TW202214643A

TW202214643A - 嘧啶并吡咯類化合物

Info

Publication number: TW202214643A
Application number: TW110126250A
Authority: TW
Inventors: 唐鋒; 劉力鋒; 蔣蕾; 嚴玉璽; 張國寶; 陳家雋; 周峰; 唐任宏; 任晉生
Original assignee: 大陸商江蘇先聲藥業有限公司
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2022-04-16
Also published as: WO2022062601A1

Abstract

本申請提供了式（Ia）所示的嘧啶并吡咯類化合物或其藥學可接受的鹽、藥物組合物及其製備方法，以及作為JAK3和/或BTK抑制劑的用途。

Description

嘧啶并吡咯類化合物

本發明要求2020年9月22日向中國國家知識產權局提交的專利申請號為202011003941.2，發明名稱為“嘧啶并吡咯類化合物”以及2021年6月29日向中國國家知識產權局提交的專利申請號為202110730368.3，發明名稱為“嘧啶并吡咯類化合物”的兩件在先申請的優先權。上述申請的全文通過引用的方式結合於本發明中。

本發明涉及一種新型的嘧啶并吡咯類化合物或其藥學可接受的鹽，含有它們的藥物組合物以及其在預防或者治療激酶相關性疾病如Janus激酶(Janus kinase, JAK，特別是JAK3)和/或布魯頓酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase, BTK)相關性疾病中的用途。

自身免疫病是由免疫功能異常引起對自身細胞或組織的攻擊，導致炎症和組織損傷的一類疾病，包括風濕性關節炎(RA)，炎症性腸炎(IBD)和系統性紅斑狼瘡(SLE)等。BTK和JAK3是針對自身免疫病的兩個重要靶點。

BTK是非受體型酪氨酸激酶TEC家族的一員，其結構上包括了PH結構域、TH結構域、SH3結構域、SH2結構域和SH1結構域。BTK在BCR信號通路的活化過程中起著關鍵的作用，調控著B細胞的發育和活化，對B細胞的增殖、促炎細胞因子的表達和抗體的分泌發揮著重要的作用（Targeting Bruton's tyrosine kinase in B cell malignancies. Nat Rev Cancer. 2014 Apr;14(4):219-32），因此BTK成為治療B細胞異常活化相關疾病的重要靶點之一，包括自身免疫病和B細胞淋巴瘤。Ibrutinib、Acalabrutinib和Zanubrutinib是已經獲批的三個BTK抑制劑，主要治療B細胞淋巴瘤，在部分病人中有明顯療效，但是臨床上也觀察到存在嚴重的副作用和耐藥突變。2017年ibrutinib被美國FDA批准用於治療GVHD，而其它的BTK抑制劑目前正在臨床上積極探索治療自身免疫疾病，包括RA、SLE和多發性硬化症(MS)。

JAK3是非受體酪氨酸激酶JAK家族的一員。JAK 激酶家族有 4 個成員: JAK-1、JAK-2、JAK-3 和 TYK-2。STAT是JAK3的下游受質，JAK3活化STAT使其成為二聚體進入細胞核內，對特定基因的轉錄表達進行調節。JAK-STAT信號通路對淋巴細胞增殖、分化以及促炎細胞因子的表達具有重要作用（JAK inhibition as a therapeutic strategy for immune and inflammatory diseases. Nat Rev Drug Discov. 2017 December 28; 17(1): 78；The JAK-STAT Pathway: Impact on Human Disease and Therapeutic Intervention. Annual Review of Medicine. Vol. 66: 311-328），因此JAK3成為自身免疫病及惡性腫瘤的靶點之一。JAK2在紅血球細胞和血小板生成中發揮著重要作用，小鼠缺失JAK2直接胚胎致死，這提示了JAK2生理功能的重要性（The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annu Rev Med. 2015, 66: 311-28）。部分JAK抑制劑由於缺乏JAK2的選擇性，對JAK2產生了明顯抑制，造成臨床上出現了貧血及血栓等副作用，這些副作用影響了藥物劑量的爬升，也間接限制了臨床療效（Jak2: normal function and role in hematopoietic disorders. Curr Opin Genet Dev. 2007, 17(1): 8-14; Clinical efficacy of new JAK inhibitors under development. Just more of the same?, Rheumatology, 58(S1): i27–i33; Optimizing management of ruxolitinib in patients with myelofibrosis: the need for individualized dosing. Journal of Hematology & Oncology 2013, 6 (1), 79; Benefit-risk profile of tofacitinib in patients with moderate-to-severe chronic plaque psoriasis: pooled analysis across six clinical trials. Br J Dermatol. 2019, 180(1): 67-75.）。托法替尼（tofacitinib）是FDA批准的JAK抑制劑，其所表現出的不良反應，包括嚴重的感染、肝損傷等，也被認為與托法替尼對JAK2選擇性不足有關。由此可見，提高同家族成員的選擇性成為開發新一代標靶JAK的小分子藥物開發的方向之一。

除了BTK和JAK3抑制劑各自單獨的臨床作用，同時抑制BTK/JAK3信號通路則會表現出協同的療效。數個研究表明，在膠原蛋白誘導的大鼠關節炎(CIA)模型中同時抑制BTK和JAK，觀察到關節腫脹有明顯緩解，破骨細胞數量減少，病理評分也顯著改善，療效優於單藥作用（2016 ACR/ARHP Annual Meeting. Abstract 484；2013 ACR/ARHP Annual Meeting. Abstract 2353）。Abbvie公司於2018年9月和2019年6月分別啟動了ABBV599 (BTK抑制劑和JAK抑制劑聯用) 針對RA和SLE的臨床二期實驗。另一針對BTK/JAK3雙靶點抑制劑DWP212525也在小鼠CIA模型中展現出了對疾病的緩解和對關節的保護作用（2019 ACR/ARHP Annual Meeting. Abstract 965）。

鑒於龐大的自身免疫病市場以及未被滿足的市場需求，基於BTK和JAK3在自身免疫病上的功能以及已有的臨床效果，有必要開發針對BTK和JAK3具有良好活性，且選擇性好、毒副作用低的雙靶點小分子抑制劑。

本發明提供一種式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽：

（Ia）其中： X為NH； R ¹選自任選被R ^a取代的以下基團：C ₁-C ₁₀烷基或3-10元雜環基； R ^a選自氘、F、Cl、Br、I、OH、CN、＝O、NO ₂或任選被R ^b取代的下列基團：NH ₂、SH、S(O)NH ₂、S(O)(C ₁-C ₁₀烷基)、S(O) ₂(C ₁-C ₁₀烷基)、P(O)(C ₁-C ₁₀烷基)、C ₁-C ₁₀烷基、C ₃-C ₁₄環烷基、3-14元雜環基、C ₁-C ₁₀烷氧基、C ₃-C ₁₄環烷基氧基、3-14元雜環基氧基、C ₂-C ₁₀烯基、C ₂-C ₁₀炔基、C ₆-C ₁₀芳基、5-10元雜芳基、C ₆-C ₁₀芳基氧基或5-10元雜芳基氧基； R ^b選自F、Cl、Br、I、OH、CN、＝O、NO ₂、NH ₂、SH、C ₁-C ₁₀烷基、C ₃-C ₁₄環烷基、3-14元雜環基、C ₁-C ₁₀烷氧基、C ₃-C ₁₄環烷基氧基、3-14元雜環基氧基、C ₂-C ₁₀烯基、C ₂-C ₁₀炔基、C ₆-C ₁₀芳基、5-10元雜芳基、C ₆-C ₁₀芳基氧基或5-10元雜芳基氧基； R ²選自C ₃-C ₆環烷基或苯基，所述C ₃-C ₆環烷基或苯基任選被R ^d取代； R ^d選自F、Cl、Br、I、OH、CN或任選被選自F、Cl、Br、I、OH的基團取代的C ₁-C ₄烷基； R ³選自H、F、Cl、Br、I或任選被選自F、Cl、Br、I、OH的基團取代的C ₁-C ₁₀烷基； R ⁴為C ₁-C ₆烷基； n選自0或1。

在一些實施方案中，式（Ia）的丙烯醯基中的H被1個或多個氘原子取代。

在一些實施方案中，R ²選自環丙基或苯基，所述環丙基或苯基任選被R ^d取代。

在一些實施方案中，R ²選自C ₃-C ₆環烷基或苯基。

在一些實施方案中，R ²選自環丙基或苯基。

在一些實施方案中，R ²為環丙基。

在一些實施方案中，R ³選自H、F、Cl、Br、I或任選被選自F、Cl、Br、I、OH的基團取代的C ₁-C ₆烷基。

在一些實施方案中，R ³選自H、F、Cl、Br、I或任選被選自F、Cl、Br、I、OH的基團取代的C ₁-C ₄烷基。

在一些實施方案中，R ³選自H、F、Cl、Br或I。

在一些實施方案中，R ³選自H或F。

在一些實施方案中，R ³為H。

在一些實施方案中，R ¹選自C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基，所述C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基任選被R ^a取代。

在一些實施方案中，R ¹選自C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基，所述4-6元雜環基含有O原子和/或N原子，所述C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基任選被R ^a取代。

在一些實施方案中，R ¹選自C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基，所述4-6元雜環基含有O和/或N作為環原子，所述C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基任選被R ^a取代。

在一些實施方案中，R ¹選自C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基，所述4-6元雜環基含有一個O原子或一個N原子，所述C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基任選被R ^a取代。

