KR102394934B1 - Akt 억제제로서의 염 형태 및 이의 결정 형태 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Akt 억제제로서의 염 형태 및 이의 결정 형태, 구체적으로는 하기 식 (I)의 화합물의 염 형태 및 결정 형태에 관한 것이다:

Description

Akt 억제제로서의 염 형태 및 이의 결정 형태
본 발명은 Akt 억제제로서의 염 형태 및 그의 결정 형태에 관한 것이며, 구체적으로 식 (I)의 화합물의 염 형태 및 이의 결정 형태에 관한 것이며, 또한 종양, 당뇨병 및 류마티스 관절염 치료용 약물에서의 상기 염 형태 및 결정 형태의 용도를 더 포함한다.
관련 발명의 교차 인용
본 발명은 하기 건에 대한 우선권을 요구한다:
CN201711331448.1， 출원일: 2017년 12월 13일.
Akt는 단백질 키나제 B (protein kinase B, PKB)라고도 불리우며, 일종의 분자량이 약 60 kDa인 세린/트레오닌 단백질 키나제로, 여러개의 신호 전달 경로의 중요한 교차점에 있으며, 사이토카인, 성장인자 및 암 유전자 Ras에 의해 활성화 되는 세포 생존 신호를 조절할 수 있으며, 진핵 생물의 조절 네트워크에 보편적으로 존재한다. Akt 신호 전달 경로는 악성 종양, 당뇨병, 류마티스 관절염 등과 같은 다양한 질병의 발생 및 발달과 밀접히 관련되어 있기 때문에 갈수록 주목을 받고 있다. 최근 몇 년간의 끊임없는 심층 연구는 사람들로 하여금 Akt의 생물학적 역할에 대하여 더 깊이 이해하게 하였으며, Akt 신호 경로의 조절 메커니즘 연구에서 많은 획기적인 발전을 이루게 하였고 이의 인류의 일부 질병 중에서 발휘하는 구체적인 작용 및 분자 조절 메커니즘이 점차 명확해지고 있다.
Akt는 N말단 조절 영역, 중간 효소 활성 영역, C말단 조절 영역 및 PH 영역과 키나제 활성 영역을 연결하는 힌지 영역 네 부분으로 구성된다. N말단 조절 영역은 하나의 혈소판-백혈구 c키나제 상동성 영역, 즉 PH 영역을 가지며, 이의 신호 전달 과정에서의 정확한 메커니즘은 정확히 밝혀지지 않았고； 중간 효소 활성 영역은 촉매 세린/트레오닌 잔기 인산화 활성을 가지며, 그중 가변 펩타이드 루프(T 루프)에 위치한 Thr308 부위의 인산화는 Akt 활성화에 반드시 필요하고； C 말단에는 프롤린이 풍부한 소수성 도메인(HM)이 있으며, 이는 Akt의 완전 활성화에 필요한 두 번째 인산화 부위인 Ser473을 포함한다. 최근, 그 각각의 도메인에 대응되는 결정 형태의 구조가 잇따라 해석이 되었고, 관건적인 인산화 부위, ATP 결합 부위 및 단백질 기질 결합 부위에 대하여서도 더 깊이 인식이 되었으며, Akt / PKB 특이성 소 분자 억제제의 개발에 기초를 닦아놓았다.
지금까지 포유 동물에서 적어도 세가지의 Akt 서브 타입, 즉 Aktl (PKBα), Akt2 (PKBβ) 및 Akt3 (PKBγ)이 발견되었으며, 이들은 각각 염색체 14q32, 19q13 및 1q43 상에 위치한 세개의 부동한 유전자로 코딩되며, 85%의 서열 상동성을 가지며, 같은 AGC 단백질 키나제 패밀리에 속한다. 마우스 배아 섬유 아세포에 대한 연구에서, 상이한 Akt 서브 타입 결핍 주는 결과적으로 상이한 표현형을 초래함을 발견하였다: Akt1 결핍은 태반 영양 실조, 성장 지연 및 체중 감소로 나타나고, Akt2 결핍은 인슐린 및 혈당의 이상으로 나타나며, Akt3 결핍은 대뇌 수축으로 나타난다. 인류 질병에서의 3 가지 Akt 서브 타입의 발현 및 효과 또한 현저한 차이가 있다.
Akt는 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 세포간기질 등과 같은 여러가지 세포 내 물질에 의해 활성화 될 수 있다. Akt는 PI3K/Akt 경로의 중심환절에 있으며 PI3K의 직접적인 표적 유전자이다. 수많은 사이토카인, 성장인자 및 물리적 자극은 모두 PI3K를 활성화시킴으로써 Akt를 인산화시킬 수 있다. 일반적으로, Akt 인산화는 PI3K 활성을 평가하는 지표로 사용될 수 있다.
Akt의 생리 기능에 대한 연구는 기질의 발견과 분리 할 수 없다. 현재까지 100 여가지 Akt 기질이 발견되었다. Akt의 3가지 서브 타입 및 다양화 된 기질은 이가 여러가지 기능을 발휘하는 구조적 기초이다. 활성화 된 Akt는 다양한 신호 경로를 통해 하류의 일련의 작동체 분자의 활성화 상태에 영향을 미치며, 세포내에서 아포토 시스를 억제하고 증식을 촉진시키는 등과 같은 생물학적 효과를 발휘한다.
Akt 경로는 많은 신호 경로와 교차하여 복잡한 신호 네트워크를 형성한다. 특정된 상황에서, Akt 경로는 NF-κB를 활성화시켜 생존 신호를 촉진하거나 JNK/p38 아포토시스 신호를 억제 할 수 있으나, p38과 Akt 사이의 작용 방식에 대하여서는 여전히 결정적인 정의를 내리지 못하였다. 상이한 세포 유형, 상이한 세포 분화 단계 및 상이한 실험 조건을 막론하고 PI3K / Akt 경로와 Ras / MAPK 경로 사이의 상호 작용은 모두 이 두 경로의 상이한 단계에서 명확하게 표현되었으나, Akt경로가 Ras / MAPK 경로에 대하여 양성 조절 작용을 하는지 음성 조절 작용을 하는지, 또한 특정된 세포내에서 어떤 종류의 조절이 우세를 차지하는지에 대하여서는 아직 완전히 밝혀지지 않았다. Akt 신호 전달 경로는 종양 및 류마티스 관절염과 같은 질병의 발생 및 발달과 밀접히 관련되며, 각 경로의 상호 연결 및 영향은 공동으로 질병 발생에 중요한 역할을 할 수 있다.
인용문헌：WO/2008/098104，WO2009/158371A1.
약물활성 성분의 상이한 고체 형태는 상이한 특성을 가질 수 있다. 상이한 고체 형태의 성질 방면의 변화는 예를 들면, 합성 또는 취급이 용이하고, 안정성 및 유통기한을 개선시키는 등 개선된 제제형태을 제공할수 있다. 상이한 고체 형태에 의하여 야기 된 특성의 변화도 최종 제제를 개선시킬 수 있다. 약물활성 성분의 상이한 고체 형태는 다결정 형태 또는 다른 결정 형태를 생성 할 수 있어서, 고체의 약물 활성 성분의 성질의 변화를 평가하기 위한 더 많은 기회를 제공한다.
