TW202237853A - 產生甲基丙烯酸甲酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於產生甲基丙烯酸甲酯之方法。本發明之方法包含以下步驟：a）在醱酵培養基中，在微生物將產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯之條件下提供該微生物；b）提供與該醱酵培養基接觸之有機相，該有機相包括比該醱酵培養基中之甲基丙烯酸C 3-C 12酯濃度更高之濃度的甲基丙烯酸C 3-C 12酯；c）移除含有該甲基丙烯酸C 3-C 12酯之有機相使其不再接觸該醱酵培養基；及d）將所移除之甲基丙烯酸C 3-C 12酯用甲醇轉酯化以產生甲基丙烯酸甲酯，其視情況在與該有機相分離之後。

Description

產生甲基丙烯酸甲酯的方法
本發明係關於一種產生甲基丙烯酸甲酯之方法。特定言之，本發明係關於一種經由醱酵產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯來生產甲基丙烯酸甲酯之方法。
甲基丙烯酸甲酯（MMA）係化學工業中之重要單體。MMA之主要用途係生產用於各種應用之塑膠；然而，MMA亦可用於矯形外科手術中使用之骨膠結劑。最重要的聚合應用為鑄造、模製或擠壓聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）以產生高光學透明度塑膠。PMMA之全球消耗估計為大約每年2.1百萬公噸。
MMA目前僅藉由化學手段製備且製備MMA之現行方法包括丙酮氰醇（ACH）路徑及其他由各種C 2-C 4前驅體開始之途徑。用於製備MMA之最成功方法之一係『阿爾法方法（Alpha process）』，其中MMA獲自丙酸甲酯這一酯與甲醛之無水反應。在阿爾法方法中，丙酸甲酯係藉由乙烯之羰基化來產生。此乙烯原料來源於化石燃料。相比於通常用於製備MMA之其他方法，阿爾法方法提供許多優勢。此等優勢包括有害化學物質之使用減少、產物選擇性高得多且對衍生自原油的原料之依賴性降低。然而原料之價格與汽油成本相關。因此期望發展一種能克服此等缺點的產生MMA的替代方法。
微生物可用於經由醱酵而非化學合成來產生高價值化學物質。重組DNA技術及此類微生物之合成代謝工程改造已使得代謝路徑朝著產生特定化學物質之方向重建。朝向丙烯酸酯之生物製備的幾個可持續途徑近期已得到發展。此等方法通常專注於由可再生原料經由微生物醱酵產生丙烯酸酯。然而，在醱酵期間此等產物之積累通常對生物催化劑具有毒性，抑制細胞生長及/或引起細胞死亡。特定言之，甲基丙烯酸高碳數烷酯（諸如甲基丙烯酸丁酯（BMA））比甲基丙烯酸低碳數烷酯（諸如MMA）對生物催化劑展現更大毒性。鑒於此，以及給出的與產生MMA之現行化學方法相關的缺點，提供一種用產生MMA之改良的生物或部份生物方法會很有利。
本發明之目標係免除或減輕一或多個上述問題，提供一種產生MMA之改良方法及/或提供一種產生MMA之改良的生物或部分生物方法。
本發明係關於一種產生MMA之方法且其部分地基於本發明人之研究，其出乎意料地顯示有可能有效地經由產生甲基丙烯酸高碳數酯之醱酵來產生MMA，儘管該等甲基丙烯酸高碳數酯對微生物展現內在毒性。亦出乎意料地發現，本發明之方法相比於直接製備MMA，對高碳數酯提供提高的反應速率。
在本發明之第一態樣中，提供一種產生甲基丙烯酸甲酯（MMA）之方法。該方法包含以下步驟： a）       在醱酵培養基中，在微生物將產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯之條件下提供該微生物； b）      提供與醱酵培養基接觸之有機相，該有機相包括比醱酵培養基中之甲基丙烯酸C 3-C 12酯濃度更高之濃度的甲基丙烯酸C 3-C 12酯； c）       移除含有該甲基丙烯酸C 3-C 12酯之有機相使其不再接觸醱酵培養基；及 d）      將經移除之甲基丙烯酸C 3-C 12酯用甲醇轉酯化以產生甲基丙烯酸甲酯，其視情況在與有機相分離之後。 甲基丙烯酸 C 3-C 12 酯
在本發明之第一態樣中，在醱酵培養基中藉由微生物產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯。
術語甲基丙烯酸C 3-C 12酯通常意指包含C 3-C 12烷基、羥烷基、烯基、烷芳基或烯基芳基之甲基丙烯酸酯，包括其結構異構體。C 3-C 12基團可以係環狀、非環狀或部分環狀、直鏈或分支鏈之脂族、芳香族或部分芳香族/脂族。較佳本發明之甲基丙烯酸C 3-C 12酯可包括，例如，甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸異丙酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸第三丁酯、甲基丙烯酸異戊酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸環己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸十二酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸異莰酯、甲基丙烯酸烯丙酯或甲基丙烯酸苯烯丙酯。
較佳甲基丙烯酸C 3-C 12酯係甲基丙烯酸C 3-C 12烷基酯，更佳甲基丙烯酸C 3-C 8烷基酯，例如，甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸異丙酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異戊酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸環己酯、甲基丙烯酸庚酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸癸酯或甲基丙烯酸十二酯。
較佳甲基丙烯酸羥烷基酯係甲基丙烯酸羥乙酯或甲基丙烯酸羥丙酯。
在具體實例中，甲基丙烯酸C 3-C 12酯係甲基丙烯酸C 3-C 12烯基芳基酯，例如甲基丙烯酸苯烯丙酯。
甲基丙烯酸C 3-C 12烷基酯更佳係甲基丙烯酸C 3-C 6烷基酯，諸如甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯或甲基丙烯酸己酯，包括例如其結構異構體。更佳地，甲基丙烯酸C 3-C 6烷基酯係甲基丙烯酸丙酯或甲基丙烯酸丁酯，尤其甲基丙烯酸異丙酯或甲基丙烯酸正丁酯。 微生物
本發明之微生物可選自天然產生之野生型或非天然產生之重組微生物，例如，細菌、古菌、酵母、真菌、藻類或任何適用於醱酵方法之各種其他微生物。
在本發明之具體實例中，微生物係細菌。適合細菌之實例包括，屬於埃希氏桿菌（ Escherichia）、腸桿菌（ Enterobacter）、泛菌（ Pantoea）、克雷伯氏菌（ Klebsiella）、沙雷菌（ Serratia）、歐文菌（ Erwinia）、沙門氏菌（ Salmonella）、摩根氏菌（ Morganella）屬或類似者之變形菌（proteobacteria）之腸內細菌；屬於短桿菌（ Brevibacterium）、棒狀桿菌（ Corynebacterium）或微桿菌（ Microbacterium）屬之所謂的棒狀菌（coryneform bacteria）；及屬於脂環桿菌（ Alicyclobacillus）、芽孢桿菌（ Bacillus）、氫桿菌（ Hydrogenobacter）、甲烷球菌（ Methanococcus）、醋桿菌（ Acetobacter）、不動桿菌（ Acinetobacter）、土壤桿菌（ Agrobacterium）、固氮根瘤菌（ Axorhizobium）、固氮菌（ Azotobacter）、邊蟲（ Anaplasma）、擬桿菌（ Bacteroides）、巴爾通體菌（ Bartonella）、鮑特氏菌（ Bordetella）、疏螺旋體（ Borrelia）、布氏桿菌（ Brucella）、伯克霍爾德菌（ Burkholderia）、鞘桿菌（ Calymmatobacterium）、曲狀桿菌（ Campylobacter）、衣原體（ Chlamydia）、嗜衣體（ Chlamydophila）、梭菌（ Clostridium）、克柯斯體（ Coxiella）、艾利希體（ Ehrlichia）、腸球菌（ Enterococcus）、弗朗西斯氏菌（ Francisella）、梭桿菌（ Fusobacterium）、加德納菌（ Gardnerella）、嗜血桿菌（ Haemophilus）、螺旋桿菌（ Helicobacter）、克雷白氏桿菌（ Kelbsiella）、甲烷桿菌（ Methanobacterium）、微球菌（ Micrococcus）、莫拉菌（ Moraxella）、分支桿菌（ Mycobacterium）、黴漿菌（ Mycoplasma）、奈瑟氏菌（ Neisseria）、巴氏桿菌（ Pasteurella）、消化鏈球菌（ Peptostreptococcus）、卟啉單胞菌（ Porphyromonas）、普雷沃菌（ Prevotella）、假單胞菌（ Pseudomonas）、根瘤菌（ Rhizobium）、立克次體菌（ Rickettsia）、羅克利馬體（ Rochalimaea）、羅氏菌（ Rothia）、志賀桿菌（ Shigella）、葡萄球菌（ Staphylococcus）、寡養單胞菌（ Stenotrophomonas）、鏈球菌（ Streptococcus）、密螺旋體（ Treponema）、弧菌（ Vibrio）、沃爾巴克氏體（ Wolbachia）、耶爾森氏菌（ Yersinia）屬或類似者之細菌。
示例性細菌包括選自以下之物種：大腸桿菌（ Escherichia coli）、產酸克雷伯氏菌（ Klebsiella oxytoca）、產琥珀酸厭氧螺菌（ Anaerobiospirillum succiniciproducens）、產琥珀酸放線桿菌（ Actinobacillus succinogenes）、產琥珀酸曼氏桿菌（ Mannheimia succiniciproducens）、埃特里根瘤菌（ Rhizobium etli）、枯草桿菌（ Bacillus subtilis）、麩胺酸棒狀桿菌（ Corynebacterium glutamicum）、氧化葡糖桿菌（ Gluconobacter oxydans）、運動醱酵單胞菌（ Zymomonas mobilis）、雷特氏乳球菌（ Lactococcus lactis）、胚芽乳桿菌（ Lactobacillus plantarum）、天藍色鏈黴菌（ Streptomyces coelicolor）、丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）、螢光假單胞菌（ Pseudomonas fluorescens）、嗜熱產氫桿菌（ Hydrogenobacter thermophilus）、詹氏甲烷球菌（ Methanococcus jannaschii）及惡臭假單胞菌（ Pseudomonas putida）。
較佳細菌屬於埃希氏桿菌、棒狀桿菌或假單胞菌屬。較佳細菌係大腸桿菌、麩胺酸棒狀桿菌、螢光假單胞菌或惡臭假單胞菌。
例示性酵母或真菌包括屬於酵母（ Saccharomyces）、裂殖酵母（ Schizosaccharomyces）、假絲酵母（ Candida）、克魯維酵母（ Kluyveromyces）、麴菌（ Aspergillus）、畢赤酵母（ Pichia）、隱球菌（ Crytpococcus）屬或類似者之彼等酵母或真菌。例示性酵母或真菌物種包括選自釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe）、乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis）、馬克斯克魯維酵母（ Kluyveromyces marxianus）、土麴菌（ Aspergillus terreus）、黑麴菌（ Aspergillus niger）、畢赤酵母（ Pichia pastoris）或類似者之彼等酵母或真菌物種。
在本發明之具體實例中，微生物可經基因修飾以產生比野生型更多之甲基丙烯酸C 3-C 12酯。
相比於野生型微生物增強甲基丙烯酸C 3-C 12酯之產生可包括藉由使用此項技術中已知之各種基因工程改造技術對現有細胞代謝過程、核酸及/或蛋白質作出修飾。增強甲基丙烯酸C 3-C 12酯之產生還可包括修飾微生物以在微生物中表現一或多種異源基因。此等可包括編碼由碳類原料至甲基丙烯酸C 3-C 12酯之所需路徑酶的基因，或可包括用以直接或間接促進此類路徑中之酶之功能及表現的其他輔助基因。
