TW202336032A - 白細胞介素2突變體以及含有其的複合物 - Google Patents

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Abstract

本發明是有關於分子生物學技術領域，具體是有關於白細胞介素2突變體以及含有其的複合物。本發明提供一種白細胞介素2突變體、含有該突變體的共軛物、含有該突變體的複合物、以及該突變體、共軛物或複合物在製備用於刺激機體免疫系統的組合物、製備用於治療癌症、自身免疫性疾病的藥物中的用途。本發明通過在IL2突變體與IL2Rα突變體之間形成共價二硫鍵連接，提高IL2與IL2Rα之間的親和力，解決相關融合蛋白中存在游離輕鏈的問題，進而提高IL2與IL2Rα相關融合蛋白的純度和穩定性。

Description

白細胞介素2突變體以及含有其的複合物
本發明是有關於分子生物學技術領域，具體是有關於白細胞介素2突變體以及含有其的複合物。
細胞激素在人體免疫調節中起重要作用，同時也參與腫瘤的免疫調控，與腫瘤的發生、發展密切相關。在免疫療法中，細胞激素可直接作用於腫瘤微環境中的免疫效應細胞，增強腫瘤抑制效果。通過臨床研究以及動物實驗，許多細胞激素已被證明具有顯著的抗腫瘤活性，已有多個細胞激素獲得FDA批准上市。
白細胞介素2(IL2)是一個約15.5-16 kDa的細胞激素，最早於1976年被Morgan等發現，具有增強免疫的作用。IL2具有許多免疫刺激和免疫調節功能，它能刺激T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)和B細胞的增殖並增強其功能。
IL2是四個α螺旋束細胞激素家族(four α-helix bundle family of cytokines)中的成員之一。IL2需通過與其受體結合發揮生物學活性。IL2受體由三個受體亞基組成：IL2受體α (IL2Rα，也稱CD25，55kDa)、IL2受體β (IL2Rβ，也稱CD122)和IL2受體γ(IL2Rγ，也稱CD132)。IL2受體α是一種單通道I型膜蛋白，包含2個Sushi結構域，是IL2與之結合並發揮生物學功能所必需的結構域。
IL2由於高劑量給藥產生毒副作用等原因未被廣泛應用，但近年來，由於人們對IL2及其受體亞型的深入研究，發現修飾的IL2的選擇性免疫刺激能力提高，這使得IL2受體重新被研究，並用於構建融合蛋白。然而，IL2與IL2受體相關的融合蛋白類型有待豐富，穩定性也有待提高。
本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提供一種白細胞介素2突變體、含有該突變體的共軛物、含有該突變體的複合物、以及該突變體、共軛物或複合物在製備用於刺激機體免疫系統的組合物、製備用於治療癌症、自身免疫性疾病的藥物中的用途。
本發明第一方面提供一種白細胞介素2突變體。根據本發明的實施方案，與野生型白細胞介素2的胺基酸序列相比，所述白細胞介素2突變體的胺基酸序列中第75位的胺基酸突變為半胱胺酸。
根據本發明的實施方案，所述野生型白細胞介素2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
野生型白細胞介素2的胺基酸序列（SEQ ID NO: 1）如下所示： APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
白細胞介素2突變體的胺基酸序列（SEQ ID NO: 25）如下所示： APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQCKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
本發明第二方面提供一種共軛物。根據本發明的實施方案，所述共軛物包括第一方面所述的白細胞介素2突變體。
根據本發明的實施方案，所述共軛物進一步包括第一抗原結合模組。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組直接或通過接頭間接地與所述白細胞介素2突變體的一端相連。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為第一抗體或其抗原結合片段的可變區。
根據本發明的實施方案，所述第一抗體或其抗原結合片段靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面的第一抗原。
所述免疫細胞包括T細胞、NK細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞。
本發明提供的共軛物含有白細胞介素2突變體和抗體或其抗原結合片段，通過抗體或其抗原結合片段與免疫細胞結合，從而刺激免疫細胞，例如刺激T細胞增殖，達到增強免疫的效果，可以用於治療一些自身免疫性疾病。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原選自TIGIT、CD47、PDL1、PD-1、GUCY2C或BCMA中的任一種或幾種。
本發明協力廠商面提供一種複合物。根據本發明的實施方案，所述複合物包括第一方面所述的白細胞介素2突變體或第二方面所述的共軛物。
根據本發明的實施方案，所述複合物進一步包括白細胞介素2受體α突變體，所述白細胞介素2受體α突變體通過二硫鍵與所述白細胞介素2突變體相連。
發明人發現，在表達IL2與IL2Rα相關融合蛋白過程中會出現游離輕鏈，導致融合蛋白純度較低；而游離輕鏈的出現考慮是由於IL2與IL2Rα之間的非共價結合作用力較弱導致的，因此，通過在IL2與IL2Rα之間設計二硫鍵改造，使非共價連接的IL2與IL2Rα之間形成共價二硫鍵連接，提高IL2與IL2Rα之間的親和力，解決游離輕鏈的問題，進而提高融合蛋白的純度和穩定性。在一些實施方式中，通過將野生型白細胞介素2的第75位的絲胺酸突變為半胱胺酸，獲得一種白細胞介素2突變體，該位置突變後的半胱胺酸與在白細胞介素2受體α突變體N端延伸出的半胱胺酸之間形成二硫鍵。
根據本發明的實施方案，與野生型白細胞介素2受體α的胺基酸序列相比，所述白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸兩個或三個胺基酸。根據本發明的實施方案，所述二硫鍵形成於所述白細胞介素2受體α突變體的延伸的第2位胺基酸與所述白細胞介素2突變體的第75位胺基酸之間；根據本發明的實施方案，所述第2位胺基酸為從野生型白細胞介素2受體α的N端開始往延伸的方向延伸的第2個胺基酸。
根據本發明的實施方案，所述野生型白細胞介素2受體α的胺基酸序列如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示。
SEQ ID NO: 2的胺基酸序列如下所示： ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
SEQ ID NO: 3的胺基酸序列如下所示： ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQ
SEQ ID NO: 2為野生型白細胞介素2受體α胞外結構域的成熟全截短形式的胺基酸序列，SEQ ID NO: 3為野生型白細胞介素2受體α胞外結構域的成熟形式的胺基酸序列。
根據本發明的實施方案，示例性的野生型白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO: 26所示。
SEQ ID NO：26的胺基酸序列如下所示： CGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
根據本發明的實施方案，所述複合物進一步包括第二抗原結合模組。
根據本發明的實施方案，所述第二抗原結合模組直接或通過接頭間接地與所述白細胞介素2受體α突變體的一端相連。
根據本發明的實施方案，當所述第二抗原結合模組直接與所述白細胞介素2受體α突變體的N端相連時，所述白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸兩個胺基酸，其中，延伸的第2位胺基酸為半胱胺酸，延伸的第1位胺基酸為非極性脂肪酸胺基酸、芳香族胺基酸、R基不帶電荷的胺基酸、R基帶正電荷的胺基酸或R基帶負電荷的胺基酸中的任一種。
根據本發明的實施方案，當所述第二抗原結合模組通過接頭間接地與所述白細胞介素2受體α突變體的N端相連時，所述白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸三個胺基酸，其中，延伸的第2位胺基酸為半胱胺酸，延伸的第1位和第3位胺基酸為非極性脂肪酸胺基酸、芳香族胺基酸、R基不帶電荷的胺基酸、R基帶正電荷的胺基酸或R基帶負電荷的胺基酸中的任一種。
根據本發明的實施方案，所述接頭可以是Linker，所述Linker為柔性Linker，所述柔性Linker的長度和具體胺基酸序列不限，本領域常用的柔性Linker均可用於本發明中。
根據本發明的實施方案，所述柔性Linker的胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示。
SEQ ID NO: 29的胺基酸序列如下所示： GGGGSGGGGSGGGGSGGG（SEQ ID NO: 29）
根據本發明的實施方案，所述非極性脂肪酸胺基酸可以是甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸等，但本發明提及的非極性脂肪酸胺基酸種類並不限於此。
根據本發明的實施方案，所述芳香族胺基酸可以是苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸等，但本發明提及的芳香族胺基酸種類並不限於此。
根據本發明的實施方案，所述R基不帶電荷的胺基酸可以是絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、脯胺酸、天冬胺酸、穀胺醯胺等，但本發明提及的R基不帶電荷的胺基酸種類並不限於此。
根據本發明的實施方案，所述R基帶正電荷的胺基酸可以是賴胺酸、精胺酸、組胺酸等，但本發明提及的R基帶正電荷的胺基酸種類並不限於此。
