RU2791694C2

RU2791694C2 - Способы лечения синдрома альпорта

Info

Publication number: RU2791694C2
Application number: RU2019139261A
Authority: RU
Inventors: Тимоти РАЙТ
Original assignee: Санофи
Priority date: 2017-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2023-03-13

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к терапии и нефрологии, и предназначено для лечения синдрома Альпорта. Способ лечения синдрома Альпорта включает введение пациенту с синдромом Альпорта двух или более доз модифицированного олигонуклеотида. Модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов и имеет структуру 5'–A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E–3' (SEQ ID NO: 3), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β–D–дезоксирибонуклеозиды, нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" представляют собой 2'–MOE–нуклеозиды, нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" представляют собой S–cEt–нуклеозиды, и каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. При этом доза указанного олигонуклеотида составляет 1,5 мг/кг, которую вводят с частотой две недели между дозами. В других воплощениях представлены варианты лечения синдрома Альпорта у пациента и способ уменьшения уровня снижения функции почек с течением времени у пациента с синдромом Альпорта. Использование группы изобретений улучшает функцию почек, снижает степень или замедляет дальнейшее прогрессирование фиброза почек, позволяет отсрочить начало развития терминальной стадии почечной недостаточности, отсрочить время до диализа, отсрочить время до трансплантации почки, а также увеличивает продолжительность жизни субъекта. 4 н. и 28 з.п. ф-лы, 3 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет преимущество приоритета по предварительной заявке на патент США № 62/501699, поданной 4 мая 2018 года, которая включена посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте для любых целей.

ОБЛАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе предусмотрены способы и композиции для лечения синдрома Альпорта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Коллаген IV типа, основной компонент базальной мембраны, представляет собой семейство шести альфа-цепей: коллаген альфа-1 (IV типа), коллаген альфа-2 (IV типа), коллаген альфа-3 (IV типа), коллаген альфа-4 (IV типа), коллаген альфа-5 (IV типа) и коллаген альфа-6 (IV типа). Альфа-3, альфа-4 и альфа-6 цепи коллагена IV являются основными компонентами коллагеновой сетки базальной мембраны почечных клубочков (GBM), которая выполняет важнейшую функцию фильтрации крови почками.

Синдром Альпорта представляет собой врожденную форму заболевания почек, при котором вырабатывается аномальный тип базальной мембраны почечных клубочков (GBM), что приводит к интерстициальному фиброзу, клубочковому склерозу и возможной потере функции почек. Заболевание также зачастую характеризуется нарушениями слуха и аномалиями зрения. Синдром Альпорта вызывается мутацией в Col4a3, Col4a4 или Col4a5, которые кодируют альфа3(IV), альфа4(IV) и альфа5(IV) цепи коллагена IV типа, соответственно. Мутации в гене Col4a5 на X-хромосоме вызывают X-сцепленную форму синдрома Альпорта, что составляет 85% всех случаев заболевания. Аутосомно-рецессивная форма возникает в результате наследования мутаций в каждой копии либо Col4a3, либо Col4a4, каждый из которых расположен на 2 хромосоме. Редкая аутосомно-доминантная форма возникает в результате наследования доминантно-негативной мутации либо в гене Col4a3, либо в гене Col4a4 . X-сцепленная форма является более тяжелой у мужчин, чем у женщин, при этом в большинстве случаев у мужчин прогрессирует до терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD). Аутосомная форма характеризуется схожей степенью тяжести у мужчин и женщин. Большинство случаев заболевания обусловлены врожденной мутацией, но некоторые случаи обусловлены мутацией de novo в одном из генов Col4aA.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Вариант осуществления 1. Способ лечения синдрома Альпорта, включающий введение субъекту с синдромом Альпорта двух или более доз модифицированного олигонуклеотида, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов и имеет структуру 5'-A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E-3' (SEQ ID NO: 3), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" представляют собой 2'-MOE-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" представляют собой S-cEt-нуклеозиды, и каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь, и где дозу, составляющую 1,5 мг/кг, вводят с частотой две недели между дозами.

Вариант осуществления 2. Способ по варианту осуществления 1, где доза доставляется в фармацевтически приемлемом разбавителе.

Вариант осуществления 3. Способ по варианту осуществления 2, где фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой солевой раствор.

Вариант осуществления 4. Способ по варианту осуществления 3, где солевой раствор представляет собой 0,3% раствор хлорида натрия.

Вариант осуществления 5. Способ по любому из вариантов осуществления 2-4, где концентрация модифицированного олигонуклеотида в фармацевтически приемлемом разбавителе составляет по меньшей мере 110 мг/мл.

Вариант осуществления 6. Способ по любому из вариантов осуществления 1-5, где доза представляет собой одну болюсную инъекцию 110 мг/мл модифицированного олигонуклеотида.

Вариант осуществления 7. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, где фармацевтическую композицию вводят в виде подкожной инъекции.

Вариант осуществления 8. Способ по варианту осуществления 7, где подкожную инъекцию производят в переднюю брюшную стенку субъекта.

Вариант осуществления 9. Способ по любому из вариантов осуществления 1-8, включающий отбор субъекта, у которого синдром Альпорта диагностировали с помощью клинических, гистопатологических и/или генетических критериев.

Вариант осуществления 10. Способ по любому из вариантов осуществления 1-9, где субъект имеет расчетную скорость клубочковой фильтрации, составляющую 30 мл/мин/1,73 м², до получения первой дозы модифицированного олигонуклеотида.

Вариант осуществления 11. Способ по варианту осуществления 15, где субъект имеет расчетную скорость клубочковой фильтрации (eGFR) от 45 до 90 мл/мин/1,73 м² до получения первой дозы модифицированного олигонуклеотида.

Вариант осуществления 12. Способ по любому из вариантов осуществления 1-11, где расчетная скорость клубочковой фильтрации у субъекта снижается со скоростью ≥5 мл/мин/1,73 м²/год до получения первой дозы модифицированного олигонуклеотида.

Вариант осуществления 13. Способ по любому из вариантов осуществления 1-12, где субъектом является мужчина, у которого была диагностирована X-сцепленная форма синдрома Альпорта, и чей возраст составляет от 18 до 30 лет.

Вариант осуществления 14. Способ по любому из вариантов осуществления 1-13, где у субъекта имеется уровень протеинурии, составляющий более 300 миллиграммов белка на грамм креатинина, до получения первой дозы модифицированного олигонуклеотида.

Вариант осуществления 15. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14, где у субъекта после введения модифицированного олигонуклеотида наблюдается улучшение в отношении одного или нескольких параметров, связанных с синдромом Альпорта, выбранных из группы, состоящей из

a. расчетной скорости клубочковой фильтрации;

b. скорости снижения расчетной скорости клубочковой фильтрации; и

c. качества жизни, измеренного с применением опросника Short Form 36 Health Survey®.

Вариант осуществления 16. Способ по любому из вариантов осуществления 1-15, где у субъекта после введения модифицированного олигонуклеотида проявляется улучшение в отношении одного или нескольких почечных биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из

a. miR-21 в ткани, полученной при биопсии;

b. уровня азота мочевины в крови;

c. соотношения белок/альбумин в моче;

d. соотношения альбумин/креатин в моче;

e. креатинина;

f. подоцитурии в моче;

g. молекулы-1 повреждения почек;

h. бета-2-микроглобулина;

i. кластерина;

j. цистатина C;

k. асимметричного диметиларгинина;

l. трансформирующего фактора роста бета;

m. фактора роста соединительной ткани; и

n. липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов.

Вариант осуществления 17. Способ по любому из вариантов осуществления 1-16, где один или несколько из креатинина, цистатина C, молекулы-1 повреждения почек, бета-2-микроглобулина и/или кластерина измеряют в образце крови субъекта.

Вариант осуществления 18. Способ по любому из вариантов осуществления 1-16, где один или несколько из креатинина, цистатина C, молекулы-1 повреждения почек, бета-2-микроглобулина и/или кластерина измеряют в образце мочи субъекта.

Вариант осуществления 19. Способ по любому из вариантов осуществления 1-18, где субъект получал лечение в виде ингибитора ангиотензин II-превращающего фермента (ACE) в течение по меньшей мере 30 дней до получения первой дозы олигонуклеотида.

Вариант осуществления 20. Способ по любому из вариантов осуществления 1-19, где субъект получал лечение в виде блокаторов рецепторов ангиотензина II (ARB) в течение по меньшей мере 30 дней до получения первой дозы олигонуклеотида.

Вариант осуществления 21. Способ по варианту осуществления 19, где ингибиторы ангиотензин II-превращающего фермента (ACE) выбран из каптоприла, эналаприла, лизиноприла, беназеприла, хинаприла, фозиноприла и рамиприла.

Вариант осуществления 22. Способ по варианту осуществления 20, где блокаторы рецепторов ангиотензина II (ARB) выбран из кандесартана, ирбесартана, олмесартана, лозартана, валсартана, телмисартана и эпросартана.

Вариант осуществления 23. Способ по любому из вариантов осуществления 1-22, где субъекту вводится по меньшей мере 24 дозы.

Вариант осуществления 24. Способ лечения синдрома Альпорта у субъекта, где способ включает:

a. отбор субъекта, у которого синдром Альпорта диагностирован с применением клинических, гистопатологических и/или генетических критериев;

b. введение субъекту двух или более доз фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов и имеет структуру 5'-A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E-3' (SEQ ID NO: 3), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" представляют собой 2'-MOE-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" представляют собой S-cEt-нуклеозиды, и каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь, где доза модифицированного олигонуклеотида составляет 1,5 мг/кг, и где дозы вводят с частотой две недели между дозами;

c. где у субъекта после введения фармацевтической композиции проявляется улучшение в отношении одного или нескольких параметров, связанных с AS, выбранных из

i. расчетной скорости клубочковой фильтрации (eGFR);

ii. скорости снижения eGFR; и

iii. качества жизни (QOL), измеренного с помощью опросника Short Form 36 Health Survey®.

Вариант осуществления 25. Способ лечения синдрома Альпорта у субъекта, где способ включает:

a. отбор субъекта, у которого синдром Альпорта диагностирован с применением клинических, гистопатологических и/или генетических критериев, где субъект имеет

i. расчетную скорость клубочковой фильтрации, составляющую по меньшей мере 30 мл/мин/1,73 м²;

ii. скорость снижения расчетной скорости клубочковой фильтрации, составляющую ≥5 мл/мин/1,73 м²/год;

iii. уровень протеинурии, больше равный 300 мг белка/г креатинина или больше; и

iv. он получал лечение в виде ингибитора ACE и/или ARB со стабильным режимом дозирования в течение по меньшей мере 30 дней;

c. где у субъекта после введения фармацевтической композиции проявляется улучшение в отношении одного или нескольких параметров, связанных с синдромом Альпорта, выбранных из

ii. скорости снижения eGFR; и

Вариант осуществления 26. Способ уменьшения уровня снижения функции почек с течением времени у субъекта с синдромом Альпорта, где способ включает:

a. отбор субъекта, у которого диагностирован синдром Альпорта, подтвержденный с помощью клинических, гистопатологических и/или генетических критериев, где субъект имеет

ii. скорости снижения eGFR; и

Вариант осуществления 27. Способ по любому из вариантов осуществления 1-26, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру:

(SEQ ID NO: 3) или ее фармацевтически приемлемой соли.

