TW202346862A - 目標物質的檢測方法及試劑 - Google Patents

Abstract

(課題) 提供能夠比目前技術更高靈敏度且價格便宜地檢測試樣中的目標物質的技術。 (解決方法) 一種目標物質檢測方法，包含：在第1反應場所中，藉由在固定在固相的第2捕捉物質、和用標示物質標示的第1捕捉物質之間，將目標物質夾在中間《做成三明治》（sandwich），形成複合體；將含標示物質部分由前述複合體分離後，藉由離心力，使這些在充填於管狀通道內的液體中移動，藉著含標示物質部分散射產生的散射光，檢測前述含標示物質部分。

Description

目標物質的檢測方法及試劑

本發明係有關於檢測試樣中的目標物質的檢測方法及試劑，特別是有關於能夠高靈敏度（high sensitivity）又價格便宜（inexpensive）地檢測的檢測方法及試劑。 [技術背景]

傳統上，已知免疫測定法（Immunoassays）係藉由檢測與疾病相關的特定的抗原或抗體作為生物標記（biomarkers）來定性或定量分析疾病的發現或治療的效果等。近年來，針對檢測更有效的生物標記物（biomarkers）的目標，對用於檢測微量生物標記的高靈敏度檢測（high sensitivity detection）的需求不斷增加。免疫測定法之一的酵素結合免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay）《本說明書中也稱為『ELISA法』》係用特異性抗體（specific antibody）或目標抗體（target antibody）結合的抗原、互補的核酸，捕捉試樣溶液中所含有的目標抗原、抗體或核酸的同時，利用酶促反應來檢測的方法；由於成本等的優勢而被廣泛使用。

酵素結合免疫吸附分析法（ELISA），係可以定量檢測目標物質的檢測方法，現今普遍採用的酵素結合免疫吸附分析法（ELISA），係在96小井（well）微量盤（microplate）上進行作業，步驟數量多，變成需要繁雜的作業；又，因為經過複數的反應步驟，獲得測量結果需要大量的勞動和時間，因此，尋求縮短作業時間和反應時間；還有，也尋求更進一步的高靈敏度檢測。

為了達成高靈敏度檢測，被認為要提高酵素（enzyme）和受質（substrate）的反應性；因此，提出將附加了信息（reporter）的免疫複合體（immune complex）《標示化合物（labelled compound）》從固態游離出來，使其在自由液體介質（free liquid medium）中反應的技術《專利文獻1》。於此專利文獻1中，將生物素（biotin）或功能化偶氮染料（functionalized azo dyes）和卵白素（avidin）引入免疫複合體，設計成免疫複合體的構造成分；舉例來說，作為標示化合物，以鏈黴親和素－生物素鍵結（streptavidin-biotin binding）為媒介，製備與信息基團（reporter group）結合之物；在固相上形成免疫複合體，以鏈黴親和素－生物素鍵結（streptavidin-biotin binding）為媒介，將信息基團引入免疫複合體。然後，加入過量的鏈黴親和素（streptavidin），複合體中的鏈黴親和素，被加入的鏈黴親和素取代，免疫複合體中的信息分子游離出來。所以，於此技術中，檢測在自由液體介質內的信息分子，可以關連到檢體中的被檢物濃度。

又，要高靈敏度檢測免疫複合體，開發了藉由微細加工技術，在微米級（micrometer scale；μm scale）的微小容器中進行反應的微型反應器（microreactor），使用反應場所變成為小空間的微型反應器的話，可以期待反應速度被提升。運用微小流徑或反應腔室（reaction chamber）在微型反應器上實現淬取或分離等的實驗作業，這樣的情形稱為晶片上實驗室（Lab-on-a-Chip）。因此，有人提出在圓盤型的碟片（disc）上作成微型反應器，藉由旋轉產生的離心力，分配試樣液體，分離生物材料（biological material）《專利文獻2》。又，也有人提出在圓盤型的碟片（disk）上作成複數的腔室（chambers）或流徑（flow path）、儲器（reservoir）等，藉由使碟片旋轉，執行試劑的液體輸送和廢液，將在小井中以手動方式進行的免疫測定的程序（procedure）以微型反應器執行《專利文獻3》。

在這個微型反應器中的免疫測定，以檢測低濃度的目標物質為目標，使用標示珠（labelled beads）的方法《專利文獻4》已經被提出。舉例來說，於專利文獻4中，顯示設計了已充填在表面有抗體改質（modify）的標示珠的珠子（beads）充填部分或檢測區域的圓盤形狀的碟片，因而，揭示：注入碟片的試樣異體中的抗原被標示珠上的抗體捕捉的同時，在標示珠上與抗原鍵結的標示珠複合體，藉由碟片的旋轉，被送出到檢測區域，被固定在檢測區域的抗體捕捉到；因此在檢測區域已固定狀態的標示珠複合體，藉由光碟片設備的光學讀取裝置計算數量，檢測試樣中的目標物質。

另一方面，使用碟片（disc）的分析方法中，在設計在碟片的反應場所內，混合攜帶抗原（antigen carrying）珠子和螢光免疫球蛋白G抗體標示試劑（Fluorescent IgG antibody labeling reagent）和試樣（sample），使其與目標物質結合，形成複合體後，藉由使碟片旋轉產生的離心力，從反應場所將珠子引入已填充了密度梯度（density gradient）介質（medium）的分離腔室，藉由電磁照射束（electromagnetic irradiation beam）的照射，檢測複合體，提出這種檢測方法。分離腔室中已充填密度梯度介質，引入的珠子靠著離心力移動至密度梯度介質中的等密度點（isodensity point）而靜止於該處；然後，藉由檢測發自等密度點的螢光，可以檢測目標的免疫複合體。依據此分析方法，沒有與不同於珠子等密度點的免疫複合體結合的剩餘螢光標示等，可以和目標免疫複合體分離不必進行清洗程序也可以檢測免疫複合體《專利文獻5》。

[專利文獻]

[專利文獻1] 特表平6-505802號公報 [專利文獻2] 特開2008-185423號公報 [專利文獻3] 特表2002-503331號公報 [專利文獻4] 特開2012-255772號公報 [專利文獻5] 特表2006-505766號公報

[發明所要解決的問題]

但是，於專利文獻1所記載的技術，僅僅揭示：使標示物質的信息分子游離於自由液體介質，於該液體中與受質反應，希望可以檢測低濃度的目標物質的檢測敏感度提高或反應性提高的表現則不充分。

於專利文獻2中，並未揭示任何有關高靈敏度地進行免疫測定法。於專利文獻3中，傳統的酵素結合免疫吸附分析法（ELISA法）的步驟，只是一個在微型反應器（microreactor）裡的實現；更進一步，於微型反應器，由於將反應場所變小，可以提高反應速度和反應性的另一方面，也有因反應容量變小產生信號強度變小的問題；因此，利用專利文獻2和專利文獻3所記載的技術實施免疫測定的情形時，高靈敏度的檢測器或相機成為必要，變成有高成本的問題。

專利文獻4中，揭示：將待檢對象作成標示珠，使用通用的光碟片執行免疫測定的技術。一般來說，微型反應器（microreactor）中的粒狀物的運送變成阻塞的原因，於專利文獻4的技術，在檢測區域將抗體固定，由於捕捉攜帶流至該檢測區域的抗原的標示珠，部分標示珠的積聚是不可避免的，隨著不同情形，會有實際處理發生困難的問題。又，在檢測區域捕捉到的標示珠彼此太靠近的話，會變成檢測錯誤的原因，有這樣的問題。

此外，專利文獻4所記載的技術中，因為標示珠流下時被固定的抗體和標示珠攜帶的抗原之間進行抗原抗體反應，檢測區域全區變成該抗原抗體反應的反應場所；由於反應性受到抗原與抗體的接觸頻率的影響，檢測區域全區變成反應場所的該技術，係抗原抗體反應效率趨向變低。又，標示珠的捕捉、和其檢測《亦即，抗原檢測》，由於在相同的反應場所進行，當反應效率低的情形時，檢測靈敏度就降低了。更進而，由於隨著抗體的流下速度而固定的抗體捕捉標示珠變得困難，有檢測靈敏度、或檢測速度變得更差的問題。

又，專利文獻5所記載之技術，使攜帶了複合體的珠子聚集《不均勻分布》在密度梯度介質中的等密度點（isodensity point）來檢測，因此，累積量越低，信號檢測變得越高，對試樣中的目標物質更高一層靈敏度地檢測是有困難的。

本發明，有鑑於前述各項問題，提供能夠以比過去技術更高靈敏度又便宜地檢測試樣中的目標物質的技術，做為目標之一。 [解決問題所採取的方法]

本發明，依據其中一個面向，提供目標物質的檢測方法，包含： 藉由在結合了標示物質的第1捕捉物質、和固定在固相的第2捕捉物質之間，將目標物質夾在中間（sandwich），形成複合體；將含標示物質部分從形成的前述複合體中分離後， 分離出來的前述含標示物質部分，藉由離心力，移動至充填在管狀通道內的液體中， 在前述管狀通道，藉由將照射前述含標示物質部分的光散射（scatter）產生散射光，檢測前述含標示物質部分；提供目標物質的檢測方法。

依據本發明的理想實施態樣， 在分離前述複合體中的前述含標示物質部分之前，於抑制前述複合體流進前述管狀通道的狀態下，實施清洗前述複合體的清洗處置。

依據本發明的理想實施態樣，當實施前述清洗處置，將清洗時使用的清洗液充滿前述管狀通道。

依據本發明的理想實施態樣，前述清洗處置所使用的清洗液存留在前述管狀通道的更下游位置。

依據本發明的理想實施態樣，藉由將前述複合體保留在特定腔室，以抑制前述複合體流入前述管狀通道的狀態實施前述清洗處置。

依據本發明的其他的理想實施態樣，本發明的方法，包含： 在做成可以旋轉的裝置中，將存留前述清洗液的第1儲液室、和前述腔室、和存留由前述腔室流出的液體的第2儲液室，依照此順序，自前述裝置的旋轉中心側向外方側配置，前述第1儲液室和前述腔室以可自由開關的流徑相連通，前述腔室和前述第2儲液室用前述管狀通道相連通； 藉由使前述裝置旋轉，將前述清洗液由前述第1儲液室供給至前述腔室後，經由前述管狀通道，使其排出至前述第2儲液室，實施前述清洗處置。

依據本發明的其他的理想實施態樣，係以能夠開放的流徑連通前述第1儲液室和前述腔室。

依據本發明的其他的理想實施態樣，前述清洗處置，直到前述第2儲液室和前述管狀通道充滿前述清洗液才進行。

依據本發明的其他的理想實施態樣，本發明的方法，包含： 在比前述裝置的前述腔室更靠近旋轉中心側，配置存留含有分離前述複合體中的前述含標示物質部分的試劑的液體的第3儲液室，以可自由開關的流徑連通前述第3儲液室和前述腔室， 藉由使前述裝置旋轉，前述清洗處置後，含有前述試劑液體供給至前述腔室，分離前述含標示物質部分後，使已分離的前述含標示物質部分移動至前述管狀通道內。

依據本發明的其他的理想實施態樣，以可自由開關的流徑連通前述第3儲液室和前述腔室。

依據本發明的其他的理想實施態樣，檢測在預定時間內來自管狀通道間歇產生的散射光。

依據本發明的其他的理想實施態樣，前述標示物質，係比充滿在前述管狀通道內的液體更大比重之物質。 依據本發明的其他的理想實施態樣，前述標示物質，係選自金屬、陶瓷製品（ceramics）、玻璃和樹脂所成群類之一者為主要構成成份的微粒子（fine particles）。 依據本發明的其他的理想實施態樣，前述標示物質，係金屬膠體粒子（metal colloidal particle）。

依據本發明的其他的理想實施態樣，前述固相，係選自玻璃粒子、陶瓷製品（ceramics）粒子、磁性粒子（magnetic particles）、和樹脂粒子（resin particle）所成群類的至少一者的粒狀物。 依據本發明的其他的理想實施態樣，前述固相，係在形成前述複合體之際所使用的容器內側的結構物。

依據本發明的其他的理想實施態樣，將前述複合體中的前述含標示物質部分分離，係藉由選自加熱處置、酸鹼值調節處置、變性處置（Denaturation treatment）、氧化處置、還原處置、酵素處置和競合反應（competition reaction）處置所成群類的至少一者處置來進行。

依據本發明的其他的理想實施態樣，前述第1捕捉物質，係選自與目標物質特異性地結合的抗體、抗體片段（antibody fragment）、修飾抗體（modified antibody）、抗原、核酸適配體（aptamer）和核酸所成群類中的至少一者。

依據本發明的其他的理想實施態樣，前述第2捕捉物質，係選自目標物質特異性地結合的抗體、抗體片段（antibody fragment）、修飾抗體（modified antibody）、抗原、核酸適配體（aptamer）和核酸所成群類中的至少一者。

依據本發明的其他的面向，係在前述本發明的目標物質的檢測方法中所使用的試劑，提供具有分離前述複合體中的前述含標示物質部分的作用的試劑。 依據本發明的其他的理想實施態樣，前述本發明的試劑，包含選自酸鹼值調節劑（pH regulator）、變性劑（denaturant）、還原劑（reducing agent）、氧化劑、酵素（enzyme）、以及競爭劑（competitor）所成群類中的至少一者。 依據本發明的其他的理想實施態樣，前述本發明的試劑，包含酸鹼值調節劑（pH regulator）。 [發明的成果]

依據本發明的目標物質的檢測方法，藉由離心力，將自前述複合體分離出來的前述含標示物質部分《於本說明書，亦稱為『含標示物質片段（fragment）』》移動到充填在管狀通道內的液體中，靠著含標示物質片段反射照射到管狀通道的光而散射產生的散射光，進行含標示物質片段的檢測。一般來說，待檢對象中的信號產生源頭《產生發光信號的物質、標示物質》越小，以吸光度變化作為信號檢測被檢對象時，就需要高階技術；但是，本發明的方法，因為以散射光作為光學信號而取得，可以充分地檢測如前述含標示物質片段般微小的待檢對象。

於此處，利用散射光檢測被檢對象的情形時，由於被檢對象以外的物質也會產生散射光，經常發生無法特異性檢測出被檢對象的問題。但是，於本發明的方法，因為液體中的含標示物質片段，靠著離心力的作用，以特有的移動速度移動，可以特異性檢測作為被檢對象的含標示物質片段。更進一步，於本發明的方法，含標示物質片段，因為靠著離心力的作用，在填充於管狀通道內的液體中移動，比起液體的流動同時輸送的情形，係以緩慢的速度移動，因而，依據本發明的方法，藉由離心力，含標示物質片段即使在管狀通道內移動中間，也很容易取得來自含標示物質片段的散射光。

再者，依據本發明的方法，例如，將珠子作為固相使用的情形時，即使一顆珠子攜帶複數的目標物質，用珠子單位並不是數算（count）1次，因為可以逐次地檢測《數算（count）》從珠子分離的含標示物質片段的數目，達到可以高靈敏度地檢測目標物質的效果。

依據本發明的試劑，因為能夠良好地分離複合體中的含標示物質部分、亦即含標示物質片段，對於目標物質的檢測，可以提供恰當的試劑。

＜本發明的檢測方法＞ 本發明的檢測方法中，由於藉由離心力，將從複合體分離出來的含標示物質部分移動至充填在管狀通道內的液體中，所以含標示物質部分就週期性地（intermittently）供給至充填在管狀通道內的液體中。因此，照射到該管狀通道的照射光，因為含標示物質部分而散射，藉由產生的散射光，檢測含標示物質部分。複合體係藉由在結合了標示物質的第1捕捉物質、和固定在固相的第2捕捉物質之間，將目標物質夾在中間（sandwich）而形成，因此，利用檢測從複合體分離出來的含標示物質部分，可以檢測目標物質。

再者，本說明書中，如『固相－第2捕捉物質－目標物質－第1捕捉物質－標示物質』般地以連字符號（hyphen）連結來表示的情形，意指相互地以物理性的或化學性的鍵結。又，『第1捕捉物質－標示物質』，也有以『結合了標示物質的第1捕捉物質』或單獨以『第1捕捉物質』來陳述的情形。『外方側』、『外側方向』及『外方』，意指離心方向。所謂『主要構成成份』，係含有量最多的構成成份，例如，提及含量超過50%質量比的成份。

以下，利用圖1，說明本發明的檢測方法的一個實施態樣。圖1係表示本發明的檢測方法的一個實施態樣概念的概要圖。還有，為了將說明簡單化，在圖1中，係將目標物質作為抗原、第1和第2捕捉物質作為初級抗體（primary antibody）的情形來表示。

在初期狀態，在反應場所《第1反應場所，實行反應的空間》反應的空間》中，預備了固定用來捕捉目標物質的第2捕捉物質的固相《步驟1（step 1），圖1(a)》；於此處，引入含有目標物質的試樣溶液時《圖1(b)》，試樣溶液中的目標物質藉由第2捕捉物質，特異性地被捕捉《步驟2》。因應需要，利用清洗處置，將被捕捉的目標物質以外的物質從反應場所除去後，結合了標示物質的第1捕捉物質被引入反應場所，此第1捕捉物質結合在目標物質，目標物質被夾在第2捕捉物質和第1捕捉物質之間的免疫複合體《以下也單以『免疫複合體』稱之》，形成於固相上《步驟3（step 3），圖1(c)》；靠著洗淨作業，從系統將剩餘的第2捕捉物質除去，亦即，對應被捕捉的目標物質的份額的標示物質，變成固定在固相的狀態；然後，進行清洗處置是較合於理想的。藉由此清洗處置，預先從系統中除去萬一混入管狀通道會影響檢測結果的物質是較為理想的，像這樣的物質，例如，未形成複合體而剩餘的第1捕捉物質、和游離的標示物質等可列舉。又，藉由此清洗處置，也可以一倂除去其他的污染物（contaminants），因此，對應被捕捉在固相的目標物質的分量的標示物質，變成被攜帶在固相的狀態。

然後，對於已形成的複合體，給予酵素、氧化還原劑、變性劑（denaturant）、酸或鹼等的試劑、或者熱、光《電磁波》、振動等的外部場域（external field）《圖1(d)》，將含標示物質部分從固相中分離《步驟4，圖1(e)》；還有，此分離部分《含標示物質部分》，可以是只有標示物質，也可以是某些分子團與標示物質結合的狀態；分子團，並未侷限第2捕捉物質－目標物質－第1捕捉物質的複合體、或目標物質－第1捕捉物質的複合體、像第1捕捉物質般、原本的分子團依其原樣殘存之物《亦即，切斷分子間的鍵結生成之物》，也可以是切斷原本分子團內的分子內鍵結（intramolecular bonding）被片段化之物。