在一些實施方案中，R ¹選自C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基，所述4-6元雜環基含有一個O或一個N作為環原子，所述C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基任選被R ^a取代。

在一些實施方案中，R ^a選自F、Cl、Br、I、OH、CN、＝O、NO ₂或任選被R ^b取代的下列基團：NH ₂、SH、S(O)NH ₂、S(O)(C ₁-C ₁₀烷基)、S(O) ₂(C ₁-C ₁₀烷基)、P(O)(C ₁-C ₁₀烷基)、C ₁-C ₁₀烷基、C ₃-C ₁₄環烷基、3-14元雜環基、C ₁-C ₁₀烷氧基、C ₃-C ₁₄環烷基氧基、3-14元雜環基氧基、C ₂-C ₁₀烯基、C ₂-C ₁₀炔基、C ₆-C ₁₀芳基、5-10元雜芳基、C ₆-C ₁₀芳基氧基或5-10元雜芳基氧基。

在一些實施方案中，R ^a選自F、Cl、Br、I、OH、CN、＝O、NO ₂或任選被R ^b取代的下列基團：NH ₂、SH、C ₁-C ₁₀烷基、C ₃-C ₁₀環烷基、3-10元雜環基、C ₁-C ₁₀烷氧基、C ₃-C ₁₀環烷基氧基、3-10元雜環基氧基、C ₂-C ₁₀烯基、C ₂-C ₁₀炔基、C ₆-C ₁₀芳基、5-10元雜芳基、C ₆-C ₁₀芳基氧基或5-10元雜芳基氧基。

在一些實施方案中，R ^b選自F、Cl、Br、I、OH、CN、＝O、NO ₂、NH ₂、SH、C ₁-C ₁₀烷基、C ₃-C ₁₀環烷基、3-10元雜環基、C ₁-C ₁₀烷氧基、C ₃-C ₁₀環烷基氧基、3-10元雜環基氧基、C ₂-C ₁₀烯基、C ₂-C ₁₀炔基、C ₆-C ₁₀芳基、5-10元雜芳基、C ₆-C ₁₀芳基氧基或5-10元雜芳基氧基。

在一些實施方案中，R ^a選自氘、F、Cl、Br、I、OH、CN、C ₁-C ₁₀烷基或C ₃-C ₁₀環烷基。

在一些實施方案中，R ^a選自F、Cl、Br、I、OH、CN、C ₁-C ₁₀烷基或C ₃-C ₁₀環烷基。

在一些實施方案中，R ^a為C ₁-C ₆烷基。

在一些實施方案中，R ^a為甲基。

在一些實施方案中，R ¹選自氘代甲基、乙基、氧雜環丁基、四氫呋喃基、四氫吡喃基或N-甲基哌啶基。

在一些實施方案中，R ¹選自甲基、乙基、氧雜環丁基、四氫呋喃基、四氫吡喃基或N-甲基哌啶基。

在一些實施方案中，R ¹選自甲基、氘代甲基、乙基、

、

、

或

。

在一些實施方案中，R ¹選自甲基、乙基、

、

或

。

在一些實施方案中，R ¹選自甲基或氘代甲基。

在一些實施方案中，R ¹選自甲基或CD ₃。

在一些實施方案中，R ¹為甲基。

在一些實施方案中，R ⁴為甲基。

在一些實施方案中，所述n為1。

在一些實施方案中，所述式（Ia）化合物或其藥學上可接受的鹽選自式（IIa）化合物或其藥學上可接受的鹽：

（IIa）其中，X、R ¹、R ²、R ³、R ⁴和n如上文所定義。

在一些實施方案中，本發明涉及以下化合物或其藥學上可接受的鹽：

或

。

本發明還提供藥物組合物，其包含式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽或者上述具體化合物或其藥學上可接受的鹽、以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。

進一步地，本發明涉及式（Ia）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，或所述具體化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物在製備預防或者治療Janus激酶(JAK，特別是JAK3)和/或布魯頓酪氨酸激酶(BTK)相關性疾病的藥物中的用途。

進一步地，本發明涉及式（Ia）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，或所述具體化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物在預防或者治療Janus激酶(JAK，特別是JAK3)和/或布魯頓酪氨酸激酶(BTK) 相關性疾病中的用途。

進一步地，本發明涉及預防或者治療Janus激酶(JAK，特別是JAK3)和/或布魯頓酪氨酸激酶(BTK) 相關性疾病的式（Ia）化合物或其藥學上可接受的鹽，或所述具體化合物或其藥學上可接受的鹽，或其藥物組合物。

本發明還涉及治療Janus激酶(JAK，特別是JAK3)和/或布魯頓酪氨酸激酶(BTK)相關性疾病的方法，該方法包括給以患者治療上有效劑量的包含本發明所述的式（Ia）化合物或其藥學上可接受的鹽或所述具體化合物或其藥學上可接受的鹽的藥物製劑。

本發明所述的Janus激酶(JAK，特別是JAK3)和/或布魯頓酪氨酸激酶(BTK) 相關性疾病包括但不限於腫瘤（如B細胞淋巴瘤）和自身免疫性疾病（如風濕性關節炎、炎症性腸炎和系統性紅斑狼瘡）等。

術語定義和說明

除非另有說明，本發明中所用的術語具有下列含義，本發明中記載的基團和術語定義，包括其作為實例的定義、示例性的定義、優選的定義、表格中記載的定義、實施例中具體化合物的定義等，可以彼此之間任意組合和結合。這樣的組合和結合後的基團定義及化合物結構，應當屬於本發明說明書記載的範圍內。一個特定的術語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照本領域普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，是指代其對應的商品或其活性成分。

本文中“

”表示連接位點。

術語“藥學上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。

術語“藥學上可接受的鹽”是指藥學上可接受的無毒酸或鹼的鹽，包括無機酸和鹼、有機酸和鹼的鹽。

術語“立體異構體”是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體，包括順反異構體、鏡像異構體、非鏡像異構體和旋轉異構體。

本發明的化合物可以具有不對稱碳原子（光學中心）或雙鍵。外消旋體、鏡像異構體、非鏡像異構體、幾何異構體和單個的異構體都包括在本發明的範圍之內。

本文中消旋體或者鏡像體純的化合物的圖示法來自Maehr，J.Chem.Ed.1985，62:114-120。除非另有說明，用楔形鍵和虛線鍵（

和

）表示一個立體中心的絕對構型。當本文所述化合物含有烯屬雙鍵或其它幾何不對稱中心，除非另有規定，它們包括E、Z幾何異構體。同樣地，所有的互變異構形式均包括在本發明的範圍之內。

本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本發明設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)-和(+)-鏡像體、(R)-和(S)-鏡像體、非鏡像異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如鏡像異構體或非鏡像體富集的混合物，所有這些混合物都屬於本發明的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本發明的範圍之內。

術語“互變異構體”是指因分子中某一原子在兩個位置迅速移動而產生的官能團異構體。本發明化合物可表現出互變異構現象。互變異構的化合物可以存在兩種或多種可相互轉化的種類。質子移變互變異構體來自兩個原子之間共價鍵合的氫原子的遷移。互變異構體一般以平衡形式存在，嘗試分離單一互變異構體時通常產生一種混合物，其理化性質與化合物的混合物是一致的。平衡的位置取決於分子內的化學特性。例如，在很多脂族醛和酮如乙醛中，酮型佔優勢；而在酚中，烯醇型佔優勢。本發明包含化合物的所有互變異構形式。

術語“藥物組合物”表示一種或多種本文所述化合物或其生理學/藥學上可接受的鹽或前體藥物與其它化學組分的混合物，其它組分例如生理學/藥學上可接受的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進化合物對生物體的投藥。

術語“被取代”是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，只要特定原子的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為氧代（即=O）時，意味著兩個氫原子被取代，氧代不會發生在芳香基上。

術語“任選”或“任選地”是指隨後描述的事件或情況可以發生或不發生，該描述包括發生所述事件或情況和不發生所述事件或情況。例如，乙基“任選”被鹵素取代，指乙基可以是未被取代的（CH ₂CH ₃）、單取代的（如CH ₂CH ₂F）、多取代的（如CHFCH ₂F、CH ₂CHF ₂等）或完全被取代的（CF ₂CF ₃）。本領域技術人員可理解，對於包含一個或多個取代基的任何基團，不會引入任何在空間上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。

當任何變量（例如R ^a、R ^b）在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義都是獨立的。例如，如果一個基團被2個R ^b所取代，則每個R ^b都有獨立的選項。

本文中的C _m-C _n，是指具有m-n範圍中的整數個碳原子。例如“C ₁-C ₁₀烷基”是指該基團可具有1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子、4個碳原子、5個碳原子、6個碳原子、7個碳原子、8個碳原子、9個碳原子或10個碳原子。

術語“鹵”或“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。

術語“C ₁-C ₁₀烷基”可理解為表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子的直鏈或支鏈飽和一價烴基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、第二丁基、第三丁基、異戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等；“C ₁-C ₆烷基” 可理解為表示具有1、2、3、4、5或6個碳原子的直鏈或支鏈飽和一價烴基；“C ₁-C ₄烷基” 可理解為表示具有1、2、3或4個碳原子的直鏈或支鏈飽和一價烴基。

術語“烷氧基”可理解為“烷基氧基”或“烷基-O-”，指直鏈狀或支鏈狀醇類失去羥基上的氫原子產生的一價基團。例如術語“C ₁-C ₁₀烷氧基”可理解為“C ₁-C ₁₀烷基氧基”或“C ₁-C ₁₀烷基-O-”。

