TW202346594A - 經修飾之抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了經修飾之抗體、其製備方法及用途。具體地,該等經修飾之抗體為雙特異性抗體或多特異性抗體。本發明中提供的該等經修飾之抗體的重鏈及輕鏈以高組合準確性及穩定性配對。
Description
本發明大體上涉及經修飾之抗體及其用途。
目前,單株抗體已被用作特異性且有效的生物藥物,該等生物藥物可顯示出對單個目標抗原的出色特異性。然而,對於一些情況,對兩種(或更多種)不同目標抗原具有特異性的單個抗體——通常被稱為雙特異性抗體(或多特異性抗體),為較佳的。雙特異性或多特異性抗體可同時識別兩種或更多種不同的抗原,中和不同的致病性介體,募集不同類型的效應細胞且調節信號路徑,此使其在許多態樣中優於單特異性抗體。在此類情況下,開發雙特異性或多特異性抗體作為人類疾病的治療劑具有重要的臨床顯著性,且雙特異性抗體近年來已經成為診斷及治療應用中廣泛使用的形式。
然而,雙特異性或多特異性抗體之產生仍具挑戰性。在雙特異性抗體之情況下,對一種抗原具有特異性的重鏈必須與對同一抗原具有特異性的輕鏈配對。若重鏈與對其他不同抗原具有特異性的輕鏈配對,則預期的抗原特異性可能被破壞或降低。因為仍然不可能很好地控制輕鏈與具有天然IgG結構的對應重鏈之間的正確配對,所以將另外的抗體特異性引入至單個抗體的努力經常引起錯誤組合抗體的產生。
仍然需要產生具有多於一種特異性的新型經修飾之抗體。
在一個方面中,本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段,該抗體或其抗原結合片段包括第一臂及第二臂,該第一臂由第一重鏈及第一輕鏈以及在其間形成的鏈間二硫鍵形成,該第二臂由第二重鏈及第二輕鏈以及在其間形成的鏈間二硫鍵形成,其中該第一重鏈上之至少一個非半胱胺酸殘基被半胱胺酸取代,其中該非半胱胺酸殘基位於選自由以下組成之群的位置處:該第一重鏈之胺基酸位置126、128、129、136、141、168、170、173、175或187;且該第一輕鏈上之至少一個非半胱胺酸殘基被半胱胺酸取代,其中該非半胱胺酸殘基位於選自由以下組成之群的位置處:該第一輕鏈之胺基酸位置114、116、118、124、135、137、138、160、162或164。
在一些實施例中,該第一重鏈上被半胱胺酸取代的該至少一個非半胱胺酸殘基選自由以下組成之群:該第一重鏈的胺基酸殘基F126、L128、A129、S136、A141、H168、F170、V173、Q175或T187;且該第一輕鏈上被半胱胺酸取代的該至少一個非半胱胺酸殘基選自由以下組成之群:該第一輕鏈的胺基酸殘基S114、F116、F118、Q124、L135、N137、N138、Q160、S162或T164。
在一些實施例中,該第一輕鏈及該第一重鏈包括該第一輕鏈上之天然半胱胺酸及該第一重鏈上之天然半胱胺酸的至少一個非半胱胺酸取代對以及至少一個選自由以下組成之群的半胱胺酸取代對:(i)位於輕鏈上之S114C及位於重鏈上之S136C;(ii)位於輕鏈上之F116C及位於重鏈上之S136C;(iii)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之L128C;(iv)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A129C;(v)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A141C;(vi)位於輕鏈上之Q124C及位於重鏈上之F126C;(vii)位於輕鏈上之L135C及位於重鏈上之F170C;(viii)位於輕鏈上之N137C及位於重鏈上之F170C;(ix)位於輕鏈上之N138C及位於重鏈上之H168C;(x)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之V173C;(xi)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之Q175C;(xii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之F170C;(xiii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之T187C;以及(xiv)位於輕鏈上之T164C及位於重鏈上之F170C;其中該至少一個半胱胺酸取代對在該第一重鏈與該第一輕鏈之間形成至少一個鏈間二硫鍵;其中該第一重鏈及該第一輕鏈上之天然半胱胺酸獨立地被非半胱胺酸殘基中之任一者取代。
在一些實施例中,該第一重鏈及該第一輕鏈上之天然半胱胺酸獨立地被絲胺酸、丙胺酸、甘胺酸或纈胺酸中之任一者取代。在一些實施例中,待取代的天然半胱胺酸為抗體之輕鏈中的胺基酸殘基C214及重鏈中的胺基酸殘基C220。在一些實施例中,該第一輕鏈包括突變C214S,且該第一重鏈包括突變C220S。
在一些實施例中,該第一重鏈及該第一輕鏈包括一個半胱胺酸取代對。在一些實施例中,該第一重鏈及該第一輕鏈包括兩個半胱胺酸取代對。
在一些實施例中,兩個半胱胺酸取代對選自由以下組成之群:(i)位於輕鏈上之S114C/Q160C及位於重鏈上之S136C/V173C;(ii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之L128C/F126C;(iii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A129C/F126C;(iv)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A141C/F126C;(v)位於輕鏈上之F116C/Q124C及位於重鏈上之S136C/F126C;(vi)位於輕鏈上之Q124C/T164C及位於重鏈上之F126C/F170C;(vii)位於輕鏈上之Q124C/N138C及位於重鏈上之F126C/H168C;(viii)位於輕鏈上之Q160C/L135C及位於重鏈上之Q175C/F170C;(ix)位於輕鏈上之S114C/S162C及位於重鏈上之S136C/F170C;(x)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之L128C/F170C;(xi)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之A141C/F170C;(xii)位於輕鏈上之Q124C/S162C及位於重鏈上之F126C/F170C;(xiii)位於輕鏈上之N137C/S162C及位於重鏈上之F170C/T187C。
在一些實施例中,該第一輕鏈包括突變Q124C/T164C/C214S,且該第一重鏈包括突變F126C/F170C/C220S。在一些實施例中,該第一輕鏈包括突變Q124C/S162C/C214S,且該第一重鏈包括突變F126C/F170C/C220S。
在一些實施例中,該第二重鏈與該第二輕鏈之間的二硫鍵在該第二輕鏈上之天然半胱胺酸與該第二重鏈上之天然半胱胺酸之間形成;其中天然半胱胺酸在該第二輕鏈上之位置與人κ鏈上之位置C214相對應,且天然半胱胺酸在該第二重鏈上之位置與人IgG1上的位置C220相對應。
在一些實施例中,該第二輕鏈及該第二重鏈包括至少一個非半胱胺酸取代對,其中該輕鏈上之天然半胱胺酸取代為絲胺酸且該重鏈上之天然半胱胺酸取代為絲胺酸,以及至少一個選自由以下組成之群的半胱胺酸取代對:(i)位於輕鏈上之S114C及位於重鏈上之S136C;(ii)位於輕鏈上之F116C及位於重鏈上之S136C;(iii)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之L128C;(iv)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A129C;(v)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A141C;(vi)位於輕鏈上之Q124C及位於重鏈上之F126C;(vii)位於輕鏈上之L135C及位於重鏈上之F170C;(viii)位於輕鏈上之N137C及位於重鏈上之F170C;(ix)位於輕鏈上之N138C及位於重鏈上之H168C;(x)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之V173C;(xi)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之Q175C;(xii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之F170C;(xiii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之T187C;以及(xiv)位於輕鏈上之T164C及位於重鏈上之F170C;其中該至少一個半胱胺酸取代對在該第二輕鏈與該第二重鏈之間形成至少一個鏈間二硫鍵,且該第一臂上的一或多個半胱胺酸取代對不同於該第二臂上的一或多個半胱胺酸取代對。非半胱胺酸取代對係指一對已經突變成非半胱胺酸的胺基酸的天然半胱胺酸(一個位於輕鏈上,且一個位於重鏈上)。半胱胺酸取代對係指一對已經突變成半胱胺酸的天然非半胱胺酸胺基酸(一個位於輕鏈上,且一個位於重鏈上)。
在一些實施例中,該第二輕鏈上取代的天然半胱胺酸位於人κ鏈上之位置C214處,且該第二重鏈上取代的天然半胱胺酸位於人IgG1上的位置C220處。
在一些實施例中,該第二重鏈及該第二輕鏈包括兩個半胱胺酸取代對。在一些實施例中,兩個半胱胺酸取代對選自由以下組成之群:(i)位於輕鏈上之S114C/Q160C及位於重鏈上之S136C/V173C;(ii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之L128C/F126C;(iii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A129C/F126C;(iv)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A141C/F126C;(v)位於輕鏈上之F116C/Q124C及位於重鏈上之S136C/F126C;(vi)位於輕鏈上之Q124C/T164C及位於重鏈上之F126C/F170C;(vii)位於輕鏈上之Q124C/N138C及位於重鏈上之F126C/H168C;(viii)位於輕鏈上之Q160C/L135C及位於重鏈上之Q175C/F170C;(ix)位於輕鏈上之S114C/S162C及位於重鏈上之S136C/F170C;(x)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之L128C/F170C;(xi)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之A141C/F170C;(xii)位於輕鏈上之Q124C/S162C及位於重鏈上之F126C/F170C;以及(xiii)位於輕鏈上之N137C/S162C及位於重鏈上之F170C/T187C;其中該第一臂上的一或多個半胱胺酸取代對不同於該第二臂上的半胱胺酸取代對。
在一些實施例中,第一重鏈恆定區及/或第二重鏈恆定區包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4;且第一輕鏈恆定區及/或第二輕鏈恆定區包括人κ輕鏈或人λ輕鏈。
在一些實施例中,該第一重鏈及該第二重鏈形成異二聚體;且該第一重鏈恆定區之Fc區及/或該第二重鏈恆定區之Fc區包括一或多個促進異二聚體化之修飾。
在一些實施例中,該第一重鏈之Fc區藉由杵/臼(Knob/Hole)結構與該第二重鏈之Fc區相互作用。在一些實施例中,該第一重鏈之Fc區包括杵(Knob)突變,且該第二重鏈之Fc區包括臼(Hole)突變;或者該第一重鏈之Fc區包括臼突變,且該第二重鏈之Fc區包括杵突變。在一些實施例中,該等杵突變包括T366W,且該等臼突變包括T366S/L368A/Y407V。
在一些實施例中,該等促進異二聚體化之修飾包括引入能夠形成二硫鍵的半胱胺酸殘基。
在一些實施例中,該第一重鏈恆定區之Fc區及該第二重鏈恆定區之Fc區分別包括CH3區中之修飾;其中兩個CH3區中之修飾選自以下:
一個CH3區中之修飾 | 另一個CH3區中之修飾 |
T366S/L368A/Y407V | T366W |
S354C/T366W | Y349C/T366S/L368A/Y407V |
T366Y | Y407T |
T366W | Y407A |
T394W | F405A |
T366Y/F405A | T394W/Y407T |
T366W/F405W | T394S/Y407A |
F405W | T394S |
D399C | K392C |
T366W/D399C | T366S/L368A/K392C/Y407V |
T366W/K392C | T366S/L368A/D399C/Y407V |
S354C/T366W | Y349C/T366S/L368A/Y407V |
Y349C/T366W | S354C/T366S/L368A/Y407V |
E356C/T366W | Y349C/T366S/L368A/Y407V |
Y349C/T366W | E356C/T366S/L368A/Y407V |
E357C/T366W | Y349C/T366S/L368A/Y407V |
Y349C/T366W | E357C/T366S/L368A/Y407V |
在一些實施例中,該第一重鏈恆定區之Fc區及該第二重鏈恆定區之Fc區分別包括CH3區中之修飾;其中兩個CH3區中之修飾選自以下:
一個CH3區中之修飾 | 另一個CH3區中之修飾 |
K370E/D399K/K439D | D356K/E357K/K409D |
K409D | D399K |
K409E | D399K |
K409E | D399R |
K409D | D399R |
D339K | E356K |
E356K/D399K | K392D/K409D |
E356K/D399K | K409D/K439D |
E357K/D399K | K370D/K409D |
D399K/E357K/E356K | K370D/K392D/K409D |
E357K/D399K | K392D/K409D |
K392D/K409D | D399K |
K360D/K409D | D399K |
在一些實施例中,該第一臂及該第二臂可與選自由以下組成之群的抗原特異性結合:SIRPα、CLDN18.2、Siglec15、HER2、EGFR、CD19、CD20、CD39、CD47、PD1、PDL1、CD3、NKG2D、NKG2A、Nkp46、CD137、OX40、CD40、LILRB1、LILRB2、LILRB4、GPC3、TROP2、CD112、TIGIT、FAP、VEGFA、DLL4、ANG-2,其中該第一臂及該第二臂可與不同的抗原特異性結合。
在一些實施例中,該第一重鏈恆定區之Fc區及/或該第二重鏈恆定區之Fc區進一步包括改善抗體或抗原結合片段之穩定性的修飾。
在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或嵌合抗體。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段為雙特異性抗體或多特異性抗體。
在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段連接於一或多個結合物部分。
在一些實施例中,結合物部分包括第二抗體片段。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段包括Fab片段,該Fab片段連接於該第二抗體片段之Fc區的C末端。
在一些實施例中,結合物部分包括用於偵測或分離之藥劑,如清除改性劑、發光標記、螢光標記、酶受質標記或純化部分。在一些實施例中,結合物部分包括治療劑或藥物。
在一個方面中,本發明提供了一種分離之多核苷酸,該分離之多核苷酸編碼本文所揭示之抗體或其抗原結合片段。
在一個方面中,本發明提供了一種載體,其包括本文所揭示之分離之多核苷酸。
在一個方面中,本發明提供了一種宿主細胞,其包括本文所揭示之載體。
在一個方面中,本發明提供了一種醫藥組合物,其包含:(i)抗體或其抗原結合片段或本文所揭示之多核苷酸;以及(ii)一或多種醫藥學上可接受之載劑。
在一個方面中,本發明提供了一種表現本文所揭示之抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括在適於表現其中包含的載體之條件下培養本文所揭示之宿主細胞。
在一個方面中,本發明提供了一種在個體中治療、預防或減輕疾病的方法,該方法包括向該個體投與治療有效量的抗體或其抗原結合片段、或編碼該抗體或其抗原結合片段的多核苷酸、或載體、或宿主細胞或本文所揭示之醫藥組合物。
在一些實施例中,個體為人。在一些實施例中,投與為經口服、經鼻、靜脈內、皮下、舌下或肌肉內投與的。
在一個方面中,本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段、或編碼該抗體或其抗原結合片段的多核苷酸、或載體、或宿主細胞或本文所揭示之醫藥組合物,在製備用於在個體中治療、預防或減輕疾病的藥物中的用途。
本發明之以下描述僅意欲說明本發明之各個實施例。如此,所討論的具體修改不應解釋為對本發明範疇的限制。對於熟習此項技術者將顯而易見的是,在不脫離本發明範疇之情況下,可做出各種等同物、改變及修改,且應當理解,此類等同實施例將被包括在本文中。在本文中引用的所有文獻,包括公開、專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文。本文所使用的術語僅出於描述特定實施例的目的,而不意欲限制本發明。
依本文所用,除非上下文另外清楚地指示,否則單數形式「一/一個/一種(a/an)」及「該(the)」亦意欲包含複數形式。舉例而言,「抗體」意謂一種抗體或多於一種抗體。
此外,在具體說明書及/或申請專利範圍中使用術語「包含(including)」、「包含(include)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其變體之情況下,此類術語意欲以類似於術語「包括(comprising)」的方式為包含性的。貫穿本發明,除非上下文另有要求,否則詞語「包括(comprise)」、「包括(comprises)」及「包括(comprising)」將被理解為暗示包含所陳述的步驟或要素或步驟或要素組,但不排除任何其他步驟或要素或步驟或要素組。「由……組成(consisting of)」意謂包含且限於片語「由……組成」之後的任何內容。因此,片語「由……組成」表示所列要素為必需的或強制性的,且可不存在其他要素。「基本上由……組成」意謂包含在該片語之後所列出的任何要素,且限於不干擾或促進本發明中針對所列要素指定的活動或行為的其他要素。因此,片語「基本上由……組成」表示所列要素為必需的或強制性的,但其他要素為視情況選用的且可存在或不存在,其決於其是否影響所列要素的活動或作用。
術語「約(about)」或「大約(approximately)」意謂在依由一般熟習此項技術者判定的特定值的可接受誤差範圍內,其將部分地取決於該值係如何量測或測定的,亦即,量測系統的侷限性。例如,根據此項技術中之實踐,「約」可意謂在1個或大於1個標準偏差內。可替代地,「約」可意謂給定值之至多20%,較佳地至多10%,更佳地至多5%且再更佳地至多1%的範圍。可替代地,特別是對於生物系統或過程,該術語可意謂在值之數量級內,較佳地在5倍內且更佳地在2倍內。當在本申請案及申請專利範圍中描述特定值時,除非另外指出,否則應當假設術語「約」意謂在特定值的可接受誤差範圍內。
貫穿本發明提及「一個實施例」、「一實施例」、「特定實施例」、「一些實施例」或「某些實施例」或其組合意謂結合實施例描述的特定特徵、結構或特性包含於本發明之至少一個實施例中。因此,上述片語在貫穿本說明書的各個地方的出現不一定全部指代同一個實施例。此外,在一或多個實施例中,可以任何適合的方式組合特定特徵、結構或特性。
I. 抗體修飾
在一些態樣中,本發明提供了具有抗體之多肽鏈的更高組合準確性及穩定性的經修飾之抗體。
在一些態樣中,經修飾之抗體被設計成減少具有兩個或更多個不同抗原結合位點的雙特異性或多特異性抗體中的重鏈及輕鏈的錯配。
在一些態樣中,經修飾之抗體具有胺基酸殘基突變,其中非半胱胺酸殘基突變為半胱胺酸殘基以在抗體之重鏈與輕鏈之間形成新的二硫鍵。
