液腺肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、上皮细胞癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、淋巴瘤、慢性髓性白血病、淋巴细胞性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤等；所述肺癌优选为非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，所述的与FGFR4活性或表达相关的疾病选自与骨骼相关的疾病，例如骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、克鲁宗综合征等。
在一些实施方案中，所述的与FGFR4活性或表达相关的疾病选自T细胞调节的炎症和自身免疫疾病，例如类风湿关节炎、胶原II关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、银屑病、青少年型糖尿病、干燥综合征、甲状腺疾病、结节病、炎性肠病、乳糜泻等。
所述药物以有效剂量施用于“受试者”或“患者”。所述的“受试者”和“患者”包括动物界的所有成员，包括但不限于，哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、猫、猴子、狗、马、猪等)和人。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。
本申请提及的结晶形式的式B化合物，包括式B化合物的无水且无溶剂形式、水合物形式、溶剂合物形式和共晶形式。
在X-射线粉末衍射图谱中，术语“基本上”或者“基本上如图所示”是指基本上纯净的某种晶型，其粉末X-射线衍射图谱中至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的峰出现在所给图谱中。进一步的，当产品中某种晶型的含量逐渐降低时，其X-射线粉末衍射图谱中的一些归属于该晶型的衍射峰可能会由于仪器的检测灵敏度的因素而变少。此外，对任何给定的晶型而言，峰的位置可能存在轻微误差，这在晶体学领域中也是公知的。例如，由于分析样品时温度的变化、样品移动或仪器的标定等，峰的位置可以移动，2θ值的测定误差有时约为±0.3°，通常约为±0.2°。因此，在确定每种晶型结构时，应该将此误差考虑在内，术语“基本上”或者“基本上如附图所示”也意图涵盖衍射峰位中的这样的差异性，是指±0.3°，优选±0.2°。
术语“肿瘤”包含良性肿瘤、恶性肿瘤和交界性肿瘤，其中恶性肿瘤又统称为癌症。
在本文使用的术语“预防”是指当用于疾病或病症(例如癌症)时，与未施用化合物或药物(例如，本申请要求保护的组合产品)的受试者相比，所述化合物或药物能降低受试者体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。
在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。
术语“可药用载体”或“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的辅料”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害活性化合物的生物活性及性能的那些载体或辅料。
本申请所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
有益效果
本发明提供结晶形式B化合物。发明人意外地发现，式B化合物相对于其对映光学异构体或消旋体具有更好的药代动力学效果，其结晶形式尤其是优选晶型质量稳定、热力学稳定， 易于成药。
附图说明
图1为式B化合物的晶型I的XRPD谱图。
图2为式B化合物的晶型I的单晶PLM图。
图3为式B化合物的晶型I的单晶计算的XRPD谱图。
图4为式B化合物的晶型II的XRPD谱图。
图5为式B化合物的晶型III的XRPD谱图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
以下实施例中，谱图的检测条件如下：
1、XRPD检测条件
仪器：德国BRUKER D8 AdvanceX射线粉末衍射仪(BRUKER GER)
条件：Cu-Kα辐射，管压40kV，管流40mA，2θ扫描范围3-40°，扫描步长为0.02°，扫描速度为0.2秒/步，样品盘为零背景样品盘。
2、动态水分吸脱附分析(DVS)
仪器：DVS Intrinsic plus(SMS,UK)。
