TW202315889A

TW202315889A - 抗體

Info

Publication number: TW202315889A
Application number: TW111131251A
Authority: TW
Inventors: 卡洛琳貝爾托; 湯瑪士科力; 妮莎達迪; 卡羅布蘭登德理; 大衛保羅胡弗瑞斯; 安懷特; 蓋勒樂弗里克; 路絲麥克霍恩; 維多利亞奧多德; 克萊爾湯普森; 凱芮路易斯泰森
Original assignee: 比利時商Ｕｃｂ生物製藥公司
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2022-08-19
Publication date: 2023-04-16
Also published as: KR20240046577A; BR112024001989A2; CA3227160A1; AU2022330347A1; WO2023021187A1; AR126820A1; IL310245A; CO2024001711A2; EP4388007A1; GB202111905D0

Abstract

本發明係關於針對HLA-G之抗體及包含該等抗體之調配物。本發明進一步關於該等HLA-G抗體及調配物在療法(尤其係實體腫瘤治療)中之用途。

Description

抗體

本發明係關於針對HLA-G之抗體及包含其之調配物。本發明進一步關於該等HLA-G抗體及調配物在療法中，尤其在實體癌治療中之使用。

I類人類白血球抗原(HLA-I)包含經典抗原HLA-A、HLA-B及HLA-C以及非經典抗原HLA-E、HLA-F及HLA-G。人類白血球抗原G (HLA-G)為在人類中表現且由HLA-G基因編碼的非經典HLA I類分子。HLA-G為異二聚體分子，其包含呈現3個與輕鏈(亦即β-2-微球蛋白(B2m))相關之球狀域(α ₁、α ₂及α ₃)的重鏈。

已鑑定出HLA-G之七種同功異型物，四種為膜結合性的(HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4)且三種為可溶性的(HLA-G5、HLA-G6及HLA-G7)，該等同功異型物係HLA-G初級轉錄物之選擇式剪接的結果。

HLA-G通常表現於胎盤中之細胞營養層上。據報導，HLA-G之表現與諸如發炎性疾病及癌症之病理學病狀相關。值得注意的是，據報導，HLA-G為在實體癌中特異性上調且與不良預後相關的致耐受性分子。

已知HLA-G經由結合於各種骨髓及淋巴細胞上所表現之至少三種受體而顯示免疫調節活性： ● 抑制性受體LILRB1 (白血球免疫球蛋白樣受體B1)，亦稱作ILT2或CD85j，其表現於淋巴細胞(B細胞、部分T細胞及NK細胞)及骨髓細胞(單核球、巨噬細胞及樹突狀細胞)上 ● 抑制性受體LILRB2 (白血球免疫球蛋白樣受體B2)，亦稱作ILT4或CD85d，其表現於骨髓細胞(單核球、巨噬細胞及樹突狀細胞)上；及 ● 調節性受體KIR2DL4或CD158d，其表現於NK細胞上。

HLA-G經由直接結合其抑制性受體來抑制免疫細胞之功能。據報導，HLA-G具有致耐受性功能，主要由其α ₃域與ILT2及ILT4之相互作用介導。ILT2僅識別與B2m相關之HLA-G分子，而ILT4識別與B2m相關及不含B2m的HLA-G分子。

經由此免疫抑制功能，腫瘤之HLA-G表現可誘導免疫遏制環境，從而允許腫瘤免疫逃逸且最終降低患者存活率。抗體介導的對HLA-G之阻斷因此可提供一種減輕腫瘤局部免疫遏制、促進抗癌免疫性之產生且提供持久療法的有效策略。

雖然在理論上，HLA-G阻斷抗體之抗腫瘤作用可藉由包括能夠接合免疫效應細胞上之FcγR從而允許直接殺死HLA-G+腫瘤細胞的活性Fc組分而增強，但HLA-G mRNA及蛋白質在包括胰臟及垂體之許多正常組織中的所報導表現表明活性Fc之使用可導致不可接受的毒性，因此排除了其在療法中之使用。

HLA-G與其他HLA-I分子(亦即HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E及HLA-F)具有較高相似度。在HLA-G蛋白質中之338個胺基酸位置中，僅20個胺基酸位置具有對於HLA-G唯一且不存在於任何其他約5000種人類HLA-I分子中之該位置處的殘基。此使得產生對HLA-G具有高特異性且對其他HLA-I分子不具有交叉反應性的抗體極具挑戰性。

現今可購得市售的HLA-G抗體。然而，據報導，一些抗體對HLA-G缺乏特異性(例如對其他HLA-I分子具有交叉反應性)，且所有抗體的抗原決定基皆在HLA-G之α1及α2域中，與α3域中之HLA-G ILT2/4結合位點相距較遠，且因此並不預測其阻斷HLA-G與ILT2及/或ILT4之間的相互作用。據報導，接合HLA-G α1域中之抗原決定基的抗體87G減輕免疫細胞功能之HLA-G抑制。然而，據報導，87G及其他市售HLA-G抗體能夠阻斷HLA-G ILT2/4相互作用。由於缺乏特異性及/或阻斷活性，因此市售抗體不適用於研發HLA-G治療抗體。

在W019202040及WO2020069133中已報導結合於HLA-G之其他抗體，並且雖然此類抗體似乎調節一或多種HLA-G活性，但其在HLA-G上之結合位點(亦即抗原決定基)尚未得到表徵。

迄今為止，抗體針對HLA-G之功效尚未在患者中證實，尤其針對實體癌治療。

因此，仍需要提供結合HLA-G且具有適用於療法之生物特性的抗體，該等生物特性諸如改良之藥物動力學特性及/或改良之生物功能(例如特異性、結合親和力、中和作用及/或細胞毒性以及吞噬作用)及/或降低之人類毒性。

本發明藉由提供適用於療法，尤其適用於治療實體癌的針對HLA-G之新抗體來解決上文所確認之需求，該等新抗體具有如本文所描述之結構及功能特性，尤其對HLA-G之高特異性，亦即阻斷HLA-G與其受體ILT2及ILT4之相互作用的能力。吾人提供證據表明，由本發明抗體識別之抗原決定基不存在於包括垂體及胰臟之正常組織中，由此首次支持包含能夠在患者中直接殺死腫瘤細胞之活性Fc的抗體型式的使用。

特別地，本發明提供一種特異性結合於人類HLA-G之抗體，其包含： a. 輕鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2，及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。

現將參照特定的非限制性態樣及其實施例且參考某些圖及實例描述本發明。

除非另外指示，否則技術術語係根據其常見含義使用。若向某些術語傳遞特定含義，則將在使用該等術語之上下文中給定術語之定義。

當術語「包含(comprising)」用於本說明書及申請專利範圍中時，不排除其他要素。出於本發明之目的，認為術語「由……組成(consist of)」為術語「包含(comprising of)」之一較佳實施例。

除非特定陳述某物，否則若在提及單數名詞時使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a/an)」或「該(the)」，則其包括複數個該名詞。

本發明提供一種針對HLA-G之抗體。在第一態樣中，本發明提供一種特異性結合於HLA-G之抗體，其包含： a. 輕鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2，及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。

HLA-G術語「HLA-G」或「人類HLA-G」係指人類白血球抗原G，其為一種經典HLA-I分子，亦稱為人類主要組織相容性複合體I分子(MHC)。通常，HLA-G與B2m一起形成MHC-I複合體。

除非另外規定，否則術語「HLA-G」係指天然由細胞表現的人類HLA-G之任何選擇式剪接或天然變體或同功異型物。完整人類HLA-G之例示性序列包含SEQ ID NO: 107中所載之序列。

在一些態樣中，本發明之抗體選擇性結合於HLA-G之胞外域(ECD) (或「HLA-G ECD」)。HLA-G ECD之例示性序列包含SEQ ID NO: 108中所載之序列。

HLA-G及其同功異型物之胺基酸及核酸序列亦為此項技術中熟知的。

已鑑定出HLA-G之七種同功異型物，四種為膜結合性的(HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4)且三種為可溶性的(HLA-G5、HLA-G6及HLA-G7)，該等同功異型物係HLA-G初級轉錄物之選擇式剪接的結果 ( 圖 1)。腎臟腫瘤之mRNA分析顯示額外同功異型物，其中一些不具有α1域，但此等同功異型物尚未在蛋白質水準下確認(Tronik-Le Roux等人, Molecular Oncology 11 (2017) 1561-1578)。

HLA-G1及HLA-G5具有與經典HLA-I分子(亦即異二聚體分子)類似之結構，其包含呈現3個與輕鏈(亦即β-2-微球蛋白(縮寫為「β2m」或「B2m」))相關之球狀域(α ₁、α ₂及α ₃)的重鏈。HLA-G1及HLA-G5亦可以無α鏈形式存在，亦即不與B2m複合。

HLA-G2及HLA-G6僅包含α1及α3域。HLA-G4僅包含α1及α2域。HLA-G3及HLA-G7僅包含α1域。

在一個實施例中，本發明之抗體結合於HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4、HLA-G5、HLA-G6及HLA-G7中之至少一者。在一個實施例中，本發明之抗體結合於所有包含α3域之HLA-G同功異型物，亦即結合於HLA-G1、HLA-G2、HLA-G5及HLA-G6，包括與B2m複合及表現為無B2m分子之HLA-G1及HLA-G5。

HLA-G1及HLA-G5可形成同源多聚體，諸如二硫鍵鍵結之二聚體及三聚體。在一個實施例中，本發明之抗體結合於單體HLA-G。在一個實施例中，本發明之抗體結合於二聚HLA-G。在一個實施例中，本發明之抗體結合於三聚HLA-G。在一個實施例中，本發明之抗體結合於單體、二聚及三聚HLA-G。

結合於 HLA-G 之抗體在本發明之上下文中使用的抗體包括全抗體及其功能活性片段(亦即，含有特異性結合抗原之抗原結合域的分子，亦稱為抗原結合片段)。除非上下文另外規定，否則本文中關於抗體所描述之特徵亦適用於抗體片段。抗體可為(或衍生自)單株、多價、多特異性、雙特異性、完全人類、人類化或嵌合抗體。

全抗體，亦稱為「免疫球蛋白(Ig)」，一般係指完整或全長抗體，亦即包含藉由二硫鍵互連之兩條重鏈及兩條輕鏈之元件，其進行組裝以界定特徵性Y形三維結構。經典天然全抗體為單特異性的，因為其結合一種抗原類型，且為二價的，因為其具有兩個獨立抗原結合域。術語「完整抗體」、「全長抗體」及「全抗體」可互換使用，係指具有與天然抗體結構類似之結構的單特異性二價抗體，包括如本文所定義之Fc區。

在全抗體中，各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區(CL)。視Ig類別而定，各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及由三個恆定域CH1、CH2及CH3或四個恆定域CH1、CH2、CH3及CH4構成之重鏈恆定區(CH)。Ig或抗體之「類別」係指恆定區的類型，且包括IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干個可進一步劃分成子類，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合於宿主組織或因子，包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。

根據本發明之抗體之VH及VL區可進一步細分為決定抗原之識別的高變區(region of hypervariability) (或「高變區(hypervariable region)」或HVR)，稱為互補決定區(CDR)，其中穿插有結構上更保守的區域，稱為構架區(FR)。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下次序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR及FR共同形成可變區。按照慣例，抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區中之CDR被稱為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且輕鏈可變區中之CDR被稱為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。該等CDR在自各鏈之N端至C端之方向上依序編號。

CDR習知地根據Kabat等人設計之系統進行編號。此系統闡述於Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest，美國衛生與人群服務部(US Department of Health and Human Services), NIH, USA (下文稱「Kabat等人(同前文獻)」中。除非另有規定，否則在本說明書中使用此編號系統。

Kabat殘基名稱不總是直接與胺基酸殘基之線性編號對應。對應於基本可變域結構中結構組分(無論是構架或互補決定區(CDR))的縮短或插入，實際線性胺基酸序列含有的胺基酸可比嚴格Kabat編號少或含有額外胺基酸。對於給定抗體，可藉由比對抗體序列與「標準」Kabat編號序列之同源殘基來確定殘基之正確Kabat編號。

根據Kabat編號系統，重鏈可變域之CDR位於殘基31-35 (CDR-H1)、殘基50-65 (CDR-H2)及殘基95-102 (CDR-H3)處。然而，根據Chothia (Chothia, C.及Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))，等同於CDR-H1的環自殘基26延伸至殘基32。因此，除非另外規定，否則如本文所採用之『CDR-H1』意欲指殘基26至35，根據Kabat編號系統與Chothia拓樸環(topological loop)定義之組合所描述。

根據Kabat編號系統，輕鏈可變域之CDR位於殘基24-34 (CDR-L1)、殘基50-56 (CDR-L2)及殘基89-97 (CDR-L3)處。

除CDR環之外，在CDR-2 (CDR-L2或CDR-H2)與CDR-3 (CDR-L3或CDR-H3)之間存在第四個環，其由構架3 (FR3)形成。Kabat編號系統界定構架3為重鏈中之位置66-94及輕鏈中之位置57-88。

基於免疫球蛋白家族之不同成員之序列的比對，已提出編號方案，且其例如描述於Kabat等人, 1991及Dondelinger等人, 2018, Frontiers in Immunology, 第9卷, 文章2278中。

本發明之抗體包含輕鏈可變區，其包含有包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及重鏈可變區，其包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。

在一個實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區之CDR；及重鏈可變區，其包含SEQ ID NO 93之重鏈可變區之CDR。

包含此等CDR序列之抗體尤其具有發明性，因為其提供對HLA-G具有高親和力、對HLA-G具有高特異性(尤其對其他HLA-I分子沒有交叉反應性，儘管其具有極高同源性)、高度抑制HLA-G生物功能且具有可製造性所必需之高穩定性的抗體。此外，當包含此等CDR序列之抗體與活性Fc組合時，其提供能夠直接殺死HLA-G+腫瘤細胞之抗體。

如本文所用，術語「恆定域」、「恆定區」可互換使用，係指抗體中在可變區外部之域。恆定域在相同同型之所有抗體中一致，但在同型之間係不同的。通常，重鏈恆定區自N端至C端由包含三個或四個恆定域之CH1-鉸鏈-CH2-CH3-視情況CH4形成。

本發明之抗體分子之恆定區域(若存在)可根據抗體分子之建議功能及尤其可能需要的效應功能來選擇。舉例而言，恆定區域可為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域。特別地，當抗體分子意欲用於治療用途且需要抗體效應功能時，可使用人類IgG恆定區域，尤其是IgG1及IgG3同型。或者，當抗體分子意欲用於治療目的且不需要抗體效應功能時，可使用IgG2及IgG4同型。應瞭解，亦可使用此等恆定區域之序列變體。舉例而言，可使用IgG4分子，其中如Angal等人(Angal等人, 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody as observed during SDS-PAGE analysis Mol Immunol 30, 105-108)中所描述，位置241 (根據Kabat編號系統進行編號)處之絲胺酸已變為脯胺酸，且在本文中稱為IgG4P。

「Fc」、「Fc片段」及「Fc區」可互換使用，係指抗體之包含除第一恆定區免疫球蛋白域以外的抗體恆定區之C端區。因此，Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定域C _H2及C _H3，或IgE及IgM之最後三個恆定域，及此等域之N端的可撓性鉸鏈。人類IgG1重鏈Fc區在本文中定義為包含殘基C226至其羧基端，其中編號係根據如Kabat中之EU索引。在人類IgG1之情形下，根據如Kabat中之EU索引，下部鉸鏈係指位置226-236，CH2域係指位置237-340，且CH3域係指位置341-447。其他免疫球蛋白之相對應Fc區可藉由序列比對來鑑定。

在本發明之上下文中，當存在時，恆定區或Fc區可為天然的，如上文所定義，或另外可以各種方式進行修飾，條件為其包含功能性FcR結合域，且較佳包含功能性FcRn結合域。較佳地，經修飾之恆定區或Fc區改善功能性及/或藥物動力學。修飾可包括Fc片段之某些部分之缺失。修飾可進一步包括能夠影響抗體之生物特性的多種胺基酸取代。亦可存在用於增加FcRn結合且因此增加活體內半衰期之突變。修飾可進一步包括抗體之糖基化概況之修飾。天然Fc片段在CH2域中糖基化，其中在兩條重鏈中之各者上存在結合於位置297處之天冬醯胺殘基(Asn297)的N-聚糖。在本發明之上下文中，抗體可經糖基修飾，亦即經工程改造以具有特定糖基化概況，例如引起改良之特性，例如改良之效應功能及/或改良之血清半衰期。

分離本文所描述之抗體。「經分離之」抗體為已與其天然環境之組分分離(例如藉由純化方式分離)的抗體。

術語「抗體」涵蓋單價抗體，亦即，僅包含一個抗原結合域之抗體(例如，包含互連的全長重鏈及全長輕鏈之單臂抗體，亦稱為「半抗體」)，及多價抗體，亦即包含超過一個抗原結合域之抗體。

根據本發明之術語「抗體」亦涵蓋抗體之抗原結合片段。

抗體之抗原結合片段包括單鏈抗體(例如scFv及dsscfv)、Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fv、單域抗體或奈米抗體(例如VH或VL，或VHH或VNAR)。用於本發明中之其他抗體片段包括國際專利申請案WO2011/117648、WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171中所描述之Fab及Fab'片段。

用於產生及製造此等抗體片段之方法為此項技術中熟知的(參見例如Verma等人, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。

如本文所用之術語「Fab片段」係指包含有包含VL (可變輕鏈)域及輕鏈之恆定域(CL)的輕鏈片段以及VH (可變重鏈)域及重鏈之第一恆定域(CH1)的抗體片段。

典型的「Fab'片段」包含重鏈及輕鏈對，其中重鏈包含可變區VH、恆定域CH1及天然或經修飾之鉸鏈區，且輕鏈包含可變區VL及恆定域CL。根據本發明之Fab'之二聚體產生F(ab') ₂，其中例如二聚化可經由鉸鏈進行。

如本文所用之術語「單域抗體」係指由單一單體可變抗體域組成之抗體片段。單域抗體之實例包括VH或VL或VHH或VNAR。

「Fv」係指兩個可變域，例如協作可變域，諸如同源對或親和力成熟可變域，亦即VH及VL對。

如本文所使用之「單鏈可變片段」或「scFv」係指藉由VH與VL可變域之間的肽連接子穩定化的單鏈可變片段。

如本文所使用之「二硫鍵穩定化之單鏈可變片段」或「dsscFv」係指藉由VH與VL可變域之間的肽連接子穩定化且亦包括VH與VL之間的域間二硫鍵的單鏈可變片段。(參見例如Weatherill等人, Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012, WO2007109254)。

在一個實施例中，可變域VH與VL之間的二硫鍵在以下所列之殘基中之兩者之間(除非上下文另外規定，否則在以下清單中均採用Kabat編號)。當參考Kabat編號時，相關參考文獻為Kabat等人, 1991 (第5版, Bethesda, Md.), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 美國衛生與人群服務部, NIH, USA。

在一個實施例中，二硫鍵位於選自包含以下之群之位置中： ● VH37 + VL95C，參見例如Protein Science 6, 781-788 Zhu等人(1997)； ● VH44 + VL100，參見例如Weatherill等人, Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012； ● VH44 + VL105，參見例如J Biochem. 118, 825-831 Luo等人(1995)； ● VH45 + VL87，參見例如Protein Science 6, 781-788 Zhu等人(1997)； ● VH55 + VL101，參見例如FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)； ● VH100 + VL50，參見例如Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber等人(1990)； ● VH100b + VL49，參見例如Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber等人(1990)； ● VH98 + VL46，參見例如Protein Science 6, 781-788 Zhu等人(1997)； ● VH101 + VL46，參見例如Protein Science 6, 781-788 Zhu等人(1997)； ● VH105 + VL43，參見例如Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第90卷第7538-7542頁 Brinkmann等人(1993)；或Proteins 19, 35-47 Jung等人(1994)， ● VH106 + VL57，參見例如FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995) 及位於分子中之可變區對中的與其相對應的一或多個位置。

在一個實施例中，在位置VH44與VL100之間形成二硫鍵。

多特異性抗體本發明之抗體可為多特異性抗體。如本文所使用之「多特異性(multispecific/multi-specific)抗體」係指具有至少兩個結合域(亦即兩個或更多個結合域，例如兩個或三個結合域)的如本文所描述之抗體，其中該至少兩個結合域獨立地結合兩種不同抗原或相同抗原上之兩種不同抗原決定基。多特異性抗體對於各特異性(抗原)而言通常為單價的。本文所描述之多特異性抗體涵蓋單價及多價，例如二價、三價、四價多特異性抗體。

在一個實施例中，構築體為雙特異性抗體。如本文所使用之「雙特異性(bispecific/bi-specific)抗體」係指具有兩種抗原結合特異性之抗體。在一個實施例中，抗體包含兩個抗原結合域，其中一個結合域結合抗原1 (ANTIGEN 1)，且另一個結合域結合抗原2 (ANTIGEN 2)，亦即各結合域對於各抗原呈單價。在一個實施例中，抗體為四價雙特異性抗體，亦即抗體包含四個抗原結合域，其中例如兩個結合域結合抗原1 (ANTIGEN 1)，且另兩個結合域結合抗原2 (ANTIGEN 2)。在一個實施例中，抗體為三價雙特異性抗體。

在一個實施例中，抗體構築體為三特異性抗體。如本文所使用之「三特異性(trispecific/tri-specific)抗體」係指具有三種抗原結合特異性之抗體。舉例而言，抗體為具有三個抗原結合域(三價)之抗體，該三個抗原結合域獨立地結合三種不同抗原或相同抗原上之三種不同抗原決定基，亦即各結合域對於各抗原為單價的。

互補位為抗體中識別且結合於抗原之區。本發明之抗體可為多互補位抗體。如本文所使用之「多互補位抗體」係指包含兩個或更多個不同互補位的如本文所描述之抗體，該等互補位與來自相同抗原或兩種不同抗原之不同抗原決定基相互作用。本文所描述之多互補位抗體可為雙互補位、三互補位、四互補位抗體。

如本文所使用之「抗原結合域」係指抗體之如下部分，其包含與標靶抗原特異性相互作用的一或多個可變域之一部分或全部，例如一對可變域VH及VL之一部分或全部。結合域可包含單域抗體。在一個實施例中，各結合域為單價的。較佳地，各結合域包含不超過一個VH及一個VL。

已產生多種多特異性抗體型式。已提出不同分類，但多特異性IgG抗體型式一般包括雙特異性IgG、附加IgG、多特異性(例如，雙特異性)抗體片段、多特異性(例如，雙特異性)融合蛋白及多特異性(例如，雙特異性)抗體結合物，如例如Spiess等人, Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106中所描述。

用於製備雙特異性抗體之技術包括(但不限於) CrossMab技術(Klein等人, Engineering therapeutic bispecific antibodies using CrossMab technology, Methods 154 (2019) 21-31)、杵臼工程改造(Knobs-in-holes engineering) (例如，WO1996027011、WO1998050431)、DuoBody技術(例如，WO2011131746)、Azymetric技術(例如，WO2012058768)。用於製備雙特異性抗體之其他技術已描述於例如Godar等人, 2018, Therapeutic bispecific antibody formats: a patent applications review (1994-2017), Expert Opinion on Therapeutic Patents, 28:3, 251-276中。雙特異性抗體尤其包括CrossMab抗體、DAF (二合一)、DAF (四合一)、DutaMab、DT-lgG、杵臼常用LC、杵臼組裝體、電荷對(Charge pair)、Fab臂交換、SEED抗體(SEEDbody)、三功能單抗(Triomab)、LUZ-Y、Fcab、κλ抗體及正交Fab。

附加IgG通常包含藉由將額外抗原結合域或抗原結合片段附加至IgG之重鏈及/或輕鏈之N端及/或C端而工程改造的全長IgG。此類額外抗原結合片段之實例包括sdAb抗體(例如VH或VL)、Fv、scFv、dsscFv、Fab、scFav。附加IgG抗體型式尤其包括DVD-IgG、lgG(H)-scFv、scFv-(H)lgG、lgG(L)-scFv、scFv-(L)lgG、lgG(L,H)-Fv、lgG(H)-V、V(H)-lgG、lgC(L)-V、V(L)-lgG、KIH IgG-scFab、2scFv-lgG、lgG-2scFv、scFv4-lg、Zy抗體(Zybody)及DVI-IgG (四合一)，例如如Spiess等人, Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106中所描述。

多特異性抗體片段包括奈米抗體、奈米抗體-HAS、BiTE、雙功能抗體、DART、TandAb、sc雙功能抗體、sc-雙功能抗體-CH3、雙功能抗體-CH3、三功能抗體(Triple Body)、微型抗體(Miniantibody)；微型抗體(Minibody)、三聚體雙特異性微型抗體(Tri Bi minibody)、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙功能抗體-Fc、雙功能抗體-Fc、串聯scFv-Fc；及胞內抗體，如例如Spiess等人, Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106所描述。

多特異性融合蛋白包括鎖鑰結構(Dock and Lock)、ImmTAC、HSA抗體(HSAbody)、sc雙功能抗體-HSA及串聯scFv-毒素。

多特異性抗體結合物包括IgG-lgG；Cov-X抗體；及scFv1-PEG-scFv2。

已於例如Brinkmann及Kontermann, The making of bispecific antibodies, mAbs, 9:2, 182-212 (2017)中，尤其在圖2中描述額外多特異性抗體型式，例如串聯scFv、三功能抗體、Fab-VHH、taFv-Fc、scFv ₄-Ig、scFv ₂-Fcab、scFv ₄-IgG。雙功能抗體、三功能抗體及其產生方法揭示於例如WO99/37791中。

用於本發明中之抗體之實例包括附加IgG及附加Fab，其中全IgG或Fab片段分別藉由將至少一個額外抗原結合域(例如兩個、三個或四個額外抗原結合域)，例如單域抗體(諸如VH或VL，或VHH)、scFv、dsscFv、dsFv附加至該IgG或Fab之重鏈及/或輕鏈之N端及/或C端而工程改造，例如如WO2009/040562、WO2010/035012、WO2011/030107、WO2011/061492、WO2011/061246及WO2011/086091中所描述。特別地，Fab-Fv型式描述於WO2009/040562中，且其二硫鍵穩定型式Fab-dsFv描述於WO2010/035012中。單一連接子Fab-dsFv描述於WO2014/096390中，其中dsFv經由Fv之VL或VH域與Fab之LC或HC之C端之間的單一連接子連接至Fab。藉由將dsFv附加至IgG之重鏈或輕鏈之C端而工程改造的包含全長IgG1之附加IgG描述於WO2015/197789中。

用於本發明中之另一實例抗體包含連接至兩個scFv或dsscFv之Fab，各scFv或dsscFv結合相同或不同標靶(例如，一個scFv或dsscFv結合治療標靶且一個scFv或dsscFv藉由結合例如白蛋白來延長半衰期)。此類抗體描述於WO2015/197772中。用於本發明片段中之另一實例抗體包含僅連接至一個scFv或dsscFv之Fab，如例如WO2013/068571及Dave等人, Mabs, 8(7) 1319-1335 (2016)中所描述。

多特異性抗體之其他熟知型式包含：

如本文所使用之雙功能抗體係指兩個Fv對，第一VH/VL對及另一VH/VL對，該等VH/VL對具有兩個Fv間連接子，使得第一Fv之VH連接至第二Fv之VL且第一Fv之VL連接至第二Fv之VH。

如本文所使用之三功能抗體係指類似於雙功能抗體之包含三個Fv及三個Fv間連接子之型式。

如本文所使用之四功能抗體係指類似於雙功能抗體之包含四個Fv及四個Fv間連接子之型式。

如本文所使用之串聯scFv係指經由單一連接子連接，使得存在單一Fv間連接子之至少兩個scFv。

如本文所使用之串聯scFv-Fc係指至少兩個串聯scFv，其中每一者例如經由鉸鏈附加至恆定區片段-CH2CH3之CH2域之N端。

如本文所使用之Fab-Fv係指可變區附加至以下每一者之C端的Fv片段：重鏈之CH1及輕鏈之CL。該型式可以其聚乙二醇化版本形式提供。

如本文所使用之Fab'-Fv類似於FabFv，其中Fab部分經Fab'置換。該型式可以其聚乙二醇化版本形式提供。

如本文所使用之Fab-dsFv係指其中Fv內二硫鍵使附加之C端可變區穩定的FabFv。該型式可以其聚乙二醇化版本形式提供。

如本文所使用之Fab-scFv為scFv附加在輕鏈或重鏈之C端上之Fab分子。

如本文所使用之Fab'-scFv為scFv附加在輕鏈或重鏈之C端上之Fab'分子。

如本文所使用之diFab係指經由重鏈之C端連接之兩個Fab分子。

如本文所使用之diFab'係指經由鉸鏈區中之一或多個二硫鍵連接的兩個Fab'分子。

如本文所使用之sc雙功能抗體為一種雙功能抗體，其包含Fv內連接子，使得該分子包含三個連接子且形成正常scFv，其VH及VL末端各自連接至另一Fv對之可變區中之一者。

如本文所使用之sc雙功能抗體-Fc為兩個sc雙功能抗體，其中每一者例如經由鉸鏈附加至恆定區片段-CH2CH3之CH2域之N端。

如本文所使用之scFv-Fc-scFv係指四個scFv，其中每一者附加至-CH2CH3片段之重鏈及輕鏈之N端及C端。

如本文所使用之sc雙功能抗體-CH3係指兩個sc雙功能抗體分子，其各自例如經由鉸鏈連接至CH3域。

如本文所使用之IgG-scFv為在每個重鏈或每個輕鏈之C端上具有scFv的全長抗體。

如本文所使用之scFv-IgG為在每個重鏈或每個輕鏈之N端上具有scFv的全長抗體。

如本文所使用之V-IgG為在每個重鏈或每個輕鏈之N端上具有可變域的全長抗體。

如本文所使用之IgG-V為在每個重鏈或每個輕鏈之C端上具有可變域的全長抗體。

DVD-Ig (亦稱為雙重V域IgG)為具有4個額外可變域(每條重鏈及每條輕鏈之N端上具有一個)之全長抗體。

本發明提供一種多特異性抗體，其包含一個特異性結合於HLA-G之結合域，該結合域包含： a. 輕鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2，及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。

本發明之抗體特異性(或選擇性)結合HLA-G。當抗體以優先或高親和力結合於所關注蛋白質(例如HLA-G)且實質上不結合於其他蛋白質時，該抗體「特異性結合」該蛋白質。換言之，抗體結合於所關注蛋白質且對任何其他分子不具有顯著交叉反應性。抗體之特異性可藉由確定抗體是否結合於如上文所論述之其他相關蛋白質或其是否對如上文所論述之其他相關蛋白質進行區別來進一步研究。

特別地，「特異性結合」HLA-G之抗體對另一人類蛋白質，尤其另一HLA-I分子不具有交叉反應性。在一個實施例中，本發明之抗體不實質上結合於HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E及HLA-F中之任一者。在一個實施例中，本發明之抗體不結合於HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E及HLA-F中之任一者。HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E及HLA-F之例示性序列分別為SEQ ID NO: 132、134、136、138及140。在一個實施例中，本發明之抗體不結合於B2m。

本發明之抗體可特異性結合HLA-G之α3域。應理解，「特異性結合HLA-G之α3域」意謂抗體結合HLA-G之α3域且對另一人類蛋白質沒有交叉反應性並且對HLA-G之另一域(例如α1或α2域)沒有交叉反應性。

交叉反應性可例如藉由本文所描述之任何適合方法評定。若抗體與另一分子之結合係其與所關注蛋白質之結合強度之至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或100%，則可認為抗體之交叉反應性顯著。特異性(或選擇性)抗體可以其結合於所關注蛋白質之強度之小於約90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%或20%的強度結合於另一分子。抗體可以其結合於所關注蛋白質之強度之小於約20%、小於約15%、小於約10%或小於約5%、小於約2%或小於約1%的強度結合於另一分子。

在一個實施例中，根據本發明，抗體與HLA-G之結合由小於20 nM、尤其小於15 nM、尤其小於10 nM、尤其小於9 nM、尤其小於8 nM、尤其小於7 nM、尤其小於6 nM、尤其小於5 nM之解離常數(K _D)表徵。

如本文所用之術語「K _D」係指平衡解離常數，其由K _d與K _a之比率(亦即K _d/K _a)獲得且以莫耳濃度(M)表示。K _d及K _a分別係指特定抗原-抗體(或其抗原結合片段)相互作用之解離速率及締合速率。抗體之K _D值可使用此項技術中沿用已久之方法測定。一種用於測定抗體之K _D的方法係藉由使用重組HLA-G或其適合融合蛋白/多肽使用表面電漿子共振(SPR) (諸如Biacore®系統，例如如本文實例中所描述)進行。通常，K _D值係在25℃之溫度下藉由SPR測定。在一個實例中，親和力係使用以與B2m之複合物形式表現的重組HLA-G胞外域(ECD)來量測，如本文實例中所描述。對於表面電漿子共振，將標靶分子固定於固相上且在沿流槽延伸之移動相中暴露於配體。若發生配體與固定標靶之結合，則局部折射率改變，引起SPR角之變化，其可藉由偵測反射光強度之變化而進行即時監測。可分析SPR信號之變化速率以產生結合反應之締合及解離相的表觀速率常數。此等值之比率得到表觀平衡常數(親和力) (參見例如Wolff等人, Cancer Res. 53:2560-65 (1993))。

術語「親和力」係指抗體與HLA-G之間的相互作用之強度。

與HLA-G之結合親和力可針對與B2m相關或不相關之HLA-G或HLA-G ECD進行量測。舉例而言，與HLA-G之結合可藉由量測與包含序列SEQ ID NO: 108或110之可溶性HLA-G ECD的結合親和力來評定。在一個實例中，與HLA-G之結合係藉由量測與同B2m相關的例如包含序列SEQ ID NO: 108或110之可溶性HLA-G ECD的結合親和力來評定。在一個實施例中，本發明之抗體以小於20 nM、尤其小於15 nM、尤其小於10 nM、尤其小於9 nM、尤其小於8 nM、尤其小於7 nM、尤其小於6 nM、尤其小於5 nM之解離常數(K _D)結合於HLA-G之ECD。在一個實施例中，表現為全長抗體之本發明抗體與單體形式之HLA-G (例如與B2m相關之HLA-G ECD)之間的解離常數係在25℃之溫度下藉由SPR測定。在一個實施例中，解離常數如實例7.1中所描述藉由SPR測定。

在另一實例中，與HLA-G之結合可藉由量測與細胞膜所表現之包含序列SEQ ID NO: 107之HLA-G的結合親和力來評定。與細胞膜所表現之HLA-G的結合可藉由FACS分析。通常，在細胞表面表現之HLA-G以二聚形式表現。在一個實施例中，藉由FACS所測定，本發明之抗體以小於2 nM、較佳小於1 nM之解離常數(K _D)結合於細胞上之HLA-G。在一個實施例中，藉由FACS所測定，本發明之抗體以小於1 nM之解離常數(K _D)結合於JEG3細胞。

在一個實施例中，本發明提供一種特異性結合於HLA-G之抗體，其包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且其中該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；且其中該抗體具有小於20 nM、尤其小於15 nM、尤其小於10 nM、尤其小於9 nM、尤其小於8 nM、尤其小於7 nM、尤其小於6 nM、或尤其小於5 nM之解離常數(K _D)。在一個實施例中，表現為全長抗體之本發明抗體與單體形式之HLA-G之間的解離常數係在25℃之溫度下藉由SPR測定。

在一個實施例中，本發明提供一種特異性結合於HLA-G之抗體，其包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且其中該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；且其中藉由FACS所測定，表現為全長抗體之該抗體以小於2 nM、較佳小於1 nM之解離常數(K _D)結合於JEG3細胞。

在一個實施例中，本發明之抗體為阻斷抗體。在抗體之上下文中，術語「阻斷(blocking)」(或「阻斷(block)」)描述能夠抑制或減弱其標靶(HLA-G)與其受體之結合的抗體。在一個實施例中，本發明之抗體阻斷HLA-G與ILT2之間的相互作用。在一個實施例中，本發明之抗體阻斷HLA-G與ILT4之間的相互作用。在一個實施例中，本發明之抗體阻斷HLA-G與ILT2之間及HLA-G與ILT4之間的相互作用。在一個實施例中，當HLA-G表現為單體及/或二聚體及/或三聚體時，本發明之抗體阻斷HLA-G與ILT2之間及/或HLA-G與ILT4之間的相互作用。