根據本發明的實施方案，所述R基帶負電荷的胺基酸可以是天冬胺酸、谷胺酸等，但本發明提及的R基帶負電荷的胺基酸種類不限於此。
根據本發明的實施方案，所述第二抗原結合模組為第一抗體或其抗原結合片段的可變區。
根據本發明的實施方案，所述第一抗體或其抗原結合片段靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面的第一抗原。
所述免疫細胞包括T細胞、NK細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原選自TIGIT、CD47、PDL1、PD-1、GUCY2C或BCMA中的任一種或幾種。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組選自所述第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區，所述第二抗原結合模組選自所述第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區；或所述第一抗原結合模組選自所述第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區，所述第二抗原結合模組選自所述第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為TIGIT抗體的輕鏈可變區（VL），所述第二抗原結合模組為所述TIGIT抗體的重鏈可變區（VH）。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為所述TIGIT抗體的重鏈可變區（VH），所述第二抗原結合模組為所述TIGIT抗體的輕鏈可變區（VL）。
示例性的TIGIT抗體包括但不限於：申請號為202211161371.9的中國專利中的TIGIT抗體、抗體tiragolumab、抗體Vibostolimab、抗體ociperlimab等。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為CD47抗體的輕鏈可變區（VL），所述第二抗原結合模組為所述CD47抗體的重鏈可變區（VH）。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為所述CD47抗體的重鏈可變區（VH），所述第二抗原結合模組為所述CD47抗體的輕鏈可變區（VL）。
示例性的CD47抗體包括但不限於：公告號為CN113004406B的中國專利中的CD47抗體中的CD47抗體、抗體magrolimab、CC9002、IBI188、lemzoparlimab、AK117等。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為PDL1抗體的輕鏈可變區（VL），所述第二抗原結合模組為所述PDL1抗體的重鏈可變區（VH）。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為所述PDL1抗體的重鏈可變區（VH），所述第二抗原結合模組為所述PDL1抗體的輕鏈可變區（VL）。
示例性的PDL1抗體包括但不限於：申請號為202111580114.4的中國專利中的PDL1抗體、抗體cemiplimab、抗體balstilima、抗體islelizumab、抗體pucotenlimab等。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為PD-1抗體的輕鏈可變區（VL），所述第二抗原結合模組為所述PD-1抗體的重鏈可變區（VH）。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為所述PD-1抗體的重鏈可變區（VH），所述第二抗原結合模組為所述PD-1抗體的輕鏈可變區（VL）。
示例性的PD1抗體包括但不限於：公告號為WO2021121373A1的國際專利中的PD1抗體、抗體pembrolizumab、抗體Nivolumab、抗體Atezolizumab、抗體avelumab、抗體Durvalumab等。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為GUCY2C抗體的輕鏈可變區（VL），所述第二抗原結合模組為所述GUCY2C抗體的重鏈可變區（VH）。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為所述GUCY2C抗體的重鏈可變區（VH），所述第二抗原結合模組為所述GUCY2C抗體的輕鏈可變區（VL）。
示例性的GUCY2C抗體包括但不限於：申請號為202310004900.2的中國專利中的GUCY2C抗體、專利WO2019224716A8中的GUCY2C抗體、抗體Indusatumab等。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為BCMA抗體的輕鏈可變區（VL），所述第二抗原結合模組為所述BCMA抗體的重鏈可變區（VH）。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組為所述BCMA抗體的重鏈可變區（VH），所述第二抗原結合模組為所述BCMA抗體的輕鏈可變區（VL）。
示例性的BCMA抗體包括但不限於：申請號為202011484592.0的中國專利中的BCMA抗體、抗體Belantamab、抗體MEDI2228等。
根據本發明的實施方案，所述第一抗原結合模組直接或通過接頭間接地與所述白細胞介素2突變體的N端相連。
根據本發明的實施方案，所述第二抗原結合模組直接或通過接頭間接地與所述白細胞介素2受體α突變體的N端相連。
根據本發明的實施方案，所述複合物進一步包括Fc區，所述Fc區通過鉸鏈區與所述白細胞介素2突變體或所述白細胞介素2受體α突變體的另一端相連。
根據本發明的實施方案，所述複合物進一步包括Fc區，所述Fc區通過鉸鏈區與所述白細胞介素2突變體或所述白細胞介素2受體α突變體的C端相連。
根據本發明的實施方案，所述複合物為雙抗分子，所述雙抗分子進一步包括第二抗體或其抗原結合片段，所述第二抗體或其抗原結合片段靶向免疫細胞或腫瘤細胞表面的第二抗原。
根據本發明的實施方案，所述雙抗分子的所述第二抗體和所述第一抗體特異性結合的抗原不同。
根據本發明的實施方案，所述免疫細胞或腫瘤細胞表面的第二抗原包括PDL1、CD47、PD-1、TIGIT、BCMA或GUCY2C中的任一種或幾種。根據本發明的實施方案，靶向第二抗原的示例性的PDL1抗體、CD47抗體、PD-1抗體、TIGIT抗體、BCMA抗體或GUCY2C抗體可以與上述靶向第一抗原的示例性PDL1抗體、CD47抗體、PD-1抗體、TIGIT抗體、BCMA抗體或GUCY2C抗體相同。
所述免疫細胞包括T細胞、NK細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞。
根據本發明的實施方案，所述雙抗分子包含第一肽鏈、第二肽鏈、第三肽鏈和第四肽鏈。
根據本發明的實施方案，所述第一肽鏈為：第一抗原模組-白細胞介素2突變體；所述第二肽鏈為：第二抗原模組-白細胞介素2受體α突變體-鉸鏈區-Fc區；所述第三肽鏈為：第二抗體的重鏈可變區-CH1-鉸鏈區-Fc區；所述第四肽鏈為：第二抗體的輕鏈可變區-CL。
根據本發明的實施方案，所述第一肽鏈為：第一抗原模組-白細胞介素2受體α突變體；所述第二肽鏈為：第二抗原模組-白細胞介素2突變體-鉸鏈區-Fc區；所述第三肽鏈為：第二抗體的重鏈可變區-CH1-鉸鏈區-Fc區；所述第四肽鏈為：第二抗體的輕鏈可變區-CL。
根據本發明的實施方案，所述鉸鏈區的胺基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
根據本發明的實施方案，所述Fc區為免疫球蛋白Fc區，所述免疫球蛋白Fc區為天然胺基酸序列或其突變序列。
根據本發明的實施方案，所述免疫球蛋白Fc區來源於人或動物。
根據本發明的實施方案，所述Fc區的胺基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
根據本發明的實施方案，所述CL為免疫球蛋白λ輕鏈或κ輕鏈的恒定區。
根據本發明的實施方案，所述免疫細胞或腫瘤細胞表面的第二抗原為PDL1。
根據本發明的實施方案，所述第二抗體的重鏈可變區（VH）的胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示，所述第二抗體的重鏈可變區（VL）的胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示。
本發明第四方面提供一種核酸分子。根據本發明的實施方案，所述核酸分子包括編碼第一方面所述的白細胞介素2突變體、第二方面所述的共軛物、或者協力廠商面所述的複合物的核苷酸序列。
本發明第五方面提供一種載體。根據本發明的實施方案，所述載體包括第四方面所述的核酸分子。
本發明第六方面提供一種宿主細胞。根據本發明的實施方案，所述宿主細胞包括第四方面所述的核酸分子和/或第五方面所述的載體。
本發明第七方面提供一種組合物。根據本發明的實施方案，所述組合物包括第一方面所述的白細胞介素2突變體、第二方面所述的共軛物、或者協力廠商面所述的複合物。
本發明第八方面提供第一方面所述的白細胞介素2突變體、第二方面所述的共軛物、協力廠商面所述的複合物在製備用於刺激機體免疫系統的組合物中的用途。
本發明第九方面提供第一方面所述的白細胞介素2突變體、第二方面所述的共軛物、協力廠商面所述的複合物在製備用於治療癌症、自身免疫性疾病的藥物中的用途。
根據本發明的實施方案，所述癌症包括選自以下中的至少之一：黑素瘤、腎細胞癌、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌等，但本發明中的癌症種類並不限於此。
根據本發明的實施方案，所述自身免疫性疾病包括選自以下中的至少之一：類風濕性關節炎、克羅恩病、銀屑病、銀屑病關節炎、多發性硬化、紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、強直性脊柱炎、I型糖尿病、乾燥綜合征、潰瘍性結腸炎、視神經脊髓炎、乳糜瀉、硬皮病、顳動脈炎、特應性皮炎、斑禿、移植物抗宿主病、自身免疫性肝炎、原發性硬化性膽管炎或炎性肌病等，但本發明中的自身免疫性疾病種類並不限於此。