此反應場所，係實施藉由在結合了標示物質的第1捕捉物質、和固定在固相的第2捕捉物質之間，將目標物質夾在中間（sandwich）而形成複合體的反應，及從已形成的前述複合體分離含標示物質部分的反應的場所，係意指劃分開來的空間。作為反應場所，例如，可列舉例示的有反應容器或反應室《反應腔室（chamber）》等。又，本方法中，前述圖1(a)〜(e)所表示的步驟1〜4，只要含標示物質部分可以藉由離心力在管狀通道內移動，也可以分別在個別的反應場所實施，或者，也可以在同一個反應場所實施連續的複數步驟，舉例來說，也可以使用單一容器完成步驟1〜3，在其他容器完成步驟4。

再者，於本實施態樣中，也可以使用裝設在構造上可以旋轉的裝置的反應腔室作為反應場所。從步驟1〜4或者適當施行的清洗處置的任一階段，可以適當選擇是否使用該反應腔室；舉例來說，已固定第2捕捉物質的固相裝載至前述裝置的反應腔室，使用該反應腔室可以實施步驟1〜4的全部，或者，也可以將步驟1〜3在前述裝置外的容器實施，步驟4以後在前述裝置的反應腔室實施。後者的情形時，無論步驟4的生成物是否固相液相分離，具有含標示物質部分的溶液被引入反應腔室，在這種情形下，反應腔室單純變成溶液的檢測場所，亦即，變成作為供給至微小管徑的管狀通道內的前室來使用。

在步驟4以後，包含在溶液中的含標示物質部分，藉著離心力，移動至檢測場所、亦即、充填在微小管徑的管狀通道內的液體中《圖1(f)》。在圖示的實例，從反應腔室朝向比旋轉中心更外側方向《圖的右側》，微小管徑的管狀通道互相連接；因此，含標示物質部分若以包含在溶液中的狀態存留裝置的反應腔室內的話，藉著使裝置旋轉時產生的離心力，含標示物質部分進入充填在微小管徑的管狀通道內的液體中，可以在該液體中更進一步向外方移動。又，在圖示的實例中，由於微小管徑的管狀通道內的孔徑係做成使含標示物質部分可以通過而固相無法通過的尺寸，一方面防止固相流入、同時可以使含標示物質部分進入管狀通道。 此處，含標示物質部分藉著離心力在充填於管狀通道內的液體中移動，該移動係因所謂離心沉降（centrifugal sedimentation）產生；也就是說，含標示物質部分的移動速度，相對地大於充填於管狀通道內的液體的移動速度。於本發明中，充填於管狀通道內的液體，因為離心力，幾乎沒有移動，通常，雖然移動速度趨近於零，但原則上，對含標示物質部分的移動沒有實質上的影響的話，少許的移動是可以容許的。

管狀通道的另一端，連接著裝設於前述裝置內的第2儲液室《圖1中未圖示出來》。管狀通道和第2儲液室，可以經常性連通，或者也可以藉由閥門（valve）自由開關。作為此第2儲液室，可以裝設在比前述裝置內的前述腔室更下游側，例如裝設在比前述腔室更外方的位置是為優選。 使含標示物質部分在管狀通道移動前，將管狀通道做成充填液體的狀態。第2儲液室裝設在比前述腔室更外方的位置的情形時，管狀通道和第2儲液室做成經常性連通的話，管狀通道和第2儲液室兩邊都充填液體。液體充填管狀通道的時間點（timing），對應使用反應腔室的時間點而有不同；舉例來說，前述的步驟3以前就使用反應腔的情形時，步驟3後的清洗處置以降，在步驟4前將液體充填至管狀通道。又，步驟4以後使用反應腔室的情形時，理想的是將具有含標示物質部分的溶液引入反應腔室以前，將液體充填至管狀通道。 再者，也可以做成以下構造：反應腔室內裝設閥門，管狀通道的液體充填結束之後，打開閥門，將含標示物質部分引入充填在管狀通道的液體中。在相關的情形下，將具有含標示物質部分的溶液引入反應腔室的時間點，可以在管狀通道的液體充填結束之前也可以在結束之後。

檢測場所，係檢測來自管狀通道的散射光的場所，配備了光源（light source）和光接收元件（light-receiving element），係因為照射光（irradiated light）而產生散射光（scattered light），被稱為引起光學變化（optical change）的場所《以下，有時將其適當稱為『第二反應場所』》。由於被照射光照射的管狀通道至少有一部分以半透明材料（translucent material）做成，從光源向管狀通道照射的照射光，經過管狀通道的管壁，因為在管狀通道移動的標示物質而散射，產生散射光；此散射光用光接收元件檢測，可以檢測標示物質的存在與否《圖1(g)》。

液體中的粒子置於離心場中的情形時的運動速度，藉由斯托克斯定律（Stokes' law）加以說明。具體地說，質量m的粒子，在旋轉半徑r ₁、旋轉角速度（rotational angular velocity）ω時，受到旋轉的話，則受到如下述公式(1)的離心力f。 f＝mr ₁ω ²………………(1) m：粒子質量 《公克 (g)》 r ₁：旋轉半徑 《公分 (cm)》 ω ²：旋轉角速度 《弧度／秒 (rad／s)》 又，若粒子半徑r ₂、粒子密度為ρ _p、液體密度為ρ ₁的話，作用在粒子上的離心力 Fc，以下述公式(2)表示之。 依據斯托克斯阻力定律（Stokes law of resistance），在黏度η的液體中，以速度vs移動的半徑r ₂的球體，所受到阻力Fr，以下述公式(3)表示之。 由於Fc和Fr在粒子的最終速度（terminal velocity）下平衡，以下述公式(4)表示，公式(4)的粒子半徑r ₂，以直徑D _p替換的話，則粒子的移動速度v _s，以下述公式(5)表示。 也就是說，離心力一旦作用，粒子直徑《D _p：cm》、粒子密度《ρ _p：g．cm ^-3》、液體密度《ρ ₁：g．cm ^-3》、溶液黏度《η：poise；g．cm ^-1．s ^-1》等都有關係，粒子的移動速度《v _s：cm／sec》就決定了；換言之，如果在相同的液體中，粒子密度、粒子直徑較大的粒子，在液體中變成較快移動者，對於已知密度和粒子直徑的粒子，以公式(5)為基礎，可以推算出移動速度和到達預定位置的移動時間。

預先把握標示物質的粒子直徑、密度、甚至溶液的密度是可能的事；又，含標示物質部分中，標示物質比起其他以外成分非常大或重的情形時，含標示物質部分可以用標示物質近似，因此，以公式(5)為基礎在理論上、或藉由實驗，可以導出含標示物質部分的移動速度以及到達管狀通道的特定位置《檢測領域》的到達時間。再者，公式(5)，由於是理論公式，如果有公式(5)的前提條件預想外的情形時，對公式(5)進行修正後也可以計算出移動速度等。

如同前述，以公式導出的移動速度為基礎，可以估計出含標示物質部分通過檢測區域的時間。又，從離心開始，含標示物質部分在一段特定時間內通過檢測區域。因此，可以判斷，在一段特定時間內，於檢測區域被檢測到的散射光係起因於目標的待檢對象的散射光。 更進一步，由於待檢對象係在管狀通道移動，那些散射光變成間歇性的訊號，因此，將連續出現的散射光可以識別為由於某種因素引起的背景干擾（background noise），從而可以有特異性地檢測到待檢對象的散射光。

因此，本發明的檢測方法，能夠適切地檢測細微的待檢對象。供給至管狀通道的標示物質《含標示物質部分》，因為來源於在反應場所與目標物質形成複合體，藉由標示物質的檢測，成為能夠檢測目標物質的存在。 又，關於在這樣的在特定時間斷續發生的散射光，可以計算產生的次數；以此計數為基礎，供給至管狀通道的含標示物質部分的數量，亦即目標物質的數量，可以定量評價；特別是，試樣中的目標物質的數量很少的微量分析的情形時，成為定量性方面的優選。

再者，本發明的檢測方法，從固相分離含標示物質部分，由於分離出來的含標示物質部分引入檢測場所，比較起使用過去提出的碟片（disc）狀的微型反應器，計算形成免疫複合體的珠子，進行免疫測定的情形，能夠大幅縮小通過流徑的物質大小，能夠滑順且簡單地將待檢對象的物質引入檢測場所。

＜目標物質＞ 本發明的檢測方法中，成為分析對象的目標物質，係結合於特定的生物分子（biomolecules），也可以藉由生化學反應與特定的生物分子結合，舉例來說，只要是免疫學或基因學可以檢測的物質的話，並無特別限制。做為目標物質，具體而言，例示的有：細菌或病毒等的病原體（pathogen）、蛋白質、胜肽（peptide）、去氧核醣核酸（DNA；deoxyribonucleic acid）、核醣核酸（RNA；ribonucleic acid）、核酸適配體（aptamer）等的核酸、外泌體《或稱：胞外體》（exosome）、聚醣（glycan）等的各種化合物等。更進一步，例示的有：荷爾蒙《激素》（hormone）等的生理活性物質（physiologically active substance）、或其活化劑（agonist）、拮抗劑（antagonist）和生物鹼（alkaloid）等。

＜第1捕捉物質＞ 本發明的第1捕捉物質，結合被第2捕捉物質捕捉的目標物質，在與固定於固相的第2捕捉物質之間，夾住目標物質，形成固定於固相的複合體，亦即，形成以固相－第2捕捉物質－目標物質－第1捕捉物質《結合了標示物質的第1捕捉物質》的順序結合起來的複合體。 目標物質是抗原的情形時，第1捕捉物質，使用相對於目標物質有特異性反應的抗體；另一方面，目標物質是抗體的情形時，作為第1捕捉物質，可以使用與該抗體特異性結合的抗原，與該抗體結合的抗體，可以是不同於第2捕捉物質的抗體，也可以使用與產生該抗體的宿主不同的宿主所製作的抗體。因此，目標物質是抗體的情形時，形成固相－抗原《第2捕捉物質》－目標物質－抗原《第1捕捉物質》或抗體《第1捕捉物質》而成的複合體、或固相－抗體《第2捕捉物質》－目標物質－抗原《第1捕捉物質》或抗體《第1捕捉物質》而成的複合體。

再者，作為本發明的第1捕捉物質，前述抗原和抗體以外，根據目標物質，使用核酸或核酸適配體（aptamer）、生物素－卵白素（biotin－avidin）的任一者、配體（ligand）－受體（receptor）的任一者，都是可以的。舉例來說，目標物質是細菌來源的去氧核醣核酸（DNA）的情形時，可以使用與該 DNA的一部分區域具有互補序列（complementary sequence）的核酸分子作為第1捕捉物質；又，目標物質是如轉錄因子（transcription factor）的序列特異性DNA結合蛋白質（sequence-specific DNA-binding protein）的情形時，可以使用具有特定序列的DNA作為第1捕捉物質。

作為第1捕捉物質而使用的抗體，可以是多株抗體（polyclonal antibody），也可以是單株抗體（monoclonal antibody），但是從反應特異性的觀點來看，使用單株抗體較為優選。

作為第1捕捉物質而使用的抗體，也包含抗體及與該抗體有實質上相等反應性的抗體片段（antibody fragment）並修飾抗體。作為抗體片段，可列舉使用的有：抗原結合區段（Fab fragment；fragment, antigen binding）、F(ab’)2區段、Fab’ 區段、scFv區段等。

＜第2捕捉物質＞ 本發明的第2捕捉物質，係具有捕捉在固相上的目標物質的功能的物質，固定在固相上而使用，例如，目標物質是抗原的情形時，使用對於目標物質有特異性反應的抗體；目標物質是抗體的情形時，使用對於目標物質有特異性反應的抗原或抗體。

再進一步，作為本發明之第2捕捉物質，前述之抗原和抗體之外，根據目標物質，也可以使用核酸或核酸適配體（aptamer）、配體（ligand）《目標物質的受質（substrate）、抑制劑（inhibitor）、競爭劑（competitor）》、受體（receptor）。舉例來說，目標物質是細菌來源的去氧核醣核酸（DNA）的情形時，可以使用與該 DNA的一部分區域具有互補序列的核酸分子作為第2捕捉物質；又，目標物質是如轉錄因子（transcription factor）的序列特異性DNA結合蛋白質（sequence-specific DNA-binding protein）的情形時，可以使用具有特定序列的DNA作為第2捕捉物質。

作為第2捕捉物質而使用的抗體，可以是多株抗體（polyclonal antibody），也可以是單株抗體（monoclonal antibody），但是從反應特異性的觀點來看，使用單株抗體較為優選。

作為第2捕捉物質而使用的抗體，也包含抗體及與該抗體有實質上相等反應性的抗體片段（antibody fragment）並修飾抗體。作為抗體片段，可列舉使用的有：抗原結合區段（Fab fragment；fragment, antigen binding）、F(ab’)2區段、Fab’ 區段、scFv區段等。

此處，比較固相的大小和第2捕捉物質的大小的話，則固相這一方顯著地大，因此，於固相中，第2捕捉物質很容易固定。在珠子等的固相裡捕捉目標物質，以計算捕捉了目標物質的珠子來檢測目標物質的傳統方法中，1個珠子上捕捉了複數的目標物質，會顯著影響檢測結果。但是，於本實施態樣，由於待檢對象係從不受珠子束縛的複合體分離的含標示物質部分，可以實現高靈敏度的檢測。 再者，由於標示物質的空間位阻（steric hindrance），對第1捕捉物質接近捕捉在固相上的目標物質具有顯著影響的情形時，使固相上的第2捕捉物質的分佈是稀疏的、亦即疏密相間，則第2捕捉物質在固相結合之際，其濃度也可以適當地調整。

＜標示物質＞ 標示物質是標示第1捕捉物質的物質，只要能檢測產生散射光的物質的話，並沒有特別的限制；例如，可以列舉玻璃、陶瓷製品（ceramics）、金屬等的無機物，和螢光物質或樹脂等為主要構造成分的細微粒子。作為樹脂粒子，聚苯乙烯乳膠（polystyrene latex）等的合成乳膠、或天然橡膠乳膠（natural rubber latex）等的乳膠、或聚苯乙烯（polystyrene）等所代表的合成樹脂等的粒子可以例示。又，標示物質，可以是單一材料構成者，也可以是複數材料構成者；再者，也可以是無機－有機的不同種類材料組合而成者。不同種類材料的組合，例如，也可以是樹脂粒子或陶瓷粒子攜帶金屬粒子而成的複合粒子、或樹脂粒子上包覆金屬而成的複合粒子。又，樹脂粒子也可以攜帶螢光物質，但並未侷限於此。

這些標示物質的粒子直徑，從散射光強度或在裝置內的移動性來看，以80奈米（nm）～3微米（μm）為理想；再者，因為隨著標示物質的種類或大小，使散射光強度、離心場所裡的移動速度、對第1捕捉物質的反應性等都不相同，將這些因素一併考慮，選擇適當正確的粒子直徑物質。

此處，考慮到離心力對移動速度的影響，作為標記物質，比重大於填充管狀通道的液體的物質是優選。比有機物密度高的無機物粒子、或粒徑較大的樹脂粒子，作為標示物質適合於理想的。這是因為含標示物質部分的移動速度與試樣中的主要污染物的有機物的移動速度，在檢測區域產生很大的差異。其中，可以期待取得良好的散射光強度的金屬粒子或金屬膠體粒子（metal colloidal particle），作為標示物質，特別適當。

可使用作為標示物質的金屬膠體粒子，可以適當選擇各種金屬膠體粒子來使用，舉例來說，可被列舉的有：金膠體、銀膠體、白金膠體等的金屬膠體，還有，這些金屬膠體的複合金屬膠體的粒子。做為複合金屬膠體，例如，白金攜帶金膠體（platinum-supported colloidal gold）、白金攜帶鈀膠體（platinum-supported colloidal palladium）等可被列舉。

作為本發明中較為優選的金屬膠體粒子，列舉出金膠體粒子、它的複合金屬膠體粒子，或銀膠體粒子；更理想的是金膠體粒子。

金屬膠體粒子的粒子直徑，通常是1奈米（nm）〜500奈米。視所選光學檢測系統的靈敏度（sensitivity）、精確度（accuracy）、測量條件等而定，在檢測上適切的金屬粒子的粒子直徑不同，例如，使用將雷射（LASER；Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation）光源和光電二極體（photodiode）組合來檢測散射光的簡便檢測系統的情形時，金屬膠體粒子的粒子直徑若是80奈米以上的話則可，150奈米以上的話則可以更容易地檢測，粒子直徑若是200奈米以上的話，則又更容易地檢測。較合適的是80奈米〜500奈米，更合適的是120奈米〜300奈米。特別合適的是180奈米〜250奈米。

再者，第1捕捉物質是抗體的情形時，包括稱為第1捕捉物質的抗體被標示的情形、以及能識別該抗體的抗體《例如：二級抗體（secondary antibody）》被標示的情形。

標示物質和第1捕捉物質的結合方法沒有限制，例如，可以利用藉由物理的吸附形成的結合、化學結合、利用親和性（affinity）的結合、以及這些結合的組合等地結合方法。藉由已知的技術，可以使標示物質和第1捕捉物質結合。

比較此標示物質和第1捕捉物質的大小的話，則標示物質相對較大；因此，可能會出現複數的第1捕捉物質與標示物質結合的情況。標示物質上結合了多數的第1捕捉物質的情形時，第1捕捉物質和目標物質的反應性提高，另一方面，目標物質的濃度變得越高，複數目標物質和一種標示物質相互對應的狀態變得越容易。於此情形下，目標物質的濃度被評估為低於實際濃度，因此，定量檢測的濃度範圍要擴展向高濃度側，也可以實施將標示物質和第1捕捉物質的比例做最佳化的處置。像這樣的處置，例如，可列舉：在使結合了標示物質的第1捕捉物質和目標物質結合的反應中，調整結合了標示物質的第1捕捉物質和目標物質的組成比例的處置。