Вариант осуществления 28. Способ по варианту осуществления 27, где модифицированный олигонуклеотид присутствует в виде фармацевтически приемлемой соли данной структуры.

Вариант осуществления 29. Способ по варианту осуществления 28, где модифицированный олигонуклеотид присутствует в виде натриевой соли данной структуры.

Вариант осуществления 30. Способ по любому из вариантов осуществления 1-29, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру:

(SEQ ID NO: 3).

Вариант осуществления 31. Способ по любому из вариантов осуществления 10-30, где расчетную скорость клубочковой фильтрации рассчитывают с применением уравнения, учитывающего уровень креатинина, разработанного Сотрудничеством в области эпидемиологии хронических заболеваний почек (CKD-EPI).

Вариант осуществления 32. Способ по любому из вариантов осуществления 10-30, где расчетную скорость клубочковой фильтрации рассчитывают с применением уравнения, учитывающего уровень креатинина и цистатина С, разработанного Сотрудничеством в области эпидемиологии хронических заболеваний почек (CKD-EPI).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же значение, какое обычно понимает специалист в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Если не приводятся конкретные определения, номенклатура, используемая по отношению к аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии и их способам и методикам, описываемым в данном документе, хорошо известны и широко применяются в данной области техники. В случае если в данном документе имеются несколько определений терминов, преимущество имеют таковые из данного раздела. Для химического синтеза, химического анализа, получения, составления и доставки фармацевтических препаратов и лечения субъектов можно применять стандартные методики. Такие определенные методики и способы можно найти, например, в "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" под редакцией Sangvi и Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; и в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18-е издание, 1990 г.; и которые включены в данный документ при помощи ссылки для любых целей. В допустимых случаях все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки и публикации, последовательности из GENBANK, веб-сайты и другие опубликованные материалы, на которые ссылаются по всему полному раскрытию в данном документе, если не указано иное, включены ссылкой во всем объеме. Если ссылка делается на URL или другой подобный идентификатор или адрес, то понимают, что такие идентификаторы могут изменяться, и конкретная информация в интернете может изменяться, но путем поиска в Интернете можно найти эквивалентную информацию. Ссылки на нее свидетельствуют о доступности и публичном распространении такой информации.

Перед тем, как будут раскрыты и описаны настоящие композиции и способы, следует понимать, что терминология, использованная в данном документе, служит только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничивающей. Следует отметить, что использованные в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа, включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.

Определения

"Синдром Альпорта" означает врожденную форму заболевания почек, при котором вырабатывается аномальный уровень базальной мембраны почечных клубочков (GBM), что приводит к интерстициальному фиброзу, клубочковому склерозу и возможной потере функции почек. Заболевание также зачастую характеризуется нарушениями слуха и аномалиями зрения.

"Гематурия" означает присутствие в моче эритроцитов.

"Альбуминурия" означает присутствие в моче избыточного альбумина и включает без ограничения нормальную альбуминурию, альбуминурию с верхней границей нормы, микроальбуминурию и макроальбуминурию. В норме барьер проницаемости клубочковой фильтрации, который состоит из подоцитов, базальной мембраны клубочка и эндотелиальных клеток, предупреждает просачивание в мочу белка сыворотки. Альбуминурия может отражать поражение барьера проницаемости клубочковой фильтрации. Уровень альбуминурии можно рассчитать на основании образца мочи, собранной за 24 часа, образца ночной мочи или образца разовой порции мочи.

"Альбуминурия с верхней границей нормы" означает повышенную альбуминурию, характеризующуюся (i) выделением от 15 до <30 мг альбумина в мочу за 24 часа и/или (ii) соотношением альбумин/креатинин от 1,25 до <2,5 мг/ммоль (или от 10 до <20 мг/г) у мужчин или от 1,75 до <3,5 мг/ммоль (или от 15 до <30 мг/г) у женщин.

"Микроальбуминурия" означает повышенную альбуминурию, характеризующуюся (i) выделением от 30 до 300 мг альбумина в мочу за 24 часа и/или (ii) соотношением альбумин/креатинин от 2,5 до <25 мг/ммоль (или от 20 до <200 мг/г) у мужчин или от 3,5 до <35 мг/ммоль (или от 30 до <300 мг/г) у женщин.

"Макроальбуминурия" означает повышенную альбуминурию, характеризующуюся выделением более 300 мг альбумина в мочу за 24 часа и/или (ii) соотношением альбумин/креатинин >25 мг/ммоль (или >200 мг/г) у мужчин или >35 мг/ммоль (или >300 мг/г) у женщин.

"Соотношение альбумин/креатинин" означает соотношение альбумина мочи (мг/дл) и креатинина мочи (г/дл) и выражается в мг/г. В определенных вариантах осуществления соотношение альбумин/креатинин можно рассчитать на основании образца разовой порции мочи и его можно использовать как оценку выделения альбумина за период 24 часа.

"Скорость клубочковой фильтрации (GFR)" означает скорость потока фильтруемой жидкости через почку и используется в качестве показателя функции почек у субъекта. В определенных вариантах осуществления GFR субъекта определяют путем вычисления расчетной скорости клубочковой фильтрации. В определенных вариантах осуществления GFR субъекта измеряют непосредственно у субъекта с применением способа на основе инулина.

"Расчетная скорость клубочковой фильтрации (eGFR) означает измерение того, насколько хорошо почки фильтруют креатинин, и используется для приблизительной оценки скорости клубочковой фильтрации. Так как прямое измерение GFR является сложным, в клинической практике часто применяют eGFR. Нормальные результаты могут находиться в диапазоне 90-120 мл/мин/1,73 м². Уровни ниже 60 мл/мин/1,73 м2 в течение 3 или более месяцев могут служить индикатором хронического заболевания почек. Уровни ниже 15 мл/мин/1,73 м2 могут служить индикатором почечной недостаточности.

"Протеинурия" означает наличие избытка белков сыворотки в моче. Протеинурия может характеризоваться выделением > 250 мг белка в мочу за 24 часа и/или соотношением белка и креатинина в моче ≥ 0,20мг/мг. Белки сыворотки, уровни которых повышаются в контексте протеинурии, включают без ограничений альбумин.

"Азот мочевины в крови" или "BUN" означает меру количества азота в крови в форме мочевины. Печень вырабатывает мочевину в орнитиновом цикле в качестве побочного продукта расщепления белка, и мочевина удаляется из крови с помощью почек. В крови нормального взрослого человека может содержаться от 7 до 21 мг азота мочевины на 100 мл (7-21 мг/дл) крови. Измерение уровня азота мочевины в крови используют как индикатор здоровья почек. Если почки не могут нормально удалять мочевину из крови, BUN у субъекта повышается.

"Терминальная стадия почечной недостаточности (ESRD)" означает полный или почти полный отказ функции почек.

"Нарушенная функция почек" означает сниженную функцию почек относительно нормальной функции почек.

"Фиброз" означает образование или развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани. В определенных вариантах осуществления фиброз происходит в качестве репаративного или реактивного процесса. В определенных вариантах осуществления фиброз происходит в ответ на повреждение или поражение. Термин "фиброз" следует понимать как образование или развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в качестве репаративного или реактивного процесса, в отличие от образования фиброзной ткани в качестве нормальной составляющей органа или ткани.

"Исходный уровень" означает измерение клинических параметров у субъекта непосредственно перед началом лечения. Измерение на исходном уровне может применяться для подтверждения того, что субъект может продолжать лечение одним или несколькими выбранными фармацевтическими средствами. В определенных вариантах осуществления исходный уровень eGFR получают от субъекта с синдромом Альпорта для подтверждения того, что субъект может продолжать лечение одним или несколькими выбранными фармацевтическими средствами, как описано в данном документе.

"Short Form 36 Health Survey®" или "SF-36" означает опросник из 36 вопросов про состояние здоровья субъекта, на которые отвечает сам субъект, применяемый для оценки состояния здоровья и качества жизни субъекта. SF-36 можно применять для контроля и сравнения тяжести заболевания у субъектов, получающих лечение от заболевания или состояния. SF-36 включает 8 отдельных областей: физическое функционирование, ролевое физическое функционирование, интенсивность боли, общее состояние здоровья, жизненная активность, ролевое социальное функционирование, ролевое эмоциональное функционирование и психическое здоровье. SF-36 был описан, например, McHorney et al. (Med Care. 1993 Mar; 31(3):247-63).

"Качество жизни" означает степень, в которой физическое, психологическое и социальное функционирование субъекта ухудшается из-за заболевания и/или лечения заболевания. Качество жизни может ухудшаться у субъектов, имеющих хроническое заболевание, включая синдром Альпорта.

"Стабильный режим дозирования" означает количество фармацевтического средства, вводимого субъекту, которое поддерживает терапевтический уровень фармацевтического средства у субъекта. Например, субъект может получить исходную дозу фармацевтического средства, причем дозу можно повышать или понижать в зависимости от того, как субъект реагирует на исходную дозу. Как только доза, обеспечивающая необходимый терапевтический уровень, была установлена, считается, что субъект получает стабильный режим дозирования. Необходимый терапевтический уровень может представлять собой необходимый уровень фармацевтического средства в ткани (такой как кровь) субъекта или необходимый фармакологический эффект, такой как улучшение в отношении одного или нескольких симптомов заболевания.

"Замедлять дальнейшее прогрессирование" означает снижать скорость, с которой медицинское состояние движется по направлению к запущенному состоянию.

"Прекратить дальнейшее прогрессирование" означает останавливать прогрессирование медицинского состояния до запущенного состояния.

"Отсрочить время до диализа" означает поддерживать достаточную функцию почек, так чтобы отсрочить необходимость в лечении диализом.

"Отсрочить время до пересадки почки" означает поддерживать достаточную функцию почек, так чтобы отсрочить необходимость в пересадке почки.

"Увеличивать продолжительность жизни" означает удлинять срок жизни субъекта посредством осуществления лечения в отношении одного или нескольких симптомов заболевания у субъекта.