在一些態樣中,經修飾之抗體具有胺基酸殘基突變,其中半胱胺酸殘基突變為非半胱胺酸殘基以破壞半胱胺酸殘基之間二硫鍵的形成。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用,以表示藉由肽鍵相互連接的一系列線性胺基酸殘基,該等肽鍵包括蛋白質、多肽、寡肽、肽以及其片段。蛋白質可由天然存在的胺基酸及/或合成(例如,經修飾的或非天然存在的)胺基酸構成。因此,依本文所用,「胺基酸」或「肽殘基」意謂天然存在的胺基酸及合成胺基酸兩者。術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」包括融合蛋白,包括但不限於具有異源胺基酸序列的融合蛋白;帶有具有或不具有N末端甲硫胺酸殘基的異源及同源前導序列的融合蛋白;免疫標記之蛋白質;具有可偵測融合搭配物的融合蛋白,例如,包括螢光蛋白、β-半乳糖苷酶、螢光素酶等作為融合搭配物的融合蛋白;及其類似者。此外,應當注意,胺基酸殘基序列開頭或結尾的橫線表示結合至另外一或多個胺基酸殘基序列的肽鍵或結合至羧基或羥基端基的共價鍵。然而,不存在破折號不應被認為意謂不存在此類至羧基或羥基端基的肽鍵或共價鍵,因為在表示胺基酸序列時通常省略橫線。
依本文所用,術語「抗體」包括與一或多個特異性抗原結合的任何免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、二價抗體、單價抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體或單特異性抗體。天然的完整抗體包括兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。哺乳動物重鏈被分類為α、δ、ε、γ及μ,各重鏈由可變區(VH)及第一恆定區、第二恆定區、第三恆定區以及視情況選用之第四恆定區(分別為CH1、CH2、CH3、CH4)組成;哺乳動物輕鏈被分類為λ或κ,而各輕鏈由可變區(VL)及恆定區組成。抗體呈「Y」型,其中Y的莖部由藉由二硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二恆定區及第三恆定區組成。Y之各臂包括單條重鏈之與單個輕鏈的可變區及恆定區結合的可變區及第一恆定區。輕鏈及重鏈之可變區負責抗原結合。兩條鏈的可變區通常包括三個高度可變環,稱為互補性決定區(CDR) (輕鏈CDR包括LCDR1、LCDR2及LCDR3,重鏈CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所揭示之抗體及抗原結合片段的CDR邊界可藉由Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani規則來定義或鑑定(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., 《分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.)》, 273(4), 927 (1997);Chothia, C.等人, 《分子生物學雜誌》 12月5日; 186(3):651-63 (1985);Chothia, C.及Lesk, A.M., 《分子生物學雜誌》, 196,901 (1987);Chothia, C.等人, 《自然(Nature)》 12月21-28日;342(6252):877-83 (1989);Kabat E.A.等人, 《具有免疫學意義的蛋白質序列(Sequences of Proteins of immunological Interest)》, 第5版 公共衛生署(Public Health Service), 馬里蘭州貝塞斯達國立衛生研究院(National Institutes of Health, Bethesda, Md.) (1991);Marie-Paule Lefranc等人, 《發育與比較免疫學(Developmental and Comparative Immunology)》, 27: 55-77 (2003);Marie-Paule Lefranc等人, 《免疫組研究(Immunome Research)》 1(3), (2005);Marie-Paule Lefranc, 《B細胞分子生物學(Molecular Biology of B cells)》 (第二版), 第26章, 481-514, (2015))。三個CDR由被稱為構架區(FR) (輕鏈FR包括LFR1、LFR2、LFR3及LFR4,重鏈FR包括HFR1、HFR2、HFR3及HFR4)的側接段間隔開,該等構架區比CDR更加高度保守且形成支架以支撐高度可變環。重鏈及輕鏈的恆定區與抗原結合無關,但表現出多種效應功能。抗體基於其重鏈恆定區之胺基酸序列可分成數類。抗體之五個主要類別或同型為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,其特徵分別在於存在α、δ、ε、γ及µ重鏈。主要抗體類別中的一些被分為亞類,如IgG1 (γ1重鏈)、IgG2 (γ2重鏈)、IgG3 (γ3重鏈)、IgG4 (γ4重鏈)、IgA1 (α1重鏈)或IgA2 (α2重鏈)。
依本文所用,術語「可變域」係指包括一或多個CDR之抗體可變區或其片段。儘管可變域可包括完整可變區(如HCVR或LCVR),但亦可能包括少於完整可變區但又仍保留與抗原結合或形成抗原結合位點的能力。
依本文所用,術語「抗原結合片段」係指由包括一或多個CDR的抗體之一部分形成的抗體片段,或與抗原結合但不包括完整天然抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段的實例包括但不限於可變域、可變區、雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')
2、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)
2、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體及二價域抗體。抗原結合片段能夠與親本抗體所結合的相同抗原結合。在某些實施例中,抗原結合片段可包括來自特定人抗體之一或多個CDR,該特定人抗體移植至來自一或多種不同人抗體之構架區。在Spiess等人, 2015 《分子免疫學(Molecular immunology)》, 67(2), 第95-106頁 (2015)及Brinkman等人, 《mAbs》, 9(2), 第182-212頁 (2017)中描述了抗原結合片段(亦稱為抗原結合部分)的更多及詳細形式,該等文獻以全文引用之方式併入本文。
關於抗體之「Fab」係指抗體的由單條輕鏈(可變區及恆定區兩者)與單條重鏈的可變區及第一恆定區藉由二硫鍵結合組成的部分。
「Fab'」係指包括鉸鏈區之一部分的Fab片段。
「F(ab')
2」係指Fab'的二聚體。
就抗體(例如,IgG、IgA或IgD同型)而言,「Fc」係指由第一重鏈的第二恆定域及第三恆定域藉由二硫鍵與第二重鏈的第二恆定域及第三恆定域結合組成的抗體之部分。IgM及IgE同型抗體之Fc進一步包括第四恆定域。抗體之Fc部分負責各種效應功能,如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及補體依賴細胞毒性(CDC),但在抗原結合中不起作用。
就抗體而言,「鉸鏈區」包括將CH1域與CH2域連接的重鏈分子的部分。此鉸鏈區包括大約25個胺基酸殘基,且係可撓性的,因此允許兩個N末端抗原結合區獨立移動。
依本文所用,「CH2域」係指包括使用習知編號方案自例如IgG抗體之約胺基酸244延伸至胺基酸360 (胺基酸244至360,Kabat編號系統;以及胺基酸231-340,EU編號系統;參見Kabat, E.等人, 美國衛生與公眾服務部(U.S. Department of Health and Human Services), (1983))的重鏈分子的部分。
CH3域自CH2域延伸至IgG分子的C端,且包括大約108個胺基酸。某些免疫球蛋白類別,例如IgM,進一步包括CH4區。
就抗體而言,「Fv」係指攜帶完整抗原結合位點的抗體之最小片段。Fv片段由單條輕鏈的可變區與單條重鏈的可變區結合組成。已經提供了許多Fv設計,包括dsFv,其中兩個域之間的締合藉由引入的二硫鍵得以增強;且可使用肽連接子將兩個域結合在一起作為單個多肽來形成scFv。亦已經產生了含有與對應免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變域及恆定域締合的重或輕免疫球蛋白鏈的可變域的Fv構築體。Fv亦已經被多聚化以形成雙功能抗體及三功能抗體(Maynard等人, 《生物醫學工程年評(Annu Rev Biomed Eng)》 2 339-376 (2000))。
「駱駝化單域抗體」、「重鏈抗體」或「HCAb」係指含有兩個V
H域而不包括輕鏈的抗體(Riechmann L.及Muyldermans S., 《免疫學方法雜誌(J Immunol Methods)》 12月10日; 231(1-2):25-38 (1999);Muyldermans S., 《生物技術雜誌(J Biotechnol.)》 6月;74(4):277-302 (2001);WO94/04678;WO94/25591;美國專利第6,005,079號)。重鏈抗體最初源自駱駝科(
Camelidae) (駱駝、單峰駱駝及美洲駝)。雖然缺失輕鏈,但駱駝化抗體具有真實的抗原結合譜(Hamers-Casterman C.等人, 《自然》 6月3日; 363(6428):446-8 (1993);Nguyen VK.等人 《免疫遺傳學(Immunogenetics)》. 4月; 54(1):39-47 (2002);Nguyen VK.等人, 《免疫學(Immunology)》. 5月; 109(1):93-101 (2003))。重鏈抗體之可變域(VHH域)表示由應變性免疫反應產生的最小已知抗原結合單位(Koch-Nolte F.等人, 《美國實驗生物學會聯合會雜誌(
FASEB J.)》 11月;21(13):3490-8. 電子版2007年6月15日 (2007))。
「奈米抗體」係指由來自重鏈抗體之VHH域以及兩個恆定域CH2及CH3組成的抗體片段。
「雙功能抗體」或「dAb」包括具有兩個抗原結合位點的小抗體片段,其中該等片段包括在同一條多肽鏈中與V
L域連接的V
H域(V
H-V
L或V
L-V
H) (參見例如,Holliger P.等人, 《美國國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)》 7月15日; 90(14):6444-8 (1993);EP404097;WO93/11161)。藉由使用太短以至於不允許在同一條鏈上的兩個域之間配對的連接子,域被迫與另一條鏈的互補域配對,由此產生兩個抗原結合位點。抗原結合位點可靶向相同或不同的抗原(或抗原決定基)。在某些實施例中,「雙特異性ds雙功能抗體」為靶向兩種不同抗原(或抗原決定基)的雙功能抗體。
依本文所用,術語「價」係指給定分子中存在指定數量的抗原結合位點。術語「單價」係指僅具有一個單抗原結合位點的抗體或抗原結合片段;且術語「多價」係指具有多個抗原結合位點的抗體或抗原結合片段。如此,術語「二價」、「三價」、「四價」及「六價」分別表示在抗原結合分子中存在兩個結合位點、三個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段為二價的。
依本文所用,「雙特異性」抗體係指具有源自兩個不同的單株抗體之片段且能夠與兩個不同的抗原決定基結合的人工抗體。兩個抗原決定基可存在於同一抗原上,或其可存在於兩種不同抗原上。
依本文所用,「多特異性」抗體係指具有源自多於兩個不同的單株抗體的片段且能夠與多於兩個不同的抗原決定基結合的人工抗體。該等多於兩個抗原決定基可存在於同一抗原上,或其可存在於多於兩種不同抗原上。
依本文所用,術語「嵌合」意謂具有源自一種物種的重鏈及/或輕鏈的一部分且重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同物種的抗體或抗原結合片段。在說明性實例中,嵌合抗體可包括源自人的恆定區及源自非人動物,如源自小鼠的可變區。在一些實施例中,非人動物為哺乳動物,例如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。
依本文所用,術語「人源化」意謂抗體或抗原結合片段包括源自非人動物的CDR、源自人的FR區以及當適用時源自人的恆定區。
依本文所用,術語「親和力」係指免疫球蛋白分子(亦即,抗體)或其片段與抗原之間非共價相互作用的強度。
依本文所用,術語「特異性結合(specific binding)」或「特異性地結合(specifically binds)」係指兩個分子之間,例如抗體與抗原之間的非隨機結合反應。特異性結合的特徵可在於結合親和力,例如由K
D值表示,亦即,當抗原與抗原結合分子之間的結合達至平衡時解離速率與締合速率的比率(k
off/k
on)。K
D可藉由使用此項技術中已知的任何習知方法測定,該方法包括但不限於表面電漿共振法、微量熱泳法、HPLC-MS法及流式細胞術(如FACS)方法。≤ 10
-6M(例如≤ 5 × 10
-7M、≤ 2 × 10
-7M、≤ 10
-7M、≤ 5 × 10
-8M、≤ 2 × 10
-8M、≤ 10
-8M、≤ 5 × 10
-9M、≤ 4 × 10
-9M、≤ 3 × 10
-9M、≤ 2 × 10
-9M或≤10
-9M)的K
D值可指示抗體或其抗原結合片段與對應的抗原之間的特異性結合。
依本文所用,術語「抗原決定基」係指抗體所結合的抗原上的特定的一組原子或胺基酸。若兩種抗體展現出針對抗原的競爭性結合,則其可與抗原內的相同或密切相關的抗原決定基結合。抗原決定基可為線性的或構象的(亦即,包括間隔開的胺基酸殘基)。
關於胺基酸序列(或核酸序列)的「序列同一性百分比(%)」被定義為在比對序列,且必要時引入空位以實現最大數量的相同胺基酸(或核酸)後,在候選序列中與參考序列中的胺基酸(或核酸)殘基相同的胺基酸(或核酸)殘基的百分比。換言之,胺基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比(%)可藉由將相對於其比較的參考序列相同的胺基酸殘基(或鹼基)的數目除以候選序列或參考序列中胺基酸殘基(或鹼基)的總數(以較短者為準)來計算。胺基酸殘基的保守取代可或可不視為相同殘基。可例如使用公開可用之工具,如BLASTN、BLASTp (可在美國國家生物技術資訊中心(U.S. National Center for Biotechnology Information,NCBI)的網站上獲得,亦參見Altschul S.F.等人, 《分子生物學雜誌》 215:403-410 (1990);Stephen F.等人, 《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》, 25:3389-3402 (1997))、ClustalW2 (可在歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute)的網站上獲得,亦參見Higgins D.G.等人, 《酶學方法(Methods in Enzymology)》, 266:383-402 (1996);Larkin M.A.等人 《生物資訊學(Bioinformatics)》 (英國劍橋), 23(21): 2947-8 (2007))以及ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體實現用於測定胺基酸(或核酸)序列同一性百分比的比對。熟習此項技術者可使用由該工具提供的預設參數或可根據比對的需要適當定製參數,例如藉由選擇合適之算法。
依本文所用,關於胺基酸殘基的術語「突變」、「突變的」係指一或多個胺基酸殘基的取代、插入或缺失。
依本文所用,關於胺基酸序列的術語「取代」或「取代的」係指用不同的胺基酸殘基替換天然胺基酸殘基。
關於胺基酸序列的術語「保守取代」係指用具有類似理化特性的側鏈的不同胺基酸殘基替換胺基酸殘基。例如,可在具有疏水側鏈的胺基酸殘基(例如,Met、Ala、Val、Leu及Ile)之間、具有中性親水側鏈的胺基酸殘基(例如,Cys、Ser、Thr、Asn及Gln)之間、具有酸性側鏈的胺基酸殘基(例如,Asp、Glu)之間、具有鹼性側鏈的胺基酸殘基(例如,His、Lys及Arg)之間或具有芳族側鏈的胺基酸殘基(例如,Trp、Tyr及Phe)之間進行保守取代。依此項技術中已知的,保守取代通常不會引起蛋白質構象結構的顯著變化,且因此可保留蛋白質的生物學活性。
術語「個體」包括人及非人動物。非人動物包括所有脊椎動物,例如哺乳動物及非哺乳動物,如非人靈長類動物、小鼠、大鼠、貓、兔、羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除非指出,術語「患者」或「個體」在本文中可互換使用。
抗體或其抗原結合片段可包括引入或移除糖基化位點的一或多個修飾。糖基化位點為具有側鏈的胺基酸殘基,碳水化合物部分(例如,寡糖結構)可連接至該側鏈。抗體之糖基化通常為N連接的或O連接的。N連接係指將碳水化合物部分與天冬醯胺殘基(例如,如天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸等三肽序列中的天冬醯胺殘基)連接的側鏈,其中X為除了脯胺酸之外的任何胺基酸。O連接的糖基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基胺基酸連接,最常見的為與絲胺酸或蘇胺酸連接。
二硫鍵之形成及斷裂
在一些實施例中,本文所提供之抗體包括第一臂及第二臂,其中該第一臂由第一重鏈及第一輕鏈以及在其間形成的至少一個二硫鍵形成,且該第二臂由第二重鏈及第二輕鏈以及在其間形成的至少一個二硫鍵形成。
在一些實施例中,形成第一臂的第一重鏈與第一輕鏈之間的連接包括人工引入的二硫鍵,而形成第二臂的第二重鏈與第二輕鏈之間的連接包括天然存在的二硫鍵。在一些實施例中,形成第一臂的第一重鏈與第一輕鏈之間的連接包括在第一組位置處的人工引入的二硫鍵,而形成第二臂的第二重鏈及第二輕鏈的連接包括在與第一組位置不同的第二組位置處的人工引入的二硫鍵。
在一些態樣中,經修飾之抗體具有胺基酸殘基突變,其中分別位於抗體之重鏈及輕鏈上之一對非半胱胺酸殘基(其可為除半胱胺酸以外的任何胺基酸)突變為半胱胺酸殘基以在其間形成新的二硫鍵。在某些實施例中,根據EU編號,重鏈上之非半胱胺酸殘基位於胺基酸位置126、128、129、136、141、168、170、173、175或187處,且根據EU編號,輕鏈上之非半胱胺酸殘基位於胺基酸位置114、116、118、124、135、137、138、160、162或164處。在某些實施例中,根據EU編號,重鏈上之非半胱胺酸殘基為F126、L128、A129、S136、A141、H168、F170、V173、Q175或T187的胺基酸殘基。在某些實施例中,根據EU編號,輕鏈上之非半胱胺酸殘基為S114、F116、F118、Q124、L135、N137、N138、Q160、S162或T164的胺基酸殘基。
在某些實施例中,經修飾之抗體包括一對或多對在以下位置處自非半胱胺酸殘基至半胱胺酸殘基的突變:
表1. 將自非半胱胺酸殘基突變為半胱胺酸殘基的胺基酸殘基。
輕鏈中之位置 (EU編號) | 重鏈中之位置 (EU編號) |
114 | 136 |
116 | 136 |
118 | 128 |
118 | 129 |
118 | 141 |
124 | 126 |
135 | 170 |
137 | 170 |
138 | 168 |
160 | 173 |
160 | 175 |
162 | 170 |
162 | 187 |
164 | 170 |
在某些實施例中,經修飾之抗體包括自非半胱胺酸殘基至半胱胺酸殘基的以下突變對中的一對或多對:
表2. 將自非半胱胺酸殘基突變為半胱胺酸殘基的胺基酸殘基。
輕鏈中之位置 (EU編號) | 重鏈中之位置 (EU編號) |
S114C | S136C |
F116C | S136C |
F118C | L128C |
F118C | A129C |
F118C | A141C |
Q124C | F126C |
L135C | F170C |
N137C | F170C |
N138C | H168C |
Q160C | V173C |
Q160C | Q175C |
S162C | F170C |
S162C | T187C |
T164C | F170C |
在一些態樣中,經修飾之抗體具有胺基酸殘基突變,其中半胱胺酸殘基突變為非半胱胺酸殘基以破壞半胱胺酸殘基之間二硫鍵的形成。在某些實施例中,突變為非半胱胺酸殘基的半胱胺酸殘基對為該抗體之輕鏈中的胺基酸殘基C214及重鏈中的胺基酸殘基C220。
在某些實施例中,經修飾之抗體在選自表1或表2的位置處具有一對或多對胺基酸殘基突變,且突變為非半胱胺酸殘基的半胱胺酸殘基對為該抗體之輕鏈中的胺基酸殘基C214及重鏈中的胺基酸殘基C220。
在一些實施例中,本發明之抗體或其抗原結合片段包括第一臂,該第一臂由第一重鏈及第一輕鏈以及在其間形成的兩個新的二硫鍵形成,其中該等兩個二硫鍵由選自表1或表2中列出的突變對的自非半胱胺酸至半胱胺酸的突變對形成。