方法：将样品置于已去皮的样品篮中，样品重量自动称量，样品在40℃/0％RH干燥直至dm/dt小于0.002％，随后降温至25℃。仪器参数如表1所示。
表1.动态水分吸脱附分析(DVS)参数表
3、单晶X射线衍射分析
仪器：Rigaku XtaLAB Synergy-DW衍射仪
方法：在180K下收集单晶X射线数据，光源为Cu Kα辐射使用CrysAlisPro
程序进行数据还原和经验吸收校正，并使用SHELXT程序采用对偶双空间算法解析该结
构。根据差值傅里叶图确定全部非氢原子的坐标，氢原子通过被相对固定在其母原子上
进行理论加氢。使用SHELXL程序，基于F2全矩阵最小二乘法完成最终结构的精修。
4、偏光显微镜分析(PLM)
仪器：ECLIPSE LV100POL偏光显微镜(尼康，日本)
方法：取少量样品置于载玻片，滴加浸油后盖上载玻片稍稍分散均匀。用4–20×物镜和
偏正光进行显微观察和拍照。
制备例1、式B化合物的制备
将化合物B-1(6g，34.5mmol)和N,N-羰基二(1,2,4-三氮唑)(17g，103.4mmol)溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(60mL)中，将混合液在室温下搅拌反应2小时，然后向其中加入化合物B-2(8.7g，24.1mmol，参照WO2017202390A1实施例10，采用S构型10a制备得到)，该反应体系在室温下搅拌过夜。HPLC监测反应完成后，反应液用10％氯化锂溶液淬灭，用乙酸乙酯萃取三遍，将有机层合并用饱和食盐水洗涤，然后无水硫酸钠干燥，浓缩后得到的粗品通过柱层析(二氯甲烷/甲醇＝25/1～20/1)得到白色固体化合物B-3(1.5g，收率11％)。
将化合物B-3(1.5g，2.7mmol)溶于四氢呋喃(30mL)中，然后在室温下向该溶液中滴加HCl(2M，水溶液)(20mL)。该反应液在室温下搅拌反应3小时。将反应液倒入适量的饱和碳酸氢钠溶液中，用二氯甲烷萃取三遍，将有机层合并后用饱和食盐水洗涤，然后无水硫酸钠干燥，浓缩后得到的粗品用柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1)分离纯化，得到式B化合物为类白色固体(0.44g，收率32％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ13.56(s,1H),10.17(s,1H),8.11(s,1H),7.85(s,1H),7.57(s,1H),5.21(s,1H),5.00(dd,J＝46.1,15.7Hz,2H),4.07–3.96(m,2H),3.45(ddd,J＝ 12.3,9.6,4.8Hz,1H),3.23(ddd,J＝16.8,10.7,6.3Hz,2H),2.98(dt,J＝12.2,4.3Hz,1H),2.91(ddd,J＝9.5,7.6,4.8Hz,1H),2.85(t,J＝6.3Hz,2H),2.79–2.69(m,1H),2.61–2.51(m,2H),2.23–2.14(m,1H),2.00–1.94(m,2H),1.94–1.69(m,3H),0.93–0.85(m,2H),0.63–0.55(m,2H).MS 515.20[M+H]+。
经XRPD测试，该固体为无定型形式。
制备例2：式C化合物的制备
参照制备例1制备方法，只是将B-2替换为R构型，得到式C化合物。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ13.56(s,1H),10.17(s,1H),8.11(s,1H),7.85(s,1H),7.57(s,1H),5.21(s,1H),5.00(dd,J＝47.8,15.7Hz,2H),4.09–3.96(m,2H),3.50–3.39(m,1H),3.30–3.14(m,2H),3.02–2.95(m,1H),2.95–2.88(m,1H),2.85(t,J＝6.2Hz,2H),2.79–2.71(m,1H),2.64–2.52(m,2H),2.25–2.15(m,1H),2.02–1.93(m,2H),1.92–1.71(m,3H),0.94–0.83(m,2H),0.64–0.55(m,2H).MS 515.16[M+H]+。
实施例1：式B化合物的晶型I的制备
将制备例1所得式B化合物(20mg)加入反应瓶中，加入二甲基亚砜3mL，60℃搅拌1小时，趁热过滤得饱和溶液。过滤所得滤液在室温条件搅拌过夜，将所得固体过滤，在50℃真空干燥12h，得式B化合物的晶型I。
所得晶型I呈现良好的结晶性，其XRPD表征谱图基本如图1所示，表征数据见表2。样品几乎不吸湿，在0-90％RH条件下吸湿增重约为0.24％，且DVS测试后的样品晶型未发生变化。