HLA-G與ILT2及/或ILT4結合之阻斷可藉由量測細胞表面處所表現的與B2m相關或不相關的HLA-G之胞外域(ECD)與例如表現為融合蛋白(諸如Fc融合蛋白(ITT2-Fc.ILT4-Fc))之ILT2及/或ILT4之間的相互作用之阻斷來評定。可使用ILT2-兔Fc融合蛋白，其包含例如SEQ ID NO: 142。可使用ILT4-兔Fc融合蛋白，其包含例如SEQ ID NO: 144。HLA-G與ILT2及/或ILT4結合之阻斷可如實例8中所描述進行評定。

在一些實施例中，本發明之抗體不阻斷HLA-G與B2m之間的締合。在一些實施例中，本發明之抗體不阻斷HLA-G與其天然以與HLA-G之複合物形式表現的同源肽之間的締合。

在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G之多聚化。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G之二聚化。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G之三聚化。

在一個實施例中，根據本發明之抗體阻斷ILT2與HLA-G之結合的IC ₅₀小於50 pM，較佳地，根據本發明之抗體阻斷ILT2與如JEG3細胞表面處天然表現之HLA-G之結合的IC ₅₀小於40 pM、或小於30 pM、或小於20 pM，例如如實例8中所描述使用大體積反應使用活體外分析所測定。在較佳實施例中，根據本發明之抗體阻斷ILT2與如JEG3細胞表面處天然表現之HLA-G之結合的IC ₅₀小於20 pM。在一個實施例中，ILT2表現為ILT2-兔Fc融合蛋白，其包含例如SEQ ID NO: 142。在一個實施例中，在如本文所描述之活體外分析中，根據本發明之抗體阻斷ILT4與HLA-G之結合的IC ₅₀小於1800 pM，較佳地，根據本發明之抗體阻斷ILT4與HLA-G之結合的IC ₅₀小於1500 pM、或小於1400 pM。在一個實施例中，ILT4表現為ILT4-兔Fc融合蛋白，其包含例如SEQ ID NO: 144。HLA-G與ILT4結合之阻斷可如實例8中所描述進行評定。

在一個實施例中，本發明提供一種特異性結合於HLA-G之抗體，其包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且其中該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；且其中該抗體： a. 阻斷ILT2與如JEG3細胞表面處天然表現之HLA-G之結合的IC ₅₀小於20 pM，例如如實例8中所描述使用大體積反應使用活體外分析所測定；及/或 b. 阻斷ILT4與HLA-G之結合的IC ₅₀小於1400 pM，例如如實例8中所描述測定。

如本文所用之術語IC ₅₀係指半最大抑制濃度，其係物質(諸如抗體)在抑制特定生物或生物化學功能(在本發明中為ILT2或ILT4與HLA-G之結合活性)之效果的量度。IC ₅₀係定量量度，其指示將指定生物過程或功能或活性抑制一半所需之特定物質量。

在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之免疫遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體藉由阻斷HLA-G與ILT2之間的相互作用及/或HLA-G與ILT4之間的相互作用來抑制HLA-G介導之免疫遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之NK細胞遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之細胞毒性T淋巴細胞(諸如CD8+ T淋巴細胞及/或CD4+ T淋巴細胞)遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之調節性T淋巴細胞遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之B細胞遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之單核球遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之巨噬細胞遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之樹突狀細胞遏制功能。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之嗜中性球遏制。在一些實施例中，本發明之抗體抑制HLA-G介導之吞噬作用遏制。

在一些實施例中，本發明之抗體誘導促發炎細胞介素，諸如TNFα、IL-1、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 (亦稱為IL-12p70)、IL-13、IL-15、IL-18、IFNγ、GM-CSF、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、TNFα之產生。在一些實施例中，本發明之抗體促進免疫細胞(單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞、T細胞或NK細胞)募集至腫瘤微環境中。在一些實施例中，本發明之抗體抑制表現HLA-G之腫瘤細胞上之HLA-G功能。在一些實施例中，本發明之抗體誘導骨髓細胞之活化。在一些實施例中，本發明之抗體例如藉由ADCC或CDC誘導腫瘤細胞殺死。在一些實施例中，本發明之抗體誘導腫瘤細胞吞噬作用，例如ADCP。在一些實施例中，本發明之抗體抑制血管生成。在一些實施例中，本發明之抗體抑制腫瘤細胞轉移。在一些實施例中，本發明之抗體抑制腫瘤細胞增殖。

在一個實施例中，本發明提供一種特異性結合於HLA-G之抗體，其包含： a. 輕鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2，及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3，其中該抗體阻斷HLA-G與ILT2及/或ILT4之結合，較佳阻斷HLA-G與ILT2及ILT4之結合，且其中該抗體對HLA-G之解離常數(KD)小於10 nM。在一個實施例中，KD值係使用本發明之全長抗體在25℃之溫度下藉由SPR測定。在一個實施例中，解離常數係針對單體形式之HLA-G進行測定。

在一個實施例中，本發明提供一種特異性結合於HLA-G之抗體，其包含： a. 輕鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2，及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含：包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3，其中該抗體抑制如上文所描述的HLA-G介導之免疫遏制功能中之至少一者。

用於本發明中之抗體可為嵌合抗體、人類化抗體或完全人類抗體。

在一個實施例中，抗體為嵌合抗體。術語「嵌合」抗體係指如下抗體，其中重鏈及/或輕鏈之可變域(或其至少一部分)來源於特定來源或物種(例如小鼠、大鼠、兔或類似者)，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分(亦即，恆定區)來源於另一物種(諸如人類)。(Morrison; PNAS 81, 6851 (1984))。嵌合抗體由來源於兩個不同物種之元件構成，使得元件保留衍生其之物種的特性。「嵌合抗體」之子類別為「人類化抗體」。

通常使用重組DNA方法來製備嵌合抗體。DNA可藉由用人類L及H鏈恆定區之編碼序列取代對應非人類(例如鼠類或兔) H及L恆定區來修飾。

人類化抗體(其包括CDR移植抗體)為具有一或多個來自非人類物種之互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區的抗體分子(參見例如US 5,585,089；WO91/09967)。應瞭解，可能僅需要轉移CDR之特異性決定殘基而非整個CDR (參見例如Kashmiri等人, 2005, Methods, 36, 25-34)。人類化抗體可視情況進一步包含一或多個來源於衍生CDR之非人類物種的構架殘基。

完全人類抗體係其中重鏈及輕鏈之可變區及恆定區(當存在時)為全人源的或與人源序列實質上一致但未必來自相同抗體的彼等抗體。完全人類抗體之實例可包括例如藉由上文所描述之噬菌體呈現方法產生的抗體，及藉由其中鼠類免疫球蛋白可變區及視情況恆定區基因已經其人類對應物置換之小鼠產生的抗體，例如如EP 0546073、US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016、US 5,770,429、EP 0438474及EP 0463151中所概括地描述。

在一個實施例中，抗體為人類抗體。若抗體之可變區或全長鏈係自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統獲得，則人類抗體包含作為特定生殖系序列之「產物」或「來源於」特定生殖系序列之重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。此類系統包括用所關注之抗原使攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫或用所關注之抗原篩選呈現在噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫。作為人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體或其片段可藉由將人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列進行比較且選擇在序列上最接近人類抗體序列(亦即最大一致性%)之人類生殖系免疫球蛋白序列來如此識別。作為特定人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」特定人類生殖系免疫球蛋白序列的人類抗體可含有與生殖系序列相比因例如天然存在之體細胞突變或有意引入之定點突變所致的胺基酸差異。然而，所選擇的人類抗體通常在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如，鼠類生殖系序列)相比時鑑定人類抗體為人類的胺基酸殘基。在某些情況下，人類抗體在胺基酸序列上與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列可至少60%、70%、80%、90%、或至少95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，來源於特定人類生殖系序列之人類抗體與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比將呈現不超過10個胺基酸差異。在某些情況下，人類抗體與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比可呈現不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。

人類抗體可藉由熟習此項技術者已知的多種方法生產。人類抗體可藉由融合瘤方法使用人類骨髓瘤或小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株製得(Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001；Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁, Marcel Dekker Inc, 1987)。替代方法包括使用噬菌體庫或轉殖基因小鼠，其兩者均利用人類可變區庫(Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455，Green LL, (1999) J Immunol Methods 231 :1 1-23)。

根據本發明之抗體可使用此項技術中已知之任何適合方法獲得。HLA-G (包括其融合蛋白)、(以重組方式或天然)表現HLA-G之細胞可用於產生特異性識別HLA-G之抗體。可使用如本文所描述之各種形式之HLA-G。

在另一實施例中，所用抗原為HLA-G，其較佳表現於兔纖維母細胞之表面處，較佳如下文實例中所描述產生。在一個實施例中，所用抗原為與B2m複合之HLA-G，其較佳表現於兔纖維母細胞之表面處，較佳如下文實例中所描述產生。

用於對宿主進行免疫接種之HLA-G或其片段可藉由此項技術中熟知之方法由包含表現系統之基因工程改造宿主細胞製備。HLA-G或其片段在一些情況下可為較大蛋白質(諸如融合蛋白，例如與親和標籤或類似物融合之融合蛋白)之一部分。

在需要對動物進行免疫接種之情況下，可使用熟知及常規的方案，藉由向動物、較佳非人類動物投與HLA-G或其部分來獲得針對HLA-G所產生的抗體，參見例如Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (編), 第4卷, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)。可對許多動物進行免疫接種，諸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、駱駝或豬。然而，通常使用小鼠、兔、豬及大鼠。在一個實施例中，本發明之抗體藉由在其表面投與表現HLA-G之大鼠纖維母細胞獲得。

可藉由多種技術製備單株抗體，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及使用含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法。本文中描述用於製備單株抗體之一些例示性方法。

舉例而言，可使用融合瘤技術(Kohler及Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、三源融合瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人, 1983, Immunology Today, 4:72)及EBV融合瘤技術(Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 第77-96頁, Alan R Liss, Inc., 1985)製備單株抗體。

用於本發明之抗體可使用單一淋巴細胞抗體方法，藉由選殖及表現免疫球蛋白可變區cDNA產生，該等免疫球蛋白可變區cDNA係由選擇用於產生特異性抗體之單一淋巴細胞，藉由例如Babcook, J.等人, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268及國際專利申請案第WO2004/106377號描述之方法產生。

單株抗體亦可使用此項技術中已知之各種噬菌體呈現方法產生，且包括由Brinkman等人(J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50)、Ames等人(J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186)、Kettleborough等人(Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958)、Persic等人(Gene, 1997 187 9-18)、Burton等人(Advances in Immunology, 1994, 57:191-280)所揭示之方法。在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖且在噬菌體庫中隨機重組，其接著可針對抗原結合噬菌體進行篩選，如Winter等人, Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)中所描述。噬菌體通常以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自免疫來源之庫提供針對免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖(例如自人類選殖)原生譜系以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單一抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人, EMBO J 12: 725-734 (1993)所描述。最後，天然庫亦可以合成方式如下製備：自幹細胞選殖未經重排之V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子來編碼高度可變的CDR3區及完成活體外重排，如Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)所描述。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括例如：US 5,750,373及US 2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936及US2009/0002360。

可使用量測與HLA-G之結合的分析及/或量測阻斷HLA-G與其受體中之一或多者之結合之能力的分析來進行抗體篩選。結合分析之實例為ELISA，例如，使用固定在盤上之標靶多肽之融合蛋白且使用經結合之二級抗體以偵測結合於標靶之抗體。阻斷分析之實例為基於流式細胞測量術之分析，其量測配體蛋白質與標靶多肽之結合之阻斷。使用經螢光標記之二級抗體偵測結合於標靶多肽之此類配體蛋白質之量。

可藉由針對具有一或多種所需活性之抗體篩選組合庫來分離抗體。舉例而言，針對具有所需結合特性之抗體篩選此類庫的各種方法係此項技術中已知的。

根據本發明之抗體可包含產生抗體之動物之構架區。舉例而言，其將包含兔抗體之如上文所定義之CDR及構架區，該兔抗體諸如包含根據SEQ ID NO: 7之輕鏈可變區(其核苷酸序列示於SEQ ID NO: 8中)及根據SEQ ID NO: 11之重鏈可變區(其核苷酸序列示於SEQ ID NO: 12中)。

在一個較佳實施例中，根據本發明之抗體為人類化抗體。

在一個較佳實施例中，結合於HLA-G之抗體(其中抗體為人類化抗體)包含可變輕鏈及可變重鏈，其中： a. 該可變輕鏈包含有包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b. 該可變重鏈包含有包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。

如本文所用，術語「人類化」抗體係指如下抗體，其中重鏈及/或輕鏈含有一或多個來自供體抗體(例如非人類抗體，諸如鼠類或兔單株抗體)之CDR (視需要包括一或多個經修飾之CDR)，該一或多個CDR移植至受體抗體(例如人類抗體)之重鏈及/或輕鏈可變區構架中。關於綜述，參見Vaughan等人，Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998。在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之任一者的決定特異性的殘基中之一或多者轉移至人類抗體構架中而非轉移整個CDR (參見例如Kashmiri等人, 2005, Methods, 36, 25-34)。在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之一或多者的決定特異性的殘基轉移至人類抗體構架中。在另一實施例中，僅將來自上文所描述之各CDR的決定特異性的殘基轉移至人類抗體構架中。

在移植CDR時，關於衍生CDR之供體抗體之類別/類型，可使用任何適當的受體可變區構架序列，包括小鼠、靈長類動物及人類構架區。

較佳地，根據本發明之人類化抗體具有包含人類受體構架區以及一或多個本文中特定提供之CDR的可變域。因此，在一個實施例中，提供一種結合HLA-G之人類化抗體，其中可變域包含人類受體構架區及非人類供體CDR。

可用於本發明之人類構架之實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM (Kabat等人，同前文獻)。舉例而言，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈，且EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈。或者，可使用人類生殖系序列；此等人類生殖系序列可在http://www.imgt.org/處獲得。

在根據本發明之人類化抗體中，受體重鏈及輕鏈不一定需要來源於相同抗體且可視需要包含具有來源於不同鏈之構架區的複合鏈。

適用於根據本發明之人類化抗體之輕鏈的構架區來源於具有SEQ ID NO: 103之人類生殖系IGKV1D-13 IGKJ4，且其核苷酸序列示於SEQ ID NO: 104中。

適用於根據本發明之人類化抗體之重鏈的構架區來源於具有如SEQ ID NO: 105中所示之序列的人類生殖系IGHV3-66 IGHJ4，且其核苷酸序列示於SEQ ID NO: 106中。

因此，在一個實施例中，提供一種結合於HLA-G之人類化抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，且其中： a. 輕鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1；及 ii. 包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2；及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1；及 ii. 包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及 iii. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；且其中該輕鏈構架區來源於包含SEQ ID NO: 103之人類生殖系IGKV1D-13 IGKJ4；且該重鏈構架區來源於包含SEQ ID NO: 105之人類生殖系IGHV3-66 IGHJ4。

在一個實施例中，本發明之抗體包含： a. 包含SEQ ID NO: 19或15或23之輕鏈可變區；及/或 b. 包含SEQ ID NO: 93、27、33、57、69、75、81或87之重鏈可變區。

在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93之重鏈可變區。

在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 23之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 33之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 57之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 69之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 75之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 81之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 87之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 23之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93之重鏈可變區。

在一個實施例中，本發明之抗體為IgG1。在一個實施例中，本發明之抗體為IgG1且包含： a. 包含SEQ ID NO: 21或17或25之輕鏈；及/或 b. 包含SEQ ID NO: 95、29、35、59、71、77、83或89之重鏈。

在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈。

在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 35之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 59之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 71之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 77之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 83之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 89之重鏈。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈。

有利地，IgG1包含活性Fc片段，亦即具有Fc介導之效應功能。因此，在一個實施例中，本發明之抗體包含Fc介導之效應功能。

術語「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區的生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)。

術語「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指誘導細胞死亡之機制，其中與標靶結合的抗體之Fc效應子域結合且活化補體組分C1q，其繼而活化補體級聯，從而引起標靶細胞死亡。

術語「抗體依賴性細胞毒性」或「ADCC」為誘導細胞死亡之機制，其依賴於抗體包覆之標靶細胞與具有溶解活性之效應細胞(諸如自然殺手細胞、單核球、巨噬細胞及嗜中性球)經由表現於效應細胞上之Fcγ受體(FcγR)進行之相互作用。

術語「抗體依賴性細胞吞噬作用」或「ADCP」為誘導吞噬作用之機制，其依賴於抗體包覆之標靶細胞或抗體包覆之可溶性標靶與具有吞噬活性之效應細胞(諸如巨噬細胞及嗜中性球)經由表現於效應細胞上之Fcγ受體(FcγR)進行之相互作用。

如實例中所描述，研究正常非腫瘤組織中之HLA-G之表現模式，且有利地，發現包含本發明抗體所結合之抗原決定基的HLA-G形式不表現於健康組織中，尤其胰臟及垂體組織中。

此發現與文獻中先前已報導之內容形成對比，在該文獻中，Cirulli等人報導HLA-G蛋白表現於胰島中(Cirulli等人, DIABETES, 第55卷, 2006年5月)；其觀測到在支持細胞複製之胞外基質上培養的胰島細胞中HLA-G顯著上調。此外，例如，Boegel等人已報導HLA-G在垂腺以及在胰島及睪丸中之基因表現(Boegel等人, BMC Medical Genomics (2018) 11:36)。

因此，本文實例中所描述之結果為出人意料的，且與根據先前技術之教示內容所預期相反，其顯示能夠例如經由Fc介導之效應功能殺死表現HLA-G之細胞的針對HLA-G之抗體表示用於治療實體腫瘤之潛在候選物，預期其不具有經由結合於正常組織而對患者產生的毒性。另外，包含活性Fc之抗體可促進效應細胞在腫瘤微環境(TME)中之募集及活化，另外，直接殺死HLA-G+腫瘤細胞可誘導腫瘤抗原釋放至局部環境中，其進一步刺激免疫反應。

如本文所描述之此類抗體能夠阻斷HLA-G與其抑制性受體之間的相互作用且能夠殺死細胞的雙重機制表示治療諸如在實體癌中具有HLA-G上調之患者的顯著優點。

另外，腫瘤異質性表明各機制(促進免疫細胞活化之HLA-G阻斷，及經由活性Fc依賴性機制之直接腫瘤細胞殺死)之重要性在患者間可能不同。因此，腫瘤細胞殺死之多種機制可經由能夠在具有不同特性(例如，不同HLA-G表現模式)之腫瘤中接入不同機制而使更廣泛範圍的患者受益。

用於選擇本發明之 HLA-G 抗體的方法由於與產生針對HLA-G之抗體相關的特定挑戰(諸如，與其他HLA-I之高同源性、能夠阻斷HLA-G與其抑制性受體之間的相互作用的抗體之鑑定)，且為了鑑定將適用於療法之抗體，必須開發專門的研發、篩選及測試策略，其涉及量測與HLA-G之結合、評定結合之親和力及特異性(對其他HLA-I不具有交叉反應性)及評定測試抗體之功能特性，以及高通量量測結合之結構態樣(標靶抗原決定基殘基)。

因此，提供一種鑑定根據本發明之抗體的方法，該方法包含： a) 用HLA-G免疫原性組合物對非人類哺乳動物進行免疫接種； b) 自該非人類哺乳動物回收B細胞； c) 選擇由該等B細胞產生的具有以下特性之抗體： i. 以由小於20 nM之解離常數K _D表示的親和力結合於HLA-G；及 ii. 不結合於除HLA-G以外之HLA-I；及 iii. 阻斷HLA-G與ILT2之間及/或HLA-G與ILT4之間的結合

步驟 a)「免疫原性組合物」係指能夠在投與該組合物之非人類哺乳動物中產生免疫反應的組合物。免疫原性組合物通常允許在所投與哺乳動物中表現所關注免疫原性抗原，針對該抗原之抗體可作為免疫反應之一部分產生。「HLA-G免疫原性組合物」係指能夠在投與該組合物之哺乳動物中產生針對HLA-G之免疫反應的組合物。

「蛋白質免疫接種」係指投與包含所關注抗原之免疫原性蛋白質或包含該所關注抗原或其免疫原性部分的該蛋白質之免疫原性部分的技術。

在一個實施例中，免疫原性組合物包含全長蛋白質。在另一實施例中，免疫原性組合物包含蛋白質之免疫原性部分。舉例而言，在一個實施例中，免疫原性組合物包含與B2m複合之全長HLA-G。在另一實施例中，免疫原性組合物包含不存在B2m之全長HLA-G。在另一實施例中，免疫原性組合物包含與B2m相關或不相關的HLA-G之免疫原性部分。在另一實施例中，免疫原性組合物包含與B2m複合的HLA-G之胞外域。在另一實施例中，免疫原性組合物包含不存在B2m的HLA-G之胞外域。

「DNA免疫接種」係指將編碼包含所關注抗原之全長蛋白質或其免疫原性部分的經基因工程改造之核酸分子(本文中亦稱為核酸疫苗或DNA疫苗)直接投與至哺乳動物之細胞中以在該等細胞中針對該所關注抗原產生免疫反應的技術。DNA免疫接種使用宿主細胞機制以表現對應於所投與核酸分子的肽及/或達成預期作用，尤其在細胞水準下之抗原表現，及此外在細胞水準下或在宿主生物體內之免疫治療作用。

「細胞免疫接種」係指投與天然表現或經包含所關注抗原之免疫原性蛋白質或包含該所關注抗原或其免疫原性部分的該蛋白質之免疫原性部分轉染的細胞之技術。在一個實施例中，步驟a)之免疫接種係使用用經包含所關注抗原之免疫原性蛋白質或包含該所關注抗原或其免疫原性部分的該蛋白質之免疫原性部分轉染之纖維母細胞進行細胞免疫接種來進行。

「免疫原性部分」意謂所關注蛋白質或抗原之一部分，其保留在投與所關注蛋白質或抗原之該部分或編碼其之DNA的非人類哺乳動物中誘導免疫反應的能力，以使得能夠產生本發明之抗體。

HLA-G (包括其融合蛋白)、(以重組方式或天然)表現HLA-G之細胞可用於產生特異性識別HLA-G之抗體。可使用如本文所描述之各種形式之HLA-G。

用於對宿主進行免疫接種之HLA-G或其片段可藉由此項技術中熟知之方法，由包含表現系統之經基因工程改造之宿主細胞製備，或其可自天然生物來源回收。HLA-G或其片段在一些情況下可為較大蛋白質(諸如融合蛋白，例如與親和標籤或類似物融合之融合蛋白)之一部分。

在一個實施例中，免疫接種步驟可使用蛋白質免疫接種、DNA免疫接種或細胞免疫接種或其任何組合進行。

在一個實施例中，非人類哺乳動物為小鼠。在一個實施例中，非人類哺乳動物為大鼠。在一個實施例中，非人類哺乳動物為兔。在一個實施例中，兔為紐西蘭白兔(New Zealand White rabbit)。在一個實施例中，哺乳動物藉由皮下注射免疫原性組合物而免疫接種。在一個實施例中，免疫原性組合物包含在細胞表面上短暫表現HLA-G之兔纖維母細胞。在一個實例中，兔纖維母細胞經包含SEQ ID NO: 111的編碼HLA-G之DNA序列轉染。在另一實施例中，免疫原性組合物包含在細胞表面上短暫共表現HLA-G及B2m之兔纖維母細胞。在一個實施例中，兔纖維母細胞為Rab9兔纖維母細胞。

免疫接種步驟可使用初免-加強免疫接種方案進行，該初免-加強免疫接種方案意指首先投與(初免免疫接種或初免投與)免疫原性組合物，且隨後在免疫接種方案之時程內時間上與首次投與間隔開的至少一次進一步投與(加強免疫接種或加強投與)。加強免疫接種涵蓋一次、兩次、三次或更多次投與。在一個實施例中，加強免疫接種包含以14天間隔兩次投與免疫原性組合物。在一個實施例中，免疫接種步驟包含首次投與在細胞表面上短暫表現HLA-G之兔纖維母細胞，接著以14天間隔進行兩次加強免疫接種。在一個實施例中，兔纖維母細胞為Rab9兔纖維母細胞。

在一個實施例中，初免免疫接種包含投與佐劑。在一個實施例中，佐劑係在與注射免疫原性組合物之部位不同的部位投與。在一個實施例中，佐劑為弗氏佐劑(Freund's adjuvant)。在一個實施例中，初免免疫接種及加強免疫接種均包含投與佐劑，諸如弗氏佐劑。

在一個實施例中，免疫接種步驟包含在第一佐劑存在下之初免免疫接種，接著為在第二佐劑存在下之至少一次加強免疫接種。

在一個實施例中，免疫原性組合物例如藉由皮下注射至肩膀中投與。

「佐劑」係指免疫刺激劑。佐劑為此項技術中熟知之物質。用作免疫刺激劑或抗原遞送系統或兩者的傳統佐劑涵蓋例如明礬(Alum)、多醣、脂質體、基於生物可降解聚合物之奈米顆粒、脂多醣。舉例而言，佐劑可為弗氏佐劑、孟塔納佐劑(Montanide adjuvant)或Fama佐劑。

步驟 b)用於分離B細胞之方法為熟知的，且一般包含自PBMC (周邊血液單核細胞)、骨髓或自次級淋巴器官(亦即自淋巴結或脾臟)分離B細胞。在一個實施例中，分離抗原特異性記憶B細胞在免疫接種步驟a)之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天進行。在一個實施例中，分離B細胞在免疫接種步驟a)之後14天進行。在一個實施例中，步驟b)包含藉由流式細胞測量術分選抗原特異性B細胞。

步驟 c)步驟c)中之篩選步驟可根據例如如本發明中所描述的用於量測結合及阻斷活性之方法進行。

i. 以由小於20 nM之解離常數(K _D)表示的親和力結合於HLA-G 可針對可溶性及/或膜結合性HLA-G測定結合。與HLA-G之結合可藉由使用表面電漿子共振(諸如Biacore®系統，例如如實例中所描述)測定。在一個實例中，如本文實例中所描述藉由Biacore針對與B2m複合之重組HLA-G ECD來量測親和力，且可選擇以小於20 nM之K _D進行結合的抗體以供進一步分析。在一個實例中，表現為全長抗體之抗體與單體形式之HLA-G之間的解離常數K _D係在25℃之溫度下藉由SPR測定。

或者或另外，可藉由FACS針對表現HLA-G之細胞(諸如經HLA-G及B2m轉染之HEK293，或天然表現HLA-G之JEG3細胞)來測定與HLA-G之結合。藉由FACS來量測抗體對HLA-G之親和力的方法提供於本文所描述之實例中。

有利地，可使用針對可溶性HLA-G及細胞表現之HLA-G兩者的結合分析來篩選抗體。

ii. 不結合於除HLA-G以外之HLA-I 已開發出一種評定結合特異性(亦即，不存在對其他HLA-I之交叉反應性)的專門篩選策略，其涉及產生HLA-G構築體變體，其中對HLA-G具有特異性之胺基酸已經其他HLA-I中存在之共通胺基酸取代(「HLA-G剔除構築體」)。如實例1中所描述之HLA-G剔除構築體可尤其適用於篩選對HLA-G具有特異性之抗體。

「HLA-G Null 1,2,3」對應於一種HLA-G變體，其中HLA-G α1、α2及α3上特異性表現之胺基酸經其他HLA-I上表現之共通胺基酸取代(20個胺基酸突變)。

在一個實施例中，鑑定根據本發明之抗體的方法包含針對「HLA-G Null 1,2,3」篩選在步驟b)之後回收的抗體以及選擇未偵測到結合的抗體。可針對在細胞表面處表現的「HLA-G Null 1,2,3」(例如包含SEQ ID NO: 115)或針對可溶性「HLA-G Null 1,2,3」(ECD) (例如包含SEQ ID NO: 113)進行篩選。

可根據實例中所描述之方法進一步評定與其他HLA-I之結合。HEK293細胞可經編碼HLA-A、B、C、E或F之DNA序列(例如，分別包含SEQ ID NO: 131、133、135、137及139之DNA序列)及編碼B2m之DNA序列(例如，包含SEQ ID NO: 130之DNA序列)轉染。與細胞所表現之HLA-I的結合可藉由FACS評定。

iii. 阻斷HLA-G與ILT2之間及/或HLA-G與ILT4之間的結合 HLA-G與ILT2及/或ILT4結合之阻斷可藉由量測細胞表面處表現(例如，如JEG3細胞表面處天然表現，或如HCT116細胞表面處短暫表現，如實例中所描述)的與B2m相關的HLA-G與例如表現為融合蛋白(諸如Fc融合蛋白(ITT2-Fc.ILT4-Fc))之ILT2及/或ILT4之間的相互作用之阻斷來評定。

具有所需特性且在步驟c)之後選擇的抗體可基於額外分析(包括例如特異性分析、ADCC、ADCP、生物物理及穩定性分析)以及調節免疫環境及在離體培養之人類原發性腫瘤中誘導腫瘤細胞殺死之能力(諸如本文實例中描述之方法)來進一步表徵及區分。

抗原決定基在本發明內，術語「抗原決定基」可互換用於構形抗原決定基及線性抗原決定基兩者。構形抗原決定基由抗原之胺基酸一級序列之不連續部分構成，且線性抗原決定基由連續胺基酸所形成之序列形成。

在一個實施例中，本發明之抗體特異性結合於HLA-G α3域。在一個實施例中，本發明之抗體結合於HLA-G之抗原決定基，該抗原決定基包含參考SEQ ID NO: 107之殘基F195及Y197。

在一些實施例中，本發明之抗體結合於HLA-G上之抗原決定基，該抗原決定基包含殘基V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257 (其中編號係根據SEQ ID NO: 107)。

在一個實施例中，本發明之抗體不結合B2m。因此，有利地，本發明之抗體結合於與B2m複合或不存在B2m之HLA-G。在一個實施例中，本發明之抗體與天然以與HLA-G之複合物形式表現的HLA-G同源肽不結合於HLA-G上之相同結合位點。因此，在一個實施例中，本發明之抗體不阻斷HLA-G與其天然以與HLA-G之複合物形式表現的同源肽之間的締合。

在一個實施例中，本發明提供一種抗HLA-G抗體，其結合於HLA-G上之抗原決定基，該抗原決定基包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或所有選自由以下組成之清單的殘基：HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257。在一個實施例中，本發明提供一種人類化IgG1抗體，其結合於HLA-G之抗原決定基，該抗原決定基包含人類HLA-G (SEQ ID NO: 107)之殘基V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257。在一個實施例中，抗體為去岩藻糖基化IgG1。

在一個實施例中，本發明提供一種抗HLA-G抗體，其結合於HLA-G上之抗原決定基，以小於4 Å接觸距離所測定，該抗原決定基包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或所有選自由以下組成之清單的殘基：HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257。在一個實施例中，抗體為去岩藻糖基化IgG1。

在一個實施例中，本發明提供一種人類化IgG1抗體，其結合於HLA-G之抗原決定基，以小於4 Å接觸距離所測定，該抗原決定基包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或所有選自由以下組成之清單的殘基：HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257。在一個實施例中，抗體為去岩藻糖基化IgG1。

在一個實施例中，本發明提供一種人類化IgG1抗體，其結合於HLA-G上之抗原決定基，以小於5 Å接觸距離所測定，該抗原決定基包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或所有選自由以下組成之清單的殘基：HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、R219、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250、E253及Y257。在一個實施例中，抗體為去岩藻糖基化IgG1。

抗原決定基可藉由此項技術中已知之任何適合之抗原決定基定位方法結合本發明所提供之抗體中之任一者鑑定。此類方法之實例包括針對與本發明之抗體或其片段之結合篩選衍生自全長HLA-G之不同長度之肽，及鑑定可特異性結合於抗體的含有抗體識別之抗原決定基之序列的最小片段。HLA-G肽可以合成方式產生或藉由蛋白水解消化HLA-G而產生。結合抗體之肽可藉由例如質譜分析來鑑定。可使用諸如X射線結晶學、核磁共振(NMR)波譜或氫氘交換質譜(HDX-MS)之方法來鑑定抗體所結合之抗原決定基。通常，在藉由X射線結晶學進行抗原決定基測定時，在CDR 4Å內的抗原之胺基酸殘基被視為抗原決定基之胺基酸殘基部分。在鑑定後，抗原決定基可用於製備結合本發明之抗體之片段且視需要用作免疫原以獲得結合相同抗原決定基之額外抗體。

如描述本發明之態樣及實施例中所指示之抗原決定基較佳為由X射線結晶學表徵之抗原決定基。在一個實施例中，本發明提供一種抗HLA-G抗體，其結合於HLA-G上之抗原決定基，以小於4 Å接觸距離所測定，該抗原決定基包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或所有選自由以下組成之清單的殘基：HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257，其中抗原決定基係由X射線結晶學表徵。

在一個實施例中，本發明提供一種人類化IgG1抗體，其結合於HLA-G上之抗原決定基，以小於4 Å接觸距離所測定，該抗原決定基包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或所有選自由以下組成之清單的殘基：HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257，其中抗原決定基係由X射線結晶學表徵。在一個實施例中，抗體為去岩藻糖基化IgG1。

在一個實施例中，本發明提供一種人類化IgG1抗體，其結合於HLA-G上之抗原決定基，藉由X射線結晶學以小於5 Å接觸距離所測定，該抗原決定基包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或所有選自由以下組成之清單的殘基：HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、R219、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250、E253及Y257。在一個實施例中，抗體為去岩藻糖基化IgG1。

另外，可使用HDX-MS及NMR來分析溶液中之相互作用，且允許展示藉由結晶學未必總是清楚的別構或構形變化。舉例而言，根據30秒氘培育下之HDX-MS，所鑑定之潛在結合區域為178-MLQRADPPKTHVTHHPVFD-196及214-ILTWQRDGEDQTQDVEL-230。

在一個實施例中，藉由如嚴格度增加超過所有位移計算值之平均值(＞0.0764)所定義之NMR測定的抗原決定基包含殘基T200、L201、L215、W217、R219、D220、E229、A245、A246、V247、V249、S251、E253、Q255、T258、H260、V261及W274。

在一個實施例中，藉由如嚴格度增加超過所有位移計算值之平均值加一個標準差(＞0.1597)所定義之NMR測定的抗原決定基包含殘基H191、Y197、E198、R202、L230、V248、G252、C259及K275。

在輕鏈、重鏈、輕鏈可變區(VL)、重鏈可變區(VH)或CDR序列方面，抗體可與如上文所定義之抗體競爭結合於HLA-G或與其結合於相同抗原決定基。

特別地，本發明提供一種抗體，其與包含SEQ ID NO: 1/2/3/4/5/6之CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3序列組合的抗體競爭結合於HLA-G或與其結合於相同抗原決定基。抗體可與包含SEQ ID NO: 19及93各自之VL及VH序列對的抗體競爭結合於HLA-G或與其結合於相同抗原決定基。抗體可與包含SEQ ID NO: 1/2/3/4/5/6之CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3序列組合的IgG1競爭結合於HLA-G或與其結合於相同抗原決定基。抗體可與包含SEQ ID NO: 19及93各自之VL及VH序列對的IgG1競爭結合於HLA-G或與其結合於相同抗原決定基。

在一個實施例中，本發明提供一種抗體，其與包含SEQ ID NO: 1/2/3/4/5/6之CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3序列組合的抗體交叉競爭結合於HLA-G。

在本發明之上下文中，與根據本發明之參考抗體競爭結合於HLA-G或與其結合於相同抗原決定基的本文所提供之抗體保留如上文部分中所描述之參考抗體之有利特性，例如對HLA-G之特異性、高親和力、ILT2及/或ILT4阻斷活性。在一個實例中，與根據本發明之參考抗體競爭結合於HLA-G或與其結合於相同抗原決定基的抗體具有以下特性： a. 表現為全長抗體之該抗體與單體形式之HLA-G之間的解離常數(K _D)小於20 nM、尤其小於15 nM、尤其小於10 nM、尤其小於9 nM、尤其小於8 nM、尤其小於7 nM、尤其小於6 nM或尤其小於5 nM，例如在25℃之溫度下藉由SPR所測定；及/或 b. 阻斷ILT2與如JEG3細胞表面處天然表現之HLA-G之結合的IC ₅₀小於20 pM，例如如實例8中所描述使用大體積反應使用活體外分析所測定；及/或 c. 阻斷ILT4與HLA-G之結合的IC ₅₀小於1400 pM，例如如實例8中所描述測定。