術語“C ₂-C ₁₀烯基”應理解為優選表示直鏈或支鏈的一價烴基，其包含一個或多個雙鍵並且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子。所述烯基可分為“順式”和“反式”取向(或者“E”和“Z”取向)。“C ₂-C ₆烯基” 應理解為直鏈或支鏈的一價烴基，其包含一個或多個雙鍵並且具有2、3、4、5或6個碳原子。“ C ₂-C ₁₀烯基”的實例包括但不限於乙烯基 (-CH＝CH ₂)、丙-1-烯基(-CH＝CHCH ₃)、丙-2-烯基(-CH ₂CH＝CH ₂)、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基-1,3-丁二烯基、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基或己-4-烯基。

術語“C ₂-C ₁₀炔基”應理解為優選表示直鏈或支鏈的一價烴基，其包含一個或多個三鍵並且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子。“C ₂-C ₁₀炔基”的實例包括但不限於乙炔基(-C≡CH)、丙-1-炔基(1-丙炔基、-C≡CCH ₃)、丙-2-炔基(炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基或丁-3-炔基。“C ₂-C ₃炔基” 實例包括乙炔基(-C≡CH)、丙-1-炔基(1-丙炔基、-C≡CCH ₃)、丙-2-炔基(炔丙基)。

術語“環烷基”指完全飽和的且以單環、并環、橋環或螺環等形式存在的碳環。除非另有指示，該碳環通常為3至14元環。例如，術語“C ₃-C ₁₄環烷基”可理解為表示飽和的一價單環、并環、螺環或橋環，其具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個碳原子。術語“C ₃-C ₁₀環烷基”可理解為表示飽和的一價單環或雙環烴環，其具有3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子。術語“C ₃-C ₆環烷基”可理解為表示飽和的一價單環或雙環烴環，其具有3、4、5、6個碳原子。環烷基具體實例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基，或者是雙環或三環烴基如降冰片基（雙環[2.2.1]庚基）、雙環[2.2.2]辛基、金剛烷基、螺[4.5]癸烷基、十氫化萘環等。根據本發明，所述雙環或三環烴基包括橋環、螺環或并環結構。術語“C ₃-C ₁₄環烷基”可以包含“C ₃-C ₁₀環烷基”，“C ₃-C ₁₀環烷基”可以包含“C ₃-C ₆環烷基”。

術語“環烷基氧基” 可理解為“環烷基-O-”。“C ₃-C ₁₄環烷基氧基”可以包含“C ₃-C ₁₀環烷基氧基”，“C ₃-C ₁₀環烷基氧基”可以包含“C ₃-C ₆環烷基氧基”。

術語“3-14元雜環基”可理解為具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個環原子的飽和的或部分飽和的一價單環或雙環烴環，其包含1、2、3、4或5個，優選1、2或3個選自N、O和S的雜原子。術語“3-10元雜環基”指具有3、4、5、6、7、8、9或10個環原子的飽和的或部分飽和的一價單環或雙環烴環，其包含1、2、3、4或5個，優選1、2或3個選自N、O和S的雜原子。術語“4-6元雜環基” 可理解為具有4、5、6個環原子的飽和的或部分飽和的一價單環或雙環烴環，其包含1、2、3、4或5個，優選1、2或3個選自N、O和S的雜原子。特別地，所述雜環基可以包括但不限於：4元環，如氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基；5元環，如四氫呋喃基、二氧雜環戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基；或6元環，如四氫吡喃基、哌啶基、嗎啉基、二噻烷基、硫代嗎啉基、哌嗪基或三噻烷基；或部分飽和的6元環如四氫吡啶基；或7元環，如二氮雜環庚烷基。任選地，所述雜環基可以是苯并稠合的。所述雜環基可以是雙環的，例如但不限於5,5元環，如六氫環戊并[c]吡咯-2(1H)-基環，或者5,6元雙環，如六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基環。含氮原子的環可以是部分不飽和的，即它可以包含一個或多個雙鍵，例如但不限於2,5-二氫-1H-吡咯基、4H-[1,3,4]噻二嗪基、4,5-二氫噁唑基或4H-[1,4]噻嗪基，或者，它可以是苯并稠合的，例如但不限於二氫異喹啉基。根據本發明，所述雜環基是無芳香性的。所述雙環烴環包括橋環、螺環或并環結構。

術語“雜環基氧基”可理解為“雜環基-O-”。“3-14元雜環基氧基”可以包含“3-10元雜環基氧基”，“3-10元雜環基氧基”可以包含“4-6元雜環基氧基”。

術語“C ₆-C ₁₀芳基”可理解為具有6、7、8、9、10個碳原子的一價芳香性或部分芳香性的單環、雙環或三環烴環，特別是具有6個碳原子的環(“C ₆芳基”)，例如苯基；或者具有9個碳原子的環(“C ₉芳基”)，例如茚滿基或茚基，或者具有10個碳原子的環(“C ₁₀芳基”)，例如四氫化萘基、二氫萘基或萘基。

術語“芳基氧基” 可理解為“芳基-O-”。

術語“5-10元雜芳基”可理解為具有5、6、7、8、9、10個環原子，特別是5或6或9或10個環原子，且其包含1-5個，特別是1-3個獨立選自N、O和S的雜原子的一價單環、雙環或三環芳族環系。特別地，雜芳基選自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基等以及它們的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、異吲哚基等；或吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它們的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、異喹啉基等；或吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等以及它們的苯并衍生物等。

術語“雜芳基氧基” 可理解為“雜芳基-O-”。

術語“治療有效量”是指(i)治療或預防特定疾病、病況或障礙，(ii)減輕、改善或消除特定疾病、病況或障礙的一種或多種症狀，或(iii)預防或延遲本文中所述的特定疾病、病況或障礙的一種或多種症狀發作的本發明化合物的用量。構成“治療有效量”的本發明化合物的量取決於該化合物、疾病狀態及其嚴重性、投藥方式以及待被治療的哺乳動物的年齡而改變，但可例行性地由本領域技術人員根據其自身的知識及本公開內容而確定。

術語“佐劑”是指可藥用惰性成分。

術語“賦形劑”的種類實例非限制性地包括黏合劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、穩定劑、填充劑和稀釋劑等。賦形劑能增強藥物製劑的操作特性，即通過增加流動性和/或黏著性使製劑更適於直接壓縮。適用於上述製劑的典型的“藥學上可接受的載體”的實例為：糖類、澱粉類、纖維素及其衍生物等在藥物製劑中常用到的佐劑。

詞語“包括（comprise）”、“含有（comprise）”或“包含（comprise）”及其英文變體例如comprises或comprising可理解為開放的、非排他性的意義，即“包括但不限於”。

本發明的藥物組合物可通過將本發明的化合物與適宜的藥學上可接受的佐劑組合而製備，例如可配製成固態、半固態、液態或氣態製劑，如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、膏劑、乳劑、懸浮劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球及氣溶膠等。

投與本發明化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物的典型途徑包括但不限於口服、直腸、局部、吸入、腸胃外、舌下、陰道內、鼻內、眼內、腹膜內、肌內、皮下、靜脈內投藥。

本發明的藥物組合物可以採用本領域眾所周知的方法製造，如常規的混合法、溶解法、製粒法、乳化法、冷凍乾燥法等。

在一些實施方案中，藥物組合物是口服形式。對於口服投藥，可以通過將活性化合物與本領域熟知的藥學上可接受的佐劑混合，來配製該藥物組合物。這些佐劑能使本發明的化合物被配製成片劑、丸劑、錠劑、糖衣劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、漿劑、懸浮劑等，用於對患者的口服投藥。

可以通過常規的混合、填充或壓片方法來製備固體口服組合物。例如，可通過下述方法獲得：將所述的活性化合物與固體佐劑混合，任選地碾磨所得的混合物，如果需要則加入其它合適的佐劑，然後將該混合物加工成顆粒，得到了片劑或糖衣劑的核心。適合的佐劑包括但不限於：黏合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑或矯味劑等。

藥物組合物還可適用於腸胃外投藥，如合適的單位劑型的無菌溶液劑、混懸劑或凍乾產品。

本文所述的通式化合物的所有施用方法中，每天投藥的劑量為0.01mg/kg到50mg/kg體重，優選為0.03mg/kg到30mg/kg體重，更優選0.05mg/kg到20mg/kg體重，以單獨或分開劑量的形式。

本發明的化合物可以通過本領域技術人員所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，所述的溶劑須適合於本發明的化學變化及其所需的試劑和物料。為了獲得本發明的化合物，有時需要本領域技術人員在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。

以下實施例詳細說明發明的技術方案，但本發明的保護範圍包括但不限於此。

化合物的結構是通過核磁共振（NMR）和/或質譜（MS）來確定的。NMR位移的單位為10 ^-6（ppm）。NMR測定的溶劑為氘代二甲基亞碸、氘代氯仿、氘代甲醇等，內標為四甲基矽烷（TMS）。“IC ₅₀”指半抑制濃度，指達到最大抑制效果一半時的濃度；EA:乙酸乙酯；PE：石油醚；SEM：三甲基矽基乙氧基甲基；Cbz：苄氧羰基；Boc：第三丁氧羰基；MeCN：乙腈；MeOH：甲醇；Pd/C：鈀碳；DIEA：二異丙基乙胺；DIPEA：二異丙基乙胺；DMSO：二甲基亞碸；Pd ₂(dba) ₃：三(二亞苄基丙酮)二鈀；BINAP：1,1’-聯萘-2,2’-雙二苯膦；Xantphos：4,5-雙(二苯基磷)-9,9-二甲基氧雜蒽；TFA：三氟醋酸；THF：四氫呋喃；TfOH：三氟甲磺酸；TLC：薄層層析；LCMS：液相層析質譜聯用；HPLC：高效液相層析；Prep-HPLC：製備高效液相層析。