在某些實施例中,本發明之抗體或其抗原結合片段包括第一臂及第二臂,該第一臂由第一重鏈及第一輕鏈以及在其間形成的二硫鍵形成,該第二臂由第二重鏈及第二輕鏈以及在其間形成的二硫鍵形成,其中該第一輕鏈及該第一重鏈包括至少一對選自由以下組成之群的自非半胱胺酸殘基至半胱胺酸殘基的突變:
(i)位於輕鏈上之S114C及位於重鏈上之S136C;
(ii)位於輕鏈上之F116C及位於重鏈上之S136C;
(iii)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之L128C;
(iv)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A129C;
(v)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A141C;
(vi)位於輕鏈上之Q124C及位於重鏈上之F126C;
(vii)位於輕鏈上之L135C及位於重鏈上之F170C;
(viii)位於輕鏈上之N137C及位於重鏈上之F170C;
(ix)位於輕鏈上之N138C及位於重鏈上之H168C;
(x)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之V173C;
(xi)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之Q175C;
(xii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之F170C;
(xiii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之T187C;以及
(xiv)位於輕鏈上之T164C及位於重鏈上之F170C;
其中自非半胱胺酸殘基至半胱胺酸殘基的至少一對突變在該第一重鏈與該第一輕鏈之間形成至少一個二硫鍵,且該第一輕鏈上之天然半胱胺酸及該第一重鏈上之天然半胱胺酸被突變為非半胱胺酸胺基酸。在某些實施例中,該天然半胱胺酸突變為的非半胱胺酸殘基獨立地選自S、A或G。
除非另有說明,否則本發明中描述的抗體之重鏈及輕鏈上之所有胺基酸殘基及位置的編號均係根據EU編號系統。依本文所用,術語「EU編號系統」係指抗體恆定區的EU編號慣例,依Edelman, G. M.等人, 《美國國家科學院院刊》, 63, 78-85 (1969)及Kabat等人, 《具有免疫學意義的蛋白質序列》, 美國衛生與人類服務部(U.S. Dept. Health and Human Services), 第5版, 1991,該等參考文獻中之每一者以全文引用之方式併入本文。
在一些實施例中,在第二輕鏈CL區上的天然半胱胺酸與第二重鏈CH1區上的天然半胱胺酸之間形成的天然存在的二硫鍵被兩個半胱胺酸上的非半胱胺酸取代破壞。在一些實施例中,天然半胱胺酸獨立地被任何一個非半胱胺酸殘基取代,只要人工引入的新殘基對之間沒有任何相互作用。在一些實施例中,天然半胱胺酸獨立地被絲胺酸(S)、丙胺酸(A)或甘胺酸(G)取代。在一些實施例中,天然半胱胺酸均被絲胺酸(S)取代。
在一些實施例中,人工引入的二硫鍵由選自由表3中列出的突變組成之群的突變體組合形成。
表3. CH1及CL上的在CH1與CL之間形成人工引入的二硫鍵的突變位點。
CL中之突變體位點 | CH1中之突變體位點 |
S114C/C214S | S136C/C220S |
F116C/C214S | S136C/C220S |
F118C/C214S | L128C/C220S |
F118C/C214S | A129C/C220S |
F118C/C214S | A141C/C220S |
Q124C/C214S | F126C/C220S |
Q160C/C214S | Q175C/C220S |
Q160C/C214S | V173C/C220S |
L135C/C214S | F170C/C220S |
N137C/C214S | H170C/C220S |
N138C/C214S | H168C/C220S |
S162C/C214S | F170C/C220S |
S162C/C214S | T187C/C220S |
T164C/C214S | F170C/C220S |
S114C/Q160C/C214S | S136C/V173C/C220S |
F118C/Q124C/C214S | L128C/F126C/C220S |
F118C/Q124C/C214S | A129C/F126C/C220S |
F118C/Q124C/C214S | A141C/F126C/C220S |
F116C/Q124C/C214S | S136C/F126C/C220S |
Q124C/T164C/C214S | F126C/F170C/C220S |
Q124C/N138C/C214S | F126C/H168C/C220S |
Q160C/L135C/C214S | Q175C/F170C/C220S |
S114C/S162C/C214S | S136C/F170C/C220S |
F118C/S162C/C214S | L128C/F170C/C220S |
F118C/S162C/C214S | A141C/F170C/C220S |
Q124C/S162C/C214S | F126C/F170C/C220S |
N137C/S162C/C214S | F170C/T187C/C220S |
在一些實施例中,形成第一臂的第一重鏈與第一輕鏈之間的連接包括兩對由選自由以下組成之群的突變體組合形成的人工引入的二硫鍵:
(i)位於輕鏈上之S114C/Q160C及位於重鏈上之S136C/V173C;
(ii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之L128C/F126C;
(iii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A129C/F126C;
(iv)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A141C/F126C;
(v)位於輕鏈上之F116C/Q124C及位於重鏈上之S136C/F126C;
(vi)位於輕鏈上之Q124C/T164C及位於重鏈上之F126C/F170C;
(vii)位於輕鏈上之Q124C/N138C及位於重鏈上之F126C/H168C;
(viii)位於輕鏈上之Q160C/L135C及位於重鏈上之Q175C/F170C;
(ix)位於輕鏈上之S114C/S162C及位於重鏈上之S136C/F170C;
(x)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之L128C/F170C;
(xi)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之A141C/F170C;
(xii)位於輕鏈上之Q124C/S162C及位於重鏈上之F126C/F170C;以及
(xiii)位於輕鏈上之N137C/S162C及位於重鏈上之F170C/T187C。
在一些實施例中,形成第一臂的第一重鏈與第一輕鏈之間的連接包括兩對由選自由以下組成之群的突變體組合形成的人工引入的二硫鍵:
(i)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之L128C/F126C;
(ii)位於輕鏈上之Q124C/T164C及位於重鏈上之F126C/F170C;
(iii)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之L128C/F170C;
(iv)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之A141C/F170C;以及
(v)位於輕鏈上之Q124C/S162C及位於重鏈上之F126C/F170C。
在一些實施例中,本文所揭示之抗體或其抗原結合片段包括與人生殖系重鏈CH1區至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的重鏈CH1區。在一些實施例中,人生殖系重鏈CH1區具有本文所提供之SEQ ID NO: 5中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中,本文所揭示之抗體或其抗原結合片段包括與人生殖系輕鏈CL區至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的輕鏈CL區。在一些實施例中,人生殖系輕鏈CL區具有本文所提供之SEQ ID NO: 4中所示的胺基酸序列。
雙特異性抗體之形成
藉由重新定位由來自CH1區及CL區的半胱胺酸對形成的二硫鍵,本發明提供了經修飾之抗體,該等經修飾之抗體的重鏈及輕鏈以高組合準確性及穩定性配對。
依本文所用,「雙特異性抗體」為對至少兩種獨立抗原或同一抗原內的不同抗原決定基具有結合特異性的抗體。
在某些實施例中,雙特異性抗體包括一個抗原決定基的第一結合位點及另一個抗原決定基的第二結合位點。在某些實施例中,兩個抗原目標選自由以下組成之群:SIRPα、CLDN18.2、Siglec15、HER2、EGFR、CD19、CD20、CD39、CD47、PD1、PDL1、CD3、NKG2D、NKG2A、Nkp46、CD137、OX40、CD40、LILRB1、LILRB2、LILRB4、GPC3、TROP2、CD112、TIGIT、FAP、VEGFA、DLL4、ANG-2。在某些實施例中,雙特異性抗體之抗原結合臂中的一個抗原結合臂可靶向SIRPα,且雙特異性抗體之其他抗原結合臂可靶向Claudin 18.2。
在某些實施例中,雙特異性抗體對兩個獨立抗原(或同一抗原上的抗原決定基)的結合親和力大致相同。在某些實施例中,雙特異性抗體對兩個獨立抗原(或同一抗原上的抗原決定基)的結合親和力不同。在一些實施例中,雙特異性抗體對兩個獨立抗原(或同一抗原上的抗原決定基)的親和力可相差1倍、2倍、3倍、4倍或更多倍。
Fc
區上的突變
本文所揭示之抗體或其抗原結合片段亦涵蓋Fc變異體,該等Fc變異體可包括一或多個在Fc區及/或鉸鏈區處的胺基酸殘基修飾或取代。
在一些實施例中,異二聚體配對係藉由工程化兩條重鏈之Fc區使得其排他性地形成異二聚體來實現的。在一些實施例中,Fc區的CH3區被引入突變。
在某些實施例中,抗體或其抗原結合片段包括Fc區的作用界面中的一或多個胺基酸取代以便於推動及/或促進異二聚體化。此等修飾包括將突起引入至第一Fc多肽中且將空腔引入至第二Fc多肽中,其中突起可定位於空腔中,以便促進第一Fc多肽與第二Fc多肽的相互作用以形成異二聚體或複合物。產生具有此等修飾之抗體的方法為此項技術中已知的,依美國專利第5,731,168號中所述。
在一些實施例中,藉由用較大的側鏈(例如,酪胺酸或色胺酸)替換來自第一抗體分子的作用界面的一或多個小胺基酸側鏈來產生「杵」。藉由用較小的胺基酸側鏈(例如,丙胺酸或蘇胺酸)替換大的胺基酸側鏈,在第二抗體分子的作用界面上產生與大的側鏈相同或類似大小的補償性「臼」。用於增強異二聚體化的CH3修飾包括例如位於一條重鏈上之Y407V/T366S/L368A及位於另一條重鏈上之T366W;位於一條重鏈上之S354C/T366W及位於另一條重鏈上之Y349C/Y407V/T366S/L368A。表4提供了在一條鏈上產生突起而在另一條鏈上產生腔的此類修飾。
表4. 形成Fc異二聚體化的杵及臼結構的突變。
一個CH3區中之修飾 | 另一個CH3區中之修飾 |
T366S/L368A/Y407V | T366W |
S354C/T366W | Y349C/T366S/L368A/Y407V |
T366Y | Y407T |
T366W | Y407A |
T394W | F405A |
T366Y/F405A | T394W/Y407T |
T366W/F405W | T394S/Y407A |
F405W | T394S |
D399C | K392C |
T366W/D399C | T3 66S/L368A/K392C/Y407V |
T366W/K392C | T366S/L368A/D399C/Y407V |
S354C/T366W | Y349C/T366S/L368A/Y407V |
Y349C/T366W | S354C/T366S/L368A/Y407V |
E356C/T366W | Y349C/T366S/L368A/Y407V |
Y349C/T366W | E356C/T366S/L368A/Y407V |
E357C/T366W | Y349C/T366S/L368A/Y407V |
Y349C/T366W | E357C/T366S/L368A/Y407V |
在一些實施例中,本文所揭示之抗體或其抗原結合片段包括第一CH3區及第二CH3區,其中第一CH3區或第二CH3區包括與野生型IgG胺基酸序列不同的胺基酸序列,使得野生型人IgG胺基酸序列中的一或多個帶正電荷的胺基酸(例如,離胺酸、組胺酸及精胺酸)被CH3區中之對應位置處的一或多個帶負電荷的胺基酸(例如,天冬胺酸及麩胺酸)替換。可替代地,第一CH3區或第二CH3區包括與野生型IgG胺基酸序列不同的van胺基酸序列,使得野生型人IgG胺基酸序列中的一或多個帶負電荷的胺基酸被CH3區中之對應位置處的一或多個帶正電荷的胺基酸替換。在一些實施例中,兩個CH3區中之修飾選自表5中所列之群。
表5. 改變Fc異二聚體化的電荷極性的突變。
一個CH3區中之修飾 | 另一個CH3區中之修飾 |
K370E/D399K/K439D | D356K/E357K/K409D |
K409D | D399K |
K409E | D399K |
K409E | D399R |
K409D | D399R |
D339K | E356K |
E356K/D399K | K392D/K409D |
E356K/D399K | K409D/K439D |
E357K/D399K | K370D/K409D |
E356K/E357K/D399K | K370D/K392D/K409D |
E357K/D399K | K392D/K409D |
K392D/K409D | D399K |
K360D/K409D | D399K |
在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段的重鏈恆定區可源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段的輕鏈恆定區可源自人κ鏈或人λ鏈。
II. 結合物
在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段進一步包括一或多個結合物部分。在某些實施例中,本文所提供之抗體或其抗原結合片段用作結合物的基礎。
結合物部分可連接於抗體或其抗原結合片段。結合物部分為可與抗體或其抗原結合片段連接的部分。設想多種結合物部分可連接於本文所提供之抗體或其抗原結合片段(參見例如「結合物疫苗(Conjugate Vaccines)」, 《對微生物學及免疫學的貢獻(Contributions to Microbiology and Immunology)》, J. M. Cruse及R. E. Lewis, Jr. (編輯), 紐約Carcer出版社(Carcer Press, New York), (1989))。此等結合物部分可藉由共價結合、親和力結合、嵌入、配位結合、複合、締合、共混或添加以及其他方法連接於抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段可藉由連接子連接於一或多種結合物。
III. 製備方法
本發明提供了編碼本文所提供之抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。
依本文所用,術語「多核苷酸」或「核酸」係指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另外指出,否則特定多核苷酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(例如,簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補性序列以及明確指出的序列。具體而言,簡併密碼子取代可藉由生成序列來實現,在該等序列中,一或多個所選的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代(參見Batzer等人, 《核酸研究》 19:5081 (1991);Ohtsuka等人, 《生物化學雜誌(J. Biol. Chem.)》 260:2605-2608 (1985);以及Rossolini等人, 《分子及細胞探針(Mol. Cell. Probes)》 8:91-98 (1994))。
編碼本文所提供之抗體或其抗原結合片段的核酸或多核苷酸可使用重組技術構築。為此,可使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離編碼親本抗體之抗原結合片段(如CDR或可變區)的DNA且對其進行定序。作為實例,獲得且可操作地連接編碼可變域(VH)的多核苷酸序列及編碼CH1、CH2及CH3的多核苷酸序列以允許在宿主細胞中轉錄及表現以產生重鏈多肽。類似地,編碼VL的多核苷酸序列可操作地連接於編碼CL的多核苷酸序列,從而允許輕鏈在宿主細胞中表現。
可藉由此項技術中已知的各種方法引入突變。在一些實施例中,使用PCR技術,具有被設計突變(例如,包括點突變、多核苷酸片段的缺失或多核苷酸片段的插入)的引子可用於引入某些突變。
在一些實施例中,具有或不具有突變的多核苷酸可藉由合成方法獲得。化學DNA合成方法為此項技術中眾所周知的。通常,該等方法包括以下步驟。第一核苷酸的5'端被二甲氧基三苯甲基(DMT)保護,而二氧化矽的連接子連接OH端。所有核苷酸的反應基團均受到化學保護。之後,藉由洗滌移除DMT,且下一個核苷酸被活化且連接於3'-OH基團。使用碘,氧化5'至3'鍵以產生磷酸三酯鍵(磷酸基團的一個O被甲基化)。反應繼續,直至達到所期望的鏈長。以此方式,可製備約70-80種殘餘聚合物。該過程亦具有自動化版本,且常規合成服務為可商購獲得的。編碼本文所揭示之抗體或其抗原結合片段的DNA使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)容易地分離及定序。
編碼多核苷酸序列可進一步可操作地連接於一或多個調控序列,視情況地在表現載體中,使得重鏈及輕鏈之表現或產生為可行的且處於適當的控制下。
本發明提供了包括編碼本文所提供之多核苷酸的載體。依本文所用,術語「載體」係指可將編碼蛋白質的多核苷酸可操作地插入其中以便引起該蛋白質的表現的媒劑。通常,構築體亦包括合適的調控序列。例如,多核苷酸分子可包括位於編碼引導RNA的核苷酸序列及/或編碼定點修飾多肽的核苷酸序列的5'-側接區的調控序列,該等調控序列以能夠在宿主細胞中表現所期望的轉錄物/基因的方式可操作地連接於編碼序列。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞,以使其攜帶的遺傳元件在宿主細胞內產生表現。載體的實例包括質體、噬菌粒、黏粒、如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或源自P1的人工染色體(PAC)等人工染色體、諸如λ噬菌體或M13噬菌體之噬菌體及動物病毒。用作載體的動物病毒之類別包括逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如,單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒及乳多空病毒(例如,SV40)。載體可包括多種用於控制表現的元件,包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、可選擇元件及報導基因。另外,載體可包括複製起點。載體亦可包括輔助其進入細胞的材料,包括但不限於病毒顆粒、脂質體或蛋白質塗層。
載體的實例包括但不限於逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如,單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒(例如,SV40)、λ噬菌體及M13噬菌體、質體pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
包括編碼抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列的載體可被引入至宿主細胞中以供選殖或基因表現。依本文所用,術語「宿主細胞」係指其中已引入有外源性多核苷酸及/或載體的細胞。
用於選殖或表現本文中的載體中的DNA的合適的宿主細胞為上述原核細胞、酵母細胞或高等真核細胞。用於此目的的合適的原核細胞包括真細菌,如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體,例如腸桿菌科(
Enterobacteriaceae),如埃希氏桿菌屬(