本發明第十方面提供一種在受試者中診斷、治療或預防癌症、自身免疫性疾病的症狀的方法，包括向受試者施用治療有效量的第七方面所述的組合物。
本發明第十一方面提供一種生產多肽的方法，包括在表達核酸分子的條件下培養第六方面所述的宿主細胞。
本發明提供的白細胞介素2突變體以及含有其的複合物提高了IL2與IL2Rα之間的親和力，解決游離輕鏈的問題，進而提高融合蛋白的純度和穩定性。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐瞭解到。
下面參考具體實施例，對本發明進行描述，需要說明的是，這些實施例僅是描述性的，而不以任何方式限制本發明。
實施例的實驗中所用到的試劑，如無特殊說明，均可通過市售獲得。
此外，術語“第一”、“第二”僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有“第一”、“第二”的特徵可以明示或者隱含地包括至少一個該特徵。在本公開的描述中，“多個”的含義是至少兩個，例如兩個，三個等，除非另有明確具體的限定。
術語 如本文所用，除非另有說明，術語“白細胞介素2”或“IL2”是指來自任何脊椎動物來源的任何天然IL2，包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)。在一些具體的實施例中，IL2為人IL2，示例性人野生型IL2的胺基酸序列顯示在SEQ ID NO:1中。
如本文所用，術語“IL2突變體”旨在包括各種形式的IL2分子的任何形式的修飾，包括全長的IL2、截短的IL2以及IL2通過融合或化學偶聯等方式與另一分子連接的形式。“全長”在指IL2時，是指成熟的、自然長度的IL2分子。各種形式的IL2突變體的特徵是至少有一個胺基酸突變影響IL2與IL2Rα的相互作用。這種突變可能涉及通常位於該位置的野生型胺基酸殘基的取代、缺失、截斷或修飾。在一些實施例中，通過胺基酸取代獲得IL2突變體或變體。在此可以使用不同的名稱來表示同一突變。例如，從75位絲胺酸到半胱胺酸的突變可以指示為75C，S75C或Ser75Cys。
本文中，“IL2Rα”是指白細胞介素2受體α，也稱為“α受體亞基”；“IL2Rβ”是指白介素2受體β，也稱為“β受體亞基”；“IL2Rγ”是指白介素2受體γ，也稱為“γ受體亞基”；“IL2Rβγ”是指白介素2受體β和受體γ形成的複合物，也稱為“β和γ受體亞基複合物”。在一些具體的實施例中，IL2Rα為人IL2Rα，示例性野生型IL2Rα的胺基酸序列如SEQ ID NO:2或3所示。
如本文所用，術語“IL2Rα突變體”旨在包括各種形式的IL2Rα分子的任何形式的修飾，包括全長的IL2Rα、截短的IL2Rα以及IL2Rα通過融合或化學偶聯等方式與另一分子連接的形式。“全長”在指IL2Rα時，是指成熟的、自然長度的IL2Rα分子。各種形式的IL2Rα突變體的特徵是至少有一個胺基酸突變影響IL2與IL2Rα的相互作用。這種突變可能涉及通常位於該位置的野生型胺基酸殘基的取代、缺失、截斷或修飾。在一些實施例中，通過胺基酸延伸或取代獲得IL2Rα突變體或變體。
術語“抗體”以最廣義使用，並包括完全組裝的抗體、四聚體抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、可以結合抗原的抗體片段(例如，Fab'、F'(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙抗體、Fab)和包含前述的重組肽，只要其展現出所需的生物活性即可。“免疫球蛋白”或“四聚體抗體”是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體糖蛋白，各自包含可變區和恒定區。抗原結合部分可以通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶促或化學切割產生。抗體片段或抗原結合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv，結構域抗體(dAb)、互補決定區(CDR)片段、CDR-移植抗體、單鏈抗體(scFv)、單鏈抗體片段、嵌合抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、線性抗體；螯合重組抗體、三鏈抗體(tribody)或雙鏈抗體(bibody)、胞內抗體、納米抗體、小模組化免疫藥物(SMIP)、抗原結合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝化抗體、含VHH抗體或其變異體或衍生物，和含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，其足以賦予與多肽結合的特異性抗原，如一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR序列，只要所述抗體保留所需的生物學活性即可。
如本文所用，“重鏈可變區”是指抗體分子的區域，其包含所述抗體重鏈可變結構域的至少一個互補決定區(CDR)。重鏈可變區可含有所述抗體重鏈的一個、兩個或三個CDR。
如本文所用，“輕鏈可變區”是指抗體分子的區域，其包含所述抗體輕鏈可變結構域的至少一個互補決定區(CDR)。輕鏈可變區可含有所述抗體輕鏈的一個、兩個或三個CDR，取決於抗體，其可以是κ或λ輕鏈。
本文所述的“抗體”也稱為免疫球蛋白，是四聚體糖蛋白。在天然存在的免疫球蛋白中，每個四聚體由兩對相同的多肽鏈構成，每對具有一個“輕”鏈(約25kDa)和一個“重”鏈(約50-70kDa)。每條重鏈在一端具有可變結構域(VH)，緊接著是許多恒定結構域。每條輕鏈在一端具有可變結構域(VL)，在另一端具有恒定結構域；輕鏈的恒定結構域與重鏈的第一恒定結構域對準，並且輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域對準。特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結構域之間形成介面(Chothia等人,《分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)》196:901-917,1987)。
免疫球蛋白可變結構域展現出由三個高變區或CDR連接的相對保守的框架區(FR)的相同的一般結構。從N末端到C末端，輕鏈和重鏈均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每個結構域的胺基酸分配符合Kabat免疫目的蛋白質序列(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)的定義(馬里蘭州貝塞斯達的美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, Bethesda, Md.)(1987和1991)；或Chothia和Lesk,《分子生物學雜誌》,196:901-917,1987；Chothia等人,《自然》,342:878-883,1989)。
抗體的高變區是指抗體的負責抗原結合的CDR胺基酸殘基。高變區包含來自CDR的胺基酸殘基，例如，輕鏈可變結構域中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重鏈可變結構域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3) (如Kabat等人,《免疫目的的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版公共衛生署,美國國家衛生研究院,馬里蘭州貝塞斯達(1991)所述)；和/或來自高變環的殘基，例如，輕鏈可變區中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變結構域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3) (如Chothia等人,《分子生物學雜誌》196:901-917(1987)所述)。
單克隆抗體是指從基本上同質的抗體群獲得的抗體，其中混合物中的所有抗體具有衍生自單個克隆的單個胺基酸序列。單克隆抗體通常是高度特異性的，並且針對單個抗原位點或表位。相反，多克隆抗體製劑通常包括針對相同或不同決定簇(表位)的具有不同胺基酸序列的抗體的混合物。除了其特異性之外，單克隆抗體的優點在於其在同源培養物中合成，不受具有不同特異性和特徵的其它免疫球蛋白的污染。
非極性脂肪酸胺基酸的單字母縮寫分別為甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、亮胺酸(L)、異亮胺酸(I)、甲硫胺酸(M)；芳香族胺基酸的單字母縮寫分別為苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)、酪胺酸(Y)；R基不帶電荷的胺基酸的單字母縮寫分別為是絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、半胱胺酸(C)、脯胺酸(P)、天冬胺酸(N)、穀胺醯胺(Q)；R基帶正電荷的胺基酸的單字母縮寫分別為賴胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)；R基帶負電荷的胺基酸的單字母縮寫分別為天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)。
如本文所用，術語“鉸鏈區(Hinge)”是指免疫球蛋白重鏈CH1區和CH2區之間的區域，該區包括H鏈間二硫鍵，富含脯胺酸，不形成α螺旋，易發生伸展及一定程度扭曲，有利於抗體的抗原結合部位與抗原表位間的互補性結合。