본 발명의 식 (I)의 화합물의 염 형태 및 그의 결정 형태의 제조는 단계이 간단하고, 또한 상기 결정 형태는 비교적 안정적이고 열 및 습도의 영향을 적게 받으므로 제제로 제조하기가 편리하다.
한 방면에서, 본 발명은 식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure 112020071706210-pct00001
.
다른 한 방면에서, 본 발명은 식 (I)의 화합물의 결정형태를 제공하며, 상기 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 X선 분말 회절 스펙트럼은 12.25°± 0.2°, 14.46°± 0.2° 및 21.83°±0.2°인 2θ 값에서 특징적 피크를 가진다.
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 X선 분말 회절 스펙트럼은 8.50°±0.2°, 10.20°±0.2°, 12.25°±0.2°, 14.46°±0.2°, 15.30°±0.2°, 21.83°±0.2°, 27.31°±0.2° 및 31.41°±0.2°인 2θ 값에서 특징적 피크를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 X선 분말 회절 스펙트럼은 도 1에 도시된 바와 같다.
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 X선 분말 회절 스펙트럼 해석 데이터는 표 1에 표시된 바와 같다.
표 1: 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 XRPD 해석 데이터
Figure 112020071706210-pct00002
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 DSC곡선은 195.10℃±3℃에서 하나의 흡열 피크의 개시점을 가지며, 또한 209.23℃±3℃에서 하나의 방열 피크의 개시점을 가진다.
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 DSC 곡선은 도 2에 도시된 바와 같다.
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 TGA 곡선은 100.00℃±3℃에서 0.295%의 질량 손실을 나타낸다.
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 TGA 곡선은 도 3에 도시된 바와 같다.
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 적외선 스펙트럼은 3316 cm-1±5 cm-1, 3079 cm-1±5 cm-1, 3058 cm-1±5 cm-1, 3016 cm-1±5 cm-1, 2954 cm-1±5 cm-1, 2935 cm-1±5 cm-1, 2915 cm-1±5 cm-1, 2902 cm-1±5 cm-1, 2864 cm-1±5 cm-1, 1704 cm-1±2 cm-1, 1633 cm-1±2 cm-1, 1623 cm-1±2 cm-1, 1589 cm-1±2 cm-1, 1530 cm-1±2 cm-1, 1514 cm-1±2 cm-1, 1486 cm-1±2 cm-1, 1445 cm-1±2 cm-1, 1429 cm-1±2 cm-1, 1408 cm-1±2 cm-1, 1395 cm-1±2 cm-1, 1373 cm-1±2 cm-1, 1359 cm-1±2 cm-1, 1345 cm-1±2 cm-1, 1332 cm-1±2 cm-1, 1282 cm-1±2 cm-1, 1247 cm-1±2 cm-1, 1214 cm-1±2 cm-1, 1173 cm-1±2 cm-1, 1135 cm-1±2 cm-1, 1114 cm-1±2 cm-1, 1054 cm-1±2 cm-1, 1030 cm-1±2 cm-1, 1000 cm-1±2 cm-1, 952 cm-1±2 cm-1, 914 cm-1±2 cm-1, 902 cm-1±2 cm-1, 883 cm-1±2 cm-1, 861 cm-1±2 cm-1, 839 cm-1±2 cm-1, 825 cm-1±2 cm-1, 789 cm-1±2 cm-1, 763 cm-1±2 cm-1, 736 cm-1±2 cm-1, 720 cm-1±2 cm-1 및 704 cm-1±2 cm-1에서 특징적 흡수 피크를 가진다.
본 발명의 일부 형태에서, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 적외선 스펙트럼은 도 4에 도시된 바와 같다.
정의 및 설명
별다른 설명이 없는 한, 본문에 사용되는 이하 용어와 짧은 문구는 하기 뜻을 구비한다. 하나의 특정된 짧은 문구 또는 용어는 특별히 정의되지 않을 경우, 불확정되거나 불명확한 것으로 이해해서는 아니되며 통상의 뜻에 따라 이해해야 한다. 본문에 상품명칭이 나타날 경우, 이는 이와 대응되는 상품 또는 이의 활성성분을 의미한다.
본 발명의 중간체 화합물은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 숙지하고 있는 다양한 합성방법으로 제조될 수 있고, 이하 예를 든 구체적인 실시형태, 이와 기타 화학 합성 방법으로 결합된 실시형태 및 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 숙지하고 있는 등가적 대체형태, 바람직한 실시형태는 본 발명의 실시예를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시 방식의 화학 반응은 적합한 용매에서 완료되고, 상기 용매는 본 발명의 화학적 변화 및 그에 필요한 시약 및 물질에 적합해야 한다. 본 발명의 화합물을 획득하기 위해, 당업자는 기존의 실시 방식에 기초하여 합성 단계 또는 반응 과정을 변경하거나 또는 선택하는 것이 때로 필요하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이러한 실시예가 본 발명을 그 어떠한 한정을 하는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 모든 용매는 시판되고, 추가 정제없이 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 약어를 사용한다:
TBTU：O-벤조트리아졸-N, N, N ', N'-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트；
DIEA：N,N-다이아이소프로필에틸아민；
DMF：N,N-다이메틸메탄아마이드；
MeOH：메탄올；
THF：테트라히드로푸란；
Pd(dppf)Cl2：[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐디클로라이드；
Pd2(dba)3：트리(디벤질리덴아세톤)디팔라듐；
XPHOS：2-디사이클로 헥실포스피노-2'4'6'-트리이소프로필비페닐.
기기 및 분석방법
1.1 X선 분말 회절계（Xray powder diffractometer, XRPD）
기기 모델: Bruker D8 advance X선 회절계
테스트 방법: XRPD 검출에 약 10 내지 20 mg의 시료가 사용됨.
자세한 XRPD 매개변수는 다음과 같다.
라이트 튜브: Cu, kα, (λ = 1.54056Å).
라이트 튜브 전압: 40kV, 라이트 튜브 전류: 40mA
발산 슬릿: 0.60 mm
검출기 슬릿: 10.50 mm
안티 산란 슬릿: 7.10 mm
스캔 범위: 3 또는 4-40 deg
스텝 각: 0.02 deg
스텝 시간: 0.12 초
샘플 플레이트 회전속도: 15 rpm
1.2 시차 주사 열량법（Differential Scanning Calorimeter, DSC）
기기 모델: TA DSC Q2000 시차 주사 열량계
테스트 방법: 테스트를 위해 시료(0.5 내지 1mg)를 DSC 알루미늄 도가니에 놓고, 50mL/min N2의 조건 하에서, 샘플을 10℃/min의 가열 속도로 실온(25℃)에서 300℃ 또는 350℃로 가열한다.