"Anti-miR" означает олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, комплементарной microRNA. В определенных вариантах осуществления anti-miR представляет собой модифицированный олигонуклеотид.

"Anti-miR-X", где "miR-X" обозначает конкретную microRNA, означает олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, комплементарной miR-X. В определенных вариантах осуществления anti-miR-X полностью комплементарен (т. е., комплементарен на 100%) miR-X. В определенных вариантах осуществления anti-miR-X по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% комплементарен miR-X. В определенных вариантах осуществления anti-miR-X представляет собой модифицированный олигонуклеотид.

"miR-21" означает зрелую microRNA с нуклеотидной последовательностью UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO: 1).

"Последовательность miR-21 со структурой типа стебель-петля" означает последовательность со структурой типа стебель-петля с нуклеотидной последовательностью UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA (SEQ ID NO: 2).

"Целевая нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, с которой предназначено гибридизировать олигомерное соединение.

"Нацеливание" означает процесс разработки и выбора нуклеотидной последовательности, которая будет гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой.

"Нацеленный на" означает имеющий нуклеотидную последовательность, которая будет позволять осуществлять гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой.

"Модуляция" означает изменение функции, количества или активности. В определенных вариантах осуществления модуляция означает увеличение функции, количества или активности. В определенных вариантах осуществления модуляция означает уменьшение функции, количества или активности.

"Экспрессия" означает любые функции и этапы, благодаря которым кодируемая геном информация превращается в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке.

"Нуклеотидная последовательность" означает порядок смежных нуклеотидных оснований в олигомерном соединении или нуклеиновой кислоте, как правило, перечисленных в ориентации 5'-3', независимо от какой-либо модификации сахаров, связей и/или нуклеотидных оснований.

"Смежные нуклеотидные основания" означают нуклеотидные основания, непосредственно прилегающие друг к другу в нуклеиновой кислоте.

"Комплементарность нуклеотидных оснований" означает способность двух нуклеотидных оснований к нековалентному спариванию посредством образования водородных связей.

"Комплементарный" означает, что одна нуклеиновая кислота способна гибридизироваться с другой нуклеиновой кислотой или олигонуклеотидом. В определенных вариантах осуществления комплементарный относится к олигонуклеотиду, способному гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой.

"Полностью комплементарный", также называемый "комплементарный на 100%", означает, что каждое нуклеотидное основание олигонуклеотида способно спариваться с нуклеотидным основанием в каждом соответствующем положении в целевой нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид полностью комплементарен microRNA, т. е. каждое нуклеиновое основание олигонуклеотида комплементарно нуклеиновому основанию в соответствующем положении в microRNA. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид, где каждое нуклеиновое основание обладает комплементарностью по отношению к нуклеиновому основанию в пределах области последовательности microRNA со структурой типа стебель-петля, полностью комплементарен последовательности microRNA со структурой типа стебель-петля.

"Процентная комплементарность" означает процентную долю нуклеотидных оснований олигонуклеотида, комплементарных части целевой нуклеиновой кислоты, имеющей такую же длину. Процентную комплементарность вычисляют путем деления числа нуклеиновых оснований олигонуклеотида, комплементарных нуклеиновым основаниям в соответствующих положениях в целевой нуклеиновой кислоте, на общее число нуклеиновых оснований в олигонуклеотиде.

"Процентная идентичность" означает число нуклеотидных оснований в первой нуклеиновой кислоте, идентичных нуклеотидным основаниям в соответствующих положениях во второй нуклеиновой кислоте, деленное на общее число нуклеотидных оснований в первой нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота представляет собой microRNA, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой microRNA. В определенных вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид.

"Гибридизировать" означает отжиг комплементарных нуклеиновых кислот, происходящий благодаря комплементарности нуклеотидных оснований.

"Несовпадение" означает, что нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты не способно к спариванию по Уотсону-Крику с нуклеотидным основанием в соответствующем положении второй нуклеиновой кислоты.

"Идентичный", применительно к нуклеотидным последовательностям, означает имеющий такую же нуклеотидную последовательность независимо от модификаций сахаров, связей и/или нуклеотидных оснований и независимо от метилированного состояния любых присутствующих пиримидинов.

"microRNA" означает эндогенную некодирующую РНК, имеющую длину от 18 до 25 нуклеотидных оснований, являющуюся продуктом расщепления пре-microRNA с помощью фермента Dicer. Примеры зрелых microRNA находятся в базе данных microRNA, известной как miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/). В определенных вариантах осуществления microRNA сокращают как "microRNA" или "miR".

"microRNA-регулируемый транскрипт" означает транскрипт, регулируемый с помощью microRNA.

"Затравочная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, содержащую от 6 до 8 смежных нуклеотидных оснований из нуклеотидных оснований 1-9 с 5'-конца последовательности зрелой microRNA.

"Последовательность, соответствующая затравочной" означает нуклеотидную последовательность, комплементарную затравочной последовательности и имеющую такую же длину, как затравочная последовательность.

"Олигомерное соединение" означает соединение, которое содержит несколько связанных мономерных субъединиц. Олигомерные соединения включают олигонуклеотиды.

"Олигонуклеотид" означает соединение, содержащее несколько связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным независимо друг от друга.

"Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь" означает 3'-5' фосфодиэфирную связь между нуклеозидами.

"Природный сахар" означает сахар, обнаруживаемый в ДНК (2'-H) или РНК (2'-OH).

"Межнуклеозидная связь" означает ковалентную связь между прилегающими нуклеозидами.

"Связанные нуклеозиды" означает нуклеозиды, соединенные с помощью ковалентной связи.

"Нуклеотидное основание" означает гетероциклический фрагмент, способный к нековалентному спариванию с другим нуклеотидным основанием.

"Нуклеозид" означает нуклеотидное основание, связанное с сахарным фрагментом.

"Нуклеотид" означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.

"Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из" ряда связанных нуклеозидов, означает соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий установленное число связанных нуклеозидов. Таким образом, соединение может включать дополнительные заместители или конъюгаты. Если не указано иное, модифицированный олигонуклеотид не гибридизируется с комплементарной цепью, гибридизированной с модифицированным олигонуклеотидом, и не содержит каких-либо дополнительных нуклеозидов, помимо таковых модифицированного олигонуклеотида.

"Модифицированный олигонуклеотид" означает одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий одну или несколько модификаций, относительно встречающихся в природе конца, сахара, нуклеинового основания и/или межнуклеозидной связи. Модифицированный олигонуклеотид может содержать немодифицированные нуклеозиды.

"Модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, имеющий любое изменение по сравнению со встречающимся в природе нуклеозидом. Модифицированный нуклеозид может иметь модифицированный сахар и немодифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный нуклеозид может иметь модифицированный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный нуклеозид может иметь природный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой бициклический нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, отличный от бициклического.

"Модифицированная межнуклеозидная связь" означает любое изменение по сравнению со встречающейся в природе межнуклеозидной связью.

"Фосфотиоатная межнуклеозидная связь" означает связь между нуклеозидами, где один из атомов, не образующих мостик, является атомом серы.

"Модифицированный сахарный фрагмент" означает замещение и/или любое изменение по сравнению с природным сахаром.

"Немодифицированное нуклеотидное основание" означает встречающиеся в природе гетероциклические основания РНК или ДНК: пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (C) (в том числе 5-метилцитозин) и урацил (U).

"5-Метилцитозин" означает цитозин, содержащий метильную группу, присоединенную к 5-положению.

"Неметилированный цитозин" означает цитозин, не содержащий метильную группу, присоединенную к 5-положению.

"Модифицированное нуклеотидное основание" означает любое нуклеотидное основание, не являющееся немодифицированным нуклеотидным основанием.

"Сахарный фрагмент" означает встречающийся в природе фуранозил или модифицированный сахарный фрагмент.

"Модифицированный сахарный фрагмент" означает замещенный сахарный фрагмент или заместитель сахара.

"2'-O-метиловый сахар" или "2'-OMe-сахар" означает сахар, имеющий модификацию, представляющую собой O-метилирование, в 2'-положении.

"2'-O-метоксиэтиловый сахар" или "2'-MOE-сахар" означает сахар, имеющий модификацию, представляющую собой O-метоксиэтилирование, в 2'-положении.

"2'-фтор" или "2'-F" означает сахар, имеющий модификацию, представляющую собой фторирование, в 2'-положении.

"Бициклический сахарный фрагмент" означает модифицированный сахарный фрагмент, содержащий 4-7-членное кольцо (включая без ограничения фуранозил), содержащее мостик, соединяющий два атома 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, что дает в результате бициклическую структуру. В определенных вариантах осуществления 4-7-членное кольцо является кольцом сахара. В определенных вариантах осуществления 4-7-членное кольцо представляет собой фуранозил. В определенных подобных вариантах осуществления мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила. Неограничивающие иллюстративные бициклические сахарные фрагменты включают LNA, ENA, cEt, S-cEt и R-cEt.

"Сахарный фрагмент закрытой нуклеиновой кислоты (LNA)" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик (CH₂)-O между атомами 4' и 2' кольца фуранозы.

"Сахарный фрагмент ENA" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик (CH₂)₂-O между атомами 4' и 2' кольца фуранозы.

"Сахарный фрагмент, конформационно закрепленный этилом (cEt)" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик CH(CH₃)-O- между атомами 4' и 2' кольца фуранозы. В определенных вариантах осуществления мостик CH(CH3)-O конформационно закреплен в S-ориентации. В определенных вариантах осуществления (CH₂)₂-O конформационно закреплен в R-ориентации.

"S-cEt-сахарный фрагмент" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий S-закрепленный мостик CH(CH₃)-O между атомами 4' и 2' кольца фуранозы.

"R-cEt-сахарный фрагмент" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий R-закрепленный мостик CH(CH₃)-O между атомами 4' и 2' кольца фуранозы.

"2'-O-метилнуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий модификацию, представляющую собой 2'-O-метилирование сахара.

"2'-O-метоксиэтилнуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий модификацию, представляющую собой 2'-O-метоксиэтилирование сахара. 2'-O-метоксиэтилнуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеотидное основание.

"2'-фторнуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий модификацию, представляющую собой 2'-фторирование сахара. 2'-фторнуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеотидное основание.

"Бициклический нуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий бициклический сахарный фрагмент. Бициклический нуклеозид может иметь модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.

"cEt-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий cEt-сахарный фрагмент. cEt-нуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.

"S-cEt-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий S-cEt-сахарный фрагмент.

"R-cEt-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий R-cEt-сахарный фрагмент.

"β-D-дезоксирибонуклеозид" означает встречающийся в природе ДНК-нуклеозид.