Escherichia),例如,大腸桿菌)、腸桿菌屬(
Enterobacter)、歐文氏菌屬(
Erwinia)、克雷伯氏菌屬(
Klebsiella)、變形桿菌屬(
Proteus)、沙門氏菌屬(
Salmonella),例如,鼠傷寒沙門氏菌(
Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬(
Serratia),例如,黏質沙雷氏菌(
Serratia marcescans)及志賀氏菌屬(
Shigella);以及芽孢桿菌綱(
Bacilli),如枯草芽孢桿菌(
B. subtilis)及地衣芽孢桿菌(
B. licheniformis);假單胞菌屬,如銅綠假單胞菌(
P. aeruginosa)及鏈黴菌屬(
Streptomyces)。
除了原核生物之外,真核微生物(如絲狀真菌或酵母)為編碼抗體之載體的合適選殖或表現宿主。釀酒酵母(
Saccharomyces cerevisiae)或普通麵包酵母在低等真核宿主微生物中為最常用的。然而,許多其他屬、物種及菌株均比較常用且在本文中適用,如粟酒裂殖酵母(
Schizosaccharomyces pombe);克魯維酵母菌屬宿主(
Kluyveromyceshost),例如,乳酸克魯維酵母(
K. lactis)、脆壁克魯維酵母(
K. fragilis) (ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(
K. bulgaricus) (ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(
K. wickeramii) (ATCC 24,178)、克魯雄酵母(
K. waltii) (ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(
K. drosophilarum) (ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(
K. thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母(
K. marxianus);耶氏酵母屬(
yarrowia) (EP 402,226);巴斯德畢赤酵母(
Pichia pastoris) (EP 183,070);念珠菌屬(
Candida);里氏木黴(
Trichoderma reesia) (EP 244,234);粗糙脈孢菌(
Neurospora crassa);許旺酵母屬(
Schwanniomyces),如西方許旺酵母(
Schwanniomyces occidentalis);以及絲狀真菌,例如,脈孢菌(
Neurospora)、青黴菌屬(
Penicillium)、彎頸黴屬(
Tolypocladium)及曲黴菌屬(
Aspergillus)宿主,如構巢麴黴(
A. nidulans)及黑曲黴菌。
用於表現本文所提供之糖基化抗體或其抗原結合片段的合適宿主細胞源自多細胞生物體。無脊椎細胞的實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定多種桿狀病毒株及變異體以及對應的許可性(permissive)昆蟲宿主細胞,該等許可性昆蟲宿主細胞來自於如以下等宿主:草地夜蛾(
Spodoptera frugiperda) (毛蟲)、埃及斑蚊(
Aedes aegypti) (蚊子)、白紋伊蚊(
Aedes albopictus) (蚊子)、黑腹果蠅(
Drosophila melanogaster) (果蠅)及家蠶(
Bombyx mori)。多種用於轉染的病毒株為公眾可得,例如苜蓿銀紋夜蛾(
Autographa californica)NPV的L-1變異體以及家蠶NPV的Bm-5株變異體,且此類病毒均可根據本發明用作本文中的病毒,特別是用於轉染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草的植物細胞培養物亦可用作宿主。
在某些實施例中,宿主細胞為脊椎動物細胞。在培養物(組織培養物)中繁殖脊椎動物細胞已變成常規程序。有用的哺乳動物宿主細胞株的實例為由SV40 (COS-7,ATCC CRL 1651)轉化的猴腎CV1株;人胚胎腎株(針對懸浮培養物中的生長次選殖的293或293細胞,Graham等人, 《普通病毒學雜誌(J. Gen. Virol.)》 36:59 (1977));小倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人, 《美國國家科學院院刊》 77:4216 (1980));小鼠支持細胞(TM4, Mather, 《生殖生物學(Biol. Reprod.)》, 23:243-251 (1980));猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人宮頸腫瘤細胞(HELA,ATCC CCL 2);犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺細胞(W138,ATCC CCL 75);人肝細胞(Hep G2,HB 8065);鼠類乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等人, 《紐約科學院年鑒(Annals N.Y. Acad. Sci.)》 383:44-68 (1982));MRC 5細胞;FS4細胞;以及人肝癌株(Hep G2)。在一些實施例中,宿主細胞為哺乳動物培養的細胞株,如CHO、BHK、NS0、293及其衍生物。
用上述用於抗體產生的表現或選殖載體轉化宿主細胞,且將該等宿主細胞在習知營養培養基中培養,該等習知營養培養基被改性成適於誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因。
本發明亦提供了一種表現本文所提供之抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括在表現本發明之載體之條件下培養本文所提供之宿主細胞。用於產生本文所提供之抗體或其抗原結合片段的宿主細胞可在各種培養基中培養。可商購獲得的培養基如Ham's F10 (西格瑪公司(Sigma))、最低必需培養基(Minimal Essential Medium,MEM) (西格瑪公司)、RPMI-1640 (西格瑪公司)及杜氏改良伊氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM) (西格瑪公司)適於培養宿主細胞。另外,在以下文獻中描述的培養基中的任何培養基均可用作宿主細胞的培養基:Ham等人, 《酶學方法》
58:44 (1979);Barnes等人, 《分析生物化學(Anal. Biochem.)》
102:255 (1980);美國專利第4,767,704號;第4,657,866號;第4,927,762號;第4,560,655號;或第5,122,469號;WO 90/03430;WO 87/00195;或美國複審專利30,985。此等培養基中之任何培養基均可根據需要補充激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷及胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN
TM藥物)、痕量元素(定義為最終濃度通常在微莫耳範圍內的無機化合物)及葡萄糖或等效能量源。亦可以熟習此項技術者員已知的適當濃度包括任何其他必要的補充物。如溫度、pH等培養條件為先前與被選定用於表現的宿主細胞一起使用的彼等條件,且對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。
當使用重組技術時,抗體可在胞內、周質間隙中產生,或者直接分泌至培養基中。若在胞內產生抗體,則作為第一步驟,可例如藉由離心或超濾來移除宿主細胞或溶解的片段的微粒狀碎片。Carter等人, 《生物/技術(Bio/Technology)》 10:163-167 (1992)描述了一種用於分離分泌至大腸桿菌的周質間隙的抗體的程序。簡而言之,將細胞糊劑在存在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)之情況下經約30分鐘解凍。細胞碎片可藉由離心移除。當抗體被分泌至培養基中時,通常首先使用可商購獲得的蛋白質濃縮過濾器(例如,Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)對來自此類表現系統的上清液進行濃縮。如PMSF等蛋白酶抑制劑可包括在上述步驟中的任何步驟中以抑制蛋白水解,且可包括抗生素以防止外來污染物的生長。
在某些實施例中,本發明提供了一種產生本文所提供之抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括:a)向宿主細胞中引入:編碼第一重鏈的第一多核苷酸、編碼第一輕鏈的第二多核苷酸、編碼第二重鏈的第三多核苷酸及編碼第二輕鏈的第四多核苷酸,其中該第一輕鏈及該第一重鏈包括位於該第一輕鏈上之C214X及位於該第一重鏈上之C220X的非半胱胺酸取代對及至少一個半胱胺酸取代對;b)允許該宿主細胞表現多肽複合物。在某些實施例中,該至少一個半胱胺酸取代對選自由以下組成之群:(i)位於輕鏈上之S114C及位於重鏈上之S136C;(ii)位於輕鏈上之F116C及位於重鏈上之S136C;(iii)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之L128C;(iv)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A129C;(v)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A141C;(vi)位於輕鏈上之Q124C及位於重鏈上之F126C;(vii)位於輕鏈上之L135C及位於重鏈上之F170C;(viii)位於輕鏈上之N137C及位於重鏈上之F170C;(ix)位於輕鏈上之N138C及位於重鏈上之H168C;(x)位於輕鏈上之T164C及位於重鏈上之F170C;(xi)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之V173C;(xii)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之Q175C;以及(xiii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之F170C。
在某些實施例中,該方法進一步包括分離抗體或其抗原結合片段。術語「分離」意欲意謂所關注之化合物已經自自然界或製備過程中伴隨其的組分中分離或純化,且以富集形式提供。
由細胞製備的抗體或其抗原結合片段可使用例如羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換層析法、硫酸銨沈澱、鹽析及親和層析法來分離。
在某些實施例中,固定在固相上的蛋白A用於抗體及其抗原結合片段的免疫親和純化。蛋白A是否合適作為親和配位體取決於抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc域的物種及同型。蛋白A可用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等人, 《免疫學方法雜誌》 62:1-13 (1983))。蛋白G被推薦用於所有小鼠同型及人γ3 (Guss等人, 《歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)》 5:1567 1575 (1986))。親和配位體附著的基質最常為瓊脂糖,但其他基質亦為可用的。與可用瓊脂糖實現的流速及處理時間相比,機械穩定的基質(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)可實現更快的流速及更短的處理時間。當抗體包含CH3域時,Bakerbond ABX
TM樹脂(新澤西州菲利普斯堡的馬林克羅特貝克有限公司(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)可用於純化。根據待回收的抗體,用於蛋白質純化的其他技術亦為可用的,如在離子交換管柱上進行分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、在二氧化矽上進行層析法、在肝素SEPHAROSE
TM上進行層析法、在陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬胺酸管柱)上進行層析法、層析聚焦、SDS-PAGE以及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟之後,可使用鹽濃度的梯度溶離對包括所關注之抗體或其抗原結合片段及污染物的混合物進行疏水相互作用層析法或離子交換層析法。
在某些實施例中,本文所提供之抗體或其抗原結合片段可使用習知方法以高產量容易地純化。抗體或其抗原結合片段的優點之一為重鏈可變域序列與輕鏈可變域序列之間的錯配顯著減少。此減少了不需要的副產物的產生,且使得使用相對簡單的純化過程以高產量獲得高純度產物成為可能。
IV. 醫藥組合物及投與
本發明進一步提供了醫藥組合物,其包含抗體或其抗原結合片段及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
本發明進一步提供了一種醫藥組合物,其包含編碼抗體或其抗原結合片段的多核苷酸以及一或多種醫藥學上可接受之載劑。本文所提供之抗體亦可藉由遞送編碼本文所提供之抗體或其抗原結合片段的多核苷酸(例如,活體外轉錄的mRNA或表現載體)而在活體內產生。用於活體內抗體表現的多核苷酸遞送的方法為此項技術中已知的,參見例如Rybakova, Y.等人, 《分子療法(Molecular Therapy)》, 第27卷(8), 第1415-1423頁 (2019);Deal, C.E.等人, 《疫苗(Vaccines)》, 2021, 9, 108。
本發明進一步提供了醫藥組合物,其包括包含編碼抗體或其抗原結合片段的多核苷酸的表現載體以及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中,表現載體包括病毒載體或非病毒載體。病毒載體的實例包括但不限於腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體及腺病毒載體。非病毒載體的實例包括但不限於裸DNA、質體、外來體(exosome)、mRNA等。在某些實施例中,表現載體適用於人類之基因療法。用於基因療法的合適載體包括例如腺相關病毒(AAV)或腺病毒載體。在某些實施例中,表現載體包括DNA載體或RNA載體。在某些實施例中,醫藥學上可接受之載劑為聚合物賦形劑,如但不限於微球、微膠囊、聚合物膠束及樹枝狀聚合物。本發明之多核苷酸及/或多核苷酸載體可藉由此項技術中已知的方法包封、黏附或塗覆在基於聚合物的組分上(參見例如W. Heiser, 《非病毒基因轉移技術(Nonviral gene transfer technologies)》, 由胡瑪納出版社(Humana Press)出版, 2004;美國專利6025337;《先進藥物遞送評論(Advanced Drug Delivery Reviews)》, 57(15): 2177-2202 (2005))。
用於本文所揭示之醫藥組合物的醫藥學上可接受之載劑可包括例如醫藥學上可接受之液體、凝膠或固相載劑、水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等張劑、緩衝液、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮劑/分配劑、多價螯合劑或螯合劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒輔助物質、此項技術中已知的其他組分或其各種組合。
合適之組分可包括例如抗氧化劑、填料、黏結劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑,如糖及環糊精。合適之抗氧化劑可包括例如甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱胺酸、硫代甘油、巰基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羥基茴香醚(butylated hydroxanisol)、丁基化羥基甲苯及/或沒食子酸丙酯(propyl gallate)。如本文所揭示之,在包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段及結合物的組合物中包括一或多種如甲硫胺酸等抗氧化劑降低了抗體或其抗原結合片段的氧化。此氧化降低可防止或減少結合親和力的喪失,從而提高抗體穩定性且最大化保質期。因此,在某些實施例中,提供了醫藥組合物,其包含如本文中所揭示之一或多種抗體或其抗原結合片段及一或多種如甲硫胺酸等抗氧化劑。進一步提供了用於藉由將抗體或抗原結合片段與一或多種如甲硫胺酸等抗氧化劑混合來防止本文所提供之抗體或抗原結合片段的氧化、延長保質期及/或提高療效的方法。
為了進一步說明,醫藥學上可接受之載劑可包括例如:水性媒劑,如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等張右旋糖注射液、無菌水注射液或右旋糖及乳酸林格氏注射液;非水性媒劑,如植物來源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油;細菌抑制或真菌抑制濃度下的抗微生物劑;等張劑,如氯化鈉或右旋糖;緩衝劑,如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑;抗氧化劑,如硫酸氫鈉;局部麻醉劑,如鹽酸普魯卡因;懸浮及分散劑,如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮;乳化劑,如聚山梨醇酯80 (TWEEN-80);多價螯合劑或螯合劑,如EDTA (乙二胺四乙酸)或EGTA (乙二醇四乙酸);乙醇;聚乙二醇;丙二醇;氫氧化鈉;鹽酸;檸檬酸或乳酸。可將用作載劑的抗微生物劑添加至多劑量容器中的醫藥組合物中,該等抗微生物劑包括苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯紮氯銨及苄索氯銨。合適之賦形劑可包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。合適之無毒輔助物質可包括例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解度增強劑或如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精等藥劑。
醫藥組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、丸劑、膠囊、錠劑、緩釋調配物或粉末。口服調配物可包括標準載劑,如醫藥級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
在某些實施例中,將醫藥組合物調配成可注射組合物。可注射醫藥組合物可以任何習知形式製備,該習知形式例如液體溶液、懸浮液、乳液或適用於產生液體溶液、懸浮液或乳液的固體形式。注射製劑可包括準備注射的無菌及/或無熱原溶液、準備在使用前與溶劑組合的無菌乾燥可溶性產品(如凍乾粉末,包括皮下注射錠劑)、準備注射的無菌懸浮液、準備在使用前與媒劑組合的無菌乾燥的不溶性產品以及無菌及/或無熱原乳液。溶液可為水性的或非水性的。
在某些實施例中,單位劑量非經腸製劑被包裝在安瓿、小瓶或帶有針頭的注射器中。正如此項技術中已知及實踐的一樣,所有用於非經腸投與的製劑均應為無菌且無熱原的。
在某些實施例中,藉由將如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段溶解在合適的溶劑中來製備無菌凍乾粉末。該溶劑可包括賦形劑,該賦形劑可改善粉末或由粉末製備的重構溶液之穩定性或其他藥理學組分。可使用的賦形劑包括但不限於水、葡聚糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合適的藥劑。溶劑可包括緩衝劑,如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀、或熟習此項技術者已知的其他此類緩衝劑,在一個實施例中,該緩衝劑為約中性pH。隨後對溶液進行無菌過濾,然後在熟習此項技術者已知的標準條件下凍乾,從而提供期望的調配物。在一個實施例中,將所得溶液分配至小瓶中以凍乾。各小瓶可含有單劑量或多劑量的抗體或其抗原結合片段或其組合物。用略微高於每次劑量所需或多次劑量所需的量(例如約10%)過填充小瓶為可接受的,以便促進取樣精確及給藥精確。可在適當的條件下(如在約4℃至室溫下)儲存凍乾粉末。