1.3 열 중량 분석（Thermal Gravimetric Analyzer, TGA）
기기 모델: TA Q5000IR 열 중량 분석기
테스트 방법: 테스트를 위해 시료(2 내지 5mg)를 TGA 백금 도가니에 놓고, 25mL/min N2의 조건 하에서, 시료를 10℃/min의 승온 속도로 실온(25℃)에서 300℃, 350℃ 또는 질량이 20% 감소할 때까지 가열한다.
1.4 동적증기 흡착기（DVS）
기기 모델：DVS Advantage-1 (SMS)
테스트 조건： DVS검출에 약10 내지 15 mg의 시료가 사용됨.
평형 dm/dt：0.01 %/min：(시간：10 min 최대180min)
건조：0% RH，120 min
RH (%) 구배의 측정：10%
RH (%) 구배의 측정 범위：0% 내지 90% 내지 0%
하기의 표 2는 흡습성 판단의 기준이다：
표 2: 흡습성의 판단기준
Figure 112020071706210-pct00003
*25℃/80%RH하에서의 흡습에 의한 무게 증가
1.5 고성능 액체 크로마토그래피（High Performance Liquid Chromatograph, HPLC）
기기 모델：애질런트 1200 고성능 액체 크로마토그래피
분석 방법은 다음과 같다：
표 3: 물질의 함유량 테스트에 관한 HPLC 분석 방법
Figure 112020071706210-pct00004
도 1은 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 XRPD 스펙트럼이다.
도 2는 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 DSC 스펙트럼이다.
도 3은 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 TGA 스펙트럼이다.
도 4는 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 적외선 흡수 스펙트럼이다.
도 5는 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 자외선 흡수 스펙트럼이다.
이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여 더 설명하지만, 본 발명에 대한 제한이 아니다. 본 명세서에서는 본 발명을 상세하게 설명하였고, 구체적인 실시예의 방법 또한 개시하였지만 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 전제하에 본 발명의 구체적인 실시형태에 대하여 다양한 변경 및 개선을 진행할수 있다.
제조 실시예
Figure 112020071706210-pct00005
단계1： 중간체 1-B의 합성
화합물 1-A (5.0 Kg, 60.9 mol)를 무수 톨루엔(7 L)에 용해시키고, 수득한 용액을 50L의 반응용기에 첨가 한 후, 디히드로푸란(5.6 Kg, 60.9 mol) 및 트리플루오로아세트산(50 mL)을 첨가하고, 반응용기의 외부 온도를 80℃로 설정하고, 하룻밤 교반반응시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 에틸아세테이트(10 L), 물(2 L)을 첨가하고, 교반 후 정치시키고, 액체를 분리시켰다. 유기층을 물(1 L x 2)로 세척하고 스핀건조하여 중간체1-B를 수득하였으며 담황색 유성 액체였다. LCMS (ESI) m/z: 167 (M±1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 1.66-1.67 (m, 3 H), 2.02-2.08 (m, 6 H), 3.66-3.72 (m, 1 H), 4.03-4.07 (m, 1 H), 5.30-5.33 (dd, J=10.0, 2.8 Hz, 1H), 7.37-7.38 (d, J=6.0 Hz, 1H).
단계2： 중간체 1-C의 합성
질소가스의 보호하에 화합물1-B (2.0 Kg, 12.03 mol)을 무수 테트라하이드로푸란(12 L)에 용해시킨 후, 수득한 용액을 50 L의 구형 용기에 넣고， 온도를 -40℃ 내지 -20℃로 낮추고 n-부틸리튬(5.3 L, 13.24 mol)을 적가하고, 적가 완료 후, 계속하여 이 온도에서 1시간 동안 교반반응 시킨 후, 이소프로필피나콜보레이트(2.351 Kg, 12.63 mol)를 적가하였다. 적가 완료 후, 냉각욕을 철거하고, 계속하여40분 동안 교반반응 시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 포화 염화암모늄 용액(2 L)을 첨가하여 퀀칭시킨 후, 6N HCl을 적가하여 pH를 5 내지 6으로 조절하였다. 물 20 L를 첨가하고, 에틸아세테이트(5 L)를 첨가하여 1 회 추출 한 후, 다시 에틸아세테이트(3 L)를 첨가하여 1회 추출하고, 유기층을 합병하고 스핀건조하여 중간체1-C를 수득하였으며 황색 고체였다.LCMS (ESI) m/z: 293 (M±1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 1.356 (s, 12 H), 1.54-1.57 (m, 1H), 1.70-1.72 (m, 2 H), 1.99-2.00 (m, 1 H), 2.08-2.09 (m, 1 H), 2.23 (s, 3 H), 2.45-2.51 (m, 1 H), 3.63-3.70 (m, 1 H), 4.02-4.06 (m, 1 H), 5.81-5.84 (dd, J=10.0, 2.4 Hz, 1H), 7.40 (s, 1 H).
단계3： 중간체 1-D의 합성
0 내지 20℃에서 교반하에 1-C(3.75Kg, 10.64mol)를 염화수소메탄올 용액(4N, 16L, 64mol)에 첨가하고 20℃좌우에서 하룻밤 교반하였다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 반응액을 용매가 더 증발하지 않을때까지 증발시킨 후, 4 리터의 석유에테르를 잔류물에 첨가하고 교반하였다. 정치시킨 후 상청액을 부어 내고， 하층의 잔류물은 약간 스핀건조하였으며, 고체가 석출하였고 여과하고, 케이크를 1.5 L의 에틸아세테이트로 슬러리화 시켰다. 여과하고 케이크를 다시 1.5L의 에틸아세테이트로 다시 슬러리화하여, 케이크를 수집하고, 여액을 합병하였다. 여액에 대하여 상기 과정을 반복하여, 다시 케이크를 수집하고, 합병한 케이크를 감압건조시켜 중간체 1-D를 수득하였으며 백색 고체였다. LCMS (ESI) m/z: 209 (M±1)；1H NMR (CD3OD): δ ppm 1.22-1.42 (d, 12H), 2.27-2.34 (d, 3H), 8.03-7.14 (d, 1H).
단계4： 중간체 1-F의 합성
20 내지 25℃에서 1-E(2502.05 g, 10.64 mol), DMF (12.5 L), 트리에틸아민(2.24 L, 16.09 mol) 및 Pd(dppf)Cl2(84.00 g, 0.115 mol）를 50L의 반응용기에 첨가한 후, 반응액을 질소 가스로 버블링하여 넣고, 버블링을 약 10 분간 실행하고, 프로파질 알코올(943mL, 15.95mol)을 반응용기에 적가하고, 질소가스의 보호하에 60℃로 승온시키고, 1시간 동안 보온 반응시켰다. 이어서, 온도를 80℃로 올리고 약 6.5 시간 동안 보온 반응시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 실온으로 온도를 낮추고, 에틸아세테이트 (20L) 및 염산 (2N, 1L)을 첨가하고, 교반 한 후 액체를 분리 하였다. 수상을 다시 에틸아세테이트 (5 L)로 1회 추출하고, 합병한 유기층에 물 (5 L x 2)을 첨가하여 세척하고, 유기상을 스핀건조시키고, 잔류물을 실리카겔칼럼(석유 에테르에서 석유에테르/에틸아세테이트=3/1)으로 용리시킨 후, 용리액을 스핀건조하여 중간체 1-F를 수득하였으며 황색 고체였다. LCMS (ESI) m/z: 211 (M±1)； 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 1.39 (t, J=7.15 Hz, 3 H), 1.78 - 1.88 (m, 1 H), 4.30 - 4.42 (m, 2 H), 4.50 - 4.59 (m, 2 H), 7.13 - 7.20 (m, 1 H), 7.61 - 7.70 (m, 1 H).