相應地，本發明之微生物可經修飾以增強甲基丙烯酸C 3-C 12酯之產生。
微生物可包含修飾，該等修飾藉由競爭相同受質及/或中間體來降低或消除催化除甲基丙烯酸C 3-C 12酯之外之化合物合成的酶的活性。替代地或另外，在本發明之方法中使用之微生物可包含修飾，該等修飾降低或消除代謝甲基丙烯酸C 3-C 12酯或代謝產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯之路徑中之中間體的酶的活性。
替代地或另外，本發明之方法中使用之微生物可包含修飾，該等修飾降低或消除參與移除中間體之其他細胞功能的蛋白質的活性。此類其他細胞功能之實例可包括：儲存機制，諸如液泡儲存（例如在酵母中）或能夠儲存代謝物之其他胞內體（例如細菌微腔）；細菌胞外質或運輸機制，諸如能夠輸出代謝物之跨膜泵或孔蛋白。
替代地或另外，在本發明之方法中使用之微生物可包含修飾以降低或消除參與如下細胞功能的酶或蛋白質的活性： （i）    將物質自甲基丙烯酸C 3-C 12酯產生路徑中轉移；及/或 （ii）   代謝甲基丙烯酸C 3-C 12酯。
替代地或另外，在本發明之方法中使用之微生物可包含修飾，該等修飾導致微生物對在本發明之方法期間遇到之醱酵條件、反應條件或其他壓力更具耐性。
增強甲基丙烯酸C 3-C 12酯之產生可包括選擇經調適以相比於野生型微生物產生更多甲基丙烯酸C 3-C 12酯的微生物。在本發明之上下文中，當術語『經調適（adapted）』關於微生物使用時，意指經基因修飾或工程改造之生物體，或例如已經基於表現一或多種引起甲基丙烯酸C 3-C 12酯之產生增強的酶而天然選擇之生物體之突變菌株。此類修飾可包括任何可能增強甲基丙烯酸C 3-C 12酯之產生的上述修飾。
為降低或消除上述酶或蛋白質之活性，可藉由習知隨機或定點突變誘發或基因工程改造技術將降低或消除酶或蛋白質之胞內活性的突變引入前述酶或蛋白質之基因中。誘變之實例可包括，例如X射線或紫外線照射、用諸如正甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍之誘變劑處理、分別藉由高保真性或易錯聚合酶鏈反應之活體外定點或隨機誘變等。基因上引入突變之位點可位於編碼酶或蛋白質之寫碼區或諸如啟動子之表現控制區。基因工程改造技術之實例可包括基因重組、轉導、細胞融合及基因剔除。
目標酶或蛋白質之胞內活性之降低或消除及降低度可藉由在由候選菌株獲得之細胞提取物或其純化部分中量測酶或蛋白質活性且將其與野生型菌株的對比，或藉由量測整個細胞之目標產物之形成來證實。
較佳地，一或多種微生物表現一或多種催化甲基丙烯酸C 3-C 12酯，較佳甲基丙烯酸C 3-C 12烷基酯之產生所必需的酶。較佳地，相關步驟及任何其他酶促步驟在一或多種微生物內活體內進行。
一或多種微生物可天然表現一或多種酶，或可經基因工程改造以表現一或多種酶，或可表現野生型酶或經基因工程改造之酶兩者之組合。此類經基因工程改造之生物體可描述為重組生物體。
一或多種微生物可內源性或異源性表現一或多種酶，或可表現內源酶及異源酶之組合。
在本發明之上下文中，術語『重組生物體（recombinant organism）』意指經基因修飾或工程改造之生物體，其包含已經人工構建且插入生物體中的遺傳物質。遺傳物質可包含可能經或可能未經進一步經基因修飾之內源或異源核酸。
在本發明之上下文中，術語『內源（endogenous）』意指來源於相同生物體物種。
在本發明之上下文中，術語『異源（heterologous）』意指來源於不同生物體物種。
可在微生物內表現以使得其經修飾產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯，較佳甲基丙烯酸C 3-C 12烷酯的一或多種基因包括編碼以下任何酶的基因。
在具體實例中，微生物可表現一或多種可將異丁醯基-CoA轉化為甲基丙烯醯基-CoA的酶，例如氧化酶、去氫酶或氧化還原酶。
氧化酶可以係作用於CH-CH鍵，在EC編號1.3.x.x下之氧化酶，更佳係使用氧作為電子受體作用於CH-CH鍵，在EC編號EC 1.3.3.x下之氧化酶。再更佳，氧化酶係適合地在EC編號EC 1.3.3.6下之醯基-CoA氧化酶。更佳，醯基-CoA氧化酶係選自以下任何酶：來自阿拉伯芥（ Arabidopsis thaliana）之ACX4、來自菸草節桿菌（ Arthrobacter nicotianae）之短鏈醯基-CoA氧化酶、來自綠豆（ Vigna radiata）之過氧化物酶體醯基-CoA氧化酶、來自假絲酵母屬之醯基-CoA氧化酶及來自熱帶假絲酵母（ Candida tropicalis）之醯基-CoA氧化酶4。最佳，醯基-CoA氧化酶係來自阿拉伯芥之ACX4。
氧化還原酶可以係在EC分類編號1.X.X.X下之氧化還原酶。較佳，氧化還原酶係作用於電子供體之CH-CH基團，適合地在EC分類1.3.X.X下之氧化還原酶。更佳，作用於供體之CH-CH基團之氧化還原酶係FAD依賴型氧化還原酶，再更佳氧化還原酶係在EC分類1.3.8.X下之CoA去氫酶。再更佳，氧化還原酶係適合地在EC分類1.3.8.1下之短鏈醯基-CoA去氫酶、適合地在EC分類1.3.8.4下之異戊醯基-CoA去氫酶、適合地在EC分類1.3.8.5下之2-甲基-分支鏈醯基-CoA去氫酶或適合地在EC分類1.3.8-下之醯基-CoA去氫酶，諸如異丁醯基-CoA去氫酶。最佳，氧化還原酶係選自以下任何酶：來自惡臭假單胞菌之短/分支鏈醯基-CoA去氫酶、來自智人（ Homo sapiens）之異丁醯基-CoA去氫酶及來自阿拉伯芥之異戊醯基-CoA去氫酶。
CoA去氫酶通常需要關聯的電子運輸系統以連接受質之氧化與泛醌之還原，其隨後再生。此類電子運輸系統由電子轉移黃素蛋白（electron transfer flavoprotein，ETF）及電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶（electron transfer flavoprotein ubiquinone oxidoreductase，ETFQO）構成。ETF必須與醯基-CoA去氫酶及ETFQO二者相容。相應地，在使用醯基-CoA去氫酶之具體實例中，較佳採用以下再生系統中之一者： • 表現內源CoA去氫酶之宿主微生物，該內源CoA去氫酶具有在異丁醯基-CoA上之活性及其關聯的電子運輸系統，諸如在例如惡臭假單胞菌之情況中； • 表現異源CoA去氫酶之宿主微生物，其伴有來自與異源CoA去氫酶相同之生物體的電子運輸系統的蛋白質。舉例而言，來自智人、惡臭假單胞菌、反硝化副球菌（ Paracoccus denitrifican）或來自阿拉伯芥之CoA去氫酶及電子運輸系統組分，全部在大腸桿菌（或另一宿主生物體）中表現；或 • 表現異源CoA去氫酶之宿主微生物，其伴有來自不同微生物之電子運輸系統組分，其中該等組分彼此相容且與CoA去氫酶相容。舉例而言，來自智人之CoA去氫酶與野豬（ Sus scrofa）之電子轉移黃素蛋白相容，繼而與來自類球紅細菌（ Rhodobacter sphaeroides）之電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶相容。替代地，由於阿拉伯芥（ A. thaliana）之ETF-泛醌氧化還原酶與類球紅細菌（ R. sphaeroides）之ETF-泛醌氧化還原酶具有優良序列同源性，異戊醯基-CoA去氫酶及擬南芥之ETF可與來自類球紅細菌之ETF-泛醌氧化還原酶形成功能系統用於氧化異丁醯基-CoA。最後，由於反硝化副球菌ETF與人類ETF及豬ETF之相似性，預測來自反硝化副球菌之ETF及ETF-泛醌氧化還原酶與來自另一來源之異丁醯基-CoA去氫酶相容，諸如智人或不同生物體之同源物之異丁醯基-CoA去氫酶。
在具體實例中，微生物可表現一或多種可將甲基丙烯醯基-CoA轉化為甲基丙烯酸C 3-C 12酯的酶，例如醇醯基轉移酶。
較佳，醇醯基轉移酶在醇，更佳C3-C12醇，最佳C3-C8醇存在下，再更佳在丙醇或丁醇（諸如正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、第二丁醇、第三丁醇）、戊醇、己醇、庚醇或辛醇存在下作用。最佳，醇醯基轉移酶在異丙醇或正丁醇存在下作用。
本文中術語醇意指具有羥基（-OH基）之物種且其能夠與甲基丙烯酸酯形成酯基。
較佳醇醯基轉移酶來源於植物來源，更佳屬於選自由以下組成之群之任何目之植物：薑目（ Zingiberales）、薔薇目（ Rosales）、石楠目（ Ericales）、葫蘆目（ Cucurbitales）、芸苔目（ Brassicales）及樟目（ Laurales）；再更佳屬於選自由以下組成之群之任何科之植物：芭蕉科（ Musaceae）、薔薇科（ Rosaceae）、石楠科（ Ericaceae）、獼猴桃科（ Actinidiaceae）、葫蘆科（ Cucurbitaceae）、番瓜樹科（ Caricaceae）及樟科（ Lauraceae）；再更佳屬於選自由以下組成之群之任何屬之植物：香蕉屬（ Musa）、草莓屬（ Fragaria）、蘋果屬（ Malus）、李屬（ Prunus）、梨屬（ Pyrus）、苔莓屬（ Vaccinium）、獼猴桃屬（ Actinidia）、甜瓜屬（ Cucumis）、番瓜樹屬（ Carica）及酪梨屬（ Persea）；再更佳任一個選自由以下組成之群之植物：香蕉、草莓、蘋果、中國梅（ Pyrus communis）、西洋梨（ Pyrus communis）、越桔、奇異果、瓜、番木瓜及鱷梨。最佳，醇醯基轉移酶來源於水果來源，諸如蘋果、瓜或番茄來源，適合地蘋果來源。
在本發明之具體實例中，微生物可表現氧化酶及醇醯基轉移酶用於將異丁醯基CoA轉化為甲基丙烯酸C 3-C 12酯。適合氧化酶及醇醯基轉移酶在上文中概述。若氧化酶係來自阿拉伯芥之ACX4則尤其較佳。
在具體實例中，微生物可表現一或多種可將2-酮基異戊酸轉化為異丁醯基-CoA的酶。在具體實例中，一或多種酶可以係由α子單元組分、硫辛醯胺醯基轉移酶組分及硫辛醯胺去氫酶組分組成之酶複合物，諸如分支鏈酮酸去氫酶複合物。最佳，去氫酶係選自以下任何酶：來自惡臭假單胞菌之分支鏈酮酸去氫酶（branched chain keto acid dehydrogenase，BCKD）、來自枯草桿菌之BCKD、來自銅綠假單胞菌（ P. aeuruginosa）之BCKD、來自阿拉伯芥之BCKD、來自天藍色鏈黴菌之BCKD及來自嗜熱棲熱菌（ Thermus thermophilus）之BCKD。
替代地，2-酮基異戊酸轉化為異丁醯基-CoA可由以下催化：適合地在EC分類1.X.X.X下之氧化還原酶；較佳，作用於供體之醛基或側氧基的，適合地在EC分類1.2.X.X下之氧化還原酶；更佳，作用於供體之醛基或側氧基使用鐵-硫蛋白質作為電子受體的，適合地在EC分類1.2.7.X下之氧化還原酶；最佳，適合地在下EC分類編號1.2.7.7下之2-酮基異戊酸酯鐵氧化還原蛋白還原酶（亦已知為酮基纈胺酸鐵氧化還原蛋白氧化還原酶），其係組成α、β、γ及δ子單元之四聚體。此類酶之實例係來自激烈火球菌（ Pyrococcus furiosis）之2-酮基異戊酸酯鐵氧化還原蛋白還原酶；來自火球菌屬之2-酮基異戊酸酯鐵氧化還原蛋白還原酶；來自嗜熱球菌（ Thermococcus）屬之2-酮基異戊酸酯鐵氧化還原蛋白還原酶；來自海濱嗜熱球菌（ Thermococcus litoralis）之2-酮基異戊酸酯鐵氧化還原蛋白還原酶；來自深層嗜熱球菌（ Thermococcus profundus）之2-酮基異戊酸酯鐵氧化還原蛋白還原酶及來自嗜熱自養甲烷桿菌（ Methanobacterium thermoautotrophicum）之2-酮基異戊酸酯鐵氧化還原蛋白還原酶。
替代地，微生物可表現一或多種可將異丁酸轉化為異丁醯基-CoA的酶，例如連接酶。連接酶適合地在EC分類編號6.X.X.X下，較佳在EC分類6.2.X.X下之碳-硫鍵形成連接酶，更佳在EC分類6.2.1.X下之酸-硫醇形成連接酶，更佳GDP形成、ADP形成或AMP形成連接酶，諸如，適合地在EC分類6.2.1.1下之AMP形成乙酸-CoA連接酶、適合地在EC分類6.2.1.2下之丁酸-CoA連接酶、適合地在EC分類6.2.1.10下之羧酸-CoA連接酶、適合地在EC分類6.2.1.13下之ADP形成乙酸-CoA連接酶、適合地在EC分類6.2.1.17下之丙酸-CoA連接酶或術語EC分類6.2.1.-之酸-硫醇連接酶。最佳，連接酶係選自以下任何酶：來自綠針假單胞菌（ Pseudomonas chlororaphis）之AcsA、來自擬青黴（ Paecilomyces varioti）之丁醯基-CoA合成酶、來自牛心臟粒線體之丁醯基-CoA合成酶。