用注射用水重構凍乾粉末提供了用於在非經腸投與的調配物。在一個實施例中,為了重構,將無菌及/或無熱原水或其他合適的液體載劑添加至凍乾粉末中。精確的量取決於給予的所選療法且可根據經驗測定。
本文所描述的包含醫藥學上可接受之載劑(如其加成鹽或水合物)的醫藥組合物可藉由多種途徑或投與方式遞送於患者。合適的投與途徑包括但不限於吸入、透皮、口服、直腸、經黏膜、腸道及非經腸投與,包括肌肉內、皮下及靜脈內注射。較佳地,包含作為靶向部分的抗體或抗體片段的本發明之醫藥組合物經非經腸投與,更佳地靜脈內投與。
依本文所用,術語「投與(administering)」及「投與(administration)」意欲涵蓋將醫藥組合物直接及間接遞送至其預期作用部位的所有方式。
本文所描述的醫藥組合物或其醫藥學上可接受之鹽及/或水合物可單獨投與,及/或與其他治療劑組合投與。當然,可與本發明之醫藥組合物共同投與的治療劑的選擇將部分取決於所治療的病狀。
例如,當向患有由依賴於自誘導物的生物體引起的疾病狀態的患者投與時,本發明之醫藥組合物可以含有用於治療疼痛、感染及通常與疾病相關的其他症狀及副作用的藥劑的混合物的形式投與。此類藥劑包括例如鎮痛劑、抗生素等。
當向經受癌症治療的個體投與時,醫藥組合物可以含有抗癌劑及/或輔助增效劑的混合物的形式投與。醫藥組合物亦可以含有治療放射療法的副作用的藥劑(如止吐藥、放射保護劑等)的混合物的形式投與。
V. 套組
在另一態樣中,本發明提供了一種套組,該套組包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中,本發明提供了一種套組,該套組包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段及第二治療劑。在某些實施例中,第二治療劑選自由以下組成之群:化學治療劑、抗癌藥物、放射療法、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向療法、細胞療法、基因療法、激素療法、抗病毒劑、抗生素、鎮痛劑、抗氧化劑、金屬螯合劑及細胞介素。
如將對熟習此項技術者顯而易見的是,若需要,此類套組可進一步包括各種習知藥物套組組件中之一或多者,例如具有一或多種醫藥學上可接受之載劑的容器、另外的容器等。套組中亦可包括指示待投與的組分的量的說明書(作為插入物或作為標籤)、投與指南及/或用於混合組分的指南。套組亦可包括一或多個小瓶、試管、燒瓶、瓶或注射器。
套組之其他形式對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的,且在本發明範疇內。
VI. 醫療用途
治療用途
在另一態樣中,本發明提供了一種用於治療需要此類治療的個體的疾病或病狀的方法,該方法包括:向該個體投與醫藥組合物,該醫藥組合物包含治療有效量的本發明之抗體或其抗原結合片段或其醫藥學上可接受之鹽以及醫藥學上可接受之載劑。
需要治療的疾病或病狀與抗體或其抗原結合片段靶向的抗原有關。在一些實施例中,所靶向的抗原選自由以下組成之群:SIRPα、CLDN18.2、Siglec15、HER2、EGFR、CD19、CD20、CD39、CD47、PD1、PDL1、CD3、NKG2D、NKG2A、Nkp46、CD137、OX40、CD40等。
在一些實施例中,本文所揭示之醫藥組合物的用途包括製備用於治療個體(如人)的疾病(如癌症)的藥物。本文中的「癌症」係指人之病理學病狀,其特徵在於不受調節的細胞增殖。
在一些實施例中,疾病為SIRPα相關疾病、病症或病狀,其特徵在於表現或過表現SIRPα及/或SIRPα特徵基因。在某些實施例中,SIRPα相關疾病、病症或病狀包括但不限於癌症、實體瘤、慢性感染、炎性疾病、多發性硬化症、自體免疫性疾病、神經系統疾病、腦損傷、神經損傷、紅細胞增多症、血色沈著症、創傷、敗血性休克、纖維化、動脈粥樣硬化、肥胖症、II型糖尿病、移植功能障礙或關節炎。
在一些實施例中,疾病為Claudin 18.2相關疾病、病症或病狀,其特徵在於表現或過表現Claudin 18.2。Claudin 18.2相關疾病的非限制性實例包括癌症。在一些實施例中,癌症為上皮細胞源性癌症。在一些實施例中,癌症為肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽囊癌、胃癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝及膽管癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、腎盂及輸尿管癌、唾液腺癌、小腸癌、尿道癌、膀胱癌、頭頸癌、脊柱癌、腦癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、大腸癌、大腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胃腸癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、陰道癌、甲狀腺癌、喉癌、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生異常症候群、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、多發性骨髓瘤、T或B細胞淋巴瘤、GI器官間質瘤、軟組織腫瘤、肝細胞癌或腺癌或其轉移。在一些實施例中,癌症為胃癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌或其轉移。
術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」在本文中意謂治療性處理及預防性或預防性處理,其中目的為減少或預防目標病理學病症或病狀。在某些實施例中,「治療(treatment)」或「治療(treating)」包括(1)抑制經歷或表現出疾病的病理學或症狀的個體的疾病;(2)改善正在經歷或表現出疾病的病理學或症狀的個體的疾病;及/或(3)實現正在經歷或表現出疾病的病理學或症狀之個體或患者的疾病的任何可量測的減少。
術語「治療有效量」在本文中意謂本文所提供之醫藥組合物的活性成分(亦即,抗體或其抗原結合片段)有效「治療」個體或哺乳動物的病症的量。適用於本發明之醫藥組合物包含其中活性成分以治療有效量,亦即以有效實現其預期目的的量包含的組合物。對於特定應用有效的實際量將尤其取決於所治療的病狀。有效量的測定完全落於熟習此項技術者的能力範圍內,特別是根據本文的詳細揭示內容。
在癌症之情況下,藥物的治療有效量可減少癌細胞的數量,減小腫瘤大小,抑制癌細胞浸潤至外周器官中,抑制腫瘤轉移,在某種程度上抑制腫瘤生長及/或在某種程度上緩解與癌症相關的一或多種症狀。
在一些實施例中,本文所提供之抗體或其抗原結合片段可單獨投與或與治療有效量的第二治療劑組合投與。例如,本文所揭示之抗體或其抗原結合片段可與第二治療劑組合投與,例如化學治療劑、抗癌藥物、放射療法、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向療法、細胞療法、基因療法、激素療法、抗病毒劑、抗生素、鎮痛藥、抗氧化劑、金屬螯合劑或細胞介素。
在此等實施例中的某些實施例中,可與一或多種另外的治療劑同時投與與一或多種另外的治療劑組合投與的本文所提供之抗體或其抗原結合片段,且在此等實施例中的某些實施例中,抗體或其抗原結合片段及另外的治療劑可作為同一醫藥組合物的一部分投與。
診斷用途
在另一態樣中,本發明提供了一種診斷個體的疾病、病症或病狀的方法,該方法包括:a)使由該個體獲得的樣品與本文所提供之抗體或其抗原結合片段接觸;b)測定樣品中抗體或其抗原結合片段靶向的抗原的存在或量;以及c)將相關抗原的存在或量與該個體的疾病、病症或病狀之存在或狀態相關。
術語「診斷(diagnosis)」、「診斷(diagnose)」或「診斷(diagnosing)」係指對病理學狀態、疾病或病狀的鑑定,如對特異性抗原相關疾病的鑑定,或者係指對可受益於特定治療方案的患有特異性抗原相關疾病的個體的鑑定。在一些實施例中,診斷包括鑑定特異性抗原的異常量或活性。在一些實施例中,診斷係指鑑定個體的癌症或自體免疫性疾病。
依本文所用,術語「樣品」係指由所關注之個體獲得或源自所關注之個體的生物組合物,該生物組合物含有例如待基於物理、生化、化學及/或生理特性表徵及/或鑑定的細胞及/或其他分子實體。樣品包括但不限於個體的由熟習此項技術者已知的任何方法獲得的細胞、組織、器官及/或生物體液。
在另一態樣中,本發明提供了套組,該等套組包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段,該抗體或其抗原結合片段視情況與可偵測部分結合,該套組可用於偵測疾病、病症或病狀。套組可進一步包括使用說明書。
提供以下實例以更好地說明所要求保護的發明且不應將該等實例解釋為限制本發明之範疇。下文描述的所有具體組合物、材料及方法全部或部分地落入本發明範疇內。此等具體組合物、材料及方法不意欲限制本發明,而僅用於說明落入本發明範疇內的具體實施例。熟習此項技術者可在不運用發明能力及不脫離本發明範疇之情況下開發出等效的組合物、材料及方法。應當理解,可在本文所述之程序中作出許多變化,同時仍然保持在本發明之界限內。本發明之發明人的意圖為此類變化均包括在本發明範疇內。
以下實例中所有胺基酸位置的編號均係根據EU編號系統的。
實例: 實例 1 :具有移位之 CH1-CL 鏈間二硫鍵之不對稱單價抗體的構築與分析
鑑定了抗體上新二硫鍵形成的多個潛在位點。潛在的位點選自輕鏈的CL區中及重鏈的CH1區中之胺基酸殘基。一對非半胱胺酸殘基(一個位於CL區中,而另一個位於CH1區中)均被半胱胺酸替換,以在其間形成新的二硫鍵。為各設計選擇一對或兩對可能形成新的鏈間二硫鍵的此類殘基,且突變為半胱胺酸。
此外,CH1中的Cys220與CL中的Cys214之間保守的天然二硫鍵藉由用絲胺酸替換兩個殘基而被破壞。為了進行初始篩選,設計了易於藉由SEC-HPLC讀出的測定系統(圖1與圖2)。
具體而言,該系統由4條多肽鏈組成。鏈1為全長HC,該全長HC在CH1區中具有半胱胺酸突變(自非半胱胺酸殘基至半胱胺酸殘基) (鏈1a用於篩選測定1,圖1)或沒有半胱胺酸突變(鏈1b用於篩選測定2,圖2),且各鏈1在Fc區中具有杵或臼突變。鏈2為全長LC,該全長LC在CL區中具有相容的半胱胺酸突變。鏈3為野生型LC,該野生型LC具有在N末端處融合的單域抗體(VHH)。鏈4為空Fc,該空Fc具有與全長HC (亦即,鏈1a或鏈1b)中的杵或臼突變相容的臼或杵突變。在此系統之情況下,主要產物(其為單價異二聚體)由兩種可能的分子物種組成,該等兩種分子物種大小不同,且可在SEC-HPLC譜中容易地辨別且容易地定量(圖1與圖2)。在兩種篩選測定中,在突變體與野生型肽鏈之間形成的異二聚體被認為係錯配的異二聚體,而設計的突變體鏈之間或野生型鏈之間的異二聚體被認為係正確配對的異二聚體。因此,定義為
的不同異二聚體之相對豐度(RA)為不同CL及CH1鏈的配對偏好的直接量測結果。
下表6中列出了兩種測定系統的不同多肽鏈的序列。VH(SEQ ID NO: 3)及VL (SEQ ID NO: 2)序列源自人源化抗CLDN18.2抗體。包括CH1區(SEQ ID NO: 5)及Fc區(SEQ ID NO: 6)的重鏈恆定區源自人IgG1。輕鏈恆定區CL (SEQ ID NO: 7)源自人κ輕鏈。VHH域(SEQ ID NO: 1)在VL區的N末端處藉由連接子(SEQ ID NO: 9)連接。所有的DNA片段均係藉由化學方法合成的。將四條多肽鏈中之每一者選殖於pcDNA3.4載體中(圖3A至圖3D)。將四種質體混合,且共轉染至ExpiCHO-S細胞(生命科技公司(Life Technologies))中。然後使用24孔盤生產系統在ExpiCHO-S細胞中產生經表現之蛋白質變異體。轉染後7天藉由離心收集培養上清液,且將其與蛋白A磁珠(金斯瑞公司(GenScript))一起培育。用0.05 M檸檬酸緩衝液(pH 3.4)溶離結合的抗體,且立即用Tris緩衝液(pH 9.0)中和。經純化之抗體藉由SDS-PAGE及SEC-HPLC (安捷倫公司(Agilent))進行評估。
表6. 用於篩選測定1及2的多肽鏈的胺基酸序列
鏈 | 胺基酸序列 | SEQ ID NO: |
VHH (鏈3之N末端部分) | EVQVVESGGGLVQSGGSLRLSCAGSGFTESAGFMVWHRQVPGKERELVALIATPSGSTQYADSVKGRFTISRDNGKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNIRGYWGQGTLVTVSS | 1 |
VL (鏈2之N末端部分) | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNAGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWSSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHCQNNYYYPLTFGGGTKLEIK | 2 |
VH(鏈1之部分) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNWVHWVRQAPGQGLEWMGEINPTNARSNYNEKFKKRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARIYYGNSFAHWGQGTLVTVSS | 3 |
CL (鏈3之部分) | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 4 |
CH1 (鏈1之部分) | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC | 5 |
Fc (wt) | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 6 |
Fc (臼) (鏈4a) | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL SC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 7 |
Fc (杵) (鏈4b) | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 8 |
連接子(VHH與VL之間) | GGGGS | 9 |
在鏈2的CL區中之各個位置(包括位置114、116、118、121、124、135、137、138、160、164)處的一個或兩個非半胱胺酸殘基被突變為半胱胺酸,且在鏈1的CH1區中之各個位置(包括位置126、128、129、136、141、168、170、173、175、187)處的一個或兩個非半胱胺酸殘基被突變為半胱胺酸。使用上述突變位點形成鏈1與鏈2之間的多個突變對,且將該等多個突變對用於篩選測定1。
在篩選測定1中,野生型及突變體CL競爭突變體CH1。在鏈2 (具有突變體CL)與鏈1a (具有突變體CH1)之間形成正確的配對,而在鏈3 (具有野生型CL)與鏈1a (具有突變體CH1)之間形成錯配。
在篩選測定1中,測試了VL-CL (在CL區中具有突變)及VH-CH1-Fc (在CH1區中具有突變,且在Fc區中具有杵/臼突變)的許多突變組合。表7與圖4A示出了產生高RA值的一些突變體對之RA值。ACF_003在此篩選測定1中用作基準。ACF_003 (包括輕鏈上之S121C及重鏈上之F126C的突變組合)在CL區及CH1區中具有如美國專利第9,527,927號中揭示之V12的對應突變。
表7篩選測定1中測試的示出高RA值的突變組合
蛋白質ID | CL 中之突變體位點 | CH1 中之突變體位點 |
ACF_003 | S121C/C214S | F126C/C220S_臼 |
ACF_004 | S121C/C214S | F126C/C220S_杵 |
ACF_058 | L135C/C214S | F170C/C220S_臼 |
ACF_065 | S114C/S121C/C214S | S136C/F126C/C220S_杵 |
ACF_070 | S114C/Q160C/C214S | S136C/Q175C/C220S_臼 |
ACF_071 | S114C/Q160C/C214S | S136C/V173C/C220S_杵 |
ACF_072 | S114C/Q160C/C214S | S136C/V173C/C220S_臼 |
ACF_074 | S114C/T164C/C214S | S136C/F170C/C220S_臼 |
ACF_078 | S114C/N137C/C214S | S136C/H168C/C220S_臼 |
ACF_084 | F118C/S121C/C214S | L128C/F126C/C220S_臼 |
ACF_086 | F118C/Q124C/C214S | L128C/F126C/C220S_臼 |
ACF_088 | F118C/Q160C/C214S | L128C/Q175C/C220S_臼 |
ACF_090 | F118C/Q160C/C214S | L128C/V173C/C220S_臼 |
ACF_092 | F118C/T164C/C214S | L128C/F170C/C220S_臼 |
ACF_102 | F118C/S121C/C214S | A129C/F126C/C220S_臼 |
ACF_104 | F118C/Q124C/C214S | A129C/F126C/C220S_臼 |
ACF_106 | F118C/Q160C/C214S | A129C/Q175C/C220S_臼 |
ACF_108 | F118C/Q160C/C214S | A129C/V173C/C220S_臼 |
ACF_120 | F118C/S121C/C214S | A141C/F126C/C220S_臼 |
ACF_122 | F118C/Q124C/C214S | A141C/F126C/C220S_臼 |
ACF_126 | F118C/Q160C/C214S | A141C/V173C/C220S_臼 |
ACF_127 | F118C/T164C/C214S | A141C/F170C/C220S_杵 |
ACF_128 | F118C/T164C/C214S | A141C/F170C/C220S_臼 |
ACF_138 | F116C/S121C/C214S | S136C/F126C/C220S_臼 |
ACF_139 | F116C/Q124C/C214S | S136C/F126C/C220S_杵 |
ACF_140 | F116C/Q124C/C214S | S136C/F126C/C220S_臼 |
ACF_142 | F116C/Q160C/C214S | S136C/Q175C/C220S_臼 |
ACF_144 | F116C/Q160C/C214S | S136C/V173C/C220S_臼 |
ACF_146 | F116C/T164C/C214S | S136C/F170C/C220S_臼 |
ACF_156 | F116C/S121C/C214S | A141C/F126C/C220S_臼 |
ACF_157 | F116C/Q124C/C214S | A141C/F126C/C220S_杵 |
ACF_158 | F116C/Q124C/C214S | A141C/F126C/C220S_臼 |
ACF_160 | F116C/Q160C/C214S | A141C/Q175C/C220S_臼 |
ACF_162 | F116C/Q160C/C214S | A141C/V173C/C220S_臼 |
ACF_164 | F116C/T164C/C214S | A141C/F170C/C220S_臼 |
ACF_174 | Q124C/Q160C/C214S | F126/Q175C/C220S_臼 |
ACF_175 | Q124C/Q160C/C214S | F126C/V173C/C220S_杵 |
ACF_176 | Q124C/Q160C/C214S | F126C/V173C/C220S_臼 |
ACF_177 | Q124C/T164C/C214S | F126C/F170C/C220S_杵 |
ACF_178 | Q124C/T164C/C214S | F126C/F170C/C220S_臼 |
ACF_182 | Q124C/N137C/C214S | F126C/H168C/C220S_臼 |
ACF_183 | Q124C/N137C/C214S | F126C/T187C/C220S_杵 |
ACF_184 | Q124C/N137C/C214S | F126C/T187C/C220S_臼 |
ACF_186 | Q124C/N138C/C214S | F126C/H168C/C220S_臼 |