단계5： 중간체 1-G의 합성
1-F(4039.55 g, 19.1 mol)을 24 L의 에탄올(품질 평가 점수 95 %)에 용해시키고, 트리에틸아민(20 mL, 0.144 mol)을 첨가하여 충분히 혼합하고, 상기 혼합물을 2 L 수소화병 20개에 균등하게 넣고, 질소 기체 보호하에 젖은 팔라듐카본(419.89 g, 10 %)을 상기 수소화병에 균등하게 배분하고, 수소를 2 회 치환하고, 수소의 압력은 50 PSI, 온도는 25℃로 설정하고 약 3 시간 동안 반응시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 여과하고 여과액을 합병하여 스핀건조하고 잔류물에 0.1N 염산 (3 L) 및 에틸아세테이트(6 L)을 첨가하고 교반 한 후 액체를 분리하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 넣어 건조시키고 여과하고 유기층을 스핀건조하여 중간체 1-G를 수득하였으며 황색 유상의 액체였다. LCMS (ESI) m/z: 215 (M±1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 1.38 (t, J=7.15 Hz, 3 H), 1.90 - 2.06 (m, 2 H), 2.97 (t, J=7.59 Hz, 2 H), 3.73 (s, 2 H), 4.34 (d, J=7.03 Hz, 2 H), 6.81 - 6.89 (m, 1 H), 7.61 - 7.70 (m, 1 H).
단계6： 중간체 1-H의 합성
20 내지 25℃ 하에서 50 L의 반응용기에 디클로로메탄(19.6 L), 1-G (3916.73 g, 18.3 mol) 및 염화철(III)(296.83 g, 1.83 mol)을 순차적으로 첨가 한 후, 10℃ 이하에서 액체 브롬(1415 mL, 27.5 mol)을 반응용기에 적가하고, 이어서 15 내지 25℃에서 밤새 반응시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 물 (20 L)을 넣고 교반 한 후 액체를 분리하고, 유기층에 포화 티오황산나트륨 용액 (20 L)을 넣고 교반 하여 액체를 분리 하고, 유기층에 물 (20 L)을 넣고 교반하여 액체를 분리하고, 유기층에 다시 물(20 L)을 넣고 교반하여 액체를 분리하였다. 유기층을 스핀건조하고, 잔류물을 실리카겔 컬럼(석유에테르에서 석유에테르/에틸아세테이트=3/1)으로 용리하고, 용리액을 스핀건조하여 중간체 1-H를 수득하였으며, 황색 유상의 액체였다. LCMS (ESI) m/z: 295 (M±1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 1.36 (t, J=7.15 Hz, 3 H), 1.88 - 2.00 (m, 2 H), 2.93 (t, J=7.59 Hz, 2 H), 3.66 - 3.79 (m, 2 H), 4.33 (d, J=7.03 Hz, 2 H), 7.57 - 7.66 (s, 1 H).
단계7： 중간체 1-I의 합성
20 내지 25℃하에, 50L의 반응용기에 1,4-디옥산(26 L), 물(5.2 L) 1-H(3277.79 g, 11.18 mol), 1-D(3300.00 g, 13.50 mol) 및 무수 탄산수소나트륨(2751.12 g, 32.75 mol)을 순차적으로 첨가 후, 질소 가스를 반응 용액에 버블링하여 넣었으며, 버블링은 약 15 분 동안 실행한 후, x-PHOS (1044.07 g, 2.19 mol)및 Pd2(dba)3(1000.00 g, 1.09 mol)을 첨가하고, 계속하여 약 20 분 동안 버블링하고, 질소가스의 보호하에 110℃에서 하룻밤 반응시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 실온까지 온도를 낮추고, 반응 용액을 여과하고, 여과액에 에틸아세테이트(22 L) 및 물 (22 L)을 넣고 교반 한 후 액체를 분리하고, 수상을 에틸아세테이트(20 L)로 1 회 추출하고, 합병한 유기층을 스핀건조하였다. 잔류물에 메틸 tert-부틸에테르(20 L) 및 2N 염산(20 L)을 첨가하고, 교반하여 액체를 분리하고, 유기층에 2N 염산 (20 L)을 첨가하고 교반하여 액체를 분리하였다. 유기층을 합병하고 메틸 tert-부틸에테르(5 L)및 석유에테르(2.5 L)의 혼합액으로 세척하고, 수상은 10 내지 20℃ 하에서 포화 탄산나트륨으로 pH를 7 내지 8로 조절하여, 대량의 고체가 석출시켰다. 여과하여 고체를 수집하고, 고체를 에탄올(5 L)에 용해하고, 활성탄(300 g)을 첨가하여 30 분간 가열 환류시켰다. 뜨거울 때 여과하고 여과액을 농축 건조하고 잔류물에 이소프로필아세테이트(2 L)를 넣고 60℃로 가열하고, 슬러리화하고 실온으로 냉각 하였다. 여과하고 고체를 수집하고 가압건조하여 중간체 1-I를 수득하였으며 담황색 고체였다. LCMS (ESI) m/z: 295 (M±1)；1H NMR (CDCl3): δ ppm 1.39-1.42 (m, 3 H), 1.98-2.04 (m, 2H), 2.17 (s, 2H), 3.16-3.20 (m, 2H), 3.64-3.67 (m, 2H), 4.35-4.41 (m, 2H), 7.43 (s, 1H), 7.79 (s, 1H).