為測定抗體是否與參考抗體競爭結合，以兩種不同實驗設置來進行上述結合方法論。在第一設置中，使參考抗體在飽和條件下結合於抗原，接著評定測試抗體與抗原之結合。在第二設置中，使測試抗體在飽和條件下結合於抗原，接著評定參考抗體與蛋白質/肽之結合。在兩種實驗性設置中，若僅第一(飽和)抗體能夠結合於蛋白質/肽，則得出以下結論：測試抗體及參考抗體競爭結合於抗原。如熟習此項技術者將瞭解，與參考抗體競爭結合之抗體可能未必與參考抗體結合於相同抗原決定基，但可藉由結合重疊或相鄰抗原決定基而在空間上阻斷參考抗體之結合或引起構形變化，該構形變化引起結合不足。

若兩種抗體中之一者競爭性地抑制(阻斷)另一者與抗原之結合，則該兩種抗體結合於相同或重疊抗原決定基。或者，若抗原中減少或消除一種抗體之結合的基本上所有胺基酸突變減少或消除另一種抗體之結合，則該兩種抗體具有相同抗原決定基。若減少或消除一種抗體之結合的一些胺基酸突變減少或消除另一種抗體之結合，則兩種抗體具有重疊抗原決定基。

接著，可進行其他常規實驗(例如，肽突變及結合分析)以確認所觀測到的測試抗體之結合不足確實係歸因於與參考抗體相同之抗原部分之結合或空間阻斷(或另一種現象)是否引起所觀測到的結合不足。此類實驗可使用ELISA、RIA、表面電漿子共振、流式細胞測量術或此項技術中可用的任何其他定量或定性抗體結合分析法來進行。

抗體變體熟習此項技術者亦瞭解抗體可進行多種轉譯後修飾。此等修飾之類型及程度常常視用於表現抗體的宿主細胞株以及培養條件而定。此類修飾可包括糖基化變化、甲硫胺酸氧化、二酮哌𠯤形成、天冬胺酸鹽異構化及天冬醯胺去醯胺。常見修飾為由於羧基肽酶作用而損失羧基端鹼性殘基(諸如離胺酸或精胺酸) (如Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995中所描述)。因此，可不存在抗體重鏈之C端離胺酸。

在一個實施例中，抗體之C端胺基酸在轉譯後修飾期間裂解。

在一個實施例中，抗體之N端胺基酸在轉譯後修飾期間裂解。

在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代、插入及/或缺失之抗體變體。用於取代型突變誘發之所關注位點包括CDR及FR。可將胺基酸取代引入所關注抗體中，且針對所需活性篩選產物，該所需活性例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC、CDC及/或ADCP。

在某些實施例中，涵蓋本文中所描述之抗體之胺基酸序列變體。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗HLA-G抗體之胺基酸序列變體可藉由將適當修飾引入編碼蛋白質之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗HLA-G抗體之胺基酸序列內(諸如，一或多個CDR及/或構架序列中或VH及/或VL域中)殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵。

在本文中所提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

應瞭解，可對本發明提供之CDR進行一或多個胺基酸取代、添加及/或缺失而不顯著改變抗體結合於HLA-G及中和HLA-G活性之能力。熟習此項技術者可容易地測試任何胺基酸取代、添加及/或缺失之作用，例如藉由使用本文所描述之方法，尤其實例中所說明之彼等方法來測定HLA-G結合及對HLA-G與其天然配體之相互作用的抑制。

因此，在變異VH及VL序列之某些實施例中，各CDR含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代，其中此類胺基酸取代為保守性的，且其中抗體保留其針對HLA-G之結合特性。

因此，本發明提供一種抗HLA-G抗體，其包含一或多個選自以下之CDR：CDR-L1 (包含SEQ ID NO: 1)、CDR-L2 (包含SEQ ID NO: 2)、CDR-L3 (包含SEQ ID NO: 3)、CDR-H1 (包含SEQ ID NO: 4)、CDR-H2 (包含SEQ ID NO: 5)及CDR-H3 (包含SEQ ID NO: 6)，其中該等CDR中之一或多者中的一或多個胺基酸已經另一胺基酸，例如如本文下文所定義之類似胺基酸取代。

在一個實施例中，本發明提供一種抗HLA-G抗體，其包含CDR-L1 (包含SEQ ID NO: 1)、CDR-L2 (包含SEQ ID NO: 2)、CDR-L3 (包含SEQ ID NO: 3)、CDR-H1 (包含SEQ ID NO: 4)、CDR-H2 (包含SEQ ID NO: 5)及CDR-H3 (包含SEQ ID NO: 6)，例如其中該等CDR中之一或多者中的一或多個胺基酸已經另一胺基酸，諸如如本文下文所定義之類似胺基酸取代。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體包含輕鏈可變域，其包含三個CDR，其中CDR-L1之序列包含與SEQ ID NO: 1中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列，及/或CDR-L2包含與SEQ ID NO: 2中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列，及/或CDR-L3包含與SEQ ID NO: 3中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體包含重鏈可變域，其包含三個CDR，其中CDR-H1之序列包含與SEQ ID NO: 4中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列，及/或CDR-H2包含與SEQ ID NO: 5中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列，及/或CDR-H3包含與SEQ ID NO: 6中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 23中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 93、27、33、57、69、75、81或87中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 19中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列，及/或該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 93中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體包含分別包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6之CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3序列，且輕鏈及重鏈可變區之其餘部分分別與SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 93具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體包含輕鏈，其包含與SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 25中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體包含重鏈，其包含與SEQ ID NO: 95、29、35、59、71、77、83或89中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體為IgG1，其包含輕鏈及重鏈，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 21中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列，且該重鏈包含與SEQ ID NO: 95中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體為IgG1，其包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6中分別所載之CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3序列，且輕鏈及重鏈之其餘部分分別與SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 95具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性。

本發明在本文中所提供之抗HLA-G抗體變體保留親本抗體(亦即，未經修飾抗體)之有利特性，亦即上文所描述之功能特性，例如高特異性、高親和力、ILT2及/或ILT4阻斷活性。在一個實例中，本發明提供之抗HLA-G抗體變體具有以下特性： a. 表現為全長抗體之該抗體與單體形式之HLA-G之間的解離常數(K _D)小於20 nM、尤其小於15 nM、尤其小於10 nM、尤其小於9 nM、尤其小於8 nM、尤其小於7 nM、尤其小於6 nM或尤其小於5 nM，例如在25℃之溫度下藉由SPR所測定；及/或 b. 阻斷ILT2與如JEG3細胞表面處天然表現之HLA-G之結合的IC ₅₀小於20 pM，例如如實例8中所描述使用大體積反應使用活體外分析所測定；及/或 c. 阻斷ILT4與HLA-G之結合的IC ₅₀小於1400 pM，例如如實例8中所描述測定。

序列一致性及相似性可容易地計算序列之間的一致性及類似性之程度。「序列一致性%」(或「序列相似性%」)係藉由以下計算：(1)在比較窗口(例如，較長序列之長度、較短序列之長度、指定窗口等)內比較兩個最佳比對之序列，(2)測定含有一致(或類似)胺基酸(例如，兩個序列中存在之一致胺基酸、兩個序列中存在之類似胺基酸)之位置數，得到匹配位置數，(3)將匹配位置數除以比較窗口(例如，較長序列之長度、較短序列之長度、指定窗口)中之總位置數，及(4)將結果乘以100，得到序列一致性%或序列相似性%。

用於比較之序列比對方法為此項技術中熟知的。用於比較之最佳序列比對可例如藉由以下方式進行：Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源演算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源比對演算法；Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性搜尋方法；此等演算法之電腦化實施方式(Wisconsin Genetics套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)；或人工比對及目視檢查(參見例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編, 1995增刊))。

適用於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法之較佳實例包括BLAST及BLAST 2.0演算法，其描述於Altschul等人, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)及Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。亦可使用FASTA，使用預設或建議參數來比較多肽序列。FASTA (例如FASTA2及FASTA3)提供查詢及搜尋序列之間的最佳重疊區域的比對及序列一致性百分比。

在某些實施例中，一或多個CDR內可存在取代、插入或缺失，只要此類變化不實質上降低抗體結合標靶之能力即可。

舉例而言，可在CDR中進行不實質上降低結合親和力之保守性變化。可在CDR中之抗原接觸殘基之外部進行此類變化。

保守性取代及更多的實質性「例示性取代」展示於表1中。表 1 ：胺基酸取代之實例

初始殘基	例示性取代	保守性取代
Ala (A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg (R)	Lys；Gln；Asn	Lys
Asn (N)	Gln；His；Asp；Lys；Arg	Gln
Asp (D)	Glu；Asn	Glu
Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln (Q)	Asn；Glu	Asn
Glu (E)	Asp；Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu (L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met (M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe (F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val；Ser	Ser
Trp (W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；	Leu

可藉由選擇在保持取代區域中之多肽主鏈之結構、標靶位點處的分子之電荷或疏水性或側鏈之主體之作用方面顯著不同的取代來實現抗體變體之生物特性之實質性修飾。可根據胺基酸側鏈之特性之類似性將胺基酸分組(A. L. Lehninger, Biochemistry第二版, 第73-75頁, Worth Publishers, New York (1975))。

一種取代型變體涉及取代親本抗體(人類化或人類抗體)之一或多個CDR區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體與親本抗體相比將具有某些生物特性之變化(例如，增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。例示性取代型變體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術便利地產生。簡言之，使一或多個CDR殘基突變，且在噬菌體上呈現變異抗體且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。

改變(例如取代)可在CDR中進行以例如改良抗體親和力。此類改變可在HVR「熱點」，亦即由在體細胞成熟過程期間高頻率地經歷突變之密碼子編碼的殘基(參見例如Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008))及/或接觸抗原之殘基中進行，隨後針對結合親和力測試所得變異VH或VL。藉由構築二級庫及自二級庫再選擇來達成親和力成熟已描述於Hoogenboom等人 Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一種將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。隨後產生二級庫。隨後篩選該庫以鑑定具有所需親和力之任何抗體變體。

一種可用於鑑定可作為突變誘發之標靶的抗體之殘基或區域之方法為丙胺酸掃描突變誘發(Cunningham及Wells (1989) Science, 244: 1081-1085)。在此方法中，鑑定殘基或多個標靶殘基且用丙胺酸置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。或者或另外，可使用抗原-抗體複合物之X射線結構來鑑定抗體與其抗原之間的接觸點。可篩選變體以確定其是否含有所需特性。

恆定區變體在一些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入至本文所提供之抗體之Fc區中，從而產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)的人類Fc區序列(例如，人類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。

描述了對FcR之結合改良或減弱的某些抗體變體。(參見例如US 6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等人, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。

具有延長之半衰期及改良之與新生Fc受體(FcRn)之結合的抗體描述於US2005/0014934A1中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該一或多個取代改良Fc區與FcRn的結合。

在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代的Fc區，該等取代例如在Fc區之位置298、333及/或334 (殘基之EU編號)處之取代。

具有降低之效應功能的抗體包括具有Fc區殘基234、235、237、238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的彼等抗體(參見例如US. 6,737,056)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處之取代的Fc突變體，其中胺基酸殘基係根據EU編號系統編號。

可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞，亦即NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)中。用於評定所關注分子之ADCC活性的活體外分析之非限制性實例描述於US5,500,362、US5,821,337中。或者或另外，可例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc. Nat l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中活體內評定所關注分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合分析以證實抗體不能結合Clq且因此不具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)；Cragg, M.S.等人, Blood 101: 1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.I Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova, S.B.等人, Int l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006))。

本發明之抗體分子之恆定區域(若存在)可根據抗體分子之建議功能及尤其可能需要的效應功能來選擇。舉例而言，恆定區域可為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域。特別地，當抗體分子意欲用於治療用途且需要抗體效應功能時，可使用人類IgG恆定區域，尤其是IgG1及IgG3同型。或者，當抗體分子意欲用於治療目的且不需要抗體效應功能時，可使用IgG2及IgG4同型。應瞭解，亦可使用此等恆定區域之序列變體。

在一些實施例中，本發明之抗體為野生型人類IgG1 (被稱為IgG1)。

在一些實施例中，本發明之抗體為IgG1 LALA，亦即其中已引入IgG1恆定區中之胺基酸取代L234A/L235A (根據EU編號)的野生型人類IgG1同功異型物之突變體。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含序列SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含序列SEQ ID NO: 97之重鏈。

在一些實施例中，本發明之抗體為IgG1 LALAGA，亦即已引入IgG1恆定區中之胺基酸取代L234A/L235A/G237A (根據EU編號)的野生型人類IgG1同功異型物之突變體。

在一些實施例中，本發明之抗體為IgG4P，亦即其中胺基酸228 (根據EU編號)經脯胺酸置換的野生型人類IgG4同功異型物之突變體，如例如Angal等人, Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108中所描述。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含序列SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含序列SEQ ID NO: 99之重鏈。

在一些實施例中，本發明之抗體為IgG4 FALA，亦即其中已引入IgG4恆定區中之取代F234A/L235A (根據EU編號)的野生型人類IgG4同功異型物之突變體。

在一些實施例中，本發明之抗體為IgG4P FALA，亦即其中胺基酸228 (根據EU編號)經脯胺酸置換且已引入IgG4恆定區中之酸取代F234A/L235A (根據EU編號)的野生型人類IgG4同功異型物之突變體。在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含序列SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含序列SEQ ID NO: 101之重鏈。

糖基化變體在某些實施例中，對本文所提供之抗體進行改變以增加或降低該抗體經糖基化之程度。向抗體中添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。

在一個實施例中，本發明之抗體經糖基修飾。在一個實施例中，本發明之抗體具有低岩藻糖含量或無岩藻糖含量。「岩藻糖含量」意謂連接至各抗體之各重鏈之Fc片段之Asn297殘基的N-聚糖內岩藻糖基化形式之百分比。「低岩藻糖含量」意謂少於或等於65%之岩藻糖含量。實際上，現今已知抗體組合物之低岩藻糖含量在該組合物經由FcγRIII誘導強ADCC反應之能力中起關鍵作用。有利地，岩藻糖含量少於或等於65%，較佳少於或等於60%、55%或50%，甚至少於或等於45%、40%、35%、30%、25%或20%。然而，岩藻糖含量並非必需為零，且其可例如少於或等於5%、10%、15%或20%。

在一個實施例中，本發明之抗體為去岩藻糖基化IgG1。產生去岩藻糖基化IgG1之方法為熟知的，且包括經基因修飾以產生去岩藻糖基化抗體之細胞之產生。在一個實施例中，本發明之去岩藻糖基化IgG1產生於CHO細胞中，其中編碼α1,6岩藻糖基轉移酶(FUT8)之基因藉由此項技術中熟知之方法基因剔除。舉例而言，可使用KO FUT8 CHOSXE/DG44細胞，如本文所提供之實例中所描述。

在一個實施例中，本發明之抗體具有改良之ADCC及/或ADCP，及/或具有改良的使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭的能力。在一個實施例中，根據本發明之去岩藻糖基化抗體的ADCC及/或ADCP功能及/或使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭之能力與對應的習知(亦即，岩藻糖基化)抗體(亦即，包含相同胺基酸序列但包含岩藻糖的抗體，例如在尚未經修飾且表現FUT8之CHO細胞中產生的抗體)相比得到改良。在本發明之上下文中，「改良之」活性(例如ADCC及/或ADCP及/或腫瘤細胞耗竭)意謂去岩藻糖基化抗體之活性(例如ADCC及/或ADCP及/或腫瘤細胞耗竭)比參考抗體(亦即，對應的習知(亦即岩藻糖基化)抗體)之相同活性高至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%。

可進行此項技術中熟知之活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認ADCC及/或ADCP活性之增加，例如如本文所描述。

在一個實施例中，本發明之抗體為去岩藻糖基化IgG1，其包含： a. 包含SEQ ID NO: 21或17或25之輕鏈；及/或 b. 包含SEQ ID NO: 95、29、35、59、71、77、83或89之重鏈。

在一個實施例中，本發明之抗體為去岩藻糖基化IgG1，其包含： a. 與SEQ ID NO: 21或17或25包含至少90%一致性或相似性之輕鏈；及/或 b. 與SEQ ID NO: 95、29、35、59、71、77、83或89包含至少90%一致性或相似性之重鏈。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體為去岩藻糖基化IgG1，其包含輕鏈及重鏈，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 21中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列，且該重鏈包含與SEQ ID NO: 95中所載之序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體為去岩藻糖基化IgG1，其包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6中分別所載之CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3序列，且輕鏈及重鏈之其餘部分分別與SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 95具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體為去岩藻糖基化IgG1，其包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93之重鏈可變區，且其中輕鏈及重鏈之其餘部分分別與SEQ ID NO: 21及95具有至少90%一致性或相似性。

在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈，且具有改良之ADCC及/或ADCP功能，及/或具有改良的使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭之能力。在一個實施例中，ADCC及/或ADCP功能及/或使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭之能力與對應的習知抗體(亦即，包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈的岩藻糖基化抗體)相比得到改良。

在一個實施例中，本發明之抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈，且具有改良之CDC功能，及/或具有改良的使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭之能力。在一個實施例中，CDC功能及/或使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭之能力與對應的習知抗體(亦即，包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈的岩藻糖基化抗體)相比得到改良。

在一個實施例中，本發明之抗HLA-G抗體為去岩藻糖基化IgG1，其包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93之重鏈可變區，或包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈，且具有改良之ADCC及/或ADCP及/或CDC功能並且具有改良的使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭之能力。

諸如抗體之生物分子含有酸性及/或鹼性官能基，藉此給予分子淨正電荷或負電荷。總體上「觀測到」的電荷之量將視實體之絕對胺基酸序列、3D結構中帶電基團之局部環境及分子之環境條件而定。等電點(pI)係特定分子或其溶劑可進入表面不攜帶淨電荷時的pH。在一個實例中，結合HLA-G之抗體可經工程改造以具有適當等電點。此可能產生具有更穩固特性，尤其適合溶解性及/或穩定性概況及/或改良之純化特性的抗體。

抗體可能例如藉由置換胺基酸殘基進行改造，諸如用一或多個鹼性胺基酸殘基置換酸性胺基酸殘基。或者，可引入鹼性胺基酸殘基或可移除酸性胺基酸殘基。或者，若分子具有不可接受地高的pI值，則可視需要引入酸性殘基以降低pI。重要的係，當調控pI時必須注意保留抗體或片段之所需活性。因此，在一個實施例中，經工程改造之抗體具有與「未經修飾」之抗體或片段相同或實質上相同的活性。

可使用諸如** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/ pi_tool.html及http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html之程式來預測抗體之等電點。

效應分子必要時，用於本發明中之抗體可與一或多個效應分子結合。

應瞭解，效應分子可包含單一效應分子或兩個或更多個連接以形成可連接至本發明抗體之單一部分的此類分子。在需要獲得連接至效應分子之抗體片段的情況下，此可藉由其中抗體片段直接或經由偶合劑連接至效應分子的標準化學或重組DNA程序來製備。使此類效應分子與抗體結合的技術為此項技術中所熟知的(參見Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人編，1987, 第623-53頁；Thorpe等人，1982, Immunol. Rev., 62:119-58及Dubowchik等人，1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123)。特定化學程序包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO 03031581中所描述之程序。或者，在效應分子為蛋白質或多肽的情況下，連接可使用重組DNA程序，例如如WO 86/01533及EP 0392745中所描述來實現。

如本文所使用之術語效應分子包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物學活性蛋白質(例如酶)、其他抗體或抗體片段、合成的或天然存在之聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金屬、奈米顆粒及報導基團，諸如螢光化合物或可藉由NMR或ESR波譜偵測的化合物。

效應分子之實例可包括細胞毒素或細胞毒性劑，包括任何對細胞不利(例如殺死細胞)之藥劑。實例包括康普瑞汀(combrestatin)、海兔毒素(dolastatin)、埃博黴素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、類美登素(maytansinoid)、海綿素(spongistatin)、根瘤菌素(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrin)、桿孢菌素(roridin)、海米斯林(hemiasterlin)、紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾比星(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。

效應分子亦包括(但不限於)抗代謝物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如甲氮芥(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C (mitomycin C)及順式-二氯二胺鉑(II) (DDP)、順鉑(cisplatin))、蒽環黴素(anthracycline) (例如道諾比星(以前為道諾黴素(daunomycin))及小紅莓)、抗生素(例如放線菌素d (dactinomycin) (以前為放線菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素、安麴黴素(anthramycin，AMC)、卡奇黴素(calicheamicin)或倍癌黴素(duocarmycin))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。

其他效應分子可包括螯合放射性核素，諸如 ¹¹¹In及 ⁹⁰Y、Lu ¹⁷⁷、鉍 ²¹³、鐦 ²⁵²、銥 ¹⁹²及鎢 ¹⁸⁸/錸 ¹⁸⁸；或藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓樸異構酶I抑制劑、類紫杉醇及蘇拉明(suramin)。

其他效應分子包括蛋白質、肽及酶。所關注酶包括但不限於蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。所關注蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白、毒素(諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素)、蛋白質(諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子)、血栓溶解劑或抗血管生成劑(例如血管生長抑素或內皮生長抑素)或生物反應調節劑(諸如淋巴激素、介白素-1 (IL-1)、介白素-2 (IL-2)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白)。

其他效應分子可包括適用於例如診斷之可偵測物質。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性核素、正電子發射金屬(用於正電子發射斷層攝影術)及非放射性順磁性金屬離子。關於適用於診斷劑的可與抗體結合之金屬離子，一般參見美國專利第4,741,900號。適合酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基包括鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白及生物素；適合螢光物質包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三𠯤基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅蛋白；適合發光物質包括魯米諾(luminol)；適合生物發光物質包括螢光素酶、發光素及水母素(aequorin)；且適合放射性核素包括 ¹²⁵I、 ¹³¹I、 ¹¹¹In及 ⁹⁹Tc。

在另一實例中，效應分子可延長抗體之活體內半衰期，及/或降低抗體之免疫原性及/或增強抗體跨上皮屏障至免疫系統之遞送。此類型之適合效應分子之實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如WO 05/117984中所描述之化合物。

在效應分子為聚合物的情況下，其一般可為合成或天然存在之聚合物，例如視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧化烯聚合物，或分支鏈或非分支鏈多醣，例如同多醣或雜多醣。

可存在於上述合成聚合物上的視情況存在之特定取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。

合成聚合物之具體實例包括視情況經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是視情況經取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

特定天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。

如本文所用，「衍生物」意欲包括反應性衍生物，例如硫醇基選擇性反應基，諸如順丁烯二醯亞胺及其類似物。反應性基團可直接地或經由連接子區段連接至聚合物。應瞭解，此類基團之殘基在一些情況下將作為抗體片段與聚合物之間的鍵聯基團形成產物之一部分。

聚合物尺寸可根據需要變化，但平均分子量通常在500 Da至50000 Da之範圍內，例如5000 Da至40000 Da，諸如20000 Da至40000 Da。聚合物尺寸可尤其基於產物之意欲用途，例如定位至某些組織(諸如腫瘤)或延長循環半衰期之能力而選擇(綜述參見Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545)。因此，舉例而言，當產物意欲離開循環且滲透組織時，宜使用例如分子量為約5000 Da之小分子量聚合物。對於產物留存在循環中之應用，宜使用例如分子量在20000 Da至40000 Da範圍內之較高分子量聚合物。

適合聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在約15000 Da至約40000 Da範圍內的聚合物。

在一個實例中，用於本發明中之抗體連接於聚(乙二醇) (PEG)部分。在一個特定實例中，抗體為抗體片段，且PEG分子可經由位於抗體片段中的任何可用的胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基，例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇基、羥基或羧基連接。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經工程改造至片段中(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO 98/25971)。在一個實例中，本發明之抗體分子係經修飾之Fab片段，其中該修飾係將一或多個胺基酸添加至其重鏈之C末端以允許連接效應分子。適合地，附加的胺基酸形成含有效應分子可連接的一或多個半胱胺酸殘基的經修飾鉸鏈區。可使用多個位點來連接兩個或更多個PEG分子。

適合地，PEG分子可經由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基之硫醇基共價連接。連接至經修飾抗體片段的各聚合物分子可共價連接於位於片段中的半胱胺酸殘基之硫原子。共價鍵一般為二硫鍵或尤其是硫-碳鍵。在硫醇基用作連接點的情況下，可使用適當活化的效應分子，例如硫醇基選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。在如上所述之經聚合物修飾的抗體片段之製備中，可使用活化聚合物作為起始物質。活化聚合物可為含有硫醇反應基之任何聚合物，諸如α-鹵基羧酸或酯，例如碘乙醯胺、醯亞胺(例如順丁烯二醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物。此類起始物質可商購(例如購自Nektar，以前為Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA)或可使用習知化學程序由可商購的起始物質製備。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可獲自Nektar，以前為Shearwater；Rapp Polymere；及SunBio)及M-PEG-SPA (可獲自Nektar，以前為Shearwater)。

在一個實施例中，抗體為聚乙二醇化的經修飾Fab片段或diFab，亦即有PEG (聚(乙二醇))共價連接於其上，例如根據揭示於EP 0948544或EP 1090037中之方法[亦參見「Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications」, 1992, J. Milton Harris (編), Plenum Press, New York；「Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications」, 1997, J. Milton Harris及S. Zalipsky (編), American Chemical Society, Washington DC；及「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」, 1998, M. Aslam及A. Dent, Grove Publishers, New York；Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]。在一個實例中，PEG連接至鉸鏈區中之半胱胺酸。在一個實例中，經PEG修飾之Fab片段具有共價連接於經修飾鉸鏈區中之單一硫醇基的順丁烯二醯亞胺基團。離胺酸殘基可共價連接於順丁烯二醯亞胺基，且離胺酸殘基上之各胺基可連接分子量為大約20,000 Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，連接至Fab片段之PEG的總分子量可為大約40,000 Da。

在一個實施例中，抗體為經修飾之Fab'片段，其在其重鏈之C末端具有經修飾鉸鏈區，該經修飾鉸鏈區含有至少一個與效應分子連接之半胱胺酸殘基。適合地，效應分子為PEG且使用WO 98/25971及WO 2004072116中或WO 2007/003898中所描述之方法連接。可使用國際專利申請案WO 2005/003169、WO 2005/003170及WO 2005/003171中所描述之方法將效應分子連接至抗體片段。

在一個實施例中，抗體不連接至效應分子。

聚核苷酸及載體本發明亦提供一種經分離聚核苷酸，其編碼根據本發明之抗體或其一部分(諸如表2中所列之胺基酸SEQ ID)。在整個本說明書中，術語「經分離」意謂聚核苷酸存在於與其在自然界中可能存在之環境不同的物理環境中。

根據本發明之經分離聚核苷酸可包含合成DNA，例如藉由化學處理、cDNA、基因體DNA或其任何組合產生。表 2 ： 12389 抗 HLA-G 抗體之胺基酸序列及其對應核酸序列。

抗體序列	胺基酸SEQ ID NO	核酸SEQ ID NO
12389gL2gH16 VL	19	20
12389gL2gH16輕鏈	21	22
12389gL2gH16 VH	93	94
12389gL2gH16重鏈IgG1	95	96
12389gL2gH16重鏈IgG1 LALA	97	98
12389gL2gH16重鏈IgG4P	99	100
12389gL2gH16重鏈IgG4P FALA	101	102

本文中提供適合的序列之實例。因此，在一個實施例中，本發明提供一種編碼抗體之經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID No 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102中所載之序列。

在一個實施例中，本發明提供一種編碼本發明抗體之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼輕鏈可變區，其中該聚核苷酸： i. 與SEQ ID NO: 20、16或24至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 20、16或24或由其組成。

在一個實施例中，本發明提供一種編碼本發明抗體之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼重鏈可變區，其中該聚核苷酸： i. 與SEQ ID NO: 94、28、34、58、70、76、82或88至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 94、28、34、58、70、76、82或88或由其組成。

在一個實施例中，本發明提供一種編碼本發明抗體之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼輕鏈，其中該聚核苷酸： i. 與SEQ ID NO: 22、18或26至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 22、18或26或由其組成。

在一個實施例中，本發明提供一種編碼本發明抗體之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼重鏈，其中該聚核苷酸： i. 與SEQ ID NO: 96、30、36、60、72、78、84或90至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 96、30、36、60、72、78、84或90或由其組成。

在一個實施例中，本發明提供一種編碼本發明之IgG1抗體之重鏈的經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 96、30、36、60、72、78、84或90中所載之序列。

亦提供一種編碼本發明之IgG1抗體之輕鏈的經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 22、18或26中所載之序列。

在較佳實施例中，本發明提供一種編碼本發明之IgG1抗體之重鏈及輕鏈的經分離聚核苷酸，其中編碼重鏈之聚核苷酸包含SEQ ID NO: 96中所載之序列且編碼輕鏈之聚核苷酸包含SEQ ID NO: 22中所載之序列。

本發明亦提供選殖或表現載體，其包含一或多種本文中所描述之聚核苷酸。在一個實例中，根據本發明之選殖或表現載體包含一或多種如上文所描述之經分離聚核苷酸。

可使用分子生物學之標準技術來製備編碼本發明之抗體的DNA序列。所需DNA序列可使用寡核苷酸合成技術完全或部分合成。適當時可使用定點突變誘發及聚合酶鏈反應(PCR)技術。

可用於構築載體之一般方法、轉染方法及培養方法為熟習此項技術者熟知的。在此方面，參考「Current Protocols in Molecular Biology」, 1999, F. M. Ausubel (編), Wiley Interscience, New York及由Cold Spring Harbor Publishing出版的Maniatis Manual。

用於產生抗體之宿主細胞亦提供一種宿主細胞，其包含根據本發明之一或多種經分離聚核苷酸序列或包含編碼本發明之抗體之一或多種經分離聚核苷酸序列的一或多種選殖或表現載體。任何適合之宿主細胞/載體系統可用於表現編碼本發明之抗體的聚核苷酸序列。可使用細菌(例如結腸桿菌( E. coli))及其他微生物系統，或亦可使用真核(例如哺乳動物)宿主細胞表現系統。適合之哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。

在另一實施例中，提供包含此類核酸或載體之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如，已經以下各者轉型)：(1)包含編碼以下之核酸的載體：包含抗HLA-G抗體之VL的胺基酸序列及包含抗HLA-G抗體之VH的胺基酸序列；或(2)第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼包含抗HLA-G抗體之VL之胺基酸序列的核酸，該第二載體包含編碼包含抗HLA-G抗體之VH之胺基酸序列的核酸。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，宿主細胞為原核細胞，例如結腸桿菌細胞。在一個實施例中，提供一種製造抗HLA-G抗體之方法，其中該方法包含：在適合於表現抗體的條件下，培養如上文所提供之包含編碼抗體之核酸的宿主細胞，且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。

適合於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，在不需要糖基化及Fc效應功能時尤其如此。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如U.S. 5,648,237、5,789,199及5,840,523。(亦參見Charlton, Methods in Molecular Biology, 第248卷(B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 第245-254頁，其描述抗體片段在結腸桿菌中之表現。)在表現之後，抗體可以可溶性溶離份自細菌細胞糊狀物分離且可進一步進行純化。

除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適合於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化模式的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004)及Li等人, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。

用於本發明中之中國倉鼠卵巢(CHO細胞)的適合類型可包括CHO及CHO-K1細胞，包括dhfr-CHO細胞，諸如可與DHFR可選標誌物一起使用之CHO-DG44細胞及CHO-DXB11細胞或可與麩醯胺酸合成酶可選標誌物一起使用之CHOK1-SV細胞。用於表現抗體之其他細胞類型包括淋巴球性細胞株，例如NS0骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞。宿主細胞可用根據本發明之經分離聚核苷酸序列或表現載體穩定轉型或轉染。

在一個實施例中，本發明之抗體在已經基因修飾以降低或消除α1,6岩藻糖基轉移酶(FUT8)之功能的宿主細胞中產生。在一個實施例中，經基因修飾之細胞為CHO細胞，且FUT8基因已經基因剔除(KO FUT8)。在一個實施例中，用於產生本發明之抗體的宿主細胞為CHO-DG44。在一個實施例中，用於產生本發明之抗體的宿主細胞為KO FUT8 CHOSXE/DG44細胞，其可根據本文提供之實例中所描述之方法產生。

用於產生抗體之方法本發明亦提供一種用於產生根據本發明之抗體的方法，其包含在適合於產生根據本發明之抗體的條件下培養根據本發明之宿主細胞且分離抗體。

本發明亦提供一種產生包含根據本發明之抗體之醫藥組合物的方法，其包含在適合於產生根據本發明之抗體的條件下培養根據本發明之宿主細胞、分離抗體以及將抗體調配成醫藥組合物。

抗體可僅包含重鏈或輕鏈多肽，在此情況下，僅需要使用編碼重鏈或輕鏈多肽之序列來轉染宿主細胞。為產生包含重鏈及輕鏈之抗體，細胞株可經兩種載體轉染，第一載體編碼輕鏈多肽且第二載體編碼重鏈多肽。或者，可使用單一載體，該載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。

因此，提供一種培養宿主細胞且表現抗體，分離抗體且視情況純化抗體以提供經分離抗體的方法。在一個實施例中，該方法進一步包含使效應分子與經分離抗體結合之步驟。

本發明亦提供一種用於產生根據本發明之抗體的方法，其包含在適於引起自編碼本發明之抗體分子之DNA表現蛋白質的條件下培養含有本發明之載體的宿主細胞，及分離抗體分子。

根據本發明之抗體由宿主細胞以優良含量表現。因此，抗體之特性似乎經最佳化用於商業加工。

在一個實施例中，提供一種經純化抗體，例如人類化抗體，尤其本發明之抗體，其呈實質上純化形式，尤其不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA。

實質上不含內毒素一般意指每毫克抗體產物之內毒素含量為1 EU或更低，諸如每毫克產物0.5或0.1 EU。

實質上不含宿主細胞蛋白質或DNA一般意指每毫克抗體產物之宿主細胞蛋白質及/或DNA含量為400 µg或更低，諸如每毫克100 µg或更低，尤其適當時每毫克20 µg。

醫藥組合物、劑量及劑量方案本發明之抗體可以醫藥組合物或診斷組合物形式提供。因此，本發明亦提供一種醫藥或診斷組合物，其包含根據本發明之抗體與醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑中之一或多者之組合。

較佳地，該醫藥或診斷組合物包含特異性結合HLA-G之抗體，其中該抗體包含： a. 輕鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1； ii. 包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2，及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1； ii. 包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及 iii. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。

在一個實施例中，根據本發明之抗體為唯一活性成分。在另一實施例中，根據本發明之抗體與一或多種額外活性成分組合。在一個實施例中，根據本發明之抗體與針對CD47之抗體組合。因此，在一個實施例中，提供一種特異性結合HLA-G之抗體，其中該抗體包含： a. 輕鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1； ii. 包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2，及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1； ii. 包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及 iii. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3，且其中該抗體與結合於CD47之第二抗體組合。

或者，醫藥組合物包含根據本發明之抗體，其係唯一活性成分且其可與其他治療性、診斷性或緩解性藥劑組合(例如同時、依序或分開)單獨地向患者投與。

根據本發明之醫藥組合物可適當地向患者投與以鑑定所需之治療有效量。如本文所用，術語「治療有效量」係指治療、改善或預防靶向性疾病或病狀或呈現可偵測之治療或預防作用所需要的治療劑之量。對於任何抗體，治療有效量可最初在細胞培養分析中或在動物模型中，通常在嚙齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物中估算。動物模型亦可用於確定投與之適當濃度範圍及途徑。此類資訊可隨後用於確定適用於在人體內投與之劑量及途徑。

用於人類個體之精確治療有效量將取決於疾病狀態之嚴重程度、個體之整體健康狀況、個體之年齡、體重及性別、飲食、投與之時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之耐受性/反應。一般而言，治療有效量將為0.01 mg/kg至500 mg/kg，例如0.1 mg/kg至200 mg/kg，諸如100 mg/kg。醫藥組合物宜呈每劑含有預定量之本發明之活性劑的單位劑型呈現。

