TW202214139A - 製造人工毛髮用纖維之方法、製造人工毛髮之方法、人工毛髮用纖維,及人工毛髮 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示製造經賦予特定形狀之人工毛髮用纖維之方法,及經賦予特定形狀之於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮的人工毛髮用纖維。製造人工毛髮用纖維之方法,包含於含有改造絲蛋白之絲蛋白纖維的表面導入半胱胺酸,與將絲蛋白纖維在沿著特定形狀之狀態保持的狀態下,使絲蛋白纖維與冷燙髮液接觸。特定形狀,為包含彎曲部分、直線狀部分或此等兩方之形狀。
Description
本發明係關於製造賦予特定形狀之人工毛髮用纖維之方法,及製造人工毛髮之方法。又,本發明係關於人工毛髮用纖維,及人工毛髮。
以往,作為假髮及接髮等之人工毛髮之材料,係使用人類毛髮或非天然纖維。人工毛髮用之非天然纖維,一般係使用聚酯纖維或丙烯酸纖維(例如專利文獻1)。非天然纖維,具有較人類毛髮更高強度且可以均一品質且安定地大量獲得所期望之長度者之優點。進一步地,亦提出有期待環境負荷更小之再生膠原蛋白纖維等之毛髮用人工蛋白質纖維(例如專利文獻2)。
而為了確保造型廣泛的變化性,有藉由所謂燙髮處理對人工毛髮賦予包含彎曲部分之形狀,或直線狀之形狀的情況。例如專利文獻2,提出藉由對膠原蛋白分子化學修飾巰基及/或雙硫鍵,得到可進行燙髮處理之再生膠原蛋白纖維。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2007-297737號公報
[專利文獻2]日本特開平11-323727號公報
[發明所欲解決之課題]
含有改造絲蛋白之絲蛋白纖維,亦被期待作為人工毛髮用纖維之應用。但是,使用以往之燙髮液進行處理,亦有難以對絲蛋白纖維賦予形狀,或所賦予的形狀容易因水洗等而消失的問題。
因而,本發明提供在使用絲蛋白纖維同時,可得到可輕易地賦予特定形狀,而且形狀之保持性優良的人工毛髮用纖維之方法。
[用以解決課題之手段]
本發明者等人經各種探討的結果,發現藉由於含有改造絲蛋白之絲蛋白纖維的表面導入半胱胺酸,可對絲蛋白纖維輕易地賦予特定形狀,而且形狀良好地被保持。亦即,本發明之一形態係關於以下。
[1]一種製造經賦予特定形狀之人工毛髮用纖維之方法,其包含
於含有改造絲蛋白之絲蛋白纖維的表面導入半胱胺酸,與
將前述絲蛋白纖維在沿著特定形狀之狀態保持的狀態下,使前述絲蛋白纖維與冷燙髮液接觸,且
前述特定形狀,為包含彎曲部分、直線狀部分或此等兩方之形狀。
[2]如[1]之方法,其中藉由前述絲蛋白纖維與含有半胱胺酸之溶液的接觸,於前述絲蛋白纖維之表面導入半胱胺酸,之後,使前述絲蛋白纖維與前述冷燙髮液接觸。
[3]如[2]之方法,其中前述冷燙髮液,為包含含有還原劑之第1液及含有氧化劑之第2液的2液型冷燙髮液,且
使於表面經導入半胱胺酸之前述絲蛋白纖維,依序與前述第2液、前述第1液及前述第2液接觸。
[4]如[1]之方法,其中前述冷燙髮液,為包含含有還原劑之第1液及含有氧化劑之第2液的2液型冷燙髮液,
前述第1液進一步含有半胱胺酸,且
藉由前述絲蛋白纖維與前述第1液之接觸,於前述絲蛋白纖維之表面導入半胱胺酸,之後,使前述絲蛋白纖維與前述第2液接觸。
[5]如[4]之方法,其中前述絲蛋白纖維與前述第1液之接觸時間,較前述絲蛋白纖維與前述第2液之接觸時間更長。
[6]如[3]~[5]中任一項之方法,其中一邊加熱前述第2液,一邊使前述絲蛋白纖維與前述第2液接觸。
[7]如[1]~[6]中任一項之方法,其中前述絲蛋白纖維係藉由捲繞於芯材,於沿著包含彎曲部分之前述特定形狀之狀態下被保持。
[8]如[1]~[7]中任一項之方法,其中前述改造絲蛋白包含改造蜘蛛絲絲蛋白。
[9]如[1]~[8]中任一項之方法,其中前述絲蛋白纖維,為於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮的纖維。
[10]一種製造人工毛髮之方法,其包含藉由如[1]~[9]中任一項之方法,得到經賦予特定形狀之人工毛髮用纖維。
[11]一種人工毛髮用纖維,其係藉由如[9]之方法被賦予特定形狀,於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮。
[12]一種人工毛髮,其包含如[11]之人工毛髮用纖維。
[發明之效果]
依照本發明之一形態,可在使用可安定供給且環境負荷小之絲蛋白纖維的同時,輕易地得到經賦予特定形狀之人工毛髮用纖維。藉由本發明之一形態之方法所得到之人工毛髮用纖維,於形狀之保持性方面亦優良。藉由本發明之一形態所提供的人工毛髮用纖維及包含其之人工毛髮,在使用非天然纖維的同時,可安定供給,且可抑制與人類毛髮之間產生不協調感。
以下詳細說明用以實施本發明之形態。惟,本發明不限定於以下實施形態。
(製造人工毛髮用纖維之方法)
製造經賦予特定形狀之人工毛髮用纖維之方法之一實施形態,包含於含有改造絲蛋白之絲蛋白纖維的表面導入半胱胺酸,與將絲蛋白纖維在沿著特定形狀之狀態保持的狀態下,使絲蛋白纖維與冷燙髮液接觸。藉由該方法,可容易得到經賦予特定形狀之包含絲蛋白纖維之人工毛髮用纖維。此處之特定形狀,可為包含彎曲部分、直線狀部分或此等兩方之形狀。包含彎曲部分之形狀,亦可稱為捲曲之形狀。
圖1為顯示製造經賦予包含彎曲部分之形狀(或捲曲之形狀)的人工毛髮用纖維之方法的一例之示意圖。圖1所示之方法中,絲蛋白纖維70係沿著圓柱狀之芯材75的外周面被捲繞。絲蛋白纖維70被捲繞於芯材75之前,或絲蛋白纖維70被捲繞於芯材75之後,於絲蛋白纖維70之表面導入半胱胺酸。藉由使於表面導入半胱胺酸之絲蛋白纖維70,在沿著捲曲之形狀的狀態下與冷燙髮液接觸,對絲蛋白纖維70,賦予對應於芯材75之外周面形狀的捲曲之形狀。經賦予捲曲之形狀的絲蛋白纖維70,自芯材75脫離後,亦可維持被賦予的形狀。
芯材75之直徑並無特殊限制,通常係1~100mm之範圍內。芯材之形狀不限於圓柱狀。
藉由使絲蛋白纖維70,與含有半胱胺酸之溶液(通常係半胱胺酸水溶液)接觸,可於絲蛋白纖維70之表面導入半胱胺酸。藉由該方法導入於絲蛋白纖維70之表面的半胱胺酸,可認為通常不與絲蛋白纖維70生成共價鍵,而是吸附於絲蛋白纖維70表面。例如,可藉由將絲蛋白纖維70浸漬於含有半胱胺酸之溶液,或於含有絲蛋白纖維70之複數單紗的纖維束中含浸含有半胱胺酸之溶液,使絲蛋白纖維70與含有半胱胺酸之溶液接觸。此時的含有半胱胺酸之溶液之溫度並無特殊限制,例如可為10℃以上、20℃以上、30℃以上,或40℃以上,可為未達100℃、90℃以下,或80℃以下。絲蛋白纖維70與含有半胱胺酸之溶液的接觸時間並無特殊限制,例如可為1分鐘以上,且24小時以內、12小時以內,或6小時以內,可為5分鐘以上,且24小時以內、12小時以內,或6小時以內,亦可為10分鐘以上,且24小時以內、12小時以內,或6小時以內。與含有半胱胺酸之溶液接觸後的絲蛋白纖維70亦可水洗。
含有半胱胺酸之溶液中的半胱胺酸之濃度,以溶液全體的質量為基準,例如可為0.1質量%以上,或0.5質量%以上,可為30質量%以下。如後述般冷燙髮液含有半胱胺酸時,半胱胺酸之濃度亦可為此等數值範圍內。
冷燙髮液,可為用於毛髮之燙髮而通常所使用者。例如,可使用包含含有還原劑之第1液及含有氧化劑之第2液的2液型之冷燙髮液。可認為藉由與含有氧化劑之第2液的接觸,半胱胺酸彼此結合而形成胱胺酸。亦可使第1液及第2液分別1次以上接觸於表面導入有半胱胺酸之絲蛋白纖維70。絲蛋白纖維70,通常係與第1液及第2液交互地接觸,但通常最後係與第2液接觸。例如,可使表面導入有半胱胺酸之絲蛋白纖維70,依序與第2液、第1液及第2液接觸。
例如,藉由將絲蛋白纖維70浸漬於第1液或第2液,或於含有絲蛋白纖維70之複數單紗的纖維束中含浸第1液或第2液,可使絲蛋白纖維70與第1液或第2液接觸。與絲蛋白纖維70接觸之第1液及/或第2液亦可被加熱。與絲蛋白纖維70接觸之第1液及第2液之溫度並無特殊限制,例如可為10℃以上且未達100℃、90℃以下,或80℃以下,可為20℃以上且未達100℃、90℃以下,或80℃以下,可為30℃以上且未達100℃、90℃以下,或80℃以下,亦可為40℃以上且未達100℃、90℃以下,或80℃以下。特別亦可將第2液加熱至30℃以上,或40℃以上。絲蛋白纖維70與第1液或第2液之接觸時間並無特殊限制,例如可為1分鐘以上且24小時以內、12小時以內,或6小時以內,可為5分鐘以上且24小時以內、12小時以內,或6小時以內,亦可為10分鐘以上且24小時以內、12小時以內,或6小時以內。
冷燙髮液之第1液,可為含有還原劑及半胱胺酸之混合液。此時,可藉由絲蛋白纖維70與第1液之接觸,於絲蛋白纖維70之表面導入半胱胺酸。絲蛋白纖維70與含有半胱胺酸之第1液之接觸後,絲蛋白纖維70係與第2液接觸。此時之第1液及第2液之溫度及接觸時間可與上述相同。絲蛋白纖維70與含有半胱胺酸之第1液之接觸時間,較絲蛋白纖維70與第2液之接觸時間更長時,係有對絲蛋白纖維70所賦予的形狀更容易被保持的傾向。
與最終之燙髮液(典型而言係第2液)接觸後之絲蛋白纖維70,亦可經水洗。可將水洗後之絲蛋白纖維70以加熱等之任意方法乾燥。
可將經賦予特定形狀的絲蛋白纖維70,作為構成人工毛髮之人工毛髮用纖維來使用。包含絲蛋白纖維之人工毛髮用纖維,可安定供給,且可抑制與人類毛髮之間產生不協調感。人工毛髮例如可使用於假髮用毛髮,及直接安裝於頭部的增毛用毛髮、接髮用毛髮等。
(絲蛋白纖維)
絲蛋白纖維70,含有改造絲蛋白作為主成分,可為藉由將改造絲蛋白予以紡絲所形成之纖維。捲繞於芯材75之絲蛋白纖維70,亦可為紡絲後不與液體的水直接接觸之纖維。
絲蛋白纖維70可為單紗、亦可為含有複數單紗之纖維束。絲蛋白纖維70之直徑(單紗直徑),例如可為10~100μm。就形狀之賦予容易性,及被賦予之形狀之維持的觀點,絲蛋白纖維70之單紗直徑,可超過30μm,亦可為35μm以上,或40μm以上。就相同之觀點,絲蛋白纖維70之單紗直徑,可為未達80μm,或70μm以下。
本說明書中「改造絲蛋白」,意指經人為製造之絲蛋白(人造絲蛋白)。改造絲蛋白,可為其結構域序列與天然來源之絲蛋白的胺基酸序列相異之絲蛋白、亦可為與天然來源之絲蛋白的胺基酸序列相同之絲蛋白。
改造絲蛋白亦可為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m,或式2:[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體(motif)表示之結構域序列的蛋白質。改造絲蛋白中,於結構域序列之N末端側及C末端側的任一者或兩者,亦可進一步附加胺基酸序列(N末端序列及C末端序列)。N末端序列及C末端序列,典型而言,為不具有絲蛋白特徵性的胺基酸結構模體之反復的區域,其包含100殘基左右的胺基酸,但不限定於此。
「改造絲蛋白」,可為直接利用天然來源之絲蛋白的胺基酸序列者、可為依據天然來源之絲蛋白的胺基酸序列而改造其胺基酸序列者(例如藉由改造經選殖的天然來源之絲蛋白的基因序列而改造了胺基酸序列者)、亦可為不依據天然來源之絲蛋白而經人工設計及合成者(例如藉由化學合成編碼所設計之胺基酸序列的核酸而具有所期望之胺基酸序列者)。
本說明書中「結構域序列」,係指產生絲蛋白特有之結晶區域(典型而言,相當於胺基酸序列之(A)
n結構模體)與非晶區域(典型而言,相當於胺基酸序列之REP)之胺基酸序列,意指式1:[(A)
n結構模體-REP]
m,或式2:[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體表示之胺基酸序列。此處,(A)
n結構模體,表示以丙胺酸殘基為主之胺基酸序列,胺基酸殘基數為2~27。(A)
n結構模體之胺基酸殘基數,可為2~20、4~27、4~20、8~20、10~20、4~16、8~16,或10~16之整數。又,相對於(A)
n結構模體中之全部胺基酸殘基數,丙胺酸殘基數之比例只要40%以上即可,亦可為60%以上、70%以上、80%以上、83%以上、85%以上、86%以上、90%以上、95%以上,或100%。結構域序列中複數存在的(A)
n結構模體,至少7個亦可僅以丙胺酸殘基構成。REP表示由2~200個胺基酸殘基所構成之胺基酸序列。REP亦可為由10~200個胺基酸殘基所構成之胺基酸序列。m表示2~300之整數,亦可為10~300之整數。複數存在之(A)
n結構模體,可為互為相同之胺基酸序列、亦可為不同的胺基酸序列。複數存在之REP,可為互為相同之胺基酸序列、亦可為不同的胺基酸序列。
本實施形態之改造絲蛋白,例如可藉由對選殖之天然來源之絲蛋白的基因序列,進行例如相當於1或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或附加的胺基酸序列之改造而得到。胺基酸殘基之取代、缺失、插入及/或附加,可藉由部分特異性突變誘發法等之所屬技術領域中具有通常知識者所週知的方法來進行。具體而言,可根據Nucleic Acid Res.10,6487(1982)、Methods in
Enzymology,100,448(1983)等之文獻記載的方法來進行。
天然來源之絲蛋白,為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m,或式2:[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體表示之結構域序列之蛋白質,具體而言,例如可列舉昆蟲或蜘蛛類所產生之絲蛋白。