如本文所用，術語“Fc區”是指包含免疫球蛋白的重鏈恒定區2(CH2)和重鏈恒定區3(CH3)的蛋白質，不包括重鏈和輕鏈可變區、重鏈恒定區1(CH1)和輕鏈恒定區(CL)。在本發明中，Fc片段意味著不僅包括天然胺基酸序列，還包括其突變序列。免疫球蛋白Fc區可以來源於人或動物,例如牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠或豚鼠。
如本文所用，術語“恒定區”是指多肽鏈的羧基末端（C端），H鏈的3/4或者4/5和L鏈的1/2區段，此區段胺基酸的數量、種類、排列順序、構型及含糖量相對比較穩定，故稱此區段為恒定區，即C區。H鏈和L鏈的C區分別用CH和CL表示。不同類免疫球蛋白的CH長度不一，IgG、IgA和IgD的CH有3個，包括CH1、CH2和CH3;IgM和IgE的CH有4個，包括CH1、CH2、CH3和CH4。每條重鏈由一個可變區(VH)以及第一、第二、第三和第四(可選地)恒定區(分別為CH1、CH2、CH3、CH4)組成。通常，天然的完整抗體呈“Y”型，“Y”型結構的莖部由通過二硫鍵結合的兩條重鏈的第二和第三恒定區組成。“Y”型結構的每條臂包括重鏈的VH和CH1(VH-CH1)以及輕鏈（VL-CL）。哺乳動物的輕鏈可分為λ鏈或κ鏈，而每條輕鏈由一個可變區(VL)以及一個恒定區（CL）組成。
如本文所用，術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸（PNA）。編碼多肽或融合蛋白的核酸指編碼多肽或融合蛋白的一個或更多個核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的一個或更多個核酸分子，和存在於宿主細胞中一個或更多個位置的這樣的一個或更多個核酸分子。除非另有說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體（例如，簡並密碼子取代）和互補序列以及明確指明的序列。
如本文所用，術語“載體”是指可將遺傳元件（例如前述核酸分子）操作性地插入其中並使該遺傳元件獲得表達的一種運載工具，例如產生由該遺傳元件編碼的蛋白質、RNA或DNA，或者複製所述遺傳元件。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳元件在宿主細胞內得以表達。舉例來說，載體包括：質粒、噬菌粒、柯斯質粒(cosmid)、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生的人工染色體(PAC)、噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體，以及動物病毒等。載體可含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還可包括協助其進入細胞的成分，包括但不限於，病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼。載體可以是表達載體或克隆載體。在一些實施方案中，本發明提供的載體(例如表達載體)含有本發明所述的編碼融合蛋白的核酸序列、至少一個可操作地連接至所述核酸序列的啟動子(例如，SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一個選擇標記。
如本文所用，術語“宿主細胞”是指可以或已經導入外源多核苷酸和/或載體的細胞。該宿主細胞中包含有該載體，可以將載體導入到哺乳動物細胞中，構建獲得宿主細胞，然後利用這些宿主細胞表達本發明提供的抗體或者抗原結合片段。對該宿主細胞進行培養，即可以獲得相應抗體或融合蛋白。可用的哺乳動物細胞可以為CHO細胞等。
如本文所用，術語“組合物”是以允許活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對將施用所述組合物的物件具有不可接受的毒性的另外的成分。
在一些具體的實施方式中，上述組合物還包括藥學上可接受的載體。
如本文所用，術語“藥學上可接受的載體”指藥學配製劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分，包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑、防腐劑、或生理學上相容的任何溶劑等。
如本文所用，術語“治療”是指暫時或永久地、部分或完全地消除、減少、抑制或改善事件、疾病或病狀的臨床症狀、表現或進展。
如本文所用，術語“診斷”是指病理狀態、疾病或狀況的鑒定、揭示、查明和/或定義致病過程的定位。在一些具體的實施方式中，本發明中的藥物組合物施用於受試者或接觸來自受試者的樣品時，有助於診斷癌症、腫瘤形成或狀況。
如本文所用，術語“有效量”、“有效劑量”或“有效劑量”定義為足以實現或至少部分實現所需效果的量。
在許多實施例中,術語“受試者”和“患者”可互換使用,而不管受試者是否已經或當前正在接受任何形式的治療。如本文所用，術語“受試者”或“患者”是指哺乳動物受試者或患者。除非指出時，否則所述術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。示例性受試者包括但不限於人、猴、犬、貓、小鼠、大鼠、牛、馬、駱駝、禽、山羊和綿羊。在某些實施方案，所述受試者是人。在一些實施方案，所述受試者是疑似患有癌症、自體免疫性疾病或病況、和/或感染的人。
下面將結合實施例對本公開的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本公開，而不應視為限定本公開的範圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例 1 、二硫鍵改造 IL2/IL2Rα 複合物的構建在IL2、IL2Rα之間設計二硫鍵改造（將野生型白細胞介素2的胺基酸序列(SEQ ID NO：1)中第75位的胺基酸突變為半胱胺酸，得到白細胞介素2突變體，示例性白細胞介素2突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO：25所示)；並將白細胞介素2受體α的胺基酸序列(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)的N端延伸兩個或三個胺基酸，其中，延伸的第2位胺基酸為半胱胺酸(第2位胺基酸是指從野生型白細胞介素2受體α的N端開始往延伸的方向延伸的第2個胺基酸)，得到白細胞介素2受體α突變體，示例性白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO：26所示），使非共價連接的IL2和IL2Rα之間形成共價二硫鍵連接。
SEQ ID NO：1的胺基酸序列如下所示： APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
SEQ ID NO：2的胺基酸序列如下所示： ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
SEQ ID NO：3的胺基酸序列如下所示： ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQ
SEQ ID NO：25的胺基酸序列如下所示： APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQCKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
SEQ ID NO：26的胺基酸序列如下所示： CGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
示例性的闡述一種二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物的構建方法，複合物的示例性結構圖如圖1A所示：靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面抗原的抗體（例如TIGIT抗體）的重鏈可變區（VH）通過Linker（linker的胺基酸序列如SEQ ID NO:29所示）連接在IL2Rα突變體上，再通過Hinge（即鉸鏈區，Hinge的胺基酸序列如SEQ ID NO:23所示）與hIgG1抗體的Fc（Fc區的胺基酸序列如SEQ ID NO:24所示）連接，上述靶向相同抗原的抗體（TIGIT抗體）的輕鏈可變區（VL）通過Linker與IL2突變體連接；靶向免疫細胞或腫瘤細胞表面抗原的抗體（例如PDL1抗體）的VH直接與hIgG1抗體的恒定區（hIgG1）連接，靶向相同抗原的抗體（PDL1抗體）的VL直接與人免疫球蛋白輕鏈kappa（CL）連接，製備具有靶向性的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物。圖1B表示靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面抗原的抗體（例如TIGIT抗體）的重鏈可變區（VH）通過Linker連接在IL2突變體上，再通過Hinge（即鉸鏈區，Hinge的胺基酸序列如SEQ ID NO:23所示）與hIgG1抗體的Fc（Fc區的胺基酸序列如SEQ ID NO:24所示）連接，上述靶向相同抗原的抗體（TIGIT抗體）的輕鏈可變區（VL）通過Linker與IL2Rα突變體連接；靶向免疫細胞或腫瘤細胞表面抗原的抗體（例如PDL1抗體）的VH直接與hIgG1抗體的恒定區（CH1-Hinge-Fc）連接，靶向相同抗原的抗體（PDL1抗體）的VL直接與人免疫球蛋白輕鏈kappa恒定區（CL）連接，製備具有靶向性的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物。
SEQ ID NO：29的胺基酸序列如下所示： GGGGSGGGGSGGGGSGGG
SEQ ID NO：23的胺基酸序列如下所示： EPKSSDKTHTCPPCPAP
SEQ ID NO：24的胺基酸序列如下所示： ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