ACF_187 | Q160C/L135C/C214S | V173C/F170C/C220S_杵 |
ACF_188 | Q160C/L135C/C214S | V173C/F170C/C220S_臼 |
ACF_196 | Q160C/L135C/C214S | Q175C/F170C/C220S_臼 |
ACF_203 | Q160C/T164C/C214S | V173C/F170C/C220S_杵 |
ACF_204 | Q160C/T164C/C214S | V173C/F170C/C220S_臼 |
ACF_206 | Q160C/T164C/C214S | Q175C/F170C/C220S_臼 |
ACF_208 | S114C/S162C/C214S | S136C/F170C/C220S_臼 |
ACF_210 | F118C/S162C/C214S | L128C/F170C/C220S_臼 |
ACF_212 | F118C/S162C/C214S | A129C/F170C/C220S_臼 |
ACF_214 | F118C/S162C/C214S | A141C/F170C/C220S_臼 |
ACF_216 | F116C/S162C/C214S | S136C/F170C/C220S_臼 |
ACF_218 | F116C/S162C/C214S | A141C/F170C/C220S_臼 |
ACF_219 | Q124C/S162C/C214S | F126C/F170C/C220S_杵 |
ACF_220 | Q124C/S162C/C214S | F126C/F170C/C220S_臼 |
ACF_235 | Q160C/L135C/C214S | V173C/V185C/C220S_杵 |
ACF_236 | Q160C/L135C/C214S | V173C/V185C/C220S_臼 |
ACF_238 | Q160C/L135C/C214S | Q175C/V185C/C220S_臼 |
ACF_239 | N137C/S162C/C214S | F170C/T187C/C220S_杵 |
ACF_240 | N137C/S162C/C214S | F170C/T187C/C220S_臼 |
ACF_244 | N138C/S162C/C214S | H168C/F170C/C220S_臼 |
在篩選測定2中,突變體及野生型CL競爭野生型CH1。藉由與篩選測定1中相同的方程計算篩選測定2中使用的突變體對之RA值,除了正確配對僅在鏈3 (具有野生型CL)與鏈1b (具有野生型CH1)之間形成,且錯配在鏈2 (具有突變體CL)與鏈1b (具有野生型CH1)之間形成之外。
表8中列出了產生高RA值的突變對。ACF_245在此篩選測定2中用作基準。ACF_245 (包括輕鏈上之S121C突變及重鏈上沒有突變)除了重鏈上沒有突變之外,在CL區中具有與ACF_003相對應的突變。表8與圖4B示出了產生高RA值的一些突變體對之RA。
表8篩選測定2中測試的示出高RA值的突變組合。
實例 2 :具有偏移的 CH1-CL 二硫鍵的對稱二價單特異性抗體的構築與分析
蛋白質ID | CL 中之突變體位點 | 重鏈 |
ACF_245 | S121C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_250 | S114C/S121C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_252 | S114C/Q160C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_253 | S114C/T164C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_254 | S114C/T164C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_255 | S114C/N137C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_256 | S114C/N137C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_258 | F118C/S121C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_259 | F118C/Q124C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_260 | F118C/Q124C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_261 | F118C/Q160C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_262 | F118C/Q160C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_265 | F116C/S121C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_266 | F116C/S121C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_267 | F116C/Q124C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_268 | F116C/Q124C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_270 | F116C/Q160C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_271 | F116C/T164C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_272 | F116C/T164C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_275 | Q124C/T164C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_276 | Q124C/T164C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_277 | Q124C/N138C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_278 | Q124C/N138C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_279 | Q160C/L135C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_280 | Q160C/L135C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_283 | F118C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_284 | F118C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_285 | F116C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_286 | F116C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_287 | N137C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_288 | N137C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_291 | Q124C/N137C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_292 | Q124C/N137C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_293 | S114C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_294 | S114C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
ACF_295 | Q124C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_臼 |
ACF_296 | Q124C/S162C/C214S | wt-CH1_Fc_杵 |
為了進一步評估在還原論系統中所選突變體的表現量及穩定性,將自實例1的實驗中選擇的一些突變體對轉化為對稱二價單特異性抗體(圖5,表9)以進行產量及純度測試。
所有突變均係基於親本抗體hu28產生的。hu28的VL區及VH區的胺基酸序列分別依SEQ ID NO: 2及3所示。hu28的CL區的胺基酸序列如SED ID NO: 4所示。hu28的CH1區的胺基酸序列如SED ID NO: 5所示。hu28之Fc區的胺基酸序列如SED ID NO: 6所示。
表9. 用於測試的二價單特異性抗體中的突變組合。
蛋白質ID | CL 中之突變體位點 | CH1 中之突變體位點 |
ACF-hu28_001 | S121C/C214S | F126C/C220S |
ACF-hu28_002 | L135C/C214S | F170C/C220S |
ACF-hu28_003 | S114C/S121C/C214S | S136C/F126C/C220S |
ACF-hu28_004 | S114C/Q160C/C214S | S136C/V173C/C220S |
ACF-hu28_005 | S114C/T164C/C214S | S136C/F170C/C220S |
ACF-hu28_006 | S114C/N137C/C214S | S136C/H168C/C220S |
ACF-hu28_007 | F118C/S121C/C214S | L128C/F126C/C220S |
ACF-hu28_008 | F118C/S121C/C214S | A129C/F126C/C220S |
ACF-hu28_009 | F118C/S121C/C214S | A141C/F126C/C220S |
ACF-hu28_010 | F118C/Q124C/C214S | L128C/F126C/C220S |
ACF-hu28_011 | F118C/Q124C/C214S | A129C/F126C/C220S |
ACF-hu28_012 | F118C/Q124C/C214S | A141C/F126C/C220S |
ACF-hu28_013 | F118C/Q160C/C214S | A141C/Q175C/C220S |
ACF-hu28_014 | F118C/Q160C/C214S | A141C/V173C/C220S |
ACF-hu28_015 | F118C/T164C/C214S | L128C/F170C/C220S |
ACF-hu28_016 | F118C/T164C/C214S | A141C/F170C/C220S |
ACF-hu28_017 | F116C/S121C/C214S | A141C/F126C/C220S |
ACF-hu28_018 | F116C/Q124C/C214S | S136C/F126C/C220S |
ACF-hu28_019 | F116C/Q124C/C214S | A141C/F126C/C220S |
ACF-hu28_020 | F116C/Q160C/C214S | A141C/V173C/C220S |
ACF-hu28_021 | F116C/Q160C/C214S | A141C/Q175C/C220S |
ACF-hu28_022 | F116C/T164C/C214S | A141C/F170C/C220S |
ACF-hu28_023 | Q124C/Q160C/C214S | F126C/Q175C/C220S |
ACF-hu28_024 | Q124C/Q160C/C214S | F126C/V173C/C220S |
ACF-hu28_025 | Q124C/T164C/C214S | F126C/F170C/C220S |
ACF-hu28_026 | Q124C/N137C/C214S | F126C/H168C/C220S |
ACF-hu28_027 | Q124C/N137C/C214S | F126C/T187C/C220S |
ACF-hu28_028 | Q124C/N138C/C214S | F126C/H168C/C220S |
ACF-hu28_029 | Q160C/L135C/C214S | V173C/F170C/C220S |
ACF-hu28_030 | Q160C/L135C/C214S | Q175C/F170C/C220S |
ACF-hu28_031 | Q160C/L135C/C214S | V173C/V185C/C220S |
ACF-hu28_032 | Q160C/T164C/C214S | V173C/F170C/C220S |
ACF-hu28_033 | Q160C/T164C/C214S | Q175C/F170C/C220S |
ACF-hu28_034 | S114C/S162C/C214S | S136C/F170C/C220S |
ACF-hu28_035 | F118C/S162C/C214S | L128C/F170C/C220S |
ACF-hu28_036 | F118C/S162C/C214S | A141C/F170C/C220S |
ACF-hu28_037 | F116C/S162C/C214S | A141C/F170C/C220S |
ACF-hu28_038 | Q124C/S162C/C214S | F126C/F170C/C220S |
ACF-hu28_039 | N137C/S162C/C214S | F170C/T187C/C220S |
ACF-hu28_040 | N138C/S162C/C214S | H168C/F170C/C220S |
合成所有DNA片段且將其選殖於pcDNA3.4載體中。使用24孔盤生產系統將含有所選殘基取代對的LC及HC載體共轉染至ExpiCHO-S細胞中,且用蛋白A珠進行純化。首先藉由SDS-PAGE及HPLC-SEC評估經純化之抗體的純度。圖6A與圖6B中分別示出了各抗體之產量及純度。將醫學免疫公司(MedImmune)在美國專利第9,527,927號中報導的含有殘基取代對的ACF-hu28_001用作參考進行比較。
如圖6A與圖6B中的結果所示,ACF-hu28_025、ACF-hu28_038、ACF-hu28_029、ACF-hu28_037、ACF-hu28_002、ACF-hu28_031、ACF-hu28_034、ACF-hu28_032、ACF-hu28_014、ACF-hu28_016、ACF-hu28_012、ACF-hu28_011、ACF-hu28_004、ACF-hu28_015、ACF-hu28_020、ACF-hu28_035、ACF-hu28_022、ACF-hu28_018、ACF-hu28_036、ACF-hu28_010、ACF-hu28_030、ACF-hu28_039、ACF-hu28_019、ACF-hu28_024、ACF-hu28_028、ACF-hu28_023,、ACF-hu28_005、ACF-hu28_003具有與參考單株抗體ACF hu28_001 (S121C/C214S,F126C/C220S)相當或更高的產量及單體百分比。
實例 3. 二價單特異性抗體之抗原結合量測及熱穩定性比較
3.1 藉由FACS測定評估結合活性
使用過表現CLDN18.2之MC38細胞,藉由FACS比較所有所選二價變異體與CLDN18.2的結合(圖7A至圖7D)。將所有蛋白質之緩衝液更換為PBS (pH 7.2),且用FACS緩衝液(BD)稀釋成不同濃度(100 nM、20 nM、4 nM、0.8 nM)。Hu28 mAb用作陽性對照。
在變異體與陽性對照mAb之間沒有觀測到抗原結合活性之顯著差異。
3.2 突變體mAb之熱穩定性分析
使用熱偏移測定評估經純化之變異體的熱穩定性(圖8)。在與新鮮稀釋的蛋白質熱偏移染料(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific))混合之前,首先將抗體變異體的緩衝液更換為PBS (pH 7.2)中。然後將混合物轉移至384孔盤中,且裝載至QuantStudio即時PCR系統(賽默飛世爾科技公司)上以進行Tm量測。溫度自25℃掃描至99℃,其中斜升速率為1.6℃/秒,且保持時間為2分鐘。用蛋白質熱偏移軟體分析所獲得的熔融曲線。資料表明,所有變異體均具有與野生型單株抗體相當的熱穩定性。
實例 4. 不對稱雙特異性抗體之產生及 LC-MS 測定
為了定量評估在雙特異性背景下同源CH1及CL鏈配對的效率,產生了兩個系列的雙特異性抗體且用LC-MS進行分析。
在兩個系列中,雙特異性抗體之一個臂源自抗CLDN 18.2抗體(hu28),且另一個臂源自抗SIRPα抗體(hu25)。將杵突變引入至hu28臂的CH3區中,且將臼突變引入至hu25臂的CH3區中。此外,消除蛋白A結合的突變被引入至hu25臂中以簡化系統。
hu25的VH區及VL區的胺基酸序列分別依SEQ ID NO: 10及11所示(如表10中所示)。hu28的VH區及VL區的胺基酸序列分別依SEQ ID NO: 2及3所示。hu25或hu28的非突變CL區的胺基酸序列依SEQ ID NO: 4所示。hu25或hu28的非突變CH1區的胺基酸序列依SEQ ID NO: 5所示。hu25或hu28的Fc (具有「臼」突變)的胺基酸序列依SEQ ID NO: 7所示。hu25或hu28的Fc (具有「杵」突變)的胺基酸序列依SEQ ID NO: 8所示。
表10. hu25的胺基酸序列。
鏈 | 胺基酸序列 | SEQ ID NO: |
hu25 VH | EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYMHWVRQAPGKGLEWIGRVDPEDAETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCNRGLVYWGQGTLVTVSS | 10 |
hu25 VL | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLIYSASNRASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK | 11 |
在案例1研究中,移位之二硫鍵形成的不同突變對被引入至hu28臂的CH1區及CL區中,且野生型序列保留在hu25臂中(圖9與圖10,表11)。
在案例2研究中,同一組突變對被引入至hu25臂中,且野生型序列保留在hu28臂中(圖11與圖12,表11)。
表11. 案例1及案例2中之不同構築體設計
案例1 | 案例2 | |||
hu28 | hu25 | hu28 | hu25 | |
杵/臼 | 杵 | 臼 | 杵 | 臼 |
RF突變 | 是 | 否 | 是 | 否 |
CH1-CL | 突變體 | 野生型 | 野生型 | 突變體 |
表12中示出了為測試構築的所有突變組合。
表12. 用於測試的案例1研究及案例2研究中的突變組合。
蛋白質ID | CL 中之突變體位點 | CH1 中之突變體位點 |
ACF_326 | S121C/C214S | F126C/C220S_杵 |
ACF_327 | F116C/Q124C/C214S | S136C/F126C/C220S_杵 |
ACF_328 | S114C/Q160C/C214S | S136C/V173C/C220S_杵 |
ACF_329 | F118C/Q124C/C214S | L128C/F126C/C220S_杵 |
ACF_330 | F118C/Q124C/C214S | A129C/F126C/C220S_杵 |
ACF_331 | F118C/Q124C/C214S | A141C/F126C/C220S_杵 |
ACF_332 | F118C/Q160C/C214S | A141C/V173C/C220S_杵 |
ACF_333 | Q124C/T164C/C214S | F126C/F170C/C220S_杵 |
ACF_334 | Q124C/N138C/C214S | F126C/H168C/C220S_杵 |