昆蟲所產生之絲蛋白,例如可列舉家蠶(Bombyx mori)、野家蠶(Bombyx mandarina)、天蠶(Antheraea yamamai)、柞蠶(Anteraea pernyi)、四黑目天蠺(Eriogyna pyretorum)、蓖麻蠶(Pilosamia Cynthia ricini)、珍珠蠶(Samia cynthia)、雙黑目天蠶(Caligura japonica)、印度柞蠶(Antheraea mylitta)、琥珀蠶(Antheraea assama)等之蠶所產生的絲蛋白質,及黃色胡蜂(Vespa simillima xanthoptera)之幼蟲所吐出的胡蜂絲蛋白質。
昆蟲所產生之絲蛋白之更具體的例子,例如可列舉蠶・絲蛋白L鏈(GenBank登錄編號M76430(鹼基序列),及AAA27840.1(胺基酸序列))。
蜘蛛類所產生之絲蛋白,例如可列舉鬼蛛、十字園蛛、方園蛛、五紋鬼蛛及野島園蛛(Araneus nojimai)等之屬於鬼蛛屬(Araneus屬)的蜘蛛;青新園蛛、嗜水新園蛛、灌木新園蛛及類青新園蛛等之屬於姬鬼蛛屬(Neoscona屬)的蜘蛛;棕類岬蛛等之屬於棕類岬蛛屬(Pronus屬)的蜘蛛、鳥糞蛛及大鳥糞蛛等之屬於鳥糞蛛屬(Cyrtarachne屬)的蜘蛛、棘蛛及乳突棘腹蛛等之屬於棘蛛屬(Gasteracantha屬)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛及六刺瘤腹蛛等之屬於瘤腹蛛屬(Ordgarius屬)的蜘蛛;悅目金蛛、小悅目金蛛及橫紋金蛛等之屬於金蛛屬(Argiope屬)的蜘蛛;雙峰曳尾蛛等之屬於曳尾蛛屬(Arachnura屬)的蜘蛛、吊葉蛛等之屬於吊葉蛛屬(Acusilas屬)的蜘蛛;雲斑蛛、花雲斑蛛及單色雲斑蛛等之屬於雲斑蛛屬(Cytophora屬)的蜘蛛;無鱗尖鼻蛛等之屬於尖鼻蛛屬(Poltys屬)的蜘蛛;八疣塵蛛、四突塵蛛、圓腹塵蛛及黑尾塵蛛等之屬於塵蛛屬(Cyclosa屬)的蜘蛛,及日本壯頭蛛等之屬於壯頭蛛屬(Chorizopes屬)的蜘蛛所產生的蜘蛛絲蛋白質,以及前齒長腳蛛、日本長腳蛛、直伸肖峭及綠鱗長腳蛛等之屬於長腳蛛屬(Tetragnatha屬)的蜘蛛;縱條銀鱗蛛、肩斑銀鱗蛛及近肩斑銀腹蛛等之屬於銀鱗蛛屬(Leucauge屬)的蜘蛛;女郎蜘蛛及大木林蜘蛛等之屬於絡新婦屬(Nephila屬)的蜘蛛、美麗麥蛛等之屬於麥蛛屬(Menosira屬)的蜘蛛、鋸螯蛛等之屬於鋸螯蛛屬(Dyschiriognatha屬)的蜘蛛;黑寡婦蜘蛛、紅背蜘蛛、棕色寡婦蛛及間斑寇蛛等之屬於寇蛛屬(Latrodectus屬)的蜘蛛,及屬於育兒網蛛屬(Euprosthenops屬)的蜘蛛等之屬於長腳蛛科(Tetragnathidae科)的蜘蛛所產生的蜘蛛絲蛋白質。蜘蛛絲蛋白質,例如可列舉MaSp(MaSp1及MaSp2)、ADF(ADF3及ADF4)等之牽引絲蛋白質、MiSp(MiSp1及MiSp2)等。
蜘蛛類所產生的蜘蛛絲蛋白質之更具體的例子,例如可列舉fibroin-3(adf-3)[Araneus diadematus來源] (GenBank登錄編號AAC47010(胺基酸序列)、U47855 (鹼基序列))、fibroin-4(adf-4)[Araneus diadematus來源] (GenBank登錄編號AAC47011(胺基酸序列)、U47856(鹼基序列))、dragline silk protein spidroin 1[Nephila clavipes來源](GenBank登錄編號AAC04504(胺基酸序列)、U37520 (鹼基序列))、major ampullate spidroin 1 [Latrodectus hesperus來源](GenBank登錄編號ABR68856 (胺基酸序列)、EF595246(鹼基序列))、dragline silk protein spidroin 2[Nephila clavata來源](GenBank登錄編號AAL32472(胺基酸序列)、AF441245(鹼基序列))、major ampullate spidroin 1[Euprosthenops australis來源] (GenBank登錄編號CAJ00428(胺基酸序列)、AJ973155(鹼基序列)),及major ampullate spidroin 2[Euprosthenops australis](GenBank登錄編號CAM32249.1(胺基酸序列)、AM490169(鹼基序列))、minor ampullate silk protein 1 [Nephila clavipes](GenBank登錄編號AAC14589.1(胺基酸序列))、minor ampullate silk protein 2[Nephila clavipes] (GenBank登錄編號AAC14591.1(胺基酸序列))、minor ampullate spidroin-like protein[Nephilengys cruentata] (GenBank登錄編號ABR37278.1(胺基酸序列)等。
天然來源之絲蛋白之更具體的例子,可進一步列舉於NCBI GenBank登錄序列資訊之絲蛋白。例如,可藉由自NCBI GenBank所登錄之序列資訊當中作為DIVISION而包含INV之序列之中,擷取於DEFINITION中記載spidroin、ampullate、fibroin、「silk及polypeptide」,或「silk及protein」作為關鍵字的序列;由CDS擷取特定之product之文字列;由SOURCE擷取特定TISSUE TYPE之文字列所記載的序列來來確認。
本實施形態之改造絲蛋白,可為改造絲(silk)絲蛋白(蠶所產生的絲蛋白質之胺基酸序列經改造者)、亦可為改造蜘蛛絲絲蛋白(蜘蛛類所產生的蜘蛛絲蛋白質之胺基酸序列經改造者)。改造絲蛋白,亦可為改造蜘蛛絲絲蛋白。
改造絲蛋白之具體的例子,可列舉蜘蛛之大壺狀腺所產生之大吐絲管曳絲蛋白質來源的改造絲蛋白(第1改造絲蛋白)、具有甘胺酸殘基之含量經減低的結構域序列之改造絲蛋白(第2改造絲蛋白)、具有(A)
n結構模體之含量經減低的結構域序列之改造絲蛋白(第3改造絲蛋白)、甘胺酸殘基之含量及(A)
n結構模體之含量經減低的改造絲蛋白(第4改造絲蛋白)、具有包含局部疏水性指標大的區域之結構域序列的改造絲蛋白(第5改造絲蛋白),以及具有麩醯胺殘基之含量經減低的結構域序列之改造絲蛋白(第6改造絲蛋白)。
第1改造絲蛋白,可列舉包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列的蛋白質。第1改造絲蛋白中,(A)
n結構模體之胺基酸殘基數,可為3~20、4~20、8~20、10~20、4~16、8~16,或10~16之整數。第1改造絲蛋白,於式1中,構成REP之胺基酸殘基的數目,可為10~200殘基、10~150殘基、20~100殘基、20~75殘基。第1改造絲蛋白,於式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之胺基酸序列中所包含的甘胺酸殘基、絲胺酸殘基及丙胺酸殘基之合計殘基數,相對於胺基酸殘基數全體,可為40%以上、60%以上,或70%以上。
第1改造絲蛋白,可為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之胺基酸序列之單位,且C末端序列為序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列或與序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列具有90%以上之同源性的胺基酸序列之多肽。
序列編號1所示之胺基酸序列,與由ADF3 (GI:1263287、NCBI)之胺基酸序列之C末端50殘基之胺基酸所成的胺基酸序列相同,序列編號2所示之胺基酸序列,與由序列編號1所示之胺基酸序列之C末端去除20殘基的胺基酸序列相同,序列編號3所示之胺基酸序列,與由序列編號1所示之胺基酸序列之C末端去除29殘基的胺基酸序列相同。
第1改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉包含(1-i)序列編號4(recombinant spider silk protein
ADF3KaiLargeNRSH1)表示之胺基酸序列,或(1-ii)與序列編號4表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列之改造絲蛋白。序列同一性可為95%以上。
序列編號4表示之胺基酸序列,為經於N末端附加包含起始密碼子、His10標籤及HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)辨識位點的胺基酸序列(序列編號5)之ADF3之胺基酸序列中,第1~13號之反復區域增加為約2倍,並且轉譯於第1154號胺基酸殘基終止的方式變異者。序列編號4表示之胺基酸序列之C末端之胺基酸序列,係與序列編號3表示之胺基酸序列相同。
(1-i)之改造絲蛋白,可為包含序列編號4表示之胺基酸序列者。
第2改造絲蛋白,其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,具有甘胺酸殘基之含量經減低的胺基酸序列。第2改造絲蛋白,相較於天然來源之絲蛋白而言,可為具有相當於至少REP中之1或複數個甘胺酸殘基被取代為別的胺基酸殘基的胺基酸序列者。
第2改造絲蛋白,可為其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,具有相當於由REP中之GGX及GPGXX(惟G表示甘胺酸殘基、P表示脯胺酸殘基、X表示甘胺酸以外之胺基酸殘基)中選出的至少一個結構模體序列中,至少1或複數個該結構模體序列中之1個甘胺酸殘基被取代為別的胺基酸殘基之胺基酸序列者。
第2改造絲蛋白,上述甘胺酸殘基被取代為別的胺基酸殘基之結構模體序列之比例,相對於全部結構模體序列而言,可為10%以上。
第2改造絲蛋白可為具有如下之胺基酸序列者:包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列,且以由上述結構域序列中,去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至上述結構域序列之C末端為止之序列後的序列中之全部REP所包含的XGX(惟X表示甘胺酸以外之胺基酸殘基)所成之胺基酸序列之總胺基酸殘基數為z,由上述結構域序列中,去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至上述結構域序列之C末端為止之序列後的序列中之總胺基酸殘基數為w時,z/w為30%以上、40%以上、50%以上或50.9%以上之胺基酸序列。相對於(A)
n結構模體中之全部胺基酸殘基數而言,丙胺酸殘基數可為83%以上、86%以上、90%以上、95%以上,或100%。相對於全部胺基酸殘基數而言,丙胺酸殘基數為100%,意指(A)
n結構模體僅由丙胺酸殘基構成。
第2改造絲蛋白,亦可為藉由將GGX結構模體之1個甘胺酸殘基取代為別的胺基酸殘基,而提高包含XGX之胺基酸序列之含有比例者。第2改造絲蛋白中,結構域序列中之包含GGX之胺基酸序列之含有比例可為30%以下、20%以下、10%以下、6%以下、4%以下,或2%以下。結構域序列中之包含GGX之胺基酸序列之含有比例,可藉由與下述包含XGX之胺基酸序列之含有比例(z/w)的算出方法相同之方法算出。
更詳細說明z/w之算出方法。首先,於包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列的絲蛋白(改造絲蛋白或天然來源之絲蛋白)中,從由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列中所包含的全部REP中,擷取包含XGX之胺基酸序列。構成XGX之胺基酸殘基的總數為z。例如,擷取50個包含XGX之胺基酸序列時(無重複),z為50×3=150。又,例如,如包含XGXGX之胺基酸序列的情況般,存在有2個XGX中所包含的X(中央的X)時。係將重複部分扣除來計算(XGXGX時係5胺基酸殘基)。w為由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列中所包含的總胺基酸殘基數。例如,如圖2所示的結構域序列的情況時,w為4+50+4+100+4+10+4+20+4+30=230(經除外位於最C末端側之(A)
n結構模體)。接著藉由將z除以w,可算出z/w(%)。
此處,說明天然來源之絲蛋白中之z/w。首先,如上述般,將於NCBI GenBank中登錄有胺基酸序列資訊的絲蛋白藉由例示之方法進行確認後,擷取了663種之絲蛋白(其中,蜘蛛類來源之絲蛋白為415種)。所擷取的全部絲蛋白當中,由包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列,且絲蛋白中之包含GGX的胺基酸序列之含有比例為6%以下的天然來源之絲蛋白之胺基酸序列中,藉由上述算出方法算出z/w。其結果,確認到天然來源之絲蛋白中的z/w,均為未達50.9%,最大為50.86%。
第2改造絲蛋白中,z/w可為50.9%以上、56.1%以上、58.7%以上、70%以上,或80%以上。z/w之上限並無特殊限制,例如可為95%以下。
第2改造絲蛋白,例如可藉由從經選殖的天然來源之絲蛋白之基因序列中,將編碼甘胺酸殘基的鹼基序列之至少一部分取代而改造為編碼別的胺基酸殘基而得到。此時,所改造的甘胺酸殘基,可選擇GGX結構模體及GPGXX結構模體中之1個甘胺酸殘基,亦可取代成z/w為50.9%以上。又,例如,亦可藉由自天然來源之絲蛋白之胺基酸序列中設計滿足上述態樣之胺基酸序列,且化學合成編碼所設計之胺基酸序列的核酸而得到。不管何種情況,均可從天然來源之絲蛋白之胺基酸序列,進行相當於將REP中之甘胺酸殘基取代為別的胺基酸殘基之改造,此外可進一步進行相當於1或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或附加的胺基酸序列之改造。
