TW202405169A - 活體內編輯ｋｌｋｂ１之方法 - Google Patents

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大衛 萊布沃爾
麥可 梅特蘭
遠欣 許
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Abstract

本文描述在臨床試驗中首次全身性投與基於CRISPR/Cas9之治療劑用於肝臟 KLKB1基因之活體內編輯。本文描述藉由全身性投與脂質奈米粒子組合物活體內編輯肝臟 KLKB1基因之方法，該組合物包含編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向該基因之指導RNA。本文亦描述生物安全指標及臨床功效指標之評價以及治療方法。

Description

活體內編輯KLKB1之方法
遺傳性血管水腫(HAE)係罕見的體染色體顯性遺傳病症，其特徵在於身體各個器官及組織之重度復發性及不可預測之發炎性發作，其可為疼痛的、使人虛弱的及危及生命的。遺傳性血管水腫源於血液中過量之舒緩肽促進血管通透性及腫脹發作。大多數HAE患者具有C1抑制劑(亦稱為C1酯酶抑制劑或C1-INH)蛋白質缺乏(降低水準之功能性C1-INH或正常水準之具有降低活性之變異體)。在缺乏足夠的C1-INH功能下，舒緩肽水準可能升高，引發血管滲漏，並導致腫脹發作。舒緩肽產生係經由胰舒血管素-激肽(接觸)路徑控制，該路徑由C1-INH內源性抑制。當高分子量激肽原(HMWK)由血漿胰舒血管素(pKal) (蛋白質前胰舒血管素之活化形式)裂解時形成舒緩肽。前胰舒血管素亦稱為KLKB1蛋白，由 KLKB1編碼。前胰舒血管素在肝臟中產生且分泌至血漿中，在血漿中其可由因子XIIa活化。一旦KLKB1活化變成胰舒血管素，pKal便立即可增加舒緩肽水準。血液中過量之舒緩肽導致流體通過血管壁滲漏至身體組織中。身體組織中流體之過量累積導致在患有HAE之個體中可見之腫脹發作。
使用藥物來防止發作(預防)或按需治療發作。由於按需治療係在HAE發作開始時投與，預防劑需要每週兩次之長期靜脈內(IV)或皮下(SC)投與或每日口服投與，以確保恆定路徑抑制從而控制疾病。儘管長期投與，但仍會發生突破性發作。
多個新治療策略已改良HAE患者之結果(Busse及Christiansen, 2020)。該等策略基於調節舒緩肽之異常產生之生物化學路徑之詳細表徵且經設計以恢復接觸活化路徑之正常功能。該等策略包括C1酯酶抑制劑(C1-INH)替代(重組或血漿源性)、B2舒緩肽受體(B2R)抑制(艾替班特(icatibant))及胰舒血管素抑制(艾卡拉肽(ecallantide)、拉那利尤單抗(lanadelumab)、貝羅司他(berotralstat))。然而，在相當大比例之患者中發生注射位點反應(使用拉那利尤單抗)及胃腸副作用(使用貝羅司他) (Cohn等人，2020)。
藉由再平衡接觸活化路徑之功能(包括持續敲低前胰舒血管素)增強舒緩肽之異常產生之調節可轉成改良患有HAE之個體之結果。因此，業內仍迫切地需要能夠在基因表現中產生長效作用(例如敲低前胰舒血管素)而無需長期投與之基因編輯療法。
本揭示案描述全身性投與基於CRISPR/Cas9之治療劑用於 KLKB1之活體內編輯。在一些實施例中，本發明提供使用單指導RNA及Cas9核酸酶(例如CRISPR/Cas9系統)實質上減少或敲低 KLKB1基因之表現、由此實質上減少或消除與經由接觸活化路徑傳訊相關之前胰舒血管素產生的方法。經由改變 KLKB1基因實質性減少或消除前胰舒血管素蛋白之產生可為血漿胰舒血管素水準之長期降低或消除，例如血漿胰舒血管素之耐久減少。其他實施例包括用於將CRISPR/Cas9 RNA組分活體內肝臟靶向LNP遞送至人類個體之脂質奈米粒子系統，例如靶向 KLKB1基因之單指導RNA及編碼Cas9核酸酶之mRNA，及使用該脂質奈米粒子系統之方法。
提供以下非限制性實施例： 1.    在第一實施例中，本文揭示治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA。 2.    在第二實施例中，本文揭示預防人類個體之HAE發作之方法，其包括向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA。 3.    在第三實施例中，本文揭示降低患有HAE之人類個體之血管水腫發作頻率之方法，其包括向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA。 4.    在第四實施例中，本文揭示在患有HAE之人類個體中活體內編輯胰舒血管素( KLKB1)基因之方法，其包括：a.向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向 KLKB1基因之指導RNA；及b.在個體之肝細胞中在由指導RNA靶向之位點處編輯 KLKB1基因；其中與基線水準相比，投與組合物導致個體之臨床指標水準之臨床上顯著之改良。 5.    在第五實施例中，本文揭示治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括：a.向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向 KLKB1基因之指導RNA，其中指導RNA包含含有核苷酸序列GGAUUGCGUAUGGGACACAA (SEQ ID NO: 15)之靶向序列， 其中相對於基線總血漿胰舒血管素蛋白水準，投與組合物降低總血漿胰舒血管素蛋白水準。 6.    在第六實施例中，本文揭示治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括：a.向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA；b.在投與之前確定個體之臨床指標之第一水準；c.在投與後一段時間確定個體之臨床指標之第二水準；及d.評價臨床指標之第一水準與第二水準之間的變化，其中投與組合物導致個體之臨床指標水準與基線水準相比改良之變化，從而治療HAE。 7.    在第七實施例中，本文揭示治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括：a.向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA；b.在投與之前確定個體之生物安全指標之第一水準；c.在投與後一段時間確定個體之生物安全指標之第二水準；及d.評價生物安全指標之第一水準與第二水準之間的變化，其中投與組合物導致個體之生物安全指標水準與基線水準相比可接受之變化。 8.    在第八實施例中，本文揭示治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括：a.向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向 KLKB1基因之指導RNA，其中與臨床指標之基線水準相比，投與組合物導致個體之臨床指標水準之臨床上顯著之改良。 9.    在第九實施例中，本文揭示治療人類個體之HAE之方法，其包括：a.向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向 KLKB1基因之指導RNA，其中編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA係以約25 mg至約75 mg之組合劑量投與。 10.  在第十實施例中，本文揭示治療人類個體之HAE之方法，其包括：a.向人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之：i.編碼Cas核酸酶之mRNA，及ii.靶向 KLKB1基因之指導RNA，其中編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA係以約50 mg至約75 mg之組合劑量投與。 11.  本文提供如實施例1-10中任一者之方法，其中在投與組合物後，胰舒血管素蛋白水準降低至少60%。 12   本文提供如實施例1-11中任一者之方法，其進一步包括在投與組合物後，使胰舒血管素活性水準降低至少60%。 13.  本文提供如實施例1-4或6-12中任一者之方法，其中指導RNA包含含有核苷酸序列GGAUUGCGUAUGGGACACAA (SEQ ID NO: 15)之靶向序列。 14.  本文提供如實施例1-13中任一者之方法，其中指導RNA進一步包含含有核苷酸序列 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 387)之支架序列。 15.  本文提供如實施例1-14中任一者之方法，其中指導RNA係包含核苷酸序列mG*mG*mA*UUGCGUAUGGGACACAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 391)或由其組成之經修飾之指導RNA，其中m指示2’-O-甲基修飾之核苷酸且*指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。 16.  本文提供如實施例1-15中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物時，同時用HAE預防治療個體。 17.  本文提供如實施例16之方法，其中HAE預防包含選自以下之劑：C1酯酶抑制劑(C1-INH)替代(例如重組或血漿源性)、B2舒緩肽受體(B2R)抑制劑(例如艾替班特)、胰舒血管素抑制劑(例如艾卡拉肽、拉那利尤單抗、貝羅司他)、減弱的雄激素(例如達那唑(danazol)、氧雄龍(oxandrolone)、司坦唑醇(stanozolol))或抗纖維蛋白溶解劑。在某些實施例中，HAE預防包含貝羅司他。在某些實施例中，HAE預防包含達那唑。在某些實施例中，HAE預防包含重組或血漿源性C1酯酶抑制劑(C1-INH)替代。在某些實施例中，HAE預防包含艾替班特。在某些實施例中，HAE預防包含艾卡拉肽。在某些實施例中，HAE預防包含拉那利尤單抗。在某些實施例中，HAE預防包含氧雄龍。在某些實施例中，HAE預防包含司坦唑醇。 18.  本文提供如實施例1-17中任一者之方法，其中在即將向人類個體全身性投與LNP組合物之前，個體具有90天內至少2次確診HAE發作之發作頻率。 19.  本文提供如實施例1-17中任一者之方法，其中在即將向人類個體全身性投與LNP組合物之前，個體具有每90天至少3次確診HAE發作之發作頻率。 20.  本文提供如實施例1-17中任一者之方法，其中在即將向人類個體全身性投與LNP組合物之前，個體具有每90天至少6次確診HAE發作之平均發作頻率。 21.  本文提供如實施例18-20中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物後緊接至少90天內，視情況地在向人類個體全身性投與LNP組合物後緊接至少6個月內，個體確診發作頻率降低至少50%。 22.  本文提供如實施例18-20中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物後緊接至少90天內，視情況地在向人類個體全身性投與LNP組合物後緊接6個月內，個體確診發作頻率降低至少80%。 23.  本文提供如實施例18-20中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物後緊接90天內，視情況地在向人類個體全身性投與LNP組合物後緊接6個月內，個體不具確診發作。 24.  本文提供如實施例18-20中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物後第29-112天時，視情況地在向人類個體全身性投與LNP組合物後第29-216天時，個體確診發作頻率降低至少80%。 25.  本文提供如實施例18-20中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物後第29-112天時，視情況地在向人類個體全身性投與LNP組合物後第29-216天時，個體確診發作頻率降低至少90%。 26.  本文提供如實施例18-20中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物後第29-112天時，視情況地在向人類個體全身性投與LNP組合物後第29-216天時，個體不具確診發作。 27.  本文提供如實施例16-26中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物的同時停用預防。 28.  本文提供如實施例16-27中任一者之方法，其中在向人類個體全身性投與LNP組合物後第36天時或之後，停用預防。 29.  本文提供如實施例1-28中任一者之方法，其中個體使用急性療法治療HAE發作之頻率降低。 30.  本文提供如實施例1-29中任一者之方法，其中與對照(例如在用組合物治療前之個體作為對照)相比，個體使用與HAE發作相關之住院之頻率降低。 31.  本文提供如實施例1-30中任一者之方法，其中個體之確診HAE發作之嚴重程度降低。 32.  本文提供如實施例1-31中任一者之方法，其中個體之確診重度HAE發作之頻率降低。 33.  本文提供如實施例1-31中任一者之方法，其中個體之確診HAE發作伴喉水腫之頻率降低。 34.  本文提供如實施例1-33中任一者之方法，其中個體具有改良之生活品質，視情況地如藉由MOXIE血管水腫生活品質評價所確定。 35.  本文提供如實施例1-34中任一者之方法，其中個體不耐受用減弱的雄激素長期治療，或在用減弱的雄激素治療的同時具有每90天至少1次之平均發作頻率。 36.  本文提供如實施例1-35中任一者之方法，其中個體係兒童、懷孕女性、患有肝病之個體、患有乳癌之個體、患有前列腺癌之個體、具有心血管風險因子之個體及患有肝細胞癌之個體。 37.  本文提供如實施例36之方法，其中個體係懷孕女性。 38.  本文提供如實施例1-37中任一者之方法，其中個體係具有生育潛能之女性。 39.  本文提供如實施例1-38中任一者之方法，其中個體已患有至少一次確診HAE發作伴喉水腫。 40.  本文提供如實施例1-28中任一者之方法，其中LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯。 41.  本文提供如實施例1-40中任一者之方法，其中LNP包含PEG脂質。 42.  本文提供如實施例41之方法，其中PEG脂質包含1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000。 43.  本文提供如實施例1-42中任一者之方法，其中LNP包含中性脂質。 44.  本文提供如實施例43之方法，其中中性脂質包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。 45.  本文提供如實施例1-44中任一者之方法，其中LNP組合物具有約5-7之N/P比率。 46.  本文提供如實施例1-45中任一者之方法，其中指導RNA及編碼Cas核酸酶之mRNA係以介於約5:1至約1:5範圍內之重量比存在。 47.  本文提供如實施例1-46中任一者之方法，其中mRNA編碼Cas9核酸酶。 48.  本文提供如實施例1-47中任一者之方法，其中mRNA編碼釀膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9。 49.  本文提供如實施例1-48中任一者之方法，其中編碼Cas核酸酶之mRNA經密碼子最佳化。 50.  本文提供如實施例1-49中任一者之方法，其中編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25-75 mg總RNA之組合劑量。 51.  本文提供如實施例1-50中任一者之方法，其中編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25 mg總RNA之組合劑量。 52.  本文提供如實施例1-50中任一者之方法，其中編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約50 mg總RNA之組合劑量。 53.  本文提供如實施例1-50中任一者之方法，其中編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約75 mg總RNA之組合劑量。 54.  本文提供如實施例1-53中任一者之方法，其中與投與組合物之前之基線總血漿胰舒血管素水準相比，投與組合物使總血漿胰舒血管素蛋白水準降低60%-95%、60%-90%、70%-95%、70%-90%或80%-95%。 55.  本文提供如實施例1-54中任一者之方法，其中與投與組合物之前之基線血漿胰舒血管素活性水準相比，投與組合物使血漿胰舒血管素活性降低60%-95%、60%-90%、70%-95%、70%-90%或80%-95%。 56.  本文提供如實施例54-55中任一者之方法，其中血漿胰舒血管素水準係在投與LNP組合物後至少28天確定。 57.  本文提供如實施例54-56中任一者之方法，其中血漿胰舒血管素水準係在投與LNP組合物後56天時確定。 58.  本文提供如實施例1-57中任一者之方法，其中投與組合物導致個體之生物安全指標水準與生物安全指標之基線水準相比可接受之變化。 59.  本文提供如實施例58之方法，其中生物安全指標係活化部分凝血激酶時間(aPTT)。 60.  本文提供如實施例58或59之方法，其中生物安全指標係丙胺酸胺基轉移酶(ALT)。 61.  本文提供如實施例58-60中任一者之方法，其中生物安全指標係天冬胺酸胺基轉移酶(AST)。 62.  本文提供如實施例58-61中任一者之方法，其中生物安全指標之變化在14天內消退。 63.  本文提供如實施例58-62中任一者之方法，其中生物安全指標係3級或更小。 64.  本文提供如實施例1-63中任一者之方法，其中組合物係與用於治療HAE之第二治療劑一起投與。 65.  本文提供如實施例64之方法，其中第二治療劑係HAE預防治療。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例圖解說明於附圖中。儘管本發明係結合所圖解說明之實施例來描述，但應理解其不欲將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲覆蓋所有替代、修改及等效內容，該等替代、修改及等效內容包括在如由所附實施例限定之本發明內。
在詳細描述本教示之前應理解，本揭示案並不限於具體組合物或製程步驟，因此可發生變化。應注意，除非上下文另外明確指明，否則如本說明書及所附實施例中所用，單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，例如，對「結合物」之提及包括複數種結合物，且對「細胞」之提及包括複數個細胞或細胞群體及諸如此類。如本文所用，術語「包括」及其語法變化形式意欲具有非限制性，使得清單中條目之列舉不欲排除可取代或添加至所列條目中之其他類似條目。
數字範圍包括限定範圍之數字。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，量測及可量測值應理解為近似值。另外，使用「包含(comprise)」、「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「含有(contain)」、「含有(contains)」、「含有(containing)」、「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(including)」不欲具有限制性。應理解，前述一般描述及詳細描述僅具有例示性及解釋性且並不限制教示。
除非本說明書中具體注明，否則本說明書中列舉「包含」各個組分之實施例亦預期為「由所列舉組分組成」或「基本上由所列舉組分組成」；本說明書中列舉「由各個組分組成」之實施例亦預期為「包含所列舉組分」或「基本上由所列舉組分組成」；且本說明書中列舉「基本上由各個組分組成」之實施例亦預期為「由所列舉組分組成」或「包含所列舉組分」(此可互換性並不適用於在申請專利範圍中使用該等術語)。
除非上下文另有明確指示，否則術語「或」係以包涵之含義使用，即等效於「及/或」。
術語「約」在用於清單或範圍之前時修飾該清單或範圍之每一成員。術語「約」或「大約」意指如由熟習此項技術者測定之特定值之可接受之誤差，此部分取決於量測或測定值之方式。舉例而言，在一些實施例中，約包括在平均值之2個標準偏差內。在本發明之一些實施例中，「約」包括所述值之±10%或視情況地±5%。應理解，一些值係固有地可變的，例如一個月中之天數係變化的，且出於監測之目的，在此項技術內存在接受的公差用於以較不頻繁之間隔監測。
數字或一系列數字之前之術語「至少」應理解為包括鄰近術語「至少」之數字，及在邏輯上可包括之所有後續數字或整數，如根據上下文清楚可見。舉例而言，核酸分子中之核苷酸數必須係整數。舉例而言，「20個核苷酸之核酸分子之至少18個核苷酸」意指，18個、19個或20個核苷酸具有所指示之性質。當在一系列數字或範圍之前存在至少時應理解，「至少」可修飾該系列或範圍中之每一數字。
如本文所用，「不超過」或「小於」應理解為鄰近該片語之值及邏輯較低之值或整數，如根據上下文在邏輯上至0。例如，「不超過2個核苷酸鹼基對」之雙鏈區具有2、1或0個核苷酸鹼基對。當「不超過」或「小於」出現在一系列數字或範圍之前時，應理解該系列或範圍中之每一數字被修飾。
如本文所用，範圍包括上限及下限二者。
如本文所用，應理解，當值之最大量表示為100% (例如100%抑制或100%囊封)時，該值受偵測方法之限制。舉例而言，100%抑制應理解為抑制至低於分析之偵測水準之水準，且100%囊封應理解為在囊泡外無法偵測到意欲用於囊封之材料。
除非另有說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義。
「mRNA」在本文中用於指包含RNA或經修飾RNA之多核苷酸，其包括可轉譯成多肽之開放閱讀框(即，可充當核糖體及胺基醯化tRNA之轉譯受質)。mRNA可包含包括核糖殘基或其類似物(例如，2’-甲氧基核糖殘基)之磷酸酯-糖主鏈。在一些實施例中，核酸磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2’-甲氧基核糖殘基或其組合組成。一般而言，mRNA不含大量胸苷殘基(例如0個殘基或少於30個、20個、10個、5個、4個、3個或2個胸苷殘基；或小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%胸苷含量)。mRNA可在其一些或所有尿苷位置含有經修飾之尿苷。
「多核苷酸」及「核酸」在本文中用於指包含核苷或核苷類似物之多聚體化合物，該等核苷或核苷類似物具有沿主鏈連接在一起之含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習用RNA、DNA、混合RNA-DNA及作為其類似物之聚合物。在一些實施例中，多核苷酸係經化學合成或活體外轉錄。多核苷酸可為mRNA，例如包含經修飾尿苷之活體外轉錄RNA。核酸「主鏈」可由多個鍵聯構成，包括糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代(例如2’甲氧基或2’鹵化物取代)之類似化合物。RNA可包含DNA或一或多種去氧核苷或去氧核苷類似物。
「指導RNA」、「gRNA」及「指導物」在本文中可互換使用且係指使Cas核酸酶靶向基因體位置之RNA，例如crRNA (亦稱為CRISPR RNA)、或crRNA及trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。此項技術中已知Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)之同源指導RNA結構。指導RNA之crRNA及trRNA序列可締合為單一RNA分子(單指導RNA，sgRNA)或作為例如單獨RNA分子(雙指導RNA、dgRNA)。trRNA可為天然存在之序列，或與天然存在之序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。指導RNA可包括如本文所述之經修飾RNA。
如本文所用，「指導序列」係指指導RNA內與靶序列互補且用於將指導RNA引導至靶序列以供Cas核酸酶結合或修飾(例如，裂解)之序列。「指導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔體序列」。指導序列之長度可為20個鹼基對，例如在釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes) (即Spy Cas9)及相關Cas9同源物/異種同源物之情形下，例如長度為18個、19個或20個連續核苷酸之指導物靶序列。在一些實施例中，指導序列及靶區域可為100%互補或一致的。在一些實施例中，指導序列及靶區域可含有1或2個錯配，其中指導序列包含靶區域之20個核苷酸。
Cas蛋白之靶序列包括基因體DNA之正股及負股二者(即給定序列及該序列之反向互補序列)，此乃因Cas蛋白之核酸受質係雙股核酸。因此，當稱指導序列「與靶序列互補」時，應理解指導序列可引導指導RNA結合至靶序列之反向互補序列。因此，在一些實施例中，當指導序列結合靶序列之反向互補序列時，指導序列與靶序列(例如，不包括PAM之靶序列)之某些核苷酸一致，指導序列中U對T之取代除外。
如本文所用，「Cas核酸酶」意指具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，例如Cas9核酸酶，其中DNA結合活性具有序列特異性且取決於指導RNA之序列。例示性Cas核酸酶(亦及「Cas蛋白」)包括Cas裂解酶，即Cas核酸酶係裂解DNA之兩個股之dsDNA裂解酶。如本文所用，「Cas9核酸酶」係單鏈多肽，例如具有dsDNA裂解酶活性之單鏈多肽。「Cas9」涵蓋Spy Cas9、本文所列之Cas9之變異體及其等效物。參見例如Makarova等人， Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人， Molecular Cell,60:385-397 (2015)。本文明確包括Spy Cas9 dsDNA裂解酶。如本文所用，Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶或釀膿鏈球菌Cas9核酸酶)之遞送包括多肽或mRNA之遞送。舉例而言，本文所述之LNP組合物可包含編碼Cas核酸酶之mRNA。
「經修飾之尿苷」在本文中用於指除胸苷外之核苷，其具有與尿苷相同之氫鍵受體及一或多個與尿苷之結構差異。在一些實施例中，經修飾之尿苷係經取代之尿苷，即其中一或多個非質子取代基(例如烷氧基，例如甲氧基)替代質子之尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係假尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係經取代之假尿苷，即其中一或多個非質子取代基(例如烷基，例如甲基)替代質子之假尿苷，例如N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係經取代之尿苷、假尿苷或經取代之假尿苷中之任一者。
如本文所用之「尿苷位置」係指由尿苷或經修飾之尿苷佔據之多核苷酸位置。因此，例如，其中「100%之尿苷位置係經修飾之尿苷」之多核苷酸在相同序列之習用RNA (其中所有鹼基皆係標準A、U、C或G鹼基)中為尿苷之每個位置含有經修飾之尿苷。除非另有指示，否則本揭示案中或本揭示案所附之序列表(sequence table)或序列表(sequence listing)之多核苷酸序列中之U可為尿苷或經修飾之尿苷。
如本文所用，「治療」係指用於個體之疾病或病症之治療劑之任何投與或施用，且包括抑制疾病、減輕疾病之一或多個症狀、治癒疾病、降低HAE發作頻率、降低HAE發作之嚴重程度、改良本文所述之一或多個臨床指標(例如適宜生活品質(QoL)問卷，例如MOXIE血管水腫生活品質(AE-QoL)問卷)或防止疾病之一或多個症狀再發。在一些實施例中，HAE之治療包括降低HAE發作頻率。在一些實施例中，HAE之治療可包括 KLKB1基因表現之實質性減少或敲低，例如至少60%之總血漿胰舒血管素蛋白水準之耐久降低，由此實質上減少或消除與HAE相關之胰舒血管素蛋白產生。在一些實施例中，HAE之治療可包括 KLKB1基因表現之實質性減少或敲低，例如至少80%之總胰舒血管素蛋白水準之耐久降低，由此實質上減少或消除與HAE相關之胰舒血管素蛋白產生。
如本文所用，「同時治療」及諸如此類應理解為，用基於藥物動力學性質(例如半衰期)可能具有藥效學效應之兩種或更多種劑治療。如本文所用，在向人類個體全身性投與LNP組合物時關於用HAE預防劑治療之「同時治療」應理解為在距HAE預防劑之給藥時間之五個半衰期內。該等劑之半衰期為此項技術中已知且各種劑之例示性值提供於本文中。對於尤其長效之劑，可定義清除時段，在此期間長效劑可能具有藥效學效應。在與用HAE預防劑治療相關之清除時段期間向人類個體全身性投與LNP組合物將理解為同時治療。
如本文所用，「敲低」係指藉由基因編輯使樣品中(例如細胞、細胞群體、組織、器官或流體中)特定基因產物(例如 KLKB1或胰舒血管素)之表現減少；其中樣品視情況地係個體樣品。在一些實施例中，基因編輯可藉由序列(例如下一代定序(NGS))來評價。與適宜對照(例如個體之基線或治療之前)相比，表現可減少至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或減少至低於分析之偵測水準。量測mRNA敲低之方法為已知且包括自所關注組織或細胞群體(例如在肝細胞中)分離之mRNA之定序。蛋白質之敲低可藉由偵測來自所關注組織、細胞群體或流體(例如非人類靈長類動物之血漿、人類之血漿及小鼠之血清)之蛋白質之量來量測。流式細胞術分析係已知用於量測蛋白質表現之敲低之方法。對於分泌蛋白，可在流體(例如組織培養基或血液、或衍生自其之血清或血漿)中評價敲低。血漿蛋白水準可藉由定量分析(例如ELISA)來量測，且用於偵測敲低。在一些實施例中，「敲低」可指特定基因產物之一定表現損失，例如轉錄或轉譯成全長蛋白質之全長野生型mRNA之量之減少，或由細胞群體表現之蛋白質之量之減少。在某些實施例中，可對樣品進行處理，例如以在實施酶分析之前活化樣品中之產物。在一些實施例中，「敲低」可指特定基因產物(例如胰舒血管素)之一定表現損失。
如本文所用，胰舒血管素敲低之上下文中之「耐久」 (例如耐久敲低)或「耐久地」減少基因(例如 KLKB1基因)之表現係指持續效應，例如基因表現之持續敲低或持續減少。在一些實施例中，血漿胰舒血管素之耐久敲低係指維持之降低(相對於基線之水準)，如在劑量後時間點所量測，以在投與LNP組合物後≥約28天時(例如在約56天時，例如在至少6個月、9個月、1年、2年、3年、4年、5年或更長時間內)達到最大降低。在一些實施例中，維持之水準可發生變化。在一些實施例中，降低與所治療病症之期望臨床功效相關。達成給定病症(例如HAE)之期望臨床功效之降低水準為此項技術中已知。舉例而言，降低至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大與特定病症之期望臨床功效相關。舉例而言，降低至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大與HAE之期望臨床功效相關。
如本文所用，「有效量」或「治療有效量」係指能夠產生治療效應之編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA的量，該治療效應包括在投與編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA後，降低HAE發作頻率、降低血漿胰舒血管素活性、降低個體之總血漿胰舒血管素水準(例如相對於基線總血漿胰舒血管素水準降低至少60%、或使總血漿胰舒血管素減少至小於約20 µg/mL)。例如，LNP組合物可包含有效量之編碼Cas核酸酶之mRNA及指導RNA，例如靶向 KLKB1之指導RNA (組合或總RNA)。在一些實施例中，LNP組合物遞送編碼Cas9核酸酶之mRNA及單指導RNA，其可包含「有效量」之量測為總RNA之RNA。在一些實施例中，相對於基線血漿胰舒血管素水準，例如總血漿胰舒血管素水準，有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及單指導RNA使個體之血清胰舒血管素水準降低至少60%、或降低60%-95%、60%-90%、70%-95%、70%-90%或80%-95%。在一些實施例中，在投與編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1之單指導RNA後，有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及單指導RNA使總血漿胰舒血管素減少至小於約20 µg/mL、小於約15 µg/mL或小於約10 µg/mL。
如本文所用，「生物安全指標」係指用於監測與將本文所述之LNP組合物投與人類個體相關之安全事件之臨床指標。生物安全指標可允許確定安全事件，包括不良事件(NCI-CTCAE 3級或更高)、嚴重不良事件、特別關注之不良事件或治療緊急不良事件(CTCAE 3級或更高)，如本文所述。用於確定安全事件(例如不良事件)之嚴重程度之指南為此項技術中已知(例如不良事件通用術語標準(Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE)，包括國家癌症研究院(National Cancer Institute，NCI)-CTCAE，5.0版)。在一些實施例中，生物安全指標係肝酶水準，例如ALT、AST。在一些實施例中，生物安全指標係aPTT。在一些實施例中，不良事件係輸注相關反應(IRR)，例如潮紅、呼吸困難、胸痛、暈厥、皮疹、心率增加及/或面部水腫。在一些實施例中，生物安全指標之水準係在投與LNP組合物之前量測。在一些實施例中，生物安全指標之水準係在投與LNP組合物之後量測。在一些實施例中，生物安全指標之水準係在投與LNP組合物之前及之後量測，由此允許比較在用LNP組合物治療之前及之後生物安全指標之水準，以確定變化，例如可接受之變化。如本文所用，「可接受之」變化係指生物安全指標水準之變化，其中所得變化並不構成安全事件(例如不良事件(NCI-CTCAE 3級或更高)、嚴重不良事件、特別關注之不良事件、治療緊急不良事件(CTCAE 3級或更高))或如由臨床醫師所確定另外需要停止研究藥物之事件。在一些實施例中，在投與LNP組合物之前量測之生物安全指標之水準可充當用於與在投與LNP組合物之後量測之一或多個生物安全指標水準進行比較之基線(例如，可將在投與後之特定間隔進行之量測與基線水準進行比較)。在一些實施例中，基線係在投與LNP組合物之前進行之末次可用量測。在一些實施例中，若單獨值可用於確定安全事件，則生物安全指標不與基線進行比較。
如本文所用，「安全且充分耐受」係指不存在如本文所述之安全事件，例如不存在：不良事件(NCI-CTCAE 3級或更高)、嚴重不良事件、治療緊急不良事件(CTCAE 3級或更高)或如由臨床醫師所確定另外需要停止研究藥物之事件。在一些實施例中，「安全且充分耐受」包括經歷NCI-CTCAE 3級或更高之不良事件之患者，該不良事件與投與本文所述之組合物(例如包含有效量之編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1之指導RNA之LNP組合物)無關，或例如在干預或不干預下，在該事件之可接受之時間段後消退。
在一些實施例中，特別關注之不良事件包括例如輸注相關反應(IRR) (例如需要治療或停止輸注，或3級或更高)；發生細胞介素釋放症候群；由臨床上相關之異常出血或血栓性或出血性發生率或CTCAE ≥ 2級異常血液測試結果定義的異常凝血發現；由ALT之CTCAE ≥ 2級升高、AST之CTCAE ≥ 2級升高、總膽紅素之CTCAE ≥ 2級升高、CTCAE ≥ 2級證實之急性肝損傷。
在一些實施例中，不良事件係投與研究藥物或已經受研究程序之個體中之任何不利醫療事故，且不必與治療具有因果關係。在一些實施例中，不良事件係與治療暫時相關之非預期徵象(包括異常實驗室發現)、症狀或疾病，無論是否與藥物(研究)產品相關。在一些實施例中，不良事件誘發臨床徵象或症狀。在一些實施例中，不良事件需要積極干預。在一些實施例中，不良事件需要中斷或停止治療。在一些實施例中，不良事件係在研究者看來在臨床上顯著之異常。不良事件之分級標準為此項技術中已知，例如不良事件通用術語標準(CTCAE)，包括國家癌症研究院(NCI)-CTCAE。
生物安全指標包括通常與例如凝血、血液學、臨床化學、尿液分析及其他生物分析評價(例如細胞介素、補體)相關之已知實驗室評價。特定生物安全指標包括(但不限於)：肝酶水準(例如在投與治療後，丙胺酸胺基轉移酶(ALT)或天冬胺酸胺基轉移酶(AST)之升高＞ 5 × ULN超過4週；在投與治療後，ALT或AST ＞ 3 × ULN且總膽紅素＞ 2 × ULN (海氏定律(Hy’s law)))；在投與治療後，活化部分凝血激酶時間(aPTT)之水準(例如aPTT之升高) ＞ 5 × ULN超過4週；凝血酶原時間(PT)之水準、凝血酶產生時間(TGT) (例如峰高、延遲時間或內源凝血酶潛能)之水準、纖維蛋白原之水準、凝血酶原國際正規化(INR)比率、水準、d-二聚體之水準、與散播性血管內凝血一致之實驗室參數、血液學值之變化(例如在投與治療後，CTCAE ＞ 2級異常血液測試結果)、化學值之變化、凝血之變化、尿液分析之變化、麩胺酸去氫酶之水準、C-反應蛋白之水準、補體(C3a、C5a、Bb)之水準、細胞介素(GM-CSF、INF-g、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-23、TNF-a、IL-17、MCP-1)之水準、急性肝損傷(例如在投與治療後，ALT、AST、總膽紅素或臨床上相關之肝損傷症狀/徵象之CTCAE ＞ 2級升高)及12導程心電圖之變化。此項技術中已知其他生物安全指標，包括與投與LNP組合物相關之彼等生物安全指標。類似地，生物安全指標之可接受之水準或變化為此項技術中已知且可藉由常規方法、例如由臨床醫師或實驗室來評價。
如本文所用，「臨床功效指標」係指用於評價用本文所述之LNP組合物治療之人類個體之疾病改善的指標。在一些實施例中，臨床功效指標之水準係在投與LNP組合物之後量測。在一些實施例中，臨床功效指標之水準係在投與LNP組合物之前及之後量測，由此允許比較在用LNP組合物治療之前及之後臨床功效指標之水準。在一些實施例中，隨時間確定功效指標，例如每月發作頻率，例如給定時間段(例如三個月時段)內之每月平均發作頻率(例如HAE發作次數之減少、突破性發作、在給定時間段內無發作之患者數量或比例、與HAE發作相關之住院之頻率、或使用與HAE發作相關之急性療法之頻率)。在一些實施例中，在投與LNP組合物之前量測之臨床指標之水準可充當與在投與LNP組合物之後量測(在投與LNP後立即量測，或在允許LNP組合物開始發揮作用之間隔後量測，例如在投與LNP組合物後29天時開始量測)之一或多個臨床指標水準進行比較之基線或對照。在一些實施例中，基線係在投與LNP組合物之前進行之末次可用量測。
對於特徵在於HAE發作之病症，臨床功效指標包括(但不限於)：總血漿胰舒血管素蛋白水準之降低(例如在投與治療後，如例如藉由ELISA所量測，總血漿胰舒血管素蛋白降低60%)、血漿總胰舒血管素活性之降低(例如血漿胰舒血管素活性降低至少60%)。其他臨床功效指標包括HAE發作頻率(例如HAE發作次數之減少、突破性發作、在給定時間段內未發作之患者數量或比例、與HAE發作相關之住院之頻率、或使用與HAE發作相關之急性療法之頻率)及HAE發作嚴重程度。本文提供確診HAE發作及對HAE發作分級之方法。下文提供「確診」 HAE發作之標準。在一些實施例中，「確診」 HAE發作係由醫師確定。
類似地，臨床功效指標之「臨床上顯著之改良」、即指示疾病改善之臨床功效指標(包括HAE發作頻率，例如確診HAE發作頻率及HAE發作嚴重程度)之水準或變化為此項技術中已知且可藉由常規方法、例如由健康護理專業人員或實驗室來評價。舉例而言，血漿胰舒血管素蛋白水準(例如總血漿胰舒血管素蛋白水準)係HAE之臨床功效指標。與基線(例如用本文所述之LNP組合物治療前)相比，用於治療HAE之此臨床功效指標之「臨床上顯著之改良」包括例如在治療後，例如在治療後立即或在治療後之預定時段開始，總血漿胰舒血管素蛋白水準降低至少60%、70%、80%、85%、90%或95%。舉例而言，HAE發作頻率(例如確診每月發作頻率，例如3個月或6個月時段內之平均確診每月發作頻率)之降低亦係HAE之臨床功效指標。與基線(例如治療前，例如用本文所述之LNP組合物治療前)相比，用於治療HAE之此臨床功效指標之「臨床上顯著之改良」包括在治療後，發作頻率降低至少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%。