ACF_335 | Q160C/L135C/C214S | Q175C/F170C/C220S_杵 |
ACF_336 | S114C/S162C/C214S | S136C/F170C/C220S_杵 |
ACF_337 | F118C/S162C/C214S | L128C/F170C/C220S_杵 |
ACF_338 | F118C/S162C/C214S | A141C/F170C/C220S_杵 |
ACF_339 | Q124C/S162C/C214S | F126C/F170C/C220S_杵 |
ACF_340 | N137C/S162C/C214S | F170C/T187C/C220S_杵 |
ACF_355 | S121C/C214S | F126C/C220S_臼 |
ACF_356 | F118C/Q124C/C214S | L128C/F126C/C220S_臼 |
ACF_357 | F118C/Q124C/C214S | A129C/F126C/C220S_臼 |
ACF_358 | F118C/Q124C/C214S | A141C/F126C/C220S_臼 |
ACF_359 | F116C/Q124C/C214S | S136C/F126C/C220S_臼 |
ACF_360 | F118C/Q160C/C214S | A141C/V173C/C220S_臼 |
ACF_361 | Q124C/T164C/C214S | F126C/F170C/C220S_臼 |
ACF_364 | S114C/S162C/C214S | S136C/F170C/C220S_臼 |
ACF_365 | F118C/S162C/C214S | L128C/F170C/C220S_臼 |
ACF_366 | F118C/S162C/C214S | A141C/F170C/C220S_臼 |
ACF_367 | Q124C/S162C/C214S | F126C/F170C/C220S_臼 |
ACF_368 | N137C/S162C/C214S | F170C/T187C/C220S_臼 |
為了產生雙特異性抗體,在共轉染之前,將hu28 HC及LC的質體與hu25 HC及LC的質體混合。使用24孔盤生產系統在ExpiCHO-S細胞(生命科技公司)中生產變異體。轉染後7天藉由離心收集培養上清液,且將其與蛋白A磁珠(金斯瑞公司)一起培育。用0.05 M檸檬酸緩衝液(pH 3.4)溶離結合的抗體,且立即用Tris緩衝液(pH 9.0)中和。首先用SDS-PAGE分析經純化之抗體(圖13A與圖13B)。
為了定量評估同源CH1及CL鏈配對的效率,藉由LC-MS在非還原條件下分析經純化之抗體。由於LC-MS測定中樣品處理條件的變性性質,含有錯配HC-LC (CH1突變的HC與野生型LC配對,或未經CH1修飾的HC與CL突變的LC配對)的分子將被解離,且在LC-MS譜中僅示出LC峰。因此,理論上,所有含有異二聚體HC的分子均將被偵測到。具有兩個正確配對的LC的異二聚體HC為期望的雙特異性完整抗體。具有錯配的LC的異二聚體HC藉由LC-MS譜中的錯配及解離的LC峰來偵測。藉由評估源自CH1-CL錯配的僅LC峰的MS信號的強度,可對不同突變對的同源CH1及CL鏈配對效率進行排序(圖9與圖11)。
藉由差示掃描螢光法評估抗體之熱穩定性。
在病例1研究中,與基準ACF_326 (醫學免疫公司設計)相比,ACF_329、333、337、338及339的hu025 LC展現出較低的信號,且hu028 LC展現出相等的信號(圖10)。此等資料指示,ACF_329、333、337、338及339中引入的突變對在此情況下提供了更高的同源CH1及CL鏈配對效率。
在病例2研究中,ACF_356、359、361、364、365、366、367、368展現出hu025 LC及hu028 LC的信號與基準ACF_355 (醫學免疫公司設計)相當(圖12)。此等資料指示,ACF_356、359、361、364、365、366、367及368中引入的突變對提供了高同源CH1及CL鏈配對效率。
值得注意的是,下面列出的突變對在兩種情況下均提供了高同源CH1及CL鏈配對效率:(i)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之L128C/F126C;(ii)位於輕鏈上之Q124C/T164C及位於重鏈上之F126C/F170C;(iii)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之L128C/F170C;(iv)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之A141C/F170C;以及(v)位於輕鏈上之Q124C/S162C及位於重鏈上之F126C/F170C。
實例 5. 不對稱雙特異性抗體之進一步產生及分析
5.1 蛋白質表現及純化
5.1.1 被測抗體之構築體及胺基酸序列
表現且純化了三種雙特異性抗體,亦即抗體1、抗體2及抗體3。
在抗體1研究中,位於輕鏈上之Q124C/T164C/C214S及位於重鏈上之F126C/F170C/C220S的突變對被引入至hu25臂中,且野生型序列保留在hu28臂中。抗體1具有與實例4中的抗體ACF_361相同的結構及胺基酸序列。因此,下文中將其指示為ACF_361或ACF361。
在抗體2研究中,位於輕鏈上之Q124C/T164C/C214S及位於重鏈上之F126C/F170C/C220S的突變對被引入至hu25臂中,且野生型序列保留在hu29 (源序列:阿替利珠單抗(Atezolizumab),一種抗PDL1抗體)臂中。下文中將抗體2指示為ACF_389或ACF389。
hu25的VH區及VL區的胺基酸序列分別依SEQ ID NO: 10及11所示(表10)。hu29的VH區及VL區的胺基酸序列分別依SEQ ID NO: 12及13所示(表11)。hu25或hu29的非突變的CL區的胺基酸序列依SEQ ID NO: 4所示。hu25或hu29的非突變的CH1區的胺基酸序列依SEQ ID NO: 5所示。hu25或hu29的Fc (具有「臼」突變)的胺基酸序列依SEQ ID NO: 7所示。hu25或hu29的Fc (具有「杵」突變)的胺基酸序列依SEQ ID NO: 8所示。
表11. hu29的重鏈可變區及輕鏈可變區的胺基酸序列
鏈 | 胺基酸序列 | SEQ ID NO: |
hu29 VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS | 12 |
hu29 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK | 13 |
在抗體3研究中,位於輕鏈上之Q124C/S162C/C214S及位於重鏈上之F126C/F170C/C220S的突變對被引入至H95臂中,且野生型序列保留在H43臂中。下文中將抗體3指示為ESB07.451。
H95的VH區及VL區的胺基酸序列分別依SEQ ID NO: 14及15所示。H43的VH區及VL區的胺基酸序列分別依SEQ ID NO: 16及17所示。H95或H43的非突變的CL區的胺基酸序列依SEQ ID NO: 19所示。H95或H43的非突變的CH1區的胺基酸序列依SEQ ID NO: 18所示。H43的Fc (具有「臼」突變)的胺基酸序列依SEQ ID NO: 21所示。H95的Fc (具有「杵」突變)的胺基酸序列依SEQ ID NO: 20所示。
表12. H95及H43的胺基酸序列
鏈 | 胺基酸序列 | SEQ ID NO: |
H95 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQRLEWMGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLGPGDYWGQGTTVTVSS | 14 |
H95 VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYSSPYTFGGGTKLEIK | 15 |
H43 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMYWVRQAPGQGLEWIGHINPSSGYTKYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPNWDNYWGQGTTVTVSS | 16 |
H43 VL | DIQMTQSPSSMSASVGDRVTITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDIATYYCQQHYSTPYTFGGGTKLEIK | 17 |
H95/H43 CH1 | ASTKGPSVCPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKKVEPKSC | 18 |
H95/H43 CL | RTVAAPSVFIFPPSDECLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQECVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES | 19 |
H95 Fc (杵) | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 20 |
H43 Fc (臼) | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK | 21 |
5.1.2 被測抗體之表現及純化
為了產生雙特異性抗體,在共轉染之前,將hu28 HC及LC的質體與hu25 HC及LC的質體混合,將hu29 HC及LC的質體與hu25 HC及LC的質體混合,且將H95 HC及LC的質體與H43 HC及LC的質體混合。
變異體係在ExpiCHO-S細胞(生命科技公司)中產生的。轉染後7天,藉由離心收集培養上清液,且將其與耐鹼蛋白A培養基(AT蛋白A Diamond,博格隆生物技術有限公司(bestchrom))一起培育。用0.05 M檸檬酸緩衝液(pH 3.4)溶離結合的抗體,且立即用Tris緩衝液(pH 9.0)中和。首先用SDS-PAGE及SEC分析經純化之抗體。圖14、圖17與圖22分別示出了ACF_361、ACF_389及ESB07.451的結果。
對於ACF_389及ESB07.451,為了獲得更純的樣品,使用Mono S層析(5/50 GL,思拓凡公司(Cytiva))。裝載抗體且用緩衝液A (10 mM乙酸鈉,pH 5.2)洗滌,然後用緩衝液B梯度(10 mM乙酸鈉,pH 5.2,250 mM NaCl)溶離。圖18與圖19中示出了ACF_389的結果。圖22與圖23中示出了ESB07.451的結果。
為了定量評估同源CH1及CL鏈配對的效率,藉由LC-MS在非還原條件下分析經純化之抗體。圖15、圖20與圖24分別示出了ACF_361、ACF_389及ESB07.451的結果。根據LC-MS結果,145 KD附近的峰呈同源CH1/CL配對,其表明三種抗體被正確組合。
5.2 結合親和力測定
5.2.1 與過表現CLDN18.2及SIRPα的細胞的結合親和力
藉由FACS測定雙特異性抗體ACF_361與細胞的雙重結合特性。
將每孔1 × 10
5個表現CLDN18.2的MC38細胞與100 nM至0.05 nM的各經純化之抗體一起培育1小時,且然後與第2抗體Alexa Flour 647抗人IgG (H+L)一起培育。
在此測定中,ES028-h26、ES028-h28、AE016-201及ES028-005-08-26H1L2-201用作陽性對照,且hIgG1 (不與CLDN18.2或SIRPα特異性結合的同型對照,下同)用作陰性對照。圖16A中示出了各被測抗體之資訊。ES028-h26及ES028-h28兩者均為靶向CLDN18.2的單特異性IgG抗體。AE016-201為靶向CLDN18.2及SIRPα的雙特異性抗體(其中scFv連接於IgG)。ES028-005-08-26H1L2-201為靶向CLDN18.2及SIRPα的雙特異性抗體(其中scFv連接於IgG)。
圖16A中示出了抗體與MC38-CLDN18.2細胞的結合曲線。
將每孔1 × 10
5個CHO/SIRPαV1細胞與100 Nm至0.05 Nm的各經純化之抗體一起培育1小時,且然後與第2抗體Alexa Flour 647抗人IgG (H+L)一起培育。
在此測定中,ES001-025.201-IgG1LALA、ES028-005-08-26H1L2-201、AE016-201用作陽性對照,且hIgG1同型用作陰性對照。圖16B中示出了各被測抗體之資訊。ES001-025.201-IgG1LALA為靶向SIRPα的單特異性IgG抗體,其中在抗體之Fc區上具有LALA突變。ES028-005-08-26H1L2-201及AE016-201兩者均為靶向CLDN18.2及SIRPα的雙特異性抗體(其中scFv連接於IgG)。
圖16B中示出了抗體與CHO/SIRPαV1細胞的結合曲線。
5.2.2 與過表現PDL1及SIRPα的細胞的結合親和力
藉由FACS測定雙特異性抗體ACF_389對細胞的雙重結合特性。將每孔1 × 10
5個表現PDL1的Raji細胞與100 nM至0.05 nM的各經純化之抗體一起培育1小時,且然後與第2抗體Alexa Flour 647抗人IgG (H+L)一起培育。
在此測定中,阿替利珠單抗用作陽性對照,且ES004-025.201-IgG4、hIgG1及hIgG4 (不與CLDN18.2或SIRPα特異性結合的同型對照,下同)用作陰性對照。阿替利珠單抗為一種已知的抗PDL1抗體,其詳細資訊可見於例如US9873740B2中。ES004-025.201-IgG4為靶向SIRPα的單特異性抗體。
圖21A中示出了抗體與Raji/PDL1細胞的結合曲線。
將每孔1 × 10
5個CHO/SIRP V1細胞與100 nM至0.05 nM的各經純化之抗體一起培育1小時,且然後與第2抗體Alexa Flour 647抗人IgG (H+L)一起培育。
在此測定中,ES004-025.201-IgG4用作陽性對照,且阿替利珠單抗、hIgG1及hIgG4用作陰性對照。上文中描述了抗體之資訊。
圖21B中示出了抗體與CHO/SIRPαV1細胞的結合曲線。
5.3 雙特異性抗體之吞噬活性
本測定中測試了ACF_361之吞噬活性。
為了獲得單細胞懸浮液,用細胞消化液在37℃下消化小噬細胞10分鐘,然後添加細胞培養基以停止消化。在400 g下離心5分鐘後,將巨噬細胞以3 × 10
4/孔重新接種於96孔盤,且在37℃下回收隔夜。用CD11b及F4/80對小鼠BMDM細胞進行染色以評估品質及純度。第二天,添加25 µl濃度為0.05 nM至10 nM的稀釋的Abs及50 µl 6 × 10
4Violet CSFE標記的Raji-CLDN18.2細胞/孔,且在37℃下培育3小時。用DPBS洗滌細胞,且用細胞消化液在37℃下消化10分鐘,且然後用FACS緩衝液洗滌經消化之細胞。將細胞與抗小鼠F4/80 APC在4℃下培育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌且懸浮染色的細胞。藉由FACS測定吞噬作用之百分比。
在此測定中,ES028-005-08-26H1L2-201及AE016-201用作陽性對照,且hIgG1+hIgG4、抗SIRPα單特異性抗體、兩種抗CLDN18.2抗體(抗CLDN18.2.h26及抗CLDN18.2.h28)及組合用作陰性對照。ES028-005-08-26H1L2-201及AE016-201兩者均為靶向CLDN18.2及SIRPα的雙特異性抗體(其中scFv連接於IgG)。添加等莫耳的抗CLDN18.2 hu26 (hIgG1)及抗SIRPα hu25.060 (hIgG4)作為組合治療組(亦即,組合)。添加等莫耳的hIgG1及hIgG4作為同型對照組(亦即,hIgG1 + hIgG4)。
圖16C中示出了彙總資料。
5.4 疏水性評估
HIC-HPLC測定中的保留時間為評價抗體疏水性的因素。將15 µl 0.25 mg/ml抗體注入安捷倫公司1260系統中的MacPac-10 HIC管柱中,且偵測280 nm/214 nm處的信號。如表13所示,ACF_361、ACF_389及ESB07.451在MacPac-10 HIC中的保留時間分別為8.413分鐘、13.583分鐘及9.9分鐘,其表示三種雙特異性抗體之疏水性低。
表13. HIC-HPLC測定中抗體之保留時間
樣品名稱 | RT-HIC-UPLC (分鐘) |
ACF_361 | 8.413 |
ACF_389 | 13.583 |
ESB07.451 | 9.9 |
5.5 穩定性測試
5.5.1 熱穩定性評估
偵測雙特異性抗體在PBS緩衝液中的熔融溫度(Tm)值以預測其熱穩定性。簡而言之,將雙特異性抗體在10 mM PBS緩衝液(pH 7.2-7.4)中溶解。然後使用QuantStudio 7 Flex即時PCR系統藉由差示掃描螢光法(DSF)偵測Tm值。如表14中所示,ACF_361、ACF_389及ESB07.451的Tm值指示雙特異性抗體具有良好的熱穩定性。
表14. 抗體之Tm值
樣品名稱 | Tm1-DSF (℃) | Tm2-DSF (℃) |
ACF_361 | 68.7 | 80.7 |
ACF_389 | 68.7 | 84.8 |
ESB07.451 | 69.2 | 74.3 |
5.5.2 低pH穩定性評估
在低pH條件下良好之穩定性對抗體而言為重要的,因為純化過程通常涉及暴露於酸性溶液條件及常用的低pH病毒滅活。低pH值通常會產生可溶的、不可溶的聚集體,且加速碎裂。因此,為了評估蛋白質在低pH條件下之穩定性,用乙酸將PBS緩衝液中的雙特異性抗體滴定至pH 3.0-3.5。然後藉由監測暴露於低pH值溶液2小時前後的總可溶性蛋白(回收率)及純度的變化來評估抗體之穩定性。
表15中示出了結果,其中T0指示原始樣品的資料,且低pH 2小時表示2小時後在低pH下的資料。可看出,暴露於低pH溶液2小時使總純度幾乎沒有變化,表示所有三種抗體ACF_361、ACF_389及ESB07.451在低pH條件下均具有良好的穩定性。
表15. 抗體之低pH穩定性
樣品名稱 | 條件 | SEC-280nm | ||
聚集% | 純度% | 碎裂% | ||
ACF_361 | T0 | 0.8 | 98.7 | 0.5 |
低pH 2小時 | 0.8 | 98.8 | 0.4 | |
ACF_389 | T0 | 0.4 | 99.7 | ND |
低pH 2小時 | 0.6 | 99.4 | ND | |
ESB07.451 | T0 | 2.1 | 97.9 | ND |
低pH 2小時 | 2.2 | 97.8 | ND |
5.5.3 凍融應力下之穩定性
經常探索凍融穩定性,以判定產品經常暴露的抗體對溫度循環的敏感性。例如,藥物物質通常被冷凍以使得能夠長期儲存。作為凍乾過程之一部分,藥物產品可能會暴露於冷凍溫度。凍融之主要降解路徑為聚集體,包括沈澱物、顆粒及可溶性顆粒。因此,藉由監測重複凍融處理前後的純度變化來評估雙特異性抗體之凍融穩定性。簡而言之,將20 mM PBS (pH 6.0-6.2)中的抗體冷凍至-80℃超過12小時,且然後在室溫下解凍。在5次重複的凍融循環後,測定應激處理的樣品的濃度及純度。
表16中示出了結果,其中T0指示原始樣品的資料,且FT5指示凍融五次後的資料。可看出,ACF_361、ACF_389及ESB07.451在多次凍融循環後均未出現明顯的聚集及碎裂增加,指示所有三種抗體均具有良好的凍融穩定性。
表16:抗體在凍融應力下之穩定性
樣品名稱 | 條件 | SEC-280nm | ||
聚集% | 純度% | 碎裂% | ||
ACF_361 | T0 | 0.8 | 98.7 | 0.5 |
FT5 | 1.2 | 98.4 | 0.4 | |
ACF_389 | T0 | 0.4 | 99.7 | ND |
FT5 | 0.5 | 99.5 | ND | |
ESB07.451 | T0 | 2.1 | 97.9 | ND |
FT5 | 2.4 | 97.7 | ND |
5.5.4 熱應力下之穩定性
在超過正常儲存條件的溫度下的熱應力可能加速降解,由此增加潛在降解路徑的可偵測性,以提供關於在預期儲存條件下長期降解的資訊。雙特異性抗體在PBS中的熱應力測試在25℃及/或40℃下進行4週。偵測SEC純度以監測不溶性或可溶性聚集體。
表17中示出了結果,其中T0指示原始樣品的資料,25C-2W指示在25℃以下持續2W的資料,且其他命名規則類似。可看出,在25℃下培育4週後,PBS中的ACF_361及ACF_389的純度變化不大,且在25℃及40℃下培育4週後,PBS中的ESB07.451的純度變化不大。
表17. 抗體在熱應力下之穩定性
樣品名稱 | 條件 | SEC-280nm | CE-NR | CE-R | ||||
聚集 % | 純度 % | 碎裂 % | 主峰% | LC% | HC% | 純度% | ||
