TW202342730A

TW202342730A - Aspergillus terreusnuk-1204菌株、源自nuk-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素及其生產方法，以及使用葡萄糖胺氧化酵素生產葡萄糖胺酸的方法

Info

Publication number: TW202342730A
Application number: TW111114467A
Authority: TW
Inventors: 林順富; 黃邦鴻
Original assignee: 國立高雄大學
Priority date: 2022-04-15
Filing date: 2022-04-15
Publication date: 2023-11-01
Also published as: TWI814343B

Abstract

本發明有關於一種 Aspergillus terreus NUK-1204菌株、源自NUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素及其生產方法，以及使用NUK-1204菌株葡萄糖胺氧化酵素生產葡萄糖胺酸的方法，本發明NUK-1204菌株所生產葡萄糖胺氧化酵素，於最適合的條件下可有效將葡萄糖胺轉化為葡萄糖胺酸。

Description

ASPERGILLUS　TERREUSNUK-1204菌株、源自NUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素及其生產方法，以及使用葡萄糖胺氧化酵素生產葡萄糖胺酸的方法

本發明關於一種 Aspergillus terreusNUK-1204菌株、源自NUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素及其生產方法，以及使用葡萄糖胺氧化酵素生產葡萄糖胺酸的方法。

幾丁聚糖是一種多功能、對環境友善的材料，葡萄糖胺是幾丁聚糖結構的單元，為葡萄糖的一個羥基被胺基取代後形成的胺基單醣。葡萄糖胺主要存在於人體的結締組織中，例如軟骨，且目前葡萄糖胺也被用來治療顳顎關節疾病和類風濕性關節炎等關節類的疾病。

葡萄糖胺酸是一種α-胺基酸，可經葡萄糖胺氧化後生成，近年來D-葡萄糖胺酸會被重視的原因，主要是其生物活性可廣泛在工業、農業、食品及醫藥的應用上，已被確定可做為具前瞻性的甜味劑及調味劑。葡萄糖胺酸是一光學分子群的成員，可充當為中間體作為許多不對稱合成胺基酸的起始物質及許多glycosidase 抑制劑，可進一步用來合成新化合物，以解決化學合成難解的光學特異性問題，大大提升體外合成特用化學品，用於製造出多種具有生理功能的生物活性物質，例如於工業領域，葡萄糖胺酸可以作為合成各種胺基酸起始材料，且可以解決化學合成胺基酸時會遇到的光學特異性問題；於醫療領域，葡萄糖胺酸可合成糖苷酶抑製劑、例如應用於合成栗精胺，以降低栗精胺的生產成本；又葡萄糖胺酸與鉻的螯合物也具有降低血糖的作用、葡萄糖胺酸與鉑的螯合物則有潛力做為癌症治療藥物；以及葡萄糖胺酸也可被應用於食品甜味劑或調味品。

目前葡萄糖胺酸生產方式主要為金屬催化氧化法、電極催化氧化法、生物合成法以及酵素催化法；其中金屬催化法的產率並不高，且有些使用的原料不容易從產物中分離，因此獲得的葡萄糖胺酸產物不適合應用於醫藥或是食品領域；電極催化氧化法需要使用貴金屬製成的電極，且需要相當長的反應時間以製備葡萄糖胺酸，因此生產成本高而較少應用於工業領域；生物合成法是直接利用微生物醱酵，例如利用不動桿菌屬( Acinetobacter sp.)、假單胞菌屬( Pseudomonas genera)與產氣桿菌屬( Aerobacter sp.)的菌株將葡萄糖胺轉化為葡萄糖胺酸，但同時菌株本身也會同時分解葡萄糖胺酸，因此產率較低；而酵素催化法是直接利用酵素將葡萄糖胺轉化為葡萄糖胺酸，兼具有反應快速、低成本以及產物純度高的優點，然而目前已知的酵素對於葡萄糖胺的催化效率都較低。因此，目前仍需要研發更佳的葡萄糖胺酸生產方法。

今，發明人即是鑒於上述現有生產葡萄糖胺酸的相關研究於實際實施使用時仍具有多處缺失，據此研創出本發明。

本發明主要目的為提供一種 Aspergillus terreusNUK-1204菌株、源自NUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素以及生產方法、與使用NUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素生產葡萄糖胺酸的方法。

Aspergillus terreusNUK-1204菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 930228，使用NUK-1204菌株生產葡萄糖胺氧化酵素的方法包含下述步驟：步驟一，將NUK-1204菌株接種於一培養基；以及步驟二，將NUK-1204菌株於溫度25℃-35℃培養3~6天，以獲得葡萄糖胺氧化酵素。

較佳的，步驟二中，NUK-1204菌株於培養3~6天之後，收集其菌體並以一萃取溶液萃取該菌體，以獲得該葡萄糖胺氧化酵素。

較佳的，NUK-1204菌株的菌體以萃取溶液萃取後會獲得一萃取物，再將萃取物進一步進行一純化程序，以獲得一純化後的葡萄糖胺氧化酵素，其中純化程序是依序將萃取物進行硫酸銨[(NH ₄) ₂SO ₄]沉澱劃分、Toyopearl phenyl-650M疏水性管柱層析、Toyopearl phenyl-650M管柱層析濃縮、Fractogel TSK HW-55分子篩管柱層析、Farcgel TSK DEAE-650M陰離子管柱層析以及Ultrogel hydroxyapatite管柱層析。

本發明亦提供一種源自 Aspergillus terreusNUK-1204菌株獲得的葡萄糖胺氧化酵素，此葡萄糖胺氧化酵素的分子量為54 kDa，且含有FAD輔成基(prosthetic group)，該葡萄糖胺氧化酵素對於葡萄糖胺的催化反應速率Km為2.6 mM，以及Kcat為0.2 S ^-1。

此外，此葡萄糖胺氧化酵素的序列為SEQ ID NO:1，且其受質包含葡萄糖胺(Glucosamine)與幾丁三糖(Chitotriose)。

本發明也揭露一種生產葡萄糖胺酸(Glucosaminic acid)的方法，其是將源自於 Aspergillus terreusNUK-1204菌株的一葡萄糖胺氧化酵素與一葡萄糖胺受質進行反應，以獲得葡萄糖胺酸。