替代地，微生物可表現一或多種可將異丁酸酯轉化為異丁醯基-CoA的酶。舉例而言，異丁酸酯可藉由激酶轉化為異丁醯基-磷酸酯且異丁醯基-磷酸酯可藉由轉移酶轉化為異丁醯基-CoA。
較佳，異丁酸酯藉由以下轉化為異丁醯基-磷酸酯：適合地在EC分類編號EC 2.X.X.X下，較佳在EC 2.7.X.X下，更佳在EC分類編號EC 2.7.2.X下之激酶，最佳適合地在EC分類2.7.2.1下之乙酸激酶、在2.7.2.6下之甲酸激酶、在EC 2.7.2.7下之丁酸激酶、在EC 2.7.2.14下之分支鏈脂肪酸激酶或在EC 2.7.2.15下之丙酸酯激酶。最佳，激酶係選自以下任何酶：來自螺旋菌（ Spirochete） MA-2之分支鏈脂肪酸激酶、來自丁酸梭菌（ C. butyricum）之丁酸激酶。
較佳，異丁醯基-磷酸酯藉由在EC分類編號2.X.X.X下之轉移酶之作用；更佳藉由在EC分類編號2.3.X.X下之醯基轉移酶之作用；再更佳藉由除胺基-醯基之外之在EC分類編號2.3.1.X下之醯基轉移酶轉移基團之作用轉化為異丁醯基-CoA。再更佳，分別在EC分類編號2.3.1.8及2.3.1.19下之磷酸乙醯基轉移酶或磷酸丁醯基轉移酶。更佳，轉移酶係來自丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）ATCC824之磷酸丁醯基轉移酶或來自枯草桿菌、麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032、海棲嗜熱孢菌（ Thermotoga maritima）及克氏梭菌（ Clostridium kluyveri）之磷酸乙醯基轉移酶。此等酶之其他來源包括其他厭氧細菌，尤其梭菌屬，諸如巴斯德梭菌（ Clostridium pasteurianum）或拜氏梭菌（ Clostridium beijerinckii）。
微生物可表現一或多種可將異丁酸轉化為異丁醯基-CoA的酶，例如合成酶，較佳異丁醯基-CoA合成酶，最佳來自黃假單胞菌（ P. chloraphis）B23之異丁醯基-CoA合成酶（AcsA）。
視情況，微生物可表現上述酶之任何組合。
編碼蛋白質，尤其在根據本發明之微生物中表現之酶之基因之核酸來源可包括，例如其中經編碼之基因產物能夠催化所提及之反應的任何物種。該等物種包括原核與真核生物體，包括但不限於：細菌，包括古菌及真細菌；及真核生物，包括酵母、植物、昆蟲、動物及哺乳動物（包括人類）。此類來源之例示性物種包括，例如，大腸桿菌、智人、丙酸桿菌（ Propionibacterium fredenreichii）、扭脫原單胞菌甲基桿菌（ Methylobacterium extorquens）、弗氏志賀菌（ Shigella flexneri）、腸道沙門氏菌（ Salmonella enterica）、費氏耶爾森氏菌（ Yersinia frederiksenii）、痤瘡丙酸桿菌（ Propionibacterium acnes）、褐家鼠（ Rattus norvegicus）、秀麗隱桿線蟲（ Caenorhabditis elegans）、蠟樣芽胞桿菌（ Bacillus cereus）、醋酸鈣不動桿菌（ Acinetobacter calcoaceticus）、貝氏不動桿菌（ Acinetobacter baylyi）、不動桿菌屬（ Acinetobacter sp.）、克氏梭菌、假單胞菌屬、嗜熱棲熱菌、綠膿桿菌（ Pseudomonas aeruginosa）、惡臭假單胞菌、家兔（ Oryctolagus cuniculus）、丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）、腸膜狀明串珠菌（ Leuconostoc mesenteroides）、巴氏真桿菌（ Eubacterium barkeri）、多毛擬桿菌（ Bacteroides capillosus）、科利霍米尼斯厭氧幹菌（ Anaerotruncus colihominis）、嗜熱鹽鹼厭氧菌（ Natranaerobius thermophilus）、空腸彎曲桿菌（ Campylobacter jejuni）、阿拉伯芥、麩胺酸棒狀桿菌、野豬、枯草桿菌（ Bacillus subtilus）、螢光假單胞菌、黏質沙雷氏菌（ Serratia marcescens）、天藍色鏈黴菌、石油甲基菌（ Methylibium petroleiphilum）、肉桂地鏈黴菌（ Streptomyces cinnamonensis）、除蟲鏈黴菌（ Streptomyces avermitilis）、閃爍古生球菌（ Archaeoglobus fulgidus）、死海鹽盒菌（ Haloarcula marismortui）、好氧火棒菌（ Pyrobaculum aerophilum）、釀酒酵母、辣根梭菌（ Clostridium cochlearium）、破傷風形梭菌（ Clostridium tetanomorphum）、破傷風梭菌（ Clostridium tetani）、無丙二酸檸檬酸桿菌（ Citrobacter amalonaticus）、富養羅爾斯通氏菌（ Ralstonia eutropha）、小家鼠（ Mus musculus）、溫帶牛（ Bos taurus）、具核梭桿菌（ Fusobacterium nucleatum）、摩氏摩根氏菌（ Morganella morganii）、巴斯德梭菌、類球紅細菌、自養黃色桿菌（ Xanthobacter autotrophicus）、丙酸梭菌（ Clostridium propionicum）、埃氏巨型球菌（ Megasphaera elsdenii）、土麴菌、假絲酵母、托科達硫化葉菌（ Sulfolobus tokodaii）、勤奮金屬球菌（ Metallosphaera sedula）、橙色綠屈撓菌（ Chloroflexus aurantiacus）、糖乙酸多丁醇梭菌（ Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、醱酵胺基酸球菌（ Acidaminococcus fermentans）、幽門螺旋桿菌（ Helicobacter pylori）以及本文揭示之或可用作對應基因之源生物體的其他例示性物種。
用於構建及測試蛋白質在非天然產生之甲基丙烯酸C 3-C 12酯產生微生物中之表現之方法可例如藉由此項技術中熟知之重組技術及偵測方法進行。此類方法可見於在例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999)中描述。
參與產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯或其形成中之中間體之路徑的外源性核酸序列可使用此項技術中熟知之技術穩定或暫時引入至微生物細胞中，該等技術包括但不限於結合、電穿孔、化學轉化、轉導、轉染及超音波轉型。
轉型方法之實例可包括，用氯化鈣處理接受體微生物細胞以增加DNA之滲透率及自處於生長期之細胞製備勝任細胞繼而用DNA轉型。替代地，亦可採用如下之方法：將DNA-接受體細胞製作為可輕易地接受重組DNA之原生質體或球形質體，繼而將重組DNA引入至細胞中，已知其適用於枯草桿菌、放線菌及酵母。此外，微生物之轉型亦可藉由電穿孔進行。此類方法為此項技術中所熟知。
對於在大腸桿菌或其他原核微生物細胞中之外源性表現，真核核酸之基因或cDNA中之一些核酸序列可編碼靶向信號，諸如N端粒線體或其他靶向信號，其可視需要在轉型為原核微生物細胞之前經移除。舉例而言，粒線體前導序列之移除導致在大腸桿菌中之表現增強（Hoffmeister等人，J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)）。為了在酵母或其他真核細胞中外源性表現，基因可在未添加前導序列之情況下表現於細胞溶質中，或可靶向線粒體或其他細胞器，或經靶向以便分泌，藉由添加諸如適用於目標細胞器之粒線體靶向或分泌信號之適合靶向序列來達成。因此，應理解為移除或包括靶向序列而對核酸序列所做出之適當修飾可併入外源性核酸序列中以賦予所需性質。此外，可使用此項技術中熟知之技術對基因進行密碼子最佳化以實現蛋白質在微生物內之最佳化表現。
可構建表現載體或載體以在微生物中包括如本文中所例示之可操作地連接於表現控制序列功能之一或多種生物合成路徑酶編碼核酸。適用於本發明之微生物的表達載體包括例如質體、黏質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體及人工染色體，其包括可操作用於穩定整合至宿主染色體中之載體及選擇序列或標記。
另外，表現載體可包括一或多種可選標記基因及適當表現控制序列。亦可包括如下可選標記基因，其例如提供對抗生素或毒素之抗性、補充營養缺陷型缺乏，或供應培養基中不存在之關鍵營養物質。表現控制序列可包括構成性、誘導性或可抑制性啟動子、轉錄強化子、轉錄終止子、轉譯信號及此項技術中所熟知之類似者。當兩個或更多個外源編碼核酸序列共表現時，兩個核酸序列皆可插入，例如，至單一表現載體中或單獨的表現載體中。就單一載體表現而言，編碼核酸可操作地連接於一個共用的表現控制序列，或連接於不同表現控制序列，諸如誘導型啟動子及構成性啟動子。在一些具體實例中，載體可具有兩個或更多個啟動子用於共表現多個基因或操縱子。在一些具體實例中，基因/操縱子可在具有一或多個對應啟動子之一或多種不同載體上表現。
用於轉型之載體可為在微生物細胞中可自主複製的載體。在諸如大腸桿菌之腸內菌科細菌之細菌中可自主複製的載體之實例可包括：質體載體pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pET20b(+)、pET28b(+)（獲自Novagen之pET載體）、pLysS、（pHSG及pSTV載體獲自Takara Bio有限公司）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMW載體獲自Nippon Gene有限公司）等及其衍生物。此外，用於棒狀菌之載體可包括：pAM330（日本專利特許公開第58-67699號）、pHM1519（日本專利特許公開第58-77895號）、pSFK6（日本專利特許公開第2000-262288號）、pVK7（USP2003-0175912A）、pAJ655、pAJ611、pAJ1844（日本專利特許公開第58-192900號）、pCG1（日本專利特許公開第57-134500號）、pCG2（日本專利特許公開第58-35197號）、pCG4、pCG11（日本專利特許公開第57-183799號）、pHK4（日本專利特許公開第5-7491號）等。此外，用於酵母之載體可包括酵母質體，諸如用於畢赤酵母之pD902或pD905，或用於釀酒酵母之pD1201、pD1204、pD1205、pD1207、pD1211、pD1214、pD1215、pD1217、pD1218、pD1221、pD1224、pD1225、pD1227、pD1231、pD1234、pD1235、pD1237。基因亦可使用熟知方法整合於宿主染色體中（例如Datensko及Wanner（Datsenko, K. A.及Wanner, B. L. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645））。
酶活性之增強可包括藉由用具有適當強度之啟動子替代目標基因之表現調節序列（諸如基因體DNA或質體上之啟動子）來增強目標基因之表現。舉例而言，已知thr啟動子、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、pL啟動子、tac啟動子等為頻繁使用之啟動子。在諸如細菌之微生物中具有高表現活性之啟動子之實例可包括：延長因子Tu（EF-Tu）基因tuf之啟動子、編碼共伴侶蛋白GroES/EL、硫氧還原蛋白還原酶、磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶之基因的啟動子及類似者（WO2006/028063、EP1697525）。強啟動子之實例及用於評估啟動子強度之方法為此項技術中所熟知。
而且，亦有可能在基因之啟動子區域中替換幾個核苷酸以致啟動子具有適當強度，如在WO 2000/18935中所揭示。表現調節序列之替換可例如以與使用溫度敏感性質體之基因替換相同之方式進行。可用於大腸桿菌或菠蘿泛菌（ Pantoea ananatis）之具有溫度敏感性複製源之載體的實例可包括例如國際公開案WO 1999/03988中所述之質體pMAN997、其衍生物等。此外，表現調節序列之替代亦可藉由採用線性DNA之方法來進行，諸如使用λ噬菌體之Red重組酶的稱為「Red驅動整合（Red-driven integration）」的方法（Datsenko, K. A.及Wanner, B. L. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645）、組合Red驅動整合方法及λ噬菌體切除系統之方法（Cho, E. H.等人2002. J. Bacteriol. 184:5200-5203）（WO2005/010175）等。表現調節序列之修飾可與增加基因複本數組合。