表2实施例1晶型I样品XRPD表征数据

实施例2：式B化合物的晶型I的制备
将约5mg制备例1所得式B化合物在50℃溶解于1mL的乙腈/二氯甲烷(V:V＝1:1)。过滤后，在滤液中加入极少的羟丙甲纤维素(HPMC)作为模板，将该样品瓶盖上扎孔的封口膜，置于通风橱中在室温下缓慢挥发。一天后，得到片状单晶，如图2所示。将该单晶样品用于单晶X射线衍射分析。该单晶结构属于单斜晶系的P21空间群，分子式为C27H30N8O3。每个不对称单元里有两个式B化合物分子，每个晶胞里有两个不对称单元。其单胞参数为：α＝90°,β＝117.360(2)°,γ＝90°,}。
单晶结构计算的XRPD图如图3所示，结果如表3所示，其与实施例1所得晶型I的XRPD图衍射峰位置基本一致：
表3单晶计算XRPD表征数据
实施例3至实施例21：式B化合物的晶型I的制备
(1)冷却结晶法
参照实施例1制备方法，采用下表的溶剂系统，得到式B化合物的晶型I。
表4冷却结晶法制备式B化合物的晶型I
(2)混悬打浆法
将制备例1所得式B化合物(20mg)加入反应瓶中，然后分别加入不同溶剂配置成混悬液。将所有混悬液在室温或50℃条件下搅拌3天，所得固体经过滤后进行XRPD表征，为晶型I。
表5悬浮打浆法制备式B化合物的晶型I
实施例22：式B化合物的晶型II的制备
将制备例1所得式B化合物(20mg)加入反应瓶中，加入二氯甲烷(4mL)溶解，在室温 下缓慢加入乙腈(8mL)，有大量固体析出。将所得固体进行XRPD表征，为晶型II。其XRPD表征谱图基本如图4所示，表征数据见表6。
表6实施例22晶型II样品XRPD表征数据
实施例23至实施例32：式B化合物的晶型II的制备
参照实施例22的制备方法，将制备例1所得式B化合物(20mg)分别溶解于不同溶剂中配置成4-10mg/mL的溶液，在室温或60℃缓慢加入反溶剂至有大量固体析出。将所得固体进行XRPD表征，为晶型II。
表7晶型II的制备及结果

实施例33：式B化合物的晶型III的制备
将制备例1所得式B化合物(20mg)加入反应瓶中，加入二氯甲烷/甲醇(V:V＝2:1，3mL)，室温下搅拌30分钟后过滤，再将滤液放置于室温条件下缓慢挥发溶剂，得晶型III。其XRPD表征谱图基本如图5所示，表征数据见表8。
表8实施例33晶型III样品XRPD表征数据
对比例：式B化合物其它晶型的制备
(1)冷却结晶法
参照实施例1制备方法，采用下表的溶剂系统，进行式B化合物晶型的制备，结果如下：
表9冷却结晶法制备式B化合物其它晶型
(2)缓慢蒸发结晶
参照实施例33制备方法，采用下表的溶剂系统，进行式B化合物晶型的制备，结果如下：
表10缓慢蒸发结晶法制备式B化合物其它晶型
测试例1：竞争性悬浮实验
将实施例1得到的式B化合物的晶型I、实施例22所得的式B化合物的晶型II与实施例33得到的B化合物的晶型III样品等量(各6mg)混合，在以下溶剂中分别在室温(25℃)、高温(50℃)下，搅拌24小时、2天和7天后，剩余固体进行XRPD测试，结果见表：
表11竞争性悬浮实验结果
测试例2：溶解度测试
将实施例1得到的晶型I样品(5mg)和实施例22所得晶型II样品(5mg)加入样品瓶中，再加入1mL SGF(模拟胃液)、FaSSIF(禁食状态模拟肠液)、FeSSIF(进食状态模拟肠液)和水。所得混悬液在37℃条件下以200rpm的转速振摇24小时。过滤，所得滤液进行浓度测试，所得固体进行XRPD表征。结果见表13。
表12生物溶媒的配置过程

表13晶型I和晶型II的溶解度测试结果
测试例3：固体稳定性研究
称取实施例1得到的晶型I和实施例22所得晶型II样品各5mg置于样品瓶中，分别放置在60℃(闭口)、40℃/75％RH(开口)条件下的固态稳定性研究，于7天取样进行XRPD表征，结果如表14所示。
表14晶型I和晶型II的固体稳定性测试结果
测试例4：研磨稳定性研究
将实施例1得到的晶型I样品(3-5mg)在溶剂中研磨，或固体直接研磨5分钟。收集剩余固体并进行XRPD表征，结果如表15所示。
表15晶型I研磨稳定性测试结果

测试例5：体外药效实验
试验药物：制备例1所得式B化合物
1.FGFR4激酶活性抑制实验