較佳的，此葡萄糖胺氧化酵素與該葡萄糖胺受質是於酸鹼值pH9~11、作用溫度20~50℃的作用條件下進行反應，以將葡萄糖胺受質轉化為該葡萄糖胺酸。

藉此，本發明提供一種 Aspergillus terreusNUK-1204菌株，以此菌株大量生產葡萄糖胺氧化酵素的方法，以及使用此葡萄糖胺氧化酵素將葡萄糖胺有效轉化為葡萄糖胺酸的方法。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明提供一種 Aspergillus terreusNUK-1204菌株、源自NUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素以及生產方法、與使用NUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素生產葡萄糖胺酸的方法。

Aspergillus terreusNUK-1204菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 930228，使用NUK-1204菌株生產葡萄糖胺氧化酵素的方法包含下述步驟：步驟一，將NUK-1204菌株接種於一培養基；以及步驟二，將NUK-1204菌株於溫度25℃-35℃培養3~6天，以獲得葡萄糖胺氧化酵素；較佳的，於步驟二中，NUK-1204菌株於培養3~6天之後，收集其菌體並以一萃取溶液萃取該菌體，以獲得一萃取物，再將此萃取物進行一純化程序，以獲得一純化後的葡萄糖胺氧化酵素，其中純化程序是依序將萃取物進行硫酸銨[(NH ₄) ₂SO ₄]沉澱劃分、Toyopearl phenyl-650M疏水性管柱層析、Toyopearl phenyl-650M管柱層析濃縮、Fractogel TSK HW-55分子篩管柱層析、Farcgel TSK DEAE-650M陰離子管柱層析以及Ultrogel hydroxyapatite管柱層析。

本發明亦提供一種源自 Aspergillus terreusNUK-1204菌株獲得的葡萄糖胺氧化酵素，此葡萄糖胺氧化酵素的分子量為54 kDa，且含有FAD輔成基，該葡萄糖胺氧化酵素對於葡萄糖胺的催化反應速率K _m為2.6 mM，以及K _cat為0.2 S ^-1；此葡萄糖胺氧化酵素的N端序列為序列表的SEQ ID NO:1，其序列為RDALLPSSLQTCLRNTGAKIVY，且其受質包含葡萄糖胺與幾丁三糖(Chitotriose)。

本發明也揭露一種生產葡萄糖胺酸(Glucosaminic acid)的方法，其是將源自於 Aspergillus terreusNUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素與一葡萄糖胺受質進行反應，以獲得葡萄糖胺酸；較佳的，此葡萄糖胺氧化酵素與該葡萄糖胺受質是於酸鹼值pH9~11、作用溫度20~50℃的作用條件下進行反應，以將葡萄糖胺受質轉化為該葡萄糖胺酸。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

以下培養菌株會使用到多種培養基，其中YM固態培養基的成分為包含0.3wt%酵母提取物、0.3 wt%麥芽提取物、0.5 wt%蛋白腖、1 wt%葡萄糖與1.5 wt%瓊脂；又以下所述的麩皮培養基，是以不同重量比例的麩皮以及純水混合後獲得。

實施例一：菌種篩選與培養

(一)、菌種篩選

秤取1克的土壤，並將其加入10毫升的無菌水中混合均勻，再將此混合液進行序列稀釋，再取0.1 毫升的不同稀釋倍數的稀釋溶液，均勻塗抹於含有每升含0.1克氯黴素(chloramphenicol)的YM固態培養基上，再將YM固態培養基於30℃培養2到5天，待觀察到菌落長成之後，以接種環挑選出型態不同的單一菌落、將該些菌落重新接種到一個新的YM固態培養基上，並於30℃培養2到5天；當單一菌落生長後，挖取面積約4平方公分之含菌的YM固態培養基，加入裝有以5克麩皮以及10毫升純水配置的麩皮培養基的培養瓶內，再於30℃培養3到5天；最後於培養瓶中加入35毫升萃取溶液混合均勻且作用，以獲得一萃取液；以紗布過濾萃取液以去除麩皮，再將濾液於4℃、以12000 rpm的轉速離心3分鐘以去除菌體，收集離心後的上清液並測試其是否具有葡萄糖胺氧化酵素的活性；其中萃取溶液為含有0.1 wt% Triton X-100的20 mM 硼酸緩衝溶液(pH 9.5)。

此處是以4-AA檢測法測試上清液是否具有葡萄糖胺氧化酵素活性；4-AA檢測法的原理利用受質與氧化酵素反應後會生成過氧化氫(H ₂O ₂)，過氧化氫與4-AA(4-aminoantipyrine)以及酚類(phenol)在過氧化氫酶(peroxidase)的催化下，所獲得的產物會在波長500 nm處有吸收波峰，因此測量產物於波長500 nm的吸光質變化量，便可以得知待測物是否具有氧化酵素的活性，以計算出氧化酵素的活性。

4-AA檢測法的步驟為：在1毫升石英管內加入反應液，反應液包含有0.1毫升的上清液、0.5毫升的50 mM Tris-HCl緩衝溶液(pH 7.8)、0.2毫升的250 mM葡萄糖胺與0.2毫升的4-AA(4-aminoantipyrine)呈色劑等組成，將反應液混合均勻後，於30℃下以分光光度計測量於波長500 nm的吸光值變化(後稱OD500)；測量時每30秒測量一次吸光值，總測量時間為3分鐘。

經過測試，所挑選的菌株中，編號NUK-1204的菌株經過上述萃取步驟後獲得的上清液，具有轉化葡萄糖胺的能力，故推定其上清液中包含了葡萄糖胺氧化酵素；又經過財團法人食品工業發展研究所鑑定，此NUK-1204菌株菌名為 Aspergillus terreus，並寄存於上述機構，寄存編號為BCRC 930228。第一圖為NUK-1204菌株於YM固態培養基、於30℃培養3天的菌株型態觀察照片，NUK-1204的菌絲呈現白色，菌落直徑約1.5公分，且觀察到菌落外圈有褐色色素產生。

