KR20240046577A - 항-hla-g 항체 - Google Patents

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토마스 콜리
니샤 디디
칼 브렌단 도일
데이비드 폴 험프리스
프리에크 게일 르
루스 맥켈혼
빅토리아 오다우드
클레어 톰슨
케리 루이스 타이슨
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Abstract

본 발명은 HLA-G에 대한 항체 및 이를 포함하는 제제에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 요법, 특히 고형 종양 치료에서의 HLA-G 항체 및 제제의 용도에 관한 것이다.

Description

항-HLA-G 항체
본 발명은 HLA-G에 대한 항체 및 이를 포함하는 제제에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 요법, 특히 고형 암 치료에서의 HLA-G 항체 및 제제의 용도에 관한 것이다.
클래스 I 인간 백혈구 항원(HLA-I)은 고전적인 항원인 HLA-A, HLA-B, HLA-C뿐만 아니라, 비고전적인 항원인 HLA-E, HLA-F, HLA-G를 포함한다. 인간 백혈구 항원 G(HLA-G)는 인간에서 발현되고 HLA-G 유전자에 의해 코딩되는 비고전적인 HLA 클래스 I 분자이다. HLA-G는 경쇄, 즉 베타-2-마이크로글로불린(B2m)과 회합된 3개의 구형 도메인(α1, α2 및 α3)을 나타내는 중쇄를 포함하는 이종이량체 분자이다.
HLA-G의 7가지 이소형이 확인되었으며, 이중 4개는 막 결합형(HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4)이고, 3개는 가용성(HLA-G5, HLA-G6 및 HLA-G7)이며, 이는 HLA-G 1차 전사체의 선택적 스플라이싱의 결과이다.
HLA-G는 일반적으로 태반의 세포영양막에서 발현된다. HLA-G의 발현은 염증성 질환 및 암과 같은 병리학적 상태와 관련이 있는 것으로 보고되었다. 특히, HLA-G는 고형 암에서 특이적으로 상향조절되는 관용원성(tolerogenic) 분자이며, 예후가 좋지 않은 것으로 보고되었다.
HLA-G는 다양한 골수 및 림프 세포에서 발현되는 적어도 3개의 수용체에 결합하여 면역 조절 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
- 림프구(B 세포, 일부 T 세포 및 NK 세포) 및 골수 세포(단핵구, 대식세포 및 수지상 세포)에서 발현되는, ILT2 또는 CD85j라고도 하는 억제 수용체 LILRB1(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B1의 경우),
- 골수 세포(단핵구, 대식세포 및 수지상 세포)에서 발현되는, ILT4 또는 CD85d라고도 하는 억제 수용체 LILRB2(백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B2); 및
- NK 세포에서 발현되는 조절 수용체 KIR2DL4 또는 CD158d.
HLA-G는 그의 억제 수용체의 직접적인 결합을 통해 면역 세포의 기능을 억제한다. HLA-G는 주로 ILT2 및 ILT4와 그의 α3 도메인의 상호작용에 의해 매개되는 관용원성 기능을 갖는 것으로 보고되었다. ILT2는 B2m과 회합하는 HLA-G 분자만 인식하는 반면, ILT4는 B2m 회합 HLA-G 분자와 B2m 미회합 HLA-G 분자를 모두 인식한다.
이러한 면역 억제 기능을 통해 종양에 의한 HLA-G 발현은 면역 억제 환경을 유도하여 종양 면역 탈출을 허용하고 궁극적으로 환자의 생존을 감소시킬 수 있다. 따라서, HLA-G의 항체 매개 차단은 종양의 국소 면역 억제를 완화하고 항암 면역의 발달을 촉진하며 지속적인 요법을 제공하는 효과적인 전략을 제공할 수 있다.
이론적으로 HLA-G 차단 항체의 항종양 효과는 HLA-G+ 종양 세포의 직접 사멸을 유도할 수 있도록 면역 이펙터 세포에 FcγR을 결합시킬 수 있는 활성 Fc 성분을 포함시킴으로써 증가될 수 있지만, 췌장 및 뇌하수체를 포함한 많은 정상 조직에서 보고된 HLA-G mRNA 및 단백질의 발현은 활성 Fc의 사용이 허용할 수 없는 독성을 초래할 수 있으므로 요법에 사용하는 것이 불가능함을 시사한다.
HLA-G는 다른 HLA-I 분자(즉, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E 및 HLA-F)와 높은 유사성을 공유한다. HLA-G 단백질의 338개 아미노산 위치 중에서 20개만이 HLA-G에 고유하고 임의의 다른 ~5000개의 인간 HLA-I 분자에는 해당 위치에 존재하지 않는 잔기를 갖는다. 이로 인해 다른 HLA-I 분자에 대한 교차 반응 없이 HLA-G에 대한 특이성이 높은 항체를 생산하는 것이 매우 어렵다.
시판되는 HLA-G 항체가 현재 이용 가능하다. 그러나, 일부 항체는 HLA-G에 대한 특이성이 부족한 것으로 보고되었으며(예를 들어, 다른 HLA-I 분자와 교차 반응성), 모든 항체가 α3 도메인의 HLA-G ILT2/4 결합 부위에서 멀리 떨어져 있는 HLA-G의 α1 및 α2 도메인에 에피토프를 가지고 있고, 따라서 HLA-G와 ILT2 및/또는 ILT4 사이의 상호작용을 차단할 것으로는 예상되지 않는다. HLA-G α1 도메인의 에피토프에 결합하는 항체 87G는 면역 세포 기능의 HLA-G 억제를 완화하는 것으로 보고되었다. 그러나, 87G 및 기타 시판되는 HLA-G 항체가 HLA-G ILT2/4 상호작용을 차단할 수 있다는 보고는 존재하지 않는다. 시판되는 항체는 특이성 및/또는 차단 활성이 부족하여 HLA-G 치료 항체의 개발에 적합하지 않다.
HLA-G에 결합하는 다른 항체는 WO19202040 및 W02020069133에 보고되었으며, 이러한 항체는 하나 이상의 HLA-G 활성을 조절하는 것으로 보이지만 HLA-G 상의 결합 부위(즉, 에피토프)는 특성화되지 않았다.
현재까지, HLA-G에 대한 항체의 효능은 환자에서, 특히 고형 암 치료에 대해 입증되지 않았다.
따라서, HLA-G에 결합하고 요법에 유용한 생물학적 특성, 예를 들어 개선된 약동학적 특성 및/또는 개선된 생물학적 기능(예를 들어, 특이성, 결합 친화도, 중화 및/또는 세포독성 및 식세포 작용) 및/또는 인간에 대한 감소된 독성을 갖는 항체를 제공할 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 본원에서 설명되는 바와 같은 구조적 및 기능적 특성, 특히 HLA-G에 대한 높은 특이성, HLA-G와 그의 수용체 ILT2 및 ILT4의 상호작용을 차단하는 능력을 갖는, 요법, 특히 고형 암의 치료에 유용한 HLA-G에 대한 새로운 항체를 제공함으로써 상기 확인된 필요성을 해결한다. 본 발명자들은 본 발명의 항체에 의해 인식되는 에피토프가 뇌하수체 및 췌장을 포함한 정상 조직에 존재하지 않는다는 증거를 제공함으로써, 환자에서 종양 세포 사멸을 유도할 수 있는 활성 Fc를 포함하는 항체 형식의 사용을 처음으로 뒷받침한다.
특히, 본 발명은 다음을 포함하는, 인간 HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다:
a. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호(SEQ ID NO:) 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및
b. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3.
도 1: HLA-G 이소형(문헌 [Carosella et al., Blood, Vol. 111, n°10, 2008]의 도 1b).
도 2. 항체 12389의 토끼 가변 경쇄 서열의 인간화. 이식편 12389gL1, gL2 및 gL3은 수용자 프레임워크로서 IGKV1D-13 인간 생식계열을 사용하는 항체 12389의 토끼 가변 경쇄의 인간화 이식편이다. CDR은 굵은 글씨/밑줄로 표시되어 있다. 공여자 잔기는 굵은 글씨/이탤릭체로 표시되며, 회색 음영으로 표시된다: V3 및 Q70.
도 3. 항체 12389의 토끼 가변 중쇄 서열의 인간화. 이식편 12389gH1, gH4, gH5, gH6, gH8, gH9, gH11, gH12, gH13, gH14, gH15 및 gH16은 IGHV3-66 인간 생식계열을 수용자 프레임워크로서 사용하는 항체 12389의 토끼 가변 중쇄의 인간화 이식편이다. CDR은 굵은 글씨/밑줄로 표시되어 있다. 공여자 잔기는 굵은 글씨/이탤릭체로 표시되며, 회색 음영으로 표시된다: V24, I48, G49, K71, S73, V78 및 G96.
도 4. 50명의 상이한 공여자의 PBMC 검정에서 HLA-G02의 특이성. 결과는 각각의 공여자 및 항체에 대한 각각의 CD4+ 세포 집단의 MFI로 표시된다.
도 5. HLA-G02의 특이성; 세포에 발현된 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 및 HLA-G4에 대한 결합(도 5a), HLA-G2에 대한 결합(도 5b).
도 6. 다양한 항-HLA-G 항체 또는 IgG1 이소형 대조군 항체로 처리한 후 고갈된 Epcam+ GFP+ HCT116 표적 세포의 백분율. 각각의 항체는 1 μg/ml(흰색 막대) 또는 O.O1 μg/ml(줄무늬 막대)의 두 가지 상이한 농도에서 시험되었다. E:T 비는 3.5:1이었다. 각각의 막대는 3개 데이터 점의 평균(및 범위)을 나타내고, 각각의 점/정사각형은 개별 시험물이다. 데이터는 대표적인 단일 공여자로부터 나온 것이다. HLA-G01 내지 HLA-G08은 각각의 ID 번호(01 내지 08)로 표시된다.
도 7. 3개의 개별 실험(3명의 다른 공여자)에서 얻은 항-HLA-G 항체 HLA-G01 및 HLA-G02 또는 IgG1 이소형 대조군 항체로 처리한 후 고갈된 Epcam+ GFP+ HCT116 표적 세포의 백분율. 항체는 1 μg/ml(도 7a) 또는 O.O1 μg/ml(도 7b)에서 시험되었다. E:T 비는 2.5 내지 3:1이었다. 각각의 막대는 개별 실험의 데이터의 평균(및 범위)을 나타내며, 각각의 점, 정사각형 또는 삼각형은 개별 시험물이다.
도 8. 이소형 대조군 IgG1과 비교한, 항-HLA-G 항체 HLA-G01 및 HLA-G02의 적정으로 처리한 후 Epcam+ GFP+ HCT116 세포의 고갈 백분율(세로축)(가로축: μg/ml 단위의 항체 농도). E:T 비는 4:1이었다. 각각의 점은 3회 반복 시험의 평균(및 범위)을 나타낸다. 표시된 데이터는 대표적인 단일 공여자로부터 얻은 것이다.
도 9b. 통상적인 HLA-G02 IgG1(실선) 또는 탈푸코실화된(아푸코실화된)(afucosylated) HLA-G02 IgG1("aF HLA-G02", 점선)로 처리한 후 JEG3 세포의 고갈 백분율(세로축). 가로 축: μg/ml 단위의 항체 농도. E:T 비는 10:1이었다. 각각의 점은 2회 반복 시험의 평균(및 범위)을 나타낸다. 대표적인 단일 공여자의 데이터가 표시된다.
도 9a. 이소형 대조군 IgG1과 비교한, 통상적인 HLA-G02 IgG1(실선) 또는 탈푸코실화된 HLA-G02 IgG1("aF HLA-G02", 점선)로 처리한 후 Epcam+ GFP+ HCT116 세포의 고갈 백분율(세로 축). 가로 축: μg/ml 단위의 항체 농도. E:T 비는 5:1이었다. 각각의 점은 3회 반복 시험의 평균(및 범위)을 나타낸다. 대표적인 단일 공여자의 데이터가 표시된다.
도 10. 항-CD47 항체("aCD47") 및 이소형 대조군 IgG1과 비교한 모의(Mock) 형질감염된(도 10a) 및 HLA-G/B2m 형질감염된 K562 표적 세포(도 10b)에 대한 HLA-G02의 HLA-G 특이적 식세포 작용 활성의 적정. 수직 축: CTY+CD11b+ 이중 양성 세포의 백분율; 가로 축: μg/ml 단위의 항체 농도.
도 11. 항-CD47 항체 및 이소형 대조군 IgG1과 비교한 모의 형질감염된(도 11a) 및 HLA-G 발현 K562 표적 세포(도 11b)에 대한 HLA-G02의 통상적인 및 탈푸코실화(aF) 형식의 HLA-G 특이적 식세포 작용 활성의 적정. 수직 축: CTY+CD11b+ 이중 양성 세포의 백분율; 가로 축: μg/ml 단위의 항체 농도.
도 12. VR12389(검은색 표면 표시)는 HLA-G와 ILT-2 및 ILT4의 상호작용을 차단한다. 도 12a: HLA-G(카툰, 회색) 및 β2M(메쉬, 회색)과 복합체를 이루는 ILT2(카툰, 흰색)의 결정 구조(PDB ID 6AEE). 도 12b: HLA-G 및 β2M과 복합체를 이루는 VR12389의 결정 구조와의 중첩은 VR12389(표면, 검정색)가 ILT2와 HLA-G의 상호작용을 차단한다는 것을 보여준다. 도 12c: HLA-G(카툰, 회색) 및 β2M(메쉬, 회색)과 복합체를 이루는 ILT4(카툰, 흰색)의 결정 구조(PDB ID 2DYP). 도 12d: HLA-G 및 β2M과 복합체를 이루는 VR12389의 결정 구조와의 중첩은 VR12389(표면, 검정색)가 ILT4와 HLA-G의 상호작용을 차단한다는 것을 보여준다.
도 13. 종양 세포 사멸 검정. 도 13a: RCC로부터 항-PDL1로 얻은 데이터. 도 13b: CRC로부터 항-PDL1로 얻은 데이터. 도 13c: RCC로부터 HLA-G02로 얻은 데이터. 도 13d: CRC로부터 HLA-G02로 얻은 데이터. 데이터는 밝은 회색의 이소형 대조군, 어두운 회색의 항-PDL1 또는 HLA-G02 및 항-PDL1 또는 HLA-G02 처리된 배양물(여기서 세포 사멸의 1.5배 이상의 증가가 흑색에서 관찰됨)에서 사멸 세포 %로 제시되었다.
도 14. 통상적인 또는 탈푸코실화된 HLA-G02로 처리한 후 2.5 내지 3시간 후 다양한 이펙터:표적 비에서 HLA-G 형질감염된 HCT116 세포의 고갈. 살아있는 HLA-G GFP+ HCT116 세포의 수는 유세포 분석법으로 결정하고, 항체가 없는 대조군에 비해 고갈 백분율(세로축)을 계산하였다. 가로축: E:T 비(이펙터:표적 비). 표시된 데이터는 단일 공여자(1)의 데이터이다. 각각의 데이터 점는 3회 반복 시험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 15. 10명의 상이한 공여자로부터 얻은 PBMC 검정에서 탈푸코실화된 HLA-G02("aF HLA-G02")의 특이성. 결과는 각각의 공여자 및 항체에 대한 각각의 CD4+ 세포 집단의 MFI로 표시된다.
도 16. 탈푸코실화된 HLA-G02에 의해 매개되는 CDC. 도 16a: HLAG-β2m-Reh 세포 용해에 대한 혈청 활성의 영향(활성 또는 열 불활성화 혈청의 존재 하에서 HLAG-β2m-Reh의 aF HLA-G02 매개 CDC를 묘사하는 농도-반응 곡선). 수직 축: 최소 및 최대 대조군에 대해 표준화된 용해(%)(N = 1, 4-PL 피트); 가로 축: 항체 농도[M]). 도 16b: aF HLA-G02 매개 용해에서 HLA-G에 대한 의존성(HLAG-β2m-Reh 또는 Reh 세포의 aF HLA-G02 매개 CDC를 묘사하는 농도-반응 곡선). 수직 축: 최소 및 최대 대조군에 대해 표준화된 용해(%)(N = 1, 4-PL 피트); 가로 축: 항체 농도[M]). 도 16c: HLAG-β2m-Reh 세포의 aF HLA-G02 매개 CDC(HLAG-β2m-Reh의 aF HLA-G02 매개 CDC를 나타내는 농도-반응 곡선). 세로 축: 최소 및 최대 대조군에 대해 표준화된 용해(%)(N = 3, 평균 ± SEM, 4-PL 피트); 가로 축: 항체 농도[M]).
도 17. αCD47 항체와 비교한, HLA-G를 발현하는 표적 세포 또는 모의 형질감염된 세포의 식세포 작용에 대한 HLA-G02 및 탈푸코실화된 HLA-G02의 농도 의존적 효과. 도 17a 및 b: 대표적인 데이터(평균±SD)(세로 축: CTY+CD11b+ 이중 양성 세포의 백분율; 가로 축: μg/ml 단위의 항체 농도). 도 17c 및 d: 2개의 독립적인 실험에 걸쳐 이중으로, 3명의 개별 공여자로부터의 단핵구를 사용하여 생성된 결합 데이터(수직축: 이소형 대조군으로 조정된 식세포 작용의 백분율 = (항체 평균 - 이소형 평균)±SD; 가로축: μg/ml 단위의 항체 농도).
도 18. 탈푸코실화된 HLA-G02에 의해 매개되는 표적 세포 사멸. 밤새 인큐베이팅한 후 다양한 농도의 탈푸코실화된 HLA-G02 또는 αCD47(가로축, μg/ml)를 사용한 ADCP에 의한 HLA-G 발현 표적 세포의 고갈 백분율(세로 축)(2개의 독립적인 실험에 걸쳐 이중으로 4명의 별도 공여자로부터). 이소형 대조군과 비교한 평균 및 표준 편차.
도 19. 각각의 이소형 대조군과 비교한, HLA-G 발현 세포 단독의(도 19a) 또는 항-CD47 Ab와의 조합(1 μg/mL, 도 19b)의 식세포 작용에 대한 탈푸코실화된 HLA-G02 및 HLA-G02 IgG4P FALA의 농도 의존적 효과에 대한 대표적인 데이터. 수직 축: CTY+CD11b+ 이중 양성 세포의 백분율; 가로 축: μg/ml 단위의 항체 농도.
도 20. 탈푸코실화된 HLA-G02 단독으로 또는 항-CD47 항체(1 μg/mL)와 조합하여 처리된 HLA-G 발현 세포의 식세포 작용. 도 20a는 탈푸코실화된 HLA-G02에 대한 데이터를 나타낸다(3명의 공여자, 이중으로, 2개의 독립적인 실험). 도 20b는 HLA-G02 IgG4P FALA에 의한 데이터를 나타낸다(4명의 공여자로부터 결합된 데이터, 각각 이중으로 분석됨, 3개의 독립적인 실험). 식세포 작용 값(%, 세로 축)은 각각의 이소형 대조군(Ab 평균 - 이소형 평균)에 맞게 조정되었으며, 평균±SD로 표시된다. 가로 축: μg/ml 단위의 항체 농도.
도 21. 탈푸코실화된 HLA-G02의 농도 범위(가로 축, μg/ml)에 걸쳐 JEG3 세포의 존재 및 부재 하에 PBMC 배양물에서 생산된 사이토카인의 수준(세로축, pg/ml)(도 21a: IFN 감마; 도 21b: TNF 알파; 도 21c: IL-2; 도 21d: IL-6; 도 21e: IL -8; 도 21f: IL-10). 값은 모든 16명의 PBMC 공여자에 대한 평균 +/- 표준 편차로 표시된다. 점선은 탈푸코실화된 이소형 대조군 항체 50 μg/ml, 항-CD3 50 μg/ml 또는 LPS 100 ng/ml의 존재 하에 생산된 각각의 사이토카인의 평균 수준을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
이제 본 개시내용은 특정한 비제한적인 측면 및 그의 실시양태와 관련하여 및 특정 도면 및 예를 참조하여 설명될 것이다.
기술 용어는 별도로 명시하지 않는 한, 그의 통상적인 의미로 사용된다. 특정 용어에 특정한 의미가 전달되는 경우, 용어의 정의는 해당 용어가 사용되는 맥락에 따라 부여된다.
본 설명 및 청구범위에서 "포함하는"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 개시내용의 목적을 위해, "이루어지는"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다.
단수 명사를 언급할 때 부정관사 또는 정관사(예를 들어, "a", "an" 또는 "the")가 사용되는 경우, 이는 특별히 명시하지 않는 한 해당 명사의 복수형을 포함한다.
본 개시내용은 HLA-G에 대한 항체를 제공한다. 첫 번째 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다:
a. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및
b. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3.
HLA-G
"HLA-G" 또는 "인간 HLA-G"라는 용어는 인간 주조직 적합성 복합체 I 분자(MHC)로도 알려진 고전적인 HLA-I 분자인 인간 백혈구 항원 G를 의미한다. 일반적으로, HLA-G는 B2m과 함께 MHC-I 복합체를 형성한다.
달리 명시하지 않는 한, "HLA-G"라는 용어는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 인간 HLA-G의 임의의 선택적 스플라이싱 또는 천연 변이체 또는 이소형을 의미한다. 전체 인간 HLA-G의 예시적인 서열은 서열 번호 107에 제시된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명의 항체는 HLA-G의 세포외 도메인(ECD)(또는 "HLA-G ECD")에 선택적으로 결합한다. HLA-G ECD의 예시적인 서열은 서열 번호 108에 제시된 서열을 포함한다.
HLA-G 및 이의 이소형의 아미노산 및 핵산 서열은 또한 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다.
HLA-G의 7가지 이소형이 확인되었으며, 4개는 막 결합형(HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4)이고, 3개는 가용성(HLA-G5, HLA-G6 및 HLA-G7)이고, 이는 HLA-G 1차 전사체의 선택적 스플라이싱의 결과이다(도 1). 일부 α1 도메인을 갖지 않는 추가의 이소형은 신장 종양의 mRNA 분석에 의해 제안되지만, 이는 단백질 수준에서 확인되지 않았다(Tronik-Le Roux et al., Molecular Oncology 11 (2017) 1561-1578).
HLA-G1 및 HLA-G5는 경쇄, 즉 베타-2-마이크로글로불린("β2m" 또는 "B2m"으로 약칭됨)와 회합되는 3개의 구형 도메인(α1, α2 및 α3)을 나타내는 중쇄를 포함하는 고전적인 HLA-I 분자, 즉 이종이량체 분자의 구조와 유사한 구조를 가지고 있다. HLA-G1 및 HLA-G5는 B2m과 복합체가 아닌 유리 알파 사슬로 존재할 수도 있다.
HLA-G2 및 HLA-G6은 α1 및 α3 도메인만을 포함한다. HLA-G4는 α1 및 α2 도메인만을 포함한다. HLA-G3 및 HLA-G7은 α1 도메인만을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6 및 HLA-G7 중 적어도 하나에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 알파 3 도메인을 포함하는 모든 HLA-G 이소형, 즉 B2m과 복합체를 이룰 때 및 B2m 미회합 분자로 발현될 때 HLA-G1 및 HLA-G5를 비롯한 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 및 HLA-G6에 결합한다.
HLA-G1 및 HLA-G5는 디설파이드 결합 이량체 및 삼량체와 같은 동종다량체를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단량체 HLA-G에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이량체 HLA-G에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 삼량체 HLA-G에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단량체, 이량체 및 삼량체 HLA-G에 결합한다.
HLA-G에 결합하는 항체
본 개시내용의 맥락에서 사용하기 위한 항체에는 전체 항체 및 이의 기능적으로 활성인 단편(즉, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 함유하는 분자 -항원 결합 단편으로도 지칭됨)이 포함된다. 항체와 관련하여 본원에서 설명되는 특징은 문맥상 달리 지시하지 않는 한 항체 단편에도 적용된다. 항체는 모노클로날, 다가, 다중특이적, 이중특이적, 완전 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다(또는 이들로부터 유래될 수 있다).
"면역글로불린(Ig)"으로도 알려진 전체 항체는 일반적으로 온전한 항체 또는 전장 항체와 관련되고, 디설파이드 결합으로 서로 연결된 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 요소를 포함하며, 이들 사슬은 조립되어 특징적인 Y자 모양의 3차원 구조를 규정한다. 고전적인 천연 전체 항체는 하나의 항원 유형에 결합한다는 점에서 단일특이적이고, 두 개의 독립적인 항원 결합 도메인을 갖는다는 점에서 2가이다. 용어 "온전한 항체", "전장 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 정의된 Fc 영역을 포함하는 천연 항체 구조와 유사한 구조를 갖는 단일특이적 2가 항체를 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용된다.
전체 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약칭함) 및 Ig 클래스에 따라 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 또는 4개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. Ig 또는 항체의 "클래스"는 불변 영역의 유형을 나타내며, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하며, 이들 중 일부는 하위 클래스, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 추가로 분류될 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 VH 및 VL 영역은 구조적으로 더 보존된 프레임워크 영역(FR)으로 칭해지는 영역들에 산재하는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 항원의 인식을 결정하는 초가변성 영역(또는 "초가변 영역" 또는 HVR)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 이들은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된다. CDR 및 FR은 함께 가변 영역을 형성한다. 관례적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역에 있는 CDR은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 지칭되고, 경쇄 가변 영역에 있는 CDR은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 지칭된다. 이들은 각각의 사슬의 N 말단에서 C 말단 방향으로 순차적으로 넘버링된다.
CDR은 전통적으로 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA](이하 "카바트 등 (상기 문헌)")에서 고안된 시스템에 따라 넘버링된다. 달리 표시된 경우를 제외하고, 이 넘버링 시스템이 본 명세서에서 사용된다.
카바트 잔기 지정은 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 항상 직접적으로 일치하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본적인 가변 도메인 구조의 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR)인지의 여부에 관계없이 구조적 성분의 단축 또는 구조적 성분 내로의 삽입에 해당하는 엄격한 카바트 넘버링보다 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 잔기를 "표준" 카바트 넘버링 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 코티아(Chothia, C. and Lesk, AMJ Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1과 동등한 루프는 잔기 26에서 잔기 32까지 확장된다. 따라서, 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용되는 'CDR-H1'은 카바트 넘버링 시스템과 코티아의 토폴로지 루프(topological loop) 정의의 조합에 의해 설명되는 바와 같이 잔기 26 내지 35를 지칭하도록 의도된다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.
CDR 루프 외에도, 프레임워크 3(FR3)에 의해 형성된 CDR-3(CDR-L3 또는 CDR-H3)과 CDR-2(CDR-L2 또는 CDR-H2) 사이에 네 번째 루프가 존재한다. 카바트 넘버링 시스템은 프레임워크 3을 중쇄의 위치 66-94 및 경쇄의 위치 57-88로 정의한다.
면역글로불린 계열의 다양한 구성원의 서열 정렬을 기반으로 넘버링 방식이 제안되었으며, 예를 들어 문헌 [Kabat et al., 1991] 및 [Dondelinger et al., 2018, Frontiers in Immunology, Vol 9, article 2278]에 설명되어 있다.
본 발명의 항체는 서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19의 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 93의 중쇄 가변 영역의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
이러한 CDR 서열을 포함하는 항체는 HLA-G에 대한 높은 친화도, HLA-G에 대한 높은 특이성(특히 매우 높은 상동성에도 불구하고 다른 HLA-1 분자와의 교차 반응성이 없음), HLA-G 생물학적 기능에 대한 높은 억제 및 제조 가능성에 필수적인 높은 안정성을 제공하기 때문에 특히 독창적이다. 또한, 활성 Fc와 결합하면, HLA-G+ 종양 세포를 직접 사멸시키는 능력을 갖는 항체를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불변 도메인(들)", "불변 영역"은 가변 영역 외부에 있는 항체의 도메인(들)을 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용된다. 불변 도메인은 동일한 이소형의 모든 항체에서는 동일하지만, 이소형마다 상이하다. 전형적으로, 중쇄의 불변 영역은 3개 또는 4개의 불변 도메인을 포함하는 CH1-힌지 -CH2-CH3-선택적으로 CH4에 의해 N 말단에서 C 말단으로 형성된다.
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은 존재하는 경우 항체 분자의 제안된 기능, 특히 필요할 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료 용도로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구되는 경우, 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 IgG1 및 IgG3 이소형이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료 목적으로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않는 경우, IgG2 및 IgG4 이소형이 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체도 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Angal et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody as observed during SDS-PAGE analysis Mol Immunol 30, 105-108]에 기재되고 본원에서 IgG4P로 지칭되는, 위치 241(카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨)의 세린이 프롤린으로 변경된 IgG4 분자가 사용될 수 있다.
"Fc", "Fc 단편" 및 "Fc 영역"은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 항체의 C-말단 영역을 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용된다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 도메인인 CH2 및 CH3, 또는 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 도메인, 및 이들 도메인의 N-말단의 유연한 힌지를 의미한다. 인간 IgG1 중쇄 Fc 영역은 카르복실 말단에 잔기 C226을 포함하는 것으로 본원에서 정의되며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 인간 IgG1의 맥락에서, 하부 힌지는 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 위치 226-236을 지칭하고, CH2 도메인은 위치 237-340을 지칭하며, CH3 도메인은 위치 341-447을 지칭한다. 다른 면역글로불린의 상응하는 Fc 영역은 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 존재하는 경우, 불변 영역 또는 Fc 영역은 위에서 정의한 바와 같이 천연일 수 있거나, 기능성 FcR 결합 도메인, 바람직하게는 기능성 FcRn 결합 도메인을 포함한다면 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 변형된 불변 영역 또는 Fc 영역은 기능성 및/또는 약동학의 개선을 유도한다. 변형에는 Fc 단편의 특정 부분의 결실이 포함될 수 있다. 변형은 항체의 생물학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 다양한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. FcRn 결합을 증가시켜 생체내 반감기를 증가시키기 위한 돌연변이도 존재할 수 있다. 변형은 항체의 글리코실화 프로파일의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 천연 Fc 단편은 2개의 중쇄 각각에서 위치 297의 아스파라긴 잔기(Asn297)에 결합된 N-글리칸이 존재하면서 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 본 개시내용의 맥락에서, 항체는 글리코 변형될 수 있고, 즉, 특정 글리코실화 프로파일을 갖도록 조작될 수 있으며, 이는 예를 들어 개선된 특성, 예를 들어 개선된 이펙터 기능 및/또는 개선된 혈청 반감기를 유도한다.
본 명세서에서 설명되는 항체는 단리된다. "단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다(예를 들어, 정제 수단에 의해).
용어 "항체"는 1가, 즉 단지 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체(예를 들어, 상호 연결된 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 단일 아암(arm) 항체 - "절반 항체(half-antibody)"라고도 함) 및 다가 항체, 즉, 하나 초과의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 용어 "항체"는 또한 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
항체의 항원 결합 단편에는 단일 사슬 항체(예를 들어, scFv 및 dsscfv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체 또는 나노바디(예를 들어, VH 또는 VL, 또는 VHH 또는 VNAR)가 포함된다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 항체 단편에는 국제 특허 출원 공개 WO2011/117648, WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 설명된 Fab 및 Fab' 단편이 포함된다.
이들 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fab 단편"은 VL(가변 경쇄) 도메인 및 경쇄의 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편, 및 VH(가변 중쇄) 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 의미한다.
전형적인 "Fab' 단편"은 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함하며, 여기서 중쇄는 가변 영역 VH, 불변 도메인 CH1 및 천연 또는 변형된 힌지 영역을 포함하고, 경쇄는 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함한다. 본 개시내용에 따른 Fab'의 이량체는 F(ab')2를 생성하며, 여기서 예를 들어 이량체화는 힌지를 통해 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 도메인 항체"는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미한다. 단일 도메인 항체의 예에는 VH 또는 VL 또는 VHH 또는 VNAR이 포함된다.
"Fv"는 2개의 가변 도메인, 예를 들어 동족 쌍 또는 친화도 성숙 가변 도메인, 즉 VH 및 VL 쌍과 같은 협동 가변 도메인을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH와 VL 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커에 의해 안정화되는 단일 사슬 가변 단편을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "디설파이드-안정화된 단일 사슬 가변 단편" 또는 "dsscFv"는 VH와 VL 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커에 의해 안정화되고 또한 VH와 VL 사이의 도메인간 디설파이드 결합을 포함하는 단일 사슬 가변 단편을 의미한다(예를 들어, 문헌 [Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012], W02007109254 참조).
한 실시양태에서, 가변 도메인 VH와 VL 사이의 디설파이드 결합은 아래 나열된 잔기 중 2개의 잔기 사이에 있다(문맥상 달리 나타내지 않는 한, 카바트 넘버링이 아래 목록에 사용됨). 카바트 넘버링에 대한 참고문헌이 있는 경우마다, 관련 참고문헌은 [Kabat et al., 1991 (5th edition, Bethesda, Md.), in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA]이다.
한 실시양태에서, 디설파이드 결합은 다음을 포함하는 군으로부터 선택되는 위치, 및 분자에 위치하는 가변 영역 쌍의 이에 상응하는 위치 또는 위치들에 있다:
· VH37 + VL95C(예를 들어, 문헌 [Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)] 참조);
· VH44 + VL100(예를 들어, 문헌 [Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012] 참조);
· VH44 + VL105(예를 들어, 문헌 [J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995)] 참조);
· VH45 + VL87(예를 들어, 문헌 [Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)] 참조);
· VH55 + VL101(예를 들어, 문헌 [FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)] 참조);
· VH100 + VL50(예를 들어, 문헌 [Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)] 참조);
· VH100b + VL49(예를 들어, 문헌 [Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)] 참조);
· VH98 + VL46(예를 들어, 문헌 [Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)] 참조);
· VH101 + VL46(예를 들어, 문헌 [Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)] 참조);
· VH105 + VL43(예를 들어, 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993)]; 또는 [Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994)] 참조),
· VH106 + VL57(예를 들어, 문헌 [FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)] 참조).
한 실시양태에서, 디설파이드 결합은 위치 VH44와 VL100 사이에 형성된다.
다중특이적 항체
본 발명의 항체는 다중특이적 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "다중특이적 또는 다중-특이적 항체"는 적어도 2개의 결합 도메인, 즉 2개 이상의 결합 도메인, 예를 들어 2개 또는 3개의 결합 도메인을 갖고, 여기서 적어도 2개의 결합 도메인은 두 개의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 두 개의 상이한 에피토프에 대해 독립적으로 결합하는, 본원에서 설명되는 항체를 지칭한다. 다중특이적 항체는 일반적으로 각각의 특이성(항원)에 대해 1가이다. 본원에서 설명되는 다중특이적 항체는 1가 및 다가, 예를 들어 2가, 3가, 4가의 다중특이적 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 구축물은 이중특이적 항체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "이중특이적 또는 이중-특이적 항체"는 2개의 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항체는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는데, 여기서 하나의 결합 도메인은 항원 1에 결합하고, 다른 결합 도메인은 항원 2에 결합한다. 즉, 각각의 결합 도메인은 각각의 항원에 대해 1가이다. 한 실시양태에서, 항체는 4가 이중특이적 항체이다. 즉, 항체는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는데, 여기서 예를 들어 2개의 결합 도메인은 항원 1에 결합하고, 나머지 2개의 결합 도메인은 항원 2에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 3가의 이중특이적 항체이다.
한 실시양태에서, 항체 구축물은 삼중특이적 항체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "삼중특이적 또는 삼중-특이적 항체"는 3가지 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 3개의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 3개의 상이한 에피토프에 독립적으로 결합하는 3개의 항원 결합 도메인(3가)을 갖는 항체이다. 즉, 각각의 결합 도메인은 각각의 항원에 대해 1가이다.
파라토프는 항원을 인식하고 항원에 결합하는 항체의 영역이다. 본 발명의 항체는 다중 파라토프 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "다중 파라토프 항체"는 동일한 항원 또는 2개의 상이한 항원으로부터의 상이한 에피토프와 상호작용하는 2개 이상의 별개의 파라토프를 포함하는, 본원에서 설명되는 항체를 의미한다. 본원에서 설명되는 다중 파라토프 항체는 2중 파라토프, 3중 파라토프, 4중 파라토프일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항원 결합 도메인"은 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 하나 이상의 가변 도메인의 일부 또는 전체, 예를 들어 한 쌍의 가변 도메인 VH 및 VL의 일부 또는 전체를 포함하는, 항체의 일부를 의미한다. 결합 도메인은 단일 도메인 항체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 결합 도메인은 1가이다. 바람직하게는, 각각의 결합 도메인은 단지 1개의 VH 및 1개의 VL을 포함한다.
다양한 다중특이적 항체 형식이 생성되었다. 다양한 분류가 제안되었지만, 다중특이적 IgG 항체 형식에는 일반적으로 예를 들어 문헌 [Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106]에서 설명된 바와 같이 이중특이적 IgG, 부가형(appended) IgG, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 단편, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 융합 단백질 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 접합체가 포함된다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 기술에는 크로스맙(CrossMab) 기술(Klein et al. Engineering therapeutic bispecific antibodies using CrossMab technology, Methods 154 (2019) 21-31), 놉-인-홀(Knobs-in-holes) 조작(예를 들어, W01996027011, WO1998050431), 듀오바디(DuoBody) 기술(예를 들어, WO2011131746), 아지메트릭(Azymetric) 기술(예를 들어, WO2012058768)이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 추가의 기술은 예를 들어 문헌 [Godar et al., 2018, Therapeutic bispecific antibody formats: a patent applications review (1994-2017), Expert Opinion on Therapeutic Patents, 28:3, 251-276]에 기재되어 있다. 이중특이적 항체에는 특히 크로스맙 항체, DAF(2-in-1), DAF(4-in-1), 듀타맙(DutaMab), DT-IgG, 놉-인-홀 공통 LC, 놉-인-홀 어셈블리, 전하 쌍, Fab-아암 교환, 씨드바디(SEEDbody), 트리오맙(Triomab), LUZ-Y, Fcab, κλ-body 및 직교 Fab가 포함된다.
부가형 IgG는 전형적으로 IgG의 중쇄 및/또는 경쇄의 N- 및/또는 C-말단에 추가의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 단편을 부가함으로써 조작된 전장 IgG를 포함한다. 이러한 추가의 항원 결합 단편의 예에는 sdAb 항체(예를 들어, VH 또는 VL), Fv, scFv, dsscFv, Fab, scFav가 포함된다. 부가형 IgG 항체 형식에는 예를 들어 문헌 [Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106]에 설명된 바와 같이 특히 DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgC(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, 자이바디(Zybody) 및 DVI-IgG(4-in-1)가 포함된다.