此外，已知在核糖體結合位點(RBS)與起始密碼子之間的區段中且尤其緊接著起始密碼子上游之序列中的幾個核苷酸之替代極大地影響mRNA可轉譯性。轉譯可藉由修飾此等序列增強。
當目標基因引入至上述質體或染色體中時，任何啟動子均可用於基因表現，只要選擇在所用微生物中起作用之啟動子即可。啟動子可為基因之天然啟動子或經修飾之啟動子。基因之表現亦可藉由適當選擇在所選微生物中起有力作用之啟動子或藉由使啟動子之-35及-10區域接近共同序列來控制。
參與代謝或合成路徑之外源性核酸序列之轉型、轉導、結合或染色體插入可使用此項技術中熟知之方法證實。此類方法包括，例如，質體或染色體DNA之萃取繼而特定目標序列之聚合酶鏈擴增；或限制定位，進一步核酸分析，諸如北方墨點法（Northern blot）、或mRNA之聚合酶鏈反應（PCR）擴增、或聚丙烯醯胺凝膠電泳、或酶活性量測、或基因產物之表現之免疫墨點法、或為測試引入的核酸序列之表現或其對應基因產物的其他適合分析方法。熟習此項技術者應瞭解，外源性核酸以足以產生所需基因產物之量表現，且另外應瞭解，可使用此項技術中熟知之方法使表現量最佳化以獲得充足表現。
應注意，一或多種編碼可在本發明之微生物中表現之酶的基因亦包含編碼該等酶之變異體，例如，包括在多肽序列中替代、刪除、插入或添加一或幾個胺基酸之變異體酶的基因，且其中該多肽保留未經修飾之酶之活性。此類變異體酶亦包括相比於未經修飾之酶及具有經修飾之變構控制之酶具有降低的酶活性的變異體酶。
用於賦予或增強甲基丙烯酸C 3-C 12酯產生能力及/或其中間體之其他方法可包括：賦予對下調因子/抑制因子之耐性、賦予對上調因子/活化因子之敏感性或減輕藉由其他化合物對酶進行變構活化之需要。 溶劑萃取
在本發明之方法中，提供與醱酵培養基接觸的有機相，有機相包括甲基丙烯酸C 3-C 12酯，較佳呈比醱酵培養基中之甲基丙烯酸C 3-C 12酯濃度更高之濃度的甲基丙烯酸C 3-C 12酯。
甲基丙烯酸C 3-C 12酯，諸如甲基丙烯酸丁酯之產生提供當達到溶解限度時以高濃度與醱酵培養基相分離之優點。因此若甲基丙烯酸C 3-C 12酯在醱酵培養基中之滴定度充分高，則可以取消對額外萃取溶劑之需要且酯將隨後形成其自身有機相。
較佳，甲基丙烯酸C 3-C 12酯在醱酵培養基中之滴定量係至少5 mg/l。舉例而言，5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155 mg/l。更佳，滴定量大於160 mg/l、180 mg/l、200 mg/l、220 mg/l或240 mg/l。
在較佳具體實例中甲基丙烯酸C 3-C 12酯在醱酵培養基中之滴定量係處於醱酵培養基之溶解限度以致甲基丙烯酸C 3-C 12酯分離出而形成與其接觸的有機相。
在甲基丙烯酸C 3-C 12酯係甲基丙烯酸丁酯之具體實例中，尤其較佳的係甲基丙烯酸丁酯在醱酵培養基中之滴定量係至少120、130、140、150或200 mg/l。甚至更佳的係甲基丙烯酸丁酯在醱酵培養基中之滴定量處於溶解限度，大約220 mg/l。在此濃度下，可以取消對額外萃取溶劑之需要。
因此，在本發明之具體實例中，在步驟b）中提供之有機相可藉由由微生物產生之甲基丙烯酸C 3-C 12酯提供。替代地，在具體實例中，在醱酵之前、期間或之後在步驟b）中提供之有機相可包含與醱酵培養基接觸（例如添加的）之外部有機溶劑。舉例而言，有機溶劑可在醱酵之前、期間或之後作為層（例如在醱酵培養基上之層）添加至醱酵培養基中。外部有機溶劑較佳在與醱酵培養基接觸期間能有效地自其萃取甲基丙烯酸C 3-C 12酯，從而典型地包括該甲基丙烯酸C 3-C 12酯。
在外部有機溶劑與醱酵培養基接觸之具體實例中，有機相較佳構成小於50%之培養基總體積（亦即醱酵培養基及有機相之總體積）。更佳，在此情況下有機相構成小於40%、30%或20%之培養基總體積。
在具體實例中，其中在步驟b）中提供之有機相實質上藉由由微生物產生之甲基丙烯酸C 3-C 12酯提供，有機相構成小於20%之培養基總體積（亦即醱酵培養基及有機相之總體積）。更佳，在此情況下有機相構成小於10%或5%之培養基總體積。
在具體實例中，有機溶劑係生物相容的，亦即對微生物不具有強毒性。
在具體實例中，有機溶劑之logP o/w值大於或等於3.0。更佳，有機溶劑之logP o/w值大於或等於3.6、3.7、3.8、3.9或4.0。logP o/w定義為特定溶劑在1-辛醇與水之標準化1:1混合物之間之分配係數之對數。本發明人已展示，隨著logP o/w值之增加，所得微生物毒性降低。尤其較佳溶劑係可為直鏈或分支鏈的C6及更大之高碳數烷烴；經一或多個C3及更大之取代基，尤其係可為直鏈或分支鏈之烷基取代基取代的C7及更大之環狀烷烴及芳族化合物，尤其苯。
在具體實例中，有機溶劑係選自由以下組成之群：甘油三丁酸酯、異丙基苯、正丙基苯、環庚烷、己烷、庚烷、環辛烷、異辛烷、1,4-二異丙基苯、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷或十二烷及其混合物。
有機溶劑亦可為離子液體。在此類具體實例中，有機溶劑係選自由以下組成之群：三己基(十四基)膦雙(2-乙基己基)磷酸鹽、三己基(十四基)膦二氰胺、三己基(十四基)膦雙(三氟甲烷)磺醯亞胺、三己基(十四基)膦乙醯磺胺酸鹽、三己基(十四基)膦醣酸鹽、三己基(十四基)膦水楊酸鹽、三己基(十四基)膦三氟甲烷磺酸鹽、三己基(十四基)膦雙(2,4,4-三甲基戊基)亞膦酸鹽、三己基(十四基)膦二氰胺、三己基(十四基)膦辛酸鹽、三己基(十四基)膦環磺酸鹽、三丁基(辛基)膦雙(三氟甲烷)磺醯亞胺、三丁基(辛基)膦水楊酸鹽、三丁基(辛基)膦三氟甲烷磺酸鹽、三丁基(辛基)膦乙醯磺胺酸鹽、三丁基(辛基)膦醣酸鹽、三丁基(辛基)膦雙(三氟甲烷)磺醯亞胺、三丁基(甲基)銨雙(三氟甲烷)磺醯亞胺或四辛基銨乙醯磺胺酸鹽或其混合物。
在本發明中，方法包括移除有機相使其不與醱酵培養基接觸。如熟習此項技術者將瞭解，片語「移除有機相（removing organic phase）」未必暗指移除全部有機相。雖然可在步驟c）中移除全部有機相（或大部分有機相），應瞭解在任何一個時間僅可移除一部分有機相。在連續方法中，可不斷地移除有機相來與醱酵培養基中之酯生成達成平衡。
在具體實例中，在本發明之方法之步驟c）中移除有機相可以係連續的，亦即可以在整個方法期間進行。替代地，移除有機相可以係非連續的，亦即可以在方法期間在限定時間點進行。
在本發明之具體實例中，方法可另外包含，例如藉由蒸餾來純化有機相中之甲基丙烯酸C 3-C 12酯（例如移除有機相）。 轉酯化
本發明包括將甲基丙烯酸C 3-C 12酯轉酯化以產生甲基丙烯酸甲酯。
本發明之步驟d）之轉酯化反應在甲醇及催化劑存在下發生。
在具體實例中，轉酯化將在催化劑存在下進行。可利用任何適合催化劑，例如酸或鹼催化劑或生物催化劑，例如酶，諸如脂肪酶。
催化劑可以係均相或非均相催化劑。在一個具體實例中，催化劑可在液體反應階段溶解。然而，催化劑可懸置於反應相可通過之固體載體上。在此情況下，反應相較佳維持呈液體，更佳水相。較佳催化劑係均相的。
如熟習此項技術者將瞭解，均相催化劑係與反應物在相同相中的催化劑，而非均相催化劑係在與反應物之相不同之相中的催化劑。
較佳催化劑係鹼式鹽催化劑。較佳，鹼性催化劑包含金屬氧化物、氫氧化物、碳酸鹽、乙酸鹽（醋酸鹽）、醇鹽（alkoxide）、碳酸氫鹽、或可分解二或三羧酸之鹽、或以上中之一者之四級銨化合物；更佳第I族或第II族金屬氧化物、氫氧化物、碳酸鹽、乙酸鹽、醇鹽、碳酸氫鹽、或可分解二或三羧酸或甲基丙烯酸之鹽。鹼性催化劑亦可包含一或多種胺。最佳催化劑係第I族或第II族金屬氫氧化物或醇鹽。
較佳，催化劑係選自以下中之一或多個：LiOH、NaOH、KOH、Mg(OH) 2、Ca(OH) 2、Ba(OH) 2、CsOH、Sr(OH) 2、RbOH、NH 4OH、Li 2CO 3、Na 2CO 3、K 2CO 3、Rb 2CO 3、Cs 2CO 3、MgCO 3、CaCO 3、SrCO 3、BaCO 3、(NH 4) 2CO 3、LiHCO 3、NaHCO 3、KHCO 3、RbHCO 3、CsHCO 3、Mg(HCO 3) 2、Ca(HCO 3) 2、Sr(HCO 3) 2、Ba(HCO 3) 2、NH 4HCO 3、Li 2O、Na 2O、K 2O、Rb 2O、Cs 2O、MgO、CaO、SrO、BaO、Li(OR 1)、Na(OR 1)、K(OR 1)、Rb(OR 1)、Cs(OR 1)、Mg(OR 1) 2、Ca(OR 1) 2、Sr(OR 1) 2、Ba(OR 1) 2、NH4(OR 1)，其中R 1係視情況經一或多個官能基取代之任何C1至C6分支鏈、非分支鏈或環狀烷基；NH 4(R 2CO 2)、Li(R 2CO 2)、Na(R 2CO 2)、K(R 2CO 2)、Rb(R 2CO 2)、Cs(R 2CO 2)、Mg(R 2CO 2) 2、Ca(R 2CO 2) 2、Sr(R 2CO 2) 2或Ba(R 2CO 2) 2，其中R 2CO 2係乙酸根；(NH 4) 2(CO 2R 3CO 2)、Li 2(CO 2R 3CO 2)、Na 2(CO 2R 3CO 2)、K 2(CO 2R 3CO 2)、Rb 2(CO 2R 3CO 2)、Cs 2(CO 2R 3CO 2)、Mg(CO 2R 3CO 2)、Ca(CO 2R 3CO 2)、Sr(CO 2R 3CO 2)、Ba(CO 2R 3CO 2)、(NH 4) 2(CO 2R 3CO 2)，其中CO 2R 3CO 2係草酸根；甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、環己胺、苯胺；R 4NOH，其中R係甲基、乙基丙基、丁基；二氮雜雙環十一烯及二氮雜雙環壬烷。
更佳，催化劑係選自以下中之一或多個：LiOH、NaOH、KOH、Mg(OH) 2、Ca(OH) 2、Ba(OH) 2、CsOH、Sr(OH) 2、RbOH、NH 4OH、Li(OR 1)、Na(OR 1)、K(OR 1)、Rb(OR 1)、Cs(OR 1)、Mg(OR 1) 2、Ca(OR 1) 2、Sr(OR 1) 2、Ba(OR 1) 2、NH4(OR 1)，其中R 1係視情況經一或多個官能基取代之任何C1至C6分支鏈、非分支鏈或環狀烷基；二氮雜雙環十一烯及二氮雜雙環壬烷。
最佳，催化劑係選自以下中之一或多個：LiOH、NaOH、KOH、RbOH、CsOH、Li(OR 1)、Na(OR 1)、K(OR 1)、Rb(OR 1)、Cs(OR 1)，其中R 1係甲基；二氮雜雙環十一烯及二氮雜雙環壬烷。
較佳催化劑包括第I族及第II族鹼性金屬鹽，例如鋰、鈉、鉀、銣、銫、鈁、鈹、鎂、鈣、鍶、鋇或鐳鹽。尤其較佳係鋰、鈉、鉀、銣、銫或鈁（亦即第I族金屬）鹽。
在本發明之較佳具體實例中，催化劑包含第I族甲醇鹽或氫氧化物，例如甲醇鈉、甲醇鋰、甲醇鉀、氫氧化鈉、氫氧化鋰或氫氧化鉀。
在尤其較佳具體實例中，催化劑係第I族或第II族甲醇鹽，較佳第I族甲醇鹽。本發明人已展示，第I族甲醇鹽，尤其甲醇鋰，尤其有利，因為催化劑不如其他催化劑那般快速失活，且因此可用在連續方法中（除分批反應之外）。
在具體實例中，甲基丙烯酸C 3-C 12酯將存在於在本發明之步驟c）中經移除之有機相中，且本發明將包括甲基丙烯酸C 3-C 12酯轉酯化。步驟d）之轉酯化可與步驟c）中之有機相移除同時進行或在其之後進行。
在具體實例中，轉酯化反應在對於催化劑而言mol%水小於或等於500%、400%、300%、200%或100%之條件下發生。較佳，對於催化劑而言mol%水小於或等於90%、80%、70%或60%。更佳，對於催化劑而言mol%水小於或等於50%、40%、30%、35%、20%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。較佳，轉酯化反應在無水存在下發生。
本發明之本發明人已出乎意料地展示，當在轉酯化反應期間存在之水降低時，甲基丙烯酸C 3-C 12酯，尤其甲基丙烯酸丁酯向甲基丙烯酸甲酯之轉化提高。因此，在本發明之較佳具體實例中，在步驟d）之轉酯化之前將對有機相進行進一步純化（或乾燥）以減少在轉酯化反應期間存在之水（例如，呈水性醱酵培養基形式）。
因此，在具體實例中，方法包含視情況在步驟d）之轉酯化之前純化（或乾燥）有機相的步驟。視情況，純化或乾燥藉由蒸餾來達成。
在本發明之具體實例中，方法將另外包含e）純化來自發生轉酯化反應之培養基中的MMA。此類純化可藉由例如蒸餾來達成。 醱酵及醱酵培養基