又，在將引入檢測場所的試樣《含標示物質部分》時，使用是中空的導管的管狀通道，較合於理想的是使用細微管徑的管狀通道。作為細微管徑的管狀通道，例如，可以使用微流徑（microfluidic）。標示物質是金屬膠體粒子等的不溶性物質的情形時，為了避免流徑阻塞，結合了第1捕捉物質的標示物質的粒子直徑越小越好；另一方面，粒子直徑變小的話，則散射光強度降低，有鑑於這一點，如同前述，標示物質適當選定在80奈米〜3微米的粒子直徑範圍是較優選的。

此處，標示物質是金屬膠體粒子的情形時，例如，實施使膠體粒子成長且粒子直徑變大的增敏反應（sensitization reaction）也可以。根據此，使第1捕捉物質和做為標示物質的金屬膠體粒子結合之際，因為使用較小的金屬膠體粒子，可以抑制與1個金屬膠體粒子結合的第1捕捉物質的數目。然後，將標示物質引入檢測場所之前，藉由增敏反應，使金屬膠體粒子的粒子直徑增大的話，可以增加散射光強度。於本發明中，將標示物質引入檢測場所就足夠了，不需要將目標物質及與其結合的第1捕捉物質引入檢測場所，因此，藉由增敏反應，即使與標示物質或第1捕捉物質結合的目標物質發生分解或變性（denaturation），也沒有問題。

具體來說，標示物質是金屬膠體粒子的情形時，例如，藉由利用該金屬膠體的催化活性、或併用還原劑，在標示物質的金屬膠體表面，將含有分別加入的金離子或銀離子的金屬鹽溶液中的金屬離子還原，使其積聚，可以使金屬膠體的粒子直徑變大。

作為進行該增敏反應的金屬膠體粒子，當作核種的金屬種子隊於氧化還原的穩定性高者為優選；再者，當作核種的金屬膠體粒子，可以是單一金屬做成，也可以是複合金屬（composite metal）。相關的金屬膠體粒子，例如，可以列舉金膠體粒子、白金膠體粒子、鈀（palladium）膠體粒子等；又複合金屬膠體粒子，例如，可以列舉金膠體粒子上攜帶白金膠體粒子的白金－金膠體粒子等。

相關的金屬膠體粒子的增敏反應中，作為金屬離子供給來源的金屬鹽，可以舉出屬於元素週期表第4、5、6週期的金屬的鹽，但是較理想的是使用金、白金、銀、鈀（palladium）、鎳（nickel）、鈷（cobalt）、銅等的鹽。被析出的金屬，可以是與金屬膠體粒子相同種類的金屬，也可以是不同種類的金屬，只要還原反應可以在容易的條件下進行，則沒有限制。

舉例來說，鈀－白金膠體粒子，藉由使用含有鎳離子、鈷離子、銅離子的金屬離子的任一者的溶液作為增敏劑溶液，可以使該膠體粒子成長。

又，例如，金膠體粒子，使用含有氯金酸《氯金(III)酸》（chloroauric acid；H[AuCl₄]）的增敏劑溶液作為金離子的供給來源，使金離子積聚在作為標示物質的金膠體粒子表面，可以使該膠體粒子成長。又，金膠體粒子，使用含有硝酸銀的增敏劑溶液，可以使銀離子積聚在金膠體粒子表面，使其成長作為複合金屬膠體粒子。白金－金膠體粒子，利用白金的催化活性，使用含有硝酸銀、硫酸銅等的銅的鹽的增敏劑溶液，可以使其成長。

增敏劑溶液，含有變成前述金屬離子供給來源的各種金屬鹽做為必要成分，因應需要，可以更進而含有錯合劑（complexing agent）、酸鹼值調整劑（pH regulator）、緩衝劑（buffer）、穩定劑（stabilizer）等。作為這樣的增敏劑溶液，可以使用傳統已知的無電式電鍍（electroless plating）溶液。

作為錯合劑，可列舉氨（ammonia）、檸檬酸鹽（citrate）、酒石酸鹽（tartrate）、乳酸鹽（lactate）等。作為酸鹼值調整劑，可列舉醋酸鹽（acetate）、丙酸鹽（propionate）、銨鹽（ammonium salt）等。作為穩定劑，可列舉各種界面活性劑（surfactant）等。

為了促進金屬離子的還原反應，也可以使用含有還原劑的溶液。作為還原劑，可列舉的有：檸檬酸、抗壞血酸（ascorbic acid）、次磷酸鈉（sodium hypophosphate）、水合肼（hydrazine hydrate）、硫酸肼（hydrazine Sulfate）、硼氫化鈉（sodium borhydride）、二甲胺硼烷（dimethylamine borane）、甲醛（formaldehyde）、羅謝爾鹽（Rochelle Salt）《或稱：酒石酸鉀鈉（potassium sodium tartrate）》、葡萄糖（glucose）、乙二醇（ethylene glycol）等，但並未侷限於這些物質。所使用的還原劑，適當選擇適合被還原的金屬離子之物質。

再者，增敏反應，也可以藉由含有金屬離子成分和還原劑的二者的增敏劑溶液進行，此種情形時，分別準備好含金屬離子成分的金屬鹽溶液、和含還原劑的還原劑溶液，在增敏反應之前，使用混合好的溶液進行也可以；較合於理想的是將金屬鹽溶液和還原劑溶液分別準備好，各別加入反應系統的方法是優選。又，藉由金屬膠體粒子催化活性（catalytic activity），即使不加入還原劑溶液，也可以實行增敏反應。

此增敏反應，在複合體形成之後、含標示物質分離之前來實施是較為理想的。

＜含標示物質部分的切斷方法＞ 本發明的檢測方法中，在反應場所，第2捕捉物質－目標物質－第1捕捉物質《結合了標示物質的第1捕捉物質》的複合體形成於固相上之後，從該複合體切斷《使其分離》含標示物質部分，從固相游離至溶液中。此切斷和分離，是複合體浸漬在液體中進行，管狀通道充滿液體之外，還加上反應場所也存留液體，使固相浸漬在液體中，管狀通道和反應場所則以液體相連通。因為切斷而從固相分離的反應場所液體中的含標示物質部分，藉由離心力，斷斷續續供給至充填在管狀通道內的液體中。如同前述，該分離部分，含有標示物質即可，包含標示物質的第1捕捉物質無須處於原樣的狀態，也就是，只要標示物質或含標示物質部分被分離，切斷複合體內的任何鍵結都可以。

再者，從複合體分離出來的含標示物質部分，從運送性等觀點來看，不含固相《固相部分》是較理想的，因而，在固相和第2捕捉物質之間、第2捕捉物質和目標物質之間、目標物質沿途、目標物質和第1捕捉物質之間、第1捕捉物質沿途、或、第1捕捉物質和標示物質之間，分離複合體，使含標示物質部分游離出來是優選。

如同前述，標示物質與第1捕捉物質的結合方法沒有限制，舉例來說，可以運用靠物理吸附的結合、化學鍵結、利用親和性的結合、及這些方式的組合等的結合方法。藉由一般已知的方法，可以使標示物質和第1捕捉物質結合。

切斷《分離》含標示物質部分的方法，可以例示的方法有：利用從外部場域（external field）投與熱、光、振動等物理能量來切斷的方法、加入氧化劑或還原劑做成的切斷試劑的方法。切斷試劑，可以是切斷固相和第2捕捉物質的結合的物質，也可以是切斷複合體內的其他結合的物質。相關的切斷試劑，只要能夠從形成在固相上的複合體分離含標示物質部分而無損標是物質的性狀，並無特別限制，但理想上，是切斷目標物質與第2捕捉物質或第1捕捉物質或之間、或第1捕捉物質與標示物質之間的結合的切斷試劑。

切斷結合的切斷試劑，例示的有：酸鹼值調節劑、變性劑（denaturant）、還原劑（reducing agent）、酵素（enzyme）、競爭劑（competitor）、氧化劑等。理想上，酸鹼值調節劑、變性劑、還原劑、酵素作為例示；更理想的話，酸鹼值調節劑、變性劑作為例示。

酸鹼值調節劑，含有酸、鹼或它們的鹽類，係使酸鹼值改變的化合物或組成物。酸可以是無機酸或有機酸的任一者，鹼也可以是無機鹼或有機鹼的任一者。作為相關的酸或鹼，一個實例如布洛斯特酸（Bronsted acid）、鹼及其鹽類等為例示，例如：鹽酸（hydrochloric acid）、硼酸（boric acid）、碳酸（carbonic acid）、硝酸（nitric acid）、醋酸（acetic acid）、苯硼酸（boronic acid）、甲酸（formic acid）、檸檬酸（citric acid）、磷酸（phosphoric acid）、草酸（oxalic acid）、乳酸（lactic acid）、蘋果酸（malic acid）、水楊酸（salicylic acid）、甘氨酸鹽酸（glycine hydrochloric acid）、甘氨酸氫氧化鈉（glycine sodium hydroxide）、氫氧化鈉（sodium hydroxide）、三乙胺（triethylamine）、二甲胺（dimethylamine）、甲胺類（methyl amines）等的胺類（amines）、氨（ammonia）、碳酸氫鈉（sodium hydrogen carbonate）等作為例示，但並非限制於此。這些物質之中，強酸和強鹼是較為理想的，其具體實例，可列舉：鹽酸、硝酸、甲酸、磷酸、草酸、甘氨酸鹽酸、甘氨酸氫氧化鈉、氫氧化鈉、三乙胺、二甲胺、甲胺類等的胺類。

變性劑（denaturant）係使蛋白質或核酸的高階結構（higher-order structure）改變的試劑，例示的有尿素或胍鹽（guanidine salt）等的蛋白質變性劑、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）等的界面活性劑；又，其他變性劑，如未包含於前述的酸鹼值調整劑的路易斯酸（Lewis acid）、或醇類（alcohol）或酯類（ester）以及它們的衍生物作為例示，但並非限定於此。

還原劑，有2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol）和二硫蘇糖醇（dithiothreitol）做為切斷雙硫鍵（disulfide bond）之例示。

酵素係水解複合體構造成分的一部分之物，例示的有胃蛋白酶（pepsin）、木瓜蛋白酶（papain）、無花果苷（ficin）、核酸酶（nuclease）或特異性作用在構造成分的特定鍵結的酵素。

競爭劑（competitor），對於目標物質與第1或第2捕捉物質的結合，發生競爭的促效劑（agonist）、拮抗劑（antagonist）、競爭性抗體（competing antibodies）可以作為例示。

又，只要對目標物質沒有影響，也可以使用包含過氧化氫等的過氧化物或其他氧化劑作為切斷試劑。

切斷試劑的種類或濃度，因應作為對象的複合體的構造或結合力而適當選擇，在對標示物質的功能或構造沒有重大損害的範圍內加以調整。

此處，想要特異性切斷複合體的隨意部分，可以預先將連結器（linker）引入複合體的預定部分。此連結器，例如，係在使固相與第2捕捉物質、或標示物質與第1捕捉物質結合之際，於使這兩個物質間連結的目的而可以使用。連結器（linker），如果是在兩末端具有可以形成化學鍵結的預定功能基或反應基的話，以連結器兩端的功能基為媒介，可以使固相和第2捕捉物質、或標示物質和第1捕捉物質之間連結。該連結器，並未侷限於使固相與第2捕捉物質、或標示物質與第1捕捉物質結合為目的才能使用；舉例來說，也可以將連結器引入第1捕捉物質或第2捕捉物質的內部。作為連結器兩末端的功能基或反應基，例如，可列舉有：形成醯胺鍵（amide bond）、雙硫鍵（disulfide bond）、酯鍵（ester bond）等的共價鍵（covalent bond）之物質；於此情形，藉由水解或還原劑處理連結器末端結合部位，分解連結器末端部分的結合，可以切斷複合體。

又，連結器和對象物質的結合機制並未限定於前述共價鍵，例如，也可以是物理性吸附、離子結合、利用分子間的親和性的結合、以及這些的結合的組合等的結合。

再來，構成連結器的分子構造並未限定，可以使用蛋白質、胜肽（peptides）、糖鏈（sugar chain）、核酸（nucleic acid）、聚乙二醇（polyethylene glycol）等的合成聚合物（synthetic polymer）。又，更進一步，也可以使用形成親和性結合的生物素－卵白素等。

相關連結器部分的切斷，藉由從外部場域的物理性能量或試劑，可以切斷。試劑，因應連結器的種類，可以使用內肽酶（endopeptidase）、糖解酵素（glycolytic enzyme）、內切核酸酶（endonuclease）等的酵素、還原劑、酸、鹼、界面活性劑、競爭劑（competitor）等。

具體來說，例如，對於雙硫鍵（disulfide bond），靠著使如2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol）和二硫蘇糖醇（dithiothreitol）般在分子內具有巰基（thiol group）的還原劑發生作用，就可以切斷。又，若是生物素－卵白素結合的話，藉由加入酸鹼值調節劑，使反應系統的酸鹼值改變、或靠著使用洗脫緩衝（elution buffer），可以切斷前述結合。再者，連結器分子是由糖鏈構成的情形時，靠著作用於構成的單糖與單糖的結合的特異性酵素，可以切斷特定的結合。

再者，使用具有組氨酸標籤（histidine tag）的連結器的情形時，例如，使具有組氨酸標籤連結器分子結合在第2捕捉物質，藉由以螯合基（chelate group）將鎳固定在固相表面，以組氨酸標籤為媒介，可以將第2捕捉物質固定在固相。此處，若加入對組氨酸標籤是競爭劑的組氨酸（Histidine）或咪唑（imidazole）作為切斷試劑的話，因為可以使組氨酸標籤從鎳解離，含有標示物質的複合體可以從固相分離。

將含標示物質部分從複合體分離的切斷試劑，在切斷反應後，也可以移除，也可以使其失去活性；例如，藉由加入酸鹼值調節劑，反應場所從中性傾向酸性或鹼性的情形時，進一步加入酸鹼值調節劑來恢復中性的處置是合適的。

本發明的試劑由製備前述切斷試劑所構成。再者，本發明的試劑也可以做成試劑套組（reagent kit）的型態。試劑套組，在本發明的試劑《切斷試劑》之外，也可以製備例如清洗液、分散與標示物質結合了的第1捕捉物質的分散液、攜帶第2捕捉物質的固相的分散液的任一者或多個。

＜固相＞ 固相，係與第1捕捉物質結合的不溶性固體；加工成可以放置在反應場所的型態、形狀和尺寸。

固相的型態或形狀，沒有特別限定， 可以是作為反應場所的反應容器的內壁面或形成在反應容器的內側與反應容器變成一體的突起或結構等的構造體、或與反應容器分開做成的構造體的任一者。

與反應容器分開做成的固相，例示的有可以收納在反應容器內的板狀體（plates）、顆粒狀體（granule）、纖維狀體（fibrous bodies）、機織織物（woven fabrics）、不織布《或稱：無紡布》（non-woven fabrics）、薄膜（films）和片料（sheets）等。板狀體、顆粒狀體和纖維狀體，可以是空心（hollow）、實心（solid）、多孔（porous）等的任一種態樣。顆粒狀體的形狀，可以是球體、環狀體、扁平體、柱狀體、無定形體等的任一種形狀。球狀體，例如，可以選自磁性顆粒（magnetic particle）、玻璃顆粒、陶瓷顆粒、乳膠顆粒（latex particle）或聚乙烯等的高分子做成的樹脂顆粒（resin particle）中的至少一種。作為固相，較優選的是玻璃顆粒、陶瓷顆粒、磁性顆粒、或樹脂顆粒。 作為這樣的固相，理想的是使用顆粒狀體、纖維狀體、機織織物、不織布；更理想的是使用顆粒狀體、纖維狀體；又更理想的是使用顆粒狀體。

再者，固相和第2捕捉物質之間的結合，例如，可以使用物理性吸附、共價結合、離子結合、利用親和性的結合、以及這些結合的組合等的結合模式。理想的是，藉由共價結合、離子結合，以比親和力或吸附力產生的結合力更強的結合，將第2捕捉物質固定於固相。又，對於固相，在設定的檢測範圍《作為可檢測的已設定的目標物質的濃度範圍》內，以捕捉可檢測的最大量的目標物質所必需的數量的第2捕捉物質加以固定。

作為這樣的顆粒狀體，考慮捕捉目標物質的話，比表面積（specific surface area）較大者應較理想，但在引入與管狀通道連通的反應腔室的情形時，選擇從管狀通道的入口不會流入管狀通道的尺寸；舉例來說，顆粒狀體的長度、寬度、厚度之中的最小的尺寸，如果是入口直徑的1.2倍至5倍的程度的話，對該管狀通道的流入就充分受抑制。再者，管狀通道的入口形狀是不規則形（anomaly）的情形時，該入口直徑取短軸方向的尺寸。顆粒狀體，市售的直徑1微米（μm）〜100微米程度的各種珠子就可以取得；理想的使用的珠子係樹脂珠子，更理想的是粒子直徑10微米〜100微米的樹脂珠子，又更理想的是粒子直徑10微米〜50微米，特別理想的是粒子直徑15微米〜30微米的樹脂珠子。

＜反應場所＞ 本實施態樣中，目標物質的檢測方法，將試樣引入至具有預先已固定第2捕捉物質的固相的反應場所，使固相上的第2捕捉物質和試樣中的目標物質發生反應後，引入第1捕捉物質，將目標物質夾在中間，形成複合體。然後，將剩餘的第1捕捉物質排出至反應系統外。接著，如同前述，切斷複合體的結合，使含標示物質部分分離，該含標示物質部分的分離的步驟在反應場所進行。被固定的第2捕捉物質在固相上的表面密度（areal density）可以預先調整，因此，像這樣目標物質與第2捕捉物質反應之後，引入第1捕捉物質，檢體內包含的目標物質的濃度，從低濃度到高濃度的廣泛範圍，可以提高檢測的定量性。

再者，於反應場所中，形成複合體的反應，亦即，混合第1捕捉物質、和攜帶了第2捕捉物質的固相、和含有目標物質的試樣的步驟，只要能形成複合體，以任一者的順序引入反應場所可以，也可以一部分或全部同時引入。 也就是說，形成複合體的步驟，並未限定像前述一般先使固定在固相的第2捕捉物質與目標物質反應後，再與結合了標示物質的第1捕捉物質反應而形成複合體。舉例來說，也可以先使結合了標示物質的第1捕捉物質與目標物質反應後，再與固定在固相的第2捕捉物質反應而形成複合體；也可以使結合了標示物質的第1捕捉物質、和目標物質、和固定在固相的第2捕捉物質同時反應而形成複合體。