治療組合物中醫藥學上可接受之載劑可另外含有液體，諸如水、生理鹽水、甘油及乙醇。另外，諸如濕潤劑或乳化劑或pH緩衝物質之輔助物質可存在於此類組合物中。

適合之投與形式包括適用於非經腸投與之形式，例如藉由注射或輸注，例如藉由彈丸注射或連續輸注、靜脈內、可吸入或皮下形式。在產品用於注射或輸注的情況下，其可採用於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液的形式且其可含有調配劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，根據本發明之抗體可呈乾燥形式，在使用之前用適當無菌液體復原。亦可製備適合於在注射前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式。

一旦調配，本發明之組合物可向個體直接投與。因此，本文提供根據本發明之抗體在藥劑製造中之用途。

較佳地，根據本發明之醫藥組合物適於向人類個體投與。

因此，在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合HLA-G之抗體，其中該抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其用於療法中，其中該抗體包含： a. 輕鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1； ii. 包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2；及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1； ii. 包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2，及 iii. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。

治療適應症如本文所用，術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語係指獲得所需藥理學及/或生理學作用。該作用就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。因此，治療涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病的任何治療，且包括：(a)預防可能易患該疾病、但尚未診斷出患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制該疾病，亦即阻滯其發展；以及(c)緩解該疾病，亦即促使該疾病消退。

「治療有效量」係指HLA-G抗體在向哺乳動物或其他個體投與以治療疾病時足以實現對疾病之該治療的量。治療有效量將視以下而變：抗HLA-G抗體、疾病及其嚴重程度以及待治療個體之年齡、體重等。

可投與本發明之抗體、其調配物或醫藥組合物以用於預防性及/或治療性治療。在預防性應用中，向具有發展如本文中所描述之病症或病狀之風險的個體投與足以阻止或降低病狀或其一或多種症狀之後續作用的量之抗體、調配物或組合物。在治療性應用中，向已罹患如本文中所描述之病症或病狀之個體投與足以治癒、緩解或部分阻滯病狀或其一或多種症狀的量之抗體。此類治療性治療可使得疾病症狀之嚴重程度降低，或無症狀時期之頻率或持續時間增加。

本發明提供一種治療有需要之個體中之如本文所描述之病症或病狀的方法，該方法包含向該個體投與根據本發明之抗體或醫藥組合物。此類抗體以治療有效量投與。

本發明亦提供一種本發明之抗體或醫藥組合物，其用於療法中，尤其用於治療如本文所描述之病症或病狀的療法中。

本發明亦提供一種本發明之抗體或醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑，尤其用於治療如本文所描述之病症或病狀的藥劑。

本發明之抗體可用於治療、預防或改善與HLA-G活性相關之任何病狀；例如完全或部分地由HLA-G受體之信號傳導引起的任何病狀。

HLA-G相關疾病或病症尤其包括癌症(或腫瘤)、感染及自體免疫病症。

在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物，其用於治療特徵為過度表現HLA-G之疾病。

本發明之抗體可尤其適用於治療或預防癌症，包括特徵為過度表現HLA-G之癌症。因此，在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物，其用於治療癌症。在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物，其用於治療特徵為過度表現HLA-G之癌症。

在本發明之上下文中，癌症包括例如腎透明細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、卵巢癌、乳癌、頭頸癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、神經母細胞瘤及血液癌。本發明之抗體可適用於治療或預防諸如血液癌之液體癌症。

本發明之抗體可尤其適用於治療或預防實體腫瘤。因此，在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物，其用於治療實體腫瘤。在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物，其用於治療特徵為過度表現HLA-G之實體腫瘤。在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物，其用於治療腎透明細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、卵巢癌、頭頸癌、胃癌或肝細胞癌。在一個特定實施例中，實體腫瘤為腎透明細胞癌(RCC)。在另一特定實施例中，實體腫瘤為結腸直腸癌(CRC)。

在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療實體腫瘤之藥劑。在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療特徵為過度表現HLA-G之實體腫瘤的藥劑。在一個實施例中，本發明提供一種本發明之抗體或醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療腎透明細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、卵巢癌、頭頸癌、胃癌或肝細胞癌之藥劑。在一個特定實施例中，實體腫瘤為腎透明細胞癌(RCC)。在另一特定實施例中，實體腫瘤為結腸直腸癌(CRC)。

在一個實施例中，本發明提供一種治療患者之實體腫瘤的方法，其包含向該患者投與治療有效量的本發明之抗體或醫藥組合物。在一個實施例中，本發明提供一種治療患者之特徵為過度表現HLA-G之實體腫瘤的方法，其包含向該患者投與治療有效量的本發明之抗體或醫藥組合物。

在一個實施例中，實體腫瘤係選自腎透明細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、卵巢癌、頭頸癌、胃癌及肝細胞癌。在一個特定實施例中，實體腫瘤為腎透明細胞癌(RCC)。在另一特定實施例中，實體腫瘤為結腸直腸癌(CRC)。

本發明亦提供一種本發明之抗體之用途，其用作診斷活性劑或用於診斷分析中，例如用於診斷疾病或其嚴重程度。

在一個實施例中，本發明提供一種藉由使用根據本發明之抗體或醫藥組合物來診斷實體腫瘤的方法。在一個實施例中，本發明提供一種藉由使用根據本發明之抗體或醫藥組合物來診斷特徵為過度表現HLA-G之實體腫瘤的方法。

在一個實施例中，本發明提供一種藉由使用根據本發明之抗體或醫藥組合物來診斷腎透明細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、卵巢癌、頭頸癌、胃癌或肝細胞癌的方法。在一個特定實施例中，實體腫瘤為腎透明細胞癌(RCC)。在另一特定實施例中，實體腫瘤為結腸直腸癌(CRC)。

較佳可對生物樣品進行診斷。「生物樣品」涵蓋獲自個體之多種樣品類型且可用於診斷或監測分析。該定義涵蓋腦脊髓液，諸如血漿及血清之血液，及生物來源之其他液體樣品，諸如尿液及唾液，固體組織樣品，諸如活檢樣本或自其及其子代衍生之組織培養物或細胞。定義亦包括在獲取之後已以任何方式操控的樣品，諸如藉由試劑處理、增溶，或富集某些組分，諸如聚核苷酸。

診斷測試較佳可對不與人類或動物身體接觸的生物樣品進行。此類診斷測試亦稱為活體外測試。活體外診斷測試可依賴於活體外偵測已自個體獲得之生物樣品中的HLA-G之方法。

在一個實施例中，本發明提供一種藉由使用根據本發明之抗體或醫藥組合物在生物樣品中診斷表現HLA-G之實體腫瘤的方法。在一個實施例中，本發明提供一種藉由使用根據本發明之抗體或醫藥組合物在生物樣品中診斷腎透明細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、卵巢癌、頭頸癌、胃癌或肝細胞癌的方法。

實例實例 1 ： 用於篩選分析中之 HLA-G 、 HLA-I 及 ILT2 、 ILT4 蛋白質之產生 1.1. HLA-G 蛋白質 ：序列使用包含HLA-G之α1、α2及α3域的HLA-G之最豐富同功異型物HLA-G1 (膜結合性)或HLA-G5 (可溶性)之序列來產生HLA-G構築體以篩選針對HLA-G之抗體。

HLA-G胞外域或ECD之序列基於晶體結構分析進行定義(藉由結晶學所測定，α1域(斜體)-α2域-α3域(加底線)-最末殘基KQ)。HLA-G特定的20個殘基呈粗體：

■ 可溶性HLA-G (HLA-G ECD)：蛋白質與AVItev10HisTag (信號肽呈粗體，用於生物素標記之抗生物素蛋白親和標籤或AVI標籤加底線，Tev蛋白酶位點加底線且呈斜體，10His Tag呈斜體)一起表現：

用於篩選分析的經純化之最終蛋白質序列包含以下序列(包含AVItev10His Tag)：

■ 用於細胞膜結合表現之HLA-G DNA序列：

對應的膜結合性蛋白質包含以下序列(信號肽 MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA在表現之後裂解，跨膜及細胞質域呈斜體)：

■ 「HLA-G Null 1,2,3」「HLA-G Null 1,2,3」對應於其中HLA-G α1、α2及α3上特異性表現之胺基酸經其他HLA-I上表現之共通胺基酸取代的HLA-G (在下方序列中，突變的20個胺基酸呈粗體)。

HLA-I共通胺基酸來源於自EBI處之免疫多態性資料庫(Immuno Polymorphism Database)獲得的序列資訊。對HLA-I全長蛋白質進行分析，且產生完整HLA-I集合中各域(α1至α3)之殘基分佈圖，其允許鑑定HLA-G特定殘基(總共20個)。

亦使用序列資訊來產生各HLA蛋白質之對偶基因共通序列，其中典型序列中之數個位置經所有對偶基因中存在之最常見殘基取代。

為了獲得HLA-G Null 1,2,3序列，在20個特定位置處將HLA-G特定殘基改變為其他HLA分子中存在之共通殘基。

可溶性蛋白質(HLA-G Null 1,2,3 ECD)與AVItev10HisTag (信號肽呈粗體，AVI標籤加底線，Tev蛋白酶位點加底線且呈斜體，10His Tag呈斜體)一起表現：

肽信號在表現之後裂解，且用於篩選分析的經純化之最終蛋白質序列包含以下序列：

用於細胞膜結合表現之「HLA-G Null 1,2,3」DNA序列：

■ 「HLA-G Null 1,3」「HLA-G Null 1,3」對應於其中HLA-G α1及α3上特異性表現之胺基酸經其他HLA-I上表現之共通胺基酸取代的HLA-G (在下方序列SEQ ID NO: 117中，突變的胺基酸呈粗體)。

蛋白質在細胞表面處表現。用於細胞膜結合表現之DNA序列包含：

■ 「HLA-G Null3」「HLA-G Null3」對應於其中HLA-G α3上特異性表現之胺基酸經其他HLA-I上表現之共通胺基酸取代的HLA-G (在下方序列SEQ ID NO: 119中，突變的5個胺基酸呈粗體)。

■ 「HLA-G Null3 2AA」「HLA-G Null3 2AA」對應於其中僅2個特異性表現於HLA-G α3上且據報導與ILT2/ILT4相互作用之胺基酸(HLA-G之F195、Y197)經其他HLA-I上表現之共通胺基酸取代的HLA-G (突變的胺基酸呈粗體)。

■ 經分離HLA-G α3域(野生型) 可溶性蛋白質以Tev-humanFc融合蛋白(信號肽呈粗體，Tev加底線，Fc片段呈斜體)之形式表現且不與B2m共表現(「不含B2m之經分離HLA-G α3域」)：

肽信號在表現之後裂解，且用於篩選分析的經純化之最終蛋白質序列包含以下序列(Fc Tag裂解斷開)：

用於細胞膜結合表現之DNA序列：

對應的膜結合性蛋白質包含以下序列(信號肽在表現之後裂解，跨膜及細胞質域呈斜體)：

■ 經分離HLA-G α3域(剔除) (突變的5個胺基酸呈粗體) 蛋白質以10HistevAVI標籤蛋白質(Tag及GS連接子呈斜體，信號肽呈粗體)之形式表現

肽信號在表現之後裂解，且10His Tag在純化期間移除。用於篩選分析的經純化之最終蛋白質序列包含以下序列(N端AVI Tag及GS連接子呈斜體)：

■ B2m篩選分析中所使用及上文所描述之所有HLA-G構築體(除不含B2m之經分離HLA-G α3域(野生型)外)與B2m共表現。對於可溶性HLA-G構築體之表現，B2m與以下序列(信號肽呈粗體)共表現：

信號肽在表現之後裂解，且用於篩選分析的最終經純化蛋白質包含以下序列：

所有膜結合性HLA-G構築體(包括細胞表現之經分離α3域)與B2m共表現。用於轉染之DNA序列如下：

對應的與B2m複合之膜結合性HLA-G構築體包含序列SEQ ID NO: 129 (信號肽 MSRSVALAVLALLSLSGLEA在表現之後裂解)。

以可溶性蛋白質形式表現之 HLA-G 構築體之產生及純化方法■ 經分離HLA-G α3域(野生型) (TevHumanFc或TevHFc)之蛋白質表現及純化遵循製造商方案，使用Expi293™表現系統(Life technologies ^TM)使HLA-G α3 TevHFc與β2m共表現。在轉染之後5天收穫細胞且上清液立即用於純化。

將包含HLA-G α3 TevHFc + β2m蛋白質之上清液施加至Hitrap Protein A管柱。用PBS洗滌未結合蛋白質及雜質，且用0.1M檸檬酸緩衝液(pH 2)溶離HLA-G α3 TevHFc + β2m蛋白質，並且用0.5 ml 2M Tris (PH 8)中和峰溶離份。彙集含有經純化之HLA-G α3 TevHFc + β2m蛋白質的溶離份，且藉由將蛋白質與tev蛋白酶以1:100之比率在室溫下培育2小時且在4℃下培育2小時來移除HFc標籤。濃縮蛋白質，且在已用PBS緩衝液平衡之S75 26/60上藉由尺寸排阻層析進一步純化。彙集含有經純化之HLA-G α3蛋白質的溶離份，濃縮，且將等分試樣儲存在-80℃下直至需要時為止。

■ 經分離HLA-G α3域(剔除)之蛋白質表現及純化遵循製造商方案，使用Expi293™表現系統(Life technologies ^TM)使10histevAVI HLA-G α3 (剔除)與β2m共表現。在轉染之後5天收穫細胞且上清液立即用於純化。將包含10histevAVI HLAG α3 (剔除) + B2m蛋白質之上清液施加至使用Äkta純化器(GE Healthcare)之HisTrap Excel管柱(GE Healthcare)。用Cytiva HyClone™磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、500 mM NaCl (pH 7.5)、10 mM咪唑洗滌未結合蛋白質及雜質，且用Cytiva HyClone™磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、500 mM NaCl (pH 7.5)、500 mM咪唑溶離蛋白質。彙集含有經純化之10histevAVI HLAG α3 (剔除) + B2m蛋白質的溶離份，且藉由將蛋白質與tev蛋白酶以1:100之比率在室溫下培育2小時且在4℃下培育2小時來移除10his標籤。濃縮蛋白質，且在已用Cytiva HyClone™磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)平衡之S75 26/60上藉由尺寸排阻層析進一步純化。彙集含有經純化之AVI HLAG α3 (剔除) + B2m蛋白質的溶離份，濃縮，且將等分試樣儲存在-80℃下直至需要時為止。

■ 與B2m共表現之HLA-G ECD (野生型或剔除變體)之蛋白質表現及純化遵循製造商之方案，使用CHO-SXE表現系統使HLA-G ECD (WT或剔除突變體)與β2m共表現。簡言之，使CHO-SXE細胞在37℃、8% CO ₂之振盪培育箱中在補充有Gibco® GlutaMAX™ (1:1000)之無血清CD CHO培養基(Gibco)中生長至6 × 10 ⁶/mL之細胞密度。細胞接著以1500 rpm旋轉且再懸浮於新製的ExpiCHO™表現培養基(Gibco)中。使用1 mg/L之DNA以1:1之HLA-G ECD與β2m比率轉染細胞。使用ExpiFectamine™ CHO轉染套組及OptiPRO™ SFM來進行轉染。轉染後96小時收集含有所分泌蛋白質之條件培養基。將過濾之細胞培養物上清液負載至使用Äkta純化器(GE Healthcare)之5-ml HisTrap Excel管柱(GE Healthcare)上。用Cytiva HyClone™磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、500 mM NaCl (pH 7.5)洗滌管柱，且用含有500 mM咪唑之相同緩衝液溶離蛋白質。使用經Quick Coomassie染色劑(VWR)染色之NuPAGE 4-20% Tris-甘胺酸(Thermo)及NuPAGE MES SDS運行緩衝液(Thermo)，藉由SDS-PAGE來分析含有蛋白質之溶離份。彙集純溶離份，隨後使用Amicon ^®Ultra-15離心過濾器單元(Millipore)進行濃縮。隨後使用Cytiva HyClone™磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)作為運行緩衝液，使用Superdex 200 16/600管柱(GE Healthcare)進一步純化蛋白質。

藉由分析型尺寸排阻HPLC及十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來評定蛋白質純度。蛋白質純度大於97% (通常至少99%)。此外，藉由液相層析質譜分析(LC-MS)來分析蛋白質以確認序列分子量(MW)如所預期。

在細胞表面處表現 HLA-G 構築體之細胞之產生方法■ HLA-G (包括剔除構築體)與B2m在ExpiHEK293表面處之短暫表現將1:1比率之HLA-G及B2m表現載體共轉染至Expi293 ^TM懸浮細胞中係使用ExpiFectamine ^TM293轉染試劑(ThermoFisher Scientific)實現，且自24小時起得到細胞表面蛋白質之表現。

■ HLA-G (包括剔除構築體)與B2m在CHO表面處之短暫表現(噬菌體淘選) 遵循製造商之建議，利用ExpiFectamine™ CHO轉染套組(Gibco)將HLA-G或HLA-G Null 1,2,3與B2m表現載體以1:1比率共轉染至專用的CHO-SXE細胞中。48小時後收穫在其表面處表現HLA-G之細胞。

■ 表現HLA-G之HCT116細胞轉染前一天，將HCT116細胞(ATCC CCL-247)以4×10 ⁶個細胞/T 75 cm ²燒瓶接種於20 ml完全RPMI生長培養基中，且在37℃、5% CO ₂下培育24小時。在轉染當天，移除生長培養基，用16 ml完全生長培養基更換。對於待轉染之各燒瓶細胞，將20 μg HLA-G及β2m質體(1:1比率)稀釋於4 ml不含血清之Opti-MEM® I低血清培養基中。將80 μl脂染胺LTX®試劑添加至上述經稀釋之Opti-MEM® DNA溶液中，且在室溫下培育30分鐘。在培育之後，將DNA-脂染胺LTX®試劑複合物直接添加至含有細胞之各燒瓶中，且將燒瓶置放於37℃之CO ₂培育箱中22 ± 2小時。

1.2. HLA-I 構築體遵循製造商方案，使用Expi293™表現系統(Life technologies)使HLA-I構築體與β2m共表現。

HLA-I共通序列來源於已公開報導的HLA-I對偶基因之胺基酸序列。用於進行分析之相關序列資訊係獲自EBI處之免疫多態性資料庫。使用此資訊來產生各HLA蛋白質之對偶基因共通序列，其中典型序列中之數個位置經所有對偶基因中存在之最常見殘基取代。

編碼共通胺基酸序列且用於轉染/細胞膜表現之DNA序列在下文列出。編碼B2m之DNA序列如上文所描述。所分泌之HLA-I蛋白質中之信號肽在表現之後移除。

■ HLA-A 用於轉染/細胞膜表現之DNA序列：

對應的膜結合性蛋白質包含以下序列：

■ HLA-B 用於轉染/細胞膜表現之DNA序列：

對應的膜結合性蛋白質包含以下序列：

■ HLA-C 用於轉染/細胞膜表現之DNA序列：

對應的膜結合性蛋白質包含以下序列：

■ HLA-E 用於轉染/細胞膜表現之DNA序列：

對應的膜結合性蛋白質包含以下序列：

■ HLA-F 用於轉染/細胞膜表現之DNA序列：

對應的膜結合性蛋白質包含以下序列：

1.3. ILT2/ILT4 構築體 (Fc 融合體 ) ：■ ILT2以可溶性ILT2 ECD-兔Fc融合蛋白(信號肽呈粗體，兔Fc加底線)之形式表現：

用於篩選分析的經純化之最終蛋白質序列包含以下序列：

■ ILT4以可溶性ILT4 ECD-兔Fc融合蛋白(信號肽呈粗體，兔Fc加底線)之形式表現：

用於篩選分析的經純化之最終蛋白質序列包含以下序列：

ILT2rbFc 及 ILT4rbFc 之表現及純化遵循製造商方案，使用Expi293™ HEK表現系統(Life technologies ^TM)藉由短暫轉染來表現蛋白質。在轉染之後5天收穫細胞且上清液立即用於純化。

將包含ILT2rbFc或ILT4rbFc蛋白質之上清液施加至Hitrap Protein A管柱。用PBS洗滌未結合蛋白質及雜質，且用不含內毒素之0.1M檸檬酸緩衝液(pH 2)溶離ILT2rbFc或ILT4rbFc蛋白質，並且用0.5 ml 2M Tris (PH 8)中和峰溶離份。彙集含有經純化蛋白質之溶離份，且濃縮，並且使用Cytiva HyClone™磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)作為運行緩衝液在S200 26/60上藉由尺寸排阻層析進一步純化。彙集含有經純化之ILT2rbFc或ILT4rbFc蛋白質的溶離份，濃縮，且等分後儲存在-80℃下。

實例 2 ： 藉由用 HLA-G 進行免疫接種來產生抗體由於與產生針對HLA-G之抗體相關的特定挑戰(諸如，與其他HLA-I分子之高同源性、能夠阻斷HLA-G與其抑制性受體之間的相互作用的抗體之鑑定)，且為了鑑定將適用於療法之抗體，必須開發專門的研發策略，包括專門的篩選及測試策略，且在下文進行描述。

免疫接種及篩選策略用表現不同形式之HLA-G、具有或不具有B2m共表現的同基因細胞對不同物種(包括小鼠及兔)之多種動物進行免疫接種。在3至5次注射之後，將動物處死且採集PBMC、脾臟、骨髓及淋巴結。監測血清與所用免疫原之結合。

設定記憶B細胞培養物，且首先在TTP Labtech Mirrorball系統(盤讀取器)或Intellicyt iQue (流式細胞測量術)上在多重免洗分析中針對超過不相關對照的與HLA-G結合之能力來篩選上清液。基於不相關對照蛋白質、內部產生的HLA-G蛋白質及/或使用在細胞表面短暫表現所關注構築體(HLA-G、HLA-G Null 1,2,3、HLA-G Null3)之EXPI293 HEK來篩選培養物。蛋白質試劑經生物素標記以使得鏈黴抗生物素蛋白捕捉至珠粒。將經螢光標記之物種特異性抗Fc二級抗體用於分析以偵測測試抗體。

在初步篩選中自總共18個各自含有100至300個盤之B細胞培養實驗鑑定出大約3800個HLA-G特異性陽性命中。來自初步篩選之陽性上清液接著繼續以在結合分析中進一步表徵(可溶性經分離α3域(剔除)及細胞表現之經分離α3域、HLA-G Null 1,3、HLA-G Null3 2AA)。

具有所需概況之孔使用螢光焦點方法及與HLA-G ECD蛋白質之結合進行可變V區回收。

同時，亦使用螢光焦點方法針對其與人類HLA-G或特定言之與α3域結合之能力直接篩選來自骨髓及淋巴結之漿細胞。此處，基於固定在鏈黴抗生物素蛋白珠粒上的經生物素標記之人類HLA-G ECD或經分離野生型HLA-G α3域來揀選分泌HLA-G特異性抗體之B細胞。使用山羊抗物種Fc-FITC結合物顯示試劑。揀選出大約1700個直接焦點。

在對所揀選之細胞進行反轉錄(RT)及PCR之後，產生編碼抗體之V區的『轉錄活性PCR』(TAP)產物且用於短暫轉染EXPI293 HEK細胞。在以下分析中測試含有重組抗體之所得TAP上清液： ● 與如上文所描述幫助建立域結合之HLA-G及剔除突變體之細胞結合(多重iQue) ● ILT2阻斷分析 ● 藉由Biacore量測親和力

接著，以匹配物種之全長IgG抗體形式選殖來自所關注TAP產物之重鏈及輕鏈可變區基因對且在短暫表現系統中再表現。隨後在上述分析中重新測試重組選殖抗體。

總共選殖且記錄 109 個 V ( 可變 ) 區，此等區中僅 30 個對 HLA-G 具有特異性且不結合其他 HLA-I ，其中僅 9 個顯示阻斷 HLA-G ILT2 相互作用。所有此等抗體結合HLA-G之α3域，且9種特異性及阻斷抗體中之5種具有不同序列且用於進一步測試(列於下表3中)。表 3 ： 選用於進一步分析的藉由免疫接種產生之抗體

抗體ID	來源/免疫原
HLA-G01	直接焦點，骨髓/Rab9細胞 + hHLA-G
HLA-G02 (VR12389 gL2gH16)	B細胞培養物，脾臟/Rab9細胞 + hHLA-G
HLA-G03	B細胞培養物，淋巴結/Rab9細胞 + hHLA-G
HLA-G04	B細胞培養物，淋巴結/Rab9細胞 + hHLA-G + B2m
HLA-G05	直接焦點，骨髓/Rab9細胞 + hHLA-G

基於其特性對一些抗體進行人類化活動，且在表徵分析中進一步評定，包括似乎為最佳抗體之HLA-G02及HLA-G01。VR12389之人類化描述於實例4中。亦對HLA-G03進行人類化，然而人類化抗體之高親和力並未轉譯至改良之功能活性中，如其他實例中將描述。

對經純化抗體進行之額外分析包括基於細胞之特異性分析、ILT4阻斷分析、ADCC。針對經純化IgG1抗體產生之資料描述於下文其他實例中。

在本發明中，抗體ID HLA-G02係指人類化VR12389gL2gH16 IgG1抗體。

引起發現抗體 12389 之免疫接種方法 短暫表現 HLA-G 之 Rab9 細胞在5層細胞培養燒瓶中在RPMI培養基 + 10% FBS及1%麩醯胺酸中培養Rab9纖維母細胞。當細胞90-100%匯合時，移除培養基，用100 ml PBS洗滌細胞，且使用100 ml阿庫酶(Accutase)並在室溫下培育10至15分鐘而自細胞培養燒瓶移除細胞。使所收穫之細胞旋轉且以5×10 ⁷個細胞/毫升再懸浮於Earles平衡鹽緩衝液中。將HLA-G DNA以每毫升細胞250 µg DNA添加至細胞中。接著將Rab9 + HLA-G DNA混合物以3×10 ⁷個細胞/比色管轉移至電穿孔比色管中。隨後使用吾人內部的電穿孔器裝置(Zapper)及Gene Pulser Xcell ShockPod比色管腔室(BIORAD)，用150-170V電力(20 ms 5.5安培)對比色管進行脈衝。在電脈衝之後，將細胞快速轉移至溫熱的Rab9培養基中且放回新的5層細胞培養燒瓶中。

在所有細胞電穿孔且轉移至新培養燒瓶中之後，接著在37℃、5% CO ₂下培育24小時，隨後使用阿庫酶收穫細胞(如前所述)，計數，且在-80冷凍器中以每冷凍小瓶2×10 ⁷個細胞冷凍至冷凍小瓶中。在24小時之後，將冷凍細胞轉移至液氮杜瓦瓶(dewar)中以用於長期儲存。

在冷凍之前，藉由用Sigma APC結合之抗HLA-G抗體(純系MEM/G9)在4℃下染色1小時且在FACS Calibre上運行樣品來測試5×10 ⁵個經轉染細胞之HLA-G表現。

在免疫接種當天，對於每次注射，1小瓶之經轉染細胞在37℃下快速解凍且在50 ml PBS中洗滌兩次，隨後再懸浮於500 µl中以投與至兔中。

編碼全長HLA-G之DNA序列(SEQ ID NO: 111)用於電穿孔(針對哺乳動物細胞中之表現最佳化的HLA-G之核酸序列)。

免疫接種用如上文所描述製備的在細胞表面上短暫表現HLA-G之2×10 ⁷個Rab9兔纖維母細胞皮下免疫接種一隻雌性紐西蘭白兔。在用細胞免疫接種的同時，在不同部位將等體積之完全弗氏佐劑皮下注射至該兔中。

用在細胞表面上短暫表現HLA-G之Rab9兔纖維母細胞以14天間隔對兔進行兩次加強注射。在每次免疫接種之前，自耳靜脈獲取肝素出血(200 µl)。在台上型離心機中在以10,000 rpm旋轉5分鐘之後自出血收集血清且在-20℃下冷凍。在最後一次加強免疫之後14天終止，其中在-80℃下在10% DMSO/FCS中製備脾臟、淋巴結、骨髓及周邊血液單核細胞之單細胞懸浮液且冷凍，直至需要用於B細胞發現目的為止。亦在終止時取血且如先前所描述製備血清。

B 細胞 回收及篩選自脾臟之記憶B細胞培養物發現VR12389。將脾臟細胞與飼養細胞株及補充劑一起在96孔盤中在37℃下培養5天。隨後經由免洗多重流式細胞測量術分析(Intellicyt iQue)來篩選此培養物。將含有所分泌抗體之培養物上清液與如上文所描述之篩選試劑(內部產生的HLA-G蛋白質及細胞表現之HLA-G構築體：HLA-G、HLA-G Null 1,2,3、HLA-G Null3)混合。用於篩選之篩選細胞經不同染色以允許圈選不同群體，且經Dylight 405標記之山羊抗兔抗體用作二級抗體以鑑定抗體結合。

命中定義為具有特異性，亦即不結合於HLA-G Null 1,2,3突變體或不相關對照轉染之HLA-G結合劑。回收引起命中之B細胞，將其放回原始培養孔中，隨後使用如先前所描述之螢光焦點方法。

針對兩種引導物之所揀選細胞在焦點步驟之後遵循相同工作流程。所揀選細胞之反轉錄(RT)及PCR產生編碼抗體之V區的『轉錄活性PCR』(TAP)產物，其用於短暫轉染EXPI293 HEK細胞。針對細胞結合、ILT2阻斷及親和力表徵含有重組抗體之所得TAP上清液，隨後選殖抗體且以更大規模表現。

如上文所提及，用表現不同形式之HLA-G、具有或不具有B2m共表現的同基因細胞對不同物種(包括大鼠、小鼠及兔)之多個動物進行免疫接種，但並非所有免疫接種策略皆成功產生針對HLA-G之抗體，或當確認產生針對HLA-G之抗體時，該等抗體對HLA-G不具有特異性及/或無阻斷性，或不能結合細胞表面所表現之HLA-G蛋白質。值得注意的是，用表現經分離α3域或表現兔-人類HLA-G嵌合體之Rab9細胞對兔進行免疫接種並未產生任何針對HLA-G之抗體。 因此，本發明提供一種免疫接種方法，其尤其適用於發現適用於療法之抗 HLA-G 抗體，該方法包含用在細胞表面上短暫表現 HLA-G 之全長序列的 Rab9 兔纖維母細胞對兔進行免疫接種。

實例 3 ： 藉由噬菌體呈現產生抗體為了鑑定將適用於療法之抗體，開發與免疫接種活動並行進行的第二方法，以嘗試自噬菌體呈現庫鑑定出將適用於療法的特異性結合於HLA-G之抗體。此外，由於與產生適用於療法之HLA-G抗體相關的特定挑戰，開發出專門的篩選及測試策略。

噬菌體呈現庫利用三個人類天然組合性scFv噬菌體庫，以使用旨在獲得對HLA-G具有選擇性且不結合於或極少結合於其他HLA-I之結合劑的不同構築體來獲得結合HLA-G之抗體。使用僅在細胞表面上表現之重組HLA-G或接著在最後一輪中使用重組HLA-G胞外域蛋白質進行三輪或四輪選擇，對庫進行生物淘選。在最後一輪中包括視情況存在的針對HLA-G Null 1,2,3 (可溶性蛋白質或細胞表現)之減除步驟以富集HLA-G特異性結合劑。

簡言之，對細胞之生物淘選包括於以下步驟中：在第一輪中在ExpiCHO中或在後續輪次中在Expi293 HEK中共轉染編碼人類HLA-G及β2m之DNA構築體，且將此等細胞與先前在未經轉染或經HLA-G Null 1,2,3轉染之細胞上耗竭的經阻斷噬菌體病毒粒子一起培育。對蛋白質之生物淘選藉由以下方式進行：將經阻斷噬菌體粒子與盤塗佈之HLA-G或與生物素標記之HLA-G溶液一起培育，接著在鏈黴抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白磁性珠粒上捕捉。使用PBS Tween洗滌若干次後，將結合標靶之噬菌體溶離且藉由感染結腸桿菌TG1而再擴增。

噬菌體篩選最後一輪選擇之後，基於在經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之盤上捕捉的經生物素標記之HLA-G ECD，藉由ELISA篩選1692個單株拯救噬菌體。藉由HRP結合之抗M13 pVIII外殼蛋白抗體來偵測結合。使用經生物素標記之HLA-G Null 1,2,3來評定此等單株噬菌體純系之特異性。對359種所關注結合劑進行定序，且基於其可變重鏈CDR3序列模體來分析多樣性。接著在哺乳動物表現載體中將81個獨特純系重新編排格式為scFv-兔IgG Fc融合體以進一步表徵。

HLA-G 選擇性結合劑之進一步表徵scFv-Fc在Expi293 HEK中表現。使用IntelliCyt iQue Screener Plus藉由流式細胞測量術測試其結合及特異性。將經稀釋的含有抗體之上清液添加至用人類HLA-G或HLA-G及β2微球蛋白共轉染之ExpiHEK中。用Fc片段特異性螢光抗體來偵測結合。

不結合HLA-G Null 1,2,3 + B2m的21種HLA-G細胞結合劑進一步表徵為scFv-Fc，及/或在重新編排格式為全長人類IgG1之後，藉由SPR以及經由流式細胞測量術進行的ILT2阻斷分析、與HEK上表現之HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F之結合及與JEG3細胞之結合進一步表徵。

確認14種抗體對HLA-G具有高特異性且不結合於或極少結合於其他HLA-I分子，其中僅發現6種抗體阻斷HLA-G與ILT2之間的相互作用。

在6種特異性及阻斷性抗體中，3種具有不同序列且用於進一步測試(HLA-G06、HLA-G07、HLA-G08)。

對經純化抗體進行之額外分析包括基於細胞之特異性分析、ILT4阻斷分析、ADCC。針對經純化抗體產生之資料描述於下文其他實例中。

實例 4 ：抗體 12389 人類化藉由將來自兔V區之CDR移植至人類生殖系抗體V區構架上來對抗體12389進行人類化。為了恢復抗體活性，來自兔V區之許多構架殘基亦保留於人類化序列中。使用Adair等人(1991) (WO91/09967)概述之方案選擇此等殘基。兔抗體(供體) V區序列與人類生殖系(受體) V區序列之比對以及所設計之人類化序列展示於圖 2 及圖 3中。除在CDR-H1中使用組合型Chothia/Kabat定義(參見Adair等人, WO91/09967)以外，自供體移植至受體序列之CDR係按Kabat (Kabat等人, 1987)所定義。

對於抗體12389，選擇人類V區IGKV1D-13加IGKJ4 J區(IMGT，http://www.imgt.org/)作為輕鏈CDR之受體。除其中分別保留參考SEQ ID NO: 7 (兔VL)之供體殘基纈胺酸(V3)及麩醯胺酸(Q70)的零個、一個或兩個來自包含殘基3及70之群之殘基以外，人類化移植物變體中之輕鏈構架殘基皆來自人類生殖系基因。

選擇人類V區IGHV3-66加IGHJ4 J區(IMGT，http://www.imgt.org/)作為抗體12389之重鏈CDR之受體。與許多兔抗體相同，抗體12389之VH基因比所選人類受體短。在與人類受體序列比對時，抗體12389之VH區之構架1缺乏保留在人類化抗體中之N端殘基(圖3)。12389兔VH區之構架3亦不具有β摺疊股D與E之間的環中的兩個殘基(75及76，參考SEQ ID NO: 11，兔VH)：在人類化移植物變體中，空位由來自所選擇的人類受體序列之對應殘基(離胺酸75，K75；天冬醯胺76，N76)填充。除其中分別保留參考SEQ ID NO: 11之供體殘基纈胺酸(V24)、異白胺酸(I48)、甘胺酸(G49)、離胺酸(K71)、絲胺酸(S73)、纈胺酸(V78)及甘胺酸(G96)的一或多個來自包含殘基24、48、49、71、73、78及96之群之殘基以外，人類化移植物變體中之重鏈構架殘基皆來自人類生殖系基因。