根據以上構建方法，發明人設計了2種二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物，即二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1和二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物2；而IL2/IL2Rα複合物3為現有報導的複合物，複合物4為二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物；複合物1、2、3、4的具體組成和胺基酸序列如下：
二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1的序列結構為：TIGIT VH-IL2Rα突變體-Fc、TIGIT VL-IL2突變體、PDL1 VH-CH1-Hinge-Fc和PDL1 VL-CL；其中，TIGIT VH-IL2Rα突變體-Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，TIGIT VL-IL2突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，PDL1 VH-CH1-Hinge-Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，PDL1 VL-CL的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。PDL1的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：27所示，PDL1的VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：28所示。
SEQ ID NO：4的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGCGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：5的胺基酸序列如下所示： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQCKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
SEQ ID NO：6的胺基酸序列如下所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRAWIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：7的胺基酸序列如下所示： EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPDQSPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：27的胺基酸序列如下所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRAWIRTYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：28的胺基酸序列如下所示： EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPDQSPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物2的序列結構為：TIGIT VH-IL2突變體-Fc、TIGIT VL- IL2Rα突變體、PDL1 VH-CH1-Hinge-Fc和PDL1 VL-CL；其中，TIGIT VH-IL2突變體-Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，TIGIT VL-IL2Rα突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，PDL1 VH-CH1-Hinge-Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，PDL1 VL-CL的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
SEQ ID NO：8的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQCKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：9的胺基酸序列如下所示： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGCGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
IL2/IL2Rα複合物3的序列結構為：TIGIT VH-IL2Rα（L42C）-Fc、TIGIT VL-IL2（F42C）、PDL1 VH-CH1-Hinge-Fc和PDL1 VL-CL；其中，TIGIT VH-IL2Rα（L42C）-Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，TIGIT VL-IL2（F42C）的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，PDL1 VH-CH1-Hinge-Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，PDL1 VL-CL的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；IL2Rα（L42C）代表：將IL2Rα的胺基酸序列中第42位亮胺酸突變為半胱胺酸，IL2（F42C）代表：將IL2的胺基酸序列中第42位苯丙胺酸突變為半胱胺酸。
SEQ ID NO：10的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSCYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：11的胺基酸序列如下所示： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTCKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4的序列結構為：TIGIT VH-野生型IL2Rα-Fc、TIGIT VL-野生型IL2、PDL1 VH-CH1-Hinge-Fc和PDL1 VL-CL；其中，TIGIT VH-野生型IL2Rα-Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示，TIGIT VL-野生型IL2的胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示，PDL1 VH-CH1-Hinge-Fc的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，PDL1 VL-CL的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
SEQ ID NO：12的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：13的胺基酸序列如下所示： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
實施例 2 、 IL2/IL2Rα 複合物的製備IL2/IL2Rα目的蛋白的瞬轉表達： 針對實施例1中的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1（SEQ ID NO：4-7）、二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物2（SEQ ID NO：6-9）、IL2/IL2Rα複合物3（SEQ ID NO：6、7、10、11）和二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4（SEQ ID NO：6、7、12、13），分別設計表達這些胺基酸序列的質粒載體，將含有目的基因的質粒分別通過與轉染試劑PEI形成陽離子複合物後，導入到宿主細胞Expi293，質粒在細胞內期間，質粒上的外源基因在細胞內發生轉錄翻譯，從而得到目的蛋白。
二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1的具體製備方法為：
Expi293在37℃、8%二氧化碳、130rpm條件培養，並在轉染前通過細胞計數，將2E6的細胞接種至1L搖瓶中，培養體系約為300mL。配製轉染混合物準備轉染：首先將750μg 目標質粒加入到含有15mLOpti-MEM試劑的50mL離心管中，輕輕混勻，標記為A管；將1.5mg轉染試劑PEI加入到含有15mLOpti-MEM試劑的50mL離心管中，輕輕混勻後，室溫孵育5min，標記為B管；將B管PEI稀釋液逐滴加入到A管DNA稀釋液中，輕輕混勻後，室溫孵育15min，孵育結束後，將PEI-目標質粒混合物加入到Expi293細胞，置於37℃搖床中繼續培養。直到第七天進行收樣。
瞬轉細胞表達液經過9000rpm/20min離心，收集上清，再經過0.22μm濾膜除菌過濾，進行二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1樣品的純化。純化採用ProA親和層析，過程如下：使用AKTA avant 150層析設備，用至少5CV平衡緩衝液（10mM PBS）平衡層析柱（如MabSelectSuRe LX，GE），載入樣品至層析柱，使目標蛋白吸附在層析柱上而其他雜質穿透分離。完成上樣後使用至少5CV平衡緩衝液（10mM PBS）再次沖洗層析柱，隨後使用洗脫緩衝液（20mM NaAc，pH=3.4）洗脫目標蛋白，收集管中預先加入中和緩衝液（1M Tris，pH8.0），中和緩衝液的加入體積根據洗脫樣品的預估含量而定，一般加入10%洗脫體積量。最終得到二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1。
