TW202208854A - 簡易鼻腔黏膜表面附著黏液之採取方法及用以檢測該檢體中之被檢測物之檢查套組 - Google Patents
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Abstract
本發明之目的在於提供一種藉由使用滴鼻裝置而非侵入性且簡便地採取鼻腔黏膜表面之附著黏液,並將其用作檢體,藉此迅速、簡便且精度較高地對檢體中之被檢測物進行分析之方法。
本發明係一種檢測感染症之方法,其使用包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液作為檢體來檢測感染症,該鼻腔黏膜表面附著黏液係向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨所獲得。
Description
本發明提供一種採取使用滴鼻裝置所獲得之鼻腔黏膜表面附著黏液作為檢體的方法、及用以檢測藉由該方法所獲得之檢體中之被檢測物的分析方法。
先前以來,於為了實施臨床檢查、感染症等之檢查而自人體採取檢體之情形時,關於檢體種類,使用如下各種檢體,例如血液、唾液、糞便、活檢組織、角結膜拭子、鼻拭子、咽拭子、鼻腔抽吸液、鼻腔洗淨液、鼻涕等。
例如,在以流感病毒為代表之感染症之檢查中,廣泛使用鼻拭子、咽拭子、鼻腔抽吸液、鼻涕,由於藉由使用所採取之檢體之檢查套組,可迅速且簡便地判定檢體中有無流感病毒抗原,因此在流感病毒流行期間,日常採取檢體以用於檢查(參照專利文獻1)。
鼻拭子通常使用醫用殺菌棉棒來進行採取,使用棉棒來採取檢體被認為侵入性較低,另一方面,為了獲得足以檢查之檢體而將棉棒伸進至鼻咽部,且需要大力進行擦拭以自黏膜採取足夠量之檢體,且有時伴有強烈之疼痛及出血。又,在咽拭子之採取過程中,需要對扁桃腺或咽部後壁充分地進行擦拭來採取檢體,有時會引起嘔吐反射,在嘔吐之同時較難採取足夠量之檢體。又,關於鼻腔抽吸液,只能擁有專用抽吸裝置之一部分醫療機構利用,又,根據患者之狀態,有時幾乎沒有鼻水,而較難採取足夠量之檢體。鼻腔洗淨液是利用注射器使液體大量地進入至鼻腔內部,使用紙杯或與鼻腔抽吸液同樣地使用抽吸裝置回收流出來之液體,但患者會因液體大量進入至鼻腔內而感到呼吸不暢,且視情況之不同,有時所進入之液體會自鼻部流至喉部,從而鼻腔洗淨液之採取並不容易。關於鼻涕,只能適用於可擤鼻涕之年齡以上之患者,且與鼻腔抽吸液同樣地,根據患者之狀態有時較難採取足夠量之檢體。根據上述理由,用於檢查流感病毒之上述鼻拭子、咽拭子、鼻腔抽吸液、鼻腔洗淨液及鼻涕這5種檢體種類及其採取方法總體來說,對患者所造成之負擔絕不輕鬆,又,根據患者之狀態不同,有時無法獲得規定之檢體量,而對檢查之精度會有影響,因此要求一種侵入性更低且可穩定地採取一定量檢體的檢體之採取方法、檢查套組。
又,上述用於檢查流感病毒之5種檢體種類及其採取方法存在如下問題:夾裹生物成分之數量變多;容易因生物成分引起偽陽性、偽陰性或無法判定等非特異反應;尤其是若為鼻腔洗淨液,則檢體會被大量之洗淨液稀釋而導致感度下降。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1:國際公開第WO2005/121794號公報
[發明所欲解決之問題]
本發明提供一種檢體中之被檢測物之分析方法,其藉由使用滴鼻裝置而非侵入性且簡便地採取鼻腔黏膜表面附著黏液,並將其用作檢體,藉此迅速、簡便且精度較高地對檢體中之被檢測物進行分析。
[解決問題之技術手段]
本申請案發明人等經過銳意研究,結果發現,藉由採取使用滴鼻裝置向鼻腔內噴霧規定量之生理鹽水來對鼻腔黏膜表面進行清洗所獲得之附著黏液,可非侵入性地、簡便且穩定地採取該檢體,且藉由建立當將該採取物作為檢體來檢測檢體中之病原體時可獲得充分感度之測定系統,該檢體可用作臨床檢體,從而完成了本發明,即藉由簡便且非侵入性之檢體採取,能夠實現檢體中之被檢測物之分析。
本發明之形態如下所述。
[1]一種檢測感染症之方法,其係使用包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液作為檢體來檢測感染症,上述鼻腔黏膜表面附著黏液係向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨所獲得。
[2]如[1]之方法,其中向鼻腔內添加之洗淨液之量為200~800 μL。
[3]如[1]或[2]之方法,其中向鼻腔內添加洗淨液之方法係噴霧。
[4]如[1]至[3]中任一項之方法,其中感染症係流感病毒感染症。
[5]如[1]至[4]中任一項之方法,其係免疫檢測法。
