CN116769013A - 白细胞介素2突变体以及含有其的复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及白细胞介素2突变体以及含有其的复合物。本发明提供一种白细胞介素2突变体、含有该突变体的缀合物、含有该突变体的复合物、以及该突变体、缀合物或复合物在制备用于刺激机体免疫系统的组合物、制备用于治疗癌症、自身免疫性疾病的药物中的用途。发明人获得白细胞介素2突变体和白细胞介素2受体α突变体，通过在IL2突变体与IL2Rα突变体之间设计二硫键改造，帮助非共价连接的IL2与IL2Rα之间形成共价二硫键连接，提高IL2与IL2Rα之间的亲和力，解决游离轻链的问题，进而提高IL2与IL2Rα相关融合蛋白的纯度和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及白细胞介素2突变体以及含有其的复合物。
背景技术
细胞因子在人体免疫调节中起重要作用，同时也参与肿瘤的免疫调控，与肿瘤的发生、发展密切相关。在免疫疗法中，细胞因子可直接作用于肿瘤微环境中的免疫效应细胞，增强肿瘤抑制效果。通过临床研究以及动物实验，许多细胞因子已被证明具有显著的抗肿瘤活性，已有多个细胞因子获得FDA批准上市。
白细胞介素2(IL2)是一个约15.5-16kDa的细胞因子，最早于1976年被Morgan等发现，具有增强免疫的作用。IL2具有许多免疫刺激和免疫调节功能，它能刺激T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)和B细胞的增殖并增强其功能。
IL2是四个α螺旋束细胞因子家族(fourα-helix bundle familyof cytokines)中的成员之一。IL2需通过与其受体结合发挥生物学活性。IL2受体由三个受体亚基组成：IL2受体α(IL2Rα，也称CD25，55kDa)、IL2受体β(IL2Rβ，也称CD122)和γc(也称CD132)。IL2受体α是一种单通道I型膜蛋白，包含2个Sushi结构域，是IL2与之结合并发挥生物学功能所必需的结构域。
IL2之前由于高剂量给药产生毒副作用等原因未被广泛应用，但近年来，由于人们对IL2及其受体亚型的深入研究，发现修饰的IL2的选择性免疫刺激能力提高，这使得IL2受体重新被研究，并用于构建融合蛋白。然而，IL2与IL2受体相关的融合蛋白类型有待丰富，稳定性也有待提高。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种白细胞介素2突变体、含有该突变体的缀合物、含有该突变体的复合物、以及该突变体、缀合物或复合物在制备用于刺激机体免疫系统的组合物、制备用于治疗癌症、自身免疫性疾病的药物中的用途。本发明通过将野生型白细胞介素2的第75位的丝氨酸突变为半胱氨酸，获得一种白细胞介素2突变体，同时，在白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸两个或三个氨基酸，其中，延伸的第2位氨基酸为半胱氨酸，获得白细胞介素2受体α突变体，两个半胱氨酸之间形成二硫键，提高了IL2与IL2Rα之间的亲和力，同时解决了表达IL2与IL2Rα相关融合蛋白过程中出现游离轻链的问题。
为此，本发明第一方面提供一种白细胞介素2突变体。根据本发明的实施方案，与野生型白细胞介素2的氨基酸序列相比，所述白细胞介素2突变体的氨基酸序列中第75位的氨基酸突变为半胱氨酸。
本发明提供一种白细胞介素2突变体，该突变体能够与含有半胱氨酸的白细胞介素2受体α突变体之间形成二硫键，提升了IL2与IL2Rα之间的亲和力。
根据本发明的实施方案，所述野生型白细胞介素2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
野生型白细胞介素2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)如下所示：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
本发明第二方面提供一种缀合物。根据本发明的实施方案，所述缀合物包括第一方面所述的白细胞介素2突变体。
根据本发明的实施方案，所述缀合物进一步包括第一抗原结合模块。
根据本发明的实施方案，所述第一抗原结合模块直接或通过接头间接地与所述白细胞介素2突变体的一端相连。
根据本发明的实施方案，所述第一抗原结合模块为抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的实施方案，所述抗体或其抗原结合片段靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面的抗原。
所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞。
本发明提供的缀合物含有白细胞介素2突变体和抗体或其抗原结合片段，通过抗体或其抗原结合片段与免疫细胞结合，从而刺激免疫细胞，例如刺激T细胞增殖，达到增强免疫的效果，可以用于治疗一些自身免疫性疾病。
根据本发明的实施方案，所述抗原选自TIGIT、CD47、PDL1、PD-1、GUCY2C或BCMA中的任一种或几种。
本发明第三方面提供一种复合物。根据本发明的实施方案，所述复合物包括第一方面所述的白细胞介素2突变体或第二方面所述的缀合物。
根据本发明的实施方案，所述复合物进一步包括白细胞介素2受体α突变体，所述白细胞介素2受体α突变体通过二硫键与所述白细胞介素2突变体相连。
发明人发现，在表达IL2与IL2Rα相关融合蛋白过程中会出现游离轻链，导致融合蛋白纯度较低；而游离轻链的出现考虑是由于IL2与IL2Rα之间的非共价结合作用力较弱导致的，因此，通过在IL2与IL2Rα之间设计二硫键改造，帮助非共价连接的IL2与IL2Rα之间形成共价二硫键连接，提高IL2与IL2Rα之间的亲和力，解决游离轻链的问题，进而提高融合蛋白的纯度和稳定性。
根据本发明的实施方案，与野生型白细胞介素2受体α的氨基酸序列相比，所述白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸两个或三个氨基酸。
根据本发明的实施方案，所述二硫键形成于所述白细胞介素2受体α突变体的延伸的第2位氨基酸与所述白细胞介素2突变体的第75位氨基酸之间；
根据本发明的实施方案，所述野生型白细胞介素2受体α的氨基酸序列如SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:2的氨基酸序列如下所示：