採用上述同樣的方法，分別得到二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物2、IL2/IL2Rα複合物3和二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4。
實施例 3 、 IL2/IL2Rα 複合物凝膠電泳檢測對實施例2製備得到的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1和2、IL2/IL2Rα複合物3、二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4進行SDS-PAGE電泳檢測。
檢測結果如圖2所示，其中，IL2/IL2Rα複合物4為未改造分子，在分子量25KD~35KD之間有條帶，說明存在游離輕鏈；二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1和2在分子量25KD~35KD之間無條帶，與IL2/IL2Rα複合物3相同，說明成功去除了游離輕鏈，二硫鍵改造成功。
對實施例2製備得到的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1進行SEC檢測。
檢測結果如圖3所示，結果說明：成功去除了游離輕鏈，且本發明製備得到的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1的純度高。
實施例 4 、二硫鍵改造 IL2/IL2Rα 複合物靶向區親和力檢測1、複合物中靶向免疫細胞或腫瘤細胞表面抗原的抗體的結合活性分析 當二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物為雙抗分子時，通過FCM實驗方法檢測雙抗分子中靶向腫瘤細胞表面抗原的抗體(抗PDL1抗體)與CHO-PDL1細胞結合活性。步驟如下：
（1）配製3%BSA緩衝液：稱取4.5 g BSA到150mL 1×PBS中，混勻後放置冰上備用；
（2）抗體稀釋：將受試抗體（二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1，簡稱R1262）、陽性對照抗體（IL2/IL2Rα複合物4，簡稱R1115）用3%BSA稀釋成初始濃度為800nM，亞型對照抗體（hIgG1抗體）用3%BSA釋成初始濃度為20μg/mL，體積300μL 3倍梯度稀釋（100μL +200μL）共10個濃度；
（3）細胞計數並鋪板：將CHO-PDL1細胞計數後，按100μL，2E+05/孔分到96孔V型板中；先將不同濃度抗體50μL加入到細胞中，2-8度孵育0.5h；350×g離心5min後，去掉上清，按200μL/孔3%BSA；350×g離心5min後，去掉上清，3%BSA配製螢光抗體PE Goat anti-human IgG Fc和PE Goat anti-mouse IgG Fc（1:500×稀釋），按100μL /孔加入對應的96孔板中，2-8度孵育30min；350g離心5min，去上清，3%BSA洗一遍細胞；350×g離心5min後，去掉上清，按100μL/孔加入1×PBS重懸細胞；按照CytoFLEX流式細胞儀標準操作規程，上機進行結合活性檢測。
檢測結果如圖4所示，結果顯示：二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1（R1262）與二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4的雙抗（R1115）相比，兩者親和力相當，說明二硫鍵改造不會影響靶向區的親和力。
2、複合物中靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面抗原的抗體的結合活性分析 當二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物為雙抗分子時，通過FCM實驗方法檢測雙抗分子中靶向免疫細胞表面抗原的抗體(抗TIGIT抗體)與CHO-TIGIT細胞結合活性。步驟如下：
（1）配製3%BSA緩衝液：稱取4.5 g BSA到150mL 1×PBS中，混勻後放置冰上備用；
（2）抗體稀釋：將受試抗體（R1262）、陽性對照抗體（R1115）用3%BSA稀釋成初始濃度為800nM，亞型對照抗體（hIgG1抗體）用3%BSA稀釋成初始濃度為20μg/mL，體積300μL，3倍梯度稀釋（100μL +200μL）共10個濃度；
（3）細胞計數並鋪板：將CHO-TIGIT細胞計數後，按100μL，2E+05/孔分到96孔V型板中；先將不同濃度抗體50μL加入到細胞中，2-8度孵育0.5h，350×g離心5min後，去掉上清，按200μL/孔3%BSA；350×g離心5min後，去掉上清，3%BSA配製螢光抗體PE Goat anti-human IgG Fc和PE Goat anti-mouse IgG Fc（1:500×稀釋），按100μL/孔加入對應的96孔板中，2-8度孵育30min；350g離心5min，去上清，3%BSA洗一遍細胞；350×g離心5min後，去掉上清，按100μL/孔加入1×PBS重懸細胞；按照CytoFLEX流式細胞儀標準操作規程，上機進行結合活性檢測。
檢測結果如圖5所示，結果顯示：二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1（R1262）與二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4（R1115）的親和力相當，說明二硫鍵改造不會影響靶向區的親和力。
3、複合物中靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面抗原的抗體的結合阻斷活性分析 當二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物為雙抗分子時，通過FCM實驗方法檢測雙抗分子中靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面抗原的抗體(抗TIGIT抗體)阻斷配體與CHO-TIGIT細胞結合活性。步驟如下：
（1）配製3%BSA緩衝液：稱取4.5 g BSA到150mL 1×PBS中，混勻後放置冰上備用；
（2）抗體稀釋：將受試抗體（R1262）、陽性對照抗體（R1115）用3%BSA稀釋成初始濃度為800nM，亞型對照抗體（hIgG1抗體）用3%BSA稀釋成初始濃度為20μg/mL，體積300μL。3倍梯度稀釋（100μL +200μL）共10個濃度；
（3）細胞計數並鋪板：將CHO-TIGIT細胞計數後，按100μL，2E+05/孔分到96孔V型板中；先將不同濃度抗體50μL加入到細胞中，2-8度孵育0.5h，再加入50μL配體，2-8度孵育0.5h；350×g離心5min後，去掉上清，按200μL/孔3%BSA；350×g離心5min後，去掉上清，3%BSA配製螢光抗體PE Goat anti-human IgG Fc和PE Goat anti-mouse IgG Fc（1:500×稀釋），按100μL/孔加入對應的96孔板中，2-8度孵育30min；350g離心5min，去上清，3%BSA洗一遍細胞；350×g離心5min後，去掉上清，按100μL/孔加入1×PBS重懸細胞；按照CytoFLEX流式細胞儀標準操作規程，上機檢測。
檢測結果如圖6所示，結果顯示：二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1（R1262）與二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4（R1115）相比，兩者對配體與靶向區結合力的阻斷效果相當。
實施例 5 、白細胞介素 2 受體 α 突變體的胺基酸序列的 N 端延伸的第 1 位和第 3 位胺基酸的種類對 IL2/IL2Rα 複合物改造後引入的二硫鍵形成的影響當第二抗原結合模組通過接頭間接地與白細胞介素2受體α突變體的N端相連時，白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸三個胺基酸；為了進一步明確白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸的第1位和第3位胺基酸的種類對IL2/IL2Rα複合物改造後引入的二硫鍵形成的影響，進行如下實驗：
1、延伸的第3位胺基酸的種類對IL2/IL2Rα複合物改造後引入的二硫鍵形成的影響 選擇延伸的第3位胺基酸為芳香族胺基酸（以苯丙胺酸為例）、R基不帶電荷的胺基酸（以絲胺酸為例）、R基帶正電荷的胺基酸（以賴胺酸為例）或R基帶負電荷的胺基酸（以天冬胺酸為例）中的任一種，構建並製備二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物5、6、7、8（簡稱依次為R1493、R1494、R1495、R1496），與二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1（IL2/IL2Rα複合物1中白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸的第3位胺基酸為甘胺酸（非極性脂肪酸胺基酸））一起作為實驗組，以二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4為對照組。
二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物5、6、7、8的製備過程與實施例2中製備二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1的過程相同。