又，反應場所，只要是可以達成固相－第2捕捉物質－目標物質－第1捕捉物質《結合了標示物質的第1捕捉物質》的複合體的形成、和從該複合體分離含標示物質部分的場所，並無特別的限制。為了實施該反應步驟，可以僅使用1個反應場所，也可以使用數個反應場所；亦即，複合體的形成和含標示物質部分的分離，可以在相同的反應場所《空間》實施，也可以在不同的反應場所《空間》實施。

此反應場所，例如可以使用分隔的容器、腔室。作為反應場所，例如，可以使用試管（test tube）、微管（microtube）、微量盤（microplate）、微型反應器（microreactor）、生物碟片（biodisc）等形成的腔室（chamber）或管路（channel）。又，在反應場所的作業，可以手動進行，也可以自動進行。在反應場所的作業是自動化的情形時，例如，可以使用以腔室形態實施的裝置，也可以再進一步將該裝置做成可以繞中心軸旋轉的碟片（disc）形式。

最好是，該裝置具備至少一個反應場所是反應腔室的形態。碟片型態的裝置的情形時，反應腔室配置在比管狀通道更靠近碟片中心軸側的位置，並在外側與管狀通道連通。與管狀通道的內部直徑相比，反應腔室，通常，無論深度方向和寬度方向，都形成大的尺寸。理想上，反應腔室也可以做成朝向管狀通道收縮的形狀《研缽形狀》。靠著切斷試劑從固相分離的反應腔室的液體中的含標示物質部分，當碟片一旋轉，則從容量大的反應腔室間歇地供應到充滿在細小管狀通道的液體中。

連通反應腔室和管狀通道的連通口《管狀通道的入口》，使含標示物質部分通過，並且，與反應腔室分開形成的固相被引入反應腔室的情形時《例如，固相是珠子等固體的情形等，在反應腔室內具有流動性的情形時》，有必要將該固相做成以不會流出的尺寸。一般而言，考慮加工精密度的話，連通口，例如，5微米（μm）以上，較理想的是10微米以上，更理想的是15微米以上，在固相不會流入管狀通道的形狀大小為前提，設計便於加工的尺寸。

做為待檢對象的含標示物質部分，希望以減少污染物的狀態被引入檢測場所，於本發明的方法中，因為藉由離心力檢測在管狀通道移動的標示物質，引入管狀通道的試樣中，一旦混有剩餘的標示物質，則大大影響檢測準確度；因此，從試樣中除去剩餘的第1捕捉物質《係與標示物質結合的第1捕捉物質，包括沒有捕捉標示物質者、或游離的標示物質》成為重要的事。

試樣中除去剩餘的第1捕捉物質的方法，也可以選擇清洗處置。具體來說，形成夾住目標物質的複合體之後，進行清洗處置的話，可以除去沒有參與反應的剩餘第1捕捉物質；另一方面，由於捕捉到目標物質的第1捕捉物質，以目標物質和第2捕捉物質為媒介，固定在固相，就保留在反應場所。於該相關狀態時加入切斷試劑的話，在將剩餘第1捕捉物質去除至不影響檢測結果的水平的條件下，可以將已分離的含標示物質部分引入檢測場所。

又，從試樣中除去剩餘第1捕捉物質的方法，可以選擇利用離心排除。利用離心的剩餘第1捕捉物質的排除，使用碟片（disk）的話，可以容易地實施。具體地說，例如，當在反應腔室形成《或者引入》複合體，於捕捉到目標物質的第1捕捉物質固定於固相的狀態，被留置在反應腔室；另一方面，剩餘的第1捕捉物質，因為沒有被固定，於前述管狀通道充滿液體的狀態下，加上反應腔室的固相浸漬在液體中，於反應腔室和管狀通道以液體連通的狀態，施予離心力的話，藉由離心力，在管狀通道中移動，可以排出至反應腔室的外面。 然後，在反應腔室加入切斷試劑，含標示物質部分從複合體分離的話，於剩餘第1捕捉物質無共存的狀態，可以將含標示物質部分引入檢測場所。像這樣，利用離心力除去剩餘第1捕捉物質的情形時，可以不需要使用清洗劑等的清洗液的清洗處置。再者，從提高清洗力的觀點來看，也可以併用利用離心力的剩餘第1捕捉物質的去除即利用清洗劑的清洗，實施清洗處置。

再者，從反應腔室排出的剩餘的第1捕捉物質，為了藉由與該第1捕捉物質特異性結合的結合劑固定，也可以在剩餘的第1捕捉物質的移動路徑保留結合劑。此結合劑被攜帶於不干擾含標示物質部分通過管狀通道的位置。因此，從反應腔室排出的剩餘的第1捕捉物質，被固定在裝置內的預定的場所。

關於結合劑，例如，可以使用與第1捕捉物質特異性結合的抗原、或抗體，也可以是與第1捕捉物質的目標物質相同的物質。

又，前述抗原和抗體以外，也可以使用第1捕捉物質結合的核酸、核酸適配體（aptamer）、配體（ligand）《受質（substrate）、抑制劑（inhibitor）、競爭劑（competitor）》、或受體（receptor），作為結合劑。

作為結合劑使用的抗體，可以是多株抗體（polyclonal antibody），也可以是單株抗體（monoclonal antibody），但是從反應特異性的觀點來看，使用單株抗體較為優選。

又，作為結合劑使用的抗體，包括抗體及與該抗體有實質上相等反應性的抗體片段（antibody fragment）並修飾抗體。作為抗體片段，可列舉使用的有：抗原結合區段（Fab fragment；fragment, antigen binding）、F(ab’)2區段、Fab’ 區段、scFv區段等。

＜檢測場所＞ 檢測場所《第2反應場所》，係引入在反應場所《第1反應場所》分離的含標示物質部分，檢測該含標示物質部分引起的散射光的場所。此檢測場所，配置含標示物質部分移動的管狀通道，裝設了朝向該管狀通道照射光線的光源、和檢測從管狀通道的標示物質放射出來的散射光的光接收元件（light-receiving element）。

前述反應場所《第1反應場所》中，複合體形成之後，若實施前述清洗處置和離心處置的話，則將複合體以外的成分排出至系統外面。然後，實行含標示物質部分的切斷的話，則在對檢測有影響的剩餘的第1捕捉物質或其他的污染物都減少的狀態下，將試樣引入檢測場所。

管狀通道裝設在做成可以旋轉的裝置中。管狀通道，為了使從光源照射的照射光能到達其內部，以能發射待檢對象產生的散射光的半透明材料（translucent material）做成。

此管狀通道，以做成兩個末端開放的中空筒狀的形狀較合於理想，沿著旋轉半徑，從旋轉中心側朝向外邊伸展裝設。管狀通道的旋轉中心側《向心方向（centripetal direction）側》的開口端《以下，也稱為『一邊的開口端』》，與保留含有含標示物質部分的溶液的反應場所連通。管狀通道如果是中空的管路的話，其橫剖面形狀並沒有限制，可以是圓形管、也可以是角状管，也可以是扁平形狀。又，可以是無接縫的一個組件構成，也可以由複數組件組合起來構成。

管狀通道的內徑，為了不要發生阻塞，是在待檢對象的3倍〜15倍程度的範圍內，以反應場所《反應腔室》內的固相不會流入的形狀來設計。如同前述，與反應腔室的連通口《管狀通道的入口》，當固相被引入反應腔室的情形，亦即，固相是在與反應腔室不同的地方形成的情形時，管狀通道的內徑小於固相的尺寸，例如，做成固相的1/1.2至1/5程度的尺寸。詳細地說，固相的長、寬、高的個別最大值中的最小值為基準值，管狀通道的入口徑做成小於該基準值，較合於理想。固相是正方形的情形時，因為長、寬、高相等，任何一者作為基準值都可以。管狀通道的內徑，可以均勻地做成與入口直徑相同寬度，也可以做成與入口直徑不同的寬度，例如，可以做成是錐形（tapered）或階梯式（stepped）地加寬或變窄。

具體來說，例如，此管狀通道的內徑，係1微米〜100微米，較理想的是5微米〜50微米，更理想的是10微米〜20微米。內徑越小，則由於管狀通道內的污染物的存在量《絕對量》減少，污染物造成的散射光干擾可以減少。

如果限定管狀通道的高度以使固相不會流入，則流徑寬度，變成可以無關於固相的尺寸來設計。管狀通道的流徑寬度的最小值，係含標示物質部分的大小；上限值，係連通的反應腔室的接觸面的寬度。管狀通道的寬度變的越寬，則管狀通道的液體的流動可以順暢，但反應腔室的接觸位置擴大的結果，從反應腔室向著管狀通道的研缽形狀的傾斜變淺，可能影響固相蓄積範圍。從相關的點來看，管狀通道的流徑寬度較狹窄會較合於理想；因此，管狀通道的流徑寬度，鑒於液體的流動和在反應腔室的固相的蓄積狀態設定適當的寬度，例如，係100微米〜1釐米，較合理想的是100微米〜5毫米，更合理想的是500微米〜3毫米，又更合理想的是500微米〜1毫米。

管狀通道的外方側的開口端《以下，也稱為『另一邊的開口端』》，連通作為第2儲液室的排液儲液室。此排液儲液室，係被劃分為存留通過管狀通道的液體的空間。在裝置中做成的反應場所《第1反應場所》進行清洗處置，則清洗處置的廢液經由管狀通道排出，存留於此排液儲液室。排液儲液室配設在比管狀通道更下游的地方為優，例如，可以沿旋轉半徑在旋轉中心側配置一部分、也可以整體配置在外方側。

此處，本發明的方法中，為了實施標示物質的檢測，必須作成以液體填充在管狀通道的狀態。換言之，即使是離心力作用的情形時，也必須使管狀通道內的液體不會從開口端流出。因此，設計了限制管狀通道的液體的流動的限制機轉。此 限制機轉，例如，藉由從該排液儲液室的末端部分向旋轉中心側延伸裝設細窄的流徑，可以實現。 如此一來，在離心力的作用下，供給至管狀通道的液體，留存在排液儲液室中時，滿溢出的液體朝向旋轉中心側進入細窄的流徑。此處，由於液體表面形成在距離旋轉中心相同的距離處，如果液體供應直到它到達管狀通道的旋轉中心側的開口端《前述一邊的開口端》，即使在朝向旋轉中心側的流徑，液體表面也形成在與管狀通道的旋轉中心側的開口端《前述一邊的開口端》相同的位置，此際，一旦受到離心力，則即使中斷了液體供給，也可以抑制液體回流上游側。因此，管狀通道變成以液體充填狀態。

又，作為限制機轉，也可以使用排液儲液室；例如，排液儲液室，相對於管狀通道，至少一部份配置在旋轉中心側的情形，可以配置為沒有連接管狀通道側的端部分到達管狀通道的旋轉中心側的開口端《前述一邊的開口端》、或比管狀通道的旋轉中心側的開口端成為旋轉中心側。供給液體直至到達管狀通道的旋轉中心側的開口端《前述一邊的開口端》，則排液儲液室的液體表面和管狀通道的液體表面，形成與旋轉中心相同的距離；因而，管狀通道變成被液體充填。再者，此種情形時，排液儲液室，由於產生使管狀通道內的液體不會從開口端流出的作用，因此無需另外設置限制管狀通道內液體流動的限制機轉也可以。

再者，在裝置內不實施清洗處置的情形時，可以不設置該排液儲液室，並且可以從管狀通道的鄰接部位朝向旋轉中心側延伸設置細窄流徑。

又，此限制機轉的其他的實例，例如，在管狀通道的另一邊的開口端、或開口端連結的空間裝設開關閥（on-off valve）作為例示。如此，開關閥關閉的話，由於管狀通道的前方關閉，管狀通道內液體充填變成可能。作為開關閥，不僅是以電氣（electrically）、電磁（electromagnetically）、機械（mechanically）方式運行，後述的毛細管被動閥（capillary burst valve）《由於在施加超過預定值的離心力之前，液體不會從開口端流出，而產生閥門作用的機轉》等作為例示，可以從這些實例中選擇適當者使用。

在檢測之際，供給至管狀通道的液體在充填於管狀通道的狀態被施予離心力，含標示物質部分通過該管狀通道，從旋轉中心側的反應場所《第1反應場所》移動至裝置的外方側。

接下來，藉由將待檢對象的含標示物質部分引入管狀通道，照射光被散射而產生散射光。該散射光用光電二極體（photodiode）等光接收元件檢測，因此可以檢測特定注意的目標物質。

散射光強度，當標示物質的粒子徑在預定的範圍時，與粒子徑之間存在相關性，又，隨著粒徑不同，特定方向的散射光強度會改變。由於使用在標示物質的該粒子的粒子徑預先把握，在能夠檢測散射光的位置就可以配置光接收元件，就能適當地檢測散射光。再者，散射光全方向性地產生的情形時，可以在任何位置配置光接收元件。檢測的散射光，可以是前方散射光、也可以是後方散射光；隨著檢測的散射光散射的方向，適當地配置光接收元件。 又，在照射光入射的界面處，雖然產生變成干擾（noise）的反射光，藉由調整光源及光接收元件的個別的位置、角度，減少反射光的干擾，可以適當地檢測來自標示物質的散射光。

此處，舉例來說，如果使用像光學讀取頭（optical pickups）所用的通用雷射光源（laser light source）的光學系統、旋轉機轉的話，可以實現小型且價錢便宜的檢測設備。但是，當待檢對象的含標示物質部分以高速通過檢測場所時，在使用價格便宜的通用構件的檢測系統中，要精確檢測微小的標示物質造成的散射光就變成困難了。

此處，於本實施態樣中，雷射光元的雷射光斑（laser spot）是直徑D微米的情形時，在N每分鐘轉速（rpm；Revolutions Per Minute）旋轉的裝置《1旋轉：60N／秒》中，含標示物質部分以移動速度v微米／秒（μm／s）移動，使做為待檢對象的標示物質，進入雷射光斑內最少1次，於此情形下，成立下述公式。 當求解本公式時，關於移動速度 v，以下述數學公式表示。

依據這些，例如，雷射光斑直徑10微米、使裝置在2000rpm旋轉的情形時，標示物質的移動速度必須作成333微米／秒以下。

本發明的方法則不相同，也考量藉由流通液體，使含標示物質部分通過管狀通道，檢測從在管狀通道移動的標示物質的散射光。因此，靠離心力在裝置中流動的液體的移動速度，以下述公式計算。 U是流速《米／秒（m／s）》、Q是流量《立方米／秒（m ³／s）》、A是流徑橫斷面的面積《平方米（m ²）》、d _H是水力直徑（hydraulic diameter）《米（m）》、ρ是流體密度《公斤／立方米（kg／m ³）》、ω是角速度《弧度／秒（rad／s）》、r ₁是流徑中的液體的平均旋轉半徑《米（m）》、△是流徑出入口的旋轉半徑差、η是流體的黏度《公斤／米．秒（kg／m．s）》、L是流徑長度《米（m）》。

在20℃的水、旋轉數2000rpm下使媒介質旋轉的碟片上的半徑方向的預定位置，靠離心力流動的媒介質的移動速度，在公式(8)，藉由產生的離心力，在媒介質中移動200奈米（nm）的金膠體粒子的移動速度，以斯托克斯（Stokes' law）的公式為基礎計算出來，則前者變成60毫米／秒（mm／sec）、後者變成84微米／秒（μm／sec）。又，實際上，藉由旋轉，確認碟片內的液體高速移動。因此，在金膠體粒子《標示物質》的移動受到液體流動的支配的情形時，散射光檢測變成困難了。

所以，本發明中，管狀通道以液體充填，像離心管（centrifuge tube）般產生功能，含標示物質部分，靠著離心力可在液體中移動，就能夠以可以檢測散射光的移動速度在管狀通道移動。

管狀通道中的含標示物質部分的移動不受液體流動的支配的本發明，含標示物質部分在管狀通道移動的移動速度，如果與充填在管狀通道內的液體相同的話，則隨含標示物質部分《標示物質》的密度及粒徑、和離心力而變化，因此，藉由適當選擇裝置的旋轉數和標示物質，可以將移動速度定在希望的範圍內。

＜裝置＞ 裝置（device），係又稱為生物碟片（biodisc）、或微型反應器（microreactor）之物，保留複合體，配合需求用來進行反應的反應腔室《對應前述反應場所》，至少具備使待檢對象移動的管狀通道《對應前述檢測場所》，因應需要，做成流通液體的細小徑的流徑、或存留試劑或液體的儲液室，變成生物試樣的分析時使用。又，本裝置，做成可以旋轉以生成離心力。

本裝置，例如，可以使用丙烯酸樹脂（acrylic resin）、聚碳酸酯樹脂（polycarbonate resin）、矽樹脂（silicon resin,）等各種塑料、或玻璃（glass）、矽（silicon）等無機材料等的一般已知的材料、以一般已知的方法製作。該材料，具有半透明性以便可以光學地檢測待檢對象為優選，而若是透明的話為更優選。

本裝置，可以用一般已知的方法製作。例如，將具有流徑或腔室圖案的薄片（sheet）或板子（plate）和平坦的薄片或板子貼合起來，就可以製造。反應腔室等的內部構造，也可以藉由機械加工或用於微影製程（photolithography）的蝕刻（Etching）、其他的一般成型技術來做成。更進而，為了使照射到光接收元件的訊號的光量增大，也可以在管狀通道的裡面配置反射層。