如本文所用，術語「脂質奈米粒子」 (LNP)係指包含複數個(即一個以上)脂質分子之粒子，該等脂質分子藉由分子間力彼此物理締合並且囊封RNA。參見例如WO2017173054及WO2019067992，該等專利之內容之全文皆以引用方式併入本文中。
如本文所用，片語「醫藥學上可接受」意指，其可用於製備醫藥組合物，該醫藥組合物通常係無毒的且並非生物學上不期望的並且對於醫藥用途原本並非不可接受的。在某些實施例中，醫藥學上可接受之組合物係無菌的。在某些實施例中，醫藥學上可接受之組合物係非致熱的。
如本文所用，全身性投與可藉由靜脈內輸注來進行。「輸注」係指一或多種劑之主動投與，輸注時間例如大約為2小時。在一些實施例中，輸注時間係在打開含有LNP組合物之小瓶之6小時內完成。在一些實施例中，將LNP (例如包含本文所述之編碼Cas9核酸酶之mRNA及本文所述之sgRNA)全身性投與人類個體。
如本文所用，「輸注預防」係指在治療前投與個體之方案(例如包括投與LNP)，其包括例如在LNP組合物之前8至24小時口服地塞米松(dexamethasone) 8 mg或等效物；及靜脈內類固醇(例如地塞米松10 mg)；靜脈內H1阻斷劑(例如苯海拉明(diphenhydramine) 50 mg)或口服H1阻斷劑(例如西替利嗪(cetirizine) 10 mg)；及在投與LNP組合物之前約1-2小時靜脈內或口服投與H2阻斷劑(例如啡莫替定(famotidine) 20 mg)。 I. 靶向基因之組合物
本文揭示編輯人類個體之肝臟中之所關注基因(例如 KLKB1)、修飾個體肝細胞中之基因或治療疾病的方法，以及相關組合物，包括用於該等方法中之組合物。一般而言，本文揭示LNP組合物，其包含編碼Cas核酸酶(例如Cas9)之mRNA及靶向基因之指導RNA，例如靶向 KLKB1基因之指導RNA。用該等方法及組合物治療之個體可具有所關注序列之野生型或非野生型基因，例如患有HAE之個體。
在一些實施例中，本文所揭示之方法包括全身性投與脂質奈米粒子系統用於指導RNA及編碼Cas核酸酶之mRNA之活體內肝臟遞送。 1. 指導 RNA (gRNA)
所揭示方法及組合物中所用之單指導RNA包含靶向所關注基因(例如 KLKB1基因)之指導序列，其包含核苷酸序列GGAUUGCGUAUGGGACA CAA (SEQ ID NO: 15)之至少18個連續核苷酸、較佳地20個核苷酸。
在sgRNA之情形下，上述指導序列可進一步包含額外核苷酸以形成sgRNA，例如具有指導序列3’端之5’至3’取向之以下例示性核苷酸序列3’：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAA UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 387)，提供具有核苷酸序列GGAUUGCGUAUGGGACACAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 388)之sgRNA。在替代實施例中，sgRNA可包括指導序列3’端之以下例示性核苷酸序列3’：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGU CCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 389)。在替代實施例中，sgRNA可包括指導序列3’端之以下例示性核苷酸序列3’：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 390)。
在一些實施例中，sgRNA經修飾。在一些實施例中，sgRNA包含5'端修飾、3'端修飾或5'及3'端修飾。在一些實施例中，sgRNA包含下文SEQ ID NO: 391中所示之修飾模式，其中經修飾之sgRNA包含以下序列：mG*mG*mA*UUGCGUAUGGGACACAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 391)，其中A、C、G及U分別指示RNA核苷(2’-OH)腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿苷；mA、mC、mG及mU分別指示2’-O-甲基修飾之腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿苷；且*指示硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，gRNA包含將Cas9核酸酶(例如SpyCas9核酸酶)引導至靶DNA序列之指導序列。sgRNA包含靶向序列GGAUUGCGUAUGGG ACACAA (SEQ ID NO: 15)之18個、19個或20個連續核苷酸。
本文所提供之單指導RNA可藉由使靶向序列與靶序列雜交用於識別 KLKB1基因體基因座中之靶序列。舉例而言，所關注靶序列之基因由包含指導RNA之所提供Cas9裂解酶識別及裂解。因此，Cas9裂解酶(例如Spy Cas9裂解酶)由指導RNA引導至 KLKB1基因體基因座中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交，且Cas9裂解酶(例如Spy Cas9裂解酶)在基因體基因座中之靶序列內裂解。 2.    gRNA 之修飾
在一些實施例中，gRNA經化學修飾。包含一或多個經修飾核苷或核苷酸之gRNA稱為「經修飾之」gRNA或「經化學修飾之」gRNA，以描述一或多種非天然或天然存在組分或組態之存在，該等組分或組態用於代替或補充規範A、G、C及U殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA係用不規範的核苷或核苷酸合成，在本文中稱為「經修飾」。
經修飾之指導RNA可包含具有沿主鏈連接在一起之含氮雜環鹼基或鹼基類似物之核苷或核苷類似物，包括習用RNA、DNA、混合RNA-DNA及作為其類似物之聚合物。指導RNA 「主鏈」可由多個鍵聯構成，包括糖-磷酸二酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯或其組合中之一或多者。指導RNA之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代(例如2’甲氧基)之類似化合物。含氮鹼基可為習用鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾之尿苷，例如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他尿苷)；肌苷；嘌呤或嘧啶之衍生物(例如，N 4-甲基去氧鳥苷、去氮雜嘌呤或氮雜嘌呤、去氮雜嘧啶或氮雜嘧啶、在5位或6位具有取代基之嘧啶鹼基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2位、6位或8位具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲基胺基嘌呤、O 6-甲基鳥嘌呤、4-硫-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O 4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。關於指導RNA之化學修飾之一般論述參見 The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams等人編輯，第11版，1992。指導RNA可僅包含習用RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習用組分及取代(例如，具有2’甲氧基鍵聯之習用鹼基，或含有習用鹼基及一或多種鹼基類似物之聚合物)。RNA及DNA具有不同之糖部分且可因在RNA中存在尿嘧啶或其類似物且在DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物而不同。
未經修飾之核酸可能易於由例如細胞內核酸酶或在血清中發現之彼等核酸酶降解。舉例而言，核酸酶可水解核酸磷酸二酯鍵。因此，在一個態樣中，本文所述之gRNA可含有一或多個經修飾之核苷或核苷酸，例如以向細胞內核酸酶或基於血清之核酸酶引入穩定性。
硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指其中硫取代磷酸二酯鍵聯中、例如核苷酸鹼基之間的鍵中之一個非橋接磷酸氧之鍵。當使用硫代磷酸酯來產生寡核苷酸時，經修飾之寡核苷酸亦可稱為S-寡核苷酸。
「*」可用於描述PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示使用PS鍵與下一個(例如，3’)核苷酸連接之核苷酸。
在本申請案中，術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可用於表示已經2’-O-Me取代且使用PS鍵與下一個(例如，3’)核苷酸連接之核苷酸。
下圖顯示S-取代非橋接磷酸氧，產生PS鍵替代磷酸二酯鍵：
在一些實施例中，5'末端之前三個、前四個或前五個核苷酸中之一或多者以及3'末端之末三個、末四個或末五個核苷酸中之一或多者經修飾。在一些實施例中，修飾係2'-O-Me、2'-F、反向無鹼基核苷酸、PS鍵或在此項技術中熟知增加穩定性或性能的其他核苷酸修飾。
在一些實施例中，5'末端之前四個核苷酸及3'末端之末四個核苷酸利用硫代磷酸酯(PS)鍵連接。
在一些實施例中，例如，5'末端之前三個核苷酸及3'末端之末三個核苷酸包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，指導RNA包含經修飾之sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO: 391中所示之修飾模式，其中N係任一天然或非天然核苷酸，且其中N之整體包含將核酸酶引導至靶序列之指導序列。
在一些實施例中，指導RNA包含WO2021158858A1之表2中之任一者中所示之sgRNA，該專利之內容之全文皆併入本文中。在一些實施例中，指導RNA包含含有WO2021158858A1之表1之指導序列中之任一者的sgRNA，該專利之內容之全文皆併入本文中，且其中指導序列可如SEQ ID NO: 391中所示經修飾。在一些實施例中，指導RNA包含表24或表25中之任一者中所示之sgRNA。 3. 包含編碼 Cas9 核酸酶之開放閱讀框之 RNA
本文所揭示之包含編碼Cas9核酸酶(例如釀膿鏈球菌Cas9)之ORF之任一RNA可在組合物或方法中與本文所揭示之sgRNA組合。在本文所述之任一實施例中，包含編碼Cas9核酸酶之開放閱讀框之核酸可為mRNA。 改良蛋白質表現或對應於高表現 tRNA 之密碼子；例示性密碼子集
在一些實施例中，核酸包含具有改良哺乳動物(例如人類)中之蛋白質表現之密碼子的ORF。在其他實施例中，核酸包含具有改良人類器官(例如肝臟)中之蛋白質表現之密碼子的ORF。在其他實施例中，核酸包含具有改良人類細胞類型(例如肝細胞)中之蛋白質表現之密碼子的ORF。肝細胞、肝臟或人類等中蛋白質表現之改良可相對於ORF之轉譯野生型序列之程度、或相對於密碼子分佈匹配衍生出ORF之生物體或在胺基酸層級上含有最相似ORF之生物體(例如釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌( S. aureus)或另一原核生物)的密碼子分佈之ORF來確定，原核生物源性Cas核酸酶(例如來自下文所述之其他原核生物之Cas核酸酶)視情況而定。替代地，在一些實施例中，相對於具有SEQ ID NO: 393之序列(表23)之ORF之轉譯，在所有其他條件相同之情況下，包括任何適用的點突變、異源結構域及諸如此類，確定Cas9序列在哺乳動物、細胞類型、哺乳動物器官、人類、人類器官等中之蛋白質表現之改良。可用於增加人類(包括人類肝臟及人類肝細胞)中之表現之密碼子可為對應於在人類肝臟/肝細胞中高表現之tRNA之密碼子，其論述於Dittmar KA, PLos Genetics2(12): e221 (2006)中 。在一些實施例中，ORF中至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子係對應於在哺乳動物(例如人類)中高表現之tRNA (例如每一胺基酸之最高表現之tRNA)的密碼子。在一些實施例中，ORF中至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子係對應於在哺乳動物器官(例如人類器官)中高表現之tRNA (例如每一胺基酸之最高表現之tRNA)的密碼子。在一些實施例中，ORF中至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子係對應於在哺乳動物肝臟(例如人類肝臟)中高表現之tRNA (例如每一胺基酸之最高表現之tRNA)的密碼子。在一些實施例中，ORF中至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子係對應於在哺乳動物肝細胞(例如人類肝細胞)中高表現之tRNA (例如每一胺基酸之最高表現之tRNA)的密碼子。
替代地，一般而言可使用對應於在生物體(例如人類)中高表現之tRNA之密碼子。各種密碼子使用方案為此項技術中已知(參見例如WO2019067910、WO2020198641)且可應用於本文所提供之ORF。 例示性序列
在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之ORF包含與SEQ ID NO: 393-407、392及408中之任一者具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性之序列。
在一些實施例中，mRNA包含編碼Cas核酸酶之ORF，其中Cas核酸酶包含與SEQ ID NO: 406-407中之任一者具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之ORF包含根據表3中所提供之來自SEQ ID NO: 393-407、392及408中任一者之序列經密碼子最佳化的序列，或與SEQ ID NO: 393-407、392及408中之任一者具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性之序列。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對表明整個第二序列之X%或更多位置與第一序列匹配，則第一序列視為「包含與第二序列具有至少X%一致性之序列」。例示性比對演算法係Smith-Waterman及Needleman-Wunsch演算法，其為此項技術中所熟知。熟習此項技術者將理解什麼演算法及參數設置選擇適用於給定的欲比對之序列對；對於長度大致相似且胺基酸之預期一致性＞50%或核苷酸之預期一致性＞75%之序列，具有EBI在www.ebi.ac.uk web伺服器上提供之Needleman-Wunsch演算法界面之預設設置之Needleman-Wunsch演算法通常係適當的。 RNA 、 mRNA 及 ORF 之其他特徵
本文所述之任一其他特徵可在可行程度上與上文所述之任一實施例組合。 經編碼之 Cas 核酸酶
在一些實施例中，Cas9核酸酶具有裂解酶活性，其可亦稱為雙股核酸內切酶活性。Cas9核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌及其他原核生物之II型CRISPR系統之彼等Cas9核酸酶，及其經修飾(例如經改造或突變體)形式。參見例如US20160312198；US 20160312199。 聚 A 尾
在一些實施例中，RNA (例如mRNA)進一步包含聚腺苷酸化(聚A)尾。在一些情況下，聚A尾在聚A尾內之一或多個位置用一或多個非腺嘌呤核苷酸「錨」「中斷」，例如當聚A尾由質體編碼時。聚A尾可包含至少8個連續腺嘌呤核苷酸，且在一些實施例中，聚A尾亦包含一或多個非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，「非腺嘌呤核苷酸」係指不包含腺嘌呤之任何天然或非天然核苷酸。鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸係例示性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述之多核苷酸(例如mRNA)之聚A尾可包含位於編碼Cas核酸酶或所關注序列之核苷酸3’之連續腺嘌呤核苷酸。在一些情況下，mRNA上之聚A尾包含位於編碼Cas核酸酶或所關注序列之核苷酸3’之非連續腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以規則或不規則隔開之間隔中斷腺嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，聚A尾在用於mRNA活體外轉錄之質體中編碼且變成轉錄物之一部分。在質體中編碼之聚A序列(即聚A序列中連續腺嘌呤核苷酸之數量)可能並不精確，例如，質體中100個聚A之序列(SEQ ID NO: 410)可在經轉錄mRNA中產生高達100個聚A之序列(SEQ ID NO: 410)。在一些實施例中，經編碼聚A尾之長度係約90或95個核苷酸。在一些實施例中，聚A尾並不在質體中編碼，且藉由PCR加尾或酶加尾、例如使用大腸桿菌( E. coli)聚(A)聚合酶添加。 UTR ； Kozak 序列
在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之RNA (例如mRNA)包含5’ UTR、3’ UTR或5’及3’ UTR。在一些實施例中，RNA (例如mRNA)包含來自羥基類固醇17-β去氫酶4 (HSD17B4或HSD)之至少一個UTR，例如來自HSD之5’ UTR。在一些實施例中，RNA (例如mRNA)包含來自球蛋白mRNA (例如人類α球蛋白(HBA) mRNA、人類β球蛋白(HBB) mRNA或非洲爪蟾(Xenopus laevis) β球蛋白(XBG) mRNA)之至少一個UTR。在一些實施例中，多核苷酸(例如mRNA)包含來自球蛋白mRNA (例如HBA、HBB或XBG)之5’ UTR、3’ UTR或5’及3’ UTR。在一些實施例中，多核苷酸(例如mRNA)包含來自牛生長激素、巨細胞病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG之5’ UTR。在一些實施例中，多核苷酸(例如mRNA)包含來自牛生長激素、巨細胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG之3’ UTR。在一些實施例中，多核苷酸(例如mRNA)包含來自牛生長激素、巨細胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB、XBG、熱休克蛋白90 (Hsp90)、甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)、β-肌動蛋白、α-微管蛋白、腫瘤蛋白(p53)或表皮生長因子受體(EGFR)之5’及3’ UTR。
在一些實施例中，多核苷酸(例如mRNA)包含來自相同來源(例如組成型表現之mRNA，例如肌動蛋白、白蛋白或球蛋白，例如HBA、HBB或XBG)之5’及3’ UTR。
在一些實施例中，多核苷酸(例如mRNA)包含Kozak序列。Kozak序列為此項技術中已知。Kozak序列可影響轉譯起始及自核酸轉譯之多肽之總產量。Kozak序列包括可用作起始密碼子之甲硫胺酸密碼子。最小Kozak序列係NNNRUGN，其中以下中之至少一者為真：第一個N係A或G，及第二個N係G。在核苷酸序列之上下文中，R意指嘌呤(A或G)。在一些實施例中，Kozak序列係gccgccRccAUGG (SEQ ID NO: 392)，具有0個錯配或具有最多一個、兩個、三個或四個與小寫位置之錯配。 經修飾之核苷酸
在一些實施例中，包含編碼Cas9核酸酶之ORF之mRNA在一些或所有尿苷位置包含經修飾之尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係在5位、例如用鹵素或C1-C3烷氧基修飾之尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係在1位、例如用C1-C3烷基修飾之假尿苷。經修飾之尿苷可為例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其組合。在一些實施例中，經修飾之尿苷係5-甲氧基尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係5-碘尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係假尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係N1-甲基-假尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷係假尿苷及N1-甲基-假尿苷之組合。在某些實施例中，mRNA在所有尿苷位置包含N1-甲基-假尿苷。
在一些實施例中，核酸中至少80%、85%、90%、95%、98%或99%或100%之尿苷位置係經修飾之尿苷。在一些實施例中，核酸中80%-95%或90%-100%之尿苷位置係經修飾之尿苷，例如N1-甲基假尿苷、假尿苷或其組合。在一些實施例中，核酸中80%-95%或90%-100%之尿苷位置係假尿苷。在一些實施例中，核酸中80%-95%或90%-100%之尿苷位置係N1-甲基假尿苷。 5’ 帽
在一些實施例中，包含編碼Cas核酸酶(例如Cas9)之ORF之mRNA包含5’帽，例如Cap0、Cap1或Cap2。5’帽通常係7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸(其可進一步經修飾，如下文例如針對ARCA所論述)，其經由5’-三磷酸連接至核酸之5’至3’鏈之第一個核苷酸之5’位，即第一個帽近端核苷酸。在Cap0中，mRNA之第一個及第二個帽近端核苷酸之核糖皆包含2’-羥基。在Cap1中，mRNA之第一個及第二個轉錄核苷酸之核糖分別包含2'-甲氧基及2'-羥基。在Cap2中，mRNA之第一個及第二個帽近端核苷酸之核糖均包含2’-甲氧基。參見例如Katibah等人(2014) Proc Natl Acad Sci USA111(33):12025-30；Abbas等人(2017) Proc Natl Acad Sci USA114(11):E2106-E2115。
帽可以共轉錄方式包括在RNA中。舉例而言，ARCA (抗反向帽類似物；Thermo Fisher Scientific目錄號AM8045)係包含連接至鳥嘌呤核糖核苷酸之5’位之7-甲基鳥嘌呤3’-甲氧基-5’-三磷酸之帽類似物，其可在起始時活體外納入轉錄物中。ARCA產生一個Cap0帽，其中第一個帽近端核苷酸之2'位置係羥基。參見，例如，Stepinski等人，(2001) 「Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 『anti-reverse』 cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG,」 RNA 7: 1486-1495。ARCA結構如下圖所示。
CleanCap TMAG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies目錄號N-7113)或CleanCap TMGG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies目錄號N-7133)可用於共轉錄提供Cap1結構。CleanCap TMAG及CleanCap TMGG之3'-O-甲基化型式亦可自TriLink Biotechnologies分別以目錄號N-7413及N-7433獲得。CleanCap TMAG結構如下圖所示。CleanCap TM結構在本文中有時使用上文所列目錄號之末三個數位來提及(例如TriLink Biotechnologies目錄號N-7113之「CleanCap TM113」)。
替代地，帽可在轉錄後添加至RNA中。例如，牛痘加帽酶係市售的(New England Biolabs目錄號M2080S)，並且具有RNA三磷酸酶及鳥苷酸轉移酶活性，由其D1次單元提供，及鳥嘌呤甲基轉移酶活性，由其D12次單元提供。因此，其可在S-腺苷甲硫胺酸及GTP存在下將7-甲基鳥嘌呤添加至RNA中，以獲得Cap0。參見，例如Guo, P.及Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87, 4023-4027；Mao, X.及Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479。關於帽及加帽方法之其他論述參見例如WO2017/053297及Ishikawa等人， Nucl. Acids. Symp. Ser. (2009)第53期，129-130。 4. 核酸組合物之遞送
在一些實施例中，提供在 KLKB1內誘導雙股斷裂(DSB)或進行基因編輯之方法，其包括全身性投與包含如本文所述之指導RNA之組合物。在一些實施例中，全身性投與指導RNA以在 KLKB1中誘導DSB。指導RNA係與編碼Cas9核酸酶(例如釀膿鏈球菌Cas9)之mRNA一起全身性投與。在具體實施例中，指導RNA經化學修飾。在一些實施例中，指導RNA及編碼Cas9核酸酶之RNA係在本文所述之LNP (例如包含可離子化脂質之LNP)中全身性投與，該可離子化脂質在本文中稱為脂質A (其係(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯)。在其他實施例中，LNP包含脂質組分，其包括脂質A、輔助脂質(例如膽固醇)、隱形脂質(stealth lipid)(例如PEG脂質，例如PEG2k-DMG)及中性脂質(例如DSPC)。
在一些實施例中，提供在 KLKB1基因內誘導雙股斷裂(DSB)之方法，其包括全身性投與包含單指導RNA (例如經化學修飾之單指導RNA)之LNP組合物。指導RNA係與編碼Cas9核酸酶(例如釀膿鏈球菌Cas9)之本文所述之mRNA一起全身性投與。在具體實施例中，指導RNA經化學修飾。在一些實施例中，指導RNA及編碼Cas核酸酶之RNA係在本文所述之LNP (例如包含脂質A、輔助脂質(例如膽固醇)、隱形脂質(例如PEG脂質，例如PEG2k-DMG)及中性脂質(例如DSPC)之LNP)中全身性投與。
在一些實施例中，提供修飾 KLKB1基因之方法，其包括全身性投與包含單指導RNA (例如經化學修飾之單指導RNA)之組合物。指導RNA係與編碼Cas9核酸酶(例如釀膿鏈球菌Cas9)之本文所述之mRNA一起全身性投與。在具體實施例中，指導RNA經化學修飾。在一些實施例中，指導RNA及編碼Cas核酸酶之RNA係在本文所述之LNP (例如包含脂質A、輔助脂質(例如膽固醇)、隱形脂質(例如PEG脂質，例如PEG2k-DMG)及視情況地中性脂質(例如DSPC)之LNP)中全身性投與。
在一些實施例中，提供治療HAE之方法，其包括全身性投與包含靶向 KLKB1基因之單指導RNA之組合物。指導RNA係與編碼Cas9核酸酶(例如釀膿鏈球菌Cas9)之本文所述之mRNA一起全身性投與。在具體實施例中，指導RNA經化學修飾。在一些實施例中，指導RNA及編碼Cas核酸酶之核酸係在本文所述之LNP (例如包含脂質A、輔助脂質(例如膽固醇)、隱形脂質(例如PEG脂質，例如PEG2k-DMG)及中性脂質(例如DSPC)之LNP)中全身性投與。
在一些實施例中，提供降低血漿胰舒血管素蛋白水準或活性之方法，其包括全身性投與靶向 KLKB1基因之指導RNA。在一些實施例中，全身性投與gRNA以降低血漿胰舒血管素蛋白水準或活性。在一些實施例中，血漿胰舒血管素蛋白水準係總血漿胰舒血管素蛋白水準。gRNA係與編碼Cas9核酸酶(例如釀膿鏈球菌Cas9)之核酸一起全身性投與。在具體實施例中，指導RNA經化學修飾。在一些實施例中，指導RNA及編碼Cas核酸酶之mRNA係在本文所述之LNP (例如包含脂質A、輔助脂質(例如膽固醇)、隱形脂質(例如PEG脂質，例如PEG2k-DMG)及中性脂質(例如DSPC)之LNP)中全身性投與。
在一些實施例中，包含指導序列之gRNA與自核酸轉譯之Cas9核酸酶一起誘導DSB，且修復期間之非同源末端連接(NHEJ)導致 KLKB1基因之突變。在一些實施例中，NHEJ導致核苷酸之缺失或插入，此誘導 KLKB1基因中之框移或無義突變。 5. 脂質組合物
在一些實施例中，包含gRNA及編碼Cas核酸酶(例如Cas9)之本文所述核酸的本文所述之核酸組合物調配於脂質奈米粒子中或經由脂質奈米粒子全身性投與；參見例如標題為「LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS」之WO2017173054A1及標題為「FORMULATIONS」之WO2019067992A1，該等專利之內容、具體而言本文所揭示之LNP組合物之全文皆以引用方式併入本文中。熟習此項技術者已知能夠將治療RNA遞送至個體之脂質奈米粒子(LNP)可與本文所述之指導RNA及編碼Cas核酸酶之核酸一起使用。
包含LNP之組合物可包括兩種活性物質，即指導RNA及編碼Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶，例如Spy. Cas9核酸酶)之RNA，以及包含可離子化脂質之脂質組分。脂質奈米粒子意指包含藉由分子間力彼此物理締合之複數個(即一個以上)脂質分子之粒子。 可離子化脂質
用於將CRISPR/Cas mRNA及指導RNA組分遞送至肝臟細胞之脂質組合物可包含脂質A，其係(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯。脂質A可描述為： 。
脂質A可根據WO2015/095340 (例如第84-86頁)合成。 其他脂質
適用於本揭示案之脂質組合物中之「中性脂質」包括例如多種中性、不帶電或兩性離子脂質。適用於本揭示案中之中性磷脂之實例包括(但不限於) 5-十七基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-棕櫚醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、1,2-雙二十碳烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞油醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及其組合。在一個實施例中，中性磷脂可選自由二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)組成之群。在另一實施例中，中性磷脂可為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)。
「輔助脂質」包括類固醇、固醇及烷基間苯二酚。適用於本揭示案中之輔助脂質包括(但不限於)膽固醇、5-十七基間苯二酚及膽固醇半琥珀酸酯。在一個實施例中，輔助脂質可為膽固醇。
「隱形脂質」係改變奈米粒子可在活體內(例如在血液中)存在之時間長度之脂質，且隱形脂質可為PEG脂質。隱形脂質可藉由例如減少粒子聚集並控制粒子大小來輔助調配過程。本文所用之隱形脂質可調節LNP之藥物動力學性質。適用於本揭示案之脂質組合物中之隱形脂質包括(但不)。通常，PEG脂質包含脂質部分及基於PEG之聚合物部分。預期此項技術中已知之PEG脂質，包括包含「PEG-2K」(亦稱為「PEG 2000」)之脂質，其具有約2,000道爾頓之平均分子量。PEG-2K在本文中由下式(I)表示，其中n係45，此意指數量平均聚合度包含約45個次單元。然而，可使用此項技術中已知之其他PEG實施例。
在本文所述之任一實施例中，PEG脂質可選自PEG-二月桂醯基甘油、PEG-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG) (目錄號GM-020，來自NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二棕櫚醯基甘油、PEG-二硬脂醯基甘油(PEG-DSPE) (目錄號DSPE-020CN, NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二月桂基糖醯胺、PEG-二肉豆蔻基糖醯胺、PEG-二棕櫚醯基糖醯胺及PEG-二硬脂醯基糖醯胺、PEG-膽固醇(1-[8'-(膽固-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB (3,4-雙十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DMPE)或1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (PEG2k-DMG)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSPE) (目錄號880120C，來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020, NOF Tokyo, Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)及1,2-二硬脂醯氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSA)。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DMG。
在一些實施例中，PEG脂質包括甘油基團。在一些實施例中，PEG脂質包括二肉豆蔻醯基甘油(DMG)基團。在一些實施例中，PEG脂質包含PEG2k。在一些實施例中，PEG脂質係PEG-DMG。在一些實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG。在一些實施例中，PEG脂質係1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。在一些實施例中，PEG2k-DMG係1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。 LNP 調配物
LNP組合物可包含脂質組分及RNA組分，該RNA組分包括Cas核酸酶mRNA (例如Cas9 mRNA，例如Spy. Cas9 mRNA)及靶向 KLKB1之gRNA。在一些實施例中，LNP組合物包括編碼Cas9核酸酶之mRNA及gRNA作為RNA組分。在某些實施例中，LNP組合物可包含RNA組分、脂質A、輔助脂質、中性脂質及隱形脂質。在某些LNP組合物中，輔助脂質係膽固醇。在某些組合物中，中性脂質係DSPC。在其他實施例中，隱形脂質係PEG2k-DMG。
在某些實施例中，脂質組合物係根據調配物中組分脂質之各別莫耳比來描述。本揭示案之實施例提供根據調配物中組分脂質之各別莫耳比描述之脂質組合物。在一個實施例中，可離子化脂質(例如脂質A)之mol%係約40 mol%至60 mol%，視情況地約50 mol%。在一個實施例中，可離子化脂質之mol%係約55 mol%。在一些實施例中，LNP批料之可離子化脂質mol%將為目標mol%之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在一些實施例中，LNP批料之可離子化脂質mol%係目標mol%之±4 mol%、±3 mol%、±2 mol%、±1.5 mol%、±1 mol%、±0.5 mol%或±0.25 mol%。所有mol%數值係以LNP組合物中脂質組分之分數給出。
在一個實施例中，中性脂質(例如中性磷脂)之mol%係約5 mol%至15 mol%，視情況地約9 mol%。在一些實施例中，LNP批料之中性脂質mol%係目標中性脂質mol%之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。
在一個實施例中，輔助脂質之mol%係約20 mol%至60 mol%。在一個實施例中，輔助脂質之mol%係約25 mol%至55 mol%，視情況地，輔助脂質之mol%係約30 mol%至40 mol%。在一個實施例中，基於可離子化脂質、中性脂質及PEG脂質濃度來調整輔助脂質之mol%以使脂質組分達到100 mol%。在一個實施例中，基於可離子化脂質及PEG脂質濃度來調整輔助脂質之mol%以使脂質組分達到至少99 mol%。在一些實施例中，LNP批料之輔助脂質mol%係目標mol%之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。
在一個實施例中，PEG脂質之mol%係約1 mol%至10 mol%。在一個實施例中，PEG脂質之mol%係約2 mol%至4 mol%。在一個實施例中，PEG脂質之mol%係約2.5 mol%至4 mol%。在一個實施例中，PEG脂質之mol%係約3 mol%。在一些實施例中，LNP批料之PEG脂質mol%係目標PEG脂質mol%之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。
在某些實施例中，負荷包括編碼Cas9核酸酶之核酸(例如mRNA)及sgRNA。在一些實施例中，可離子化脂質係脂質A。在一些實施例中，LNP組合物包含可離子化脂質(例如脂質A)、中性脂質、輔助脂質及PEG脂質。在某些實施例中，輔助脂質係膽固醇。在某些實施例中，中性脂質係DSPC。在特定實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG。在一些實施例中，LNP組合物可包含脂質A、輔助脂質、中性脂質及PEG脂質。在其他實施例中，LNP組合物包含脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。
本揭示案之實施例亦提供根據可離子化脂質之帶正電之可離子化基團(N)與欲囊封核酸之帶負電之磷酸基團(P)之間的莫耳比描述之脂質組合物。此在數學上可由比率N/P表示。在一些實施例中，LNP組合物可包含脂質組分，該脂質組分包含可離子化脂質、輔助脂質、中性脂質及PEG脂質；及核酸組分，其中N/P比率係約3至10。在一些實施例中，N/P比率係約5至7，視情況地，N/P比率係約6。在一些實施例中，N/P比率係6 ± 1。在一些實施例中，N/P比率係6 ± 0.5。在一些實施例中，N/P比率係目標N/P比率之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。
在一些實施例中，RNA組分包含編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9核酸酶)之mRNA (例如本文所揭示之核酸)、本文所述之mRNA及本文所述之sgRNA。在任一前述實施例中，sgRNA係本文所述之經化學修飾之sgRNA。
在某些實施例中，LNP組合物包括本文所述之Cas9核酸酶mRNA (例如Spy Cas9 mRNA)及本文所述之sgRNA。在某些實施例中，LNP組合物包括約10:1至1:10 (例如約1:1、1:2或1:3)之gRNA對Cas9核酸酶mRNA (例如Spy Cas9核酸酶mRNA)之比率。
在一些實施例中，LNP係藉由混合RNA水溶液與基於有機溶劑之脂質溶液(例如100%乙醇)來形成。適宜溶液或溶劑包括或可含有：水、PBS、Tris緩衝液、NaCl、檸檬酸鹽緩衝液、乙醇、氯仿、二乙醚、環己烷、四氫呋喃、甲醇、異丙醇。可使用例如用於活體內投與LNP之醫藥學上可接受之緩衝液。
在一些實施例中，使用微流體混合、T-混合或交叉混合。在某些態樣中，流量、接合處大小、接合處幾何形狀、接合處形狀、管直徑、溶液或RNA及脂質濃度可發生變化。LNP或LNP組合物可例如經由透析、切向流過濾或層析濃縮或純化。LNP可由4種脂質構成，包括脂質A；DSPC；膽固醇；及DMG-PEG2k。在一些實施例中，將LNP懸浮且調配於50 mM Tris、45 mM NaCl及5% (w/v)蔗糖之水性緩衝液(pH 7.4)中。
可使用動態光散射(「DLS」)來表徵本揭示案之LNP之多分散性指數(「pdi」)及大小。DLS量測由使樣品經歷光源產生之光散射。如根據DLS量測確定之PDI表示群體中粒子大小之分佈(在平均粒子大小附近)，且完全均勻之群體之PDI係0。