在本發明中，將微生物在該微生物將產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯的條件下提供於醱酵培養基中。
在具體實例中，本發明包含在該醱酵培養基中培養微生物。培養（culturing/cultivation）適合地需要微生物可在其上衍生出能量且生長的碳類原料。較佳，因此，微生物在碳類原料上培養。
醱酵培養基可為包圍微生物之周圍培養基。較佳，碳類原料存在於培養基中，視情況溶解或懸浮於培養基中、鼓泡通過培養基及/或與培養基混合。較佳，因此，培養基包含微生物及碳類原料以及任何緩衝液及鹽。
醱酵培養基可為適合於微生物之需求的任何可商購培養基。醱酵培養基適合地含有碳類原料及氮源以及微生物之生長及/或甲基丙烯酸C 3-C 12酯之形成所需的額外化合物。
此項技術中已知之適合碳類原料之實例包括：葡萄糖、麥芽糖、麥芽糊精、蔗糖、水解澱粉、澱粉、木質素、芳香烴、合成氣或其組分、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、糖蜜及油。較佳，碳類之原料來源於生物質。亦可使用混合物以及廢物，諸如城市廢物、食品廢物及來自食品加工、林業或農業之木質纖維素廢物。
此項技術中已知之適合氮源之實例包括大豆食物、玉米漿、酵母提取物、氨、銨鹽、硝酸鹽、尿素、氮氣或其他含氮來源。
可能係微生物之生長所需（且因此可存在於醱酵培養基中）之額外化合物之實例包括：抗生素、抗真菌劑、抗氧化劑、緩衝液、磷酸鹽、硫酸鹽、鎂鹽、微量元素及/或維生素。
微生物之生長及/或產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯所需的額外化合物，如磷酸鹽、硫酸鹽或微量元素，可在不同類別之微生物之間，亦即真菌、酵母及細菌之間以不同的量添加。此外，待添加之額外化合物之量可由形成甲基丙烯酸C 3-C 12酯使用何種路徑來決定。
待添加至培養基中之碳類原料及氮源之量可視微生物之需求及/或微生物培養之長度而變化。在培養物培養基中碳類原料與氮源之比可顯著不同。
典型地，微生物之生長所需之各醱酵培養基組分之量藉由量測在營養物質上之生長產率確定且對於培養方法中所使用之碳類原料之量進一步評估，因為形成之生物質之量將主要由所使用之碳類原料之量及在任何饋料方案期間施加之營養物質限制決定。
在具體實例中，其中碳類原料來源於生物質，生物質較佳包含大量碳水化合物。尤其較佳的係C5或C6糖、碳類氣體或芳香烴之來源的碳水化合物，較佳C5或C6糖，更佳葡萄糖，例如但不限於澱粉、木質素、纖維素、肝糖、阿拉伯木聚糖、幾丁質或果膠。
替代地，生物質可包含大量脂肪，尤其較佳甘油及脂肪酸之來源之脂肪或油，特別係甘油三酯。適合之甘油三酯包括容易地獲自植物或動物來源之任何油或脂肪。該等油及脂肪之實例包括：棕櫚油、亞麻籽油、菜籽油、豬油、黃油、鯡魚油、椰子油、植物油、葵花油、蓖麻油、大豆油、橄欖油、可可脂、酥油、鯨油等。
生物質可由一或多種不同生物質來源構成。適合之生物質來源之實例如下：原生木材、能源作物、農業殘渣、食品廢物、城市廢物及工業廢物或副產物。
原生木材生物質來源可包括但不限於，木片、樹皮、殘枝、原木、鋸屑、木顆粒或木塊。
能量作物生物質量來源可包括但不限於：短輪伐期矮林或森林；非木本草，諸如芒草、大麻柳枝稷、蘆葦或黑麥；農業作物，諸如糖、澱粉或油類作物；或水生植物，諸如微藻類或大型藻類及野草。
農業殘渣可包括但不限於：苞、草稈、玉米秸稈、麵粉、穀物、家禽垃圾、糞肥、泥漿、合成氣或青貯料。
食品廢物可包括但不限於：外皮/皮、殼、苞、核心、仁果/硬核、動物或魚類之不可食部分、來自果汁之果肉及油提取物、來自釀造之廢穀物或啤酒花、家庭廚房廢物、豬油或油或脂肪。
工業廢物可包括但不限於：包括顆粒、未經處理之木材、經處理之木材、葉岩氣體、包括MDF/OSD之木材複合材料、木材層壓製品、紙漿/碎屑/廢料、包括纖維/紗線/流出物之紡織物或污水淤泥。
微生物可以分批、重複分批、饋料批式、重複饋料批式或連續培養方法來培養。
方法較佳按工業規模進行。工業規模方法應理解為涵蓋在體積規模≥ 0.01 m 3，較佳≥ 0.1 m 3，較佳≥ 0.5 m 3，較佳≥ 5 m 3，較佳≥ 10 m 3，更佳≥ 25 m 3，更佳≥ 50 m 3，更佳≥ 100 m 3，最佳≥ 200 m 3之一或多個醱酵槽中之培養法。
在具體實例中，培養在生物反應器中進行。生物反應器通常理解為意指在其中進行微生物之工業培養的容器。生物反應器可具有任何大小、編號及形式，且可包括用於提供營養物質、用於生長之額外化合物、新鮮培養基、碳類原料、氣體添加劑（諸如但不限於空氣、氮氣、氧氣或二氧化碳）之入口。生物反應器亦可包含用於移除大量培養物培養基之出口，以自醱酵培養基收集甲基丙烯酸C 3-C 12酯。生物反應器亦可具有用於取樣培養物之出口。
生物反應器可通常經組態以例如藉由攪拌、搖動、振盪、倒轉、氣體鼓泡通過培養物等混合醱酵培養基。替代地，一些連續培養物不需要混合，例如使用塞流系統之微反應器系統。生物反應器常見且此項技術中熟知，且實例有標準本文可查得，諸如『Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology』章節版本（1989）作者：Wulf Cruegar及ANnelise Crueger，由Thomas D. Brock Sinauer Associates有限公司，Sunderland，MA翻譯。
所描述及說明之具體實例應被認為在性質上係說明性的而非限制性的，應理解，僅已展示且描述較佳實施例，且希望應保護在如申請專利範圍中界定之本發明之範圍內的所有改變及修改。
應理解在描述中雖然使用詞語諸如「較佳（preferable）」、「較佳（preferably）」、「較佳（preferred）」或「更佳（more preferred）」表明因此描述之特徵可能係合乎需要的，儘管如此其可能不係必需的且可將不具有此類特徵之具體實例涵蓋在如所附申請專利範圍所定義之本發明之範圍內。關於申請專利範圍，意圖當在特徵前使用詞語諸如「一（a/an）」或「至少一（at least one）」時，不意圖將申請專利範圍限制於僅一個此類特徵，除非特別在申請專利範圍中相反地陳述。
本發明人進行大規模測試以確定MMA怎樣能有效地藉由使用微生物產生。特定言之，經由大規模實驗，本發明人已研發出可經由藉由醱酵產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯之步驟來製備MMA之方法。儘管此類甲基丙烯酸C 3-C 12酯對微生物之毒性，其先前被認為使此類方法不可行，本發明人已出乎意料地成功研發出此類方法。 通用材料及方法 培養物生長及維持微生物
將大腸桿菌及釀酒酵母菌株儲存於-80℃下之16%甘油儲備溶液中。在瓊脂盤上製備處理培養物。 Luria Bertani（LB）及瓊脂製備
不論何時提及LB培養基時使用Luria Bertani高鹽培養基（Melford）（25 g/L）。藉由在1公升水中溶解來自酪蛋白分解之蛋白腖（10 g）、酵母提取物（5 g）及氯化鈉（10 g）來製備LB培養基。將混合物藉由在126℃高壓處理15分鐘來滅菌，隨後使其冷卻至室溫。將液體LB培養基儲存於密封無菌Duran瓶中在室溫下至多一週。使用LB高鹽培養基（25 g/l）及瓊脂（20 g/l）製備LB瓊脂盤。藉由高壓處理將LB與瓊脂混合物滅菌且使其在50℃水浴中冷卻，之後使用無菌技術傾注至無菌培養皿中。將盤在4℃下儲存至多兩週。 酵母提取物-蛋白腖-右旋糖（YEPD）及瓊脂製備
藉由在蒸餾水（1 l）中溶解酵母提取物（3 g）、麥芽提取物（3 g）、來自大豆之蛋白腖（5 g）及葡萄糖（10 g）來製備酵母提取物-蛋白腖-右旋糖（YEPD）培養基及瓊脂盤。若製備瓊脂盤，則添加瓊脂（15 g）。將混合物在126℃下高壓處理15分鐘，且隨後使其冷卻至60℃，之後使用無菌技術將盤傾注至無菌培養皿中。將盤在4℃下儲存至多兩週。將液體YEPD培養基在室溫下儲存至多一週。 MSX培養液製備
分三份製備最小鹽（MSX）培養基；MSA、MSB及Vishniac微量元素 藉由合併EDTA二鈉鹽（50 g）與水（800 ml）來製備Vishniac微量元素溶液（1 l），藉由添加KOH顆粒(每次2-3個）將其溶解。隨後按以下順序添加化學物質；ZnSO 4（2.2 g）、CaCl 2（5.54 g）、MnCl 2.4H 2O（5.06 g）、FeSO 4.7H 2O（5 g）、(NH 4) 6Mo 7O 24.4H 2O（1.1 g）、CuSO 4.5H 2O（1.57 g）及CoCl 2.6H 2O（1.61 g）。使用KOH（1 M）調節溶液至pH 6，隨後加水至1 l。將溶液儲存在4℃下至多六個月。藉由在水（660 ml）中溶解KH 2PO 4（6 g）及Vishniac微量元素（2 ml）來製備MSA。使用KOH（1 M）調節溶液至pH 7。隨後向溶液加水至760 ml。藉由在水（200 ml）中溶解NH 4Cl（3 g）及MgSO 4.7H 2O（0.4 g）來製備MSB。亦藉由在水（100 ml）中溶解D-葡萄糖（12.5 g）製備葡萄糖之儲備溶液（12.5%）。將MSA、MSB及葡萄糖（40ml）單獨地在126℃下高壓處理15分鐘，隨後一經冷卻便無菌合併，最終溶液之pH為6.8。將溶液在室溫下儲存至多一週。 在液體培養基中培養微生物通用
將來自甘油儲備溶液中之大腸桿菌及釀酒酵母在無菌瓊脂盤使用四個拋棄式接種環上劃線。對於大腸桿菌與釀酒酵母分別將經接種盤放入培育箱中在37℃或30℃下隔夜。使用無菌技術將適量無菌LB、YEPD或MSX培養基（於100 ml燒瓶中之25 ml培養基及於250 ml燒瓶中之50 ml培養基）添加至裝配有聚胺酯泡沫塞子且蓋有鋁箔的無菌錐形瓶中。對瓊脂盤中之接種物，使用拋棄式接種環自該盤移除充分分離之單一群落。群落轉移至含有適當培養基之預高壓處理燒瓶。替換燒瓶塞且將燒瓶在軌道式培育箱中針對對應微生物在30℃或37℃下以200 rpm培育。一旦達到OD 600值≈0.8，就使用無菌移液管自隔夜培養物中移除接種物之等分試樣且轉移至預高壓處理燒瓶。在培養之此階段所需之燒瓶類型及體積特定於各測試，且在此章中在各相關部分中陳述。此方法用於最初接種用於在整篇本論文中進行之生長及毒性測試的全部培養物。
培養物之比生長速率係以指數生長期使用等式ln Nt/N0 = μt計算，其中Nt係在t（小時）時間之任意光散射單位且μ係生長速率（小時-1）。取決於生長培養基之類型亦及在不同測試之間生長速率稍微不同，因此所有生長測試結果表示為與該特定測試一起進行之對照組之百分比值。 生長抑制測試-搖瓶培養物
由於甲基丙烯酸酯之波動性及降解塑料孔盤之能力，在無菌40 ml鐵氟龍（Teflon密封玻璃瓶）中進行甲基丙烯酸酯毒性測試。藉由無菌技術向各瓶添加適當LB培養基或MSX培養基用於大腸桿菌，以及YEPD用於釀酒酵母。隨後用大腸桿菌或釀酒酵母（100 μl）之隔夜培養物接種培養基。隨後留下一個僅含有此等組分之瓶作為對照測試，且向其餘三個瓶添加所需甲基丙烯酸酯。隨後將根據甲基丙烯酸酯之四個瓶轉移至設置為30℃或37℃，250 rpm之軌道式培育箱，分別用於大腸桿菌或釀酒酵母。最初每30分鐘對水性培養基相取樣，且一旦細胞進入指數生長期就每10分鐘取樣，且一旦達到穩定期就再次每30分鐘取樣，製作生長曲線。使用無菌玻璃注射器及針頭經由鐵氟龍密封蓋採集樣品，與使用UV/Vis分光光度計記錄OD600值，稀釋樣品至適當偵測範圍。 引子及序列之表
參考 引子序列（5'至3'） SEQ ID
BCKAD.F GGCCTGTCATGAGTGATTACGAGCCG 1
BCKAD.R CGGCCCTGCAGGTTCGCGGGAATCAGATGTGC 2
AAT.F AGGAGATATACCATGAAAAGCTTTTCTGTACTC 3
AAT.R AGCAGCCGGATCCCCTGCAGGACTAGTTTACTGGCTGGTGCTAC 4
ACX4.F CACCAGCCAGTAAGCTAGCAAGGAGATATACCATGGCTG 5
ACX4.R TCCCCTGCAGGACTAGTTTACAGGCGAGAACGGGTAG 6
質體之表
質體參考 來源 描述
pET16b（Sse） 本研究 具有經修飾之Sse8387I限制位點的pET16b表現載體。
pMMA121 本研究 pET16b（Sse）表現載體，其含有來自阿拉伯芥之經優化用於在pET16b（Sse）中在其XbaI與Sse8387I限制位點之間表現的ACX4基因。
pWA008 本研究 pET16b（Sse）表現載體，其含有插入在其NcoI與Sse8387I限制位點之間的編碼來自綠膿桿菌PA01菌株之BCKAD複合物的操縱子。