除非另作說明，混合溶劑表示的比例是體積混合比例。

除非另作說明，否則%是指質量百分比wt%。

化合物經手工或ChemDraw ^®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。

實施例 1 化合物 009 的製備

1-((2 S,5 R)-5-((5-環丙基-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮

合成路線及具體合成步驟：

第一步： (2 S,5 R)-5-((2-氯-5-環丙基-7-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-羧酸苄酯（9c）的合成

室溫下分別將2,4-二氯-5-環丙基-7-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶(9a, 500 mg, 1.39 mmol), (2S,5R)-5-氨基-2-甲基哌啶-1-羧酸苄酯(9b, 346 mg, 1.39 mmol) 和DIEA (448 mg, 3.48 mmol) 加入到異丙醇 (10.0 mL) 溶液中，將反應體系加熱到110℃，並在此溫度下攪拌反應16小時。將反應液在減壓下濃縮得到粗產品，後經過矽膠柱層析 (乙酸乙酯/石油醚=1/1) 純化得到9c（385 mg, 產率：48.6%）。

LCMS: Rt: 2.157 min; MS m/z (ESI): 570.2 [M+H]；

¹H NMR (400M Hz, DMSO- d ₆ ) δ7.45-7.39 (m, 4H), 7.35-7.32 (m, 1H), 6.77 (s, 1H), 5.72（d, J= 8.0 Hz, 1H), 5.46（s, 2H), 5.20 (dd, J= 17.6, 12.4 Hz, 2H ), 4.60-4.55 (m, 2H), 4.26-4.20 (m, 1H), 3.54 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 2.73 (t, J= 11.6 Hz, 1H), 2.21 (s, 1H), 2.12-2.08 (m, 1H), 1.93-1.88 (m, 1H), 1.70-1.65 (m, 2H), 1.31-1.28 (m, 1H), 1.25 (d, J= 6.8 Hz, 3H), 0.93 (t, J= 8.0 Hz, 3H), 0.72-0.71 (m, 2H), 0.03 (s, 9H).

第二步： (2 S,5 R)-5-((5-環丙基-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-羧酸苄酯（9e）的合成

室溫氮氣保護下，將Pd ₂(dba) ₃(32.0 mg, 0.035 mmol) 和BINAP (21.8 mg, 0.035 mmol ) 加入到 9c(200 mg, 0.351 mmol)，1-甲基-1 H-吡唑-4-氨基( 9d, 40.8 mg, 0.421 mmol)和Cs ₂CO ₃(285.9 mg, 0.878 mmol) 的1,4-二氧六環（10.0 mL）溶液中，反應體系升溫至100℃攪拌反應16小時，冷卻至室溫。過濾，濾餅用乙酸乙酯（30.0 mL）洗滌，將此溶液在減壓下濃縮後，過Chem-flash純化(乙腈/0.1%（v/v）三氟乙酸體系)，得到 9e（195 mg, 產率：88.0%）。

LCMS: Rt: 2.148 min; MS m/z (ESI): 631.3 [M+H]。

第三步：5-環丙基- N ²-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N ⁴-((3 R,6 S)-6-甲基哌啶-3-基)-7-((2-(三甲基矽基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2,4-二胺（ 9f）的合成

室溫氮氣保護下，將Pd/C（5 mg）加入到 9e(195 mg, 0.309 mmol) 的甲醇（5.0mL）中，反應體系在氫氣下室溫攪拌16小時。反應混合物減壓過濾，用甲醇（20.0 mL）洗滌濾餅，合併濾液，減壓蒸乾，殘留物過Chem-flash純化 (乙腈/0.1%（v/v）三氟乙酸體系)，得到 9f（136 mg, 產率：88.3%）。

LCMS: Rt: 1.212 min; MS m/z (ESI): 497.3 [M+H]。

第四步：5-環丙基- N ²-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)- N ⁴-((3 R,6 S)-6-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-2,4-二胺（9g）的合成

在0℃下，將三氟乙酸（1 mL）加入到 9f(136 mg, 0.273 mmol) 的二氯甲烷溶液（5.0 mL）中，反應液室溫攪拌2小時，減壓下將反應液濃縮,得到的黃色油狀物加入到DIEA（1.0 mL）的甲醇溶液（5.0 mL）中，反應液50℃攪拌6小時。減壓下將反應液濃縮，殘留物過Chem-flash純化(乙腈/0.1%（v/v）三氟乙酸體系)，得到 9g（95 mg，產率：94.8%）。

LCMS: Rt: 1.124 min; MS m/z (ESI): 367.2 [M+H]。

第五步：1-((2 S,5 R)-5-((5-環丙基-2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮 (009) 的合成

將9g（95 mg, 0.259 mmol）溶解在四氫呋喃（2.0 mL）和H ₂O(3.0mL)的混合液中，加入磷酸鉀固體 (137.5mg, 0.648mmol)，在0℃攪拌下，將丙烯醯氯(9h, 28.2 mg, 0.311 mmol)滴加到反應液中，室溫攪拌2小時。反應液過濾，濾液用Prep-HPLC (甲酸體系)製備純化得到009(18.35mg，產率：16.8%，de值：100%，ee值：100%)。

LCMS:Rt: 4.416 min; MS m/z (ESI): 421.5 [M+H]；

¹H NMR (400M Hz, DMSO- d ₆ ) δ10.59 (s, 1H), 8.40（s, 1H), 7.81（s, 1H), 7.38（s, 1H), 6.92（brs, 1H), 6.43（s, 1H), 6.11-6.07（m, 1H）, 5.87（d, J= 8.4 Hz, 1H), 5.64（brs, 1H), 4.79-4.28 (m, 2H), 4.13（brs, 1H), 3.71 (s, 3H), 2.76-2.70 (m, 1H), 2.03-1.99 (m, 1H), 1.87-1.85 (m, 2H), 1.72-1.67 (m, 2H), 1.23 (s, 3H), 0.83 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 0.61-0.57 (m, 1H), 0.47-0.43 (m, 1H).

實施例2 化合物010的製備

（ R）-1-（3-（（5-環丙基-2-（（1-甲基-1 H-吡唑-4-基）氨基）-7 H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基）氨基）吡咯烷-1-基）丙-2-烯-1-酮

合成路線及具體合成步驟：

第一步：（ R）-3-（（2-氯-5-環丙基-7-（（2-（三甲基甲矽烷基）乙氧基）甲基）-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基）氨基）吡咯烷-1-羧酸第三丁酯(10c)的合成

室溫下分別將10a(500mg, 1.4mmol), （ R）-3-氨基吡咯烷-1-羧酸第三丁酯(10b, 313mg, 1.68mmol)和DIPEA(543mL, 4.2mmol) 加入到異丙醇(10.0mL)溶液內。將反應體系密封並加熱到110℃，在此溫度下攪拌16小時。將反應液在減壓下濃縮得到粗產品，後經過矽膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯= 4/1)純化得到10c（450 mg, 產率：63.5%）。

LCMS: Rt: 1.320 min; MS m/z (ESI): 508.3 [M+H]。

第二步：（（ R）-3-（（5-環丙基-2-（（1-甲基-1H-吡唑-4-基）氨基）-7-（（2-（三甲基甲矽烷基）乙氧基）甲基）-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基）氨基）吡咯烷-1-羧酸第三丁酯 (10e) 的合成

室溫在氮氣保護下，將Pd ₂(dba) ₃(72.3mg, 0.079mmol)、BINAP(49.1mg, 0.079mmol )加入到10c(400mg, 0.79mmol)、1-甲基-1H-吡唑-4-胺(10d, 92mg, 0.94mmol) 和碳酸銫(772mg, 2.37mmol)的1,4-二氧六環（30mL）溶液中，反應體系升溫至100℃攪拌16小時，冷卻至室溫。加水（30mL）淬滅，用乙酸乙酯（50.0mL*2）萃取，將有機相濃縮後經過矽膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯=2/1)純化得到10e(361mg, 產率：80.4%)。

LCMS: Rt: 1.474 min; MS m/z (ESI): 569.3 [M+H]；

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.82 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 6.74 (d, J= 0.8 Hz, 1H), 6.07 (s, 1H), 5.45 (s, 2H), 4.82-4.75 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.79-3.76 (m, 1H), 3.59 (t, J= 8.0 Hz, 3H), 3.48 (s, 1H), 3.43 (s, 1H), 2.34 (s, 1H), 2.14 (s, 2H), 1.51 (d, J= 8.8 Hz, 9H), 0.94-0.91 (m, 4H ), 0.62 (s, 2H), 0.00 (s, 9H).