采用Caliper迁移率变动检测技术(Caliper mobility shift assay)测定FGFR4蛋白激酶活性。将化合物用DMSO溶解后用激酶缓冲液稀释，在384孔板中加入5μL的5倍反应终浓度的化合物(10％DMSO)。加入10μL的2.5倍酶(FGFR4)溶液后在室温下孵育10分钟，再加入10μL的2.5倍底物(FAM-labeled peptide and ATP)溶液。28℃下孵育30-60分钟后加25μL终止液终止反应。Caliper EZ Reader II(Caliper Life Sciences)上读取转化率数据。把转化率转化成抑制率数据(％抑制率＝(max-样品转化率)/(max-min)*100)。其中max是指DMSO对照的转化率，min是指无酶活对照的转化率。以化合物浓度和抑制率为横纵坐标，绘制曲线，使用XLFit Excel Add-in version4.3.1软件拟合曲线并计算IC50。
结果表明，本发明式B化合物的FGFR4激酶活性抑制(IC50，nM)为＜5nM。
2.化合物对Huh-7肿瘤细胞增殖抑制试验
用DMEM+2mM Glutamine+10％FBS培养基将Huh7细胞悬液调整到5x10e4/毫升或2x10e4/毫升。每孔加100μL细胞悬液于96-孔细胞培养板，最终细胞浓度为5000细胞/孔(72小时)或2000细胞/孔(168小时)。以DMSO溶解待测试化合物为10毫摩尔储存液。用储存液和DMSO制备200X终浓度的化合物，并制备3X系列梯度稀释液，然后用培养基各稀释20倍。最后每株细胞每孔分别加入10μL相应的10倍溶液，每个药物浓度单孔。最终各化合物处理浓度分别为3000nM、1000nM、333.3nM、111.1nM、37.04nM、12.35nM、4.12nM、1.37nM，每孔DMSO终浓度为0.5％。置于37℃，5％CO2孵箱中培养72或168小时。药物处理72或168小时后，按照CTG操作说明，每孔加入100μL预先融化并平衡到室温的CTG溶液，用微孔板震荡器混匀2分钟，于室温放置10分钟后用EnSpire读板仪测定化学发光信号值。细胞存活率用公式：(Vsample–Vblank)/(Vvehicle control–Vblank)x100％计算。其中Vsample为药物处理组的读数，Vvehicle control为溶剂对照组的平均值，Vblank为空白对照孔的平均值。应用GraphPad Prism 5.0软件,使用非线性回归模型绘制S型剂量-存活率曲线并计算IC50值。
结果表明，本发明式B化合物的抑制Huh7肿瘤细胞增殖(IC50，nM)为＜10nM。
测试例6：式B化合物在大鼠体内的药物代谢动力学研究
试验药物：制备例1所得式B化合物。
仪器：LC-MS/MS-13(TQ5500,Triple quad)，操作软件为Xcalibur2.0.7(美国Thermo Fisher Scientific)；LC-10ADvp(日本岛津公司)液相色谱系统，岛津LC-20AD液相泵，岛津CBM-20A系统控制器，岛津CTO-20A柱温箱，SIL-20AC自动进样器(日本岛津公司)。色谱柱：Agilent Zorbax SB-CN 3.5u 100*2.1mm；柱温40℃；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液，流速为0.60毫升/分钟，采用梯度洗脱，0至0.5分钟，从1％的流动相B增至90％的流动相B，0.5至1.2分钟，维持90％的B，从1.21分钟起，改为1％的流动相B，1.60分钟停止洗脱。
动物：雄性SD大鼠6只，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。体重范围180～220克，购入后在实验动物中心实验室饲养2天后使用，给药前10-14小时及给药后4小时内禁食，试验期间自由饮水。大鼠被随机分成两组，每组3只，一组用于静脉注射，另一组用于灌胃。
灌胃给药溶液的配制：精密称量式B化合物(4.85mg)，各加入含0.5％甲基纤维素与含0.4％Tween-80混合水溶液(9.70毫升)，常温下超声，配制成0.5毫克/毫升的悬浮液。静脉注射给药溶液的配制：精密称量式B化合物(2.79毫克)，加入DMSO(21微升)、PEG200(2.79毫升)和生理盐水(4.164毫升)，配制成0.4毫克/毫升的溶液。
灌胃给药组分别于给药前约0.25小时和给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24小时取血；静注给药分别于给药前约0.25小时和给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24小时取血，经颈静脉或者其他静脉穿刺采血0.25mL/时间点，EDTA-K2或者EDTA-K3抗凝，采集后放置冰上。血液样本采集后离心分离血浆(离心条件：6800g/分钟，6分钟，2-8℃)。采集的血浆样本在分析前存放于-80℃冰箱内，供测试。
