TW202231871A - 莫匹羅星的發酵方法 - Google Patents

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寇廣會
許一鳴
胡煒杰
張宇辰
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Abstract

本發明公開一種莫匹羅星的發酵方法，包括搖瓶種子培養、種子罐培養、發酵培養、補料培養。本發明的發酵方法既適用於工業化放量生產，同時也提高了莫匹羅星的發酵效價，可穩定保持在8000ug/ml以上。

Description

莫匹羅星的發酵方法
本發明屬醫藥技術領域，更進一步的屬發酵技術領域，具體涉及一種莫匹羅星的發酵方法，包括種子培養、發酵培養、補料培養等。
莫匹羅星，即假單胞菌酸A，是一種氨基醯轉氨酶抑制劑類抗生素，能特異性地結合到細菌的異亮氨酸轉移RNA合成酶，從而抑制細菌中含異亮氨酸蛋白質的合成。其能夠對抗各種革蘭氏陽性菌，包括金黃色葡萄球菌、釀胺鏈球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌等；也能夠對抗一些革蘭氏陰性菌，包括流感嗜血桿菌等。莫匹羅星與其他抗生素無交叉耐藥性，具有較高的醫療價值，早已被臨床應用，其商品名為百多邦或莫匹羅星軟膏。
專利WO2000046389公開了製備假單胞菌酸A的方法，包括在有機氮源或碳源的培養基上培養能夠生物合成假單胞菌酸A的假單胞菌算株並完成培養，此方法涉及的培養基成分複雜且效價不穩定。專利CN201410083050.0公開了假單胞菌酸A的製備方法及一系列培養及發酵條件，此方法的步驟繁複且效價不穩定，不確定能否投入實際應用。專利CN201810896368.9公開了一種莫匹羅星的發酵培養基，該培養基附加使用了生產促進劑，但其效價不佳，不適用於大規模生產的情況。
莫匹羅星的發酵方法因工藝控制條件苛刻、環境需求及商業或生態角度上都存在難以令人滿意方面。因此，仍然需要適用於工業化大規模生產且環境友好、成本可控的的莫匹羅星的發酵新方法。
莫匹羅星是一種由熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）發酵生產的假單胞菌酸A（Pseudomonas A）。現有的莫匹羅星的發酵方法不穩定且發酵效價較低，不能滿足工業化放量生產的現狀，本發明提供一種適用於工業化大規模生產的莫匹羅星發酵方法，包括搖瓶種子培養、種子罐培養、發酵培養和補料培養。
本發明提供的發酵方法適合大規模放量生產，且對環境友好。採用本發明提供的方法發酵的莫匹羅星的效價穩定可達8000ug/ml以上。
一種莫匹羅星的發酵培養基，包括以下組分：
發酵培養基組分 質量體積比（W/V）
碳源 5~12%
氮源 2~10%
無機鹽 0.1~1.5%
消泡劑 0.1~0.5%
所述發酵培養基的pH值為6.0~7.5。
發酵培養基按上述工藝配方進行配料，發酵罐內加水，邊攪拌邊投入原料；
所述的發酵投料後的體積可為0~20000L；
所述的發酵罐培養的時間為48~144小時，優選為80~132小時；
所述的發酵罐溫度為10~37℃，優選為20~30℃。
發酵培養24小時開始補料，補料後若pH上升則適當增加補糖量，若pH平穩則維持或適當減少補糖量；
補料配方如下：
補料組分 質量體積比（W/V）
碳源 25~60%
氮源 1~10%
無機鹽 0.10~0.5%
消泡劑 0.1~0.5%
所述的補料後pH為5.0~6.5。
作為一種具體的實施方式，所述的碳源包括但不限於：葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、糊精、蛋白腖、麥麩、豆餅粉、玉米澱粉、黃豆粉、馬鈴薯粉、木薯澱粉、玉米漿、酵母粉、甘露醇等。
作為一種具體的實施方式，所述的氮源包括但不限於：氨水、尿素、銨鹽、硝酸鹽、蛋白腖、麥麩、玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、酵母粉等。
作為一種具體的實施方式，所述的無機鹽包括但不限於：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物等。
本發明還提供一種莫匹羅星的發酵方法，包括以下步驟：
1.搖瓶種子培養：包括搖瓶種子的配置、分裝、滅菌、接種和培養，得到搖瓶種子菌液；
2.種子罐培養：包括種子培養的配料、滅菌、接種和培養，得到種子菌液；
3.發酵培養：包括發酵培養基的配料、滅菌、接種和培養，得到莫匹羅星發酵液；
4.補料培養：包括補料培養的配料、滅菌和培養，得到莫匹羅星發酵液；
5.放罐。
其中，搖瓶種子培養其培養配方如下：
搖瓶種子培養組分 質量體積比（W/V）
碳源 1~5%
氮源 0.5~1.5%
無機鹽 0.1~0.5%
消泡劑 0.02~0.1%
所述搖瓶種子培養的pH為6.0~7.5；
所述搖瓶種子培養的溫度為20~30℃；
所述搖瓶種子的培養時間為18~30小時，優選為20~24小時。
其中，搖瓶種子的接種量為0.1~10%接入種子罐。
其中，種子罐培養的培養配方如下：
種子罐培養組分 質量體積比（W/V）
碳源 1~5%
氮源 0.5~1.5%
無機鹽 0.1~0.5%
消泡劑 0.01~0.1%