設計在本裝置內的存留試劑或液體的儲液室，相對反應腔室，配設在旋轉中心側，用來藉由離心力將液體供給至反應腔室。於本發明的目標物質的檢測方法中，管狀通道充滿液體的狀態下，藉由離心力使待檢對象在管狀通道內的液體中移動，因此，充填在管狀通道的液體預先存留在儲液室的情形時，在預定的時間，存留在儲液室的液體充填至管狀通道。又，於本實施態樣中，對於攜帶在反應腔室內的複合體實施清洗處置的情形時，裝設作為第1儲液室的清洗液儲液室、和作為第2儲液室的排液儲液室，清洗液就存留於清洗液儲液室。排液儲液室，可以配置在管狀通道的下流側，對於管狀通道也可以至少一部分配置在旋轉中心側，對於管狀通道也可以全部配置在外方側。再者，清洗液可以兼做充填管狀通道的液體，相關的情形時，存留前述管狀通道充填的液體的儲液室和清洗液儲液室也可以做成1個空間《室》。 用清洗液儲液室裡存留的清洗液充填管狀通道的情形時，排液儲液室，例如，對於管狀通道至少一部份配設在旋轉中心側之時，沒有連通管狀通道的端部分，可以配設在與管狀通道的旋轉中心側的開口端《前述一邊的開口端》和旋轉中心等距或更近的位置。然後，在排液儲液室和管狀通道中，至少存留到達管狀通道的旋轉中心側的開口端的容量的清洗液在清洗液儲液室，則可以。排液儲液室的全部，對於管狀通道為配設在外方側的情形時，存留超過排液儲液室和管狀通道的總內容量、未滿於排液儲液室和管狀通道和反應腔室的清洗液，則可以。存留像這樣數量的清洗液，清洗後，管狀通道已清洗液充填、反應腔室液存留液體的同時，反應腔室的殘餘空間中，變成可以接受含標示物質部分的切斷試劑。

又，用存留在清洗液儲液室的清洗液充填管狀通道的情形時，清洗處置，可以在排液儲液室和管狀通道被清洗液填滿再進行，反應腔室的殘餘空間可以接受含標示物質部分的切斷試劑的話，也可以在清洗液超過管狀通道的容量流入反應腔室再進行。當清洗液除了流進管狀通道也流入反應腔室內，且清洗液存留於反應腔室內時，管狀通道與反應腔室以液體連通。

再來，於本實施態樣中，實施從複合體分離含標示物質部分的切斷處置，在裝置中實施的情形時，設計作為第3儲液室的切斷試劑儲液室，存留必需的切斷試劑。又，如同前述，在進行金屬膠體粒子的增敏反應（sensitization reaction）的情形時，設計增敏劑除液室，存留增敏反應所必需的增敏劑溶液。

存留在相關的儲液室裡的試劑，可以採液體的狀態存留，也可以採固體的狀態存留。採固體的狀態存留的情形時，做成構造是溶解試劑的溶解液流入存留這些固體的儲液室之後，從儲液室將試劑送出至反應腔室的構造。

在者，藉由熱或電磁波等，從外部環境施予能量，實施分離含標示物質部分的切斷反應的情形時，也可以不設計切斷試劑儲液室。

＜控制系統＞ 為了進行散射光檢測而配置在檢測場所的各種設備，靠著訊號處理設備以電力控制。又，以接受光的散射光為基礎來實施訊號處理，將散射光最為訊號，檢測標示物質《含標示物質部分》。 本發明的檢測方法中，使裝置旋轉，藉由產生的離心力，使待檢對象的標示物質在管狀通道內移動。其移動速度，如果已知標示物質、管狀通道內充填的液體、施予的離心力的話，則可以求出移動速度。又，從旋轉數和雷射光源的光斑直徑也可以算出容許的標示物質移動速度《前述公式(7)》。以這些為基礎，能夠導出旋轉速度的可設定範圍。 光接收元件，檢測來自預定的旋轉半徑位置的散射光；換言之，在預定的旋轉半徑位置，照射來自雷射光源的照射光，該光斑直徑變成檢測區域。光接收元件，配設在検測來自檢測區域的散射光的位置。作為光接收元件，例如，光電二極體（Photodiode）、雪崩光電二極體（avalanche photodiode；APD）、光電倍增管（Photomultiplier；PMT）、互補式金屬氧化物半導體（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor；CMOS）、電荷耦合元件（Charge Coupled Device；CCD）可作為例示，但並未侷限於此。

標示物質一旦進入雷射光源的光斑直徑內，則散射光照射進入作為光接收元件如光電二極體，接著，入射光做光電轉換（photoelectric conversion），從光電二極體輸出，對應入射的散射光強度的電壓值輸入類比數位轉換器（A/D converter；Analog-to-Digital Converter；ADC）；然後，在類比數位轉換器，於預定的取樣時間（sampling time）取樣，將訊號數位化，從類比數位轉換器輸入訊號處理設備。類比數位轉換器，只要能將類比訊號轉換為數位訊號者即可，並無特別限制，舉例來說，積體電路（integrated circuit；IC）或示波器（oscilloscope）都可以。取樣時間，以對於流徑寬度的解決為基礎來設計，例如，相對於雷射光源的光斑直徑，設定為在1／10以上、未及1／1的每個間隔可以取得數據；又例如，相對於2000rpm旋轉的管狀通道，在旋轉半徑50毫米的位置、雷射光源的光斑直徑為10微米的情形時，在約1微米的間隔取的數據，則取樣時間設定在100奈秒（ns）附近。

在訊號處理設備，例如，根據需要，在管狀通道剛充滿液體後、標示物質被供給到管狀通道之前，空白數據（blank data），與管狀通道的流徑的寬度方向的規定位置相關聯，加以存儲；然後，在每次預訂取樣時間，輸入的電壓值關聯的相同位置存儲的同時，算出與空白數據的差值。兩者的差值是預定的閾值以下的話，於該位置檢測不到標示物質，或者判斷為干擾的散射光，散射光產生無法計數《計數被取消》。另一方面，計算出來差值超過預定的閾值的情形時，判斷為是基於標示物質的散射光。再者，由於標示物質比雷射光源的光斑直徑小，在穿過光斑直徑《檢測區域》前反覆經過，得到散射光被檢測的結果。因此，複數次的測定後隨著電壓值降低《空白和輸入的電壓值的差值變成預定的閾值以下》，也可以做成散射光的產生次數計數為1的構造。

再進一步，依據本發明的檢測方法，可以充分地分離標示物質《含標示物質部分》和污染物分離而檢測，但是出於某種原因，可以假設在檢測標示物質的時點（timing）《從檢測開始，以標示物質的移動速度為基礎的預定時間的範圍》，標示物質以外的異物混入管狀通道、或起因於損傷等的管狀通道狀態的散射光產生。在這種情形時，由於異物和管狀通道引起的散射光的訊號模式與標示物質的訊號模式不同，可以辨析二者，能夠確實地檢測目標的檢測對象。辨析目標的檢測對象並能夠檢測的情形時，如前述的標示物質檢測前的空白數據的取得就不是必要的了。

此外，於本檢測方法中，標示物質和充填在管狀通道的液體，也可以預先確定雷射光源《光斑直徑》，並且也可以預先導出最適合檢測的裝置的旋轉速度《旋轉數》。因此，這些數值可以做為默認值（default）儲存在訊號處理設備；再者，也可以配置為在檢測之際讓使用者在輸入適當必要的值。此外，預先判明因管狀通道的損傷等產生特有的散射光的情形時，也可以將該訊號模式作為空白數據以默認值（default）儲存。

＜目標物質的檢測方法1《抗體檢查》＞ 關於本實施態樣相關的目標物質《抗體》的例示的檢測方法1，加以說明。本檢測方法，係使用圖1說明的檢測方法的概要具體化在抗體檢查。本方法中，首先，按照常規方法將相對於目標物質的抗原《第2捕捉物質》固定在聚苯乙烯珠子（polystyrene beads）《固相》表面；其次，實施封閉（blocking）後，將聚苯乙烯珠子《固定在固相上的第2捕捉物質》引入預定體積的容器中。聚苯乙烯珠子以分散在緩衝液（buffer）中的狀態引入，然後適當地進行過濾、離心分離等以除去溶劑。然後，加入含目標物質《抗體》的血清等的試樣，使其與珠子接觸一段預定時間進行反應後，如有必要可藉由緩衝液清洗，接著加入二級抗體溶液《結合了標示物質的第1捕捉物質》，使其反應一段預定時間。再者，於此處，標示物質做成金屬膠體粒子，如此，在珠子上形成抗原－抗體－二級抗體的夾心餅《三明治》型式的免疫複合體，用緩衝液清洗後，引入切斷試劑《酸鹼值調整劑》變成酸鹼值0〜4或酸鹼值10〜14，使含金屬膠體粒子部分從形成在固相上的免疫複合體游離出來。

再者，即使在這樣的抗體測試中，抗原固定在聚苯乙烯珠子（polystyrene beads）《固相》後，從哪個階段開始使用裝置的反應腔室作為反應場所，如上所述，使用者可以任意選擇。又，使用裝置的反應腔室的情形時，在聚苯乙烯珠子上，形成抗原－抗體－二級抗體的免疫複合體後，也可以僅做1次清洗處置。

切斷處置之後，進行已分離的含金屬膠體粒子部分的檢測。於本方法中，因切斷處置而分離的含金屬膠體粒子部分，引入裝置的管狀通道進行檢測。在連接管狀通道的反應腔室，設計了小於聚苯乙烯珠子直徑的尺寸的高度所做成連通口《入口》，含金屬膠體粒子部分，引入或存留在該反應腔室亦即管狀通道的前室。接著，藉由離心力，經過連通口《入口》引入管狀通道的同時，在管狀通道中向外移動。此處，管狀通道內已充填液體，由於實質上沒有產生液體的移動，藉著離心力，含金屬膠體粒子部分在該液相內移動。此管狀通道已有照射光照射，當金屬膠體粒子通過管狀通道之際，產生散射光；散射光在每次金屬膠體粒子通過時間歇性產生。由於對應各金屬膠體粒子的訊號，得到不只是連續的並且是特有的訊號，藉著測量這些訊號，可以檢測金屬膠體粒子，其結果可以檢測做為目標物質的抗體。

如同上述，藉由這種方法，可以實施檢測目標物質的目標物質檢測方法。

＜目標物質的檢測方法2《抗原檢查》＞ 關於本實施態樣相關的目標物質《抗原》的例示的檢測方法2，加以說明。本檢測方法，係更具體化關於圖1中概要說明的被稱為夾心餅《三明治》形式的免疫測定法。本方法中，首先，使用磷酸鹽緩衝生理鹽水（Phosphate buffered saline）《以下，稱為PBS》或緩衝液稀釋相對目標物質的抗體《第2捕捉物質》至適當的濃度，按照常規方法將抗體固定在聚苯乙烯珠子（polystyrene beads）《固相》表面；其次，實施封閉（blocking）後，將預訂容量的聚苯乙烯珠子《固定在固相上的第2捕捉物質》充填至預定體積的容器中。然後，加入含目標物質《抗原》的血清等的試樣，使其與珠子接觸一段預定時間進行反應後，用緩衝液清洗，接下來在金屬膠體粒子加入已標示的一級抗體《結合了標示物質的第1捕捉物質》，使其與抗原結合。如此，在聚苯乙烯珠子上，形成抗體－抗原－抗體的夾心餅《三明治》型式的免疫複合體。

再者，本方法也與前述的檢測方法1相同，從哪個階段開始使用裝置的反應腔室，使用者可以任意選擇。又，使用裝置的反應腔室的情形時，在聚苯乙烯珠子上，形成抗體－抗原－抗體的免疫複合體後，也可以僅做1次清洗處置。含金屬膠體粒子部分的檢測，與前述的檢測方法1相同，因此可以實施檢測目標物質的免疫測定法。

以下，關於本實施態樣的裝置的一個實例，利用圖2更詳細地說明。圖2係顯示用來實施目標物質的檢測的碟片（disc）1的概要之圖，圖2(a)係顯示碟片（disk）的全體圖，圖2(b)係圖2(a)的一部分放大圖。本碟片（disc）1，係在圓板形狀的塑膠碟片內做成液體可以流動的細微徑的流徑或腔室，為了要施予離心力，採用適合旋轉的圓板形狀，圓板中心成為旋轉中心。碟片1設計了6個單元（unit）2，構造為各個單元2可以各自獨立檢測目標物質。

在各個單元2，配備保留複合體的反應腔室10、和與反應腔室10互相連接的管狀通道11、和與管狀通道11互相連接的排液儲液室12、和存留清洗液的清洗液儲液室13、和存留切斷試劑的切斷試劑儲藏室14。

反應腔室10具備貫通腔室內外的供給口10a在其上表面，做成含固相溶液或試劑等可以從供給口10a投進去。反應腔室10，成為在本碟片1上的反應場所。引入反應腔室10的固相，一當施予離心力，就積聚在管狀通道11的內壁《包括頂部、底部、側面的任一者》。此處，固相抑制在反應腔室10的寬度方向《與旋轉半徑相交的方向的長度》的擴展並積聚，反應腔室10的外側形狀，當從頂部觀察時，形成像研缽的形狀。又，反應腔室10的管狀通道11側的內部，底面朝向管狀通道11側漸漸變淺，傾斜形成斜面。

本碟片1中，依照如圖1所示的步驟，可以順序實施必要作業。於本碟片1，反應腔室10中，可以實行從複合體分離含標示物質部分的處置，在反應腔室10，保留已形成的複合體《固相－第2捕捉物質－目標物質－結合了標示物質的第1捕捉物質所構成之物等》。

管狀通道11，係兩端開口的中空管路，沿著碟片1的旋轉中心延伸，並且旋轉中心側的開口端形成連通反應腔室10的連通口《入口》11a，另一邊的開口端，形成連通排液儲液室12的連通口《出口》11b。此管狀通道11，以半透明材料做成。管狀通道11的流徑寬度，做成比反應腔室10的寬度較狹小；又，其深度，使引入到反應腔室10的固相可以被阻擋，做成比引入的固相外形的最小外徑更小。在本碟片1，管狀通道11，接觸連接到反應腔室10的上側，與反應腔室10連通；管狀通道11，由於做成具有限定其深度方向來阻擋引入反應腔室10的固相的構造，所以流徑寬度被設計為與固相的尺寸無關。

排液儲液室12，相對管狀通道11，與碟片1的旋轉半徑方向外側相互連接，存留在反應腔室10產生的廢液。管狀通道11和排液儲液室12，藉由連通口《出口》11b連通，反應腔室10的廢液經由管狀通道11排出至排液儲液室12。又，排液儲液室12，以連通口11b為中心向兩側延伸，連接從其兩端朝向旋轉中心側延伸的細窄流徑17。，其前端連通清洗液儲液室13。超過排液儲液室12容量而供給的液體，在侵入此流徑17的同時，也侵入管狀通道11。

清洗液儲液室13，係規劃設計為存留要加入反應腔室10的清洗液的空間，在碟片上表面側設置為了引入清洗液而做成貫通的引入口13a。又，清洗液儲液室13，相對於反應腔室10，配置在旋轉中心側，靠著流徑15連接至反應腔室10。再者，於單元2，只設計1個清洗液儲液室13，保存1次份的清洗液。於本碟片1中，在清洗液儲液室13，存留著超過排液儲液室12和管狀通道11的總容量、又未達到排液儲液室12和管狀通道11和反應腔室10的總容量的數量的清洗液。

切斷試劑儲藏室14，係規劃設計為存留要加入反應腔室10的切斷試劑的空間，在碟片上表面側設置為了引入試劑而做成貫通的引入口14a。又，切斷試劑儲藏室14，相對於反應腔室10，配置在旋轉中心側，靠著流徑16連接至反應腔室10。

切斷試劑，存留在切斷試劑儲藏室14的全部數量，調整成高濃度收存在切斷試劑儲藏室14，使其在加入反應腔室10的時候變成所要的最終濃度。

流徑15、16，係在兩端開口的可自由開關的細微通道的中空管。此處，所謂『自由開關』，表示可以控制往流徑內外的液體的移動的狀態；也就是，可以根據旋轉數切換打開狀態和關閉狀態。還有，階段式提高旋轉數的本實施態樣中，在打開狀態時，流徑15、16就依原樣打開著直到一系列處置結束，雖然具有可自由開關的功能，但實際上是做成可以打開的。亦即，在本發明的檢測方法中，也可以用可以打開的流徑代替可自由開關的流徑，連通切斷試劑儲藏室14和反應腔室10。流徑15、16，具有稱為毛細管被動閥（capillary burst valve）的功能，當施予預定值以上的離心力時，就進入打開模式，再預定值以下的離心力時，則不產生液體的流通。流徑15的內徑，設計成比流徑16的內徑大，在比流徑16打開較低的離心力《較低的旋轉數》時就可打開，因此，清洗液從清洗液儲液室13被供給至反應腔室10；然後，旋轉數提高的話，流徑16就打開，切斷試劑儲藏室14的切斷試劑流通，將切斷試劑加入至反應腔室10。

再者，供給清洗液至反應腔室10的旋轉數，根據突發（burst）的難易程度為基礎來決定。突發（burst）的難易程度，因流徑的形狀、在流徑中流動的液體的特性而變動，舉例來說，流徑剖面面積、流徑長度、流徑的入口和出口位置《旋轉半徑》及形狀、液體的表面張力、接觸角度、黏度，都有影響。因此，考慮這些因素，從理論或透過實驗選擇旋轉數。再者，從機械負荷的觀點來看，適當的旋轉數以10,000rpm以下為優選。 本碟片1，係做成清洗次數為1次的構造，但是清洗次數變成複數次的情形時，設計清洗液儲液室13劃分為複數，個別裝設流徑。然後各流徑連接至反應腔室10。又，每個流徑都設計為低於流徑16打開的旋轉數並且以不同的旋轉數個別打開。

使用此碟片1檢測目標物質的情形時，在反應腔室10內，首先，已固定第2捕捉物質的珠子《固相》所散布的溶液，從供給口10a被引入反應腔室10內；在反應腔室10內，做成與管狀通道11連通的連通口11a，對於固相，選擇無法通過連通口11a的大小之物，因此，引入的溶液中的固相被留置在反應腔室10內。

其次，從供給口10a將稀釋至適當濃度的試樣供給至反應腔室10，使試樣中的目標物質被珠子上的第2捕捉物質捕捉，經過一段預定的時間後，從供給口10a將含地1捕捉物質的溶液供給至反應腔室10，目標物質與第1捕捉物質結合，形成複合體。如此，複合體保留在反應腔室10。再者，反應腔室10內的溶劑，隨著旋轉從連通口11a排出，經過管狀通道11，存留在排液儲液室12內。

以預定的旋轉數使碟片1旋轉，當流徑15打開，則清洗液儲液室13的清洗液供給至反應腔室10，實施清洗。經由此，反應腔室10內的剩餘的第1捕捉物質、或其他的污染物，靠著清洗液轉移至排液儲液室12。