上述之別的胺基酸殘基,只要係甘胺酸殘基以外之胺基酸殘基則並無特別限制,可為纈胺酸(V)殘基、白胺酸(L)殘基、異白胺酸(I)殘基、甲硫胺酸(M)殘基、脯胺酸(P)殘基、苯丙胺酸(F)殘基及色胺酸(W)殘基等之疏水性胺基酸殘基;麩醯胺(Q)殘基、天門冬醯胺(N)殘基、絲胺酸(S)殘基、離胺酸(K)殘基及麩胺酸(E)殘基等之親水性胺基酸殘基。別的胺基酸殘基,可由纈胺酸(V)殘基、白胺酸(L)殘基、異白胺酸(I)殘基、苯丙胺酸(F)殘基及麩醯胺(Q)殘基中選出,亦可為麩醯胺(Q)殘基。
第2改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉包含(2-i)序列編號6(Met-PRT380)、序列編號7(Met-PRT410)、序列編號8(Met-PRT525)或序列編號9(Met-PRT799)表示之胺基酸序列,或(2-ii)與序列編號6、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列之改造絲蛋白。
說明(2-i)之改造絲蛋白。序列編號6表示之胺基酸序列,為相當於天然來源之絲蛋白的序列編號10(Met-PRT313)表示之胺基酸序列之REP中的全部GGX被取代為GQX者。序列編號7表示之胺基酸序列,為由序列編號6表示之胺基酸序列中,自N末端側朝向C末端側每隔2個則使(A)
n結構模體缺失,進而於C末端序列之前插入1個[(A)
n結構模體-REP]者。序列編號8表示之胺基酸序列,為於序列編號7表示之胺基酸序列之各(A)
n結構模體的C末端側插入2個丙胺酸殘基,進而將一部分的麩醯胺(Q)殘基取代為絲胺酸(S)殘基,使C末端側的一部分之胺基酸缺失而成為與序列編號7之分子量大致相同者。序列編號9表示之胺基酸序列,為於使序列編號7表示之胺基酸序列中所存在的20個結構域序列之區域(惟該區域之C末端側的數個胺基酸殘基經取代)重複4次的序列之C末端,附加有特定之絞鏈序列與His標籤序列者。
序列編號10表示之胺基酸序列(相當於天然來源之絲蛋白)中的z/w之值,為46.8%。序列編號6表示之胺基酸序列、序列編號7表示之胺基酸序列、序列編號8表示之胺基酸序列,及序列編號9表示之胺基酸序列中的z/w之值,分別為58.7%、70.1%、66.1%及70.0%。又,序列編號10、序列編號6、序列編號7、序列編號8及序列編號9表示之胺基酸序列之鋸齒狀比率(後述)1:1.8~11.3時的x/y之值,分別為15.0%、15.0%、93.4%、92.7%及89.8%。
(2-i)之改造絲蛋白,可為包含序列編號6、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列者。
(2-ii)之改造絲蛋白,為包含與序列編號6、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列者。又,(2-ii)之改造絲蛋白,亦為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列的蛋白質。上述序列同一性亦可為95%以上。
(2-ii)之改造絲蛋白,當以與序列編號6、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性,且REP中所包含的XGX(惟,X表示甘胺酸以外之胺基酸殘基)所成的胺基酸序列之總胺基酸殘基數為z,以上述結構域序列中之REP的總胺基酸殘基數為w時,z/w可為50.9%以上。
第2改造絲蛋白,亦可於N末端及C末端之任一方或兩方包含標籤序列。藉此,可進行改造絲蛋白之單離、固定化、檢測及可見化等。
標籤序列例如可列舉利用與其他分子之特異親和性(結合性、親和性)的親和性標籤。親和性標籤之具體例子,可列舉組胺酸標籤(His標籤)。His標籤係組胺酸殘基4至10個左右並列的短胜肽,其具有與鎳等之金屬離子特異性結合的性質,因此可利用於以金屬螯合層析(chelating metal chromatography)來單離改造絲蛋白。標籤序列之具體例子,例如可列舉序列編號11表示之胺基酸序列(包含His標籤序列及絞鏈序列之胺基酸序列)。
亦可利用特異性結合於麩胱甘肽之麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、特異性結合於麥芽糖之麥芽糖結合蛋白質(MBP)等之標籤序列。
亦可利用利用了抗原抗體反應之「抗原決定位標籤」。藉由附加顯示抗原性之胜肽(抗原決定位)作為標籤序列,可結合抗該抗原決定位之抗體。抗原決定位標籤,可列舉HA(流行性感冒病毒之血球凝集素的胜肽序列)標籤、myc標籤、FLAG標籤等。藉由利用抗原決定位標籤,能夠以高的特異性輕易地純化改造絲蛋白。
亦可使用可將標籤序列以特定蛋白酶切除者。亦可藉由將透過該標籤序列而吸附的蛋白質進行蛋白酶處理,來回收經切除標籤序列的改造絲蛋白。
包含標籤序列之改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉包含(2-iii)序列編號12(PRT380)、序列編號13(PRT410)、序列編號14(PRT525)或序列編號15(PRT799)表示之胺基酸序列,或(2-iv)與序列編號12、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列具有90%以上的序列同一性之胺基酸序列的改造絲蛋白。
序列編號16(PRT313)、序列編號12、序列編號13、序列編號14及序列編號15表示之胺基酸序列,為分別於序列編號10、序列編號6、序列編號7、序列編號8及序列編號9表示之胺基酸序列之N末端附加了序列編號11表示之胺基酸序列(包含His標籤序列及絞鏈序列)者。
(2-iii)之改造絲蛋白,亦可為包含序列編號12、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列者。
(2-iv)之改造絲蛋白,為包含與序列編號12、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列者。又,(2-iv)之改造絲蛋白,亦為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列的蛋白質。上述序列同一性亦可為95%以上。
(2-iv)之改造絲蛋白,當以與序列編號12、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性,且REP中所包含的XGX(惟,X表示甘胺酸以外之胺基酸殘基)所成的胺基酸序列之總胺基酸殘基數為z,以上述結構域序列中之REP的總胺基酸殘基數為w時,z/w可為50.9%以上。
第2改造絲蛋白,亦可包含用以將於重組蛋白質生產系統中所生產的蛋白質放出於宿主外部的分泌訊息。分泌訊息之序列,可依宿主種類來適當設定。
第3改造絲蛋白,其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,具有(A)
n結構模體之含量經減低的胺基酸序列。第3改造絲蛋白之結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,可具有相當於至少1或複數個(A)
n結構模體經缺失的胺基酸序列。
第3改造絲蛋白,亦可具有相當於自天然來源之絲蛋白使(A)
n結構模體缺失10~40%的胺基酸序列。
第3改造絲蛋白,其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,可具有相當於至少由N末端側起朝向C末端側每1~3個(A)
n結構模體缺失1個(A)
n結構模體的胺基酸序列。
第3改造絲蛋白,其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,可具有相當於至少由N末端側起朝向C末端側,依序重複有2個連續之(A)
n結構模體的缺失,及1個(A)
n結構模體的缺失之胺基酸序列。
第3改造絲蛋白,其結構域序列,可具有相當於至少由N末端側朝向C末端側,每隔2個則使(A)
n結構模體缺失的胺基酸序列。
第3改造絲蛋白,亦可為具有如下的胺基酸序列者:包含式1:[(A)
n結構模體-REP]m表示之結構域序列,且自N末端側朝向C末端側,依序比較相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元的REP之胺基酸殘基數,以將胺基酸殘基數較少的REP之胺基酸殘基數為1時,另一方的REP之胺基酸殘基數之比為1.8~11.3的相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元之胺基酸殘基數予以加總的合計值之最大值為x,結構域序列之總胺基酸殘基數為y時,x/y為20%以上、30%以上、40%以上或50%以上之胺基酸序列。相對於(A)
n結構模體中之全部胺基酸殘基數而言,丙胺酸殘基數可為83%以上、86%以上、90%以上、95%以上,或100%。相對於全部胺基酸殘基數而言,丙胺酸殘基數為100%,意指(A)
n結構模體僅由丙胺酸殘基構成。
一邊參照圖2,更詳細說明x/y之算出方法。圖2顯示自改造絲蛋白去除N末端序列及C末端序列後的結構域序列。該結構域序列,自N末端側(左側)起具有(A)
n結構模體-第1 REP(50胺基酸殘基)-(A)
n結構模體-第2 REP (100胺基酸殘基)-(A)
n結構模體-第3 REP(10胺基酸殘基)-(A)
n結構模體-第4 REP(20胺基酸殘基)-(A)
n結構模體-第5 REP(30胺基酸殘基)-(A)
n結構模體之序列。
相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元,係自N末端側起朝向C末端側依次選擇為無重複。此時,亦可存在有未被選擇的[(A)
n結構模體-REP]單元。圖2顯示模式1 (第1 REP與第2 REP之比較,及第3 REP與第4 REP之比較)、模式2(第1 REP與第2 REP之比較,及第4 REP與第5 REP之比較)、模式3(第2 REP與第3 REP之比較,及第4 REP與第5 REP之比較)、模式4(第1 REP與第2 REP之比較)。再者,此外也存在有別的選擇方法。
接著針對各模式,比較所選擇的相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元中的各REP之胺基酸殘基數。藉由求得以胺基酸殘基數較少那一方為1時,另一方之胺基酸殘基數的比,來進行比較。例如,比較第1 REP(50胺基酸殘基)與第2 REP(100胺基酸殘基)時,以胺基酸殘基數較少的第1 REP為1時,第2 REP之胺基酸殘基數的比,為100/50=2。同樣地,比較第4 REP(20胺基酸殘基)與第5 REP(30胺基酸殘基)時,以胺基酸殘基數較少的第4 REP為1時,第5 REP之胺基酸殘基數的比,為30/20=1.5。
圖2中,以胺基酸殘基數較少那一方為1時,另一方之胺基酸殘基數的比為1.8~11.3之[(A)
n結構模體-REP]單元之組係以實線表示。本說明書中,將該比稱為鋸齒狀比率。以胺基酸殘基數較少那一方為1時,另一方之胺基酸殘基數的比未達1.8或超過11.3之[(A)
n結構模體-REP]單元之組係以虛線表示。
各模式中,將以實線表示的相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元的全部之胺基酸殘基數予以加總(不僅REP,也含(A)
n結構模體之胺基酸殘基數)。然後,比較所加總的合計值,以該合計值成為最大之模式的合計值(合計值之最大值)為x。圖2所示之例子中,模式1之合計值係最大。
接著,藉由將x除以結構域序列之總胺基酸殘基數y,可算出x/y(%)。
第3改造絲蛋白中,x/y可為50%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上,或80%以上。x/y之上限並無特殊限制,例如,x/y可為100%以下。鋸齒狀比率可為1:1.9~11.3、x/y可為89.6%以上。鋸齒狀比率可為1:1.8~3.4、x/y可為77.1%以上。鋸齒狀比率可為1:1.9~8.4、x/y可為75.9%以上。鋸齒狀比率可為1:1.9~4.1、x/y可為64.2%以上。
第3改造絲蛋白,為結構域序列中存在複數個之(A)
n結構模體的至少7個係僅由丙胺酸殘基構成之改造絲蛋白時,x/y可為46.4%以上、50%以上、55%以上、60%以上、70%以上,或80%以上。x/y之上限並無特殊限制,只要係100%以下即可。
此處,說明天然來源之絲蛋白中的x/y。首先,如上述般,將於NCBI GenBank登錄有胺基酸序列資訊的絲蛋白藉由例示之方法進行確認後,擷取663種之絲蛋白(其中,蜘蛛類來源之絲蛋白為415種)。所擷取的全部絲蛋白當中,由以式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列所構成的天然來源之絲蛋白之胺基酸序列,藉由上述算出方法來算出x/y。其結果,天然來源之絲蛋白中之x/y,均未達64.2%,最大為64.14%。
第3改造絲蛋白,例如可藉由自所選殖的天然來源之絲蛋白的基因序列,使編碼(A)
n結構模體的序列之1或複數個缺失,而使x/y成為64.2%以上而得到。又,例如亦可藉由自天然來源之絲蛋白之胺基酸序列,設計相當於1或複數個(A)