다중특이적 항체 단편에는 예를 들어 문헌 [Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106]에 설명된 바와 같이 나노바디, 나노바디-HAS, BiTE, 디아바디(Diabody), DART, TandAb, sc디아바디, sc-디아바디-CH3, 디아바디-CH3, 트리플바디, 미니안티바디; 미니바디, 트리 비(Tri Bi) 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCAb, sc디아바디-Fc, 디아바디-Fc, 직렬(Tandem) scFv-Fc; 및 인트라바디가 포함된다.
다중특이적 융합 단백질에는 독 앤드 락(Dock and Lock), ImmTAC, HSAbody, sc디아바디-HAS 및 직렬 scFv-독소가 포함된다.
다중특이적 항체 접합체에는 IgG-IgG; Cov-X-바디; 및 scFv1-PEG-scFv2가 포함된다.
추가의 다중특이적 항체 형식은 예를 들어 문헌 [Brinkmann and Kontermann, The making of bispecific antibodies, mAbs, 9:2, 182-212 (2017)], 특히 도 2에 기재되어 있고, 예를 들어 직렬 scFv, 트리플바디, Fab-VHH, taFv-Fc, scFv4-Ig, scFv2-Fcab, scFv4-IgG이다. 비바디, 트리바디 및 이를 생산하는 방법은 예를 들어 WO99/37791에 개시되어 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체의 예에는 부가형 IgG 및 부가형 Fab가 포함되며, 여기서 전체 IgG 또는 Fab 단편은 예를 들어 WO2009/040562, WO2010/035012, WO2011/030107, WO2011/061492, WO2011/061246 및 WO2011/086091에 설명된 바와 같이 각각의 적어도 하나의 추가의 항원 결합 도메인(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개의 추가의 항원 결합 도메인), 예를 들어 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, dsscFv, dsFv를 상기 IgG 또는 Fab의 중쇄 및/또는 경쇄의 N- 및/또는 C-말단에 부가함으로써 조작된다. 특히, Fab-Fv 형식은 WO2009/040562에 기재되어 있고, 그의 디설파이드 안정화 버전인 Fab-dsFv는 WO2010/035012에 기재되어 있다. dsFv가 Fv의 VL 또는 VH 도메인과 Fab의 LC 또는 HC의 C 말단 사이의 단일 링커를 통해 Fab에 연결되는 단일 링커 Fab-dsFv가 WO2014/096390에 기재되어 있다. IgG의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 dsFv를 부가함으로써 조작된 전장 IgG1을 포함하는 부가형 IgG가 WO2015/197789에 기재되어 있다.
본 발명에 사용하기 위한 또 다른 예시적인 항체는 2개의 scFv 또는 dsscFv에 연결된 Fab를 포함하며, 각각의 scFv 또는 dsscFv는 동일하거나 상이한 표적에 결합한다(예를 들어, 하나의 scFv 또는 dsscFv는 치료 표적에 결합하고, 하나의 scFv 또는 dsscFv는 예를 들어 알부민에 대한 결합에 의해 반감기를 증가시킨다). 이러한 항체는 WO2015/197772에 설명되어 있다. 본 발명의 단편에 사용하기 위한 또 다른 예시적인 항체는 예를 들어 WO2013/068571 및 문헌 [Dave et al., Mabs, 8(7) 1319-1335 (2016)]에 설명된 바와 같이 단지 하나의 scFv 또는 dsscFv에만 연결된 Fab를 포함한다.
기타 잘 알려진 다중특이적 항체의 형식은 다음을 포함한다:
본원에서 사용되는 디아바디는 두 개의 Fv 쌍, 즉 첫 번째 VH/VL 쌍 및 두 개의 Fv 사이의 링커를 갖는 추가의 VH/VL 쌍을 의미하고, 여기서 첫 번째 Fv의 VH는 두 번째 Fv의 VL에 연결되고, 첫 번째 Fv의 VL은 두 번째 Fv의 VH에 연결된다.
본원에서 사용되는 트리아바디는 3개의 Fv 및 3개의 Fv 사이의 링커를 포함하는 디아바디와 유사한 형식을 의미한다.
본원에서 사용되는 테트라바디는 4개의 Fv 및 4개의 Fv 사이의 링커를 포함하는 디아바디와 유사한 형식을 의미한다.
본원에서 사용되는 직렬 scFv는 단일 Fv 사이의 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 연결된 적어도 2개의 scFv를 의미한다.
본원에서 사용되는 직렬 scFv-Fc는 적어도 2개의 직렬 scFv를 지칭하며, 여기서 그 각각은 예를 들어 힌지를 통해 불변 영역 단편 -CH2CH3의 CH2 도메인의 N-말단에 부가된다.
본원에서 사용되는 Fab-Fv는 중쇄의 CH1 및 경쇄의 CL의 C 말단에 각각 가변 영역이 부가된 Fv 단편을 의미한다. 그 형식은 PEG화된 버전으로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 Fab'-Fv는 FabFv와 유사하며, 여기서 Fab 부분은 Fab'로 대체된다. 형식은 PEG화된 버전으로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 Fab-dsFv는 Fv 내부 디설파이드 결합이 부가된 C-말단 가변 영역을 안정화시키는 FabFv를 의미한다. 그 형식은 PEG화된 버전으로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 Fab-scFv는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 scFv가 부가된 Fab 분자이다.
본원에서 사용되는 Fab'-scFv는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 scFv가 부가된 Fab' 분자이다.
본원에서 사용되는 DiFab은 중쇄의 C-말단을 통해 연결된 2개의 Fab 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 DiFab'은 그의 힌지 영역에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된 두 개의 Fab' 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, sc디아바디는 분자가 3개의 링커를 포함하고 그의 VH 및 VL 말단이 추가의 Fv 쌍의 가변 영역 중의 하나에 각각의 연결되는 정상 scFv를 형성하도록 Fv 내부 링커를 포함하는 디아바디이다.
본원에서 사용되는 Sc디아바디-Fc는 각각 예를 들어 힌지를 통해 불변 영역 단편 -CH2CH3의 CH2 도메인의 N-말단에 부착된 2개의 sc디아바디이다.
본원에서 사용되는 ScFv-Fc-scFv는 4개의 scFv를 의미하며, 여기서 그 각각은 -CH2CH3 단편의 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 N-말단 및 C-말단에 부착된다.
본원에서 사용되는 Sc디아바디-CH3은 예를 들어 힌지를 통해 CH3 도메인에 각각의 연결된 2개의 sc디아바디 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 IgG-scFv는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C-말단에 scFv를 갖는 전장 항체이다.
본원에서 사용되는 scFv-IgG는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N-말단에 scFv를 갖는 전장 항체이다.
본원에서 사용되는 V-IgG는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N-말단에 가변 도메인을 갖는 전장 항체이다.
본원에서 사용되는 IgG-V는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C-말단에 가변 도메인을 갖는 전장 항체이다.
DVD-Ig(이중 V 도메인 IgG로도 알려짐)는 4개의 추가의 가변 도메인(각각의 중쇄 및 각각의 경쇄의 N 말단에 하나씩)이 있는 전장 항체이다.
본 개시내용은 HLA-G에 특이적으로 결합하는 하나의 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체를 제공하며, 상기 결합 도메인은 다음을 포함한다:
a. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및
b. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3.
본 발명의 항체는 HLA-G에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다. 항체는 관심 단백질(예를 들어, HLA-G)에 대해 우선적인 또는 높은 친화도로 결합하지만 다른 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 경우 단백질에 "특이적으로 결합"한다. 즉, 항체는 임의의 다른 분자에 대한 유의한 교차 반응 없이 관심 단백질에 결합한다. 항체의 특이성은 항체가 위에서 논의된 다른 관련 단백질과 결합하는지의 여부 또는 단백질을 구별하는지의 여부를 결정함으로써 추가로 연구될 수 있다.
특히, HLA-G에 "특이적으로 결합하는" 항체는 또 다른 인간 단백질, 특히 또 다른 HLA-I 분자와 교차 반응하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E 및 HLA-F 중 어느 것에도 실질적으로 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E 및 HLA-F 중 어느 것에도 결합하지 않는다. HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E 및 HLA-F의 예시적인 서열은 각각 서열 번호 132, 134, 136, 138 및 140이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 B2m에 결합하지 않는다.
본 발명의 항체는 HLA-G의 알파 3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다. "HLA-G의 알파 3 도메인에 특이적으로 결합한다"는 것은 항체가 또 다른 인간 단백질과의 교차 반응성 및 HLA-G의 또 다른 도메인(예를 들어, 알파 1 또는 알파 2 도메인)과의 교차 반응성 없이 HLA-G의 알파 3 도메인에 결합하는 것으로 이해될 것이다.
교차 반응성은 예를 들어 본원에서 설명되는 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 항체가 관심 단백질에 결합하는 강도의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%의강도로 다른 분자에 결합하는 경우 항체의 교차반응성은 유의한 것으로 간주될 수 있다. 특이적(또는 선택적) 항체는 항체가 관심 단백질에 결합하는 강도의 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20% 미만의 강도로 다른 분자에 결합할 수 있다. 항체는 항체가 관심 단백질에 결합하는 강도의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 강도로 다른 분자에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라, HLA-G에 대한 항체의 결합은 20 nM 미만, 특히 15 nM 미만, 특히 10 nM 미만, 특히 10 nM 미만, 특히 9 nM 미만, 특히 8 nM 미만, 특히 7 nM 미만, 특히 6 nM 미만, 특히 5 nM 미만의 해리 상수(KD)를 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비 (즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고 몰 농도(M)로 표현되는 평형 해리 상수를 의미한다. Kd 및 Ka는 각각 특정 항원-항체(또는 이의 항원 결합 단편) 상호작용의 해리율 및 회합율을 의미한다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술 분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 재조합 HLA-G 또는 이의 적합한 융합 단백질/폴리펩타이드를 사용하여, 예를 들어 본원의 실시예에서 설명되는 바와 같은 비아코어(Biacore)® 시스템과 같은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하는 것이다. 일반적으로, KD 값은 25℃의 온도에서 SPR에 의해 결정된다. 한 예에서, 친화도는 본원의 실시예에서 설명되는 바와 같이 B2m과 복합체로서 발현된 재조합 HLA-G 세포외 도메인(ECD)을 사용하여 측정된다. 표면 플라즈몬 공명을 위해, 표적 분자는 고체상에 고정되고, 유동 셀을 따라 흐르는 이동상의 리간드에 노출된다. 고정된 표적에 리간드가 결합하면, 국부 굴절률이 변하고, SPR 각도가 변하는데, 이는 반사광 세기의 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링할 수 있다. SPR 신호의 변화율을 분석하여 결합 반응의 회합 및 해리 단계에 대한 겉보기 속도 상수를 얻을 수 있다. 이들 값의 비는 겉보기 평형 상수(친화도)를 제공한다(예를 들어, 문헌 [Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)] 참조).
"친화도"라는 용어는 항체와 HLA-G 사이의 상호작용의 강도를 의미한다. HLA-G에 대한 결합 친화도는 B2m과 회합되거나 회합되지 않은 HLA-G 또는 HLA-G ECD에 대해 측정될 수 있다. 예를 들어, HLA-G에 대한 결합은 서열 번호 108 또는 110의 서열을 포함하는 가용성 HLA-G ECD에 대한 결합 친화도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 한 예에서, HLA-G에 대한 결합은 B2m과 회합된, 서열 번호 108 또는 110의 서열을 포함하는 가용성 HLA-G ECD에 대한 결합 친화도를 측정함으로써 평가된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 20 nM 미만, 특히 15 nM 미만, 특히 10 nM 미만, 특히 9 nM 미만, 특히 8 nM 미만, 특히 7 nM 미만, 특히 6 nM 미만, 특히 5 nM 미만의 해리 상수(KD)로 HLA-G의 ECD에 결합한다. 한 실시양태에서, 해리 상수는 전장 항체로서 발현되는 본 발명의 항체와 HLA-G의 단량체 형태(예를 들어, B2m과 회합된 HLA-G ECD) 사이에서 25℃의 온도에서 SPR에 의해 결정된다. 한 실시양태에서, 해리 상수는 실시예 7.1에서 설명되는 바와 같이 SPR에 의해 결정된다.
또 다른 예에서, HLA-G에 대한 결합은 서열 번호 107의 서열을 포함하는 세포막 발현 HLA-G에 대한 결합 친화도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 세포막 발현 HLA-G에 대한 결합은 FACS에 의해 분석할 수 있다. 일반적으로, 세포의 표면에서 발현되는 HLA-G는 이량체 형태로 발현된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 FACS에 의해 결정 시에 2 nM 미만, 바람직하게는 1 nM 미만의 해리 상수(KD)로 세포 상의 HLA-G에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 FACS에 의해 결정 시에 1 nM 미만의 해리 상수(KD)로 JEG3 세포에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; 항체는 20 nM 미만, 특히 15 nM 미만, 특히 10 nM 미만, 특히 9 nM 미만, 특히 8 nM 미만, 특히 7 nM 미만, 특히 6 nM, 또는 특히 5 nM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 한 실시양태에서, 해리 상수는 전장 항체로서 발현된 본 발명의 항체와 HLA-G의 단량체 형태 사이에서 25℃의 온도에서 SPR에 의해 결정된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; 전장 항체로서 발현된 항체는 FACS에 의해 결정 시에 2 nM 미만, 바람직하게는 1 nM 미만의 해리 상수(KD)로 JEG3 세포에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 차단 항체이다. 항체와 관련하여 용어 "차단"(또는 "차단하다")은 그의 표적(HLA-G)의 그의 수용체에 대한 결합을 억제하거나 약화시킬 수 있는 항체를 설명한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G와 ILT2 사이의 상호작용을 차단한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G와 ILT4 사이의 상호작용을 차단한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G와 ILT2 사이, 및 HLA-G와 ILT4 사이의 상호작용을 차단한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G가 단량체 및/또는 이량체 및/또는 삼량체로서 발현되는 경우 HLA-G와 ILT2 사이 및/또는 HLA-G와 ILT4 사이의 상호작용을 차단한다.
ILT2 및/또는 ILT4에 대한 HLA-G 결합의 차단은 세포의 표면에서 발현되는 B2m과 회합되거나 회합되지 않은 HLA-G의 세포외 도메인(ECD)과, 융합 단백질, 예를 들어 Fc 융합 단백질(ITT2-Fc, ILT4-Fc)로서 발현된 ILT2 및/또는 ILT2 사이의 상호작용의 차단을 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 142를 포함하는 ILT2-토끼Fc 융합 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 144를 포함하는 ILT4-토끼Fc 융합 단백질이 사용될 수 있다. ILT2 및/또는 ILT4에 대한 HLA-G 결합의 차단은 실시예 8에 설명된 대로 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G와 B2m 사이의 회합을 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G와, HLA-G와 복합체로서 자연적으로 발현되는 그의 동족 펩타이드 사이의 회합을 차단하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G의 다량체화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G의 이량체화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G의 삼량체화를 억제한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 HLA-G에 대한 ILT2의 결합을 차단하기 위해 50 pM 미만의 IC50을 가지며, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 예를 들어 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 대량의 반응 부피를 사용하는 시험관내 검정을 사용하여 측정 시에, JEG3 세포의 표면에서 자연적으로 발현되는 HLA-G에 대한 ILT2의 결합의 차단을 위해 40 pM 미만, 또는 30 pM 미만, 또는 20 pM 미만의 IC50을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 JEG3 세포의 표면에서 자연적으로 발현되는 HLA-G에 대한 ILT2의 결합을 차단하기 위해 20 pM 미만의 IC50을 갖는다. 한 실시양태에서, ILT2는 예를 들어 서열 번호 142를 포함하는 ILT2-토끼Fc 융합 단백질로서 발현된다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 HLA-G에 대한 ILT4의 결합을 차단하기 위해 1800 pM 미만의 IC50을 갖고, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 본원에서 설명되는 시험관 검정에서 HLA-G에 대한 ILT4의 결합을 차단하기 위해 1500 pM 미만, 또는 1400 pM 미만의 IC50을 갖는다. 한 실시양태에서, ILT4는 예를 들어 서열 번호 144를 포함하는 ILT4-토끼Fc 융합 단백질로서 발현된다. ILT4에 대한 HLA-G 결합을 차단하는 것은 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 평가할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; 항체는
a. 예를 들어 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 대량의 반응 부피를 사용하는 시험관내 검정을 사용하여 측정된, JEG3 세포의 표면에서 자연적으로 발현되는 HLA-G에 대한 ILT2의 결합의 차단을 위한 20 pM 미만의 IC50; 및/또는
b. 예를 들어 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 결정된, HLA-G에 대한 ILT4의 결합의 차단을 위한 1400 pM 미만의 IC50
을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 IC50은 본 발명에서 HLA-G에 대한 ILT2 또는 ILT4의 결합 활성인 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는데 있어서 항체와 같은 물질의 유효성의 척도인 최대 억제 농도의 절반을 의미한다. IC50은 특정 생물학적 과정 또는 기능 또는 활성을 절반으로 억제하는 데 필요한 특정 물질의 양을 나타내는 정량적 척도이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G 매개 면역 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G와 ILT2 사이의 상호작용 및/또는 HLA-G와 ILT4 사이의 상호작용을 차단함으로써 HLA-G 매개 면역 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 NK 세포의 HLA-G 매개 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CD8+ T 림프구 및/또는 CD4+ T 림프구와 같은 세포독성 T 림프구의 HLA-G 매개 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 조절 T 림프구의 HLA-G 매개 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 B 세포의 HLA-G 매개 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단핵구의 HLA-G 매개 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 대식세포의 HLA-G 매개 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 수지상 세포의 HLA-G 매개 억제 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 호중구의 HLA-G 매개 억제를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 식세포 작용의 HLA-G 매개 억제를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전염증성 사이토카인, 예를 들어 TNF 알파, IL-1, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12(IL-12p70으로도 알려짐), IL-13, IL-15, IL-18, IFN 감마, GM-CSF, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, TNF 알파의 생성을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 종양 미세환경으로의 면역 세포(단핵구, 대식세포, 수지상 세포, B 세포, T 세포 또는 NK 세포)의 동원을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G를 발현하는 종양 세포에 대한 HLA-G 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 골수 세포의 활성화를 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 ADCC 또는 CDC에 의해 종양 세포 사멸을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 종양 세포 식세포 작용, 예를 들어 ADCP를 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 혈관신생을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 종양 세포 전이를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 종양 세포 증식을 억제한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다:
a. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및
b. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3.
여기서, 항체는 ILT2 및/또는 ILT4, 바람직하게는 ILT2 및 ILT4에 대한 HLA-G 결합을 차단하고, 항체는 HLA-G에 대해 10 nM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 한 실시양태에서, KD 값은 본 발명의 전장 항체를 사용하여 25℃의 온도에서 SPR에 의해 결정된다. 한 실시양태에서, 해리 상수는 HLA-G의 단량체 형태에 대해 결정된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다:
a. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및
b. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3.
여기서, 항체는 상기 기재된 바와 같은 HLA-G 매개 면역 억제 기능 중 적어도 하나를 억제한다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 키메라 항체, 인간화 또는 완전 인간 항체일 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. "키메라" 항체라는 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분(즉, 불변 영역)이 인간과 같은 또 다른 종에서 유래하면서 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인(또는 이의 적어도 일부)은 특정 공급원 또는 종, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 유사한 동물로부터 유래된 항체를 의미한다(Morrison; PNAS 81, 6851(1984)). 키메라 항체는 요소가 유래된 종의 특성을 유지하도록 두 개의 상이한 종에서 유래된 요소로 구성된다. "키메라 항체"의 하위 카테고리는 "인간화 항체"이다.
키메라 항체는 일반적으로 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산된다. DNA는 상응하는 비인간(예를 들어, 뮤린 또는 토끼) H 및 L 불변 영역을 인간 L 및 H 사슬 불변 영역에 대한 코딩 서열로 대체함으로써 변형될 수 있다.
인간화 항체(CDR 이식 항체 포함)는 비인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다(예를 들어, US 5,585,089; WO91/09967 참조). 전체 CDR보다는 CDR의 특이성 결정 잔기만 전달하는 것이 필요할 수 있다는 것이 이해될 것이다(예를 들어, 문헌 [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 인간화 항체는 선택적으로 CDR이 유래된 비인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
완전 인간 항체는 중쇄와 경쇄 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)이 모두 인간 기원이거나 또는 인간 기원의 서열에 대해 실질적으로 동일하지만 반드시 동일한 항체에서 나온 것은 아닌 항체이다. 완전 인간 항체의 예에는 예를 들어 상기 기재된 파지 디스플레이 방법에 의해 생산된 항체 및 뮤린 면역글로불린 가변 영역 및 선택적으로 불변 영역 유전자가 예를 들어 EP 0546073, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 0438474 및 EP 0463151에서 일반 용어로 설명된 바와 같이 그의 인간 대응물로 대체된 마우스에 의해 생산된 항체가 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 인간이다. 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 사슬이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템에서 얻어지는 경우 특정 생식세포 서열의 "산물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템에는 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 형질전환 마우스를 관심 항원으로 면역화하거나 또는 파지에 제시된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것이 포함된다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체 또는 그의 단편은 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 서열이 인간 항체의 서열과 가장 가까운(즉, 가장 큰 동일성 %) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 예를 들어 자연적으로 발생하는 체세포 돌연변이 또는 부위 지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인해 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 일반적으로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하며, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 뮤린 생식계열 서열)과 비교할 때 인간 항체를 인간 항체인 것으로 확인하는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 아미노산 서열이 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
인간 항체는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방법에 의해 생산될 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용하는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다(Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001; Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63, Marcel Dekker Inc, 1987). 대안적인 방법에는 인간 가변 영역 레퍼토리를 활용하는 파지 라이브러리 또는 형질전환 마우스의 사용이 포함된다(Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231 :1 1-23).
본 발명에 따른 항체는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 얻을 수 있다. HLA-G(이의 융합 단백질 포함), HLA-G를 발현하는(재조합 또는 자연적으로) 세포는 HLA-G를 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 다양한 형태의 HLA-G가 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 사용되는 항원은 바람직하게는 토끼 섬유모세포의 표면에서 발현되고, 바람직하게는 하기 실시예에서 설명되는 바와 같이 생성된 HLA-G이다. 한 실시양태에서, 사용되는 항원은 바람직하게는 토끼 섬유모세포의 표면에서 발현되고, 바람직하게는 하기 실시예에서 설명되는 바와 같이 생성된 B2m과 복합체화된 HLA-G이다.
숙주를 면역화하는데 사용하기 위한 HLA-G 또는 이의 단편은 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 관련 기술 분야에 널리 공지된 공정에 의해 제조될 수 있다. HLA-G 또는 이의 단편은 일부 경우에 예를 들어 친화도 태그 또는 유사한 것에 융합된 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부일 수 있다.
HLA-G에 대해 생성된 항체는 동물의 면역화가 필요한 경우, 잘 알려져 있는 일상적인 프로토콜을 사용하여 동물, 바람직하게는 인간이 아닌 동물에게 HLA-G 또는 이의 일부를 투여함으로써 얻을 수 있다(예를 들어, 문헌 [Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986] 참조). 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타, 돼지와 같은 많은 동물이 면역화될 수 있다. 그러나, 일반적으로 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 사용된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 그의 표면에 HLA-G를 발현하는 래트 섬유모세포를 투여함으로써 획득된다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법을 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하기 위한 일부 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)이 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 또한 예를 들어 문헌 [Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481]; 국제 특허 출원 공개 번호 WO92/02551; WO2004/051268 및 W02004/106377에 기술된 방법에 의해 특정 항체의 생산을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 관련 기술 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있으며, 문헌에 의해 개시된 방법을 포함한다(Brinkman et al. J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50, Ames et al. J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186, Kettleborough et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958, Persic et al. Gene, 1997 187 9-18, Burton et al. Advances in Immunology, 1994, 57:191-280). 특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합된 다음, 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 일반적으로 단일 사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 제시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 문헌 [Griffiths et al., EMBO J 12: 725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자기 항원 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을를 제공하기 위해 클로닝될 수 있다(예를 들어, 인간으로부터). 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 줄기세포에서 재배열되지 않은 V- 유전자 세그먼트를 클로닝하고, 가변성이 높은 CDR3 영역을 코딩하고 시험관 내에서 재배열을 수행하기 위해 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 나이브 라이브러리를 합성적으로 만들 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하고 있는 특허 및 출원 공개에는 예를 들어 US 5,750,373, and US 2005/0079574, US2005/0119455, US2005/0266000, US2007/0117126, US2007/0160598, US2007/0237764, US2007/0292936, 및 US2009/0002360을 포함한다.
항체 스크리닝은 HLA-G에 대한 결합을 측정하는 검정 및/또는 하나 이상의 그의 수용체에 대한 HLA-G의 결합을 차단하는 능력을 측정하는 검정을 사용하여 수행할 수 있다. 결합 검정의 한 예는 ELISA이고, 이것은 예를 들어 플레이트에 고정된 표적 폴리펩타이드의 융합 단백질을 사용하고 접합된 2차 항체를 사용하여 표적에 결합된 항체를 검출한다. 차단 검정의 예는 표적 폴리펩타이드에 결합하는 리간드 단백질의 차단을 측정하는 유세포 분석 기반 검정이다. 형광 표지된 2차 항체는 표적 폴리펩타이드에 결합하는 이러한 리간드 단백질의 양을 검출하는 데 사용된다.
원하는 활성(들)을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝하여 항체를 단리할 수 있다. 예를 들어, 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대한 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 항체는 항체가 생성된 동물의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 위에서 정의한 CDR 및 토끼 항체, 예를 들어 서열 번호 7에 따른 경쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 8에 표시됨) 및 서열 번호 11에 따른 중쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 12에 표시됨)을 포함하는 항체의 프레임워크 영역을 포함할 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간화 항체이다.
한 바람직한 실시양태에서, HLA-G에 결합하는 항체(여기서 항체는 인간화 항체임)는 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하며, 여기서
a. 가변 경쇄는 서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄는 서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화" 항체는 수용자 항체(예를 들어, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 이식된 공여자 항체(예를 들어, 비인간 항체, 예를 들어 뮤린 또는 토끼 모노클로날 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(원하는 경우, 하나 이상의 변형된 CDR 포함)을 중쇄 및/또는 경쇄가 함유하는 항체를 의미한다. 검토를 위해, 문헌 [Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조한다. 한 실시양태에서, 전체 CDR이 전달되는 대신, 상기 본원에서 설명된 CDR 중 어느 하나로부터의 특이성 결정 잔기 중 하나 이상만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다(예를 들어, 문헌 [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 한 실시양태에서, 상기 본원에서 설명된 하나 이상의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 본원에서 설명된 각각의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다.
CDR이 이식될 때, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 비롯하여 CDR이 유래되는 공여자 항체의 클래스/유형을 고려하여 임의의 적절한 수용자 가변 영역 프레임워크 서열이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체는 인간 수용자 프레임워크 영역뿐만 아니라, 본원에서 구체적으로 제공되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 도메인을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서 HLA-G에 결합하는 인간화 항체가 제공되며, 여기서 가변 도메인은 인간 수용자 프레임워크 영역 및 비인간 공여자 CDR을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(Kabat et al., 상기 참조). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 사용될 수 있으며, EU, LAY 및 POM은 중쇄와 경쇄 둘 모두에 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식계열 서열이 사용될 수 있으며; 이들은 http://www.imgt.org/에서 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 인간화 항체에서, 수용자 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 원하는 경우, 상이한 사슬로부터 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄에 적합한 프레임워크 영역은 서열 번호 103을 갖고 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 104에 제시되는 인간 생식계열 IGKV1D-13 IGKJ4로부터 유래된다.
본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄에 적합한 프레임워크 영역은 서열 번호 105을 갖고 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 106에 제시되는 인간 생식계열 IGHV3-66 IGKJ4로부터 유래된다.
따라서, 한 실시양태에서 HLA-G에 결합하는 인간화 항체가 제공되며, 여기서 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서
a. 경쇄 가변 영역은
서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3
을 포함하고;
b. 중쇄 가변 영역은
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3
을 포함하고,
여기서, 경쇄 프레임워크 영역은 서열 번호 103을 포함하는 인간 생식계열 IGKV1D-13 IGKJ4로부터 유래되고; 중쇄 프레임워크 영역은 서열 번호 105를 포함하는 인간 생식계열 IGHV3-66 IGHJ4로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
a. 서열 번호 19, 15 또는 23을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
b. 서열 번호 93, 27, 33, 57, 69, 75, 81 또는 87을 포함하는 중쇄 가변 영역.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 93을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 33을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 57을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 69를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 75를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 81을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 87을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 93을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1이고, 다음을 포함한다:
a. 서열 번호 21, 17, 또는 25를 포함하는 경쇄; 및/또는
b. 서열 번호 95, 29, 35, 59, 71, 77, 83, 또는 89를 포함하는 중쇄.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 17을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 29를 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 29를 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 25를 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 29를 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 35를 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 59를 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 71을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 77을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 83을 포함하는 중쇄를 포함한다. 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 89를 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 25를 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함한다.
유리하게는, IgG1은 활성 Fc 단편을 포함하고, 즉 Fc 매개 이펙터 기능을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fc매개 이펙터 기능을 포함한다.
"이펙터 기능"이라는 용어는 항체 이소형에 따라 달라지는 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 매개 식세포 작용(ADCP)이 포함된다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"라는 용어는 표적 결합 항체의 Fc 이펙터 도메인이 보체 성분 C1q에 결합하여 활성화하고, 이는 결국 보체 캐스케이드를 활성화하여 표적 세포 사멸로 이어지는 세포 사멸을 유도하는 메커니즘을 의미한다.
"항체 의존성 세포 독성" 또는 "ADCC"라는 용어는 이펙터 세포에서 발현되는 Fc 감마 수용체(FcγR)를 통해 용해 활성을 갖는 이펙터 세포, 예를 들어 자연 살해 세포, 단핵구, 대식세포 및 호중구와 항체 코팅 표적 세포의 상호작용에 따라 세포사멸을 유도하는 메커니즘이다.
"항체 의존성 세포 식세포 작용" 또는 "ADCP"라는 용어는 이펙터 세포에서 발현되는 Fc 감마 수용체(FcγR)를 통해 식세포 작용 활성을 갖는 이펙터 세포, 예를 들어 대식세포 및 호중구와 항체 코팅 표적 세포 또는 항체 코팅 가용성 표적의 상호작용에 따라 식세포 작용을 유도하는 메커니즘이다.
실시예에서 설명되는 바와 같이, 정상인 비종양 조직에서 HLA-G의 발현 패턴을 조사한 결과, 유리하게도 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 HLA-G의 형태가 건강한 조직에서, 특히 췌장 및 뇌하수체 조직에서 발현되지 않는 것으로 밝혀졌다.
이것은 췌장 소도에서 HLA-G 단백질의 발현을 보고한 문헌 [Cirulli et al., DIABETES, Vol. 55, May 2006]에서 이전에 보고된 것과 대조적이다. 즉, 상기 문헌의 저자들은 세포 복제를 지원하는 세포외 매트릭스에서 배양된 소도 세포에서 HLA-G의 유의한 상향조절을 관찰하였다. 또한, 예를 들어 뇌하수체뿐만 아니라 췌장 소도 및 고환에서도 HLA-G의 유전자 발현이 문헌 [Boegel et al., BMC Medical Genomics (2018) 11:36]에 의해 보고되었다.
따라서, 본원의 실시예에서 설명되는 결과는 놀라운 것이고, 선행 기술의 교시내용으로부터 예상했던 것과는 반대로, 예를 들어 Fc 매개 이펙터 기능을 통해 HLA-G를 발현하는 세포를 죽일 수 있는 HLA-G에 대한 항체가 정상 조직에 대한 결합을 통해 환자에 대한 독성이 예상되지 않는, 고형 종양 치료를 위한 잠재적인 후보를 나타냄을 보여준다. 또한, 활성 Fc를 포함하는 항체는 종양 미세환경(TME)에서 이펙터 세포 동원 및 활성화를 촉진할 수 있으며, 또한 HLA-G+ 종양 세포의 직접적인 사멸은 종양 항원의 국소 환경으로의 방출을 유도하여 면역 반응을 추가로 자극할 수 있다.
HLA-G와 이의 억제 수용체 사이의 상호작용을 차단할 수 있고 세포를 사멸할 수 있는, 본원에서 설명되는 항체의 이중 메카니즘은 고형 암에서와 같이 HLA-G가 상향조절된 환자의 치료에 상당한 이점을 나타낸다.
또한, 종양 불균일성은 각각의 메커니즘(면역 세포 활성화를 촉진하는 HLA-G 차단 및 활성 Fc 의존성 메커니즘을 통한 직접적인 종양 세포 사멸)의 중요성이 환자마다 다를 수 있음을 시사한다. 따라서, 종양 세포 사멸의 다중 메카니즘은 다양한 특징, 예를 들어 다양한 HLA-G 발현 패턴을 갖는 종양에서 다양한 메카니즘을 관여시키는 능력을 통해 더 넓은 범위의 환자에게 이익을 줄 수 있다.
본 발명의 HLA-G 항체를 선택하는 방법
HLA-G에 대한 항체의 생산과 관련된 특정 문제(예를 들어, 다른 HLA-I과의 높은 상동성, HLA-G와 그의 억제 수용체 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 항체의 확인)로 인해 및 치료에 유용할 항체를 확인하기 위해, HLA-G에 대한 결합의 측정, 결합 친화도 및 특이성의 평가(다른 HLA-G에 대한 교차 반응성 없음) 및 시험 항체의 기능적 특성의 평가뿐만 아니라 결합의 구조적 측면(표적 에피토프 잔기)에 대한 고처리량 측정을 수반하는 특수한 발견, 스크리닝 및 시험 전략이 개발되어야 하였다.
따라서, 다음을 포함하는, 본 발명에 따른 항체를 확인하는 방법이 제공돤다:
a) HLA-G 면역원성 조성물로 비인간 포유동물을 면역화시키는 단계;
b) 상기 비인간 포유동물로부터 B 세포를 회수하는 단계;
c) 다음 특성을 갖는 상기 B 세포에 의해 생산된 항체를 선택하는 단계:
i. 20 nM 미만의 해리 상수 KD로 표시되는 친화도로 HLA-G에 결합함;
ii. HLA-G 이외의 다른 HLA-I에 결합하지 않음; 및
iii. HLA-G와 ILT2 사이 및/또는 HLA-G와 ILT4 사이의 결합을 차단함.
a) 단계
"면역원성 조성물"은 상기 조성물이 투여된 비인간 포유동물에서 면역 반응을 생성할 수 있는 조성물을 의미한다. 면역원성 조성물은 전형적으로 투여된 포유동물에서 관심 면역원성 항원의 발현을 허용하며, 이에 대한 항체는 면역 반응의 일부로서 생성될 수 있다. "HLA-G 면역원성 조성물"은 상기 조성물이 투여된 포유동물에서 HLA-G에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 조성물을 의미한다.
"단백질 면역화"는 관심 항원을 포함하는 면역원성 단백질, 또는 상기 단백질의 면역원성 부분을 투여하는 기술을 의미한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 전장 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 단백질의 면역원성 부분을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 B2m과 복합체를 이루는 전장 HLA-G를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 B2m이 없는 전장 HLA-G를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 B2m과 회합되거나 회합되지 않은 HLA-G의 면역원성 부분을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 B2m과 복합체를 이루는 HLA-G의 세포외 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 B2m이 없는 HLA-G의 세포외 도메인을 포함한다.
"DNA 면역화"는 관심 항원에 대해 세포에서 면역학적 반응을 생성하기 위해 전장 단백질 또는 관심 항원을 포함하는 이의 면역원성 부분을 코딩하는 유전자 조작된 핵산 분자(본원에서 핵산 백신 또는 DNA라고도 함)를 포유동물의 세포에 직접 투여하는 기술을 의미한다. DNA 면역화는 투여된 핵산 분자에 상응하는 펩타이드(들)를 발현하고/하거나, 예상 효과, 특히 세포 수준에서의 항원 발현, 및 세포 수준에서 또는 숙주 유기체 내에서 추가의 면역치료 효과(들)를 달성하기 위해 숙주 세포 기구를 사용한다.
"세포 면역화"는 관심 항원을 포함하는 면역원성 단백질, 또는 상기 관심 항원 또는 그의 면역원성 부분을 포함하는 상기 단백질의 면역원성 부분을 자연적으로 발현하거나 이들로 형질감염된 세포를 투여하는 기술을 의미한다. 한 실시양태에서, 단계 a)에서의 면역화는 관심 항원을 포함하는 면역원성 단백질, 또는 상기 관심 항원 또는 그의 면역원성 부분을 포함하는 상기 단백질의 면역원성 부분으로 형질감염된 섬유모세포를 이용한 세포 면역화를 사용하여 수행된다.
"면역원성 부분"은 본 발명의 항체의 생산을 가능하게 하기 위해 관심 단백질 또는 항원의 일부 또는 이를 코딩하는 DNA가 투여된 비인간 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는 상기 관심 단백질 또는 항원의 부분을 의미한다.
HLA-G(이의 융합 단백질 포함), HLA-G를 발현하는(재조합 방식으로 또는 자연적으로) 세포는 HLA-G를 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 다양한 형태의 HLA-G가 사용될 수 있다.
숙주를 면역화하는데 사용하기 위한 HLA-G 또는 이의 단편은 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 관련 기술 분야에 널리 공지된 공정에 의해 제조될 수 있거나, 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. HLA-G 또는 이의 단편은 일부 경우에 예를 들어 친화도 태그 또는 유사한 것에 융합된 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부일 수 있다.
한 실시양태에서, 면역화 단계는 단백질 면역화, DNA 면역화, 세포 면역화 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 비인간 포유동물은 마우스이다. 한 실시양태에서, 비인간 포유동물은 래트이다. 한 실시양태에서, 비인간 포유동물은 토끼이다. 한 실시양태에서, 토끼는 뉴질랜드 백색 토끼이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역원성 조성물의 피하 주사에 의해 면역화된다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 세포 표면 상에 HLA-G를 일시적으로 발현하는 토끼 섬유모세포를 포함한다. 한 예에서, 토끼 섬유모세포는 서열 번호 111을 포함하는 HLA-G를 코딩하는 DNA 서열로 형질감염되었다. 또 다른 실시양태예에서, 면역원성 조성물은 세포 표면 상에 HLA-G 및 B2m을 일시적으로 동시 발현하는 토끼 섬유모세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 토끼 섬유모세포는 Rab9 토끼 섬유모세포이다.