pAAT212 本研究 pET（Sse）表現載體，其含有插入其NcoI與Sse8387I限制位點之間之來自蘋果之經優化用於在pET16b（Sse）中表現的AAT基因。
pMMA133 本研究 pAAT212質體，其另外含有插入在SpeI限制位點與AAT基因之間之來自阿拉伯芥之經優化用於在pET16b（Sse）載體中表現之ACX4基因。
pMMA134 本研究  pMMA133及pWA008質體連接在一起，且含有插入在XbaI與Sse8387I限制位點之間之來自阿拉伯芥之用於在pET16b（Sse）載體中表現的ACX4基因、來自蘋果之經優化用於在pET16b（Sse）載體中表現的AAT基因及來自綠膿桿菌PA01菌株之BCKAD複合物。
分析方法生物質濃度
使用Agilent 8453分光光度計使用聚苯乙烯比色管（10 mm路徑長度）在600 nm處進行光學密度（Optical density，OD）量測。將待分析樣品（1 ml）轉移至比色管且量測OD。當讀數在0至0.8範圍之外時，將樣品在dH 2O中成10倍稀釋直至讀數在指定範圍內。 氣相層析法
使用氣相層析法在以下操作條件下分析來自BMA/MMA萃取實驗之樣品：
管柱 Agilent HP-5MS（最高325℃）
管柱尺寸 30 m×0.25 mm×0.25 µm標稱
氣體 氦氣
He 流速 1.00 ml min -1
偵測器 FID
烘箱設定點 55℃
烘箱勻變 ℃/ 分鐘 後續 ℃ 保持分鐘 運行時間
初始    55 3.5 3.5
勻變 1 30 180 1 8.67
使用氣相層析法在以下操作條件下分析來自轉酯化實驗之樣品：
管柱 RTX-1701（來自Thames Restek）
管柱尺寸 62 m×0.32 mm×1.0 µm標稱
氣體 氫氣
H 2 流速 2.01 ml min -1
偵測器 FID
烘箱設定點 60℃
烘箱勻變 ℃/ 分鐘 後續 ℃ 保持分鐘 運行時間
初始    60 10 10
勻變1 10 180 2 24
勻變2 20 220 6 32
實施例 高碳數甲基丙烯酸酯對大腸桿菌及釀酒酵母之毒性
本發明人探究了甲基丙烯酸C 3-C 12酯對微生物，尤其大腸桿菌菌株MG1655及釀酒酵母菌株DSM70449之毒性。
特定言之，藉由分別在LB及YEPD培養基中在各種濃度之甲基丙烯酸酯存在下生長大腸桿菌MG1655及釀酒酵母DSM70449來探究甲基丙烯酸甲酯（MMA）、甲基丙烯酸異丙酯（iPMA）及甲基丙烯酸丁酯（BMA）之相對毒性。
在72小時之後記錄最終生物質濃度且用於計算各酯之抑制濃度（IC 50）。此係相比於在無酯存在下生長，達到最大光學密度（MaxOD 600）之一半時的酯之濃度（參見表1）。
   IC 50 範圍（g/l ）   
甲基丙烯酸酯 logP o/w 釀酒酵母 大腸桿菌
MMA 0.95 0.73-1.45 3.19-4.25
iPMA 1.81 0.66-0.99 1.18-1.77
BMA 2.57 0.04-0.07 0.07-0.11
表 1 ：所計算之甲基丙烯酸酯對於生長於複合培養基中之大腸桿菌及釀酒酵母之IC 50值。
亦測定當細胞在MSX培養基中生長時MMA、iPMA及BMA對大腸桿菌之毒性。最終生物質濃度用於計算各酯之抑制濃度（IC 50）（參見表2）。
甲基丙烯酸酯 logP o/w IC 50 範圍（g/l ）
MMA 0.95 3.19-4.25
iPMA 1.81 1.18-1.77
BMA 2.57 0.07-0.11
表 2 ：所計算之甲基丙烯酸酯對生長於MSX培養基中之大腸桿菌之IC 50值。
所測試之所有酯均對大腸桿菌及釀酒酵母二者具有毒性（表1及2）。然而，相比於較短鏈甲基丙烯酸酯，BMA存在時顯示出顯著增強的毒性，由於對微生物展現的毒性使得由醱酵產生此酯很困難。 藉由重組大腸桿菌自2-酮基異戊酸酯產生甲基丙烯酸丁酯
本發明人隨後進行實驗以確定甲基丙烯酸C 3-C 12酯，例如甲基丙烯酸丁酯，是否可藉由微生物（諸如大腸桿菌）產生。
來自阿拉伯芥之ACX4基因針對大腸桿菌經密碼子優化且合成且選殖至pET16b Sse）載體中。此基因經Nhe1/Sse8387I分解且連接在經Xba1/Sse8387I分解之pET16b（Sse）中。將所得質體pMMA121（參見圖1）引入至大腸桿菌BL21(DE3)中，且重組大腸桿菌（BL21(DE3)/pMMA121）如下培養。
將BL（DE3）/pET16b（載體對照）或BL21(DE3)/pMMA121在補充有安比西林（ampicillin）（0.1 mg/ml）之LB培養基中接種且在37℃下在試管中生長隔夜。隔夜培養物之一等分試樣轉移至於燒瓶中之100 ml相同培養基中且在37℃下振盪2至3小時。向燒瓶中添加IPTG（最終1 mM）且將培養物在20℃下在振盪下培育隔夜。
藉由離心收集細胞且懸浮於0.1 M磷酸鈉緩衝液（pH 7.0），隨後藉由音波處理破碎。將破碎的大腸桿菌細胞離心成上清液與顆粒片段，且對含有pMMA121之載體對照及細胞二者分析ACO（醯基-CoA氧化酶）活性（參見圖2）且藉由SDS-PAGE分析ACX4蛋白質之表現（參見圖3）。
圖2顯示，緩衝液中僅存在IBA-CoA，含有僅包含未經改變之質體pET16b之細胞的樣品中存在IBA-CoA及少量CoA，且含有包含質體pMMA121之細胞的樣品中存在MAA-CoA、少得多的IBA-CoA及未知化合物。因此，在BL21(DE3)/pMMA121之上清液部分中偵測到高ACO活性，其藉由甲基丙烯醯基CoA之產生指示，顯示圖3中藉由SDS-PAGE偵測到之40 kDa蛋白質係ACX4蛋白質。SDS-PAGE顯示，色帶1-BL21/pET16b（載體）SF（可溶部分）；色帶2-BL21/pMMA121 SF；色帶3-BL21/pET16b IF（不可溶部分）；色帶4-BL21/pMMA121 IF；及色帶5-分子量標記。僅在BL21/pMMA121色帶中觀測到約40 kDa之譜帶（藉由黑色方框突出顯示）而在BL21/pET16b（載體）色帶未觀測到。
BCKAD複合基因如下選殖於綠膿桿菌PA01菌株。藉由PCR使用引子BCKAD.F與BCKAD.R使用基因體DNA作為模板得到含有編碼BCKAD複合基因之全部基因操縱子的DNA片段。得到的片段用限制酶BspHI及Sse8387I分解且插入至載體pET16b（Sse）中Nco1/Sse8387I之間（pET16b之BamH位點轉化為Sse8387I位點）。將所得質體命名為pWA008（參見圖4）。
用於表現蘋果AAT及阿拉伯芥ACX4之質體構建如下。含有AAT或ACX4基因之DNA片段分別藉由PCT使用引子AAT.F與AAT.R或ACX4.F與ACX4.R使用含有經密碼子優化之AAT基因或pMMA121的質體作為模板來擴增。使用限制酶NcoI及Sse8387I分解pET（Sse）載體且藉由使用In-Fusion HD選殖套組（Takara Bio）將其與含有AAT基因之DNA片段接合。將所得質體pAAT212使用限制酶SpeI分解且藉由使用In-Fusion HD選殖套組將其與含有ACX4基因之DNA片段接合。所得質體pMMA133含有具有T7啟動子控制的AAT及ACX4基因（參見圖4）。
表現BCKAD、AAT及ACX4之質體構建如下。使用限制酶SpeI及Sse83877I分解質體pMMA133，且得到經線性化之DNA片段。使用限制酶XbaI及Sse8387I分解質體pWA008且分離含有BCKAD複合基因之5.0 kb片段。兩片段皆使用DNA連接套組『MightyMix』（由Takara Bio有限公司製造）連接。將所得質體pMMA134（圖4）引入至大腸桿菌BL21(DE3)中用於甲基丙烯酸丁酯產生實驗。
以與上文關於ACX4之表現所描述之基本上相同的方式培養大腸桿菌BL21(DE3)/pMMA134。藉由離心機收集細胞，用0.1 M磷酸鈉緩衝液（pH 7.0）洗滌，且懸浮於相同緩衝液中以得到細胞懸浮液。在含有40 mM2-酮基異戊酸酯（2-側氧基異戊酸酯）、60 mM丁醇、0.05 M磷酸鈉緩衝液（pH 7.0）及細胞（OD 650=12.5）之各瓶中使用細胞懸浮液製備約1 ml靜息細胞反應溶液。在30℃下180 rpm下進行反應3至44小時，且向瓶中添加1 ml乙腈且充分混合至終止反應。在使用針筒過濾器DISMIC/孔直徑0.45微米（由ADVANTEC製造）過濾之後，藉由HPLC在ODS管柱上進行分析。HPLC條件如下：設備：Waters 2695，管柱：CAPCELL PAK C18 UG120，2.0 mml.C.×250 mm，移動相：0.1%磷酸/65%甲醇，流量：0.25毫升/分鐘，運行時間：12分鐘，管柱溫度：35℃及偵測：UB 210 nm。
圖5顯示以下化學物質隨醱酵時間之濃度：■，2-酮基異戊酸酯（2-OIV）；▲，異丁酸（IBA）；♦，甲基丙烯酸丁酯（BMA）；及ˣ，甲基丙烯酸（MAA）。隨著2-酮基異戊酸酯(2-）之原料濃度下降，路徑中之中間體異丁酸之產生增加，正如最終酯產物甲基丙烯酸丁酯之產生。
此實施例展現可行的甲基丙烯酸C 3-C 12酯尤其甲基丙烯酸丁酯之活體內產生，由直接自葡萄糖製備之生化中間體2-酮基異戊酸酯（2-側氧基異戊酸酯）及作為常見工業原料之試劑丁醇。以工業適用含量顯示了甲基丙烯酸丁酯之產生，藉由培養表現BCKAD操縱子之重組大腸桿菌細胞將2-酮基異戊酸酯轉化為異丁醯基CoA、表現ACX4之重組大腸桿菌細胞將異丁醯基CoA轉化為甲基丙烯醯基CoA及表現AAT之重組大腸桿菌細胞將甲基丙烯醯基藉由與丁醇反應轉化為甲基丙烯酸丁酯。 萃取BMA至有機溶劑
按照以上展示藉由重組大腸桿菌自2-酮基異戊酸酯產生甲基丙烯酸丁酯之研究，本發明人進行了重要實驗，研究自醱酵培養基中萃取甲基丙烯酸C 3-C 12酯，例如BMA。
簡言之，生長五個搖瓶培養物，其含有類似於展示藉由重組大腸桿菌自2-酮基異戊酸酯產生甲基丙烯酸丁酯之以上實施例中所使用之大腸桿菌菌株的變異體大腸桿菌菌株。自各燒瓶收集生物質且進行單獨生物轉化。藉由氣相層析火焰離子化偵測器（gas chromatography flame ionization detector ，GC-FID）定量溶劑萃取之後在十二烷中之BMA及MMA含量。
在1 l帶擋板搖瓶中，將含有200 µg/ml安比西林之200 ml LB培養基之起始培養物生長16.33小時。將培養物稀釋在5個含有300 ml新鮮LB培養基之1 l帶擋板搖瓶中至OD 6000.2且使其在30℃且250 rpm下生長23.35小時。隨後藉由在5000 rpm且4℃下離心15分鐘收集生物質。用100 mM磷酸鈉（pH 6.7）洗滌各細胞顆粒且重複離心步驟。在所需體積之生物轉化培養基中再懸浮生物質直至達到OD 600為25。
在5×250 ml密封肖特（Schott）瓶中在30℃且180 rpm下進行生物轉化反應24小時。用於各生物轉化之條件顯示於下表3中。
生物轉化 # 添加的基質 / 外部標準 磷酸鈉緩衝液之濃度（ pH 6.7 ）
1 40 mM 2-酮基異戊酸酯 60 mM 1-丁醇 50 mM
2 0.28 mM BMA（40 mg/l） 100 mM
3 0.40 mM MMA（40 mg/l） 100 mM
4 0.70 mM BMA（100 mg/l） 100 mM
5 1 mM MMA（100 mg/l） 100 mM
表 3 ：生物轉化條件
在5小時及24小時時間點採集樣品用於GC-FID分析。在各時間點時移除5 ml樣品且轉移至15 ml離心（falcon）管中。添加乙腈（5 ml）以及十二烷（1 ml）。將混合物在＞800 rpm下劇烈振盪10分鐘，之後在3900 rpm且20℃下離心20分鐘。自有機相及水相二者採集500 µl樣品，經由0.45 µm過濾器過濾且在注射之前置於旋緊蓋的氣相層析瓶中。
在生物轉化樣品中之BMA及MMA含量之定量藉由使用藉由製備已知濃度下之BMA及MMA之體積儲備溶液獲得的外部標準校正培養物來達成。
萃取實驗之結果顯示於下表4中：
生物轉化 # 取樣時間點 在 t=0 分鐘時添加之 MMA 之量 在 t=0 分鐘時添加之 BMA 之量 觀測到的總 BMA 觀測到的總 MMA 萃取至十二烷中的量 殘留於水相中的量
   h mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l % mg/l %
1 5 - - 138 - 54.1 39.2 83.9 60.8
   24 - - 102.4 - 47.5 46.4 54.9 53.6
2 5 - 40 37.1 - 11.1 29.9 26.0 70
   24 - 40 26.3 - 6.0 22.8 20.3 77.2
3 5 40 - - 41.7 3.2 7.7 38.5 92.3
   24 40 - - 28.9 3.4 11.8 25.5 88.2
4 5 - 100 72.8 - 26.5 36.4 46.3 63.6