"β-D-рибонуклеозид" означает встречающийся в природе РНК-нуклеозид.

"LNA-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий сахарный фрагмент LNA.

"ENA-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий сахарный фрагмент ENA.

"Субъект" означает человека или животное, отличное от человека, выбранные для лечения или терапии.

"Субъект, нуждающийся в этом" означает субъекта, который идентифицирован как нуждающийся в терапии или лечении.

"Субъект, предположительно имеющий" означает субъекта, у которого проявляется один или несколько клинических индикаторов заболевания.

"Введение" означает предоставление субъекту фармацевтического средства или композиции, и оно включает без ограничений введение медицинским работником и самостоятельное введение.

"Парентеральное введение" означает введение посредством инъекции или инфузии.

Парентеральное введение включает без ограничений подкожное введение, внутривенное введение и внутримышечное введение.

"Подкожное введение" означает введение непосредственно под кожу.

"Внутривенное введение" означает введение в вену.

"Вводимый сопутствующим образом" относится к совместному введению двух или более средств любым способом, при котором фармакологические эффекты обоих проявляются у субъекта одновременно. При сопутствующем введении не требуется, чтобы оба средства вводили в одной фармацевтической композиции, в одной и той же лекарственной форме или используя один и тот же путь введения. Не требуется, чтобы эффекты обоих средств проявлялись в одно и то же время. Требуется только, чтобы эффекты перекрывались в течение определенного периода времени, и не требуется, чтобы они были одинакового протяжения во времени.

"Продолжительность" означает период времени, в течение которого продолжается активность или событие. В определенных вариантах осуществления продолжительность лечения представляет собой период времени, в течение которого вводят дозы фармацевтического средства или фармацевтической композиции.

"Терапия" означает способ лечения заболевания. В определенных вариантах осуществления терапия включает без ограничений химиотерапию, радиотерапию или введение фармацевтического средства.

"Лечение" означает применение одной или нескольких конкретных процедур, применяемых для излечения или облегчения заболевания. В определенных вариантах осуществления конкретная процедура представляет собой введение одного или нескольких фармацевтических средств.

"Облегчать течение" означает уменьшать тяжесть по меньшей мере одного индикатора состояния или заболевания. В определенных вариантах осуществления облегчение включает отсрочку или замедление прогрессирования одного или нескольких индикаторов состояния или заболевания. Тяжесть индикаторов может определяться с помощью субъективных или объективных мер, известных специалистам в данной области.

"Подверженный риску развития" означает статус, при котором субъект предрасположен к развитию состояния или заболевания. В определенных вариантах осуществления у субъекта, подверженного риску развития состояния или заболевания, проявляется один или несколько симптомов состояния или заболевания, но не проявляется достаточного числа симптомов, чтобы у него можно было диагностировать состояние или заболевание. В определенных вариантах осуществления у субъекта, подверженного риску развития состояния или заболевания, проявляется один или несколько симптомов состояния или заболевания, но в меньшей степени, чем требуется для диагностирования состояния или заболевания.

"Предупредить начало развития" означает предупредить развитие состояния или заболевания у субъекта, подверженного риску развития заболевания или состояния. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития заболевания или состояния, получает лечение, подобное лечению, получаемому субъектом, у которого уже есть заболевание или состояние.

"Отсрочить начало развития" означает отсрочить развитие состояния или заболевания у субъекта, подверженного риску развития заболевания или состояния. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития заболевания или состояния, получает лечение, подобное лечению, получаемому субъектом, у которого уже есть заболевание или состояние.

"Терапевтическое средство" означает фармацевтическое средство, применяемое для излечения, облегчения или предупреждения заболевания.

"Доза" означает установленное количество фармацевтического средства, обеспеченного в однократном введении. В определенных вариантах осуществления дозу можно вводить в двух или более болюсах, таблетках или инъекциях. Например, в определенных вариантах осуществления, где необходимо подкожное введение, для необходимой дозы требуется объем, который нелегко предоставить посредством одной инъекции. В таких вариантах осуществления можно применять две или более инъекций для достижения необходимой дозы. В определенных вариантах осуществления дозу можно вводить в двух или более инъекциях для того, чтобы свести к минимуму реакцию в месте инъекции у индивида. В определенных вариантах осуществления дозу вводят посредством медленной инфузии.

"Единица дозирования" означает форму, в которой предоставлено фармацевтическое средство. В определенных вариантах осуществления единица дозирования представляет собой флакон, содержащий лиофилизированный олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления единица дозирования представляет собой флакон, содержащий восстановленный олигонуклеотид.

"Терапевтически эффективное количество" относится к количеству фармацевтического средства, обеспечивающему терапевтическую пользу животному.

"Фармацевтическая композиция" означает смесь веществ, подходящих для введения индивиду, которая содержит фармацевтическое средство. Например, фармацевтическая композиция может содержать стерильный водный раствор.

"Фармацевтическое средство" означает вещество, которое обеспечивает терапевтический эффект при введении субъекту.

"Активный фармацевтический ингредиент" означает вещество в фармацевтической композиции, которое обеспечивает необходимый эффект.

"Улучшенная функция органа" означает изменение функции органа в сторону нормального диапазона значений. В определенных вариантах осуществления функцию органа оценивают путем измерения уровня молекул, обнаруживаемых в крови или моче субъекта. Например, в определенных вариантах осуществления улучшенную функцию почки измеряют по снижению уровня азота мочевины в крови, снижению уровня протеинурии, снижению уровня альбуминурии и т. д.

"Приемлемый профиль безопасности" означает картину побочных эффектов, находящуюся в клинически приемлемых пределах.

"Побочный эффект" означает физиологический ответ, связанный с лечением, отличный от необходимых эффектов. В определенных вариантах осуществления побочные эффекты включают без ограничений реакции в месте инъекции, аномалии функциональных проб печени, аномалии функции почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, аномалии центральной нервной системы и виды миопатии. Такие побочные эффекты можно выявить прямо или косвенно. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на гепатотоксичность или отклонение от нормы функции печени. Например, повышенный уровень билирубина может указывать на гепатотоксичность или аномалию функции печени.

"Приверженность субъекта к лечению" означает соблюдение субъектом указаний в отношении рекомендованной или назначенной терапии.

"Следовать предписаниям" означает соблюдение субъектом указаний в отношении рекомендованной терапии.

"Рекомендованная терапия" означает лечение, рекомендованное медицинским работником для лечения, облегчения или предупреждения заболевания.

Термин "кровь", используемый в данном документе, охватывает цельную кровь и фракции крови, какие как сыворотка и плазма.

Обзор

Синдром Альпорта является врожденной формой заболевания почек, при которой вырабатывается аномальный уровень базальной мембраны почечных клубочков (GBM), что приводит к интерстициальному фиброзу, клубочковому склерозу и, как правило, приводит к терминальной стадии почечной недостаточности. При проведении лечения синдрома Альпорта основной целью лечения является поддержание функции почек и предупреждение начала развития терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD), что в свою очередь продлевает продолжительность жизни субъектов с синдромом Альпорта.

Синдром Альпорта характеризуется прогрессивным фиброзом вследствие нарушений в составе GBM, таким образом, необходимы улучшения морфологии GBM и функции почек.

Ранее режимы дозировки для RG-012, раскрытые в регистре клинических испытаний, представляли собой фиксированные дозы, составляющие 110 мг в неделю и 220 мг в неделю. Анализ фармакокинетических данных от нескольких видов в доклинических моделях, а также от здоровых добровольцев в исследовании с многократным введением увеличивающихся доз показал, что рассчитанная по весу доза, составляющая 1,5 мг/кг, вводимая с менее частым интервалом, составляющим один раз в две недели, будет тем режимом дозирования, который является одновременно эффективным и достаточно безопасным.

Некоторые модифицированные олигонуклеотиды

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет структуру 5'-A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E-3' (SEQ ID NO: 3), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса обозначают β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" обозначают 2'-MOE-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим индексом "S" обозначают S-cEt-нуклеозиды; и каждая межнуклеозидная связь является фосфотиоатной межнуклеозидной связью.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет структуру:

(SEQ ID NO: 3).

В данном документе также предусмотрены фармацевтически приемлемые соли модифицированного олигонуклеотида. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет структуру:

(SEQ ID NO: 3) или ее фармацевтически приемлемой соли. Неограничивающая иллюстративная фармацевтически приемлемая соль модифицированного олигонуклеотида имеет структуру

(SEQ ID NO: 3).

В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемая соль модифицированного олигонуклеотида содержит меньше катионных противоионов (таких как Na⁺), чем имеется фосфотиоатных связей на молекулу (т. е., некоторые фосфотиоаты являются протонированными). В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемая соль модифицированного олигонуклеотида содержит менее 18 катионных противоионов (таких как Na⁺) на молекулу модифицированного олигонуклеотида. То есть в некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемая соль модифицированного олигонуклеотида может содержать в среднем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 катионных противоионов на молекулу модифицированного олигонуклеотида, причем оставшийся фосфотиоат является протонированным.

Определенные пути применения настоящего изобретения

В данном документе предусмотрены способы лечения синдрома Альпорта, включающие введение субъекту с синдромом Альпорта или с подозрением на него, модифицированного олигонуклеотида, предусмотренного в данном документе.

В определенных вариантах осуществления субъект имел диагноз синдрома Альпорта перед введением модифицированного олигонуклеотида. Диагностику синдрома Альпорта можно осуществлять путем оценки параметров, включая без ограничений семейный анамнез субъекта, клинические признаки (включая без ограничений протеинурию, альбуминурию, гематурию, нарушенную GFR, например, определенную с помощью измерения eGFR, глухоту и/или изменения в отношении глаза) и результаты исследований биоптатов тканей. Биоптаты почек можно тестировать на наличие или отсутствие альфа-3, альфа-4 и альфа-5 цепей коллагена IV типа. Кроме того, с помощью электронной микроскопии материала биоптата почки можно выявлять структурные изменения в клубочках. Биоптат кожи можно тестировать на наличие цепи альфа-5 коллагена IV типа, которая в норме присутствует в коже и почти всегда отсутствует у субъектов-мужчин с X-сцепленной формой синдрома Альпорта. Диагностика синдрома Альпорта также может включать скрининг в отношении мутаций в одном или нескольких из генов Col4a3, Col4a4 или Col4a5.

В определенных вариантах осуществления субъект с синдромом Альпорта имеет eGFR, составляющую по меньшей мере 30 мл/мин/1,73 м². В определенных вариантах осуществления субъект с синдромом Альпорта имеет eGFR, составляющую 45-90 мл/мин/1,73 м². В определенных вариантах осуществления у субъекта с синдромом Альпорта имеется уровень протеинурии, равный 300 мг белка/г креатинина или больше.