表現變異人類化抗體鏈及其組合，且評定其相對於親本抗體對人類HLA-G之結合親和力。

Expi293 細胞中之表現藉由ATUM (Newark, CA)之自動合成方法來設計及構築編碼變異重鏈及輕鏈V區序列之基因。為了在哺乳動物細胞中短暫表現，將人類化輕鏈V區基因選殖至輕鏈表現載體pMhCK中，該表現載體含有編碼人類κ鏈恆定區的DNA (Km3異型)。將人類化重鏈V區基因選殖至人類γ-4重鏈表現載體pMhg4PFL中，該表現載體含有編碼具有鉸鏈穩定化突變S228P之人類γ-4重鏈恆定區的DNA (Angal S.、King D.J.、Bodmer M.W.、Turner A., Lawson A.D.G.、Roberts G.、Pedley B.及Adair J.R. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol. Immunol.1993, 30 (1):105-8)；或選殖至γ-1重鏈表現載體pMhg1FL中，該表現載體含有編碼人類γ-1重鏈恆定區的DNA (G1m17，1種異型)。將所得重鏈及輕鏈載體共轉染至Expi293 ^TM懸浮細胞中係使用ExpiFectamine ^TM293轉染試劑(A14525, ThermoFisher Scientific)實現，且得到人類化重組IgG4P及IgG1抗體之表現。

藉由 SPR 進行 親和力量測如下文所描述，分析形式為藉由固定之抗人類IgG Fc特異性抗體捕捉抗HLA-G IgG，接著相對於捕捉表面滴定HLA-G。

使用Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences AB)藉由表面電漿子共振來測定抗HLA-G IgG結合HLA-G之親和力。分析在25℃下進行。經由胺偶合化學方法將Fc特異性親和純化F(ab') ₂片段山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch)固定在S系列CM5感測器晶片(GE Healthcare Bio-Sciences AB)上直至大約6000個反應單位(RU)之水準。使用HBS-EP ⁺緩衝液(10 mM HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，GE Healthcare Bio-Sciences AB)作為運行緩衝液，流動速率為10 µL/min。藉由活化及去活化適當流槽來準備參考表面。

注射10 µL濃度為0.15-0.7 µg/mL之抗HLA-G IgG，以用於藉由固定之抗人類IgG Fc進行之捕捉。以30 µL/min之流動速率，在50 nM下相對於所捕捉之抗HLA-G IgG滴定人類HLA-G ECD + B2m持續60秒，隨後解離150秒。藉由注射10 µL之40 mM HCl接著注射5 µL之5 mM NaOH，表面以10 µL/min之流動速率再生。

使用Biacore T200評估軟體(3.0版)，使用與局部Rmax擬合之1:1結合來分析減去背景之結合曲線。

在分析開始及結束時分析抗體且顯示良好精確度。產生所有樣品之高品質資料，如表4及5中所概述。表 4 ： 12389 ( 嵌合兔 V 區 / 人類 Fc) 及表現為 hIgG4P 之人類化移植物的親和力資料

抗體12389	輕鏈供體殘基	重鏈供體殘基	k _a(M ^-1s ^-1)	k _d(s ^-1)	親和力(KD) nM
12389 (嵌合兔V區/人類Fc)	-	-	9.49E+05	9.20E-03	9.69
12389gL1gH1	V3, Q70	V24, I48, G49, K71, S73, V78, G93	8.48E+05	6.78E-03	7.99
12389gL2gH1	V3	V24, I48, G49, K71, S73, V78, G93	9.28E+05	7.08E-03	7.63
12389gL3gH1	-	V24, I48, G49, K71, S73, V78, G93	8.45E+05	6.97E-03	8.25
12389gL2gH4	V3	I48, G49, K71, S73, V78, G93	8.88E+05	7.18E-03	8.09
12389gL2gH5	V3	V24, G49, K71, S73, V78, G93	8.17E+05	1.01E-02	12.4
12389gL2gH6	V3	V24, I48, K71, S73, V78, G93	8.39E+05	1.04E-02	12.5
12389gL2gH8	V3	V24, I48, G49, S73, V78, G93	7.87E+05	1.21E-02	15.4
12389gL2gH9	V3	V24, I48, G49, K71, V78, G93	8.50E+05	6.03E-03	7.09
12389gL2gH11	V3	V24, I48, G49, K71, S73, G93	8.50E+05	9.07E-03	10.7
12389gL2gH12	V3	V24, I48, G49, K71, S73, V78	8.44E+05	6.24E-03	7.39
12389gL2gH13	V3	I48, G49, K71, V78, G93	9.56E+05	6.32E-03	6.61
12389gL2gH14	V3	I48, G49, K71, S73, V78	8.75E+05	6.64E-03	7.58
12389gL2gH15	V3	V24, I48, G49, K71, V78	8.96E+05	5.67E-03	6.33
12389gL2gH16	V3	I48, G49, K71, V78	9.02E+05	5.46E-03	6.06
12389gL3gH16	-	I48, G49, K71, V78	8.33E+05	5.60E-03	6.72

表 5 ： 在兩個實驗中 12389 ( 嵌合兔 V 區 / 人類 Fc) 及表現為 hIgG1 之 12389gL2gH16 的親和力資料

抗體12389	輕鏈供體殘基	重鏈供體殘基	k _a(M ^-1s ^-1)	k _d(s ^-1)	親和力(KD) nM
12389 (嵌合兔V區/人類Fc)	-	-	8.41E+05	9.10E-03	10.80
12389gL2gH16 IgG1	V3	I48, G49, K71, V78	7.29E+05	3.48E-03	4.78
12389 (嵌合兔V區/人類Fc)	-	-	7.82E+05	9.18E-03	11.70
12389gL2gH16 IgG1	V3	I48, G49, K71, V78	6.72E+05	3.64E-03	5.42

如表4中所示，除12389gL2gH5、12389gL2gH6、12389gL2gH8、12389gL2gH11外的所有移植物皆具有小於10 nM之KD，且小於親本12389 (嵌合兔V區/人類Fc)之KD量測值。

藉由表面電漿子共振所量測，保留VH構架供體殘基I48、G49、K71及V78以及VL構架供體殘基V3的移植物12389gL2gH16與人類HLA-G結合之親和力最高，且在以不同型式(諸如IgG4P及IgG1 (表4至5))表現時保留功能性，並且選擇其進行進一步表徵。

實例 5. HLA-G01 至 HLA-G08 之表現及純化抗體在經編碼HLA-G01至HLA-G08抗體之LC及HC (1:1比率之LC:HC)之DNA載體轉染的CHO細胞中短暫表現為IgG1，且根據熟知方法經由蛋白質A親和層析純化以進行進一步測試。

藉由使用nanodrop讀取在280 nm處之吸光度來測定蛋白質濃度，且藉由分析型尺寸排阻HPLC來測定純度。使用分析型尺寸排阻層析及SDS Page電泳來測定單體含量。使用Charles River Endosafe® LAL試劑濾筒技術及Endosafe® nexgen-PTS讀取器來測定內毒素含量，其中含量＜ 1 EU/ml具有可接受品質。

最終純化樣品為高純度的且含有＞98%單體含量。藉由無損質譜分析來分析最終純化樣品以確認重鏈及輕鏈質量、預期修飾及一致性。

實例 6 ： 去岩藻糖基化 HLA-G02 抗體之產生 產生 KO FUT8 CHOSXE/DG44 細胞之方法RNA引導物(gRNA)經設計成剔除包含編碼α1,6岩藻糖基轉移酶(FUT8)活性位點之序列的2個外顯子。使用Benchling軟體來設計gRNA 2至8 (共計7個)以在正向及反向股中產生多個缺失，最大可能缺失為4kb，且使用引導物作為池以使可能的剔除最大化。gRNA之序列提供於下表6中。表 6 ： gRNA 序列

名稱	序列
FUT8-gRNA-2	GAUGGAGGCUGUCUACAAUG
FUT8-gRNA-3	GUCAGGGCUGUAGCACACUG
FUT8-gRNA-4	GAAGUGGUAGUAACUUUACA
FUT8-gRNA-5	AUUAGUAUCCCUAGUCAUGG
FUT8-gRNA-6	UGGUACACCUAGUACUACUG
FUT8-gRNA-7	UGACUAUACAAAUUUCUGGG
FUT8-gRNA-8	AGUCAACAAUGUCUUAGACA

以如表7中所提供之最終pmol濃度製備gRNA池。將Cas09 (ThermoFisher)製備為如表7中所提供之所需濃度。

製備3×10 ⁶個CHO SXE/DG44細胞用於核轉染，以x100g離心8分鐘之後，將細胞在PBS中洗滌，以x100g再次離心8分鐘且在100 µl核轉染溶液中再懸浮，得到每微升3×10 ⁴個細胞。如下表7中所示製備預轉染混合物，在不存在細胞的情況下在室溫下靜置10至60分鐘，以允許形成Cas09/gRNA複合物。表 7 ：預轉染混合物

	9:1 比率	6:1 比率	3:1 比率	陰性	模擬物
核轉染溶液	60 µl	60 µl	60 µl	60 µl	60 µl
gRNA	20 µl (90 pmol)	20 µl (60 pmol)	20 µl (30 pmol)	-	-
Cas09 (3.22 mg/ml)	3.33 µl	3.33 µl	3.33 µl	3.33 µl	-

根據製造商之說明，將16.67 µl細胞(3×10 ⁴個細胞/µl)添加至複合物中，隨後進行核轉染(核轉染儀4D，Lonza)。藉由添加900 µl預溫熱的CD CHO培養基來回收細胞，將其放入豎直放置的小T25燒瓶中。在37℃、5% CO ₂靜置24小時，將培養基更換為預溫熱的新製CD CHO (添加抗生素青黴素、鏈黴素及兩性黴素B以降低污染風險)，一旦回收且分離細胞，便將細胞移動至125 ml振盪燒瓶中(96至120小時後)。

核轉染後10天，細胞準備藉由FACS進行分選。細胞經LCA染色劑(與螢光素結合之小扁豆凝集素(Lens Culinaris Agglutinin))染色。細胞藉由以下準備用於FACS：以x100g離心8分鐘，用PBS洗滌細胞，以x100g再次離心8分鐘且在預溫熱的CD CHO培養基中再懸浮，添加20 µg/ml LCA染色劑，靜置45分鐘，用×2 PBS洗滌細胞(以x100g離心8分鐘，在PBS中再懸浮)以移除任何未結合的染色劑。LCA結合FUT8陽性細胞之細胞表面上的岩藻糖，FUT8陰性(基因剔除細胞)未被染色且將其收集至預溫熱的CD CHO培養基中。將細胞置於37℃、5% CO ₂下以恢復及傳代，直至細胞達到所需細胞密度。

去岩藻糖基化 HLA-G 抗體之產生在經工程改造之CHO-SXE細胞株(Cain等人2012)中表現HLA-G02抗體構築體，該細胞株如上文所描述已進一步經修飾以基因剔除α-1,6-岩藻糖基轉移酶(FUT8)。使用ExpiCHO轉染系統(Thermo Fisher Scientific)自此等細胞短暫產生去岩藻糖基化抗體。遵循高產率方案，將細胞以6×10^6個細胞/毫升之細胞密度接種於ExpiCHO表現培養基中。對於200 ml培養物，將200 μg DNA稀釋至8 ml Opti-PRO無血清培養基(SFM)中，且在添加至細胞中之前與7.4 ml含有640 μl ExpiFectamine轉染試劑之Opti-PRO SFM混合。將細胞轉移至設定為8% CO ₂及37℃之培育箱中，放在設定為190 RPM之振盪平台上。轉染後第1天，將48 ml進料及1200 μl增強劑添加至細胞中，且放回培育箱，將溫度降低至32℃。在第10天藉由以4 000 RPM離心1小時來收穫培養物。藉由施加至0.22 µM Stericup過濾器使細胞培養物上清液澄清。

藉由將100 µl上清液負載至與Infinity高效液相層析(HPLC)系統連接之蛋白質G管柱上來測定產物力價。用150 mM氯化鈉(pH 2.1)自管柱溶離產物，且將A ₂₈₀信號與經純化之Fab標準物進行比較。將澄清之上清液以5 ml/min負載至MabSelect Sure管柱(GE Healthcare)上，且用3個管柱體積(CV)之PBS pH 7.4洗滌。用低pH緩衝液，亦即0.1 M檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.6)自管柱溶離所捕捉之蛋白質。用2 M Tris-HCl (pH 8.5)中和溶離液。為了移除高分子量物種，將親和純化之蛋白質以1 ml/min負載至於10 mM磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)中平衡之Superdex 16/60凝膠過濾層析管柱上，且藉由分析型SE-UPLC分析所溶離之溶離份，隨後彙集適當的溶離份。所彙集之溶離份經受SDS-PAGE及SE-UPLC以測定蛋白質品質及純度。

在本發明中，除非另外規定，否則「HLA-G02」係指未經修飾的習知(亦即岩藻糖基化) VR12389gL2gH16 IgG1。「去岩藻糖基化HLA-02」係指如根據本文中所描述之方法產生的對應去岩藻糖基化IgG1抗體。

實例 7 ： HLA-G 抗體之結合、親和力及特異性 7.1. 藉由 SPR 量測的對 HLA-G WT 之 親和力使用Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences AB)藉由表面電漿子共振來測定抗HLA-G抗體(hIgG1型式)對HLA-G之結合親和力。分析在25℃下進行。經由胺偶合化學方法將Fc特異性親和純化F(ab') ₂片段山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch)固定在S系列CM5感測器晶片(GE Healthcare Bio-Sciences AB)上直至大約6000個反應單位(RU)之水準。使用HBS-EP ⁺緩衝液(10 mM HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，GE Healthcare Bio-Sciences AB)作為運行緩衝液，流動速率為10 µL/min。藉由活化及去活化適當流槽來準備參考表面。

注射10 µL濃度為0.6-0.9 µg/mL之抗HLA-G抗體，以用於藉由固定之抗人類IgG Fc進行之捕捉。以30 µL/min之流動速率，自各種最高濃度4000 nM、400 nM、100 nM及50 nM相對於所捕捉之抗HLA-G hIgG1滴定人類HLA-G ECD + B2m持續60秒、90秒或120秒，隨後解離120秒、180秒或240秒(表8)。表 8 ：

捕捉物	樣品	濃度(nM)	接觸(s)	解離(s)
習知HLA-G02及去岩藻糖基化HLA-G02	HLA-G	50	90	180
HLA-G01、HLA-G03、HLA-G05	HLA-G	100	90	180
HLA-G04	HLA-G	400	120	240
HLA-G06、HLA-G07、HLA-G08	HLA-G	4000	60	120

結果呈現於表9中。表 9 ：藉由 SPR 測定的 HLA-G 抗體之親和力

抗體ID	k _a(M ^-1s ^-1)	k _d(s ^-1)	KD (nM)
HLA-G01	5.85E+05	3.35E-03	5.72
HLA-G02 (VR12389gL2gH16)	6.18E+05	3.15E-03	5.09
HLA-G06	3.09E+05	7.91E-02	256
HLA-G03	4.04E+05	2.34E-04	0.58
HLA-G07	4.39E+05	2.00E-01	456
HLA-G04	5.61E+04	4.33E-04	7.72
HLA-G05	2.00E+05	1.40E-03	6.98
HLA-G08	2.19E+05	7.66E-02	349

藉由 SPR 所測定， HLA-G06 、 HLA-G07 及 HLA-G08 對 HLA-G 之 親和力最低 (KD 值最高 ) 。 HLA-G01 、 HLA-G02 、 HLA-G03 對 HLA-G 之 親和力最高。

在另一分析中，亦評定去岩藻糖基化HLA-G02之親和力且發現類似於習知(岩藻糖基化) HLA-G02對應物。結果呈現於下表10中。表 10 ：藉由 SPR 測定的 習知及去岩藻糖基化 HLA-G02 抗體之親和力

抗體ID	k _a(M ^-1s ^-1)	k _d(s ^-1)	KD (nM)
HLA-G02 (習知，亦即岩藻糖基化)	8.24E+05	3.54E-03	4.30
去岩藻糖基化HLA-G02	8.07E+05	3.55E-03	4.40

7.2. 藉由 SPR 量測對 HLA-G Null 1,2,3 之 親和力以評定特異性使用Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences AB)藉由表面電漿子共振來測定抗HLA-G IgG1抗體對HLA-G Null 1,2,3之結合親和力。分析在25℃下進行。經由胺偶合化學方法將Fc特異性親和純化F(ab') ₂片段山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch)固定在S系列CM5感測器晶片(GE Healthcare Bio-Sciences AB)上直至大約6000個反應單位(RU)之水準。使用HBS-EP ⁺緩衝液(10 mM HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，GE Healthcare Bio-Sciences AB)作為運行緩衝液，流動速率為10 µL/min。藉由活化及去活化適當流槽來準備參考表面。

注射10 µL濃度為0.6-0.9 µg/mL之抗HLA-G抗體，以用於藉由固定之抗人類IgG Fc進行之捕捉。以30 µL/min之流動速率，自20 µM相對於所捕捉之抗HLA-G IgG滴定人類「HLA-G Null 1,2,3」突變體AVI tev 10HisTag + B2m持續60秒，隨後解離150秒。藉由注射10 µL之40 mM HCl接著注射5 µL之5 mM NaOH，表面以10 µL/min之流動速率再生。

使用Biacore T200評估軟體(3.0版)，使用穩態分析來分析減去背景之結合曲線。結果呈現於表11中。表 11 ：藉由 SPR 測定的對 HLA-G Null 1,2,3 之 親和力

抗體ID	KD (µM)
HLA-G01	無結合
HLA-G02 (習知，亦即岩藻糖基化)	無結合
去岩藻糖基化HLA-G02	無結合
HLA-G06	無結合
HLA-G03	無結合
HLA-G07	無結合
HLA-G04	無結合
HLA-G05	無結合
HLA-G08	7.8

HLA-G01 至 HLA-G07 未 偵測到結合。 HLA-G08 顯示與 HLA-G Null 1,2,3 具有一定結合， 且因此對 HLA-G 之特異性較低。

7.3. 與 HEK 表現之野生型 HLA-G 之結合相較於與 HLA-G Null 1,2,3 之結合以 評定抗體之特異性量測與人類胚胎腎(HEK293)細胞上表現之野生型HLA-G之結合，且與「HLA-G Null 1,2,3」相比較以確定結合特異性。有利地，可使用基於細胞之分析來評定與二聚HLA-G之結合，而上文所描述之SPR分析僅量測與單體HLA-G之結合。

經HLA-G/β2m或HLA-G Null 1,2,3/β2m轉染之HEK293細胞與抗HLA-G IgG1一起在384孔V底盤(Greiner)中在4度下培育兩小時。IgG濃度在100 nM至0.05 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。在培育期之後，將細胞在分析緩衝液中洗滌三次，隨後與20 µl染色溶液一起在4度下培育20分鐘(R-藻紅蛋白親和純化F(ab') ₂片段山羊抗人類IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) (3.75 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在40 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定PE陽性細胞之百分比。使用FlowJo分析軟體根據中值螢光強度計算EC50及Emax。結果呈現於表12中。表 12 ：藉由 FACS 測定的對 HEK 表現之 HLA-G 及 HLA-G Null 1,2,3 之 親和力

抗體ID	HEK 細胞上之結合
	HLA-G WT EC50 (nM)	HLA-G WT Emax (MFI)	HLA-G null 1,2,3 EC50 (nM)	HLA-G null 1,2,3 Emax (MFI)
HLA-G01	1.54	129298	ND	61
HLA-G02 (VR12389 gL2gH16)	1.65	141300	ND	67
去岩藻糖基化HLA-02	0.92	89198	ND	63
HLA-G06	1.26	115689	ND	53
HLA-G03	2.02	189443	ND	101
HLA-G07	1.03	104296	ND	37
HLA-G04	2.73	178887	ND	30
HLA-G05	2.96	165437	ND	143
HLA-G08	1.57	137718	35.90	2858

與 HLA-G01 及 HLA-G02 相比， HLA-G03 對 HEK293 上表現之 HLA-G 之 親和力最低。因此 ， HLA-G01 及 HLA-G02 優於 HLA-G03 。

去岩藻糖基化HLA-G02對HEK表現之HLA-G之親和力與其習知(岩藻糖基化)對應物類似。偵測到HLA-G08與HLA-G Null 1,2,3之結合，其證實此抗體具有較低特異性。

7.4. 藉由 FACS 分析測定的對 JEG3 細胞之結合親和力在基於細胞之分析流式細胞測量術中，使用天然表現HLA-G之人類絨毛膜癌滋養細胞(JEG3)來量測抗HLA-G IgG之結合親和力。有利地，可使用此分析來量測與天然表現HLA-G之細胞之結合，包括與細胞上之二聚HLA-G之結合，而上文所描述之SPR分析僅量測與單體HLA-G之結合。

JEG3細胞與1.5 ml抗HLA-G IgG1溶液一起在微量離心管(Eppendorf)中在4度下培育兩小時。IgG濃度在10 nM至0.0005 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。將細胞轉移至384孔V底盤(Greiner)中且在分析緩衝液中洗滌三次，與20 µl染色溶液一起在4度下培育20分鐘(R-藻紅蛋白親和純化F(ab') ₂片段山羊抗人類IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) (7.5 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在20 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定PE陽性細胞之百分比。使用FlowJo分析軟體根據中值螢光強度計算KD。結果呈現於表13中。表 13 ：藉由 FACS 測定的對 JEG3 細胞之親和力

抗體ID	FACS 親和力
	KD (nM)
HLA-G01	0.045
HLA-G02 (VR12389 gL2gH16)	0.020
HLA-G06	-
HLA-G03	0.068
HLA-G07	-
HLA-G04	-
HLA-G05	0.174
HLA-G08	-

HLA-G01 及 HLA-G02 在 FACS 分析中顯示更高親和力。結果證實與 HLA-G01 及 HLA-G02 相比， HLA-G03 對於在 天然表現 HLA-G 之 細胞表面上表現 ， 尤其以二聚體形式表現的 HLA-G 具有較低 親和力。

7.5. 與 HLA-I 及 JEG3 野生型 (WT)/HLA-G 基因剔除型 之結合量測與HEK293細胞上表現之HLA-A/B/C/E/F共通分子之結合以進一步探究抗HLA-G IgG之結合特異性。在相同分析中，亦量測與JEG3細胞上表現之HLA-G之結合且與JEG3 HLA-G基因剔除型(KD)相比較。

經HLA-A、B、C、E或F共通序列/β2m及JEG3 WT及JEG3 KD轉染之HEK293細胞與抗HLA-G IgG1一起在384孔V底盤(Greiner)中在4度下培育兩小時。IgG濃度在100 nM至0.05 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。在培育期之後，將細胞在分析緩衝液中洗滌三次，隨後與20 µl染色溶液一起在4度下培育20分鐘(R-藻紅蛋白親和純化F(ab') ₂片段山羊抗人類IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) (3.75 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在40 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定PE陽性細胞之百分比。使用FlowJo分析軟體根據中值螢光強度計算EC50及Emax。結果呈現於表14及15中。表 14 ：與 HLA-A/B/C/E/F 之結合

抗體 ID	HLA-A 結合 EC50 (nM)	HLA-A 結合 Emax (MFI)	HLA-B 結合 EC50 (nM)	HLA-B 結合 Emax (MFI)	HLA-C 結合 EC50 (nM)	HLA-C 結合 Emax (MFI)
HLA-G01	ND	373.3	ND	221.6	ND	119
HLA-G02	ND	57.3	ND	142.6	ND	65
去岩藻糖基化 HLA-G02	ND	191	ND	91	ND	117
抗體 ID	HLA-E 結合 EC50 (nM)	HLA-E 結合 Emax (MFI)	HLA-F 結合 EC50 (nM)	HLA-F Emax (MFI)
HLA-G01	ND	120.5	ND	54
HLA-G02	ND	45	ND	67.6
去岩藻糖基化 HLA-G02	ND	54	ND	73

未偵測到與 HLA-I 共通序列之結合 ( 「 ND 」 ) 。 結果證實抗體 HLA-G01 及 HLA-G02 對 HLA-G 具有高特異性。 表 15 ：與 JEG3 WT 之結合

抗體ID	JEG3 WT 結合EC50 (nM)	JEG3 WT 結合Emax (MFI)
HLA-G01	0.38	58094
HLA-G02	0.43	63979
去岩藻糖基化HLA-G02	0.2	44416
HLA-G06	4.10	6966
HLA-G03	0.41	38189
HLA-G07	3.42	4900
HLA-G04	3.65	31373
HLA-G05	1.26	44413

另外，未偵測到與JEG3 KD之結合。與HLA-G01及HLA-G02 (或去岩藻糖基化HLA-G02)相比，HLA-G03具有類似EC50但Emax低得多，且因此不如HLA-G01或HLA-G02好。

7.6. 確定抗 HLA G 抗體之 HLA-G 上的 結合域量測與人類胚胎腎(HEK293)細胞上表現之HLA-G Null3、HLA-G Null1,3及HLA-G Null3 2AA之結合以表徵抗HLA-G IgG之結合域。

經HLA-G Null3/β2m、HLA-G Null1,3/β2M及HLA-G Null3 2AA/β2M轉染之HEK293細胞與抗HLA-G IgG1一起在384孔V底盤(Greiner)中在4度下培育兩小時。IgG濃度在100 nM至0.05 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。在培育期之後，將細胞在分析緩衝液中洗滌三次，隨後與20 µl染色溶液一起在4度下培育20分鐘(R-藻紅蛋白親和純化F(ab') ₂片段山羊抗人類IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) (3.75 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在40 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定PE陽性細胞之百分比。使用FlowJo分析軟體根據中值螢光強度計算EC50及Emax。結果呈現於表16中。表 16 ：與 HEK293 上表現之 HLA-G Null3 、 HLA-G Null 1,3 及 HLA-G Null3 2AA 之結合

抗體 ID	HLA-G Null3 EC50 (nM)	HLA-G Null3 Emax (MFI)	HLA-G Null 1,3 EC50 (nM)	HLA-G Null 1,3 Emax (MFI)	HLA-G Null3 2AA EC50 (nM)	HLA-G Null3 2AA Emax (MFI)
HLA-G01	ND	214	ND	182	ND	281
HLA-G02	ND	97	ND	87	ND	44
HLA-G06	ND	348	ND	318	ND	281
HLA-G03	ND	166	ND	247	ND	186
HLA-G07	0.09	124	ND	206	ND	97
HLA-G04	ND	204	ND	278	ND	317
HLA-G05	ND	17	ND	111	ND	178
HLA-G08	13.38	4893	17.02	11716	15.50	2318

資料顯示包括 HLA-G02 在內的該等 抗體對 HLA-G α 3 域具有特異性。資料證實HLA-G08之特異性最低。

7.7. 在 PBMC 實驗中評定的 HLA-G02 之特異性使用來自50個不同供體之PBMC進一步證實HLA-G02之特異性，該等供體呈現各種HLA-I對偶基因。目標為證實抗HLA-G抗體具有特異性，且尤其不與PBMC及CD4+ T淋巴細胞上表現之其他HLA-I分子交叉反應。

PBMC自周邊靜脈血液純化得到，且在冷凍培養基(90% FBS + 10% DMSO)中在液氮中進行儲存。將來自50個不同供體之PBMC解凍且再懸浮於1 ml完全RPMI培養基(RPMI 1640培養基加10%胎牛血清、2 mM Glutamax及1%青黴素/鏈黴素)中。將細胞以300 rpm離心10分鐘且用PBS洗滌兩次。將細胞沈澱物再懸浮於1 ml Facs緩衝液(PBS、0.5% BSA及2 mM EDTA)中，且將細胞接種於96孔盤中，每孔50 µl細胞懸浮液。

細胞經抗人類CD4-APC (Biolegend，2.5 µl/孔)且經抗HLA-G抗體(HLA-G02或對照「泛HLA」(結合於HLA-I且對HLA-G不具有特異性之IgG1))或同型對照(50 µl溶液，20 µg/ml/孔)染色。細胞在室溫下在暗處培育20分鐘，且隨後用Facs緩衝液洗滌兩次，且再懸浮於50 µl含有二級抗體山羊抗人類IgG-FITC (Jackson ImmunoResearch，1/100稀釋)之Facs緩衝液中。細胞在室溫下在暗處再培育20分鐘，隨後用Facs緩衝液洗滌兩次。將細胞再懸浮於100 µl/孔之Facs緩衝液中，且在Canto II (HTS 1)上獲取樣品，每樣品收集到10,000個事件。使用FlowJo軟體v10.6.0，藉由量測各供體之各CD4+細胞群體之平均螢光強度(MFI)來進行分析。使用Graphpad Prism軟體繪製曲線圖。

結果呈現於圖 4中。圖4顯示與泛HLA抗體相比，特異性抗HLA-G抗體HLA-G02與50個不同供體之CD4 T細胞缺乏結合。資料以各供體之平均螢光強度(MFI)表示。

7.8. HLA-G02 與 細胞膜結合性 HLA-G 同功異型物 HLA-G1 、 HLA-G2 、 HLA-G3 或 HLA-G4 之結合使用ExpiFectamine™ 293轉染套組且遵循製造商之方案(ThermoFisher Scientific，參考編號A14524)，用編碼HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3或HLA-G4之質體對Expi293F人類細胞進行轉染。轉染後24小時，收穫細胞，在PBS中洗滌(300 rpm，10分鐘)，且再懸浮於PBS中。將細胞接種於96孔/盤中且用抗HLA-G抗體HLA-G02 (人類IgG1)或市售抗體4H84 (Abcam，小鼠IgG1)以10 µg/ml最終濃度染色，且在暗處培育20分鐘。細胞隨後用Facs緩衝液(PBS、0.5% BSA及2 mM EDTA)洗滌兩次，且再懸浮於50 µl含有二級抗體山羊抗人類IgG-PE (Jackson ImmunoResearch，1/100稀釋)或山羊抗小鼠IgG-PE (Jackson ImmunoResearch，1/100稀釋)之Facs緩衝液中。細胞在室溫下在暗處再培育20分鐘，隨後用Facs緩衝液洗滌兩次。將細胞再懸浮於100 µl Facs緩衝液中，且在Canto II (HTS 1)上獲取樣品。

結果呈現於圖 5中。圖5A顯示，與陰性對照(neg CTRL，不相關Ab)相比，對HLA-G α3域具有特異性之HLA-G02抗體識別HLA-G1及HLA-G2 (分別具有68%及17%陽性細胞)，但不識別HLA-G3及HLA-G4。對α1域具有特異性之市售小鼠抗HLA-G抗體4H84用作陽性對照，且識別所有同功異型物HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3或HLA-G4 (分別染色81%、34%、67%及16%之細胞)。

圖5B更尤其顯示與陰性對照(不相關Ab)相比，對HLA-G α3域具有特異性之HLA-G02抗體識別HLA-G2 (17%陽性細胞)。對α1域具有特異性之市售小鼠抗HLA-G抗體4H84用作HLA-G2之陽性對照(34%陽性細胞)。

實例 8 ：評定 HLA-G 抗體阻斷 HLA-G 與 ILT2 或 ILT4 之間的相互作用的能力 8.1. JEG3 與 ILT2 之間的相互作用之阻斷抗HLA-G IgG與表現HLA-G之人類絨毛膜癌滋養細胞(JEG3)及ILT2兔Fc一起培育，以量測其阻斷ILT2與HLA-G之結合的效力。

JEG3細胞與抗HLA-G IgG1一起在384孔V底盤(Greiner)中在4度下培育一小時。IgG濃度在100 nM至0.05 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。在培育期之後，將細胞在分析緩衝液中洗滌，隨後與3 µg/ml之20 µl ILT2rbFc溶液一起在4度下培育一小時。在培育之後，在4度下將5 µl染色溶液(Fc片段特異性螢光素(FITC)親和純化F(ab') ₂片段山羊抗兔IgG (Jackson ImmunoResearch) (7.5 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))添加至各孔中後保持20分鐘。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在40 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定FITC陽性細胞之百分比。使用FACSDiva分析軟體根據中值螢光強度計算IC50及抑制百分比。結果呈現於表17中。

JEG3 與 ILT2 之間的相互作用之阻斷 ： 大體積反應一些抗體在先前ILT2阻斷分析中展現極低的IC50。在此等低濃度下，很可能因小體積反應而出現配體耗竭，其可能導致IC50值之過度估算。為了解決配體耗竭的問題，將大體積之抗HLA-G IgG溶液(先前分析中鑑定出的最佳阻斷抗體)與表現HLA-G之JEG3及ILT2兔Fc一起培育，以改良其阻斷ILT2與HLA-G之結合之效力的量測。

JEG3細胞與1.5 ml抗HLA-G IgG1溶液一起在微量離心管(Eppendorf)中在4度下培育兩小時。IgG濃度在10 nM至0.005 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。將細胞轉移至384孔V底盤(Greiner)中且在分析緩衝液中洗滌三次，隨後與3 µg/ml之20 µl ILT2rbFc溶液一起在4度下培育一小時。在培育期之後，洗滌細胞，且與20 µl染色溶液(Fc片段特異性螢光素(FITC)親和純化F(ab') ₂片段山羊抗兔IgG (Jackson ImmunoResearch) (7.5 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))一起在4度下培育20分鐘。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在20 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定FITC陽性細胞之百分比。使用FlowJo分析軟體根據中值螢光強度計算IC50及抑制百分比。結果呈現於表17中。

8.2. HEK 上表現之 HLA-G 與 ILT2 之間的相互作用之阻斷抗HLA-G IgG與經HLA-G轉染之HEK293細胞及ILT2兔Fc一起培育，以量測其阻斷ILT2與HLA-G之結合的效力。

經HLA-G/β2M轉染之HEK293細胞與抗HLA-G IgG1一起在384孔V底盤(Greiner)中在4度下培育一小時。IgG濃度在100 nM至0.05 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。在培育期之後，將細胞在分析緩衝液中洗滌，隨後與1 µg/ml之20 µl ILT2rbFc溶液一起在4度下培育一小時。在培育之後，在4度下將5 µl染色溶液(Fc片段特異性螢光素(FITC)親和純化F(ab') ₂片段山羊抗兔IgG (Jackson ImmunoResearch) (3 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))添加至各孔中後保持20分鐘。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在40 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定FITC陽性細胞之百分比。使用FACSDiva分析軟體根據中值螢光強度計算IC50及抑制百分比。結果呈現於表17中。

8.3. HCT116 上表現之 HLA-G 與 ILT4 之間的相互作用之阻斷抗HLA-G IgG與經HLA-G轉染之人類結腸癌(HCT116)細胞及ILT4兔Fc一起培育，以量測其阻斷ILT4與HLA-G之結合的效力。

經HLA-G/β2M轉染之HCT116細胞與抗HLA-G IgG一起在384孔V底盤(Greiner)中在4度下培育一小時。IgG1濃度在100 nM至0.05 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。在培育期之後，將細胞在分析緩衝液中洗滌，隨後與0.4 µg/ml之20 µl ILT4rbFc溶液一起在4度下培育一小時。在培育之後，在4度下將5 µl染色溶液(Fc片段特異性螢光素(FITC)親和純化F(ab') ₂片段山羊抗兔IgG (Jackson ImmunoResearch) (1.5 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))添加至各孔中後保持20分鐘。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在40 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定FITC陽性細胞之百分比。使用FACSDiva分析軟體根據中值螢光強度計算IC50及抑制百分比。結果呈現於表17中。表 17 ： HLA-G 抗體之阻斷活性 (IC50 值 )

抗體ID	ILT2rbFc	ILT2rbFc	ILT2rbFc	ILT4rbFc
	JEG3 流動平均IC50 (nM)	大體積JEG3 平均IC50 (nM)	HEK-HLAG 平均IC50 (nM)	HCT116-HLAG 平均IC50 (nM)
HLA-G01	0.59	0.039	1.58	1.78
HLA-G02 (VR12389 gL2gH16)	0.53	0.017	1.37	1.31
去岩藻糖基化HLA-G02	0.51	0.021	0.83	1.38
HLA-G06	7.40	-	10.54	4.58
HLA-G03	0.47	0.038	1.59	1.86
HLA-G07	1.82	-	2.33	2.82
HLA-G04	1.10	-	2.05	3.32
HLA-G05	0.74	-	1.51	2.59
HLA-G08	1.58	-	9.84	2.75