단계8： 중간체 1-J의 합성
20 내지 25℃하에, 디클로로메탄(18L), 1-I(1890.24g, 6.42mol), 트리에틸아민(2700mL, 19.26mol) 및 메탄설포닐클로라이드（1238 mL, 16.05 mol）를 50L의 반응용기에 순차적으로 첨가하고, 약 0.5 시간 동안 교반 반응시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 4.5 L의 포화 염화암모늄 용액을 첨가하고, 교반하여 액체를 분리하고, 수상에 4.5 L의 디클로로메탄을 넣어 추출하고, 유기층을 합병하여 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 유기층을 스핀건조시켰다. 잔류 물을 50L 반응용기에 옮기고 무수 에탄올(18 L), 요오드화 칼륨 (213.34g, 1.28 mol) 및 나트륨메톡사이드(1041.01g, 19.28 mol)를 첨가하고 90℃로 온도를 높여 하룻밤 반응시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 온도를 50 내지 60℃로 낮추고, 물 (18 L)과 고체 수산화나트륨(771.12 g, 19.28 mol)을 넣고, 약 30 분간 교반 반응시켰다. HPLC에 의하여 반응이 완료되었음을 검출하고, 약 20L로 감압 농축하고, 메틸 tert-부틸에테르(9 L)을 첨가하여, 교반하여 액체를 분리하고, 수상에 메틸 tert-부틸에테르(9 L) 를 넣고 교반하여 액체를 분리시키고, 수상에 농염산을 넣어 pH를 3 내지 4로 조절하여 대량의 고체를 석출시키고, 여과하고 고체를 수집하여, 케이크를 물(1 L Х 2) 및 아세톤(2.25 L Х 2)으로 순차적으로 세척하고 여과하고 감압 건조하여 중간체 1-J를 수득하였으며 담황색 고체였다. LCMS (ESI) m/z: 249 (M±1)；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ ppm 2.14 (s, 3H), 2.17-2.21 (m, 2H), 3.07-3.11 (m, 2H), 4.23-4.25 (m, 2H), 7.28 (s, 1H) 7.80 (s, 1H).
단계9： 중간체 1-L의 합성
20 내지 25℃에서 N, N-디메틸포름아미드(11.3 L), 1-J (1417.92 g, 5.69 mol), 1-K (2007.29 g, 5.92 mol) 및 N, N- 다이아이소프로필에틸아민(2.487 L, 14.24 mol)을 50L의 고온 및 저온 반응용기에 순차적으로 첨가하고, 고체가 완전히 용해 될 때까지 교반하였다. 혼합액을 0 내지 5℃로 냉각하고, TBTU(2200.23g, 6.85mol)을 배치로 첨가하고, 첨가 시의 온도는 20℃를 초과하지 않도록 제어하였다. 첨가 완료 후 20 내지 25℃로 승온하고, 보온하면서 2 시간 동안 교반하였다. HPLC에 의해 검출하여, 1-J의 함량이 0.5% 이하 시 반응을 정지시켰다. 교반하에, 20 내지 25℃에서 에틸아세테이트(3 L) 및 희염산(0.25 N, 34 L)을 순차적으로 첨가하여, 대량의 고체를 석출시키고, 계속하여 보온하면서 10 분간 교반하였다. 여과하고 케이크를 물(7 L Х 2)로 세척하고, 50 L의 반응용기에 케이크를 넣고, 메탄올(14 L)을 첨가하여 슬러리화하고, 원심 분리기로 여과하였고, 케이크는 3 일간 자연 건조시켰다. HPLC에 의해 케이크를 검출하여, 순도가 98.0 % 이하 시, 슬러리화를 반복하였다. 케이크를 50 L의 반응용기에 넣고, 메탄올 (30 L)을 첨가하여 슬러리화하고, 원심 분리기로 여과하고, 케이크를 진공 건조하여 중간체 1-L을 수득하였으며, 백색 고체였다. LCMS (ESI) m/z: 529 (M±1)；1H NMR (CDCl3): δ ppm 2.21 (s, 3H), 2.24-2.28 (m, 2H), 2.91-2.93 (m, 1H), 2.98-3.02 (m, 2H), 3.06-3.07 (m, 1H), 3.76-3.78 (m, 1H), 3.83-3.84 (m, 1H), 4.21-4.24 (m, 2H), 4.51-4.52 (m, 1H), 6.82-6.93 (m, 2H), 6.97-7.01 (m, 1H), 7.04-7.08(m, 1H), 7.21-7.25 (m, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.67-7.68 (m, 2H), 7.76-7.78 (dd, J=5.2, 3.0 Hz, 2H).
단계10： 중간체 1-M의 합성
20 내지 25℃에서, 메탄올 (20 L) 및 1-L(2233.25 g, 4.19 mol)을 50 L의 고온 및 저온의 반응용기에 넣어 교반하고, 98 %의 히드라진 수화물(1050 mL, 98 %, 24.54 mol)을 첨가하고, 80 내지 90℃로 온도를 높이고, 1.7 시간 동안 환류 반응시켜, 대량의 고체를 석출시켰다. HPLC에 의하여 검출하여, 1-L함량이 0.5% 이하 시, 반응을 정지시켰다. 뜨거울 때 여과하고 여액을 20 내지 25℃로 냉각시켜, 대량의 고체를 석출시켰으며, 여과하고, 케이크를 메탄올(5 L)로 세척하였다. 여과액을 원 용량의 약 1/5 정도(약 5 L)로 농축 한 후, 교반하면서 20 L의 물을 상기 농축액에 천천히 부어넣어, 대량의 고체를 석출시켰으며, 여과하고, 케이크를 물 (5 L)로 세척 하였다. 20 내지 25℃에서 희염산(1 N, 20 L)을 케이크에 첨가하고, 교반하고 여과하고, 케이크를 물(5 L)로 세척하였다. 여과액을 50 L의 분액기에 옮기고, 에틸아세테이트와 메탄올의 혼합 용매 (10/1 (v / v) 11 L Х 2)로 역 추출하였다. 수상을 0 내지 5℃로 냉각시키고, 교반하에 탄산수소나트륨 고체로 pH를 8 내지 9로 조절하고, 대량의 고체를 석출시켰으며, 여과하고 케이크를 물(2 L)로 세척하고, 진공 건조시켜 중간체 1-M를 수득하였으며, 백색 고체였다. LCMS (ESI) m/z: 399 (M±1)；1H NMR (CD3OD): δ ppm 2.23 (s, 3H), 2.24-2.34 (m, 2H), 2.89-2.98 (m, 4H), 3.06-3.09 (m, 2H), 4.23-4.25 (m, 2H), 4.25-4.35 (m, 1H), 6.93-7.02 (m, 1H), 7.04-7.11 (m, 2H), 7.27-7.29 (m, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.83 (s, 1H).
단계11： 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 합성
20 내지 25℃ 하에, 메탄올(13.2 L) 및 1-M (1654.31 g, 3.93 mol)을 50 L의 고온 및 저온 반응용기에 순차적으로 넣고, 80 내지 90℃로 승온시키고 보온하면서 0.5 시간 동안 교반하였다. 뜨거울 때에 여과하고, 여과액을 다시 50L의 고온 및 저온 반응용기로 옮겨, 80 내지 90℃로 승온시키고, 말레산 메탄올 용액 (505.94 g의 말레 산을 1 L의 메탄올에 용해, 4.36 mol )을 첨가하고, 보온하면서 1 시간 동안 교반 하였다. 점차적으로 냉각시키고, 외부 온도를 60 내지 70℃로 보온하면서 2 시간 동안 교반하여 고체를 석출시켰다. 40 내지 50℃로 보온하면서 1 시간 동안 교반하고, 20 내지 25℃에서 13.5 시간 교반하였다. 여과하고 메탄올 (500mL)로 케이크를 세척하고, 케이크를 진공 건조하여 식 (I)의 화합물의 조질의 생성물을 얻었다. 20 내지 25℃하에, 메탄올(13 L)과 식 (I)의 화합물(1680 g)을 50L의 고온 및 저온의 반응용기에 넣고, 보온하면서 약 3시간 동안 교반하고, 여과하고 케이크를 메탄올 (2L)로 세척하고, 진공 건조하여 식 (I)의 화합물의 결정 형태를 수득하였으며, 백색의 분말이었다. LCMS (ESI) m/z: 399 (M±1)；1H NMR (CD3OD): δ ppm 2.23 (s, 3H), 2.28-2.39 (m, 2H), 2.97-3.13 (m, 4H), 3.13-3.29 (m, 2H), 4.25 (br d, J=6.0 Hz, 2H), 4.47-4.59 (m, 1H), 6.25 (s, 2H), 6.92-7.02 (m, 1H), 7.03-7.18 (m, 2H), 7.33 (s, 2H), 7.80 (s, 1H).