第三步：（ R）-5-環丙基-N ²-（1-甲基-1H-吡唑-4-基）- N ⁴-（吡咯烷-3-基）-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-2,4-二胺(10f)的合成

室溫下將10e(361mg, 0.63mmol)加入到三氟乙酸（1.0mL）的二氯甲烷溶液（3.0mL）中，反應液室溫攪拌2小時，得到單一產物。減壓下將反應液濃縮，加入到四氫呋喃/水（4.0mL/2mL）的氫氧化鋰溶液（100mg, 2.3mmol）中，反應液室溫攪拌4小時。減壓下將反應液濃縮，得到10f（190mg，產率：88.8%）。

LCMS: Rt: 1.245 min; MS m/z (ESI): 339.5 [M+H]。

第四步：（ R）-1-（3-（（5-環丙基-2-（（1-甲基-1 H-吡唑-4-基）氨基）-7H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基）氨基）吡咯烷-1-基）丙-2-烯-1-酮(010)的合成

將10f（190mg, 0.56mmol）溶解在四氫呋喃（4.0mL）和H ₂O(2.0mL)的混合液中，加入磷酸鉀固體(297mg, 1.4mmol)室溫攪拌，將丙烯醯氯10g(71mg, 0.78mmol)滴加進去，0℃下攪拌2小時，過濾，製備純化得到010(25.59mg，產率：11.2%)。

LCMS: Rt: 6.005 min; MS m/z (ESI): 393.2 [M+H]。

¹H NMR (400M Hz, DMSO- d ₆ ) δ 10.83 (brs, 1H), 8.88（brs, 1H), 7.84 (d, J= 2.4 Hz, 1H), 7.49 (d, J= 3.6 Hz, 1H), 6.67-6.54 (m, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.18-6.12 (m, 1H), 5.68 (t, J= 12.8 Hz, 1H), 4.81-4.69 (m, 1H), 4.03-3.99 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.74-3.59 (m, 2H), 3.54-3.44 (m, 2H), 2.34-2.17 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 2H), 0.79 (t, J= 2.8 Hz, 2H), 0.50 (d, J= 2.4 Hz, 2H).

實施例3 化合物011的製備

1-[(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-基]氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮

合成路線和具體合成步驟：

第一步：1-( ²H ₃)甲基-4-硝基-1 H-吡唑（11b）的合成

將4-硝基-1 H-吡唑11a(2.5g, 22.1mmol)溶於乙腈(20mL)中，加入氘代碘甲烷(3.92g, 27.6mmol)和碳酸鉀(4.58g, 33.1mmol)，80℃攪拌12小時，TLC檢測反應完畢。將反應液冷卻至室溫過濾，濾液使用乙酸乙酯(200mL)稀釋，有機相用飽和氯化鈉水溶液(50mL x 2)洗滌，有機相減壓濃縮後殘留物經柱層析(四氫呋喃/石油醚=1/2)純化，得到白色固體11b(2.5 g)。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ 8.85 (s, 1H), 8.24 (s, 1H).

第二步：1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-胺(11c)的合成

將11b(2.5g, 19.2mmol)溶於無水甲醇(60mL)中，加入10% Pd/C (500mg)，25℃攪拌16小時，TLC檢測反應完畢。將反應液過濾濃縮，得到油狀物1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-胺11c(1.89g)。

第三步：(2 S,5 R)-苯甲基-5-((2-氯-5-環丙基-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯（11e）的合成

將2,4-二氯-5-環丙基-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶 9a (3.0g, 8.37mmol)溶於二甲亞碸(20mL)中，加入二異丙基乙胺(3.25g, 25.1mmol)和(2 S,5 R)-5-氨基-2-甲基哌啶-1-羧酸苄基酯鹽酸鹽 11d (2.5g, 8.78mmol)，100℃攪拌2小時。LCMS檢測反應完畢。將反應液冷卻至室溫，加入飽和氯化銨水溶液(30mL)，使用乙酸乙酯(100mL x 2)進行萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液(50mL)洗滌，乾燥過濾後有機相減壓濃縮，殘留物經柱層析(四氫呋喃/二氯甲烷=1/4)純化，得到無色油狀物(2 S,5 R)-苯甲基-5-((2-氯-5-環丙基-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯11e(3.58 g) 。

LC-MS: Rt: 1.080 min; MS m/z (ESI): 570.5 [M+H].

第四步：苯甲基-(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1H-吡唑-4-基]氨基)-7-([2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基]甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯（11f）的合成

將(2 S,5 R)-苯甲基-5-((2-氯-5-環丙基-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯 11e(2.0g, 3.51mmol) 和1-( ²H ₃)甲基-1H-吡唑-4-胺 11c (400mg, 3.99mmol)溶於無水二氧六環(20mL)中，加入三(二亞苄基丙酮)二鈀(322mg, 351µmol)，4,5-雙(二苯基磷)-9,9-二甲基氧雜蒽(406mg, 702µmol)和碳酸銫(3.43g, 10.5mmol)，在氮氣氛圍下100℃攪拌16小時。LCMS檢測反應完畢。加入水(30mL)稀釋，使用乙酸乙酯(100mL x 2)進行萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液(50mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓濃縮，殘留物經柱層析(四氫呋喃/二氯甲烷=1/2)純化，得到白色固體苯甲基-(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1H-吡唑-4-基]氨基)-7-([2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基]甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯11f (2.57g) 。

LC-MS: Rt: 4.356 min; MS m/z (ESI): 635.2 [M+H].

第五步：苯甲基(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-基]氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯（11g）的合成

將苯甲基-(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1H-吡唑-4-基]氨基)-7-([2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基]甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯 (11f) (850mg, 1.34mmol)溶於無水二氯甲烷(8mL)中，加入三氟乙酸(8mL)，25℃攪拌2小時。LCMS檢測反應完畢。將反應液減壓濃縮得到的粗產品溶於無水四氫呋喃(12mL)和水(4mL)中，加入一水合氫氧化鋰(169mg, 4.02mmol)，25℃攪拌16小時。LCMS檢測反應完畢。反應液過濾，將濾液用1M稀鹽酸調節pH=6，使用乙酸乙酯(100mL)萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液(30mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓濃縮，殘留物經柱層析(四氫呋喃/二氯甲烷=1/3)純化，得到白色固體苯甲基-(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-基]氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯 (11g) (670mg)。

LC-MS: Rt: 0.887 min; MS m/z (ESI): 526.1 [M+Na].

第六步：5-環丙基- N ²-[1-(²H₃)甲基-1H-吡唑-4-基]- N ⁴-[(3 R,6 S)-6-甲基哌啶-3-基]-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-2,4-二胺（11h）的合成

將甲基-(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-基]氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯 (11g) (300mg, 596µmol)溶於三氟乙酸(5mL)中，加入三氟甲磺酸(268mg, 1.79mmol)，25℃攪拌30分鐘。TLC檢測反應完畢。反應液過濾濃縮，得到固體粗產品5-環丙基- N ²-[1-( ²H ₃)甲基-1H-吡唑-4-基]- N ⁴-[(3 R,6 S)-6-甲基哌啶-3-基]-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-2,4-二胺(11h) (200 mg)。

LC-MS: Rt: 0.729 min; MS m/z (ESI): 370.2[M+H].

第七步：1-[(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-基]氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮（011）的合成

將5-環丙基- N ²-[1-( ²H ₃)甲基-1H-吡唑-4-基]- N ⁴-[(3 R,6 S)-6-甲基哌啶-3-基]-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-2,4-二胺(200mg, 541µmol)溶於四氫呋喃(4mL)和水(2mL)中，在0℃下加入磷酸鉀(345mg, 1.62mmol)和丙烯醯氯(73.5mg, 812µmol)，25℃攪拌2小時。LCMS 檢測反應完畢。加水(15mL)稀釋，用乙酸乙酯(50mL x 2)萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液(30mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓濃縮，殘留物經柱層析(四氫呋喃/二氯甲烷=1/1)純化，得到的粗產品經Prep-HPLC[層析柱Phenomenex C18 80*40mm*3µm；流動相：A：水(含0.05%氫氧化銨v/v); B: 乙腈, B%: 27%-67%, 9min]分離純化，得到白色固體1-[(2 S,5 R)-5-[(5-環丙基-2-([1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-基]氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基]-2-甲基哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮 011(17.3 mg)。

LC-MS: Rt: 0.816 min; MS m/z (ESI): 446.1 [M+Na].

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ 10.59 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.09 (d, J= 15.4 Hz, 1H), 5.88 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 5.66 (s, 1H), 4.95 - 4.20 (m, 2H), 4.14 (s, 1H), 3.09 (s, 1H), 2.03 - 1.69 (m, 5H), 1.24 (s, 3H), 0.85 (d, J= 7.8 Hz, 2H), 0.63 - 0.44 (m, 2H).

實施例 4 化合物 012 的製備

1-((2S,5R)-5-((5-環丙基-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-基)-2,3,3-( ²H ₃)-丙-2-烯-1-酮的合成

參照實施例1的製備方法，不同的是將第五步的丙烯醯氯替換為2-丙烯醯-2,3,3-( ²H ₃)-氯，同法製得化合物012。

MS m/z (ESI): 424.1[M+H].

實施例 5 化合物 013 的製備

1-((2S,5R)-5-((5-環丙基-2-((1-( ²H ₃)甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-基)-2,3,3-( ²H ₃)-丙-2-烯-1-酮的合成

參照實施例3的製備方法，不同的是將第七步的丙烯醯氯替換為2-丙烯醯-2,3,3-( ²H ₃)-氯，同法制得化合物013。

MS m/z (ESI): 427.3[M+H].