隨著清洗液從清洗液儲液室13排出，清洗液逐漸儲存在排液儲液室12中，由於清洗液儲液室13存留超過排液儲液室12容量的清洗液，因此從排液儲液室12清洗液滿溢而侵入流徑17，更進而在管狀通道11也使液面上升。此處，由於在碟片1上有向外的離心力作用，所以清洗液不會亂流到反應腔室10側。又，流徑17一直在排出空氣，反應腔室10、管狀通道11、排液儲液室12的空氣也跟著朝向流徑17排出，並被推出清洗液儲液室13。一旦清洗液完全從清洗液儲液室13排出，則排液儲液室12和管狀通道11，被液體充填，更進而連反應腔室10也積留液體，一邊在旋轉中心側留有間隙、一邊固相形成浸漬的狀態。再者，藉由清洗液的流動，運送到排液儲液室12的大部分的第1捕捉物質，靠著發生作用的離心力，沉澱在排液儲液室12的底部《外方側》。

其次，將旋轉數提高到打開流路16的規定旋轉數，使儲存在切斷試劑儲藏室14中的切斷試劑流出至反應腔室10。因此，反應腔室10內的切斷室劑濃度漸漸升高，從複合體切斷含標示物質部分，使之分離；分離的含標示物質部分通過管狀通道11移動至排液儲液室12。

來自光源的照射光照射在管狀通道的預定位置，因此，含標示物質部分通過管狀通道11之際，產生散射光。藉由用光接收元件檢測這些散射光，可以適當地檢測含標示物質部分，其結果，能夠檢測目標物質。

圖3係第一實施態樣的碟片1的修改例（modification），係顯示碟片的另外一個實例的圖。本修改例，具體上，係碟片1的單元2變更而來的，本修改例的單元2圖示在圖3，與前述碟片1相同的部分賦予相同號碼，省略其說明。

於本單元2中，從旋轉中心側朝向外方，設計了第1儲液室101、與第1儲液室101連通的流徑102、存留充填在管狀通道11的液體的第2儲液室103、管狀通道11；然後，裝設了從管狀通道11的前端分支的分支流徑的端部朝向旋轉中心側延伸設置的細窄流徑17。

本單元2，係用來將在碟片1的外部的反應場所中實行含標示物質部分的分離的試樣導入碟片1內，進行含標示物質部分的檢測，因此，無須實施在碟片1的清洗處置。

於本單元2中，首先，預定數量試樣溶液從第1儲液室101的上面開口101a引入到第1儲液室101內，此處，由於流徑102是具備毛細管被動閥（capillary burst valve）的功能的構造，在靜置狀態下被引入的試樣溶液不會通過流徑102流出到第2儲液室103。又，充填在管狀通道11的液體的預定數量，從第2儲液室103的上面開口103a引入到第2儲液室103內。在第2儲液室103，於旋轉中心側的端部分，流徑102的延伸線之外的位置朝向旋轉中心側裝設了突起的引入部分。開口103a，形成貫穿在此引入部分的上表面。如此，保留在第1儲液室101的試樣溶液引入第2儲液室103之際，可以抑制液體從開口103a漏出。

在第2儲液室103的深度方向的上方部分，相互連接管狀通道11，成為連通的構造。第2儲液室103存留充填管狀通道11必要數量的液體，但當管狀通道11充滿液體時，由於在管狀通道11及其前面的分支流徑、和連通它們的流徑17中，直到對應管狀通道11的連通口《入口》11a的位置，都變成充滿液體，以這些管狀通道11、其前面的分支流徑和流徑17的對應部分的容積總和為基準，設計第2儲液室103。又，在液體存留的狀態下，設計第2儲液室103的構造，使存留的液體的液面變成低於管狀通道11的連通口11a的底部。再者，由於裝置1以通用樹脂材料製成時，第1、第2儲液室101、103的內部成為疏水性（hydrophobic）表面，使引入的水性試樣溶液及管狀通道充填用液體朝著貯留在各自的室內的方向作用。

然後，使裝置1以流徑102不會打開的預定的旋轉數旋轉，第2儲液室103的液體引入管狀通道11。此處，流徑17，因為作為排空氣功能，在預定的旋轉數使裝置1旋轉，第2儲液室103的液體就順利地引入管狀通道11。

接下來，當提高旋轉速度到流徑102打開，則試樣溶液從第1儲液室101流出至第2儲液室103，然後，含標示物質部分，藉由離心力在管狀通道11朝向外方移動。因此，在碟片1的外部的反應場所實施至切斷處置的情形時，用簡單的裝置構造就可以實施目標物質的檢測。

再者，碟片1的旋轉，例如，使用圖4顯示的裝置。該裝置具備馬達（motor）、和連接馬達的旋轉軸，此旋轉軸上，旋轉支撐（pivoted supported）用來使碟片1在水平方向旋轉的裝載台。當馬達啟動，則裝載在裝載台上面的碟片1就旋轉，被施予離心力。馬達連接未顯示在圖中的微控制器（microcontroller），以微控制器為媒介，連接訊號處理設備《個人電腦（personal computer；PC）》。訊號處理設備，在連接的各設備之間接收送出訊號，控制各設備。還有，訊號處理設備《個人電腦》，只要是可以實施訊號控制的設備，並沒有特別限制。一旦來自訊號處理設備的控制訊號輸入微控制器，則微控制器控制馬達使其以預定的旋轉數旋轉預定的時間。

裝載台，裝載碟片1的情形時，在與管狀通道11相對的位置，設有沿著厚度方向貫通的窗。在裝載台的上方，設置調整過的雷射光源《雷射二極體（laser diode；LD）》，使對於裝載台的上面照射光以傾斜的角度射入。在雷射光源的前面，配設對焦透鏡（focus lens），來自雷射光源的照射光，調整為使照射光在管狀通道11內聚焦。此雷射光源，由前述微控制器為媒介，連接個人電腦，藉著接受來自個人電腦的指令的微控制器，控制其輸出。

在裝載台的窗的下方，配置聚焦透鏡（condenser lens）和光電二極體（photodiode；PD），做成接受散射光的構造。藉由光電二極體的光電轉換（photoelectric conversion），散射光強度被轉換為電壓並輸入到信號檢測器《示波器（Oscilloscope）》；在信號檢測器，以預定的採樣時間（sampling time）進行抽樣（sampling），將輸入的類比信號（analog signal）《電壓值（voltage value）》轉換為數位信號（digital signal），並輸入到個人電腦中，接著在個人電腦中輸出散射光的測定結果。如此，取得標示物質的散射光，界能夠檢測目標物質。

以上，以實施態樣為基礎，說明本發明，但是本發明並未侷限於前述實施態樣的任一者，可以很容易地推斷在未脫離本發明要旨的範圍內，可以進行各種改良和修改。

舉例來說，碟片1，也可以做成裝設控制流體移動的適當機轉的構造。作為此種機轉，閥等可為例示；這樣的閥，是流徑或室的連通口切換關閉狀態和打開狀態之物，前述流徑15、16裝設的毛細管被動閥（capillary burst valve）以外，可以使用藉由電力、磁力、電磁力、機械的機轉（mechanical mechanism）、慣性力（inertial force）、離心力、熱運轉的各種物件。

接著，例如，碟片1是圓形的圓板，已說明過，但在本發明中，並未限定是圓板，其他的形狀也可以。也就是，於本發明的方法中，裝置只要是在能施予離心力的態樣，其形狀並沒有大的限制。因此，例如，只具備一個單元2時，外型做成扇形、或成型為長方形的晶片型可作為例示。在這種情形時，使裝置旋轉的設備的裝載台，設計保持晶片的機關或夾具，將晶片嵌入其中，藉著旋轉可以施予離心力。

作為本發明的修改例，可用以下的發明作為例示。 結合了標示物質的第1捕捉物質將目標物質捕捉形成的複合體、和未捕捉目標物質的前述第1捕捉物質混合一起的試樣中，使其接觸特異性結合前述第1捕捉物質的結合劑，未捕捉目標物質的前述第1捕捉物質與前述結合劑結合、及前述結合劑留置在存留試樣的腔室內，施予離心力，前述複合體由前述腔室引出，使其在充填液體的管狀通道移動，提出藉由在前述管狀通道移動的前述複合體將照射光散射而生成的散射光，檢測前述複合體的目標物質檢測方法。

本修改例中，待檢對象是目標物質和第1捕捉物質結合形成的複合體。此處，由於未與目標物質結合的剩餘的第1捕捉物質也結合了標示物質，如果這些被引入檢測場所，則從未反應的第1捕捉物質也檢測了散射光，使檢測結果產生誤差。在前述的第一實施態樣，一旦目標物質固定在固相，而第1捕捉物質攜帶在固相，又，藉由適當的清洗處置，除去剩餘的第1捕捉物質，但在本修改例，剩餘的第1捕捉物質與結合劑結合，又，由於結合劑留置在腔室中，剩餘的第1捕捉物質可以留置在腔室中，抑制這些被引入檢測場所，不需要清洗並且可以達到複合體檢測的精確度（accuracy）提高。

複合體的形成、以及剩餘的第1捕捉物質與結合劑的結合，是在液體存留的狀態下實施，舉例來說，管狀通道和用來供給試樣至管狀通道的前室《腔室》設計在1裝置中的同時，結合劑留置在前室的話，使引入前室的試樣裡所含有的剩餘的第1捕捉物質和結合劑結合，可以留存在前室。還有，留置結合劑的腔室，沒必要一定和裝置一體形成，也可以使用設在裝置外的其他的腔室來留置剩餘的第1捕捉物質。在腔室中，留置剩餘的第1捕捉物質的情形時，可以適當選擇腔室的內壁已固定結合劑，或者，將結合劑固定在固體並將其引入腔室中的方法。

又，結合劑引入前室的情形時，固定了結合劑的固體比管狀通道大的話，就可以留置剩餘的第1捕捉物質。然後，在腔室裝設閥門（valve），管狀通道的液體充填結束後，打開閥門，目標物質和的1捕捉物質結合形成的複合體引入管狀通道，也可以做成這樣的構造。

＜結合劑＞ 結合劑，係與第1捕捉物質特異性結合之物，比較適當的例示是抗原。又，抗原，可以直接地攜帶在內避禍固體等固相上，也可以以抗體等為媒介間接地固定在固相上。又，例如，當使用抗原作為結合劑時，此抗原上已附加生物素（biotin）等的標籤（tag），如果使蛋白質卵白素（avidin）與固相結合，則藉由生物素－蛋白質卵白素的結合可以將結合劑固定在固相上。

再者，固相和結合劑之間的結合，例如，物理性吸附、共價結合、離子結合、利用親和性的結合、以及這些結合的組合等的結合模式可以使用。理想的是，藉由共價結合、離子結合，以比親和力或吸附力產生的結合力更強的結合，將結合劑固定在固相。

還有，標示物質比第1捕捉物質大的情形時，假定標示物質有複數的第1捕捉物質結合，但於本修改例中，與標示物質結合的第1捕捉物質的數目越少，月可以做好，理想上，希望與標示物質結合的第1捕捉物質是1個。 [實施例]

關於本發明，以下，藉由實施例更進一步詳細說明。再者，本發明並未侷限於實施例的描述。

＜參考例1＞白金－金膠體懸浮液的調製 將所使用的玻璃器具全部以王水洗淨。將390毫升（mL）的超純水（ultrapure water）放入燒瓶中，使其沸騰，於此沸騰水中加入氯金(III)酸（chloroauric acid）水溶液《水溶液1公升（L）含金1公克（g），片山化學工業公司製造》30毫升，然後，加入1%重量比的檸檬酸鈉（sodium citrate）水溶液60毫升；加入檸檬酸鈉水溶液後，加入氯鉑(IV)酸（chloroplatinic acid）水溶液《水溶液1公升含白金1公克，和光純學工業公司製造》數十毫升；然後在5分鐘後，加入1%重量比的檸檬酸鈉水溶液60毫升，進行4小時的回流（reflux），得到白金－金膠體懸浮液（platinum-gold colloid suspension）。又，適當加入試劑和還原劑，將膠體粒子直徑調整至100奈米（nm）以上，以便能夠準確檢測含標示物質部分。

＜參考例2＞單株抗體（monoclonal antibody）的調整 市售的新冠病毒核衣殼蛋白（SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein）《以下，簡稱為『SARS-CoV-2 NP』》《CUSABIO公司》作為免疫用抗原，依照一般的方法，取得SARS-CoV-2 NP單株抗體《以下，簡稱為『抗NP抗體』。

具體的說，將小鼠（mouse）《BALB/c（巴比賽），5週大、日本SLC》用100微克的新冠病毒核衣殼蛋白《SARS-CoV-2 NP》免疫3次，取脾臟細胞進行細胞融合（cell fusion）。在細胞融合方面，使用小鼠的骨髓癌細胞（myeloma cell）即Sp2／0-Ag14細胞（mouse hybridoma）《Shulman等人，1978》；在細胞的培養方面，於達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM）《Gibco公司》中，加入左旋麩醯胺酸（L‐glutamine）0.3毫克／毫升（mg／mL）、苄青黴素鉀（Penicillin G potassium）100單位／毫升、硫酸鏈黴素（streptomycin sulfate）100微克／毫升、慶大黴素（Gentacin）40微克／毫升《達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基（DMEM）》，培養基中再加入胎牛血清（fetal bovine serum；FBS）《JRH公司》達到10%，用來作為培養液。 細胞融合，將免疫小鼠的脾臟細胞和SP2／0-Ag14細胞混合，藉由加入聚乙二醇溶液（polyethylene glycol solution）《Sigma公司》至混合物中來進行；融合的細胞在HAT-RPMI《含有0.1毫莫耳（mM）次黃嘌呤鈉（Sodium Hypoxanthine）、0.4微莫耳（μM）氨基蝶呤（Aminopterin）和 0.1毫莫耳（mM）胸苷（Thymidine）［Gibco公司］的添加血清RPMI》培養基培養，藉由酵素結合免疫吸附分析法（Enzyme-liked Immunosorbent Assay；ELISA）在培養上清層（supernatant）中確認產生抗體。將產生抗體陽性的細胞放在HT-RPMI《含有0.1毫莫耳（mM）次黃嘌呤鈉（Sodium Hypoxanthine）和 0.1毫莫耳（mM）胸苷（Thymidine）的添加血清RPMI》培養基培養，使其增生。

選殖（cloning）的細胞，接種至已接種2,6,10,14-四甲基十五烷（2,6,10,14-tetramethyl-pentadecane）《Kishida化學公司》的小鼠《BALB/c（巴比賽），退休，日本SLC》的腹腔內，抽取腹水。將該腹水放入蛋白G管柱（protein G column），用來純化單株抗體；最後得到83株針對SARS-CoV-2NP的單株抗體產生細胞。

＜參考例3＞金膠體懸浮液的調製 氯金(III)酸（chloroauric acid）水溶液《水溶液1公升（L）含金1公克（g），片山化學工業公司製造》作為原料，依照一般方法調整金膠體粒子；具體地說，藉由加熱使其沸騰的純水99毫升中，加入1%(v/w)氯金(III)酸水溶液1毫升，然後在1分鐘後，加入1%(v/w)檸檬酸鈉（sodium citrate）水溶液1.5毫升，加熱5分鐘使其沸騰後，放置在室溫冷卻。接下來，於此溶液中加入200毫莫耳碳酸鉀（potassium carbonate）水溶液，調製成酸鹼值9.0，再加入超純水使全部數量成為100毫升，得到金膠體粒子懸浮的金膠體粒子懸浮液。再者，沒有得到預期的粒子直徑的情形時，適當調整針對氯金(III)酸的還原劑的加入量，製作所需要的粒子直徑的金膠體粒子。

＜實施例1＞使用酸鹼值調整劑的含標示物質《白金－金膠體粒子》部分的分離 （1）白金－金膠體標示抗體溶液的調製 對於選自在參考例2取得的抗NP抗體的1個抗NP抗體，依照以下的順序進行白金－金膠體標示。將抗NP抗體的蛋白質當量（protein equivalent weight）1微克《以下，當表示蛋白質當量時，係以由純化蛋白質的重量分析而來的重量數值表示》和在參考例1調製的粒子直徑120奈米的白金－金膠體粒子懸浮液1毫升混合，在室溫靜置2分鐘，使抗NP抗體結合在白金－金膠體粒子的表面；然後，加入10%牛血清白蛋白（bovine serum albumin）《以下，寫為『BSA』》水溶液，使最後濃度針對全部液體量變成1.0%，藉由用BSA封閉白金－金膠體粒子的殘留表面來製備白金－金膠體標示抗NP抗體溶液。然後，以離心分離《600相對離心力（ ×ｇ），25分鐘》該溶液，使白金－金膠體標示抗NP抗體沉澱，除去上清層，取得白金－金膠體標示抗NP抗體。將取得的白金－金膠體標示抗NP抗體懸浮在含有10%蔗糖（saccharose）和1%BSA和0.5% 曲拉通X-100（Triton X-100；C ₁₄H ₂₂O(C ₂H ₄O)n）《商品名》的50毫莫耳三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液《或稱：Tris鹽酸緩衝液》（Tris Hydrochloric Acid Buffer；Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride buffer solution）《酸鹼值7.4》，做成白金－金膠體標示抗體溶液。

（2）用酸鹼值調整劑作切斷處置 在參考例2取得的抗NP抗體中，與用於前述白金－金膠體標示抗NP抗體的抗NP抗體不同的抗體，在Tris鹽酸緩衝液中，製作成調整至20微克／毫升的抗體稀釋液；在96小井（well）微量盤（microplate）的各小井，加入該抗體稀釋液100微升，靜置15〜18小時，將抗體固定。然後，施予封閉處置，加入調整為10奈克／毫升（ng／mL）的SARS-CoV-2 NP溶液50微升、和白金－金膠體標示抗體溶液50微升，在37℃靜置10分鐘；接下來，用TBS－T《Tris鹽酸緩衝液－吐溫20（或稱：聚山梨醇酯20）》（Tris Buffered Saline with Tween 20）清洗，排出清洗液後，加入酸鹼值不相同的各種試劑100微升，在室溫靜置2分鐘後，回收小井內的溶液。所用的試劑和酸鹼值顯示在表1。酸鹼值係使用酸鹼度測定計（pH-meter）《LAQUA 堀場公司製造》測定。