在一些實施例中，本文所揭示之LNP具有50 nm至100 nm之大小。在一些實施例中，LNP具有85 nm至90 nm之大小。除非另有指示，否則本文所提及之所有大小皆係完全形成之奈米粒子之平均大小(直徑)，如在Malvern Zetasizer上藉由動態光散射所量測。將奈米粒子樣品稀釋於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，以使得計數率係大約200-400 kct。數據呈現為強度量測之加權平均值。
在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA及本文所揭示之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9核酸酶)之mRNA相關之LNP用於製備用來治療HAE之藥物。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA及本文所揭示之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9核酸酶)之mRNA相關之LNP用於製備用來減少患有HAE之個體之血漿胰舒血管素的藥物。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA及本文所揭示之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA相關之LNP用於製備用來降低血漿胰舒血管素濃度之藥物。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA及本文所揭示之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA相關之LNP用於製備用來降低血漿胰舒血管素活性之藥物。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA及本文所揭示之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA相關之LNP用於治療人類個體之HAE。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA及本文所揭示之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA相關之LNP用於降低人類個體之血漿胰舒血管素蛋白水準或血漿胰舒血管素活性水準。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA及本文所揭示之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA相關之LNP用於降低人類個體之總血漿胰舒血管素蛋白水準。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA及本文所揭示之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA相關之LNP用於降低人類個體之HAE發作頻率。
在一些實施例中，LNP包含脂質組分且脂質組分包含以下，基本上由其組成或由其組成：約50 mol%之可離子化脂質，例如脂質A；約9 mol%之中性脂質，例如DSPC；約3 mol%之隱形脂質，例如PEG脂質，例如PEG2k-DMG，且脂質組分之剩餘部分係輔助脂質，例如膽固醇，其中LNP組合物之N/P比率係約6。在一些實施例中，可離子化脂質係脂質A。在一些實施例中，中性脂質係DSPC。在一些實施例中，隱形脂質係PEG脂質。在一些實施例中，隱形脂質係PEG2k-DMG。在一些實施例中，輔助脂質係膽固醇。在一些實施例中，LNP包含脂質組分且脂質組分包含：約50 mol%之脂質A；約9 mol%之DSPC；約3 mol%之PEG2k-DMG，且脂質組分之剩餘部分係膽固醇，其中LNP組合物之N/P比率係約6。 II. 全身性遞送之方法
在一些實施例中，全身性投與本文所述之LNP組合物，其包含編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA。如本文所用，全身性投與係指生物體內之廣泛生物分佈，例如靜脈內投與。
在一些實施例中，單次投與本文所述之LNP組合物足以敲低靶蛋白之表現。在一些實施例中，單次投與LNP組合物足以敲低細胞群體中靶蛋白之表現。在其他實施例中，投與一次以上之LNP組合物可能有益於經由累積效應最大化編輯。舉例而言，LNP組合物可第二次或第三次投與(「後續劑量」)，例如第二劑量或第三劑量。第二劑量或第三劑量之劑量可由臨床醫師確定以提供與基線水準(例如第一次LNP投與前之水準)相比，血漿胰舒血管素總蛋白或活性水準降低例如約60%、70%、80%或90%或以上。一次以上之投與(第二劑量或第三劑量)可作為均一劑量(例如25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg或150 mg)；或作為基於重量之劑量投與。
在一些實施例中，本文所述之LNP組合物係藉由輸注投與，輸注時間為約2-4小時。在一些實施例中，本文所述之LNP組合物係藉由輸注投與，輸注時間為約2-5小時。在一些實施例中，本文所述之LNP組合物係藉由輸注投與，輸注時間為至少2小時。 III. 劑量
在一些實施例中，本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA，例如靶向 KLKB1基因之指導RNA (總劑量或組合劑量))係使用固定劑量投與。在人類個體中，固定劑量可為約25-75 mg。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25-100 mg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約50-75 mg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25 mg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約50 mg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約75 mg之組合劑量。LNP組合物可以有效量投與之原因在於，在基於總RNA給藥時，LNP組合物投與有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA。
在本發明之一些實施例中，「約」意指在所述值之±5%內，例如對於約25 mg之值，範圍係23.75 mg至26.25 mg，或對於約75 mg之值，範圍係71.25 mg至78.75 mg。在本發明之一些實施例中，「約」意指在所述值之±10%內。在本發明之一些實施例中，「約」意指在所述值之±20%內，例如對於約25 mg之值，範圍係20 mg至30 mg，或對於約75 mg之值，範圍係60 mg至90 mg。應理解各種技術內之可接受之公差。
在一些實施例中，本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA (總RNA或組合RNA))係使用基於重量之劑量投與例如小兒患者。
在其他實施例中，接受不足以提供總血漿胰舒血管素蛋白水準或總血漿胰舒血管素活性之足夠降低之劑量的個體可接受一次以上之LNP組合物投與，以經由累積效應最大化編輯。舉例而言，LNP組合物可投與2次、3次、4次、5次或更多次，例如2次，例如第二次投與、第三次投與、第四次投與或第五次投與。在一些實施例中，將LNP組合物投與先前已投與LNP組合物之人類個體。在一些實施例中，將LNP組合物投與先前已投與LNP組合物且如例如在第一次LNP投與後至少28天時(例如在56天時)所測定，如藉由例如ELISA (例如前胰舒血管素及胰舒血管素人類ELISA套組目錄號ab171015)所量測，尚未達成大於60%、70%或80%之總血漿胰舒血管素蛋白水準降低(例如在投與LNP組合物後，總血漿胰舒血管素蛋白水準之降低小於60%、70%或80%)的人類個體。在一些實施例中，將LNP組合物投與先前已投與LNP組合物且如例如在第一次LNP投與後至少28天時(例如在56天時)所測定，如藉由例如活性分析套組(例如SensoLyte® Rh110血漿胰舒血管素活性分析套組*Fluorimetric*，目錄號AS-72255)所量測，尚未達成大於60%、70%或80%之血漿胰舒血管素活性水準降低(例如在投與LNP組合物後，血漿胰舒血管素活性水準之降低小於60%、70%或80%)的人類個體。將降低%與在投與LNP組合物之前獲得之基線樣品進行比較。商業套組可用於測定總胰舒血管素蛋白水準及總胰舒血管素活性水準。適當對照及該等套組之驗證方法之選擇為熟習此項技術者所熟知。 IV. 使用方法 遺傳性血管水腫疾病病理學及治療干預
HAE係罕見的體染色體顯性遺傳病症，其特徵在於身體各個器官及組織之皮膚及黏膜下腫脹之復發性、疼痛、不可預測及潛在致命性發炎性發作。該等症狀係由舒緩肽產生之失調引起，舒緩肽係導致血管通透性增加及所得腫脹之肽。發作之頻率可高達每7天至14天一次且持續48小時至72小時，喉水腫係尤其危及生命的，此乃因其可導致氣道阻塞及窒息死亡(Zuraw 2008；Busse 2020，美國HAEA醫學諮詢委員會2020遺傳性血管水腫管控指南(US HAEA Medical Advisory Board 2020 Guidelines for the Management of Hereditary Angioedema) (doi.org/10.1016/j.jaip.2020.08.046))。
HAE之最常見形式係因缺乏C1酯酶抑制劑(C1-INH)引起，該酯酶抑制劑係接觸活化路徑之關鍵調節劑。缺乏歸因於低水準之功能活性C1-INH蛋白(I型)或正常水準之功能無活性C1-INH (II型)。參見例如圖1。因子XII (FXII)係接觸活化路徑開始時之血漿蛋白，其中在活化成因子XIIa (FXIIa)時，其將血漿前胰舒血管素(PKK)轉化成活性胰舒血管素。胰舒血管素催化高分子量之激肽原轉化成舒緩肽。在健康個體中，FXIIa及胰舒血管素活性之穩態受C1-INH之負控制，其係FXIIa及胰舒血管素之直接抑制劑。然而，在I型及II型HAE中，C1-INH缺乏或功能障礙導致FXIIa及胰舒血管素活性失調、舒緩肽之局部累積及血管通透性增加以及血管舒張，隨後導致血管水腫(Busse 2020)。美國HAEA醫學諮詢委員會2020遺傳性血管水腫管控指南建議，HAE應廣泛地分成C1INH缺乏性HAE (HAE-C1INH)及HAE-nl-C1INH (具有正常C1INH之HAE)。HAE-C1INH進一步細分成I型及II型，其在臨床上似乎係相似的。HAE-nl-C1INH基於潛在突變進一步細分，或在尚未發現突變之情形下係未知的。
目前批准之大多數HAE治療經設計以恢復接觸活化路徑之正常功能。該等策略包括C1-INH替代(重組或血漿源性)、B2舒緩肽受體抑制(艾替班特)及胰舒血管素抑制(艾卡拉肽、拉那利尤單抗、貝羅司他)。端視該劑，該等藥物用於預防發作(預防)或按需治療發作。其係IV、藉由皮下(SC)注射或經口投與。由於按需治療係在HAE發作開始時投與，預防劑需要每週兩次之長期IV或SC投與或每日口服投與，以確保疾病控制之恆定路徑抑制。然而，儘管長期投與，但仍會出現突破性發作。
用於HAE發作預防之劑可與NTLA-2002結合使用。該等劑可尤其用於用NTLA-2002給藥後之初始時段。停用HAE發作預防之時間可由健康護理提供者確定。儘管用於HAE發作預防之一些劑在本研究之背景下係不允許的，但該等劑不必禁止與NTLA-2002一起使用。相反，某些劑不允許與本研究結合使用，例如，此乃因其可能潛在地干擾本研究中之某些診斷措施。
用於HAE發作預防之劑可在用NTLA-2002給藥前停用。該等劑之半衰期及清除時段為此項技術中已知且提供於本文中。可在清除時段期間或在完成清除時段後用NTLA-2002給藥。 1. 活體內編輯之方法
本文提供活體內編輯人類個體(例如患有HAE之人類個體)之肝臟中之 KLKB1基因之方法。在一些實施例中，活體內編輯基因之方法包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物，該組合物包含編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA。在一些實施例中，活體內編輯發生在個體之肝細胞中之由指導RNA靶向之位點處。
在該等實施例中，向個體投與LNP組合物可能與生物安全指標之變化相關。在一些實施例中，對個體進行評價以確定生物安全指標之變化是否係可接受之變化。在一些實施例中，可接受之變化可由臨床醫師或實驗室確定。在一些實施例中，可接受之變化可為不符合安全事件之變化，包括不良事件(NCI-CTCAE，不大於或等於3級)、嚴重不良事件、特別關注之不良事件或治療緊急不良事件(CTCAE，不大於或等於3級)，如本文所述。生物安全指標(包括與投與LNP組合物相關之彼等生物安全指標)為此項技術中已知。生物安全指標之可接受之水準或變化為此項技術中已知且可藉由常規方法評價。
在一些實施例中，可接受之生物安全指標水準係落在個體納入標準內或未落在本文所述之個體排除標準內之水準。
在一些實施例中，生物安全指標水準之可接受之變化係在一段時間後可接受之變化，例如最初落在可接受之水準外，但截至例如投與後第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第14天或第28天穩定至可接受之水準。對於本文之各種措施，提供生物安全指標水準之可接受之變化及可接受之消退時間。量測及對生物安全指標水準分級之方法為此項技術中已知。
在一些實施例中，可接受之生物安全指標水準(或生物安全指標水準之可接受之變化)係根據CTCAE指南(包括國家癌症研究院(NCI)-CTCAE指南，5.0版)不會構成3級或更高不良事件之水準。在一些實施例中，若生物安全指標水準(例如與實驗室參數、生命徵象、ECG數據、身體檢查等相關之一或多個水準，如本文所述)之變化例如誘發臨床徵象或症狀；需要積極干預；需要中斷或停止LNP組合物；或如由臨床醫師所確定生物安全指標之變化係臨床上顯著的，則該變化構成為不良事件。
在一些實施例中，不良事件係投與研究藥物或已經受研究程序之個體中之任何不利醫療事故，且不必與治療具有因果關係。在一些實施例中，不良事件係與治療暫時相關之非預期徵象(包括異常實驗室發現)、症狀或疾病，無論是否與藥物(研究)產品相關。在一些實施例中，不良事件誘發臨床徵象或症狀。在一些實施例中，不良事件需要積極干預。在一些實施例中，不良事件需要中斷或停止治療。在一些實施例中，不良事件係在研究者看來在臨床上顯著之異常。不良事件之分級標準為此項技術中已知，例如不良事件通用術語標準(CTCAE)，包括國家癌症研究院(NCI)-CTCAE。
在一些實施例中，可接受之生物安全指標水準(或生物安全指標水準之可接受之變化)係不會構成嚴重不良事件之水準。在一些實施例中，嚴重不良事件導致死亡。在一些實施例中，嚴重不良事件係危及生命的(例如如由臨床醫師所確定，將個體置於立即死亡風險下)。在一些實施例中，嚴重不良事件導致持續或顯著之失能。在一些實施例中，嚴重不良事件導致實施正常生活功能之能力喪失或實質性破壞。在一些實施例中，嚴重不良事件導致先天性異常或出生缺陷。在一些實施例中，嚴重不良事件需要住院病患住院或導致住院延長。
在一些實施例中，可接受之生物安全指標水準(或生物安全指標水準之可接受之變化)係不會構成治療緊急不良事件之不良事件通用術語標準(CTCAE)等於或大於3級的水準。
活體內編輯之方法可包括量測通常與例如凝血、血液學、臨床化學、尿液分析及其他生物分析評價(例如細胞介素、補體)相關之已知實驗室評價。特定生物安全指標包括(但不限於)以下非限制性生物安全指標中之一或多者：肝酶、活化部分凝血激酶時間(aPTT)之水準、凝血酶原時間(PT)之水準、凝血酶產生時間(TGT) (例如峰高、延遲時間或內源凝血酶潛能)之水準、纖維蛋白原之水準、凝血酶原國際正規化(INR)比率、d-二聚體之水準、HBV、HBsAg、HCV Ab、與散播性血管內凝血一致之實驗室參數、血液學值之變化、化學值之變化、凝血之變化、尿液分析之變化、C-反應蛋白之水準、補體(C3a、C5a、Bb)之水準、細胞介素(GM-CSF、INF-g、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-23、TNF-a、IL-17、MCP-1)之水準、急性肝損傷(例如在投與治療後，ALT、AST、總膽紅素或臨床上相關之肝損傷症狀/徵象之CTCAE ＞ 2級升高)及12導程心電圖之變化。在某些實施例中，實驗室評價係活化部分凝血激酶時間(aPTT)水準。在一些實施例中，生物安全指標包括注射位點反應及胃腸症狀。
與例如血液學、凝血、臨床化學及尿液分析相關之其他生物安全指標為此項技術中已知。舉例而言，與血液學相關之生物安全指標包括(但不限於)血小板計數、RBC計數、血紅素、血容比、RBC指數(MCV、MCH、MCHC、RDW)、網狀紅血球%、微分白血球(WBC)計數(嗜中性球、淋巴球、單核球、嗜酸性球、嗜鹼性球)。舉例而言，與凝血相關之生物安全指標包括(但不限於) aPTT、PT、INR、纖維蛋白原、d-二聚體及TGT。舉例而言，與臨床化學相關之生物安全指標包括(但不限於)白蛋白、血尿素氮、肌酸酐、非禁食葡萄糖、鉀、鈉、氯化物、二氧化碳、鈣、AST、ALT、鹼性磷酸酶、總膽紅素及直接膽紅素、總蛋白、肌酸激酶、乳糖去氫酶、總膽固醇及LDL膽固醇。舉例而言，與尿液分析相關之生物安全指標包括(但不限於)比重、pH、葡萄糖、蛋白質、血液、酮、膽紅素、尿膽素原、亞硝酸鹽及白血球酯酶。在某些實施例中，生物安全指標係aPTT水準。
在一些實施例中，生物安全指標之水準係在投與LNP組合物之後量測。在一些實施例中，生物安全指標之水準係在投與LNP組合物之前及之後量測，由此允許比較在用LNP組合物治療之前及之後生物安全指標之水準。在一些實施例中，在投與LNP組合物之前量測之生物安全指標之水準可充當與在投與LNP組合物之後量測之一或多個生物安全指標水準進行比較之基線。在一些實施例中，基線係在投與LNP組合物之前進行之末次可用量測。在該等實施例中，投與LNP組合物導致肝酶水準之可接受之變化(例如在投與治療後，ALT或AST之升高不超過＞ 5 × ULN超過4週；在投與治療後，ALT或AST ＞ 3 × ULN且總膽紅素＞ 2 × ULN (海氏定律))。在該等實施例中，投與組合物導致活化部分凝血激酶時間(aPTT)水準之可接受之變化(例如在投與治療後，aPTT之升高＞ 5 × ULN超過4週)。在該等實施例中，投與組合物導致凝血酶原時間(PT)水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致凝血酶產生時間(TGT) (例如峰高、延遲時間或內源凝血酶潛能)水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致纖維蛋白原水準之可接受之變化。在一些實施例中，投與組合物導致凝血酶原國際正規化(INR)比率之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致d-二聚體水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致與散播性血管內凝血一致之實驗室參數之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致血液學值之可接受之變化(例如在投與治療後，CTCAE ＞ 2級異常血液測試結果)。在該等實施例中，投與組合物導致化學值之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致由臨床上相關之異常出血定義之異常凝血發現之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致尿液分析之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致C-反應蛋白水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致補體水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致細胞介素水準之可接受之變化。
在該等實施例中，投與組合物導致根據CTCAE指南不會構成3級或更高治療緊急不良事件之生物安全指標水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致不會構成血栓形成發生之生物安全指標水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致不會構成出血發生之生物安全指標水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致不會構成散播性血管內凝血發生之生物安全指標水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致不會構成細胞介素釋放症候群發生之生物安全指標水準之可接受之變化。在該等實施例中，投與組合物導致不會構成急性肝損傷之生物安全指標水準之可接受之變化(例如在投與治療後，ALT、AST、總膽紅素或臨床上相關之肝損傷症狀/徵象之CTCAE ＞ 2級升高)。在該等實施例中，投與組合物導致如由臨床醫師所確定12導程心電圖之可接受之變化。
在一些實施例中，活體內編輯基因之方法包括向人類個體全身性投與包含有效量之編碼Cas9之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA的LNP組合物，且該投與導致抗Cas9抗體水準之可接受之變化。
在一些實施例中，投與LNP組合物導致脂質A之藥物動力學之可接受之變化。在一些實施例中，投與LNP組合物導致DMG-PEG2k之藥物動力學之可接受之變化。在一些實施例中，投與LNP組合物導致Cas9 mRNA之藥物動力學之可接受之變化。在一些實施例中，投與LNP組合物導致sgRNA之藥物動力學之可接受之變化。 2. 治療方法
本文提供藉由活體內編輯肝臟中之 KLKB1基因來治療人類個體之方法。在一些實施例中，活體內編輯 KLKB1基因之方法包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA)，且活體內編輯 KLKB1基因發生在個體之肝細胞中之由指導RNA靶向之位點處。在某些實施例中，指導RNA包含含有GGAUUGCGUAUGGGACACAA (SEQ ID NO: 15)之至少18個連續核苷酸、較佳地20個核苷酸之靶向序列。在一些實施例中，指導RNA包含GGAUUGCGUAUGGGACACAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 388)之核苷酸序列。在一些實施例中，sgRNA經修飾。在一些實施例中，sgRNA包含下文SEQ ID NO: 391中所示之修飾模式，其中經修飾之sgRNA包含以下序列：mG*mG*mA*UUGCGUAUGGGACACAAGUUU UAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 391)，其中A、C、G及U分別指示RNA核苷(2’-OH)腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿苷；mA、mC、mG及mU分別指示2’-O-甲基修飾之腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿苷；且*指示硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，本文提供治療患有如本文所述之HAE之人類個體之方法(例如HAE發作次數之減少、突破性發作或在給定時間段內未發作之患者數量或比例、與HAE發作相關之住院之頻率、或使用與HAE發作相關之急性療法之頻率)。在一些實施例中，HAE係I型。在一些實施例中，HAE係II型。
在一些實施例中，本文提供治療人類個體之HAE之方法，其包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA，例如具有SEQ ID NO: 15 (GGAUUGCGUAUGGGACACAA)之靶向序列之指導物)，從而治療HAE，其中與臨床指標之基線水準相比，投與組合物導致個體之臨床指標水準之臨床上顯著之改良。
在一些實施例中，本文提供治療人類個體之HAE之方法，其包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA，例如具有SEQ ID NO: 15 (GGAUUGCGUAUGGGACACAA)之靶向序列之指導物)，從而治療HAE，其中編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA係以約25-150 mg (例如約25-100 mg)之組合劑量投與。
在一些實施例中，本文提供治療人類個體之HAE之方法，其包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA，例如具有SEQ ID NO: 15 (GGAUUGCGUAUGGGACACAA)之靶向序列之指導物)，從而治療HAE，其中編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA係以約25-75 mg之組合劑量投與。
在一些實施例中，本文提供治療人類個體之HAE之方法，其包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA，例如具有SEQ ID NO: 15 (GGAUUGCGUAUGGGACACAA)之靶向序列之指導物)，從而治療HAE，其中編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA係以約50-75 mg之組合劑量投與。
在一些實施例中，本文提供治療人類個體之HAE之方法，其包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向基因之指導RNA，例如靶向 KLKB1基因之指導RNA，例如具有SEQ ID NO: 15 (GGAUUGCGUAUGGGACACAA)之靶向序列之指導物)，從而治療HAE，其中相對於基線血漿，投與組合物降低總血漿胰舒血管素蛋白水準或胰舒血管素活性水準。在一些實施例中，HAE係I型。在一些實施例中，HAE係II型。在一些實施例中，LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯。在一些實施例中，LNP包含PEG脂質。在LNP包含PEG脂質之實施例中，PEG脂質包含二肉豆蔻醯基甘油(DMG)。在PEG脂質包含二肉豆蔻醯基甘油(DMG)之實施例中，PEG脂質包含PEG-2k。在一些實施例中，LNP組合物具有約5-7之N/P比率。在一些實施例中，指導RNA及Cas核酸酶係以介於約5:1-1:5範圍內之重量比存在。在一些實施例中，mRNA編碼Cas9核酸酶。在一些實施例中，mRNA編碼釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，Cas核酸酶經密碼子最佳化。在一些實施例中，指導RNA包含至少一個修飾。在指導RNA包含至少一個修飾之實施例中，指導RNA包括2’-O-甲基修飾之核苷酸或核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25-150 mg總RNA之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25-100 mg總RNA之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約例如25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg或150 mg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約50-75 mg總RNA之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25 mg總RNA之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約75 mg總RNA之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約50 mg總RNA之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約0.3-2 mg/kg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約0.5-1 mg/kg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約0.3 mg/kg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約0.5 mg/kg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約0.7 mg/kg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約0.9 mg/kg之組合劑量。在一些實施例中，編碼Cas核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約1 mg/kg之組合劑量。在一些實施例中，與投與組合物之前之基線總血漿胰舒血管素蛋白相比，投與組合物使總血漿胰舒血管素蛋白減少至少60%或減少60%-95%、60%-90%、70%-95%、70%-90%或80%-95%。在一些實施例中，在投與組合物後，總血漿胰舒血管素蛋白水準小於約20 µg/mL。在一些實施例中，在投與組合物後，總血漿胰舒血管素蛋白水準小於約15 µg/mL。在一些實施例中，在投與組合物後，總血漿胰舒血管素蛋白水準小於約10 µg/mL。
在某些實施例中，本文所提供之方法用於相對於個體之既往發作頻率降低該個體之HAE發作頻率。
在某些實施例中，本文所提供之方法用於例如根據適宜生活品質(QoL)問卷(例如MOXIE血管水腫生活品質(AE-QoL)問卷)改良本文所述之HAE之一或多個臨床指標，或預防一或多個症狀之再發。
在某些實施例中，本文所提供之方法用於相對於個體之既往發作嚴重程度降低該個體之HAE發作嚴重程度。在某些實施例中，本文所提供之方法用於降低發作伴喉水腫之頻率，該喉水腫通常與重度之總發作嚴重程度相關，其特徵在於活動明顯受限，且個體需要輔助。
在某些實施例中，本文所提供之方法用於相對於個體之既往發作頻率及嚴重程度降低該個體之HAE發作頻率及嚴重程度。
在某些實施例中，個體使用與HAE發作相關之住院之頻率降低。在某些實施例中，個體使用與HAE發作相關之急性療法之頻率降低。
在某些實施例中，由於發作之嚴重程度，本文所提供之方法可用於治療具有罕見或不頻繁發作或甚至在單次發作後之個體。在某些實施例中，本文所提供之方法用於具有單次發作之個體，其中發作包括喉水腫，因此水腫可能係危及生命的。
在一些實施例中，治療方法包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA)，其中在投與LNP組合物之前，個體每月具有平均至少兩次HAE發作，例如確診HAE發作，如在三個月(90天)時段內平均化。在一些實施例中，在投與LNP組合物之前，個體每月具有平均至少一次HAE發作，例如確診HAE發作，如在三個月(90天)時段內平均化。
儘管預防HAE，但伴HAE之突破性發作係常見的，尤其在患有更重度疾病之彼等個體中。在一些實施例中，本文提供治療接受HAE預防之個體之方法，包括治療在接受HAE預防的同時具有突破性發作之個體之方法。在一些實施例中，治療方法包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA)，其中個體已用或目前正用不同之HAE療法(例如非急性HAE療法，即HAE預防)治療。在一些實施例中，在投與LNP組合物之前，在服用HAE預防的同時，個體每月具有平均至少兩次HAE發作，例如確診HAE發作，如在三個月(90天)時段內平均化。在一些實施例中，在投與LNP組合物之前，在服用HAE預防的同時，個體每月具有平均至少一次HAE發作，例如確診HAE發作，如在三個月(90天)時段內平均化。
在一些實施例中，個體不耐受使用至少一種類型之HAE預防進行長期治療，例如正在進行之非急性治療或使用慢性治療之令人不滿意的治療後之治療緊急事件(例如針疲勞)。在某些實施例中，由於臨床上不可接受之不良事件(例如3級或更高之不良事件)，個體不耐受使用至少一種類型之HAE預防進行長期治療。在某些實施例中，不良事件係由個體確定為不可接受的，儘管在臨床上係可接受的，例如體重增加、痤瘡，使得個體已選擇停止使用特定劑之HAE預防。在某些實施例中，個體不耐受使用至少一種類型之HAE預防進行長期治療，此乃因該治療在個體(例如懷孕、試圖懷孕或哺乳之女性、兒童)中係禁止的。在某些實施例中，個體不耐受使用至少一種類型之HAE預防進行長期治療，此乃因該治療因現有或先前共病(例如某些類型之肝病、乳癌、前列腺癌、肝細胞癌及某些心血管風險因子)在個體中係禁止的。在某些實施例中，HAE預防係使用減弱的雄激素(例如達那唑、氧雄龍、司坦唑醇)進行預防。
應理解，不耐受治療(例如正在進行之非急性治療或使用慢性治療之令人不滿意的治療後之治療緊急事件(例如針疲勞)，例如使用可用於HAE預防之某些劑之長期治療)的個體可耐受用於急性療法、即短期或間歇性治療、而非長期治療之劑。
在一些實施例中，活體內編輯 KLKB1基因之方法包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA)，且導致臨床指標(例如發作頻率、發作嚴重程度)水準之臨床上顯著之改良。在某些實施例中，發作頻率係在個體維持於HAE預防時量測。在某些實施例中，發作頻率係在個體已停用HAE預防後量測。在某些實施例中，發作嚴重程度係在個體維持於HAE預防時量測。在某些實施例中，發作嚴重程度係在個體已停用HAE預防後量測。
在某些實施例中，與適當歷史時段(例如每月確診HAE發作，如在一段時間(三個月(90天)時段)內平均化)相比，在投與LNP組合物後至少6個月內，視情況地在投與LNP組合物後至少一年內，確診HAE發作頻率降低至少60%、70%，較佳地至少80%、85%、90%或95%。在某些實施例中，用於確定投與LNP組合物後之發作頻率之時段在投與LNP組合物後立即(例如在一天內)開始。在某些實施例中，用於確定投與LNP組合物後之發作頻率之時段在投與LNP組合物後之4週後(即在第29天時)開始。
在一些實施例中，活體內編輯 KLKB1基因之方法包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA)，且導致生活品質指標評價(例如MOXIE血管水腫生活品質(AE-QoL)評價)之態樣之水準的顯著改良。在一些實施例中，活體內編輯 KLKB1基因之方法包括向人類個體全身性投與本文所述之LNP組合物(例如包含有效量之編碼Cas9核酸酶之mRNA及靶向 KLKB1基因之指導RNA)，且導致生活品質評價(例如MOXIE血管水腫生活品質(AE-QoL)評價)水準之顯著改良。
其他臨床功效指標(包括用於評價HAE治療之功效之指標)為此項技術中已知。類似地，指示HAE改善之臨床功效指標之水準或變化為此項技術中已知且可藉由常規方法(例如由臨床醫師或實驗室)評價。
在一些實施例中，治療HAE之方法包括投與本文所述之LNP組合物及在投與LNP組合物後量測臨床功效指標。在一些實施例中，治療HAE之方法包括投與本文所述之LNP組合物及在投與LNP組合物之前及之後量測臨床功效指標，由此允許比較在用LNP組合物治療之前及之後臨床功效指標之水準。
舉例而言，血漿胰舒血管素水準(例如總血漿胰舒血管素蛋白水準)係HAE之臨床功效指標。在一些實施例中，治療HAE之方法包括投與本文所述之LNP組合物及降低個體之胰舒血管素水準，例如總血漿胰舒血管素蛋白水準。在一些實施例中，治療HAE之方法包括投與本文所述之LNP組合物，及至少在治療後(例如在投與LNP組合物後28天或約56天後)，與基線(例如治療前)相比，降低個體之總血漿胰舒血管素蛋白水準。在一些實施例中，與基線相比，本文所述之治療HAE之方法在治療後(例如在投與LNP組合物後至少28天或約56天)產生總血漿胰舒血管素蛋白水準之至少60%降低。在一些實施例中，與基線相比，本文所述之治療HAE之方法在治療後(例如在投與LNP組合物後至少28天或約56天)產生胰舒血管素水準(例如總血漿胰舒血管素蛋白水準)之60%-95%、60%-90%、70%-95%、70%-90%或80%-95%降低。
在其他實施例中，投與LNP組合物使個體之總血漿胰舒血管素蛋白水準降低至小於約20 µg/mL。在一些實施例中，投與LNP組合物使總血漿胰舒血管素蛋白水準降低至小於約15 µg/mL。在一些實施例中，投與LNP組合物使總血漿胰舒血管素蛋白水準降低至小於約10 µg/mL。在某些實施例中，該水準係在治療後至少28天(例如約56天)量測。 a. 個體納入標準
在一些實施例中，針對以下個體納入標準中之一或多者評價投與本文所述之LNP組合物(例如包含編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA，例如靶向 KLKB1基因之指導RNA)的患有HAE (I型HAE或II型HAE)之個體。 i. HAE 個體納入標準
在一些實施例中，人類個體在治療前已經診斷或同時經診斷患有HAE。在一些實施例中，人類個體基於遺傳測試經診斷患有HAE。在一些實施例中，基於藉由評價功能性C1-INH水準、C1-INH抗原水準及C4水準之確診，人類個體經診斷患有HAE。另外，個體必須已確診HAE發作。在自開始篩選之先前3個月(90天)期間，1期之個體必須具有至少3次研究者確診並記載之既往HAE發作次數。在觀察時段(即自開始篩選之3個月(90天))期間，可用某些類型之預防治療試驗1期部分之個體，各種排除論述於下文中。2期之個體必須在先前3個月(90天)期間具有至少3次研究者確診並記載之既往HAE發作次數才能進入導入時段，且必須在8週(56天)導入時段期間具有至少2次研究者確診並記載之既往HAE發作次數才能有資格入選及隨機化。在本研究之2期部分中，個體必須同意自8週導入時段開始至16週主要觀察時段結束不使用預防療法，且本研究者必須確認此在醫學上係適當的並不會將個體置於不適當的安全風險下。下文提供其他預防劑排除。
在1期及2期試驗中，個體必須已使用≥ 1種急性藥物來治療血管水腫發作，並具有使用≥ 1種急性藥物來治療血管水腫發作之能力。
在一些實施例中，人類個體在投與時係至少18歲。在一些實施例中，人類個體經診斷患有具有發作頻率之HAE，具或不具預防，如上文所提供。在一些實施例中，人類個體患有1型HAE。在一些實施例中，人類個體患有II型HAE。在一些實施例中，人類個體在篩選時具有≤正常範圍上限(ULN)之天冬胺酸胺基轉移酶(AST)水準。在一些實施例中，人類個體在篩選時具有≤正常範圍上限(ULN)之丙胺酸胺基轉移酶(ALT)水準。在一些實施例中，人類個體在篩選時具有≤正常範圍上限(ULN)之總膽紅素水準，且試驗允許在篩選評估時總膽紅素≤ 2 × ULN之具有吉爾伯特氏症候群(Gilbert’s Syndrome)病史之個體。在一些實施例中，人類個體在篩選時具有參考範圍內或主要研究者(PI)確定之臨床上不顯著的aPTT、國際正規化比率(INR)、纖維蛋白原及d-二聚體水準。在一些實施例中，人類個體在篩選時具有＞ 45 mL/min/1.73 m^2之估計的腎小球濾過率(GFR) (例如如藉由腎病飲食修正方程(Modification of Diet in Renal Disease equation)所量測)。在一些實施例中，人類個體在篩選時具有≥ 100,000個細胞/mm3之血小板計數。儘管體重未指定為納入標準，但在歷史上，用於治療HAE之臨床試驗之個體具有約80 kg之平均體重。該例示性體重可用於近似計算均一給藥與基於體重之給藥之間的劑量轉化。
在一些實施例中，人類個體在篩選本研究之相關時期時滿足上文所述之所有實驗室及其他標準。在一些實施例中，在篩選期間及至用本文所述之組合物治療後28天，人類個體將酒精消耗限制為每天1杯酒精飲料。
在一些實施例中，例如在簽署知情同意書時，人類個體係18至90歲(包括18歲及90歲)之男性或女性個體。在一些實施例中，可使用絕經後範圍內之高卵泡刺激激素(FSH)水準來確認未使用激素避孕或激素替代療法之女性之絕經後狀態。在一些實施例中，在不存在12個月之閉經下，單一FSH量測係不夠的。在一些實施例中，女性個體在篩選前至少1個月進行手術絕育(例如子宮切除術、雙側輸卵管切除術及雙側卵巢切除術)。在一些實施例中，具有生育潛能或懷孕伴侶之男性個體同意在篩選前及在研究藥物投與後84天內使用保險套。在一些實施例中，男性個體同意在研究藥物投與後84天內不捐獻精子。若基於國家特異性指南，精子捐獻係禁止的，則時程可延長超過84天。
在一些實施例中，評價人類個體之SARS-CoV-2傳播或傳染之風險，確定在健康護理機構進行選擇性程序係可接受的(例如記載完成疫苗接種系列、最新PCR測試陰性或不再需要該測試等)。