ACF_361 | T0 | 0.8 | 98.7 | 0.5 | 90.0 | 32.2 | 63.6 | 95.8 |
25C-2W | 0.9 | 98.5 | 0.6 | NA | NA | NA | NA | |
25C-4W | 1.2 | 98.0 | 0.8 | NA | NA | NA | NA | |
ACF_389 | T0 | 0.4 | 99.7 | ND | 98.6 | 31.7 | 67.8 | 99.5 |
25C-2W | 0.8 | 97.9 | 1.3 | NA | NA | NA | NA | |
25C-4W | 1.0 | 97.6 | 1.4 | NA | NA | NA | NA | |
ESB07.451 | T0 | 2.1 | 97.9 | ND | NA | NA | NA | NA |
25C-3W | 2.2 | 97.8 | ND | NA | NA | NA | NA | |
25C-4W | 2.3 | 97.8 | ND | NA | NA | NA | NA | |
40C-3W | 2.2 | 97.2 | 0.6 | NA | NA | NA | NA | |
40C-4W | 2.2 | 97.0 | 0.8 | NA | NA | NA | NA |
圖1示出了篩選測定1之示意圖。
圖2示出了篩選測定2之示意圖。
圖3A至圖3D示出了篩選測定1及2中使用的表現載體的結構。圖3A示出了具有或不具有移位之二硫鍵突變的輕鏈的表現載體的結構。圖3B示出了具有或不具有移位之二硫鍵突變的重鏈的表現載體的結構。圖3C示出了具有在N末端處融合的VHH域的野生型輕鏈的表現載體的結構。圖3D示出了具有杵或臼殘基取代的裸Fc的表現載體的結構。
圖4A與圖4B示出了用SEC-HPLC表徵的工程化的不對稱Fab-Fc及VHH-Fab-Fc變異體之相對豐度的結果。圖4A示出了具有CH1-CL鏈間二硫鍵移位之不同殘基取代對的不對稱Fab-Fc變異體,依藉由篩選測定1所偵測的。圖4B示出了具有天然CH1-CL鏈間二硫鍵的不對稱VHH-Fab-Fc分子,依藉由篩選測定2所偵測的。
圖5示出了在兩個Fab臂中具有移位之鏈間二硫鍵的對稱二價單特異性抗體之示意性結構。
圖6A與圖6B示出了具有CH1-CL鏈間二硫鍵移位之不同殘基取代對的工程化的對稱抗體變異體的產量(圖6A)及單體百分比評估(圖6B)的結果。
圖7A至圖7D示出了藉由FACS測定對所有對稱二價抗CLDN18.2抗體變異體與過表現CLDN18.2的MC38細胞結合的結合活性評估的結果。
圖8示出了使用熱移位分析對具有CH1-CL鏈間二硫鍵偏移的不同殘基取代對的對稱二價抗體變異體的熱穩定性分析的結果。
圖9示出了案例1研究之示意圖。
圖10示出了在案例1研究中測試的抗體之組合準確性及熱穩定性的結果,如分別藉由LC-MS測定及差示掃描螢光法量測的。
圖11示出了案例2研究之示意圖。
圖12示出了在案例2研究中測試的抗體之組合準確性及熱穩定性的結果,如分別藉由LC-MS測定及差示掃描螢光法量測的。
圖13A與圖13B示出了在案例1研究(圖13A)及案例2研究(圖13B)中測試的抗體之SDS-PAGE結果。
圖14示出了被測抗體ACF_361之SDS-PAGE及SEC結果。
圖15示出了測試抗體ACF_361之LC-MS結果。
圖16A示出了藉由FACS得到的抗體與MC38/CD47/CLDN18.2細胞的結合親和力結果。圖16B示出了藉由FACS得到的抗體與CHO/SIRPαV1細胞的結合親和力結果。圖16C示出了抗體之吞噬活性結果。
圖17示出了被測抗體ACF_389的SDS-PAGE及SEC結果。
圖18與圖19示出了被測抗體ACF_389的Mono S層析純化結果。
圖20示出了測試抗體ACF_389的LC-MS結果。
圖21A示出了藉由FACS得到的抗體與Raji/PDL1細胞的結合親和力結果。圖21B示出了藉由FACS得到的抗體與CHO/SIRPαV1細胞的結合親和力結果。
圖22與圖23示出了被測抗體ESB07.451的Mono S層析純化結果。
圖24示出了測試抗體ESB07.451的LC-MS結果。
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Claims (38)
- 一種抗體或其抗原結合片段,其包括第一臂及第二臂,該第一臂由第一重鏈及第一輕鏈以及在其間形成的鏈間二硫鍵形成,該第二臂由第二重鏈及第二輕鏈以及在其間形成的鏈間二硫鍵形成, 其中該第一重鏈上之至少一個非半胱胺酸殘基被半胱胺酸取代,其中該非半胱胺酸殘基位於選自由以下組成之群的位置處:該第一重鏈之胺基酸位置126、128、129、136、141、168、170、173、175或187;及 該第一輕鏈上之至少一個非半胱胺酸殘基被半胱胺酸取代,其中該非半胱胺酸殘基位於選自由以下組成之群的位置處:該第一輕鏈之胺基酸位置114、116、118、124、135、137、138、160、162或164。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中 該第一重鏈上被半胱胺酸取代的該至少一個非半胱胺酸殘基選自由以下組成之群:該第一重鏈的胺基酸殘基F126、L128、A129、S136、A141、H168、F170、V173、Q175或T187;及 該第一輕鏈上被半胱胺酸取代的該至少一個非半胱胺酸殘基選自由以下組成之群:該第一輕鏈的胺基酸殘基S114、F116、F118、Q124、L135、N137、N138、Q160、S162或T164。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該第一輕鏈及該第一重鏈包括對該第一輕鏈上之天然半胱胺酸及該第一重鏈上之天然半胱胺酸的至少一個非半胱胺酸取代對以及至少一個選自由以下組成之群的半胱胺酸取代對: (i)位於輕鏈上之S114C及位於重鏈上之S136C; (ii)位於輕鏈上之F116C及位於重鏈上之S136C; (iii)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之L128C; (iv)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A129C; (v)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A141C; (vi)位於輕鏈上之Q124C及位於重鏈上之F126C; (vii)位於輕鏈上之L135C及位於重鏈上之F170C; (viii)位於輕鏈上之N137C及位於重鏈上之F170C; (ix)位於輕鏈上之N138C及位於重鏈上之H168C; (x)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之V173C; (xi)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之Q175C; (xii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之F170C; (xiii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之T187C;以及 (xiv)位於輕鏈上之T164C及位於重鏈上之F170C; 其中該至少一個半胱胺酸取代對在該第一重鏈與該第一輕鏈之間形成至少一個鏈間二硫鍵; 其中該第一重鏈及該第一輕鏈上之該等天然半胱胺酸獨立地被非半胱胺酸殘基中之任一者取代。
- 如請求項3之抗體或其抗原結合片段,該第一重鏈及該第一輕鏈上之該等天然半胱胺酸獨立地被絲胺酸、丙胺酸、甘胺酸或纈胺酸中之任一者取代。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該第一重鏈及該第一輕鏈包括一個半胱胺酸取代對。
- 如請求項5之抗體或其抗原結合片段,其中該第一重鏈及該第一輕鏈包括兩個半胱胺酸取代對。
- 如請求項6之抗體或其抗原結合片段,其中該等兩個半胱胺酸取代對選自由以下組成之群: (i)位於輕鏈上之S114C/Q160C及位於重鏈上之S136C/V173C; (ii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之L128C/F126C; (iii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A129C/F126C; (iv)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A141C/F126C; (v)位於輕鏈上之F116C/Q124C及位於重鏈上之S136C/F126C; (vi)位於輕鏈上之Q124C/T164C及位於重鏈上之F126C/F170C; (vii)位於輕鏈上之Q124C/N138C及位於重鏈上之F126C/H168C; (viii)位於輕鏈上之Q160C/L135C及位於重鏈上之Q175C/F170C; (ix)位於輕鏈上之S114C/S162C及位於重鏈上之S136C/F170C; (x)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之L128C/F170C; (xi)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之A141C/F170C; (xii)位於輕鏈上之Q124C/S162C及位於重鏈上之F126C/F170C; (xiii)位於輕鏈上之N137C/S162C及位於重鏈上之F170C/T187C; (xiv)位於輕鏈上之Q124C/T164C/C214S及位於重鏈上之F126C/F170C/C220S;以及 (xv)位於輕鏈上之Q124C/S162C/C214S及位於重鏈上之F126C/F170C/C220S。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該第二重鏈與該第二輕鏈之間的該鏈間二硫鍵在該第二輕鏈上之天然半胱胺酸與該第二重鏈上之天然半胱胺酸之間形成; 其中該天然半胱胺酸在該第二輕鏈上之位置與人κ鏈上之位置C214相對應,且該天然半胱胺酸在該第二重鏈上之位置與人IgG1上的位置C220相對應。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該第二輕鏈及該第二重鏈包括至少一個非半胱胺酸取代對,其中該輕鏈上之天然半胱胺酸取代為絲胺酸且該重鏈上之天然半胱胺酸取代為絲胺酸,以及至少一個選自由以下組成之群的半胱胺酸取代對: (i)位於輕鏈上之S114C及位於重鏈上之S136C; (ii)位於輕鏈上之F116C及位於重鏈上之S136C; (iii)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之L128C; (iv)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A129C; (v)位於輕鏈上之F118C及位於重鏈上之A141C; (vi)位於輕鏈上之Q124C及位於重鏈上之F126C; (vii)位於輕鏈上之L135C及位於重鏈上之F170C; (viii)位於輕鏈上之N137C及位於重鏈上之F170C; (ix)位於輕鏈上之N138C及位於重鏈上之H168C; (x)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之V173C; (xi)位於輕鏈上之Q160C及位於重鏈上之Q175C; (xii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之F170C; (xiii)位於輕鏈上之S162C及位於重鏈上之T187C;以及 (xiv)位於輕鏈上之T164C及位於重鏈上之F170C; 其中該至少一個半胱胺酸取代對在該第二輕鏈與該第二重鏈之間形成至少一個鏈間二硫鍵,且該第一臂上的該一或多個半胱胺酸取代對不同於該第二臂上的該一或多個半胱胺酸取代對。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中在該第二輕鏈上取代的天然半胱胺酸位於該人κ鏈上之位置C214處,且在該第二重鏈上取代的天然半胱胺酸位於該人IgG1上的位置C220處。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該第二重鏈及該第二輕鏈包括兩個半胱胺酸取代對。
- 如請求項11之抗體或其抗原結合片段,其中該等兩個半胱胺酸取代對選自由以下組成之群: (i)位於輕鏈上之S114C/Q160C及位於重鏈上之S136C/V173C; (ii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之L128C/F126C; (iii)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A129C/F126C; (iv)位於輕鏈上之F118C/Q124C及位於重鏈上之A141C/F126C; (v)位於輕鏈上之F116C/Q124C及位於重鏈上之S136C/F126C; (vi)位於輕鏈上之Q124C/T164C及位於重鏈上之F126C/F170C; (vii)位於輕鏈上之Q124C/N138C及位於重鏈上之F126C/H168C; (viii)位於輕鏈上之Q160C/L135C及位於重鏈上之Q175C/F170C; (ix)位於輕鏈上之S114C/S162C及位於重鏈上之S136C/F170C; (x)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之L128C/F170C; (xi)位於輕鏈上之F118C/S162C及位於重鏈上之A141C/F170C; (xii)位於輕鏈上之Q124C/S162C及位於重鏈上之F126C/F170C;以及 (xiii)位於輕鏈上之N137C/S162C及位於重鏈上之F170C/T187C; 其中該第一臂上的該一或多個半胱胺酸取代對不同於該第二臂上的該等半胱胺酸取代對。
- 如請求項1至12中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中 第一重鏈恆定區及/或第二重鏈恆定區包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4;及 第一輕鏈恆定區及/或第二輕鏈恆定區包括人κ輕鏈或人λ輕鏈。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該第一重鏈及該第二重鏈形成異二聚體;且該第一重鏈恆定區之Fc區及/或該第二重鏈恆定區之Fc區包括一或多個促進異二聚體化之修飾。
- 如請求項14之抗體或其抗原結合片段,其中該第一重鏈之Fc區藉由杵/臼(Knob/Hole)結構與該第二重鏈之Fc區相互作用。
- 如請求項15之抗體或其抗原結合片段,其中該第一重鏈之Fc區包括杵(Knob)突變,且該第二重鏈之Fc區包括臼(Hole)突變;或者該第一重鏈之Fc區包括臼突變,且該第二重鏈之Fc區包括杵突變。
- 如請求項16之抗體或其抗原結合片段,其中該等杵突變包括T366W,且該等臼突變包括T366S/L368A/Y407V。
- 如請求項14之抗體或其抗原結合片段,其中該等促進異二聚體化之修飾包括引入能夠形成鏈間二硫鍵的半胱胺酸殘基。
- 如請求項14之抗體或其抗原結合片段,其中該第一重鏈恆定區之Fc區及該第二重鏈恆定區之Fc區分別包括CH3區中之修飾;其中兩個CH3區中之該等修飾選自以下:
一個CH3區中之修飾 另一個CH3區中之修飾 T366S/L368A/Y407V T366W S354C/T366W Y349C/T366S/L368A/Y407V T366Y Y407T T366W Y407A T394W F405A T366Y/F405A T394W/Y407T T366W/F405W T394S/Y407A F405W T394S D399C K392C T366W/D399C T366S/L368A/K392C/Y407V T366W/K392C T366S/L368A/D399C/Y407V S354C/T366W Y349C/T366S/L368A/Y407V Y349C/T366W S354C/T366S/L368A/Y407V E356C/T366W Y349C/T366S/L368A/Y407V Y349C/T366W E356C/T366S/L368A/Y407V E357C/T366W Y349C/T366S/L368A/Y407V Y349C/T366W E357C/T366S/L368A/Y407V 。 - 如請求項14之抗體或其抗原結合片段,其中該第一重鏈恆定區之Fc區及該第二重鏈恆定區之Fc區分別包括CH3區中之修飾;其中兩個CH3區中之該等修飾選自以下:
一個CH3區中之修飾 另一個CH3區中之修飾 K370E/D399K/K439D D356K/E357K/K409D K409D D399K K409E D399K K409E D399R K409D D399R D339K E356K E356K/D399K K392D/K409D E356K/D399K K409D/K439D E357K/D399K K370D/K409D E356K/E357K/D399K K370D/K392D/K409D E357K/D399K K392D/K409D K392D/K409D D399K K360D/L409D D399K 。 - 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該第一臂及該第二臂能夠與選自由以下組成之群的抗原特異性結合:SIRPα、CLDN18.2、Siglec15、HER2、EGFR、CD19、CD20、CD39、CD47、PD1、PDL1、CD3、NKG2D、NKG2A、Nkp46、CD137、OX40、CD40、LILRB1、LILRB2、LILRB4、GPC3、TROP2、CD112、TIGIT、FAP、VEGFA、DLL4、ANG-2,其中該第一臂及該第二臂可與不同的抗原特異性結合。
- 如請求項14之抗體或其抗原結合片段,其中該第一重鏈恆定區之Fc區及/或該第二重鏈恆定區之Fc區進一步包括改善該抗體或該抗原結合片段之穩定性的修飾。
- 根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段,其為人源化抗體或嵌合抗體。
- 根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段,其為雙特異性抗體或多特異性抗體。
- 根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段,其連接於一或多個結合物部分。
- 如請求項25之抗體或其抗原結合片段,其中該結合物部分包括第二抗體片段。
- 如請求項26之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包括Fab片段,該Fab片段連接於該第二抗體片段之Fc區的C末端。
- 如請求項25之抗體或其抗原結合片段,其中該結合物部分包括用於偵測或分離之藥劑,如清除改性劑、發光標記、螢光標記、酶受質標記或純化部分。
- 如請求項25之抗體或其抗原結合片段,其中該結合物部分包括治療劑或藥物。
- 一種分離之多核苷酸,其編碼根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體,其包括如請求項30之分離之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包括如請求項31之載體。
- 一種醫藥組合物,其包含: (i)如請求項1至29中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項30之多核苷酸;以及 (ii)一或多種醫藥學上可接受之載劑。
- 一種表現如請求項1至29中任一項之抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括在適於表現如請求項32之宿主細胞中所含的載體之條件下培養該宿主細胞。
- 一種在個體中治療、預防或減輕疾病的方法,該方法包括向該個體投與治療有效量的如請求項1至29中任一項之抗體或其抗原結合片段、或如請求項30之編碼該抗體或其抗原結合片段的多核苷酸、或如請求項31之載體、或如請求項32之宿主細胞,或如請求項33之醫藥組合物。
- 如請求項35之方法,其中該個體為人。
- 如請求項35或36之方法,其中該投與經口、經鼻、靜脈內、皮下、舌下或肌肉內投與進行。
- 一種如請求項1至29中任一項之抗體或其抗原結合片段、或如請求項30之編碼該抗體或其抗原結合片段的多核苷酸、或如請求項31之載體、或如請求項32之宿主細胞或如請求項33之醫藥組合物,在製備用於在個體中治療、預防或減輕疾病的藥物中的用途。
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