면역화 단계는 면역원성 조성물의 제1 투여(프라임(prime) 면역화 또는 프라임 투여) 및 면역화 프로토콜 과정 내에서 제1 투여와 시간상 분리된 적어도 1회의 추가의 투여(부스트(boost) 면역화 또는 부스트 투여)를 의미하는 프라임-부스트 면역화 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다. 부스트 면역화에는 1회, 2회, 3회 또는 그 초과의 투여가 포함된다. 한 실시양태에서, 부스트 면역화는 14일 간격으로 면역원성 조성물을 2회 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역화 단계는 세포 표면 상에 HLA-G를 일시적으로 발현하는 토끼 섬유모세포의 1차 투여에 이어, 14일 간격으로 2회의 부스트 면역화를 포함한다. 한 실시양태에서, 토끼 섬유모세포는 Rab9 토끼 섬유모세포 세포이다.
한 실시양태에서, 프라임 면역화는 아주반트의 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 아주반트는 면역원성 조성물의 주사 부위와 다른 부위에 투여된다. 한 실시양태에서, 아주반트는 프로인트(Freund) 아주반트이다. 한 실시양태에서, 프라임 면역화 및 부스트 면역화 둘 모두는 프로인트 아주반트와 같은 아주반트의 투여를 포함한다.
한 실시양태에서, 면역화 단계는 제1 아주반트의 존재 하에 프라임 면역화, 이어서 제2 아주반트의 존재 하에 적어도 1회의 부스트 면역화를 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 피하 주사, 예를 들어 어깨에 투여된다.
"아주반트"는 면역 자극제를 의미한다. 아주반트는 관련 기술 분야에 잘 알려진 물질이다. 면역 자극제 또는 항원 전달 시스템 또는 둘 모두로 작용하는 전통적인 아주반트는 예를 들어 명반, 폴리사카라이드, 리포솜, 생분해성 중합체 기반 나노입자, 리포폴리사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 아주반트는 프로인트 아주반트, 몬타나이드(Montanide) 아주반트, 파마(Fama) 아주반트일 수 있다.
단계 b)
B 세포를 단리하는 방법은 잘 알려져 있으며, 일반적으로 PBMC(말초 혈액 단핵 세포), 골수로부터 또는 2차 림프 기관, 즉 림프절 또는 비장으로부터 B 세포를 단리하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 특이적 기억 B 세포의 단리는 면역화 단계 a) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 후에 수행된다. 한 실시양태에서, B 세포 단리는 면역화 단계 a) 14일 후에 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 b)는 유세포 분석법에 의해 항원 특이적 B 세포를 분류하는 것을 포함한다.
단계 c)
단계 c)의 스크리닝 단계는 예를 들어 본 개시내용에 기재된 바와 같은 결합 및 차단 활성을 측정하는 방법에 따라 수행될 수 있다.
i. 20 nM 미만의 해리 상수(KD)로 표시되는 친화도로 HLA-G에 결합함.
결합은 가용성 및/또는 막 결합 HLA-G에 대해 결정될 수 있다. HLA-G에 대한 결합은 예를 들어 실시예에서 설명되는 바와 같이 비아코어® 시스템과 같은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정될 수 있다. 한 예에서, 친화도는 본원의 실시예에서 설명되는 바와 같이 B2m과 복합체를 이루는 재조합 HLA-G ECD에 대해 비아코어에 의해 측정되며, 20 nM 미만의 KD로 결합하는 항체가 추가의 분석을 위해 선택될 수 있다. 한 예에서, 해리 상수 KD는 전장 항체로서 발현된 항체와 HLA-G의 단량체 형태 사이에서 25℃의 온도에서 SPR에 의해 결정된다.
대안적으로 또는 추가로, HLA-G에 대한 결합은 HLA-G를 발현하는 세포, 예를 들어 HLA-G 및 B2m으로 형질감염된 HEK293, 또는 자연적으로 HLA-G를 발현하는 JEG3 세포에 대한 FACS에 의해 결정될 수 있다. FACS에 의해 HLA-G에 대한 항체의 친화도를 측정하는 방법은 본원에서 설명되는 실시예에 제공된다.
유리하게는, 항체는 가용성 HLA-G와 세포 발현 HLA-G 둘 모두에 대한 결합 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
ii. HLA-G 이외의 다른 HLA-I에 결합하지 않음.
결합 특이성, 즉 HLA-G에 특이적인 아미노산이 다른 HLA-I("HLA-G Null 구축물")에서 발견되는 컨센서스 아미노산으로 치환된 HLA-G 구축물 변이체의 생성과 관련된 다른 HLA-I에 대한 교차 반응성의 부재를 평가하기 위한 특별한 스크리닝 전략이 개발되었다. 실시예 1에서 설명되는 HLA-G Null 구축물은 HLA-G에 특이적인 항체를 스크리닝하는 데 특히 유용할 수 있다.
"HLA-G Null 1,2,3"은 HLA-G α1, α2 및 α3에서 특이적으로 발현되는 아미노산이 다른 HLA-I에서 발현되는 컨센서스 아미노산으로 치환된 HLA-G 변이체에 상응한다(20개의 아미노산이 돌연변이됨).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체를 확인하는 방법은 단계 b) 후에 회수된 항체를 "HLA-G Null 1,2,3"에 대해 스크리닝하고, 결합이 검출되지 않는 항체를 선택하는 것을 포함한다. 스크리닝은 세포의 표면에서 발현된 "HLA-G Null 1,2,3"(예를 들어, 서열 번호 115 포함)에 대해 또는 가용성 "HLA-G Null 1,2,3"(ECD)(예를 들어, 서열 번호 113 포함)에 대해 수행될 수 있다.
다른 HLA-I에 대한 결합은 실시예에서 설명되는 방법에 따라 추가로 평가될 수 있다. HEK293 세포는 HLA-A, B, C, E 또는 F(예를 들어, 각각 서열 번호 131, 133, 135, 137 및 139를 포함하는 DNA 서열) 및 B2m(예를 들어, 서열 번호 130을 포함하는 DNA 서열)을 코딩하는 DNA 서열로 형질감염될 수 있다. 세포 발현 HLA-I에 대한 결합은 FACS에 의해 평가될 수 있다.
iii. HLA-G와 ILT2 사이 및/또는 HLA-G와 ILT4 사이의 결합을 차단함.
ILT2 및/또는 ILT4에 대한 HLA-G 결합의 차단은 세포의 표면에서 발현되는(예를 들어, 실시예에서 설명되는 바와 같이, JEG3 세포의 표면에서 자연적으로 발현되거나 또는 HCT116 세포의 표면에서 일시적으로 발현되는) B2m과 회합된 HLA-G와, 예를 들어 융합 단백질, 예를 들어 Fc 융합 단백질(ITT2-Fc, ILT4-Fc)로서 발현된 ILT2 및/또는 ILT4 사이의 상호작용의 차단을 측정하여 평가할 수 있다.
필요한 특성을 갖고 단계 c) 이후에 선택되는 항체는 예를 들어 특이성 검정, ADCC, ADCP, CDC, 생물물리학적 및 안정성 검정, 및 면역 환경을 조절하고 생체외 배양 인간 원발성 종양에서 종양 세포 사멸을 유도하는 능력을 포함하는 추가의 검정, 예를 들어 본원의 실시예에서 설명되는 방법을 기반으로 하여 추가로 특성화되고, 구분될 수 있다.
에피토프
본 발명 내에서, 용어 "에피토프"는 입체형태적 및 선형 에피토프 둘 모두에 대해 교환 가능하게 사용된다. 입체형태적 에피토프는 항원의 1차 아미노산 서열의 중단된 섹션으로 구성되고, 선형 에피토프는 연속적인 아미노산에 의해 형성된 서열에 의해 형성된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G 알파 3 도메인에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 107에서의 잔기 F195 및 Y197을 포함하는 HLA-G의 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G 상의 에피토프에 결합하며, 상기 에피토프는 잔기 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257을 포함한다(여기서, 넘버링은 서열 번호 107에 따른다).
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 B2m에 결합하지 않는다. 따라서, 유리하게는, 본 발명의 항체는 B2m과 복합체를 이루는 HLA-G에 결합하거나 B2m의 부재 하에 HLA-G에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G와 복합체로서 자연적으로 발현되는 HLA-G 동족 펩타이드와 동일한 HLA-G 상의 결합 부위에 결합하지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HLA-G와 복합체로서 자연적으로 발현되는 그의 동족 펩타이드와 HLA-G 사이의 회합을 차단하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G 상의 에피토프에 결합하는 항-HLA-G 항체를 제공하며, 상기 에피토프는 HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 전부를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 에피토프에 결합하는 인간화 IgG1 항체를 제공하고, 상기 에피토프는 인간 HLA-G(서열 번호 107)의 잔기 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 탈푸코실화된 IgG1이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G 상의 에피토프에 결합하는 항-HLA-G 항체를 제공하며, 상기 에피토프는 4 Å 미만의 접촉 거리에서 결정될 때 HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 전부를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 탈푸코실화된 IgG1이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 에피토프에 결합하는 인간화 IgG1 항체를 제공하며, 상기 에피토프는 4 Å 미만의 접촉 거리에서 결정될 때 HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 전부를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 탈푸코실화된 IgG1이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 에피토프에 결합하는 인간화 IgG1 항체를 제공하며, 상기 에피토프는 5 Å 미만의 접촉 거리에서 결정될 때 HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250, E253, 및 Y257로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 전부를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 탈푸코실화된 IgG1이다.
에피토프는 본 발명에 의해 제공되는 항체 중 어느 하나와 조합하여 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 에피토프 매핑 방법에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법의 예는 본 발명의 항체 또는 이의 단편에 결합하기 위해 전장 HLA-G로부터 유래된 다양한 길이의 펩타이드를 스크리닝하고, 항체에 의해 인식되는 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 확인하는 것을 포함한다. HLA-G 펩타이드는 합성으로 생산되거나, HLA-G의 단백질 분해 소화에 의해 생산될 수 있다. 항체에 결합하는 펩타이드는 예를 들어 질량 분광 분석에 의해 확인될 수 있다. X선 결정학, 핵자기공명(NMR) 분광학 또는 수소 중수소 교환 질량 분광 분석(HDX-MS)와 같은 방법을 사용하여 항체에 결합된 에피토프를 확인할 수 있다. 전형적으로, 에피토프 결정이 X-선 결정학에 의해 수행될 때, CDR로부터 4 Å 내에 있는 항원의 아미노산 잔기는 에피토프의 아미노산 잔기 부분으로 간주된다. 일단 확인되면, 에피토프는 본 발명의 항체에 결합하는 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있고, 필요한 경우 동일한 에피토프에 결합하는 추가의 항체를 얻기 위한 면역원으로 사용될 수 있다.
본 발명을 설명하는 측면 및 실시양태에 표시된 에피토프는 바람직하게는 X-선 결정학에 의해 특징이 결정되는 에피토프이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G 상의 에피토프에 결합하는 항-HLA-G 항체를 제공하며, 상기 에피토프는 4 Å 미만의 접촉 거리에서 결정될 때 HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 전부를 포함하고, 에피토프는 X-선 결정학에 의해 특징이 결정된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 에피토프에 결합하는 인간화 IgG1 항체를 제공하며, 상기 에피토프는 4 Å 미만의 접촉 거리에서 결정될 때 HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 전부를 포함하고, 에피토프는 X-선 결정학에 의해 특징이 결정된다. 한 실시양태에서, 항체는 탈푸코실화된 IgG1이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 에피토프에 결합하는 인간화 IgG1 항체를 제공하며, 상기 에피토프는 X-선 결정학에 의해 5 Å 미만의 접촉 거리에서 결정될 때 HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250, E253 및 Y257로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 전부를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 탈푸코실화된 IgG1이다.
또한, HDX-MS 및 NMR을 사용하여 용액 내의 상호작용을 분석하고, 결정학에서 항상 명확하지는 않은 알로스테릭(allosteric) 또는 입체형태적 변화를 보여줄 수 있다. 예를 들어, 30초의 중수소 인큐베이팅에서 HDX-MS에서 확인된 잠재적 결합 영역은 178-MLQRADPPKTHVTHHPVFD-196 및 214-ILTWQRDGEDQTQDVEL-230이었다.
한 실시양태에서, 모든 계산된 이동의 평균(>0.0764)을 초과하는 것으로서 엄격도가 증가하는 것으로 정의되는 NMR에 의해 결정된 에피토프는 잔기 T200, L201, L215, W217, R219, D220, E229, A245, A246, V247, V249, S251, E253, Q255, T258, H260, V261 및 W274를 포함한다.
한 실시양태에서, 모든 계산된 이동의 평균 + 1 표준 편차(>0.1597)를 초과하는 것으로서 엄격도가 증가하는 것으로 정의되는 NMR에 의해 결정된 에피토프는 잔기 H191, Y197, E198, R202, L230, V248, G252, C259 및 K275를 포함한다.
항체는 HLA-G에 결합하기 위해 경쇄, 중쇄, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역 또는 CDR 서열과 관련하여 위에서 정의된 것과 경쟁하거나 상기 정의된 것과 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
특히, 본 발명은 HLA-G에 결합하기 위해 서열 번호 1/2/3/4/5/6의 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열 조합을 포함하는 항체와 경쟁하거나 상기 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 HLA-G에 결합하기 위해 각각의 서열 번호 19 및 93의 VL 및 VH 서열 쌍을 포함하는 항체와 경쟁하거나 상기 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 항체는 HLA-G에 결합하기 위해 서열 번호 1/2/3/4/5/6의 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열 조합을 포함하는 IgG1과 경쟁하거나 상기 IgG1과 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 항체는 HLA-G에 결합하기 위해 각각의 서열 번호 19 및 93의 VL 및 VH 서열 쌍을 포함하는 IgG1과 경쟁하거나 상기 IgG1과 동일한 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G에 결합하기 위해 서열 번호 1/2/3/4/5/6의 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열 조합을 포함하는 항체와 교차 경쟁하는 항체를 제공한다.
본 발명의 맥락에서, HLA-G에 결합하기 위해 본 발명에 따른 참조 항체와 경쟁하거나 상기 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 본원에서 제공되는 항체는 상기 섹션에서 설명된 참조 항체의 유리한 특성, 예를 들어 HLA-G에 대한 특이성, 높은 친화도, ILT2 및/또는 ILT4 차단 활성을 유지한다. 한 예에서, HLA-G에 결합하기 위해 본 발명에 따른 참조 항체와 경쟁하거나 상기 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 다음을 갖는다:
a. 전장 항체로서 발현된 상기 항체와 HLA-G의 단량체 형태 사이에서, 예를 들어 25℃의 온도에서 SPR에 의해 결정될 때 20 nM 미만, 특히 15 nM 미만, 특히 10 nM 미만, 특히 9 nM 미만, 특히 8 nM 미만, 특히 7 nM 미만, 특히 6 nM 미만 또는 특히 5 nM 미만의 해리 상수(KD); 및/또는
b. 예를 들어 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 대량의 반응 부피를 사용하는 시험관내 검정을 사용하여 결정될 때 JEG3 세포의 표면에서 자연적으로 발현되는 HLA-G에 대한 ILT2의 결합을 차단하기 위한 20 pM 미만의 IC50; 및/또는
c. 예를 들어 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 결정될 때 HLA-G에 대한 ILT4의 결합을 차단하기 위한 1400 pM 미만의 IC50.
항체가 결합을 위해 참조 항체와 경쟁하는지 확인하기 위해, 위에서 설명한 결합 방법을 두 가지 다른 실험 설정에서 수행한다. 첫 번째 설정에서는, 참조 항체가 포화 조건 하에서 항원에 결합하도록 허용한 후, 항원에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 두 번째 설정에서는, 포화 조건 하에서 시험 항체가 항원에 결합하도록 허용한 후, 참조 항체의 단백질/펩타이드에 대한 결합을 평가한다. 두 실험 설정 모두에서 첫 번째(포화) 항체만이 단백질/펩타이드에 결합할 수 있다면, 시험 항체와 참조 항체가 항원 결합을 위해 경쟁한다고 결론지을 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 참조 항체와 결합을 위해 경쟁하는 항체는 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩되거나 인접한 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단하거나, 입체형태적 변화를 야기하여 결합의 부족을 발생시킬 수 있다.
두 항체가 서로 경쟁적으로 항원에 대한 다른 항체의 결합을 억제(차단)하는 경우, 두 항체는 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 대안적으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는 것이다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 중첩되는 에피토프를 갖는 것이다.
그런 다음, 추가의 통상적인 실험(예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여 관찰된 시험 항체의 결합 부족이 실제로 참조 항체와 동일한 항원 부분에 대한 결합으로 인한 것인지 또는 입체적 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합 부족의 원인인지 확인할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포 분석 또는 관련 기술 분야에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다.
항체 변이체
항체가 다양한 번역 후 변형을 겪을 수 있다는 것도 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 이러한 변형의 유형 및 정도는 종종 항체를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포주와 배양 조건에 따라 달라진다. 이러한 변형에는 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화의 변형이 포함될 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다제의 작용으로 인한 카르복시 말단 염기성 잔기(예를 들어, 라이신 또는 아르기닌)의 손실이다(문헌 [Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 설명됨). 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 라이신은 부재할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체로부터의 C-말단 아미노산은 번역 후 변형 동안 절단된다.
한 실시양태에서, 항체로부터의 N-말단 아미노산은 번역 후 변형 동안 절단된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이 유발에 대한 관심 부위에는 CDR 및 FR이 포함된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입될 수 있으며, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 유지/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 향상된 ADCC, CDC 및/또는 ADCP에 대해 스크리닝될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항-HLA-G 항체의 아미노산 서열 변이체는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 변형을 도입하거나, 펩타이드 합성을 통해 제조될 수 있다. 이러한 변형에는 예를 들어 항-HLA-G 항체의 아미노산 서열(예를 들어, 하나 이상의 CDR 및/또는 프레임워크 서열 또는 VH 및/또는 VL 도메인) 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 최종 구축물이 원하는 특성을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 통해 최종 구축물에 도달할 수 있다.
본원에서 제공되는 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 함유한다.
HLA-G에 결합하고 HLA-G 활성을 중화시키는 항체의 능력을 유의하게 변경하지 않으면서 본 발명에 의해 제공되는 CDR에 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 효과는 HLA-G 결합 및 그의 천연 리간드와 HLA-G의 상호작용의 억제를 결정하기 위해, 예를 들어 본원에서 설명되는 방법, 특히 실시예에 예시된 방법을 사용하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 시험될 수 있다.
따라서, 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 CDR은 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 함유하며, 이러한 아미노산 치환은 보존적이며, 항체는 HLA-G에 대한 그의 결합 특성을 유지한다.
따라서, 본 발명은 CDR-L1(서열 번호 1 포함), CDR-L2(서열 번호 2 포함), CDR-L3(서열 번호 3 포함), CDR-H1(서열 번호 4 포함), CDR-H2(서열 번호 5 포함) 및 CDR-H3(서열 번호 6 포함)으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항-HLA-G 항체를 제공하고, 여기서 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산, 예를 들어 하기 본원에서 정의되는 바와 유사한 아미노산으로 치환되었다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CDR-L1(서열 번호 1 포함), CDR-L2(서열 번호 2 포함), CDR-L3(서열 번호 3 포함), CDR-H1(서열 번호 4 포함), CDR-H2(서열 번호 5 포함) 및 CDR-H3(서열 번호 6 포함)을 포함하는 항-HLA-G 항체를 제공하고, 여기서 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산, 예를 들어 하기 본원에서 정의되는 바와 유사한 아미노산으로 치환되었다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR-L1의 서열은 서열 번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고/하거나, CDR-L2는 서열 번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고/하거나, CDR-L3은 서열 번호 3에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR-H1의 서열은 서열 번호 4에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고/하거나, CDR-H2는 서열 번호 5에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고/하거나, CDR-H3은 서열 번호 6에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 서열 번호 19, 서열 번호 15 또는 서열 번호 23에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 서열 번호 93, 27, 33, 57, 69, 75, 81 또는 87에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 번호 19에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고/하거나, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 93에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하는 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열을 포함하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 나머지는 각각 서열 번호 19 및 서열 번호 93에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 서열 번호 21, 서열 번호 17 또는 서열 번호 25에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 서열 번호 95, 29, 35, 59, 71, 77, 83 또는 89에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 서열 번호 21에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 95에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 IgG1이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 제시된 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열을 포함하는 IgG1이고, 경쇄 및 중쇄의 나머지는 각각 서열 번호 21 및 서열 번호 95에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는다.
본 발명에 의해 본원에서 제공되는 항-HLA-G 항체 변이체는 모 항체(즉, 비변형 항체)의 유리한 특성, 즉 위에서 설명한 기능적 특성, 예를 들어 높은 특이성, 높은 친화도, ILT2 및/또는 ILT4 차단 활성을 유지한다. 한 예에서, 본 발명에 의해 제공되는 항-HLA-G 항체 변이체는 다음 특성을 갖는다:
a. 전장 항체로서 발현된 상기 항체와 HLA-G의 단량체 형태 사이에서, 예를 들어 25℃의 온도에서 SPR에 의해 결정될 때 20 nM 미만, 특히 15 nM 미만, 특히 10 nM 미만, 특히 9 nM 미만, 특히 8 nM 미만, 특히 7 nM 미만, 특히 6 nM 미만 또는 특히 5 nM 미만의 해리 상수(KD); 및/또는
b. 예를 들어 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 대량의 반응 부피를 사용하는 시험관내 검정을 사용하여 결정될 때 JEG3 세포의 표면에서 자연적으로 발현되는 HLA-G에 대한 ILT2의 결합을 차단하기 위한 20 pM 미만의 IC50; 및/또는
c. 예를 들어 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 결정될 때 HLA-G에 대한 ILT4의 결합을 차단하기 위한 1400 pM 미만의 IC50.
서열 동일성 및 유사성
서열 간의 동일성 및 유사성 정도를 쉽게 계산할 수 있다. "서열 동일성 %"(또는 "서열 유사성 %")는 (1) 비교 창(예를 들어, 더 긴 서열의 길이, 더 짧은 서열의 길이, 특정된 창 등)에 걸쳐 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하고, (2) 일치하는 위치의 수를 산출하기 위해 동일한(또는 유사한) 아미노산을 포함하는 위치의 수(예를 들어, 동일한 아미노산이 두 서열 모두에 발생하고 유사한 아미노산이 두 서열 모두에 발생함)를 결정하고, (3) 일치하는 위치의 수를 비교 창(예를 들어, 더 긴 서열의 길이, 더 짧은 서열의 길이, 특정된 창)의 전체 위치의 수로 나누고, (4) 서열 동일성 % 또는 서열 유사성 %를 얻기 위해 결과에 100을 곱함으로써 계산된다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 국소 상동성 알고리즘(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), 상동성 정렬 알고리즘(Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), 유사성 검색 방법(Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), 이들 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행(Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재), 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 바람직한 예에는 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 포함된다. 또한, 디폴트 또는 권장 파라미터를 사용하여 FASTA를 사용하여 폴리펩타이드 서열을 비교할 수도 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 질의 서열과 검색 서열 사이에 가장 잘 중첩되는 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다.
특정 실시양태에서, 그 변경이 표적에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다.
예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경이 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR의 항원 접촉 잔기 외부에서 이루어질 수 있다.
보존적 치환은 보다 실질적인 "예시적 치환"과 함께 표 1에 제시되어 있다.
항체 변이체의 생물학적 특성에 대한 실질적인 변형은 치환 영역에서 폴리펩타이드 백본의 구조, 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성 유지 또는 측쇄의 부피 유지에 대한 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 아미노산은 측쇄 특성의 유사성에 따라 분류될 수 있다(A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)).
치환 변이체의 한 유형은 모 항체(인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 CDR 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)에서는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)이 변경되고/되거나, 모 항체의 특정 생물학적 특성이 실질적으로 유지될 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게 설명하면, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 제시되고, 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해 CDR에 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩되는 잔기(예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)] 참조). 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 이루어질 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 다양한 방법(예를 들어, 오류 빈발 PCR, 사슬 셔플링 또는 올리고뉴클레오타이드 지정 돌연변이 유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 그런 다음, 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다.
돌연변이 유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하는 데 사용될 수 있는 방법 중 하나는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이다(Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085). 이 방법에서, 하나의 잔기 또는 다수의 표적 잔기를 확인하고, 알라닌으로 대체하여 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 X선 구조를 사용하여 항체와 그의 항원 사이의 접촉점을 확인할 수 있다. 원하는 특성을 포함하는지 결정하기 위해 변이체를 스크리닝할 수 있다.
불변 영역 변이체
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공되는 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 특정 항체 변이체가 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
반감기가 증가하고 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체는 예를 들어 US2005/0014934A1에 기재되어 있다. 이러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 향상시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334(EU 잔기 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
이펙터 기능이 감소된 항체에는 Fc 영역 잔기 234, 235, 237, 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상이 치환된 항체가 포함된다(예를 들어, US 6,737,056 참조). 이러한 Fc 돌연변이체에는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환이 있는 Fc 돌연변이체가 포함되며, 여기서 아미노산 잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 검정을 수행하여 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만(따라서, ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음), FcRn 결합 능력은 유지하는지 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예는 US5,500,362; 미국 5,821,337에 기재되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q에 결합할 수 없어 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.I Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소/반감기 결정은 또한 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al, Int l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)] 참조).
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은 존재하는 경우 항체 분자의 제안된 기능, 특히 필요할 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료 용도로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구되는 경우에, 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 IgG1 및 IgG3 이소형이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료 목적으로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않는 경우에는, IgG2 및 IgG4 이소형이 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체도 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 야생형 인간 IgG1(IgG1로 지칭됨)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1의 불변 영역에 아미노산 치환 L234A/L235A(EU 넘버링에 따름)가 도입된 야생형 인간 IgG1 이소형의 돌연변이체인 IgG1 LALA이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21의 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 97의 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1의 불변 영역에 아미노산 치환 L234A/L235A/G237A(EU 넘버링에 따름)가 도입된 야생형 인간 IgG1 이소형의 돌연변이체인 IgG1 LALAGA이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 문헌 [Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 기재된 바와 같이 아미노산 228(EU 넘버링에 따름)이 프롤린으로 대체된 야생형 인간 IgG4 이소형의 돌연변이체인 IgG4P이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21의 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 99의 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG4의 불변 영역에 치환 F234A/L235A(EU 넘버링에 따름)가 도입된 야생형 인간 IgG4 이소형의 돌연변이체인 IgG4 FALA이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 228(EU 넘버링에 따름)이 프롤린으로 대체되고 IgG4의 불변 영역에 아미노산 치환 F234A/L235A(EU 넘버링에 따름)이 도입된 야생형 인간 IgG4 이소형의 돌연변이체인 IgG4P FALA이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21의 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 101의 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
글리코실화 변형
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가의 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 글리코 변형된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 푸코스 함량이 낮거나 푸코스가 존재하지 않는다. "푸코스 함량"은 각각의 항체의 각각의 중쇄의 Fc 단편의 Asn297 잔기에 부착된 N-글리칸 내의 푸코실화된 형태의 백분율을 의미한다. "낮은 푸코스 함량"은 65% 이하의 푸코스 함량을 의미한다. 실제로, 항체 조성물의 낮은 푸코스 함량은 FcγRIII를 통해 강력한 ADCC 반응을 유도하는 상기 조성물의 능력에 결정적인 역할을 한다는 것이 현재 알려져 있다. 유리하게는, 푸코스 함량은 65% 이하, 바람직하게는 60%, 55% 또는 50% 이하, 심지어 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 25%, 20% 이하이다. 그러나, 푸코스 함량이 반드시 0일 필요는 없으며, 예를 들어 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 탈푸코실화된 IgG1이다. 탈푸코실화된 IgG1의 생산 방법은 잘 알려져 있으며, 탈푸코실화된 항체의 생산을 위해 유전적으로 변형된 세포의 생산을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 탈푸코실화된 IgG1은 알파1,6 푸코실트랜스퍼라제(FUT8)를 코딩하는 유전자가 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해 유전적으로 낙아웃된 CHO 세포에서 생산된다. 예를 들어, KO FUT8 CHOSXE/DG44 세포는 본 개시내용에서 제공되는 실시예에서 설명되는 바와 같이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 개선된 ADCC 및/또는 ADCP를 갖고/갖거나, HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 개선된 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 탈푸코실화된 항체의 ADCC 및/또는 ADCP 기능 및/또는 HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 능력은 상응하는 통상적인(즉, 푸코실화된) 항체(즉, 동일한 아미노산 서열을 포함하지만, 예를 들어 변형되지 않고 FUT8을 발현하는 CHO 세포에서 생성된 푸코스를 포함하는 항체)에 비해 개선된다. 본 발명의 맥락에서, "개선된" 활성(예를 들어, ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 종양 세포 고갈)은 탈푸코실화된 항체의 활성(예를 들어, ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 종양 세포 고갈)이 참조 항체(즉, 상응하는 통상적인 항체, 즉 푸코실화된 항체)의 동일한 활성보다 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 더 높다는 것을 의미한다.
관련 기술 분야에 널리 공지된 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행하여, 예를 들어 본원에서 설명되는 바와 같은 ADCC 및/또는 ADCP 활성의 증가를 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함하는 탈푸코실화된 IgG1이다:
a. 서열 번호 21, 17, 또는 25를 포함하는 경쇄; 및/또는
b. 서열 번호 95, 29, 35, 59, 71, 77, 83, 또는 89를 포함하는 중쇄.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함하는 탈푸코실화된 IgG1이다:
a. 서열 번호 21, 17, 또는 25와 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 포함하는 경쇄; 및/또는
b. 서열 번호 95, 29, 35, 59, 71, 77, 83 또는 89와 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 포함하는 중쇄.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 서열 번호 21에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 95에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 탈푸코실화된 IgG1이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 제시된 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 서열을 포함하고, 경쇄 및 중쇄 가변의 나머지는 각각 서열 번호 21 및 서열 번호 95에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 탈푸코실화된 IgG1이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 93을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 탈푸코실화된 IgG1이며, 여기서 경쇄 및 중쇄의 나머지는 각각의 서열 번호 21 및 95에 대해 적어도 90%의 동일성 또는 유사성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함하고, 개선된 ADCC 및/또는 ADCP 기능을 갖고/갖거나, HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 개선된 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, ADCC 및/또는 ADCP 기능 및/또는 HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 능력은 상응하는 통상적인 항체(즉, 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함하는 푸코실화된 항체)에 비해 개선된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함하고, 개선된 CDC 기능을 갖고/갖거나, HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 개선된 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, CDC 및/또는 HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 능력은 상응하는 통상적인 항체(즉, 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함하는 푸코실화된 항체)에 비해 개선된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-HLA-G 항체는 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 93을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열 번호 21을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함하는 탈푸코실화된 IgG1이고, 개선된 ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 CDC 기능을 가지며, HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 개선된 능력을 갖는다.
항체와 같은 생물학적 분자는 산성 및/또는 염기성 작용기를 포함하여 분자에 순 양전하 또는 음전하를 부여한다. "관찰된" 전하의 총량은 엔티티의 절대 아미노산 서열, 3D 구조에서 전하를 띤 기의 국소 환경 및 분자의 환경 조건에 따라 달라진다. 등전점(pI)은 특정 분자 또는 용매에 접근할 수 있는 그의 표면이 순 전하를 보이지 않는 pH이다. 한 예에서, HLA-G에 결합하는 항체는 적절한 등전점을 갖도록 조작될 수 있다. 이는 보다 견고한 특성, 특히 적합한 용해도 및/또는 안정성 프로파일 및/또는 개선된 정제 특성을 갖는 항체를 생성할 수 있다.
예를 들어, 산성 아미노산 잔기를 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 대체하는 것과 같이 아미노산 잔기를 대체함으로써 항체를 조작할 수 있다. 대안적으로, 염기성 아미노산 잔기가 도입될 수 있거나, 산성 아미노산 잔기가 제거될 수 있다. 대안적으로, 분자가 허용할 수 없을 정도로 높은 pI 값을 갖는 경우, 필요에 따라 산성 잔기를 도입하여 pI을 낮출 수 있다. pI를 조작할 때 항체 또는 단편의 바람직한 활성을 유지하도록 주의를 기울여야 하는 것이 중요하다. 따라서, 한 실시양태에서, 조작된 항체는 "비변형" 항체 또는 단편과 동일하거나 실질적으로 동일한 활성을 갖는다.
** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.ht ml, 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.ht ml과 같은 프로그램이 항체의 등전점을 예측하는 데 사용될 수 있다.
이펙터 분자
필요한 경우, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다.
이펙터 분자는 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 단일 이펙터 분자 또는 2개 이상의 분자를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 이펙터 분자에 연결된 항체 단편을 얻고자 하는 경우, 이는 항체 단편이 직접적으로 또는 커플링제를 통해 이펙터 분자에 연결되는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 이러한 이펙터 분자를 항체에 접합시키는 기술은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다(문헌 [Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 및 Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123] 참조). 특정한 화학적 절차에는 예를 들어 WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03031581에 기술된 것들이 포함된다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩타이드인 경우, 연결은 예를 들어 WO 86/01533 및 EP 0392745에 설명된 바와 같은 재조합 DNA 절차를 사용하여 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 이펙터 분자에는 예를 들어 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 기타 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 자연 발생 중합체, 핵산 및 그의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 그의 단편, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오드, 방사성 동위원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 리포터 기, 예를 들어 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물이 포함된다.
이펙터 분자의 예에는 세포에 유해한(예를 들어, 세포를 죽이는) 임의의 작용제를 포함하는 세포독소 또는 세포독성제가 포함될 수 있다. 그 예는 다음을 포함한다: 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스털린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체.
이펙터 분자에는 또한 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머카토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(예를 들어, CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 듀오카르마이신) 및 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴).
다른 이펙터 분자는 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188과 같은 킬레이팅된 방사성 핵종; 또는 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민과 같은 약물(이에 국한되지 않음)을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자에는 단백질, 펩타이드 및 효소가 포함된다. 관심 효소에는 단백질 분해 효소, 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제, 트랜스퍼라제가 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. 관심 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 면역글로불린, 독소, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예를 들어 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제, 혈전제 또는 항혈관신생제, 예를 들어, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 반응 조절제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 기타 성장 인자 및 면역글로불린.
다른 이펙터 분자에는 예를 들어 진단에 유용한 검출 가능한 물질이 포함될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층 촬영에 사용) 및 비방사성 상자성 금속 이온이 있다. 진단용으로 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미국 특허 번호 4,741,900을 참조한다. 적합한 효소에는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되며; 적합한 보결분자단에는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴이 포함되며; 적합한 형광 물질에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린이 포함되며; 적합한 발광 물질에는 루미놀이 포함되며; 적합한 생물발광 물질에는 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린이 포함되며; 적합한 방사성 핵종에는 125I, 131I, 111In 및 99Tc가 포함된다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체 내에서 항체의 반감기를 증가시키고/시키거나, 항체의 면역원성을 감소시키고/시키거나, 상피 장벽을 통과하여 면역계로의 항체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예에는 WO 05/117984에 기술된 것과 같은 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물이 포함된다.
이펙터 분자가 중합체인 경우, 이는 일반적으로 합성 또는 자연 발생 중합체, 예를 들어 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지쇄 또는 비분지쇄 폴리사카라이드, 예를 들어 호모- 또는 헤테로-폴리사카라이드일 수 있다.
상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 특정한 선택적인 치환체에는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 기가 포함된다.
합성 중합체의 특정 예에는 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이의 유도체, 특히 선택적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예를 들어 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체가 포함된다.
특정 자연 발생 중합체에는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 말레이미드 등과 같은 티올 선택성 반응성 기를 포함하도록 의도된다. 반응성 기는 직접적으로 또는 링커 세그먼트를 통해 중합체에 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔기는 일부 경우에 항체 단편과 중합체 사이의 연결기로서 생성물의 일부를 형성할 것이라는 것이 이해될 것이다.
중합체의 크기는 원하는 대로 다양할 수 있지만 일반적으로 평균 분자량 범위는 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들어 5000 내지 40000 Da, 예를 들어 20000 내지 40000 Da일 것이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도, 예를 들어 종양과 같은 특정 조직에 국한되거나 순환 반감기를 연장하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다(검토를 위해, 문헌 [Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545] 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 순환계를 떠나 조직에 침윤하도록 의도되는 경우, 예를 들어 약 5000 Da의 분자량을 갖는 작은 분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환계 내에 남아 있는 용도의 경우, 예를 들어 20000 Da 내지 40000 Da 범위의 분자량을 갖는 고분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체에는 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체와 같은, 특히 약 15000 Da 내지 약 40000 Da 범위의 분자량을 갖는 폴리알킬렌 중합체가 포함된다.
한 가지 예에서, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 한 특정 예에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카르복실 기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에서 자연적으로 발생할 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 사용하여 단편으로 조작될 수 있다(예를 들어, US 5,219,996; US 5,667,425; WO 98/25971 참조). 한 예에서, 본 발명의 항체 분자는 변형된 Fab 단편이며, 여기서 변형은 이펙터 분자의 부착을 허용하는 하나 이상의 아미노산을 그의 중쇄의 C-말단에 부가하는 것이다. 적절하게는, 추가의 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 여러 부위를 사용하여 두 개 이상의 PEG 분자를 부착할 수 있다.
적합하게는, PEG 분자는 항체 단편에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유적으로 연결될 수 있다. 변형된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 연결될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 디설파이드 결합, 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올 기가 적절하게 활성화된 이펙터 분자의 부착 지점으로 사용되는 경우, 예를 들어 말레이미드 및 시스테인 유도체와 같은 티올 선택적 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기재된 바와 같이 중합체 변형 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드와 같은 티올 반응성 기를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 입수될 수 있거나(예를 들어, 미국 앨라배마주 헌츠빌 소재의 Nektar(이전 Shearwater Polymers Inc.)로부터), 또는 통상적인 화학적 절차를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 특정 PEG 분자에는 20K 메톡시-PEG-아민(Nektar(이전 Shearwater), Rapp Polymere 및 SunBio에서 구입 가능) 및 M-PEG-SPA(Nektar(이전 Shearwater)에서 구입 가능)가 포함된다.