在一些實施例中，人類個體同意在試驗持續期間不參與另一干預性研究。 b. 個體排除標準
在一些實施例中，針對以下個體排除標準中之一或多者評價投與本文所述之LNP組合物(例如包含編碼Cas9核酸酶(例如Spy Cas9)之mRNA；及靶向 KLKB1基因之指導RNA)之患有HAE (I型HAE或II型HAE)之個體。 i. HAE 個體排除標準
在一些實施例中，人類個體滿足以下標準： 在2期研究中，個體在開始篩選前之5個半衰期內未使用HAE之長期預防；如下表中之預防劑、半衰期及建議清除時段清單中所提供。 表1：HAE預防產品及估計的清除持續時間
在某些實施例中，個體在開始2期導入時段前劑之5個半衰期內未使用C1-INH來治療HAE；即，在使用兔純化之C1-INH (ruconest)後，在開始導入時段之前需要清除24小時，且在使用人類血漿純化之C1-INH (berinert)後，在開始導入時段之前需要清除4天。在導入時段期間之例外係，可使用C1-INH來治療急性HAE發作。
在某些實施例中，個體不具任何其他類型之復發性血管水腫(包括獲得性或特發性血管水腫)之同時診斷。
在一些實施例中，人類個體對任何脂質奈米粒子(LNP)組分不具高敏感性或先前已接受LNP且經歷任何治療相關之實驗室異常或不良事件(例如在接受含LNP之產品後，ALT或AST ＞ 3 × ULN (若基線係正常的)，或ALT或AST ＞ 3 ×基線(若基線高於正常值)；在接受含LNP之產品後，INR、aPTT或d-二聚體＞ 1.5 × ULN (若基線係正常的)，或INR、aPTT或d-二聚體＞ 1.5 ×基線(若基線高於正常值)；LNP治療相關之不良事件分類為CTCAE 3級或更高，對含LNP之產品之輸注相關反應(IRR)需要治療或停止輸注)。
在某些實施例中，個體在研究藥物投與前90天內未暴露於血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑或具有全身性吸收之任何含雌激素之藥物。在某些實施例中，個體在研究藥物投與前之14天內未使用除阿司匹靈(aspirin)外之抗血栓療法(例如華法林(warfarin)、達比加群(dabigatran)、阿哌沙班(apixaban))。
在某些實施例中，個體不具血栓好發症病史或陽性因子V萊頓(Factor V Leiden)或凝血酶原20210遺傳測試。在一些實施例中，人類個體不具肝硬化病史。在一些實施例中，人類個體不具已知或疑似全身性病毒、寄生蟲或真菌感染或尚未接受用於細菌感染之抗生素。在一些實施例中，人類個體不具B型或C型肝炎感染史或陽性B型肝炎表面抗原(HBsAg)或C型肝炎病毒抗體(HCV Ab)測試史。在一些實施例中，人類個體不具陽性人類免疫缺乏病毒(HIV)狀態史。在一些實施例中，人類個體尚未進行先前肝臟、心臟或其他實體器官移植或骨髓移植或預期在投與1年內移植。在一些實施例中，人類個體在篩選前3年內不具酒精或藥物濫用史。在一些實施例中，人類個體不為女性及具有生育潛能或正在哺乳。在一些實施例中，人類個體在投與7天內不具陽性重度急性呼吸症候群冠狀病毒-2 (SARS-CoV-2)聚合酶鏈反應(PCR)測試。
對研究方案進行修正以納入具有生育潛能之女性，其最初出於謹慎被排除在外，此乃因在本研究開始時，正在進行研究卵母細胞編輯潛能之非臨床研究。在進行本研究的同時，在含有人類 KLKB1基因之基因轉殖小鼠中完成明確的GLP育種研究。此研究未揭露 KLKB1編輯之生殖系傳播之證據，此表明具有生育潛能之女性之總體益處/風險評價與總患者群體之總體益處/風險評價相當。已更新益處/風險評價以反映此點，且已添加與納入具有生育潛能之女性相關之其他變化，包括妊娠測試、避孕及妊娠報告要求。
該等及其他排除標準之評價為此項技術中已知。
在某些實施例中，個體滿足上文所述之所有排除標準。 3. 輸注預防
在一些實施例中，本文所述之方法(例如包括向個體投與本文所述之LNP組合物，例如包含編碼Cas核酸酶(例如Cas9)之mRNA；及靶向基因之指導RNA，例如靶向 KLKB1基因之指導RNA)進一步包括輸注預防。在一些實施例中，輸注預防係在投與基因編輯組合物之前投與個體。在一些實施例中，在投與LNP組合物之前投與個體之輸注預防方案包括投與靜脈內類固醇；靜脈內H1阻斷劑或口服H1阻斷劑；及靜脈內或口服H2阻斷劑。靜脈內類固醇可為地塞米松，例如10 mg。靜脈內H1阻斷劑可為苯海拉明，例如50 mg。口服H1阻斷劑可為西替利嗪，例如10 mg。靜脈內或口服H2阻斷劑可為啡莫替定，例如20 mg。 臨床試驗評價方案及標準
提供臨床試驗中所用之以下例示性套組及方法。對於標準實驗室值(例如ALT、AST)之評價，未提供方法，此乃因該等方法係常規的且在此項技術中已充分建立。 血漿胰舒血管素蛋白及活性水準
用於偵測總血漿胰舒血管素(前胰舒血管素+胰舒血管素)及用於胰舒血管素活性水準之套組為此項技術中已知，且驗證套組及分析之方法為此項技術中已知。
前胰舒血管素及胰舒血管素人類ELISA套組(Abcam，目錄號ab171015)提供使用該套組定量量測血漿、血清、唾液、乳汁、腦脊液及細胞培養物以及細胞溶解物中之人類前胰舒血管素(夫列契因子(Fletcher factor))濃度的說明書。
該套組提供預包被至96孔板上且經封閉用於該方法中之前胰舒血管素特異性抗體。將與套組一起提供之標準品或測試樣品添加至孔中，並隨後添加前胰舒血管素特異性生物素化偵測抗體，且然後用洗滌緩衝液洗滌。添加鏈球親生物素蛋白-過氧化物酶結合物且用洗滌緩衝液洗掉未結合之結合物。然後使用TMB使鏈球親生物素蛋白-過氧化物酶酶反應可視化。藉由鏈球親生物素蛋白-過氧化物酶催化TMB以產生藍色產物，其在添加酸性終止溶液後變成黃色。黃色之密度與在板中捕獲之前胰舒血管素及胰舒血管素之量成正比，且據報導分析為約0.77 ng/ml。蛋白質分析係具有參考標準曲線之定量方法且報告濃度。驗證結果證實分析係特異的、準確的、精確的且對其預期用途靈敏的。樣品中之貝羅司他並不干擾偵測。方法並不偵測組織胰舒血管素。
SensoLyte® Rh110血漿胰舒血管素活性分析套組*Fluorimetric* (AnaSpec，目錄號AS-72255)提供使用該套組使用96孔板格式偵測血漿胰舒血管素活性之說明書。SensoLyte®Rh110血漿胰舒血管素活性分析套組採用螢光肽受質來偵測酶活性。此受質含有羅丹明(rhodamine) 110螢光團(Rh110)。血漿胰舒血管素裂解此Rh110受質且導致亮綠色螢光之釋放並可在激發/發射= 496 nm/520 nm處偵測。Rh110之更長波長光譜及更高消光係數提供更大之靈敏度及更少的來自其他反應組分之干擾。據報導，該分析可偵測低至1 ng/mL之活性血漿胰舒血管素。據報導，該套組可用於偵測經純化酶製劑、生物樣品中之酶活性，且亦可應用於化合物篩選。活性分析係定性方法且直接基於斜率(信號對時間作為動力學讀出)報告為抑制%。為用於本文所提供之臨床試驗方法中，根據套組說明書，首先將樣品活化以將所有前胰舒血管素轉化成胰舒血管素，且隨後量測胰舒血管素活性。此螢光方法係基於酶反應之動力學量測(隨時間之螢光信號)之定性分析(不具參考標準曲線)。測定線性範圍內之分析斜率(隨時間之信號)，且劑量後活性(斜率)報告為與劑量前斜率相比之相對信號。
對於總胰舒血管素蛋白水準及胰舒血管素活性水準二者，對於每一患者基於其劑量前水準(3個劑量前樣品(2個來自篩選時段且1個來自劑量前之給藥日)之平均值)計算劑量後時間點之抑制%。對劑量前樣品僅測試一次且報告為個別濃度(蛋白質分析)或基於劑量後對劑量前斜率之抑制% (活性分析)。陽性對照來自自匯集之人類血漿純化之商業胰舒血管素蛋白。
使用正常人類血漿(多個匯集物)來確認蛋白質及活性之偵測。無患者樣品用於方法開發及驗證。正常血漿樣品來自CRL員工捐獻計劃，且使用與臨床試驗中相同之程序處理樣品。 遺傳性血管水腫 (HAE) 發作數據收集及確認
向研究者及研究中心團隊提供關於記載及審查發作史以及收集、審查及評價視為潛在血管水腫發作之事件的以下指導。提供指導以有助於： •     提供遺傳性血管水腫(HAE)發作之定義 •     定義審查潛在發作之最佳原理 •     提供確定個體報告之彼等潛在事件是否係真HAE發作之方法 HAE 發作
為視為HAE發作，報告為該事件之一部分之徵象或症狀必須包括以下中之至少1者： •     外周血管水腫：涉及四肢、面部、頸部、軀幹或泌尿生殖區之皮膚腫脹 •     腹部血管水腫：腹痛，具或不具腹脹、噁心、嘔吐或腹瀉 •     喉血管水腫：喘鳴、呼吸困難、說話困難、吞嚥困難、喉嚨發緊、或舌、腭、懸雍垂或喉腫脹
儘管存在該等徵象或症狀，但在臨床上，當出現以下情況時，該事件可能仍不代表HAE發作： •     診斷駁斥了該事件 •     所報告事件之持續時間遠遠超過該個體之典型發作時程 •     存在另一病因
為視為不同於先前確診之發作之獨特HAE發作，必須確定徵象或症狀在先前發作之徵象或症狀消退後24小時以上才開始。
前驅症狀本身並不視為發作。將急性HAE發作治療用於潛在發作之報告本身並非HAE發作之確診。 個體 HAE 發作史
根據研究方案，將每一個體之HAE發作史記載在研究中心且輸入eCRF中。資訊包括： •     典型發作頻率 •     典型發作位置及症狀 •     個體是否曾經經歷過喉發作之徵象及症狀 •     個體是否經歷前驅徵象及症狀 •     典型發作嚴重程度 •     典型發作持續時間 •     急性發作療法使用 •     任何預防治療史 •     先前3個月(90天)中之發作次數 •     在過去90天中使用HAE相關藥物之完整病史 關於日記及潛在 HAE 發作記錄之個體訓練
在篩選期間，中心人員訓練個體(及護理人員)鑑別發作之症狀、完成日記及在日記中報告發作之要求。根據試驗方案，中心人員在整個研究中評價個體與報告要求之順從性且將在必要時再訓練個體，以維持與方案之順從性。 如個體報告之潛在 HAE 發作資訊
個體(或護理人員)在報告潛在HAE發作時(或盡可能快)或在與研究人員討論時，應在日記中記錄以下資訊： •     首次經歷發作之徵象或症狀之日期及時間 •     所經歷徵象及症狀之描述，包括位置 •     用於治療發作之任何藥物 •     發作之嚴重程度 •     需要輔助、醫療干預、門診、急診或住院病患住院 •     個體不再經歷症狀之日期及時間
個體不必等到其症狀完全消退才在日記中報告潛在HAE發作。
關於正在進行之症狀之資訊可由該中心在計劃研究訪視或計劃遠距醫療訪視或電話聯繫期間獲得。
個體不應為在日記中記錄潛在發作資訊而拒絕或延遲其通常將接受之治療其發作之任何治療。 研究中心人員及研究者對潛在 HAE 發作資訊之審查
如試驗方案中所詳述，中心人員審查日記資訊用於瞭解總體日記順從性。另外，在計劃研究訪視或計劃遠距醫療訪視或電話聯繫期間，中心人員與個體或護理人員一起審查日記資訊且視需要收集額外資訊以進一步記載任何潛在HAE發作。此額外資訊視為研究來源文件。
如研究方案中所詳述，本研究者或設計者審查發作資訊並評估事件是否代表確診HAE發作。在必要時，為進行評估，本研究者或設計者亦可聯繫個體或護理人員審查並收集額外資訊。此額外資訊視為研究來源文件。 報告多次發作
若個體經歷其歸因於1次以上之獨特發作之徵象及症狀，則其可在電子日記中將此報告為多次發作。基於本研究者或設計者對所報告潛在HAE發作之審查，確定報告為獨立之事件是否確診為獨立發作。 中心與個體或護理人員之聯繫
中心人員根據活動時間表建立聯繫個體或護理人員之建議方法及時間。在篩選時及在本研究之整個持續時間(104週)內，中心將定期確認主要聯繫人，且(若可能)確認備用人員及聯繫資訊(例如電子郵件、手機、家用電話)。 研究中心人員及研究者對日記及潛在 HAE 發作資訊之審查
在本研究者或設計者對發作之臨床評價中，每一所報告潛在HAE發作之完全及準確的記載係有益的。中心應審查日記資訊且確保日記含有或其亦記載以下內容並輸入eCRF中： •     與個體聯繫之日期及時間 •     個體首次經歷徵象及症狀之日期及時間 •     總體潛在發作嚴重程度 •     潛在發作是否涉及喉部 •     用於治療潛在發作之藥物，包括HAE急性療法 •     所需輔助、醫療干預、門診、急診或住院病患住院 •     個體不再經歷潛在發作之任何症狀之日期及時間 •     潛在發作是否視為確診發作 •     潛在發作未確診之原因 •     潛在發作是否視為不良事件
所有研究者對潛在及確診發作之評價將記載在中心且亦將由中心人員輸入eCRF中。 發作嚴重程度
個體潛在HAE發作之總體嚴重程度將由個體及中心使用以下指南確定： •     輕度：短暫的或輕度不適 •     中度：輕度至中度活動受限-需要一些輔助 •     重度：活動明顯受限，需要輔助 HAE 發作及報告不良事件
如研究方案中所詳述，中心人員審查日記資訊用於瞭解總體日記順從性。另外，在計劃研究訪視或計劃遠距醫療訪視或電話聯繫期間，中心人員與個體或護理人員一起審查日記資訊且視需要收集額外資訊以進一步記載任何潛在HAE發作。此額外資訊視為研究來源文件。
在每一聯繫及排定的研究訪視時，中心人員將詢問個體是否經歷任何發作、不良事件或其正在服用之藥物之變化。
潛在HAE發作將在日記及eCRF中捕獲，且由本研究者或設計者進行評價。若在研究者或設計者審查潛在HAE發作後，作出替代性診斷且認為事件並非HAE發作，則該事件亦將由中心作為不良事件(AE)輸入eCRF中。所有AE，無論嚴重性、嚴重程度或與研究藥物之因果關係如何，皆記錄在eCRF之AE頁面上。其他AE報告細節提供於研究方案中。
若本研究者認為潛在HAE發作滿足以下標準中之任一者，則在日記及eCRF中將其記錄為發作，且亦必須完成AE eCRF或SAE病例報告表(CRF)： •     本研究者報告且認為HAE發作在臨床上比個體報告為其HAE發作史一部分之彼等發作更重度 •     發作之位置係新的，或個體根據其HAE發作史先前從未經歷過發作 •     本研究者報告且認為HAE發作在臨床上比個體報告為其HAE發作史一部分之彼等發作的持續時間更長 •     HAE發作在發作消退前需要不同或顯著更大之醫療或臨床干預，個體報告之彼等干預為其HAE發作史之一部分 •     HAE發作導致住院 •     主要研究者(PI)進行之任何其他臨床評價或判斷，認為HAE發作與個體報告為其HAE發作史一部分之彼等發作不同且在臨床上較為顯著 血管水腫生活品質
MOXIE血管水腫生活品質(AE-QoL)問卷係患者報告之結果量測，其經開發以獨立於其潛在原因評價患有復發性血管水腫之個體之QoL障礙(Weller等人，2012)。為進行評價，110名血管水腫患者參與AE-QoL之驗證。發現AE-QoL具有四維結構以及有效總分。問卷包括四個領域(功能、疲勞/情緒、恐懼/羞恥、食物)且包括17個問題。測試-再測試已證實儀器總分及領域得分之良好可靠性。發現性別以及患者之自評疾病活動性係AE-QoL總分之預測子。其係可用於臨床研究及常規患者護理之簡短評價。評價工具具有4週之召回時段。該評價可以期望間隔實施，且在不到5分鐘內完成。其可用於幫助更好地表徵受侵襲之患者，幫助治療決策，並監測治療負擔，此在HAE中可為實質性的。在本文所提供之試驗中，評價用於主要觀察時段及主要觀察時段中之單一基線後時間點(第16週)。隨後添加其他評價，具體而言EuroQol Group EQ-5D-5L，其係由5個問題構成之簡短、多屬性、通用之健康狀態量測；以及工作效率及活動障礙問卷(Work Productivity and Activity Impairment Questionnaire)：一般健康(WPAI:GH)評價。 實例 實例 1. 用於 KLKB1 基因編輯之基於 LNP 粒子之組合物 核酸酶 mRNA 之活體外轉錄 ( 「 IVT 」 )
使用常規方法藉由活體外轉錄產生含有N1-甲基假U之經加帽及聚腺苷酸化之mRNA。簡言之，線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶。根據製造商之方案，用XbaI將含有T7啟動子、轉錄序列及聚腺苷酸化區域之質體DNA線性化。藉由加熱使XbaI不活化。自酶及緩衝液鹽純化線性化質體。藉由將以下物質在37℃下培育來實施IVT反應以產生經修飾mRNA：50 ng/µL線性化質體；各2-5 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假UTP (Trilink)；10-25 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶；1 U/µL鼠類RNase抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液。將TURBO DNase (ThermoFisher)添加至0.01 U/µL之最終濃度，且將反應物在37℃下培育以移除DNA模板。
根據製造商之方案，使用MegaClear轉錄清除套組(ThermoFisher)或RNeasy Maxi套組(Qiagen)純化mRNA。替代地，經由沈澱方案純化mRNA，在一些情形下，其後係基於HPLC之純化。簡言之，在DNase消化後，使用LiCl沈澱、乙酸銨沈澱及乙酸鈉沈澱純化mRNA。對於HPLC純化之mRNA，在LiCl沈澱及復原後，藉由RP-IP HPLC純化mRNA (參見例如Kariko等人，Nucleic Acids Research, 2011，第39卷，第21期el42)。將經選擇用於匯集之流份合併且如上文所述藉由乙酸鈉/乙醇沈澱去鹽。在另一種替代方法中，用LiCl沈澱法純化mRNA，然後藉由切向流過濾進一步純化。藉由量測260 nm處之吸光度(Nanodrop)來確定RNA濃度，且藉由毛細管電泳藉由生物分析儀(Agilent)分析轉錄物。
根據序列表，自編碼開放閱讀框之質體DNA產生釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA。當本段中所引用之序列在下文針對RNA提及時應理解，T應用U (其可為如上文所述之經修飾核苷)替代。實例中所用之信使RNA包括5'帽及3'聚腺苷酸化序列，例如多達100 nt且在表3中鑑別。藉由此項技術中已知之方法化學合成指導RNA。 含有 sgRNA 及 Cas9 mRNA 之 LNP 調配物之製備
一般而言，將脂質奈米粒子組分以不同莫耳比溶解於100%乙醇中。將RNA負荷(例如，Cas9 mRNA及sgRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 5.0)中，產生大約0.45 mg/mL之RNA負荷濃度。所用LNP含有可離子化脂質((9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯)(在本文中亦稱為脂質A)、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG，莫耳比分別為50:38:9:3。用約6之脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及1:2之gRNA對mRNA重量比來調配LNP。所用LNP包含Cas9 mRNA及sgRNA。
LNP係使用橫流技術利用乙醇中之脂質與兩體積RNA溶液及一體積水之衝擊噴流混合來製備。經由混合四通將乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液混合。第四股水流經由直插式三通與四通之出口流混合(參見WO2016010840之圖2。)。將LNP在室溫下保持1小時，且進一步用水(大約1:1 v/v)稀釋。在平板柱(Sartorius, 100 kD MWCO)上使用切向流過濾濃縮稀釋之LNP且使用PD-10去鹽管柱(GE)緩衝液交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)中。然後使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。對最終LNP進行表徵以確定囊封效率、多分散性指數及平均粒子大小。將最終LNP儲存在4°C或-80°C下直至進一步使用。使用反相離子配對高效液相層析(IP-RP-HPLC)來確定LNP中之總RNA含量。在IP-RP層析及UV偵測之前，將脂質奈米粒子去調配以釋放RNA。藉由比較sgRNA或cas9 mRNA峰之吸光度信號與使用用於釋放測試之參考標準產生之相應標準曲線來計算每一RNA之濃度。sgRNA及cas9 mRNA濃度之和報告為總RNA濃度，以mg/mL表示。 下一代定序 ( 「 NGS 」 ) 及編輯效率之分析
根據此項技術中已知之方法，例如使用QuickExtract DNA提取溶液(Epicentre，目錄號QE09050)或Quick Extract (Lucigen，目錄號SS000035-D2)，自細胞或組織提取基因體DNA。為定量測定基因體中靶位置之編輯效率，利用定序來鑑別藉由基因編輯引入之插入及缺失之存在。在所關注基因(例如 KLKB1)內之靶位點附近設計PCR引子，且擴增所關注之基因體區域。按照本領域中之標準設計引子序列。
根據製造商之方案(Illumina)進行額外PCR以添加用於定序之化學物質。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子進行定序。在消除具有低品質得分之讀數後，將讀數與參考基因體(例如hg38)進行比對。將含有該等讀數之所得檔案映射至參考基因體(BAM檔案)，其中選擇與所關注靶區域重疊之讀數且計算野生型讀數之數量對含有插入或缺失(「插入/缺失」)之讀數之數量。
編輯百分比(例如「編輯效率」或「編輯%」)定義為在序列讀數之總數(包括野生型)內，具有插入或缺失(「插入/缺失」)之序列讀數之總數。 實例 2. 靶向 KLKB1 基因之 sgRNA 之選擇，包括脫靶分析
在應用電腦模擬及經驗方法之組合之綜合脫靶表徵工作流程後，選擇靶向 KLKB1基因序列GGAUUGCGUAUGGGACACAA (SEQ ID No: 15；染色體基因座chr4:186251793-186251812內之人類基因體構建hg38)之sgRNA用於有效的基因剔除及特異性。為選擇高治療指數(靶控編輯對脫靶編輯之比率)，使用經驗脫靶發現分析SITE-Seq，對G012267 (NTLA-2002中之指導RNA)實施全基因體分析及靶向定序，以鑑別並驗證候選sgRNA脫靶位點。
生物化學性經驗CRISPR/Cas9脫靶發現分析SITE-Seq係無細胞之生物化學方法，其係對潛在脫靶編輯發現最靈敏之方法之一且依賴於經分離gDNA (Cameron 2017)。對衍生自2個獨特男性血液供體之外周血單核細胞之人類gDNA實施SITE-Seq。用Cas9及NTLA-2002中所用之人類 KLKB1sgRNA (hu-G012267)之裝配RNP活體外消化每一gDNA樣品，以誘導與sgRNA序列同源之靶控位點及潛在脫靶位點之DNA裂解。在gDNA消化後，用轉接蛋白將游離gDNA片段末端連結以促進經編輯之片段富集及NGS文庫構築。對NGS文庫進行定序，且經由生物資訊學分析，分析讀數以確定游離DNA末端之基因體坐標。然後將人類基因體中具有讀數累積之位置註釋為潛在脫靶位點。
SITE-Seq發現 KLKB1靶向指導物hu-G012267之61個潛在脫靶基因座。使用藉由SITE-Seq (Cameron 2017)鑑別之hu-G012267之潛在脫靶編輯基因座來補充作為正交發現技術之計算脫靶編輯發現方法Cas-OFFinder (Bae 2014)。SITE-Seq發現61個脫靶位點，且Cas-OFFinder提名47個位點。作為添加之防護措施，亦包括自使用替代性hu-G012267 sgRNA合成化學之2個額外實驗藉由SITE-Seq發現之潛在脫靶基因座用於脫靶編輯驗證，此使潛在脫靶基因座之數量自108 (47個Cas-OFFinder加61個SITE-Seq基因座)增加至196。
隨後經由靶向擴增子定序(rhAmpSeq或AMP-Seq)使用用超飽和劑量之NTLA-2002處理之PHH對藉由Cas-OFFinder及SITE-Seq鑑別之策劃的196個潛在脫靶編輯基因座進行表徵用於脫靶插入/缺失偵測。靶向擴增子定序可確定每一潛在位點之脫靶編輯是否在相關細胞類型PHH中得到驗證。為更好地在治療相關劑量下情景化脫靶編輯，確定每一經驗證之脫靶位點之劑量反應曲線(DRC)中之編輯頻率。
為最大化脫靶編輯偵測之靈敏度，Intellia實施活體外基因體編輯，指導RNA之超飽和劑量(6 nM)比在PHH中達成80%胰舒血管素蛋白減少之憑經驗確定之治療相關劑量(0.12 nM)高50倍。然後用多重擴增子PCR方法rhAMPSeq表徵用超飽和劑量之NTLA-2002 LNP編輯之2個PHH供體之經純化gDNA。由於PCR引子相容性之限制及擴增子富集之技術失敗，rhAMPSeq無法表徵藉由Cas-OFFinder及SITE-Seq發現之每個潛在脫靶編輯位點。潛在脫靶基因座成功地藉由rhAMPSeq表徵或替代地用單重AMP-Seq表徵，以完成所有潛在脫靶編輯基因座之表徵。憑經驗確定rhAmpSeq及AMP-Seq分別具有0.3%及0.5%之插入/缺失偵測下限(分別為TREP-0079及TREP-0120)。
在NTLA-2002之DRC中進一步表徵經驗證之脫靶基因座以將脫靶編輯驗證及插入/缺失頻率置於治療相關劑量之NTLA-2002之背景下，此在PHH中達成＞ 80%之胰舒血管素蛋白減少。用DRC中之NTLA-2002處理PHH之兩個供體批次(Hu8290及Hu8317)且評價靶控及脫靶位點之編輯。
rhAmpSeq在PHH批次Hu8290及Hu8317中在比達成80%胰舒血管素蛋白減少之憑經驗確定之治療相關劑量高50倍之濃度下分別以0.90%及0.60%之頻率在基因 MAPK1(chr22:21837431-21837451)之第一個內含子中偵測到1個經驗證之脫靶編輯位點(表2)。AMP-Seq未偵測到任何經驗證之脫靶位點。
在DRC實驗中，在兩個供體之PHH中在較高劑量下達成 KLKB1基因座處≥ 85%靶控編輯之飽和水準(圖2)。在比達成80%胰舒血管素蛋白減少之治療相關劑量高＞ 50倍之劑量下，觀察到之最大 MAPK1內含子基因座編輯係1.5%。在治療相關劑量(0.12 nM指導RNA)下，在任一PHH批次中未觀察到可偵測之 MAPK1編輯(偵測下限= 0.5%)。
在由Cas-OFFinder及SITE-Seq提名之196個潛在脫靶位點中，僅1個位點在經處理PHH中展示有效的CRISPR/Cas9介導之編輯。此位點位於 MAPK1之內含子1中。在NTLA-2002之治療相關劑量下未偵測到 MAPK1脫靶位點之編輯，此表明與此位點之編輯相關之低風險。
為進一步表徵 MAPK1內含子中之脫靶編輯之潛在效應，使用Droplet Digital™ PCR (ddPCR)來量化 MAPK1mRNA轉錄物。
設計與 MAPK1內含子位點完全同源之指導物hu-G018729以最大化與此基因座處之編輯相關之任何潛在表型。將此指導物以及hu-G012267 (NTLA-2002中之 KLBK1靶向指導物)及ctl-G000739 (非靶向對照sgRNA)與Cas9 mRNA000042一起調配成個別LNP用於活體外研究：分別為LNP-G018729 (含有 MAPK1內含子靶向hu-G018729之LNP)、NTLA-2002及ctl-LNP-G000739 (含有非靶向ctl-G000739之LNP)。在劑量反應分析中，用3種LNP中之每一者處理PHH。在處理後3天，自該等細胞提取gDNA且定序以確定經編輯基因座處之插入/缺失率。亦在處理後10天，自該等細胞提取RNA用於MAPK1表現分析。實施成對雙尾t檢驗，以使用組平均值之差異與匯集之兩組標準誤差的比率來估計治療組與非靶向對照(LNP-G000739)組平均值之間的真實差異。使用本傑明-霍克伯格(Benjamini-Hochberg，B-H)程序作為降低假發現率之工具。
當用 MAPK1靶向LNP-G018729處理時，兩個供體之PHH在MAPK1基因座處達成飽和編輯水準(圖3)。使用具有B-H程序之成對t檢驗，與對照樣品相比，在治療後10天，所有劑量之NTLA-2002處理之PHH及 MAPK1靶向LNP-G018729處理之PHH的後續 MAPK1mRNA量化未導致 MAPK1轉錄物之顯著差異(表3)。
由於 MAPK1基因之非編碼內含子區域內脫靶位點之位置，證實 MAPK1mRNA轉錄物水準無變化之該等結果係預期的。經驗證之脫靶位點之內含子位置與對 MAPK1mRNA水準無影響之觀察、甚至與LNP-G018729在此基因座達成＞ 90編輯%的組合，以及在NTLA-2002之治療相關劑量下在此基因座處無可偵測到之編輯，表明與脫靶編輯相關之低風險。 實例 3. 原代人類肝細胞中之 DNA 結構變異體表徵
為表徵潛在DNA結構變異體(SV)，將2種互補技術應用於表徵基因體穩定性及潛在DNA結構變異體，該等變異體可能因使用NTLA-2002之基因體編輯而出現：合格的獨特標識符標記(UnIT) NGS分析及長片段PCR，然後使用Pacific Biosciences技術進行長讀數定序。使用基於Illumina之NGS的基於靶向PCR之擴增子定序表徵並量化DNA結構變異體(SV) (例如＞ 100 bp之缺失、重複、倒位及轉座)的能力係有限的。
DNA SV發現技術稱為UnIT，其係基於使用Illumina NGS之公開報導來開發(Giannoukos 2018；Klein 2011)。此方法使得能夠同時量測靶控位點之小插入/缺失(＜ 100 bp)及因DNA修復後之重排所致之潛在結構變異體，例如倒位、重複及染色體間轉座。
使用分段及不一致之NGS比對來偵測DNA SV。當NGS讀數或讀數對與基因體中之＞ 1個基因座比對時，使用所涉及之2個片段(在分段比對中來自相同讀數之2個區段，或在不一致比對中來自同一對之2個讀數)對SV進行分類。
實施互補長片段定序方法，其可捕獲短讀數NGS定序可能丟失之編輯位點附近之大缺失。長片段PCR、然後使用Pacific Biosciences技術進行長讀數定序表徵靶控位點附近之大缺失之可能性，此可能係由用NTLA-2002進行基因體編輯後之DNA修復過程引起。
在用NTLA-2002進行基因體編輯後，將UnIT DNA SV表徵分析以一式三份應用於自2個PHH供體純化之gDNA。未偵測到高於憑經驗確定之0.5%偵測限值之DNA SV。
使用長片段PCR及長讀數定序對2個獨特的PHH供體表徵潛在之大缺失。在任一PHH批次中未觀察到高於偵測限值(0.5%)之大缺失。
未鑑別出高於憑經驗確定之0.5%偵測限值之DNA結構變異體且所鑑別之轉座與任何已知致癌風險無關。因此，靶控基因座之基因體重排並不代表已知安全風險。 實例 4. NTLA-2002 效能之 活體外 評估
活體外。已分別在人類及食蟹猴之原代肝細胞中對NTLA-2002及cyn-LNP-G013901實施活體外藥理學研究。在人類肝細胞中測試活體外活性(基因編輯、 KLKB1mRNA減少及胰舒血管素蛋白減少)。飽和水準之NTLA-2002導致 KLKB1基因中之≥ 85%插入/缺失形成(編輯)，隨後 KLKB1mRNA減少≥ 85%，且胰舒血管素蛋白減少≥ 99%。在原代猴肝細胞中觀察到cyn-LNP-G013901之相當之活體外活性。當使用來自猴研究之藥物動力學(PK)/藥效學(PD)數據預測活體內人類PD效應(胰舒血管素蛋白減少)時，考慮cyn-LNP-G013901及NTLA-2002之相對活體外活性。 實例 5. 基因轉殖小鼠中 NTLA-2002 之效能之活體內評估
在表現人類 KLKB1基因之基因轉殖鼠類模型(huKLKB1小鼠)中實施NTLA-2002之活體內藥理學之功能驗證。Hu KLKB1小鼠模型包含人源化 KLKB1基因座，其中小鼠 KLKB1之起始密碼子至終止密碼子之區域用相應人類基因體序列替代。對動物稱重且以個別體重之特異性體積給藥。NTLA-2002係以0.3 mg、0.1 mg、0.03 mg及0.01 mg總RNA/kg體重給藥。
在LNP投與後第13天時，對小鼠實施安樂死。使用Zymo Research Bashing Bead Lysis Rack溶解，且根據製造商之方案使用Qiagen RNeasy Mini套組(Qiagen，目錄號74106)提取RNA。使用Nanodrop 8000 (ThermoFisher Scientific，目錄號ND-8000-GL)量化RNA。在使用前，將RNA樣品儲存在-20℃下。
使用SuperScript III鉑一步qRT-PCR套組(Invitrogen，目錄號11732-088)來產生PCR反應。將靶向Hu KLKB1及內部對照Ms PPIB之定量PCR探針用於反應中。根據製造商之說明書，按比例縮放至適當反應體積，以及使用上文所指定之Hu KLKB1及Ms PPIB探針，實施定量PCR分析。根據製造商之方案，使用StepOnePlus即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific，目錄號4376600)來實施即時PCR反應及轉錄物量化。
使用標準曲線量化Hu KLKB1mRNA，自20 ng/uL之自媒劑對照組匯集之mRNA開始，5個進一步3倍稀釋，以0.06 ng/uL結束。自StepOnePlus即時PCR系統確定Ct值。如實例1中所述藉由ELISA確定用KLKB1試劑處理之細胞之總分泌人類前胰舒血管素蛋白之減少。
表4及圖4顯示編輯%、血清前胰舒血管素水準(以TSS媒劑對照治療之小鼠之%表示)及mRNA轉錄物水準(以TSS媒劑對照治療之動物之%表示)。 表 4 Hu KLKB1 小鼠模型中之編輯 % 、 KLKB1 mRNA ( 基礎水準之 %) 及血清前胰舒血管素蛋白水準 ( 基礎水準之 %)
指導物 劑量(mpk) 編輯% TSS 蛋白% TSS mRNA% SD
TSS 0 平均值 0.1 100 100.5 9.7
動物1 0.1 75.8
動物2 0.1 93.8
動物3 0.1 76.0
動物4 0.1 137.6
動物5 0.1 116.8
NTLA-2002 0.01 平均值 3.9 91.9 100.1 9.5
動物1 4.4 55.3
動物2 3.8 57.3
動物3 4.5 126.2
動物4 4.2 122.2
動物5 2.6 98.6
0.03 平均值 19.0 64.2 69.3 13.8
動物1 22.1 38.6
動物2 0.3 51.0
動物3 26.9 78.9
動物4 21.3 80.5
動物5 24.3 72.2
0.1 平均值 55.4 23.3 48 11.4
動物1 52.1 17.6
動物2 52.7 19.6
動物3 56.5 25.3
動物4 57.5 25.6
動物5 58.0 28.3
0.3 平均值 72.9 3.1 23 13
動物1 73.9 2.7
動物2 70.4 2.9
動物3 72.7 3.1
動物4 73.1 3.4
動物5 74.3 3.4
實施概念驗證研究以評估人源化小鼠中之 KLKB1基因編輯、總胰舒血管素蛋白表現及血管滲漏。存在6組(N=5，每組具有2隻雄性小鼠、3隻雌性小鼠)。對動物稱重且以個別體重之特異性體積給藥。NTLA-2002係基於每公斤體重10 ml體積中之總RNA負荷或媒劑對照(TSS)以0.03 mg/kg、0.1 mg/kg或0.3 mg/kg經由側尾靜脈給藥。
在血管滲漏研究前一天時，收集並處理血液且經由ELISA量測分泌的人類前胰舒血管素以偵測總胰舒血管素。伊文思藍血管通透性分析係建立之水腫及血管滲漏模型，其可用作HAE研究中之模型(參見例如Bhattacharjee等人，2013)。簡言之，在劑量後13天，使用血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑硫甲丙脯酸之2.5 mg/kg腹膜內注射來誘導血管通透性。15分鐘後，藉由靜脈內尾注射投與伊文思藍染料(30 mg/kg)及硫酸葡聚糖(0.3 mg/kg)之混合物。在此注射後15分鐘對動物實施安樂死且經由Clariostar板讀數器(BMG LabTech)根據600 nm吸光度下之光學密度(OD)評估染料外滲至結腸中。收集肝臟及血清以分別量化hu KLKB1基因編輯及胰舒血管素蛋白。
編輯%、血清hu前胰舒血管素水準及血管滲漏之結果顯示於表5以及圖5及圖6中。 表 5. huKLKB1 小鼠中之編輯 % 、前胰舒血管素水準及血管滲漏
劑量(mg/kg) 編輯% 血清胰舒血管素(ug/ml) 結腸(OD)
TSS-1 0 0.02 100.00 0.07
TSS-2 0 0.06 94.92 0.22
對照 0.3 0.1 92.99 0.30
NTLA-2002 0.03 16.48 82.97 0.26
NTLA-2002 0.1 40.46 48.97 0.20
NTLA-2002 0.3 68.66 13.88 0.09
KLKB1基因編輯及血清胰舒血管素減少之劑量依賴性增加導致硫甲丙脯酸誘導之血管通透性降低。在最高測試劑量下，所誘導之通透性與基線水準相似。 實例 7. 非人類靈長類動物中 LNP 介導之編輯
在n=3之隊列中治療食蟹猴。用實例1之LNP調配物實施本研究。每一LNP調配物含有聚腺苷酸化Cas9 mRNA (包含SEQ ID NO: 408)及gRNA (G013901，其係食蟹猴特異性 KLKB1指導RNA，mG*mG*mA*UUACAUAUGGG ACACAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 409))，且mRNA:gRNA重量比係2:1。基於總RNA負荷以1.5 mg、3 mg或6 mg/kg劑量對動物給藥。藉由NGS量測插入/缺失形成(編輯%)。如上文所述量測總胰舒血管素活性及血漿胰舒血管素蛋白水準。
本研究顯示，用G013901對 KLKB1(其係導致舒緩肽釋放之生物學路徑之一部分)進行基因剔除在NHP組中產生高達90%或更大之胰舒血管素活性降低，其係顯示對HAE發作率達成治療上有意義之影響的超過靶活性之穩健反應(胰舒血管素活性降低60%；Banerji, 2017)。本研究顯示增加的編輯率、降低的血漿胰舒血管素水準與降低的胰舒血管素活性之間的劑量依賴性關聯。該反應在NHP中已持續一年。循環胰舒血管素蛋白及活性水準提供於表6及表7；以及圖7及圖8中。 表 6 胰舒血管素活性 ( 基礎活性之 %)
TSS (n=3) 1.5 mpk (n=3) 3 mpk (n=3) 6 mpk (n=3)
天數 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD
0 100 0 100 0 100 0 100 0
7 108.4 9 67.8 7 42.8 12.4 18.2 10.6
14 101.8 18.3 31.1 3.2 15.9 11 5.3 1.6
28 124.4 7.9 26.8 6.5 10.6 5.4 3.9 1.4
42 117.8 5.8 19.8 11.9 8.6 4.4 3.6 0.4
56 130.3 32.5 8.8 5 3.4 0.6 4.2 2.2
70 109.2 15 6 1.7 3 0.4 3.9 1.6
84 121.3 25.7 10.6 3.8 4.2 2.1 4.7 2.5
105 130.8 15.5 23.3 4.9 6 3.6 4.7 2.5
119 88.2 9.1 12.2 10.2 3.4 0.5 3 0.5
147 101.1 3.3 11.9 6.6 4.5 1.4 3 0.5
161 113.2 13.4 21 1.8 6 2.8 5.6 1.8
180 122.3 8.7 19.2 9.5 4.7 1 5 1.9
238 125.5 27.3 16.6 6.5 4.7 1.4 3.2 0.7
252 122.7 27 19.1 7.3 8.2 4.4 3.1 0.7
266 115 23.3 13.9 3.3 8.9 5.2 2.7 0.6
280 112.2 22.7 17.5 2.3 6.8 3.6 3 1
294 126.3 34.1 17 5.8 7.9 4.1 2.9 0.6
308 122.9 28.9 18.2 2.3 7.4 3.3 3 0.8
326 111.6 23 13.3 5.2 5.5 2.9 3.5 0.4
333 127.3 22.4 15.9 1.8 6.8 2.8 3.3 0.4
347 108.4 11.7 16.9 1 4.1 1.8 2.9 0.3
365 118 2.2 24.1 10.2 10 5.7 3.4 0.7
表 7. 血漿胰舒血管素蛋白水準 ( 基礎水準之 %)
TSS (n=3) 1.5 mpk (n=3) 3 mpk (n=3) 6 mpk (n=3)
天數 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD
0 100 0 100 0 100 0 100 0
14 101.3 14.9 28.8 7.4 27.1 8.2 13.7 3.3
28 117.7 7 32.7 8.5 16.9 6.8 6.6 2.3
42 112.6 23.5 31.5 9.1 16 7 6.3 2.8
56 111 16 30.1 8.8 15.4 6 5.8 2.5
70 112.5 14.1 29.8 8 15.4 5.8 5.8 2.8
84 133.6 9 38.7 11.1 17.1 6.7 6.7 2.5
105 118.2 20.1 47 12.7 22.3 10.3 7.6 3.8