(二)、NUK-1204菌株培養條件測試

(1)、培養水分測試

將NUK-1204菌株接種於YM固態培養基，於30℃培養3天，再挖取面積約4平方公分之含菌的YM固態培養基，分別接種於含有不同重量水分的麩皮培養基中，並於30℃培養4天；所使用的麩皮培養基，其含有的麩皮與純水重量比介於1:0.5~1:5，且麩皮培養基的成分以及對應的名稱請見表一。

表一

	成分		成分
培養基1	5克麩皮+2.5克純水	培養基6	5克麩皮+15克純水
培養基2	5克麩皮+5克純水	培養基7	5克麩皮+17.5克純水
培養基3	5克麩皮+7.5克純水	培養基8	5克麩皮+20 克純水
培養基4	5克麩皮+10克純水	培養基9	5克麩皮+22.5 克純水
培養基5	5克麩皮+12.5克純水	培養基10	5克麩皮+25克純水

將上述培養瓶於30℃培養4天之後，於培養瓶中加入35 毫升的含有0.1 wt% Triton X-100的20 mM 硼酸緩衝溶液(pH 9.5)萃取，混合均勻且作用；作用後將培養瓶中的內容物取出，於4℃、以12000 rpm的轉速離心3分鐘以去除菌體，並且收集上清液，並將上清液以4-AA檢測法測量上清液中酵素活性；將獲得的測量數值計算後，以百分比方式呈現在含水量不同的水份培養條件下，NUK-1204菌株產生的葡萄糖胺氧化酵素的相對活性。

請參見第二圖，在其他培養條件皆相同的情況下，以培養基7培養NUK-1204菌株所獲得的萃取液，具有最高的葡萄糖胺氧化酵素活性。

(2)、固態麩皮培養時間測試

將NUK-1204菌株先接種於YM固態培養基，於30℃培養3天後，取面積約4平方公分之含菌的YM固態培養基，接種於培養基7並於30℃培養，於培養後的12小時~6天的不同時間點，收集菌體並以萃取液進行萃取，並將萃取後的產物以4-AA檢測法測量其中的葡萄糖胺氧化酵素活性；每一個樣品測量時，每30秒偵測一次吸光值，總測量時間為3分鐘，並將所得數據以百分比方式計算在不同培養天數下葡萄糖胺氧化酵素的相對活性。

根據第三圖的測量結果，在培養後第0~5天所收集的樣本，酵素活性會隨著培養天數增加而上升，且培養後第5天所收集的樣本具有最高的酵素活性；培養5天之後，樣本中的酵素活性會開始下降。

實施例二、葡萄糖胺氧化酵素的製備、純化與活性測試

(一)、菌株培養與酵素萃取

將NUK-1204菌株先接種於YM固態培養基，於30℃培養3天後，取面積約4平方公分之含菌的YM固態培養基，接種於裝有培養基7的培養瓶中，於30℃培養5天，此實施例中共培養24瓶此規格的培養瓶；於培養後的4天，於每一培養瓶中加入35 mL的萃取液，作用後再將培養瓶中的內容物以紗布過濾，先去除其中的麩皮；接著將過濾後的濾液於4℃、以8000 rpm的轉速離心45分鐘且收集離心後的上清液，以去除菌的孢子，將此處收集的上清液稱為粗萃酵素溶液。

計算粗萃酵素溶液的體積，且於粗萃酵素溶液內添加2 mM的硫酸錳(MnSO ₄)溶液，以抑制粗萃酵素溶液中的過氧化氫酶(catalase)活性，此步驟都在低溫0~4℃的環境下進行；粗萃酵素溶液與硫酸錳反應15分鐘後，取部分粗萃酵素溶液測量其中葡萄糖胺氧化酵素的活性後，再進一步將粗萃酵素溶液藉由硫酸銨[(NH ₄) ₂SO ₄]沉澱劃分、Toyopearl phenyl-650M疏水性管柱層析、Toyopearl phenyl-650M管柱層析濃縮、Fractogel TSK HW-55分子篩管柱層析、Farcgel TSK DEAE-650M陰離子管柱層析以及Ultrogel hydroxyapatite管柱層析進行純化，以獲得相對純化的葡萄糖胺氧化酵素。

(二)、酵素純化

(1)、硫酸銨[(NH ₄) ₂SO ₄]沉澱劃分

測量粗萃酵素溶液的體積，並將粗萃酵素溶液放置於冰上，再緩慢的加入硫酸銨[(NH ₄) ₂SO ₄]，以使粗萃酵素溶液中硫酸銨的飽和度達到65%，待硫酸銨完全溶解後，再將此混合液於0~4℃靜置4~6小時，接著將混合液於4℃、8000 rpm的轉速離心45分鐘，因酵素不被硫酸銨沉澱，去除沉澱物並收集上清液，收集的上清液稱為硫酸銨酵素溶液。

(2)、Toyopearl phenyl-650M疏水性管柱層析：

先以含有硫酸銨飽和度為65%的硼酸緩衝溶液(pH 9.5)填充Toyopearl phenyl-650M疏水性管柱(2.5 X 30公分)，平衡後再將酵素溶液通入管柱，再以硫酸銨飽和度為65%的硼酸緩衝溶液(pH 9.5)沖洗，以去除不吸附於管柱上的雜蛋白；接著使用硫酸銨飽和度為65%~0%的硼酸緩衝溶液(pH9.5)，以直線梯度進行沖提，並收集有酵素活性的部分，直線梯度沖提總體積為1400 毫升，且操作流速為每小時60毫升；將此處收集的酵素液稱為TP-650M純化酵素溶液。

(3)、Toyopearl phenyl-650M管柱濃縮

為進行下一步驟分子篩管柱層析，需濃縮體積，將TP-650M純化酵素溶液的硫酸銨飽和度加到2 M；以含有2 M硫酸銨的硼酸緩衝溶液(pH 9.5)填充至一小型Toyopearl phenyl-650M管柱(1.5×6公分)，平衡後將TP-650M純化酵素溶液通入管柱，待酵素溶液完全進入管柱之後，再直接以硼酸緩衝溶液(pH 9.5)沖提，操作流速為每小時60 毫升，收集有酵素活性的部分；將此處收集的溶液稱為濃縮TP-650M酵素溶液。