n結構模體缺失之胺基酸序列,且化學合成編碼所設計的胺基酸序列之核酸,使x/y成為64.2%以上而得到。不管何種情況,於相當於自天然來源之絲蛋白之胺基酸序列使(A)
n結構模體缺失的改造以外,均可進行相當於進一步使1或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或附加的胺基酸序列之改造。
第3改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉包含(3-i)序列編號17(Met-PRT399)、序列編號7(Met-PRT410)、序列編號8(Met-PRT525)或序列編號9(Met-PRT799)表示之胺基酸序列,或(3-ii)與序列編號17、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列具有90%以上的序列同一性之胺基酸序列的改造絲蛋白。
說明(3-i)之改造絲蛋白。序列編號17表示之胺基酸序列,為自相當於天然來源之絲蛋白的序列編號10 (Met-PRT313)表示之胺基酸序列,自N末端側朝向C末端側每隔2個使(A)
n結構模體缺失,進一步於C末端序列之前插入1個[(A)
n結構模體-REP]者。序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列,係如第2改造絲蛋白所說明。
序列編號10表示之胺基酸序列(相當於天然來源之絲蛋白)之鋸齒狀比率1:1.8~11.3時的x/y之值為15.0%。序列編號17表示之胺基酸序列,及序列編號7表示之胺基酸序列中之x/y之值,均為93.4%。序列編號8表示之胺基酸序列中之x/y之值為92.7%。序列編號9表示之胺基酸序列中之x/y之值為89.8%。序列編號10、序列編號17、序列編號7、序列編號8及序列編號9表示之胺基酸序列中之z/w之值,各為46.8%、56.2%、70.1%、66.1%及70.0%。
(3-i)之改造絲蛋白,亦可為包含序列編號17、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列者。
(3-ii)之改造絲蛋白,為包含與序列編號17、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列者。又,(3-ii)之改造絲蛋白,亦為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列的蛋白質。上述序列同一性亦可為95%以上。
(3-ii)之改造絲蛋白,與序列編號17、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性,且自N末端側起朝向C末端側,依序比較相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元的REP之胺基酸殘基數,以將胺基酸殘基數較少的REP之胺基酸殘基數為1時,另一方的REP之胺基酸殘基數之比為1.8~11.3(鋸齒狀比率為1:1.8~11.3)的相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元之胺基酸殘基數予以加總的合計值之最大值為x,結構域序列之總胺基酸殘基數為y時,x/y可為64.2%以上。
第3改造絲蛋白,可於N末端及C末端的任一方或兩方,包含上述標籤序列。
包含標籤序列的改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉包含(3-iii)序列編號18(PRT399)、序列編號13(PRT410)、序列編號14(PRT525)或序列編號15(PRT799)表示之胺基酸序列,或(3-iv)與序列編號18、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列之改造絲蛋白。
序列編號18、序列編號13、序列編號14及序列編號15表示之胺基酸序列,為分別於序列編號17、序列編號7、序列編號8及序列編號9表示之胺基酸序列之N末端,附加有序列編號11表示之胺基酸序列(包含His標籤序列及絞鏈序列)者。
(3-iii)之改造絲蛋白,亦可為包含序列編號18、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列者。
(3-iv)之改造絲蛋白,為包含與序列編號18、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列者。又,(3-iv)之改造絲蛋白,亦為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列的蛋白質。上述序列同一性可為95%以上。
(3-iv)之改造絲蛋白,與序列編號18、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性,且自N末端側起朝向C末端側,依序比較相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元的REP之胺基酸殘基數,以將胺基酸殘基數較少的REP之胺基酸殘基數為1時,另一方的REP之胺基酸殘基數之比為1.8~11.3的相鄰之2個[(A)
n結構模體-REP]單元之胺基酸殘基數予以加總的合計值之最大值為x,結構域序列之總胺基酸殘基數為y時,x/y可為64.2%以上。
第3改造絲蛋白,亦可包含用以將於重組蛋白質生產系統中所生產的蛋白質放出於宿主外部的分泌訊息。分泌訊息之序列,可依宿主種類來適當設定。
第4改造絲蛋白,其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,除了(A)
n結構模體之含量經減低以外,且為具有甘胺酸殘基之含量經減低的胺基酸序列者。第4改造絲蛋白之結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,除了至少1或複數個(A)
n結構模體缺失以外,可進一步具有相當於至少REP中之1或複數個甘胺酸殘基被取代為別的胺基酸殘基之胺基酸序列。亦即,第4改造絲蛋白,為一併具有上述第2改造絲蛋白與第3改造絲蛋白之特徵的改造絲蛋白。具體的態樣等,係如第2改造絲蛋白及第3改造絲蛋白所說明。
第4改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉包含(4-i)序列編號7(Met-PRT410)、序列編號8(Met-PRT525)、序列編號9(Met-PRT799)、序列編號13(PRT410)、序列編號14(PRT525)或序列編號15(PRT799)表示之胺基酸序列,或(4-ii)與序列編號7、序列編號8、序列編號9、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列之改造絲蛋白。包含序列編號7、序列編號8、序列編號9、序列編號13、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列的改造絲蛋白之具體的態樣係如上述。
第5改造絲蛋白,其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,可為具有相當於REP中之1或複數個胺基酸殘基被取代為疏水性指標大的胺基酸殘基,及/或於REP中插入1或複數個疏水性指標大的胺基酸殘基之包含局部疏水性指標大的區域之胺基酸序列者。
局部疏水性指標大的區域,可由連續的2~4個胺基酸殘基所構成。
上述之疏水性指標大的胺基酸殘基,可為由異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、苯丙胺酸(F)、半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)及丙胺酸(A)中選出的胺基酸殘基。
第5改造絲蛋白,相較於天然來源之絲蛋白而言,除了相當於REP中之1或複數個胺基酸殘基被取代為疏水性指標大的胺基酸殘基,及/或於REP中插入1或複數個疏水性指標大的胺基酸殘基之改造以外,亦可進一步具有相較於天然來源之絲蛋白而言,相當於1或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或附加的胺基酸序列之改造。
第5改造絲蛋白,例如可藉由自所選殖的天然來源之絲蛋白的基因序列,將REP中之1或複數個親水性胺基酸殘基(例如疏水性指標為負的胺基酸殘基)取代為疏水性胺基酸殘基(例如疏水性指標為正的胺基酸殘基),及/或於REP中插入1或複數個疏水性胺基酸殘基而得到。又,例如亦可藉由自天然來源之絲蛋白之胺基酸序列,設計相當於將REP中之1或複數個親水性胺基酸殘基取代為疏水性胺基酸殘基,及/或於REP中插入1或複數個疏水性胺基酸殘基之胺基酸序列,且化學合成編碼所設計之胺基酸序列的核酸而得到。不管何種情況,除了相當於自天然來源之絲蛋白之胺基酸序列將REP中之1或複數個親水性胺基酸殘基取代為疏水性胺基酸殘基,及/或於REP中插入1或複數個疏水性胺基酸殘基的改造以外,亦可進一步進行相當於1或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或附加的胺基酸序列之改造。
第5改造絲蛋白,包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列,且於由上述結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至上述結構域序列之C末端為止之序列後的序列中所包含的全部REP中,以連續4個胺基酸殘基之疏水性指標的平均值為2.6以上之區域中所包含的胺基酸殘基之總數為p,由上述結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至上述結構域序列之C末端為止之序列後的序列中所包含的胺基酸殘基之總數為q時,亦可具有p/q為6.2%以上之胺基酸序列。
就胺基酸殘基之疏水性指標而言,係使用公知之指標(Hydropathy index:Kyte J,&Doolittle R(1982)“A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”,J.Mol.Biol.,157,pp.105-132)。具體而言,各胺基酸之疏水性指標(疏水性指數,以下亦記載為「HI」),係如下述表1所示。
更詳細說明p/q之算出方法。算出係使用由式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列中,去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列(以下稱為「序列A」)。首先,於序列A中所包含的全部REP中,算出連續4個胺基酸殘基之疏水性指標的平均值。疏水性指標之平均值,係將連續4個胺基酸殘基中所包含的各胺基酸殘基之HI的總和除以4(胺基酸殘基數)來求得。疏水性指標之平均值,係針對全部之連續4個胺基酸殘基來求得(各胺基酸殘基,係用於算出1~4次平均值)。接著,特定出連續4個胺基酸殘基之疏水性指標的平均值為2.6以上的區域。即使某胺基酸殘基,相當於複數個「疏水性指標之平均值為2.6以上的連續4個胺基酸殘基」時,於區域中亦作為1個胺基酸殘基而含有。此外,該區域中所包含的胺基酸殘基之總數為p。又,序列A中所包含的胺基酸殘基之總數為q。
例如,「疏水性指標之平均值為2.6以上的連續4個胺基酸殘基」被由20個部位擷取時(無重複),連續4個胺基酸殘基之疏水性指標的平均值為2.6以上的區域中,係包含有20個連續4個胺基酸殘基(無重複),p為20×4=80。又,例如,2個「疏水性指標之平均值為2.6以上的連續4個胺基酸殘基」僅有1個胺基酸殘基重複存在時,連續4個胺基酸殘基之疏水性指標的平均值為2.6以上的區域中,係成為包含7個胺基酸殘基(p=2×4-1=7。「-1」為扣除重複部分)。例如,圖3所示的結構域序列之情況時,「疏水性指標之平均值為2.6以上的連續4個胺基酸殘基」係未重複而存在有7個,故p為7×4=28。又,例如,圖3所示的結構域序列之情況時,q為4+50+4+40+4+10+4+20+ 4+30=170(不含C末端側的最後所存在之(A)
n結構模體)。接著,藉由將p除以q,可算出p/q(%)。圖3的情況時,係28/170=16.47%。
第5改造絲蛋白中,p/q可為6.2%以上、7%以上、10%以上、20%以上,或30%以上。p/q之上限並無特殊限制,例如可為45%以下。
第5改造絲蛋白,例如可藉由將所選殖的天然來源之絲蛋白之胺基酸序列,以滿足上述p/q之條件的方式,將REP中之1或複數個親水性胺基酸殘基(例如疏水性指標為負的胺基酸殘基)取代為疏水性胺基酸殘基(例如疏水性指標為正的胺基酸殘基),及/或於REP中插入1或複數個疏水性胺基酸殘基,以改造為包含局部疏水性指標大的區域之胺基酸序列而得到。又,例如,亦可藉由自天然來源之絲蛋白之胺基酸序列,設計滿足上述p/q之條件的胺基酸序列,且化學合成編碼所設計之胺基酸序列的核酸而得到。不管何種情況,除了相較於天然來源之絲蛋白而言,相當於REP中之1或複數個胺基酸殘基被取代為疏水性指標大的胺基酸殘基,及/或於REP中插入1或複數個疏水性指標大的胺基酸殘基之改造以外,亦可進一步進行相當於1或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或附加之改造。