再者，檸檬酸溶液（citric acid solution）的酸鹼值，將檸檬酸和檸檬酸三鈉鹽（trisodium citrate）混合並調整，做成期望的酸鹼值的溶液《pH2.94〜pH6.96》。又，磷酸溶液，將磷酸二氫鈉（sodium dihydrogen phosphate）和磷酸氫二鈉（disodium hydrogen phosphate）混合並調整，做成中性附近的期望的酸鹼值《pH6.99〜pH8.56》，將磷酸二氫鈉（sodium dihydrogen phosphate）和磷酸三鈉（trisodium phosphate）混合並調整，做成鹼性的期望的酸鹼值《pH11.33〜pH12.85》。關於甘氨酸鹽酸緩衝液（glycine hydrochloric acid buffer）、甘氨酸氫氧化鈉緩衝液（glycine NaOH buffer）和三乙胺溶液（triethylamine solution），加入鹽酸或氫氧化鈉來調製所要的酸鹼值。又，鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液，改變稀釋的倍數來調節酸鹼值。

【表1】

酸鹼值調整劑	酸鹼值
鹽酸	1.89
甘氨酸鹽酸	1.53	2.48	3.18
檸檬酸	2.94	3.97	4.92	5.93	6.96
磷酸(中性)	6.99	7.97	8.56
甘氨酸氫氧化納	8.60	8.98	10.51
三乙胺	9.73	10.53	11.63
磷酸(鹼性)	11.33	12.09	12.85
氫氧化納	13.90

（3）白金－金膠體粒子的測定 經由前述的作業而回收的溶液中，測定所含有的白金－金膠體粒子的量。具體地說，回收的溶液引入到試樣管（sample cell）中，對於試樣管，用650奈米（nm）的雷射光束（laser beam）照射而獲得散射光，以設置在預定位置的光電二極管（photodiode）測量該散射光。

由於溶液中的白金－金膠體粒子的濃度和散射光強度增加成比例，藉著測定散射光強度，可以定量分析溶液中的白金－金膠體粒子的濃度。亦即，藉著以酸鹼值調整劑處理免疫複合體，可以檢測從固相或免疫複合體分離出來的『含白金－金膠體粒子部分』。

再者，白金－金膠體標示抗NP抗體，《在抗原以外的地方》非特異性吸附，靠著清洗處置無法除去的情形時，藉由酸鹼值調整劑而分離，混入測定試樣中。所以，與前述相同抗體固定處置的小井中，只加入白金－金膠體標示抗NP抗體溶液100微升，在37℃靜置10分鐘，接著，用TBS－T《Tris鹽酸緩衝液－吐溫20（或稱：聚山梨醇酯20）》（Tris Buffered Saline with Tween 20）清洗，加入酸鹼值調節整劑液100微升，在室溫靜置2分鐘後，從小井回收溶液，進行散射光測定。每次對個別的酸鹼值調整劑進行相同的作業，所得到的散射光強度作為每種酸鹼值調整劑的空白值（blank value）。 再者，酸鹼值調整劑切斷複合體的處置能力較弱的情形時，由於試樣的散射光強度和空白值的射光強度的差值變小，兩者的差值的結果中, 試樣測量結果的散射光強度，可能以負值表示。

空白值，由於能夠估計在小井內來自非特異性吸附的白金－金膠體標示抗NP抗體的白金－金膠體粒子的散射光強度，從測定值減去該空白值，作為已形成的免疫複合體的『含白金－金膠體粒子部分』的散射光強度。其結果顯示於圖5。

圖5，係顯示各試劑的酸鹼值和切斷特性的關係的圖。在圖5的下方，已顯示各試劑的酸鹼值和對應的散射光強度的值；在圖5的上側，以圖形（graph）表示各值，圖形橫軸是酸鹼值，縱軸是散射光強度。從圖5可以看出，酸鹼值是中性附近的情形時，散射光強度低，也就是，加入的中性試劑，對複合體的『含白金－金膠體粒子部分』表現出較低的切斷性能；另一方面，加入的試劑是酸性或鹼性的情形時，散射光強度會提高，藉由酸或鹼等的酸鹼值調整劑，顯示可以切斷結合在固相的複合體《固相－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－白金－金膠體標示抗NP抗體》的『含白金－金膠體粒子部分』。

特別是，酸鹼值低於4的酸鹼值調整劑《酸》、酸鹼值10.6以上作成的酸鹼值調整劑《鹼》顯示具有良好的切斷性能，更進一步，酸鹼值11.6以上的酸鹼值調節劑《鹼》顯示具有極優的切斷性能。

＜實施例2＞使用氫氧化鈉的含標示物質《白金－金膠體粒子》部分的分離 實施例1的結果，由於氫氧化鈉溶液的切斷力特別良好，再進一步進行評價改變氫氧化鈉的濃度，從結合在固相的複合體《固相－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－白金－金膠體標示抗NP抗體》的含標示物質部分的切斷性能。

氫氧化鈉的濃度，做成0.01毫莫耳、0.1毫莫耳、1毫莫耳、10毫莫耳、100毫莫耳、1莫耳。使用調整成各濃度的氫氧化鈉水溶液100微升以外，施行與實施例1相同的處置，結果顯示在圖6。

圖6，係顯示對於複合體的氫氧化鈉的切斷性能的圖。在圖6的下方，已顯示氫氧化鈉的各濃度的酸鹼值和散射光強度的值；在圖6的上側，以圖形（graph）表示各值，圖形橫軸是氫氧化鈉的莫耳濃度，縱軸是散射光強度。 從圖6也可看出，在10毫莫耳以上的濃度，氫氧化鈉使免疫複合體的含白金－金膠體粒子部分分離《游離》出來，是很明顯的了。再者，10毫莫耳的氫氧化鈉溶液的酸鹼值是11.87。

＜實施例3＞使用變性劑（denaturant）的含標示物質《白金－金膠體粒子》部分的分離 準備微量盤（microplate），該微量盤具備用與實施例1相同的方法將抗NP抗體固定並施予封閉處置的小井。然後，將此微量盤的小井作為固相，對於形成的複合體《固相－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－白金－金膠體標示抗NP抗體》，用變性劑（denaturant）取代酸鹼值調整劑使其作用以外，與實施例1相同，回收小井的溶液，與實施例1（3）相同，進行白金－金膠體粒子量的測定。再者，關於變形劑，使用8莫耳尿素、6莫耳鹽酸胍（guanidine hydrochloride）、或1%十二烷基硫酸鈉（SDS；sodium dodecyl sulfate）。其結果顯示於圖7。再者，為了比較，使用1莫耳氫氧化鈉進行相同的處置的結果，一併顯示在圖7。

圖7係對於結合在固相的免疫複合體的變性劑的作用以分離《游離》出來的白金－金膠體《含白金－金膠體粒子部分》的散射光強度顯示的圖。以使用1莫耳氫氧化鈉的情形作為比較數據來表示。從圖7可以看出，任何一種變性劑都能使含白金－金膠體粒子部分游離出來，是很清楚的。

＜實施例4＞金膠體粒子的增敏處置（sensitization treatment） 將在參考例3已調整的金膠體粒子懸浮液《粒子徑約12奈米》用純水調整至4.36奈莫耳（nM）的濃度，將其2微升加到1莫耳氫氧化鈉100微升中並且混合。這個1莫耳氫氧化鈉的處置，係用針對複合體的酸鹼值調整劑的切斷處置示意性地進行。加入100微升的1莫耳鹽酸加以中和，此中和液6.35微升加入10毫莫耳沃波爾緩衝溶液（Walpole's buffer solution）《酸鹼值2.0》972微升和12.1莫耳氯金酸《氯金(III)酸》（chloroauric acid；H[AuCl₄]）溶液1.65微升的混合液中，然後再加入375毫莫耳鹽酸羥胺（hydroxylammonium chloride）20微升並且混合，在室溫靜置10分鐘進行增敏反應。然後，進行離心使溶液中的金膠體粒子沉澱，除去上清液，用超純水清洗。將利用此法得到的金膠體粒子分散液1微升滴到貼有碳帶（carbon tape）的試樣支架（holder），排去空氣（degas），用電子顯微鏡TM4000Plus《日立製作所公司製造》攝影，外施電壓（Applied voltage）15千伏（kV）、放大率（magnification）1000。藉由拍攝5個或更多視野並分析影像，來計算平均粒徑和標準偏差。再者，使用不含金膠體粒子超純水取代4.36奈莫耳的，進行相同的，做為比較對象球結果顯示於圖8。

圖8係表示由於增敏處置（sensitization treatment）引起的金膠體（gold colloid）粒子直徑的變化的圖，從圖8可以了解，藉由增敏反應，可以使4.36奈莫耳金膠體粒子分散液中的金膠體粒子，其粒子徑成長為3〜5微米；另一方面，即使不含金膠體粒子的情形時，也觀察到金膠體粒子的沉澱，但是與實施增敏處置的情形相比，由於是顯著的小粒子，兩者在檢測時能夠清楚地區別。再者，如果調整反應條件，因為粒子徑當然可以調整，能夠做出適合檢測系統的粒子徑的金膠體粒子，是明顯不過的了。 因此，從結果表示，微小的金膠體粒子經過增敏處置可以加大直徑，更進而該增敏後的金《膠體》粒子可以用光學方法充分檢測。

＜實施例5＞金屬粒子的粒子徑產生的散射光的變化 （1）各種粒子徑的金膠體粒子和白金膠體粒子的製備 依據參考例1製備粒子徑120奈米的白金－金膠體粒子。又，依據參考例3製備粒子徑12奈米和200奈米的金膠體粒子，粒子徑500奈米和1000奈米的金《膠體》粒子以市售商品《NANOPARTz、A11－500－CIT－DIH－1－50、A11－1000－NPC－DIH－1－100》取得。將各別的粒子製備成分散在溶液中的狀態。

（2）散射光強度的測定 前述中製備的各種粒子徑的金膠體粒子分散液，稀釋為可以測量散射光的範圍的濃度，用與實施例1相同的方法，實行散射光的測量。所得到的散射光強度的值除以濃度，計算 1奈莫耳的散射光強度。該結果，可以了解隨著金膠體粒子的粒子徑的增加，散射光強度就增加。結果顯示在圖9。

圖9係顯示金屬膠體粒子的粒子徑和散射光強度的關係的圖。橫軸是粒子徑《奈米（nm）》，縱軸是以對數表示的散射光強度。從圖9也可看出，因為射光強度從120奈米開始顯著增加，顯示以雷射（LASER）光源和光電二極體等的簡易的散射光檢測系統，從100奈米程度就可以檢測金屬膠體粒子。

＜實施例6＞含標示物質《白金－金膠體粒子》部分為基礎的抗原檢測 實施例1中用於固定的抗NP抗體，以Tris鹽酸緩衝液調整為20微克／毫升（μg／mL），製作抗體稀釋液。將該液與磁性粒子《JSR生命科學（life science）公司製造》混合，以化學鍵結將抗NP抗體固定在磁性粒子上；然後，將固定在磁性粒子上的抗NP抗體、和調節成10、100、1000、10000皮克／毫升（pg／mL）濃度的SARS-CoV-2 NP溶液的各個、和在實施例1調整後的白金－金膠體標示抗NP抗體，於37℃使其反應30分鐘。反應後的各溶液，分別以0.45微米離心式過濾器《默克（Merck）公司》離心過濾，回收磁性粒子，用TBS-T清洗5次。然後，將1莫耳氫氧化鈉加入磁性粒子中，對於結合在磁性粒子的複合體《磁性粒子－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－白金－金膠體標示抗NP抗體》進行切斷處置《溶出》，測量回收的溶出液的散射光強度。測量結果顯示於圖10。 還有，實施例中所謂溶出，從複合體切斷其中的一部分即含標示物質部分，其結果，其中的一部分從固相分離並釋放到液體中就足夠了，並非限定解釋為被分離的一部分溶解於液體中。

圖10係溶出的白金－金膠體粒子《含白金－金膠體粒子部分》的濃度以散射光強度表示的圖；縱軸是以對數表示的散射光強度，橫軸是抗原濃度。從圖10可以看出，以白金－金膠體粒子為基礎的散射光強度與抗原濃度成比例；亦即，伴隨抗原濃度升高，溶出的白金－金膠體粒子也增加，對於藉由抗原抗體反應形成在固相的複合體，實行有效的切斷處置，更進一步，含被切斷的標示物質部分分離、溶出，並適當地被檢測，已獲得實證。

＜實施例7＞從旋轉碟片的散射光檢測 （1）金膠體粒子的流出性能評價試驗 本實施例，係金膠體粒子的流出性能的試驗性評價，為了本試驗，製備了碟片，該碟片具有在圓片中心側劃分的腔室、和連通腔室朝向圓片半徑方向外側延伸設置的流徑。此碟片，在下凹設置了腔室和流徑的圓板的上面，以黏著層為媒介，緊密黏著50微米厚度的聚丙烯片板（polypropylene sheet）《以下，簡稱『PP片板』》，該PP片板形成腔室和流徑的上表面。

圖11係表示在本實施例所使用的碟片的流徑部分的一部份的示意剖面圖。腔室的內側做成厚度方向的深度為1000微米，又，在腔室中的旋轉中心與相對側的壁上方有流徑連通。流徑做成寬230微米、深度15微米，具有長方形狀的剖面（cross section），碟片旋轉超過預定的旋轉數時就打開，變成液體流通的毛細管被動閥（capillary burst valve）。又，如圖11所示，連接流徑的腔室壁是傾斜的，從底部斜著上升；因此，腔室的深度朝向流徑逐漸地變淺。製備完成的碟片中，設置刺穿腔室上表面的PP片板並貫通腔室內外的貫通口。

以設置好的貫通口為媒介，將聚苯乙烯珠子（polystyrene beads）《PS珠子》《Micromod公司製造，粒子徑20微米，25毫克／毫升 水性分散液（aqueous dispersion）》分散液灌注到此腔室內。由於灌注的分散液係比腔室的容積較少數量，在貫通口附近，靠著表面張力形成液池。其次，以每分鐘2000轉速（2000 rpm）旋轉1分鐘，將腔室內的溶劑排出至流徑；經過流徑的溶劑，在流徑前面的腔室，上表面的PP片板上開孔，用移液管（pipette）吸取並全部回收。

然後，將在參考例3製作的金膠體粒子分散液10微升從貫通口貫注至腔室，如此，在貫通口附近，靠著表面張力形成金膠體粒子分散液的液池；接著，以每分鐘2000轉速（2000 rpm）旋轉1分鐘，使腔室內的溶液排出至流徑；從在流徑前面的腔室，同樣地回收經過流徑的溶劑。在參考例3製作的金膠體粒子分散液及聚苯乙烯珠子分散液的回收液，用顯微分光光度計（microspectrophotometer）或散射光強度測量設備（scattered light intensity measurement device）測量吸光度（absorbance）或散射光強度並比較兩者。其結果，任何一者回收液中都不含聚苯乙烯珠子，另一方面，來自金膠體粒子分散液的回收液含有超過初始濃度的60％的金膠體粒子，因此，可以確認金膠體粒子通過阻塞的聚苯乙烯珠子，從腔室流出到流徑。

（2）藉由散射光的標示物質的特異性檢測 其次，進行當生物材料共存時的標示物質的散射光檢測；BSA《10%牛血清白蛋白（bovine serum albumin）》 被示意性地用作污染物。金膠體粒子，使用與參考例3同樣地調製成的粒子徑200奈米的金膠體粒子分散而成的分散液。準備10%的BSA溶液《Oriental Yeast Co., Ltd.製造，Cat 47408903》或水，分別作為溶劑，將2匹莫耳（pM）的金膠體粒子分散液稀釋為2飛莫耳（fM）。稀釋後的金膠體粒子分散液和10%BSA溶液分別加到300微升的比色管（cuvette），以實施例1所使用的散射光檢測設備測量散射光強度。

為了此試驗，準備了具備旋轉中心側劃分的腔室、和連通腔室朝向圓片半徑方向外側延伸設置的流徑的碟片。此碟片，腔室和流徑係下凹設置在樹脂製作的圓板，圓板的上面以黏著層為媒介，緊密黏著50微米厚度的聚丙烯片板（polypropylene sheet）《以下，簡稱『PP片板』》，該PP片板形成腔室和流徑的上表面。腔室和流徑的任一者做成深度15微米，底面相互連接。流徑的寬度係1毫米，延伸設置的流徑的前端，連接到直通流徑的分支徑，分支徑，在其兩端朝向旋轉中心側連接細窄流徑。此細窄流徑在腔室的旋轉中心側端部連接腔室的旋轉中心側端部並連通。腔室做成比流徑寬廣。又，在腔室的上表面刺穿設置貫通口。

此碟片的腔室中，分別灌注BSA溶液或用BSA溶液稀釋成2飛莫耳的金膠體粒子分散液。碟片放置在圖4所示的設備的裝載台上，以每分鐘2000轉速（2000 rpm）旋轉2分鐘，計算散射光的產生樹木，結果顯示在表2。 【表2】

試樣	散射光強度 (a.u.)	計數
GNP	67	-
BSA	121	0
GNP+BSA	217	104

水＝0 校正時

從表2的上段依照順序，顯示金膠體粒子分散液《『GNP』》、BSA溶液《『BSA』》、BSA溶液稀釋金膠體粒子分散液《『GNP+BSA』》的測量結果，中間欄位顯示藉由散射光檢測設備的散射光強度的測量結果，最右邊欄位顯示來自旋轉的碟片的散射光產生數的計數結果。 從這些可以了解，在使用比色管的散射光強度的測量，金膠體粒子分散液和BSA溶液分別測量散射光，在兩者混合的試樣測量到更強的散射光。從這個結果來看，顯示使用像300微升比色管等容量較大的比色槽（cell），在靜置狀態下照射光照射並檢測散射光的測定方法，污染物存在的情形時，金膠體粒子等的待檢對象要藉由散射光而特異性檢測出來是有困難的。另一方面，使用碟片的情形時，水作為空白值的測量和BSA溶液的測量，變成相同的結果，肇因於BSA的散射光的產生無法被計數《檢測》出來。再進一步，測量金膠體粒子分散液的情形時，來自金膠體粒子的散射光的產生被計數，顯示金膠體粒子的檢測。

圖12係表示使用碟片的金膠體粒子的檢測結果之圖。圖12的橫軸表示在管狀通道的流徑寬度方向的位置（position），縱軸係以電壓值表示散射光的強度。又，被計數的金膠體粒子的峰值（peak）以▼表示。於圖12中，從上向下，顯示隨著時間經過的檢測峰值的變化；據此，可以看出存在著不隨時間變化而連續觀察到的峰值、和僅在短時間內出現的間歇峰值。不隨時間變化的峰值可以判斷為干擾（noise）。因此，在管狀通道的相同位置所取得的空白值的散射光強度《電壓值》，減去測量過程中在任何繞轉（round）所得到的散射光強度《電壓值》，就可以消除干擾。另一方面，斷斷續續產生的間歇性峰值，可歸因於通過流徑的動態性的金膠體粒子。所以，顯示即使污染物存在，目標的待檢對象分離並可特異性地檢測。