특성 실시예
실시예1： 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 안정성 시험
1.1 실험단계
식 (I)의 화합물의 결정 형태를 약 10 mg 정확하게 칭량하여 깨끗하고 건조한 유리 병에 넣어 얇은 층으로 펼친 후, 정식 시험용 시료로 하였다. 가속 시험 조건(40℃ / 75 % RH 및 60℃ / 75 % RH)하에, 시료를 완전히 노출시켜, 알루미늄 호일로 덮고 작은 구멍을 찔러놓았다. 시험은 10일, 1개월, 2개월에 샘플링하여 분석하였다. 결과는 표 4를 참조한다.
1.2 희석제 및 이동상의 제조
희석제：아세토니트릴：물（1:1）을 희석제로 한다
예： 100 mL의 순수한 물 및 100 mL의 순수한 아세토니트릴을 유리병에서 혼합하고, 초음파로 10 분간 탈기하고, 실온까지 냉각시켰다.
이동상A：0.1%의 인산 수용액
예： 2.0 mL의 인산을 칭량하여 2000 mL의 물에 첨가한 후, 10분간 초음파하여 균일하게 혼합하고, 실온까지 냉각시켜 이동상 A로 하였다.
이동상B： 아세토니트릴
아세토니트릴을 취하여 이동상 B로 하였다.
1.3 대조용 용액의 제조（0.25mg/mL, 유리 알칼리로 계산）
0일의 시료를 참조 시료로, 16 mL 희석액을 넣고, 5 분간 초음파 처리하고 균일하게 혼합하였다. 다시 한 배 희석하여, 각각 STD-1 및 STD-2로 표기하였다.
1.4 감도 시료 용액의 제조
대조용 용액 STD-1（0일의 샘플）을 취하여 2000배로 희석하여 LOQ로 표기 하였다.
1.5 시료 용액의 제조（0.25mg/mL, 유리 알칼리로 계산）
시료를 취하여 실온으로 회복한 후 16mL의 희석액을 넣어 용해시켰다. 다시 한 배 희석하여 관련 물질의 함량을 검출하는 시료 용액으로 하였다.
표 4: 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 안정성 테스트
Figure 112020071706210-pct00006
RRT：메인 피크 대비 상대 유지 시간；TRS： 불순물 총 함량； RH： 상대 습도.
실험 결과로부터, 식 (I)의 화합물의 결정 형태는 고온 고습 조건 하에서 모두 안정적이고, 불순물 함량은 기본적으로 변하지 않음을 알 수 있다.
실시예2： 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 용해도 실험
2.1 실험 절차
식 (I)의 화합물의 결정 형태 10 mg을 정확하게 칭량하여 유리병에 넣고 1 mL의 용매를 첨가하여 25±2℃에서 5분 간격으로 30초간 격렬하게 흔들고 30 분 이내의 용해현상을 관찰하였다. 해당 데이터를 기록하였다.
단계2.1에서 용해되지 않은 시료 1 mg을 정확하게 취하여 유리병에 넣고 적절한 용매를 넣어 25±2℃에서 5분 간격으로 30 초간 격렬하게 흔들고 30 분 이내의 용해 현상을 관찰하였다. 해당 데이터를 기록하였다.
표 5: 용해도 판단 기준
Figure 112020071706210-pct00007
표 6: 상이한 용매에서의 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 대체적인 용해도 상황
Figure 112020071706210-pct00008
실험 결과로부터, 식 (I)의 화합물의 결정 형태는 디메틸술폭시드 또는 N-메틸피롤리돈에 쉽게 용해되며, 메탄올에서 조금 용해되고, 아세토니트릴 또는 물에서는 거의 용해되지 않거나 용해되지 않고; 0.1N 염산 또는 0.1N 수산화 나트륨 용액에서는 거의 용해되지 않거나 용해되지 않음을 알수 있다.
실시예3： 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 흡습성 시험
실험과정
3 개의 플러그가 있는 건조한 유리 계량병 (외경 50 mm, 높이 30 mm)을 취하여 아래쪽에 염화암모늄 포화용액을 넣은 건조기에 넣고, 계량병을 개방된 상태로 넣고, 건조기 카바를 덮은 후, 건조기를 25℃의 항온 상자에 넣어 하룻밤 방치하였다.
계량병을 하룻밤 방치한 후 꺼내어 무게를 정확하게 측정하였고, 각각 m11, m12, m13이였다.
적당량의 식 (I)의 화합물의 결정 형태를 꺼내어 이미 무게를 정확하게 측정한 계량병에 평평하게 깔고(시료의 두께는 약 1mm), 무게를 정확하게 측정하였고, 각각m2 1, m2 2, m2 3였다.
계량병을 개방하여 뚜껑과 함께 바닥에 염화암모늄 포화 용액을 넣은 건조기에 넣고, 계량병을 개방해 놓고, 건조기 카바를 잘 덮은 후, 건조기를 25℃의 항온 상자에 넣고 24 시간 방치하였다.
24 시간 방치 한 후, 계량병 뚜껑을 잘 닫고, 꺼내어 무게를 정확하게 측정하고, 각각 m3 1, m3 2, m3 3으로 표기하였다.
흡습성 중량 증가를 계산하였으며, 계산 공식은 다음과 같다：
중량 증가율=100%Х（m3-m2）/(m2-m1)
표 7: 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 흡습 상황표
Figure 112020071706210-pct00009
흡습성 테스트 결과에 따르면, 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 흡습 평균치는 0.07 % <0.2 %이며, 따라서 식 (I)의 화합물의 결정 형태는 흡습성이 없거나 거의 없다.
실시예4： 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 적외선 흡수 시험
기기：Nicolet 6700 FT-IR형 적외선 분광기
방법：ATR 감쇠 전반사법
식 (I)의 화합물의 결정 형태의 샘플의 적외선 흡수 스펙트럼은 도 4를 참고로 한다.
표 8: 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 적외선 흡수 스펙트럼 검출 결과
Figure 112020071706210-pct00010
s：강한 피크를 나타내고；m：중등 강도 피크를 나타내고；w：약한 피크를 나타낸다.