疏水性指標大的胺基酸殘基,並無特別限制,可為由異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、苯丙胺酸(F)、半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)及丙胺酸(A)中選出的胺基酸殘基,亦可為由纈胺酸(V)、白胺酸(L)及異白胺酸(I)中選出的胺基酸殘基。
第5改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉包含(5-i)序列編號19(Met-PRT720)、序列編號20(Met-PRT665)或序列編號21(Met-PRT666)表示之胺基酸序列,或(5-ii)與序列編號19、序列編號20或序列編號21表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列之改造絲蛋白。
說明(5-i)之改造絲蛋白。序列編號19表示之胺基酸序列,係對於序列編號7(Met-PRT410)表示之胺基酸序列,除外C末端側之終端的結構域序列,每隔一個REP分別於2個部位插入含3個胺基酸殘基的胺基酸序列(VLI),進一步將一部分的麩醯胺(Q)殘基取代為絲胺酸(S)殘基,且使C末端側之一部分之胺基酸缺失者。序列編號20表示之胺基酸序列,係對於序列編號8(Met-PRT525)表示之胺基酸序列,每隔一個REP分別於1個部位插入含3個胺基酸殘基之胺基酸序列(VLI)者。序列編號21表示之胺基酸序列,係對於序列編號8表示之胺基酸序列,每隔一個REP分別於2個部位插入含3個胺基酸殘基之胺基酸序列(VLI)者。
(5-i)之改造絲蛋白,亦可為包含序列編號19、序列編號20或序列編號21表示之胺基酸序列者。
(5-ii)之改造絲蛋白,為包含與序列編號19、序列編號20或序列編號21表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列者。又,(5-ii)之改造絲蛋白,亦為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列的蛋白質。上述序列同一性亦可為95%以上。
(5-ii)之改造絲蛋白,與序列編號19、序列編號20或序列編號21表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性,且由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列中所包含的全部REP中,以連續4個胺基酸殘基之疏水性指標的平均值為2.6以上的區域中所包含之胺基酸殘基的總數為p,由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列中所包含的胺基酸殘基之總數為q時,p/q可為6.2%以上。
第5改造絲蛋白,亦可於N末端及C末端之任一方或兩方包含標籤序列。
包含標籤序列的改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉包含(5-iii)序列編號22(PRT720)、序列編號23(PRT665)或序列編號24(PRT666)表示之胺基酸序列,或(5-iv)與序列編號22、序列編號23或序列編號24表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列之改造絲蛋白。
序列編號22、序列編號23及序列編號24表示之胺基酸序列,係分別於序列編號19、序列編號20及序列編號21表示之胺基酸序列之N末端,附加有序列編號11表示之胺基酸序列(包含His標籤序列及絞鏈序列)者。
(5-iii)之改造絲蛋白,亦可為包含序列編號22、序列編號23或序列編號24表示之胺基酸序列者。
(5-iv)之改造絲蛋白,為包含與序列編號22、序列編號23或序列編號24表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列者。又,(5-iv)之改造絲蛋白,亦為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m表示之結構域序列的蛋白質。上述序列同一性亦可為95%以上。
(5-iv)之改造絲蛋白,與序列編號22、序列編號23或序列編號24表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性,且由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列中所包含的全部REP中,以連續4個胺基酸殘基之疏水性指標的平均值為2.6以上之區域中所包含的胺基酸殘基之總數為p,由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列中所包含的胺基酸殘基之總數為q時,p/q亦可為6.2%以上。
第5改造絲蛋白,亦可包含用以將於重組蛋白質生產系統中所生產的蛋白質放出於宿主外部的分泌訊息。分泌訊息之序列,可依宿主種類來適當設定。
第6改造絲蛋白,相較於天然來源之絲蛋白而言,具有麩醯胺殘基之含量經減低的胺基酸序列。
第6改造絲蛋白,於REP之胺基酸序列中,亦可包含由GGX結構模體及GPGXX結構模體中選出的至少一個結構模體。
第6改造絲蛋白,於REP中包含GPGXX結構模體時,GPGXX結構模體含有率,通常可為1%以上、5%以上,或10%以上。GPGXX結構模體含有率之上限並無特殊限制,可為50%以下,或30%以下。
本說明書中,「GPGXX結構模體含有率」,係藉由以下方法所算出的值。
於包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m,或式2:[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體表示之結構域序列的絲蛋白(改造絲蛋白或天然來源之絲蛋白)中,由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列中所包含的全部REP中,以該區域中所包含的GPGXX結構模體之個數總數的3倍之數(亦即,相當於GPGXX結構模體中之G及P的總數)為s,由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列,進一步去除(A)
n結構模體後之全部REP之胺基酸殘基的總數為t時,GPGXX結構模體含有率係作為s/t而被算出。
於算出GPGXX結構模體含有率時,以「由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列」為對象,係由於「自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列」(相當於REP之序列)中,可能包含與絲蛋白之特徵性的序列相關性低的序列,m為小時(換言之,結構域序列為短時),會影響GPGXX結構模體含有率之算出結果,因而要排除此影響之故。再者,「GPGXX結構模體」位於REP之C末端時,即使「XX」為例如「AA」時,亦視為「GPGXX結構模體」。
圖4為顯示改造絲蛋白之結構域序列的示意圖。一邊參照圖4一邊具體說明GPGXX結構模體含有率之算出方法。首先,圖4所示之改造絲蛋白的結構域序列(為「[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體」型)中,全部的REP係包含於「由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列」(圖4中,以「區域A」表示的序列)中,因此用以算出s之GPGXX結構模體之個數為7,s為7×3=21。同樣地,由於全部的REP係包含於「由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列」(圖4中,以「區域A」表示的序列)中,因此由該序列中進一步去除(A)
n結構模體後的全部REP之胺基酸殘基之總數t為50+40+10+20+30=150。接著,藉由將s除以t,可算出s/t(%),圖4之改造絲蛋白的情況時為21/150=14.0%。
第6改造絲蛋白之麩醯胺殘基含有率可為9%以下、7%以下、4%以下,或0%。
本說明書中,「麩醯胺殘基含有率」,係藉由以下方法所算出的值。
於包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m,或式2:[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體表示之結構域序列的絲蛋白(改造絲蛋白或天然來源之絲蛋白)中,由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列(相當於圖4之「區域A」之序列)中所包含的全部REP中,以該區域中所包含的麩醯胺殘基之總數為u,由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列,進一步去除(A)
n結構模體後的全部REP之胺基酸殘基的總數為t時,麩醯胺殘基含有率係作為u/t而被算出。於算出麩醯胺殘基含有率時,以「由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列」為對象的理由,係同上述理由。
第6改造絲蛋白,其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,可具有相當於REP中之1或複數個麩醯胺殘基缺失,或取代為其他胺基酸殘基的胺基酸序列。
「其他胺基酸殘基」,只要係麩醯胺殘基以外之胺基酸殘基即可,亦可為較麩醯胺殘基疏水性指標更大的胺基酸殘基。胺基酸殘基之疏水性指標係如表1所示。
如表1所示,較麩醯胺殘基疏水性指標更大的胺基酸殘基,可列舉由異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、苯丙胺酸(F)、半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)、丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、蘇胺酸(T)、絲胺酸(S)、色胺酸(W)、酪胺酸(Y)、脯胺酸(P)及組胺酸(H)中選出的胺基酸殘基。此等之中,尤可為由異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、苯丙胺酸(F)、半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)及丙胺酸(A)中選出的胺基酸殘基,亦可為由異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)及苯丙胺酸(F)中選出的胺基酸殘基。
第6改造絲蛋白之REP的疏水性度,可為-0.8以上、-0.7以上、0以上、0.3以上,或0.4以上。REP之疏水性度的上限並無特殊限制,可為1.0以下,或0.7以下。
本說明書中,「REP之疏水性度」,係藉由以下方法所算出的值。
於包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m,或式2:[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體表示之結構域序列的絲蛋白(改造絲蛋白或天然來源之絲蛋白)中,由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列(相當於圖4之「區域A」之序列)中所包含的全部REP中,以該區域之各胺基酸殘基之疏水性指標的總和為v,由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列,進一步去除(A)
n結構模體後的全部REP之胺基酸殘基的總數為t時,REP之疏水性度係作為v/t而被算出。於算出REP之疏水性度時,以「由結構域序列中去除自位於最C末端側之(A)
n結構模體起至結構域序列之C末端為止的序列後之序列」為對象的理由,係同上述理由。
第6改造絲蛋白,其結構域序列,相較於天然來源之絲蛋白而言,除了相當於REP中之1或複數個麩醯胺殘基缺失,及/或將REP中之1或複數個麩醯胺殘基取代為其他胺基酸殘基的改造以外,亦可進一步具有相當於1或複數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或附加的胺基酸序列之改造。
第6改造絲蛋白,例如可藉由自所選殖的天然來源之絲蛋白的基因序列,使REP中之1或複數個麩醯胺殘基缺失,及/或將REP中之1或複數個麩醯胺殘基取代為其他胺基酸殘基而得到。又,例如亦可藉由自天然來源之絲蛋白之胺基酸序列,設計相當於使REP中之1或複數個麩醯胺殘基缺失,及/或將REP中之1或複數個麩醯胺殘基取代為其他胺基酸殘基的胺基酸序列,且化學合成編碼所設計之胺基酸序列的核酸而得到。
第6改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉(6-i)包含序列編號25(Met-PRT888)、序列編號26(Met-PRT965)、序列編號27(Met-PRT889)、序列編號28(Met-PRT916)、序列編號29(Met-PRT918)、序列編號30(Met-PRT699)、序列編號31(Met-PRT698)、序列編號32(Met-PRT966)、序列編號41(Met-PRT917)或序列編號42(Met-PRT1028)表示之胺基酸序列的改造絲蛋白,或(6-ii)包含與序列編號25、序列編號26、序列編號27、序列編號28、序列編號29、序列編號30、序列編號31、序列編號32、序列編號41或序列編號42表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列之改造絲蛋白。