   24 - 100 52.3 - 20.3 38.8 32.0 61.2
5 5 100 - - 81.0 7.8 9.6 73.2 90.4
   24 100 - - 49.3 6.4 13.0 42.9 87.0
表 4：MMA及BMA在十二烷中之質量平衡及萃取效率。
本發明人展示，BMA在十二烷中之萃取效率始終高於MMA。舉例而言，生物轉化2與3之比較指示：相比於MMA，BMA之萃取效率高2.7倍，且生物轉化4與5之比較指示：相比於MMA，BMA之萃取效率高3.3倍。在所有樣品中，相比於MMA之10.5%，BMA在十二烷中萃取之平均量約為35.6%。 藉由轉酯化自BMA產生MMA
在本發明之方法中，將經由醱酵得到之BMA轉酯化以產生MMA。本發明人進行實驗確定如何研發出一種能以高反應轉化及選擇性進行的有效轉酯化方法。
轉酯化反應通常利用催化劑來驅動反應。此類催化劑可以係例如酸催化劑、鹼催化劑或生物催化劑。多種均相及非均相催化劑已經用於驅動MMA至較高分子量甲基丙烯酸酯之轉酯化。然而，逆反應尚未被探究。
使用n-BMA、甲醇及一系列催化劑進行多個轉酯化實驗。
在三頸舒倫克（Schlenk）燒瓶中在氮氣惰性氛圍下進行轉酯化實驗。藉由將熱電偶插入反應溶液中測定反應溫度。總體而言，在反應期間採集多個反應樣品。然而，若最終實驗樣品顯示無反應發生則不分析其之前的樣品。
使用丁醇鈦、丁醇鋯、乙醯基丙酮酸鋯、非均相烷基金屬複合物（於矽膠上之銫）、Amberlyst 15-H（磺酸官能化聚苯乙烯樹脂）之BMA至MMA之轉化之水準低（0與20%之間）。然而，使用甲醇鈉、甲醇鋰及氫氧化鋰之轉化之水準高得多，如下概述。 使用 甲醇及甲醇鈉之 n- BMA 之轉酯化
在氮氣下向250 ml三頸舒倫克燒瓶中添加n-BMA（1 mol，142.20 g）、MeOH（1 mol，32.04 g）、4-羥基-TEMPO（0.1 g）及NaOMe（1.01 g，18.7 mmol）。將燒瓶之一個頸塞住，一個頸用矽塞塞住，其用於向反應溶液中插入熱電偶，且第三個頸連接於冷凝器。溫度最初保持在大約20℃一小時，且隨後每小時升高大約10℃，直至在88.2℃達成回流。在各溫度點採集樣品且藉由氣相層析分析。
使用甲醇鈉作為催化劑帶來n-BMA至MMA之優良轉化（約50%；圖6）。 使用 甲醇及氫氧化鋰之 n-BMA 之轉酯化
在氮氣下向250 ml三頸舒倫克燒瓶中添加n-BMA（1 mol，142.20 g）、MeOH（1 mol，32.04 g）、4-羥基-TEMPO（0.1 g）及LiOH（1.01 g，42 mmol）。將燒瓶之一個頸塞住，一個頸用矽塞塞住，其用於向反應溶液中插入熱電偶，且第三個頸連接於冷凝器。溫度最初保持在大約20℃一小時，且隨後每小時升高大約10℃，直至在88.2℃達成回流。在各溫度點採集樣品且藉由氣相層析分析。
使用氫氧化鋰作為催化劑達成n-BMA至MMA之優良轉化（5%與60%之間；圖7）。
隨後進行重複實驗（使用氫氧化鋰作為催化劑）以測定在反應物之回流溫度下之反應速率。
在密封舒倫克燒瓶中將氫氧化鋰（0.51 g，21 mmol）藉由攪拌溶解於甲醇（32.43 g，1 mol）中。在氮氣下向250 ml三頸舒倫克燒瓶添加n-BMA（142.18 g，1 mol）及4-羥基-TEMPO（0.1 g），在一個頸塞住一個加塞且另一個連接於冷凝器的情況下將此混合物加熱至88.2℃。當達到回流且溫度穩定時，藉由注射器向反應瓶添加催化劑（氫氧化鋰）及MeOH溶液。前十分鐘每兩分鐘採集樣品且每五分鐘採集樣品持續一小時。隨後藉由氣相層析分析樣品。如圖8中所示，在加熱四分鐘之後達成n-BMA與MMA之平衡比。 使用 甲醇及甲醇鋰之 n- BMA 之轉酯化
在密封燒瓶中將甲醇鋰（0.79 g，20.9 mmol）藉由攪拌溶解於甲醇（32.04 g，1.00 mol）中。在氮氣氛圍下加熱nBMA（142.20 g，1.00 mol）與4-羥基-TEMPO（0.10 g）之溶液（91℃）。當溫度穩定時，添加催化劑及甲醇溶液且達成回流（88℃）。前十分鐘每兩分鐘採集樣品，且每半小時採集樣品持續一小時。此等樣品經由二氧化矽過濾且藉由氣相層析分析。
在四分鐘之後nBMA至MMA之轉化達成53±3%（圖9）。 對比 LiOH 與 LiOMe 作為催化劑之 nBMA 至 MMA 之轉酯化
亦探究氫氧化鋰及甲醇鋰這兩種鋰催化劑之失活度。此為確定催化劑壽命。
此藉由使用LiOH及LiOMe催化劑進行nBMA與甲醇之轉酯化反應來探究。在回流小時之後，向反應添加另外一莫耳nBMA及一莫耳甲醇，且時間監控向MMA之轉化。
在氮氣氛圍下將nBMA（142.20 g，1.00 mol）、甲醇（32.04 g，1.00 mol）及4-羥基-TEMPO（0.10 g）之溶液用催化劑處理且加熱至回流（87℃）。在回流一小時之後向反應溶液添加另外nBMA（142.20 g，1.00 mol）及甲醇（32.04 g，1.00 mol）。前十分鐘每兩分鐘採集樣品，且每半小時採集樣品持續一小時。此等樣品經由二氧化矽過濾且藉由氣相層析分析。使用LiOH（0.50 g，20.9 mmol）及LiOMe（0.79 g，20.9 mmol）催化劑。
向由LiOH催化之轉酯化反應溶液中添加額外nBMA及甲醇時，未觀測到向MMA之轉化之進一步提高。此表明全部催化劑均被第一轉酯化反應中形成之水去活化，因此當添加新鮮反應物時無法發生進一步反應（圖10）。然而，在LiOMe催化之轉酯化溶液的情況中，當添加更多反應物時向MMA之轉化增加直至達到平衡（圖10）。
此數據表明使用LiOH作為催化劑將需要隨時間推移添加新鮮LiOH以維持反應。然而，LiOMe無需頻繁添加且因此可能更適合於連續反應。LiOH之失活可能由於LiOH向LiMMA之轉化；LiOMe不與甲醇反應就地形成水且因此未迅速失活。 在轉酯化反應中增加之水之量的影響
在本發明之方法中，醱酵反應在水性環境中發生且因此製備之甲基丙烯酸C 3-C 12酯將由水飽和。然而，出乎意料地，水影響轉酯化反應。
對於向nBMA與甲醇之轉酯化反應中添加增加量之水，在轉酯化反應中存在水之後果顯示如下。在回流溫度下進行反應且對向MMA之轉化進行時間監控。水之所有百分比均作為水之莫耳數對於LiOH之莫耳數測定（表5）。
實驗編號 LiOH 質量 (g) 水質量 (g) LiOH 莫耳 (mmol) 水莫耳 (mmol) 對於 LiOH 之 mol % H 2O
1 0.50 0 20.9 0 0
2 0.50 0.13 20.9 7.18 34.09%
3 0.50 0.53 20.9 29.5 140.29%
4 0.50 2.01 20.9 112 522.98%
表5-向轉酯化反應添加水。
在密封燒瓶中將氫氧化鋰（0.50 g，20.9 mmol）藉由攪拌溶解於甲醇（32.04 g，1.00 mol）及水（0.13 g，71.8 mmol）中。在氮氣氛圍下將nBMA與4-羥基-TEMPO（0.10 g）之溶液加熱至90℃。當溫度穩定時，添加LiOH、甲醇及水溶液且觀測到回流溫度86℃。前十分鐘每兩分鐘採集樣品，且隨後在30分鐘後及60分鐘後採集樣品。此等樣品經由矽膠過濾，之後藉由氣相層析分析。用質量0.53 g及2.01 g之水重複此方法。
自結果中顯然可知，在反應中水之增加降低nBMA至MMA之轉化（圖11）。此等結果表示，雖然甲基丙烯酸C 3-C 12酯向MMA之轉化可以在水存在下進行，若水之存在受限則有利於提高轉化。因此，在開始轉酯化反應之前自水性環境中移除本發明之甲基丙烯酸C 3-C 12酯可能有利。 生物轉化
使用不同醇在經修飾之用於產生甲基丙烯酸酯之新的大腸桿菌菌株上進行生物轉化實驗以比較生物轉化。
在帶擋板搖瓶中在LB-Miller （Merck）加安比西林（200 µg/ml）中在30℃且250 rpm下生長細胞隔夜。
將所得培養物離心且用0.1 M磷酸鈉緩衝液（pH 7）再懸浮顆粒至OD為50。將此再懸浮培養物之等分試樣（15 mL）置於250 mL肖特瓶中且添加15 mL 80 mM KIV（酮基異戊酸酯）儲備溶液。此提供總體OD為25且在30 mL體積中最終濃度為40 mM KIV及0.05 M磷酸鈉緩衝液。無摻雜地添加各醇至最終濃度為5 mM。在肖特瓶中30℃且250 rpm下進行生物轉化培育。
在培育3.5小時之後採集樣品用於GC-MS分析以測定甲基丙烯酸烷酯含量。
藉由採集生物轉化培養液之0.5 mL樣品添加0.5 mL庚烷且將混合物渦流連續5分鐘來進行取樣。隨後藉由微離心分離各相（14,800 rpm，5分鐘）。採集所得庚烷萃取物之0.2 mL樣品且置於GC瓶（含有0.25 mL瓶插入物）中且旋緊。隨後使用帶有Agilent 5973質量選擇性偵測器（單一四極）之Agilent 6890系列GC對樣品進行GC-MS。使用30 m管柱、250 μm內部直徑及0.25 μm膜厚度之ZB-WAXPlus使用氦氣載氣進行分析物分離。特定GC細節在表6中給出且結果闡述在表7中。 表6
GC 參數   
管柱類型 ZB-WAXPlus TM
管柱長度 30 metres
內部直徑 0.25 mm
膜厚度 0.25 µm
載氣 Helium
流速 1 mL min -1
注射類型 分離
分離比 50:1
注射體積 1 µL
入口溫度 250℃
壓力 12.3 psi
表7 在3.5 小時下使用各種醇之生物轉化 甲基丙烯酸烷酯濃度
   3.5小時
甲醇 0.117 mM
丁醇 1.031 mM
戊醇 2.122 mM
己醇 0.756 mM
庚醇 1.460 mM
辛醇 0.665 mM
結論
此等研究表示，使用第I族及第II族鹼性金屬鹽作為催化劑甲基丙烯酸C 3-C 12酯（尤其n-BMA）可經轉酯化特別高效地產生MMA，且不存在水帶來更高轉化效率。此外，已顯示高碳數酯之產生以比甲基丙烯酸甲酯之產生更快的速率進行。
本說明書中所揭示之所有特徵（包括任何隨附申請專利範圍、摘要及圖式）及/或如此揭示之任何方法之所有步驟可以任何組合形式組合，此類特徵及/或步驟中之至少一些相互排斥的組合除外。
除非另外明確說明，否則本說明書（包括任何隨附申請專利範圍、摘要及圖式）中所揭示之各特徵可經達成相同、等效或類似目的之替代特徵置換。因此，除非另外明確說明，否則所揭示之各特徵僅為一系列通用等效或類似特徵之一個實例。
本發明不限於任何前述具體實例之細節。本發明延伸至本說明書（包括任何隨附申請專利範圍、摘要及圖式）中所揭示之特徵之任何新穎特徵或任何新穎組合或延伸至如此揭示之任何方法之步驟的任何新穎步驟或任何新穎組合。
此外，應瞭解，可在不背離如所附申請專利範圍中所界定之本發明之範圍的情況下對上述方法作出多種修改。
無
本發明現將參照以下圖式進一步描述，其顯示：
[ 圖 1] ：用於在大腸桿菌中表現阿拉伯芥ACX4蛋白質之質體pMMA121之結構。
[ 圖 2] ：使用自重組大腸桿菌產生之阿拉伯芥ACX4蛋白質由異丁醯基-CoA產生甲基丙烯醯基-CoA。
[ 圖 3] ：含有阿拉伯芥ACX4蛋白質之重組大腸桿菌之片段的SDS-PAGE分析。
[ 圖 4] ：在重組大腸桿菌中，用於表現蘋果AAT（MpAAT1）、來自阿拉伯芥之ACX4及來自綠膿桿菌PA01菌株之BCKAD複合基因bkdA1、bkdA2、bkdB及IpdV的質體pWA008、pMMA133及pMMA134的結構。
[ 圖 5] ：由2-酮基異戊酸酯及丁醇產生甲基丙烯酸丁酯，藉由產生表現質體pMMA134之重組大腸桿菌之培養物之樣品的HPLC分析。■，2-酮基異戊酸酯（2-OIV）；▲，異丁酸（IBA）；♦，甲基丙烯酸丁酯（BMA）；及ˣ，甲基丙烯酸（MAA）。
[ 圖 6] ：使用甲醇鈉作為催化劑，n-BMA向MMA之轉化與反應溫度之關係。
[ 圖 7] ：使用氫氧化鋰作為催化劑，n-BMA向MMA之轉化與反應溫度之關係。
[ 圖 8] ：使用氫氧化鋰作為催化劑，在某一反應溫度下n-BMA向MMA之轉化與時間之關係。
[ 圖 9] ：在由甲醇鋰催化之反應中，nBMA向MMA之轉化隨時間之變化。
[ 圖 10] ：當在由LiOH及LiOMe催化之初始轉酯化反應之後進一步添加甲醇及nBMA時，nBMA之轉酯化反應向MMA之轉化相對於時間之曲線。
[ 圖 11] ：具有增加的含水量的nBMA之轉酯化向MMA之轉化相對於時間之曲線。 
                         
          <![CDATA[<110>  英商三菱化學英國有限公司（Mitsubishi Chemical UK Limited）]]>
          <![CDATA[<120>  產生甲基丙烯酸甲酯的方法]]>
          <![CDATA[<140>  ]]>
          <![CDATA[<141>  ]]>
          <![CDATA[<150>  GB1619827.7]]>
          <![CDATA[<151>  2016-11-23]]>