한 실시양태에서, 항체는 PEG화된, 즉 예를 들어 EP 0948544 또는 EP 1090037에 개시된 방법에 따라 PEG(폴리(에틸렌글리콜))가 공유적으로 부착된 변형된 Fab 단편 또는 diFab이다[또한, 문헌 ["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545] 참조). 한 예에서, PEG는 힌지 영역 내의 시스테인에 부착된다. 한 예에서, PEG 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역의 단일 티올 기에 공유적으로 연결된 말레이미드 기를 갖는다. 라이신 잔기는 말레이미드 기에 공유적으로 연결될 수 있고, 라이신 잔기의 각각의 아민 기에는 대략 20,000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 이펙터 분자가 부착되는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 그의 중쇄의 C-말단에 갖는 변형된 Fab' 단편이다. 적합하게는, 이펙터 분자는 PEG이고, WO 98/25971 및 WO 2004072116 또는 WO 2007/003898에 기술된 방법을 사용하여 부착된다. 이펙터 분자는 국제 특허 출원 공개 WO 2005/003169, WO 2005/003170 및 WO 2005/003171에 기술된 방법을 사용하여 항체 단편에 부착될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 이펙터 분자에 부착되지 않는다.
폴리뉴클레오타이드 및 벡터
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 일부를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다(표 2에 나열된 아미노산 SEQ ID 등). 본 명세서 전반에 걸쳐 용어 "단리된"은 폴리뉴클레오타이드가 자연에서 발생할 수 있는 환경과는 별개의 물리적 환경에 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 화학적 처리에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
적합한 서열의 예가 본 명세서에 제공된다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명은 서열 번호 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102에 제시된 서열을 포함하는, 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 경쇄 가변 영역을 코딩하고, 여기서 폴리뉴클레오타이드는
i. 서열 번호 20, 16 또는 24에 대해 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열 번호 20, 16 또는 24를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 중쇄 가변 영역을 코딩하고, 여기서 폴리뉴클레오타이드는
i. 서열 번호 94, 28, 34, 58, 70, 76, 82 또는 88에 대해 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열 번호 94, 28, 34, 58, 70, 76, 82 또는 88을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 경쇄를 코딩하고, 여기서 폴리뉴클레오타이드는
i. 서열 번호 22, 18, 또는 26에 대해 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열 번호 22, 18, 또는 26을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 중쇄를 코딩하고, 여기서 폴리뉴클레오타이드는
i. 서열 번호 96, 30, 36, 60, 72, 78, 84, 또는 90에 대해 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열 번호 96, 30, 36, 60, 72, 78, 84, 또는 90을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 96, 30, 36, 60, 72, 78, 84, 또는 90에 제시된 서열을 포함하는, 본 발명의 IgG1 항체의 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 서열 번호 22, 18, 또는 26에 제시된 서열을 포함하는, 본 발명의 IgG1 항체의 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 IgG1 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 96에 제시된 서열을 포함하고, 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 22에 제시된 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 설명되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 한 예에서, 본 발명에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
분자생물학의 표준 기술을 사용하여 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술이 적절하게 사용될 수 있다.
벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
항체 생산을 위한 숙주 세포
또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 및 기타 미생물 시스템이 사용될 수 있거나, 진핵생물, 예를 들어 포유동물 숙주 세포 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포에는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포가 포함된다.
추가의 실시양태에서, 이러한 핵산(들) 또는 벡터(들)을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항-HLA-G 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항-HLA-G 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항-HLA-G 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항-HLA-G 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어, 이로 형질전환된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포이다. 한 실시양태에서, 항-HLA-G 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포에는 본원에서 설명되는 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서는, 예를 들어 US 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다(이. 콜라이에서 항체 단편의 발현을 설명하는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획으로 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 그의 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 유도하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 항체 코딩 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] 참조).
본 발명에 사용하기에 적합한 유형의 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)에는 dhfr- CHO 세포를 포함하는 CHO 및 CHO-K1 세포, 예를 들어 CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포(선택 가능한 DHFR 마커와 함께 사용될 수 있음) 또는 CHOK1-SV 세포(글루타민 합성효소 선택 마커와 함께 사용될 수 있음)가 포함될 수 있다. 항체 발현에 사용되는 다른 세포 유형에는 림프구 세포주, 예를 들어 NS0 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포가 포함된다. 숙주 세포는 본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 발현 벡터로 안정하게 형질전환되거나 형질감염될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 알파1,6 푸코실트랜스퍼라제(FUT8)의 기능을 감소시키거나 제거하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포에서 생산된다. 한 실시양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 CHO 세포이고, FUT8 유전자는 낙아웃되었다(KO FUT8). 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 생산을 위한 숙주 세포는 CHO-DG44이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 생산을 위한 숙주 세포는 KO FUT8 CHOSXE/DG44 세포이고, 이는 본원에서 제공되는 실시예에서 설명되는 방법에 따라 생산될 수 있다.
항체 생산 방법
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 생산하는데 적합한 조건 하에서 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하고, 항체를 단리하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 항체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 생산하는데 적합한 조건 하에서 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하고, 항체를 단리하고, 항체를 약제학적 조성물로 제제화하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법을 제공한다.
항체는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드만을 포함할 수 있으며, 이 경우 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드 코딩 서열만이 숙주 세포를 형질감염시키는데 사용될 필요가 있다. 중쇄와 경쇄를 모두 포함하는 항체를 생산하기 위해, 세포주는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터의 두 벡터로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 단일 벡터가 사용될 수 있다.
따라서, 숙주 세포를 배양하고, 항체를 발현하고, 항체를 단리하고, 선택적으로 항체를 정제하여 단리된 항체를 제공하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 단리된 항체에 이펙터 분자를 접합시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하고, 항체 분자를 단리하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 항체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항체는 숙주 세포로부터 양호한 수준으로 발현된다. 따라서, 항체의 특성은 상업적 생산에 최적화된 것으로 보이다.
한 실시양태에서, 정제된 항체, 예를 들어 인간화 항체, 특히 실질적으로 정제된 형태, 특히 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA가 없거나 실질적으로 없는 본 발명에 따른 항체가 제공된다.
내독소가 실질적으로 없다는 것은 일반적으로 내독소 함량이 항체 생성물 1 mg당 1 EU 이하, 예를 들어, 생성물 1 mg당 0.5 또는 0.1 EU임을 의미하는 것으로 의도된다.
숙주 세포 단백질 또는 DNA가 실질적으로 없다는 것은 일반적으로 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량이 항체 생성물 1 mg당 400 μg 이하, 예를 들어 1 mg당 100 μg 이하, 특히 적절하다면 1 mg당 20 μg임을 의미하는 것으로 의도된다.
약제학적 조성물, 투여량 및 투여 요법
본 발명의 항체는 약제학적 조성물 또는 진단 조성물로 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 중 하나 이상과 함께 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약제학적 또는 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 약제학적 또는 진단 조성물은 HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 여기서 항체는 다음을 포함한다:
a. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및
b. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 유일한 활성 성분이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 하나 이상의 추가의 활성 성분과 조합된다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 CD47에 대한 항체와 조합된다. 따라서, 한 실시양태에서는 HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체가 제공되며, 여기서 항체는 다음을 포함하고, 항체는 CD47에 결합하는 제2 항체와 조합된다:
a. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및
b. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3.
대안적으로, 약제학적 조성물은 유일한 활성 성분인 본 발명에 따른 항체를 포함하고, 이는 다른 치료제, 진단제 또는 완화제와 조합하여(예를 들어, 동시에, 순차적으로 또는 별도로) 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 필요한 치료 유효량을 확인하기 위해 환자에게 적합하게 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 표적 질병 또는 병태를 치료, 개선 또는 예방하거나 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내기 위해 필요한 치료제의 양을 의미한다. 모든 항체에 대해, 치료 유효량은 처음에는 세포 배양 검정 또는 동물 모델, 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 추정할 수 있다. 또한, 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 동물 모델을 사용할 수도 있다. 그런 다음, 이러한 정보를 사용하여 인간에게 투여하는 데 유용한 투여 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
인간 대상체에 대한 정확한 치료 유효량은 질병 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강 상태, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 치료에 대한 순응도/반응에 따라 결정될 것이다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예를 들어 100 mg/kg일 것이다. 약제학적 조성물은 용량당 미리 결정된 양의 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있다.
치료 조성물 내의 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 추가적으로, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다.
투여에 적합한 형태에는 정맥내, 흡입성 또는 피하 형태의 주사 또는 주입, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여에 적합한 형태가 포함된다. 제품이 주사 또는 주입용인 경우, 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 사용하기 전에 적절한 멸균 액체로 재구성하기 위한 건조 형태일 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 내의 용액 또는 현탁액으로 만들기에 적합한 고체 형태도 준비될 수 있다.
일단 제제화되면, 본 발명의 조성물은 대상에게 직접 투여될 수 있다. 따라서, 의약 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도가 본원에서 제공된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인간 대상체에 대한 투여를 위해 변형된다.
따라서, 또 다른 측면에서 본 발명은 치료에 사용하기 위한, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 항체는 다음을 포함한다:
a. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및
b. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3.
치료 적응증
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나, 질병 및/또는 질병으로 인한 유해한 영양에 대한 부분적 또는 완전한 치유 측면에서 치료적일 수 있다. 따라서, 치료는 포유동물, 특히 인간의 질병에 대한 모든 치료를 포괄하며, (a) 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉 질병의 발달을 저지하는 것; 및 (c) 질병을 완화시키는 것, 즉 질병의 퇴행을 일으키는 것을 포함한다.
"치료 유효량"은 질병을 치료하기 위해 포유동물 또는 다른 대상체에게 투여될 때 질병에 대한 그러한 치료를 생성하기에 충분한 HLA-G 항체의 양을 의미한다. 치료 유효량은 항-HLA-G 항체, 질병 및 그의 중증도, 치료할 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 항체, 이의 제제 또는 약제학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다. 예방적 적용에서, 항체, 제제 또는 조성물은 병태 또는 그의 증상 중 하나 이상의 후속 효과를 예방하거나 감소시키기에 충분한 양으로 본원에서 설명되는 장애 또는 병태의 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 치료 적용에서, 항체는 본원에서 설명되는 장애 또는 병태를 이미 앓고 있는 대상체에게 병태 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료, 완화 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 치료적 처치는 질병 증상의 중증도를 감소시키거나, 증상이 없는 기간의 빈도 또는 기간을 증가시키는 결과를 가져올 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 본원에서 설명되는 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 항체는 치료 유효량으로 투여된다.
본 발명은 또한 치료에 사용하기 위한, 특히 본원에서 설명되는 장애 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 특히 본원에서 설명되는 장애 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 항체는 HLA-G 활성과 연관된 임의의 병태, 예를 들어, 전체적으로 또는 부분적으로 HLA-G 수용체를 통한 신호전달로 인해 발생하는 임의의 병태를 치료, 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있다.
HLA-G 관련 질병 또는 장애에는 특히 암(또는 종양), 감염 및 자가면역 장애가 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 과다발현을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체는 HLA-G의 과다발현을 특징으로 하는 암을 비롯한 암을 치료 또는 예방하는 데 특히 유용할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 과다발현을 특징으로 하는 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 맥락에서 암에는 예를 들어 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 유방암, 두경부 암종, 위암, 간세포 암종, 폐암, 신경모세포종 및 혈액암이 포함된다. 본 발명의 항체는 혈액암과 같은 액체암을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 고형 종양을 치료 또는 예방하는데 특히 유용할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 과다발현을 특징으로 하는 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 또는 간세포 암종의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 고형 종양은 신장 투명 세포 암종(RCC)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 고형 종양은 결장직장 암종(CRC)이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-G의 과다발현을 특징으로 하는 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 또는 간세포 암종의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 고형 종양은 신장 투명 세포 암종(RCC)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 고형 종양은 결장직장 암종(CRC)이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 HLA-G의 과다발현을 특징으로 하는 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 고형 종양은 신장 투명 세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 및 간세포 암종으로부터 선택된다. 한 특정 실시양태에서, 고형 종양은 신장 투명 세포 암종(RCC)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 고형 종양은 결장직장 암종(CRC)이다.
본 발명은 또한 진단 활성제로서 또는 예를 들어 질병 또는 이의 중증도를 진단하기 위한 진단 검정에서의 본 발명의 항체의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 사용하여 고형 종양을 진단하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 사용하여 HLA-G의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양을 진단하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 이용하여 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 또는 간세포 암종을 진단하는 방법을 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 고형 종양은 신장 투명 세포 암종(RCC)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 고형 종양은 결장직장 암종(CRC)이다.
진단은 바람직하게는 생물학적 샘플에서 수행될 수 있다. "생물학적 샘플"는 개인으로부터 얻은 다양한 유형의 샘플을 포함하며, 진단 또는 모니터링 검정에 사용될 수 있다. 샘플의 정의에는 뇌척수액, 혈장 및 혈청과 같은 혈액, 및 소변 및 타액과 같은 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포 및 그의 자손체와 같은 고형 조직 샘플이 포함된다. 또한, 이 정의에는 시약 처리, 용해 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 특정 성분의 농축 등과 같이 그의 입수 후에 임의의 방식으로 조작된 샘플도 포함된다.
진단 시험은 바람직하게는 인간 또는 동물 신체와 접촉하지 않는 생물학적 샘플에서 수행될 수 있다. 이러한 진단 시험은 시험관내 시험라고도 한다. 시험관내 진단 시험은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 HLA-G를 검출하는 시험관내 방법에 의존할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 사용하여 생물학적 샘플에서 HLA-G를 발현하는 고형 종양을 진단하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 사용하여 생물학적 샘플에서 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 또는 간세포 암종을 진단하는 방법을 제공한다.
실시예
실시예 1: 스크리닝 검정에 사용하기 위한 HLA-G, HLA-I 및 ILT2, ILT4 단백질의 생성
1.1. HLA-G 단백질: 서열
HLA-G의 알파 1, 2 및 3 도메인을 포함하는 HLA-G, HLA-G1(막 결합) 또는 HLA-G5(가용성)의 가장 풍부한 이소형의 서열을 사용하여 HLA-G에 대한 항체를 스크리닝하기 이한 HLA-G 구축물을 생성하였다.
HLA-G 세포외 도메인, 즉 ECD의 서열은 결정 구조 분석(알파 1 도메인: 이탤릭체, 알파 2 도메인-알파 3 도메인: 밑줄침, 마지막 잔기 KQ: 결정학에 의해 결정됨)을 기반으로 하여 정의되었다. HLA-G에 특이적인 20개의 잔기는 굵은 글씨로 표시되어 있다.
- 가용성 HLA-G(HLA-G ECD):
단백질은 AVItev10HisTag(굵은 글씨로 표시된 신호 펩타이드, 밑줄친 아비딘 태그 또는 비오티닐화를 위한 AVI 태그, 밑줄친 이탤릭체로 표시된 Tev 프로테아제 부위, 이탤릭체로 표시된 10His 태그)로 발현되었다:
스크리닝 검정을 위해 사용된 정제된 최종 단백질 서열은 다음 서열(AVItev10His 태그 포함)을 포함한다:
- 세포막 결합 발현을 위한 HLA-G DNA 서열:
상응하는 막 결합 단백질은 다음 서열(발현 후에 절단되는 신호 펩타이드 MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA, 이탤릭체로 표시된 막 통과 및 세포질 도메인)을 포함한다:
- "HLA-G Null 1,2,3"
"HLA-G Null 1,2,3"은 HLA-G α1, α2 및 α3에서 특이적으로 발현되는 아미노산이 다른 HLA-I에서 발현되는 컨센서스 아미노산으로 치환된 HLA-G에 상응한다(20개의 아미노산 돌연변이, 아래 서열에 굵은 글씨로 표시됨).
HLA-I 컨센서스 아미노산은 EBI의 면역 다형성 데이터베이스(Immuno Polymorphism Database)에서 얻은 서열 정보로부터 유래되었다. HLA-I 전장 단백질을 분석하고, HLA-G 특이적 잔기(총 20개)를 확인할 수 있는 전체 HLA-I 세트에 걸쳐 각각의 도메인(알파 1-3)에 대해 잔기 프로파일 플롯을 생성하였다.
서열 정보는 또한 정규 서열의 위치를 모든 대립유전자에서 발견되는 가장 일반적인 잔기로 대체한 각각의 HLA 단백질에 대한 대립유전자 컨센서스 서열을 생성하는 데 사용되었다.
HLA-G Null 1,2,3 서열을 얻기 위해, HLA-G 특정 잔기를 20개의 특정 위치에서 다른 HLA 분자에서 발견되는 컨센서스 잔기로 변경하였다.
가용성 단백질(HLA-G Null 1,2,3 ECD)은 AVItev1OHis 태그(굵은 글씨로 표시된 신호 펩타이드, 밑줄친 AVI 태그, 밑줄친 이탤릭체로 표시된 Tev 프로테아제 부위, 이탤릭체로 표시된 10His 태그)로 발현되었다.
펩타이드 신호는 발현 후에 절단되고, 스크리닝 검정을 위해 사용된 정제된 최종 단백질 서열은 다음 서열을 포함한다:
세포막 결합 발현을 위한 "HLA-G Null 1,2,3"
상응하는 막 결합 단백질은 다음 서열(발현 후에 절단되는 신호 펩타이드 MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA, 이탤릭체로 표시된 막 통과 및 세포질 도메인)을 포함한다:
"HLA-G Null 1,3"
"HLA-G Null 1,3"은 HLA-G α1 및 α3에서 특이적으로 발현되는 아미노산이 다른 HLA-I에서 발현되는 컨센서스 아미노산으로 치환된 HLA-G에 상응한다(아래 서열 번호 117에 굵은 글씨로 표시된 돌연변이된 아미노산).
단백질은 세포의 표면에서 발현되었다. 세포막 결합 발현을 위한 DNA 서열은 다음을 포함한다:
상응하는 막 결합된 단백질은 다음 서열(발현 후에 절단되는 신호 펩타이드 MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA, 이탤릭체로 표시된 막 통과 및 세포질 도메인)을 포함한다:
- "HLA-G Null3"
"HLA-G Null3"은 HLA-G α3에서 특이적으로 발현되는 아미노산이 다른 HLA-I에서 발현되는 컨센서스 아미노산으로 치환된 HLA-G에 상응한다(아래 서열 번호 119에 굵은 글씨로 표시된 돌연변이된 5개의 아미노산).
단백질은 세포의 표면에서 발현되었다. 세포막 결합 발현을 위한 DNA 서열은 다음을 포함한다:
상응하는 막 결합된 단백질은 다음 서열(발현 후에 절단되는 신호 펩타이드 MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA, 이탤릭체로 표시된 막 통과 및 세포질 도메인)을 포함한다:
- "HLA-G Null3 2AA"
"HLA-G Null3 2AA"는 HLA-G α3에서 특이적으로 발현되고 ILT2/ILT4와 상호작용하는 것으로 보고된 단지 2개의 아미노산(HLA-G의 F195, Y197)이 다른 HLA-I에서 발현되는 컨센서스 아미노산으로 치환된 HLA-G에 상응한다(굵은 글씨로 표시된 돌연변이된 아미노산).
단백질은 세포의 표면에서 발현되었다. 세포막 결합 발현을 위한 DNA 서열은 다음을 포함한다:
상응하는 막 결합된 단백질은 다음 서열(발현 후에 절단되는 신호 펩타이드 MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA, 이탤릭체로 표시된 막 통과 및 세포질 도메인)을 포함한다:
- 단리된 HLA-G 알파 3 도메인(야생형)
가용성 단백질은 Tev-인간 Fc 융합 단백질(굵은 글씨로 표시된 신호 펩타이드, 밑줄친 Tev, 이탤릭체로 표시된 Fc 단편)로 발현되었고, B2m과 동시 발현되지 않았다("B2m 미함유의 단리된 HLA-G 알파 3 도메인").
펩타이드 신호는 발현 후에 절단되고, 스크리닝 검정을 위해 사용된 정제된 최종 단백질 서열은 다음 서열을 포함한다(Fc 태그가 절단됨):
세포막 결합 발현을 위한 DNA 서열
상응하는 막 결합된 단백질은 다음 서열(발현 후에 절단되는 신호 펩타이드, 이탤릭체로 표시된 막 통과 및 세포질 도메인)을 포함한다:
- 단리된 HLA-G 알파 3도메인, Null(굵은 글씨로 표시된 돌연변이된 5개의 아미노산)
단백질은 10HistevAVI 태그 단백질(이탤릭체로 표시된 태그 및 GS 링커, 굵은 글씨로 표시된 신호 펩타이드)로 발현되었다.
펩타이드 신호는 발현 후에 절단되고, 10His 태그는 정제 동안 제거되었다. 스크리닝 검정을 위해 사용된 정제된 최종 단백질 서열은 다음 서열을 포함한다(이탤릭체로 표시된 N-말단 AVI 태그 및 GS 링커):
- B2m
스크리닝 검정에 사용되고 상기 설명된 모든 HLA-G 구축물(B2m 미함유의 단리된 HLA-G 알파 3 도메인, 야생형 제외)은 B2m과 동시 발현되었다. 가용성 HLA-G 구축물의 발현을 위해, B2m은 다음 서열과 함께 동시 발현되었다(굵은 글씨로 표시된 신호 펩타이드).
펩타이드 신호는 발현 후에 절단되고, 스크리닝 검정을 위해 사용된 정제된 최종 단백질은 다음 서열을 포함한다:
모든 막 결합된 HLA-G 구축물(세포 발현된 단리된 알파 3 도메인 포함)은 B2m과 동시 발현되었다. 형질감염을 위해 사용된 DNA 서열은 다음과 같다:
HLA-G 구축물과 복합체화된 상응하는 B2m은 서열 번호 129(발현 후 절단되는 신호 펩타이드 MSRSVALAVLALLSLSGLEA)를 포함한다.
가용성 단백질로서 발현된 HLA-G 구축물의 생산 및 정제 방법
- 단리된 HLA-G α3 도메인, 야생형(TevHumanFc 또는 TevHFc)의 단백질 발현 및 정제
HLA-G α3 TevHFc는 제조업체의 프로토콜에 따라 Expi293™ 발현 시스템(Life Technologies™)을 사용하여 β2m과 함께 동시 발현되었다. 형질감염 5일 후에 세포를 수확하고, 상청액을 즉시 정제에 사용하였다.
HLA-G α3 TevHFc + β2m 단백질을 포함하는 상청액을 하이트랩(HiTrap) 단백질 A 컬럼에 적용하였다. 결합되지 않은 단백질 및 오염물을 PBS 및 HLA-G α3 TevHFc + β2m 단백질(0.1 M 시트르산 완충액, pH 2로 용리됨)로 세척하고, 피크 분획을 0.5 ml 2 M 트리스(Tris)(pH 8)로 중화하였다. 정제된 HLA-G α3 TevHFc + β2m 단백질을 포함하는 분획을 모으고, 1:100의 비로 tev 프로테아제와 함께 실온에서 2시간, 4℃에서 2시간 동안 단백질을 인큐베이팅하여 HFc 태그를 제거하였다. 단백질을 농축하고, PBS 완충액으로 평형화된 S75 26/60에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 정제된 HLA-G α3 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 농축하고, 분취량을 필요할 때까지 -80℃에 보관하였다.
- 단리된 HLA-G apha 3 도메인, null의 단백질 발현 및 정제
10histevAVI HLA-G α3 null은 제조업체의 프로토콜에 따라 Expi293™ 발현 시스템(Life Technologies™)을 사용하여 β2m과 함께 동시 발현되었다. 형질감염 5일 후에 세포를 수확하고, 상청액을 즉시 정제에 사용하였다. 1OhistevAVI HLAG α3 null +B2m 단백질을 포함하는 상청액을 악타 퓨리파이더(Akta Purifier)(GE Healthcare)를 사용하여 HisTrap 엑셀(Excel) 컬럼(GE Healthcare)에 적용하였다. 결합되지 않은 단백질 및 오염물을 사이티바 하이클론(Cytiva HyClone)™ 포스페이트 완충 식염수(PBS), 500 mM NaCl(pH 7.5)로 세척하였다. 10 mM 이미다졸 및 단백질을 사이티바 하이클론™ 포스페이트 완충 식염수(PBS), 500 mM NaCl(pH 7.5), 500 mM 이미다졸로 용리하였다. 정제된 10histevAVI HLAG α3 null +B2m 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 단백질을 1:100의 비로 tev 프로테아제와 실온에서 2시간 동안 및 4℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하여 10his 태그를 제거하였다. 사이티바 하이클론™ 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 평형화된 S75 26/60에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단백질을 농축하고, 추가로 정제하였다. 정제된 AVI HLAG α3 null +B2m 단백질을 함유하는 분획을 모아서 농축하고, 필요할 때까지 -80℃에서 분취량을 보관하였다.
- B2m과 함께 동시 발현되는 HLA-G ECD(야생형 또는 null 변이체)의 단백질 발현 및 정제
HLA-G ECD(WT 또는 null 돌연변이체)는 제조업체의 프로토콜에 따라 CHO-SXE 발현 시스템을 사용하여 β2m과 동시 발현되었다. 간단히 설명하면, CHO-SXE 세포는 깁코(Gibco)® 글루타맥스(GlutaMAX)™(1:1000)가 보충된 무혈청 CD CHO 배지(Gibco)에서 8% CO2, 37℃의 진탕 인큐베이터에서 세포 밀도가 6x106/mL가 되도록 성장시켰다. 그런 다음, 세포를 1500 rpm에서 회전시키고, 새로운 ExpiCHO™ 발현 배지(Gibco)에 재현탁시켰다. HLA-G ECD와 β2m의 1:1의 비에서 1 mg/L의 DNA를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 엑스피펙타민(ExpiFectamine)™ CHO 형질감염 키트 및 옵티프로(OptiPRO)™ SFM을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 분비된 단백질을 함유하는 조건화된 배지를 형질감염 96시간 후에 수집하였다. 여과된 세포 배양 상청액을 악타 퓨리파이더(GE Healthcare)를 사용하여 5 ml HisTrap 엑셀 컬럼(GE Healthcare)에 로딩하였다. 컬럼을 사이티바 하이클론™ 포스페이트 완충 식염수(PBS), 500 mM NaCl(pH 7.5)로 세척하고, 500 mM 이미다졸을 함유한 동일한 완충액으로 단백질을 용리하였다. NuPAGE 4-20% 트리스-글리신(Thermo) 및 퀵 쿠마시 염료(Quick Coomassie Stain)(VWR)로 염색된 NuPAGE MES SDS 이동 완충액(Thermo)을 사용하여 단백질을 포함하는 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다. 아미콘(Amicon)® 울트라(Ultra)-15 원심분리 필터 장치(Millipore)를 사용하여 농축하기 전에 순수한 분획을 모았다. 그런 다음, 이동 완충액으로 사이티바 하이클론™ 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 사용하여 수퍼덱스 200 16/600 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 단백질을 추가로 정제하였다.
단백질 순도는 분석용 크기 배제 HPLC 및 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 평가되었다. 단백질의 순도는 97%를 초과하였다(일반적으로, 적어도 99%). 또한, 단백질을 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)에 의해 분석하여 서열 분자량(MW)이 예상한 것과 일치하는지 확인하였다.
세포의 표면에 HLA-G 구축물을 발현하는 세포의 생산 방법
- ExpiHEK293 표면에서 B2m과 함께 HLA-G(null 구축물 포함)의 일시적 발현
Expi293™ 현탁 세포에 대해 1:1 비의 HLA-G 및 B2m 발현 벡터를 사용한 동시 형질감염은 엑스피펙타민™ 293 형질감염 시약(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 달성되었으며, 24시간부터 세포 표면 단백질이 발현되었다.
- CHO의 표면에서 B2m과 함께 HLA-G(null 구축물 포함)의 일시적 발현(PHAGE 패닝(panning))
HLA-G 또는 HLA-G Null 1,2,3은 제조업체의 권장 사항에 따라 엑스피펙타민™ CHO 형질감염 키트(Gibco)를 사용하여 독점 소유의 CHO-SXE 세포에 B2m 발현 벡터와 1:1 비로 공동 형질감염되었다. 그 표면에 HLA-G를 발현하는 세포를 48시간 후에 수확하였다.
- HLA-G를 발현하는 HCT116 세포
형질감염 전날, HCT116 세포(ATCC CCL-247)를 20 ml의 완전 RPMI 성장 배지에 T 75 cm2 플라스크당 4x106개의 세포로 접종하고, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 형질감염 당일에 성장 배지를 제거하고, 16 ml의 완전 성장 배지로 교체하였다. 형질감염될 세포의 각각의 플라스크에 대해, 20 μg HLA-G 및 β2m 플라스미드(1:1 비)를 무혈청 Opti-MEM® I 환원 혈청 배지 4 ml에 희석하였다. 80 μl의 리포펙타민 LTX® 시약을 상기 희석된 Opti-MEM® DNA 용액에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, DNA-리포펙타민 LTX® 시약 복합체를 세포가 들어 있는 각각의 플라스크에 직접 첨가하고, 플라스크를 37℃의 CO2 인큐베이터에 22 ± 2시간 동안 두었다.
1.2. HLA-I 구축물
HLA-I 구축물은 제조업체의 프로토콜에 따라 Expi293™ 발현 시스템(Life Technologies)을 사용하여 β2m과 동시 발현되었다.
HLA-I 컨센서스 서열은 공개적으로 보고된 HLA-I 대립유전자의 아미노산 서열로부터 유래되었다. 분석을 위해 전달된 관련 서열 정보는 EBI의 면역 다형성 데이터베이스에서 얻었다. 이 정보는 정규 서열의 위치를 모든 대립유전자에서 발견되는 가장 일반적인 잔기로 대체하는 각각의 HLA 단백질에 대한 대립유전자 컨센서스 서열을 생성하는 데 사용되었다.
컨센서스 아미노산 서열을 코딩하고 형질감염/세포막 발현에 사용되는 DNA 서열은 아래에 제시되어 있다. B2m을 코딩하는 DNA 서열은 위에서 설명한 바와 같다. 분비된 HLA-I 단백질의 신호 펩타이드는 발현 후에 제거되었다.
- HLA-A
형질감염/세포막 발현에 사용된 DNA 서열:
상응하는 막 결합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
- HLA-B
형질감염/세포막 발현에 사용된 DNA 서열:
상응하는 막 결합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
- HLA-C
형질감염/세포막 발현에 사용된 DNA 서열:
상응하는 막 결합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
- HLA-E
형질감염/세포막 발현에 사용된 DNA 서열:
상응하는 막 결합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
- HLA-F
형질감염/세포막 발현에 사용된 DNA 서열:
상응하는 막 결합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
1.3 ILT2/ILT4 구축물(Fc 융합체):
- ILT2는 가용성 ILT2 ECD-토끼 Fc 융합 단백질로서 발현되었다(굵은 글씨로 표시된 신호 펩타이드, 밑줄친 토끼 Fc)
스크리닝 검정을 위해 사용된 정제된 최종 단백질 서열은 다음 서열을 포함한다:
- ILT4는 가용성 ILT4 ECD-토끼 Fc 융합 단백질로서 발현되었다(굵은 글씨로 표시된 신호 펩타이드, 밑줄친 토끼 Fc)
스크리닝 검정을 위해 사용된 정제된 최종 단백질 서열은 다음 서열을 포함한다:
ILT2rbFc 및 ILT4rbFc의 발현 및 정제
제조업체의 프로토콜에 따라 Expi293™ HEK 발현 시스템(Life Technologies™)을 사용하여 일시적 형질감염에 의해 단백질을 발현시켰다. 형질감염 5일 후에 세포를 수확하고, 상청액을 즉시 정제에 사용하였다.
ILT2rbFc 또는 ILT4rbFc 단백질을 포함하는 상청액을 하이트랩 단백질 A 컬럼에 적용하였다. 결합되지 않은 단백질 및 오염물을 PBS로 세척하고, ILT2rbFc 또는 ILT4rbFc 단백질을 내독소 미함유(endo free) 0.1 M 시트르산 완충액(pH 2)으로 용리하고, 피크 분획을 0.5 ml의 2 M 트리스(pH 8)로 중화하였다. 정제된 단백질을 함유하는 분획을 모아서 농축하고, 이동 완충액으로 사이티바 하이클론™ 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 사용하여 S200 26/60에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 정제된 ILT2rbFc 또는 ILT4rbFc 단백질을 함유하는 분획을 모아서 농축하고, 분취한 후 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2: HLA-G를 사용한 면역화에 의한 항체의 생성
HLA-G에 대한 항체 생산(예를 들어, 다른 HLA-I 분자와의 높은 상동성, HLA-G와 그의 억제 수용체 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 항체의 확인)과 관련된 특정 문제로 인해, 치료에 유용할 항체를 확인하려면, 특별한 스크리닝 및 시험 전략을 포함하는 특별한 발견 전략이 개발되어야 했으며, 이에 대해서는 아래에서 설명한다.
면역화 및 스크리닝 전략
다양한 종(마우스 및 토끼 포함)에 걸쳐 다수의 동물을 B2m 동시 발현 유무에 관계없이 다양한 형태의 HLA-G를 발현하는 동계(syngeneic) 세포로 면역화하였다.
3-5회 주사한 후, 동물을 희생시키고, PBMC, 비장, 골수 및 림프절을 채취하였다. 사용된 면역원에 대한 결합에 대해 혈청을 모니터링하였다.
기억 B 세포 배양물을 배치하고, TTP 랩테크 미러볼(Labtech Mirrorball) 시스템(플레이트 판독기) 또는 인텔리사이트(Intellicyt) iQue(유세포 분석기)에서 다중 비세척 검정으로 비관련 대조군보다 높은 수준으로 HLA-G에 결합하는 능력에 대해 상청액을 먼저 스크리닝하였다. 배양물은 비관련 대조군 단백질, 자체 생성된 HLA-G 단백질에 대해 및/또는 세포 표면에서 관심 구축물을 일시적으로 발현하는 EXPI293 HEK를 사용하여 스크리닝되었다(HLA-G, HLA-G Null 1,2,3, HLA- G Null3). 단백질 시약을 비오티닐화하여 스트렙타비딘을 비드에 포획할 수 있도록 하였다. 시험 항체를 검출하기 위한 검정을 위해 형광 표지된 종 특이적 항-Fc 2차 항체를 사용하였다.
대략 3,800개의 HLA-G 특이적 양성 히트가 각각 100-300개의 플레이트를 포함하는 총 18개의 B 세포 배양 실험으로부터 1차 스크린에서 확인되었다. 그런 다음, 결합 검정(가용성의 단리된 알파 3 도메인 null 및 세포에서 발현된 단리된 알파 3 도메인, HLA-G Null 1,3, HLA-G Null3 2AA)의 추가의 특성화를 1차 스크린의 양성 상청액에 대해 수행하였다.
형광 초점 방법 및 HLA-G ECD 단백질에 대한 결합을 사용하여 가변 V 영역 회수를 바람직한 프로파일을 갖는 웰에 대해 수행하였다.
이와 동시에, 골수 및 림프절의 형질 세포도 형광 초점 방법을 사용하여 인간 HLA-G 또는 특이적으로 α3 도메인에 결합하는 능력에 대해 직접 스크리닝되었다. 여기서, HLA-G 특이적 항체를 분비하는 B 세포는 비오티닐화된 인간 HLA-G ECD에서 선별되거나 스트렙타비딘 비드에 고정된 단리된 야생형 HLA-G α3 도메인에서 선별되었다. 염소 항-종 Fc-FITC 접합체 공개 시약을 사용하였다. 약 1700개의 직접 초점이 선별되었다.
선별된 세포의 역전사(RT) 및 PCR 후에, 항체의 V 영역을 코딩하는 '전사 활성 PCR'(TAP) 산물이 생성되어 EXPI293 HEK 세포를 일시적으로 형질감염시키는 데 사용되었다. 재조합 항체를 함유하는 생성된 TAP 상청액을 다음 검정으로 시험하였다:
- 도메인 결합 확립을 돕는 위에서 설명한 바와 같이 HLA-G 및 null 돌연변이체에 대한 세포 결합(다중 iQue).
- ILT2 차단 검정
- 비아코어에 의한 친화도 측정
그런 다음, 관심 TAP 생성물로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 쌍을 종 일치된 전장 IgG 항체로서 클로닝하고, 일시적 발현 시스템에서 재발현시켰다. 그런 다음, 재조합 클로닝된 항체를 위의 검정에서 다시 시험하였다.
총 109개의 V(가변) 영역이 클로닝되고, 등록되었으며, 이들 중 30개만이 HLA-G에 특이적이고 다른 HLA-I에는 결합하지 않았으며, 그 중 9개만이 HLA-G ILT2 상호작용을 차단하는 것으로 나타났다. 이들 항체는 모두 HLA-G의 알파 3 도메인에 결합하였으며, 9개의 특이적 및 차단 항체 중 5개는 다양한 서열을 갖고, 추가의 시험을 위해 사용되었다(아래 표 3에 나열됨).
인간화 캠페인은 그의 특성을 기반으로 일부 항체에 대해 수행되었으며, 최고의 항체인 것으로 보이는 HLA-G02 및 HLA-G01을 포함한 특성화 검정에서 추가로 평가되었다. VR12389의 인간화는 실시예 4에 기재되어 있다. HLA-G03도 인간화되었으나, 인간화 항체의 높은 친화도는 추가의 실시예에서 설명되는 바와 같이 개선된 기능적 활성으로 해석되지 않았다.
정제된 항체에 대해 수행된 추가의 검정에는 세포 기반 특이성 검정, ILT4 차단 검정, ADCC가 포함되었다. 정제된 IgG1 항체에 대해 생성된 데이터는 아래의 추가의 실시예에서 설명된다.
본 개시내용에서, 항체 ID HLA-G02는 인간화 VR12389gL2gH16 IgG1 항체를 지칭한다.
항체 12389를 발견한 면역화 방법
HLA-G를 일시적으로 발현하는 Rab9 세포
Rab9 섬유모세포를 5단 세포 배양 플라스크 내의 RPMI 배지 + 10% FBS 및 1% 글루타민에서 배양하였다. 세포가 90-100% 융합되었을 때, 배지를 제거하고, 세포를 100 ml PBS로 세척하고, 100 ml 아큐타제(Accutase)를 사용하여 세포 배양 플라스크에서 세포를 제거하고, 실온에서 10-15분 동안 인큐베이팅하였다. 수확된 세포를 회전시키고, 얼스 균형 염(Earles Balanced Salt) 완충액에 5x107개의 세포/ml로 재현탁시켰다. HLA-G DNA를 세포 1 ml당 250 μg의 DNA로 세포에 첨가하였다. 이어서, Rab9 + HLA-G DNA 혼합물을 3x107개의 세포/큐벳으로 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 이어서, 큐벳은 본 발명자들의 전기천공기 장치(Zapper) 및 젠 펄서 엑셀 쇼크포드(Gene Pulser Xcell ShockPod) 큐벳 챔버(BIORAD)를 사용하여 150-170V 전기(20 ms 5.5 Amp)로 펄싱되었다. 전기 펄스에 이어, 세포를 따뜻한 Rab9 배지로 빠르게 옮기고, 새로운 5단 세포 배양 플라스크에 다시 넣었다.