119 96 9.8 31.6 8.7 18.1 7.2 6.4 2.2
147 110.7 12 32.1 8.3 18.3 8.1 6.7 2.2
161 119.3 6.1 35.8 10.5 7.5 6.8 7.4 3.5
180 131 10.1 33.8 11.4 18 10.1 2.9 1
238 106.2 3.7 27.4 10.8 16.4 9.8 3.7 0.9
252 114.3 21.4 27.9 9.1 15.6 7.1 3.9 0.8
266 117.6 8.7 28.7 9.7 21.8 10.4 3.7 0.5
280 93.4 22.1 33.7 7.1 24.6 9.8 6.3 2.9
294 122.1 23.7 30.4 13.8 24.6 14 7.4 4
308 93.2 12.8 20.6 13.8 27.6 14.2 6.2 3.1
326 N/A 29.7 7.3 23.8 12.5 8 2.8
333 130.2 25.5 30.9 6.4 25.3 12.4 7.8 2.3
347 106.9 15 26 8.2 22.1 11.2 7.3 3.2
365 108.5 41.3 22.7 8 11.4 5.3 4.3 1.6
在比較TSS緩衝液對照組與治療組時，所選NHP樣品之測試發現，在第10週或第15週時在NHP中未觀察到 KLKB1基因剔除對凝血路徑生物標記物之影響(基於量測凝血酶原、APTT及纖維蛋白原(皆在第10週時量測)及因子XII (在第15週時量測))。
使用包括與人類 KLKB1完全互補之指導序列之指導物G012267，重複NHP研究以評估食蟹猴中之總胰舒血管素蛋白表現及總胰舒血管素活性水準。與具有與食蟹猴 KLKB1完全互補之指導序列之G013901相比，G012267之指導序列具有一個核苷酸差異。本研究中之實驗方案及LNP調配物與上述實驗中所述基本上相同，只是動物(n=3)僅以基於總RNA負荷之3 mg/kg給藥。使用實例1中所述之方法量測總胰舒血管素活性及胰舒血管素蛋白水準。
本研究顯示，用G012267敲低 KLKB1在NHP組中產生高達65%之胰舒血管素活性降低。該反應在NHP中持續9個月。循環胰舒血管素蛋白及活性水準提供於表8及表9以及圖9及圖10中。 表 8. 胰舒血管素活性 ( 基礎活性之 %)
TSS (n=3) 3 mpk (n=3)
天數 平均值 標準偏差 平均值 標準偏差
0 100 N/A 100 N/A
7 90.9 13.7 68.7 11.3
15 87.7 6.6 51.3 18.7
28 90.5 2.5 39.3 24
42 96.5 4.8 31.9 19.5
56 94.5 1.6 34.1 16.7
70 96.2 7.2 42.3 25.7
91 100.2 11.7 45.3 27.6
106 100.2 6.3 45.7 14.3
120 99.8 7.4 46.5 11.1
134 115.2 8.5 47.5 32.4
148 91.5 2 52.9 34.7
162 86.1 21.1 50.1 43.2
180 97.9 1.8 47.3 22.1
192 87.9 1.9 43 24.6
208 94.4 5.8 48 23
222 97 2.9 34.6 21.1
236 97.2 2.2 43.5 19.1
250 91.8 12 46.5 18.3
264 99.9 10.6 51.3 25.2
278 105.3 13.4 60.8 32.3
表 9. 血漿胰舒血管素蛋白水準 ( 基礎水準之 %)
TSS (n=3) 3 mpk (n=3)
天數 平均值 標準偏差 平均值 標準偏差
0 100 N/A 100 N/A
7 99.6 5.1 72.3 13.3
15 89.7 13.1 50.6 9
28 93.9 5.2 52.8 22.3
42 90.3 8.6 52.7 25.5
56 104.2 17.3 49.9 19.1
70 93.9 5.2 52.8 22.3
91 90.3 8.6 52.7 25.5
106 99.3 21.9 43.1 17.3
120 121.7 12.6 41.1 6.2
134 104.2 12 49.7 5.5
148 93 15.8 47.5 11.8
162 100.3 15.7 56.2 26.7
180 106.8 10.9 44.1 33.2
192 96.5 20.5 52 26.6
208 105.6 25 52.9 28.5
250 103.7 21.5 63.3 17.4
264 101.4 7 67.3 15.4
278 94.3 14.4 62.6 16.7
表 10. 基於自非人類靈長類動物研究建模預測的人類之胰舒血管素蛋白減少%
總 RNA 劑量 (mg) BW* (kg) 預測之胰舒血管素減少 %
等效 在人類中之效能係食蟹猴之 7.9 倍
25 81.2 29.4 80.7
75 81.2 58.4 95.1
150 81.2 75.2 99.4
           
*如Wang等人，Clinical and Translational Science. 2020;13 (6): 1208-16報導之HAE患者之平均體重。 實例 8. 生物分佈及組織編輯研究
在NHP中實施使用含有上文實例中所述之sgRNA G013901之食蟹猴替代性LNP調配物之藥物動力學研究。在劑量水準增加3倍之情況下，LNP組分之暴露在雄性中接近或成劑量比例，且在雌性中接近或大於劑量比例。於組分之暴露在雄猴及雌猴中通常係相似的。在使用替代劑cyn-LNP-G013901之研究中，組分係在˂ 5天內自循環清除。
使用NTLA-2002及其替代物cyn-LNP-G013901來評估NHP肝臟(靶組織)中之組織編輯及向其他組織之生物分佈。如藥理學彙總中所述，觀察到劑量依賴性肝臟編輯。在用1.5 mg/kg或4.5 mg/kg cyn-LNP-G013901處理之性成熟之雄性NHP中，腎上腺中之平均編輯分別係2.4%及18.7%，且在彼等劑量水準下，脾中之平均編輯分別係12.2%及18%。在精液或睪丸中未偵測到編輯。在用3 mg/kg、6 mg/kg或9 mg/kg NTLA-2002治療之動物中，腎上腺中之平均編輯分別係1.2%、4.0%及5.1%，且在彼等劑量水準下，脾中之平均編輯分別係2.4%、3.1%及6.0%。與用cyn-LNP-G013901治療之雄性相似，NTLA-2002治療之雄性在睪丸組織中未展現可偵測到之編輯。在雌性中，在一些但非所有雌性之大量卵巢組織中偵測到介於0.8%-1.8%範圍內之低水準之編輯。
在含有人類 KLKB1基因(huKLKB1)之基因轉殖小鼠中觀察到相似之發現。大量卵巢組織中之該等發現保證基因體編輯事件之無意生殖系傳播潛能之進一步研究。在基因轉殖huKLKB1小鼠之GLP育種研究中評估此風險。用NTLA-2002以比預期有效劑量(3 mg/kg)高17倍之劑量治療雌性huKLKB1小鼠(n = 70)且與幼稚雄性huKLKB1小鼠交配。經治療雌性中之平均肝臟編輯係78%，此指示靶器官中之最大活性。在382個後代中，0個展示 KLKB1編輯之基因型。因此，本研究未揭露NTLA-2002介導之編輯事件之生殖系傳播之證據，此支持將具有生育潛能之女性(WOCBP)納入臨床研究中。 實例 9. 臨床試驗
整體原始治療設計彙總於圖11中。對治療設計進行修正以將第三隊列之劑量自150 mg減小至50 mg。 A.   HAE 劑量遞增研究
前言：遺傳性血管水腫(HAE)係罕見的遺傳病症，其特徵在於復發性、使人虛弱的及潛在致命性腫脹發作。靶向胰舒血管素(由 KLKB1基因編碼之蛋白酶)之預防性治療顯著降低發作頻率。NTLA-2002係靶向肝細胞中之 KLKB1之基於CRISPR/Cas9之研究性療法，目標係在單次投與後達成對HAE發作之終身控制。
方法：NCT05120830係HAE患者中之NTLA-2002之人類中之首次1/2期研究。1期係單一遞增劑量設計，主要目標係評估安全性並鑑別出至多兩個劑量以進入隨機化2期，以進一步評估功效及安全性。
結果：隊列1 (25 mg；n = 3)完成16週之主要觀察時段。未觀察到DLT或臨床上顯著之實驗室異常。治療緊急不良事件(TEAE)係不嚴重的且自發消退，其中輸注相關反應最常見(n = 2；CTCAE G1)。所有個體展示血漿胰舒血管素水準(在第16週時平均值為62% ± 27%)及HAE發作頻率自基線之臨床上顯著之耐久降低，其中2個個體自輸注以來保持無發作。在隊列2 (75 mg)中已治療三個個體。對兩個隊列中之所有個體進行隨訪。
結論：迄今為止，單一25 mg劑量之NTLA-2002已充分耐受，滿足進入2期之預定標準，且血漿胰舒血管素水準及HAE發作率在輸注後之整個16週時段內維持降低。將呈現兩個隊列之安全性、藥效學及HAE發作率數據。 隊列 1 、 2 及 3 入選
根據資格標準篩選個體。根據方案，使個體入選劑量遞增隊列1及2，如圖11中所示。使用與隊列1及2相同之納入及排除標準入選隊列3。修正給藥方案，且向個體投與50 mg劑量之NTLA-2002而非如原始方案中之150 mg劑量。 臨床試驗設計及資格
來自全球、1期、開放標記、多中心研究之兩個初始隊列(隊列1及2)之數據呈現於本文中。用靜脈內投與之單劑量之NTLA-2002，25 mg總RNA (3個個體)或75 mg總RNA (3個個體)來治療患者。本文亦報告來自後續治療之該等患者之數據。部分1之關鍵資格標準包括至少18歲，藉由評價功能性C1-INH水準、C1-INH抗原水準及C4水準或遺傳測試確診之HAE (I型或II型)之記載的診斷，以及研究者確診並記載之自篩選開始之先前3個月(90天)期間至少3次之既往HAE發作次數。亦要求個體已使用≥ 1種急性藥物來治療血管水腫發作且具有使用≥ 1種急性藥物來治療血管水腫發作之能力；並在篩選期間滿足實驗室標準，包括： a.    在篩選時，天冬胺酸胺基轉移酶(AST)、丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及總膽紅素(參見下文吉爾伯特氏症候群之例外) ≤正常範圍上限(ULN)。 b.    對於具有吉爾伯特氏症候群病史之個體，篩選評估時之總膽紅素≤ 2 × ULN。 c.    在篩選時，血清肌酸酐≤ ULN，或對於血清肌酸酐高於ULN之個體，其可在估計的腎小球濾過率(eGFR)＞ 45 mL/min/1.73 m^2時納入，如藉由腎病飲食修正方程所量測。該下限後來變成＞60 mL/min/1.73 m^2。 d.    在篩選時，血小板計數≥ 100,000個細胞/mm^3。 e.    在篩選時，在參考範圍或主要研究者(PI)確定之臨床上不顯著之aPTT、國際正規化比率(INR)、纖維蛋白原及d-二聚體水準內。
自1期研究排除已用某些治療劑治療之個體如下： a.    在開始篩選前6個月內使用艾卡拉肽或拉那利尤單抗。 b.    在開始2期導入時段前劑之5個半衰期內使用C1-INH來治療HAE；即，在使用兔純化之C1-INH (ruconest)後，在開始導入時段之前需要清除24小時，且在使用人類血漿純化之C1-INH (berinert)後，在開始導入時段之前需要清除4天。注意：在導入時段期間，可使用C1-INH來治療急性HAE發作。 c.    在研究藥物投與前90天內，暴露於血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑或具有全身性吸收之任何含雌激素之藥物。 d.    在研究藥物投與前14天內，進行除阿司匹靈外之抗血栓療法(例如華法林、達比加群、阿哌沙班)。
排除存在某些感染或醫療疾患之個體，包括： a.    同時診斷有任何其他類型之復發性血管水腫，包括獲得性或特發性血管水腫。 b.    血栓好發症病史或陽性因子V萊頓或凝血酶原20210遺傳測試。 c.    肝硬化病史。 d.    在篩選前14天內，已知或疑似全身性病毒、寄生蟲或真菌感染，包括新冠病毒肺炎(COVID)-19或接受用於細菌感染之抗生素。 e.    在篩選時，B型或C型肝炎感染史或陽性B型肝炎表面抗原(HBsAg)或C型肝炎病毒抗體(HCVAb)測試史。 f.     陽性人類免疫缺乏病毒(HIV)狀態史。
要求個體願意且能夠遵守其他標準，包括(但不限於)使用有效避孕，並願意遵守研究程序，包括隨訪及與本研究者合作。
試驗1期部分之篩選時段長達28天(需要時+14天)。滿足所有納入標準且不滿足排除標準之個體可進行給藥。在篩選期間記錄血管水腫發作且在評估投與NTLA-2002後之發作率降低時，與3個月既往發作數據一起使用。 遺傳性血管水腫 (HAE) 發作數據收集及確認
向本研究者及研究中心團隊提供詳細指導以提供與發作史之記載及審查相關之一致性，以及收集、審查及評價視為潛在血管水腫發作之事件。上文提供定義及方法之詳細論述。 劑量遞增及劑量限制性毒性
設計1期臨床試驗以證實NTLA-2002之安全性並鑑別適用於2期研究之給藥。如圖11中所示，1期係由至多3個劑量遞增隊列組成，且隊列1至3係由最少3個劑量限制性毒性(DLT)可評估個體及最多6個DLT可評估個體組成。本研究亦允許至多2個視情況存在之劑量減少隊列，每一隊列係由最少3個DLT可評估個體及最多6個DLT可評估個體組成。總之，至多30個DLT可評估個體可入選1期。NTLA-2002將如圖11中所示之隊列給藥綜述表中所示給藥，如所述進行可能的遞增/減少修改。
每個隊列需要最少3個DLT可評估個體。DLT可評估個體係已接受NTLA-2002之全部分配劑量且完成第29天評價之彼等個體，及無論是否投與全部劑量，經歷劑量限制性毒性(DLT)之任何個體。 隊列給藥
在單一遞增劑量期中，每一隊列向哨兵個體給藥以評估14天之潛在急性毒性。若哨兵個體未經歷DLT，則可向隊列中之2個額外個體平行給藥。若任一個體在給藥與長達且包括第15天訪視評價之間經歷DLT，則在任一DLT已消退至至少1級後且在所有活躍個體完成第15天訪視評價後，向該劑量隊列中之下一個體給藥。若任一個體在第14天訪視評價後及長達且包括第29天訪視評價經歷DLT，則可在任一DLT已消退至至少1級後，向該劑量隊列中之下一個體給藥。
持續28天評估在每一隊列中給藥之最後一個個體，且之後基於下文所提供之標準考慮劑量遞增。贊助商與本研究者及數據監測委員會(Data Monitoring Committee，DMC)聯合確定事件是否滿足DLT之定義以及是否在前28天中發生。贊助商可使如本研究者報告之不良事件(AE)之嚴重程度、嚴重性或相關性升級；贊助商禁止AE之降級。
若在任一隊列中3個個體中之1個具有DLT，則可使額外3個個體依序入選，在該劑量水準下每一個體之間最少間隔14天。若3個個體中之2個或3個經歷DLT，則停止入選至該隊列且可(再)開放下一更低劑量隊列以使3個個體入選。在任一隊列中，若3個個體中之3個在第22天時具有aPTT ≥ 125秒，則該劑量水準將宣佈為最大評估劑量。若該等隊列關閉事件發生在初始劑量水準1隊列(25 mg)中，則研究3個個體之劑量減小隊列，以評價較低劑量是否係安全且耐受的並具有藥理學活性證據。可使至多6個個體入選最終劑量隊列以確認安全性。
DLT包括以下(在給藥後前28天內發生之事件)： •     與研究藥物可能、大概或明確相關之任何不良事件通用術語標準(CTCAE) 3級或更高之不良事件，不包括與血管水腫、aPTT延長或患者之其他共生(潛在)疾患相關之AE •     持續≥ 7天且與研究藥物可能、大概或明確相關之任何CTCAE 3級實驗室異常(不包括aPTT延長) •     與研究藥物可能、大概或明確相關之任何CTCAE 4級實驗室異常 •     滿足方案定義之暫停入選標準之任何AE，包括致命性或危及生命之不良事件；ALT或AST之升高＞ 5 × ULN超過4週，或ALT或AST ＞ 3 × ULN且總膽紅素＞ 2 × ULN (無膽汁淤積[升高的血清鹼性磷酸酶]之初始發現；海氏定律)；或血栓形成、出血或與散播性血管內凝血一致之實驗室參數，其中方案定義之暫停入選標準由本研究者確定為與研究藥物可能、大概或明確相關。 •     贊助商與本研究者及DMC協商後認為會妨礙進一步給藥之任何其他不良事件或實驗室異常。 劑量遞增、劑量減小或完成入選
在完成至少3個個體之劑量水準隊列入選及直至第29天訪視評價之隨訪後，贊助商審查所有可獲得之安全性及耐受性數據，以與本研究者及數據監測委員會(DMC) (根據DMC章程)協商確定下一步。劑量遞增/減小決策係基於全部可獲得之數據，包括輸注後28天內之DLT之初始觀察、aPTT自基線至第22天之變化以及安全性、功效及PD數據。 •     若滿足以下標準中之兩者，則可由贊助商提出將劑量遞增至下一計劃劑量水準：發現所投與之劑量水準係安全且充分耐受的，並且個別aPTT之審查揭露，在第22天訪視評價時，隊列中至少1/3之個體具有aPTT ＜ 125秒。基於所有可獲得數據之審查，可修改劑量遞增，使得下一計劃劑量水準係介於目前劑量與下一方案指定劑量之間的劑量。替代地，贊助商可選擇開放隊列，使得下一計劃劑量水準係劑量減小。 •     若滿足以下標準中之任一者，則將由贊助商提出將劑量減小至低於目前劑量水準之劑量：發現隊列中投與之劑量並非安全且充分耐受的；或隊列aPTT之審查指示，在隊列中之所有個體中在第22天訪視時達成最大預期藥理學效應(≥ 125秒)。
劑量遞增、劑量減小或完成研究1期入選及開始2期將由贊助商決定，且研究者及DMC提供建議(根據DMC章程)。除上文所述之標準外，在贊助商之判斷下，可出於任一原因停止研究入選並召開DMC會議以保護個體安全。
在所有3-5個計劃劑量隊列完成第29天評價後；或若鑑別出最大評估劑量時；或基於贊助商評價與本研究者及DMC協商提前終止研究，則宣佈完成1期研究入選。
為將劑量之選擇通知2期研究中之測試，贊助商實施所有1期安全性、耐受性、PK、PD (前胰舒血管素/胰舒血管素濃度降低)及治療活性(第5-16週HAE發作率之分析)之綜合分析。將由本研究者及DMC審查結果以確定是否在2期研究中測試劑量。
在開始2期研究之前，使用適當之數據截止點，根據國家要求向管理機構或研究倫理規範審查小組(Institutional Review Board，IRB)/倫理委員會(Ethics Committee，EC)提供累積數據彙總。 2期
2期涉及多達25個個體及3個臂，包括接受不同劑量之NTLA-2002之至多2個臂及接受鹽水安慰劑之1個臂。若在2期中使用2個劑量水準之NTLA-2002，則將個體以2:2:1 (NTLA-2002劑量水準1:NTLA-2002劑量水準2:安慰劑)隨機化。若在2期中使用僅1個劑量水準之NTLA-2002，將多達15個個體以2:1 (NTLA-2002劑量水準1:安慰劑)隨機化。經選擇用於2期之NTLA-2002劑量係在1期中確定為安全且充分耐受之劑量，其中平均總血漿前胰舒血管素/胰舒血管素水準自基線至最低點降低至少60%，及HAE發作減少之證據。
2期涉及多達25個個體及3個臂，包括接受不同劑量之NTLA-2002 (25 mg (n=10)及50 mg (n=10))之至多2個臂及接受鹽水安慰劑之1個臂(n=5)。主要目標係直至第16週對發作之臨床功效，及其他藥效學、安全性、耐受性、藥物動力學及生活品質評價。 藥物動力學
期中藥物動力學數據表明，在靜脈內(IV)輸注後，NTLA-2002可離子化脂質展現自峰值水準快速下降，隨後為次峰值，且然後進入線性對數期。 實例 10. 遺傳性血管水腫患者中 KLKB1 之活體內 CRISPR/-Cas9 編輯：人類中之首次研究 隊列 1 ：
報告實例9中所述之1期研究之隊列1中的用25 mg NTLA-2002治療之三個個體之數據。隊列1人口統計資訊及HAE發作特徵描述於表13中。個體完成16週之主要觀察時段。個體不具觀察到之DLT。個體不具臨床上顯著之實驗室異常。TEAE係不嚴重的且自發消退，其中輸注相關反應最常見(n = 2；CTCAE G1)。所有輸注相關反應皆視為輕度的、可消退且無臨床後遺症。未觀察到治療緊急SAE或≥ 3級之AE。個體展示HAE發作頻率自基線降低，其中兩個個體自輸注以來保持無發作(表11及表12以及圖15及圖16A)。與篩選時段相比，在輸注後第1-16週中，隊列1中之個體具有＞90%之平均發作頻率降低(平均值為-91% ± 16% SD)。包括90天患者報告之歷史時段之分析導致每月發作率之-94%之平均變化%。個體亦展示血漿胰舒血管素水準之降低，例如臨床上顯著之耐久降低(在第16週時平均值為62% ± 27 %) (參見例如圖12)。圖13描述輸注後之平均絕對蛋白質減少。圖14描述輸注後之平均絕對蛋白質減少之更新結果。迄今為止，單一25 mg劑量之NTLA-2002已充分耐受且滿足進入2期之預定標準，其中血漿胰舒血管素水準及HAE發作率在輸注後之整個16週時段內維持降低。 表 11 ：隊列 1 (25 mg) 發作率之降低 表 12 ：隊列 1 (25 mg) 發作率之個別降低
患者
每月發作率 1 2 3
90天歷史時段(患者報告) 1.9 14.0 2.2
篩選時段(研究者確診) 1.1 7.2 2.9
第1-16週(研究者確診) 0 2 0
表 13 ：隊列 1 (25 mg) 人口統計數據及發作表徵
患者1 患者2 患者3
年齡 30 52 26
I 型或II 型HAE II型HAE家族史 I型HAE家族史 I型
篩選期間之每月發作率 1.1 7.2 2.9
預防 無預防 長期達那唑預防 貝羅司他
發作特徵 嚴重程度通常為中度，涉及四肢腫脹 突破性發作，通常為重度，涉及腹部腫脹、疼痛及外周水腫 突破性發作，涉及喉腫脹、泌尿生殖區以及四肢及腹部之皮膚腫脹
隊列 2 ：
在實例9中所述之1期研究之隊列2中，已用75 mg之NTLA-2002治療三個個體。
在使用隊列2之隨訪分析中，個體不具臨床上顯著之實驗室異常。TEAE係不嚴重的且自發消退，其中輸注相關反應最常見(n = 2；CTCAE G1，及n = 2；CTCAE G2)。所有輸注相關反應皆視為輕度的、可消退且無臨床後遺症。未報告3級或更高之TEAE。圖13描述輸注後之平均絕對蛋白質減少。圖14描述輸注後之平均絕對蛋白質減少之更新結果。在自基線至最低點之降低%係65% (25 mg)及92% (75 mg)的情況下，兩個劑量水準展示預期與HAE發作之有效預防相關之藥效學反應。
患者人口統計資訊及特徵提供於表14中。隊列1及2之患者HAE發作史及預防使用個別地及共同呈現於表15中。 表 14 ：患者人口統計資訊及特徵
參數 25 mg (n=3) 75 mg (n=3) 所有患者 (n=6)
中值年齡，歲 (Min, Max) 30 (26, 52) 45 (27, 49) 38 (26, 52)
性別，n (%)         
男性 3 (100%) 2 (67%) 5 (83%)
女性 - 1 (33%) 1 (17%)
中值體重，kg (Min, Max) 83 (78, 135) 72 (64, 84) 81 (64, 135)
HAE 類型，n (%)         
I 型 2 (67%) 2 (67%) 4 (67%)
II 型 1 (33%) 1 (33%) 2 (33%)
表 15 ： HAE 發作史及預防
參數 25 mg n = 3 75 mg n = 3 所有患者 n = 6
先前使用預防，n (%)是 否    3 (100%) –    3 (100%) –    6 (100%) –
既往每月發作率( 患者報告)平均值(SD)    6.0 (6.9)    7.7 (8.0)    6.8 (6.8)
典型發作嚴重程度，n (%)輕度 中度 重度    1 (33%) 1 (33%) 1 (33%)    1 (33%) 1 (33%) 1 (33%)    2 (33%) 2 (33%) 2 (33%)
NTLA-2002在兩個劑量水準下通常係充分耐受的。在兩個劑量水準下，最頻繁之不良事件係疲勞及輸注相關反應。大多數治療緊急不良事件之嚴重程度係輕度，且67% (n=4)及33% (n=2)之患者分別報告1級或2級之最大不良事件嚴重程度。所有輸注相關反應皆視為輕度(n = 4)或中度的(n = 1)、可消退且無臨床後遺症。所有患者接受NTLA-2002之完整研究劑量。
未觀察到臨床上顯著之實驗室發現。觀察到AST (n = 3)及ALT (n = 2)之短暫1級升高。未觀察到活化部分凝血激酶時間之增加。未觀察到治療緊急SAE或≥ 3級之AE。不良事件彙總於下表16中。 表 16 ：不良事件
   隊列1 (25 mg) n=3 隊列2 (75 mg) n=3 所有患者n=6
在＞ 2名患者中出現之AE 1級 2級 1級 2級 1級 2級
輸注相關反應 2 - 2 1 4 1
疲勞 1 - 2 - 3 -
頭痛 - - 2 - 2 -
COVID-19 2 - - - 2 -
上呼吸道感染 1 - 1 - 2 -
在不超過一名患者中報告所有其他不良事件(腹痛、胸部損傷、軟組織損傷、疾病前驅階段、鼻炎、腹瀉、嘔吐、嗜眠、肌痛、失眠、口咽疼痛、病毒性上呼吸道感染)。
單劑量之NTLA-2002導致總血漿胰舒血管素水準之穩健的劑量依賴性及耐久降低。在第8週時達成65% (25 mg)及92% (75 mg)之平均降低。直至第16週，25 mg隊列中HAE發作之平均降低＞90%。25 mg隊列中之所有患者達成完全發作控制。進行先前預防療法之患者能夠停止且保持無發作。
NTLA-2002在兩個劑量水準下通常係充分耐受的；所有AE皆具有輕度或中度之嚴重程度。已入選且治療50 mg隊列。 隊列 3 ：
在實例9中所述之1期研究之隊列3中，已用50 mg之NTLA-2002治療四個個體。
在使用隊列3之隨訪分析中，個體不具臨床上顯著之實驗室異常。在所有劑量水準下，TEAE係輕度(n = 5)至中度的(n = 4)、可消退且無臨床後遺症。未觀察到活化部分凝血激酶時間之增加。未報告治療緊急SAE或3級或更高之TEAE。圖17描述輸注後之平均絕對蛋白質減少之更新結果。圖18描述輸注後相對於基線之平均胰舒血管素蛋白減少%之更新結果。所有三個劑量水準展示預期與HAE發作之有效預防相關之藥效學反應。
患者人口統計資訊及特徵提供於表17中。隊列1-3之患者HAE發作史及預防使用呈現於表18中。 表 17 ：患者人口統計資訊及特徵
參數 25 mg (n=3) 50 mg (n=4) 75 mg (n=3) 所有患者(n=10)
中值年齡，歲 (Min, Max) 30 (26, 52) 65 (52, 73) 45 (27, 49) 51 (26, 73)
性別，n (%)            
男性 3 (100%) 1 (25%) 2 (67%) 6 (60%)
女性 - 3 (75%) 1 (33%) 4 (40%)
中值體重，kg (Min, Max) 83 (78, 135) 86 (74, 107) 72 (64, 84) 83 (64, 135)
HAE 類型，n (%)            
I 型 2 (67%) 1 (25%) 2 (67%) 5 (50%)
II 型 1 (33%) 2 (50%) 1 (33%) 4 (40%)
未知 - 1 (25%) - 1 (10%)
表 18 ： HAE 發作史及預防
參數 25 mg n = 3 50 mg n = 4 75 mg n = 3 所有患者 n = 10
先前使用長期預防，n (%)是 否    2 (67%) 1 (33%)    4 (100%)    3 (100%)    9 (90%) 1 (10%)
伴隨長期預防，n (%)是 否    2 (67%) 1 (33%)    3 (75%) 1 (25%)    1 (33%) 2 (67%)    6 (60%) 4 (40%)
既往每月發作率( 患者報告)平均值(SD)    6.0 (6.9)    1.2 (0.47)    7.7 (8.00)    4.6 (5.83)
典型發作嚴重程度，n (%)輕度 中度 重度    1 (33%) 1 (33%) 1 (33%)    2 (50%) 2 (50%) 0    1 (33%) 1 (33%) 1 (33%)    4 (40%) 4 (40%) 2 (20%)
NTLA-2002在所有三個劑量水準下通常係充分耐受的。在所有三個劑量水準下，最頻繁之不良事件係疲勞及輸注相關反應。大多數治療緊急不良事件之嚴重程度係輕度，且50% (n=5)及40% (n=4)之患者分別報告1級或2級之最大不良事件嚴重程度。所有輸注相關反應皆視為輕度(n = 5)或中度的(n = 2)、可消退且無臨床後遺症。所有患者接受NTLA-2002之完整研究劑量。
未觀察到臨床上顯著之實驗室發現。不良事件彙總於下表19中。 表 19 ：不良事件
   隊列1 (25 mg) n=3 隊列3 (50 mg) n=4 隊列2 (75 mg) n=3 所有患者 n=10
在＞ 2名患者中出現之AE 1級 2級 1級 2級 1級 2級 1級 2級
任一TEAE (最高等級) 2 1 2 1 1 2 5 4
輸注相關反應 2 - 1 1 2 1 5 2
疲勞 1 - 2 1 2 - 5 1
COVID-19 2 - 1 - 1 - 4 -
口咽疼痛 2 - - - 1 - 3 -
頭痛 - - - - 2 - 2 -
上呼吸道感染 1 - - - 1 - 2 -
病毒性上呼吸道感染 - - - - 2 - 2 -
在不超過一名患者中報告所有其他不良事件AE (腹部不適、腹痛、上腹痛、關節痛、無力、胸部損傷、憂鬱情緒、腹瀉、疾病前驅階段、側腹痛、失眠、肌痛、鼻炎、鼻竇炎、軟組織損傷、嗜眠、嘔吐)。
單劑量之NTLA-2002導致總血漿胰舒血管素水準之穩健的劑量依賴性及耐久降低。在最低點時觀察到65% (25 mg)至92% (75 mg)之平均血漿減少，且反應持續隨訪之持續時間。
在具有至少16週隨訪之所有患者中觀察到HAE發作率之臨床上有意義之降低。隊列1 (25 mg)及隊列2 (75 mg)中100%之患者具有2.3個月至10.6個月之持續無發作間隔；治療之前三名患者已無發作達5.5-10.6個月(圖19、圖20A及圖20B)。在投與NTLA-2002後之第1-16週中，隊列1之發作自基線之平均變化百分比係91%，且隊列2之發作自基線之平均變化百分比係78%。在投與NTLA-2002後之第5-16週中，隊列1之發作自基線之平均變化百分比係89%，且隊列2之發作自基線之平均變化百分比係89% (圖21)。在NTLA-2002輸注後停止預防療法之患者保持無發作。
與早期分析一致，NTLA-2002在兩個劑量水準下通常係充分耐受的；所有AE皆具有輕度或中度之嚴重程度。 實例 11. 遺傳性血管水腫患者中 KLKB1 之活體內 CRISPR/-Cas9 編輯：更新之臨床數據
提供實例10之隊列1-3之隨訪分析。圖22描述輸注後之平均絕對蛋白質減少之更新結果。圖23描述輸注後相對於基線之平均胰舒血管素蛋白減少%之更新結果。輸注後每一隊列之血漿胰舒血管素活性平均絕對值描述於圖28中。輸注後每一隊列之血漿胰舒血管素活性自基線之平均變化百分比描述於圖29中。胰舒血管素蛋白水準自基線之變化百分比之個體患者數據之義大利麵圖描述於圖30-圖32中。胰舒血管素活性水準自基線之變化百分比之個體患者數據之義大利麵圖描述於圖33-圖35中。與早期報導之發現一致，所有三個劑量水準展示預期與HAE發作之有效預防相關之藥效學反應。
單劑量之NTLA-2002導致總血漿胰舒血管素水準之穩健的劑量依賴性及耐久降低。在最低點時觀察到65% (25 mg)、81% (50 mg)及92% (75 mg)之平均血漿減少，且反應持續隨訪之持續時間。
在具有至少24週隨訪之所有患者中觀察到HAE發作率之臨床上有意義之降低。除隊列1 (25 mg)中之患者外，所有患者具有3.7個月至12個月之持續無發作間隔(圖24-圖27)。隊列1 (25 mg)中之患者經歷單次輕度發作。在投與NTLA-2002後之第1-24週中，隊列1 (25 mg)之發作自基線之平均變化百分比係93.8%，隊列2 (75 mg)之發作自基線之平均變化百分比係83.7%，且隊列3 (50 mg)之發作自基線之平均變化百分比係98.3%。在投與NTLA-2002後之研究時段中，隊列1之發作自基線之平均變化百分比係95.4%，隊列2之發作自基線之平均變化百分比係91.2%，且隊列3之發作自基線之平均變化百分比係98.3% (表20、表21)。在接受伴隨長期預防之6名患者(表18)中，100%能夠停止預防療法且保持無發作(圖24)。隊列1-3之患者HAE發作史呈現於表20 (研究者確診之HAE發作)及表21 (研究者確診之需要急性療法之HAE發作)中。
與早期分析一致，NTLA-2002在所有三個劑量水準下通常係充分耐受的；所有AE皆具有輕度或中度之嚴重程度。所有治療相關之TEAE皆係2級或更低。所有患者接受NTLA-2002之完整研究劑量。不良事件彙總於下表22中。 表 20 ：研究者確診 HAE 發作之描述性彙總
      劑量水準25 mg N= 3 劑量水準50 mg N= 4 劑量水準75 mg N= 3 總數 N=10
      觀察到 自基線之變化% 觀察到 自基線之變化% 觀察到 自基線之變化% 觀察到 自基線之變化%
基線 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 3.7 (3.11) 2.9 1.1, 7.2    4 (100) 2.1 (2.96) 0.9 0.0, 6.5    3 (100) 4.7 (1.04) 4.3 4.0, 5.9    10 (100) 3.4 (2.59) 3.4 0.0, 7.2   
第1-16週 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 0.7 (1.15) 0.0 0.0, 2.0 3 (100) -90.7 (16.12) -100.0 -100.0, -72.1 4 (100) 0.1 (0.25) 0.0 0.0, 0.5 3 (75.0) -97.4 (4.47) -100.0 -100.0, -92.3 3 (100) 1.4 (2.24) 0.3 0.0, 4.0 3 (100) -75.6 (37.32) -94.2 -100.0, -32.7 10 (100) 0.7 (1.32) 0.0 0.0, 4.0 9 (90.0) -87.9 (22.62) -100.0 -100.0, -32.7
第5-16週 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 0.8 (1.35) 0.0 0.0, 2.2 3 (100) -89.1 (18.81) -100.0 -100.0, -67.4 4 (100) 0.0 (0.00) 0.0 0.0, 0.0 3 (75.0) -100.0 (0.00) -100.0 -100.0, -100.0 3 (100) 0.9 (1.54) 0.0 0.0, 2.7 3 (100) -85.0 (25.92) -100.0 -100.0, -55.1 10 (100) 0.5 (1.06) 0.0 0.0, 2.7 9 (90.0) -91.4 (17.36) -100.0 -100.0, -55.1
第1-24週 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 0.4 (0.77) 0.0 0.0, 1.3 3 (100) -93.8 (10.75) -100.0 -100.0, -81.4 4 (100) 0.1 (0.17) 0.0 0.0, 0.3 3 (75.0) -98.3 (2.98) -100.0 -100.0, -94.8 3 (100) 0.9 (1.49) 0.2 0.0, 2.7 3 (100) -83.7 (24.88) -96.1 -100.0, -55.1 10 (100) 0.5 (0.88) 0.0 0.0, 2.7 9 (90.0) -91.9 (15.08) -100.0 -100.0, -55.1
研究時段 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 0.2 (0.31) 0.1 0.0, 0.6 3 (100) -95.4 (4.12) -94.2 -100.0, -92.0 4 (100) 0.1 (0.16) 0.0 0.0, 0.3 3 (75.0) -98.3 (2.91) -100.0 -100.0, -95.0 3 (100) 0.5 (0.79) 0.1 0.0, 1.4 3 (100) -91.2 (13.15) -97.4 -100.0, -76.1 10 (100) 0.2 (0.45) 0.0 0.0, 1.4 9 (90.0) -95.0 (7.70) -97.4 -100.0, -76.1
基線定義為在投與NTLA-2002之前長達42天之篩選時段。HAE發作係基於「PI發作評價」 CRF。僅計算在基線期間患有HAE發作之個體自基線之變化%。
研究時段定義為自研究藥物輸注日至數據截止日之末次HAE發作評價之時間。每月HAE發作次數計算為在基線/指定觀察時段期間發生之HAE發作次數除以個體貢獻於基線/指定觀察時段之天數乘以28天。 表 21 ：研究者確診之需要急性療法之 HAE 發作之描述性彙總
      劑量水準25 mg N= 3 劑量水準50 mg N= 4 劑量水準75 mg N= 3 總數 N= 10
      觀察到 自基線之變化% 觀察到 自基線之變化% 觀察到 自基線之變化% 觀察到 自基線之變化%
基線 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 2.1 (1.79) 2.9 0.0, 3.3    4 (100) 0.7 (1.02) 0.3 0.0, 2.2    3 (100) 4.4 (1.47) 4.3 3.0, 5.9    10 (100) 2.2 (2.04) 2.5 0.0, 5.9   
第1-16週 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 0.6 (1.01) 0.0 0.0, 1.8 2 (66.7) -73.1 (38.01) -73.1 -100, -46.3 4 (100) 0.1 (0.25) 0.0 0.0, 0.5 2 (50.0) -88.4 (16.41) -88.4 -100.0, -76.8 3 (100) 1.3 (1.95) 0.3 0.0, 3.5 3 (100) -78.4 (32.48) -94.2 -100.0, -41.1 10 (100) 0.6 (1.16) 0.0 0.0, 3.5 7 (70.0) -79.8 (26.03) -94.2 -100.0, -41.1
第5-16週 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 0.8 (1.35) 0.0 0.0, 2.3 2 (66.7) -64.2 (50.68) -64.2 -100.0, -28.3 4 (100) 0.0 (0) 0.0 0.0, 0.0 2 (50.0) -100.0 (0) -100.0 -100.0, -100.0 3 (100) 0.7 (1.15) 0.0 0.0, 0.2 3 (100) -88.8 (19.44) -100.0 -100.0, -66.3 10 (100) 0.4 (0.92) 0.0 0.0, 2.3 7 (70.0) -85.0 (27.94) -100.0 -100.0, -28.3
第1-24週 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 0.4 (0.67) 0.0 0.0, 1.2 2 (66.7) -82.1 (25.34) -82.1 -100.0, -64.2 4 (100) 0.1 (0.17) 0.0 0.0, 0.3 2 (50.0) -92.3 (10.94) -92.3 -100.0, -84.5 3 (100) 0.8 (1.30) 0.2 0.0, 2.3 3 (100) -85.6 (21.65) -96.1 -100.0, -60.7 10 (100) 0.4 (0.77) 0.0 0.0, 2.3 7 (70.0) -86.5 (17.35) -96.1 -100.0, -60.7
研究時段 N (%) 平均值(SD) 中值 Min, Max 3 (100) 0.2 (0.29) 0.0 0.0, 0.5 2 (66.7) -92.3 (10.83) -92.3 -100.0, -84.7 4 (100) 0.1 (0.16) 0.0 0.0, 0.3 2 (50.0) -92.4 (10.69) -92.4 -100.0, -84.9 3 (100) 0.5 (0.69) 0.1 0.0, 1.2 3 (100) -92.2 (11.43) -97.4 -100.0, -79.0 10 (100) 0.2 (0.40) 0.0 0.0, 1.2 7 (70.0) -92.3 (9.06) -97.4 -100.0, -79.0
基線定義為在投與NTLA-2002之前長達42天之篩選時段。HAE發作係基於「PI發作評價」 CRF。僅計算在基線期間患有需要急性療法之HAE發作之個體自基線之變化%。研究時段定義為自研究藥物輸注日至數據截止日之末次HAE發作評價之時間。每月HAE發作次數計算為在基線/指定觀察時段期間發生之HAE發作次數除以個體貢獻於基線/指定觀察時段之天數乘以28天。 表 22 ：不良事件