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
SEQ ID NO:3的氨基酸序列如下所示：
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQ
SEQ ID NO:2为野生型白细胞介素2受体α胞外结构域的成熟全截短形式的氨基酸序列，SEQ ID NO:3为野生型白细胞介素2受体α胞外结构域的成熟形式的氨基酸序列。
根据本发明的实施方案，所述复合物进一步包括第二抗原结合模块。
根据本发明的实施方案，所述第二抗原结合模块直接或通过接头间接地与所述白细胞介素2受体α突变体的一端相连。
根据本发明的实施方案，当所述第二抗原结合模块直接与所述白细胞介素2受体α突变体的N端相连时，所述白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸两个氨基酸，其中，延伸的第2位氨基酸为半胱氨酸，延伸的第1位氨基酸为非极性脂肪酸氨基酸、芳香族氨基酸、R基不带电荷的氨基酸、R基带正电荷的氨基酸或R基带负电荷的氨基酸中的任一种。
根据本发明的实施方案，当所述第二抗原结合模块通过接头间接地与所述白细胞介素2受体α突变体的N端相连时，所述白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸三个氨基酸，其中，延伸的第2位氨基酸为半胱氨酸，延伸的第1位和第3位氨基酸为非极性脂肪酸氨基酸、芳香族氨基酸、R基不带电荷的氨基酸、R基带正电荷的氨基酸或R基带负电荷的氨基酸中的任一种。
根据本发明的实施方案，所述接头可以是Linker，所述Linker为柔性Linker，所述柔性Linker的长度和具体氨基酸序列不限，本领域常用的柔性Linker均可用于本发明中。
根据本发明的实施方案，所述柔性Linker的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGSGGG。
根据本发明的实施方案，所述非极性脂肪酸氨基酸可以是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸等，但本发明提及的非极性脂肪酸氨基酸种类并不限于此。
根据本发明的实施方案，所述芳香族氨基酸可以是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等，但本发明提及的芳香族氨基酸种类并不限于此。
根据本发明的实施方案，所述R基不带电荷的氨基酸可以是丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺等，但本发明提及的R基不带电荷的氨基酸种类并不限于此。
根据本发明的实施方案，所述R基带正电荷的氨基酸可以是赖氨酸、精氨酸、组氨酸等，但本发明提及的R基带正电荷的氨基酸种类并不限于此。
根据本发明的实施方案，所述R基带负电荷的氨基酸可以是天冬氨酸、谷氨酸等，但本发明提及的R基带负电荷的氨基酸种类不限于此。根据本发明的实施方案，所述第二抗原结合模块为抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的实施方案，所述抗体或其抗原结合片段靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面的抗原。
所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞。
根据本发明的实施方案，所述抗原选自TIGIT、CD47、PDL1、PD-1、GUCY2C或BCMA中的任一种或几种。
根据本发明的实施方案，所述第一抗原结合模块和所述第二抗原结合模块为靶向同一抗原的重链可变区或轻链可变区。
例如，所述第一抗原结合模块为靶向TIGIT的抗体的重链可变区，所述第二抗原结合模块则为靶向TIGIT的抗体的轻链可变区。
根据本发明的实施方案，所述第一抗原结合模块直接或通过接头间接地与所述白细胞介素2突变体的N端相连。
根据本发明的实施方案，所述第二抗原结合模块直接或通过接头间接地与所述白细胞介素2受体α突变体的N端相连。
根据本发明的实施方案，所述复合物进一步包括Fc区，所述Fc区通过铰链区与所述白细胞介素2突变体或所述白细胞介素2受体α突变体的另一端相连。
根据本发明的实施方案，所述复合物进一步包括Fc区，所述Fc区通过铰链区与所述白细胞介素2突变体或所述白细胞介素2受体α突变体的C端相连。
根据本发明的实施方案，所述复合物为双抗分子，所述双抗分子进一步包括靶向免疫细胞或肿瘤细胞表面抗原的抗体。
根据本发明的实施方案，所述免疫细胞或肿瘤细胞表面抗原包括PDL1、CD47、PD-1、TIGIT、BCMA或GUCY2C中的任一种或几种。
所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞。
本发明第四方面提供一种核酸分子。根据本发明的实施方案，所述核酸分子包括编码第一方面所述的白细胞介素2突变体、第二方面所述的缀合物、或者第三方面所述的复合物的核苷酸序列。
本发明第五方面提供一种载体。根据本发明的实施方案，所述载体包括第四方面所述的核酸分子。
本发明第六方面提供一种宿主细胞。根据本发明的实施方案，所述宿主细胞包括第四方面所述的核酸分子和/或第五方面所述的载体。
本发明第七方面提供一种组合物。根据本发明的实施方案，所述组合物包括第一方面所述的白细胞介素2突变体、第二方面所述的缀合物、或者第三方面所述的复合物。
本发明第八方面提供第一方面所述的白细胞介素2突变体、第二方面所述的缀合物、第三方面所述的复合物在制备用于刺激机体免疫系统的组合物中的用途。
本发明第九方面提供第一方面所述的白细胞介素2突变体、第二方面所述的缀合物、第三方面所述的复合物在制备用于治疗癌症、自身免疫性疾病的药物中的用途。
根据本发明的实施方案，所述癌症包括选自以下中的至少之一：
黑素瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、头颈癌、皮肤癌、鳞状细胞癌等，但本发明中的癌症种类并不限于此。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明实施例2中制备的纯化后的二硫键改造与未改造IL2/IL2Rα复合物的凝胶电泳检测结果；其中，复合物1和2为二硫键改造IL2/IL2Rα复合物，复合物3为现有报道的IL2/IL2Rα复合物，复合物4为二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物。