說明(6-i)之改造絲蛋白。序列編號25表示之胺基酸序列,為將序列編號7表示之胺基酸序列(Met-PRT410)中的QQ全部取代為VL者。序列編號26表示之胺基酸序列,為將序列編號7表示之胺基酸序列中之QQ全部取代為TS,且將剩餘的Q取代為A者。序列編號27表示之胺基酸序列,為將序列編號7表示之胺基酸序列中之QQ全部取代為VL,且將剩餘的Q取代為I者。序列編號28表示之胺基酸序列,為將序列編號7表示之胺基酸序列中之QQ全部取代為VI,且將剩餘的Q取代為L者。序列編號29表示之胺基酸序列,為將序列編號7表示之胺基酸序列中之QQ全部取代為VF,且將剩餘的Q取代為I者。
序列編號30表示之胺基酸序列,為將序列編號8表示之胺基酸序列(Met-PRT525)中之QQ全部取代為VL者。序列編號31表示之胺基酸序列,為將序列編號8表示之胺基酸序列中之QQ全部取代為VL,且將剩餘的Q取代為I者。
序列編號32表示之胺基酸序列,為將序列編號7表示之胺基酸序列(Met-PRT410)中所存在的20個結構域序列之區域重複2次的序列中之QQ全部取代為VF,且將剩餘的Q取代為I者。
序列編號41表示之胺基酸序列(Met-PRT917),為將序列編號7表示之胺基酸序列中之QQ全部取代為LI,且將剩餘的Q取代為V者。序列編號42表示之胺基酸序列(Met-PRT1028),為將序列編號7表示之胺基酸序列中之QQ全部取代為IF,且將剩餘的Q取代為T者。
序列編號25、序列編號26、序列編號27、序列編號28、序列編號29、序列編號30、序列編號31、序列編號32、序列編號41及序列編號42表示之胺基酸序列,麩醯胺殘基含有率均為9%以下(表2)。
(6-i)之改造絲蛋白,可為包含序列編號25、序列編號26、序列編號27、序列編號28、序列編號29、序列編號30、序列編號31、序列編號32、序列編號41或序列編號42表示之胺基酸序列者。
(6-ii)之改造絲蛋白,為包含與序列編號25、序列編號26、序列編號27、序列編號28、序列編號29、序列編號30、序列編號31、序列編號32、序列編號41或序列編號42表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列者。又,(6-ii)之改造絲蛋白,亦為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m,或式2:[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體表示之結構域序列的蛋白質。上述序列同一性亦可為95%以上。
(6-ii)之改造絲蛋白之麩醯胺殘基含有率亦可為9%以下。(6-ii)之改造絲蛋白之GPGXX結構模體含有率亦可為10%以上。
第6改造絲蛋白,可於N末端及C末端之任一方或兩方包含標籤序列。藉此,可進行改造絲蛋白之單離、固定化、檢測及可見化等。
包含標籤序列之改造絲蛋白之更具體的例子,可列舉(6-iii)包含序列編號33(PRT888)、序列編號34(PRT965)、序列編號35(PRT889)、序列編號36(PRT916)、序列編號37(PRT918)、序列編號38(PRT699)、序列編號39(PRT698)、序列編號40(PRT966)、序列編號43(PRT917)或序列編號44(PRT1028)表示之胺基酸序列的改造絲蛋白,或(6-iv)包含與序列編號33、序列編號34、序列編號35、序列編號36、序列編號37、序列編號38、序列編號39、序列編號40、序列編號43或序列編號44表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列之改造絲蛋白。
序列編號33、序列編號34、序列編號35、序列編號36、序列編號37、序列編號38、序列編號39、序列編號40、序列編號43及序列編號44表示之胺基酸序列,係分別於序列編號25、序列編號26、序列編號27、序列編號28、序列編號29、序列編號30、序列編號31、序列編號32、序列編號41及序列編號42表示之胺基酸序列之N末端附加有序列編號11表示之胺基酸序列(包含His標籤序列及絞鏈序列)者。由於僅於N末端附加標籤序列,因此麩醯胺殘基含有率並無變化,序列編號33、序列編號34、序列編號35、序列編號36、序列編號37、序列編號38、序列編號39、序列編號40、序列編號43及序列編號44表示之胺基酸序列,麩醯胺殘基含有率均為9%以下(表3)。
(6-iii)之改造絲蛋白,亦可為包含序列編號33、序列編號34、序列編號35、序列編號36、序列編號37、序列編號38、序列編號39、序列編號40、序列編號43或序列編號44表示之胺基酸序列者。
(6-iv)之改造絲蛋白,為包含與序列編號33、序列編號34、序列編號35、序列編號36、序列編號37、序列編號38、序列編號39、序列編號40、序列編號43或序列編號44表示之胺基酸序列具有90%以上之序列同一性的胺基酸序列者。又,(6-iv)之改造絲蛋白,亦為包含式1:[(A)
n結構模體-REP]
m,或式2:[(A)
n結構模體-REP]
m-(A)
n結構模體表示之結構域序列的蛋白質。上述序列同一性亦可為95%以上。
(6-iv)之改造絲蛋白之麩醯胺殘基含有率亦可為9%以下。(6-iv)之改造絲蛋白之GPGXX結構模體含有率亦可為10%以上。
第6改造絲蛋白,亦可包含用以將於重組蛋白質生產系統中所生產的蛋白質放出於宿主外部的分泌訊息。分泌訊息之序列,可依宿主種類來適當設定。
改造絲蛋白,亦可為在第1改造絲蛋白、第2改造絲蛋白、第3改造絲蛋白、第4改造絲蛋白、第5改造絲蛋白,及第6改造絲蛋白所具有的特徵中,一併具備至少2個以上之特徵的改造絲蛋白。
改造絲蛋白,由於可抑制與水分之接觸所致之收縮,故亦可為疏水性改造絲蛋白。本說明書中,「疏水性改造絲蛋白」,係指求得構成改造絲蛋白的全部胺基酸殘基之疏水性指標(HI)的總和,接著將該總和除以全部胺基酸殘基數之值(平均HI)為0以上的改造絲蛋白。改造絲蛋白之疏水性指標的平均值(平均HI),可為0.5以上,或0.6以上。改造絲蛋白之疏水性指標的平均值(平均HI),例如可為1.2以下,或0.9以下。疏水性指標係如表1所示。又,亦有將平均HI未達0的改造絲蛋白稱為親水性改造絲蛋白者。
疏水性改造絲蛋白,例如可列舉包含序列編號27、序列編號28、序列編號29、序列編號30、序列編號31、序列編號32、序列編號33或序列編號43表示之胺基酸序列、序列編號35、序列編號37、序列編號38、序列編號39、序列編號40、序列編號41或序列編號44表示之胺基酸序列的改造絲蛋白。
親水性改造絲蛋白,例如可列舉包含序列編號4表示之胺基酸序列、序列編號6、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列、序列編號13、序列編號11、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列、序列編號18、序列編號7、序列編號8或序列編號9表示之胺基酸序列、序列編號17、序列編號11、序列編號14或序列編號15表示之胺基酸序列、序列編號19、序列編號20或序列編號21表示之胺基酸序列的改造絲蛋白。
上述所有實施形態之改造絲蛋白,均可藉由例如經具有編碼該改造絲蛋白之核酸序列,及與該核酸序列連結為可作動的1或複數個調節序列之表現載體轉形的宿主來表現該核酸藉以生產。
編碼改造絲蛋白之核酸的製造方法並無特殊限制。例如,可藉由利用編碼天然之絲蛋白之基因,以聚合酶連鎖反應(PCR)等放大而選殖,並以基因工程手法來改造之方法,或化學合成之方法,來製造該核酸。核酸之化學合成方法亦無特殊限制,例如,可基於由NCBI之網站資料庫等而獲得的絲蛋白之胺基酸序列資訊,藉由將經AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare Japan股份有限公司)等自動合成之寡核苷酸以PCR等予以連結之方法,來將基因化學合成。此時,為了使改造絲蛋白之純化及/或確認成為容易,亦可合成編碼包含於上述之胺基酸序列之N末端附加含起始密碼子及His10標籤的胺基酸序列而得之胺基酸序列的改造絲蛋白之核酸。
調節序列,為控制宿主中之改造絲蛋白的表現之序列(例如啟動子、增強子、核糖體結合序列、轉錄終止序列等),可依宿主種類來適當選擇。啟動子可使用於宿主細胞中發揮功能,可誘導改造絲蛋白表現之誘導性啟動子。誘導性啟動子,為可藉由誘導物質(表現誘導劑)之存在、抑制物分子之非存在,或溫度、滲透壓或pH值之上昇或降低等之物理性要因來控制轉錄的啟動子。
表現載體之種類,可依宿主種類適當選擇質體載體、病毒載體、黏接質體載體、F型黏接質體載體、人工染色體載體等。表現載體,亦可為於宿主細胞中可自主複製,或可接入宿主之染色體中,且於可轉錄編碼改造絲蛋白之核酸的位置上含有啟動子者。
原核生物,以及酵母、絲狀真菌、昆蟲細胞、動物細胞及植物細胞等之真核生物均可使用作為宿主。
原核生物之宿主的例子可列舉屬於大腸桿菌屬、短芽胞桿菌(Brevibacillus)屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、微桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬及假單胞桿菌屬等之細菌。屬於大腸桿菌屬之微生物,例如可列舉大腸桿菌(Escherichia coli)等。屬於短芽胞桿菌屬之微生物,例如可列舉土壤短芽孢桿菌(Brevibacillus agri)等。屬於沙雷氏菌屬之微生物,例如可列舉液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)等。屬於芽孢桿菌屬之微生物,例如可列舉枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。屬於微桿菌屬之微生物,例如可列舉嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)等。屬於短桿菌屬之微生物,例如可列舉麩胺酸短桿菌(Brevibacterium divaricatum)等。屬於棒狀桿菌屬之微生物,例如可列舉產氨棒狀桿菌(Corynebacterium
ammoniagenes)等。屬於假單胞桿菌(Pseudomonas)屬之微生物,例如可列舉戀臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)等。
以原核生物為宿主時,導入編碼改造絲蛋白之核酸的載體,例如可列舉pBTrp2(Boehringer Mannheim公司製)、pGEX(Pharmacia公司製)、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold、pUB110、pNCO2(日本特開2002-238569號公報)等。
真核生物之宿主,例如可列舉酵母及絲狀真菌(黴菌等)。酵母例如可列舉屬於酵母菌屬、畢赤酵母菌屬、裂殖酵母菌屬等之酵母。絲狀真菌例如可列舉屬於麴菌屬、青黴菌屬、木黴菌(Trichoderma)屬等之絲狀真菌。
以真核生物為宿主時,導入編碼改造絲蛋白之核酸的載體,例如可列舉YEP13(ATCC37115)、YEp24 (ATCC37051)等。表現載體對上述宿主細胞之導入方法,只要係對上述宿主細胞導入DNA的方法,則均可使用。例如,可列舉使用鈣離子之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 69,2110(1972)]、電穿孔法、球形質體(spheroplast)法、原生質體法、乙酸鋰法、勝任細胞法等。
以經表現載體轉形之宿主來表現核酸的方法,除了直接表現以外,可根據分子選殖(Molecular Cloning)第2版所記載之方法等,進行分泌生產、融合蛋白質表現等。
改造絲蛋白,例如可藉由在培養基中培養經表現載體轉形的宿主,於培養基中使該改造絲蛋白生成及累積,並由該培養基中採取來製造。將宿主在培養基中培養的方法,可遵照通常使用於宿主培養的方法來進行。
宿主為大腸菌等之原核生物或酵母等之真核生物時,作為培養基,只要係含有宿主可利用之碳源、氮源及無機鹽類等,且可有效率地進行宿主培養的培養基,則天然培養基及合成培養基均可使用。
碳源只要係上述轉形微生物可利用者即可,例如可使用葡萄糖、果糖、蔗糖,及含有此等之糖蜜、澱粉及澱粉水解物等之碳水化合物;乙酸及丙酸等之有機酸,以及乙醇及丙醇等之醇類。氮源例如可使用氨、氯化銨;硫酸銨、乙酸銨及磷酸銨等之無機酸或有機酸之銨鹽;其他含氮化合物,以及蛋白腖、肉萃取物、酵母萃取物、玉米浸液、酪蛋白水解物、大豆粕及大豆粕水解物、各種發酵菌體及其消化物。無機鹽類例如可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵(II)、硫酸錳、硫酸銅及碳酸鈣。
大腸菌等之原核生物或酵母等之真核生物之培養,例如可於振盪培養或深部通氣攪拌培養等之好氣條件下進行。培養溫度例如為15~40℃。培養時間通常為16小時~7日。培養中之培養基的pH可保持為3.0~9.0。培養基之pH的調整,可使用無機酸、有機酸、鹼溶液、尿素、碳酸鈣及氨等來進行。
又,培養中,亦可依需要於培養基中添加安比西林及四環黴素等之抗生素。培養經使用誘導性之啟動子作為啟動子的表現載體轉形之微生物時,亦可依需要於培養基中添加誘導物(inducer)。例如,於培養經使用lac啟動子之表現載體轉形的微生物時,可於培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷等,於培養經使用trp啟動子之表現載體轉形的微生物時,可於培養基中添加吲哚丙烯酸等。