對比例1 對比例1化合物的合成

1-((2 S,5 R)-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮

合成路線和具體合成步驟：

第一步： (2 S,5 R)- 苯甲基 -5-((2,5- 二氯 -7-((2-( 三甲基甲矽烷基 ) 乙氧基 ) 甲基 )-7 H- 吡咯并 [2,3- d] 嘧啶 -4- 基 ) 氨基 )-2- 甲基哌啶 -1- 甲酸基酯（中間體 2 ）的合成

將2,4,5-三氯-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶(3.72 g, 10.5 mmol)溶於二甲基亞碸(20mL)中，加入二異丙基乙胺(4.08g, 31.6mmol)和(2 S, 5 R)-5-氨基-2-甲基哌啶-1-羧酸苄基酯鹽酸鹽(3.0g, 10.5mmol)，100℃攪拌2小時。LCMS檢測反應完畢。將反應液冷卻至室溫，加入飽和氯化銨水溶液(30mL)，使用乙酸乙酯(100mL x 2)進行萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液(50mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓濃縮，殘留物經柱層析(四氫呋喃/二氯甲烷 =1/8)純化，得到白色固體(2 S,5 R)-苯甲基-5-((2,5-二氯-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯(4.65 g) 。

LC-MS: Rt: 1.006 min; MS m/z (ESI): 564.1 [M+H].

第二步：(2 S,5 R)-苯甲基-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯（中間體3）的合成

將(2 S,5 R)-苯甲基-5-((2,5-二氯-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯(3.2g, 5.67mmol)和1-甲基-1 H-吡唑-4-胺(720mg, 7.41mmol)溶於無水二氧六環(30mL)中，加入三(二亞苄基丙酮)二鈀(519mg, 567µmol)，4,5-雙(二苯基磷)-9,9-二甲基氧雜蒽(656mg, 1.13mmol)和碳酸銫(5.54g, 17.0mmol)，在氮氣氛圍下100℃攪拌16小時。LCMS檢測反應完畢。加入水(30mL)稀釋，使用乙酸乙酯(100mL x 2)進行萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液(50mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓濃縮，殘留物經柱層析(四氫呋喃/二氯甲烷 =1/4)純化，得到白色固體(2 S,5 R)-苯甲基-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯(2.82g)。

LC-MS: Rt: 1.112 min; MS m/z (ESI): 625.3 [M+H].

第三步：(2 S,5 R)-苯甲基-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯（中間體4）的合成

將(2 S,5 R)-苯甲基-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯(2.0g, 3.20mmol)溶於無水二氯甲烷(20mL)中，加入三氟乙酸(10mL)，25℃攪拌2小時。LCMS檢測反應完畢。將反應液減壓濃縮得到的粗產品溶於無水甲醇(30mL)中，加入碳酸鉀(2.5g, 18.1mmol)，25℃攪拌16小時。LCMS檢測反應完畢。將反應液過濾濃縮，殘留物用乙酸乙酯(100mL)溶解，有機相用飽和氯化鈉水溶液(30mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓濃縮，殘留物經柱層析(四氫呋喃/二氯甲烷 =1/3)純化，得到白色固體(2 S,5 R)-苯甲基-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯(730mg)。

LC-MS: Rt: 2.627 min; MS m/z (ESI): 495.3 [M+H].

第四步：5-氯- N ²-(1-甲基-1 H-吡唑-4-基)- N ⁴-((3 R,6 S)-6-甲基哌啶-3-基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-2,4-二胺（中間體5）的合成

將(2 S,5 R)-苯甲基-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-甲酸基酯(730mg, 1.47mmol)溶於三氟乙酸(5mL)中，加入三氟甲磺酸(664mg, 4.42mmol)，25℃攪拌30分鐘。TLC檢測反應完畢。反應液過濾濃縮，得到固體粗產品5-氯- N ²-(1-甲基-1 H-吡唑-4-基)- N ⁴-((3 R,6 S)-6-甲基哌啶-3-基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-2,4-二胺(532mg)。

LC-MS: Rt: 0.660 min; MS m/z (ESI): 361.1 [M+H].

第五步：1-((2 S,5 R)-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮的合成

將5-氯- N ²-(1-甲基-1 H-吡唑-4-基)- N ⁴-((3 R,6 S)-6-甲基哌啶-3-基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-2,4-二胺(532mg, 1.47mmol)溶於四氫呋喃(10mL)和水(5mL)中，在0℃下加入磷酸鉀(936mg, 4.41mmol)和丙烯醯氯(199mg, 2.21mmol)，25℃攪拌30分鐘。LCMS檢測反應完畢。加水(20mL)稀釋，用乙酸乙酯(50mL x 2)萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液(30mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓濃縮，殘留物經柱層析(四氫呋喃/二氯甲烷 =1/3)純化，得到的粗產品經Prep-HPLC[層析柱：YMC Triart 30*150mm*7µm；流動相：A: 水(含0.05%氫氧化銨v/v); B: 乙腈, B%: 28%-68%, 9min]分離純化，得到白色固體1-((2 S,5 R)-5-((5-氯-2-((1-甲基-1 H-吡唑-4-基)氨基)-7 H-吡咯并[2,3- d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮(160mg)。

LC-MS: Rt: 1.979 min; MS m/z (ESI): 415.1 [M+H].

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆ ) δ 11.19 (br s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.80 (br s, 1H), 7.41 (br s, 1H), 6.91 (d, J =2.3 Hz, 1H), 6.81 (br s, 1H), 6.14 - 6.05 (m, 2H), 5.64 (br s, 1H), 4.92 - 4.09 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.11 - 2.73 (m, 1H), 1.99 - 1.89 (m, 1H), 1.83 (br d, J =9.6 Hz, 1H), 1.70 (br s, 2H), 1.23 (br s, 3H).

生物學活性及相關性質測試例

測試實施例1：BTK激酶活性抑制實驗

實驗原理：BTK激酶與化合物共同孵育後，在ATP的作用下與受質反應。使用Promega公司的ADP-GLO檢測試劑盒對反應產生的ADP進行定量，從而反映酶活性。

實驗儀器：Labcyte公司Echo650移液系統；Perkin Elmer公司Envision酶標儀；Eppendorf公司5810離心機。

實驗材料：

試劑	品牌	貨號
Tris hydrochloride溶液	Sigma	T2663
BRIJ 35 detergent (10%)	Merck	203728
MgCl2 溶液	Sigma	M1028
ADP-Glo 激酶檢測試劑盒	Promega	V9102
BTK	Carna bioscience	08-180
Poly (4:1 Glu, Tyr)	Sigma	P0275
384孔板	Perkin Elmer	6007290

實驗方法：用Echo移液系統將待測化合物在二甲基亞碸(DMSO)中稀釋到不同濃度，轉移至384孔板中，並且加入2µL/孔的BTK，孵育30分鐘。然後加入3µL/孔的受質Poly(4:1 Glu, Tyr)和ATP的混合溶液，啟動酶反應。化合物終濃度從300nM起始，3倍稀釋。反應中酶的終濃度為1.7ng/孔，ATP終濃度為36µM，受質的終濃度為0.1mg/mL。反應1小時後，加入5µL/孔ADP-GLO試劑，孵育40分鐘。然後加入10µL/孔激酶反應檢測試劑，孵育30分鐘。用Envision酶標儀讀取螢光信號，並計算抑制率、半抑制濃度(IC ₅₀)。

本發明化合物的生物活性通過以上的試驗進行測定，測得的IC ₅₀值見下表1。

表1 實施例化合物對BTK激酶活性抑制的IC ₅₀

實施例化合物編號	IC ₅₀（nM）
009	3.43
010	3.92
011	4.98

測試實施例2：JAK3激酶活性抑制實驗

實驗原理：JAK3激酶與化合物共同孵育後，在ATP的作用下與受質反應。使用Promega公司的ADP-GLO檢測試劑盒對反應產生的ADP進行定量，從而反映酶活性。

實驗儀器：

Labcyte公司Echo650移液系統；Perkin Elmer公司Envision酶標儀；Eppendorf公司5810離心機。

實驗材料：

試劑	品牌	貨號
Tris hydrochloride溶液	Sigma	T2663
BRIJ 35 detergent (10%)	Merck	203728
MgCl ₂溶液	Sigma	M1028
ADP-Glo激酶檢測試劑盒	Promega	V9102
JAK3	Carna bioscience	08-046
Poly (4:1 Glu, Tyr)	Sigma	P0275
384孔板	Perkin Elmer	6007290

實驗方法：

用Echo移液系統將待測化合物在二甲基亞碸(DMSO)中稀釋到不同濃度，轉移至384孔板中，並且加入2µL/孔的JAK3，孵育30分鐘。然後加入3µL/孔的受質Poly(4:1 Glu, Tyr)和ATP的混合溶液，啟動酶反應。化合物終濃度分別從300nM起始，3倍稀釋。反應中酶的終濃度為1.9ng/孔，ATP終濃度為36µM，受質的終濃度為0.1mg/mL。反應1小時後，加入5µL/孔ADP-GLO試劑，孵育40分鐘。然後加入10µL/孔激酶反應檢測試劑，孵育30分鐘。用Envision酶標儀讀取螢光信號，並計算抑制率、半抑制濃度(IC ₅₀)。

本發明化合物的生物活性通過以上的試驗進行測定，測得的IC ₅₀值見下表2。

表2 本發明化合物對JAK3激酶活性抑制的IC ₅₀

實施例化合物編號	IC ₅₀（nM）
009	1.81
010	1.27
011	1.08

測試實施例3：JAK3/JAK2激酶選擇性實驗

實驗原理：本實驗使用Cisbio公司的HTRF KinEASE-TK試劑盒。JAK2激酶與化合物共同孵育後，在ATP的作用下催化特定受質磷酸化，通過檢測抗體產生的螢光值的變化，反映化合物對JAK2酶活性的抑制能力。同時，參照測試實施例2的方法，測定化合物對JAK3酶活性的抑制能力。通過比較化合物對JAK2和JAK3酶活性的抑制能力，得到化合物的JAK3/JAK2激酶選擇性倍數（即對JAK2的IC ₅₀與對JAK3的IC ₅₀的比值）。