图2显示了采用本发明中二硫键改造IL2/IL2Rα复合物(复合物1)SEC检测结果。
图3显示了采用本发明中二硫键改造与未改造IL2/IL2Rα复合物对靶向区(双抗分子中靶向肿瘤细胞表面抗原的抗体)亲和力的检测结果；其中，R1262为二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1，R1115为IL2/IL2Rα复合物4，hIgG1为亚型对照抗体。
图4显示了采用本发明中二硫键改造与未改造IL2/IL2Rα复合物对靶向区(靶向免疫细胞表面抗原的抗体)亲和力的检测结果；其中，R1262为二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1，R1115为IL2/IL2Rα复合物4，hIgG1为亚型对照抗体。
图5显示了采用本发明中二硫键改造与未改造IL2/IL2Rα复合物对配体与靶向区(靶向免疫细胞表面抗原的抗体)结合力的阻断检测结果；其中，R1262为二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1，R1115为IL2/IL2Rα复合物4，hIgG1为亚型对照抗体。
图6显示了本发明实施例5中制备的纯化后的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物5、6、7、8以及复合物1的凝胶电泳检测结果，二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4作为对照。
图7显示了本发明实施例5中制备的纯化后的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物9、10、11、12、13以及复合物1的凝胶电泳检测结果，二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4作为对照。
具体实施方式
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
术语
本文中，“IL2Rα”是指白细胞介素2受体α，也称为“α受体亚基”；“IL2Rβ”是指白介素2受体β，也称为“β受体亚基”；“IL2Rγ”是指白介素2受体γ，也称为“γ受体亚基”；“IL2Rβγ”是指白介素2受体β和受体γ形成的复合物，也称为“β和γ受体亚基复合物”。
如本文所用，“Treg”是指调节性T细胞。
术语“抗体”以最广义使用，并包括完全组装的抗体、四聚体抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、可以结合抗原的抗体片段(例如，Fab'、F'(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体、Fab)和包含前述的重组肽，只要其展现出所需的生物活性即可。“免疫球蛋白”或“四聚体抗体”是由两条重链和两条轻链组成的四聚体糖蛋白，各自包含可变区和恒定区。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗体片段或抗原结合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv，结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、CDR-移植抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、线性抗体；螯合重组抗体、三链抗体(tribody)或双链抗体(bibody)、胞内抗体、纳米抗体、小模块化免疫药物(SMIP)、抗原结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含VHH抗体或其变异体或衍生物，和含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，其足以赋予与多肽结合的特异性抗原，如一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR序列，只要所述抗体保留所需的生物学活性即可。
如本文所用，“重链可变区”是指抗体分子的区域，其包含所述抗体重链可变结构域的至少一个互补决定区(CDR)。重链可变区可含有所述抗体重链的一个、两个或三个CDR。
如本文所用，“轻链可变区”是指抗体分子的区域，其包含所述抗体轻链可变结构域的至少一个互补决定区(CDR)。轻链可变区可含有所述抗体轻链的一个、两个或三个CDR，取决于抗体，其可以是κ或λ轻链。
与本文方法一起使用的术语“治疗”是指暂时或永久地、部分或完全地消除、减少、抑制或改善事件、疾病或病状的临床症状、表现或进展。
本文所述的“抗体”也称为免疫球蛋白，是四聚体糖蛋白。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻”(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，紧接着是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面(Chothia等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917,1987)。
免疫球蛋白可变结构域展现出由三个高变区或CDR连接的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构。从N末端到C末端，轻链和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配符合Kabat免疫目的蛋白质序列(Kabat SequencesofProteins of Immunological Interest)的定义(马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1987和1991)；或Chothia和Lesk,《分子生物学杂志》,196:901-917,1987；Chothia等人,《自然》,342:878-883,1989)。