所述種子罐培養的pH為6.0~7.5；
所述種子罐培養的溫度為20~30℃；
所述種子罐培養的培養時間為12~36小時，優選為18~24小時。
其中，培養配方中所述的碳源包括但不限於：葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、糊精、蛋白腖、麥麩、豆餅粉、玉米澱粉、黃豆粉、馬鈴薯粉、木薯澱粉、玉米漿、酵母粉、甘露醇等。
其中，培養配方中所述的氮源包括但不限於：氨水、尿素、銨鹽、硝酸鹽、蛋白腖、麥麩、玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、酵母粉等。
其中，培養配方中所述的無機鹽包括但不限於：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物等。
作為一種具體的實施方式，本發明的發酵培養基的配方如下：
發酵培養基組分 質量體積比（W/V）
葡萄糖 4.0~10.0%；
豆餅粉 1.5~3.0%；
麥麩 0.5~2.5%；
尿素 0.1~0.2%；
甘油 1.0~2.0%；
硫酸銨 0.01~1.0%；
磷酸二氫鉀 0.01~0.25%；
硫酸鎂 0.01~0.25%；
氯化鉀 0.01~0.25%；
硫酸鋅 0.01~0.25%；
泡敵 0.1~0.5%。
作為一種具體的實施方式，發酵培養的方式為，按配比取各組分進行配料，發酵罐內加入水，邊攪拌邊加入原料，用氫氧化鈉調節pH至6.8~7.5；依次進行實罐滅菌和管道滅菌後，用無菌空氣把種子液壓入發酵罐。
作為一種具體的實施方式，本發明的補料培養配方如下：
補料組分 質量體積比（W/V）
葡萄糖 25~60%；
豆餅粉 1~5%；
麥麩 1~5%；
甘油 0.1~1.0%；
磷酸二氫鉀 0.01~0.1%；
硫酸鎂 0.01~0.1%；
硫酸鋅 0.01~0.1%；
泡敵 0.1~0.5%。
作為一種具體的實施方式，補料培養的方式為，按配比取各組分進行配料，在依次進行實罐滅菌和管道滅菌後進行移種；移種後適時監測pH和葡萄糖含量。
作為一種具體的實施方式，本發明的搖瓶種子配方如下：
搖瓶種子組分 質量體積比（W/V）
葡萄糖 0.5~5%；
麥麩 0.2~1.0%；
甘油 0.2~1.0%；
硫酸銨 0.1~0.5%；
硫酸鎂 0.01~0.1%；
磷酸二氫鉀 0.01~0.1%；
泡敵 0.01~0.1%。
作為一種具體的實施方式，搖瓶種子的培養方法為，按配比取各配方組分，加入適量水，攪拌均勻，用氫氧化鈉溶液調節pH至6.8~7.5，滅菌後取斜面，用無菌水洗，以0.1~10.0%的接種量接入種子搖瓶，其中，種子搖瓶的培養溫度為20~30℃，培養時間為12~48小時。
作為一種具體的實施方式，本發明的種子罐培養配方如下：
種子罐培養組分 質量體積比（W/V）
葡萄糖 0.5~5%；
麥麩 0.2~1.0%；
甘油 0.2~1.0%；
硫酸銨 0.1~0.5%；
硫酸鎂 0.01~0.1%；
磷酸二氫鉀 0.01~0.1%；
泡敵 0.1~0.5%。
作為一種具體的實施方式，種子罐的培養方法為，按配比取各配方組分，種子罐內加入水，在攪拌下投入組分，用氫氧化鈉調節pH至6.8~7.5，滅菌後將搖瓶種子液接入種子罐，接種時罐溫為20~30℃，培養時間為12~48小時，培養的pH為6.8~7.5。
作為一種具體的實施方式，在發酵培養和/或補料培養80~132小時後，開始放罐，放罐效價大於等於8000ng/ml，並在放罐之前停止pH和葡萄糖的監測和控制，將發酵液轉移至預處理罐，用於下一步提取和/或純化。
作為一種具體的實施方式，發酵結束放罐時的pH大於6.0，葡萄糖含量的質量體積比為0.5~6%。
作為一種具體的實施方式，搖瓶種子接入種子罐時，葡萄糖含量的質量體積比為0.1~5%，優選為0.5~1.5%；搖瓶種子接入種子罐時pH為6.0~7.0。
作為一種具體的實施方式，種子液壓入發酵罐時，接種量為1.0~8.0%，優選為2.5~5%。
作為一種具體的實施方式，種子液壓入發酵罐前，pH為6.0~6.5；發酵培養基的葡萄糖含量的質量體積比為3.0~7.0，優選為4.0~6.5%。
作為一種具體的實施方式，所述的搖瓶種子培養的方法為，稱取各原料，以重量體積比計為，葡萄糖1.0%、麥麩0.5%、甘油0.5%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸銨0.2%、泡敵0.05%，餘量加入飲用水後攪拌均勻，用氫氧化鈉溶液調節pH至6.8~7.5，滅菌後取斜面，用無菌水洗，以0.1~10.0%的接種量接入種子搖瓶，種子搖瓶的培養溫度20~30℃，振盪培養12~48小時。
作為一種具體的實施方式，所述的種子罐培養的方法為稱取各原料，以重量體積比計為，葡萄糖1.0%、麥麩0.5%、甘油0.5%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸銨0.2%、泡敵0.05%；種子罐內加入水，邊攪拌邊投入原料，用氫氧化鈉調節pH至6.8~7.5，於罐溫90~150℃下滅菌；接種前檢測種子罐培養基中葡萄糖含量為0.5~1.5%且培養基pH為6.0~7.0，將搖瓶種子液接入種子罐，罐溫20~30℃，培養12~36小時，pH控制為6.5~7.5；在顯微鏡下觀察細胞形態為杆狀、菌量多、染色深、無雜菌。