모든 세포를 전기천공하고 새로운 배양 플라스크로 옮긴 후, 세포를 아큐타제를 사용하여(앞서 설명한 바와 같이) 수확하기 전에 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이팅하고, 계수한 다음, -80℃ 냉동고에서 냉동바이알당 2x107개의 세포로 냉동바이알에 넣고 냉동하였다. 24시간 후, 장기 보관을 위해 냉동 세포를 액체 질소 듀어(dewar)로 옮겼다.
동결 전에, 5x105개의 형질감염된 세포를 시그마(Sigma) APC 접합 항-HLA-G 항체(클론 MEM/G9)로 4℃에서 1시간 동안 염색하고 FACS 칼리버(Calibre)에서 샘플을 통과시켜 HLA-G의 발현에 대해 시험하였다.
면역화 당일에 각각의 주사에 대해 1 바이알의 형질감염된 세포를 37℃에서 빠르게 해동하고, 50 ml의 PBS로 두 번 세척한 후, 토끼에게 투여하기 위해 500 μl에 재현탁시켰다.
전장 HLA-G(서열 번호 111)를 코딩하는 DNA 서열을 전기천공에 사용하였다(포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 HLA-G의 핵 서열).
면역화
한 마리의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼(New Zealand White rabbit)를 상기 기재된 바와 같이 제조된 세포 표면에 HLA-G를 일시적으로 발현하는 2x107개의 Rab9 토끼 섬유모세포로 피하 면역화하였다. 동일한 부피의 완전 프로인트 아주반트를 토끼의 별도 부위에 피하 주사하였지만, 이와 동시에 세포로 면역화하였다.
토끼에게 세포 표면에 HLA-G를 일시적으로 발현하는 Rab9 토끼 섬유모세포를 14일 간격으로 2회 부스터 주사하였다. 각각의 면역화 전에 귀 정맥에서 헤파린 처리된 혈액(200 μl)을 채취하였다. 벤치 탑 원심분리기에서 5분 동안 10,000 rpm으로 회전시킨 후 혈액으로부터 혈청을 수집하고, -20℃에서 동결시켰다. 비장, 림프절, 골수 및 말초 혈액 단핵 세포의 단일 세포 현탁액을 준비하고 B 세포 발견 목적을 위해 필요할 때까지 -80℃에서 10% DMSO/FCS에 냉동함으로써 최종 부스트 14일 후에 과정이 종료되었다. 종료 시에 혈액을 채취하고, 이전에 설명한 바와 같이 혈청을 준비하였다.
B 세포 회수 및 스크리닝
VR12389는 비장의 기억 B 세포 배양물에서 발견되었다. 비장 세포를 피더 세포주 및 보충제와 함께 96웰 플레이트에서 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 이어서, 이 배양물을 비세척 다중 유세포 분석 기반 검정(Intellicyt iQue)을 통해 스크리닝하였다. 분비된 항체를 함유하는 배양 상청액을 상기 기재된 바와 같은 스크리닝 시약(자체 생성된 HLA-G 단백질 및 세포 발현된 HLA-G 구축물: HLA-G, HLA-G Null 1,2,3, HLA-G Null3)과 혼합하였다. 스크린에 사용된 스크리닝 세포는 상이한 집단의 게이팅을 허용하기 위해 차별적으로 염색되었으며, 딜라이트(Dylight) 405 표지된 염소 항-토끼 항체를 2차 항체로 사용하여 항체 결합을 확인하였다.
히트는 특이적인, 즉 HLA-G Null 1,2,3 돌연변이체 또는 관련 없는 대조군 형질감염체에 결합하지 않는 HLA-G 결합제로 정의되었다. 히트를 담당하는 B 세포는 원래의 배양 웰로 돌아가서, 이전에 설명한 바와 같이 형광 초점 방법을 사용하여 회수되었다.
두 리드(lead) 모두에 대해 선별된 세포는 초점 단계 이후 동일한 작업 흐름을 따랐다. 선별된 세포의 역전사(RT) 및 PCR은 EXPI293 HEK 세포를 일시적으로 형질감염시키는 데 사용된 항체의 V 영역을 코딩하는 '전사 활성 PCR'(TAP) 산물을 생성하였다. 재조합 항체를 함유하는 생성된 TAP 상청액은 항체를 클로닝하고 더 큰 규모로 발현시키기 전에 세포 결합, ILT2 차단 및 친화도를 특성화하였다.
위에서 언급한 바와 같이, 다양한 종(래트, 마우스 및 토끼 포함)에 걸쳐 다수의 동물을 B2m 동시 발현 유무에 관계없이 다양한 형태의 HLA-G를 발현하는 동계 세포로 면역화했지만 모든 면역화 전략이 HLA-G에 대한 항체의 생산에 성공한 것은 아니거나, HLA-G에 대한 항체의 생산이 확인된 경우 항체는 HLA-G에 특이적이지 않았거나 차단하지 않았거나, 세포 표면 발현된 HLA-G 단백질에 결합할 수 없었다. 주목할 만한 점은 단리된 알파 3 도메인을 발현하거나 토끼-인간 HLA-G 키메라를 발현하는 Rab9 세포로 토끼를 면역화한 결과, HLA-G에 대한 어떠한 항체도 생성되지 않았다는 것이다. 그러므로, 본 개시내용은 치료에 유용한 항-HLA-G 항체를 발견하는 데 특히 유용한 면역화 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 표면에서 HLA-G의 전장 서열을 일시적으로 발현하는 Rab9 토끼 섬유모세포로 토끼를 면역화하는 것을 포함한다.
실시예 3: 파지 디스플레이에 의한 항체의 생성
치료에 유용할 항체를 확인하기 위해, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 치료에 유용할, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하려는 면역화 캠페인과 병행하여 두 번째 접근 방식이 개발되었다. 다시 말하지만, 치료에 유용한 HLA-G 항체 생산과 관련된 특정 문제로 인해 특별한 스크리닝 및 검사 전략이 개발되었다.
파지 디스플레이 라이브러리
다른 HLA-I에 결합하지 않거나 최소한으로 결합하는, HLA-G에 대한 선택적인 결합제를 얻기 위한 목적으로 상이한 구축물을 사용하여 HLA-G에 결합하는 항체를 얻기 위해 3개의 인간 나이브 조합 scFv 파지 라이브러리를 사용하였다. 라이브러리는 세포의 표면에서만 발현되는 재조합 HLA-G를 사용하거나 최종 라운드에서 재조합 HLA-G 세포외 도메인 단백질을 사용하는 3 또는 4회의 선택 라운드를 사용하여 바이오패닝되었다. HLA-G Null 1,2,3(가용성 단백질 또는 세포 발현된)에 대한 선택적 배제 단계가 HLA-G 특이적 결합제를 농축하기 위해 최종 라운드에 포함되였다.
간단히 설명하면, 세포에 대한 바이오 패닝은 첫 번째 라운드의 경우 ExpiCHO에서 인간 HLA-G 및 β2m을 코딩하는 DNA 구축물을, 후속 라운드의 경우에는 Expi293 HEK를 동시 형질감염시키고, 이들 세포를 비형질감염된 또는 HLA-G Null 1,2,3 형질감염된 세포에 대해 이전에 고갈된 차단된 파지 비리온과 함께 인큐베이팅하는 것으로 구성되었다. 단백질에 대한 바이오 패닝은 차단된 파지 입자를 플레이트 코팅된 HLA-G와 함께 또는 용액 내의 비오티닐화된 HLA-G와 함께 인큐베이팅한 후, 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘 자기 비드에 포획하여 수행되었다. PBS Tween을 사용하여 여러 번 세척한 후, 이. 콜라이 TG1을 감염시켜 표적에 결합된 파지를 용리하고, 다시 증폭시켰다.
파지 스크리닝
마지막 선택 라운드 후, 1692개의 모노클로날 구조 파지를 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 포획된 비오티닐화된 HLA-G ECD에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 결합은 HRP-접합 항-M13 pVIII 코트 단백질 항체에 의해 검출되었다. 비오티닐화된 HLA-G Null 1,2,3을 사용하여 이러한 모노클로날 파지 클론의 특이성을 평가하였다. 관심 있는 359개 결합제를 시퀀싱하고, 가변 중쇄 CDR3 서열 모티프를 기반으로 하여 다양성을 분석하였다. 그런 다음, 81개의 독특한 클론을 추가의 특성화를 위해 포유동물 발현 벡터에서 scFv-토끼 IgG Fc 융합체로 재포맷하였다.
HLA-G 선택성 결합제의 추가의 특성화
scFv-Fc는 Expi293 HEK에서 발현되었다. 이들의 결합 및 특이성은 인텔리사이트 iQue 스크리너 플러스(Screener Plus)를 사용하여 유세포 분석에 의해 시험되었다. 희석된 항체 함유 상청액을 인간 HLA-G 또는 HLA-G 및 β2 마이크로글로불린으로 동시 형질감염된 ExpiHEK에 첨가하였다. Fc-단편 특이적 형광 항체를 사용하여 결합을 검출하였다.
HLA-G Null 1,2,3 +B2m에 결합하지 않은 21개의 HLA-G 세포 결합제는 scFv-Fc로서 및/또는 전장 인간 IgG1로 재포맷하나 이상의는 후에 SPR, ILT2 차단 검정, 유세포 분석에 의한 HEK 상에 발현된 HLA-A, -B, -C, -E, -F에 대한 결합 및 JEG3 세포에 대한 결합에 의해 추가로 특성화되었다.
14개의 항체는 다른 HLA-I 분자에 대한 결합이 없거나 최소한으로 결합하여 HLA-G에 매우 특이적인 것으로 확인되었으며, 그 중 6개의 항체만이 HLA-G와 ILT2 사이의 상호작용을 차단하는 것으로 밝혀졌다.
6개의 특이적 및 차단 항체 중에서, 3개는 다양한 서열을 갖고 있으며, 추가의 시험을 위해 사용되었다(HLA-G06, HLA-G07, HLA-G08).
정제된 항체에 대해 수행된 추가의 검정에는 세포 기반 특이성 검정, ILT4 차단 검정, ADCC가 포함되었다. 정제된 항체에 대해 생성된 데이터는 아래 추가의 실시예에서 설명된다.
실시예 4: 항체 12389 인간화
항체 12389는 토끼 V-영역의 CDR을 인간 생식계열 항체 V-영역 프레임워크에 이식하여 인간화되었다. 항체의 활성을 회복하기 위해, 토끼 V-영역의 다수의 프레임워크 잔기도 인간화 서열에 유지되었다. 이들 잔기는 아데어(Adair) 등에 의해 개괄된 프로토콜을 사용하여 선택되었다(WO91/09967). 토끼 항체(공여자) V-영역 서열과 인간 생식계열(수용자) V-영역 서열의 정렬이 설계된 인간화 서열과 함께 도 2 및 3에 표시되어 있다. 공여자로부터 수용자 서열로 이식된 CDR은 카바트(Kabat et al., 1987)에 의해 정의된 것과 같지만, CDR-H1은 코티아/카바트 조합 정의가 사용된다(Adair et al., WO91/09967 참조).
항체 12389의 경우, 인간 V-영역 IGKV1D-13 + IGKJ4 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 경쇄 CDR에 대한 수용자로서 선택하였다. 인간화 이식 변이체의 경쇄 프레임워크 잔기는 잔기 3 및 70을 포함하는 군으로부터의 하나 또는 두 개의 잔기를 제외하고는 모두 인간 생식계열 유전자에서 유래하고, 여기서 서열 번호 7(토끼 VL)에서의 공여자 잔기 발린(V3) 및 글루타민(Q70)은 각각 유지되었다.
인간 V-영역 IGHV3-66 + IGHJ4 J-영역(IMGT, http://www.imgt.org/)이 항체 12389의 중쇄 CDR에 대한 수용자로서 선택되었다. 많은 토끼 항체와 마찬가지로, 항체 12389의 VH 유전자는 선택된 인간 수용자보다 더 짧다. 인간 수용자 서열과 정렬될 때, 항체 12389의 VH 영역의 프레임워크 1에는 인간화 항체에서 유지되는 N-말단 잔기가 결여되어 있다(도 3). 12389 토끼 VH 영역의 프레임워크 3에는 또한 베타 시트 가닥 D와 E 사이의 루프에 2개의 잔기(75 및 76, 서열 번호 11 참조, 토끼 VH)가 결여되어 있고, 인간화 이식 변이체에서 갭은 선택된 인간 수용자 서열로부터의 상응하는 잔기(라이신 75, K75; 아스파라긴 76, N76)로 채워져 있다. 인간화 이식 변이체의 중쇄 프레임워크 잔기는 잔기 24, 48, 49, 71, 73, 78 및 96을 포함하는 군으로부터의 하나 또는 두 개의 잔기를 제외하고는 모두 인간 생식계열 유전자에서 유래하고, 여기서 서열 번호 11에서의 공여자 잔기 발린 (V24), 이소류신(148), 글리신(G49), 라이신(K71), 세린(S73), 발린(V78) 및 글리신(G96)은 각각 유지되었다.
변이체 인간화 항체 사슬 및 이들의 조합을 발현시키고, 모 항체에 비해 인간 HLA-G에 대한 결합 친화도를 평가하였다.
Expi293 세포에서의 발현
변이체 중쇄 및 경쇄 V-영역 서열을 코딩하는 유전자는 ATUM(미국 캘리포니아주 뉴어크 소재)의 자동 합성 접근법에 의해 설계 및 구축되었다. 포유동물 세포에서의 일시적 발현을 위해, 인간화 경쇄 V-영역 유전자를 인간 카파 사슬 불변 영역(Km3 동종형)을 코딩하는 DNA를 함유하는 경쇄 발현 벡터 pMhCK에 클로닝하였다. 인간화 중쇄 V-영역 유전자를 힌지 안정화 돌연변이 S228P를 갖는 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 인간 감마-4 중쇄 발현 벡터 pMhg4PFL(Angal S., King D.J., Bodmer M.W., Turner A., Lawson A.D.G., Roberts G., PedleyB. and Adair J.R. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol. Immunol.1993, 30 (1):105-8) 내로 또는 인간 감마-1 중쇄 불변 영역(G1m17, 1 동종형)을 코딩하는 DNA를 함유하는 감마-1 중쇄 발현 벡터 pMhg1FL 내로 클로닝하였다. 생성된 중쇄 및 경쇄 벡터를 엑스피펙타민™ 293 형질감염 시약(A14525, ThermoFisher Scientific)을 사용하여 Expi293™ 현탁 세포로 동시 형질감염시키고, 인간화 재조합 IgG4P 및 IgG1 항체를 발현시켰다.
SPR에 의한 친화도 측정
아래에서 설명되는 바와 같이, 검정 형식은 고정된 항-인간 IgG Fc-특이적 항체에 의한 항-HLA-G IgG의 포획, 이어서 포획된 표면에 대한 HLA-G의 적정이었다.
항-HLA-G IgG 결합 HLA-G의 친화도는 비아코어 T200(GE Healthcare Biosciences AB)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되었다. 검정은 25℃에서 수행되었다. 아피니퓨어(Affinipure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적(Jackson ImmunoResearch)을 아민 커플링 화학을 통해 시리즈(Series) S CM5 센서 칩(GE Healthcare BioSciences AB)에 약 6000 반응 단위(RU) 수준으로 고정하였다. HBS-EP+ 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 10 μL/분의 유속으로 이동 완충액으로 사용하였다. 적절한 유동 셀을 활성화 및 불활성화하여 참조 표면을 준비하였다.
0.15 - 0.7 μg/mL 농도의 항-HLA-G IgG의 10 μL 주사를 고정된 항-인간 IgG인 Fc에 의한 포획에 사용하였다. 인간 HLA-G ECD + B2m은 60초 동안 30 μL/분의 유속으로 50 nM에서 포획된 항-HLA-G IgG에 대해 적정된 후, 150초 동안 해리되었다. 40 mM HCl의 10 μL 주입, 이어서 5 mM NaOH의 5 μL 주입에 의해 표면이 10 μL/분의 유속으로 재생되었다.
로컬 Rmax가 적용된 1:1 결합을 사용하여 비아코어 T200 평가 소프트웨어(버전 3.0)를 사용하여 배경 차감 결합 곡선을 분석하였다.
항체는 검정의 시작 및 끝에서 분석되었으며, 우수한 정밀도를 보여주었다. 표 4 및 5에 요약된 바와 같이 모든 샘플에 대해 고품질 데이터가 생성되었다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 12389gL2gH5, 12389gL2gH6, 12389gL2gH8, 12389gL2gH11을 제외한 모든 이식편은 10 nM 미만의 KD를 가졌고, 이것은 모 12389(키메라 토끼 V 영역/인간 Fc)에 대해 측정된 KD 미만이었다.
VH 프레임워크 공여자 잔기 I48, G49, K71 및 V78 및 VL 프레임워크 공여자 잔기 V3을 보유하는 이식편 12389gL2gH16은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때 인간 HLA-G에 대한 가장 높은 친화도 결합을 가졌고, 다른 형식으로 발현될 때 기능성을 유지하였고(예를 들어, IgG4P 및 IgG1(표 4-5)), 추가의 특성화를 위해 선택하였다.
실시예 5. HLA-G01-HLA-G08의 발현 및 정제
항체는 HLA-G01-HLA-G08 항체의 LC 및 HC(LC:HC의 1:1 비)를 코딩하는 DNA 벡터로 형질감염된 CHO 세포에서 IgG1로 일시적으로 발현되었고, 추가의 시험을 위해 잘 알려진 방법에 따라 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
단백질 농도는 나노드롭(nanodrop)을 사용하여 280 nm에서 흡광도를 판독하여 결정하고, 순도는 분석용 크기 배제 HPLC에 의해 결정하였다. 분석용 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS PAGE 전기영동을 사용하여 단량체 함량을 결정하였다. 내독소 수준은 챨스 리버 엔도세이프(Charles River Endosafe)® LAL 시약 카트리지 기술 및 엔도세이프® 넥스겐(nexgen)-PTS 판독기를 사용하여 측정되었으며, <1 EU/ml 수준이 허용 가능한 품질이었다.
최종 정제된 샘플은 매우 순도가 높았으며, >98%의 단량체 함량을 함유하였다. 최종 정제된 샘플을 온전한 질량 분석법에 의해 분석하여 중쇄 및 경쇄 질량, 예상되는 변형 및 종류를 확인하였다.
실시예 6: 탈푸코실화된 HLA-G02 항체의 생산
KO FUT8 CHOSXE/DG44 세포의 생산 방법
RNA 가이드(gRNA)는 알파1,6 푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 활성 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 2개의 엑손을 낙아웃하도록 설계되었다. gRNA 2-8(총 7개)은 벤칠링(Benchling) 소프트웨어를 사용하여 정방향 및 역방향 가닥 둘 모두에서 다중 결실을 수행하도록 설계되었으며, 가능한 가장 큰 결실은 4 kb이며, 가이드는 가능한 낙아웃을 최대화하기 위한 풀로서 사용되었다. gRNA의 서열은 아래 표 6에 제공된다.
gRNA 풀은 표 7에 제공된 바와 같이 최종 pmol 농도로 준비되었다. Cas09(ThermoFisher)는 표 7에 제공된 바와 같이 필요한 농도로 준비되었다.
3x106개의 CHO SXE/DG44 세포는 뉴클레오펙션(nucleofection)을 위해 준비되었으며, x100 g에서 8분 동안 원심분리한 후, 세포를 PBS로 세척하고, 다시 x100 g에서 8분 동안 원심분리하고, 3x104/μl의 세포를 제공하기 위해 100 μl의 뉴클레오펙션 용액에 재현탁하였다. 형질감염 전 믹스를 아래 표 7에 표시된 바와 같이 제조하고, 세포 없이 실온에서 10-60분 동안 방치하여 CasO9/gRNA 복합체가 형성되도록 하였다.
제조사의 지시에 따라 뉴클레오펙션(뉴클레오펙터(nucleofector) 4D, Lonza)을 진행하기 전에 16.67 μl의 세포(3x104개의 세포/μl)를 복합체에 첨가하였다. 900 μl의 미리 데워진 CD CHO 배지를 첨가하여 세포를 회수하고, 수직으로 세운 작은 T25 플라스크에 넣었다. 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 방치한 후, 세포가 회복되고 나누어지면 배지를 미리 데워진 신선한 CD CHO(오염 위험을 줄이기 위해 항생제 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B를 첨가하였다)로 교체하고, 125 ml의 진탕 플라스크에 옮겼다(96-120시간 후).
뉴클레오펙션 10일 후에, 세포는 FACS에 의해 분류될 준비가 되었다. 세포를 LCA 염색(플루오레세인에 접합된 렌즈 쿨리나리스(Lens Culinaris) 아글루티닌)으로 염색하였다. 8분 동안 x100 g에서 원심분리하여 FACS를 위해 세포를 준비하고, 세포를 PBS로 세척하고, x100 g에서 8분 동안 다시 원심분리하고, 미리 데워진 CD CHO 배지에 재현탁하고, 20 μg/ml의 LCA 염색물을 첨가하고, 45분 동안 방치하고, 세포를 PBS로 2회 세척하여(x10O g에서 8분 동안 원심분리, PBS에 재현탁) 임의의 결합되지 않은 염색을 제거하였다. FUT8 양성 세포의 세포 표면에 있는 LCA 결합 푸코스, FUT8 음성(낙아웃 세포)은 염색되지 않았으며, 미리 데워진 CD CHO 배지에 수집되었다. 세포를 37℃, 5% CO2에 놓아서 세포가 필요한 세포 밀도에 도달할 때까지 회수하고 계대배양하였다.
탈푸코실화된 HLA-G 항체의 생산
HLA-G02 항체 구축물은 전술한 바와 같이 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 효소(FUT8)가 낙다운되도록 추가로 변형된 조작된 CHO-SXE 세포주(Cain et al. 2012)에서 발현되었다. ExpiCHO 형질감염 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 이들 세포로부터 탈푸코실화된 항체를 일시적으로 생성하였다. 고수율 프로토콜에 따라, 세포를 ExpiCHO 발현 배지에 6x106개의 세포/ml의 세포 밀도로 접종하였다. 200 ml 배양의 경우, 200 μg의 DNA를 8 ml의 Opti-PRO 무혈청 배지(SFM)로 희석하고, 세포에 첨가하기 전에 640 μl의 엑스피펙타민 형질감염 시약을 함유한 7.4 ml의 Opti-PRO SFM과 혼합하였다. 세포를 190 RPM으로 설정된 진탕 플랫폼에서 8% CO2 및 37℃로 설정된 인큐베이터로 옮기고, 형질감염 후 제1일에, 48 ml의 피드 및 1200 μl의 인핸서를 세포에 첨가하고, 인큐베이터로 다시 옮기고, 온도를 32℃로 낮추었다. 제10일에 4,000 RPM에서 1시간 동안 원심분리하여 배양물을 수확하였다. 세포 배양 상청액은 0.22 μM 스테리컵(Stericup) 필터에 적용하여 정화하였다.
생성물 역가는 인피니티(Infinity) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에 부착된 단백질 G 컬럼에 상청액 100 μl를 로딩하여 결정되었다. 생성물은 150 mM 염화나트륨(pH 2.1)을 사용하여 컬럼에서 용리되었으며, A280 신호는 정제된 Fab 표준물과 비교되었다. 정화된 상청액을 맵셀렉트 슈어(MabSelect Sure) 컬럼(GE Healthcare)에 5 ml/분의 속도로 로딩하고, 3 컬럼 부피(CV)의 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 포획된 단백질은 낮은 pH 완충액인 0.1 M 시트르산나트륨 완충액(pH 3.6)를 사용하여 컬럼에서 용리되었다. 용리액은 2 M 트리스-HCl(pH 8.5)로 중화되었다. 고분자량 종을 제거하기 위해, 친화도 정제된 단백질을 10 mM 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)에서 평형화된 수퍼덱스 16/60 겔 여과 크로마토그래피 컬럼에 1 ml/분으로 로딩하고, 용리된 분획을 적절한 분획을 모으기 전에 분석용 SE-UPLC에 의해 분석하였다. 모은 분획을 SDS-PAGE 및 SE-UPLC에 적용하여 단백질 품질 및 순도를 결정하였다.
본 개시내용에서, 달리 명시하지 않는 한, "HLA-G02"는 변형되지 않은 통상적인(즉, 푸코실화된) VR12389gL2gH16 IgG1을 의미한다. "탈푸코실화된 HLA-02"는 본원에서 설명되는 방법에 따라 생산된 상응하는 탈푸코실화된 IgG1 항체를 지칭한다.
실시예 7: HLA-G 항체의 결합, 친화도 및 특이성
7.1. SPR에 의해 측정한 HLA-G WT에 대한 친화도
HLA-G에 대한 항-HLA-G 항체(hIgG1 형식)의 결합 친화도는 비아코어 T200(GE Healthcare Biosciences AB)을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되었다. 검정은 25℃에서 수행되었다. 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 특이성(Jackson ImmunoResearch)을 아민 커플링 화학을 통해 시리즈 S CM5 센서 칩(GE Healthcare Bio-Sciences AB)에 대략 6000 반응 단위(RU) 수준으로 고정하였다. HBS-EP+ 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 10 μL/분의 유속으로 이동 완충액으로 사용하였다. 적절한 유동 셀을 활성화 및 불활성화하여 참조 표면을 준비하였다.
0.6 - 0.9 μg/mL 농도의 항-HLA-G 항체 10 μL 주사를 고정된 항-인간 IgG, Fc에 의한 포획에 사용하였다. 인간 HLA-G ECD + B2m은 60초, 90초 또는 120초 동안 30 μL/분의 유속으로 다양한 최고 농도 4000 nM, 400 nM, 100 nM 및 50 nM로부터 포획된 항-HLA-G hIgG1에 대해 적정된 후, 120초, 180초 또는 240초 동안 해리되었다(표 8).
결과는 표 9에 제시되어 있다.
HLA-G06, HLA-G07 및 HLA-G08은 SPR에 의해 결정될 때 HLA-G에 대해 가장 낮은 친화도(더 높은 K D 값)를 가졌다. HLA-G01, HLA-G02, HLA-G03은 HLA-G에 대한 친화도가 가장 높았다.
또 다른 검정에서, 탈푸코실화된 HLA-G02의 친화도가 또한 평가되었으며, 통상적인(푸코실화된) HLA-G02 대응물과 유사한 것으로 밝혀졌다. 그 결과는 하기 표 10에 제시되어 있다.
7.2. 특이성을 평가하기 위해 SPR에 의해 측정된 HLA-G Null 1,2,3에 대한 친화도
HLA-G Null 1,2,3에 대한 항-HLA-G IgG1 항체의 결합 친화도는 비아코어 T200(GE Healthcare Biosciences AB)을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되었다. 검정은 25℃에서 수행되었다. 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 특이성(Jackson ImmunoResearch)을 아민 커플링 화학을 통해 시리즈 S CM5 센서 칩(GE Healthcare Bio-Sciences AB)에 대략 6000 반응 단위(RU) 수준으로 고정하였다. HBS-EP+ 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 10 μL/분의 유속으로 이동 완충액으로 사용하였다. 적절한 유동 셀을 활성화 및 불활성화하여 참조 표면을 준비하였다.
0.6 - 0.9 μg/mL 농도의 항-HLA-G 항체의 10 μL 주사를 고정된 항-인간 IgG인 Fc에 의한 포획에 사용하였다. 인간 "HLA-G Null 1,2,3" 돌연변이체 AVItev 1OHisTag + B2m은 60초 동안 30 μL/분의 유속으로 2 μM에서 포획된 항-HLA-G IgG에 대해 적정된 후, 150초 동안 해리되었다. 40 mM HCl의 10 μL 주입, 이어서 5 mM NaOH의 5 μL 주입에 의해 표면이 10 μL/분의 유속으로 재생되었다.
정상 상태 분석을 사용하고 비아코어 T200 평가 소프트웨어(버전 3.0)를 사용하여 배경 차감 결합 곡선을 분석하였다. 그 결과는 표 11에 제시되어 있다.
HLA-G01 - HLA-G07에 대한 결합이 검출되지 않았다. HLA-G08은 HLA-G Null 1,2,3에 일부 결합을 보이고, 따라서 HLA-G에 덜 특이적이었다.
7.3. 항체의 특이성을 평가하기 위한 HEK 발현 HLA-G 야생형 대 HLA-G Null 1,2,3에 대한 결합
인간 배아 신장(HEK293) 세포에서 발현된 HLA-G 야생형에 대한 결합을 측정하고, "HLA-G Null 1,2,3"과 비교하여 결합 특이성을 결정하였다. 유리하게는, 세포 기반 검정을 사용하여 이량체 HLA-G에 대한 결합을 평가할 수 있는 반면, 위에서 설명한 SPR 검정은 단량체 HLA-G에 대한 결합만을 측정한다.
HLA-G/β2m 또는 HLA-G Null 1,2,3/β2m으로 형질감염된 HEK293 세포를 384웰 V-바닥 플레이트(Greiner)에서 4℃에서 2시간 동안 항-HLA-G IgG1과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 100 nM 내지 0.05 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 인큐베이팅 기간 후에, 세포를 검정 완충액에서 3회 세척한 후, 20 μl의 염색 용액(R-피코에리트린 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)) - 3.75 μg/ml 및 생존성 염료(Viability Dye) e780(Life Technologies))과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 40 μl PBS에 재현탁시켰다. PE 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토(Canto) II 기기에서 실행하였다. FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 EC50 및 Emax를 계산하였다. 그 결과는 표 12에 제시되어 있다.
HLA-G03은 HLA-G01 및 HLA-G02와 비교하여 HEK293에서 발현된 HLA-G에 대해 가장 낮은 친화도를 가졌다. 따라서, HLA-G03보다 HLA-G01 및 HLA-G02가 선호되었다.
HEK 발현 HLA-G에 대한 탈푸코실화된 HLA-G02의 친화도는 통상적인(푸코실화된) 대응물과 유사하였다. HLA-G Null 1,2,3에 대한 HLA-G08의 결합이 검출되었으며, 이는 이 항체가 덜 특이하다는 것을 확인시켜주었다.
7.4. FACS 검정에 의해 결정된 JEG3 세포에 대한 결합 친화도
항-HLA-G IgG의 결합 친화도는 HLA-G를 자연적으로 발현하는 인간 영양막 융모막암종(choriocarcinoma trophoblastic)(JEG3)을 사용하는 유세포 분석 세포 기반 검정으로 측정되었다. 이 검정은 유리하게는 세포 상의 이량체 HLA-G에 대한 결합을 포함하여 HLA-G를 자연적으로 발현하는 세포에 대한 결합을 측정하는 데 사용될 수 있는 반면, 위에서 설명한 SPR 검정은 단량체 HLA-G에 대한 결합만을 측정한다.
JEG3 세포를 미세원심분리 튜브(Eppendorf)에서 4℃에서 2시간 동안 1.5 ml의 항-HLA-G IgG1 용액과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 10 nM 내지 0.0005 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 세포를 384웰 V-바닥 플레이트(Greiner)에 옮기고, 20 μl의 염색 용액(R-피코에리트린 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch))- 7.5 μg/ml 및 생존성 염료 e780(Life Technologies))과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 20 μl PBS에 재현탁시켰다. PE 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토 II 기기에서 실행하였다. FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 KD를 계산하였다. 그 결과는 표 13에 제시되어 있다.
HLA-G01 및 HLA-G02는 FACS 검정에서 더 높은 친화도를 보여주었다. 결과는 HLA-G03이 HLA-G01 및 HLA-G02와 비교하여 HLA-G를 자연적으로 발현하는 세포의 표면에, 특히 이량체로서 발현될 때 HLA-G에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다는 것을 확인시켜 주었다.
7.5. HLA-I 및 JEG3 야생형(WT)/HLA-G 낙다운에 대한 결합
항-HLA-G IgG의 결합 특이성을 추가로 조사하기 위해 HEK293 세포에서 발현된 HLA-A/B/C/E/F 컨센서스 분자에 대한 결합을 측정하였다. 동일한 검정에서, JEG3 세포에서 발현된 HLA-G에 대한 결합도 측정하고, JEG3 HLA-G 낙다운(KD)과 비교하였다.
HLA-A, B, C, E 또는 F 컨센서스 서열/β2m 및 JEG3 WT, 및 JEG3 KD로 형질감염된 HEK293 세포를 384웰 V-바닥 플레이트(Greiner)에서 4℃에서 2시간 동안 항-HLA-G IgG1과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 100 nM 내지 0.05 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 인큐베이팅 기간 후에, 세포를 검정 완충액에서 3회 세척한 후, 20 μl의 염색 용액(R-피코에리트린 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch))- 3.75 μg/ml 및 생존성 염료 e780(Life Technologies))과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 40 μl PBS에 재현탁시켰다. PE 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토 II 기기에서 실행하였다. FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 EC50 및 Emax를 계산하였다. 그 결과는 표 14 및 15에 제시되어 있다.
HLA-I 컨센서스에 대한 결합은 검출되지 않았다("ND"). 결과는 항체 HLA-G01 및 HLA-G02가 HLA-G에 매우 특이적임을 확인시켜 주었다.
또한, JEG3 KD에 대한 결합도 검출되지 않았다. HLA-G03은 유사한 EC50을 가졌으나, HLA-G01 및 HLA-G02(또는 탈푸코실화된 HLA-G02)에 비해 Emax가 훨씬 낮았고, 따라서 HLA-G01 또는 HLA-G02만큼 좋지는 않았다.
7.6. 항-HLA G 항체의 HLA-G에 대한 결합 도메인 결정
인간 배아 신장(HEK293) 세포에서 발현된 HLA-G Null3, HLA-G Null 1,3 및 HLA-G Null3 2AA에 대한 결합을 측정하여 항-HLA-G IgG의 결합 도메인을 특성화하였다.
HLA-G Null3/β2m, HLA-G Null 1,3/β2M　및 HLA-G Null3 2AA/β2M으로 형질감염된 HEK293 세포를 384웰 V-바닥 플레이트(Greiner)에서 4℃에서 2시간 동안 항-HLA-G IgG1과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 100 nM 내지 0.05 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 인큐베이팅 기간 후에, 세포를 검정 완충액에서 3회 세척한 후, 20 μl의 염색 용액(R-피코에리트린 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch))- 3.75 μg/ml 및 생존성 염료 e780(Life Technologies))과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 40 μl PBS에 재현탁시켰다. PE 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토 II 기기에서 실행하였다. FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 EC50 및 Emax를 계산하였다. 그 결과는 표 16에 제시되어 있다.
데이터에 따르면, HLA-G02를 포함하는 항체는 HLA-G 알파 3 도메인에 특이적인 것으로 나타났다. 데이터를 통해 HLA-G08의 특이도가 가장 낮은 것으로 확인되었다.
7.7. PBMC 실험에서 평가된 HLA-G02의 특이성
HLA-G02의 특이성은 다양한 HLA-I 대립유전자를 대표하는 50명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 추가로 확인되었다. 목표는 항-HLA-G 항체가 특이적이고, 특히 PBMC 및 CD4+ T 림프구 상에 발현된 다른 HLA-1 분자와 교차 반응하지 않는다는 것을 확인하는 것이었다.
PBMC는 말초 정맥혈에서 정제하고, 냉동 배지(90% FBS + 10% DMSO) 내에서 액체 질소에 보관하였다. 50명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를 해동하고, 1 ml의 완전 RPMI 배지(RPMI 1640 배지 + 10% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 재현탁하였다. 세포를 300 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, PBS로 2회 세척하였다. 세포 펠렛을 1 ml의 Fac 완충액(PBS, 0.5% BSA 및 2 mM EDTA)에 재현탁시키고, 세포를 50 μl의 세포 현탁액/웰로 96웰 플레이트에 접종하였다.
세포를 항-인간 CD4-APC(Biolegend, 2.5 μl/웰) 및 항-HLA-G 항체(HLA-G02 또는 대조군 "pan-HLA", 즉 HLA-I에 결합하고 HLA-G에 특이적이지 않는 IgG1) 또는 이소형 대조군(웰당 20 μg/ml의 용액 50 μl)로 염색하였다. 세포를 실온에서 암실에서 20분 동안 인큐베이팅한 후, Facs 완충액으로 2회 세척하고, 2차 항체 염소 항-인간 IgG-FITC(Jackson ImmunoResearch, 1/100 희석)를 함유하는 50 μl의 Facs 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 암실에서 추가로 20분 동안 인큐베이팅한 다음, Facs 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 100 μl/웰의 Facs 완충액에 재현탁시키고, 샘플을 칸토 II(HTS 1)에서 수집했으며, 샘플당 10,000개의 이벤트를 수집하였다. 각각의 공여자에 대해 각각의 CD4+ 세포 집단의 평균 형광 강도(MFI)를 측정함으로써 FlowJo 소프트웨어 v10.6.0을 사용하여 분석을 수행하였다. 그래프는 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
결과는 도 4에 제시되어 있다. 도 4는 pan-HLA 항체와 비교하여 특이적 항-HLA-G 항체 HLA-G02의 50명의 상이한 공여자에 걸친 CD4 T 세포에 대한 결합의 결여를 보여준다. 데이터는 각각의 공여자에 대한 평균 형광 강도(MFI)로 표현된다.
7.8. 세포막 결합된 HLA-G 이소형, 즉 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 또는 HLA-G4에 대한 HLA-G02의 결합
Expi293F 인간 세포는 엑스피펙타민™ 293 형질감염 키트를 사용하고 제조사의 프로토콜(ThermoFisher Scientific, ref#A14524)에 따라 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 또는 HLA-G4를 코딩하는 플라스미드로 형질감염되었다. 형질감염 24시간 후, 세포를 수확하고, PBS(300 rpm, 10분)에서 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. 세포를 96웰/플레이트에 접종하고, 항-HLA-G 항체 HLA-G02(인간 IgG1) 또는 상업용 항체 4H84(Abcam, 마우스 IgG1)를 10 μg/ml의 최종 농도로 염색하고, 암실에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 Facs 완충액(PBS, 0.5% BSA 및 2 mM EDTA)으로 두 번 세척하고, 2차 항체 염소 항-인간 IgG-PE(Jackson ImmunoResearch, 1/100 희석) 또는 염소 항-마우스 IgG-PE(Jackson ImmunoResearch, 1/100 희석)를 포함하는 50 μl의 Facs 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 암실에서 추가로 20분 동안 인큐베이팅한 다음, Facs 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 100 μl의 Facs 완충액에 재현탁시키고, 샘플을 칸토 II(HTS 1)에서 획득하였다.