[6]如[1]至[4]中任一項之方法,其係基因擴增法。
[7]一種用以檢測感染症之檢查套組,其使用包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液作為檢體,上述鼻腔黏膜表面附著黏液係向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨所獲得,上述檢查套組包括滴鼻裝置,該滴鼻裝置包含用以檢測感染症之檢查試劑、及用以洗淨鼻腔黏膜之洗淨液。
[8]如[7]之檢查套組,其中滴鼻裝置係一次性使用型之滴鼻裝置,該裝置中含有以1次量計為200~800 μL之供向鼻腔內添加之洗淨液。
[9]如[7]或[8]之檢查套組,其中向鼻腔內添加洗淨液之方法係噴霧。
[10]如[7]至[9]中任一項之檢查套組,其中感染症係流感病毒感染症。
[11]如[7]至[10]中任一項之檢查套組,其係免疫檢查套組。
[12]如[7]至[10]中任一項之檢查套組,其係基因擴增用檢查套組。
[13]一種採取檢體之方法,其藉由向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨,而採取含有包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液的檢體。
[14]如[13]之方法,其中向鼻腔內添加之洗淨液之量為200~800 μL。
[15]如[13]或[14]之方法,其中向鼻腔內添加洗淨液之方法係噴霧。
[16]如[13]至[15]中任一項之方法,其中感染症係流感病毒感染症。
本說明書包含作為本申請案之優先權之基礎的日本專利申請2020-122106號之揭示內容。
[發明之效果]
根據本發明之方法,可建立一種根據包含對鼻腔黏膜表面進行清洗所獲得之附著黏液之檢體來進行感染症之診斷的方法。
本發明之方法中,於使用對鼻腔黏膜表面進行清洗所獲得之附著黏液作為檢體來進行感染症之診斷的情形時,能夠以與使用鼻拭子、咽拭子、鼻腔抽吸液、鼻腔洗淨液及鼻涕作為檢體來進行感染症之診斷時相同程度之感度,或者更好之感度進行感染症之診斷。
以下,對本發明詳細地進行說明。
本發明之特徵在於採取附著黏液作為檢體,該附著黏液係藉由滴鼻裝置向鼻腔內噴霧規定量之生理鹽水等洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行清洗所獲得。此處,附著黏液係指附著於鼻腔黏膜表面之黏液。
例如,對於根據問診等而懷疑感染了感染症之患者即受試者,使用預先填充有洗淨液之滴鼻裝置,向受試者鼻腔內藉由噴霧或滴加而添加規定量之洗淨液。噴霧或滴加之後,藉由洗淨液對鼻腔黏膜表面進行清洗,回收流出至鼻部入口附近處之包含附著黏液之洗淨液作為檢體。使用如此所獲得之檢體,實施各種檢查。
本發明可藉由向鼻腔內噴霧洗淨液而利用洗淨液對鼻腔黏膜表面進行清洗,回收流出至鼻部入口附近處之包含附著黏液之洗淨液作為檢體。
若利用點滴器或附有噴嘴之器具使洗淨液流入鼻腔內,則對鼻腔內局部地進行洗淨,因此無法採取較廣範圍之鼻腔黏膜表面黏液。
相對於此,藉由向鼻腔內噴霧洗淨液,可採取較廣範圍之鼻腔黏膜表面黏液。
又,若利用點滴器或附有噴嘴之器具使洗淨液流入鼻腔內,則洗淨液會因流入勢頭通過鼻腔而流向喉部,變得無法高效率地回收洗淨液。
相對於此,藉由向鼻腔內噴霧洗淨液,可防止洗淨液通過鼻腔流向喉部,可高效率地回收洗淨液。
又,若利用點滴器或附有噴嘴之器具使洗淨液流入鼻腔內,則因洗淨液局部地流入鼻腔內之勢頭而對鼻腔內造成負擔,受驗者(尤其是兒童)大多會感到疼痛或呼吸不暢等。
相對於此,藉由向鼻腔內噴霧洗淨液,可減輕鼻腔內之負擔,而使得受驗者(尤其是兒童)變得不易感到疼痛或呼吸不暢等。
於本發明中,滴鼻裝置係指填充有生理鹽水等洗淨液之容器。本發明之滴鼻裝置可利用作為滴鼻容器市售之滴鼻裝置、或噴霧裝置、醫用噴霧設備等,但並不限定於此。
又,作為洗淨液,例如可例舉生理鹽水。生理鹽水可利用以日本藥典之生理鹽水市售者、或根據日本藥典之配方所製備者等,但並不限定於此。又,亦可使用林格氏溶液、乳酸林格氏溶液、葡萄糖液等等張液作為洗淨液。
鼻腔內之洗淨只要藉由滴鼻裝置向鼻腔內噴霧或滴加200~800 μL、較佳為400~700 μL、進而較佳為300~500 μL之洗淨液即可。
作為回收流出至鼻部入口附近處之包含附著黏液之液體作為檢體的方法,可例舉藉由各種採取器具進行採取之方法,作為採取器具,可利用可擔載液體之器具,例如棉棒、拭子(醫用棉花棒)、刷、前端為網狀之器具、海綿狀之器具、布狀等吸收體等。只要使該等器具吸收包含附著黏液之液體以進行採取即可。