HLA-G01 及 HLA-G02 經鑑定為 HLA-G 與 ILT2 之締合及 HLA-G 與 ILT4 之締合的最佳阻斷劑。去岩藻糖基化 HLA-G02 之阻斷特性與其習知 ( 亦即 岩藻糖基化 ) 對應物之特性類似。

實例 9 ： HLA-G01 至 HLA-G08 抗體在表現 HLA-G 之 細胞之 ADCC 中的 功效及效力抗體依賴性細胞毒性(ADCC)為表現Fc受體之細胞(諸如NK細胞)可藉以識別及殺死抗體包覆之細胞的一種免疫機制。其為抗癌反應之關鍵過程且為許多抗癌療法功效之潛在關鍵機制。使用兩種不同類型的表現HLA-G之標靶細胞來測定一組抗HLA-G IgG1抗體活體外誘發ADCC之能力。此等細胞已經HLA-G及人類β-2-微球蛋白轉染(HCT116結腸直腸癌細胞)或在其細胞表面上內源性表現標靶(JEG3細胞)。

方法： HCT116 結腸直腸癌細胞株之轉染 HCT116細胞經亦編碼綠色螢光蛋白(GFP)標籤之HLA-G構築體轉染。因此，成功地經HLA-G轉染之細胞亦表現GFP，且可容易地藉由流式細胞測量術鑑定及精確監測。使用共計40 µg DNA (HLA-G ECD GFP及人類β2M質體各20 µg)及80 µL脂染胺LTX來轉染T75組織培養燒瓶中之4 × 10 ⁶個HCT116細胞。24小時後，自燒瓶分離細胞且用作如下文所描述之標靶細胞。

活體外 ADCC 分析將經HLA-G轉染之HCT116或JEG3標靶細胞塗鋪(2 × 10 ⁴個細胞/孔，50 µL體積)於聚丙烯圓底盤中之適當培養基中。將抗HLA-G或對照抗體在相同培養基中製備為4×濃縮儲備液，且以每孔50 µl添加至適當孔中。視可用供體NK細胞之數目而定，一式兩份或一式三份地測試所有抗體。一些標靶細胞中不添加任何抗體且用作未處理對照。

使用磁性珠粒套組(Miltenyi Biotech)藉由陰性選擇自全血分離原代人類NK細胞。將純化之NK細胞再懸浮於分析所需之最小體積的RPMI +10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸中。向分析盤之適當孔中在標靶細胞及抗體上方添加每孔100 µl NK細胞。視供體NK細胞數目而定，效應子:標靶比率在10:1與3:1之間。

將分析盤在37℃、5% CO ₂下培育約3小時。3小時後，藉由流式細胞測量術來量測活標靶細胞之數目。將分析盤以300g離心3分鐘以使細胞沈澱，且針對上皮細胞標誌物Epcam及NK細胞標誌物CD56對各孔進行染色。在細胞染色緩衝液中將染色抗體(抗Epcam PE及抗CD56 BV421)稀釋至1/100，且將每孔100 µL添加至各孔中。將盤在室溫下培育15分鐘。在染色之後，細胞用每孔150 µl PBS洗滌兩次，且在各洗滌之間將盤以300g離心3分鐘。在染色結束時，將各孔中之細胞再懸浮於含有50 nM TO-PRO™-3細胞死活染料的每孔最終體積100 µL之PBS中。

10分鐘後，在BD FACS Canto II儀器上獲取來自各孔之恰好70 µL樣品，且使用FlowJoV10.60軟體分析資料。測定各孔之活標靶細胞總數目。首先鑑定活標靶細胞為TO-PRO-™3陰性，其次鑑定其為CD56陰性及SSC高的。隨後基於Epcam (JEG3)或Epcam及GFP表現(HCT116)來圈選細胞。計算各測試樣品之相比於未處理細胞或同型對照之耗竭百分比，且將資料傳送至GraphPad Prism 8.1.1軟體以進行分析。

結果： 圖 6展示用不同抗HLA-G抗體或IgG1同型對照抗體處理後Epcam+ GFP+ HCT116標靶細胞之耗竭百分比。在1 µg (白色條柱)或0.01 µg/ml (條紋條柱)兩種不同濃度下測試各抗體。E:T比率為3.5:1。各條柱表示三個資料點之平均值(及範圍)，且各圓點/正方形為個別重複實驗。資料來自一個代表性供體。

表 18列出圖6中所展示的各抗體之平均Epcam+ GFP+ HCT116細胞耗竭百分比(N.D.：未偵測到) 表 18 ：平均 Epcam+ GFP+ HCT116 細胞耗竭百分比

抗體ID	平均GFP+ 細胞耗竭% (1 µg/mL)	平均GFP+ 細胞耗竭% (0.01 µg/mL)
HLA-G01	67.15	69.41
HLA-G02	73.11	70.51
HLA-G06	75.79	55.90
HLA-G03	75.01	61.45
HLA-G07	57.20	2.46
HLA-G04	66.48	43.83
HLA-G05	73.68	51.78
HLA-G08	71.20	39.00
IgG1同型	0.93	N.D

若干抗體在最高抗體濃度(1 µg/mL)下展現類似的平均GFP+細胞耗竭%。抗體HLA-G01及HLA-G02觀測到在最低濃度(0.01 µg/mL)下所觀測到的最高平均GFP+細胞耗竭%。將彼等抗體用於在ADCC分析中進一步表徵。

圖 7展示來自三個獨立實驗(3個不同供體)的用抗HLA-G抗體HLA-G01及HLA-G02或IgG1同型對照抗體處理後Epcam+ GFP+ HCT116標靶細胞之耗竭百分比。在1 µg/ml (圖7A)或0.01 µg/ml (圖7B)下測試抗體。E:T比率在2.5:1與3:1之間。各條柱表示來自個別實驗之資料的平均值(及範圍)，且各圓點、正方形或三角形為個別重複實驗。

表19列出圖7A中所展示的1 µg/mL之各抗體之平均Epcam+ GFP+ HCT116細胞耗竭百分比。表 19 ：平均 Epcam+ GFP+ HCT116 耗竭百分比 (1 µg/mL 抗體 )

人類IgG1抗體	平均耗竭% 實驗1	平均耗竭% 實驗2	平均耗竭% 實驗3
HLA-G01	81.61	70.21	67.15
HLA-G02	87.71	79.25	73.11
同型	-34.56	-44.76	0.93

表20列出圖7B中所展示的0.01 µg/mL之各抗體之平均Epcam+ GFP+ HCT116細胞耗竭百分比。表 20 ：平均 Epcam+ GFP+ HCT116 耗竭百分比 (0.01 µg/mL 抗體 )

人類IgG1抗體	平均耗竭% 實驗1	平均耗竭% 實驗2	平均耗竭% 實驗3
HLA-G01	83.83	70.79	69.41
HLA-G02	85.09	75.92	69.42
同型	N.D	N.D	N.D

如在 ADCC 分析中所測定 ， 在兩種抗體濃度下 ，抗體 HLA-G02 與 HLA-G01 相比具有更佳 細胞耗竭活性 。

圖 8展示與同型對照相比，用抗HLA-G抗體HLA-G01及HLA-G02滴定處理後Epcam+ GFP+ HCT116細胞之耗竭百分比。E:T比率為4:1。各點表示3個重複實驗之平均值(及範圍)。所示資料來自單一代表性供體。

基於彼等結果，選擇抗體HLA-G02用於進一步表徵及開發，尤其如上文所描述製備HLA-G02之去岩藻糖基化型式以與習知IgG1進行比較。

抗體之去岩藻糖基化已顯示增加FcγRIII:Fc結合親和力，且據報導增加IgG1分子之ADCC潛力。因此，測試HLA-G02之去岩藻糖基化型式誘發經轉染HCT116或JEG3細胞之ADCC的能力。將去岩藻糖基化抗體與以習知IgG1型式製備之相同抗體V區進行比較。

圖 9A展示用習知HLA-G02 IgG1 (實踐)或去岩藻糖基化HLA-G02 IgG1 (「aF HLA-G02」，虛線)處理後JEG3細胞之耗竭百分比。E:T比率為10:1。各點表示2個重複實驗之平均值(及範圍)。所示資料來自單一代表性供體。

圖 9B展示用習知HLA-G02 IgG1 (實踐)或去岩藻糖基化HLA-G02 IgG1 (「aF HLA-G02」，虛線)處理後Epcam+ GFP+ HCT116細胞之耗竭百分比。E:T比率為5:1。各點表示3個重複實驗之平均值(及範圍)。所示資料來自單一代表性供體。

抗體 HLA-G02 在 細胞殺死分析中展現更佳效力及功效，且因此選擇其作為用於療法之候選者以用於進一步開發。 HLA-G02 之去岩藻糖基化型式與其習知 ( 亦即 岩藻糖基化 ) 對應物相比具有改良之 ADCC 。

實例 10 ： HLA-G 抗體 HLA-G02 在表現 HLA-G 之 細胞之吞噬作用中的功效及效力HLA陰性K562細胞用作標靶且經轉染以表現HLA-G。預標記之標靶細胞(CTY+)與單核球衍生之巨噬細胞(CD11b+)及hIgG1型式之HLA-G02抗體一起培育。藉由量測CTY+CD11b+細胞之百分比來分析吞噬作用

方法：CD14+單核球係使用泛單核球分離套組(人類) (Miltenyi) (用於分離無接觸單核球的間接磁性標記系統)自周邊靜脈血液純化得到。細胞在37℃、5% CO ₂下在完全RPMI培養基(RPMI 1640培養基加10%胎牛血清、2 mM Glutamax及1%青黴素/鏈黴素)中在50 ng/ml重組MCSF存在下分化成巨噬細胞，持續7天。

HLA陰性紅白血病K562細胞使用4D-核轉染儀系統及SF細胞株4D-核轉染儀TM X套組L (Lonza，參考編號V4XC-2024)經模擬物轉染或經HLA-G及B2m轉染，且在37℃、5% CO ₂下在完全RPMI中培養24小時。第二天，收穫細胞，洗滌且用Cell Trace Yellow (Thermofisher)標記，再次洗滌，且以25.000個細胞/孔塗鋪於96孔圓底超低附著盤(Corning Costar)中之100 µl完全RPMI中。細胞隨後與10 µg/ml之抗CD47抗體或抗HLA-G抗體或同型對照一起在37℃、5% CO ₂下培育1小時。在洗滌之後，將細胞與單核球衍生之巨噬細胞(50.000個巨噬細胞/孔)以巨噬細胞:標靶細胞比率 = 2:1組合。混合之細胞在37℃、5% CO ₂下培育2小時。隨後，洗滌細胞，且在4℃下在PBS加10%經純化人類FcγR結合抑制劑(Thermofisher)中再懸浮20分鐘，隨後在4℃下用抗CD11b-APC (Biolegend)染色20分鐘。洗滌細胞，且在PBS加2 mM EDTA加0.5% BSA中在DAPI (500 ng/ml)存在下再懸浮，除去死細胞。在BD FACSCanto上藉由流式細胞測量術獲取樣品。使用FlowJo軟體v10.6.0，藉由量測CTY+CD11b+雙陽性細胞之百分比來進行分析。

抗CD47用作陽性對照；研究顯示，抑制標靶細胞上之CD47使得CD47與SIRPa (巨噬細胞上表現的一種受體)之相互作用得到抑制，從而提高吞噬作用活性。已顯示CD47之表現在腫瘤細胞上出現上調，且目前正在臨床試驗中測試抗CD47抗體。在吞噬作用分析中，評估單核球衍生之巨噬細胞之吞噬活性係一個良好控制，且其顯示經模擬物及HLA-G轉染之細胞均能夠誘發吞噬作用。

結果：表21展示與表現HLA-G之K562標靶細胞(HLA-G/B2m K562)相比，抗HLA-G抗體對經模擬物轉染之K562之HLA-G特異性吞噬作用活性。資料以CTY+CD11b+雙陽性細胞之百分比形式表示，且表示一式兩份的3個獨立實驗。表 21 ：抗 HLA-G02 之吞噬作用活性

IgG1 抗體	CTY+CD11b+ 細胞% ( 平均值)
模擬物K562	HLA-G/B2m K562
同型對照	26.8	24.6
抗CD47	53.6	49.6
HLA-G02	25.6	39.6

表22展示與IgG1同型對照相比，HLA-G02之統計顯著性HLA-G特異性吞噬作用活性。資料表示來自6個供體(一式兩份)之合併資料。將資料導出至Excel，且相對於經模擬物轉染之細胞之平均吞噬作用百分比正規化。表 22 ：抗 HLA-G02 之吞噬作用活性 (6 個供體 )

IgG1 抗體	相對於平均對照之CTY+CD11b+ 細胞%
模擬物K562	HLA-G/B2m K562
供體A	供體B	供體C	供體D	供體E	供體F	供體A	供體B	供體C	供體D	供體E	供體F
同型對照	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	104.8	92.5	110.5	115.9	92.2	105.4
抗CD47	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	98.6	99.4	109.8	88.6	86.5	71.6
HLA-G02	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	123.6	109.8	215.9	256.1	202.4	184.8

圖 10展示與抗CD47抗體及同型對照相比，人類抗HLA-G IgG1抗體HLA-G02對經模擬物轉染(圖10A)及經HLA-G/B2m轉染(圖10B)之K562標靶細胞之HLA-G特異性吞噬作用活性的滴定。資料以CTY+CD11b+雙陽性細胞之百分比形式表示，且表示2個供體中之1者(表23)。表 23 ： HLA-G02 之 HLA-G 特異性吞噬作用活性之滴定

濃度(µg/ml)	CTY+CD11b+ 細胞% ( 平均值)
模擬物K562	HLA-G/B2m K562
同型IgG1	HLA-G02	陰性對照1	陰性對照2	aCD47	同型IgG1	HLA-G02	陰性對照1	陰性對照2	aCD47
10	17.4	15.5	17.6	17.4	24.9	20.4	44.2	22.1	19.9	27.6
1	17.3	15.8	18.7	17.4	31.2	18.9	46.4	21.1	20.4	29.4
0.1	17.0	17.0	18.8	18.5	22.7	17.3	43.8	19.9	18.1	22.9
0.01	16.2	17.6	19.7	18.2	17.1	17.4	32.4	21.4	18.7	19.3
0.001	15.1	15.1	15.1	15.1	15.1	19.4	19.4	19.4	19.4	19.4

圖 11展示與抗CD47抗體及同型對照相比，習知及去岩藻糖基化(aF)型式之HLA-G02對經模擬物轉染(圖11A)及表現HLA-G (圖11B)之K562標靶細胞之HLA-G特異性吞噬作用活性的滴定。資料以CTY+CD11b+雙陽性細胞之百分比形式表示，且表示2個獨立實驗中3個供體中之1者(表24)。表 24 ： HLA-G02 及去岩藻糖基化 HLA-G02 之 HLA-G 特異性吞噬作用活性之滴定

抗體濃度(µg/ml)	CTY+CD11b+ 細胞% ( 平均值)
模擬物K562	HLA-G/B2m K562
同型HuIgG1	HLA-G02	aF HLA-G02	aCD47	同型HuIgG1	HLA-02	aF HLA-G02	aCD47
10	17.0	24.3	26.6		22.5	43.3	48.0
1	18.6	21.5	24.1	43.1	22.8	43.0	47.8	45.5
0.1	17.6	20.6	21.0	33.0	22.2	43.7	45.3	37.6
0.01	18.3	19.3	18.9	23.8	23.7	36.2	36.0	26.5
0.001	18.5	25.3	25.1	20.6	21.4	28.8	30.9	25.2
0.0001	19.6	21.4	23.3		21.4	28.7	29.2
0.00001	17.8	21.0	24.0		21.5	28.0	28.0
0.000001	18.5	18.6	21.3		23.5	25.3	26.1

去岩藻糖基化 HLA-G02 與 其習知 ( 亦即 岩藻糖基化 ) 對應物 HLA-G02 相比展現改良之 ADCP 。

實例 11 ：藉由 X 射線結晶學對 VR12389 抗體進行抗原決定基定位 HLA-G 融合蛋白之蛋白質產生● PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his( HLA-G( C42S))，其中均二聚所需的半胱胺酸突變為絲胺酸(信號肽(粗體) (在表現後裂解)、肽(加底線)、GS連接子(斜體)、B2m序列、GS連接子(斜體)、具有C42S之HLA-G序列(灰色陰影)、tev裂解位點(粗體及斜體)、GS連接子(斜體)、10 histag)，

遵循製造商方案，使用Expi293™表現系統(Life technologiesTM)藉由短暫轉染來表現蛋白質PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his。在轉染之後5天收穫細胞且上清液立即用於純化。將包含PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his蛋白質之上清液施加至Histrap NiExcel管柱。用PBS、500 mM NaCl、20 mM咪唑(pH 7.4)洗滌未結合蛋白質及雜質，且用PBS、500 mM NaCl、500 mM咪唑(pH 7.4)溶離PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his蛋白質。彙集含有經純化之PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his蛋白質的溶離份，且藉由將蛋白質與tev蛋白酶以1:100之比率在室溫下培育2小時且在4℃下培育2小時來移除his標籤。濃縮蛋白質，且在已用20 mM Tris、50 mM NaCl、pH 7.4緩衝液平衡之S200 26/60上藉由尺寸排阻層析進一步純化。彙集含有經純化之PeptideB2mHLAG C42S mut蛋白質的溶離份，濃縮至2.94 mg/ml，且以1 mg等分試樣儲存在-80℃下。

PeptideB2mHLAG C42S mut蛋白質藉由SDS-PAGE表徵且遷移至凝膠上與糖基化蛋白質之預期分子量(MW)一致之位置。

用於複合及在晶體結構中獲得的蛋白質PeptideB2mHLAG C42S mut之胺基酸序列如下：

● Fab 純化 VR12389兔Fab (VR12389) (由SEQ ID NO: 9表示之輕鏈序列及由SEQ ID NO: 13表示之重鏈序列)在ExpiCHO細胞中以分泌蛋白質形式表現。針對輕鏈及重鏈之表現構築體以1:1莫耳比共轉型。藉由使條件培養基通過蛋白質G珠粒來純化所分泌之蛋白質，且用0.1M甘胺酸(pH 2.7)溶離。藉由添加2M Tris-HCl (pH 8.5)中和溶離份。蛋白質滲析至PBS (pH 7.2)中，接著濃縮至5.62 mg/ml且儲存在4℃下。

● 具有 VR12389 RbFab 之 PeptideB2mHLAG C42S mut 蛋白質融合肽_β2m_HLA-G與VR12389 RbFab以1:1.1莫耳比培育1小時。隨後使用10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl (pH 7.5)作為運行緩衝液，使用Superdex 200 16/600管柱(GE Healthcare)純化複合物。使用NuPAGE 4-20% Tris-甘胺酸(Thermo)藉由SDS-PAGE分析溶離份，且隨後使用Amicon ^®Ultra-15離心過濾器單元(Millipore)將純化之複合物溶離份濃縮至10.4 mg/ml。

具有 VR12389 RbFab 之 PeptideB2mHLAG C42S mut 蛋白質之結晶學使用若干市售結晶篩選試劑來鑑定複合物之結晶條件。此等鑑定係使用Swissci 96孔2滴MRC結晶盤(來源於Molecular Dimensions，目錄號MD11-00-100)以沈滴形式(sitting drop format)進行。首先，使用Microlab STAR液體處理系統(Hamilton)，向儲集器中填充75 µL各結晶條件之篩選試劑。接著，使用Mosquito液體處理器(TTP LabTech)，將300 nL HLA-G/VR12389複合物及300 nL儲集器溶液分配於結晶盤之各孔中。在含有2M硫酸銨及0.1 M Tris (pH 8.0)之ProPlex-HT96篩選試劑(Molecular Dimensions)之條件G4中鑑定晶體。使用含有25%甘油之儲集器溶液作為低溫保護劑來凍結晶體。在Diamond Light Source處收集繞射資料。在Phaser中使用分子置換法來解析結構。在自動及人工優化之交替循環中使用Phenix.refine及Coot。

藉由將HLA-G與VR12389之複合物的晶體結構同HLA-G與ILT2及ILT4之複合物的晶體結構相疊加(如文獻中報導，參見例如Q Wang等人, Cellular & Molecular Immunology, 2019及Shiroishi, PNAS 第103卷, 第44期, 第16412-16417頁, 2006)，可清楚看出VR12389藉由位阻阻止HLA-G與ILT2及ILT4受體相互作用 ( 圖 12)。

在＜ 4 Å接觸距離下，VR12389抗體所識別之HLA-G抗原決定基包含HLA-G殘基V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257。

在＜ 5 Å接觸距離下，VR12389抗體所識別之HLA-G抗原決定基包含HLA-G殘基V194、F195、Y197、E198、R219、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250、E253及Y257。

實例 12 ：藉由 HDX-MS 及 NMR 對 12389 抗體進行抗原決定基定位相比於在靜態條件下進行之結晶學，HDX-MS及NMR係分析溶液中之相互作用且允許展示藉由結晶學未必總是清楚的別構或構形變化的技術。

HDX-MS 材料及方法 樣品製備及資料獲取 對於HDX-MS分析，將12 µM人類HLA-G ECD (SEQ ID NO: 110)與36 µM 12389抗體(以IgG1或Fab形式表現)複合，且在4℃下培育1小時。

在25℃下將4 μl HLA-G或HLA-G複合物稀釋至57 μL含10 mM磷酸鹽之H ₂O (pH 7.0)中，或稀釋至含10 mM磷酸鹽之D ₂O (pD 7.0)中。接著，將經氘化之樣品在25℃下培育0.5、2、15及60分鐘。在反應之後，在1℃下藉由以1:1與淬滅緩衝液(4 M鹽酸胍、250 mM鹽酸參(2-羧乙基)膦(TCEP)、100 mM磷酸鹽)混合來淬滅所有樣品。混合溶液之最終pH為2.5。將混合物立即注射至nanoAcquity HDX模組(Waters Corp.)中以進行胃蛋白酶消化。接著，使用酶線上消化管柱(Waters)，在含0.2%甲酸之水中，在20℃下且在100 μL/min之流動速率下線上進行肽消化。所有氘化時間點及非氘化對照皆一式三份地進行，且在各資料點之間進行空白對照。

接著，使用Acquity BEH C18 1.7 μM VANGUARD冷凍型預管柱歷時3分鐘捕集肽片段。接著，使用以下梯度將肽溶離至經冷凍之Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM 1.0×100中：0分鐘，5% B；6分鐘，35% B；7分鐘，40% B；8分鐘，95% B；11分鐘，5% B；12分鐘，95% B；13分鐘，5% B；14分鐘，95% B；15分鐘，5% B (A：含0.2% HCOOH之H ₂O，B：含0.2% HCOOH之乙腈)。藉由正電噴霧至Synapt G2-Si質譜儀(Waters)中來將肽片段離子化。使用MSe方法，在50至2000 Th之m/z範圍內，在僅ToF模式下進行資料獲取(低碰撞能量，4 V；高碰撞能量：自18 V上升至40 V)。使用Glu-1-纖維蛋白肽B肽進行內部鎖定質量校正。

HDX-MS 資料處理 使用Waters Protein Lynx Global Server 2.5.1 (PLGS)，將來自HLA-G之未氘化對照樣品之MS ^E資料用於序列鑑定。針對僅HLA-G序列之資料庫進行肽搜尋，其中前驅體強度臨限值為500個計數且需要3個匹配之產物離子以進行分配。將3個對照樣品之離子核算檔案合併至輸入Dynamx v3.0軟體之肽清單中。

肽在DynamX中經歷進一步過濾。所使用之過濾參數為：最小及最大肽序列長度分別為4及25，最小強度為1000，最小MS/MS產物為2，以每個胺基酸計之最小產物為0.2，及最大MH+誤差臨限值為10 ppm。使用DynamX v3.0定量在各時間點時，各肽之由氘攝取產生之同位素包膜。此外，檢驗且目視檢查所有譜圖以確保m/z峰之正確分配，且僅使用具有高訊號對雜訊比之肽進行HDX-MS分析。

在Dynamx中進行人工過濾之後，使用Deuteros進行統計分析及過濾，該Deuteros使用Houde等人, 2011所公佈之統計分析。Deuteros產生森林圖(woods plot)，其顯示肽長度、起始及末端殘基、整體覆蓋率及y軸量度(其為絕對攝取) (以道爾頓(Dalton)為單位)。其為存在配體(結合)之情況與無輔基形式的攝取差異。森林圖首先對各時間點時的所有肽進行信賴度過濾。位於所選信賴界限之外的具有不同氘化之肽為非顯著的。

結果在VR12389存在下，針對HLA-G觀測到總共十二種在抗體結合時展現氘併入之統計顯著減少的肽，其中九種展現主要保護。主要保護覆蓋殘基178至196 (MLQRADPPKTHVTHHPVFD)及214至230 (ILTWQRDGEDQTQDVEL)。兩個區均在α3域內(及α2之末端五個殘基)。在抗體結合時展現中等保護之區覆蓋殘基234至249 (RPAGDGTFQKWAAVVV)且可能係歸因於構形變化。在抗體存在及不存在下展示類似交換模式之肽具有非顯著氘併入。表 25 ：藉由 HDX-MS 所 測定在 VR12389 結合於 HLA-G 時展示 氘併入之減少的肽

開始	結束	肽序列	氘攝取
234	249	RPAGDGTFQKWAAVVV	中等保護
184	195	RADPPKTHVTHHPVF	中等保護
180	196	QRADPPKTHVTHHPVFD	中等保護
181	195	RADPPKTHVTHHPVF	主要保護
217	229	WQRDGEDQTQDVE	主要保護
214	230	ILTWQRDGEDQTQDVEL	主要保護
178	196	MLQRADPPKTHVTHHPVFD	主要保護
216	229	TWQRDGEDQTQDVE	主要保護
180	195	QRADPPKTHVTHHPVF	主要保護
178	195	MLQRADPPKTHVTHHPVF	主要保護
181	196	RADPPKTHVTHHPVFD	主要保護
216	227	TWQRDGEDQTQD	主要保護

作為結論，根據30秒氘培育下之HDX-MS，VR12389之潛在結合域為178-MLQRADPPKTHVTHHPVFD-196及214-ILTWQRDGEDQTQDVEL-230。

核磁共振 (NMR) 波譜使用抗體之Fab片段，藉由NMR波譜來測定抗體VR12389之抗原決定基定位。

材料 HLA-G α3 域之經 ² H/ ¹³C/ ¹⁵N 標記表現BL21(DE3)感受態結腸桿菌(New England BioLabs #C2527H)經由標準熱激用1 µg HLA-G α3短N-His ATUM #393044 (HLA-G殘基：207至300)進行轉型。將經轉型細胞塗鋪在含有100 µg/ml卡本西林(carbenicillin)之LB瓊脂盤上且在37℃下培育過夜。第二天，使用單一群落來接種10 ml含有100 µg/ml卡本西林(Merck #C1389)之L-肉湯，且在37℃下在以200 RMP振盪下生長5小時(New Brunswick Excella E25)。隨後使用1 ml起子培養物來接種500 ml經 ²H/ ¹³C/ ¹⁵N標記之基本培養基(描述如下)，且在一次性2 L Erlenmeyer燒瓶(VWR #734-1904)中在37℃下在以200 RPM振盪下生長過夜。第二天，記錄(Amersham Biosciences Ultrospec 3100 pro)過夜培養物之光密度(OD ₆₀₀)。表現培養物隨後用過夜培養物接種至0.1之最終OD ₆₀₀。

經 ²H/ ¹³C/ ¹⁵N標記之基本培養基表現培養物分成500 ml批量在一次性2 L Erlenmeyer燒瓶中在37℃下在以200 RMP振盪下生長，直至達到0.9之OD ₆₀₀。隨後用500 µM IPTG (Sigma # I6758)誘導HLA-G α3表現。經誘導之培養物隨後在37℃下再靜置4小時，接著藉由以7,000g離心30分鐘(Beckman Coulter J6-MI)收穫。隨後在細胞溶解之前將所收穫之沈澱物在-20℃下冷凍。

人類 β2m 之 未經標記表現BL21(DE3)感受態結腸桿菌如上所述經1 µg人類β2m (殘基：21至119) ATUM# 358573轉型及生長。第二天，使用單一群落來接種10 ml含有100 µg/ml卡本西林之L-肉湯(10 g/L胰蛋白腖、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、1 mM NaHO)，且在37℃下在以200 RMP振盪下生長5小時。隨後使用1 ml起子培養物來接種500 ml含有100 µg/ml卡本西林之L-肉湯，且在一次性2 L Erlenmeyer燒瓶中在37℃下在以200 RPM振盪下生長過夜。第二天，記錄過夜培養物之OD ₆₀₀。表現培養物隨後用過夜培養物接種至0.1之最終OD ₆₀₀。

同樣，將2× TY (胰蛋白腖16 g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L)表現培養物分成500 ml批量在一次性2 L Erlenmeyer燒瓶中在37℃下在以200 RMP振盪下生長，直至達到3.0之OD ₆₀₀。隨後將培育箱溫度降低至17℃。30分鐘後，向培養物中饋入20×進料溶液(1 M MOPS pH 7.2、20 mM MgCl ₂、20 mM MgSO ₄、20%甘油)，且用150 µM IPTG誘導表現。經誘導之培養物隨後在17℃下靜置16小時，接著藉由離心(7,000g，30分鐘)收穫。隨後在細胞溶解之前將所收穫之沈澱物在-20℃下冷凍。

細菌細胞溶解用於純化及再摺疊之方案係由以下文獻修改得到：Craig S. Clements等人 The production, purification and crystallization of a soluble heterodimeric form of a highly selected T-cell receptor in its unliganded and liganded state. Biological Crystallography, 2002。

使細胞沈澱物溶解於溶解緩衝液(50 mM Tris pH 8.0、1% (v/v) Triton X-100、1% (w/v)去氧膽酸鈉、100 mM NaCl、10 mM DTT、1 mg DNA酶I (Biomedicals)、5 mM MgCl ₂、cOmplete蛋白酶抑制劑(Roche))中。在室溫下連續攪拌10分鐘之後，添加10 mM EDTA。隨後使再懸浮之細胞沈澱物在4℃在20 psi之壓力下通過CF細胞破碎儀(Constant systems)3×。隨後經由在4℃下以48,000g離心1小時(Beckman Coulter Avanti JXN-26)使溶解物澄清。不溶的沈澱物隨後用洗滌緩衝液1 (50 mM Tris pH 8.0、0.5% (v/v) Triton X-100、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.2 mM cOmplete蛋白酶抑制劑)洗滌2×。在各洗滌之間，再懸浮之包涵體以48,000×g離心30分鐘。在第二次洗滌之後，將包涵體在最終洗滌緩衝液(50 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、1 mM DTT、cOmplete蛋白酶抑制劑)中最後洗滌一次。經純化之包涵體隨後再溶解於20 mM Tris pH 8.0、8 M脲(Sigma #U5378)、0.5 mM EDTA、1 mM DTT中。使用經Quick Coomassie染色劑染色之NuPAGE 4-12%、Bis-Tris (Thermo #NP0322)及NuPAGE MES SDS運行緩衝液(Thermo #NP0002)，藉由SDS-PAGE來分析經純化之溶離份。

² H/ ¹³C/ ¹⁵N HLA-G α3 及未經標記之人類 β2m 再摺疊隨後在再摺疊之前，在1.5 M胍HCl、5 mM乙酸鈉、5 mM EDTA中將再溶解之包涵體稀釋至大約1 mg/ml。

首先將人類β2m逐滴添加至再摺疊緩衝液(Tris pH 8.5、0.4 M精胺酸、0.5 mM氧化麩胱甘肽、5 mM還原麩胱甘肽、2 mM EDTA)中。接著以1:1莫耳比添加經 ²H/ ¹³C/ ¹⁵N標記之HLA-G α3域。再摺疊反應物在輕緩攪拌下在室溫下保持16小時。隨後使用3,000 MWCO Spectra/Por滲析膜，在滲析緩衝液(5 mM Tris pH 8.5)中以1:20稀釋因子滲析再摺疊反應物。在室溫下在24小時滲析期間更換一次滲析緩衝液。

摺疊複合物之純化隨後使用AKTA Pure (GE Healthcare)系統及HiTrap Q管柱(Cytiva Life Sciences)使用以下緩衝液及純化順序來純化再摺疊之HLA-G α3/β2m複合物：緩衝液A：10 mM Tris、10 mM NaCl pH 8.5，緩衝液B：10 mM Tris、500 mM NaCl pH 8.5。純化順序：以5 ml/min運行，用5 CV緩衝液A平衡，負載經滲析之再摺疊反應物，用10 CV緩衝液A洗滌，溶離：10 CV內0-40% B，在40%下保持10 CV，20 CV內40-100% B，100% B保持10 CV。

使用經Quick Coomassie染色劑(VWR #SERA35081.01)染色之NuPAGE 4-12%、Bis-Tris (Thermo)及NuPAGE MES SDS運行緩衝液(Thermo)，經由SDS-PAGE來分析溶離份。彙集純溶離份，隨後使用10,000 MWCO Amicon Ultra (Millipore)濃縮，且負載至S75 300/10加強型凝膠過濾管柱(Cytiva Life Sciences)上，使用150 mM NaCl、10 mM Tris pH 7.4、0.02% NaN ₃作為運行緩衝液。再次，經由SDS-PAGE分析溶離份且彙集純溶離份。經由SDS-PAGE再次分析最終經純化樣品，隨後將其濃縮至約350 µm。使用Thermo Scientific Nanodrop 2000分光光度計測定蛋白質濃度。

Fab 試劑之純化 ：使用AKTA Pure系統(GE Healthcare)及填充型Gammabind Plus Sepharose (Cytiva Life Sciences)管柱來純化Fab試劑。在捕捉前使用AKTA Flux系統(GE Healthcare)將上清液濃縮至超過300 mg/L。如下使用以下緩衝液及純化順序：緩衝液A：10 mM PBS pH 7.4。緩衝液B：0.1 M甘胺酸-HCl pH 2.7。用5 CV緩衝液A平衡。以確保至少20分鐘接觸時間之流動速率負載上清液。用5 CV緩衝液A洗滌。用5 CV 100%緩衝液B溶離。用2 M Tris pH 8.5中和溶離之溶離份。

使用經Quick Coomassie染色劑染色之NuPAGE 4-20% Tris-甘胺酸及NuPAGE MOPS SDS運行緩衝液，經由SDS-PAGE分析溶離份。彙集純溶離份，隨後使用10,000 MWCO Amicon Ultra (Millipore)濃縮，且負載至S200 26/60過濾管柱(Cytiva Life Sciences)上，使用10 mM PBS pH 7.4作為運行緩衝液。再次，經由SDS-PAGE及使用BEH200 SEC管柱(Waters)之Acquity UPLC H-Class系統(Waters)分析溶離份。彙集純溶離份，隨後將其濃縮至超過5 mg/ml。使用Thermo Scientific Nanodrop 2000分光光度計測定蛋白質濃度。

HLA-G α3 之主鏈分配為了獲得HLA-G α3域之主鏈分配，在150 mM NaCl、10 mM Tris pH 7.4、0.02% NaN ₃中製備HLA-G α3與未經標記β2M之複合物的500 µl經 ²H/ ¹³C/ ¹⁵N標記之樣品，其濃度為320 µM，且將其轉移至5 mm NMR管中。所有實驗皆在35℃、在裝配有低溫冷卻探針的600 MHz Bruker AVIII-HD或600 MHz Bruker AVANCE NEO光譜儀上記錄。蛋白質中之殘基之主鏈NMR信號之間的順序連接係使用3D TROSY-HNCACB (Wittekind及Mueller, 1993 HNCACB, a High-Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide-Proton and Nitrogen Resonances with the Alpha- and Beta-Carbon Resonances in Proteins. J. Magn. Reson. Ser. B 101, 201-205. 數位物件識別碼(doi):10.1006/jmrb.1993.1033；Salzmann等人, 1999. TROSY-type Triple Resonance Experiments for Sequential NMR Assignment of Large Proteins. J. Am. Chem. Soc. 121, 844-848. 數位物件識別碼: 10.1021/ja9834226)及3D TROSY-HNCOCACB (Salzmann等人, 1999, TROSY-type Triple Resonance Experiments for Sequential NMR Assignment of Large Proteins. J. Am. Chem. Soc. 121, 844-848；Eletsky等人, 2001. TROSY NMR with partially deuterated proteins. J. Biomol. NMR 120, 177-180)來進行。TROSY-HNCACB係在 ¹³C、 ¹⁵N及 ¹H維度中分別利用75、36及16 ppm之譜寬及9 (F1)、21 (F2)及70 (F3) ms之獲取時間來進行記錄(每個增量16次掃描，1.3 s弛豫延遲，5天之總獲取時間)。TROSY-HNCOCACB係在 ¹³C、 ¹⁵N及 ¹H維度中分別利用75、36及16 ppm之譜寬及9 (F1)、21 (F2)及70 (F3) ms之獲取時間來進行記錄(每個增量8次掃描，1.3 s弛豫延遲，2天17小時之總獲取時間)。使用NMRPipe (Delaglio等人, 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-93)來處理NMR波譜。使用Sparky (Goddard及Kneller, D. G. SPARKY 3. In., University of California, San Francisco)進行資料分析，從而得到80個殘基(對應於天然蛋白質之93%殘基(不包括脯胺酸殘基))之醯胺質子及氮殘基的分配。