(4)、Fractogel TSK HW-55分子篩管柱層析

先以50 mM的Tris-HCl緩衝溶液(pH 7.8)填充Fractogel TSK HW-55管柱(2.5×115.0公分)，平衡後再將濃縮TP-650M酵素溶液通入管柱中，待酵素溶液完全進入管柱之後，再以50 mM的Tris-HCl緩衝溶液(pH 7.8)進行沖提，操作流速為每小時12 毫升，並收集有酵素活性的部分；將此處收集的溶液稱為HW-55純化酵素溶液。

(5)、Farcgel TSK DEAE-650M陰離子管柱層析

以50 mM的Tris-HCl緩衝溶液(pH 7.8)填充Farcgel TSK DEAE-650M陰離子管柱(2.5×30公分)，平衡後將HW-55純化酵素溶液通入管柱中，待酵素溶液完全進入管柱之後，再以50 mM 的Tris-HCl緩衝溶液(pH 7.8)進行沖提，去除不吸附於管柱上的雜蛋白；再用含有0~0.15 M氯化鈉(NaCl)的50 mM的Tris-HCl緩衝溶液(pH 7.8)，以直線梯度進行沖提，直線梯度沖提總體積為1000 毫升，操作流速為每小時75毫升，並收集具有酵素活性的部分；此步驟收集到的溶液，稱為TP DEAE-650M純化酵素溶液。

(6)、透析

接著，將TP DEAE-650M純化酵素溶液加入透析袋(3.5 kDa)中，並將透析袋放入裝有1 公升的10 mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)的燒杯中，於4℃緩慢攪拌，透析隔夜後，收集透析袋內的溶液，並將其稱為透析後酵素溶液。

(7)、Ultrogel hydroxyapatite管柱層析

以10 mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)填充Ultrogel hydroxyapatite管柱(2.5×15公分)進行平衡後，將透析後酵素溶液通入管柱中，等酵素溶液完全進入管柱後，以10 mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)進行沖提，去除不吸附的雜蛋白，再用10 mM~150 mM之磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以直線梯度進行沖提，直線梯度沖提的總體積為600 毫升，操作流速為每小時60 毫升，並收集具有酵素活性的部分；此部分收集的溶液稱為UH純化酵素溶液。

請參見表二，為粗萃酵素溶液以及上述各步驟純化過程中獲得的各溶液，所得到產物內的蛋白質含量、酵素總活性以及酵素比活性(Specific activity)的分析結果；其中蛋白質含量的測試方法是分別測量樣本以及蛋白質濃度標準品(牛蛋白血清)與呈色溶液作用後、於波長595 nm光線的吸光值(OD595)，並將樣本的OD595與使用蛋白質濃度標準品繪製的標準曲線做比對，以獲得樣本中的蛋白質濃度。又表二測量酵素活性的方法為4-AA檢測法。

粗萃酵素溶液中的蛋白質含量為816.4 mg，且總活性為1.2活性單位，以及比活性為14.9 X 10 ^-4活性單位/毫克；硫酸銨沉澱酵素溶液的蛋白質含量為307.0 mg，且酵素比活性為24.8 X 10 ^-4活性單位/毫克，又其酵素總活性為0.8活性單位，低於粗萃酵素溶液，下降的原因可能是酵素活性受到硫酸銨鹽的影響；TP-650M純化酵素溶液的蛋白質含量為133.7 mg、總活性為1.0活性單位，以及比活性為每毫克77.8 X 10 ^-4活性單位/毫克；HW-55純化酵素溶液的蛋白質含量為64.7 mg、總活為0.9 活性單位，以及比活性為136.1 X 10 ^-4活性單位/毫克；TP DEAE-650M酵素溶液的蛋白質含量為13.2 mg，總活性為0.5活性單位，以及比活性為387.2 X 10 ^-4活性單位/毫克；又UH純化酵素溶液蛋白質含量為3.5 mg，總活性為0.5活性單位，以及比活性為0.1活性單位/毫克，又最後UH純化酵素溶液的回收率(Recovery yield)為40.2％。

由於NUK-1204固態發酵過程中，除了產生葡萄糖胺氧化酵素以外也會生產過氧化氫酵素(catalase)，過氧化氫酵素會分解過氧化氫，進而影響4-AA活性測試法的結果，又因為過氧化氫酵素只能藉由分子篩去除，因此上述純化步驟中，於使用分子篩管柱(Fractogel TSK HW-55管柱)進行純化之前所獲得的產物，因為其中的過氧化氫酵素尚未被去除，所以酵素比活性測量結果都會呈現活性較低的情形。

表二

	總體積 (mL)	總蛋白質(mg)	總活性 (U)	比活性 (10 ^-4U/mg)	純化倍率	回收率(%)
粗萃酵素溶液	830	816.4	1.2	14.9	1.0	100
硫酸銨沉澱酵素溶液	1040	307.0	0.8	24.8	1.7	62.3
TP-650M純化酵素溶液	352	133.7	1.0	77.8	5.2	85.3
HW-55純化酵素溶液	70.4	64.7	0.9	136.1	9.1	72.1
TP DEAE-650M純化酵素溶液	575	13.2	0.5	387.2	25.9	41.8
UH純化酵素溶液	176	3.5	0.5	1400.0	93.7	40.2

(二)、酵素分析

以下試驗中使用的酵素溶液，為上述的UH純化酵素溶液。

(1)、蛋白質分子量分析

此試驗中使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳方法(SDS-PAGE)測量純化後獲得的葡萄糖胺氧化酵素的分子量，其原理是將蛋白質樣品注入十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠中，以電泳方式使不同分子量的蛋白質移動到凝膠的不同位置，電泳結束後以Coomassie Brilliant Blue染劑將凝膠染色，待染劑將凝膠中的蛋白質染色後，再以10%醋酸水溶液脫色，以洗去凝膠中非蛋白質處的染劑，再將樣品與蛋白質分子量標準品進行比對，以獲得樣品的分子量；染色結果請見第四圖，本發明純化的葡萄糖胺氧化酵素大小約為54 kDa。