於本發明中,將如此採取到之檢體稱作簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體。
使採取器具所採取到之檢體例如溶解或懸浮於液體中而獲得液體,只要將該液體作為檢體樣本即可。藉由將採取器具之吸收有包含附著黏液之液體的部分、例如棉棒前端之棉球部於液體中揉搓、或擠壓、或摩擦等,可使得採取器具所採取到之檢體溶解或懸浮於液體中。作為供使檢體溶解或懸浮之液體,可使用緩衝液。
於本發明中,可在不對檢體進行濃縮、培養操作等處理之情況下,直接用作樣本。又,亦可將檢體與緩衝液混合而製成樣本。作為緩衝液,例如可使用磷酸緩衝液,亦可包含Tween20(聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯)等界面活性劑、或血清白蛋白。例如,於利用使用膜片之側流式免疫測定法即免疫膠體層析法進行分析之情形時,使棉棒所採取到之檢體懸浮於緩衝液中而用作檢體樣本。
本發明中供進行檢測之感染症係由病毒、細菌、原生動物、真菌、黴漿菌、立克次體、披衣菌等病原體所引起之感染症,其中,尤其是以檢測由病毒所引起之感染症為目的。作為病毒,可例舉:流感病毒;SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒)、MERS-CoV(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,中東呼吸症候群冠狀病毒)、SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型)等冠狀病毒;RS(Respiratory Syncytial,呼吸系融合細胞)病毒;腺病毒;人類偏肺病毒等。只要將導致該等感染症之病原體作為被檢測物進行檢測即可。
作為使用本發明之被檢測物之檢測方法,可例舉:免疫測定法(免疫學測定法)、基因檢查法、分離培養・鑑定法等。
在免疫測定法中,利用抗體抗原反應對檢體中之病毒進行分析。具體而言,可使用對病毒之抗原具有特異性之抗體進行分析。針對病毒之抗原之抗體可藉由公知之方法獲得。作為免疫測定法,可使用業者周知之任一種方法,例如:免疫染色法(包括螢光抗體法、酵素標記抗體法、重金屬標記抗體法、放射性同位素標記抗體法);將利用電泳法之分離、與利用螢光、酵素、放射性同位素等之檢測方法組合而成之方法(包括西方點墨法、螢光二維電泳法);酵素免疫測定吸附法(ELISA,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay);點印漬法;乳膠凝集法(LA:Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay,乳膠凝集免疫比濁法);免疫膠體層析法等。再者,於本發明中,「分析」包括:定量、半定量、檢測中之任一者。
上述免疫測定法之中,較佳為夾層法。夾層法本身在免疫測定之領域中眾所周知,例如可藉由側流式地進行免疫測定之免疫膠體層析法、或ELISA法來進行。該等夾層法本身均眾所周知,本發明之方法可藉由熟知之夾層法進行。
在以夾層法作為檢測原理之免疫測定中,作為供固定抗體之固相,可使用藉由公知技術能夠固定抗體之所有固相,例如,可任意地選擇公知之固相,例如具有毛細管作用之多孔性薄膜(膜片)、粒子狀物質、試管、樹脂平板等。又,作為標記抗體之物質,可使用酵素、放射性同位素、螢光物質、發光物質、有色粒子、膠體粒子等。又,亦可使用2種以上之抗體。2種以上之抗體較佳為使用於夾層法,且會識別出彼此不同之表位的抗體。
於基於上述各種材料之免疫測定法之中,尤其是基於臨床檢查之簡便性及迅速性之觀點而言,較佳為使用膜片之側流式免疫測定法即免疫膠體層析法。
本發明之方法之側流式免疫測定法可使用免疫測定器具來進行,該免疫測定器具包括:具有固定有供捕捉測定對象物(抗原)之抗體(抗體1)之檢測區域的支持體;具有經著色聚苯乙烯粒子或金膠體等適當之標記物質標記且能夠移動之標記抗體(抗體2)的標記體區域;供滴加檢體之樣本墊;供吸收展開之檢體液之吸收帶;及用於將該等構件貼合成一體之背襯片。在該方法中,向樣本墊滴加作為包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液之檢體,該鼻腔黏膜表面附著黏液係向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨所獲得,且對固定化有抗體1之固相支持體,利用毛細現象,使經著色聚苯乙烯粒子或金膠體等適當之標記物質標記且能夠與被檢測物質(標記試劑)結合之抗體2與被檢測物質之複合體展開移動。其結果為,於固相支持體上形成已固定化之物質-被檢測物質-標記試劑之複合體,對自該複合體發出之標記試劑之訊號(於金膠體之情形時,固定化有能夠與被檢測物質結合之物質之固相支持體部分變紅)進行檢測,藉此可檢測被檢測物質。該免疫測定方法可於5~35℃、較佳為室溫下進行,當利用檢體處理液實施預處理時,亦只要於該溫度範圍內進行免疫測定方法即可。