В определенных вариантах осуществления уровни miR-21 повышены в почках субъекта с синдромом Альпорта. В определенных вариантах осуществления перед введением определяют, что у субъекта в почке имеется повышенный уровень miR-21. Уровни miR-21 можно измерять на основании материала биоптата почки. В определенных вариантах осуществления перед введением определяют, что у субъекта в моче или крови субъекта имеется повышенный уровень miR-21.

В определенных вариантах осуществления введение модифицированного олигонуклеотида, комплементарного miR-21, приводит к улучшению в отношении одного или нескольких параметров, связанных с синдромом Альпорта. В определенных вариантах осуществления введение обеспечивает повышение расчетной скорости клубочковой фильтрации. В определенных вариантах осуществления введение обеспечивает повышение измеренной скорости клубочковой фильтрации. В определенных вариантах осуществления введение замедляет скорость снижения скорости клубочковой фильтрации. В определенных вариантах осуществления введение улучшает качество жизни субъекта.

В определенных вариантах осуществления введение улучшает функцию почек. В определенных вариантах осуществления введение позволяет отсрочить начало развития терминальной стадии почечной недостаточности. В определенных вариантах осуществления введение позволяет отсрочить время до диализа. В определенных вариантах осуществления введение позволяет отсрочить время до трансплантации почки. В определенных вариантах осуществления введение увеличивает продолжительность жизни субъекта.

В определенных вариантах осуществления введение снижает степень фиброза почек. В определенных вариантах осуществления введение замедляет дальнейшее прогрессирование фиброза почек. В определенных вариантах осуществления введение прекращает дальнейшее прогрессирование фиброза почек. В определенных вариантах осуществления введение снижает степень гематурии. В определенных вариантах осуществления введение позволяет отсрочить начало развития гематурии. В определенных вариантах осуществления введение снижает уровень протеинурии. В определенных вариантах осуществления введение позволяет отсрочить начало развития протеинурии.

Субъект, имеющий или предположительно имеющий синдром Альпорта, может иметь мутацию в гене, кодирующем цепь альфа 3 коллагена IV типа (Col4a3), мутацию в гене, кодирующем цепь альфа 4 коллагена IV типа (Col4a4) или мутацию в гене, кодирующем цепь альфа 5 коллагена IV типа (Col4a5). В определенных вариантах осуществления субъектом является мужчина. В определенных вариантах осуществления субъектом является женщина.

В определенных вариантах осуществления субъект имеет нарушенную функцию почек. В определенных вариантах осуществления субъект нуждается в улучшенной функции почек. В определенных вариантах осуществления субъекта идентифицируют как имеющего нарушенную функцию почек. В определенных вариантах осуществления субъекта идентифицируют как имеющего гематурию. В определенных вариантах осуществления субъекта идентифицируют как имеющего протеинурию.

В любых из вариантов осуществления, предусмотренных в данном документе, субъекту можно проводить определенные пробы для оценки функции почек. Такие пробы включают без ограничения измерение уровня азота мочевины в крови у субъекта; измерение уровня креатинина в крови субъекта; измерение в крови у субъекта клиренса креатинина; измерение у субъекта уровня протеинурии; измерения у субъекта соотношения альбумин:креатинин; измерение у субъекта расчетной скорости клубочковой фильтрации; и измерение у субъекта количества выделяемой мочи.

В определенных вариантах осуществления подоцитурию у субъекта оценивают путем анализа количества подоцитов и подоцит-специфичных mRNA в моче субъекта.

В любом из вариантов осуществления, предусмотренных в данном документе, белки, присутствующие в моче или крови, можно использовать для оценки функции почек. Такие пробы в отношении функции почек включают без ограничений измерение уровня белка N-ацетил-β-D-глюкозаминидаза (NAG) в моче субъекта; измерение уровня белка нейтрофильный желатиназа-ассоциированный липокалин (NGAL) в моче субъекта; измерение уровня белка молекула-1 повреждения почек (KIM-1) в моче субъекта; измерение уровня белка интерлейкин-18 (IL-18) в моче субъекта; измерение уровней фактора роста соединительной ткани (CTGF) в моче субъекта; измерение уровней моноцитарного хемоаттрактантного белка 1 (MCP1) в моче субъекта; измерение уровня фрагментов коллагена IV (Col IV) в моче субъекта; измерение уровней фрагментов коллагена III (Col III) в моче субъекта; измерение уровня цистатина C в крови субъекта; измерение уровня белка β-trace protein (BTP) в крови субъекта; и измерение уровня 2-микроглобулина (B2M) в крови субъекта. В любом из вариантов осуществления, предусмотренных в данном документе, маркеры поражения подоцитов можно измерить в моче. Такие белки включают нефрин и подоцин. Можно производить количественный анализ белков, например, при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммуноанализа (RIA), используя коммерчески доступные наборы.

В любом из вариантов осуществления, предусмотренных в данном документе, введение модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на miR-21, обеспечивает улучшение в отношении одного или нескольких маркеров функции почек у субъекта. Улучшения в отношении маркеров функции почек включают без ограничения: пониженный уровень азота мочевины в крови у субъекта; пониженный уровень креатинина в крови субъекта; улучшенный клиренс креатинина у субъекта; уменьшенный уровень протеинурии у субъекта; сниженное соотношение альбумин:креатинин у субъекта; улучшенную расчетную скорость клубочковой фильтрации у субъекта; и/или увеличенное количество выделяемой мочи у субъекта.

Некоторые фармацевтические композиции

В данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 19 связанных нуклеозидов и имеющий структуру 5'-A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E-3' (SEQ ID NO: 3), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" представляют собой 2'-MOE-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим индексом "S" представляют собой S-cEt-нуклеозиды, и каждая межнуклеозидная связь является фосфотиоатной межнуклеозидной связью; или ее фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых таких вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид присутствует в фармацевтической композиции в виде своей октадеканатриевой соли. Если не указано иное, значения веса и дозы модифицированного олигонуклеотида 5'-A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E-3' (SEQ ID NO: 3) рассчитаны по весу модифицированного олигонуклеотида в форме октадеканатриевой соли. В качестве неограничивающего примера 110 мг модифицированного олигонуклеотида в форме октадеканатриевой соли эквивалентно 103,6 мг модифицированного олигонуклеотида в форме свободной кислоты.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию получают для инъекции. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, полученная для инъекции, содержит модифицированный олигонуклеотид в концентрации 110 мг/мл в стерильном водном растворе. Подходящие пути введения посредством инъекции включают подкожную и внутривенную инъекции.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, предусмотренную в данном документе, вводят в форме болюсной единицы дозирования. В некоторых вариантах осуществления болюсная единица дозирования содержит модифицированный олигонуклеотид в концентрации 110 мг/мл в стерильном водном растворе. В некоторых вариантах осуществления болюсная единица дозирования содержит модифицированный олигонуклеотид в концентрации 110 мг/мл в стерильном 0,3% водном растворе хлорида натрия. В некоторых вариантах осуществления для обеспечения дозы модифицированного олигонуклеотида, составляющей 110 мг, субъекту вводят болюсную единицу дозирования объемом 1 мл, содержащую 110 мг/мл модифицированного олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления введение осуществляют путем подкожной инъекции.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид предоставлен в виде стерильного лиофилизированного модифицированного олигонуклеотида, который восстанавливают в подходящем разбавителе, например в водном растворе, таком как вода или физиологически совместимые буферы, такие как солевой раствор, раствор Хэнка и раствор Рингера. Восстановленный продукт могут вводить в виде подкожной инъекции или в виде внутривенной инфузии. Лиофилизированный лекарственный препарат состоит из модифицированного олигонуклеотида, который был получен в стерильном водном растворе для инъекций, доведен во время получения до pH 7,0-9,0 с помощью кислоты или основания и затем лиофилизирован. Лиофилизированный лекарственный препарат может быть упакован во флакон типа I из прозрачного стекла объемом 2 мл, закрытый резиновой пробкой и укупоренный алюминиевым колпачком.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно находящиеся в фармацевтических композициях, при их уровнях применения, установленных в области техники. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, содержат один или несколько наполнителей. В таких определенных вариантах осуществления наполнители выбраны из воды, солевых растворов, спирта, полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, стеарата магния, талька, кремниевой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.

Некоторые дополнительные типы терапии

Способы лечения синдрома Альпорта могут включать введение модифицированного олигонуклеотида anti-miR-21, предусмотренного в данном документе, и по меньшей мере один дополнительный тип терапии. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный тип терапии предусматривает фармацевтическое средство.

В определенных вариантах осуществления до введения первой дозы модифицированного олигонуклеотида субъект с синдромом Альпорта получал лечение с помощью дополнительной терапии при стабильном режиме дозирования в течение по меньшей мере 30 дней. В определенных вариантах осуществления субъект получал блокаторы рецептора ангиотензина II при стабильном режиме дозирования. В определенных вариантах осуществления субъект получал ингибитор ангиотензин II-превращающего фермента при стабильном режиме дозирования.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный тип терапии предусматривает фармацевтическое средство.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают блокаторы рецепторов ангиотензина II (ARB). В определенных вариантах осуществления блокатор рецепторов ангиотензина II представляет собой кандесартан, ирбесартан, олмесартан, лозартан, валсартан, телмисартан или эпросартан.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают ингибиторы ангиотензин II-превращающего фермента (ACE). В определенных вариантах осуществления ингибитором ACE является каптоприл, эналаприл, лизиноприл, беназеприл, хинаприл, фозиноприл или рамиприл.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой антигипертензивное средство. Антигипертензивные средства применяют для регулирования кровяного давления субъекта.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой аналог витамина D. Аналоги витамина D можно применять для ограничения у субъекта выработки паратиреоидного гормона.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой пероральное связывающее фосфаты вещество, которое снижает абсорбцию фосфора из рациона.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают иммуносупрессивные средства. В определенных вариантах осуществления иммуносупрессивное средство представляет собой кортикостероид, циклофосфамид или микофенолата мофетил.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой циклоспорин, ингибитор HMG-кофермента A, ингибитор вазопептидазы или антагонист TGF-бета.

В определенных вариантах осуществления дополнительный тип терапии представляет собой генную терапию. В определенных вариантах осуществления генная терапия обеспечивает нормальный ген Col4a3. В определенных вариантах осуществления генная терапия обеспечивает нормальный ген Col4a4. В определенных вариантах осуществления генная терапия обеспечивает нормальный ген Col4a5.