   隊列1 (25 mg) n=3 隊列3 (50 mg) n=4 隊列2 (75 mg) n=3 所有患者 n=10
任何TEAE 3 (100) 3 (75.0) 3 (100) 9 (90.0)
劑量限制性毒性 0 0 0 0
治療相關之TEAE 2 (66.7) 3 (75.0) 3 (100) 8 (80.0)
嚴重TEAE 0 0 0 0
治療相關之嚴重TEAE 0 0 0 0
≥3級之TEAE 3級 4級 5級 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
≥3級之治療相關之TEAE 3級 4級 5級 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
導致研究藥物輸注中斷之TEAE 0 1(25.0) 0 1 (10.0)
導致研究藥物輸注中斷之治療相關之TEAE 0 1(25.0) 0 1 (10.0)
導致研究藥物輸注停止之TEAE 0 0 0 0
導致研究藥物輸注停止之治療相關之TEAE 0 0 0 0
治療緊急AESI 2 (66.7) 2 (50.0) 3 (100) 7 (70.0)
治療相關之治療緊急AESI 2 (66.7) 2 (50.0) 3 (100) 7 (70.0)
導致死亡之TEAE 0 0 0 0
導致死亡之治療相關之TEAE 0 0 0 0
TEAE =治療緊急不良事件；AESI =特別關注之不良事件。
TEAE係在研究藥物輸注日或之後開始或在研究藥物輸注後直至研究結束時惡化之AE。若在「不良事件」 eCRF頁面上與NTLA-2002之關係= 「可能的」或「大概的」，或若關係丟失，則認為AE係治療相關的。若個體在給定AE類別中經歷多個事件，則僅對每一個體計數一次最大等級。 實例 12. 遺傳性血管水腫患者中 KLKB1 之活體內 CRISPR/-Cas9 編輯：更新之臨床數據
使用實例11中之數據來分析投與單劑量(25 mg、50 mg或75 mg)之NTLA-2002後，HAE患者之血漿胰舒血管素蛋白濃度(自基線之變化%)與胰舒血管素活性(自基線之變化%)之間的相關圖(圖36)。分析展示胰舒血管素蛋白與胰舒血管素活性自基線之變化%之間的強線性相關(R 2= 0.820)，斜率係0.929 (95% CI：0.840-1.019)。 實例 13. 遺傳性血管水腫患者中 KLKB1 之活體內 CRISPR/-Cas9 編輯：更新之臨床數據、藥物動力學分析
收集血液樣品以評價輸注前、輸注時段期間及輸注時段結束時之血漿濃度時間概況。在如本段中所指示之預定時間點收集輸注後樣品(圖37)。使用液相層析及串聯質譜(LC-MS/MS)方法量化LP01 (脂質A)。遵循管理指南使用經驗證之方法評估血漿樣品。LP01展示劑量依賴性暴露且截至第15天快速下降至量化限值以下，其中平均t1/2介於16.8 h與21.3 h之間。 實例 14. 遺傳性血管水腫患者中 KLKB1 之活體內 CRISPR/-Cas9 編輯：更新之臨床數據、藥物動力學分析
提供實例10之隊列1-3之隨訪分析。
在具有至少24週隨訪之所有患者中觀察到HAE發作率之臨床上有意義之降低。除隊列1 (25 mg)中之一名患者外，所有患者具有3.7個月至12個月之持續無發作間隔(圖38)。每一列顯示個體患者血管水腫發作數據，其中左側指示篩選前之既往每月發作率。患者係以NTLA-2002治療日期之順序呈現。彩色條之長度指示發作之持續時間。箭頭指示停用任何伴隨長期預防(LTP)之時間。無箭頭之患者未伴隨研究藥物服用長期預防。
進入研究時正在服用伴隨長期預防之六名患者(既往發作率介於0.9-14.0次發作/月範圍內)能夠在NTLA-2002投與後2.6-5.4個月之間停用其預防(圖37)。該等患者在停用長期預防後未報告任何發作。在所有患者中，在不存在背景伴隨LTP下，與基線時之3.5 (SD, 2.7)相比，平均每月發作率係0.14 (SD, 0.45) (圖39)。在研究過程之四個時間段時，研究者確診之每月血管水腫發作率。各行指示中值；各條指示四分間距；每一顏色指示個體患者。基線定義為在投與NTLA-2002之前長達42天之篩選時段。研究時段定義為自投與NTLA-2002至數據截止日之末次血管水腫發作評價之時間。長期預防定義為用於治療遺傳性血管水腫之任一類型之長期預防，包括NTLA-2002。僅包括在NTLA-2002投與後發生之血管水腫發作。
所有患者展示高度的血管水腫發作控制。患者1在第343天時經歷由運動損傷誘發之輕度手腫脹，但不需要醫療干預或急性療法，且腫脹在兩天內消退。
評價所有隊列中之所有患者之不同間隔的研究者確診之每月發作自基線之平均變化百分比呈現於下表26中。 表 26. 每月研究者確診之發作數自基線之變化 %
   NTLA-2002 25 mg (n=3) NTLA-2002 50 mg (n=4) NTLA-2002 75 mg (n=3) 所有患者 (N=10)
第1-16週 -91 (16) -97 (5) -80 (30) -89 (19)
第5-16週 -89 (19) -100 (0) -87 (23) -92 (16)
第1-24週 -94 (11) -98 (3) -86 (20) -93 (13)
研究時段 -95 (4) -98 (3) -93 (11) -95 (6)
數據係自基線之平均變化% (標準偏差)。基線定義為在投與NTLA-2002之前長達42天之篩選時段。由於在篩選期間不要求最少發作次數，故僅計算在基線時具有發作之患者之每月發作率自基線之變化%。50 mg隊列中之一名患者在篩選期間未經歷發作，因此無法確定自基線之變化%。研究時段定義為自投與NTLA-2002至數據截止日之末次血管水腫發作評價之時間。
與早期分析一致，NTLA-2002在所有三個劑量水準下通常係充分耐受的；所有AE皆具有輕度或中度之嚴重程度。所有治療相關之TEAE皆係2級或更低。所有患者接受NTLA-2002之完整研究劑量。不良事件彙總於下表27中。 表 27. 治療緊急不良事件
發生在≥2 名患者中之不良事件 NTLA-2002 25 mg (n=3) NTLA-2002 50 mg (n=4) NTLA-2002 75 mg (n=3) 所有患者 (N=10)
任一TEAE 3 (100) 3 (75) 3 (100) 9 (90)
任一TEAE ≥ 3 級 0 0 0 0
輸注相關反應 2 (67) 2 (50) 3 (100) 7 (70)
疲勞 1 (33) 3 (75) 2 (67) 6 (60)
COVID-19 3 (100) 1 (25) 1 (33) 5 (50)
上呼吸道感染 1 (33) 1 (25) 2 (67) 4 (40)
口咽疼痛 2 (67) 0 1 (33) 3 (30)
腹痛 1 (33) 0 1 (33) 2 (20)
頭痛 0 0 2 (67) 2 (20)
病毒性上呼吸道感染 0 0 2 (67) 2 (20)
數據係n (%)。COVID-19，新冠病毒肺炎2019；mg，毫克；TEAE，治療緊急不良事件。
在10名遺傳性血管水腫患者中，單劑量之NTLA-2002係充分耐受的。在隨訪持續時間內在所有患者中觀察到，65%-95%之血漿胰舒血管素之穩健的劑量依賴性及耐久減少以及95%之每月血管水腫發作率降低。停止伴隨LTP之患者繼續患有充分控制之疾病。基於該等數據，在本研究之隨機化、雙盲、安慰劑對照2期部分中選擇25 mg及50 mg劑量進行研究。該等發現為靶向胰舒血管素蛋白表現作為遺傳性血管水腫之治療模式提供進一步臨床驗證。
入選1期之患者在篩選前具有不同之既往每月血管水腫發作率。一些患者患有更重度之基線疾病，且該等患者具有更長時間來控制發作。另外，達成血漿胰舒血管素之穩態減少所需之時間(約4週)與一些患者之主要觀察時段早期之持續發作相關。此可基於改良之發作率降低來推斷，相對於第1-16週之80%-97%，當在整個隨訪持續時間內評估時，發作率介於93%-98%範圍內。
由於用NTLA-2002治療導致血漿胰舒血管素顯著減少，故可與患有先天性血漿前胰舒血管素缺乏症或「夫列契因子症候群(Fletcher factor syndrome)」(罕見之體染色體隱性病症)之個體進行比較。據報導，該等個體明顯係健康的，且唯一充分建立之標誌係無表觀臨床結果之延長的aPTT。儘管血漿胰舒血管素參與凝血，但在該等個體中發現大出血事件之盛行率係極低的且與一般群體中可見之發生率相當。目前研究中之患者皆未經歷延長的aPTT或任何血栓栓塞性或出血事件。
本研究係單臂研究且允許在NTLA-2002後伴隨使用LTP，此使得難以分離NTLA-2002之治療效應。一旦停用LTP，幾乎所有患者之每月發作率便達成0，此表明臨床益處源自單獨NTLA-2002。正在進行之隨機化2期研究要求在用NTLA-2002治療前清除LTP且將更精確地界定NTLA-2002之治療效應。 表 23 ：序列表
SEQ ID NO: 描述 序列
15 KLKB1靶向序列：G012267 GGAUUGCGUAUGGGACACAA
387 G012267之Mod6支架序列(未經修飾) GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAA UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAA GUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
388 全長G012267序列 GGAUUGCGUAUGGGACACAAGUUUUAGAG CUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAG UCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCG AGUCGGUGCUUUU
389 G012267序列之90mer GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCG AGUCGGUGC
390 G012267序列之88mer GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC
391 G012267經修飾 mG*mG*mA*UUGCGUAUGGGACACAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
393 編碼Sp. Cas9之ORF AUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGUAAUGA
394 編碼Sp. Cas9之ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG
395 編碼Sp. Cas9之ORF ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
396 編碼Sp. Cas9之ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGCCUGGACAUCGGCACGAACAGCGUUGGCUGGGCUGUGAUCACGGACGAGUACAAGGUUCCCUCAAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACGGACCGGCACAGCAUCAAGAAGAAUCUCAUCGGUGCACUGCUGUUCGACAGCGGUGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCUGAAGCGGACGGCCCGCCGGCGGUACACGCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCAGCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACAGCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGAGCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAAGUCGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCGACUGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCACUGGCCCACAUGAUAAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCUGACAACAGCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCAGCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUCAGCGCCCGCCUCAGCAAGAGCCGGCGGCUGGAGAAUCUCAUCGCCCAGCUUCCAGGUGAGAAGAAGAAUGGGCUGUUCGGCAAUCUCAUCGCACUCAGCCUGGGCCUGACUCCCAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUCAGCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAAUCUCCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCUGCCAAGAAUCUCAGCGACGCCAUCCUGCUCAGCGACAUCCUGCGGGUGAACACAGAGAUCACGAAGGCCCCCCUCAGCGCCAGCAUGAUAAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACGCUGCUGAAGGCACUGGUGCGGCAGCAGCUUCCAGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAAUGGGUACGCCGGGUACAUCGACGGUGGUGCCAGCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACAGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACAGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACGUUCGACAAUGGGAGCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACAGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACGUUCCGGAUCCCCUACUACGUUGGCCCCCUGGCCCGCGGCAACAGCCGGUUCGCCUGGAUGACGCGGAAGAGCGAGGAGACGAUCACUCCCUGGAACUUCGAGGAAGUCGUGGACAAGGGUGCCAGCGCCCAGAGCUUCAUCGAGCGGAUGACGAACUUCGACAAGAAUCUUCCAAACGAGAAGGUGCUUCCAAAGCACAGCCUGCUGUACGAGUACUUCACGGUGUACAACGAGCUGACGAAGGUGAAGUACGUGACAGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUCAGCGGUGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACGAACCGGAAGGUGACGGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACAGCGUGGAGAUCAGCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCAGCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACGCUGACGCUGUUCGAGGACAGGGAGAUGAUAGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACGGGCUGGGGCCGGCUCAGCCGGAAGCUGAUCAAUGGGAUCCGAGACAAGCAGAGCGGCAAGACGAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACGUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUCAGCGGCCAGGGCGACAGCCUGCACGAGCACAUCGCCAAUCUCGCCGGGAGCCCCGCCAUCAAGAAGGGGAUCCUGCAGACGGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCAGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCAGGGAGAACCAGACGACUCAAAAGGGGCAGAAGAACAGCAGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACUCAACUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAAUGGGCGAGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUCAGCGACUACGACGUGGACCACAUCGUUCCCCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUGCUGACGCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGUUCCCUCAGAGGAAGUCGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACUCAACGGAAGUUCGACAAUCUCACGAAGGCCGAGCGGGGUGGCCUCAGCGAGCUGGACAAGGCCGGGUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACGCGGCAGAUCACGAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACAGCCGGAUGAACACGAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCAGGGAAGUCAAGGUGAUCACGCUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGAGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCUGUGGUUGGCACGGCACUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGAGCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUAGCCAAGAGCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACGGCCAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAGAUCACGCUGGCCAAUGGUGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACGAAUGGUGAGACGGGUGAGAUCGUGUGGGACAAGGGGCGAGACUUCGCCACGGUGCGGAAGGUGCUCAGCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACAGAAGUCCAGACGGGUGGCUUCAGCAAGGAGAGCAUCCUUCCAAAGCGGAACAGCGACAAGCUGAUCGCCCGCAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGUGGCUUCGACAGCCCCACCGUGGCCUACAGCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGGAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACGAUCAUGGAGCGGAGCAGCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAAGCCAAGGGGUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUUCCAAAGUACAGCCUGUUCGAGCUGGAGAAUGGGCGGAAGCGGAUGCUGGCCAGCGCCGGUGAGCUGCAGAAGGGGAACGAGCUGGCACUUCCCUCAAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCAGCCACUACGAGAAGCUGAAGGGGAGCCCAGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCAGCGAGUUCAGCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAAUCUCGACAAGGUGCUCAGCGCCUACAACAAGCACCGAGACAAGCCCAUCAGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACGCUGACGAAUCUCGGUGCCCCCGCUGCCUUCAAGUACUUCGACACGACGAUCGACCGGAAGCGGUACACGUCGACUAAGGAAGUCCUGGACGCCACGCUGAUCCACCAGAGCAUCACGGGCCUGUACGAGACGCGGAUCGACCUCAGCCAGCUGGGUGGCGACGGUGGUGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUAG
397 編碼Sp. Cas9之ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGCCUCGACAUCGGCACCAACAGCGUCGGCUGGGCCGUCAUCACCGACGAGUACAAGGUCCCCAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUCGGCAACACCGACCGCCACAGCAUCAAGAAGAACCUCAUCGGCGCCCUCCUCUUCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGCCUCAAGCGCACCGCCCGCCGCCGCUACACCCGCCGCAAGAACCGCAUCUGCUACCUCCAGGAGAUCUUCAGCAACGAGAUGGCCAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUCGAGGAGAGCUUCCUCGUCGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGCCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUCGACGAGGUCGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUCCGCAAGAAGCUCGUCGACAGCACCGACAAGGCCGACCUCCGCCUCAUCUACCUCGCCCUCGCCCACAUGAUCAAGUUCCGCGGCCACUUCCUCAUCGAGGGCGACCUCAACCCCGACAACAGCGACGUCGACAAGCUCUUCAUCCAGCUCGUCCAGACCUACAACCAGCUCUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCAGCGGCGUCGACGCCAAGGCCAUCCUCAGCGCCCGCCUCAGCAAGAGCCGCCGCCUCGAGAACCUCAUCGCCCAGCUCCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUCUUCGGCAACCUCAUCGCCCUCAGCCUCGGCCUCACCCCCAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUCGCCGAGGACGCCAAGCUCCAGCUCAGCAAGGACACCUACGACGACGACCUCGACAACCUCCUCGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUCUUCCUCGCCGCCAAGAACCUCAGCGACGCCAUCCUCCUCAGCGACAUCCUCCGCGUCAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUCAGCGCCAGCAUGAUCAAGCGCUACGACGAGCACCACCAGGACCUCACCCUCCUCAAGGCCCUCGUCCGCCAGCAGCUCCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUCGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUCCUCGUCAAGCUCAACCGCGAGGACCUCCUCCGCAAGCAGCGCACCUUCGACAACGGCAGCAUCCCCCACCAGAUCCACCUCGGCGAGCUCCACGCCAUCCUCCGCCGCCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUCAAGGACAACCGCGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUCACCUUCCGCAUCCCCUACUACGUCGGCCCCCUCGCCCGCGGCAACAGCCGCUUCGCCUGGAUGACCCGCAAGAGCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUCGUCGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCUUCAUCGAGCGCAUGACCAACUUCGACAAGAACCUCCCCAACGAGAAGGUCCUCCCCAAGCACAGCCUCCUCUACGAGUACUUCACCGUCUACAACGAGCUCACCAAGGUCAAGUACGUCACCGAGGGCAUGCGCAAGCCCGCCUUCCUCAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUCGACCUCCUCUUCAAGACCAACCGCAAGGUCACCGUCAAGCAGCUCAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACAGCGUCGAGAUCAGCGGCGUCGAGGACCGCUUCAACGCCAGCCUCGGCACCUACCACGACCUCCUCAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUCGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUCGAGGACAUCGUCCUCACCCUCACCCUCUUCGAGGACCGCGAGAUGAUCGAGGAGCGCCUCAAGACCUACGCCCACCUCUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUCAAGCGCCGCCGCUACACCGGCUGGGGCCGCCUCAGCCGCAAGCUCAUCAACGGCAUCCGCGACAAGCAGAGCGGCAAGACCAUCCUCGACUUCCUCAAGAGCGACGGCUUCGCCAACCGCAACUUCAUGCAGCUCAUCCACGACGACAGCCUCACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUCAGCGGCCAGGGCGACAGCCUCCACGAGCACAUCGCCAACCUCGCCGGCAGCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUCCAGACCGUCAAGGUCGUCGACGAGCUCGUCAAGGUCAUGGGCCGCCACAAGCCCGAGAACAUCGUCAUCGAGAUGGCCCGCGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGCGAGCGCAUGAAGCGCAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUCGGCAGCCAGAUCCUCAAGGAGCACCCCGUCGAGAACACCCAGCUCCAGAACGAGAAGCUCUACCUCUACUACCUCCAGAACGGCCGCGACAUGUACGUCGACCAGGAGCUCGACAUCAACCGCCUCAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCCCAGAGCUUCCUCAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUCACCCGCAGCGACAAGAACCGCGGCAAGAGCGACAACGUCCCCAGCGAGGAGGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGCCAGCUCCUCAACGCCAAGCUCAUCACCCAGCGCAAGUUCGACAACCUCACCAAGGCCGAGCGCGGCGGCCUCAGCGAGCUCGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGCCAGCUCGUCGAGACCCGCCAGAUCACCAAGCACGUCGCCCAGAUCCUCGACAGCCGCAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUCAUCCGCGAGGUCAAGGUCAUCACCCUCAAGAGCAAGCUCGUCAGCGACUUCCGCAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCCGCGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUCAACGCCGUCGUCGGCACCGCCCUCAUCAAGAAGUACCCCAAGCUCGAGAGCGAGUUCGUCUACGGCGACUACAAGGUCUACGACGUCCGCAAGAUGAUCGCCAAGAGCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUCGCCAACGGCGAGAUCCGCAAGCGCCCCCUCAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUCUGGGACAAGGGCCGCGACUUCGCCACCGUCCGCAAGGUCCUCAGCAUGCCCCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACCGAGGUCCAGACCGGCGGCUUCAGCAAGGAGAGCAUCCUCCCCAAGCGCAACAGCGACAAGCUCAUCGCCCGCAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACAGCCCCACCGUCGCCUACAGCGUCCUCGUCGUCGCCAAGGUCGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCUCAAGAGCGUCAAGGAGCUCCUCGGCAUCACCAUCAUGGAGCGCAGCAGCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUCGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUCAAGAAGGACCUCAUCAUCAAGCUCCCCAAGUACAGCCUCUUCGAGCUCGAGAACGGCCGCAAGCGCAUGCUCGCCAGCGCCGGCGAGCUCCAGAAGGGCAACGAGCUCGCCCUCCCCAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUACCUCGCCAGCCACUACGAGAAGCUCAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUCUUCGUCGAGCAGCACAAGCACUACCUCGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCAGCGAGUUCAGCAAGCGCGUCAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAGGUCCUCAGCGCCUACAACAAGCACCGCGACAAGCCCAUCCGCGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUCUUCACCCUCACCAACCUCGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGCAAGCGCUACACCAGCACCAAGGAGGUCCUCGACGCCACCCUCAUCCACCAGAGCAUCACCGGCCUCUACGAGACCCGCAUCGACCUCAGCCAGCUCGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGCAAGGUCUAG
398 編碼Sp. Cas9之ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
399 編碼Sp. Cas9切口酶之ORF ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
400 編碼Sp. Cas9切口酶之ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
401 編碼Sp. Cas9之mRNA GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCGCCACCAUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAGCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
402 編碼Sp. Cas9之mRNA GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
403 編碼Sp. Cas9之mRNA GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACAGCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCAGCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCAGCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACAGCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGAGCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACAGCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACAGCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCAGCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGAGCGCCCGGCUGAGCAAGAGCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGAGCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGAGCGACGCCAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGAGCGCCAGCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCAGCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACAGCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACAGCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACAGCGUGGAGAUCAGCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCAGCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGAGCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGAGCGGCCAGGGCGACAGCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCAGCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGAGCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGUGCCCAGCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGAGCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACAGCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGAGCAAGCUGGUGAGCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGAGCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGAGCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGAGCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCAGCAAGGAGAGCAUCCUGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACAGCCCCACCGUGGCCUACAGCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGAGCAGCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACAGCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCAGCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCAGCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCAGCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCAGCGAGUUCAGCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGAGCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCAGCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGAGCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGAGCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