准确称量式B化合物配制成不同的浓度，在质谱上进行定量分析，从而建立起标准曲线，然后测试上述血浆里式B化合物的浓度，得出不同时间点的式B化合物的浓度。所有的测定数据由相关的软件采集并处理，采用统计矩法进行药代动学参数计算(主要包括动力学参数Tmax、T1/2、Cmax、AUC0-t等)。
结果：式B化合物按2.0mg/kg剂量静脉注射给药后AUC0-t为3978.65h*ng/mL，半衰期为1.88小时，容量分布为0.883L/kg，清除率为517.78mL/h/kg；按5mg/kg灌胃给药后AUC0-t为4835.41h*ng/mL，2.67小时后达到血药浓度峰值，Cmax为1218.83ng/mL，半衰期为1.95小时，绝对生物利用度为48.61％。
测试例7：式C化合物在大鼠体内的药物代谢动力学研究
试验药物：制备例2所得式C化合物。
采用与测试例6相同的方法对式C化合物在大鼠体内的药物代谢动力学进行研究。
结果：式C化合物按2.0mg/kg剂量静脉注射给药后AUC0-t为2553.74h*ng/mL，半衰期为1.23小时，容量分布为0.973L/kg，清除率为803.23mL/h/kg；按5mg/kg灌胃给药后AUC0-t为2254.69h*ng/mL，2.5小时后达到血药浓度峰值，Cmax为596.53ng/mL，半衰期为1.24小时，绝对生物利用度为35.32％。
综上，本发明的式B化合物具有优良的FGFR4激酶抑制活性和Huh-7肿瘤细胞增殖抑制活性，相对于其对映光学异构体或消旋体，药代动力学效果更好，其结晶形式尤其是其优选晶型溶解性好、质量稳定、热力学稳定，易于成药。

Claims (9)

  1. 一种结晶形式的式B化合物，
  2. 如权利要求1所述的结晶形式的式B化合物，其中，其为无水物。
  3. 如权利要求1或2所述的结晶形式的式B化合物，其为晶型I，其中：
    (1)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰，或
    (2)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、20.9±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰，或
    (3)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、20.9±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰，或
    (4)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、20.9±0.2°、22.4±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰，或
    (5)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、11.7±0.2°、12.0±0.2°、14.6±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、19.7±0.2°、20.9±0.2°、22.4±0.2°、23.6±0.2°、25.0±0.2°处具有特征峰，或
    (6)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.4±0.2°、9.8±0.2°、11.7±0.2°、12.0±0.2°、14.6±0.2°、15.5±0.2°、15.9±0.2°、17.4±0.2°、18.8±0.2°、19.7±0.2°、20.9±0.2°、22.0±0.2°、22.4±0.2°、23.6±0.2°、25.0±0.2°、27.8±0.2°处具有特征峰，或
    使用Cu-Kα辐射，具有基本上如图1或图3所示的X射线粉末衍射谱图。
  4. 如权利要求1或2所述的结晶形式的式B化合物，其为晶型I，其中，其单晶使用CuKα辐射，属单斜晶系，P21空间群，其单胞参数为： α＝90°,β＝117.360(2)°,γ＝90°,
  5. 如权利要求1或2所述的结晶形式的式B化合物，其为晶型II，其中：
    (1)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、14.0±0.2°处具有特征峰，或
    (2)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、14.0±0.2°、15.2±0.2°、20.4±0.2°、24.8±0.2°处具有特征峰，或