二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物5、6、7、8的序列結構均為：TIGIT VH-IL2Rα突變體-Fc、TIGIT VL-IL2突變體（SEQ ID NO：5）、PDL1 VH-hIgG1（SEQ ID NO：6）和PDL1 VL-CL（SEQ ID NO：7）；其中，二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物5、6、7、8的TIGIT VH-IL2Rα突變體-Fc的胺基酸序列如依次SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17所示（其中，白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸的三個胺基酸以粗體示出，帶有底線的為延伸的第3位胺基酸）；
SEQ ID NO：14的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGFCGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：15的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSCGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：16的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGKCGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：17的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGDCGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
將獲得的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物5、6、7、8以及複合物1進行SDS-PAGE電泳檢測，二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4為對照組，以探究白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸的第3位胺基酸的種類對IL2/IL2Rα複合物改造後引入的二硫鍵形成的影響，實驗結果如圖7所示，可以看出，與對照組相比，二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物5、6、7、8均成功去除了游離輕鏈，二硫鍵改造成功；表明延伸的第3位胺基酸為非極性脂肪酸胺基酸、芳香族胺基酸、R基不帶電荷的胺基酸、R基帶正電荷的胺基酸或R基帶負電荷的胺基酸，均不會影響IL2/IL2Rα複合物改造後引入的二硫鍵的形成。
2、延伸的第1位和第3位元胺基酸組合的種類對IL2/IL2Rα複合物改造後的二硫鍵形成的影響 選擇延伸的第1位和第3位胺基酸為非極性脂肪酸胺基酸（以甘胺酸為例）、芳香族胺基酸（以苯丙胺酸為例）、R基不帶電荷的胺基酸（以絲胺酸為例）、R基帶正電荷的胺基酸（以賴胺酸為例）或R基帶負電荷的胺基酸（以天冬胺酸為例）中的任一種組合，構建並製備二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物9、10、11、12、13（簡稱依次為R1662、R1663、R1664、R1665、R1666），與二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1一起作為實驗組，以二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4為對照組。
二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物9、10、11、12、13的製備過程與實施例2中製備二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1的過程相同。
二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物9、10、11、12、13的序列結構均為：TIGIT VH-IL2Rα突變體-Fc、TIGIT VL-IL2突變體（SEQ ID NO：5）、PDL1 VH-hIgG1（SEQ ID NO：6）和PDL1 VL-CL（SEQ ID NO：7）；其中，二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物9、10、11、12、13的TIGIT VH-IL2Rα突變體-Fc的胺基酸序列如依次SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22所示（其中，白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸的三個胺基酸以粗體示出，帶有底線的為延伸的第1位和第3位胺基酸）；
SEQ ID NO：18的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGFCSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：19的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGKCDELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：20的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSCDELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：21的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGDCFELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：22的胺基酸序列如下所示： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSCKELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
將獲得的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物9、10、11、12、13以及複合物1進行SDS-PAGE電泳檢測，二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4為對照組，以探究白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸的第1位和第3位元胺基酸組合的種類對IL2/IL2Rα複合物改造後引入的二硫鍵形成的影響，實驗結果如圖8所示，可以看出，與對照組相比，二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物9、10、11、12、13均成功去除了游離輕鏈，二硫鍵改造成功；表明延伸的第1位和第3位胺基酸為非極性脂肪酸胺基酸、芳香族胺基酸、R基不帶電荷的胺基酸、R基帶正電荷的胺基酸或R基帶負電荷的胺基酸的任意組合，均不會影響IL2/IL2Rα複合物改造後引入的二硫鍵的形成。
在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、“一些實施方案”或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
CH1:重鏈恒定區1 CL:輕鏈恒定區 Fc:免疫球蛋白Fc區 Hinge:鉸鏈區 @PDL1-VH:PDL1抗體的重鏈可變區 @PDL1-VL:PDL1抗體的輕鏈可變區 @TGIT-VH:TIGIT抗體的重鏈可變區 @TGIT-VL:TIGIT抗體的輕鏈可變區
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中： 圖1顯示了本發明二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物的示例性結構圖。其中，圖A表示靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面抗原的抗體（例如TIGIT抗體）的重鏈可變區（VH）通過Linker連接在IL2Rα突變體上，再通過Hinge（即鉸鏈區）與hIgG1抗體的Fc連接，上述靶向相同抗原的抗體（TIGIT抗體）的輕鏈可變區（VL）通過Linker與IL2突變體連接。圖B表示靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面抗原的抗體（例如TIGIT抗體）的重鏈可變區（VH）通過Linker連接在IL2突變體上，再通過Hinge（即鉸鏈區）與hIgG1抗體的Fc連接，上述靶向相同抗原的抗體（TIGIT抗體）的輕鏈可變區（VL）通過Linker與IL2Rα突變體連接。圖A和B表示的複合物的另一側均為靶向免疫細胞或腫瘤細胞表面抗原的抗體（例如PDL1抗體）的VH直接與hIgG1抗體的恒定區（hIgG1）連接，靶向相同抗原的抗體（PDL1抗體）的VL直接與人免疫球蛋白輕鏈kappa恒定區（CL）連接。 圖2顯示了本發明實施例2中製備的純化後的二硫鍵改造與未改造IL2/IL2Rα複合物的凝膠電泳檢測結果；其中，複合物1和2為二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物，複合物3為現有報導的IL2/IL2Rα複合物，複合物4為二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物。 圖3顯示了採用本發明中二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物（複合物1）SEC檢測結果。 