抗体的高变区是指抗体的负责抗原结合的CDR氨基酸残基。高变区包含来自CDR的氨基酸残基，例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(如Kabat等人,《免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版公共卫生署,美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达(1991)所述)；和/或来自高变环的残基，例如，轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(如Chothia等人,《分子生物学杂志》196:901-917(1987)所述)。
单克隆抗体是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，其中混合物中的所有抗体具有衍生自单个克隆的单个氨基酸序列。单克隆抗体通常是高度特异性的，并且针对单个抗原位点或表位。相反，多克隆抗体制剂通常包括针对相同或不同决定簇(表位)的具有不同氨基酸序列的抗体的混合物。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点在于其在同源培养物中合成，不受具有不同特异性和特征的其它免疫球蛋白的污染。
非极性脂肪酸氨基酸的单字母缩写分别为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)；芳香族氨基酸的单字母缩写分别为苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；R基不带电荷的氨基酸的单字母缩写分别为是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(N)、谷氨酰胺(Q)；R基带正电荷的氨基酸的单字母缩写分别为赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；R基带负电荷的氨基酸的单字母缩写分别为天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1、二硫键改造IL2/IL2Rα复合物的构建
在IL2、IL2Rα之间设计二硫键改造(将野生型白细胞介素2的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)中第75位的氨基酸突变为半胱氨酸；并将白细胞介素2受体α的氨基酸序列(SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3)的N端延伸两个或三个氨基酸，其中，延伸的第2位氨基酸为半胱氨酸)，帮助非共价连接的IL2和IL2Rα之间形成共价二硫键连接。
示例性的阐述一种二硫键改造IL2/IL2Rα复合物的构建方法：靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面抗原的抗体(例如TIGIT抗体)的重链可变区(VH)通过Linker连接在IL2Rα突变体上，再通过Hinge(铰链区)与hIgG1抗体的Fc连接，靶向相同抗原的抗体(TIGIT抗体)的轻链可变区(VL)通过Linker与IL2突变体连接；靶向免疫细胞或肿瘤细胞表面抗原的抗体(例如PDL1抗体)的VH直接与hIgG1抗体的恒定区(hIgG1)连接，靶向相同抗原的抗体(PDL1抗体)的VL直接与人免疫球蛋白轻链kappa抗体(κ-IgLC)连接，制备具有靶向性的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物。
根据以上构建方法，发明人设计了2种二硫键改造IL2/IL2Rα复合物，即二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1和二硫键改造IL2/IL2Rα复合物2；而IL2/IL2Rα复合物3为现有报道的复合物，复合物4为二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物；复合物1、2、3、4的具体组成和氨基酸序列如下：
二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1的序列结构为：TIGIT VH-IL2Rα突变体-Fc、TIGITVL-IL2突变体、PDL1 VH-hIgG1和PDL1 VL-κ-IgLC；其中，TIGIT VH-IL2Rα突变体-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，TIGIT VL-IL2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，PDL1VH-hIgG1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，PDL1 VL-κ-IgLC的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
SEQ ID NO：4的氨基酸序列如下所示：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGCGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：5的氨基酸序列如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQCKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
SEQ ID NO：6的氨基酸序列如下所示：
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRAWIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：7的氨基酸序列如下所示：
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPDQSPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
二硫键改造IL2/IL2Rα复合物2的序列结构为：TIGIT VH-IL2突变体-Fc、TIGITVL-IL2Rα突变体、PDL1 VH-hIgG1和PDL1 VL-κ-IgLC；其中，TIGIT VH-IL2突变体-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，TIGIT VL-IL2Rα突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，PDL1 VH-hIgG1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，PDL1 VL-κ-IgLC的氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示。