(2) N端定序

將上述純化後的葡萄糖胺氧化酵素進行N-末端定序，所得到的胺基酸序列為SEQ ID NO:1且列於表三，表三同時列出與其他菌株的可生產醣類氧化的酵素的N端胺基酸序列，如序列編號為SEQ ID NO:2的 Paraphaeosphaeriasp. NUK-47菌株的寡糖氧化酵素 (中華民國專利第TWI752463B號發明專利)、序列編號為SEQ ID NO:3的 Microdochium nivale的COX酵素 (carbohydrate：acceptor oxidoreductase)的N端序列(Xu, F. et al., 2001)、序列編號為SEQ ID NO:4的 Paraconiothyriumsp. 的PCOX酵素(Kiryu, T. et al.,2008)，以及序列編號為SEQ ID NO:5的 Fusarium graminearum的幾丁寡糖氧化酵素(Chitooligosaccharide oxidase, ChitO)(Heuts, D.P.H.M. et al., 2007)，經過比較，本發明所得到葡萄糖胺氧化酵素的N端胺基序列與這些已知酵素的N端胺基酸序列完全不同，是一種全新的序列，可見本發明的葡萄醣胺氧化酵素的特殊性。

表三

序列編號	酵素	N端胺基酸序列
SEQ ID NO:1	本發明葡萄糖胺氧化酵素	RDALLPSSLQTCLRNTGAKIVY
SEQ ID NO:2	寡糖氧化酵素 ( Paraphaeosphaeriasp. NUK-47)	AAIDKXLTDAGVPID
SEQ ID NO:3	COX ( Microdochium nivale)	GAIEACLSAAGVPID
SEQ ID NO:4	PCOX ( Paraconiothyriumsp.)	AVIDKXLTDDGVPVD
SEQ ID NO:5	ChitO ( Fusarium graminearum)	VPTKREAVNSCLTQA

(3)、紫外光-可見光光譜(UV-VIS)測試

本試驗以紫外光-可見光(Ultraviolet-visible spectroscopy，後簡稱UV-VIS)光譜法測量純化後的酵素的輔成基(prosthetic group)，測試方法簡述如下：取4μL之每毫升0.5活性單位的酵素溶液，分別與1μL的250 mM葡萄糖胺或是去離子水混合，以作為待測物，並分別以超微量分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop One)進行UV-VIS光譜分析。第五圖的樣本A為酵素溶液與去離子水混合後的樣本，其在波長372 nm與439 nm處有明顯的吸收峰，與黃素腺嘌呤二核苷酸輔因子(FAD)的吸收波長吻合，故推測本發明的葡萄糖胺氧化酵素含有FAD輔成基；又樣本B為本案酵素溶液與葡萄糖胺作用後的產物，其在372 nm與439 nm的吸收峰消失，導致此現象的可能原因為葡萄糖胺氧化酵素與葡萄糖胺作用後，其輔成基FAD由氧化態轉變為還原態，因此原有的吸收波峰消失，此結果進一步佐證本發明的葡萄糖胺氧化酵素確實含有FAD。

(4)、酵素最佳反應酸鹼值

此試驗目的為測試本發明葡萄糖胺氧化酵素作用時的最佳酸鹼值，是利用氧電極法測量酵素活性，測試方法簡述如下：配製50 mM具有不同酸鹼值的不同緩衝溶液，其分別為Tris-HCl(pH 7.0-9.0)緩衝溶液、磷酸鹽(Phosphate buffer，K ₂HPO ₄-NaH ₂PO ₄，pH5.5-8.0)緩衝溶液、碳酸鹽(Carbonate buffer，Na ₂CO ₃-NaHCO ₃，pH9.0-11.0)緩衝溶液，以及醋酸鹽(Acetate buffer，CH ₃COOH-CH ₃COONa，pH4.5-5.5)緩衝溶液；於4.5毫升反應槽中分別加入3.4毫升上述的各種緩衝溶液與0.9毫升的100 mM葡萄糖胺，待反應槽溫度升至30℃後再加入0.2毫升的酵素溶液(其每毫升含有0.94活性單位)，其中一組別中以0.2毫升去離子水取代酵素溶液以作為對照組。

接著使用溶氧電極偵測儀測量混合溶液的溶氧量變化，總偵測時間為3分鐘，且每10秒偵測一次，紀錄其數值；取實驗組與對照組於1分鐘之內的溶氧變化量，並以實驗組之變化量減去對照組的溶氧變化量，所得數值再以百分比方式計算酵素在不同pH值下的相對活性。

第六圖為本發明葡萄糖胺氧化酵素在不同緩衝溶液中的相對活性分析結果，葡萄糖胺氧化酵素於pH10.5的碳酸鹽緩衝溶液具有最高的活性，並將其定義為100%；葡萄糖胺氧化於pH10.0以及pH11.0的碳酸鹽緩衝溶液具有次佳的活性，活性分別為99％與97％；根據整體的測量結果，本發明葡萄糖胺氧化在鹼性環境中都具有較高的活性，而當環境的pH值下降，本案的酵素活性也會逐漸減弱，即本發明所純化的酵素適合於鹼性環境反應，且於pH10.5的碳酸鹽緩衝溶液中，本案的酵素具有較佳的活性。

(5)、酵素最適反應溫度

此試驗的目的為測試本發明酵素的最適合反應溫度，也是利用氧電極法測量酵素活性，且於其中一個組別中以去離子水取代酵素溶液以作為對照組。

第七圖為酵素在不同反應溫度下的相對活性分析結果，反應溫度30℃的組別，酵素活性最佳且定義為100%，隨著反應溫度的升高，酵素活性逐漸下降，40℃組的酵素的活性為73.3%、50℃組的酵素活性為56.4%，又20℃組的酵素活性為46.9%，也低於30℃組的酵素活性。