В определенных вариантах осуществления дополнительным типом терапии является диализ. В определенных вариантах осуществления дополнительным типом терапии является трансплантация почки.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой антагониста альдостерона. В определенных вариантах осуществления антагонистом альдостерона является спиронолактон.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противовоспалительные средства. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой стероидное противовоспалительное средство. В определенных вариантах осуществления стероидное противовоспалительное средство представляет собой кортикостероид. В определенных вариантах осуществления кортикостероид представляет собой преднизон. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой нестероидное противовоспалительное лекарственное средство. В определенных вариантах осуществления нестероидным противовоспалительным средством является ибупрофен, ингибитор COX-I или ингибитор COX-2.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой фармацевтическое средство, которое блокирует один или несколько ответов на фиброгенные сигналы.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противодиабетическое средство. Противодиабетические средства включают без ограничения бигуаниды, ингибиторы глюкозидазы, инсулины, производные сульфонилмочевины и тиазолидиндионы.

Некоторые модификации

Модифицированный олигонуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеозиды с модифицированным сахаром и модифицированные межнуклеозидные связи.

При выборе модифицированным нуклеиновому основанию, сахару и/или межнуклеозидной связи могут отдавать предпочтение перед немодифицированными формами в связи с наличием необходимых свойств, таких как, например, повышенное поглощение клетками, повышенное сродство в отношении других мишеней, представляющих собой олигонуклеотиды или нуклеиновую кислоту, и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Нуклеозиды с модифицированным сахаром предусматривают бициклические сахарные фрагменты. В таких определенных вариантах осуществления бициклический сахарный фрагмент представляет собой D-сахар в альфа-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления бициклический сахарный фрагмент представляет собой D-сахар в бета-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления бициклический сахарный фрагмент представляет собой L-сахар в альфа-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления бициклический сахарный фрагмент представляет собой L-сахар в бета-конфигурации.

Нуклеозиды, содержащие такие бициклические сахарные фрагменты, называют бициклическими нуклеозидами или BNA. В некоторых вариантах осуществления бициклические нуклеозиды включают без ограничения (A) α-L-метиленокси-(4'-CH₂-O-2')-BNA; (B) β-D-метиленокси-(4'-CH₂-O-2')-BNA; (C) этиленокси-(4'-(CH₂)₂-O-2')-BNA; (D) аминоокси-(4'-CH₂-O-N(R)-2')-BNA; (E) оксиамино-(4'-CH₂-N(R)-O-2')-BNA; (F) метил(метиленокси) (4'-CH(CH₃)-O-2')-BNA (также называемый конформационно закрепленным этилом или cEt); (G) метилен-тио-(4'-CH₂-S-2')-BNA; (H) метилен-амино (4'-CH2-N(R)-2')-BNA; (I) метил-карбоциклический (4'-CH₂-CH(CH₃)-2')-BNA; (J) c-MOE-(4'-CH₂-OMe-2')-BNA и (K) пропилен-карбоциклический (4'-(CH₂)₃-2')-BNA, как изложено ниже.

где Bx представляет собой фрагмент нуклеинового основания, и R независимо представляет собой H, защитную группу или C₁-C₁₂алкил.

В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из F, OCF_3, O-CH₃, OCH₂CH₂OCH₃, 2'-O(CH₂)₂SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(CH₃)₂, -O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂ и O-CH₂-C(=O)-N(H)CH₃.

В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из F, O-CH₃ и OCH₂CH₂OCH₃.

В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-2'-модифицированный нуклеозид. 4'-Тио-модифицированный нуклеозид содержит β-D-рибонуклеозид, где 4'-O заменен на 4'-S. 4'-Тио-2'-модифицированный нуклеозид представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид, содержащий 2'-OH, замененный 2'-замещающей группой. Подходящие 2'-замещающие группы включают 2'-OCH₃, 2'-O-(CH₂)₂-OCH₃ и 2'-F.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одну или несколько межнуклеозидных модификаций. В таких определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь содержит атом фосфора.

В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.

Некоторые наборы

Настоящее изобретение также предусматривает наборы. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат модифицированный олигонуклеотид anti-miR-21, предусмотренный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид может находиться во флаконе. Несколько флаконов, например 10, могут находиться, например, в распределительных упаковках. В некоторых вариантах осуществления флакон изготовлен так, чтобы он был доступным для шприца. Набор также может содержать инструкции по применению модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления наборы могут применяться для введения модифицированного олигонуклеотида. В таких случаях в дополнение к модифицированному олигонуклеотиду набор может дополнительно содержать один или несколько из следующего: шприц, тампон, пропитанный спиртом, ватный шарик и/или марлевую прокладку. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид может находиться в предварительно наполненном шприце (например, шприцах с разовой дозой, например, с калибром иглы 27, иглой ½ дюйма с колпачком иглы) вместо флакона. Несколько предварительно заполненных шприцов, например 10, могут находиться, например, в распределительных упаковках. Набор может также содержать инструкции по введению модифицированного олигонуклеотида.

Некоторые экспериментальные модели

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы применения и/или тестирования модифицированных олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению на экспериментальной модели. Специалисты в данной области техники имеют возможность выбирать и модифицировать протоколы для таких экспериментальных моделей для оценки фармацевтического средства согласно настоящему изобретению.

Обычно модифицированные олигонуклеотиды сначала тестируют на культивируемых клетках. Подходящие типы клеток включают те, которые относятся к типу клеток, для которого необходима доставка модифицированного олигонуклеотида in vivo. Например, подходящие типы клеток для изучения способов, описанных в данном документе, включают эмбриональные или культивируемые клетки.

В определенных вариантах осуществления степень, в которой модифицированный олигонуклеотид препятствует активности miR-21, оценивают на культивируемых клетках. В определенных вариантах осуществления ингибирование активности miR-21 можно оценивать путем измерения уровней miR-21 в клетке или ткани. В качестве альтернативы, можно измерять уровень предсказанного или подтвержденного microRNA-регулируемого транскрипта. Ингибирование активности miR-21 может привести к повышению количества miR-21-регулируемого транскрипта и/или белка, кодируемого miR-21-регулируемым транскриптом. Кроме того, в определенных вариантах осуществления можно измерять некоторые фенотипические результаты.

Несколько животных моделей доступны специалистам в данной области техники для изучения miR-21 на моделях заболевания человека. Например, ингибиторы miR-21 можно изучать на экспериментальной модели синдрома Альпорта, например на мышах, нокаутных по Col4a3 (мыши Col4a3 ^-/-). Тяжесть заболевания в мышиной модели зависит от генетического фона мыши, несущей мутацию в Col4a3. Например, начало развития и прогрессирование заболевания происходит обычно более быстро на фоне 129X1/SvJ по сравнению с фоном C57BL/6J. Соответственно, генетический фон мыши Col4a3 ^-/- можно выбрать для того, чтобы изменять начало развития и прогрессирование заболевания. Дополнительные модели включают экспериментальные модели на собаках X-сцепленного, аутосомно-рецессивного или аутосомно-доминантного синдрома Альпорта. См., например, Kashtan, Nephrol. Dial. Transplant, 2002, 17: 1359-1361.

Некоторые количественные анализы

Эффекты антисмыслового ингибирования miR-21 после введения модифицированного олигонуклеотида можно оценивать с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления такие способы применяют для проведения количественного анализа уровней microRNA в клетках или тканях in vitro или in vivo. В определенных вариантах осуществления изменения уровней microRNA измеряют с помощью микроматричного анализа. В определенных вариантах осуществления изменения уровней microRNA измеряют с помощью одного из нескольких коммерчески доступных ПЦР-анализов, таких как анализ microRNA TaqMan® (Applied Biosystems). В определенных вариантах осуществления антисмысловое ингибирование miR-21 оценивают путем измерения уровня мРНК и/или белка мишени miR-21. Антисмысловое ингибирование miR-21, как правило, приводит к повышению уровня мРНК и/или белка мишени microRNA.

Анализ захвата мишени

Модуляция активности microRNA с помощью anti-miR или имитатора microRNA можно оценивать путем измерения захвата мишени. В определенных вариантах осуществления захват мишени измеряют с помощью определения профиля мРНК с помощью микроматричного анализа. В последовательностях мРНК, которые модулируются (активность либо повышается, либо понижается) с помощью anti-miR или имитатора microRNA, выполняется поиск на предмет затравочных последовательностей microRNA для сравнения модуляции мРНК, которые являются мишенями microRNA, с модуляцией мРНК, которые не являются мишенями microRNA. Таким образом, можно оценивать взаимодействие anti-miR с miR-21 или имитатора miR-21 с его мишенями. В случае anti-miR проводится скрининг мРНК, уровни экспрессии которых повышены, на последовательности мРНК, которые содержат затравочную последовательность, соответствующую microRNA, с которой комплементарна anti-miR.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Однако их не следует рассматривать как ограничивающие широкий объем настоящего изобретения.

Специалистам в данной области техники будет легко позаимствовать основополагающие принципы данного открытия для разработки различных соединений без отклонения от сущности настоящего изобретения.

Пример 1. Исследование фазы 2 с участием субъектов с синдромом Альпорта

Исследование представляет собой рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое, мультицентровое, исследование фазы 2, проведенное с участием субъектов с синдромом Альпорта в нескольких исследовательских центрах. Синдром Альпорта представляет собой врожденную форму заболевания почек, обусловленную мутациями в генах, кодирующих коллаген IV базальной мембраны капилляра. С течением времени синдром Альпорта вызывает повреждение почек.

Исследуемым лекарственным средством является RG-012. Ранее режимы дозировки для RG-012, раскрытые в регистре клинических испытаний, представляли собой фиксированные дозы, составляющие 110 мг в неделю и 220 мг в неделю. Анализ фармакокинетических данных от нескольких видов в доклинических моделях, а также от здоровых добровольцев в исследовании с многократным введением увеличивающихся доз показал, что рассчитанная по весу доза, составляющая 1,5 мг/кг, вводимая с менее частым интервалом, составляющим один раз в две недели, будет тем режимом дозирования, который является одновременно эффективным и достаточно безопасным.

Активным ингредиентом (AI) в RG-012 является октадеканатриевая соль одноцепочечного, химически модифицированного олигонуклеотида из 19 оснований со структурой

5'-A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E-3' (SEQ ID NO: 3), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" представляют собой 2'-MOE-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим индексом "S" представляют собой S-cEt-нуклеозиды, и каждая межнуклеозидная связь является фосфотиоатной межнуклеозидной связью.

RG-012 составляют в виде водного раствора AI, содержащего 0,3% хлорида натрия, и вводят подкожным (SC) путем один раз в две недели.

В некоторых случаях в главном активном метаболите (AM) отсутствует 3'-концевой 2'-MOE-модифицированный "A"-нуклеозид

5'-A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_ST-3' (SEQ ID NO: 4), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" представляют собой 2'-MOE-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим индексом "S" представляют собой S-cEt-нуклеозиды, и каждая межнуклеозидная связь является фосфотиоатной межнуклеозидной связью.