SEQ ID NO：8的氨基酸序列如下所示：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQCKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：9的氨基酸序列如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGCGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
IL2/IL2Rα复合物3的序列结构为：TIGIT VH-IL2Rα(L42C)-Fc、TIGIT VL-IL2(F42C)、PDL1 VH-hIgG1和PDL1 VL-κ-IgLC；其中，TIGIT VH-IL2Rα(L42C)-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，TIGIT VL-IL2(F42C)的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，PDL1 VH-hIgG1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，PDL1 VL-κ-IgLC的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；IL2Rα(L42C)代表：将IL2Rα的氨基酸序列中第42位亮氨酸突变为半胱氨酸，IL2(F42C)代表：将IL2的氨基酸序列中第42位苯丙氨酸突变为半胱氨酸。
SEQ ID NO：10的氨基酸序列如下所示：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSCYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：11的氨基酸序列如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTCKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4的序列结构为：TIGIT VH-野生型IL2Rα-Fc、TIGIT VL-野生型IL2、PDL1 VH-hIgG1和PDL1 VL-κ-IgLC；其中，TIGIT VH-野生型IL2Rα-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，TIGIT VL-野生型IL2的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，PDL1 VH-hIgG1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，PDL1 VL-κ-IgLC的氨基酸序列如SEQID NO：7所示。
SEQ ID NO：12的氨基酸序列如下所示：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：13的氨基酸序列如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
实施例2、二硫键改造IL2/IL2Rα复合物的制备
二硫键改造IL2/IL2Rα目的蛋白的瞬转表达：
针对实施例1中的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1(SEQ ID NO：4-7)、二硫键改造IL2/IL2Rα复合物2(SEQ ID NO：6-9)、IL2/IL2Rα复合物3(SEQ ID NO：6、7、10、11)和二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4(SEQ ID NO：6、7、12、13)，分别设计表达这些氨基酸序列的质粒载体，将含有目的基因的质粒分别通过与转染试剂PEI形成阳离子复合物后，导入到宿主细胞Expi293，质粒在细胞内期间，质粒上的外源基因在细胞内发生转录翻译，从而得到目的蛋白。
二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1的具体制备方法为：
Expi293在37℃、8％二氧化碳、130rpm条件培养，并在转染前通过细胞计数，将2E6的细胞接种至1L摇瓶中，培养体系约为300mL。配制转染混合物准备转染：首先将750μg目标质粒加入到含有15mL Opti-MEM试剂的50mL离心管中，轻轻混匀，标记为A管；将1.5mg转染试剂PEI加入到含有15mL Opti-MEM试剂的50mL离心管中，轻轻混匀后，室温孵育5min，标记为B管；将B管PEI稀释液逐滴加入到A管DNA稀释液中，轻轻混匀后，室温孵育15min，孵育结束后，将PEI-目标质粒混合物加入到Expi293细胞，置于37℃摇床中继续培养。直到D7-D10后收样。
瞬转细胞表达液经过9000rpm/20min离心，收集上清，再经过0.22μm滤膜除菌过滤，进行二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1样品的纯化。纯化采用ProA亲和层析。过程如下：使用AKTA avant 150层析设备，用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)平衡层析柱(如MabSelectSuRe LX，GE)，加载样品至层析柱，使目标蛋白吸附在层析柱上而其他杂质穿透分离。完成上样后使用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)再次冲洗层析柱，随后使用洗脱缓冲液(20mM NaAc，pH＝3.4)洗脱目标蛋白，收集管中预先加入中和缓冲液(1M Tris，pH8.0)，中和缓冲液的加入体积根据洗脱样品的预估含量而定，一般加入10％洗脱体积量。最终得到二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1。
采用上述同样的方法，分别得到二硫键改造IL2/IL2Rα复合物2、IL2/IL2Rα复合物3和二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4。