적외선 스펙트럼 분석：
1) 3316 cm-1：N-H 신축 진동； 1704 내지 1623 cm-1：C=O 신축 진동； 1359 내지 1000 cm-1：C-N 신축 진동； 952 내지 704 cm-1：N-H 면외 변각 진동； 본 발명의 구조중에 아미드가 함유되어 있음을 증명한다；
2) 3079，3058，3016 cm-1：=C-H 신축 진동；1704 내지 1445 cm-1： C=C 및 C=N 신축 진동； 1359 내지 1000 cm-1：C-H 면내 변각 진동； 952 내지 704 cm-1：=C-H 면외 변각 진동； 본 발명의 구조 중에 벤젠 고리， 방향족 헤테로 고리， 알케닐기가 함유되어 있음을 증명한다；
3) 2954 내지 2864 cm-1：C-H 대칭 및 비대칭 신축 진동； 1486 내지 1373 cm-1：C-H 변각 진동； 본 발명의 구조중에 -CH-, -CH2- 및 -CH3 구조가 함유되어 있음을 증명한다；
4) 3316 내지 2864 cm-1：NH3 ±의 신축 진동； 1359 내지 1000 cm-1：C-N 신축 진동； 952 내지 704 cm-1：N-H 신축 진동； 본 발명의 구조 중에 아민염이 함유되어 있음을 증명한다； 1633 내지 1530 cm-1： 카르복실산염의 역대칭 신축 진동； 1445 내지 1395 cm-1： 카르복실산염의 대칭 신축 진동； 본 발명의 구조 중에 카르복실산염이 함유되어 있음을 증명한다；
5) 1359 내지 1000 cm-1：C-F 신축 진동； 본 발명 중에 C-F결합이 함유되어 있음을 증명한다；
오차 범위는 《중국 약전》의 요구 사항에 부합된다, 즉, 3000 cm-1 부근에 ±5cm-1의 오차 하용 범위가 존재할 수 있으며, 1000 cm-1 부근에 ±2cm-1의 오차 허용 범위가 존재할 수 있다.
적외선 스펙트럼으로부터, 본 발명의 구조는 아미드, 벤젠 고리, 방향족 헤테로 고리, 알케닐기, -CH-, -CH2-, -CH3, 아민염, 카르복실산염 및 C-F 결합 구조를 함유 함을 알 수있다. 상기 IR 스펙트럼의 결과는 식 (I)의 화합물의 결정 구조와 일치하다.
실시예5： 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 자외선 흡수 시험
기기： Agilent 8453 자외선 가시 광선 분광기
용매： 메탄올/순수한 물=1/1(v/v)
모액： 10.198 mg의 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 시료를 칭량하여 100 mL 용량의 플라스크에서 취하여, 희석제(메탄올/순수한 물=1/1(v/v))로 충분히 용해시키고 마크한 용량까지 희석하고, 균일하게 흔들었다.
시험액： 2.2 mL의 모액을 10 mL 용량의 플라스크에 취하고, 희석제(메탄올/순수한 물=1/1(v/v))로 마크한 용량까지 희석 한 후 잘 흔들어 4.3601 x 10-5 mol / L의 농도의 시료 용액을 수득하였다.
측정 파장： 200 내지 700 nm
메탄올에서 시료의 자외선 스펙트럼은 도 5에 도시되었다.
표 9: 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 자외선 흡수 스펙트럼 검출 결과
Figure 112020071706210-pct00011
메탄올 용액에서，λmax= 208nm은 방향족 헤테로 고리의 E밴드 특징적 흡수이고，λmax=248 nm은 방향족 고리의 B밴드 특징적 흡수，λmax =300 nm은 방향족 고리의 K밴드 특징적 흡수이다.
활성 테스트
실시예1： 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 AKT효소 활성 테스트
AKT는, 단백질 키나제 B (PKB)라고도 불리우며, 주로 AKT1, AKT2 및 AKT3을 포함하는 세린/트레오닌 특이성 단백질 키나제이다. AKT 신호 전달 경로는 포도당 대사, 아포토시스, 세포 증식 전사 및 세포 이동 등 다양한 세포 과정에서 중요한 작용을 한다. 본 연구는 AKT 패밀리 구성원의 키나제 활성에 대한 식 (I)의 화합물의 억제 효과를 분석하고자 한다.
시약 및 소모재:
ULight-CREBtide (PerkinElmer TRF0107-M, 배치 2035700)
Europium-Anti-P-CREB（Ser-133）(PerkinElmer TRF0200-M, 批次2002391)
LANCE Detection Buffer, 10* (PerkinElmer CR97-100)
ATP (Invitrogen PV3227)
Akt1 protein (life technology 배치 11629928C)
Akt2 protein (life technology 배치 28870GG)
Akt3 protein (life technology 배치 1715050B)
384웰 플레이트_검출 플레이트(PerkinElmer 6007299)
실험 원리:
본 실험은 균질 시간에 분해 형광 공명 에너지 전달(LANCE TR-FRET®) 방법을 사용하여 검출 플레이트에서 효소, 바이오틴 표식의 펩티드 기질 및 검출 화합물을 혼합하고, ATP를 첨가하여 반응을 시작하고 배양하였다. 반응 후, EDTA를 첨가하여 반응을 종료시키고, 동시에 Eu표식이 있는 항체를 첨가하여 반응시키고 및 검출하였다. 검출 플레이트는 PE사의 Envision을 사용하여 검출하고, 분석 모드는 TR-FRET이며, 데이터는 각각 665 nm 및 615 nm의 형광 신호의 판독값을 사용하여 나타내었다. 그 중 665nm/615nm의 높은 비율은 활성이 비교적 높음을 나타내고, 665nm/615nm의 낮은 비율은 활성이 억제되었음을 나타낸다.
실험 방법:
화합물의 제조： 시험 화합물 및 참조 화합물을 100 % DMSO에 희석하고, 화합물의 초기 농도는 10μM이며, 3 배의 구배로 10 개 농도로 희석하였다. 화합물을 세포 플레이트에 옮겨 이중 반복 웰 실험을 설치하였다.
키나제의 검출 : 효소와 기질을 미리 조제한 상이한 농도의 화합물과 혼합하여 Akt1, Akt2, Akt3 키나제의 최종 농도를 각각 1.25nM 2nM 및 2 nM로 하였다. 실온에서 15 분간 방치하고, 농도 당 이중 반복 웰 실험을 설치하였다. ATP를 Akt1, Akt2 및 Akt3 키나제 반응에 첨가하여 최종 농도를 각각 36μM, 360μM 및 160μM로 하였으며, 실온에서 90 분 동안 반응시켰다(여기서 음성 및 양성 대조군을 설정). 반응 종료 후 항체를 첨가하여 검출하고 실온에서 60 분 동안 배양 한 후 Evnvision 에 의하여 검출하고 데이터를 수집하였다. * Lfit5 소프트웨어에 따라 데이터 분석 및 그래프를 만들었다.
실험 결과: 표 10을 참조한다.