Основной целью является оценка безопасности и переносимости RG-012 при введении раз в неделю в течение 48 недель. Безопасность и переносимость оценивают с помощью переменных, таких как побочные явления, лабораторные показатели, основные показатели состояния организма, ECG и реакции в месте инъекции.

Вторичные цели включают

оценку влияния RG-012 на другие выбранные биомаркеры крови, мочи и почек;

оценку фармакокинетических (PK) параметров исходного соединения (AI) и его главного активного метаболита (AM) после введения RG-012;

оценку потенциального образования антител к лекарственному средству (ADA) после введения RG-012;

оценку предварительной эффективности RG-012 в отношении снижения уровня ухудшения функции почек с течением времени;

оценку качества жизни (QoL) после введения RG-012 с применением опросника Short Form 36 Health Survey®.

Группы исследования	Назначенные вмешательства
Препарат сравнения, представляющий собой плацебо: 1 мл плацебо, один раз в неделю, 48 недель	Лекарственное средство: плацебо 2 мкг/мл рибофлавина в 0,9% хлорида натрия
Экспериментальная: 1,5 мг/кг RG-012, один раз в две недели, в течение 48 недель	Лекарственное средство: RG-012 для подкожной инъекции, поставляемый готовым для инъекции в виде состава с активным ингредиентом в 0,3% хлорида натрия с номинальной концентрацией 110 мг/мл

Двойной слепой, плацебо-контролируемый период лечения. Субъектов, подходящих для участия в исследовании, рандомизируют в соотношении 1:1:1 для получения каждые две недели (один раз в две недели) подкожных (SC) инъекций 1,5 мг/кг RG-012 или плацебо в течение 48 недель.

Исследователь может снижать индивидуальную дозу RG-012, которую субъект получает каждые две недели, до 0,75 мг/кг исходя из переносимости. Для субъектов, чьи двухнедельные дозы RG-012 были уменьшены до 0,75 мг/кг, их дозы также могут повторно корректировать обратно до 1,5 мг/кг по усмотрению исследователя.

Для субъектов, принимающих ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (ACE) или блокаторы рецепторов ангиотензина II (ARB), поддерживают стабильную дозу и режим введения этих средств в течение всего периода лечения с помощью активного препарата. Для всех других сопутствующих препаратов также поддерживают стабильный режим дозирования в течение исследования.

Открытый дополнительный период. Субъекты, завершающие 48 недель лечения, допускаются к отбору для участия в 48-недельном дополнительном исследовании, в котором все субъекты получают лечение с помощью активного препарата.

Период последующего наблюдения. После завершения лечения в рамках исследования все субъекты будут включены в 12-недельный период последующего наблюдения, который будет включать короткий визит на дому на неделе 2 последующего наблюдения, визит на дому на неделе 4 последующего наблюдения и визит в исследовательский центр на неделе 12 последующего наблюдения. Субъекты, которые завершают двойной слепой плацебо-контролируемый период лечения, но не включаются в открытый дополнительный период лечения, будут непосредственно включаться в период последующего наблюдения.

Критерии включения

1. Субъекты мужского пола возрастом от 18 до 65 лет (включительно)

2. Подтвержденный диагноз синдрома Альпорта (клинический, гистопатологический и/или генетический диагноз)

3. Согласно оценкам с помощью уравнения, учитывающего уровень креатинина и цистатина C, разработанного Сотрудничеством в области эпидемиологии хронических заболеваний почек (CKD-EPI), должны соблюдаться следующие параметры eGFR:

a. Значение eGFR при исходном скрининге составляет 40-90 мл/мин/1,73 м²;

b. Снижение eGFR, составляющее ≥5 мл/мин/1,73 м²/год, на основе анализа наклона линейной регрессии ≥4 значений eGFR за предыдущие 52 недели. Снижение eGFR, составляющее ≥5 мл/мин/1,73 м²/год, эквивалентное наклону eGFR, составляющему ≤ -5 мл/мин/1,73 м²/год. Наклон eGFR или изменение eGFR субъекта с течением времени, рассчитывали с применением линейной регрессии.

4. Протеинурия ≥300 мг белка/г креатинина при исходном скрининге и начальных визитах.

Субъекты без достаточного количества предыдущих измерений eGFR для обеспечения расчета наклона eGFR могут подойти по критериям отбора для исследования, если они являются мужчинами, у которых диагностировали XLAS, и чей возраст составляет 18-30 лет (включительно).

Субъекты, принимающие ингибитор ACE и/или ARB должны находиться в стабильном режиме дозирования ингибиторов ACE и/или ARB в течение ≥30 дней до скрининга.

Критерии исключения

1. Причины хронического заболевания почек помимо синдрома Альпорта (включая без ограничения диабетическую нефропатию, гипертоническую нефропатию, волчанку, нефропатию IgA).

2. ESRD, о чем свидетельствует постоянная диализная терапия или трансплантация почки в анамнезе.

3. Любое другое состояние или обстоятельство, которое, по мнению ответственного клинического исследователя, может сделать продолжение исследования или выполнение процедур и требований исследования субъектом маловероятным или может представлять риск для безопасности и хорошего самочувствия субъекта.

Фармакодинамические конечные точки включают изменение с течением времени фармакодинамических и биомаркерных конечных точек, включающих:

уровень азота мочевины в крови [BUN];

соотношение белок/альбумин и соотношение альбумин/креатинин в моче;

креатинин, цистатин C, молекула-1 повреждения почек [KIM-1], β-2-микроглобулин и кластерин как в сыворотке крови, так и в моче;

асимметричный диметиларгинин (ADMA), трансформирующий фактор роста-β (TGFβ), фактор роста соединительной ткани (CTGF) и липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL), как в сыворотке крови, так и в моче;

гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1), кальбиндин, интерлейкин-18 (IL-18) и эпидермальный фактор роста (EGF) в моче;

и подоцитурия, измеренная с помощью анализа на количество подоцитов и подоцит-специфичных mRNA в моче.

Фармакокинетические конечные точки включают концентрации в плазме и рассчитанные PK-параметры исходного соединения (AI) и его активного метаболита (AM).

Конечные точки эффективности включают:

наклон линейной регрессии для расчетной скорости клубочковой фильтрации (eGFR) от исходного уровня до 24, 48 и 96 недель;

абсолютное и процентное изменение значений eGFR от исходного уровня до 24, 48 и 96 недель;

процент субъектов с ответом на лечение от исходного уровня до 24, 48 и 96 недель, основанный на следующих определениях:

наклон eGFR > -2 мл/мин/1,73 м²/год

наклон eGFR > -5 мл/мин/1,73 м²/год

наклон eGFR > -10 мл/мин/1,73 м²/год

наклон eGFR > -15 мл/мин/1,73 м²/год;

<5% снижения значений eGFR относительно исходного уровня

<10% снижения значений eGFR относительно исходного уровня

<20% снижения значений eGFR относительно исходного уровня

<30% снижения значений eGFR относительно исходного уровня;

отличие наклона eGFR между периодом скрининга и периодом лечения;

число и процент субъектов, которые достигли терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD), определяющейся по eGFR ≤15 мл/мин/1,73 м² или началу гемодиализа или трансплантации почки; и

изменение с течением времени QoL, измеренного с применением опросника Short Form 36 Health Survey® (SF-36).

Предполагается, что доза 1,5 мг/кг RG-012, вводимая один раз в две недели субъекту с синдромом Альпорта, обеспечивает необходимый запас безопасности и приводит к улучшению в отношении конечных точек эффективности, например к поддержанию или улучшению функции почек.

Пример 2. Расчет скорости клубочковой фильтрации

Национальный почечный фонд предлагает несколько уравнений, разработанных Сотрудничеством в области эпидемиологии хронических заболеваний почек (CKD-EPI), для подсчета расчетной скорости клубочковой фильтрации (eGFR) у субъекта. Одно или несколько таких уравнений применяют для измерения eGFR у субъектов, прошедших скрининг и участвующих в исследовании фазы 2, описанном в данном документе.

Уравнение, учитывающее уровень креатинина, разработанное CKD-EPI (2009)

Выражено в виде одного уравнения: eGFR=141 × min(S_Cr/κ, 1)^α × max(S_Cr /κ, 1)^-1,209×0,993^{возраст} × 1,018 [ели женщина] × 1,159 [если афроамериканец]

Сокращения/единицы

eGFR (расчетная скорость клубочковой фильтрации) = мл/мин/1,73 м²

S_Cr (сывороточный креатинин) = мг/дл

S_cys (стандартизированный сывороточный цистатин C) = мг/л

κ=0,7 (женщины) или 0,9 (мужчины)

α = -0,248 (женщины) или -0,207 (мужчины)

min(S_Cr/κ или 1) = обозначает минимальное значение S_Cr/κ или 1

max(S_Cr/κ или 1) = обозначает максимальное значение S_Cr/κ или 1

min(S_cys/0,8, 1) = обозначает минимальное значение S_cys/0,8, 1

max(S_cys/0,8, 1) = обозначает максимальное значение S_cys/0,8, 1

возраст=лет.

Уравнение, учитывающее уровень креатинина и цистатина, разработанное CKD-EPI (2012)

Выражено в виде одного уравнения: eGFR=135 × min(S_Cr/κ, 1)^α × max(S_Cr/κ, 1)^-0,601 ×

min(S_cys/0,8, 1)^-0,375 max(S_cys/0,8, 1)^-0,711 × 0,995^{возраст} × 0,969 [если женщина] × 1,08 [если афроамериканец]

Сокращения/единицы

S_Cr (стандартизированное значение сывороточного креатинина) = мг/дл

κ=0,7 (женщины) или 0,9 (мужчины)

α = -0,329 (женщины) или -0,411 (мужчины)

min=обозначает минимальное значение S_Cr/κ или 1

max=обозначает максимальное значение S_Cr/κ или 1

возраст=лет.

Пример 3. Исследование фазы 1 с помощью биопсии

Исследование представляет собой исследование безопасности, фармакодинамики и фармакокинетики фазы 1 для RG-012, вводимого субъектам с синдромом Альпорта. Во время данного открытого исследования все субъекты, подходящие для участия в исследовании, будут получать RG-012. Исследование состоит из двух частей (часть A и часть B). Во время части A половина участников будет получать однократную дозу RG-012, половина будет получать 4 дозы RG-012 (по одной дозе раз в две недели в течение 6 недель). Все субъекты будут проходить две биопсии почек, одну до и одну после получения RG-012, чтобы оценить влияние RG-012 на почки. После завершения части A субъекты могут включаться в часть B исследования. В течение части B все субъекты будут получать RG-012 через каждые две недели в течение 48 недель.