作為一種具體的實施方式，所述的發酵培養的方法為，稱取各原料，以重量體積比計為，葡萄糖5.0~6.0%、豆餅粉2.0%、麥麩1.5%、甘油1.5%、尿素0.15%、硫酸銨0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.06%、氯化鉀0.12%、硫酸鋅0.2%、泡敵0.3%；發酵罐內加入水，邊攪拌邊投入原料，用氫氧化鈉調節pH至6.8~7.5，於罐溫90~150℃下滅菌，保溫保壓0.5~1小時；接種前檢測發酵罐培養基中葡萄糖含量為4.0~6.5%且培養基pH為6.0~7.0，用無菌空氣把種子液壓入發酵罐，接種量為1.0~8.0%，罐溫20~30℃，發酵代謝過程中的發酵液pH和葡萄糖含量為主要控制參數。
作為一種具體的實施方式，所述的補料培養的方法為，發酵培養開始後定時取樣檢測葡萄糖含量和pH，當葡萄糖含量低於1.0%時開始補料；補料中葡萄糖的配置比例為葡萄糖30~50%、麥麩1~5%、豆餅粉1~5%、甘油0.5%、硫酸鎂0.06%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鋅0.05%、泡敵0.3%；於罐溫90~150℃下滅菌；反復檢測並控制罐內葡萄糖含量和pH，當葡萄糖含量低於1.0%時開始補料，補料後pH控制在5.0~6.0且葡萄糖控制在1.0~1.5%。
作為一種具體的實施方式，所述的放罐的方法為，發酵培養80~128小時，放罐效價大於等於8000ug/ml，在放罐之前停止pH和葡萄糖的檢測和控制；當pH至6.0以上且葡萄糖含量小於0.5%時發酵結束，將發酵液轉移至預處理罐，準備進入發酵液的提取和純化步驟。
本發明提供的莫匹羅星發酵方法，包括以下步驟：
1.搖瓶種子培養：稱取各原料，以重量體積比計為，葡萄糖1.0%、麥麩0.5%、甘油0.5%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸銨0.2%、泡敵0.05%，餘量加入飲用水後攪拌均勻，用氫氧化鈉溶液調節pH至6.8~7.5，置於90~150℃下滅菌0.5~1小時，後取斜面，用無菌水洗，以0.1~10.0%的接種量接入種子搖瓶，種子搖瓶的培養溫度20~30℃，振盪培養12~48小時；
2.種子罐培養：稱取各原料，以重量體積比計為，葡萄糖1.0%、麥麩0.5%、甘油0.5%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸銨0.2%、泡敵0.05%；種子罐內加入水，邊攪拌邊投入原料，用氫氧化鈉調節pH至6.8~7.5，於罐溫90~150℃下滅菌，保溫保壓0.5~1小時；接種前檢測種子罐培養基中葡萄糖含量為0.5~1.5%且培養基pH為6.0~7.0，將搖瓶種子液接入種子罐，罐溫20~30℃，培養12~36小時，pH控制為6.5~7.5；在顯微鏡下觀察細胞形態為杆狀、菌量多、染色深、無雜菌；
3.發酵培養：稱取各原料，以重量體積比計為，葡萄糖5.0~6.0%、豆餅粉2.0%、麥麩1.5%、甘油1.5%、尿素0.15%、硫酸銨0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.06%、氯化鉀0.12%、硫酸鋅0.2%、泡敵0.3%；發酵罐內加入水，邊攪拌邊投入原料，用氫氧化鈉調節pH至6.8~7.5，於罐溫90~150℃下滅菌，保溫保壓0.5~1小時；接種前檢測發酵罐培養基中葡萄糖含量為4.0~6.5%且培養基pH為6.0~7.0，用無菌空氣把種子液壓入發酵罐，接種量為1.0~8.0%；發酵罐於罐溫20~30℃培養，發酵代謝過程中的發酵液pH和葡萄糖含量為主要控制參數；
4.補料培養：發酵培養開始後定時取樣檢測葡萄糖含量和pH，當葡萄糖含量低於1.5%時開始補料；補料中葡萄糖的配置比例為葡萄糖30~50%、麥麩1~5%、豆餅粉1~5%、甘油0.5%、硫酸鎂0.06%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鋅0.05%、泡敵0.3%；於罐溫90~150℃下滅菌，保溫保壓0.5~1小時，滅菌後降溫至25~40℃保溫；反復檢測並控制罐內葡萄糖含量和pH，當葡萄糖含量低於1.0%時開始補料，補料後pH控制在5.0~6.0且葡萄糖控制在1.0~1.5%；
5.放罐：發酵培養80~132小時後，放罐效價大於等於8000ug/ml，在放罐之前停止pH和葡萄糖的檢測和控制；當pH至6.0以上且葡萄糖含量小於0.5%時發酵結束，將發酵液轉移至預處理罐，準備進入發酵液的提取和純化步驟。
莫匹羅星發酵工藝的現有技術中，有補料分批發酵的生產方式，在發酵培養過程中持續向發酵體系中補入葡萄糖以供給菌體分裂傳代、生長產抗階段的碳源支持。本發明提供的莫匹羅星發酵工藝，在微生物培養過程中，補入由發酵培養基為基礎的，包含速效碳源葡萄糖、綜合性碳源甘油、綜合性碳源氮源豆餅粉和麥麩、無機鹽磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鋅及消泡劑泡敵的混合補料。即，在補料分批發酵中，將單一碳源補料轉變為以培養基比例為基礎的混合補料，適當延長發酵時間，達到發酵效價的提升。