표 10: 키나제 활성 억제에 대한 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 IC50값
Figure 112020071706210-pct00012
본 실험 결과는 식 (I)의 화합물의 결정 형태는 AKT1, AKT2 및 AKT3 키나제 활성에 대하여 모두 비교적 강한 억제 효과를 가지며, 그 중 AKT1 키나제 활성에 대한 억제 효과가 제일 현저함을 보여주었다.
실시예2： 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 세포활성 테스트
본 실험은 식 (I)의 화합물의 결정 형태가 AKT 과다 발현의 전립선 암 세포 LNCaP에 대한 억제 효과를 연구하는 것을 목적으로 한다.
시약 및 소모재:
1. 세포 배양： RPMI-1640배지, 소 태아 혈청, Accutase, DPBS
2. 세포주：LNCaP
3. 검출시제： CellTiter-Glo 생 세포 검출 키트
4. 기타 주요 소모재 및 시약: 화합물 희석 플레이트, 중간 플레이트, 검출 플레이트, DMSO
실험 원리:
ATP 함량은 세포의 수량과 세포 상태를 직접적으로 반영하며, ATP에 대하여 정량 측정하여 살아있는 세포 수를 검출 할 수 있다. 생세포 검출 키트는 루시퍼라제와 그의 기질이 포함되어 있어, ATP의 참여를 통하여, 루시퍼라제는 기질에 대해 촉매를 진행하고, 안정된 광 신호를 내보낼 수 있으며, 신호의 강도를 검출하는것을 통하여 세포 내 ATP 량을 검출한다. 여기서, 광 신호는 세포 내의 ATP의 양에 정비례하며, ATP는 또한 살아있는 세포 수와 정적인 상관 관계가 있기 때문에, 세포의 증식 상황을 검출 할 수 있다. 검출 플레이트는 PE사의 Envision를 사용하여 분석하였다.
실험 방법:
1. 세포 플레이트의 제조
LNCaP 세포를 384 웰 플레이트에 접종시키며, 웰 당 1000개의 세포를 포함한다. 세포 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다.
2. 화합물의 준비
Bravo을 이용하여 3배로 희석하고, 10개 화합물 농도로 하여 이중 반복 실험을 설치하였다.
3. 화합물에 의한 세포 처리
화합물을 세포 플레이트로 옮기고, 화합물의 시작 농도는 10μ┢M이다. 세포 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 3 일 동안 배양하였다.
4. 검출
세포 플레이트에 Promega CellTiter-Glo 시제를 첨가하고, 실온에서 10 분간 배양하여 발광 신호를 안정화시켰다. PerkinElmer Envision 멀티 레이블 분석기를 이용하여 판독하였다.
실험결과: 표 11을 참고로 한다.
표 11: 세포증식 억제에 대한 식 (I)의 화합물의 결정 형태의 IC50값
Figure 112020071706210-pct00013
본 실험 결과는 식 (I)의 화합물의 결정 형태가 AKT과다 발현의 세포LNCaP의 성장에 현저한 억제 작용을 가지고 있음을 나타내었다.

Claims (13)

  1. 하기 식 (I)의 화합물:
    Figure 112022006643489-pct00014
    (I).
  2. 하기 식 (I)의 화합물의 결정형으로서, 상기 결정형의 X선 분말 회절 스펙트럼이 12.25°±0.2°, 14.46°±0.2° 및 21.83°±0.2°인 2θ 값에서 특징적 피크를 갖는, 식 (I)의 화합물의 결정형:
    Figure 112022006643489-pct00021
    (I).
  3. 제2항에 있어서,
    상기 결정형의 X선 분말 회절 스펙트럼은 8.50°±0.2°, 10.20°±0.2°, 12.25°±0.2°, 14.46°±0.2°, 15.30°±0.2°, 21.83°±0.2°, 27.31°±0.2° 및 31.41°±0.2°인 2θ 값에서 특징적 피크를 갖는, 식 (I)의 화합물의 결정형.
  4. 제2항에 있어서,
    식 (I)의 화합물의 결정형의 X선 분말 회절 스펙트럼이 하기 표에 기재된 2θ 각도에서의 특징적 회절 피크를 포함하고, 상기 특징적 회절 피크의 면간격 및 상대 강도가 하기 표에 기재된 바와 같은, 식 (I)의 화합물의 결정형:
    Figure 112022006643489-pct00022
    .
  5. 삭제
  6. 제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정형의 DSC 곡선은 195.10℃±3℃에서 하나의 흡열 피크의 개시점을 가지며, 또한 209.23℃±3℃에서 하나의 방열 피크의 개시점을 갖는, 식 (I)의 화합물의 결정형.
  7. 삭제
  8. 제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정형의 TGA 곡선은 100.00℃±3℃에서 0.295%의 질량 손실을 나타내는. 식 (I)의 화합물의 결정형.
  9. 삭제
  10. 제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정형의 적외선 스펙트럼은 3316 cm-1±5 cm-1, 3079 cm-1±5 cm-1, 3058 cm-1±5 cm-1, 3016 cm-1±5 cm-1, 2954 cm-1±5 cm-1, 2935 cm-1±5 cm-1, 2915 cm-1±5 cm-1, 2902 cm-1±5 cm-1, 2864 cm-1±5 cm-1, 1704 cm-1±2 cm-1, 1633 cm-1±2 cm-1, 1623 cm-1±2 cm-1, 1589 cm-1±2 cm-1, 1530 cm-1±2 cm-1, 1514 cm-1±2 cm-1, 1486 cm-1±2 cm-1, 1445 cm-1±2 cm-1, 1429 cm-1±2 cm-1, 1408 cm-1±2 cm-1, 1395 cm-1±2 cm-1, 1373 cm-1±2 cm-1, 1359 cm-1±2 cm-1, 1345 cm-1±2 cm-1, 1332 cm-1±2 cm-1, 1282 cm-1±2 cm-1, 1247 cm-1±2 cm-1, 1214 cm-1±2 cm-1, 1173 cm-1±2 cm-1, 1135 cm-1±2 cm-1, 1114 cm-1±2 cm-1, 1054 cm-1±2 cm-1, 1030 cm-1±2 cm-1, 1000 cm-1±2 cm-1, 952 cm-1±2 cm-1, 914 cm-1±2 cm-1, 902 cm-1±2 cm-1, 883 cm-1±2 cm-1, 861 cm-1±2 cm-1, 839 cm-1±2 cm-1, 825 cm-1±2 cm-1, 789 cm-1±2 cm-1, 763 cm-1±2 cm-1, 736 cm-1±2 cm-1, 720 cm-1±2 cm-1 및 704 cm-1±2 cm-1에서 특징적 흡수 피크를 갖는, 식 (I)의 화합물의 결정형.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    악성 종양, 당뇨병 또는 류마티스 관절염의 치료용 약제로서 사용하기 위한 식 (I)의 화합물.
  13. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    악성 종양, 당뇨병 또는 류마티스 관절염의 치료용 약제로서 사용하기 위한 식 (I)의 화합물의 결정형.
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