Группы исследования	Назначенные вмешательства
Экспериментальная: Однократная доза RG-012 Подкожная инъекция 1,5 мг/кг RG012	Лекарственное средство: RG-012 RG-012 в 0,3% хлорида натрия
Экспериментальная: RG-012 через каждые две недели Подкожная инъекция 1,5 мг/кг RG-012 через каждые две недели	Лекарственное средство: RG-012 RG-012 в 0,3% хлорида натрия

Первичные критерии эффективности включают:

частоту возникновения и тяжесть побочных явлений; и

влияние RG-012 на содержание miR-21 в почках.

Вторичные критерии эффективности включают:

фармакокинетический (PK) параметр - Cmax (максимальная наблюдаемая концентрация в плазме)

фармакокинетический (PK) параметр - Tmax (время до достижения максимальной наблюдаемой концентрации в плазме)

фармакокинетический (PK) параметр - AUC (площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени).

Критерии включения

1. Мужчины или женщины в возрасте 18-65 лет.

2. Подтвержденный диагноз синдрома Альпорта.

3. Значение eGFR в диапазоне от 40 до 90 мл/мин/1,73 м²

4. Уровень протеинурии, составляющий по меньшей мере 300 мг белка/г креатинина.

5. Для субъектов, принимающих ингибитор ACE или ARB, режим дозирования должен быть стабилен в течение по меньшей мере 30 дней до скрининга.

6. Готовность соблюдать требования в отношении контрацепции.

Критерии исключения

1. Причины хронического заболевания почек помимо синдрома Альпорта (такие как диабетическая нефропатия, гипертоническая нефропатия, волчаночный нефрит, или IgA-нефропатия).

2. Терминальная стадия почечной недостаточности (ESRD), о чем свидетельствует постоянная диализная терапия или трансплантация почки в анамнезе.

3. Любое другое состояние, которое может представлять риск для безопасности и хорошего самочувствия субъекта.

4. Субъекты женского пола, которые являются беременными или кормят грудью.

влияние RG-012 на содержание miR-21 в почках.

В данном исследовании субъекты проходили биопсию почек до получения первой дозы RG-012 и после получения последней дозы RG-012. Собирают образцы крови. Выделяют РНК из почек и измеряют уровни miR-21. Измеряют уровни RG-012 в крови и ткани почек. Может осуществляться измерение miR-21-регулируемых транскриптов mRNA.

Предполагается, что введение дозы 1,5 мг/кг один раз в две недели обеспечивает достаточные уровни RG-012 в почках для блокирования (т. е., ингибирования) miR-21.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> REGULUS THERAPEUTICS INC.

<120> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА АЛЬПОРТА

<130> 01138-0037-00PCT

<150> US 62/501,699

<151> 2017-05-04

<160> 4

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 72

<212> РНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60

ggcugucuga ca 72

<210> 3

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический

<220>

<221> другой_признак

<222> (13)..(13)

<223> РНК

<400> 3

acatcagtct gauaagcta 19

<210> 4

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический

<220>

<221> другой_признак

<222> (13)..(13)

<223> РНК

<400> 4

acatcagtct gauaagct 18

<---

Claims

1. Способ лечения синдрома Альпорта, включающий введение пациенту с синдромом Альпорта двух или более доз модифицированного олигонуклеотида, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов и имеет структуру 5'–A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E–3' (SEQ ID NO: 3), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β–D–дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" представляют собой 2'–MOE–нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" представляют собой S–cEt–нуклеозиды, и каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь и где дозу, составляющую 1,5 мг/кг, вводят с частотой две недели между дозами.

2. Способ по п. 1, в котором дозу доставляют в фармацевтически приемлемом разбавителе.

3. Способ по п. 2, в котором фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой солевой раствор.

4. Способ по п. 3, в котором солевой раствор представляет собой 0,3% раствор хлорида натрия.

5. Способ по любому из пп. 2–4, в котором концентрация модифицированного олигонуклеотида в фармацевтически приемлемом разбавителе составляет по меньшей мере 110 мг/мл.

6. Способ по любому из пп. 1–5, в котором доза представляет собой одну болюсную инъекцию 110 мг/мл модифицированного олигонуклеотида.

7. Способ по любому из пп. 1–6, в котором фармацевтическую композицию вводят в виде подкожной инъекции.

8. Способ по п. 7, в котором подкожную инъекцию вводят в переднюю брюшную стенку пациента.

9. Способ по любому из пп. 1–8, включающий отбор пациента, у которого синдром Альпорта диагностирован с применением клинических, гистопатологических и/или генетических критериев.

10. Способ по любому из пп. 1–9, в котором пациент имеет расчетную скорость клубочковой фильтрации, составляющую 30 мл/мин/1,73 м², до получения первой дозы модифицированного олигонуклеотида.

11. Способ по п. 15, в котором пациент имеет расчетную скорость клубочковой фильтрации (eGFR), находящуюся в диапазоне от 45 до 90 мл/мин/1,73 м², до получения первой дозы модифицированного олигонуклеотида.

12. Способ по любому из пп. 1–11, в котором расчетная скорость клубочковой фильтрации у пациента снижается со скоростью ≥5 мл/мин/1,73 м²/год до получения первой дозы модифицированного олигонуклеотида.

13. Способ по любому из пп. 1–12, в котором пациентом является мужчина, у которого диагностирована X–сцепленная форма синдрома Альпорта, и чей возраст составляет от 18 до 30 лет.

14. Способ по любому из пп. 1–13, в котором у пациента имеется уровень протеинурии, составляющий более 300 миллиграммов белка на грамм креатинина, до получения первой дозы модифицированного олигонуклеотида.

15. Способ по любому из пп. 1–14, в котором у пациента после введения модифицированного олигонуклеотида наблюдается улучшение в отношении одного или нескольких параметров, связанных с синдромом Альпорта, выбранных из группы, состоящей из

16. Способ по любому из пп. 1–15, в котором у пациента после введения модифицированного олигонуклеотида проявляется улучшение в отношении одного или нескольких почечных биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из

a. miR–21 в ткани, полученной при биопсии;

b. уровня азота мочевины в крови;

c. соотношения белок/альбумин в моче;

d. соотношения альбумин/креатин в моче;

e. креатинина;

f. подоцитурии в моче;

g. молекулы–1 повреждения почек;

h. бета–2–микроглобулина;

i. кластерина;

j. цистатина C;

k. асимметричного диметиларгинина;

l. трансформирующего фактора роста бета;

m. фактора роста соединительной ткани; и

17. Способ по любому из пп. 1–16, в котором один или более маркеров из числа креатинина, цистатина C, молекулы–1 повреждения почек, бета–2–микроглобулина и/или кластерина измеряют в образце крови пациента.

18. Способ по любому из пп. 1–16, в котором один или более маркеров из числа креатинина, цистатина C, молекулы–1 повреждения почек, бета–2–микроглобулина и/или кластерина измеряют в образце мочи пациента.

19. Способ по любому из пп. 1–18, в котором пациент получал лечение в виде ингибитора ангиотензин II–превращающего фермента (ACE) в течение по меньшей мере 30 дней до получения первой дозы олигонуклеотида.

20. Способ по любому из пп. 1–19, в котором пациент получал лечение в виде блокатора рецепторов ангиотензина II (ARB) в течение по меньшей мере 30 дней до получения первой дозы олигонуклеотида.

21. Способ по п. 19, в котором ингибиторы ангиотензин II–превращающего фермента (ACE) выбраны из каптоприла, эналаприла, лизиноприла, беназеприла, хинаприла, фозиноприла и рамиприла.

22. Способ по п. 20, в котором блокаторы рецепторов ангиотензина II (ARB) выбраны из кандесартана, ирбесартана, олмесартана, лозартана, валсартана, телмисартана и эпросартана.

23. Способ по любому из пп. 1–22, в котором пациенту вводят по меньшей мере 24 дозы.

24. Способ лечения синдрома Альпорта у пациента, включающий:

a. отбор пациента, у которого синдром Альпорта диагностирован с применением клинических, гистопатологических и/или генетических критериев;

b. введение пациенту двух или более доз фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов и имеет структуру 5'–A_EC_SATC_SAGTC_STGAU_SAAGC_STA_E–3' (SEQ ID NO: 3), где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β–D–дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "E" представляют собой 2'–MOE–нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" представляют собой S–cEt–нуклеозиды, и каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь, где доза модифицированного олигонуклеотида составляет 1,5 мг/кг и где дозы вводят с частотой две недели между дозами;

c. где у пациента после введения фармацевтической композиции проявляется улучшение в отношении одного или нескольких параметров, связанных с AS, выбранных из

ii. скорости снижения eGFR; и

25. Способ лечения синдрома Альпорта у пациента, включающий:

a. отбор пациента, у которого синдром Альпорта диагностирован с применением клинических, гистопатологических и/или генетических критериев, где пациент имеет

iii. уровень протеинурии, равный 300 мг белка/г креатинина или больше; и

iv. получал лечение в виде ингибитора ACE и/или ARB со стабильным режимом дозирования в течение по меньшей мере 30 дней;

c. где у пациента после введения фармацевтической композиции проявляется улучшение в отношении одного или нескольких параметров, связанных с синдромом Альпорта, выбранных из

ii. скорости снижения eGFR; и

26. Способ уменьшения уровня снижения функции почек с течением времени у пациента с синдромом Альпорта, включающий:

a. отбор пациента, у которого диагностирован синдром Альпорта, подтвержденный с помощью клинических, гистопатологических и/или генетических критериев, где пациент имеет

ii. скорости снижения eGFR; и

27. Способ по любому из пп. 1–26, в котором модифицированный олигонуклеотид имеет структуру:

28. Способ по п. 27, в котором модифицированный олигонуклеотид присутствует в виде фармацевтически приемлемой соли структуры.

29. Способ по п. 28, в котором модифицированный олигонуклеотид присутствует в виде натриевой соли структуры.

30. Способ по любому из пп. 1–29, в котором модифицированный олигонуклеотид имеет структуру:

(SEQ ID NO: 3).

31. Способ по любому из пп. 10–30, в котором расчетную скорость клубочковой фильтрации рассчитывают с применением уравнения, учитывающего уровень креатинина, разработанного Сотрудничеством в области эпидемиологии хронических заболеваний почек (CKD–EPI).

32. Способ по любому из пп. 10–30, в котором расчетную скорость клубочковой фильтрации рассчитывают с применением уравнения, учитывающего уровень креатинина и цистатина С, разработанного Сотрудничеством в области эпидемиологии хронических заболеваний почек (CKD–EPI).