404 編碼Sp. Cas9之mRNA GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGCCUGGACAUCGGCACGAACAGCGUUGGCUGGGCUGUGAUCACGGACGAGUACAAGGUUCCCUCAAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACGGACCGGCACAGCAUCAAGAAGAAUCUCAUCGGUGCACUGCUGUUCGACAGCGGUGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCUGAAGCGGACGGCCCGCCGGCGGUACACGCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCAGCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACAGCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGAGCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAAGUCGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCGACUGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCACUGGCCCACAUGAUAAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCUGACAACAGCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCAGCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUCAGCGCCCGCCUCAGCAAGAGCCGGCGGCUGGAGAAUCUCAUCGCCCAGCUUCCAGGUGAGAAGAAGAAUGGGCUGUUCGGCAAUCUCAUCGCACUCAGCCUGGGCCUGACUCCCAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUCAGCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAAUCUCCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCUGCCAAGAAUCUCAGCGACGCCAUCCUGCUCAGCGACAUCCUGCGGGUGAACACAGAGAUCACGAAGGCCCCCCUCAGCGCCAGCAUGAUAAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACGCUGCUGAAGGCACUGGUGCGGCAGCAGCUUCCAGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAAUGGGUACGCCGGGUACAUCGACGGUGGUGCCAGCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACAGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACAGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACGUUCGACAAUGGGAGCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACAGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACGUUCCGGAUCCCCUACUACGUUGGCCCCCUGGCCCGCGGCAACAGCCGGUUCGCCUGGAUGACGCGGAAGAGCGAGGAGACGAUCACUCCCUGGAACUUCGAGGAAGUCGUGGACAAGGGUGCCAGCGCCCAGAGCUUCAUCGAGCGGAUGACGAACUUCGACAAGAAUCUUCCAAACGAGAAGGUGCUUCCAAAGCACAGCCUGCUGUACGAGUACUUCACGGUGUACAACGAGCUGACGAAGGUGAAGUACGUGACAGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUCAGCGGUGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACGAACCGGAAGGUGACGGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACAGCGUGGAGAUCAGCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCAGCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACGCUGACGCUGUUCGAGGACAGGGAGAUGAUAGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACGGGCUGGGGCCGGCUCAGCCGGAAGCUGAUCAAUGGGAUCCGAGACAAGCAGAGCGGCAAGACGAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACGUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUCAGCGGCCAGGGCGACAGCCUGCACGAGCACAUCGCCAAUCUCGCCGGGAGCCCCGCCAUCAAGAAGGGGAUCCUGCAGACGGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCAGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCAGGGAGAACCAGACGACUCAAAAGGGGCAGAAGAACAGCAGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACUCAACUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAAUGGGCGAGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUCAGCGACUACGACGUGGACCACAUCGUUCCCCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUGCUGACGCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGUUCCCUCAGAGGAAGUCGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACUCAACGGAAGUUCGACAAUCUCACGAAGGCCGAGCGGGGUGGCCUCAGCGAGCUGGACAAGGCCGGGUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACGCGGCAGAUCACGAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACAGCCGGAUGAACACGAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCAGGGAAGUCAAGGUGAUCACGCUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGAGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCUGUGGUUGGCACGGCACUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGAGCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUAGCCAAGAGCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACGGCCAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAGAUCACGCUGGCCAAUGGUGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACGAAUGGUGAGACGGGUGAGAUCGUGUGGGACAAGGGGCGAGACUUCGCCACGGUGCGGAAGGUGCUCAGCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACAGAAGUCCAGACGGGUGGCUUCAGCAAGGAGAGCAUCCUUCCAAAGCGGAACAGCGACAAGCUGAUCGCCCGCAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGUGGCUUCGACAGCCCCACCGUGGCCUACAGCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGGAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACGAUCAUGGAGCGGAGCAGCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAAGCCAAGGGGUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUUCCAAAGUACAGCCUGUUCGAGCUGGAGAAUGGGCGGAAGCGGAUGCUGGCCAGCGCCGGUGAGCUGCAGAAGGGGAACGAGCUGGCACUUCCCUCAAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCAGCCACUACGAGAAGCUGAAGGGGAGCCCAGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCAGCGAGUUCAGCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAAUCUCGACAAGGUGCUCAGCGCCUACAACAAGCACCGAGACAAGCCCAUCAGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACGCUGACGAAUCUCGGUGCCCCCGCUGCCUUCAAGUACUUCGACACGACGAUCGACCGGAAGCGGUACACGUCGACUAAGGAAGUCCUGGACGCCACGCUGAUCCACCAGAGCAUCACGGGCCUGUACGAGACGCGGAUCGACCUCAGCCAGCUGGGUGGCGACGGUGGUGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
405 編碼Sp. Cas9之mRNA GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGCCUCGACAUCGGCACCAACAGCGUCGGCUGGGCCGUCAUCACCGACGAGUACAAGGUCCCCAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUCGGCAACACCGACCGCCACAGCAUCAAGAAGAACCUCAUCGGCGCCCUCCUCUUCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGCCUCAAGCGCACCGCCCGCCGCCGCUACACCCGCCGCAAGAACCGCAUCUGCUACCUCCAGGAGAUCUUCAGCAACGAGAUGGCCAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUCGAGGAGAGCUUCCUCGUCGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGCCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUCGACGAGGUCGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUCCGCAAGAAGCUCGUCGACAGCACCGACAAGGCCGACCUCCGCCUCAUCUACCUCGCCCUCGCCCACAUGAUCAAGUUCCGCGGCCACUUCCUCAUCGAGGGCGACCUCAACCCCGACAACAGCGACGUCGACAAGCUCUUCAUCCAGCUCGUCCAGACCUACAACCAGCUCUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCAGCGGCGUCGACGCCAAGGCCAUCCUCAGCGCCCGCCUCAGCAAGAGCCGCCGCCUCGAGAACCUCAUCGCCCAGCUCCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUCUUCGGCAACCUCAUCGCCCUCAGCCUCGGCCUCACCCCCAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUCGCCGAGGACGCCAAGCUCCAGCUCAGCAAGGACACCUACGACGACGACCUCGACAACCUCCUCGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUCUUCCUCGCCGCCAAGAACCUCAGCGACGCCAUCCUCCUCAGCGACAUCCUCCGCGUCAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUCAGCGCCAGCAUGAUCAAGCGCUACGACGAGCACCACCAGGACCUCACCCUCCUCAAGGCCCUCGUCCGCCAGCAGCUCCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUCGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUCCUCGUCAAGCUCAACCGCGAGGACCUCCUCCGCAAGCAGCGCACCUUCGACAACGGCAGCAUCCCCCACCAGAUCCACCUCGGCGAGCUCCACGCCAUCCUCCGCCGCCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUCAAGGACAACCGCGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUCACCUUCCGCAUCCCCUACUACGUCGGCCCCCUCGCCCGCGGCAACAGCCGCUUCGCCUGGAUGACCCGCAAGAGCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUCGUCGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCUUCAUCGAGCGCAUGACCAACUUCGACAAGAACCUCCCCAACGAGAAGGUCCUCCCCAAGCACAGCCUCCUCUACGAGUACUUCACCGUCUACAACGAGCUCACCAAGGUCAAGUACGUCACCGAGGGCAUGCGCAAGCCCGCCUUCCUCAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUCGACCUCCUCUUCAAGACCAACCGCAAGGUCACCGUCAAGCAGCUCAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACAGCGUCGAGAUCAGCGGCGUCGAGGACCGCUUCAACGCCAGCCUCGGCACCUACCACGACCUCCUCAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUCGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUCGAGGACAUCGUCCUCACCCUCACCCUCUUCGAGGACCGCGAGAUGAUCGAGGAGCGCCUCAAGACCUACGCCCACCUCUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUCAAGCGCCGCCGCUACACCGGCUGGGGCCGCCUCAGCCGCAAGCUCAUCAACGGCAUCCGCGACAAGCAGAGCGGCAAGACCAUCCUCGACUUCCUCAAGAGCGACGGCUUCGCCAACCGCAACUUCAUGCAGCUCAUCCACGACGACAGCCUCACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUCAGCGGCCAGGGCGACAGCCUCCACGAGCACAUCGCCAACCUCGCCGGCAGCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUCCAGACCGUCAAGGUCGUCGACGAGCUCGUCAAGGUCAUGGGCCGCCACAAGCCCGAGAACAUCGUCAUCGAGAUGGCCCGCGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGCGAGCGCAUGAAGCGCAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUCGGCAGCCAGAUCCUCAAGGAGCACCCCGUCGAGAACACCCAGCUCCAGAACGAGAAGCUCUACCUCUACUACCUCCAGAACGGCCGCGACAUGUACGUCGACCAGGAGCUCGACAUCAACCGCCUCAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCCCAGAGCUUCCUCAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUCACCCGCAGCGACAAGAACCGCGGCAAGAGCGACAACGUCCCCAGCGAGGAGGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGCCAGCUCCUCAACGCCAAGCUCAUCACCCAGCGCAAGUUCGACAACCUCACCAAGGCCGAGCGCGGCGGCCUCAGCGAGCUCGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGCCAGCUCGUCGAGACCCGCCAGAUCACCAAGCACGUCGCCCAGAUCCUCGACAGCCGCAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUCAUCCGCGAGGUCAAGGUCAUCACCCUCAAGAGCAAGCUCGUCAGCGACUUCCGCAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCCGCGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUCAACGCCGUCGUCGGCACCGCCCUCAUCAAGAAGUACCCCAAGCUCGAGAGCGAGUUCGUCUACGGCGACUACAAGGUCUACGACGUCCGCAAGAUGAUCGCCAAGAGCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUCGCCAACGGCGAGAUCCGCAAGCGCCCCCUCAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUCUGGGACAAGGGCCGCGACUUCGCCACCGUCCGCAAGGUCCUCAGCAUGCCCCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACCGAGGUCCAGACCGGCGGCUUCAGCAAGGAGAGCAUCCUCCCCAAGCGCAACAGCGACAAGCUCAUCGCCCGCAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACAGCCCCACCGUCGCCUACAGCGUCCUCGUCGUCGCCAAGGUCGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCUCAAGAGCGUCAAGGAGCUCCUCGGCAUCACCAUCAUGGAGCGCAGCAGCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUCGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUCAAGAAGGACCUCAUCAUCAAGCUCCCCAAGUACAGCCUCUUCGAGCUCGAGAACGGCCGCAAGCGCAUGCUCGCCAGCGCCGGCGAGCUCCAGAAGGGCAACGAGCUCGCCCUCCCCAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUACCUCGCCAGCCACUACGAGAAGCUCAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUCUUCGUCGAGCAGCACAAGCACUACCUCGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCAGCGAGUUCAGCAAGCGCGUCAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAGGUCCUCAGCGCCUACAACAAGCACCGCGACAAGCCCAUCCGCGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUCUUCACCCUCACCAACCUCGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGCAAGCGCUACACCAGCACCAAGGAGGUCCUCGACGCCACCCUCAUCCACCAGAGCAUCACCGGCCUCUACGAGACCCGCAUCGACCUCAGCCAGCUCGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGCAAGGUCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
406 Sp. Cas9之胺基酸序列 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
407 Sp. Cas9切口酶之胺基酸序列 MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
392 例示性Kozak序列 gccgccRccAUGG
408 Cas9 ORF GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAG
* = PS鍵聯；『m』 = 2'-O-Me核苷酸，『f』 = 2'-F核苷酸
表 24 ：人類 KLKB1 靶向指導序列、染色體坐標以及人類單指導 RNA 及雙指導 RNA 以及替代食蟹猴 (cyno) 單指導物
SEQ ID NO: ( 人類) 例示性基因體坐標(hg38) 人類指導序列 人類sgRNA 人類dgRNA cyno sgRNA Cyno 指導物SEQ ID NO:
1 chr4:186228230-186228252 ACAGGAAACUGUAGCAAACA G012253 CR005916 NA NA
2 chr4:186228248-186228270 AUAGAUAAUUCACUUACCAC G012254 CR005917 NA NA
3 chr4:186232154-186232176 UACAUCCCCACCUCUGAAGA G012255 CR005918 NA NA
4 chr4:186251256-186251278 UCUUGAGGAGUAGAGGAACU G012256 CR005922 NA NA
5 chr4:186251308-186251330 ACCAGGUAAAGUUCUUUUGC G012257 CR005924 NA NA
6 chr4:186251489-186251511 GGGUAAAUUUUAGAAUGGCA G012258 CR005925 NA NA
7 chr4:186251504-186251526 AUUUACCCGGGAGUUGACUU G012259 CR005928 NA NA
8 chr4:186251507-186251529 UACCCGGGAGUUGACUUUGG G012260 CR005929 NA NA
9 chr4:186251828-186251850 UCUUUGAGAUUGUGUAACAC G012261 CR005931 NA NA
10 chr4:186251829-186251851 CUUUGAGAUUGUGUAACACU G012262 CR005932 NA NA
11 chr4:186251830-186251852 UUUGAGAUUGUGUAACACUG G012263 CR005933 NA NA
12 chr4:186254748-186254770 UACAUACCAGUGUAAUUCAA G012264 CR005943 NA NA
13 chr4:186251784-186251806 CUCCAACUAGGAUUGCGUAU G012265 CR005949 G013933 373
14 chr4:186251792-186251814 AGGAUUGCGUAUGGGACACA G012266 CR005951 G013904 344
15 chr4:186251793-186251815 GGAUUGCGUAUGGGACACAA G012267 CR005952 G013901 341
16 chr4:186238297-186238319 GUUACUCAGCACCUUUAUAG G012268 CR005956 G013945 385
17 chr4:186238263-186238285 UGCCUAUUAAAGUACAGUCC G012269 CR005959 NA NA
18 chr4:186251772-186251794 CUAUGGAUGGUUCUCCAACU G012270 CR005960 G013922 362
19 chr4:186254601-186254623 GAUGUUUGGCGCAUCUAUAG G012271 CR005963 G013921 361
20 chr4:186254592-186254614 AUGCGCCAAACAUCCUGCAG G012272 CR005970 G013885 325
21 chr4:186236785-186236807 CUCCUUUAUAAAUGUCUCGA G012273 CR005979 G013905 345
22 chr4:186236863-186236885 UGUUACUGGUGCACCUUUUU G012274 CR005982 NA NA
23 chr4:186254593-186254615 GAUGCGCCAAACAUCCUGCA G012275 CR005983 G013876 316
24 chr4:186232192-186232214 AUCUGGCAGUAUUGGGCAUU G012276 CR005992 G013915 355
25 chr4:186236893-186236915 GCGUGGCAUAUGAAAAAAAC G012277 CR005994 NA NA
26 chr4:186236798-186236820 UAUAAAGGAGUUGAUAUGAG G012278 CR005995 G013913 353
27 chr4:186236938-186236960 ACACCUUGAAUUGUACUCAC G012279 CR005998 NA NA
28 chr4:186232214-186232236 UGAGGUGCACAUUCCACCCA G012280 NA NA NA
29 chr4:186232190-186232212 CUGGCAGUAUUGGGCAUUUG G012281 NA NA NA
30 chr4:186232148-186232170 AAAACGCCUUCUUCAGAGGU G012282 NA NA NA
31 chr4:186232227-186232249 UGAAUAGCAAACACCUUGGG G012283 NA NA NA
32 chr4:186236821-186236843 AGUCAAUUUUAAUGUGUCUA G012284 NA NA NA
33 chr4:186236850-186236872 GUGUUGAAGAAUGCCAAAAA G012285 NA NA NA
34 chr4:186236910-186236932 UGCCUUGUGAAAUGUUUGCG G012286 NA NA NA
35 chr4:186250265-186250287 GCAUCUUGCGUUCUCAGAUG G012287 NA G013927 367
36 chr4:186250276-186250298 UCUCAGAUGUGGAUGUUGCC G012288 NA NA NA
37 chr4:186250306-186250328 CUCCAGAUGCUUUUGUGUGU G012289 NA NA NA
38 chr4:186251325-186251347 UAUUAUCAAAUCACAUUACC G012290 NA NA NA
39 chr4:186251271-186251293 CCAGAUAUGGUGUUUUCUUG G012291 NA NA NA
40 chr4:186251300-186251322 AAGUUCUUUUGCAGGUUAAA G012292 NA NA NA
41 chr4:186251620-186251642 UUUACUCCCAGAAGACUGUA G012293 NA NA NA
42 chr4:186251492-186251514 UGCCAUUCUAAAAUUUACCC G012294 NA NA NA
43 chr4:186251572-186251594 UCAUCUUUGUGCAAGUCUCU G012295 NA NA NA
44 chr4:186251510-186251532 UCUCCUCCAAAGUCAACUCC G012296 NA NA NA
45 chr4:186252049-186252071 GGAGGAACAAACUCUUCUUG G012297 NA NA NA
46 chr4:186252098-186252120 AGGUGAAGCUGACAGCUCAG G012298 NA NA NA
47 chr4:186256046-186256068 CCAUCCGGUUACCCAACAGU G012299 NA G013931 371
48 chr4:186256042-186256064 UAUACCAACUGUUGGGUAAC G012300 NA G012300 NA
49 chr4:186256034-186256056 GCACAAUUUAUACCAACUGU G012301 NA NA NA
50 chr4:186256059-186256081 AACCGGAUGGGGCUUCUCGA G012302 NA G013932 372
51 chr4:186256047-186256069 CAACUGUUGGGUAACCGGAU G012303 NA G013882 322
52 chr4:186256035-186256057 CACAAUUUAUACCAACUGUU G012304 NA G012304 NA
53 chr4:186256046-186256068 CCAACUGUUGGGUAACCGGA G012305 NA G013924 364
54 chr4:186256061-186256083 CUCCUUCGAGAAGCCCCAUC G012306 NA NA NA
55 chr4:186256048-186256070 AACUGUUGGGUAACCGGAUG G012307 NA G013914 354
56 chr4:186256003-186256025 CCAAUAUGCCUACCUUCCAA G012308 NA NA NA
57 chr4:186256015-186256037 GUGCUUGUGUCACCUUUGGA G012309 NA G013900 340
58 chr4:186256011-186256033 UUGUGUCACCUUUGGAAGGU G012310 NA NA NA
59 chr4:186256019-186256041 AAUUGUGCUUGUGUCACCUU G012311 NA NA NA
60 chr4:186255996-186256018 AAGGUAGGCAUAUUGGUUUU G012312 NA NA NA
61 chr4:186257312-186257334 ACCCAACGGAUGGUCUGUGC G012313 NA NA NA
62 chr4:186257314-186257336 AGCCAGCACAGACCAUCCGU G012314 NA NA NA
63 chr4:186257302-186257324 UUAUAAAAUAACCCAACGGA G012315 NA G012315 NA
64 chr4:186257326-186257348 CUGUGCUGGCUAUAAAGAAG G012316 NA NA NA
65 chr4:186257261-186257283 CAUUCUUCAUUUGUUACCAA G012317 NA NA NA
66 chr4:186257284-186257306 UAUAAUCUUGAUAUCUUUUC G012318 NA NA NA
67 chr4:186257313-186257335 GCCAGCACAGACCAUCCGUU G012319 NA NA NA
68 chr4:186257324-186257346 GUCUGUGCUGGCUAUAAAGA G012320 NA G012320 NA
69 chr4:186257325-186257347 UCUGUGCUGGCUAUAAAGAA G012321 NA NA NA
70 chr4:186258130-186258152 GUCCAUGUACUCAGCGACUU G012322 NA G012322 NA
71 chr4:186258128-186258150 CACCAAAGUCGCUGAGUACA G012323 NA G012323 NA
72 chr4:186258050-186258072 ACACAAUGGAAUGUGGCGUU G012324 NA G012324 NA
73 chr4:186258068-186258090 UUUGGUGGGCAUCACCAGCU G012325 NA G012325 NA
74 chr4:186258204-186258226 CUCUGGACUGCUUCUCAUGC G012326 NA NA NA
75 chr4:186258133-186258155 AAGUCGCUGAGUACAUGGAC G012327 NA G012327 NA
76 chr4:186258089-186258111 GGGUGAAGGCUGUGCCCGCA G012328 NA G013895 335
77 chr4:186258054-186258076 AAUGGAAUGUGGCGUUUGGU G012329 NA G012329 NA
78 chr4:186258037-186258059 UCCAUUGUGUUUGCAAACUA G012330 NA G013942 382
79 chr4:186258067-186258089 GUUUGGUGGGCAUCACCAGC G012331 NA NA NA
80 chr4:186258043-186258065 UUUGCAAACACAAUGGAAUG G012332 NA G013916 356
81 chr4:186258103-186258125 GACACCAGGUUGCUCCCUGC G012333 NA NA NA
82 chr4:186258009-186258031 ACUGUGACUCAGGGAGAUUC G012334 NA G013943 383
83 chr4:186258099-186258121 UGUGCCCGCAGGGAGCAACC G012335 NA NA NA
84 chr4:186258036-186258058 CCAUUGUGUUUGCAAACUAA G012336 NA G013929 369
85 chr4:186258088-186258110 GGGGUGAAGGCUGUGCCCGC G012337 NA NA NA
86 chr4:186258117-186258139 GCGACUUUGGUGUAGACACC G012338 NA NA NA
87 chr4:186258036-186258058 CCCUUAGUUUGCAAACACAA G012339 NA NA NA
88 chr4:186258053-186258075 CAAUGGAAUGUGGCGUUUGG G012340 NA G012340 NA
89 chr4:186232230-186232252 AACUGAAUAGCAAACACCUU NA CR005919 NA NA
90 chr4:186238351-186238373 ACAAUUACCAAUUUCUGAAA NA CR005920 NA NA
91 chr4:186238352-186238374 UACAAUUACCAAUUUCUGAA NA CR005921 NA NA
92 chr4:186251263-186251285 GGUGUUUUCUUGAGGAGUAG NA CR005923 NA NA
93 chr4:186251490-186251512 CGGGUAAAUUUUAGAAUGGC NA CR005926 G013884 324
94 chr4:186251494-186251516 CUCCCGGGUAAAUUUUAGAA NA CR005927 G013925 365
95 chr4:186251801-186251823 UAUGGGACACAAGGGAGCUC NA CR005930 NA NA
96 chr4:186252047-186252069 UUGGAGGAACAAACUCUUCU NA CR005934 G013912 352
97 chr4:186252048-186252070 UGGAGGAACAAACUCUUCUU NA CR005935 NA NA
98 chr4:186252056-186252078 CAAACUCUUCUUGGGGAGAG NA CR005936 NA NA
99 chr4:186252123-186252145 CUAUGAGUGACCCUCCACAC NA CR005937 G013886 326
100 chr4:186252124-186252146 CUGUGUGGAGGGUCACUCAU NA CR005938 G013938 378