本發明的有益效果為：
1.本發明提供的莫匹羅星發酵方法，既適用於小試級別的實驗，也適用於千升級別的工業化生產，本工藝發酵效價平均水平可達8000ug/ml以上，且質量符合USP41和EP9.0標準。
2.本發明相較於現有技術，通過改進發酵培養過程中的補料配方，用以發酵培養基培養為基礎調整的混合補料代替基礎的補糖方法，配合發酵週期的相應調整，提高了菌體在發酵過程中傳代和代謝的能力，並延長產效價的時間，提高了發酵的最終產出。
下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。以下實施例用於理解本發明的方法和核心思想，對於本領域的技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，進行任何可能的變化或替換，均屬本發明的保護範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件；未注明來源的原料和試劑，通常為通過商業途徑可購得的常規試劑。
菌種保存方法 菌種以甘油管和斜面兩種形式保藏。
實施例1 搖瓶種子的製備（菌種培養）
配方（W/V） ：葡萄糖 1.0% ；麥麩 0.5%；硫酸鎂 0.05% ；磷酸二氫鉀 0.05% ；硫酸銨 0.2% ；泡敵 0.05%；甘油 0.5%。
配製、分裝、滅菌：按其配比所需稱取各原料，加飲用水400ml，攪拌均勻，用氫氧化鈉溶液調pH至7.0，定容至500ml，後裝於3000ml三角瓶中，121℃滅菌30min。
接種、培養：取斜面，用無菌水洗下，以0.1~10.0%的接種量接入種子搖瓶。種子搖瓶培養溫度20~30℃，振盪培養24h。
鏡檢搖瓶種子要求：菌體杆狀、菌量多、染色深、無雜菌。
實施例2 種子罐的製備（種子培養）
種子罐培養基配方（W/V）：葡萄糖 1.0% ；麥麩 0.5%；硫酸鎂 0.05% ；磷酸二氫鉀 0.05% ；硫酸銨 0.2% ；泡敵 0.05%；甘油 0.5%。
按上述工藝配方進行配料,種子罐內加水，邊攪拌邊投入原料，用6N氫氧化鈉溶液調節pH至7.0。
進汽實罐滅菌，罐溫120℃，罐壓0.09~0.12MPa，保溫保壓30min。
把經上一步驟製備的搖瓶種子液接入種子罐。接前檢測滅菌後種子罐培養基要求為，葡萄糖：0.5~1.5%，pH 6.0~7.0。種液於罐壓0.04~0.05MPa，罐溫20~30℃，pH控制為6.5~7.5。顯微鏡下觀察細胞形態：杆狀、菌量多、染色深、無雜菌。
實施例3 發酵罐的製備（發酵培養）
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0% ；豆餅粉2.0% ；麥麩1.5% ；尿素 0.15%；硫酸銨0.5% ；磷酸二氫鉀0.10% ；硫酸鎂0.06% ；氯化鉀0.12% ；硫酸鋅0.2% ；甘油1.5% ；泡敵0.3 %。
按上述工藝配方進行配料，發酵罐內加水，邊攪拌邊投入原料，用固體氫氧化鈉調節pH至6.5~7.0。
進汽實罐滅菌，罐溫120℃，罐壓0.09~0.12MPa，保溫保壓30min；進行管道滅菌，滅菌時間60min。用無菌空氣把種子液壓入發酵罐（接種量為1.0~8.0%），接種前檢查並記錄種子情況。接種前檢測滅菌後發酵罐培養基，要求：葡萄糖4.0~6.5%，pH 6.0~6.5。
發酵液于罐溫20~30℃，罐壓0.04~0.05MPa，發酵代謝過程中的發酵液pH和葡萄糖含量為主要控制參數。
實施例4 補料的製備（補料培養）
補料中葡萄糖配製比例為葡萄糖30~50%；麥麩2.0%；豆餅粉2.0%；甘油0.5%；硫酸鎂0.06%；磷酸二氫鉀0.05%；硫酸鋅0.05%；泡敵0.3%。
進汽實罐滅菌，罐溫120℃，罐壓0.09~0.12MPa，保溫保壓30min，滅菌後降溫至30~40℃保溫。後進行補糖管道滅菌，滅菌時間60min。
發酵培養開始後定時取樣檢測葡萄糖和pH，當葡萄糖低於1.0%時開始補糖，補糖後pH控制到5.0~6.0，葡萄糖控制在1.5%以下；保持定時取樣檢測葡萄糖和pH。
實施例5 發酵罐與補料配方中碳源與氮源的考察
實驗設計：
本次實驗意在篩選發酵培養與補料培養物料配方中碳源和氮源的選擇。
本實驗主要篩選的碳源、氮源及複合碳氮源有：糊精、蛋白腖、麥麩、豆餅粉、生豆粉、玉米漿、酵母粉、尿素，等。
下述每個篩選的實驗方案，除發酵罐與補料配方中的碳源氮源的組分與比例外，其餘方案均與實施例1~4相同。
實驗方案：
實驗1
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0%，酵母粉2.0%，麥麩1.5%，尿素 0.15%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3 %；
補料配方（W/V）：葡萄糖30~50%，硫酸鋅0.05%，硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.05%，甘油0.5%，酵母粉1.5%，麥麩1.5%，泡敵0.3%。
實驗2
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0%，豆餅粉2.0%，麥麩1.5%，尿素 0.15%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3 %；