实施例3、二硫键改造IL2/IL2Rα复合物凝胶电泳检测
对实施例2制备得到的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1和2、IL2/IL2Rα复合物3、IL2/IL2Rα复合物4进行SDS-PAGE电泳检测。
检测结果如图1所示，其中，IL2/IL2Rα复合物4为未改造分子，在分子量25KD～35KD之间有条带，说明存在游离轻链；二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1和2在分子量25KD～35KD之间无条带，与IL2/IL2Rα复合物3相同，说明成功去除了游离轻链，二硫键改造成功。
对实施例2制备得到的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1进行SEC检测。
检测结果如图2所示，结果说明：成功去除了游离轻链，且本发明制备得到的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1的纯度高。
实施例4、二硫键改造IL2/IL2Rα复合物靶向区亲和力检测
1、复合物中靶向免疫细胞或肿瘤细胞表面抗原的抗体的结合活性分析
当二硫键改造IL2/IL2Rα复合物为双抗分子时，通过FCM实验方法检测双抗分子中靶向肿瘤细胞表面抗原的抗体(抗PDL1抗体)与CHO-PDL1细胞结合活性。步骤如下：
(1)配制3％BSA缓冲液：称取4.5g BSA到150mL 1×PBS中，混匀后放置冰上备用；
(2)抗体稀释：将受试抗体(二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1，简称R1262)、阳性对照抗体(IL2/IL2Rα复合物4，简称R1115)用3％BSA稀释成初始浓度为800nM，亚型对照抗体(hIgG1抗体)用3％BSA释成初始浓度为20μg/mL，体积300μL 3倍梯度稀释(100μL+200μL)共10个浓度；
(3)细胞计数并铺板：将CHO-PDL1细胞计数后，按100μL，2E+05/孔分到96孔V型板中；先将不同浓度抗体50μL加入到细胞中，2-8度孵育0.5h；350×g离心5min后，去掉上清，按200μL/孔3％BSA；350×g离心5min后，去掉上清，3％BSA配制荧光抗体PE Goat anti-human IgG Fc和PE Goat anti-mouse IgG Fc(1:500×稀释)，按100μL/孔加入对应的96孔板中，2-8度孵育30min；350g离心5min，去上清，3％BSA洗一遍细胞；350×g离心5min后，去掉上清，按100μL/孔加入1×PBS重悬细胞；按照CytoFLEX流式细胞仪标准操作规程，上机进行结合活性检测。
检测结果如图3所示，结果显示：二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1(R1262)与二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4的双抗(R1115)相比，两者亲和力相当，说明二硫键改造不会影响靶向区的亲和力。
2、复合物中靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面抗原的抗体的结合活性分析
当二硫键改造IL2/IL2Rα复合物为双抗分子时，通过FCM实验方法检测双抗分子中靶向免疫细胞表面抗原的抗体(抗TIGIT抗体)与CHO-TIGIT细胞结合活性。步骤如下：
(1)配制3％BSA缓冲液：称取4.5g BSA到150mL 1×PBS中，混匀后放置冰上备用；
(2)抗体稀释：将受试抗体(R1262)、阳性对照抗体(R1115)用3％BSA稀释成初始浓度为800nM，亚型对照抗体(hIgG1抗体)用3％BSA稀释成初始浓度为20μg/mL，体积300μL，3倍梯度稀释(100μL+200μL)共10个浓度；
(3)细胞计数并铺板：将CHO-TIGIT细胞计数后，按100μL，2E+05/孔分到96孔V型板中；先将不同浓度抗体50μL加入到细胞中，2-8度孵育0.5h，350×g离心5min后，去掉上清，按200μL/孔3％BSA；350×g离心5min后，去掉上清，3％BSA配制荧光抗体PE Goat anti-human IgG Fc和PE Goat anti-mouse IgG Fc(1:500×稀释)，按100μL/孔加入对应的96孔板中，2-8度孵育30min；350g离心5min，去上清，3％BSA洗一遍细胞；350×g离心5min后，去掉上清，按100μL/孔加入1×PBS重悬细胞；按照CytoFLEX流式细胞仪标准操作规程，上机进行结合活性检测。
检测结果如图4所示，结果显示：二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1(R1262)与二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4(R1115)的亲和力相当，说明二硫键改造不会影响靶向区的亲和力。
3、复合物中靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面抗原的抗体的结合阻断活性分析
当二硫键改造IL2/IL2Rα复合物为双抗分子时，通过FCM实验方法检测双抗分子中靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面抗原的抗体(抗TIGIT抗体)阻断配体与CHO-TIGIT细胞结合活性。步骤如下：
(1)配制3％BSA缓冲液：称取4.5g BSA到150mL 1×PBS中，混匀后放置冰上备用；
(2)抗体稀释：将受试抗体(R1262)、阳性对照抗体(R1115)用3％BSA稀释成初始浓度为800nM，亚型对照抗体(hIgG1抗体)用3％BSA稀释成初始浓度为20μg/mL，体积300μL。3倍梯度稀释(100μL+200μL)共10个浓度；
(3)细胞计数并铺板：将R0254-3细胞计数后，按100μL，2E+05/孔分到96孔V型板中；先将不同浓度抗体50μL加入到细胞中，2-8度孵育0.5h，再加入50μL配体，2-8度孵育0.5h；350×g离心5min后，去掉上清，按200μL/孔3％BSA；350×g离心5min后，去掉上清，3％BSA配制荧光抗体PE Goat anti-human IgG Fc和PE Goat anti-mouse IgG Fc(1:500×稀释)，按100μL/孔加入对应的96孔板中，2-8度孵育30min；350g离心5min，去上清，3％BSA洗一遍细胞；350×g离心5min后，去掉上清，按100μL/孔加入1×PBS重悬细胞；按照CytoFLEX流式细胞仪标准操作规程，上机检测。