實驗儀器：

實驗材料：

試劑	品牌	貨號
JAK2酶	Carna bioscience	08-045
HTRF KinEASE-TK試劑盒	Cisbio	62TK0PEB
384孔板	Perkin Elmer	6007290

實驗方法：

用Echo移液系統將待測化合物轉移至384孔板中，並且加入5µL/孔的JAK2，孵育5分鐘。然後加入5µL/孔的受質和ATP的混合溶液，啟動酶反應。化合物終濃度分別從3µM（溶劑為DMSO）起始，3倍稀釋。反應中酶的終濃度為0.05nM，ATP終濃度為0.6µM，受質的終濃度為2µM。反應1小時後，加入5µL/孔Streptavidin-XL665終濃度為0.125µM，再加入5µL/孔TK Antibody-Cryptate，孵育30分鐘。用Envision酶標儀讀取螢光信號，並計算抑制率、半抑制濃度（IC ₅₀）。參照測試實施例2的方法，測定化合物對JAK3激酶活性的抑制率和IC ₅₀。計算化合物在JAK2和JAK3兩個激酶活性測試中IC ₅₀的比值，對JAK2的IC ₅₀與對JAK3的IC ₅₀的比值即為化合物對JAK3/JAK2激酶的選擇性倍數。

通過以上試驗進行測定本發明化合物對JAK3/JAK2激酶的選擇性倍數，結果見下表3。

表3 受試化合物對JAK3/JAK2激酶的選擇性

受試化合物編號	IC _{50, JAK2}/IC _{50, JAK3}倍數
009	75.3
011	62.8
對比例1	4.4

注：IC _{50, JAK2}是指化合物對JAK2的IC ₅₀值，IC _{50, JAK3}是指化合物對JAK3的IC ₅₀值。IC _{50, JAK2}/IC _{50, JAK3}倍數越大，表明化合物對JAK3/JAK2激酶的選擇性越高。

實驗結論：本測試實施例表明，與對比例相比，本發明實施例化合物在JAK家族中對JAK3的抑制作用明顯強於對JAK2的抑制作用，且具有良好的JAK3/JAK2激酶選擇性。

測試實施例4：對Ramos細胞中BTK磷酸化的抑制作用

實驗原理：將Ramos細胞與化合物和刺激劑孵育後，使用Cisbio公司的BTK磷酸化檢測試劑盒，通過均相時間分辨螢光(HTRF)的方法檢測螢光能量的轉移，從而反映對磷酸化的抑制作用。

實驗儀器：

儀器	品牌	型號
生物安全櫃	ESCO	CLASSⅡ BSC
離心機	Eppendorf	5810
CO ₂培養箱	ESCO	CCL-170B-8
細胞計數儀	CountStar	IC1000
Envision	Perkin Elmer	/

實驗材料：

試劑	提供商	貨號
RPMI-1640培養基	GIBCO	A10491-01
去活化胎牛血清(HI-FBS)	GIBCO	10100147
HBSS溶液	GIBCO	14025-092
anti-human IgM抗體	Jackson Immuno	109-006-129
BTK phospho-Y223 HTRF檢測試劑盒	Cisbio	63ADK017PEH
384孔板	Perkin Elmer	6007680
Ramos	ATCC	CRL-1596

實驗方法：

用Echo移液系統將待測化合物轉移至384孔板中，將Ramos細胞密度調整為1 x 10 ⁷細胞/mL，加入10µL/孔細胞懸液，在37℃，5% CO ₂的培養箱中孵育1小時。然後加入5µL/孔的刺激劑anti-human IgM抗體，刺激劑終濃度為10µg/mL，孵育10分鐘。化合物終濃度為1µM起始，在二甲基亞碸(DMSO)中4倍稀釋。加入5µL/孔的細胞裂解液，室溫孵育30分鐘。使用Cisbio公司的BTK phospho-Y223試劑盒對BTK的磷酸化程度進行檢測，最終在Envision酶標儀上讀取發射光665nm和615nm下的螢光信號，計算抑制率和半抑制濃度(IC ₅₀)。

本發明化合物的生物活性通過以上的試驗進行測定，測得的IC ₅₀值見下表4。

表4 本發明化合物對Ramos細胞中BTK磷酸化抑制活性

實施例化合物編號	IC ₅₀（nM）
009	5.73
010	53.49
011	6.06

測試實施例5：對CTLL-2細胞中STAT5磷酸化的抑制作用

實驗原理：此實驗是評價化合物對JAK3下游受質STAT5磷酸化的影響。將CTLL-2細胞與化合物和刺激劑孵育後，使用Perkin Elmer公司的p-STAT5 (Tyr694/699)檢測試劑盒，通過時間分辨螢光的方法檢測供體微珠和受體微珠之間的螢光能量轉移，從而反映對磷酸化的抑制作用。

實驗儀器：

儀器	品牌	型號
生物安全櫃	Thermo Scientific	1300 Series A2
離心機	Eppendorf	5702
CO ₂培養箱	Thermo Scientific	371
細胞計數儀	Invitrogen	C10281
Envision	Perkin Elmer	/
Echo	Labcyte	655

實驗材料：

試劑	品牌	貨號
胎牛血清（FBS）	GIBCO	10099-141
二甲基亞碸（DMSO）	Sigma	D8418-1L
IL-2	R&D	402-ML-020
CTLL-2	ATCC	TIB-214
AlphaLISA SureFire Ultra p-STAT5 (Tyr694/699) 檢測試劑盒	Perkin Elmer	ALSU-PST5-B500

實驗方法：

將CTLL-2細胞種在384孔板中，1.5 x 10 ⁴細胞/15µL/孔，用Echo將化合物轉移至384孔板中，在37℃，5% CO ₂的培養箱中孵育30分鐘。然後加入5µL/孔的刺激劑IL-2，終濃度為1ng/mL，孵育30分鐘。化合物終濃度從3µM起始，在二甲基亞碸(DMSO)中3倍稀釋。加入5µL/孔細胞裂解液，室溫孵育10分鐘。用Perkin Elmer公司的AlphaLISA p-STAT5 (Tyr694/699)檢測試劑盒對STAT5的磷酸化程度進行檢測，最終在Envision酶標儀上讀取AlphaLISA信號，計算抑制率和半抑制濃度(IC ₅₀)。

本發明化合物的生物活性通過以上的試驗進行測定，測得的IC ₅₀值見下表5。

表5 本發明化合物對CTLL-2細胞中STAT5磷酸化的抑制活性

實施例化合物編號	IC ₅₀（nM）
009	46.85
010	143.82

測試實施例6：對小鼠脾臟中BTK靶點的佔據

實驗原理：此實驗是評價化合物在小鼠脾臟中對BTK靶點的佔據。將冷凍的脾臟樣品勻漿，然後與帶生物素標記的探針化合物孵育，化合物未佔據的BTK蛋白與探針結合，化合物已經佔據的BTK蛋白則不能與探針結合，通過ELISA方法檢測，從而反映化合物對BTK靶點的佔據。

實驗儀器：

儀器	品牌	型號
離心機	Eppendorf	5810
離心機	Eppendorf	5430R
組織研磨儀	美壁	LD48
Envision	Perkin Elmer	/

實驗材料：

儀器	品牌	型號
Anti-BTK抗體	Cell signal	8547S
鏈黴親和素包被板	R&D Systems	CP004
CNX-500	MCE	HY-100338
ELISA顯色液	R&D Systems	DY999
ELISA終止液	R&D Systems	DY994
RIPA裂解液	Sigma	R0278
Anti-rabbit IgG抗體	Cell signal	7074S
BCA Protein Assay試劑盒	Pierce	23225

實驗方法：使用C57BL/6N雌性小鼠，將待測化合物配製在2%吐溫80/0.5%甲基纖維素溶液中灌胃投藥，劑量為10mg/kg，投藥後0.5h或者24小時後取脾臟保存於乾冰中。將冷凍的脾臟樣品勻漿並用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白濃度調整一致後的脾臟勻漿液與探針化合物CNX-500孵育1小時，CNX-500終濃度為1µM。然後轉移100µL/孔至鏈黴親和素包被板中孵育過夜。棄上清並清洗，加入anti-BTK抗體孵育2小時。棄上清並清洗，加入HRP標記的Anti-rabbit IgG抗體，孵育1小時。棄上清並清洗，用顯色液顯色10-15分鐘，終止反應後，使用Envision在波長450nm下讀取吸光度值。計算佔據比率，佔據比率計算公式為：

其中：信號 _max表示：對照組樣品加入探針化合物後產生的信號；信號 _min表示：對照組樣品不加探針化合物後產生的信號；信號 _{待測化合物}表示：給待測化合物的樣品加入探針化合物後產生的信號。

實驗結果如表6所示。

表6 本發明化合物對小鼠脾臟中BTK靶點的佔據

化合物編號	劑量	BTK佔據
時間點	佔據比率
009	10mpk	0.5h	100%
24h	43%

測試實施例7：對小鼠全血中IL-2誘導的STAT5磷酸化的抑制作用

實驗原理：此實驗是評價化合物對JAK3下游受質STAT5磷酸化的影響。小鼠口服投藥後取全血，加入刺激劑IL-2孵育15分鐘，通過流式細胞技術檢測淋巴細胞中STAT5磷酸化水平，從而反映化合物對JAK3靶點的抑制作用。