補料配方（W/V）：葡萄糖30~50%，硫酸鋅0.05%，硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.05%，甘油0.5%，豆餅粉1.5%，麥麩1.5%，泡敵0.3%。
實驗3
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0%，蛋白腖2.0%，麥麩1.5%，尿素 0.15%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3 %；
補料配方（W/V）：葡萄糖30~50%，硫酸鋅0.05%，硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.05%，甘油0.5%，蛋白腖1.5%，麥麩1.5%，泡敵0.3%。
實驗4
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0%，生豆粉2.0%，麥麩1.5%，尿素 0.15%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3 %；
補料配方（W/V）：葡萄糖30~50%，硫酸鋅0.05%，硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.05%，甘油0.5%，生豆粉1.5%，麥麩1.5%，泡敵0.3%。
實驗5
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0%，豆餅粉2.0%，糊精1.5%，尿素 0.15%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3 %；
補料配方（W/V）：葡萄糖30~50%，硫酸鋅0.05%，硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.05%，甘油0.5%，豆餅粉1.5%，糊精1.5%，泡敵0.3%。
實驗6
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0%，豆餅粉2.0%，玉米漿1.5%，尿素 0.15%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3 %；
補料配方（W/V）：葡萄糖30~50%，硫酸鋅0.05%，硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.05%，甘油0.5%，豆餅粉1.5%，玉米漿1.5%，泡敵0.3%。
實驗7
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0%，豆餅粉2.0%，尿素 1.0%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3 %；
補料配方（W/V）：葡萄糖30~50%，硫酸鋅0.05%，硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.05%，甘油0.5%，豆餅粉1.5%，尿素0.5%，泡敵0.3%。
實驗8
發酵培養基配方（W/V）：葡萄糖5.0~6.0%，生豆粉2.0%，糊精1.5%，尿素 0.15%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3 %；
補料配方（W/V）：葡萄糖30~50%，硫酸鋅0.05%，硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.05%，甘油0.5%，生豆粉1.5%，糊精1.5%，泡敵0.3%。
實驗結果：
方案 放罐效價 (ug/ml)
實驗1 7977
實驗2 8870
實驗3 5982
實驗4 8020
實驗5 8535
實驗6 8507
實驗7 4570
實驗8 8217
實驗結論：配方中引入蛋白腖導致發酵效價不佳，配方中尿素過量導致發酵效價不佳；基本確認本發明發酵罐與補料的碳源、氮源、複合碳氮源的選擇可以為葡萄糖、甘油、糊精、麥麩、豆餅粉、生豆粉、玉米漿、酵母粉。
實施例6 補料配方的考察
發酵基礎料培養基配方中物料分別有葡萄糖、豆餅粉、麥麩、尿素 、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸鋅、甘油、泡敵。補料配方是基於發酵基礎料培養基，經過篩選進而確定補料罐配方。
由於基礎料中硫酸鎂比例較低，僅為0.06%，鎂元素是許多酶的活化劑,能促進碳水化合物的新陳代謝、核酸的合成、磷酸鹽的轉化等屬基本元素，只提供基本生長的營養，故補料配方中硫酸鎂0.06%比例保持不變。
泡敵只用於消除泡沫，不影響工藝，故補料配方中比例和發酵基礎料保持相同。
豆餅粉和麥麩均屬廉價有機氮源，除提供氮源外，還提供大量的無機鹽及生長因子。考慮微生物的同化能力，因此需討論豆餅粉和麥麩在補料配方中的最適比例。