결과는 도 5에 제시되어 있다. 도 5a는 HLA-G 알파 3 도메인에 특이적인 HLA-G02 항체가 음성 대조군(예를 들어, neg CTRL, 관련 없는 Ab)과 비해 HLA-G1 및 HLA-G2(각각 68% 및 17% 양성 세포)를 모두 인식하지만 HLA-G3 및 HLA-G4는 인식하지 못함을 보여준다. α1 도메인에 특이적인 상업용 마우스 항-HLA-G 항체 4H84를 양성 대조군으로 사용하였으며, 모든 이소형 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 또는 HLA-G4를 인식한다(각각 81, 34, 67 및 16%의 세포 염색).
도 5b는 특히 HLA-G 알파 3 도메인에 특이적인 HLA-G02 항체가 음성 대조군(관련 없는 Ab)에 비해 HLA-G2(17% 양성 세포)를 인식한다는 것을 보여준다. α1 도메인에 특이적인 상업용 마우스 항-HLA-G 항체 4H84를 HLA-G2에 대한 양성 대조군으로 사용하였다(34% 양성 세포).
실시예 8: HLA-G와 ILT2 또는 ILT4 사이의 상호작용을 차단하는 HLA-G 항체의 능력 평가
8.1. JEG3과 ILT2 사이의 상호작용의 차단
항-HLA-G IgG를 HLA-G를 발현하는 인간 영양막 융모막암종(JEG3) 및 ILT2 토끼 Fc와 함께 인큐베이팅하여 HLA-G에 대한 ILT2 결합을 차단하는 효능을 측정하였다.
JEG3 세포를 384웰 V-바닥 플레이트(Greiner)에서 4℃에서 1시간 동안 항-HLA-G IgG1과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 100 nM 내지 0.05 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 인큐베이팅 기간 후에, 세포를 검정 완충액에서 세척한 후, 3 μg/ml의 20 μl의 ILT2rbFc 용액과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 5 μl의 염색 용액(플루오레세인(FITC) 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-토끼 IgG, Fc 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch)) - 7.5 μg/ml 및 생존성 염료 e780(Life Technologies))를 4℃에서 20분 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 40 μl PBS에 재현탁시켰다. FITC 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토 II 기기에서 실행하였다. FACSDiva 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 IC50 및 억제 백분율을 계산하였다. 그 결과는 표 17에 제시되어 있다.
JEG3와 ILT2 사이의 상호작용의 차단: 대량 부피의 반응
일부 항체는 이전의 ILT2 차단 검정에서 매우 낮은 IC50을 나타냈다. 이러한 낮은 농도에서는 IC50 값이 과대평가될 수 있는 작은 반응 부피로 인해 리간드 고갈이 발생할 가능성이 가장 높다. 리간드 고갈을 극복하기 위해, 대량 부피의 항-HLA-G IgG 용액(이전 검정에서 확인된 최고의 차단 항체 중의)을 HLA-G를 발현하는 JEG3 및 ILT2 토끼 Fc와 함께 인큐베이팅하여 HLA-G에 대한 ILT2의 결합을 차단하는 효능의 측정을 개선하였다.
JEG3 세포를 미세원심분리 튜브(Eppendorf)에서 4℃에서 2시간 동안 1.5 ml의 항-HLA-G IgG1 용액과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 10 nM 내지 0.0005 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 세포를 384웰 V-바닥 플레이트(Greiner)에 옮기고, 검정 완충액에서 3회 세척한 후, 3 μg/ml의 20 μl의 ILT2rbFc 용액과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 20 μl의 염색 용액(플루오레세인(FITC) 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-토끼 IgG, Fc 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch)) - 7.5 μg/ml 및 생존성 염료 e780(Life Technologies))과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 20 μl PBS에 재현탁시켰다. FITC 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토 II 기기에서 실행하였다. IC50 및 억제 백분율은 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 계산하였다. 그 결과는 표 17에 제시되어 있다.
8.2. HEK에 발현된 HLA-G와 ILT2 사이의 상호작용의 차단
항-HLA-G IgG를 HLA-G 및 ILT2 토끼 Fc로 형질감염된 HEK293 세포와 함께 인큐베이팅하여 HLA-G에 대한 ILT2 결합을 차단하는 효능을 측정하였다.
HLA-G/β2M으로 형질감염된 HEK293 세포를 384웰 V-바닥 플레이트(Greiner)에서 4℃에서 1시간 동안 항-HLA-G IgG1과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 100 nM 내지 0.05 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 인큐베이팅 기간 후에, 세포를 검정 완충액에서 세척한 후, 1 μg/ml의 20 μl의 ILT2rbFc 용액과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 5 μl의 염색 용액(플루오레세인(FITC) 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-토끼 IgG, Fc 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch)) - 3 μg/ml 및 생존성 염료 e780(Life Technologies))를 4℃에서 20분 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 40 μl PBS에 재현탁시켰다. FITC 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토 II 기기에서 실행하였다. FACSDiva 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 IC50 및 억제 백분율을 계산하였다. 그 결과는 표 17에 제시되어 있다.
8.3. HCT116에 발현된 HLA-G와 ILT4 사이의 상호작용의 차단
항-HLA-G IgG를 HLA-G 및 ILT4 토끼 Fc로 형질감염된 인간 결장암(HCT116) 세포와 함께 인큐베이팅하여 HLA-G에 대한 ILT4 결합을 차단하는 효능을 측정하였다.
HLA-G/β2M으로 형질감염된 HCT116 세포를 384웰 V-바닥 플레이트(Greiner)에서 4℃에서 1시간 동안 항-HLA-G IgG1과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 100 nM 내지 0.05 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 인큐베이팅 기간 후에, 세포를 검정 완충액에서 세척한 후, 0.4 μg/ml의 20 μl의 ILT2rbFc 용액과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 5 μl의 염색 용액(플루오레세인(FITC) 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-토끼 IgG, Fc 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch)) - 1.5 μg/ml 및 생존성 염료 e780(Life Technologies))를 4℃에서 20분 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 40 μl PBS에 재현탁시켰다. FITC 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토 II 기기에서 실행하였다. FACSDiva 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 IC50 및 억제 백분율을 계산하였다. 그 결과는 표 17에 제시되어 있다.
HLA-G01 및 HLA-G02는 HLA-G와 ILT2의 회합 및 HLA-G와 ILT4의 회합을 가장 효과적으로 차단하는 것으로 확인되었다. 탈푸코실화된 HLA-G02의 차단 특성은 그의 통상적인(즉, 푸코실화된) 대응물의 특성과 유사하였다.
실시예 9: HLA-G 발현 세포의 ADCC에서 HLA-G01-HLA-G08 항체의 효능 및 효력
항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)은 NK 세포와 같은 Fc 수용체를 발현하는 세포가 항체로 코팅된 세포를 인식하고 죽일 수 있는 면역 메커니즘이다. 이는 항암 반응에 중요한 과정이며, 많은 항암 요법의 효능을 뒷받침하는 중요한 메커니즘이다. 시험관 내에서 ADCC를 유도하는 항-HLA-G IgG1 항체 패널의 능력은 HLA-G를 발현하는 두 가지의 상이한 유형의 표적 세포를 사용하여 결정되었다. 이들 세포는 HLA-G 및 인간 베타-2-마이크로글로불린으로 형질감염되었거나(HCT116 결장직장암 세포) 또는 그의 세포 표면에 표적을 내인적으로 발현하였다(JEG3 세포).
방법:
HCT116 결장직장암 세포주의 형질감염
HCT116 세포를 녹색 형광 단백질(GFP) 태그를 또한 코딩하는 HLA-G 구축물로 형질감염시켰다. 따라서, HLA-G로 성공적으로 형질감염된 세포는 GFP도 발현했으며, 유세포 분석을 통해 쉽게 확인하고 정확하게 모니터링할 수 있었다. 총 40 μg의 DNA(각각 20 μg의 HLA-G ECD GFP 및 인간 β2M 플라스미드) 및 80 μL의 리포펙타민 LTX를 사용하여 T75 조직 배양 플라스크에서 4 x 106개의 HCT116 세포를 형질감염시켰다. 24시간 후에, 세포를 플라스크에서 분리하고, 아래에서 설명되는 바와 같이 표적 세포로 사용하였다.
시험관내 ADCC 검정
HLA-G 형질감염된 HCT116 또는 JEG3 표적 세포를 폴리프로필렌 둥근 바닥 플레이트 내의 적절한 배양 배지에 접종하였다(50 μL 부피의 웰당 2 x 104개의 세포). 항-HLA-G 또는 대조군 항체를 동일한 배지에서 4X 농축 스톡으로 제조하고, 50 μl/웰을 적절한 웰에 첨가하였다. 모든 항체는 이용 가능한 공여자 NK 세포의 수에 따라 이중 또는 삼중으로 시험되었다. 일부 표적 세포는 어떠한 항체도 없는 상태였으며, 무처리 대조군으로 사용되었다.
1차 인간 NK 세포는 자기 비드 키트(Miltenyi Biotech)를 사용하여 음성 선택을 통해 전혈에서 단리되었다. 정제된 NK 세포를 검정에 필요한 최소 부피의 RPMI + 10% FBS, 2 mM L-글루타민에 재현탁시켰다. 검정 플레이트의 적절한 웰에 100 μl/웰의 NK 세포를 표적 세포 및 항체의 상부에 첨가하였다. 이펙터:표적 비는 공여자 NK 세포 수에 따라 10:1 내지 3:1이었다.
검정 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 ~3시간 동안 인큐베이팅하였다. 3시간 후, 살아있는 표적 세포의 수를 유세포 분석법으로 측정하였다. 검정 플레이트를 300 g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 각각의 웰을 상피 세포 마커 Epcam 및 NK 세포 마커 CD56에 대해 염색하였다. 염색 항체(항-Epcam PE 및 항-CD56 BV421)를 세포 염색 완충액에 1/100로 희석하고, 100 μL/웰을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 염색 후, 세포를 150 μl/웰 의PBS로 두 번 세척하고, 플레이트를 각각의 세척 사이에 3분 동안 300 g에서 원심분리하였다. 염색이 끝나면, 각각의 웰의 세포를 50 nM TO-PRO™-3 세포 생존성 염료를 함유하는 최종 부피 100 μL/웰의 PBS에 재현탁시켰다.
10분 후, 각각의 웰로부터 정확히 70 μL의 샘플을 BD FACS 칸토 II 기기에서 수집하고, 데이터를 FlowJoV10.60 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 웰에 대해 살아있는 표적 세포의 총 수를 결정하였다. 살아있는 표적 세포는 처음에는 TO-PRO-™3 음성으로 확인되었고, 그 다음에는 CD56 음성 및 SSC 높음으로 확인되었다. 그런 다음, 세포를 Epcam(JEG3) 또는 Epcam 및 GFP 발현(HCT116)에 대해 게이팅하였다. 처리되지 않은 세포 또는 이소형 대조군과 비교한 고갈 %를 각각의 시험 샘플에 대해 계산하고, 데이터를 분석을 위해 그래프패드 프리즘 8.1.1 소프트웨어로 전송하였다.
결과:
도 6은 다양한 항-HLA-G 항체 또는 IgG1 이소형 대조군 항체로 처리한 후, 고갈된 Epcam+ GFP+ HCT116 표적 세포의 백분율을 보여준다. 각각의 항체는 1 μg(흰색 막대) 또는 O.O1 μg/ml(줄무늬 막대)의 두 가지 상이한 농도에서 시험되었다. E:T 비는 3.5:1이었다. 각각의 막대는 3개 데이터 점의 평균(및 범위)을 나타내고, 각각의 점/정사각형은 개별 시험물이다. 데이터는 대표적인 단일 공여자로부터 나온 것이다.
표 18은 도 6에 나타낸 각각의 항체에 의한 Epcam+ GFP+ HCT116 세포의 평균 고갈 백분율을 나열한 것이다(N.D.: 검출되지 않음).
몇몇 항체는 최고 농도의 항체(1 μg/mL)에서 유사한 GFP+ 세포의 평균 고갈 %를 나타냈다. 가장 낮은 농도(0.01 μg/mL)에서 관찰된 GFP+ 세포의 가장 높은 평균 고갈%는 항체 HLA-G01 및 HLA-G02에 대해 관찰되었다. 이러한 항체는 ADCC 검정에서 추가의 특성화를 위해 사용되었다.
도 7은 3개의 개별 실험(3명의 다른 공여자)에서 얻은 항-HLA-G 항체 HLA-G01 및 HLA-G02 또는 IgG1 이소형 대조군 항체로 처리한 후 고갈된 Epcam+ GFP+ HCT116 표적 세포의 백분율을 보여준다. 항체는 1 μg/ml(도 7a) 또는 O.O1 μg/ml(도 7b)에서 시험되었다. E:T 비는 2.5 내지 3:1이었다. 각각의 막대는 개별 실험의 데이터의 평균(및 범위)을 나타내며, 각각의 점, 정사각형 또는 삼각형은 개별 시험물이다.
표 19는 도 7a에 나타낸 1 μg/mL에서의 각각의 항체에 의한 Epcam+ GFP+ HCT116 세포의 평균 고갈 백분율을 나열한 것이다.
표 20은 도 7b에 나타낸 0.01 μg/mL에서의 각각의 항체에 의한 Epcam+ GFP+ HCT116 세포의 평균 고갈 백분율을 나열한 것이다.
두 항체 농도 모두에서, 항체 HLA-G02는 ADCC 검정에서 측정된 바와 같이 HLA-G01보다 더 나은 세포 고갈 활성을 나타냈다.
도 8은 이소형 대조군과 비교한, 항-HLA-G 항체 HLA-G01 및 HLA-G02의 적정으로 처리한 후 Epcam+ GFP+ HCT116 세포의 고갈 백분율을 보여준다. E:T 비는 4:1이었다. 각각의 점은 3회 반복 시험의 평균(및 범위)을 나타낸다. 표시된 데이터는 대표적인 단일 공여자로부터 얻은 것이다.
이러한 결과에 기초하여, 추가의 특성화 및 개발을 위해 항체 HLA-G02를 선택했으며, 특히 HLA-G02의 탈푸코실화된 버전을 통상적인 IgG1과의 비교를 위해 위에서 설명한 대로 제조하였다.
항체의 탈푸코실화는 FcγRIII:Fc 결합 친화도를 증가시키는 것으로 나타났으며, IgG1 분자의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 보고되었다. 따라서, HLA-G02의 탈푸코실화된 버전을 형질감염된 HCT116 또는 JEG3 세포의 ADCC를 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 탈푸코실화된 항체를 통상적인 IgG1 형식으로 만들어진 동일한 항체 V 영역과 비교하였다.
도 9a는 통상적인 HLA-G02 IgG1(실선) 또는 탈푸코실화된 HLA-G02 IgG1("aF HLA-G02", 점선)로 처리한 후 JEG3 세포의 고갈 백분율을 보여준다. E:T 비는 10:1이었다. 각각의 점은 2회 반복 시험의 평균(및 범위)을 나타낸다. 대표적인 단일 공여자의 데이터가 표시된다.
도 9b는 통상적인 HLA-G02 IgG1(실선) 또는 탈푸코실화된 HLA-G02 IgG1("aF HLA-G02", 점선)로 처리한 후 Epcam+ GFP+ HCT116 세포의 고갈 백분율을 보여준다. E:T 비는 5:1이었다. 각각의 점은 3회 반복 시험의 평균(및 범위)을 나타낸다. 대표적인 단일 공여자의 데이터가 표시된다.
항체 HLA-G02는 세포 사멸 검정에서 더 나은 효능 및 효력을 나타냈고, 따라서 치료에 사용하기 위한 후보로서 추가의 개발을 위해 선택되었다. HLA-G02의 탈푸코실화된 버전은 그의 통상적인(즉, 푸코실화된) 대응물에 비해 향상된 ADCC를 가졌다.
실시예 10: HLA-G 발현 세포의 식세포 작용에서 HLA-G 항체 HLA-G02의 효능 및 효력
HLA 음성 K562 세포를 표적으로 사용하고, 형질감염시켜 HLA-G를 발현시켰다. 미리 표지된 표적 세포(CTY+)를 hIgG1 형식의 HLA-G02 항체와 함께 단핵구 유래 대식세포(CD11b+)와 함께 인큐베이팅하였다. CTY+CD11b+ 세포의 백분율을 측정하여 식세포 작용을 분석하였다.
방법:
CD14+ 단핵구는 미처리된(untouched) 단핵구의 단리를 위한 간접 자기 표지 시스템인 인간 범 단핵구 단리(Pan Monocyte Isolation) 키트(Miltenyi)를 사용하여 말초 정맥혈로부터 정제되었다. 세포는 7일 동안 37℃, 5% CO2에서 완전 RPMI 배지(RPMI 1640 배지 + 10% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 50 ng/ml의 재조합 MCSF를 사용하여 대식세포로 분화시켰다.
HLA 음성 적백혈병 K562 세포를 4D-뉴클레오펙터 시스템 및 SF 세포주 4D-뉴클레오펙터™ X 키트 L(Lonza, ref# V4XC-2024)을 사용하여 HLA-G 및 B2m으로 형질감염시키거나 모의 형질감염시키고, 완전 RPMI에서 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 수확하고, 세척하고, 셀 트레이스 옐로(Cell Trace Yellow)(Thermofisher)로 표지하고, 다시 세척하고, 96웰 둥근 바닥 초저 부착 플레이트(Corning Costar) 내의 100 μl의 완전 RPMI에 웰당 25,000개의 세포로 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 100 μg/ml로 항-CD47 항체 또는 항-HLA-G 항체 또는 이소형 대조군과 함께 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세척 후, 세포를 대식세포:세포 표적 = 2:1의 비로 단핵구 유래 대식세포(웰당 50,000개의 대식세포)와 합하였다. 혼합된 세포를 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 다음, 세포를 세척하고, PBS + 10%의 정제된 인간 Fc 감마R-결합 억제제(Thermofisher)에 4℃에서 20분 동안 재현탁한 다음, 4℃에서 20분 동안 항-CD11b-APC(Biolegend)로 염색하였다. 세포를 세척하고, DAPI(500 ng/ml) 죽은 세포 배제의 존재 하에 PBS + 2 mM EDTA + 0.5% BSA에 재현탁시켰다. 샘플은 BD FACSCanto에서 유세포 분석을 통해 획득되었다. CTY+CD11b+ 이중 양성 세포의 백분율을 측정함으로써 FlowJo 소프트웨어 v10.6.0을 사용하여 분석을 수행하였다.
항-CD47을 양성 대조군으로 사용하였다. 연구에 따르면, 표적 세포에서 CD47을 억제하면, 대식세포에서 발현되는 수용체인 SIRPa와 CD47의 상호작용이 억제되어 식세포 작용이 증가하는 것으로 나타났다. CD47의 발현은 종양 세포에서 상향조절되는 것으로 나타났으며, 항-CD47 항체는 현재 임상 시험에서 시험되고 있다. 식세포 작용 검정에서, 단핵구 유래 대식세포의 식세포 작용 활성을 평가하는 것이 좋은 대조군이며, 모의 세포와 HLA-G 형질감염 세포 둘 모두 식세포 작용을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
결과:
표 21은 HLA-G 발현 K562 표적 세포(HLA-G/B2m K562)와 비교하여 모의 형질감염된 K562에 대한 항-HLA-G 항체의 HLA-G 특이적 식세포 작용 활성을 보여준다.
데이터는 CTY+CD11b+ 이중 양성 세포의 백분율로 표시되며, 이중으로 실시된 3번의 독립적인 실험을 나타낸다.
표 22는 IgG1 이소형 대조군과 비교하여 HLA-G02의 통계적으로 유의한 HLA-G 특이적 식세포 작용 활성을 보여준다. 데이터는 6명의 공여자로부터 수집된 데이터(이중)를 나타낸다. 데이터를 엑셀로 내보내고, 모의 형질감염된 세포의 식세포 작용 평균 백분율로 정규화하였다.
도 10은 항-CD47 항체 및 이소형 대조군과 비교한 모의 형질감염된(도 10a) 및 HLA-G/B2m 형질감염된 K562 표적 세포(도 10b)에 대한 인간 항-HLA-G IgG1 항체 HLA-G02의 HLA-G 특이적 식세포 작용 활성의 적정을 보여준다. 데이터는 CTY+CD11b+ 이중 양성 세포의 백분율로 표시되며, 공여자 2명 중 1명을 나타낸 것이다(표 23).
도 11은 항-CD47 항체 및 이소형 대조군과 비교한 모의 형질감염된(도 11a) 및 HLA-G 발현 K562 표적 세포(도 11b)에 대한 HLA-G02의 통상적인 및 탈푸코실화(aF) 형식의 HLA-G 특이적 식세포 작용 활성의 적정을 보여준다.
데이터는 CTY+CD11b+ 이중 양성 세포의 백분율로 표시되며, 2회의 독립적인 실험에서 공여자 3명 중 1명을 대표한다(표 24).
탈푸코실화된 HLA-G02는 그의 통상적인(즉, 푸코실화된) 대응물 HLA-G02에 비해 개선된 ADCP를 보여주었다.
실시예 11: X선 결정학에 의한 VR12389 항체의 에피토프 매핑
HLA-G 융합 단백질의 생산
- 동종이량체화에 필요한 시스테인이 세린으로 돌연변이된 PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his-HLA-G(C42S)(굵은 글씨의 신호 펩타이드(발현 후 절단됨), 밑줄 친 펩타이드, 이탤릭체의 GS 링커, B2m 서열, 이탤릭체의 GS 링커, 회색 음영으로 표시된 C42S가 있는 HLA-G 서열, 굵은 글씨의 이탤릭체로 표시된 tev 절단 부위, 이탤릭체의 GS 링커, 10개의 히스태그),
단백질 PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his는 제조업체의 프로토콜에 따라 Expi293™ 발현 시스템(Life Technologies™)을 사용하여 일시적 형질감염에 의해 발현되었다. 형질감염 5일 후 세포를 수확하고, 상청액을 즉시 정제에 사용하였다. PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his 단백질을 포함하는 상청액을 히스트랩 니엑셀(Histrap NiExcel) 컬럼에 적용하였다. 결합되지 않은 단백질 및 오염물을 PBS, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸(pH 7.4)로 세척하고, 펩타이드 B2mHLAG C42S mut tev10his 단백질의를 PBS, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸(pH 7.4)로 용리하였다. 정제된 PeptideB2mHLAG C42S mut tev10his 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 단백질을 tev 프로테아제와 함께 1:100 비로 실온에서 2시간 동안, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하여 his 태그를 제거하였다. 단백질을 농축하고, 20 mM 트리스, 50 mM NaCl(pH 7.4) 완충액으로 평형화된 S200 26/60에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 정제된 PeptideB2mHLAG C42S mut 단백질을 함유한 분획을 모으고, 2.94 mg/ml로 농축하고, -80℃에서 1 mg 분취량으로 보관하였다.
PeptideB2mHLAG C42S mut 단백질은 SDS-PAGE에 의해 특성화되었으며, 글리코실화된 단백질의 예상 분자량(MW)과 일치하는 겔 상의 위치로 이동하였다.
복합체 형성 및 결정 구조에 사용된, 획득된 단백질 PeptideB2mHLAG C42S mut의 아미노산 서열은 다음과 같다:
- Fab 정제 VR12389
토끼 Fab(VR12389)(서열 번호 9로 표시되는 경쇄 서열 및 서열 번호 13으로 표시되는 중쇄 서열)는 분비된 단백질로서 ExpiCHO 세포에서 발현되었다. 경쇄 및 중쇄에 대한 발현 구축물을 1:1의 몰비로 동시 형질전환시켰다. 분비된 단백질은 단백질 G 비드 위에 조건화된 배지를 통과시켜 정제하고, 0.1 M 글리신(pH 2.7)로 용리시켰다. 2 M 트리스-HC1(pH 8.5)를 첨가하여 분획을 중화하였다. 단백질을 PBS(pH 7.2)로 투석한 다음, 5.62 mg/ml로 농축하고, 4℃에서 보관하였다.
- VR12389 RbFab이 포함된 PeptideB2mHLAG C42S mut 단백질
융합된 펩타이드_β2m_HLA-G를 VR12389 RbFab와 1:1.1의 몰비로 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 이동 완충액으로 10 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl(pH 7.5)을 사용하여 수퍼덱스 200 16/600 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 복합체를 정제하였다. NuPAGE 4-20% 트리스-글리신(Thermo)을 사용하여 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석한 다음, 아미콘® 울트라-15 원심분리 필터 장치(Millipore)를 사용하여 가장 순수한 복합체 분획을 10.4 mg/ml로 농축하였다.
VR12389 RbFab를 포함하는 PeptideB2mHLAG C42S mut 단백질의 결정학
복합체의 결정화 조건은 여러 개의 상업적으로 이용 가능한 결정화 스크린을 사용하여 확인되었다. 이는 Swissci 96웰 2방울 MRC 결정화 플레이트(Molecular Dimensions에서 구입, 카탈로그 번호 MD11-00-100)를 사용하여 시팅 드롭(sitting drop) 형식으로 수행되었다. 먼저, 마이크로랩(Microlab) STAR 액체 취급 시스템(Hamilton)을 사용하여 스크린의 각각의 결정화 조건 용액 75 μL를 저장소에 채웠다. 그런 다음, HLA-G/VR12389 복합체 300 nL 및 저장 용액 300 nL를 모스퀴토(Mosquito) 액체 취급기(TTP LabTech)를 사용하여 결정화 플레이트의 웰에 분배하였다. 결정은 pH 8.0에서 2 M 황산암모늄 및 0.1 M 트리스를 함유하는 ProPlex-HT96 스크린(Molecular Dimensions)의 조건 G4에서 확인되었다. 동결 방지제로서 25% 글리세롤을 함유한 저장소 용액을 사용하여 결정을 동결하였다. 회절 데이터는 다이아몬드 광원에서 수집되었다. 구조는 페이저(Phaser)에서 분자 대체를 사용하여 결정되었다. Phenix.refine 및 쿠트(Coot)는 자동 및 수동 개선 주기를 번갈아 사용하는 데 사용되었다.
VR12389와 복합체를 이루는 HLA-G의 결정 구조를 ILT2 및 ILT4와 복합체를 이루는 HLA-G의 결정 구조와 중첩함으로써(문헌에 보고된 바와 같음, 예를 들어 [Q Wang et al., Cellular & Molecular Immunology, 2019 and Shiroishi, PNAS vol 103, No44, P 16412-16417, 2006] 참조), VR12389는 입체 장애에 의해 HLA-G가 ILT2 및 ILT4 수용체와 상호작용하는 것을 방지한다는 것이 분명하였다(도 12).
4 Å 미만의 접촉 거리에서, VR12389 항체에 의해 인식되는 HLA-G 에피토프는 HLA-G 잔기 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257을 포함한다.
5 Å 미만의 접촉 거리에서, VR12389 항체에 의해 인식되는 HLA-G 에피토프는 HLA-G 잔기 V194, F195, Y197, E198, R219, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250, E253 및 Y257을 포함한다.
실시예 12: HDX-MS 및 NMR에 의한 12389 항체의 에피토프 매핑
정적 조건에서 수행되는 결정학과 달리, HDX-MS 및 NMR은 용액 내의 상호작용을 분석하고 결정학에서 항상 명확하지는 않은 알로스테릭 또는 입체형태적 변화를 보여줄 수 있는 기술이다.
HDX-MS 재료 및 방법
샘플 준비 및 데이터 획득
HDX-MS 분석을 위해, 12 μM의 인간 HLA-G ECD(서열 번호 110)를 36 μM의 12389 항체(IgG1 또는 Fab로서 발현됨)와 복합체화하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다.
4 μl의 HLA-G 또는 HLA-G 복합체를 25℃에서 H2O(pH 7.0) 중의 57 μL의 10 mM 포스페이트로 희석하거나, 또는 D2O(pD 7.0) 중의 10 mM 포스페이트로 희석하였다. 이어서, 중수소화된 샘플을 25℃에서 0.5, 2, 15 및 60분 동안 인큐베이팅하였다. 반응 후, 모든 샘플을 켄칭 완충액(4 M 구아나딘 하이드로클로라이드, 250 mM 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(TCEP), 100 mM 포스페이트)과 1:1로 혼합하여 1℃에서 켄칭하였다. 혼합된 용액의 최종 pH는 2.5였다. 혼합물을 펩신 소화를 위해 나노애퀴티(nanoAcquity) HDX 모듈(Waters Corp.)에 즉시 주입하였다. 그런 다음, 20℃의 물 중의 0.2% 포름산에서 100 μL/분의 유속으로 효소 온라인 분해 컬럼(Waters)을 사용하여 온라인으로 펩타이드 분해를 수행하였다. 모든 중수소화된 시점 및 중수소화되지 않은 대조군은 각각의 데이터 점 사이에 블랭크 실행을 두고 3회 수행되었다.
그런 다음, 애퀴티(Acquity) BEH C18 1.7 μM VANGUARD 냉각 프리컬럼을 사용하여 펩타이드 단편을 3분 동안 포획하였다. 이어서, 펩타이드를 다음 구배를 사용하여 냉각된 애퀴티 UPLC BEH C18 1.7 μM 1.0 x 100으로 용리하였다: 0분, 5% B; 6분, 35% B; 7분, 40% B; 8분, 95% B, 11분, 5% B; 12분, 95% B; 13분, 5% B; 14분, 95% B; 15분, 5% B(A: H2O 중의 0.2% HCOOH, B: 아세토니트릴 중의 0.2% HCOOH. 펩타이드 단편은 양성 전기분무를 통해 시냅트(Synapt) G2-Si 질량 분석기(Waters)로 이온화되었다. 데이터 획득은 MSe 방법(낮은 충돌 에너지, 4 V; 높은 충돌 에너지: 18 V로부터 40 V로의 램프)을 사용하여 50-2000 Th의 m/z 범위에 걸쳐 ToF 전용 모드로 실행되었다. Glu-1-피브리노펩타이드 B 펩타이드는 내부 잠금 질량 보정(internal lock mass correction)에 사용되었다.
HDX-MS 데이터 처리
HLA-G의 중수소화되지 않은 대조군 샘플의 MSE 데이터는 워터스 프로테인 링스 글로벌 서버(Waters Protein Lynx Global Server) 2.5.1(PLGS)을 사용하여 서열 확인에 사용되었다. 펩타이드 검색은 HLA-G 서열의 데이터베이스에 대해서만 수행되었으며, 전구체 강도 임계값은 500개이고, 3개의 일치된 생성 이온이 할당에 필요하였다. 3개의 대조군 샘플에 대한 이온 계산 파일을 Dynamx v3.0 소프트웨어에 입력한 펩타이드 목록과 조합하였다.
펩타이드는 DynamX에서 추가의 필터링을 거쳤다. 사용된 필터링 파라미터는 최소 및 최대 펩타이드 서열 길이가 각각 4 및 25, 최소 강도가 1000, 최소 MS/MS 생성물이 2, 아미노산당 최소 생성물이 0.2, 최대 MH +오류 임계값이 10 ppm이었다. DynamX v3.0은 각각의 시점에서 각각의 펩타이드에 대한 중수소 흡수로 인한 동위원소 외피를 정량하는 데 사용되었다. 또한, m/z 피크의 올바른 할당을 보장하기 위해 모든 스펙트럼을 시각적으로 검사하고 확인했으며, 신호 대 잡음비가 높은 펩타이드만 HDX-MS 분석에 사용하였다.
Dynamx의 수동 필터링에 이어서, 통계 분석 및 필터링은 문헌 [Houde et al. 2011]에서 발표된 통계 분석을 사용하는 듀터로스(Deuteros)를 사용하여 수행되었다. 듀터로스는 펩타이드 길이, 시작 및 끝 잔기, 전체적인 적용 범위, 및 절대 흡수량(Daltons 단위)인 y축 측정 기준을 표시하는 우즈 플롯(woods plot)을 생성한다. 이는 리간드(결합) 존재 하에서와 apo 형태의 흡수의 차이이다. 우즈 플롯은 먼저 각각의 시점에서 모든 펩타이드에 신뢰도 필터링을 적용한다. 선택된 신뢰 한계를 벗어난 차등 중수소화를 갖는 펩타이드는 유의하지 않은 것이다.
결과:
VR12389의 존재 하에, 항체 결합 시에 중수소 혼입의 통계적으로 유의한 감소를 나타내는 총 12개의 펩타이드가 HLA-G에 대해 관찰되었으며, 그 중 9개는 주요 보호를 나타냈다. 주요 보호 대상은 잔기 178 - 196(MLQRADPPKTHVTHHPVFD) 및 214 - 230(ILTWQRDGEDQTQDVEL)이었다. 두 영역 모두 α3 도메인 내 (및 α2의 마지막 5개의 잔기)에 있다. 항체 결합 시에 중등도 보호를 나타내는 영역은 잔기 234 - 249(RPAGDGTFQKWAAVVV)를 포함하며, 입체형태적 변화로 인한 것으로 보인다. 항체의 존재 및 부재 하에 유사한 교환 패턴을 나타내는 펩타이드는 유의하지 않은 중수소 혼입을 갖는다.
결론적으로, 30초의 중수소 인큐베이팅의 HDX-MS로부터, VR12389에서 잠재적인 결합 도메인은 178-MLQRADPPKTHVTHHPVFD-196 및 214-ILTWQRDGEDQTQDVEL-230이다.
핵자기공명(NMR) 분광학
항체 VR12389의 에피토프 매핑은 항체의 Fab 단편을 사용하여 NMR 분광학에 의해 결정되었다.
재료
HLA-G α3 도메인의 2 H/ 13 C/ 15 N 표지 발현
BL21(DE3) 수용성(Competent) 이. 콜라이(New England BioLabs #C2527H)을 1 μg의 HLA-G α3 짧은 N-His ATUM #393044(HLA-G 잔기: 207-300)로 표준 열 충격을 통해 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 100 μg/ml의 카르베니실린이 함유된 LB 한천 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음날, 단일 콜로니를 사용하여 100 μg/ml의 카르베니실린(Merck #C1389)을 함유한 10 ml L브로쓰를 접종하고, 37℃에서 200 RMP으로 5시간 동안 진탕하면서 성장시켰다(New Brunswick Excella E25). 그런 다음, 출발 배양액 1 ml를 사용하여 2H/13C/15N 표지 최소 배지(아래에서 설명됨) 500 ml를 접종하고, 일회용 2 L 얼렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크(VWR #734-1904)에서 37℃에서 200 RPM에서 진탕하면서 밤새 성장시켰다. 다음날, 하룻밤 배양액의 광학 밀도(OD600)를 기록하였다(Amersham Biosciences Ultrospec 3100 pro). 이어서, 발현 배양물에 하룻밤 배양물을 최종 OD600이 0.1이 되도록 접종하였다.
2H/13C/15N 표지된 최소 배지 발현 배양물을 OD600이 0.9에 도달할 때까지 200 RMP으로 진탕하면서 37℃에서 일회용 2 L 얼렌마이어 플라스크에서 500 ml 배치로 성장시켰다. 이어서, HLA-G α3 발현은 500 μM IPTG(Sigma # 16758)로 유도되었다. 그런 다음, 유도된 배양물을 37℃에서 추가로 4시간 동안 방치한 후, 7,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 수확하였다(Beckman Coulter J6-MI). 수확된 펠렛은 세포 용해 전에 -20℃에서 냉동되었다.
인간 β2m의 표지되지 않은 발현
BL21(DE3) 수용성 이. 콜라이를 1 μg의 인간 β2m(잔기: 21-119) ATUM# 358573으로 형질전환하고, 위와 같이 성장시켰다. 다음날, 단일 콜로니를 사용하여 100 μg/ml의 카르베니실린을 함유한 10 ml L브로쓰(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L NaCl, 1 mM NaH2O)를 접종하고, 200 RMP으로 진탕하면서 37℃에서 5시간 동안 성장시켰다. 그런 다음, 1 ml의 출발 배양액을 사용하여 100 μg/ml의 카르베니실린을 함유하는 500 ml L브로쓰를 접종하고, 일회용 2 L 얼렌마이어 플라스크에서 37℃에서 200 RPM으로 진탕하면서 밤새 성장시켰다. 다음날, 하룻밤 배양물의 OD600을 기록하였다. 이어서, 발현 배양물에 하룻밤 배양물을 최종 OD600이 0.1이 되도록 접종하였다.
2x TY(트립톤 16 g/L, 효모 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L) 발현 배양물을 일회용 2 L 얼렌마이어 플라스크에서 500 ml 배치로 37℃에서 200 RMP으로 진탕하면서 OD600이 3.0에 도달할 때까지 다시 성장시켰다. 그런 다음, 인큐베이터 온도를 17℃로 낮췄다. 30분 후, 배양물에 20x 공급 용액(1 M MOPS pH 7.2, 20 mM MgCl2, 20 mM MgSO4, 20% 글리세롤)을 공급하고, 150 μM IPTG로 발현을 유도하였다. 유도된 배양물을 17℃에서 16시간 동안 방치한 후, 원심분리(30분 동안 7,000 g)로 수확하였다. 수확된 펠렛은 세포 용해 전에 -20℃에서 냉동되었다.
박테리아 세포 용해
정제 및 재접힘을 위한 프로토콜은 문헌 [Craig S. Clements et al. The production, purification and crystallization of a soluble heterodimeric form of a highly selected T-cell receptor in its unliganded and liganded state. Biological Crystallography, 2002]에 제시된 것이었다.