經表現之改造絲蛋白的單離及純化能夠以通常使用的方法進行。例如,該改造絲蛋白於細胞內以溶解狀態表現時,係於培養結束後,將宿主細胞以離心分離回收,懸浮於水系緩衝液後,藉由超音波破碎機、法式細胞破碎機、Manton Gaulin均質機及DYNO
®-MILL等使宿主細胞破碎,得到無細胞萃取液。可由將該無細胞萃取液離心分離所得之上清液中,單獨或組合使用通常使用於蛋白質單離純化的方法,亦即,溶劑萃取法、以硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、以有機溶劑之沈澱法、使用二乙基胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠(sepharose)、DIAION HPA-75(三菱化成公司製)等之樹脂之陰離子交換層析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司製)等之樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠等之樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和性層析法、層析聚焦法、等電點電泳等之電泳法等之方法,得到純化標準品。
改造絲蛋白於細胞內形成不溶體而表現時,係同樣地將宿主細胞回收後,使其破碎,進行離心分離,藉以作為沈澱區分而回收改造絲蛋白之不溶體。經回收的改造絲蛋白之不溶體可藉由蛋白質變性劑而可溶化。該操作後,可藉由與上述相同之單離純化法得到改造絲蛋白之純化標準品。該改造絲蛋白分泌於細胞外時,可由培養上清液中回收該改造絲蛋白。亦即,可藉由將培養物以離心分離等之手法處理而取得培養上清液,且藉由使用與上述相同之單離純化法而由該培養上清液得到純化標準品。
被賦予特定形狀或捲曲之形狀的絲蛋白纖維,可為於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮者。藉由以上述方法對於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮之絲蛋白纖維賦予特定形狀,可容易地製造於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮的經賦予特定形狀之人工毛髮用纖維。特定形狀可為包含彎曲部分、直線狀部分或此等兩方之形狀。
於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮的絲蛋白纖維之以下述式(1)所定義的絲蛋白纖維之復元率可為95%以上。
式(1):復元率=(從濕潤狀態乾燥時之絲蛋白纖維的長度/成為濕潤狀態前之絲蛋白纖維的長度)×100(%)
以式(1)所定義之復元率越高,於濕潤/乾燥時之行為越接近人類毛髮,因此可抑制於人工毛髮與人類毛髮之間產生不協調感。以式(1)所定義的絲蛋白纖維之復元率亦可為96%以上、97%以上、98%以上,或99%以上。
以下述式(4)所定義之絲蛋白纖維之伸長率可為17%以下。以式(4)所定義之伸長率,為使絲蛋白纖維成為濕潤狀態時之伸長特性的指標。
式(4):伸長率={(濕潤狀態之絲蛋白纖維的長度/成為濕潤狀態前之絲蛋白纖維的長度)-1}×100(%)
以式(4)所定義之伸長率,例如可為15%以下、13%以下、10%以下或5%以下。以式(4)所定義之伸長率,可為超過0%、1%以上、2%以上、5%以上、10%以上或13%以上。本實施形態之絲蛋白纖維之伸長率,例如可為超過0%且17%以下、可為超過0%且15%以下、可為2%以上且15%以下、可為5%以上且15%以下、可為5%以上且13%以下、可為5%以上且10%以下、可為超過0%且10%以下、亦可為超過0%且5%以下。就使人工毛髮與人類毛髮之間的不協調感更小的觀點,以式(4)所定義之伸長率亦可為小。
以下述式(5)所定義之絲蛋白纖維之收縮率C可為17%以下。以式(5)所定義之收縮率C,為將絲蛋白纖維從濕潤狀態乾燥時之收縮特性的指標。
式(5):收縮率C={1-(從濕潤狀態乾燥時之絲蛋白纖維的長度/濕潤狀態之絲蛋白纖維的長度)}×100(%)
以式(5)所定義之收縮率C,可為15%以下、13%以下、10%以下或5%以下。以式(5)所定義之收縮率C,可為超過0%、1%以上、2%以上、5%以上、10%以上或13%以上。本實施形態之絲蛋白纖維之收縮率C,例如,可為超過0%且17%以下、超過0%且15%以下、2%以上且15%以下、5%以上且15%以下、5%以上且13%以下、5%以上且10%以下、超過0%且10%以下,或超過0%且5%以下。就使人工毛髮與人類毛髮之間的不協調感更小的觀點,以式(5)所定義之收縮率C亦可為小。
絲蛋白纖維,亦可為具有因於紡絲後與水接觸而不可逆地收縮之收縮歷程的纖維。此時,以下述式(2)所定義之絲蛋白纖維之收縮率A可為2%以上。收縮率A為2%以上之絲蛋白纖維,於濕潤/乾燥時之行為更接近於人類毛髮。
式(2):收縮率A={1-(因於紡絲後與水接觸而不可逆地收縮之纖維的長度/紡絲後,與水接觸前之纖維的長度)}×100(%)
以式(2)所定義之收縮率A,可為2.5%以上、3%以上、3.5%以上、4%以上、4.5%以上、5%以上、5.5%以上、6%以上、10%以上、15%以上、20%以上或25%以上。以式(2)所定義之收縮率A的上限並無特殊限定,收縮率A可為80%以下、60%以下、40%以下、20%以下、10%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下或3%以下。
絲蛋白纖維,亦可為具有因於紡絲後與水接觸而不可逆地收縮之後,藉由乾燥而更加收縮的收縮歷程之纖維。此時,以下述式(3)所定義之絲蛋白纖維之收縮率B可為超過7%。以式(3)所定義之收縮率B超過7%之絲蛋白纖維,於濕潤/乾燥時之行為更接近於人類毛髮。
式(3):收縮率B={1-(因於紡絲後與水接觸而不可逆地收縮之後,藉由乾燥而更加收縮之纖維的長度/紡絲後,與水接觸前之纖維的長度)}×100(%)
以式(3)所定義之收縮率B,可為10%以上、15%以上、超過25%、32%以上、40%以上、48%以上、56%以上、64%以上或72%以上。以式(3)所定義之收縮率B的上限並無特殊限定,通常為80%以下。
於絲蛋白纖維之表面,亦可形成有向纖維軸方向延伸的凹部或溝部。具有形成有凹部或溝部之表面的絲蛋白纖維,光澤被抑制,可實現與人類毛髮同樣的外觀。於絲蛋白纖維之表面設置凹部的方法,例如可採用將原料纖維紡絲時,藉由濕式紡絲法紡絲之方法、使脫溶劑之速度變慢的方法(例如於凝固液中添加紡絲原液之溶劑的方法)、國際公開第2016/201369號記載之方法(例如使凝固浴中之滯留時間較長的方法(60秒以上)、使凝固浴中之溶劑比變化的方法)。
以下述式(6)所定義之絲蛋白纖維之熱收縮率可為4%以下。
式(6):熱收縮率={1-(加熱至160℃時之絲蛋白纖維的長度/加熱前之絲蛋白纖維的長度)}×100(%)
包含含有改造絲蛋白之絲蛋白纖維的人工毛髮用纖維,具有較一般的合成纖維更高,與人類毛髮匹敵之溫度的軟化點。因此,於160℃之熱收縮率(以式(6)所定義之熱收縮率)為小。通常髮乾燥機之溫風溫度為120~140℃,直捲髮夾(hair iron)之使用適溫為170℃以下。藉由使以式(6)所定義之熱收縮率小,可抑制使用髮乾燥機、直捲髮夾時之損傷。以式(6)所定義之熱收縮率例如可為4%以下、3%以下,或2.5%以下。
含有改造絲蛋白之絲蛋白纖維,亦可配製為animal free(不含動物來源成分)之素材。
絲蛋白纖維70,可使用含有改造絲蛋白之紡絲原液,藉由通常的紡絲方法製造。紡絲原液例如係將改造絲蛋白與依需要之作為溶解促進劑之無機鹽一起添加於二甲基亞碸(DMSO)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、甲酸,或六氟異丙醇(HFIP)等之溶劑中,溶解而製作。使用該紡絲原液,藉由濕式紡絲、乾式紡絲、乾濕式紡絲等之紡絲方法紡絲,可得到目標的絲蛋白纖維。紡絲方法亦可為熔融紡絲法等。
圖5為顯示用以製造絲蛋白纖維之紡絲裝置的一例之示意圖。圖5所示之紡絲裝置10,為乾濕式紡絲用之紡絲裝置之一例,具有擠出裝置1、未延伸紗製造裝置2、濕熱延伸裝置3與乾燥裝置4。
儲存於儲存槽7之紡絲原液6,藉由齒輪泵8而自接口9擠出。於實驗室規模時,亦可將紡絲原液填充於圓柱缸,並使用注射泵自噴嘴擠出。接著,將所擠出的紡絲原液6,經過氣隙19,供給至凝固液槽20之凝固液11內,去除溶劑,使改造絲蛋白凝固,形成纖維狀凝固體。接著,纖維狀凝固體係被供給至延伸浴槽21內之溫水12中而被延伸。延伸倍率係依供給軋輥13與捲取軋輥14之速度比而決定。之後,經延伸之纖維狀凝固體被供給至乾燥裝置4,於導紗道22內乾燥,作為捲紗體5而得到絲蛋白纖維70。18a~18g為導線器。
凝固液11只要係可脫溶劑之溶劑即可,例如可列舉甲醇、乙醇及2-丙醇等之碳數1~5之低級醇,以及丙酮等。凝固液11亦可含有水。凝固液11之溫度,可為0~30℃。使用具有直徑0.1~0.6mm之噴嘴的注射泵作為接口9時,擠出速度可為每1孔0.2~6.0ml/小時,或1.4~4.0ml/小時。經凝固之蛋白質通過凝固液11中之距離(實質上係導線器18a至導線器18b之距離),只要係可有效率地進行脫溶劑之長度即可,例如為200~500mm。未延伸紗之捲取速度,例如可為1~20m/分鐘,或1~3m/分鐘。於凝固液11中之滯留時間,例如可為0.01~3分鐘,或0.05~0.15分鐘。於凝固液11中亦可進行延伸(前延伸)。凝固液槽20亦可設有多段,又,延伸亦可依需要以各段或特定之段進行。
作為絲蛋白纖維70之延伸,除了例如於上述凝固液槽20內進行的前延伸,及於延伸浴槽21內進行的濕熱延伸外,亦可採用乾熱延伸。
濕熱延伸可於溫水中、於溫水添加了有機溶劑等的溶液中,或蒸氣加熱中進行。溫度例如可為50~90℃,或75~85℃。濕熱延伸中,可將未延伸紗(或前延伸紗)例如延伸為1~10倍,或2~8倍。
乾熱延伸,可使用管狀電爐、乾熱板等來進行。乾熱延伸之溫度,例如可為140℃~270℃,或160℃~230℃。乾熱延伸中,可將未延伸紗(或前延伸紗),例如延伸為0.5~8倍,或1~4倍。
濕熱延伸及乾熱延伸可分別單獨進行,又,亦可將此等以多段,或組合來進行。可將第一段延伸以濕熱延伸進行、第二段延伸以乾熱延伸進行,或第一段延伸以濕熱延伸進行、第二段延伸以濕熱延伸進行,進而第三段延伸以乾熱延伸進行等,適當組合濕熱延伸及乾熱延伸來進行。
最終的延伸倍率,相對於未延伸紗(或前延伸紗)而言,可為超過1倍、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上,或9倍以上,可為40倍以下、30倍以下、20倍以下、15倍以下、14倍以下、13倍以下、12倍以下、11倍以下,或10倍以下。絲蛋白纖維若為經2倍以上的延伸倍率紡絲之纖維時,使絲蛋白纖維與水接觸而成為濕潤狀態時之收縮率會變更高。
亦可使藉由紡絲所形成之絲蛋白纖維70收縮。經收縮之步驟所得之絲蛋白纖維,可具有於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮的性質。收縮之步驟,例如可包含使紡絲後、與水接觸前之絲蛋白纖維70,與水接觸而不可逆地收縮。與水接觸後,亦可藉由乾燥,使絲蛋白纖維70進一步收縮。
絲蛋白與水之接觸步驟中,係使紡絲後、與水接觸前之絲蛋白纖維70,與水接觸,使絲蛋白纖維70成為濕潤狀態。濕潤狀態,意指絲蛋白纖維70之至少一部分經水濡濕的狀態。藉此,可不藉外力,使絲蛋白纖維70不可逆地收縮。
接觸於絲蛋白纖維70的水之溫度,可為未達沸點。藉此,操作性及收縮步驟之作業性等提高。就收縮時間充分縮短的觀點,水之溫度可為10℃以上、40℃以上,或70℃以上。水之溫度亦可為90℃以下。
使水與絲蛋白纖維70接觸之方法並無特殊限定。該方法之例子可列舉將絲蛋白纖維70浸漬於水中之方法、對絲蛋白纖維70將水以常溫或經加溫的蒸氣等之狀態噴霧之方法,及將絲蛋白纖維70暴露於充滿水蒸氣的高濕度環境下之方法。由於可有效地實現收縮時間之縮短化,並且可實現加工設備的簡化等,故可採用將絲蛋白纖維70浸漬於水中之方法。
使絲蛋白纖維70在鬆弛的狀態與水接觸時,絲蛋白纖維70不僅光是收縮,可能會如波狀起伏般鬈曲。為了防止如此的鬈曲產生,例如亦可將絲蛋白纖維70於纖維軸方向施加張力同時與水接觸等,在不使絲蛋白纖維70鬆弛之狀態下與水接觸。
亦可使濕潤狀態之絲蛋白纖維70藉由乾燥而收縮。乾燥例如可為自然乾燥、亦可為使用乾燥設備之強制乾燥。作為乾燥設備,係接觸型或非接觸型之公知的乾燥設備均可使用。乾燥溫度例如只要係較使改造絲蛋白分解或絲蛋白纖維70受到熱損傷之溫度更低的溫度即可,例如可為20~150℃,或50~100℃。乾燥時間係依乾燥溫度等而適當設定,例如係採用可儘可能排除過度乾燥所致對絲蛋白纖維70之品質及物性等的影響之時間等。
圖6為顯示用以製造絲蛋白纖維之製造裝置的一例之示意圖。圖6所示之製造裝置40,為用以使藉由紡絲所形成的絲蛋白纖維70收縮之裝置。製造裝置40,具有將絲蛋白纖維70送出之進料輥42、捲繞經收縮之絲蛋白纖維70之捲取機44、用以使絲蛋白纖維70與水接觸之水浴46,與用以將濕潤狀態之絲蛋白纖維70乾燥之乾燥機48。
絲蛋白纖維70之捲繞物係安裝於進料輥42。藉由電動馬達等之旋轉,絲蛋白纖維70係連續且自動地被送出。捲取機44係將經收縮之絲蛋白纖維70,藉由電動馬達的旋轉而連續且自動地捲繞。以進料輥42之絲蛋白纖維70之送出速度,與以捲取機44之絲蛋白纖維70之捲繞速度,可互相獨立地控制。捲取機44之捲繞速度,可較進料輥42之送出速度更慢。藉此,絲蛋白纖維70在進料輥42與捲取機44之間以不鬆弛而緊張的狀態下,藉由與水47的接觸而收縮,因此可防止鬈曲的產生。藉由與水47之接觸,絲蛋白纖維70係不可逆地收縮。