Fab 片段 之結合位點的定位Fab片段之結合位點之定位係使用含有10%莫耳過量之未經標記Fab的 ²H/ ¹³C/ ¹⁵N HLA-G α3與未經標記β2M之複合物的150 µM樣品來進行。在與上文針對HLA-G α3之主鏈分配所描述相同的緩衝液中製備200 µl樣品，且將其轉移至3 mm NMR管中。藉由比較針對HLA-G α3/β2M/Fab複合物所記錄之TROSY (Pervushin等人, 1998. Single Transition-to-single Transition Polarization Transfer (ST2-PT) in [ ¹⁵N, ¹H]-TROSY. J. biomol. NMR 12, 345-348)光譜與HLA-G α3/β2M之等效對照TROSY實驗來測定 ¹H及 ¹⁵N化學位移變化。HLA-G α3/β2M之對照TROSY實驗係在 ¹⁵N及 ¹H維度中分別利用36及16 ppm之譜寬及60 (F1)及80 (F2) ms之獲取時間來進行記錄(每個增量8次掃描，1.5 s弛豫延遲，1小時之總獲取時間)。HLA-G α3/β2M/Fab之TROSY實驗係在 ¹⁵N及 ¹H維度中分別利用36及16 ppm之譜寬及60 (F1)及80 (F2) ms之獲取時間來進行記錄(每個增量8次掃描，1.5 s弛豫延遲，1小時之總獲取時間)。使用NMRPipe (Delaglio等人, 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-93)來處理光譜。使用Sparky進行資料分析。

使用最小位移方法(Williamson等人, 1997, Mapping the binding site for matrix metalloproteinase on the N-terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-2 by NMR chemical shift perturbation. Biochemistry 36, 13882-9)來分析化學位移變化，使用以下等式來計算組合化學位移變化(Δδ)：

其中Δδ _HN及Δδ _N分別為 ¹H及 ¹⁵N化學位移之差值。αN對應於縮放因數0.2，其用於考慮氮化學位移之化學位移範圍的差異。

為了鑑定HLA-G α3上的Fab結合位點，利用組合最小位移相對於蛋白質序列的直方圖來鑑定HLA-G α3之含有顯著擾動信號的區。若胺基酸之組合最小位移變化的大小超過所有胺基酸之組合化學位移變化的平均值之臨限值，則選擇此等殘基作為Fab結合位點中之可能接觸殘基進行進一步評估。

應用兩個臨限值來鑑定Fab所結合之殘基：最小位移超過所有位移計算值之平均值的殘基，及最小位移超過所有最小位移計算值之平均值加一個標準差的殘基。在此等分析中，脯胺酸殘基由於其不含醯胺質子而未能鑑定。

結果藉由如嚴格度增加超過所有位移計算值之平均值(＞0.0764)所定義之NMR測定的抗原決定基包含殘基T200、L201、L215、W217、R219、D220、E229、A245、A246、V247、V249、S251、E253、Q255、T258、H260、V261及W274。藉由如嚴格度增加超過所有位移計算值之平均值加一個標準差(＞0.1597)所定義之NMR測定的抗原決定基包含殘基H191、Y197、E198、R202、L230、V248、G252、C259及K275。

實例 13 ： 藉由液相層析 - 質譜 (LC-MS) 表徵抗體分子使用具有Xevo G2 Q-ToF質譜儀之Waters ACQUITY UPLC系統，藉由LC-MS由單獨重鏈及輕鏈(還原性)量測HLA-G02 (VR12389gL2gH16) (未經修飾(岩藻糖基化)及去岩藻糖基化)、VR12389 gL2gH15及HLA-G01之分子量(MW)。在37℃下用含5 mM參(2-羧乙基)膦(TCEP)之150 mM乙酸銨還原樣品(約5 µg) 40分鐘。LC管柱為Waters BioResolve ™RP mAb聚苯基，450 Å，2.7 µm，保持在80℃下，經95%溶劑A (水/0.02%三氟乙酸(TFA)/0.08%甲酸)及5%溶劑B (95%乙腈/5%水/0.02% TFA/0.08%甲酸)平衡，流動速率為0.6毫升/分鐘。將蛋白質用5%至50%溶劑B之梯度歷時8.8分鐘溶離，接著用95%溶劑B洗滌且重新平衡。在280 nm處獲取UV資料。MS條件如下：離子模式：ESI正離子，解析模式，質量範圍：400至5000 m/z及用NaI外部校準。

使用Waters MassLynx™及MaxEnt軟體分析資料。

如表26中所示，對於所有抗體，序列之MW預測值與藉由LC-MS測定的重鏈及輕鏈之MW觀測值一致。此外，對於VR12389 gL2gH16，如所預期，對應去岩藻糖基化型式之重鏈之質量差異為約146 Da。表 26 ： LC 及 HC 分子量

抗體	輕鏈MW (Da)	重鏈MW (Da)
預期值	觀測值	Δm	預期值	觀測值	Δm
HLA-G01	23741.3	23741.4	0.1	49689.8	49691.8	2.0
VR12389 gL2gH15	23489.2	23489.0	-0.2	49771.8	49775.0	3.2
HLA-G02 (VR12389 gL2gH16)	23489.1	23488.4	-0.7	49743.8	49744.0	0.2
去岩藻糖基化HLA-G02	23489.2	23487.0	-2.2	49597.7	49598.0	0.3

實例 14 ：熱穩定性 (Tm) 量測使用熱轉移分析來測定解鏈溫度(Tm)或去摺疊中點處之溫度以評定分子之構形穩定性，且因此評定製造穩固性及長期穩定性。

使用螢光染料SYPRO®橙，根據對隨著溫度升高而暴露之疏水區的結合來監測蛋白質去摺疊過程。反應混合物含有5 µL 30× SYPRO®橙蛋白凝膠染色劑(Thermofisher scientific，S6651)，用測試緩衝液自5000×濃縮物稀釋。將0.2 mg/mL於PBS pH 7.4中之45 µL樣品添加至染料中且混合。將10 µL此溶液一式四份分配於384 PCR光學孔盤中且在QuantStudio 7即時PCR系統(Thermofisher™)上運行。PCR系統加熱裝置設定在20℃下且以1.1℃/min之速率升高至99℃。電荷耦合裝置監測孔中的螢光變化。標繪螢光強度之增加，使用斜率之反曲點產生表觀中點溫度(Tm)。資料展示於表27中。表 27 ： PBS pH 7.4 中之 樣品之熱位移分析資料概述。

抗體	CH2 域 ( ℃)	Fab 域 ( ℃)
HLA-G01	69.5 ±0.2	86.8 ±0.2
HLA-G02 (VR12389gL2gH16)	69.7 ±0.1	85.4 ±0.1
去岩藻糖基化HLA-G02	70.3 ±0.2	84.2 ±0.2
VR12389 gL2gH15	69.6 ±0.1	83.9 ±0.1

樣品展現較高及類似的熱穩定性，表明移植物之間無實質性結構差異。Fab域之熱穩定性可顯著變化(典型範圍為70℃至84℃)，高熱穩定性由於更高機械穩定性而更佳。如所預期，在習知(亦即岩藻糖基化)與去岩藻糖基化HLA-G02之間未觀測到有意義的結構差異。

實例 15 ：實驗等電點 (pI) 量測使用iCE3 ^TM全柱成像毛細管等電聚焦(cIEF)系統(ProteinSimple ^TM)以實驗方式測定pI。

發現HLA-G01及HLA-G02之主峰之實驗pI類似。pI在預期適合於製造步驟及調配物緩衝液之範圍內。微量酸性及鹼性帶電物種之存在與其他IgG1治療分子一致且可歸因於常見轉譯後修飾。

實例 16 ：使用聚乙二醇 (PEG) 聚集分析進行溶解度量測PEG聚集分析用作高濃度溶解度模擬分析。PEG為非吸附、非變性聚合物，且由於其惰性性質，已用於主要經由排除體積效應來促進蛋白質沈澱。使樣品暴露於增加濃度之PEG 3350；藉由標繪A280 nm處之吸光度測定溶液中剩餘之樣品量。對一半樣品已沈澱之PEG濃度%進行測定產生PEG中點(PEGmdpnt)評分。此評分允許抗體分子以表觀天然狀態聚集傾向評級，低PEGmdpnt評分(例如≤ 10)指示天然狀態聚集之傾向更大。

儲備40% PEG 3350溶液(w/v)在PBS pH 7.4及pH 5.0緩衝液(常見預調配儲存緩衝器)中製備。藉由ASSIST PLUS液體處理機器人(INTEGRA ^TM4505)進行連續滴定，產生40%至15.4%範圍內之PEG 3350。為了將非平衡沈澱降至最少，樣品製劑係由以1:1體積比混合之抗體及PEG溶液組成。藉由液體處理機器人將35 µL PEG 3350儲備溶液添加至96孔v底PCR盤(A1至H1)中。將35 µL之2 mg/mL樣品溶液添加至PEG儲備溶液中，產生1 mg/mL之測試濃度及20%至7.7%之最終PEG 3350濃度。此溶液藉由自動化緩慢重複移液而混合且在37℃下培育0.5小時以再溶解任何非平衡聚集體。接著，在20℃下培育樣品24小時。隨後以4000 × g在20℃下使樣品盤離心1小時。將50 µL上清液分配至UV-Star®半區96孔μClear®微量盤(Greiner，675801)中。藉由在280 nm處使用FLUOstar ®Omega多偵測微量盤讀取器(BMG LABTECH ^TM)進行UV分光光度法來測定蛋白質濃度。使用Graphpad prism 7.04版繪製所得值，自S形劑量反應(可變斜率)擬合之中點處衍生PEG中點(PEG _mdpnt)評分。

資料展示於表28中，其中較高PEG中點(%)等於較大高濃度溶解度。NB *樣品在PEG 3350之最低測試濃度(7.7%)下顯示聚集跡象，因此無法產生精確的PEG中點。表 28 ： PBS pH 7.4 及 pH 5 緩衝液中之 PEG 聚集 分析資料 (PEG% 中點值 )

抗體	PBS pH 7.4	pH 5.0緩衝液
HLA-G01	9.5	＜7.7*
HLA-G02 (VR12389 gL2gH16)	9.4	15.8
去岩藻糖基化HLA-G02	9.5	15.2
VR12389 gL2gH15	9.6	15.6

PEG聚集分析資料指示，所有測試樣品皆在PBS中展現中等聚集傾向。 值得注意的是， HLA-G01 在 pH 5.0 下展現極高的聚集傾向。與之相反， VR12389 移植物在 pH 5.0 緩衝液中展現低聚集傾向。在習知(亦即岩藻糖基化) HLA-G02與其去岩藻糖基化對應物之間未觀測到有意義的差異。

實例 17 ： kD 相互作用參數量測 ( 膠體穩定性 ) kD相互作用參數用於評估膠體穩定性，其中正值及負值分別與排斥性及吸引性分子間力相關。

動態光散射(DLS)在DynaPro III盤讀取器(Wyatt Technology Corp，Santa Barbara, CA, USA)上進行。將樣品在PBS pH 7.4中或在pH 5緩衝液中稀釋至30 µL，且以1 mg/mL之增量自7 mg/mL稀釋至1 mg/mL。選擇含有緩衝液之孔作為溶劑偏移且在25℃下進行量測，其中雷射功率設定為20%且啟動自動衰減。各量測值為五次5s掃描一式三份(5×3)的平均值。量測擴散係數( Dm)且根據以下等式計算相互作用參數(kD)，其中 D ₀ 表示無限稀釋時之擴散係數。

等式：D ₀藉由Debye曲線在Y-截距處給出。斜率 = kD*D ₀。

擴散係數依據蛋白質濃度量測且kD用於評定膠體穩定性，其中正值及負值分別表明排斥性及吸引性分子間力。對於展示吸引力/自締合之樣品，擴散係數隨蛋白質濃度而變大且此以負kD值反映。資料展示於表29中。表 29 ：抗 HLA-G 抗體之 kD 相互作用參數資料

樣品	mL/g
PBS	Ac pH 5
HLA-G01	-9.93	-68.7
VR12389 gL2gH15	-9.30	-4.04
HLA-G02 (VR12389 gL2H16)	-7.92	-2.98

顯示HLA-G01之kD相互作用參數在pH 5.0下具有較大負值，且在pH 7.4中具有較小負值，表明其在生理pH下之膠體穩定性更高。VR12389移植物具有較小的負kD值，表明其在任一pH下均具有良好膠體穩定性。

實例 18 ： 機械應力對聚集穩定性之影響 ( 聚集分析 ) 蛋白質在暴露於空氣-液體界面時傾向於去摺疊，其中向疏水環境(空氣)呈現疏水性表面且向親水環境(水)呈現親水性表面。攪拌蛋白質溶液可實現可驅動聚集之大型空氣-液體界面。此分析用以模仿分子在製造(例如超過濾)期間將經受之應力且提供嚴格條件以便試圖區分不同的抗體分子。

PBS pH 7.4或pH 5緩衝液中之樣品使用Eppendorf Thermomixer Comfort ™藉由渦旋來施加應力。在渦旋之前，將濃度調節至1 mg/mL，且使用Varian Cary 50-Bio分光光度計®獲得595 nm處之吸光度以建立零時間讀數。將各樣品再等分至1.5 mL錐形Eppendorf®型加蓋管(3×250 μL)中且以1400 rpm在25℃下渦旋達24小時。藉由使用Varian Cary® 50-Bio分光光度計在渦旋後3小時及24小時時量測595 nm處之樣品來監測聚集(濁度)。資料概述於表30中。表 30 ：空氣 - 液體界面處之應力對 PBS pH 7.4 及 pH 5 緩衝液中之抗 HLA-G 人類化移植物分子的影響 (595 nm 處之渾濁 ) 。

抗體	OD 595 nm
PBS pH 7.4	pH 5緩衝液
3h	24h	3h	24h
HLA-G01	0.005±0	0.029±0.011	0.003±0	0.20±0.084
VR12389 gL2gH15	0.006±0	0.016±0	0	0.065±0.010
HLA-G02 (VR12389 gL2gH16)	0.004±0	0.013±0.001	0	0.041±0.023
去岩藻糖基化HLA-G02	ND	0.050±0.0043	ND	ND

渦旋後3h時，對於所有抗體樣品，在PBS pH 7.4及pH 5緩衝液中均觀測到低聚集傾向(595 nm處之低吸光度)。僅有可能在更長時間點(24h)區分樣品且評定緩衝液依賴性。24h時，與PBS pH 7.4相比，在pH 5緩衝液中出現略微更大的聚集傾向，同樣，與VR12389移植物分子相比，HLA-G01出現略微更大的聚集傾向。在習知(亦即岩藻糖基化) HLA-G02與其去岩藻糖基化對應物之間未觀測到有意義的差異。

實例 19 ：疏水相互作用層析 (HIC) 疏水相互作用層析(HIC)按提高之疏水性的順序分離分子。分子在高濃度極性鹽存在下結合於疏水性固定相且隨著鹽濃度降低而解吸附於移動相中。較長之滯留時間等於較高疏水性。

樣品(2.0 mg/mL)用1.6 M硫酸銨、100 mM磷酸鹽pH 7.4以1:2稀釋，且將30 µg (30 µL)樣品注射至Dionex ProPac™ HIC-10管柱(100 mm × 4.6 mm)上，該管柱與具有螢光偵測器之Agilent 1200二元HPLC串聯連接。藉由內源螢光(激發及發射波長分別為280 nm及340 nm)監測分離。使用緩衝液A (0.8 M硫酸銨、50 mM磷酸鹽pH 7.4)及緩衝液B (50 mM磷酸鹽pH 7.4)，使用如下梯度溶離來分析樣品：(i)在0% B下保持2分鐘；(ii) 30分鐘內0至100% B之線性梯度(0.8毫升/分鐘)；(iii)管柱用100% B洗滌2分鐘且在0% B中重新平衡10分鐘，之後進行下一次樣品注射。將管柱溫度維持在20℃。滯留時間(以分鐘為單位)展示於表31中。表 31 . 抗 HLA-G 人類化抗體之疏水相互作用層析

抗體	HIC滯留時間(min)
HLA-G01	6.4
HLA-G02 (VR12389 gL2gH16)	5.6
去岩藻糖基化HLA-G02	5.6
VR12389 gL2gH15	5.5

分子顯示早溶離時間，其指示低表觀疏水性。低疏水勢據報導為所需特性，且可指示由於聚集傾向降低而帶來的可開發性提高(Jarasch A等人2015)。在習知(亦即岩藻糖基化) HLA-G02抗體與其去岩藻糖基化對應物之間未觀測到有意義的差異。

實例 20 ： HLA-G 組織交叉反應性使用與HLA-G02識別類似抗原決定基、針對冷凍組織染色最佳化的抗體(「HLA-G Ab」)來研究HLA-G在正常非腫瘤組織中之表現模式，且出人意料地發現包含HLA-G Ab所結合之抗原決定基(且因此HLA-G02所結合之抗原決定基)的HLA-G形式並未表現於健康組織中，尤其胰臟及垂體組織中。

方法：使用上文所提及的特異性結合於HLA-G之HLA-G Ab來進行人類組織中之組織交叉反應性研究。此組織交叉反應性(TCR)研究之目標為使用免疫組織化學(IHC)技術，在冷凍人類組織及血液塗片中使用與FITC結合之HLA-G抗體來評估HLA-G抗體之潛在交叉反應性。

評估一組42種不同冷凍正常人類組織及血液塗片(每組織三個供體)。使用設定為3及10 µg/mL之兩種HLA-G Ab-FITC濃度，其中陰性對照IgG1-FITC具有最高濃度10 µg/mL。

結果：HLA-G Ab-FITC在胎盤中之絨毛外滋養細胞中產生膜性可變細胞質染色。由於HLA-G係幾乎唯一在胎兒-母體界面處之絨毛外滋養細胞中表現的主要組織相容基因(絨毛外滋養細胞侵入蛻膜及母體螺旋動脈)，因此認為此模式表示HLA-G Ab之中靶結合(Goldman Whol，2000)。

相比之下，在以下組織中未觀測到陽性染色：腎上腺、血細胞、骨髓、乳房、盲腸、小腦、大腦皮質、結腸、十二指腸、內皮(血管)、眼睛、食道、輸卵管(fallopian tube/oviduct)、膽囊、心臟、回腸、空腸、腎臟、肝臟、肺、淋巴結、肌肉、神經、卵巢、胰臟、腮腺、副甲狀腺、垂腺、前列腺、直腸、皮膚、脊髓、脾臟、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管、膀胱、子宮(子宮頸及子宮內膜)。

總之，發現包含HLA-G Ab所結合之抗原決定基的HLA-G形式僅在絨毛外滋養細胞中表現(如文獻中所報導且用作本研究中之對照)且其並未表現於所測試的任何其他正常組織中。

因此，結果為出人意料的，且與根據先前技術之教示內容所預期相反，其顯示能夠例如經由Fc介導之效應功能殺死表現HLA-G之細胞的針對HLA-G之抗體表示用於治療實體腫瘤之潛在候選物，預期其不具有經由結合於正常組織而對患者產生的毒性。後驗，存在可解釋此分析中獲得之結果與文獻中報導之結果具有意想不到的差異的潛在假設：i)如垂體中所報導之mRNA表現不一定指示膜蛋白表現。舉例而言，mRNA可能未轉譯成蛋白質，或mRNA可編碼可溶性HLA-G同功異型物，該(等)同功異型物可能未在冷凍組織中偵測到且在毒性方面不存在問題，因為其並非膜結合性的。mRNA亦可由浸潤性免疫細胞而非由垂體細胞表現，ii)使用市售抗體4H84來偵測胰臟中之HLA-G蛋白且已知此抗體為非特異性的。4H84亦識別HLA-G之α1域中之抗原決定基，而本發明之抗體對HLA-G具有高特異性且結合α3域。因此，胰臟中表現之HLA-G同功異型物可能不含有α3域，但仍將由α1結合劑偵測到(例如HLA-G3、HLA-G4、HLA-G7)。HLA-G在胎盤滋養細胞中之陽性偵測且在正常組織中未偵測到表明本發明之抗體可能夠結合於腫瘤中表現的含有HLA-G之免疫調節功能所需之ILT2/4結合a3域的HLA-G蛋白，但不可結合正常組織中之細胞。

實例 21 ： HLA-G 抗體在 3D 類 腫瘤模型中之功能特性使用Nilogen Oncosystems (Tampa, Florida, US)之3D類腫瘤模型技術，在原發性活體外人類類腫瘤平台中評定HLA-G抗體活性。Nilogen之技術採用患者衍生之新鮮腫瘤組織，且產生保留包括浸潤性免疫細胞之完整腫瘤微環境且體現完整腫瘤異質性的3D腫瘤類器官。該技術獲得與臨床中所見之患者反應率類似的患者反應率，且因此提供適用於評估免疫療法候選物用於治療患者之潛力的模型。

獲得十種結腸直腸腺癌腫瘤(CRC)及十種腎透明細胞癌腫瘤(RCC)，且各自使用Nilogen之方法衍生出數千種含有所有腫瘤細胞(腫瘤細胞、基質細胞、浸潤性免疫細胞)及基質組分的類腫瘤。

經分離之類腫瘤(每治療孔100至400個)在無先前培養的情況下直接暴露於抗體72h。使用Nilogen之3D-Explore ^TM成像平台在24h及72h時評估腫瘤細胞死亡水準。在24h時收集培養基以評定細胞介素含量。在72h時分解類腫瘤且藉由流式細胞測量術分析以評定對免疫細胞活化概況之影響。另外，在治療之前，藉由流式細胞測量術分析類腫瘤以表徵其細胞組成，且針對HLA-G、ILT2及ILT4對各腫瘤之FFPE切片進行染色。

藉由與IgG1同型對照比較，以活性IgG1型式分析HLA-G02抗體之活性。使用具有活性IgG1型式之抗PD-L1抗體來進行比較。

腫瘤細胞死亡緊接在分離之後，每孔含有約100個類腫瘤之培養物在10 mg/ml之同型對照IgG1、抗PDL1陽性對照或HLA-G02 IgG1存在下培養。培養24小時及72小時之後，用活/死染料對類腫瘤進行染色，成像，且使用專用演算法計算死細胞百分比。

結果呈現於圖 13中。圖13A：在RCC中抗PDL1獲得之資料。圖13B：在CRC中抗PDL1獲得之資料。圖13C：在RCC中HLA-G02獲得之資料。圖13D：在CRC中HLA-G02獲得之資料。資料以死細胞%之形式呈現，同型對照為淺灰色，抗PDL1或HLA-G02為深灰色，且其中觀測到1.5倍或更高倍數細胞死亡增加的經抗PDL1或HLA-G02處理之培養物為黑色。

各腫瘤在患者間可不同，因此資料充分表示本發明之抗體治療癌症尤其RCC及CRC之潛力。總體而言，資料顯示本發明之抗體能夠在腫瘤環境中及在反應完全依賴於浸潤性免疫細胞之條件下殺死腫瘤細胞。有利地，資料提供證據表明，抗體在某些腫瘤中可具有增加之細胞殺死活性。

值得注意的是，由於死細胞隨時間推移而自培養物損失，因此在72h時可能不再偵測到24h時殺死之增加。另外，對於抗PDL1陽性對照，總共5種腫瘤在24h時顯示細胞殺死之增加(1×RCC及4×CRC)，在72h時未觀測到殺死增加。對於HLA-G02，6種腫瘤在24h時顯示殺死之增加(2×RCC及4×CRC)，且4種腫瘤在72h時顯示殺死之增加(1×RCC及3×CRC)。總計，僅5/20腫瘤在抗PDL1的情況下顯示殺死增加，但9/20腫瘤在HLA-G02的情況下顯示殺死增加。

因此，資料顯示與諸如抗PD-L1之抗免疫檢查點相比，本發明之抗體可有利於治療實體腫瘤。

實例 22 ：去岩藻糖基化 HLA-G02 之 組織交叉反應性分析使用與實例20中所描述相同的方法，使用去岩藻糖基化HLA-G02來進一步研究HLA-G在正常非腫瘤組織中之表現模式。

評估一組37種不同冷凍正常人類組織及血液塗片(每組織三個供體) (垂體及胰臟除外，其中評估8個供體)。使用設定為1及10 µg/mL之兩種HLA-G Ab-FITC濃度，其中陰性對照IgG1-FITC具有最高濃度10 µg/mL。

使用人類胎盤之冷凍切片及表現野生型HLA-G之細胞(HLA-G1)作為陽性對照樣品。使用人類結腸之冷凍切片、HLA-G Null 1,2,3細胞(3個α域中之每一者中的HLA-G獨特胺基酸突變成I類MHC共通胺基酸)及未經轉染細胞作為陰性對照樣品。使用剔除蛋白質之目的為測試其他I類MHC分子之潛在交叉反應性。

其結果為，去岩藻糖基化HLA-G02在胎盤中之絨毛外滋養細胞中產生膜性可變細胞質染色，此與先前所報導內容一致，但在最佳濃度之去岩藻糖基化HLA-G02下未觀測到對正常健康組織之膜染色，證實去岩藻糖基化HLA-G02不結合正常健康細胞之膜上暴露的任何抗原決定基。

實例 23 ：藉由 FACS 分析測定的對 JEG3 細胞之結合親和力在基於細胞之分析流式細胞測量術中，使用天然表現HLA-G之JEG3來量測去岩藻糖基化HLA-G02之結合親和力。

JEG3細胞與1.5 ml去岩藻糖基化HLA-G02溶液一起在微量離心管(Eppendorf)中在4度下培育兩小時。IgG濃度在10 nM至0.00046 nM範圍內，在PBS、1% FBS、0.1%疊氮化鈉中進行稀釋。將細胞轉移至384孔V底盤(Greiner)中且在分析緩衝液中洗滌三次，與20 µl染色溶液一起在4度下培育20分鐘(R-藻紅蛋白親和純化F(ab') ₂片段山羊抗人類IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) (7.5 µg/ml)及死活染料e780 (Life Technologies))。洗滌步驟之後，細胞在10%中性緩衝福馬林溶液(Sigma-Aldrich)中在室溫下避光培育10分鐘。隨後洗滌細胞且在20 µl PBS中再懸浮。在HTS模式之FACS Canto II儀器上運行樣品以測定PE陽性細胞之百分比。使用FlowJo分析軟體根據中值螢光強度計算KD。

結果證實去岩藻糖基化HLA-G02在此分析中以高親和力/親合力(avidity)結合JEG-3細胞上之HLA-G。藉由三個獨立分析之幾何平均值所測定，去岩藻糖基化HLA-G02之EC ₅₀為0.021±0.001 nM，且分析為高度可再現的，EC ₅₀範圍為0.020至0.021 nM。

實例 24 ： HLA-G02 及去岩藻糖基化 HLA-G02 在表現 HLA-G 之 細胞之 ADCC 中的功效及效力 方法：將經HLA-G轉染之HCT116 (如先前實例9中所描述製備)標靶細胞塗鋪(2 × 10 ⁴個細胞/孔，50 µL體積)於聚丙烯圓底盤中之適當培養基中。將抗HLA-G (習知HLA-G02或去岩藻糖基化HLA-G02)或對照抗體(同型IgG1或去岩藻糖基化IgG1同型)在相同培養基中製備為4×濃縮儲備液，且以每孔50 µl添加至適當孔中。視可用供體NK細胞之數目而定，一式兩份或一式三份地測試所有抗體。一些標靶細胞中不添加任何抗體且用作未處理對照。

使用磁性珠粒套組(Miltenyi Biotech)藉由陰性選擇自全血分離原代人類NK細胞。將純化之NK細胞再懸浮於分析所需之最小體積的RPMI +10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸中。向分析盤之適當孔中在標靶細胞及抗體上方添加每孔100 µl NK細胞。

對於效應子:標靶滴定實驗，將NK細胞稀釋且塗鋪(100 μL/孔)於含有標靶細胞及抗體之96孔分析盤中，得到20:1至0.313:1之最終效應子:標靶比率範圍。

將分析盤在37℃、5% CO ₂下培育2.5至3小時。2.5至3小時後，藉由流式細胞測量術來量測活標靶細胞之數目。將分析盤以300g離心2分鐘以使細胞沈澱，且針對上皮細胞標誌物Epcam及NK細胞標誌物CD56對各孔進行染色。在細胞染色緩衝液中將染色抗體(抗Epcam PE及抗CD56 BV421)稀釋至1/100，且將每孔100 µL添加至各孔中。將盤在室溫下培育15分鐘。在染色之後，細胞用每孔150 µl PBS洗滌兩次，且在各洗滌之間將盤以300g離心3分鐘。在染色結束時，將各孔中之細胞再懸浮於含有50 nM TO-PRO™-3細胞死活染料的每孔最終體積125 µL之PBS中。

30秒後，在BD FACS Canto II儀器上獲取來自各孔之恰好100 µL樣品，且使用FlowJoV10.60軟體分析資料。測定各孔之活標靶細胞總數目。首先鑑定活標靶細胞為TO-PRO-™3陰性，其次鑑定其為CD56陰性及SSC高的。隨後基於Epcam及GFP表現(HCT116)來圈選細胞。計算各測試樣品之相比於未處理細胞或同型對照之耗竭百分比，且將資料傳送至GraphPad Prism 8.1.1軟體以進行分析。

結果：資料展示於下表32及圖 14中。對於給定供體，在所有效應子:標靶比率下，當細胞用去岩藻糖基化HLA-G02處理時與用其習知(亦即岩藻糖基化)對應物處理時相比觀測到較高最大平均耗竭。重要的是，HLA-G陽性HCT116細胞在低於1:1之低效應子:標靶比率下仍耗竭。去岩藻糖基化HLA-G02及其習知(亦即岩藻糖基化)對應物在0.625:1之效應子標靶比率下觀測到的平均耗竭分別仍為46.63%及38.15%。此在免疫細胞(諸如NK細胞)之數目通常受限的腫瘤微環境中可為重要的。此等實驗證實HLA-G02之去岩藻糖基化與抗體之習知IgG1型式相比具有增加的分子耗竭活性。表 32 ：經 HLA-G+GFP+ 轉染之 HCT116 細胞在不同 E:T 比率下之平均耗竭

	HLA-G02	去岩藻糖基化HLA-G02
E:T 比率	供體1	供體2	供體3	供體1	供體2	供體3
20:1	49.58	58.46	23.26	89.07	87.19	51.67
10:1	50.80	51.95	15.33	87.05	80.85	40.75
5:1	56.48	45.42	14.88	84.72	73.50	34.03
2.5:1	51.78	41.11	3.49	77.15	66.73	18.99
1.25:1	48.16	34.11	-4.09	69.57	64.42	2.17
0.625:1	38.15	32.88	-17.56	46.63	46.11	-7.15
0.313:1	9.94	32.75	-16.85	19.30	52.57	-8.06

實例 25 ：在 PBMC 實驗中評定的去岩藻糖基化 HLA-G02 之特異性使用來自10個不同供體之PBMC進一步證實去岩藻糖基化HLA-G02之特異性，該等供體呈現各種HLA-I對偶基因。目標為證實抗HLA-G抗體具有特異性，且尤其不與PBMC及CD4+ T淋巴細胞上表現之其他HLA-I分子交叉反應。

PBMC自周邊靜脈血液純化得到，且在冷凍培養基(90% FBS + 10% DMSO)中在液氮中進行儲存。將來自10個不同供體之PBMC解凍且再懸浮於1 ml完全RPMI培養基(RPMI 1640培養基加10%胎牛血清、2 mM Glutamax及1%青黴素/鏈黴素)中。將細胞以300 rpm離心10分鐘且用PBS洗滌兩次。將細胞沈澱物再懸浮於1 ml Facs緩衝液(PBS、0.5% BSA及2 mM EDTA)中，且將細胞接種於96孔盤中，每孔50 µl細胞懸浮液。

細胞經抗人類CD4-APC (Biolegend，2.5 µl/孔)且經抗HLA-G抗體(去岩藻糖基化HLA-G02或兩種對照「泛HLA」(結合於HLA-I且對HLA-G不具有特異性之兩種IgG1))或同型對照(50 µl溶液，20 µg/ml/孔)染色。細胞在室溫下在暗處培育20分鐘，且隨後用Facs緩衝液洗滌兩次，且再懸浮於50 µl含有二級抗體山羊抗人類IgG-FITC (Jackson ImmunoResearch，1/100稀釋)之Facs緩衝液中。細胞在室溫下在暗處再培育20分鐘，隨後用Facs緩衝液洗滌兩次。將細胞再懸浮於100 µl/孔之Facs緩衝液中，且在Canto II (HTS 1)上獲取樣品，每樣品收集到10,000個事件。使用FlowJo軟體v10.6.0，藉由量測各供體之各CD4+細胞群體之平均螢光強度(MFI)來進行分析。使用Graphpad Prism軟體繪製曲線圖。

結果呈現於圖 15中。圖15顯示與兩種泛HLA抗體相比，特異性抗HLA-G抗體去岩藻糖基化HLA-G02與10個不同供體之CD4 T細胞缺乏結合。資料以各供體之平均螢光強度(MFI)表示。

實例 26 ： 評定去岩藻糖基化 HLA-G02 介導之補體依賴性細胞毒性 (CDC) 方法使用以下方法來評定去岩藻糖基化HLA-G02 (「aF HLA-G02」)介導之CDC：將HLAG-β2m-Reh細胞負載有螢光鈣黃綠素-AM染料，且在抗體溶液中在混合人類血清存在下在37℃培育2小時。使細胞沈澱且收集上清液。使用分光光度計定量上清液內之螢光以定量細胞溶解。在Excel中處理資料，且將其導出至繪製曲線之Prism中，從而允許計算各測試樣品之EC ₅₀(半最大有效濃度)及E _max(最大有效濃度)。下文提供方法之細節。

細胞株Reh細胞株(ATCC CRL-8286)展現淋巴母細胞形態且自來自急性淋巴球性白血病患者之人類組織分離得到。人類淋巴母細胞HLAG-β2m-Reh細胞株為穩定表現人類HLA-G及β2微球蛋白之多株細胞池。為了產生HLAG-β2m-Reh細胞株，將HLA-G及β2微球蛋白密碼子最佳化序列選殖至哺乳動物基因表現慢病毒載體中且封裝至慢病毒中(pLV-Neo-EF1A-人類HLA-G:IRES:人類B2m；Vectorbuilder)。將Reh細胞用HLAG-β2m慢病毒以30之感染倍率進行點種，隨後將經轉染細胞維持在含有慶大黴素(1 mg/ml)之培養基中。7天後，藉由流式細胞測量術定量HLA-G在細胞上之表現。簡言之，未經轉染之Reh及HLAG-β2m-Reh細胞由經PE標記之HLA-G抗體(MEM-G/9；Invitrogen)結合，且定量抗體與細胞表面之結合。並行地，定量Quantibrite珠粒(BD)之螢光。使用此等珠粒，測定HLAG-β2m-Reh細胞之細胞表面上的HLA-G受體之平均數目為76665。將HLAG-β2m-Reh細胞株維持在補充有胎牛血清(FBS，10%)及glutamax (1%)及慶大黴素(1 mg/ml)之RPMI-1640中。