    (3)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、9.5±0.2°、14.0±0.2°、15.2±0.2°、16.3±0.2°、20.4±0.2°、21.6±0.2°、21.9±0.2°、23.2±0.2°、23.5±0.2°、24.8±0.2°处具有特征峰，或
    (4)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、9.5±0.2°、10.2±0.2°、12.7±0.2°、14.0±0.2°、15.2±0.2°、16.3±0.2°、16.8±0.2°、18.3±0.2°、20.4±0.2°、21.6±0.2°、21.9±0.2°、23.2±0.2°、23.5±0.2°、24.8±0.2°处具有特征峰，或
    (5)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在7.6±0.2°、9.5±0.2°、10.2±0.2°、12.7±0.2°、14.0±0.2°、15.2±0.2°、16.3±0.2°、16.8±0.2°、17.9±0.2°、18.3±0.2°、20.4±0.2°、21.6±0.2°、21.9±0.2°、23.2±0.2°、23.5±0.2°、24.8±0.2°、26.8±0.2°、27.7±0.2°、28.2±0.2°处具有特征峰，或
    使用Cu-Kα辐射，具有基本上如图4所示的X射线粉末衍射谱图。
  6. 如权利要求1或2所述的结晶形式的式B化合物，其为晶型III，其中：
    (1)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在4.4±0.2°处具有特征峰，或
    (2)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在4.4±0.2°、10.4±0.2°、13.4±0.2°、25.3±0.2°、25.8±0.2°处具有特征峰，或
    (3)使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射在4.4±0.2°、10.4±0.2°、13.4±0.2°、14.0±0.2°、18.1±0.2°、18.5±0.2°、20.5±0.2°、24.3±0.2°、25.3±0.2°、25.8±0.2°处具有特征峰，或
    使用Cu-Kα辐射，具有基本上如图5所示的X射线粉末衍射谱图。
  7. 一种药物组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的结晶形式的式B化合物或式B化合物的晶型I、晶型II、晶型III中的一种或几种的混合物，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体。
  8. 权利要求1-6任一项所述的结晶形式的式B化合物或权利要求7所述的药物组合物在制备用于治疗与FGFR4活性或表达相关的疾病的药物上的用途。
  9. 如权利要求8所述的用途，其中，所述与FGFR4活性或表达相关的疾病选自癌症， 例如肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、唾液腺肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、上皮细胞癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、淋巴瘤、慢性髓性白血病、淋巴细胞性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤；优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌；或
    所述的与FGFR4活性或表达相关的疾病选自与骨骼相关的疾病，例如骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、克鲁宗综合征；或
    所述的与FGFR4活性或表达相关的疾病选自T细胞调节的炎症和自身免疫疾病，例如类风湿关节炎、胶原II关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、银屑病、青少年型糖尿病、干燥综合征、甲状腺疾病、结节病、炎性肠病、乳糜泻。
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