甘油作為一種極性質子溶劑，能完全溶于水和短鏈醇而不溶於烴類，它可促進水相中多種非有機酸、堿、鹽，以及親水性有機化合物的溶解。此外，甘油與生物酶具有較好的生物相容性，可促進蛋白的正確折疊，穩定蛋白結構，並保持酶的活性，對生物細胞和酶在熱和有機溶劑環境下具有一定的保護作用。因此確定甘油在補料配方中的最適比具有必要性。
硫酸鋅適量的存在對發酵單位的提高具有一定的促進作用，但加入過量對發酵單位提高沒有促進作用 ，因此需要考慮硫酸鋅在補料配方中的最適比例。
實驗方案：
現將通過不同比例的配比確認豆餅粉、麥麩、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、甘油對莫匹羅星發酵效價的影響，選取效價高的配方作為發酵過程中補料罐中混合補料最適配方。種子罐在20~30℃條件下培養24h後轉接至現有發酵罐中培養，培養6天后放瓶檢測發酵效價。
因素 硫酸鋅 % 豆餅粉 % 磷酸二氫鉀 % 甘油 % 麥麩 %
實驗1 0.05 1.0 0.05 0.5 0.5
實驗2 0.05 2.0 0.075 1 1.0
實驗3 0.05 2.5 0.1 1.5 1.5
實驗4 0.05 3.0 0.125 2 2.0
實驗5 0.125 1.0 0.075 1.5 2.0
實驗6 0.125 2.0 0.05 2 1.5
實驗7 0.125 2.5 0.125 0.5 1.0
實驗8 0.125 3.0 0.1 1 0.5
實驗9 0.2 1.0 0.1 2 1.0
實驗10 0.2 2.0 0.125 1.5 0.5
實驗11 0.2 2.5 0.05 1 2.0
實驗12 0.2 3.0 0.075 0.5 1.5
實驗13 0.275 1.0 0.125 1 1.5
實驗14 0.275 2.0 0.1 0.5 2.0
實驗15 0.275 2.5 0.075 2 0.5
實驗16 0.275 3.0 0.05 1.5 1.0
按照上述方案開展16次試驗，得到16個試驗的放罐效價，用正交分析軟件進行分析，得出五單因素變量的也影響，
實驗結果（發酵效價）：
因素 放罐效價 (ug/ml)
實驗1 9140
實驗2 9936
實驗3 8783
實驗4 8088
實驗5 7835
實驗6 10244
實驗7 8832
實驗8 3815
實驗9 9938
實驗10 7390
實驗11 8073
實驗12 7447
實驗13 2095
實驗14 8633
實驗15 5835
實驗16 3746
實驗分析：
因素 硫酸鋅 % 豆餅粉 % 磷酸二氫鉀 % 甘油 % 麥麩 %
均值1 0.05 1.0 0.05 0.5 0.5
均值2 0.125 2.0 0.075 1 1.0
均值3 0.2 2.5 0.1 1.5 1.5
均值4 0.275 3.0 0.125 2 2.0
因素 對應效價 (ug/ml)
均值1 8986.75 7252.00 7800.75 8513.00 6545.00
均值2 7681.50 9050.75 7763.25 5979.75 8113.00
均值3 8212.00 7880.75 7792.25 6938.50 7142.25
均值4 5077.25 5774.00 6601.25 8526.25 8157.25
硫酸鋅：均值1的發酵放罐效價8986.75，明顯高於其他三組水平，所以硫酸鋅的配比選定為水平1，即0.05%；
豆餅粉：均值2的發酵放罐效價9050.75，明顯高於其他三組水平，所以豆餅粉的配比選定為水平2，即2.0%；
磷酸二氫鉀：均值1、均值2、均值3、均值4的發酵放罐效價分別是7800.75、7763.25、7792.25和6601.25，前三者無明顯差異，均值4呈明顯下降趨勢，隨著磷酸二氫鉀配比的增加，放罐效價呈現下降趨勢，表明磷酸二氫鉀配比越高，放罐效價下降的風險增大，所以選擇風險最小且放罐效價最高的水平1，即0.05%；
甘油：均值1的發酵放罐效價是8513.00，均值4的發酵放罐效價是8526.25，均值1和均值4的發酵放罐效價較高且無明顯差異，鑒於補料配方中已有葡萄糖，甘油和葡萄糖均作為碳源補入，且葡萄糖的比例更大，起到主要碳源的作用，如果甘油使用0.5%和2%比例，發酵放罐效價無明顯差異，選擇較小的比例即可，二是從成本上考慮；且選擇較小的比例生產成本更低，所以選擇0.5%比例，因此確定甘油的比例為0.5%；
麥麩：均值1、均值2、均值3、均值4的發酵放罐效價分別是6545.00、8113.00、7142.25、8157.25。隨著麥麩配比的增加，放罐效價呈現上升趨勢，表明麥麩配比越低，放罐效價下降的風險增大，所以選擇選擇風險最小且放罐效價最高的水平4，即2.0%。
實驗結論：確認本發明補料配方為，葡萄糖30~50%；麥麩2.0%；豆餅粉2.0%；甘油0.5%；硫酸鎂0.06%；磷酸二氫鉀0.05%；硫酸鋅0.05%；泡敵0.3%。
實施例7 發酵工藝穩定性的考察
對發酵工藝進行放大的驗證，本實施例使用了4噸發酵罐進行試驗。根據效價檢測結果，確認本發酵工藝的發酵放罐水平的穩定性。
實驗方案：
種子培養基配方：葡萄糖1.0%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸銨0.2%，泡敵0.05%，甘油0.5%，麥麩0.5%，調節pH 7.0；