(6)、酸鹼值穩定度

此試驗的的目的是測試酵素於不同酸鹼值環境下的穩定度，測試方式如下：配製上述具有不同酸鹼值的不同緩衝溶液，接著將本發明酵素溶液(每毫升中含有0.94活性單位)與各緩衝溶液以體積百分比1：9比例進行混合、以獲得總體積為1毫升的混合溶液，將混合溶液於30℃反應1小時後；再取0.1毫升反應後的混合溶以4-AA檢測法進行酵素動力學測定，總測量時間為3分鐘，每30秒測量一次吸光值，並將所得數據以百分比方式計算酵素在不同pH值下的相對活性。

請見第八圖，葡萄糖胺氧化酵素在酸鹼值為pH10.5的碳酸鹽緩衝溶液作用一小時後，仍擁有最高的殘餘活性，並將其定義為100%；隨著緩衝溶液酸鹼值上升或下降，酵素的活性雖然有稍微下降的趨勢，但與pH10.5的組別相比都仍具有80%以上的相對活性，表示本發明葡萄糖胺氧化酵素即使在pH 4.5-11.0的環境中預作用1小時後，其酵素活性仍相對穩定，不會受到太大的影響。

(7)、溫度穩定度

取0.1毫升的酵素溶液(每毫升中包含0.05活性單位)，分別於20~70℃下反應1小時，接著再以4-AA檢測法進行酵素動力學測定，並計算在不同溫度下作用後的酵素的相對活性。請見第九圖，酵素在50℃反應一小時後仍具有最高的殘餘活性，並將其定義為100%；又作用溫度介於20℃至50℃範圍區間，隨著溫度上升，本發明葡萄糖胺氧化酵素的相對活性會由80%上升至100%；又葡萄糖胺氧化酵素於60℃反應一小時之後，酵素的活性會下降至5.9%，而葡萄糖胺氧化酵素於70℃反應一小時之後，會完全失去酵素活性；根據測試結果，本發明葡萄糖胺氧化在20℃至50℃的環境中較穩定。

(8)、金屬離子對葡萄糖胺氧化酵素活性影響

將每毫升含有0.05活性單位的酵素溶液，分別與10 mM的金屬離子溶液以體積比9:1的比例混合，以獲得一總體積為0.2毫升、且金屬離子最終濃度為1 mM的混合溶液；將混合溶液於30℃反應1小時，再以氧電極法測量酵素的活性，其中一組別以去離子水取代酵素溶液作用，以做為對照組。所使用的金屬離子溶液為硝酸銀(AgNO ₃)溶液、氯化鈣(CaCl ₂)溶液、氯化鎘(CdCl ₂)溶液、氯化鈷(CoCl ₂)溶液、硫酸銅(CuSO ₄)溶液、氯化鉛(PbCl ₂)溶液、氯化亞錫(SnCl ₂)溶液、硫酸鐵(FeSO ₄)溶液、氯化汞(HgCl ₂)溶液、硫酸鋁(AlSO ₄)溶液、硫酸猛(MnSO ₄)溶液、硫酸鎂(MgSO ₄)溶液與氯化鎳(NiCl ₂)溶液。

氧電極法的測量步驟簡述如下：於反應槽中加入3.4 mL的50 mM Tris-HCl緩衝溶液與0.9毫升的250 mM葡萄糖胺，待反應槽溫度升至30℃後加入0.2毫升前述與金屬離子作用後的混合溶液，並使用溶氧電極偵測儀進行測量，共測量時間為3分鐘，每10秒測量一次，並紀錄數值。分別取實驗組與對照組在1分鐘內的數值變化量，並以實驗組的變化量減去對照組的變化量，再將所得數值以百分比方式計算酵素活性。

請見表四，為葡萄糖胺氧化酵素與金屬離子作用一小時之後，酵素活性的測量結果；與對照組相比，氯化鎘組以及氯化鉛組的酵素活性分別為123.5%以及127.3%，皆高於對照組，表示這兩種金屬離子會增強酵素的活性；氯化鈣組、氯化錫組、硫酸鋁組、硫酸鎂組與氯化鎳組的酵素活性都都低於對照組，表示這幾種金屬離子會抑制酵素活性；又剩下的組別，酵素活性的變化與對照組比差異不會超過10%，表示該些組別的金屬離子對於酵素活性影響較小；根據表四，鎘離子(Cd ²⁺)與鉛離子(Pb ²⁺)會增強葡萄糖胺氧化酵素的活性，鎂離子(Mg ²⁺)與鎳離子(Ni ²⁺)則會明顯抑制葡萄糖胺氧化酵素的活性。

表四

金屬離子	相對活性(%)	金屬離子	相對活性(%)
無(對照組)	100.0	氯化亞錫	87.4
硝酸銀	96.4	硫酸鐵	99.5
氯化鈣	84.3	氯化汞	98.4
氯化鎘	123.8	硫酸鋁	88.8
氯化鈷	102.7	硫酸猛	107.8
硫酸銅	103.4	硫酸鎂	77.9
氯化鉛	127.3	氯化鎳	66.5

(9)、化學試劑對葡萄糖胺氧化酵素活性影響

將每毫升含有0.05活性單位的酵素溶液，與濃度1 mM之化學試劑以體積比9：1的比例進行混合，以獲得總體積為200μL的混合溶液；將混合溶液於30℃反應1小時，再以氧電極法測量酵素活性，其中一組別以去離子水取代酵素液作為對照組。此試驗中使用的化學試劑包含乙二胺四乙酸(EDTA)、過氧化氫(H ₂O ₂)、苯甲基磺醯氟(PMSF)、疊氮化鈉(NaN ₃)、2,4’-二溴苯乙酮(2,4'-dibromoacetophenone)、2-溴-4'-硝基苯乙酮(2-bromo-4'-nitroacetophone)、N-乙基馬來醯亞胺(N-ethy-lmaleimide)與鄰二氮菲(1,10-phenanthroline)。

表五為酵素與各化學試劑作用後的活性分析結果，此試驗中所使用的各種化學試劑都會抑制葡萄糖胺氧化酵素的活性，且抑制效果較強的化學試劑為乙二胺四乙酸、疊氮化、2,4’-二溴苯乙酮、2-溴-4'-硝基苯乙酮與鄰二氮菲，其對酵素的抑制比例都超過10%；其中鄰二氮菲能與大多數金屬離子形成穩定的配合物，而2-溴-4'-硝基苯乙酮為組胺酸抑制劑，二者都會明顯抑制本發明酵素的活性。