检测结果如图5所示，结果显示：二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1(R1262)与二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4(R1115)相比，两者对配体与靶向区结合力的阻断效果相当。
实施例5、白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸的第1位和第3位氨基酸的种类对IL2/IL2Rα复合物改造后引入的二硫键形成的影响
当第二抗原结合模块通过接头间接地与白细胞介素2受体α突变体的N端相连时，白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸三个氨基酸；为了进一步明确白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸的第1位和第3位氨基酸的种类对IL2/IL2Rα复合物改造后引入的二硫键形成的影响，进行如下实验：
1、延伸的第3位氨基酸的种类对IL2/IL2Rα复合物改造后引入的二硫键形成的影响选择延伸的第3位氨基酸为芳香族氨基酸(以苯丙氨酸为例)、R基不带电荷的氨基酸(以丝氨酸为例)、R基带正电荷的氨基酸(以赖氨酸为例)或R基带负电荷的氨基酸(以天冬氨酸为例)中的任一种，构建并制备二硫键改造IL2/IL2Rα复合物5、6、7、8(简称依次为R1493、R1494、R1495、R1496)，与二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1(IL2/IL2Rα复合物1中白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸的第3位氨基酸为甘氨酸(非极性脂肪酸氨基酸))一起作为实验组，以二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4为对照组。
二硫键改造IL2/IL2Rα复合物5、6、7、8与实施例2中制备二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1的过程相同。
二硫键改造IL2/IL2Rα复合物5、6、7、8的序列结构均为：TIGIT VH-IL2Rα突变体-Fc、TIGIT VL-IL2突变体(SEQ ID NO：5)、PDL1 VH-hIgG1(SEQ ID NO：6)和PDL1 VL-κ-IgLC(SEQ ID NO：7)；其中，二硫键改造IL2/IL2Rα复合物5、6、7、8的TIGIT VH-IL2Rα突变体-Fc的氨基酸序列如依次SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17所示(其中，白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸的三个氨基酸以粗体示出，带有下划线的为延伸的第3位氨基酸)；
SEQ ID NO：14的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO：15的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO：16的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO：17的氨基酸序列如下所示：
将获得的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物5、6、7、8以及复合物1进行SDS-PAGE电泳检测，二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4为对照组，以探究白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸的第3位氨基酸的种类对IL2/IL2Rα复合物改造后引入的二硫键形成的影响，实验结果如图6所示，可以看出，与对照组相比，二硫键改造IL2/IL2Rα复合物5、6、7、8均成功去除了游离轻链，二硫键改造成功；表明延伸的第3位氨基酸为非极性脂肪酸氨基酸、芳香族氨基酸、R基不带电荷的氨基酸、R基带正电荷的氨基酸或R基带负电荷的氨基酸，均不会影响IL2/IL2Rα复合物改造后引入的二硫键的形成。
2、延伸的第1位和第3位氨基酸组合的种类对IL2/IL2Rα复合物改造后的二硫键形成的影响
选择延伸的第1位和第3位氨基酸为非极性脂肪酸氨基酸(以甘氨酸为例)、芳香族氨基酸(以苯丙氨酸为例)、R基不带电荷的氨基酸(以丝氨酸为例)、R基带正电荷的氨基酸(以赖氨酸为例)或R基带负电荷的氨基酸(以天冬氨酸为例)中的任一种组合，构建并制备二硫键改造IL2/IL2Rα复合物9、10、11、12、13(简称依次为R1662、R1663、R1664、R1665、R1666)，与二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1一起作为实验组，以二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4为对照组。
二硫键改造IL2/IL2Rα复合物9、10、11、12、13与实施例2中制备二硫键改造IL2/IL2Rα复合物1的过程相同。
二硫键改造IL2/IL2Rα复合物9、10、11、12、13的序列结构均为：TIGIT VH-IL2Rα突变体-Fc、TIGIT VL-IL2突变体(SEQ ID NO：5)、PDL1 VH-hIgG1(SEQ ID NO：6)和PDL1 VL-κ-IgLC(SEQ ID NO：7)；其中，二硫键改造IL2/IL2Rα复合物9、10、11、12、13的TIGIT VH-IL2Rα突变体-Fc的氨基酸序列如依次SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22所示(其中，白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸的三个氨基酸以粗体示出，带有下划线的为延伸的第1位和第3位氨基酸)；