實驗儀器：

儀器	品牌	型號
生物安全櫃	ESCO	CLASSⅡ BSC
離心機	Eppendorf	5810
CO ₂培養箱	ESCO	CCL-170B-8
Flow cytometer	BD Biosciences	Canto II
-4℃冷藏箱	海爾	HYC-650

實驗材料：

試劑	品牌	貨號
AF647 Mouse Anti-pStat5抗體	BD Biosciences	562076
BV 421 anti-mouse CD8 抗體	Biolegend	100738
BV421 Anti-Mouse CD3抗體	BD Biosciences	740014
FITC Anti-Mouse CD4抗體	BD Biosciences	553047
IL-2	R&D	402-ML-020
小鼠Fc封閉抗體	Biolegend	156603
裂解固定液	BD Biosciences	558049
細胞染色液	Biolegend	420201
96孔板	Corning	3799
Perm Buffer III	BD Biosciences	558050
96孔深孔板	Axygen	P-96-450V-C

實驗方法：使用C57BL/6N雌性小鼠，將待測化合物配製在2% Tween80/0.5%甲基纖維素溶液中，灌胃投藥，劑量為10mg/kg，投藥0.5小時後取全血置於肝素鈉抗凝管中。將全血80µL/孔種於96孔板中，加入小鼠Fc封閉抗體，然後再加入檢測抗體5µL/孔，不同批次實驗中檢測抗體為CD8抗體或者CD3抗體/CD4抗體混合液。加入10µL/孔刺激劑IL-2，孵育15分鐘，刺激劑終濃度為200ng/mL。將全血轉移60µL/孔至96孔深孔板中，並加入裂解固定液350µL/孔，孵育10分鐘。離心棄上清後，將細胞重懸於100µL/孔Perm Buffer III，孵育30分鐘。離心棄上清，加入pSTAT5抗體50µL/孔，孵育30分鐘。離心棄上清後，將細胞重懸於染色液中，用流式細胞儀檢測pSTAT5的信號，並計算抑制率。抑制率計算公式為：

其中：信號 _max表示：對照組樣品加入刺激劑IL-2後產生的信號；信號 _min表示：對照組樣品不加刺激劑IL-2後產生的信號；信號 _{待測化合物}表示：給待測化合物的樣品加入刺激劑IL-2後產生的信號。

實驗結果如表7所示。

表7 本發明化合物對小鼠全血中IL-2誘導的STAT5磷酸化的抑制作用

化合物編號	劑量	對STAT5磷酸化的抑制作用
時間點	抑制率
009	10mpk	0.5h	54%

測試實施例8：大鼠CIA模型藥效實驗

選擇7-8週齡Lewis雌性大鼠，每隻大鼠使用三點注射法，異氟烷麻醉大鼠，前兩個點在背部兩側大腿根部剃毛後皮內注射各100μL乳劑，第三個點在離尾底2cm處，將針頭斜朝上並與尾平行插入，直到針頭尖端離尾底0.5cm處，在尾基部皮下注射50μL乳劑。乳劑製備方法如下：將濃度為2mg/mL的免疫級牛II型膠原(Chondrex)與IFA(弗氏不完全佐劑, Chondrex)聯通注射器等體積混合，起始由IFA推注到膠原溶液中，牛II型膠原終濃度為1mg/mL，在混合過程中保持乳劑的冷卻。初次誘導7天後，再次誘導，在相同部位（避開初次注射點）注射同等劑量乳劑。

臨床發病一般在第2週開始，可從初次誘導後14天進行關節炎評分，根據每隻大鼠的疾病評分（主要）和足趾腫脹體積進行分組，保證每組大鼠的疾病指標盡可能均一，並在分組完，開始投藥治療。

疾病發病評價：

（1）臨床評分：0，正常；1，輕微，但明確的發紅和腫脹的腳踝或手腕，或明顯的發紅和腫脹僅限於個別手指，無論受影響的手指數量；2，腳踝或腕部中度發紅和腫脹；3，整個爪子嚴重發紅和腫脹，包括手指；4，肢體嚴重發炎，多關節受累。

（2）足趾腫脹體積測量：在選定的時間點，異氟烷麻醉大鼠，用不可磨滅的記號筆標記大鼠後爪，用肢體腫脹測量儀（ugo basile Italy）測定大鼠後爪腫脹情況，以體積變化表示。大鼠CIA模型治療方案：將試驗動物分組為空白組、陰性對照組、陽性對照組及實驗組，其中實驗組化合物009設置投藥劑量為10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg，陽性對照組為10mg/kg的JAK抑制劑托法替尼，陰性對照組為空白溶媒（2%吐溫80/0.5%甲基纖維素），自分組當天開始灌胃投藥，連續治療12天。期間監測大鼠後肢體積及臨床評分，評分時由獨立第二人盲法評價。

根據圖1和圖2所示：化合物009 10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg治療性投藥，可劑量依賴性減輕大鼠關節炎臨床評分，顯著緩解足趾腫脹程度。同等劑量下，化合物009的藥效優於陽性參照藥物JAK抑制劑托法替尼。

以上，對本發明的實施方式進行了說明。但是，本發明不限定於上述實施方式。凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。

圖1為大鼠CIA模型中各組大鼠的臨床關節炎評分隨時間變化的曲線；及圖2為大鼠CIA模型中各組大鼠的後肢體積隨時間變化的曲線。

Claims

一種式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽：
（Ia）其中， X為NH； R ¹選自任選被R ^a取代的以下基團：C ₁-C ₁₀烷基或3-10元雜環基； R ^a選自氘、F、Cl、Br、I、OH、CN、＝O、NO ₂或任選被R ^b取代的下列基團：NH ₂、SH、S(O)NH ₂、S(O)(C ₁-C ₁₀烷基)、S(O) ₂(C ₁-C ₁₀烷基)、P(O)(C ₁-C ₁₀烷基)、C ₁-C ₁₀烷基、C ₃-C ₁₄環烷基、3-14元雜環基、C ₁-C ₁₀烷氧基、C ₃-C ₁₄環烷基氧基、3-14元雜環基氧基、C ₂-C ₁₀烯基、C ₂-C ₁₀炔基、C ₆-C ₁₀芳基、5-10元雜芳基、C ₆-C ₁₀芳基氧基或5-10元雜芳基氧基； R ^b選自F、Cl、Br、I、OH、CN、＝O、NO ₂、NH ₂、SH、C ₁-C ₁₀烷基、C ₃-C ₁₄環烷基、3-14元雜環基、C ₁-C ₁₀烷氧基、C ₃-C ₁₄環烷基氧基、3-14元雜環基氧基、C ₂-C ₁₀烯基、C ₂-C ₁₀炔基、C ₆-C ₁₀芳基、5-10元雜芳基、C ₆-C ₁₀芳基氧基或5-10元雜芳基氧基； R ²選自C ₃-C ₆環烷基或苯基，該C ₃-C ₆環烷基或苯基任選被R ^d取代； R ^d選自F、Cl、Br、I、OH、CN或任選被選自F、Cl、Br、I、OH的基團取代的C ₁-C ₄烷基； R ³選自H、F、Cl、Br、I或任選被選自F、Cl、Br、I、OH的基團取代的C ₁-C ₁₀烷基； R ⁴為C ₁-C ₆烷基； n選自0或1。
如請求項1所述的式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該R ^a選自F、Cl、Br、I、OH、CN、＝O、NO ₂或任選被R ^b取代的下列基團：NH ₂、SH、S(O)NH ₂、S(O)(C ₁-C ₁₀烷基)、S(O) ₂(C ₁-C ₁₀烷基)、P(O)(C ₁-C ₁₀烷基)、C ₁-C ₁₀烷基、C ₃-C ₁₄環烷基、3-14元雜環基、C ₁-C ₁₀烷氧基、C ₃-C ₁₄環烷基氧基、3-14元雜環基氧基、C ₂-C ₁₀烯基、C ₂-C ₁₀炔基、C ₆-C ₁₀芳基、5-10元雜芳基、C ₆-C ₁₀芳基氧基或5-10元雜芳基氧基。
如請求項1所述的式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該R ⁴為甲基。
如請求項1至3中任一項所述的式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該R ²選自C ₃-C ₆環烷基或苯基，優選為環丙基。
如請求項1至3中任一項所述的式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該R ¹選自C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基，該C ₁-C ₆烷基或4-6元雜環基任選被R ^a取代。
如請求項5所述的式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該R ¹選自甲基或氘代甲基。
如請求項1至6中任一項所述的式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該式（Ia）的丙烯醯基中的H被1個或多個氘原子取代。
如請求項1至7中任一項所述的式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該式（Ia）化合物或其藥學上可接受的鹽選自式（IIa）化合物或其藥學上可接受的鹽：
（IIa）其中，X、R ¹、R ²、R ³、R ⁴和n如請求項1至7任一項中所定義。
如請求項1至8中任一項所述的式（Ia）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該n為1。
一種如下化合物或其藥學上可接受的鹽：

或
。
一種藥物組合物，該組合物包含請求項1至10中任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
如請求項1至10中任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或者請求項11的藥物組合物在預防或者治療Janus激酶和/或布魯頓酪氨酸激酶相關性疾病中的用途，該Janus激酶和/或布魯頓酪氨酸激酶相關性疾病優選為腫瘤或自身免疫性疾病。