表五

化學試劑	相對活性(%)	化學試劑	相對活性(%)
無(對照組)	100	2,4’-二溴苯乙酮	80.6
乙二胺四乙酸	83.8	2-溴-4'-硝基苯乙酮	79.3
過氧化氫	95.1	N-乙基馬來醯亞胺	93.7
苯甲基磺醯氟	94.5	鄰二氮菲	66.6
疊氮化鈉	84.4

(10)、受質專一性

此試驗的測試方法簡述如下：先配製100 mM與10 mM的受質溶液，並取0.2毫升受質溶液、與0.5毫升的50 mM Tris-HCl緩衝溶液、0.2毫升的4-AA呈色劑與0.1毫升的酵素溶液(每毫升含有0.05活性單位)混合，並在室溫下使用分光光度計測量混合溶液於波長500 nm光線的吸光值，以進行酵素動力學測定，總測量時間為3分鐘，每30秒測量一次，最後將所得數據以百分比方式計算酵素對於不同受質的相對活性。此試驗中使用的受質包含葡萄糖胺(Glucosamine)、幾丁三糖(Chitotriose)、N-乙醯基葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、葡萄糖(Glucose)、乳糖(Lactose)、纖維二糖(Cellobiose)以及殼聚糖(Chitosan)。

表六為本試驗的測量結果，將受質為葡萄糖胺的組別作為酵素活性100%，在受質最終濃度為50 mM時，葡萄糖胺氧化酵素對N-乙醯基葡萄糖胺的相對活性為6.5%，但是對葡萄糖、乳糖、纖維二糖與殼聚糖的相對活性皆為0%；又受質的最終濃度為3 mM時，葡萄糖胺氧化酵素對幾丁三糖的相對活性為85%。

表六

受質	相對活性(%)	受質	相對活性(%)
葡萄糖胺	100	乳糖	0.0
幾丁三糖(3 mM)	85.0	纖維二糖	0.0
N-乙醯基葡萄糖胺	6.5	殼聚糖	0.0
葡萄糖	0.0

進一步，將本發明葡萄糖胺氧化酵素與其他的葡萄糖胺氧化酵素或葡萄糖胺衍生物氧化酵素進行比較，比較結果請參見表七；根據表七，本發明葡萄糖胺氧化酵素的分子量與寡糖氧化酵素相近；又只有本發明葡萄糖胺氧化酵素是以葡萄糖胺為主要受質，與其他四種酵素的受質專一性明顯不同，可證實本案由NUK-1204菌株產生的氧化酵素為一種新型的葡萄糖胺氧化酵素。

表七

酵素	來源	分子量(kDa)	輔成基	受質專一性(%)
葡萄糖胺	葡萄糖	N-乙醯基葡萄糖胺	幾丁三糖
本發明酵素	NUK-1204菌株	54	FAD	100	0	6.5	85
寡糖氧化酵素	Paraphaeosphaeria 屬NUK-47菌	54	FAD	0	2.9	---	52
香草醇氧化酵素	Fusarium graminearum	60	FAD	---	0.02	4.2	100
N-乙醯基葡萄糖胺氧化酵素	Pseudomonas	170	FAD	14	---	100	---
葡萄糖氧化酵素	Aspergillus niger	80	FAD	2	100	---	---

(11)、酵素動力學

此試驗的目的是測量本發明葡萄糖胺氧化酵素的K _m值與K _cat值，K _m值是用於表示酵素對受質親和性的指標，若K _m值低則代表酵素對受質的親和性高，反之當K _m值高時酵素對受質的親合性低；又K _cat值代表每一分子酵素每秒能夠催化受質轉化的數目，大多數以K _cat/K _m作為酵素的催化力指標，此數值越大代表酵素有越高的催化力。

試驗方式如下：先配製不同濃度的葡萄糖胺受質溶液，並將0.2毫升受質溶液、0.5毫升的50 mM Tris-HCl緩衝溶液、0.2毫升的 4-AA呈色劑與0.1毫升的酵素溶液(每毫升含有0.05活性單位)混合，在室溫下以分光光度計測量混合溶液於波長500 nm的吸光值以進行酵素動力學分析，總共測量時間為3分鐘，每30秒測量一次，並取一分鐘變化量之數據，再計算產物的產量，最後將受質初始濃度與產物產量以倒數作Lineweaver-Burk Plot圖，以受質初始濃度倒數作為X軸，產物產量倒數作為Y軸，以計算酵素K _m值。測量結果請見表八，本發明酵素對於葡萄糖胺的K _m值為2.6、K _cat值為0.2，而K _cat/K _m為74.1。

表八

受質	K _m(mM)	K _cat(S ^-1)	K _cat/ K _m(S ^-1mM ^-1)
葡萄糖胺	2.6	0.2	74.1

實施例三、葡萄糖胺酸的生產

取50μL的20 mM葡萄糖胺與20μL的酵素溶液(每毫升含有0.05活性單位)，將其加入微量離心管中，以封口膜密封微量離心管管口，於封口膜上戳數個小洞使空氣流通，於30℃反應8小時，待反應結束後將產物以矽膠薄層層析分析 (Thin layer chromatography，TLC)進行分析。

分析方法簡述如下：將silica G60 (Merck)薄層切割為2 X 8平方公分的TLC平板，並取適量產物點於TLC平板距離底端約0.5公分處，再配製展開液以進行展開；待TLC平板乾燥後，將50%硫酸溶液均勻噴灑於TLC平板上，以150℃烘烤TLC平板，烘烤時間為10分鐘，最後觀察TLC平板上的顯色位置。此試驗所使用的展開液的成分為包含正丁醇、甲醇、氨水的水溶液，且其體積比為正丁醇：甲醇：氨水：去離子水=5：4：2：1。