水浴46與乾燥機48,係於進料輥42與捲取機44之間,自絲蛋白纖維70之送出方向的上游側起依序配置。製造裝置40,具有將絲蛋白纖維70予以中繼之中繼輥50及52。
水浴46具有加熱器54,藉由該加熱器54所加溫之水47,被容納於水浴46內。於水浴46內,張力輥56係以浸漬於水47中之狀態被設置。自進料輥42所送出的絲蛋白纖維70,係在水浴46內,於被張力輥56所捲動的狀態下,一邊浸漬於水47中,一邊朝向捲取機44側移動。
乾燥機48具有一對熱輥58。自水浴46內脫離而朝向捲取機44側移動的絲蛋白纖維70,係被一對熱輥58捲動。濕潤狀態之絲蛋白纖維70,係於乾燥機48內被一對熱輥58加熱,藉此乾燥。藉由該乾燥,絲蛋白纖維70更加收縮。乾燥後之絲蛋白纖維70係被捲取機44捲繞。
藉由控制進料輥42之送出速度與捲取機44之捲繞速度的比率,可將絲蛋白纖維70進一步收縮、亦可不使絲蛋白纖維70的長度變化。
圖7為顯示用以製造絲蛋白纖維之製造裝置之別的一例之示意圖。圖7之製造裝置亦為用以使藉由紡絲所形成的絲蛋白纖維70收縮之裝置,其具備用以使絲蛋白纖維70與水接觸之加工裝置60,與用以將濕潤狀態之絲蛋白纖維70乾燥之乾燥裝置62,此等係獨立地設置。
圖7(a)之加工裝置60,具備進料輥42、水浴46與捲取機44,此等係由絲蛋白纖維70之移動方向的上游朝向下游側依序配置。自進料輥42所送出的絲蛋白纖維70,係浸漬於水浴46內的水47中。藉此絲蛋白纖維70會收縮。浸漬後之絲蛋白纖維70係被捲取機44捲繞。亦可省略進料輥42與捲取機44,將絲蛋白纖維以所謂批式而浸漬於水中。
圖7(b)之乾燥裝置62,具有進料輥42及捲取機44,與配置於此等之間的乾熱板64。自進料輥43捲出的絲蛋白纖維70,係藉由一邊與乾熱板64之乾熱面66接觸一邊移動而乾燥。藉由控制進料輥42之送出速度與捲取機44之捲繞速度的比率,可使絲蛋白纖維70進一步收縮、亦可不使絲蛋白纖維70的長度變化。藉由乾燥裝置62之乾燥並非必需。
[實施例]
以下基於實施例等以更具體說明本發明。惟,本發明不限定於以下實施例。
1.絲蛋白纖維
(1)改造絲蛋白
合成編碼序列編號40表示之改造絲蛋白(PRT966)的核酸。對所合成之核酸於5’末端附加NdeI位點、於終止密碼子下游附加EcoRI位點。將核酸選殖於選殖載體(pUC118)。之後,將該核酸以NdeI及EcoRI限制酵素進行處理而切出。將所切出之核酸重組於蛋白質表現載體pET-22b(+),得到表現載體。
以所得之pET-22b(+)表現載體將大腸菌BLR(DE3)轉形。將該轉形大腸菌,以含安比西林之2mL之LB培養基培養15小時。將該培養液添加於含安比西林之100mL種子培養用培養基(表4),使OD
600成為0.005。將培養液溫度保持於30℃,進行約15小時之燒瓶培養,至OD
600成為5,得到種子培養液。
將該種子培養液添加於添加有500mL生產培養基(表5)之發酵槽中,使OD
600成為0.05。將培養液溫度保持為37℃,於pH6.9控制為一定來進行培養。又,將培養液中之溶存氧濃度,維持為溶存氧飽和濃度之20%。
於生產培養基中之葡萄糖完全被消耗後,立即將供料液(葡萄糖455g/1L、Yeast Extract 120g/1L)以1mL/分鐘的速度添加。將培養液溫度保持為37℃,於pH6.9控制為一定來進行培養。將培養液中之溶存氧濃度,維持為溶存氧飽和濃度之20%,同時進行20小時培養。之後,對培養液添加1M之異丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)使終濃度成為1mM,表現誘導目標之改造絲蛋白。於IPTG添加後經過20小時的時間點,將培養液離心分離,回收菌體。由IPTG添加前與IPTG添加後之培養液,使用所調製的菌體進行SDS-PAGE,藉由相當於依賴IPTG添加之目標改造絲蛋白的大小之帶紋(band)的出現,確認表現了目標改造絲蛋白。
將添加IPTG起2小時後所回收的菌體以20mM Tris-HCl buffer(pH7.4)洗淨。將洗淨後之菌體懸浮於含有約1mM之PMSF的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4),以高壓均質機(GEA Niro Soavi公司)使細胞破碎。將破碎的細胞離心分離,得到沈澱物。將所得之沈澱物,以20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)洗淨直到成為高純度。將洗淨後之沈澱物懸浮於8M 胍緩衝液(8M 胍鹽酸鹽、10mM 磷酸二氫鈉、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)使成為100mg/mL之濃度,於60℃以攪拌子攪拌30分鐘使其溶解。溶解後,使用透析管(三光純藥股份有限公司製之纖維素管36/32)以水進行透析。將透析後所得之白色的凝集蛋白質藉由離心分離回收。以冷凍乾燥機由回收的凝集蛋白質去除水,得到目標的改造絲蛋白之冷凍乾燥粉末。
(2)絲蛋白纖維之製作
使用溶解有4.0質量%之氯化鋰的二甲基亞碸(DMSO)作為溶劑,於其中溶解改造絲蛋白之冷凍乾燥粉末。之後,去除不溶物與氣泡,得到改造絲蛋白溶液。藉由使用所得之改造絲蛋白溶液作為紡絲原液之乾濕式紡絲,製作絲蛋白纖維。延伸倍率為6倍。
將長30cm的複數條之絲蛋白纖維的單紗予以急束,得到纖度150丹尼之纖維束。於各纖維束安裝0.8g之鉛錘。於該狀態下將纖維束浸漬於40℃之水10分鐘,藉此使絲蛋白纖維收縮。之後,將由水中取出的纖維束於室溫放置2小時藉以乾燥。藉此得到含改造絲蛋白之單紗直徑80μm的乾燥之絲蛋白纖維之纖維束。將所得之纖維束,進行以下之絲蛋白纖維之形狀賦予試驗。
2.形狀賦予試驗
比較例
準備Meros Cosmetics股份有限公司製之「Bolteh」(商品名),作為包含第1液及第2液之冷燙髮液。將絲蛋白纖維以水濡濕,捲繞於直徑約25mm之金屬製之圓柱狀芯材。將捲繞於芯材之絲蛋白纖維,浸漬於冷燙髮液之第1液中1小時,接著水洗後浸漬於冷燙髮液之第2液中1小時。最後將絲蛋白纖維水洗。自芯材取下的絲蛋白纖維,係被賦予捲曲之形狀。將所得之絲蛋白纖維水洗1次後,所賦予的形狀幾乎消失。
實施例1
使用與比較例相同之市售冷燙髮液。將絲蛋白纖維以水濡濕,捲繞於直徑約25mm之金屬製之圓柱狀芯材。將捲繞於芯材之絲蛋白纖維,浸漬於濃度14質量%之L-半胱胺酸水溶液。將L-半胱胺酸水溶液加溫至42℃同時放置6小時。接著,將捲繞於芯材之絲蛋白纖維,水洗後,依序於冷燙髮液之第2液中42℃浸漬3小時、於冷燙髮液之第1液中42℃浸漬3小時、於冷燙髮液之第2液中42℃浸漬3小時。由各液中取出的絲蛋白纖維,係水洗後浸漬於如下之液中。對最後之第2液之浸漬後亦將絲蛋白纖維水洗。自芯材取下的絲蛋白纖維,係較比較例更強地被賦予捲曲之形狀。所得之絲蛋白纖維,於進行3次之水洗及乾燥後,亦維持某種程度的被賦予之形狀。
實施例2
混合與比較例相同之市售冷燙髮液之第1液10質量份、L-半胱胺酸50質量份,與水40質量份,調製含有L-半胱胺酸之試驗用之第1液。將絲蛋白纖維以水濡濕,捲繞於直徑約25mm之金屬製之圓柱狀芯材。將捲繞於芯材之絲蛋白纖維,於試驗用之第1液中室溫(約20℃)下浸漬一晩。接著,將絲蛋白纖維水洗後,於與比較例相同之市售冷燙髮液之第2液中室溫(約20℃)下浸漬4小時。
自芯材取下的絲蛋白纖維,係較比較例更強地被賦予捲曲之形狀。所得之絲蛋白纖維,於進行3次之水洗及乾燥後,亦維持捲曲之形狀。圖8為水洗後之絲蛋白纖維之照片。(a1)為1次水洗後之實施例2之絲蛋白纖維、(a2)為1次水洗後之比較例之絲蛋白纖維、(b1)為5次水洗後之實施例2之絲蛋白纖維。實施例2之絲蛋白纖維,於5次水洗後亦充分維持捲曲之形狀。
實施例3
除了將對第1液之浸漬時間變更為4小時、對第2液之浸漬時間變更為一晩以外,係與實施例2同樣地得到賦予捲曲之形狀的絲蛋白纖維。圖9為水洗後之絲蛋白纖維之照片。(a1)為1次水洗後之實施例2之絲蛋白纖維、(a2)為1次水洗後之實施例3之絲蛋白纖維、(b1)為5次水洗後之實施例2之絲蛋白纖維、(b2)為5次水洗後之實施例3之絲蛋白纖維。對第1液之浸漬時間較第2液之浸漬時間更長之實施例2,觀察到形狀之保持性更優良的傾向。
實施例4
使用與比較例相同之市售冷燙髮液。將絲蛋白纖維以水濡濕,捲繞於直徑約25mm之金屬製之圓柱狀芯材。將捲繞於芯材之絲蛋白纖維,浸漬於濃度1質量%之L-半胱胺酸水溶液。將L-半胱胺酸水溶液加溫至42℃同時放置39分鐘。接著,將捲繞於芯材之絲蛋白纖維,水洗後依序於冷燙髮液之第2液中42℃浸漬30分鐘、於冷燙髮液之第1液中42℃浸漬30分鐘、於冷燙髮液之第2液中42℃浸漬30分鐘。將自各液中取出的絲蛋白纖維水洗後浸漬於如下之液中。對最後之第2液的浸漬後亦將絲蛋白纖維水洗。自芯材取下的絲蛋白纖維,係較比較例更強地被賦予捲曲之形狀。
水伸縮性
分別測定賦予形狀前之絲蛋白纖維,及實施例1~4所得之經賦予捲曲之形狀的絲蛋白之乾燥狀態的長度(成為濕潤狀態前之絲蛋白纖維的長度)。接著,於各絲蛋白纖維安裝0.8g之鉛錘,於該狀態下將絲蛋白纖維於40℃之水中浸漬10分鐘。之後,於水中測定各絲蛋白纖維的長度(成為濕潤狀態時之絲蛋白纖維的長度)。為了使各絲蛋白纖維之鬈曲消失,於水中之各絲蛋白纖維的長度測定,係在於各絲蛋白纖維安裝0.8g之鉛錘的狀態下實施。接著,將自水中取出之各絲蛋白纖維,在安裝0.8g之鉛錘的狀態下,於室溫放置2小時使其乾燥。乾燥後,測定各絲蛋白纖維的長度(從濕潤狀態乾燥時之絲蛋白纖維的長度)。由所得之測定值,遵照下述式(1)、式(4)及式(5),算出各絲蛋白纖維之復元率、伸長率及收縮率C。
式(1):復元率=(從濕潤狀態乾燥時之絲蛋白纖維的長度/成為濕潤狀態前之絲蛋白纖維的長度)×100(%)
式(4):伸長率={(濕潤狀態之絲蛋白纖維的長度/成為濕潤狀態前之絲蛋白纖維的長度)-1}×100(%)
式(5):收縮率C={1-(從濕潤狀態乾燥時之絲蛋白纖維的長度/濕潤狀態之絲蛋白纖維的長度)}×100(%)
賦予形狀前之絲蛋白纖維,及經賦予捲曲之形狀的各實施例之絲蛋白纖維,顯示出2~17%之伸長率、2~17%之收縮率C,及95~100%之復元率。亦即,此等絲蛋白纖維,顯示出於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮的特性。
1:擠出裝置
2:未延伸紗製造裝置
3:濕熱延伸裝置
4:乾燥裝置
6:紡絲原液
10:紡絲裝置
20:凝固液槽
21:延伸浴槽
40:製造裝置
42:進料輥
44:捲取機
46:水浴
48:乾燥機
54:加熱器
56:張力輥
58:熱輥
60:加工裝置
62:乾燥裝置
64:乾熱板
70:絲蛋白纖維
75:芯材
[圖1]顯示製造經賦予包含彎曲部分之形狀的人工毛髮用纖維之方法的一例之示意圖。
[圖2]顯示改造絲蛋白之結構域序列的一例之示意圖。
[圖3]顯示改造絲蛋白之結構域序列的一例之示意圖。
[圖4]顯示改造絲蛋白之結構域序列的一例之示意圖。
[圖5]顯示用以製造絲蛋白纖維之紡絲裝置的一例之示意圖。
[圖6]顯示用以製造絲蛋白纖維之製造裝置的一例之示意圖。
[圖7]顯示用以製造絲蛋白纖維之製造裝置的一例之示意圖。
[圖8]經賦予包含彎曲部分之形狀之絲蛋白纖維之圖(照片)。
[圖9]經賦予包含彎曲部分之形狀之絲蛋白纖維之圖(照片)。
70:絲蛋白纖維
75:芯材
Claims (12)
- 一種製造經賦予特定形狀之人工毛髮用纖維之方法,其包含 於含有改造絲蛋白之絲蛋白纖維的表面導入半胱胺酸,與 將前述絲蛋白纖維在沿著特定形狀之狀態保持的狀態下,使前述絲蛋白纖維與冷燙髮液接觸,且 前述特定形狀,為包含彎曲部分、直線狀部分或此等兩方之形狀。
- 如請求項1之方法,其中藉由前述絲蛋白纖維與含有半胱胺酸之溶液的接觸,於前述絲蛋白纖維之表面導入半胱胺酸,之後,使前述絲蛋白纖維與前述冷燙髮液接觸。
- 如請求項2之方法,其中前述冷燙髮液,為包含含有還原劑之第1液及含有氧化劑之第2液的2液型冷燙髮液,且 使於表面經導入半胱胺酸之前述絲蛋白纖維,依序與前述第2液、前述第1液及前述第2液接觸。
- 如請求項1之方法,其中前述冷燙髮液,為包含含有還原劑之第1液及含有氧化劑之第2液的2液型冷燙髮液, 前述第1液進一步含有半胱胺酸,且 藉由前述絲蛋白纖維與前述第1液之接觸,於前述絲蛋白纖維之表面導入半胱胺酸,之後,使前述絲蛋白纖維與前述第2液接觸。
- 如請求項4之方法,其中前述絲蛋白纖維與前述第1液之接觸時間,較前述絲蛋白纖維與前述第2液之接觸時間更長。
- 如請求項3~5中任一項之方法,其中一邊加熱前述第2液,一邊使前述絲蛋白纖維與前述第2液接觸。
- 如請求項1~6中任一項之方法,其中前述絲蛋白纖維係藉由捲繞於芯材,於沿著包含彎曲部分之前述特定形狀之狀態下被保持。
- 如請求項1~7中任一項之方法,其中前述改造絲蛋白包含改造蜘蛛絲絲蛋白。
- 如請求項1~8中任一項之方法,其中前述絲蛋白纖維,為於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮的纖維。
- 一種製造人工毛髮之方法,其包含藉由如請求項1~9中任一項之方法,得到經賦予特定形狀之人工毛髮用纖維。
- 一種人工毛髮用纖維,其係藉由如請求項9之方法被賦予特定形狀,於濕潤狀態時伸長,且從濕潤狀態乾燥時會收縮。
- 一種人工毛髮,其包含如請求項11之人工毛髮用纖維。
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