發酵培養基配方：葡萄糖5.5%，豆餅粉2.0%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.10%，硫酸鎂0.06%，氯化鉀0.12%，硫酸鋅0.2%，甘油1.5%，泡敵0.3%，尿素0.15%，麥麩1.0%，調節pH7.0；
補料配方：葡萄糖30~50%，豆餅粉2.0%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0.06%，硫酸鋅0.05%，甘油0.5%，泡敵0.3%，麥麩2.0%；
搖瓶備種及種子罐配消：按上述工藝配方進行配料,投料後體積為220L，用氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，滅菌罐溫120℃，保溫保壓30min；
種子罐接前樣送檢，種子罐接種及發酵罐配消：按上述工藝配方進行配料，投料後體積為800L；用固體氫氧化鈉調節pH至7.0，發酵罐接前樣送檢，進行種子罐培養；
種子罐移種及糖化液配消，糖化液送檢，發酵開始培養；
發酵培養：發酵液于罐溫20~30℃下培養，移種後第二天早上8:00開始每隔2小時取樣檢測葡萄糖和pH，當葡萄糖低於1.0%時開始補糖。補糖後pH控制到5.6~6.5，葡萄糖控制在1.5%以下。之後每天8:00起定時檢測pH，葡萄糖，效價。
放罐當天早上8:00和放罐時測pH，葡萄糖，8:00開始每隔2小時測效價。發酵培養80~132小時。
實驗設計：上述放大化實驗方案重複三次，編號為F190304FJ、F190401FJ、F1900402FJ，以發酵時間為橫坐標，效價為坐標記錄生長曲線。生長曲線的記錄於批移種後第三天早上8:00開始，每4小時檢測效價，每天8:00和16:00檢測pH、葡萄糖。放罐當天8:00和放罐檢測pH、葡萄糖，12:00開始每兩小時檢測效價，直至放罐。
實驗結論：從附圖1可知，三次放大實驗的放罐效價穩定達到8000ug/ml，生產過程穩定可控。
圖1 - 實施例7發酵工藝放大實驗的菌種生長趨勢圖

Claims (11)

  1. 一種莫匹羅星的發酵方法，其包括發酵培養和補料培養步驟，所述的補料培養步驟添加的培養基按質量體積比包括碳源25~60%，氮源1~10%，無機鹽0.10~0.25%，消泡劑0.1~0.5%，所述的碳源選自葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、糊精、蛋白腖、麥麩、豆餅粉、玉米澱粉、黃豆粉、馬鈴薯粉、木薯澱粉、玉米漿、酵母粉或甘露醇中的一種或多種；所述的氮源選自氨水、尿素、銨鹽、硝酸鹽、蛋白腖、麥麩、玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉或酵母粉中的一種或多種；所述的無機鹽選自硫酸鹽和/或磷酸鹽。
  2. 如請求項1所述的莫匹羅星發酵方法，所述的碳源選自葡萄糖、甘油、糊精、麥麩、豆餅粉、玉米漿或酵母粉中的一種或多種；所述的氮源選自麥麩、豆餅粉、玉米漿或酵母粉中的一種或多種。
  3. 如請求項2所述的莫匹羅星發酵方法，所述的補料培養步驟添加的培養基按質量體積比包括葡萄糖25~60%，豆餅粉1~5%，麥麩1~5%，甘油0.1~1.0%； 或，葡萄糖25~60%，酵母粉1~5%，麥麩1~5%，甘油0.1~1.0%； 或，葡萄糖25~60%，生豆粉1~5%，麥麩1~5%，甘油0.1~1.0%； 或，葡萄糖25~60%，豆餅粉1~5%，糊精1~5%，甘油0.1~1.0%； 或，葡萄糖25~60%，豆餅粉1~5%，玉米漿1~5%，甘油0.1~1.0%； 或，葡萄糖25~60%，生豆粉1~5%，糊精1~5%，甘油0.1~1.0%。
  4. 如請求項1所述的莫匹羅星發酵方法，所述的補料培養步驟添加的培養基中無機鹽為磷酸二氫鉀、硫酸鎂和硫酸鋅，所述的補料培養步驟添加的培養基中按質量體積比包括磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸鎂0.01~0.1%，硫酸鋅0.01~0.1%。
  5. 如請求項1所述的莫匹羅星發酵方法，所述的補料培養步驟添加的培養基中消泡劑為泡敵，所述的補料培養步驟添加的培養基按質量體積比包括泡敵0.1~0.5%。
  6. 如請求項1所述的莫匹羅星發酵方法，所述的補料培養步驟pH為5.0~6.5。
  7. 如請求項1所述的莫匹羅星發酵方法，所述的發酵培養步驟添加的培養基按質量百分比包括碳源5.0~12.0%，氮源2.0~10.0%，無機鹽0.10~1.5%，消泡劑0.1~0.5%； 所述碳源和氮源選自葡萄糖、甘油、糊精、麥麩、豆餅粉、生豆粉、玉米漿、酵母粉中的一種或多種； 和/或，無機鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽和氯化物； 和/或，所述發酵培養的pH值為6.0~7.5，優選為6.8~7.5； 和/或，所述發酵投料後的體積可為0~20000L； 和/或，所述發酵罐培養的時間為48~144小時，優選為80~132小時； 和/或，所述發酵罐溫度為10~37℃，優選為20~30℃。