圖4顯示了採用本發明中二硫鍵改造與未改造IL2/IL2Rα複合物對靶向區（雙抗分子中靶向腫瘤細胞表面抗原的抗體）親和力的檢測結果；其中，R1262為二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1，R1115為IL2/IL2Rα複合物4，hIgG1為亞型對照抗體。 圖5顯示了採用本發明中二硫鍵改造與未改造IL2/IL2Rα複合物對靶向區（靶向免疫細胞表面抗原的抗體）親和力的檢測結果；其中，R1262為二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1，R1115為IL2/IL2Rα複合物4，hIgG1為亞型對照抗體。 圖6顯示了採用本發明中二硫鍵改造與未改造IL2/IL2Rα複合物對配體與靶向區（靶向免疫細胞表面抗原的抗體）結合力的阻斷檢測結果；其中，R1262為二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物1，R1115為IL2/IL2Rα複合物4，hIgG1為亞型對照抗體。 圖7顯示了本發明實施例5中製備的純化後的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物5、6、7、8以及複合物1的凝膠電泳檢測結果，二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4作為對照。 圖8顯示了本發明實施例5中製備的純化後的二硫鍵改造IL2/IL2Rα複合物9、10、11、12、13以及複合物1的凝膠電泳檢測結果，二硫鍵未改造IL2/IL2Rα複合物4作為對照。
TW202336032A_112108784_SEQL.xml
CH1:重鏈恒定區1
CL:輕鏈恒定區
Fc:免疫球蛋白Fc區
Hinge:鉸鏈區
@PDL1-VH:PDL1抗體的重鏈可變區
@PDL1-VL:PDL1抗體的輕鏈可變區
@TGIT-VH:TIGIT抗體的重鏈可變區
@TGIT-VL:TIGIT抗體的輕鏈可變區

Claims (18)

  1. 一種白細胞介素2突變體，其中，與野生型白細胞介素2的胺基酸序列相比，所述白細胞介素2突變體的胺基酸序列中第75位的胺基酸突變為半胱胺酸。
  2. 如請求項1所述的白細胞介素2突變體，其中，所述野生型白細胞介素2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 任選地，所述白細胞介素2突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。
  3. 一種共軛物，其中，所述共軛物包括請求項1或2所述的白細胞介素2突變體。
  4. 如請求項3所述的共軛物，其中，所述共軛物進一步包括第一抗原結合模組； 任選地，所述第一抗原結合模組直接或通過接頭間接地與所述白細胞介素2突變體的一端相連； 任選地，所述第一抗原結合模組為第一抗體或其抗原結合片段的可變區； 任選地，所述第一抗體或其抗原結合片段靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面的第一抗原； 任選地，所述第一抗原選自TIGIT、CD47、PDL1、PD-1、GUCY2C或BCMA中的任一種或幾種。
  5. 一種複合物，其包括請求項1或2所述的白細胞介素2突變體或請求項3或4所述的共軛物。
  6. 如請求項5所述的複合物，其中，所述複合物進一步包括白細胞介素2受體α突變體，所述白細胞介素2受體α突變體通過二硫鍵與所述白細胞介素2突變體相連； 任選地，與野生型白細胞介素2受體α的胺基酸序列相比，所述白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸兩個或三個胺基酸； 任選地，所述二硫鍵形成於所述白細胞介素2受體α突變體的延伸的第2位胺基酸與所述白細胞介素2突變體的第75位胺基酸之間； 所述第2位胺基酸為從野生型白細胞介素2受體α的N端開始往延伸的方向延伸的第2個胺基酸； 任選地，所述野生型白細胞介素2受體α的胺基酸序列如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示。
  7. 如請求項6所述的複合物，其中，所述複合物進一步包括第二抗原結合模組； 任選地，所述第二抗原結合模組直接或通過接頭間接地與所述白細胞介素2受體α突變體的一端相連； 任選地，當所述第二抗原結合模組直接與所述白細胞介素2受體α突變體的N端相連時，所述白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸兩個胺基酸，其中，延伸的第2位胺基酸為半胱胺酸，延伸的第1位胺基酸為非極性脂肪酸胺基酸、芳香族胺基酸、R基不帶電荷的胺基酸、R基帶正電荷的胺基酸或R基帶負電荷的胺基酸中的任一種； 任選地，當所述第二抗原結合模組通過接頭間接地與所述白細胞介素2受體α突變體的N端相連時，所述白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列的N端延伸三個胺基酸，其中，延伸的第2位胺基酸為半胱胺酸，延伸的第1位和第3位胺基酸為非極性脂肪酸胺基酸、芳香族胺基酸、R基不帶電荷的胺基酸、R基帶正電荷的胺基酸或R基帶負電荷的胺基酸中的任一種； 任選地，所述白細胞介素2受體α突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO: 26所示； 任選地，所述第二抗原結合模組為第一抗體或其抗原結合片段的可變區； 任選地，所述第一抗體或其抗原結合片段靶向腫瘤細胞或免疫細胞表面的第一抗原； 任選地，所述第一抗原選自TIGIT、CD47、PDL1、PD-1、GUCY2C或BCMA中的任一種或幾種。
  8. 如請求項7所述的複合物，其中，所述第一抗原結合模組選自所述第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區，所述第二抗原結合模組選自所述第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區；或所述第一抗原結合模組選自所述第一抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區，所述第二抗原結合模組選自所述第一抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區； 任選地，所述第一抗原結合模組為TIGIT抗體的輕鏈可變區，所述第二抗原結合模組為所述TIGIT抗體的重鏈可變區； 任選地，所述第一抗原結合模組為所述TIGIT抗體的重鏈可變區，所述第二抗原結合模組為所述TIGIT抗體的輕鏈可變區。
  9. 如請求項8所述的複合物，其中，所述複合物進一步包括Fc區，所述Fc區通過鉸鏈區與所述白細胞介素2突變體或所述白細胞介素2受體α突變體的另一端相連。
  10. 如請求項8或9所述的複合物，其中，所述複合物為雙抗分子，所述雙抗分子進一步包括第二抗體或其抗原結合片段，所述第二抗體或其抗原結合片段靶向免疫細胞或腫瘤細胞表面的第二抗原； 任選地，所述雙抗分子的所述第二抗體和所述第一抗體特異性結合的抗原不同； 任選地，所述第二抗體或其抗原結合片段為靶向免疫細胞或腫瘤細胞表面第二抗原的抗體的可變區； 任選地，所述免疫細胞或腫瘤細胞表面的第二抗原包括PDL1、CD47、PD-1、TIGIT、BCMA或GUCY2C中的任一種或幾種； 任選地，所述雙抗分子包含第一肽鏈、第二肽鏈、第三肽鏈和第四肽鏈； 任選地，所述第一肽鏈為：第一抗原模組白細胞介素2突變體；所述第二肽鏈為：第二抗原模組-白細胞介素2受體α突變體-鉸鏈區-Fc區；所述第三肽鏈為：第二抗體的重鏈可變區-CH1-鉸鏈區-Fc區；所述第四肽鏈為：第二抗體的輕鏈可變區-CL；或所述第一肽鏈為：第一抗原模組-白細胞介素2受體α突變體；所述第二肽鏈為：第二抗原模組-白細胞介素2突變體-鉸鏈區-Fc區；所述第三肽鏈為：第二抗體的重鏈可變區-CH1-鉸鏈區-Fc區；所述第四肽鏈為：第二抗體的輕鏈可變區-CL； 任選地，所述鉸鏈區的胺基酸序列如SEQ ID NO:23所示； 任選地，所述Fc區為免疫球蛋白Fc區，所述免疫球蛋白Fc區為天然胺基酸序列或其突變序列； 任選地，所述免疫球蛋白Fc區來源於人或動物； 任選地，所述Fc區的胺基酸序列如SEQ ID NO:24所示； 任選地，所述CL為免疫球蛋白λ輕鏈或κ輕鏈的恒定區； 任選地，所述免疫細胞或腫瘤細胞表面的第二抗原為PDL1； 任選地，所述第二抗體的重鏈可變區（VH）的胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示，所述第二抗體的重鏈可變區（VL）的胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示。
  11. 一種核酸分子，其包括編碼請求項1或2所述的白細胞介素2突變體、請求項3或4所述的共軛物、或者請求項5-10中任一項所述的複合物的核苷酸序列。
  12. 一種載體，其包括請求項11所述的核酸分子。
  13. 一種宿主細胞，其包括請求項11所述的核酸分子和/或請求項12所述的載體。
  14. 一種組合物，其包括請求項1或2所述的白細胞介素2突變體、請求項3或4所述的共軛物、或者請求項5-10中任一項所述的複合物。
  15. 一種如請求項1或2所述的白細胞介素2突變體、請求項3或4所述的共軛物、或者請求項5-10中任一項所述的複合物在製備用於刺激機體免疫系統的組合物中的用途。
  16. 一種如請求項1或2所述的白細胞介素2突變體、請求項3或4所述的共軛物、或者請求項5-10中任一項所述的複合物在製備用於治療癌症、自身免疫性疾病的藥物中的用途。
  17. 一種在受試者中診斷、治療或預防癌症、自身免疫性疾病的症狀的方法，其包括向受試者施用治療有效量的請求項14所述的組合物。
  18. 一種生產多肽的方法，其包括在表達核酸分子的條件下培養請求項13所述的宿主細胞。
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