＜實施例8＞使用旋轉晶片型裝置的含標示物質《金膠體粒子》部分的分離及散射光檢測 （1）金膠體標示抗體溶液的調製 作為標示物質，使用在參考例3調製的粒子徑200奈米的金膠體粒子代替白金－金膠體粒子，此外，以與實施例1的白金－金膠體標示抗體的製作相同的順序，製作金膠體標示抗NP抗體。製作完成的金膠體標示抗NP抗體，懸浮在檢體抽取液，作為金膠體標示抗體溶液。

（2）聚苯乙烯珠子固定抗體的調製 在參考例2調製的抗NP抗體之中，選擇與前述的金膠體標示抗NP抗體所使用的抗NP抗體不同的抗體，藉由馬來醯亞胺法（maleimide method），與聚苯乙烯珠子（polystyrene beads）《Micromod公司製造，粒子徑20微米，25毫克／毫升 水性分散液》結合，調製聚苯乙烯珠子固定抗NP抗體。

（3）抗體－抗原－抗體的夾心《三明治》型式的免疫複合體的形成 作為抗原，使用SARS-CoV-2 NP，用檢體抽取液將抗原、前述金膠體標示抗體溶液、前述聚苯乙烯珠子固定抗NP抗體的分別調整為預訂的濃度。然後，將他們混合，在室溫使其反應10分鐘，生成抗體－抗原－抗體的夾心《三明治》型式的免疫複合體。

（4）清洗處置 製備了一個單元獨立形成的芯片型裝置，具備與圖2b相同的反應腔室、流徑、管狀通道、排液儲液室、清洗液儲液室和試劑貯藏室《切斷試劑儲液室》。

然後，在前述中調製完成的含免疫複合體溶液引入該晶片型裝置。具體地說，將在前述中調製完成的含免疫複合體溶液灌注到反應腔室，將該晶片型裝置設置在圖4所示的裝置的裝載台上，以每分鐘2000轉（2000rpm）旋轉10分鐘，進行清洗處置。清洗處置後，管狀通道被液體充填。又，清洗液超過管狀通道的入口，反應腔室內的聚苯乙烯珠子通常充填至被浸漬的位置而存留的狀態。

（5）含標示物質《金膠體粒子》部分的分離及利用散射光的標示物質的特異性檢測 清洗處置後，1莫耳氫氧化鈉（NaOH）作為切斷試劑，灌注到反應腔室內。然後，使此晶片型裝置以每分鐘2000轉（2000rpm）旋轉3分鐘，金膠體粒子《含金膠體粒子部分》從複合體分離，亦即，從存留在反應腔室的液體中溶出。反應腔室內的液體中溶出的金膠體粒子，靠著離心力通過管狀通道，那時，檢測藉由照射光照射而產生的散射光。檢測到的散射光，被轉換為電信號（electronic signals）作為電壓值而取得。將抗體濃度調整為0.5匹克／毫升（pg／mL）形成免疫複合體的情形的散射光檢測結果顯示在圖13a和圖13b。

圖13a、圖13b，係表示於本實施例中以散射光檢測金膠體粒子《含金膠體粒子部分》的結果的圖。於圖13a中，橫軸表示晶片型裝置的旋轉時間《時間(繞轉)（time (round)）》，1000時間相當於30秒；縱軸表示管狀通道的寬度方向的位置《位置(取樣)（position (sam：sampling）》，100 sam相當於492微米。又，檢測到的散射光對應的電壓值，以灰階（grayscale）影像數據（image data）輸出並顯示，灰階的濃淡對應電壓值的高低，形成電壓值越高則亮度變低。圖13b係圖13a的一部分的放大圖，橫軸表示1000〜2000繞轉（round）的範圍，縱軸表示200〜300取樣（sam）的範圍。

此處，不添加抗原，將聚苯乙烯珠子固定抗NP抗體和金膠體標示抗體溶液混合物作為試樣（sample），實施依據本實施例的前述順序（4）清洗處置和（5）含標示物質《金膠體粒子》部分的分離《溶出》及利用散射光的標示物質的特異性檢測的結果，顯示在圖14a、圖14b。圖14a、圖14b的縱軸、橫軸、顯示數據，分別與圖13a、圖13b中的相同，圖14b係圖14a的一部分的放大圖。

被引入反應腔室的金膠體標示抗NP抗體，對於抗原以外的物質也產生吸附《非特異性吸附》，此非特異性吸附的金膠體標示抗NP抗體，一旦添加氫氧化鈉《切斷試劑》，也會變成含金膠體粒子部分從被吸附體分離。這種現象，由於是因添加切斷試劑而產生，與待檢對象的金膠體粒子《已形成複合體的金膠體粒子》、非待檢對象的金膠體粒子也一起被引入管狀通道並被無意地檢測到了。但是，預先，如前述的方法中，把握了非特異性吸附的金膠體標示抗NP抗體的數量，就可以校正所得到的結果。

再者，圖13a及圖14a中，在管狀通道的寬度方向兩端附近，觀察到不會隨時間變化的持續的強訊號（strong signal），由於在圖14a中也觀察到，因此很難假設這樣的訊號是由金膠體粒子引起的，可以判斷是在管狀通道的端部附近產生的光的折射（refraction）、散射（scattering）和畸變（distortion）引起的干擾（noise）。測量像這樣的訊號的時候，從檢測的有效範圍排除管狀通道的端部附近。 又，在相同位置持續檢測到的訊號《圖13a、圖14a中，沿著時間軸以相同強度輸出，以線狀影像顯示》，由於是源自於不會在管狀通道移動物質的散射光，可以判斷是基於管狀通道內的損傷的干擾。 再進一步，只有金膠體粒子流過晶片型裝置的管狀通道，並檢測散射光，從所得到的影像數據確認表示金膠體粒子的散射光的訊號的形狀當下，在圖13a〜圖14b中，可以了解大致呈圓形的微小斑點（spot）就是金膠體粒子的訊號。因此，圖14a中被認出的各向異性（anisotropic）、或稍稍大的點狀的斑點，由於與源自金膠體粒子的訊號的形狀不同，可以判斷是基於異物的散射光《干擾（noise）》。從而，可以將這些干擾訊號從檢測結果排除。

另一方面，斷斷續續產生的大致呈圓形的微小斑點，可以判斷是基於來自通過管狀通道的動態金膠體粒子的散射光。在除去管狀通道的寬度方向兩端附近的檢測有效範圍內，對應此金膠體粒子的斑點，分別在圖13a和圖14a中計算。

然後，從圖13a的計算數減去圖14a的計算數，作為對應抗原的金膠體粒子的計算數。該計算數《計算數（count）《－空白值（blank）》》與免疫複合體形成之際的抗原濃度的關係顯示在圖15，橫軸是以常用對數表示的抗原濃度，縱軸是對應抗原的散射光的計算數。

從圖13a和圖14a的比較可以了解，顯示在圖14a的表示金膠體粒子的斑點，與圖13a比較要多的多。又進一步，如圖15所示，檢測到的計算數《計算數（count）《－空白值（blank）》》係以千為單位的『正值』，與抗原不存在的情形相比，有明顯的顯著差異。因此，顯示：使用裝置，對於固定在固相的免疫複合體，實施清洗處置和利用切斷試劑的切斷處置，可以從複合體分離含標示物質部分，此已分離的含標示物質部分藉由離心力在管狀通道內移動，藉由來自該移動的標示物質的散射光，可以檢測該標示物質。 再進一步，如圖13b、圖14b所示，可以清楚地識別對應金膠體粒子的斑點；亦即，以一個一個的金膠體粒子的散射光為基礎的訊號，可以計數，顯示可以實現金膠體粒子的定量評價。

特別是，從圖15觀察到，在抗原濃度是低濃度的情形時，基於金膠體粒子的散射光的計算數與抗原濃度之間存在良好相關性的趨勢。由此，特別是試樣中所含的抗原是低濃度的情形時，顯示對應抗原濃度的金膠體粒子更可以定量地檢測的可能性。

為了研究前述相關的方法是否能夠以比目前的免疫層析法（immunochromatographic method）檢測更低濃度的抗原，將上述結果與目前的免疫層析法進行比較。目前免疫層析法中，使用新型冠狀病毒《ImunoAce SARS-CoV-2 Ⅱ》《TAUNS Laboratories 公司製造》，藉由目視評價抗原檢測結果。再者，作為抗原，使用調整成預定濃度的SARS-CoV-2NP。其結果顯示於表3。

【表3】

抗原濃度 (匹克／毫升)	免疫層析法	前述相關的檢測方法
500	十	十
50	十	十
5	未檢測到	十
0.5	未檢測到	十
0.05	未檢測到	未檢測到
0	未檢測到	未檢測到

表3中，最左的欄位表示形成免疫複合體之際所使用的抗原的最終濃度；中間欄位表示目前的免疫層析法的結果；最右的欄位表示實施例8的相關的檢測方法的結果。『十』表示用免疫層析法檢測抗原的結果，在本實施例的方法中，表示散射光被計數到；『未檢測到』表示用免疫層析法未檢測到抗原，在本實施例的方法中，表示散射光沒有被計數到。確認檢測到的最低抗原濃度，在本實施例的方法中，係0.5匹克／毫升（pg／mL），相對於此，在目前的免疫層析法中，係50匹克／毫升。由此，本實施例的方法，比較目前的免疫層析法，能夠檢測更低濃度的抗體，可以說靈敏度優越。

再者，前述本實施例的方法中，清洗處置之際，清洗液從外部直接灌注到反應腔室內，但替代這種形式，也可以將清洗液存留在清洗液儲液室，藉由使晶片型裝置旋轉，從清洗液儲液室供給清洗液到反應腔室內。在這方面，於分別實施的試驗中，清洗液灌注到清洗液儲液室，使晶片型裝置以每分鐘2000轉數旋轉1分鐘後，清洗液儲液室的清洗液減少，反應腔室的清洗液增加，以目視確認此事。由此，顯示存留在清洗液儲液室的清洗液，可以藉由旋轉被引入反應腔室，並進行清洗處置。

又，晶片型裝置中，試劑室貯藏室《切斷試劑儲液室》配置在相對反應腔室的旋轉中心側，靠著流徑連接反應腔室。此試劑貯藏室，由於藉由與清洗液儲液室相同的流徑連接反應腔室和管狀通道，由前述的旋轉產生清洗液轉移實驗可知，如果試劑貯藏室中也儲存有切斷試劑，藉由使晶片型裝置旋轉，靠著產生的離心力，和清洗液相同，可以將切斷試劑供給至反應腔室，可以說在反應腔室能夠實施切斷處置。 [產業方面的可能應用]

依據本發明，由於能夠高靈敏度且價格便宜地檢測目標物質，醫療領域之外，可以應用作為在各種產業領域的物質的檢測方法和設備。

1:碟片 2:單元 10:反應腔室 11:管狀通道 12:排液儲液室 13:清洗液儲液室 14:切斷試劑貯藏室

【圖1】係說明本發明的檢測方法的一個實施態樣的概要之圖。 【圖2a】係在實施第一實施態樣的檢測方法時，顯示恰當的碟片（disk）的一個實例的示意平面圖。 【圖2b】係圖2a的一部分放大圖。 【圖3】係在實施第一實施態樣的檢測方法時，顯示恰當的碟片（disk）的另外一個實例的示意平面圖。 【圖4】係顯示檢測設備的一個實例的示意圖。 【圖5】係表示實施例1中的各試劑的酸鹼值（pH值）和切斷特性（cutting characteristic）之關係的圖。 【圖6】係表示實施例2中的氫氧化鈉（NaOH）的濃度《酸鹼值》和切斷特性（cutting characteristic）之關係的圖。 【圖7】係表示實施例3中的各種變性劑（denaturant）的切斷特性的圖。 【圖8】係顯示由於實施例4的增敏處置（sensitization treatment）引起的金膠體（gold colloid）粒子直徑的變化的圖。 【圖9】係表示實施例5中的金屬膠體粒子的粒子直徑和散射光（scattered light）強度的關係的圖。 【圖10】係表示實施例6中被溶出的金膠體粒子《含有金膠體粒子的部分》的濃度《對應抗原濃度》和散射光強度的關係的圖。 【圖11】係說明實施例7中金膠體粒子《含有金膠體粒子的部分》的選擇性流出的圖。 【圖12】係表示測定實施例7中金膠體粒子《含有金膠體粒子的部分》的結果的圖。 【圖13a】係表示實施例8中，以散射光作為電壓值，檢測金膠體粒子《含有金膠體粒子的部分》的結果的圖。 【圖13b】係圖13a的一部分放大圖。 【圖14a】係表示實施例8中，免疫複合體形成時，未使用抗原的情形時《空白（blank）》，金膠體粒子《含有金膠體粒子的部分》的散射光作為電壓值的檢測的結果的圖。 【圖14b】係圖14a的一部分放大圖。 【圖14a】係表示實施例8中測定的光斑（spot）的計算數（count number）和抗原濃度的關係的圖。

Claims (22)

1. 一種目標物質的檢測方法，包含： 藉由在結合了標示物質的第1捕捉物質、和固定在固相的第2捕捉物質之間，將目標物質夾在中間（sandwich），形成複合體；將含有示物質部分從形成的前述複合體中分離後， 分離出來的前述含標示物質部分，藉由離心力，移動至充填在管狀通道內的液體中， 在前述管狀通道中，藉由將照射前述含標示物質部分的光散射（scatter）產生散射光，檢測前述含標示物質部分。
2. 如申請專利範圍第1項所述之目標物質的檢測方法，包含：由前述複合體分離前述含標示物質部分之前，於抑制前述複合體流進前述管狀通道的狀態下，實施清洗前述複合體的清洗處置。
3. 如申請專利範圍第2項所述之目標物質的檢測方法，係當實施前述清洗處置時，將清洗時使用的清洗液充滿前述管狀通道。
4. 如申請專利範圍第2項所述之目標物質的檢測方法，係將前述清洗處置所使用的清洗液存留在前述管狀通道的更下游位置。
5. 如申請專利範圍第2項所述之目標物質的檢測方法，係藉由將前述複合體保留在特定腔室，抑制前述複合體流入前述管狀通道。
6. 如申請專利範圍第5項所述之目標物質的檢測方法，包含： 在做成可以旋轉的裝置中，將存留前述清洗液的第1儲液室、和前述腔室、和存留由前述腔室流出的液體的第2儲液室，依照此順序，自前述裝置的旋轉中心側向外方側配置，前述第1儲液室和前述腔室以可自由開關的流徑相連通，前述腔室和前述第2儲液室用前述管狀通道相連通； 藉由使前述裝置旋轉，將前述清洗液由前述第1儲液室供給至前述腔室後，經由前述管狀通道，使其排出至前述第2儲液室，實施前述清洗處置。
7. 如申請專利範圍第6項所述之目標物質的檢測方法，係以能夠開放的流徑連通前述第1儲液室和前述腔室。
8. 如申請專利範圍第6項所述之目標物質的檢測方法，其中前述清洗處置，直到前述第2儲液室和前述管狀通道充滿前述清洗液才進行。
9. 如申請專利範圍第8項所述之目標物質的檢測方法，包含： 在比前述裝置的前述腔室更靠近旋轉中心側，配置存留含有由前述複合體分離的前述含標示物質部分的試劑的液體的第3儲液室，前述第3儲液室和前述腔室以可自由開關的流徑相連通， 藉由使前述裝置旋轉，前述清洗處置後，含有前述試劑液體供給至前述腔室，分離前述含標示物質部分後，使已分離的前述含標示物質部分移動至前述管狀通道內。
10. 如申請專利範圍第9項所述之目標物質的檢測方法，前述第3儲液室和前述腔室利用可自由開關的流徑連通。
11. 如申請專利範圍第1項至第10項之任一項所述之目標物質的檢測方法，檢測在預定時間內來自管狀通道間歇產生的散射光。
12. 如申請專利範圍第1項至第10項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述標示物質，係比充滿在前述管狀通道內的液體更大比重之物質。
13. 如申請專利範圍第12項所述之目標物質的檢測方法，其中前述標示物質，係選自金屬、陶瓷製品（ceramics）、玻璃和樹脂所成群類之一者為主要構成成份的微粒子（fine particles）。
14. 如申請專利範圍第13項所述之目標物質的檢測方法，其中前述標示物質，係金屬膠體粒子（metal colloidal particle）。
15. 如申請專利範圍第1項至第10項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述固相，係選自玻璃粒子、陶瓷製品（ceramics）粒子、磁性粒子（magnetic particles）、和樹脂粒子（resin particle）所成群類的至少一者的粒狀物。
16. 如申請專利範圍第1項至第10項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述固相，係形成前述複合體之際所使用的容器內側的結構物。
17. 如申請專利範圍第1項至第10項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中將前述複合體中的前述含標示物質部分分離，係藉由選自加熱處置、酸鹼值調節處置、變性處置（Denaturation treatment）、氧化處置、還原處置、酵素處置和競合反應（competition reaction）處置所成群類中的至少一者處置來進行。
18. 如申請專利範圍第1項至第10項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述第1捕捉物質，係選自與目標物質特異性地結合的抗體、抗體片段（antibody fragment）、修飾抗體（modified antibody）、抗原、核酸適配體（aptamer）和核酸所成群類中的至少一者。
19. 如申請專利範圍第1項至第10項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述第2捕捉物質，係選自目標物質特異性地結合的抗體、抗體片段（antibody fragment）、修飾抗體（modified antibody）、抗原、核酸適配體（aptamer）和核酸所成群類中的至少一者。
20. 係申請專利範圍第1項的目標物質的檢測方法中所使用的試劑，具有分離前述複合物中含前述標示物質部分的作用的試劑。
21. 如申請專利範圍第20項所述之試劑，包含選自酸鹼值調節劑（pH regulator）、變性劑（denaturant）、還原劑（reducing agent）、氧化劑、酵素（enzyme）、以及競爭劑（competitor）所成群類中的至少一者。
22. 如申請專利範圍第21項所述之試劑，包含酸鹼值調節劑（pH regulator）。