세포 펠렛을 용해 완충액(50 mM 트리스(pH 8.0), 1%(v/v) Triton X-100, 1%(w/v) 나트륨 데옥시콜레이트, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mg DNAse I(Biomedicals), 5 mM MgCl2, 완전한 프로테아제 억제제(Roche))에 용해시켰다. 실온에서 10분 동안 계속 교반한 후, 10 mM EDTA를 첨가하였다. 그런 다음, 재현탁된 세포 펠렛을 4℃에서 20 psi의 압력으로 CF 세포 파괴기(Constant 시스템)를 3회 통과시켰다. 그런 다음, 4℃에서 1시간 동안 48,000 g로 원심분리하여 용해물을 정화하였다(Beckman Coulter Avanti JXN-26). 그런 다음, 불용성 펠렛을 세척 완충액 1(50 mM 트리스(pH 8.0), 0.5%(v/v) Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2 mM, 완전 프로테아제 억제제)로 2회 세척하였다. 각각의 세척 사이에 재현탁된 봉입체를 48,000xg에서 30분 동안 원심분리하였다. 두 번째 세척 후에, 봉입체를 최종 세척 완충액(50 mM 트리스(pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 완전 프로테아제 억제제)로 최종 세척하였다. 그런 다음, 정제된 봉입체를 20 mM 트리스(pH 8.0), 8 M 우레아(Sigma #U5378), 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT에서 재용해시켰다. NuPAGE 4-12%, 비스-트리스(Thermo #NP0322) 및 퀵 쿠마시 염료로 염색된 NuPAGE MES SDS 이동 완충액(Thermo #NP0002)을 사용하여 SDS-PAGE를 통해 정제 분획을 분석하였다.
2 H/ 13 C/ 15 N HLA-G α3 및 표지되지 않은 인간 β2m 재접힘
이어서, 재용해된 봉입체를 1.5 M 구아니딘 HCl, 5 mM 아세트산나트륨, 5 mM EDTA에서 대략 1mg/ml로 희석한 후, 재접히도록 하였다.
인간 β2m을 먼저 재접힘 완충액(트리스(pH) 8.5, 0.4 M 아르기닌, 0.5 mM 산화 글루타티온, 5 mM 환원 글루타티온, 2 mM EDTA)에 적가하였다. 이어서, 1:1 몰비의 2H/13C/15N 표지된 HLA-G α3 도메인을 적가하였다. 재접힘 반응물을 부드럽게 교반하면서 실온에서 16시간 동안 방치하였다. 이어서, 3,000 MWCO 스펙트라(Spectra)/포르(Por) 투석막을 사용하여 1:20의 희석 팩터로 투석 완충액(5 mM 트리스(pH 8.5))에서 재접힘 반응을 투석하였다. 투석 완충액은 실온에서 24시간 투석하는 동안 한 번 변경되었다.
접힌 복합체의 정제
이어서, 재접힘된 HLA-G α3/β2m 복합체를 다음 완충액 및 정제 순서를 사용하여 AKTA 퓨어(GE Healthcare) 시스템 및 하이트랩 Q 컬럼(Cytiva Life Sciences)을 사용하여 정제하였다: 완충액 A: 10 mM 트리스, 10 mM NaCl(pH 8.5), 완충액 B: 10 mM 트리스, 500 mM NaCl(pH 8.5). 정제 순서: 5 ml/분의 속도로 실행, 5 CV 완충액 A의 평형화, 투석된 재접힘 반응물의 로딩, 10 CV 완충액 A의 세척, 용리: 10 CV에서 0-40% B, 10 CV에 대해 40% 유지, 20 CV에서는 40-100% B, 10 CV에서는 100% B 유지.
NuPAGE 4-12%, 비스-트리스(Thermo) 및 퀵 쿠마시 염료(VWR #SERA35081.01)로 염색된 NuPAGE MES SDS 이동 완충액(Thermo)을 사용하여 SDS-PAGE를 통해 분획을 분석하였다. 순수한 분획을 모아서 10,000 MWCO 아미콘 울트라(Millipore)를 사용하여 농축하고, 이동 완충액으로 150 mM NaCl, 10 mM 트리스(pH 7.4), 0.02% NaN3을 사용하여 S75 300/10 인크리즈(increase) 겔 여과 컬럼(Cytiva Life Sciences)에 로딩하였다. 다시, SDS-PAGE를 통해 분획을 분석하고, 순수한 분획을 모았다. 최종 정제된 샘플을 SDS-PAGE를 통해 다시 분석한 후, ~ 350 μm로 농축하였다. 써모 사이언티픽 나노드랍(Thermo Scientific Nanodrop) 2000 분광광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
Fab 시약의 정제:
Fab 시약은 AKTA 퓨어 시스템(GE Healthcare) 및 패킹된 감마바인드 플러스 세파로스(Gammabind Plus Sepharose)(Cytiva Life Sciences) 컬럼을 사용하여 정제되었다. 상청액은 AKTA 플럭스(Flux) 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 포획 전에 300 mg/L를 초과하도록 농축되었다. 다음 완충액 및 정제 순서는 다음과 같이 사용되었다: 완충액 A: 10 mM PBS(pH 7.4), 완충액 B: 0.1 M 글리신-HCl(pH 2.7). 5 CV 완충액 A의 평형화. 적어도 20분의 접촉 시간을 보장하기 위한 유속에서의 상청액 로딩. 완충액 A 5 CV 세척. 100% 완충액 B 5 CV 용리. 용리 분획은 2 M 트리스(pH 8.5)로 중화되었다.
NuPAGE 4-20% 트리스-글리신 및 NuPAGE MOPS SDS 이동 완충액(퀵 쿠마시 염료로 염색됨)를 사용하여 SDS-PAGE를 통해 분획을 분석하였다. 순수한 분획을 모아서 10,000 MWCO 아미콘 울트라(Millipore)를 사용하여 농축하고, 이동 완충액으로 10 mM PBS(pH 7.4)를 사용하여 S200 26/60 여과 컬럼(Cytiva Life Sciences)에 로딩하였다. 다시, BEH200 SEC 컬럼(Waters)을 사용하여 SDS-PAGE 및 애퀴티 UPLC H-클래스 시스템(Waters)을 통해 분획을 분석하였다. 순수한 분획을 모아서 5 mg/ml를 초과하도록 농축하였다. 단백질 농도는 써모 사이언티픽 나노드랍 2000 분광광도계를 사용하여 결정되었다.
HLA-G α3의 백본 할당
HLA-G α3 도메인의 백본 할당을 얻기 위해, 150 mM NaCl, 10 mM 트리스(pH 7.4, 0.02% NaN3에서 320 μM 농도의 비표지 β2M과 복합체를 이루는 HLA-G α3의 500 μl의 2H/13C/15N 표지된 샘플을 제조하고, 5 mm NMR 튜브로 옮겼다. 모든 실험은 극저온 냉각 프로브가 장착된 600 MHz 브루커(Bruker) AVIII-HD 또는 600 MHz 브루커 어드밴스 네오(AVANCE NEO) 분광계를 사용하여 35℃에서 기록되었다. 단백질 잔기의 백본 NMR 신호 사이의 순차적 연결은 3D TROSY-HNCACB(Wittekind and Mueller, 1993 HNCACB, a High-Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide-Proton and Nitrogen Resonances with the Alpha- and Beta-Carbon Resonances in Proteins. J. Magn. Reson. Ser. B 101, 201-205. doi:10.1006/jmrb.1993.1033; Salzmann et.al., 1999. TROSY-type Triple Resonance Experiments for Sequential NMR Assignment of Large Proteins. J. Am. Chem. Soc. 121, 844-848. doi: 10.1021/ja9834226) 및 3D TROSY-HNCOCACB(Salzmann et.al., 1999, TROSY-type Triple Resonance Experiments for Sequential NMR Assignment of Large Proteins. J. Am. Chem. Soc. 121, 844-848; Eletsky et.al., 2001. TROSY NMR with partially deuterated proteins. J. Biomol. NMR 120, 177-180)를 사용하여 이루어졌다. TROSY-HNCACB는 각각 13C, 15N 및 1H 차원에서 75, 36 및 16 ppm의 스펙트럼 폭 및 9(F1), 21(F2) 및 70(F3) ms의 획득 시간으로 기록되었다(16회 스캔/증분, 1.3초 이완 지연, 총 획득 시간 5일). TROSY-HNCOCACB는 각각 13C, 15N 및 1H 차원에서 75, 36 및 16 ppm의 스펙트럼 폭 및 9(F1), 21(F2) 및 70(F3) ms의 획득 시간으로 기록되었다(8회 스캔/증분, 1.3초 이완 지연, 총 획득 시간 2일 17시간). NMR 스펙트럼은 NMRPipe를 사용하여 처리되었다(Delaglio et al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-93). Sparky(Goddard and Kneller, D. G. SPARKY 3. In., University of California, San Francisco)를 사용하여 데이터 검정을 수행한 결과, 80개 잔기의 아미드 양성자 및 질소 잔기가 할당되었으며, 이는 천연 단백질의 잔기(프롤린 잔기 제외)의 93%에 해당한다.
Fab 단편의 결합 부위 매핑
Fab 단편의 결합 부위의 매핑은 10% 몰 과량의 표지되지 않은 Fab를 함유하는 표지되지 않은 β2M과 복합체를 이루는 2H/13C/15N HLA-G α3의 150 μM 샘플을 사용하여 수행되었다. HLA-G α3의 백본 할당에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 완충액에서 200 μl의 샘플을 준비하고, 3 mm NMR 튜브로 옮겼다. 1H 및 15N 화학적 이동 변화는 HLA-G α3의 동등한 대조군 TROSY 실험과 HLA-G α3/β2M/Fab 복합체에 대해 기록된 TROSY(Pervushin et.al., 1998. Single Transition-to-single Transition Polarization Transfer (ST2-PT) in [15N,1H]-TROSY. J. biomol. NMR 12, 345-348) 스펙트럼과 비교하여 결정되었다. HLA-G α3/β2M의 대조군 TROSY 실험은 각각 15N 및 1H 차원에서 36 및 16 ppm의 스펙트럼 폭 및 60(F1) 및 80(F2) ms의 획득 시간으로 기록되었다(8회 스캔/증분, 1.5초 이완 지연, 총 획득 시간 1일). HLA-G α3/β2M/Fab의 TROSY 실험은 각각 15N 및 1H 차원에서 36 및 16 ppm의 스펙트럼 폭 및 60(F1) 및 80(F2) ms의 획득 시간으로 기록되었다(8회 스캔/증분, 1.5초 이완 지연, 총 획득 시간 1일). 스펙트럼은 NMRPipe를 사용하여 처리되었다(Delaglio et al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-93). 데이터 분석은 Sparky를 사용하여 수행되었다.
화학적 이동 변화는 조합된 화학적 이동 변화(△δ)를 계산하기 위해 아래 식을 사용하는 최소 이동 접근 방식을 사용하여 분석되었다(Williamson et al., 1997, Mapping the binding site for matrix metalloproteinase on the N-terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-2 by NMR chemical shift perturbation. Biochemistry 36, 13882-9).
여기서, 은 각각 1H 및 15N 화학적 이동의 차이이다. αN은 질소 화학적 이동의 화학적 이동 범위의 차이를 설명하는 데 사용되는 0.2의 스케일링 팩터에 해당한다.
HLA-G α3에서 Fab 결합 부위를 확인하기 위해, 조합된 최소 이동 대 단백질 서열의 히스토그램을 사용하여 유의하게 교란된 신호를 포함하는 HLA-G α3의 영역을 확인하였다. 아미노산에 대한 조합된 최소 이동 변화의 크기가 모든 아미노산에 대한 조합된 화학적 이동 변화의 평균의 역치 값을 초과하는 경우, 이들 잔기는 Fab 결합 부위에서 가능한 접촉 잔기로서 추가의 평가를 위해 선택하였다.
Fab에 의해 결합된 잔기를 확인하기 위해 다음과 같은 두 가지 임계값이 적용되었다: 최소 이동이 모든 계산된 이동의 평균을 초과하는 것 및 최소 이동이 모든 계산된 최소 이동의 평균 + 1 표준 편차를 초과하는 것. 이러한 분석에서, 프롤린 잔기는 아미드 양성자를 포함하지 않기 때문에 확인할 수 없다.
결과:
모든 계산된 이동의 평균(>0.0764)을 초과하는 증가하는 엄격함으로 정의된 NMR에 의해 결정된 에피토프는 잔기 T200, L201, L215, W217, R219, D220, E229, A245, A246, V247, V249, S251, E253, Q255, T258, H260, V261 및 W274를 포함한다. 모든 계산된 이동의 평균 + 1 표준편차(>0.1597)을 초과하는 증가하는 엄격함으로 정의된 NMR에 의해 결정된 에피토프는 잔기 H191, Y197, E198, R202, L230, V248, G252, C259 및 K275를 포함한다.
실시예 13: 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)에 의한 항체 분자의 특성화
HLA-G02(VR12389gL2gH16)(비변형(푸코실화) 및 탈푸코실화), VR12389 gL2gH15 및 HLA-G01의 분자량(MW)은 Xevo G2 Q-ToF 질량 분석기를 갖춘 워터스 애퀴티(Waters ACQUITY) UPLC 시스템을 사용하여 LC-MS에 의해 별도의 중쇄 및 경쇄(환원)에 의해 측정되었다. 샘플(~5 μg)을 150 mM 아세트산암모늄 중의 5 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 사용하여 37℃에서 40분 동안 환원하였다. LC 컬럼은 80℃로 유지되고 유속 0.6 mL/분으로 95% 용매 A(물 / 0.02% 트리플루오로아세트산(TFA) / 0.08% 포름산) 및 5% 용매 B(95% 아세토니트릴 / 5% 물 / 0.02% TFA / 0.08% 포름산)로 평형화된 워터스 바이오리졸브(Waters BioResolve)™RP mAb 폴리페닐, 450 Å, 2.7 μm이다. 단백질은 8.8분에 걸쳐 5%로부터 50%로의 용매 B의 구배를 사용하여 용리되었으며, 이어서 95% 용매 B 세척 및 재평형이 이루어졌다. UV 데이터는 280 nm에서 획득되었다. MS 조건은 다음과 같다: 이온 모드: ESI 양이온, 분해능 모드, 질량 범위: 400-5000 m/z 및 NaI를 사용한 외부 보정.
워터스 매스링스(Waters MassLynx)™ 및 맥스엔트(MaxEnt) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
표 26에 나타낸 바와 같이, 서열로부터 예측된 MW는 모든 항체에 대해 LC-MS에 의해 관찰된 중쇄 및 경쇄의 MW와 일치하였다. 또한, VR12389 gL2gH16의 경우, 예상된 바와 같이 상응하는 탈푸코실화 버전의 중쇄에 대해 ~146 Da의 질량 차이가 있었다.
실시예 14: 열 안정성(Tm) 측정
용융 온도(Tm) 또는 풀림(unfolding) 중간점의 온도는 분자의 구조적 안정성 및 이에 따른 제조 견고성 및 장기 안정성을 평가하기 위해 열 이동 검정을 사용하여 결정하였다.
형광 염료 SYPRO® 오렌지는 온도가 증가함에 따라 노출되는 소수성 영역에 결합하여 단백질 풀림 과정을 모니터링하는 데 사용되었다. 반응 혼합물에는 시험 완충액으로 5000x 농축액으로부터 희석된 30x SYPRO® Orange 단백질 겔 염료(Thermofisher science, S6651) 5 μL가 포함되었다. PBS(pH 7.4)에 용해된 0.2 mg/mL의 샘플 45 μL를 염료에 첨가하고, 혼합하였다. 이 용액 10 μL를 384 PCR 광학 웰 플레이트에 4중으로 분배하고, QuantStudio 7 실시간 PCR 시스템(Thermofisher™)에서 실행하였다. PCR 시스템 가열 장치를 20℃로 설정하고, 1.1℃/분의 속도로 99℃까지 상증시켰다. 전하 커플링 장치는 웰의 형광 변화를 모니터링하였다. 형광 강도 증가를 플로팅하고, 기울기(들)의 변곡점을 사용하여 겉보기 중간점 온도(Tm)를 생성하였다. 데이터는 표 27에 제시되어 있다.
샘플은 높고 유사한 열 안정성을 나타냈는데, 이는 이식편 사이에 실질적인 구조적 차이가 없음을 시사한다. Fab 도메인의 열 안정성은 상당히 다양할 수 있으며(일반적인 범위는 70℃ 내지 84℃임), 기계 안정성이 더 높기 때문에 높은 열 안정성이 바람직하다. 예상한 바와 같이, 통상적인(즉, 푸코실화된) HLA-G02와 탈푸코실화된 HLA-G02 사이에는 의미 있는 구조적 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 15: 실험적 등전점(pl) 측정
iCE3™ 전체 모세관 영상화 모세관 등전점 포커싱(cIEF) 시스템(ProteinSimple™)을 사용하여 pI를 실험적으로 결정하였다.
주요 피크의 실험적 pI는 HLA-G01과 HLA-G02에서 유사한 것으로 나타났다. pI는 제조 단계 및 제제 완충액에 좋을 것으로 예상되는 범위에 있었다. 미량의 산성 및 염기성 하전 종의 존재는 다른 IgG1 치료 분자와 일치하며, 이는 일반적인 번역 후 변형에 기인한 것일 수 있다.
실시예 16: 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 응집 검정을 이용한 용해도 측정
PEG 응집 검정은 고농도 용해도의 모방으로 사용되었다. PEG는 비흡착성, 비변성 중합체이며, 그의 불활성 특성으로 인해 주로 배제된 부피 효과를 통해 단백질 침전을 촉진하는 데 사용되었다. 샘플을 증가하는 농도의 PEG 3350에 노출시키고, 용액에 남아있는 샘플의 양은 A280 nm에서의 흡광도를 플로팅하여 결정되었다. 샘플의 절반이 침전된 % PEG 농도를 측정하여 PEG 중간점(PEGmdpnt) 점수를 생성하였다. 이 점수는 항체 분자가 명백한 천연 상태 응집 성향에 따라 순위가 매겨지는 것을 허용했으며, 낮은 PEGmdpnt 점수(예를 들어, ≤ 10)는 천연 상태 응집에 대한 경향이 더 크다는 것을 나타낸다.
스톡 40% PEG 3350 용액(w/v)을 PBS(pH 7.4) 및 pH 5.0 완충액(일반적인 제제화 전의 저장 완충액)에서 제조하였다. 어시스트 플러스(ASSIST PLUS) 액체 취급 로봇(INTEGRA™ 4505)으로 연속 적정을 수행하여 40% 내지 15.4% PEG 3350의 범위를 얻었다. 비평형 침전을 최소화하기 위해, 샘플 준비는 항체와 PEG 용액을 1:1 부피로 혼합하는 것으로 구성되었다. 35 μL의 PEG 3350 스톡 용액을 액체 취급 로봇에 의해 96웰 v 바닥 PCR 플레이트(A1 내지 H1)에 첨가하였다. 35 μL의 2 mg/mL 샘플 용액을 PEG 스톡 용액에 첨가하여 1 mg/mL 시험 농도 및 20% 내지 7.7%의 최종 PEG 3350 농도를 얻었다. 이 용액을 자동 저속 반복 피페팅으로 혼합하고, 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이팅하여 임의의 비평형 응집체를 재용해하였다. 그런 다음, 샘플을 20℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 이후 샘플 플레이트를 20℃에서 1시간 동안 4000 x g로 원심분리하였다. 50 μL의 상청액을 UV-Star®, 절반 영역, 96웰, μClear®, 마이크로플레이트(Greiner, 675801)에 분배하였다. 단백질 농도는 FLUOstar® Omega 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(BMG LABTECH™)를 사용하여 280 nm에서 UV 분광광도법에 의해 측정하였다. 결과 값은 그래프패드 프리즘 버전 7.04를 사용하여 플로팅되었으며, PEG 중간점(PEGmdpnt) 점수는 S자형 용량-반응(가변 기울기) 피트의 중간점으로부터 유도되었다.
데이터는 표 28에 나타나 있으며, 여기서 더 높은 PEG 중간점(%)은 더 큰 고농도 용해도와 동일하다. NB* 샘플은 가장 낮은 시험 농도인 PEG 3350(7.7%)에서 응집 징후를 보여 정확한 PEG 중간점을 생성할 수 없었다.
PEG 응집 검정 데이터는 시험된 모든 샘플이 PBS에서 중간 정도의 응집 성향을 보임을 나타낸다. 특히, HLA-G01은 pH 5.0에서 매우 높은 응집 성향을 나타냈다. 이와 대조적으로, VR12389 이식편은 pH 5.0 완충액에서 낮은 응집 경향을 나타냈다. 통상적인(즉, 푸코실화된) HLA-G02와 그의 탈푸코실화된 대응물 사이에 의미 있는 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 17: kD 상호작용 파라미터 측정(콜로이드 안정성)
kD 상호작용 파라미터는 콜로이드 안정성을 평가하는 데 사용되었으며, 여기서 양수 값 및 음수 값은 각각 분자간 반발력 및 인력과 관련된다.
동적 광산란(DLS)은 DynaPro III 플레이트 판독기(Wyatt Technology Corp, 미국 캘리포니아주 산타 바바라 소재)에서 수행되었다. 샘플을 PBS(pH 7.4) 또는 pH 5 완충액에 30 μL로 희석하고, 7 mg/mL로부터 1 mg/mL로 1 mg/mL씩 희석하였다. 완충액이 포함된 웰은 용매 오프셋(solvent offset)으로 선택되었으며, 레이저 출력은 20%로 설정되고 자동 감쇠가 활성화된 상태에서 25℃에서 측정이 수행되었다. 각각의 측정은 3중으로 5회의 5초 스캔(5x3)의 평균이었다. 확산 계수(Dm)를 측정하고, 상호작용 파라미터(kD)를 아래 식에 따라 계산하였고, 여기서 D 0 은 무한 희석에서의 확산 계수를 나타낸다.
식: Y 절편에서 Debye 플롯으로 제공된 D0. 기울기 = kD*D0.
확산 계수는 단백질 농도 및 콜로이드 안정성을 평가하는 데 사용된 kD의 함수로 측정되었으며, 여기서 양수 값 및 음수 값은 각각 분자간 반발력 및 인력을 제시한다. 인력/자가 회합을 나타내는 샘플의 경우, 확산 계수는 단백질 농도의 함수로 커지고, 이는 음의 kD 값에 반영된다. 데이터는 표 29에 제시되어 있다.
kD 상호작용 파라미터는 pH 5.0에서 HLA-G01에 대해 매우 음성인 것으로 나타났고, pH 7.4에서는 덜 음성인 것으로 나타났으며, 이는 생리학적 pH에서 더 큰 콜로이드 안정성을 시사한다. VR12389 이식편은 두 pH 모두에서 우수한 콜로이드 안정성을 시사하는 작은 음의 kD 값을 가졌다.
실시예 18: 응집 안정성에 대한 기계적 스트레스의 영향(응집 검정)
단백질은 소수성 표면이 소수성 환경(공기)으로 제시되고 친수성 표면이 친수성 환경(물)으로 제시되는 공기-액체 계면에 노출될 때 풀리는 경향이 있다. 단백질 용액을 교반하면 응집을 유도할 수 있는 대규모 공기-액체 계면이 생성된다. 이 검정은 제조 중에 분자에 가해지는 스트레스(예를 들어, 한외여과)를 모방하고 상이한 항체 분자를 구별하기 위해 엄격한 조건을 제공하는 역할을 한다.
PBS(pH 7.4) 또는 pH 5 완충액 내의 샘플에 에펜도르프 써모믹서 컴포트(Eppendorf Thermomixer Comfort)™를 사용하여 볼텍싱함으로써 스트레스을 가하였다. 볼텍싱 전에 농도를 1 mg/mL로 조정하고, 바리안 캐리(Varian Cary) 50-바이오 분광 광도계®를 사용하여 595 nm에서의 흡광도를 얻어 시간 0 판독값을 설정하였다. 각각의 샘플을 1.5 mL의 원뿔형 에펜도르프® 스타일 캡형 튜브(3x 250 μL)에 분취하고, 최대 24시간 동안 25℃에서 1400 rpm으로 볼텍싱하였다. 바리안 캐리® 50-바이오 분광 광도계를 사용하여 볼텍싱 후 3시간 및 24시간에 595 nm에서 샘플을 측정하여 응집(탁도)을 모니터링하였다. 데이터는 표 30에 요약되어 있다.
볼텍싱 3시간 후, 모든 항체 샘플에 대해 PBS(pH 7.4) 및 pH 5 완충액 둘 모두에서 낮은 응집 경향(595 nm에서의 낮은 흡광도)이 관찰되었다. 더 긴 시점(24시간)에서 샘플을 구별하고 완충액 의존성을 평가하는 것만이 가능하였다. 24시간에, PBS(pH 7.4)와 비교하여 pH 5 완충액에서 및 또한 VR12389 이식편 분자와 비교하여 HLA-G01에서 응집 경향이 약간 더 컸다. 통상적인(즉, 푸코실화된) HLA-G02와 이의 푸코실화된 대응물 사이에는 의미 있는 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 19: 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 소수성이 증가하는 순서로 분자를 분리한다. 분자는 고농도의 극성 염이 있는 경우 소수성 고정상에 결합하고, 염의 농도가 감소하면 이동상으로 탈착된다. 체류 시간이 길수록 소수성이 높아진다.
샘플(2.0 mg/mL)을 1.6 M 황산암모늄, 100 mM 포스페이트(pH 7.4)로 1:2로 희석하였다. 샘플 30 μg(30 μL)을 형광 검출기를 갖춘 애질런트(Agilent) 1200 바이너리 HPLC에 직렬로 연결된 디오넥스 프로팍(Dionex ProPac)™ HIC-10 컬럼(100 mm x 4.6 mm)에 주입하였다. 분리는 고유 형광(여기 및 방출 파장, 각각 280 nm 및 340 nm)으로 모니터링되었다. 완충액 A(0.8 M 황산암모늄, 50 mM 포스페이트(pH 7.4)) 및 완충액 B(50 mM 포스페이트(pH 7.4))를 사용하여, 샘플을 다음과 같이 구배 용리를 사용하여 검정하였다: (i) 0% B에서 2분간 유지, (ii) 30분 동안 0% B에서 100% B로의 선형 구배(0.8 mL/분), (iii) 컬럼을 2분 동안 100% B로 세척하고, 다음 샘플 주입 전에 10분 동안 0% B로 재평형화. 컬럼 온도는 20℃로 유지하였다. 체류 시간(분)은 표 31에 나와 있다.
분자는 낮은 겉보기 소수성을 암시하는 초기 용리 시간을 나타냈다. 낮은 소수성 잠재력은 바람직한 특성으로 보고되었으며, 감소된 응집 경향으로 인해 증가된 개발 가능성을 나타낼 수 있다(Jarasch A et al. 2015). 통상적인(즉, 푸코실화된) HLA-G02 항체와 이의 푸코실화된 대응물 사이에 의미 있는 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 20: HLA-G 조직 교차 반응성
HLA-G02("HLA-G Ab")와 유사한 에피토프를 인식하는 냉동 조직의 염색에 최적화된 항체를 사용하여 정상의 비종양 조직에서의 HLA-G 발현 패턴을 조사한 결과, 놀랍게도 HLA-G Ab에 의해 결합된 에피토프(따라서, HLA-G02에 의해 결합된 에피토프)를 포함하는 HLA-G의 형태는 건강한 조직, 특히 췌장 및 뇌하수체 조직에서 발현되지 않았다.
이는 시룰리(Cirulli) 등이 췌장 섬에서 HLA-G 단백질의 발현을 보고한 문헌에서 이전에 보고된 것과 대조적인데(Cirulli et al, DIABETES, Vol. 55, May 2006); 이들은 세포 복제를 지원하는 세포외 매트릭스에서 배양된 섬 세포에서 HLA-G의 상당한 상향조절을 관찰하였다. 또한, 예를 들어, 뇌하수체, 췌장섬 및 고환에서 HLA-G의 유전자 발현이 보겔(Boegel) 등에 의해 보고되었다(Boegel et al., BMC Medical Genomics (2018) 11:36).
방법:
인간 조직에서의 조직 교차 반응성 연구는 HLA-G에 특이적으로 결합하는 위에서 언급된 HLA-G Ab를 사용하여 수행되었다. 이 조직 교차 반응성(TCR) 연구의 목적은 면역조직화학(IHC) 기술을 사용하여 냉동 인간 조직 및 혈액 도말 검사에서 FITC 접합 HLA-G 항체를 사용하여 HLA-G 항체의 잠재적인 교차 반응성을 평가하는 것이었다.
42개의 상이한 냉동 정상 인간 조직 및 혈액 도말 표본(조직당 3명의 공여자)으로 구성된 패널이 평가되었다. 3 및 10 μg/mL로 설정된 두 가지 농도의 HLA-G Ab-FITC가 사용되었으며, 음성 대조군 IgG1-FITC는 10 μg/mL의 최고 농도에서 사용되었다.
결과:
HLA-G Ab-FITC는 태반의 융모외 영양막에서 막성, 다양한 세포질 염색을 나타냈다. HLA-G는 태아-산모 경계면의 융모외 영양막에서 거의 독점적으로 발현되는 주요 조직적합성 유전자이기 때문에(융모외 영양막은 탈락막 및 모체 나선 동맥을 침범함), 이 패턴은 HLA-G Ab의 표적 결합을 나타내는 것으로 간주되었다(Goldman Whol, 2000).
이에 반해, 다음 조직에서는 양성 염색이 관찰되지 않았다: 부신, 혈액 세포, 골수, 유방, 맹장, 소뇌, 대뇌 피질, 결장, 십이지장, 내피(혈관), 눈, 식도, 나팔관(난관), 담낭, 심장, 회장, 공장, 신장, 간, 폐, 림프절, 근육, 신경, 난소, 췌장, 이하선, 부갑상선, 뇌하수체, 전립선, 직장, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 요관, 방광, 자궁(자궁경부 및 자궁내막).
결론적으로, HLA-G Ab에 의해 결합된 에피토프를 포함하는 HLA-G의 형태는 융모외 영양막 세포에서만 발현되고(문헌에 보고되었으며 본 연구에서는 대조군으로 사용됨), 시험된 임의의 다른 정상 조직에서는 발현되지 않는다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 이 결과는 놀라운 것이었고, 선행 기술의 교시 내용으로부터 예상했던 것과는 반대로, 예를 들어 Fc 매개 이펙터 기능을 통해 HLA-G를 발현하는 세포를 죽일 수 있는 HLA-G에 대한 항체가 정상 조직과의 결합을 통해 환자에게 독성을 나타내리라고 예상하지 않으면서 고형 종양의 치료를 위한 잠재적인 후보임을 나타낸다. 사후적으로, 문헌에 보고된 것과 비교하여 이 검정에서 얻은 결과의 예상치 못한 차이를 설명할 수 있는 잠재적인 가설이 있다: i) 뇌하수체에서 보고된 mRNA 발현이 반드시 막 단백질 발현을 나타내는 것은 아니다. 예를 들어, mRNA는 단백질로 번역되지 않을 수 있거나, 냉동 조직에서 검출되지 않을 수 있고 막에 결합되어 있지 않기 때문에 독성 측면에서 문제를 나타내지 않는 가용성 HLA-G 이소형(들)을 mRNA가 코딩할 수 있다. 또한, mRNA는 뇌하수체 세포가 아닌 면역 세포에 침윤함으로써 발현될 수도 있다. ii) 상업용 항체 4H84는 췌장에서 HLA-G 단백질을 검출하는 데 사용되었으며, 이 항체는 비특이적인 것으로 알려져 있다. 또한, 4H84는 HLA-G의 α1 도메인에 있는 에피토프를 인식하는 반면, 본 발명의 항체는 HLA-G에 고도로 특이적이고 α3 도메인에 결합한다. 따라서, 췌장에서 발현된 HLA-G 이소형이 α3 도메인을 포함하지 않지만 여전히 a1 결합제(예를 들어, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G7)에 의해 검출될 가능성이 있다. 태반 영양막에서 HLA-G가 양성으로 검출되고 정상 조직에서는 검출되지 않는다는 것은 본 발명의 항체가 HLA-G의 면역 조절 기능에 필요한 ILT2/4 결합 α3 도메인을 함유하는 종양에서 발현되는 HLA-G 단백질에 결합할 수 있지만 정상 조직의 세포에는 결합하지 않을 수 있음을 시사한다.
HLA-G와 이의 억제 수용체 사이의 상호작용을 차단할 수 있고 세포 사멸이 가능한, 본원에서 설명되는 항체의 이중 메카니즘은 고형 암에서와 같이 HLA-G가 상향 조절된 환자의 치료에 상당한 이점을 나타낸다.
실시예 21: 3D 종양 오르가노이드(tumoroid) 모델에서 HLA-G 항체의 기능적 특성
HLA-G 항체 활성은 닐로겐 온코시스템즈(Nilogen Oncosystems)(미국 플로리다주 탬파 소재)의 3D 종양 오르가노이드 모델 기술을 사용하여 1차 생체외 인간 종양 플랫폼에서 평가되었다. 닐로겐의 기술은 새로운 환자 유래 종양 조직을 사용하고, 침윤하는 면역 세포를 포함하여 온전한 종양 미세 환경을 유지하고 전체 종양 이질성을 포착하는 3D 종양 오르가노이드(organoid)를 생성한다. 이 기술은 임상에서 볼 수 있는 것과 유사한 환자 반응률을 포착하고, 따라서 환자 치료를 위한 면역요법 후보의 잠재력을 평가하는 데 유용한 모델을 제공한다.
10개의 결장직장 선암종 종양(CRC) 및 10개의 신장 투명 세포 암종 종양(RCC)을 얻었고, 각각 닐로겐의 방법을 사용하여 모든 종양 세포(종양 세포, 간질 세포, 침윤 면역 세포) 및 매트릭스 성분을 포함하는 수천 개의 종양 오르가노이드를 유도하는 데 사용되었다.
단리된 종양 오르가노이드(치료 웰당 100-400개)을 사전 배양 없이 즉시 72시간 동안 항체에 노출시켰다. 종양 세포 사멸 수준은 닐로겐의 3D-익스플로어(Explore)™ 영상화 플랫폼을 사용하여 24시간 및 72시간에 평가되었다. 사이토카인 수준을 평가하기 위해 배양 배지를 24시간에 수집하였다. 종양 오르가노이드를 72시간에 분리하고, 유세포 분석에 의해 분석하여 면역 세포 활성화 프로파일에 대한 효과를 평가하였다. 또한, 치료 전에 종양 오르가노이드를 유세포 분석에 의해 분석하여 그 세포 구성을 특성화하고, 각각의 종양의 FFPE 섹션을 HLA-G, ILT2 및 ILT4에 대해 염색하였다.
HLA-G02 항체의 활성은 IgG1 이소형 대조군과 비교하여 활성 IgG1 형식으로 분석되었다. 활성 IgG1 형식을 갖는 항-PD-L1 항체를 비교를 위해 사용하였다.
종양 세포 사멸
단리 직후, 웰당 약 100개의 종양 오르가노이드를 함유하는 배양물을 10 mg/ml의 이소형 대조군 IgG1, 항-PDL1 양성 대조군 또는 HLA-G02 IgG1의 존재 하에 배양하였다. 24시간 및 72시간의 배양 후에 종양 오르가노이드를 살아있는/죽은 염료로 염색하고, 영상화하고, 독점 소유의 알고리즘을 사용하여 죽은 세포 백분율을 계산하였다.
결과는 도 13에 제시되어 있다. 도 13a: RCC로부터 항-PDL1로 얻은 데이터. 도 13b: CRC로부터 항-PDL1로 얻은 데이터. 도 13c: RCC로부터 HLA-G02로 얻은 데이터. 도 13d: CRC로부터 HLA-G02로 얻은 데이터. 데이터는 밝은 회색의 이소형 대조군, 어두운 회색의 항-PDL1 또는 HLA-G02 및 항-PDL1 또는 HLA-G02 처리된 배양물(여기서 세포 사멸의 1.5배 이상의 증가가 흑색에서 관찰됨)에서 사멸 세포 %로 제시되었다.
각각의 종양은 환자마다 다를 수 있으므로, 데이터는 암, 특히 RCC 및 CRC 치료에서 본 발명의 항체의 잠재력을 잘 나타낸다. 종합적으로, 데이터는 본 발명의 항체가 종양 환경 및 반응이 침윤된 면역 세포에 전적으로 의존하는 조건 하에서 종양 세포를 죽일 수 있다는 것을 보여준다. 유리하게도, 데이터는 항체가 특정 종양에서 증가된 세포 사멸 활성을 가질 수 있다는 증거를 제공한다.
주목할 점은 죽은 세포가 시간이 지남에 따라 배양액에서 손실되기 때문에, 24시간에서의 사멸 증가가 72시간에서는 더 이상 검출되지 않을 수 있다는 것이다. 또한, 항-PDL1 양성 대조군의 경우 총 5개 종양이 24시간(1 x RCC 및 4 x CRC)에 세포 사멸의 증가를 나타냈고, 72시간에는 사멸 증가가 관찰되지 않았다. HLA-G02의 경우, 6개 종양은 24시간(2 x RCC 및 4 x CRC)에 증가된 사멸을 보였고, 72시간에는 4개 종양(1 x RCC 및 3 x CRC)이 증가된 사멸을 나타냈다. 총 20개의 종양 중 5개의 종양만이 항-PDL1을 사용할 때 증가된 사멸을 보인 반면, HLA-G02를 사용할 때에는 20개의 종양 중 9개의 종양이 증가된 사멸을 나타냈다.
따라서, 데이터는 본 발명의 항체가 항-PD-L1과 같은 항면역 체크포인트와 비교하여 고형 종양의 치료에 유리할 수 있음을 보여준다.
실시예 22: 탈푸코실화된 HLA-G02를 사용한 조직 교차 반응성 검정
정상의 비종양 조직에서의 HLA-G의 발현 패턴을 실시예 20에서 설명된 것과 동일한 방법을 사용하여 탈푸코실화된 HLA-G02를 사용하여 추가로 조사하였다.
37개의 상이한 냉동 정상 인간 조직 및 혈액 도말 표본의 패널(조직당 3명의 공여자)이 평가되었다(8명의 공여자가 평가된 뇌하수체 및 췌장 제외). 1 및 10 μg/mL로 설정된 두 가지 농도의 HLA-G Ab-FITC가 사용되었으며, 음성 대조군 IgG1-FITC는 10 μg/mL의 최고 농도에서 사용되었다.
인간 태반의 냉동 섹션 및 야생형 HLA-G 발현 세포(HLA-G1)를 양성 대조군 샘플로 사용하였다. 인간 결장의 냉동 섹션, HLA-G Null 1,2,3 세포(MHC 클래스 I 컨센서스 아미노산으로 돌연변이된 3개 알파 도메인 각각의 HLA-G 고유 아미노산) 및 형질감염되지 않은 세포를 음성 대조군 샘플로 사용하였다. null 단백질을 사용하는 목적은 다른 MHC 클래스 I 분자에 대한 잠재적인 교차 반응성을 시험하는 것이다.