SEQ ID NO：18的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO：19的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO：20的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO：21的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO：22的氨基酸序列如下所示：
将获得的二硫键改造IL2/IL2Rα复合物9、10、11、12、13以及复合物1进行SDS-PAGE电泳检测，二硫键未改造IL2/IL2Rα复合物4为对照组，以探究白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸的第1位和第3位氨基酸组合的种类对IL2/IL2Rα复合物改造后引入的二硫键形成的影响，实验结果如图7所示，可以看出，与对照组相比，二硫键改造IL2/IL2Rα复合物9、10、11、12、13均成功去除了游离轻链，二硫键改造成功；表明延伸的第1位和第3位氨基酸为非极性脂肪酸氨基酸、芳香族氨基酸、R基不带电荷的氨基酸、R基带正电荷的氨基酸或R基带负电荷的氨基酸的任意组合，均不会影响IL2/IL2Rα复合物改造后引入的二硫键的形成。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (16)
1.一种白细胞介素2突变体，其特征在于，与野生型白细胞介素2的氨基酸序列相比，所述白细胞介素2突变体的氨基酸序列中第75位的氨基酸突变为半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的白细胞介素2突变体，其特征在于，所述野生型白细胞介素2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物包括权利要求1或2所述的白细胞介素2突变体。
4.根据权利要求3所述的缀合物，其特征在于，所述缀合物进一步包括第一抗原结合模块；
任选地，所述第一抗原结合模块直接或通过接头间接地与所述白细胞介素2突变体的一端相连；
任选地，所述第一抗原结合模块为抗体或其抗原结合片段；
任选地，所述抗体或其抗原结合片段靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面的抗原；
任选地，所述抗原选自TIGIT、CD47、PDL1、PD-1、GUCY2C或BCMA中的任一种或几种。
5.一种复合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的白细胞介素2突变体或权利要求3或4所述的缀合物。
6.根据权利要求5所述的复合物，其特征在于，所述复合物进一步包括白细胞介素2受体α突变体，所述白细胞介素2受体α突变体通过二硫键与所述白细胞介素2突变体相连；
任选地，与野生型白细胞介素2受体α的氨基酸序列相比，所述白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸两个或三个氨基酸；
任选地，所述二硫键形成于所述白细胞介素2受体α突变体的延伸的第2位氨基酸与所述白细胞介素2突变体的第75位氨基酸之间；
任选地，所述野生型白细胞介素2受体α的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求6所述的复合物，其特征在于，所述复合物进一步包括第二抗原结合模块；
任选地，所述第二抗原结合模块直接或通过接头间接地与所述白细胞介素2受体α突变体的一端相连；
任选地，当所述第二抗原结合模块直接与所述白细胞介素2受体α突变体的N端相连时，所述白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸两个氨基酸，其中，延伸的第2位氨基酸为半胱氨酸，延伸的第1位氨基酸为非极性脂肪酸氨基酸、芳香族氨基酸、R基不带电荷的氨基酸、R基带正电荷的氨基酸或R基带负电荷的氨基酸中的任一种；
任选地，当所述第二抗原结合模块通过接头间接地与所述白细胞介素2受体α突变体的N端相连时，所述白细胞介素2受体α突变体的氨基酸序列的N端延伸三个氨基酸，其中，延伸的第2位氨基酸为半胱氨酸，延伸的第1位和第3位氨基酸为非极性脂肪酸氨基酸、芳香族氨基酸、R基不带电荷的氨基酸、R基带正电荷的氨基酸或R基带负电荷的氨基酸中的任一种；
任选地，所述第二抗原结合模块为抗体或其抗原结合片段；
任选地，所述抗体或其抗原结合片段靶向肿瘤细胞或免疫细胞表面的抗原；
任选地，所述抗原选自TIGIT、CD47、PDL1、PD-1、GUCY2C或BCMA中的任一种或几种。
8.根据权利要求7所述的复合物，其特征在于，所述第一抗原结合模块和所述第二抗原结合模块为靶向同一抗原的重链可变区或轻链可变区。
9.根据权利要求8所述的复合物，其特征在于，所述复合物进一步包括Fc区，所述Fc区通过铰链区与所述白细胞介素2突变体或所述白细胞介素2受体α突变体的另一端相连。
10.根据权利要求8或9所述的复合物，其特征在于，所述复合物为双抗分子，所述双抗分子进一步包括靶向免疫细胞或肿瘤细胞表面抗原的抗体；
任选地，所述免疫细胞或肿瘤细胞表面抗原包括PDL1、CD47、PD-1、TIGIT、BCMA或GUCY2C中的任一种或几种。
11.一种核酸分子，其特征在于，包括编码权利要求1或2所述的白细胞介素2突变体、权利要求3或4所述的缀合物、或者权利要求5-10中任一项所述的复合物的核苷酸序列。
12.一种载体，其特征在于，包括权利要求11所述的核酸分子。
13.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求11所述的核酸分子和/或权利要求12所述的载体。
14.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的白细胞介素2突变体、权利要求3或4所述的缀合物、或者权利要求5-10中任一项所述的复合物。
15.权利要求1或2所述的白细胞介素2突变体、权利要求3或4所述的缀合物、或者权利要求5-10中任一项所述的复合物在制备用于刺激机体免疫系统的组合物中的用途。
16.权利要求1或2所述的白细胞介素2突变体、权利要求3或4所述的缀合物、或者权利要求5-10中任一项所述的复合物在制备用于治疗癌症、自身免疫性疾病的药物中的用途。
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