試驗結果請見第十圖，樣本A為葡萄糖胺在TLC平板上展開的位置，樣本C為葡萄糖胺酸在TLC平板上展開的位置，而樣本B則是葡萄糖胺與本發明葡萄糖胺氧化酵素反應6小時之後的產物；樣本B中，於葡萄糖胺酸的展開位置上有觀察到色帶，表示樣本B中的葡萄糖胺確實被酵素轉化為葡萄糖胺酸，但是樣本B對應葡萄糖胺展開的位置仍有觀察到色帶，表示樣本B的葡萄糖胺受質並未被完全轉化，可再提高酵素作用濃度，以將受質完全轉化。

又，以下為擴大化生產葡萄糖胺酸的試驗，其試驗條件如下：準備20毫升的反應溶液，反應溶液由50 mM 的Tris緩衝液(pH 8.0)緩衝液、20活性單位本發明葡萄糖胺氧化酵素、1.0 wt%葡萄糖胺及300活性單位過氧化氫酵素所組成；將反應溶液於30℃下作用，且作用的同時以200 rpm的轉速攪拌反應溶液，反應中以添加1 N 氫氧化鈉維持反應溶液PH值在 8.0，定時取出反應溶液進行產物分析。

請參見第十一圖，為擴大化生產葡萄糖胺酸試驗所得到的產物的薄層色層層析分析結果，第十一圖中的樣本A者為葡萄糖胺酸標準品、樣本C者為葡萄糖胺，而樣本B者為大範圍生產葡萄糖胺酸試驗的產物；根據第十一圖的結果，於上述的作用條件下，反應4小時後可將反應溶液中的葡萄糖胺完全轉化生成葡萄糖胺酸。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1. 本發明源自 Aspergillus terreusNUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素，對葡萄糖胺有極高的氧化活性，且對於殼聚糖、葡萄糖與纖維二糖並無氧化活性，另在酵素的N端胺基序列分析也呈現出是一種全新的序列，確實是一種新型的葡萄糖胺氧化酵素。

2. 本發明也揭露此源自 Aspergillus terreusNUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素，在適當的反應條件下，能有效的將葡萄糖胺轉化為葡萄糖胺酸，因此具有高度的商業價值。

3. 本發明揭露的使用葡萄糖胺氧化酵素生成葡萄糖胺酸的方法，成本低且對環境不會造成危害。

綜上所述，本發明 Aspergillus terreusNUK-1204菌株、源自NUK-1204菌株的葡萄糖胺氧化酵素及其生產方法，以及使用NUK-1204菌株葡萄糖胺氧化酵素生產葡萄糖胺酸的方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

無

第一圖：本發明NUK-1204菌株型態示意圖。

第二圖：固態培養基水分含量影響葡萄糖胺氧化酵素活性分析圖。

第三圖：培養時間影響葡萄糖胺氧化酵素活性分析圖。

第四圖：純化後葡萄糖胺氧化酵素的凝膠電泳分析圖。

第五圖：液態發酵之培養基氮源影響寡糖氧化酵素產量之分析圖。

第六圖：反應酸鹼值影響葡萄糖胺氧化酵素活性分析圖。

第七圖：反應溫度影響葡萄糖胺氧化酵素活性分析圖。

第八圖：葡萄糖胺氧化酵素酸鹼值穩定性分析圖。

第九圖：葡萄糖胺氧化酵素溫度穩定性分析圖。

第十圖：葡萄糖胺氧化酵素轉化葡萄糖胺為葡萄糖胺酸之薄層色層分析圖。

第十一圖：擴大化生產葡萄糖胺酸產物的薄層色層的分析圖。

寄存單位：財團法人食品工業發展研究所

寄存日期：中華民國 111 年 3 月 2 日

寄存編號：BCRC 930228

Claims

一種 Aspergillus terreusNUK-1204菌株，其係生產一葡萄糖胺氧化酵素，且該NUK-1204菌株的寄存編號為BCRC 930228。
一種製備葡萄糖胺氧化酵素的方法，其包含下述步驟：步驟一：將一 Aspergillus terreusNUK-1204菌株接種於一培養基中，其中該NUK-110菌株寄存編號為BCRC 930228；以及步驟二：將該NUK-1204菌株於溫度25℃-35℃培養3~6天，以獲得一葡萄糖胺氧化酵素。
如請求項2所述之方法，其中該培養基係選自含有麩皮與水組成之固態培養基、或含有麩皮組成且添加有磷酸鹽之液態培養基。
如請求項2或3所述之方法，其中步驟二，該NUK-1204菌株於培養3~6天之後，收集其菌體並以一萃取溶液萃取該菌體，以獲得該葡萄糖胺氧化酵素。
如請求項4所述之方法，該菌體以該萃取溶液萃取後獲得一萃取物，該萃取物係進一步進行一純化程序，以獲得一純化後的該葡萄糖胺氧化酵素，其中該純化程序係依序將該萃取物進行硫酸銨[(NH ₄) ₂SO ₄]沉澱劃分、Toyopearl phenyl-650M疏水性管柱層析、Toyopearl phenyl-650M管柱層析濃縮、Fractogel TSK HW-55分子篩管柱層析、Farcgel TSK DEAE-650M陰離子管柱層析以及Ultrogel hydroxyapatite管柱層析。
一種以請求項2~5任一項所述之方法製備的葡萄糖胺氧化酵素，該葡萄糖胺氧化酵素的分子量為54 kDa，且含有FAD輔成基，該葡萄糖胺氧化酵素對於葡萄糖胺的催化反應速率K _m為2.6 mM，以及K _cat為0.2 S ^-1。
如請求項6所述的葡萄糖胺氧化酵素，其胺基酸序列為SEQ ID NO:1。
如請求項6所述的葡萄糖胺氧化酵素，其可催化基質受質包含葡萄糖胺以及幾丁三糖。
一種生產葡萄糖胺酸的方法，其係將分離自 Aspergillus terreusNUK-1204菌株的一葡萄糖胺氧化酵素與一葡萄糖胺基質受質進行反應，以獲得葡萄糖胺酸，其中該NUK-1204菌株的寄存編號為BCRC 930228。
如請求項9所述的方法，其中該葡萄糖胺氧化酵素係與該葡萄糖胺基質受質係於酸鹼值pH9~11、作用溫度20~50℃進行反應，以將該葡萄糖胺基質受質轉化為該葡萄糖胺酸。