그 결과, 탈푸코실화된 HLA-G02는 이전에 보고된 것과 일치하는, 태반의 융모외 영양막에서 막성, 다양한 세포질 염색을 나타내었지만, 최적 농도의 탈푸코실화된 HLA-G02에서는 정상적이고 건강한 조직에서 막 염색이 관찰되지 않았으며, 이는 탈푸코실화된 HLA-G02가 정상적인 건강한 세포의 막에 노출된 어떠한 에피토프에도 결합하지 않는다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 23: FACS 검정에 의해 결정된 JEG3 세포에 대한 결합 친화도
탈푸코실화된 HLA-G02의 결합 친화도는 HLA-G를 자연적으로 발현하는 JEG3을 사용하는 유세포 분석 세포 기반 검정으로 측정되었다.
JEG3 세포를 미세원심분리 튜브(Eppendorf)에서 4℃에서 2시간 동안 1.5 ml의 탈푸코실화된 HLA-G02 용액과 함께 인큐베이팅하였다. IgG 농도는 10 nM 내지 0.00046 nM 범위이었다(PBS, 1% FBS, 0.1% 아지드화나트륨에 희석됨). 세포를 384-웰 V-바닥 플레이트(Greiner)로 옮기고, 검정 완충액에서 3회 세척하고, 20 μl의 염색 용액과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다(R-피코에리트린 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch) - 7.5 μg/ml 및 생존성 염료 e780(Life Technologies)). 세척 단계 후, 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 20 μl PBS에 재현탁시켰다. PE 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 샘플을 HTS 모드의 FACS 칸토 II 기기에서 실행하였다. KD는 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 중앙 형광 강도로부터 계산되었다.
결과는 탈푸코실화된 HLA-G02가 이 검정에서 높은 친화도/결합력으로 JEG-3 세포의 HLA-G에 결합한다는 것을 확인시켜 준다. 탈푸코실화된 HLA-G02는 3개의 독립적인 검정의 기하 평균에 의해 결정된 바와 같이 0.021±0.001 nM의 EC50을 가졌고, 검정은 0.020 내지 0.021 nM의 EC50 범위로 고도로 재현 가능하였다.
실시예 24: HLA-G 발현 세포의 ADCC에서 HLA-G02 및 탈푸코실화된 HLA-G02의 효능 및 효력
방법:
HLA-G 형질감염된 HCT116(실시예 9에서 이전에 기술된 바와 같이 제조됨) 표적 세포를 폴리프로필렌 둥근 바닥 플레이트 내의 적절한 배양 배지에 접종하였다(50 μL 부피의 웰당 2 x 104개의 세포). 항-HLA-G(통상적인 HLA-G02 또는 탈푸코실화된 HLA-G02) 또는 대조군 항체(이소형 IgG1 또는 탈푸코실화된 IgG1 이소형)를 동일한 배지에서 4X 농축 스톡으로 제조하고, 50 μl/웰을 적절한 웰에 첨가하였다. 모든 항체는 이용 가능한 공여자 NK 세포의 수에 따라 이중 또는 삼중으로 시험되었다. 일부 표적 세포는 어떠한 항체도 없는 상태였으며, 무처리 대조군으로 사용되었다.
1차 인간 NK 세포는 자기 비드 키트(Miltenyi Biotech)를 사용하여 음성 선택을 통해 전혈에서 단리되었다. 정제된 NK 세포를 검정에 필요한 최소 부피의 RPMI + 10% FBS, 2 mM L-글루타민에 재현탁시켰다. 검정 플레이트의 적절한 웰에 100 μl/웰의 NK 세포를 표적 세포 및 항체의 상부에 첨가하였다.
이펙터:표적 적정 실험을 위해, NK 세포를 희석하고, 표적 세포 및 항체를 함유하는 96웰 검정 플레이트에 접종하여(100 μL/웰), 최종 이펙터:표적 비는 20:1 내지 0.313:1이었다.
검정 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 2.5 내지 3시간 동안 인큐베이팅하였다. 2.5 내지 3시간 후, 살아있는 표적 세포의 수를 유세포 분석법으로 측정하였다. 검정 플레이트를 300 g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 각각의 웰을 상피 세포 마커 Epcam 및 NK 세포 마커 CD56에 대해 염색하였다. 염색 항체(항-Epcam PE 및 항-CD56 BV421)를 세포 염색 완충액에 1/100로 희석하고, 100 μL/웰을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 염색 후, 세포를 150 μl/웰 의PBS로 두 번 세척하고, 플레이트를 각각의 세척 사이에 3분 동안 300 g에서 원심분리하였다. 염색이 끝나면, 각각의 웰의 세포를 50 nM TO-PRO™-3 세포 생존성 염료를 함유하는 최종 부피 125 μL/웰의 PBS에 재현탁시켰다.
30초 후, 각각의 웰로부터 정확히 100 μL의 샘플을 BD FACS 칸토 II 기기에서 수집하고, 데이터를 FlowJoV10.60 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 웰에 대해 살아있는 표적 세포의 총 수를 결정하였다. 살아있는 표적 세포는 처음에는 TO-PRO-™3 음성으로 확인되었고, 그 다음에는 CD56 음성 및 SSC 높음으로 확인되었다. 그런 다음, 세포를 Epcam 및 GFP 발현(HCT116)에 대해 게이팅하였다. 처리되지 않은 세포 또는 이소형 대조군과 비교한 고갈 %를 각각의 시험 샘플에 대해 계산하고, 데이터를 분석을 위해 그래프패드 프리즘 8.1.1 소프트웨어로 전송하였다.
결과:
데이터는 하기 표 32 및 도 14에 제시되어 있다. 세포가 주어진 공여자에 대해 모든 이펙터:표적 비에서 그의 통상적인(즉, 푸코실화된) 대응물에 비해 탈푸코실화된 HLA-G02로 처리되었을 때 더 높은 최대 평균 고갈이 관찰되었다. 중요하게도, HLA-G 양성 HCT116 세포는 1:1 미만의 낮은 이펙터:표적 비에서 여전히 고갈되었다. 0.625:1의 이펙터:표적 비에서 관찰된 평균 고갈은 탈푸코실화된 HLA-G02 및 이의 통상적인(즉, 푸코실화된) 대응물에 대해 각각 여전히 46.63% 및 38.15%이었다. 이것은 NK 세포와 같은 면역 세포의 수가 종종 제한되는 종양 미세 환경에서 중요할 수 있다. 이들 실험은 HLA-G02의 탈푸코실화가 항체의 통상적인 IgG1 형식과 비교하여 분자의 고갈 활성을 증가시켰다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 25: PBMC 실험에서 평가된 탈푸코실화된 HLA-G02의 특이성
탈푸코실화된 HLA-G02의 특이성은 다양한 HLA-I 대립유전자를 대표하는 10명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 추가로 확인되었다. 목표는 항-HLA-G 항체가 특이적이고, 특히 PBMC 및 CD4+ T 림프구에 발현된 다른 HLA-1 분자와 교차 반응하지 않는다는 것을 확인하는 것이었다.
PBMC는 말초 정맥혈에서 정제하고, 냉동 배지(90% FBS + 10% DMSO)의 액체 질소에 보관하였다. 10명의 다른 공여자로부터의 PBMC를 해동하고, 1 ml의 완전 RPMI 배지(RPMI 1640 배지 + 10% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 재현탁시켰다. 세포를 300 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, PBS로 2회 세척하였다. 세포 펠렛을 1 ml Fac 완충액(PBS, 0.5% BSA 및 2 mM EDTA)에 재현탁시키고, 세포를 50 μl 세포 현탁액/웰로 96웰 플레이트에 접종하였다.
세포를 항-인간 CD4-APC(Biolegend, 2.5 μl/웰) 및 항-HLA-G 항체(탈푸코실화된 HLA-G02 또는 "pan-HLA", 즉 HLA-I에 결합하고 HLA-G에 특이적이지 않은 2개의 IgG1) 또는 이소형 대조군(웰당 20 μg/ml의 용액 50 μl)로 염색하였다. 세포를 실온에서 암실에서 20분 동안 인큐베이팅한 후, Facs 완충액으로 2회 세척하고, 2차 항체 염소 항-인간 IgG-FITC(Jackson ImmunoResearch, 1/100 희석)를 함유하는 50 μl의 Facs 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 암실에서 추가로 20분 동안 인큐베이팅한 다음, Facs 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 100 μl/웰의 Facs 완충액에 재현탁시키고, 샘플을 칸토 II(HTS 1)에서 수집했으며, 샘플당 10,000개 이벤트를 수집하였다. 각각의 공여자에 대해 각각의 CD4+ 세포 집단의 평균 형광 강도(MFI)를 측정함으로써 FlowJo 소프트웨어 v10.6.0을 사용하여 분석을 수행하였다. 그래프는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 작성되었다.
결과는 도 15에 제시되어 있다. 도 15는 2개의 pan-HLA 항체와 비교하여 특정 항-HLA-G 항체 탈푸코실화된 HLA-G02의 10명의 상이한 공여자에 걸쳐 CD4 T 세포에 대한 결합이 결여됨을 보여준다. 데이터는 각각의 공여자에 대한 평균 형광 강도(MFI)로 표현된다.
실시예 26: 탈푸코실화된 HLA-G02에 의해 매개되는 보체 의존성 세포독성(CPC)의 평가
방법:
탈푸코실화된 HLA-G02("aF HLA-G02")에 의해 매개되는 CDC를 평가하기 위해 다음 방법을 사용하였다: HLAG-β2m-Reh 세포에 형광 칼세인-AM 염료를 로딩하고, 풀링된 인간 혈청의 존재 하에 항체 용액에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 펠렛화하고, 상청액을 수집하였다. 세포 용해를 정량하기 위해 분광광도계를 사용하여 상청액 내의 형광을 정량하였다. 데이터는 엑셀에서 처리되었으며, 프리즘으로 내보내져 곡선을 플로팅하고, 이를 통해 각각의 시험 샘플에 대한 EC50(최대 유효 농도의 절반) 및 Emax(최대 유효 농도)를 계산할 수 있었다. 방법의 상세한 내용은 아래에서 제공된다.
세포주
Reh 세포주(ATCC CRL-8286)는 림프모구 형태를 나타내며, 급성 림프구성 백혈병 환자의 인간 조직으로부터 단리되었다. 인간 림프모구성 HLAG-β2m-Reh 세포주는 인간 HLA-G 및 β2 마이크로글로불린을 안정적으로 발현하는 폴리클로날 세포 풀이다. HLAG-β2m-Reh 세포주를 생성하기 위해, HLA-G 및 β2 마이크로글로불린 코돈 최적화된 서열을 포유동물 유전자 발현 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고, 렌티바이러스(pLV-Neo-EF1A-HumanHLA-G:IRES:HumanB2m; Vectorbuilder)에 패키징하였다. Reh 세포를 30의 감염 다중도에서 HLAG-β2m 렌티바이러스로 스핀접종한 후, 형질감염된 세포를 겐타마이신(1 mg/ml)을 함유하는 배지에서 유지시켰다. 7일 후, 세포에서의 HLA-G 발현을 유세포 분석법으로 정량하였다. 간략하게 설명하면, 형질감염되지 않은 Reh 및 HLAG-β2m-Reh 세포에 PE 표지된 HLA-G 항체(MEM-G/9, Invitrogen)를 결합시키고, 세포 표면에 대한 항체의 결합을 정량하였다. 이와 동시에, 퀀티브라이트(Quantibrite) 비드(BD)의 형광을 정량하였다. 이들 비드를 사용하여 HLAG-β2m-Reh 세포의 세포 표면에 있는 HLA-G 수용체의 평균 수는 76665인 것으로 결정되었다. HLAG-β2m-Reh 세포주는 소 태아 혈청(FBS, FBS, 10%) 및 글루타맥스(1%) 및 겐타마이신(1 mg/ml)으로 보충된 RPMI-1640에 유지되었다.
CDC 검정
풀링된 인간 혈청을 해동하고, 공급업체로부터 수령한 후 분취하였다. 사용할 때까지 80℃에서 보관하였다. 사용 직전에 혈청을 실온의 벤치에서 해동시켰다. 필요에 따라 56℃에서 30분 동안 가열하여 혈청을 불활성화하였다. HLAG-β2m-Reh 세포를 300 xg에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 PBS에 1x107개 세포/ml로 재현탁시켰다. 칼세인-AM을 첨가하고(10 μM), HLAG-β2m-Reh 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 300 xg에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 검정 완충액에 재현탁시켰다. 이는 총 2회 세척 동안 반복되었다. 최종 세척 후, 세포를 검정 배지(RPMI-1640, 2% FBS, 1% 글루타맥스)에 0.2x106개 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포를 384웰 v-바닥 플레이트에 걸쳐 분배하였다(50 μl/웰).
활성 또는 불활성의 풀링된 인간 보체 혈청 용액을 준비하고(1부 혈청, 4부 검정 배지), 필요에 따라 검정 플레이트(25 μl/웰)에 걸쳐 분배하였다.
탈푸코실화된 HLA-G02의 연속 희석액을 96웰 v-바닥 플레이트에서 검정 배지로 생성하였다. 처음에는, 검정 배지에서 400 nM의 최고 농도를 준비하였다. 이 용액을 어시스트(Integra)를 사용하여 플레이트에 걸쳐 1:3으로 희석하여 10점 연속 희석액을 형성하였다. 배경 형광(MIN) 및 최대 용해(MAX)를 평가하기 위해 검정 배지를 포함하는 추가의 웰을 준비하였다.
시험 시약(3.7 mg/ml의 탈푸코실화된 HLA-G02 또는 1 mg/ml의 인간 IgG1 이소형 대조군 항체; 25 μl) 및 MIN/MAX 대조군(25 μl)를 비아플로(Integra)를 사용하여 이중으로 96웰 플레이트로부터 384웰 검정 플레이트로 옮겼다.
검정 플레이트를 통기성 막으로 밀봉하고, 짧게 볼텍싱시킨 후, 300 x g에서 10초 동안 원심분리하였다. 검정 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다.
2시간 인큐베이팅 기간 후에, 10 μl의 용해 완충액(10% Triton-X, 검정 배지)을 모든 MAX 대조군 웰에 첨가하고, 피페팅으로 잘 혼합하였다. 검정 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 10분 동안 인큐베이팅하였다. 검정 플레이트를 300 xg에서 3분 동안 원심분리하였다.
비아플로(Integra)를 사용하여 각각의 웰에서 40 μl의 상청액을 제거하고, 검은색 벽으로 둘러싸인 편평하고 투명한 384웰 바닥 플레이트로 옮겼다. 세포 펠렛을 방해하지 않도록 주의하였다. 새로운 검정 플레이트를 1000 xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 새로운 검정 플레이트는 488 nm의 여기와 520 nm의 방출을 갖는 분광 광도계에서 검정되었다.
통계 검정
형광 방출 데이터를 엑셀로 내보냈다. 형광 신호는 검정 완충액(MIN) 및 1% Triton X-100(MAX)을 함유하는 처리 웰의 평균에 대해 정규화되어 주어진 농도의 시험 시약에서 달성된 용해 백분율을 생성하였다. 4-파라미터 로지스틱 핏(4-PL) 곡선 피팅 및 EC50 값 계산은 그래프패드 프리즘® 8.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
결과:
HLAG-β2m-Reh 세포주의 용해에 대한 혈청 불활성화의 영향
결과는 활성 인간 혈청이 HLAG-β2m-Reh 세포의 aF HLA-G02 매개 CDC에 필수적이라는 것을 확인시켜 준다. 가열에 의해 혈청이 불활성화되면, aF HLA-G02는 CDC를 매개할 수 없다. 데이터는 도 16a에 시각화되어 있다.
고갈에 대한 HLA-G 의존성
활성 인간 혈청의 존재 하에, HLAG-β2m-Reh 세포주의 용해는 aF HLA-G02에 의해 농도 의존적 방식으로 매개되었다. 모 Reh 세포주의 용해는 100 nM의 최대 aF HLA-G02 농도까지 관찰되지 않았다. 데이터는 도 16b에 시각화되어 있다.
HLAG-β2m-Reh 세포의 CDC
결과는 활성 혈청의 존재 하에 aF HLA-G02가 HLAG-β2m-Reh 세포의 CDC를 매개함을 확인시켜 준다. aF HLA-G02는 100 nM 내지 0.0051 nM 범위의 농도에서 시험되었다. aF HLA-G02는 3개의 독립적인 검정의 평균에 의해 결정된 바와 같이 3.17 ± 0.60 nM의 EC50을 가졌다. 데이터는 아래 표 33 및 34에 요약되어 있으며, 도 16c에 시각화되어 있다.
결론:
HLAG-β2m-Reh에 대한 탈푸코실화된 HLA-G02 결합은 강력하고 효과적인 보체 의존성 용해를 유발하였다(EC50 = 3.17 ± 0.60 nM; Emax = 63.2 ± 7.23%).
관찰된 용해가 CDC 매개인지 확인하기 위해, 열 불활성화 혈청을 사용한 탐색적 연구가 수행되었다. 탈푸코실화된 HLA-G02는 풀링된 활성 인간 혈청이 존재할 때만 HLAG-β2m-Reh 세포의 용해를 촉발하는 것으로 나타났다. 풀링된 인간 혈청이 고온에 장기간 노출되어 불활성화되면, CDC를 매재하는 탈푸코실화된 HLA-G02의 능력이 무효화되었다.
관찰된 용해가 HLA-G 의존적이었는지 확인하기 위해, 형질감염되지 않은 모 Reh 세포주를 풀링된 활성 인간 혈청의 존재 하에 탈푸코실화된 HLA-G02에 노출시켰다. 탈푸코실화된 HLA-G02는 시험된 농도 범위 내에서 Reh 세포의 CDC를 매개할 수 없는 것으로 나타났다. 그러나, 탈푸코실화된 HLA-G02는 동일한 농도 범위 내에서 HLAG-β2m-Reh 세포의 CDC를 매개하는 데 강력하고 효과적이었다.
결론적으로, 이들 결과는 HLA-G 발현 세포의 CDC 매개에서 탈푸코실화된 HLA-G02의 선택성, 효력 및 효능을 입증하였다.
실시예 27: 다양한 활성 및 불활성 Fc 형식의 HLA-G02에 의해 매개되는 식세포 작용, 및 HLA-G02와 항-CD47 항체의 조합 치료
이 연구의 목적은 시험관내 대식세포 의존성 식세포 작용 검정을 사용하여 HLA-G 발현 종양 세포의 대식세포 매개 식세포 작용을 촉진하는 탈푸코실화된 HLA-G02의 능력을 평가하는 것이었다.
본 발명자들은 다음과 같은 상이한 Fc 형식으로 발현될 때 HLA-G 발현 K562 표적 세포의 식세포 작용을 지시하는 탈푸코실화된 HLA-G02의 능력을 조사하였다: 항체 Fc 최적화의 영향을 평가하기 위한, 대식세포에서 발현된 Fc 수용체와 상호작용할 수 있는 '활성' Fc 형식(탈푸코실화된 HLA-G02 및 이의 통상적인(즉, 푸코실화된) 대응물) 및 FcR 독립적인 작용 메커니즘의 가능성을 평가하기 위한, Fc 수용체와 상호작용하지 않는 '불활성' Fc 형식(HLA-G02 IgG4P FALA).
이 연구에서, 항-CD47 항체가 양성 대조군으로 사용되었다. 인간 세포에서 널리 발현되는 CD47은 골수 세포 상의 수용체 SIRPα와 상호작용하여 식세포 작용을 억제한다. CD47은 종양 세포에서 과다발현되는 것으로 나타났으며, 종양 세포 식세포 작용을 촉진하는 항-CD47 차단 항체가 현재 임상 시험에서 시험되고 있다.
또한, 본 발명자들은 항-CD47 및 탈푸코실화된 HLA-G02와의 조합 치료의 잠재적 효과를 시험하였다.
방법:
CD14+ 단핵구는 미처리된 단핵구의 단리를 위한 간접 자기 표지 시스템인 인간 범 단핵구 단리(Miltenyi)를 사용하여 말초 정맥혈에서 정제되었다. 세포를 7일 동안 37C, 5% CO2에서 완전 RPMI 배지(RPMI 1640 배지 + 10% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 50 ng/ml 재조합 MCSF를 사용하여 대식세포로 분화시켰다.
HLA 음성 적백혈병 K562 세포를 4D-뉴클레오펙터 시스템 및 SF 세포주 4D-뉴클레오펙터™ X 키트 L(Lonza, ref# V4XC-2024)을 사용하여 HLA-G 및 B2m으로 형질감염시키거나 모의 형질감염시키고, 완전 RPMI에서 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 수확하고, 세척하고, 셀 트레이스 옐로(Thermofisher)로 표지하고, 다시 세척하고, 96웰 둥근 바닥 초저 부착 플레이트(Corning Costar) 내의 100 μl의 완전 RPMI에 웰당 25,000개의 세포로 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 10 μg/ml로 항-CD47 항체 또는 항-HLA-G 항체 또는 이소형 대조군과 함께 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세척 후, 세포를 대식세포:세포 표적 = 2:1의 비로 단핵구 유래 대식세포(웰당 50,000개의 대식세포)와 합하였다. 혼합된 세포를 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 다음, 세포를 세척하고, PBS + 10%의 정제된 인간 Fc 감마R-결합 억제제(Thermofisher)에 4℃에서 20분 동안 재현탁한 다음, 4℃에서 20분 동안 항-CD11b-APC(Biolegend)로 염색하였다. 세포를 세척하고, DAPI(500 ng/ml) 죽은 세포 배제의 존재 하에 PBS + 2 mM EDTA + 0.5% BSA에 재현탁시켰다. 샘플은 BD FACSCanto에서 유세포 분석을 통해 획득되었다. CTY+CD11b+ 이중 양성 세포인 대식세포의 백분율에 상응하는 식세포 작용의 백분율을 측정함으로써 FlowJo 소프트웨어 v10.6.0을 사용하여 분석을 수행하였다.
이중 데이터는 상응하는 이소형 대조군으로 정규화되었으며, 대조군 대비 고갈%(고갈% = 100 - [(평균 표적 세포 aF HLA-G02) x 100 / (평균 표적 세포 이소형 대조군)]로 표시되었다.
데이터는 엑셀 파일로 내보내졌고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 그래프가 생성되었다.
결과:
HLA-G02 및 탈푸코실화된 HLA-G02에 의해 매개되는 식세포 작용
모의 형질감염된 세포 및 HLA-G 형질감염된 세포(모의 형질감염된 세포는 HLA-G DNA의 부재 하에서 형질감염 프로토콜에 적용됨)의 식세포 작용의 비교는 두 세포 유형 모두의 식세포 작용을 유도하는 양성 대조군 항-CD47 항체와 비교하여 HLA-G 발현 세포에 대한 탈푸코실화된 HLA-G02(및 이의 푸코실화된 대응물) 매개 ADCP의 특이성을 보여준다. HLA-G 발현 표적 세포의 농도 의존적 식세포 작용은 이소형 대조군과 비교하여 통상적인 HLA-G02 및 탈푸코실화된 HLA-G02 둘 모두에서 관찰된다. 0.OO1 μg/mL부터 시작하는 농도에서 탈푸코실화된 HLA-G02에서 증가하는 식세포 작용이 관찰된다. 탈푸코실화된 HLA-G02는 그의 통상적인 푸코실화된 대응물에 비해 대식세포 매개 식세포 작용의 최소의 향상을 보여준다. 그 결과는 도 17에 제시되어 있다.
탈푸코실화된 HLA-G02에 의해 매개되는 표적 세포 사멸
HLA-G 발현 표적 세포의 사멸은 정의된 식세포 작용 시간(밤새) 후에 남아 있는 표적 세포의 수를 이소형 대조군과 비교하여 탈푸코실화된 HLA-G02 또는 항-CD47 항체와 비교함으로써 평가되었다. 데이터는 두 항체 모두 표적 세포의 유사한 농도 의존적 고갈을 유도한다는 것을 보여준다. 탈푸코실화된 HLA-G02 처리는 0.1 μg/mL에서 22.0±10.8% 및 10 μg/mL에서 44.8±8.6%의 표적 세포 고갈을 초래하고, 항-CD47 처리는 각각 11.3±10.4% 및 43.3±10.8%를 초래한다. 그 결과는 도 18에 제시되어 있다.
항-CD47 항체는 현재 암 치료제로서 임상 시험에서 시험되고 있다. 본 발명자들은 이후에 탈푸코실화된 HLA-G02 및 항-CD47 항체와의 조합 치료가 HLA-G 발현 세포의 식세포 작용을 두 항체 단독으로 관찰된 것보다 더 높은 수준으로 증가시킬 수 있는지의 여부를 조사하였다. 이 실험에서, HLA-G 발현 세포를 증가하는 농도의 탈푸코실화된 HLA-G02 또는 HLA-G02 IgG4P FALA와 조합하여 항-CD47 항체(1 μg/mL)로 처리하였다. 대표적인 데이터는 도 19에 제시되어 있으며, 여러 공여자의 조합된 데이터는 도 20에 제시되어 있다.
탈푸코실화된 HLA-G02에서 관찰된 식세포 작용의 증가가 이의 활성 Fc 형식에 의존하는지의 여부를 결정하기 위해 IgG4P FALA 형식이 포함되었다. 탈푸코실화된 HLA-G02 단독은 그의 탈푸코실화된 IgG1 형식에서 농도 의존적 식세포 작용을 유도하였다. HLA-G02 IgG4P FALA도 식세포 작용을 증가시켰지만, 그 정도는 낮았다. IgG1과 달리, IgG4P FALA는 Fc 수용체를 통해 ADCP를 유도할 수 없으며, 이는 HLA-G02 IgG4P FALA에서 관찰되는 식세포 작용이 HLA-G가 대식세포 상의 그의 수용체인 ILT2/4와 결합하는 것을 차단함으로써 매개된다는 것을 분명히 시사한다. 또한, 데이터는 어느 형식에서든 항-CD47과 탈푸코실화된 HLA-G02의 조합이 HLA-G 발현 세포의 식세포 작용을 향상시킨다는 것을 보여준다.
요약하자면, 본 연구에서는 탈푸코실화된 HLA-G02 및 이의 통상적인(즉, 푸코실화된) 대응물 둘 모두가 HLA-G 발현 세포의 특정 항체 의존성 세포 식세포 작용(ADCP)을 유도함을 보여주었다. 또한, HLA-G02의 IgG4P FALA 형식도 식세포 작용을 증가시켰지만, 그 정도는 덜하였다. 데이터는 탈푸코실화된 HLA-G02 및 이의 푸코실화된 대응물이 다음과 같은 두 가지 작용 메커니즘을 통해 식세포 작용을 촉진한다는 것을 나타낸다: (1) Fc 수용체 매개 항체 의존성 세포 식세포 작용을 통해, 및 (2) HLA-G와 이의 수용체의 상호작용을 차단함으로써.
또한, 본 발명자들은 탈푸코실화된 HLA-G02와 식세포 체크포인트 CD47을 표적으로 하는 항체의 조합이 HLA-G 발현 세포의 식세포 작용을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
실시예 28: 탈푸코실화된 HLA-G02에 의해 매개되는 사이토카인 방출
사이토카인 방출 검정(CRA)은 면역 세포에서 사이토카인 방출을 유도하는 새로운 치료법의 가능성을 평가하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이러한 검정에서는 전염증성 사이토카인을 측정하기 전에 관심 치료제로 처리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 전혈을 사용한다.
본 연구는 16명의 인간 PBMC 공여자로부터의 전염증성 사이토카인 방출에 대한 가용성 탈푸코실화된 HLA-G02의 효과를 평가하고, 사이토카인 수준을 알려진 양성 대조군과 비교하는 것을 목표로 한다. 사이토카인 방출은 MSD 다중 샌드위치 면역검정법을 사용하여 측정되었다. 사이토카인의 방출 수준은 또한 탈푸코실화된 HLA-G02 처리된 PBMC와 JEG3 세포(높은 수준의 HLA-G를 발현함)의 공동 배양 후에 측정되었다. 이 공동 배양은 활성 Fc 고갈 메커니즘 이후 HLA-G 양성 종양 미세환경에서 잠재적인 사이토카인 방출 수준을 모방하는 것을 목표로 하였다.
방법:
PBMC는 표준 방법에 따라 인간 전혈로부터 단리되었다. JEG3 세포를 배양하고, RPMI 완전 배지에서 4x105개 세포/mL의 밀도로 유지하였다. 96웰 편평 바닥 조직 배양 플레이트의 적절한 웰에 JEG3 세포를 첨가하였다(50 μL/웰). PBMC 전용 웰의 경우, 50 μL의 RPMI 완전 배지(RPMI 1640(500 mL)+10% FBS(50 mL)+2 mM 글루타맥스™(5 mL))를 JEG3 세포 대신 플레이팅하였다.
탈푸코실화된 HLA-G02를 시작 농도 200 μg/mL(최대 최종 농도 50 μg/mL의 4배)로 희석한 다음, 100, 40, 4, 0.4, 0.04, 0.004 및 0.0004 μg/ml로 연속 희석하였다(25, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 및 0.0001 μg/ml의 최종 농도 제공). 이소형 대조군 항체 및 항-CD3 항체는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하기 위해 가장 높은 항체 농도(200 μg/mL)로만 제조되었다. 대안적인 양성 대조군으로서, LPS도 RPMI 완전 배지에서 400 ng/mL(최종 농도 100 ng/mL의 4배)로 희석되었다. 희석 후, 시험 항체/물질을 96웰 편평 바닥 검정 플레이트 내의 JEG3 또는 배지 위에 3중으로 플레이팅하였다(50 μL/웰). 그런 다음, PBMC를 100 μL(1x105 세포/웰)로 항체 위의 편평 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 각각의 웰의 총 부피는 200 μL였다. 그런 다음, 검정 플레이트를 37℃, 5% CO2, 100% 습도 인큐베이터로 24시간 동안 옮겼다.
시간 후, 96웰 배양 플레이트를 400 g에서 3분간 원심분리하여 각각의 웰의 상청액에 세포가 남아 있지 않도록 하였다. 각각의 웰에서 150 μL의 상청액을 새로운 96웰 플레이트로 옮기고, 다중 검정이 수행될 때까지 샘플을 -20℃에서 보관하였다.
사이토카인 수준은 제조업체의 지침에 따라 MSD 전염증성 패널 1 키트를 사용하여 상청액에서 측정되었다.
결과:
HLA-G 발현 JEG3 세포의 존재 또는 부재 하에 50 μg/mL 탈푸코실화된 HLA-G02, 50 μg/mL 이소형 대조군, 50 μg/mL 항-CD3 또는 100 ng/mL LPS로 치료된 16명의 PBMC 공여자로부터 방출된 10개의 전염증성 사이토카인의 평균 수준은 아래 표 35에 요약되어 있다. 주요 사이토카인 IFNγ, TNFα, IL2, IL6, IL8 및 IL10에 대한 JEG3 세포의 존재 및 부재 하에 0.0001 내지 50 μg/ml의 HLA-G02 농도 범위에 걸쳐 생성된 평균 값은 도 21(a-f)에 요약되어 있다.
10가지의 전염증성 사이토카인(IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL4, IL-6, IL-8 및 TNF-α)이 50 μg/mL 탈푸코실화된 HLA-G02로 처리된 PBMC로부터 낮은 수준으로 생산되었다. 이 사이토카인 방출 수준은 PBMC를 이소형 대조군 항체로 처리했을 때 관찰된 수준과 유사하였다. 시험한 사이토카인에 따라, 50 μg/mL 탈푸코실화된 HLA-G02로 처리한 후 생성된 양은 각각 항-CD3 및 리포폴리사카라이드(LPS) 양성 대조군보다 2 내지 130배 더 낮았거나 3.5 내지 700배 더 낮았다.
PBMC와 JEG3 세포의 공동 배양은 탈푸코실화된 HLA-G02로 처리한 후 전염증성 사이토카인의 방출을 증가시켰다. PBMC 단독과 비교하여, 9/10 사이토카인(TNF-α를 제외한 모든)의 수준은 50 mg/ml에서 PBMC-JEG3 공동 배양의 상청액에서 증가하였다. 측정된 사이토카인에 따라, 이러한 증가는 탈푸코실화된 HLA-G02 처리된 PBMC 단독과 비교하여 3배(IFN-γ, IL1-β, IL-2) 내지 9배(IL-10)의 변화이었다. 또한, HLA-G02의 농도 범위에 걸쳐 HLA-G 발현 JEG3 세포의 존재 하에서 사이토카인의 수준이 증가하였다.
HLA-G 발현 세포의 존재 하에 관찰된 사이토카인 방출의 증가는 탈푸코실화된 HLA-G02로 처리된 HLA-G 양성 종양에서 Fc 매개 활성의 결과로 발생할 수 있는 전염증성 사이토카인 방출 수준의 지표를 제공한다.
본 발명에 포함된 12389 항체 서열 및 인간 프레임워크는 아래 표 36에 제시되어 있다("(nt.)": 핵산 서열):

Claims (41)

  1. HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체로서,
    a. i. 서열 번호 1을 포함하는 CDR-L1,
    ii. 서열 번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
    iii. 서열 번호 3을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    b. i. 서열 번호 4를 포함하는 CDR-H1,
    ii. 서열 번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
    iii. 서열 번호 6을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, HLA-G에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 ILT2 및 ILT4에 대한 HLA-G 결합을 차단하고/하거나, HLA-G 매개 면역 억제 기능을 억제하는 것인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 HLA-G에 대해 10 nM 미만의 평형 해리 상수(KD)를 갖는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-G 알파 3 도메인에 특이적으로 결합하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호 107을 참조하여 잔기 F195 및 Y197을 포함하는 HLA-G의 에피토프에 결합하는 것인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가, HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257을 포함하는 HLA-G의 에피토프에 결합하는 것인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 에피토프가 X선 결정학에 의해 특성화되는 것인 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가
    a. 서열 번호 19 또는 15 또는 23을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는
    b. 서열 번호 93, 27, 33, 57, 69, 75, 81 또는 87을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 93을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 전장 항체인 항체.
  12. 제11항에 있어서, 전장 항체가 IgG1, IgG1 LALA, IgG1LALAGA, IgG4, IgG4P 또는 IgG4P FALA인 항체.
  13. 제12항에 있어서, 항체가 IgG1인 항체.
  14. 제13항에 있어서, 항체가 탈푸코실화된 IgG1인 항체.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 항체가
    a. 서열 번호 21 또는 17 또는 25를 포함하는 경쇄; 및/또는
    b. 서열 번호 95, 29, 35, 59, 71, 77, 83, 또는 89를 포함하는 중쇄
    를 포함하는 것인 항체.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 항체가
    a. 서열 번호 21 또는 17 또는 25에 대해 적어도 90%의 동일성 또는 유사성을 포함하는 경쇄; 및/또는
    b. 서열 번호 95, 29, 35, 59, 71, 77, 83, 또는 89에 대해 적어도 90%의 동일성 또는 유사성을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 것인 항체.
  17. 제13항 또는 제14항에 있어서, 항체가 서열 번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 93을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 및 중쇄의 나머지가 각각 서열 번호 21 및 95에 대해 적어도 90%의 동일성 또는 유사성을 갖는 것인 항체.
  18. 제13항 또는 제14항에 있어서, 항체가 서열 번호 21을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 HLA-G 매개 면역 억제 기능을 억제하고, HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시켜 종양 성장을 억제하는 것인 항체.
  20. 제14항에 있어서, 항체가 서열 번호 21을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 95를 포함하는 중쇄를 포함하고, 항체가 개선된 ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 CDC 기능을 갖고/갖거나 HLA-G를 발현하는 종양 세포를 고갈시키는 개선된 능력을 갖는 것인 항체.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 Fab, Fab', F(ab')2, dsFv, scFv 또는 dsscFv인 항체.
  22. HLA-G에 결합하기 위해 제1항의 항체와 교차 경쟁하거나 또는 HLA-G(서열 번호 107)의 V194, F195, Y197, E198, Q224, Q226, D227, V248, V249, P250 및 Y257을 포함하는 HLA-G의 에피토프에 결합하는 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제23항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가
    a. 경쇄 가변 영역 또는
    b. 중쇄 가변 영역
    을 코딩하고,
    a의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는
    i. 서열 번호 20, 16 또는 24에 대해 적어도 90% 동일하거나;
    ii. 서열 번호 20, 16 또는 24를 포함하거나 이로 이루어지고;
    b의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는
    i. 서열 번호 94, 28, 34, 58, 70, 76, 82 또는 88에 대해 적어도 90% 동일하거나;
    ii. 서열 번호 94, 28, 34, 58, 70, 76, 82 또는 88을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제23항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가
    a. 경쇄 또는
    b. 중쇄
    를 코딩하고,
    a의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는
    i. 서열 번호 22, 18 또는 26에 대해 적어도 90% 동일하거나;
    ii. 서열 번호 22, 18 또는 26을 포함하거나 이로 이루어지고;
    b의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는
    i. 서열 번호 96, 30, 36, 60, 72, 78, 84, 또는 90에 대해 적어도 90% 동일하거나;
    ii. 서열 번호 96, 30, 36, 60, 72, 78, 84, 또는 90을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  27. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 제26항에 따른 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 제26항에 따른 하나 이상의 발현 벡터를 포함하고, 알파1,6 푸코실트랜스퍼라제의 기능을 감소시키거나 제거하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체의 제조 방법으로서, 제27항 또는 제28항에 따른 숙주 세포를 항체 제조에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계 및 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 상기 항체의 제조 방법.
  30. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법으로서, 제29항에 정의된 방법의 단계를 포함하고, 항체를 약제학적 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는, 상기 약제학적 조성물의 제조 방법.
  31. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 제1항 내지 제22항, 또는 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한, 항체 또는 약제학적 조성물.
  33. 제1항 내지 제22항, 또는 제31항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-G의 과다발현을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한, 항체 또는 약제학적 조성물.
  34. 제1항 내지 제22항, 또는 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양의 치료에 사용하기 위한, 항체 또는 약제학적 조성물.
  35. 제1항 내지 제22항, 또는 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 또는 간세포 암종의 치료에 사용하기 위한, 항체 또는 약제학적 조성물.
  36. 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제31항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  37. 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제31항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  38. 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 또는 간세포 암종의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제31항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  39. 환자에서 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제31항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 고형 종양이 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 및 간세포 암종으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제31항에 따른 약제학적 조성물을 사용하여 신장 투명세포 암종(RCC), 결장직장 암종(CRC), 췌장암, 난소암, 두경부 암종, 위암 또는 간세포 암종을 진단하는 방법.
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