          <![CDATA[<160>  6     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn第3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
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          caccagccag taagctagca aggagatata ccatggctg                              39
          <![CDATA[<210>  6]]>
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          tcccctgcag gactagttta caggcgagaa cgggtag                                37
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (36)

  1. 一種用於產生甲基丙烯酸甲酯（MMA）之方法，該方法包含以下步驟： a）       在醱酵培養基中，在微生物將產生甲基丙烯酸C 3-C 12酯之條件下提供該微生物； b）      提供與該醱酵培養基接觸之有機相，該有機相包括比該醱酵培養基中之甲基丙烯酸C 3-C 12酯濃度更高之濃度的甲基丙烯酸C 3-C 12酯； c）       移除含有該甲基丙烯酸C 3-C 12酯之有機相使其不再接觸該醱酵培養基；及 d）      將所移除之甲基丙烯酸C 3-C 12酯用甲醇轉酯化以產生甲基丙烯酸甲酯，其視情況在與該有機相分離之後； 其中所述微生物表現醯基CoA氧化酶。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該醯基CoA氧化酶係來自阿拉伯芥（ Arabidopsis thaliana）之ACX4。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該甲基丙烯酸C 3-C 12酯係選自C 3-C 12烷基、羥基烷基、烯基、烷芳基或烯基芳基甲基丙烯酸酯。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該甲基丙烯酸C 3-C 12酯係選自甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸異丙酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸第三丁酯、甲基丙烯酸異戊酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸環己酯、甲基丙烯酸庚酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸十二酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸異莰酯、甲基丙烯酸烯丙酯或甲基丙烯酸苯烯丙酯。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該甲基丙烯酸C 3-C 12酯係甲基丙烯酸丁酯。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該微生物包含：大腸桿菌（ E. coli）、麩胺酸棒狀桿菌（ Corynebacterium glutamicum）、螢光假單胞菌（ Pseudomonas fluorescens）或惡臭假單胞菌（ Pseudomonas putida）。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該微生物是大腸桿菌。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該微生物經基因修飾以產生相比於野生型更多的甲基丙烯酸C 3-C 12酯。
  9. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該微生物表現一或多種通常在適合的C 3-C 12醇存在下，能將甲基丙烯醯基-CoA轉化為甲基丙烯酸C 3-C 12酯之酶。
  10. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該微生物表現一或多種通常在適合的C 3-C 8醇存在下，能將甲基丙烯醯基-CoA轉化為甲基丙烯酸C 3-C 8酯之酶。
  11. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該微生物表現醯基CoA氧化酶及醇醯基轉移酶。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該醯基CoA氧化酶係來自阿拉伯芥（ Arabidopsis thaliana）之ACX4。
  13. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該微生物表現一或多種能將2-酮基異戊酸轉化為異丁醯基-CoA之酶。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該酶包含分支鏈酮酸去氫酶複合物或氧化還原酶。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該分支鏈酮酸去氫酶複合物包含：來自惡臭假單胞菌之分支鏈酮酸去氫酶（BCKD）、來自枯草桿菌（ Bacillus subtilis）之BCKD、來自銅綠假單胞菌（ P. aeuruginosa）之BCKD、來自阿拉伯芥之BCKD、來自天藍色鏈黴菌（ Streptomyces coelicolor）之BCKD或來自嗜熱棲熱菌（ Thermus thermophiles）之BCKD。
  16. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中碳類原料（carbon-based feedstock）存在於該發酵培養基中，且其中該碳類原料包含C5或C6糖之來源的碳水化合物。
  17. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟d）之轉酯化在甲醇及催化劑存在下發生。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係鹼性催化劑。
  19. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係選自金屬氧化物、氫氧化物、碳酸鹽、乙酸鹽（醋酸鹽）、草酸鹽、醇鹽、碳酸氫鹽、以上中之一者之四級銨化合物、烷基或苯基胺、二氮雜雙環十一烯及二氮雜雙環壬烷。
  20. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係選自以下中之一或多個：LiOH、NaOH、KOH、Mg(OH) 2、Ca(OH) 2、Ba(OH) 2、CsOH、Sr(OH) 2、RbOH、NH 4OH、Li 2CO 3、Na 2CO 3、K 2CO 3、Rb 2CO 3、Cs 2CO 3、MgCO 3、CaCO 3、SrCO 3、BaCO 3、(NH 4) 2CO 3、LiHCO 3、NaHCO 3、KHCO 3、RbHCO 3、CsHCO 3、Mg(HCO 3) 2、Ca(HCO 3) 2、Sr(HCO 3) 2、Ba(HCO 3) 2、NH 4HCO 3、Li 2O、Na 2O、K 2O、Rb 2O、Cs 2O、MgO、CaO、SrO、BaO、Li(OR 1)、Na(OR 1)、K(OR 1)、Rb(OR 1)、Cs(OR 1)、Mg(OR 1) 2、Ca(OR 1) 2、Sr(OR 1) 2、Ba(OR 1) 2、NH4(OR 1)，其中R 1係視情況經一或多個官能基取代之任何C1至C6分支鏈、非分支鏈或環狀烷基；NH 4(R 2CO 2)、Li(R 2CO 2)、Na(R 2CO 2)、K(R 2CO 2)、Rb(R 2CO 2)、Cs(R 2CO 2)、Mg(R 2CO 2) 2、Ca(R 2CO 2) 2、Sr(R 2CO 2) 2或Ba(R 2CO 2) 2，其中R 2CO 2係乙酸根；(NH 4) 2(CO 2R 3CO 2)、Li 2(CO 2R 3CO 2)、Na 2(CO 2R 3CO 2)、K 2(CO 2R 3CO 2)、Rb 2(CO 2R 3CO 2)、Cs 2(CO 2R 3CO 2)、Mg(CO 2R 3CO 2)、Ca(CO 2R 3CO 2)、Sr(CO 2R 3CO 2)、Ba(CO 2R 3CO 2)、(NH 4) 2(CO 2R 3CO 2)，其中CO 2R 3CO 2係草酸根；甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、環己胺、苯胺；R 4NOH，其中R係甲基、乙基丙基、丁基；二氮雜雙環十一烯及二氮雜雙環壬烷。
  21. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係選自第I族或第II族金屬鹽。
  22. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係選自第I族或第II族金屬氧化物、氫氧化物、碳酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、醇鹽及碳酸氫鹽。
  23. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係第I族金屬鹽。
  24. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係第I族甲醇鹽。
  25. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係均相催化劑。
  26. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該催化劑係選自由以下組成之群：甲醇鈉、甲醇鋰、甲醇鉀、氫氧化鈉、氫氧化鋰、氫氧化鉀及其混合物。
  27. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟d）之轉酯化在對於該催化劑而言mol%水小於或等於50%之條件下發生。
  28. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟d）之轉酯化之前進行乾燥該有機相之步驟，其視情況藉由蒸餾。
  29. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟d）之轉酯化在無水存在下發生。
  30. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在該醱酵培養基中甲基丙烯酸C 3-C 12酯之滴定量係大約220 mg/l。
  31. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟b）中提供之該有機相係藉由由該微生物產生之甲基丙烯酸C 3-C 12酯提供。
  32. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟b）中提供之該有機相包含與該醱酵培養基接觸之外部有機溶劑。
  33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該有機溶劑係生物相容的。
  34. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該有機溶劑之logP o/w值大於或等於3.0。
  35. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該溶劑係選自由以下組成之群：甘油三丁酸酯、異丙基苯、正丙基苯、環庚烷、己烷、庚烷、環辛烷、異辛烷、1,4-二異丙基苯、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷及其混合物。
  36. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該方法進一步包含純化該有機相中之甲基丙烯酸C 3-C 12酯。
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