101 chr4:186252134-186252156 GGUCACUCAUAGGACACCAG NA CR005939 G013946 386
102 chr4:186252135-186252157 GUCACUCAUAGGACACCAGU NA CR005940 G013896 336
103 chr4:186252163-186252185 ACUGCUGCCCACUGCUUUGA NA CR005941 NA NA
104 chr4:186252171-186252193 ACACUUACCCAUCAAAGCAG NA CR005942 G013902 342
105 chr4:186238286-186238308 AGGAACACCUACCGCUAUAA NA CR005944 G013871 311
106 chr4:186238265-186238287 CUCCGGGACUGUACUUUAAU NA CR005945 G013889 329
107 chr4:186251786-186251808 GUCCCAUACGCAAUCCUAGU NA CR005946 G013890 330
108 chr4:186238293-186238315 CUCAGCACCUUUAUAGCGGU NA CR005947 G013892 332
109 chr4:186238282-186238304 UAUAGCGGUAGGUGUUCCUC NA CR005948 G013874 314
110 chr4:186238266-186238288 CUAUUAAAGUACAGUCCCGG NA CR005950 G013875 315
111 chr4:186238308-186238330 GUGCUGAGUAACGUGGAAUC NA CR005953 G013883 323
112 chr4:186238301-186238323 UAUAAAGGUGCUGAGUAACG NA CR005954 G013878 318
113 chr4:186251783-186251805 UCUCCAACUAGGAUUGCGUA NA CR005955 G013908 348
114 chr4:186238281-186238303 AUAGCGGUAGGUGUUCCUCC NA CR005957 G013873 313
115 chr4:186233989-186234011 CUGCCAAAAGUACAUCGAAC NA CR005958 G013877 317
116 chr4:186238345-186238367 ACCAAUUUCUGAAAGGGCAC NA CR005961 NA NA
117 chr4:186251755-186251777 GUGUUUCUUAAGAUUAUCUA NA CR005962 NA NA
118 chr4:186238344-186238366 CCAAUUUCUGAAAGGGCACA NA CR005964 NA NA
119 chr4:186251759-186251781 UUCUUAAGAUUAUCUAUGGA NA CR005965 G013940 380
120 chr4:186233988-186234010 CUGUUCGAUGUACUUUUGGC NA CR005966 NA NA
121 chr4:186233987-186234009 UGUUCGAUGUACUUUUGGCA NA CR005967 G013880 320
122 chr4:186232209-186232231 GGUGGAAUGUGCACCUCAUC NA CR005968 G013939 379
123 chr4:186250308-186250330 GUCCGACACACAAAAGCAUC NA CR005969 G013894 334
124 chr4:186236877-186236899 AAACUGGCAGCGAAUGUUAC NA CR005971 G013930 370
125 chr4:186236908-186236930 UGCCACGCAAACAUUUCACA NA CR005972 NA NA
126 chr4:186233992-186234014 GCACCUGUUCGAUGUACUUU NA CR005973 G013870 310
127 chr4:186254594-186254616 AGAUGCGCCAAACAUCCUGC NA CR005974 NA NA
128 chr4:186232199-186232221 GCACCUCAUCUGGCAGUAUU NA CR005975 NA NA
129 chr4:186250262-186250284 CAUCUGAGAACGCAAGAUGC NA CR005976 G013934 374
130 chr4:186232196-186232218 AUGCCCAAUACUGCCAGAUG NA CR005977 NA NA
131 chr4:186232200-186232222 UGCACCUCAUCUGGCAGUAU NA CR005978 G013944 384
132 chr4:186232258-186232280 AUGUCAUUGAUUGAACUUGC NA CR005980 G013936 376
133 chr4:186252031-186252053 ACAAGCACACGCAUUGUUGG NA CR005981 G013893 333
134 chr4:186254723-186254745 UAUCGCCUUGAUAAAACUCC NA CR005984 G013926 366
135 chr4:186251271-186251293 CCUCAAGAAAACACCAUAUC NA CR005985 G013906 346
136 chr4:186232149-186232171 AAACGCCUUCUUCAGAGGUG NA CR005986 NA NA
137 chr4:186252028-186252050 AAAACAAGCACACGCAUUGU NA CR005987 G013891 331
138 chr4:186234001-186234023 CAUCGAACAGGUGCAGUUUC NA CR005988 G013879 319
139 chr4:186254587-186254609 GGCUUCCCCUGCAGGAUGUU NA CR005989 G013881 321
140 chr4:186234029-186234051 UUGAUGACCACAUUGCUUCA NA CR005990 G013937 377
141 chr4:186254728-186254750 AGGAGCCUGGAGUUUUAUCA NA CR005991 NA NA
142 chr4:186236783-186236805 UGCCAUCGAGACAUUUAUAA NA CR005993 G013899 339
143 chr4:186232260-186232282 AGCAAGUUCAAUCAAUGACA NA CR005996 G013897 337
144 chr4:186234022-186234044 GGACAUUCCUUGAAGCAAUG NA CR005997 NA NA
145 chr4:186250330-186250352 GUUGGGGUGAUAGGUGCAGA NA CR005999 NA NA
146 chr4:186232147-186232169 GAAAACGCCUUCUUCAGAGG NA CR006000 NA NA
147 chr4:186232144-186232166 UAUGAAAACGCCUUCUUCAG NA CR006001 NA NA
148 chr4:186250277-186250299 CUCAGAUGUGGAUGUUGCCA NA CR006002 NA NA
149 chr4:186254579-186254601 CUCUCCUAGGCUUCCCCUGC NA CR006003 NA NA
表 25 ： Cyno KLKB1 靶向單指導序列、染色體坐標及與人類之指導序列同源性
Cyno sgRNA Cyno SEQ ID NO 例示性基因體坐標(mf5) cyno 指導序列 與人類指導物之同源性%
G013870 310 chr5:185648888-185648908 GCACCUGCUCGACGUACUUU 90
G013871 311 chr5:185652966-185652986 AGGAACGCCUACCACUAUAA 90
G013872 312 chr5:185688465-185688485 UGAUGGAAACGCUCGGAUGC NA
G013873 313 chr5:185652964-185652984 AUAGUGGUAGGCGUUCCUCC 90
G013874 314 chr5:185652965-185652985 UAUAGUGGUAGGCGUUCCUC 90
G013875 315 chr5:185652946-185652966 CUCUUAAAGCACAGUCCCGG 90
G013876 316 chr5:185684512-185684532 AAUGCGCCAAACAUCCGGUA 100
G013877 317 chr5:185648882-185648902 UUGCCAAAAGUACGUCGAGC 85
G013878 318 chr5:185652981-185653001 UAUAAAGGUGCUGAAUAACG 95
G013879 319 chr5:185648894-185648914 CGUCGAGCAGGUGCAAUUUC 85
G013880 320 chr5:185648883-185648903 UGCUCGACGUACUUUUGGCA 90
G013881 321 chr5:185684503-185684523 GGCUUCCCUUACCGGAUGUU 85
G013882 322 chr4:186256046-186256066 CAACUGUUGGGUAACUGGAU 100
G013883 323 chr5:185652988-185653008 GUGCUGAAUAACGUGGAAUC 95
G013884 324 chr5:185680852-185680872 CGGGUAAAUUUUAGAAUGGC 100
G013885 325 chr5:185684511-185684531 AUGCGCCAAACAUCCGGUAA 100
G013886 326 chr5:185681472-185681492 CUAUGAGUGACCCUCCACAC 100
G013887 327 chr5:185679339-185679359 GGCAACAUCCACAUCCGAGA NA
G013888 328 chr5:185679426-185679446 UUACGUUCUAUACGAAUGCA 85
G013889 329 chr5:185652948-185652968 CUCCGGGACUGUGCUUUAAG 90
G013890 330 chr5:185681135-185681155 GUCCCAUAUGUAAUCCUAGU 90
G013891 331 chr5:185681374-185681394 AAAACAAGCUCACGCAUUGU 95
G013892 332 chr5:185652976-185652996 UUCAGCACCUUUAUAGUGGU 90
G013893 333 chr5:185681377-185681397 ACAAGCUCACGCAUUGUUGG 95
G013894 334 chr5:185679374-185679394 GUUCGACACACAAAAGCAUC 95
G013895 335 chr4:186258088-186258108 GGGCGAAGGCUGUGCCCGCA 100
G013896 336 chr5:185681481-185681501 GUCACUCAUAGGACACCAGU 100
G013897 337 chr5:185647160-185647180 AGCAAGUUCCAUCAAUGACA 95
G013898 338 chr5:185679413-185679433 AACGUAAAGAAGAGGCAGCU 100
G013899 339 chr5:185651465-185651485 UGCCACCGAGACAUUUAUAA 95
G013900 340 chr4:186256017-186256037 GUGUUUGUGUCACCUUUGGA 100
G013901 341 chr4:186251792-186251812 GGAUUACAUAUGGGACACAA 100
G013902 342 chr5:185681520-185681540 ACACUUACCCAUCAAAGCAG 100
G013903 343 chr5:185684660-185684680 CAGUGUAAUUCAAAGGAGCC 100
G013904 344 chr5:185681138-185681158 AGGAUUACAUAUGGGACACA 100
G013905 345 chr5:185651470-185651490 UUCCUUUAUAAAUGUCUCGG 100
G013906 346 chr5:185680632-185680652 CCUCAAGAAAACACCACAUC 95
G013907 347 chr5:185688458-185688478 AGAGCAGUGAUGGAAACGCU NA
G013908 348 chr5:185681129-185681149 UCUCCAACUAGGAUUACAUA 90
G013909 349 chr5:185680982-185681002 ACUCCCAGAAGACUGUAAGG NA
G013910 350 chr5:185679360-185679380 AGCAUCUGGGGCGAGAACUC 100
G013911 351 chr5:185679372-185679392 UCGACACACAAAAGCAUCUG NA
G013912 352 chr5:185681393-185681413 UUGGAGGAACAAACUCUUCU 100
G013913 353 chr4:186236797-186236817 UAUAAAGGAAUUGAUAUGAG 100
G013914 354 chr4:186256047-186256067 AACUGUUGGGUAACUGGAUG 100
G013915 355 chr5:185647095-185647115 AUCUGGCAGUGCUGGGCGUU 100
G013916 356 chr4:186258042-186258062 CUUGCAAACACAAUGGAAUG 100
G013917 357 chr4:186251628-186251648 UCUCCUCCUUACAGUCUUCU   
G013918 358 chr5:185688296-185688316 CUGUGACUCAGGGAGAUUCA NA
G013918 358 chr5:185688296-185688316 CUGUGACUCAGGGAGAUUCA 100
G013919 359 chr4:186258084-186258104 GGCACAGCCUUCGCCCCAGC 100
G013920 360 chr5:185647084-185647104 CUGGGCGUUCGGGGUGUACA 100
G013921 361 chr4:186254600-186254620 GAUGUUUGGCGCAUUUAUAG 100
G013922 362 chr4:186251771-186251791 CUUCGGAUGGUUCUCCAACU   
G013923 363 chr5:185684517-185684537 CUAUAAAUGCGCCAAACAUC NA
G013923 363 chr5:185684517-185684537 CUAUAAAUGCGCCAAACAUC 100
G013924 364 chr4:186256045-186256065 CCAACUGUUGGGUAACUGGA   
G013925 365 chr5:185680856-185680876 CUCCCGGGUAAAUUUUAGAA 100
G013926 366 chr5:185684639-185684659 UAUCGCCUUAAUAAAACUCC 95
G013926 366 chr4:186254722-186254742 UAUCGCCUUAAUAAAACUCC 100
G013927 367 chr4:186250264-186250284 GCAUCUUGCCUUCUCGGAUG   
G013928 368 chr5:185679421-185679441 UCGUAUAGAACGUAAAGAAG 90
G013929 369 chr4:186258038-186258058 CCAUUGUGUUUGCAAGCUAA 100
G013930 370 chr5:185651562-185651582 AAAUUGGCAGCGAAUGUUAU 90
G013930 370 chr4:186236879-186236899 AAAUUGGCAGCGAAUGUUAU 100
G013931 371 chr4:186256048-186256068 CCAUCCAGUUACCCAACAGU 100
G013932 372 chr4:186256058-186256078 AACUGGAUGGGGCUUCUCGA 100
G013933 373 chr5:185681130-185681150 CUCCAACUAGGAUUACAUAU 100
G013934 374 chr5:185679328-185679348 CAUCCGAGAAGGCAAGAUGC 90
G013935 375 chr4:186251536-186251556 UUGAAUGUGACUUUCGUUAA 100
G013936 376 chr5:185647161-185647181 AUGUCAUUGAUGGAACUUGC 95
G013937 377 chr5:185648925-185648945 UUGAUGACCACACUGCUUUA 90
G013938 378 chr5:185681470-185681490 CUGUGUGGAGGGUCACUCAU 100
G013939 379 chr5:185647112-185647132 GGUGGAAUGUGCACAUCAUC 95
G013940 380 chr5:185681105-185681125 UUCUUAAGAUUAUCUUCGGA 90
G013941 381 chr5:185685921-185685941 CCUUUGGAAGGUAGGCAUAU 100
G013942 382 chr4:186258039-186258059 UCCAUUGUGUUUGCAAGCUA 100
G013943 383 chr4:186258008-186258028 CCUGUGACUCAGGGAGAUUC 100
G013944 384 chr5:185647103-185647123 UGCACAUCAUCUGGCAGUGC 85
G013945 385 chr4:186238299-186238319 GUUAUUCAGCACCUUUAUAG 100
G013946 386 chr5:185681480-185681500 GGUCACUCAUAGGACACCAG 100
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圖 1：顯示由C1-INH抑制之路徑之簡圖。C1-INH缺乏導致舒緩肽之上調釋放及積聚，活化內皮細胞，且引起血管水腫。 圖 2：原代人類肝細胞(PHH)中NTLA-2002驗證之脫靶及靶控編輯。 圖 3：NTLA-2002、靶向 MAPK1之LNP-G018729及非靶向LNP-G000739 MAPK1內含子基因座編輯在原代人類肝細胞中之劑量反應。 圖 4： KLKB1之編輯%、 KLKB1mRNA水準及血清前胰舒血管素水準，以TSS媒劑對照治療之小鼠之%表示。 圖 5：人源化小鼠中隨NTLA-2002劑量變化之 KLKB1之肝臟編輯%及血清前胰舒血管素水準。 圖 6：在用包含gRNA (G013901)之LNP調配物及對照治療之人源化小鼠中，用伊文思藍(Evans blue)血管通透性分析評價之血管通透性。 圖 7：用包含gRNA (G013901)之LNP調配物對對照治療之非人類靈長類動物中之血漿胰舒血管素活性水準。 圖 8：用包含gRNA (G013901)之LNP調配物對對照治療之非人類靈長類動物中之血漿胰舒血管素蛋白水準。 圖 9：用包含gRNA (G012267)之LNP調配物對對照治療之非人類靈長類動物中之血漿胰舒血管素蛋白水準。 圖 10：用包含gRNA (G012267)之LNP調配物對對照治療之非人類靈長類動物中之血漿胰舒血管素活性水準。 圖 11：描述劑量遞增方案之臨床試驗設計之圖。 圖 12：在用單一25 mg及75 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體中血漿胰舒血管素水準之平均變化%。 圖 13：在用單一25 mg及75 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體之平均絕對胰舒血管素減少。 圖 14 ：在用單一25 mg或75 mg劑量之NTLA-2002治療後，隊列1及隊列2之個體之平均胰舒血管素減少%之結果。 圖 15：圖解說明在用單一25 mg (患者1-3)或75 mg (患者4-6)劑量之NTLA-2002治療後，個體患者之發作頻率及嚴重程度之游泳圖。指示預防之使用。在第151天時，患者2停用達那唑。在第112天時，患者3停用貝羅司他。 圖 16A 及圖 16B：在用單一25 mg或75 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體之(A)隊列1 (n=3)及(B)隊列2 (n=3) HAE發作率自基線之變化%之結果。 圖 17：在用單一25 mg、50 mg或75 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體之平均絕對胰舒血管素減少。 圖 18：在用單一25 mg、50 mg或75 mg劑量之NTLA-2002治療後，隊列1、2及3之個體之平均胰舒血管素減少%之結果。 圖 19：圖解說明在用單一25 mg (患者1-3)、50 mg (患者7-10)或75 mg (患者4-6)劑量之NTLA-2002治療後，個體患者之發作頻率及嚴重程度之游泳圖。箭頭指示停用預防。 圖 20A 及圖 20B：在用單一25 mg或75 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體之(A)隊列1 (n=3)及(B)隊列2 (n=3) HAE發作率自基線之變化%之更新結果。 圖 21 ：在基線時及在用單一25 mg或50 mg劑量之NTLA-2002治療後之16週主要觀察時段期間研究者確診之每月發作率，及每一隊列之第1-16週及第5-16週之自基線之平均變化%。 圖 22 ：在用單一25 mg、50 mg或75 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體之平均絕對胰舒血管素減少之更新結果。 圖 23 ：在用單一25 mg、50 mg或75 mg劑量之NTLA-2002治療後，隊列1、2及3之個體之平均胰舒血管素減少%之更新結果。 圖 24 ：圖解說明在用單一25 mg (患者1-3)、50 mg (患者7-10)或75 mg (患者4-6)劑量之NTLA-2002治療後，個體患者之發作頻率及嚴重程度之更新游泳圖。箭頭指示停用預防。 圖 25 ：在用單一25 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體之隊列1 (n=3) HAE發作率自基線之變化%之更新結果。 圖 26 ：在用單一50 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體之隊列1 (n=4) HAE發作率自基線之變化%之更新結果。 圖 27 ：在用單一75 mg劑量之NTLA-2002治療後，個體之隊列1 (n=3) HAE發作率自基線之變化%之更新結果。 圖 28 ：隊列1、2及3之患者在迄今為止之研究時段內之平均絕對胰舒血管素活性值。 圖 29 ：隊列1、2及3之患者在迄今為止之研究時段內之胰舒血管素活性值自基線之平均變化百分比。 圖 30 ：隊列1 (25 mg)之患者之胰舒血管素蛋白水準自基線之變化百分比的義大利麵圖(Spaghetti plot)。 圖 31 ：隊列3 (50 mg)之患者之胰舒血管素蛋白水準自基線之變化百分比的義大利麵圖。 圖 32 ：隊列2 (75 mg)之患者之胰舒血管素蛋白水準自基線之變化百分比的義大利麵圖。 圖 33 ：隊列1 (25 mg)之患者之胰舒血管素活性水準自基線之變化百分比的義大利麵圖。 圖 34 ：隊列3 (50 mg)之患者之胰舒血管素活性水準自基線之變化百分比的義大利麵圖。 圖 35 ：隊列2 (75 mg)之患者之胰舒血管素活性水準自基線之變化百分比的義大利麵圖。 圖 36 ：在投與單劑量(25 mg、50 mg或75 mg)之NTLA-2002後，HAE患者之血漿胰舒血管素蛋白濃度(自基線之變化百分比)及胰舒血管素活性(自基線之變化百分比)的相關圖。 圖 37 ：在單劑量IV輸注所指示劑量之NTLA-2002後，LP01之幾何平均血漿濃度-時間概況。描述自開始NTLA-2002輸注至76小時，可獲得之LP01 (脂質A)藥物動力學數據。 圖 38：篩選時段期間、主要觀察時段期間及主要觀察時段後之血管水腫發作。 圖 39：血管水腫每月發作率隨時間之變化。
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Claims (66)

  1. 一種治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA。
  2. 一種預防人類個體之HAE發作之方法，其包括向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA。
  3. 一種降低患有HAE之人類個體之血管水腫發作頻率之方法，其包括向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA。
  4. 一種活體內編輯患有HAE之人類個體之胰舒血管素( KLKB1)基因的方法，其包括： a. 向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向該 KLKB1基因之指導RNA；及 b. 在該個體之肝細胞中在由該指導RNA靶向之位點處編輯該 KLKB1基因； 其中與基線水準相比，投與該組合物導致該個體之臨床指標水準之臨床上顯著之改良。
  5. 一種治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括： a. 向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向 KLKB1之指導RNA，其中該指導RNA包含含有核苷酸序列GGAUUGCGUAUGGGACACAA (SEQ ID NO: 15)之靶向序列， 其中相對於基線總血漿胰舒血管素蛋白水準，投與該組合物降低總血漿胰舒血管素蛋白水準。
  6. 一種治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括： a. 向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA； b. 在投與之前確定該個體之臨床指標之第一水準； c. 在投與後一段時間，確定該個體之該臨床指標之第二水準；及 d. 評價該臨床指標之該第一水準與該第二水準之間的變化，其中投與該組合物導致該個體之該臨床指標水準與基線水準相比改良之變化，從而治療HAE。
  7. 一種治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括： a. 向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向肝臟中之 KLKB1基因之指導RNA； b. 在投與之前確定該個體之生物安全指標之第一水準； c. 在投與後一段時間確定該個體之該生物安全指標之第二水準；及 d. 評價該生物安全指標之該第一水準與該第二水準之間的變化，其中投與該組合物導致該個體之生物安全指標水準與基線水準相比可接受之變化。
  8. 一種治療人類個體之遺傳性血管水腫(HAE)之方法，其包括： a. 向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向 KLKB1基因之指導RNA， 其中與臨床指標之基線水準相比，投與該組合物導致該個體之該臨床指標水準之臨床上顯著之改良。
  9. 一種治療人類個體之HAE之方法，其包括： a. 向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向 KLKB1基因之指導RNA， 其中該編碼Cas核酸酶之mRNA及該靶向 KLKB1基因之指導RNA係以約25 mg至約75 mg之組合劑量投與。
  10. 一種治療人類個體之HAE之方法，其包括： a. 向該人類個體全身性投與LNP組合物，該LNP組合物包含治療有效量之： i. 編碼Cas核酸酶之mRNA，及 ii. 靶向 KLKB1基因之指導RNA， 其中該編碼Cas核酸酶之mRNA及該靶向 KLKB1基因之指導RNA係以約50 mg至約75 mg之組合劑量投與。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中在投與該組合物後，胰舒血管素蛋白水準降低至少60%。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其進一步包括在投與該組合物後，使胰舒血管素活性水準降低至少60%。
  13. 如請求項1至4或6至12中任一項之方法，其中該指導RNA包含含有核苷酸序列GGAUUGCGUAUGGGACACAA (SEQ ID NO: 15)之靶向序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該指導RNA進一步包含含有核苷酸序列 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 387)之支架序列。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該指導RNA係包含核苷酸序列mG*mG*mA*UUGCGUAUGGGACACAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 391)或由其組成之經修飾之指導RNA，其中m指示2’-O-甲基修飾之核苷酸且*指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物時，同時用HAE預防治療該個體。
  17. 如請求項16之方法，其中該HAE預防包含選自以下之劑：C1酯酶抑制劑(C1-INH)替代(重組或血漿源性)、B2舒緩肽受體(B2R)抑制劑(艾替班特(icatibant))、胰舒血管素抑制劑(艾卡拉肽(ecallantide)、拉那利尤單抗(lanadelumab)、貝羅司他(berotralstat))、減弱的雄激素(達那唑(danazol)、氧雄龍(oxandrolone)、司坦唑醇(stanozolol))或抗纖維蛋白溶解劑。
  18. 如請求項17之方法，其中該HAE預防包含選自貝羅司他及達那唑之劑。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中在即將向該人類個體全身性投與該LNP組合物之前，該個體具有90天內至少2次確診HAE發作之發作頻率。
  20. 如請求項1至18中任一項之方法，其中在即將向該人類個體全身性投與該LNP組合物之前，該個體具有每90天至少3次確診HAE發作之發作頻率。
  21. 如請求項1至18中任一項之方法，其中在即將向該人類個體全身性投與該LNP組合物之前，該個體具有每90天至少6次確診HAE發作之平均發作頻率。
  22. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後緊接至少90天內，視情況地在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後緊接至少6個月內，該個體確診發作頻率降低至少50%。
  23. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後緊接至少90天內，視情況地在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後緊接6個月內，該個體確診發作頻率降低至少80%。
  24. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後緊接90天內，視情況地在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後緊接6個月內，該個體不具確診發作。
  25. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後第29至112天時，視情況地在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後第29至216天時，該個體確診發作頻率降低至少80%。
  26. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後第29至112天時，視情況地在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後第29至216天時，該個體確診發作頻率降低至少90%。
  27. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後第29至112天時，視情況地在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後第29至216天時，該個體不具確診發作。
  28. 如請求項16至27中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物的同時停用預防。
  29. 如請求項16至28中任一項之方法，其中在向該人類個體全身性投與該LNP組合物後第36天時或之後，停用預防。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該個體使用急性療法治療HAE發作之頻率降低。
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中與對照、例如在用該組合物治療前之該個體相比，該個體使用與HAE發作相關之住院之頻率降低。
  32. 如請求項1至31中任一項之方法，其中該個體之確診HAE發作之嚴重程度降低。
  33. 如請求項1至32中任一項之方法，其中該個體之確診重度HAE發作之頻率降低。
  34. 如請求項1至32中任一項之方法，其中該個體之確診HAE發作伴喉水腫之頻率降低。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該個體具有改良之生活品質，視情況地如藉由適宜生活品質(QoL)評價所確定。
  36. 如請求項1至35中任一項之方法，其中該個體不耐受用減弱的雄激素長期治療，或在用減弱的雄激素治療的同時具有每90天至少1次之平均發作頻率。
  37. 如請求項1至36中任一項之方法，其中該個體係兒童、懷孕女性、患有肝病之個體、患有乳癌之個體、患有前列腺癌之個體、具有心血管風險因子之個體及患有肝細胞癌之個體。
  38. 如請求項37之方法，其中該個體係懷孕女性。
  39. 如請求項1至38中任一項之方法，其中該個體係具有生育潛能之女性。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該個體已患有至少一次確診HAE發作伴喉水腫。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法，其中該LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該LNP包含PEG脂質。
  43. 如請求項42之方法，其中該PEG脂質包含1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000。
  44. 如請求項1至43中任一項之方法，其中該LNP包含中性脂質。
  45. 如請求項44之方法，其中該中性脂質包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法，其中該LNP組合物具有約5-7之N/P比率。
  47. 如請求項1至46中任一項之方法，其中該指導RNA及該編碼Cas核酸酶之mRNA係以介於約5:1至約1:5範圍內之重量比存在。
  48. 如請求項1至47中任一項之方法，其中該mRNA編碼Cas9核酸酶。
  49. 如請求項1至48中任一項之方法，其中該mRNA編碼釀膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9。
  50. 如請求項1至49中任一項之方法，其中該編碼Cas核酸酶之mRNA經密碼子最佳化。
  51. 如請求項1至50中任一項之方法，其中該編碼Cas核酸酶之mRNA及該靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25-75 mg總RNA之組合劑量。
  52. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該編碼Cas核酸酶之mRNA及該靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約25 mg總RNA之組合劑量。
  53. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該編碼Cas核酸酶之mRNA及該靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約50 mg總RNA之組合劑量。
  54. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該編碼Cas核酸酶之mRNA及該靶向 KLKB1基因之指導RNA之有效量係約75 mg總RNA之組合劑量。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法，其中與投與該組合物之前之基線總血漿胰舒血管素水準相比，投與該組合物使總血漿胰舒血管素蛋白水準降低60%-95%、60%-90%、70%-95%、70%-90%或80%-95%。
  56. 如請求項1至55中任一項之方法，其中與投與該組合物之前之基線血漿胰舒血管素活性水準相比，投與該組合物使血漿胰舒血管素活性降低60%-95%、60%-90%、70%-95%、70%-90%或80%-95%。
  57. 如請求項55至56中任一項之方法，其中該血漿胰舒血管素水準係在投與該LNP組合物後至少28天確定。
  58. 如請求項55至57中任一項之方法，其中該血漿胰舒血管素水準係在投與該LNP組合物後56天時確定。
  59. 如請求項1至58中任一項之方法，其中投與該組合物導致該個體之生物安全指標水準與該生物安全指標之基線水準相比可接受之變化。
  60. 如請求項59之方法，其中該生物安全指標係活化部分凝血激酶時間(aPTT)。
  61. 如請求項59或60之方法，其中該生物安全指標係丙胺酸胺基轉移酶(ALT)。
  62. 如請求項59至61中任一項之方法，其中該生物安全指標係天冬胺酸胺基轉移酶(AST)。
  63. 如請求項59至62中任一項之方法，其中該生物安全指標之變化在14天內消退。
  64. 如請求項59至63中任一項之方法，其中該生物安全指標係3級或更小。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該組合物係與用於治療HAE之第二治療劑一起投與。
  66. 如請求項65之方法，其中該第二治療劑係HAE預防治療。
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