  8. 如請求項1所述的莫匹羅星發酵方法，具體包括以下步驟， a. 搖瓶種子培養：搖瓶種子配置於pH6.0~7.5、分裝、滅菌、以0.1~10.0%的接種量接入種子搖瓶並於20~30℃培養12~48小時，得到搖瓶種子菌液； b. 種子罐培養：將步驟a得到的種子培養配置於pH6.0~7.5、滅菌、種液並于罐溫20~30℃培養12~36小時，得到種子菌液； c. 發酵培養：將步驟b得到的種子菌液接種至發酵培養，調節pH至6.8~7.5，於20~30℃下培養，監控pH和葡萄糖含量並補料，收集產物，得莫匹羅星發酵液。
  9. 如請求項8所述的莫匹羅星發酵方法，所述的發酵培養步驟中接種的種子菌液是經過1~2級種子培養得到的種子菌液，接種的種子菌液的接種量按體積比為1.0~8.0%。
  10. 如請求項7、8或9所述的莫匹羅星發酵方法，所述的發酵培養步驟的培養基按質量體積比包括：葡萄糖5.0~6.0%，豆餅粉1.5~3.0%，麥麩0.5~2.5%，尿素0.1~0.2%，甘油1.0~2.0%，硫酸銨0.01~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.25%，硫酸鎂0.01~0.25%，氯化鉀0.01~0.25%，硫酸鋅0.01~0.25%，泡敵0.1~0.5%； 或，葡萄糖5.0~6.0%，酵母粉1.5~3.0%，麥麩0.5~2.5%，尿素0.1~0.2%，甘油1.0~2.0%，硫酸銨0.01~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.25%，硫酸鎂0.01~0.25%，氯化鉀0.01~0.25%，硫酸鋅0.01~0.25%，泡敵0.1~0.5%； 或，葡萄糖5.0~6.0%，生豆粉1.5~3.0%，麥麩0.5~2.5%，尿素0.1~0.2%，甘油1.0~2.0%，硫酸銨0.01~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.25%，硫酸鎂0.01~0.25%，氯化鉀0.01~0.25%，硫酸鋅0.01~0.25%，泡敵0.1~0.5%； 或，葡萄糖5.0~6.0%，豆餅粉1.5~3.0%，糊精0.5~2.5%，尿素0.1~0.2%，甘油1.0~2.0%，硫酸銨0.01~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.25%，硫酸鎂0.01~0.25%，氯化鉀0.01~0.25%，硫酸鋅0.01~0.25%，泡敵0.1~0.5%； 或，葡萄糖5.0~6.0%，豆餅粉1.5~3.0%，玉米漿0.5~2.5%，尿素0.1~0.2%，甘油1.0~2.0%，硫酸銨0.01~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.25%，硫酸鎂0.01~0.25%，氯化鉀0.01~0.25%，硫酸鋅0.01~0.25%，泡敵0.1~0.5%； 或，葡萄糖5.0~6.0%，生豆粉1.5~3.0%，糊精0.5~2.5%，尿素0.1~0.2%，甘油1.0~2.0%，硫酸銨0.01~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.25%，硫酸鎂0.01~0.25%，氯化鉀0.01~0.25%，硫酸鋅0.01~0.25%，泡敵0.1~0.5%。
  11. 一種培養基在製備莫匹羅星中的應用，所述的培養基按質量體積比包括：葡萄糖25~60%，豆餅粉1~5%，麥麩1~5%，甘油0.1~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸鎂0.01~0.1%，硫酸鋅0.01~0.1%，泡敵0.1~0.5%； 或，所述的補料培養的配方為葡萄糖25~60%，酵母粉1~5%，麥麩1~5%，甘油0.1~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸鎂0.01~0.1%，硫酸鋅0.01~0.1%，泡敵0.1~0.5%； 或，所述的補料培養的配方為葡萄糖25~60%，生豆粉1~5%，麥麩1~5%，甘油0.1~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸鎂0.01~0.1%，硫酸鋅0.01~0.1%，泡敵0.1~0.5%； 或，所述的補料培養的配方為葡萄糖25~60%，豆餅粉1~5%，糊精1~5%，甘油0.1~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸鎂0.01~0.1%，硫酸鋅0.01~0.1%，泡敵0.1~0.5%； 或，所述的補料培養的配方為葡萄糖25~60%，豆餅粉1~5%，玉米漿1~5%，甘油0.1~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸鎂0.01~0.1%，硫酸鋅0.01~0.1%，泡敵0.1~0.5%； 或，所述的補料培養的配方為葡萄糖25~60%，生豆粉1~5%，糊精1~5%，甘油0.1~1.0%，磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸鎂0.01~0.1%，硫酸鋅0.01~0.1%，泡敵0.1~0.5%。
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