CDC 分析將混合人類血清解凍且在自供應商接收之後等分。將其儲存在80℃下直至使用。在即將使用之前，將血清在室溫下在實驗台上解凍。視需要，血清藉由在56℃下加熱30分鐘而不活化。HLAG-β2m-Reh細胞以300 × g離心3分鐘，抽吸上清液，且將細胞以1×10 ⁷個細胞/毫升再懸浮於PBS中。添加鈣黃綠素-AM (10 µM)，且HLAG-β2m-Reh細胞在37℃下培育1小時。細胞以300 × g離心3分鐘，抽吸上清液，且將細胞再懸浮於分析緩衝液中。此重複總計兩次洗滌。最後一次洗滌後，將細胞以0.2×10 ⁶個細胞/毫升再懸浮於分析培養基(RPMI-1640、2% FBS、1% glutamax)中。將細胞分配在384孔V底盤上(50 µl/孔)。

製備活化或不活化的混合人類補體血清溶液(1份血清、4份分析培養基)，且視需要將其分配在分析盤上(25 µl/孔)。

在96孔V底盤中在分析培養基中產生去岩藻糖基化HLA-G02之連續稀釋液。最初，在分析培養基中製備400 nM最高濃度。將此溶液在盤上使用Assist (Integra)以1:3稀釋，形成10點連續稀釋液。製備含有分析培養基之額外孔，以用於評定背景螢光(MIN)及最大溶解(MAX)。

使用Viaflo (Integra)一式兩份地將測試試劑(3.7 mg/ml之去岩藻糖基化HLA-G02或1 mg/ml之人類IgG1同型對照抗體；25 µl)及MIN/MAX對照(25 µl)自96孔盤轉移至384孔分析盤中。

用透氣膜密封分析盤，短暫渦旋且以300 × g離心10秒。將分析盤在37℃及5% CO ₂下培育2小時。

2小時培育期之後，將10 µl溶解緩衝液(10% Triton-X、分析培養基)添加至所有MAX對照孔中且藉由移液充分混合。將分析盤在37℃及5% CO ₂下培育10分鐘。分析盤以300 × g離心3分鐘。

使用Viaflo (Integra)，自各孔移出40 µl上清液且轉移至384孔黑色壁的平坦透明底盤中。注意不干擾細胞沈澱物。

新的分析盤以1000 × g離心5分鐘。新的分析盤在分光光度計上以488 nm之激勵及520 nm之發射進行分析。

統計分析將螢光發射資料導出至Excel。螢光信號相對於含有分析緩衝液(MIN)及1% Triton X-100 (MAX)之處理孔之平均值正規化，以產生在給定測試試劑濃度下獲得的溶解百分比。

使用Graphpad Prism® 8.0軟體進行4參數邏輯擬合(4-PL)曲線擬合及EC ₅₀值之計算。

結果 血清不活化對 HLAG-β2m-Reh 細胞株之溶解的影響結果證實活化人類血清對HLAG-β2m-Reh細胞之aF HLA-G02介導之CDC至關重要。當血清藉由加熱不活化時，aF HLA-G02不能介導CDC。資料在圖 16 A中視覺化。

耗竭對 HLA-G 之依賴性在活化人類血清存在下，HLAG-β2m-Reh細胞株之溶解藉由aF HLA-G02以濃度依賴性方式介導。在高達100 nM之最大aF HLA-G02濃度下未觀測到親本Reh細胞株之溶解。資料在圖 16 B中視覺化。

HLAG-β2m-Reh 細胞之 CDC結果證實在活化血清存在下，aF HLA-G02介導HLAG-β2m-Reh細胞之CDC。在100 nM至0.0051 nM範圍之濃度下測試aF HLA-G02。藉由三個獨立分析之平均值所測定，aF HLA-G02之EC ₅₀為3.17 ± 0.60 nM。資料概述於下表33及34中且在圖 16 C中視覺化。表 33 ： 不同濃度之 aF HLA-G02 介導之溶解 (%) 、 EC50 及 Emax 。根據三個獨立實驗計算值。

	濃度(nM) 下之溶解(%)
aF HLA-G02 批次	100.0	33.3	11.1	3.70	1.23	0.41	0.14	0.046	0.015	0.0051	EC50 (nM)	Emax (%)
1	68.5	67.9	64.3	46.2	11.5	1.8	-0.4	-0.7	-0.6	0.3	2.51	68.5
2	66.2	63.1	57.4	35.6	3.7	-0.4	-1.8	-1.3	-1.6	-1.5	3.29	66.2
3	54.9	54.8	50.9	26.5	7.8	2.0	-2.0	-2.0	-1.9	-1.9	3.70	54.9

表 34 ：平均 EC50 及 Emax 之概述 (SEM ( 平均值標準誤差 ))

	EC ₅₀(nM)	E _max(%)
	平均值	SEM	平均值	SEM
aF HLA-G02 (N=3)	3.17	0.60	63.2	7.23

結論去岩藻糖基化HLA-G02與HLAG-β2m-Reh之結合觸發強力且有效的補體依賴性溶解(EC ₅₀= 3.17 ± 0.60 nM；E _max= 63.2 ± 7.23%)。

為了確保所觀測之溶解係CDC介導的，進行使用加熱不活化血清之探索性研究。其顯示去岩藻糖基化HLA-G02僅在存在活化混合人類血清時才觸發HLAG-β2m-Reh細胞之溶解。當混合人類血清藉由長期暴露於高溫而不活化時，去岩藻糖基化HLA-G02介導CDC之能力消失。

為了確保所觀測之溶解係HLA-G依賴性的，在活化混合人類血清存在下將未經轉染之親本Reh細胞株暴露於去岩藻糖基化HLA-G02。其顯示去岩藻糖基化HLA-G02在所測試濃度範圍內不能介導Reh細胞之CDC。然而，在相同濃度範圍內，去岩藻糖基化HLA-G02強力且有效地介導HLAG-β2m-Reh細胞之CDC。

總之，此等結果證明了去岩藻糖基化HLA-G02介導表現HLA-G之細胞之CDC的選擇性、效力及有效性。

實例 27 ： 不同活性及非活性 Fc 型式之 HLA-G02 介導的吞噬作用 ，及 HLA-G02 與抗 CD47 抗體之組合處理此研究之目標為使用活體外巨噬細胞依賴性吞噬作用分析來評估去岩藻糖基化HLA-G02促進巨噬細胞介導的表現HLA-G之腫瘤細胞之吞噬作用的能力。

吾人研究了去岩藻糖基化HLA-G02在以不同Fc型式表現時介導表現HLA-G之K562標靶細胞之吞噬作用的能力：能夠與巨噬細胞上表現之Fc受體相互作用的『活性』Fc型式(去岩藻糖基化HLA-G02及其習知(亦即岩藻糖基化)對應物，以評定抗體Fc最佳化之影響)，及不與Fc受體相互作用的『非活性』Fc型式(HLA-G02 IgG4P FALA)，以評估FcR非依賴性作用機制之可能性。

在此等研究中，使用抗CD47抗體作為陽性對照。人類細胞上廣泛表現之CD47與骨髓細胞上之受體SIRPα相互作用以防止吞噬作用。CD47已顯示在腫瘤細胞中過度表現，且目前正在臨床試驗中測試促進腫瘤細胞吞噬作用之抗CD47阻斷抗體。

另外，吾人測試了抗CD47與去岩藻糖基化HLA-G02之組合處理的潛在作用。

HLA陰性紅白血病K562細胞使用4D-核轉染儀系統及SF細胞株4D-核轉染儀TM X套組L (Lonza，參考編號V4XC-2024)經模擬物轉染或經HLA-G及B2m轉染，且在37℃、5% CO ₂下在完全RPMI中培養24小時。第二天，收穫細胞，洗滌且用Cell Trace Yellow (Thermofisher)標記，再次洗滌，且以25.000個細胞/孔塗鋪於96孔圓底超低附著盤(Corning Costar)中之100 µl完全RPMI中。細胞隨後與10 µg/ml之抗CD47抗體或抗HLA-G抗體或同型對照一起在37℃、5% CO ₂下培育1小時。在洗滌之後，將細胞與單核球衍生之巨噬細胞(50.000個巨噬細胞/孔)以巨噬細胞:標靶細胞比率 = 2:1組合。混合之細胞在37℃、5% CO ₂下培育2小時。隨後，洗滌細胞，且在4℃下在PBS加10%經純化人類FcγR結合抑制劑(Thermofisher)中再懸浮20分鐘，隨後在4℃下用抗CD11b-APC (Biolegend)染色20分鐘。洗滌細胞，且在PBS加2 mM EDTA加0.5% BSA中在DAPI (500 ng/ml)存在下再懸浮，除去死細胞。在BD FACSCanto上藉由流式細胞測量術獲取樣品。使用FlowJo軟體v10.6.0，藉由量測與作為CTY+CD11b+雙陽性細胞之巨噬細胞之百分比相對應的吞噬作用百分比來進行分析。

來自重複實驗之資料已相對於對應同型對照正規化，且表示為相對於對照之耗竭% (耗竭%=100-[(平均標靶細胞aF HLA-G02) × 100/(平均標靶細胞同型對照)]。

將資料導出至excel文件，且使用Graphpad Prism軟體產生曲線圖。

結果： HLA-G02 及去岩藻糖基化 HLA-G02 介導之吞噬作用經模擬物轉染之細胞(經模擬物轉染之細胞在無HLA-G DNA存在下經歷轉染方案)與經HLA-G轉染之細胞的吞噬作用比較結果顯示，與誘導兩種細胞類型之吞噬作用的陽性對照抗CD47抗體相比，去岩藻糖基化HLA-G02 (及其岩藻糖基化對應物)介導之ADCP對表現HLA-G之細胞具有特異性。與同型對照相比，在習知HLA-G02及去岩藻糖基化HLA-G02兩者的情況下觀測到表現HLA-G之標靶細胞之濃度依賴性吞噬作用。在始於0.001 μg/mL之濃度的去岩藻糖基化HLA-G02下觀測到增加的吞噬作用。去岩藻糖基化HLA-G02與其習知岩藻糖基化對應物相比展現對巨噬細胞介導之吞噬作用之極少增強。結果繪示於圖 17中。

由 去岩藻糖基化 HLA-G02 介導之標靶細胞殺死藉由比較在去岩藻糖基化HLA-G02或抗CD47抗體與同型對照的情況下在所限定之吞噬作用時間(過夜)之後剩餘的標靶細胞之數目來評定表現HLA-G之標靶細胞之殺死。資料顯示兩種抗體均誘導標靶細胞之類似濃度依賴性耗竭。去岩藻糖基化HLA-G02處理在0.1 μg/mL下引起22.0±10.8%之目標細胞耗竭且在10 μg/mL下引起44.8±8.6%之目標細胞耗竭，且抗CD47處理分別引起11.3±10.4%及43.3±10.8%之目標細胞耗竭。結果繪示於圖 18中。

目前正在臨床試驗中測試作為癌症治療劑之抗CD47抗體。吾人隨後研究了去岩藻糖基化HLA-G02與抗CD47抗體之組合處理是否使表現HLA-G之細胞之吞噬作用增加至大於任一單獨藥劑下所觀測到之水準。在此實驗中，用抗CD47抗體(1 μg/mL)與遞增濃度之去岩藻糖基化HLA-G02或HLA-G02 IgG4P FALA之組合來處理表現HLA-G之細胞。代表性資料展示於圖 19中，且來自若干供體之組合資料展示於圖 20中。

包括IgG4P FALA型式以確定在去岩藻糖基化HLA-G02下觀測到的吞噬作用之增加是否取決於其活性Fc型式。單獨的去岩藻糖基化HLA-G02在其去岩藻糖基化IgG1型式下誘導濃度依賴性吞噬作用。HLA-G02 IgG4P FALA亦增加吞噬作用，但程度較小。不同於IgG1，IgG4P FALA無法誘導經由Fc受體之ADCP，其明確表明在HLA-G02 IgG4P FALA下觀測到的吞噬作用係藉由阻斷HLA-G與巨噬細胞上之其受體ILT2/4接合而介導。另外，資料顯示抗CD47與呈任一型式之去岩藻糖基化HLA-G02的組合引起表現HLA-G之細胞之吞噬作用增強。

作為總結，研究顯示去岩藻糖基化HLA-G02及其習知(亦即岩藻糖基化)對應物均誘導表現HLA-G之細胞之特異性抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。HLA-G02之IgG4P FALA型式亦增加吞噬作用，但程度較小。資料指示去岩藻糖基化HLA-G02及其岩藻糖基化對應物經由兩種作用機制促進吞噬作用：(1)經由Fc受體介導之抗體依賴性細胞吞噬作用，及(2)藉由阻斷HLA-G與其受體之相互作用。

另外，吾人已發現將去岩藻糖基化HLA-G02與靶向吞噬細胞檢查點CD47之抗體組合在一起會增加表現HLA-G之細胞之吞噬作用。

實例 28 ： 去岩藻糖基化 HLA-G02 介導之細胞介素釋放細胞介素釋放分析(CRA)提供一種評估新穎治療劑誘導免疫細胞之細胞介素釋放之潛力的方法。通常，此等分析使用周邊血液單核細胞(PBMC)或全血，用所關注治療劑處理，隨後量測促發炎細胞介素。

此研究旨在評估可溶性去岩藻糖基化HLA-G02對十六個人類PBMC供體之促發炎細胞介素釋放的影響且與已知陽性對照之細胞介素含量進行比較。使用MSD多重夾心免疫分析來量測細胞介素釋放。亦在經去岩藻糖基化HLA-G02處理之PBMC與JEG3細胞(其表現高水準之HLA-G)共培養之後量測細胞介素釋放水準。此共培養旨在模擬遵循活性Fc耗竭機制之HLA-G陽性腫瘤微環境中的潛在細胞介素釋放水準。

方法：PBMC根據標準方法自人類全血分離。在RPMI完全培養基中培養JEG3細胞且將其維持在4×10 ⁵個細胞/毫升之密度。想96孔平底組織培養盤之適當孔中添加JEG3細胞(50 μL/孔)。對於僅PBMC孔，塗鋪50 μL RPMI完全培養基(RPMI 1640 (500 mL) + 10% FBS (50 mL) + 2 mM Glutamax ^™(5 mL))代替JEG3細胞。

將去岩藻糖基化HLA-G02稀釋至200 μg/mL之起始濃度(最大最終濃度50 μg/mL之4×)，隨後連續稀釋至100、40、4、0.4、0.04、0.004及0.0004 μg/ml (得到25、10、1、0.1、0.01、0.001及0.0001 μg/ml之最終濃度)。僅製備最高抗體濃度(200 μg/mL)之同型對照抗體及抗CD3抗體以分別用作陰性及陽性對照。作為替代陽性對照，亦將LPS在RPMI完全培養基中稀釋至400 ng/mL (最終濃度100 ng/mL之4×)。一旦稀釋，便將測試抗體/物質一式三份地塗鋪(50 μL/孔)在96孔平底分析盤中之JEG3或培養基上方。

隨後將PBMC以100 μL (1×10 ⁵個)細胞/孔塗鋪至平底盤中之抗體上方。各孔中之總體積為200 µL。隨後將分析盤轉移至37℃、5% CO ₂、100%濕度之培育箱中24小時。

24小時後，96孔培養盤以400g離心3分鐘，以確保各孔中之上清液中無細胞殘留。將來自各孔之150 μL上清液轉移至新的96孔盤中，且將樣品儲存在-20℃下直至進行多重分析。

根據製造商之說明書，使用MSD Proinflammatory Panel 1套組來量測上清液中之細胞介素含量。

結果：在表現HLA-G之JEG3細胞存在或不存在下用50 μg/mL去岩藻糖基化HLA-G02、50 μg/mL同型對照、50 μg/mL抗CD3或100 ng/mL LPS處理之16個PBMC供體釋放的10種促發炎細胞介素之平均含量概述於下表35中。在JEG3細胞存在及不存在下0.0001至50 μg/ml濃度範圍之HLA-G02產生的關鍵細胞介素IFNγ、TNFα、IL2、IL6、IL8及IL10之平均值概述於圖 21中。表 35 ： 10 種所 釋放促發炎細胞介素之平均含量

16 個供體( 三次重複實驗 ) 之平均值	僅PBMC	PBMC+JEG3 細胞
LPS	CD3	同型	aFHLA-G02	LPS	CD3	同型	aFHLA-G02
IFN-γ(pg/mL)	8260.6	7399.0	302.0	56.8	26772.7	8792.0	81.0	177.9
IL-10(pg/mL)	148.0	64.4	4.5	3.1	522.5	112.0	2.3	26.9
IL-12p70(pg/mL)	30.8	5.9	0.7	0.7	24.2	9.2	3.2	6.5
IL-13(pg/mL)	95.4	58.6	11.5	26.1	168.0	95.4	27.5	120.1
IL-1β(pg/mL)	1401.9	34.7	5.9	3.1	1065.1	30.3	12.6	10.4
IL-2(pg/mL)	85.5	212.0	26.5	6.6	274.8	247.2	7.0	17.1
IL-4(pg/mL)	13.0	3.8	0.5	0.2	21.2	6.6	0.3	1.3
IL-6(pg/mL)	7070.3	55.0	15.7	10.5	7392.0	114.7	52.8	41.5
IL-8(pg/mL)	10119.9	8234.4	681.5	1531.1	35308.6	8618.2	565.1	7706.5
TNF-α(pg/mL)	1712.5	865.9	68.0	55.5	844.0	415.2	14.4	64.6

經50 μg/mL去岩藻糖基化HLA-G02處理之PBMC產生低含量的十種促發炎細胞介素(IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL4、IL-6、IL-8及TNF-α)。此細胞介素釋放水準與在PBMC經同型對照抗體處理時觀測到的水準相當。視所測試之細胞介素而定，用50 μg/mL去岩藻糖基化HLA-G02處理後產生的量分別比抗CD3及脂多糖(LPS)陽性對照低2至130倍或低3.5至700倍。

PBMC與JEG3細胞之共培養引起用去岩藻糖基化HLA-G02處理後之促發炎細胞介素釋放之增加。與僅PBMC相比，在50 mg/ml之PBMC-JEG3共培養物之上清液中，9/10細胞介素(除TNF-α外之所有者)之含量增加。視所量測之細胞介素而定，與經去岩藻糖基化HLA-G02處理之僅PBMC相比，此增加在3倍(IFN-γ、IL1-β、IL-2)至9倍(IL-10)變化之範圍內。另外，在HLA-G02之濃度範圍內，在表現HLA-G之JEG3細胞存在下，細胞介素之含量增加。

在表現HLA-G之細胞存在下觀測到的細胞介素釋放增加提供促發炎細胞介素釋放水準之指示，該釋放可由於經去岩藻糖基化HLA-G02處理之HLA-G陽性腫瘤中Fc介導之活性而出現。

本發明中包括的 12389 抗體序列及人類構架展示於下表36中(「(nt.)」：核酸序列)：表 36 ：

名稱	序列	SEQ ID NO:
CDR-L1	QASQSIYSYLS	1
CDR-L2	KASTLAS	2
CDR-L3	QNHWNVGGNGWP	3
CDR-H1	GIDLSSNAMS	4
CDR-H2	TISSGGRTYYASWAKG	5
CDR-H3	GDGATGFNI	6
兔VL	ALVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSIYSYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECGDAATYYCQNHWNVGGNGWPFGGGTEVVVK	7
兔VL (nt.)	gcccttgtgatgacccagactccagcctccgtgtctgaacctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtcagagcatttacagctacttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctaatctacaaggcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacctggagtgtggcgatgctgccacttactactgtcaaaatcattggaatgttggtggtaatggttggcctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa	8
兔輕鏈	ALVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSIYSYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECGDAATYYCQNHWNVGGNGWPFGGGTEVVVKRTPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC	9
兔輕鏈(nt.)	gcccttgtgatgacccagactccagcctccgtgtctgaacctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtcagagcatttacagctacttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctaatctacaaggcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacctggagtgtggcgatgctgccacttactactgtcaaaatcattggaatgttggtggtaatggttggcctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcatcttcccaccagctgctgatcaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcaataggggtgactgt	10
兔VH	QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSNAMSWVRQAPGEGLEWIGTISSGGRTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKIPSPTTEDTATYFCGRGDGATGFNIWGPGTLVTVSS	11
兔VH (nt.)	cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcacagtctctggaatcgacctcagtagcaatgcaatgagctgggtccgccaggctccaggggaggggctggaatggatcggaaccattagtagtggtggtaggacatactacgcgagctgggcaaaaggccgattcaccatctccaaaacctcgaccacggtggatctgaaaatccccagtccgacaaccgaggacacggccacctatttctgtggcagaggagatggtgctactggctttaacatctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcgagt	12
兔重鏈(Fab)	QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSNAMSWVRQAPGEGLEWIGTISSGGRTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKIPSPTTEDTATYFCGRGDGATGFNIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKP	13
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人類IGKV1D-13 IGKJ4 受體構架	AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK	103
人類IGKV1D-13 IGKJ4 受體構架(nt.)	gccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcctccagtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa	104
人類IGHV3-66 IGHJ4 受體構架	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYFDYWGQGTLVTVSS	105
人類IGHV3-66 IGHJ4 受體構架(nt.)	gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccgtcagtagcaactacatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagttatttatagcggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggcagattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatcttcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagatactttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctca	106

圖 1 ：HLA-G同功異型物(Carosella等人, Blood, 第111卷, n˚ 10, 2008之圖1B) 圖 2.抗體12389之兔可變輕鏈序列之人類化。移植物12389gL1、gL2及gL3為使用IGKV1D-13人類生殖系作為受體構架的抗體12389之兔可變輕鏈之人類化移植物。CDR以粗體/底線展示。供體殘基以粗體/斜體展示且加灰色陰影：V3及Q70。圖 3. 抗體12389之兔可變重鏈序列之人類化。移植物12389gH1、gH4、gH5、gH6、gH8、gH9、gH11、gH12、gH13、gH14、gH15及gH16為使用IGHV3-66人類生殖系作為受體構架的抗體12389之兔可變重鏈之人類化移植物。CDR以粗體/底線展示。供體殘基以粗體/斜體展示且加灰色陰影：V24、I48、G49、K71、S73、V78及G96。圖 4.50個不同供體之PBMC分析中HLA-G02之特異性。結果以各供體及抗體之各CD4+細胞群體之MFI表示。圖 5. HLA-G02之特異性；與細胞上表現之HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3及HLA-G4結合(圖5A)。與HLA-G2結合(圖5B)。圖 6.用不同抗HLA-G抗體或IgG1同型對照抗體處理後Epcam+ GFP+ HCT116標靶細胞之耗竭百分比。在1 µg/ml (白色條柱)或0.01 µg/ml (條紋條柱)兩種不同濃度下測試各抗體。E:T比率為3.5:1。各條柱表示三個資料點之平均值(及範圍)，且各圓點/正方形為個別重複實驗。資料來自一個代表性供體。HLA-G01至HLA-G08由其各別ID編號(01至08)表示。圖 7 .來自三個獨立實驗(3個不同供體)的用抗HLA-G抗體HLA-G01及HLA-G02或IgG1同型對照抗體處理後Epcam+ GFP+ HCT116標靶細胞之耗竭百分比。在1 µg/ml (圖7A)或0.01 µg/ml (圖7B)下測試抗體。E:T比率在2.5:1與3:1之間。各條柱表示來自個別實驗之資料的平均值(及範圍)，且各圓點、正方形或三角形為個別重複實驗。圖 8. 與同型對照IgG1相比，用抗HLA-G抗體HLA-G01及HLA-G02滴定處理後Epcam+ GFP+ HCT116細胞之耗竭百分比(豎軸) (橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度)。E:T比率為4:1。各點表示3個重複實驗之平均值(及範圍)。所示資料來自單一代表性供體。圖 9A. 用習知HLA-G02 IgG1 (實線)或去岩藻糖基化HLA-G02 IgG1 (「aF HLA-G02」，虛線)處理後JEG3細胞之耗竭百分比(豎軸)。橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度。E:T比率為10:1。各點表示2個重複實驗之平均值(及範圍)。所示資料來自單一代表性供體。圖 9B.與同型對照IgG1相比，用習知HLA-G02 IgG1 (實線)或去岩藻糖基化HLA-G02 IgG1 (「aF HLA-G02」，虛線)處理後Epcam+ GFP+ HCT116細胞之耗竭百分比(豎軸)。橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度。E:T比率為5:1。各點表示3個重複實驗之平均值(及範圍)。所示資料來自單一代表性供體。圖 10. 與抗CD47抗體(「aCD47」)及同型對照IgG1相比，HLA-G02對經模擬物轉染(圖10A)及經HLA-G/B2m轉染(圖10B)之K562標靶細胞之HLA-G特異性吞噬作用活性的滴定。豎軸：CTY+CD11b+雙陽性細胞之百分比；橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度。圖 11 .與抗CD47抗體及同型對照IgG1相比，習知及去岩藻糖基化(aF)型式之HLA-G02對經模擬物轉染(圖11A)及表現HLA-G (圖11B)之K562標靶細胞之HLA-G特異性吞噬作用活性的滴定。豎軸：CTY+CD11b+雙陽性細胞之百分比；橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度。圖 12.VR12389 (黑色表面表示)阻斷HLA-G與ILT-2及ILT4之相互作用。圖12A：ILT2 (草圖，白色)與HLA-G (草圖，灰色)及β2M (網狀，灰色)之複合物之晶體結構(PDB ID 6AEE)。圖12B：VR12389與HLA-G及β2M之複合物之晶體結構的重疊表明VR12389 (表面，黑色)阻斷ILT2與HLA-G之相互作用。圖12C：ILT4 (草圖，白色)與HLA-G (草圖，灰色)及β2M (網狀，灰色)之複合物之晶體結構(PDB ID 2DYP)。圖12D：VR12389與HLA-G及β2M之複合物之晶體結構的重疊表明VR12389 (表面，黑色)阻斷ILT4與HLA-G之相互作用。圖 13. 腫瘤細胞殺死分析。圖13A：在RCC中抗PDL1獲得之資料。圖13B：在CRC中抗PDL1獲得之資料。圖13C：在RCC中HLA-G02獲得之資料。圖13D：在CRC中HLA-G02獲得之資料。資料以死細胞%之形式呈現，同型對照為淺灰色，抗PDL1或HLA-G02為深灰色，且其中觀測到1.5倍或更高倍數細胞死亡增加的經抗PDL1或HLA-G02處理之培養物為黑色。圖 14 .在用習知或去岩藻糖基化HLA-G02處理後2.5至3小時之後，不同效應子:標靶比率下經HLA-G轉染之HCT116細胞之耗竭。橫軸：E:T比率=效應子:標靶比率。藉由流式細胞測量術測定活HLA-G GFP+ HCT116細胞之數目，且相對於無抗體對照計算耗竭百分比(豎軸)。所示資料來自單一供體(1個)。各資料點表示3個重複實驗之平均值。誤差條表示95%信賴區間。圖 15.10個不同供體之PBMC分析中去岩藻糖基化HLA-G02 (「aF HLA-G02」)之特異性。結果以各供體及抗體之各CD4+細胞群體之MFI表示。圖 16 .由去岩藻糖基化HLA-G02介導之CDC。圖16A：血清活性對HLAG-β2m-Reh細胞溶解之影響(濃度-反應曲線描繪在活化或加熱不活化血清存在下HLAG-β2m-Reh之aF HLA-G02介導之CDC。豎軸：相對於最小及最大對照標準化之溶解(%) (N = 1，4-PL擬合)；橫軸：抗體濃度[M])。圖16B：aF HLA-G02介導之溶解對HLA-G之依賴性(濃度-反應曲線描繪HLAG-β2m-Reh或Reh細胞之aF HLA-G02介導之CDC。豎軸：相對於最小及最大對照標準化之溶解(%) (N = 1，4-PL擬合)；橫軸：抗體濃度[M])。圖16C：HLAG-β2m-Reh細胞之aF HLA-G02介導之CDC (濃度-反應曲線描繪HLAG-β2m-Reh之aF HLA-G02介導之CDC。相對於最小及最大對照標準化之溶解(%) (N = 3，平均值±SEM，4-PL擬合)；橫軸：抗體濃度[M])。圖 17 .與αCD47 Ab相比，HLA-G02及去岩藻糖基化HLA-G02對表現HLA-G之標靶細胞或經模擬物轉染之細胞之吞噬作用的濃度依賴性作用。圖17A及圖17B：代表性資料(平均值±SD) (豎軸：CTY+CD11b+雙陽性細胞之百分比；橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度)。圖17C及圖17D：在兩個獨立實驗中一式兩份使用來自三個不同供體之單核球產生的結合資料(豎軸：相對於同型對照調整之吞噬作用百分比=(Ab平均值-同型平均值)±SD；橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度)。圖 18 .由去岩藻糖基化HLA-G02介導之標靶細胞殺死。培育過夜後，在不同去岩藻糖基化HLA-G02或αCD47濃度(橫軸，以µg/ml為單位)下ADCP引起的表現HLA-G之標靶細胞之耗竭百分比(來自四個不同供體，一式兩份，兩個獨立實驗)。平均值及標準差與同型對照相比。圖 19 .與各別同型對照相比，去岩藻糖基化HLA-G02及HLA-G02 IgG4P FALA對單獨的表現HLA-G之細胞(圖19A)或對與抗CD47 Ab (1 μg/mL)組合的表現HLA-G之細胞(圖19B)之吞噬作用的濃度依賴性作用的代表性資料。豎軸：CTY+CD11b+雙陽性細胞之百分比；橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度。圖 20 .用單獨的去岩藻糖基化HLA-G02或與抗CD47抗體組合之去岩藻糖基化HLA-G02 (以1 μg/mL為單位)處理的表現HLA-G之細胞之吞噬作用。圖20A呈現去岩藻糖基化HLA-G02之資料(三個供體，一式兩份，兩個獨立實驗)。圖20B呈現HLA-G02 IgG4P FALA之資料(來自四個供體之合併資料，各供體重複分析兩次，三個獨立實驗)。吞噬作用值(%，豎軸)相對於各別同型對照進行調整(Ab平均值-同型平均值)且呈現為平均值±SD。橫軸：以µg/ml為單位之抗體濃度。圖 21.在去岩藻糖基化HLA-G02之濃度範圍(橫軸，µg/ml)內，在存在及不存在JEG3細胞下在PBMC培養物中產生的細胞介素之水準(豎軸，pg/ml) (圖21A：IFN γ；圖21B：TNFα；圖21C：IL-2；圖21D：IL-6；圖21E：IL-8；圖21F：IL-10)。值呈現為所有16個PBMC供體之平均值+/-標準差。點線指示在50 µg/ml之去岩藻糖基化同型對照抗體、50 µg/ml之抗CD3或100 ng/ml之LPS存在下產生的各細胞介素之平均水準。

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Claims

一種特異性結合於HLA-G之抗體，其中該抗體包含： a. 輕鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1； ii. 包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2；及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b. 重鏈可變區，其包含： i. 包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1； ii. 包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2；及 iii. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
如請求項1之抗體，其中該抗體阻斷HLA-G與ILT2及ILT4之結合及/或抑制HLA-G介導之免疫遏制功能。
如請求項1或請求項2之抗體，其中該抗體針對HLA-G之平衡解離常數(KD)小於10 nM。
如請求項1至3中任一項之抗體，其特異性結合於HLA-G α3域。
如請求項1至4中任一項之抗體，其中該抗體結合於HLA-G之抗原決定基，該抗原決定基包含參考SEQ ID NO: 107之殘基F195及Y197。
如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體結合於HLA-G之抗原決定基，該抗原決定基包含HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257。
如請求項6之抗體，其中該抗原決定基由X射線結晶學表徵。
如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為嵌合或人類化抗體。
如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含： a. 包含SEQ ID NO: 19或15或23之輕鏈可變區；及/或 b. 包含SEQ ID NO: 93、27、33、57、69、75、81或87之重鏈可變區。
如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93之重鏈可變區。
如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為全長抗體。
如請求項11之抗體，其中該全長抗體為IgG1、IgG1 LALA、IgG1LALAGA、IgG4、IgG4P或IgG4P FALA。
如請求項12之抗體，其中該抗體為IgG1。
如請求項13之抗體，其中該抗體為去岩藻糖基化IgG1。
如請求項13或請求項14之抗體，其中該抗體包含： a. 包含SEQ ID NO: 21或17或25之輕鏈；及/或 b. 包含SEQ ID NO: 95、29、35、59、71、77、83或89之重鏈。
如請求項13或請求項14之抗體，其中該抗體包含： a. 與SEQ ID NO: 21或17或25包含至少90%一致性或相似性之輕鏈；及/或 b. 與SEQ ID NO: 95、29、35、59、71、77、83或89包含至少90%一致性或相似性之重鏈。
如請求項13或請求項14之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93之重鏈可變區，且其中該輕鏈及該重鏈之其餘部分分別與SEQ ID NO: 21及95具有至少90%一致性或相似性。
如請求項13或請求項14之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈。
如請求項13至18中任一項之抗體，其中該抗體抑制HLA-G介導之免疫遏制功能且藉由使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭而抑制腫瘤生長。
如請求項14之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 95之重鏈，且其中該抗體具有改良之ADCC及/或ADCP功能，及/或具有使表現HLA-G之腫瘤細胞耗竭之經改良能力。
如請求項1至10中任一項之抗體，其中該抗體為Fab、Fab'、F(ab') ₂、dsFv、scFv或dsscFv。
一種抗體，其與如請求項1之抗體交叉競爭結合於HLA-G，或其結合於HLA-G之抗原決定基，該抗原決定基包含HLA-G (SEQ ID NO: 107)之V194、F195、Y197、E198、Q224、Q226、D227、V248、V249、P250及Y257。
一種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項1至22中任一項之抗體。
如請求項23之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼： a. 輕鏈可變區，其中該聚核苷酸： i. 與SEQ ID NO: 20、16或24至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 20、16或24或由其組成；或 b. 重鏈可變區，其中該聚核苷酸： i. 與SEQ ID NO: 94、28、34、58、70、76、82或88至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 94、28、34、58、70、76、82或88或由其組成。
如請求項23之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼： a. 輕鏈，其中該聚核苷酸： i. 與SEQ ID NO: 22、18或26至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 22、18或26或由其組成；或 b. 重鏈，其中該聚核苷酸： i. 與SEQ ID NO: 96、30、36、60、72、78、84或90至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 96、30、36、60、72、78、84或90或由其組成。
一種選殖或表現載體，其包含一或多種如請求項23至25中任一項之聚核苷酸。
一種宿主細胞，其包含一或多種如請求項23至25中任一項之聚核苷酸或一或多種如請求項26之表現載體。
一種宿主細胞，其包含一或多種如請求項23至25中任一項之聚核苷酸或一或多種如請求項26之表現載體，其中該宿主細胞已經基因修飾以降低或消除α1,6岩藻糖基轉移酶之功能。
一種用於產生如請求項1至22中任一項之抗體的方法，其包含在適合產生該抗體之條件下培養如請求項27或28之宿主細胞及分離該抗體。
一種用於產生包含如請求項1至22中任一項之抗體的醫藥組合物的方法，其包含如請求項29之方法步驟，且進一步包含將該抗體調配為醫藥組合物。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至22中任一項之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
一種如請求項1至22中任一項之抗體或如請求項31之醫藥組合物的用途，其係用於製造用於療法之藥劑。
一種如請求項1至22中任一項之抗體或如請求項31之醫藥組合物的用途，其係用於製造用以治療特徵為過度表現HLA-G之疾病的藥劑。
一種如請求項1至22中任一項之抗體或如請求項31之醫藥組合物的用途，其係用於製造藥劑。
一種如請求項1至22中任一項之抗體或如請求項31之醫藥組合物的用途，其係用於製造用以治療實體腫瘤之藥劑。
一種如請求項1至22中任一項之抗體或如請求項31之醫藥組合物的用途，其係用於製造用以治療腎透明細胞癌(Renal clear cell carcinoma；RCC)、結腸直腸癌(Colorectal carcinoma；CRC)、胰臟癌、卵巢癌、頭頸癌、胃癌或肝細胞癌之藥劑。
一種用於診斷腎透明細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、卵巢癌、頭頸癌、胃癌或肝細胞癌之方法，其係藉由使用如請求項1至22中任一項之抗體或如請求項31之醫藥組合物。