再者,檢測區域之數量及標記體區域中所含有之標記抗體之種類並不限定於1種,藉由使用與複數個測定對象物對應之抗體,可利用同一免疫測定器具檢測2種以上之抗原。
本發明亦包括:免疫測定試劑,其係用以對檢體中之被檢測物進行分析而檢測感染症之上述免疫測定器具;及檢查套組,其係包含免疫測定試劑、及滴鼻裝置之免疫測定套組。
於病毒等被檢測物之數量較少之情形時,亦可藉由分離培養・鑑定法進行培養而使數量增加之後再進行分析。
作為基因檢查法,可例舉:PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶連鎖反應)法、LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification,恆溫環型核酸擴增法)法、TMA(Transcription Mediated Amplification,轉錄媒介擴增)法、SDA(Strand Displacement Amplification,股替代擴增)法、ICAN(Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acids,嵌合引物介導恆溫擴增)法等基因擴增法。其中,適宜使用PCR法。只要將包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液作為檢體,使該檢體中所含有之病原體之基因擴增即可,上述含鼻腔黏膜表面附著黏液係向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨所獲得。PCR法係利用Taq DNA聚合酶反應,使被具有特定序列之引物所包圍之基因區域在活體外進行擴增之方法。基因擴增反應係藉由使用正向引物與反向引物之一對引物,並反覆三個步驟之熱循環30~40次來進行之方法,上述三個步驟i)雙股DNA之熱改性、ii)引物之退火、及iii)延伸反應。所有方法均公知。
本發明亦包括:上述基因擴增用試劑,其用以對檢體中之被檢測物進行分析而檢測感染症;及檢查套組,其係包含基因擴增用試劑、及滴鼻裝置之基因擴增用套組。該套組之滴鼻裝置包含向鼻腔內添加之洗淨液。該滴鼻裝置可為一次性使用型,一次性使用型之滴鼻裝置含有以1次量計為200~800 μL、較佳為400~700 μL、進而較佳為300~500 μL之向鼻腔內添加之洗淨液。
實施例
以下,例舉實施例,進一步詳細地進行說明,但本發明並不僅受實施例所限定。
[實施例1]
1.滴鼻裝置之製作
於20 mL容量之滴鼻容器(Kinshi製作所製造)中填充10 mL生理鹽水(Otsuka pharmaceutical製造),從而製成滴鼻裝置。
2.簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體之採取
使用滴鼻裝置,向3名成人健康者噴霧200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、700 μL、800 μL,使Ex swab 003T吸收流出至鼻部入口處之液體以進行採取,將其作為簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體。
3.採取時之官能試驗
當在2.中採取簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體時,3名成人健康者根據各噴霧量下之採取之容易性、呼吸不暢之程度、及不易流向喉部之程度這三個觀點來進行評價。
4.比較研究
根據表1之結果,雖存在個人差異,但認為噴霧量300~500 μL為最佳之噴霧量。但,由於為成人健康者,故而若是兒童則有可能產生變化,又,根據人種不同亦有可能產生變化,因此並不限定於此。
[表1]
◎:非常好、:較好、△:一般、×:較差
噴霧量(μL) | 官能試驗評價項目 | 3名健康者 | ||
A | B | C | ||
200 | 採取之容易性 | △ | × | △ |
呼吸不暢之程度 | ◎ | ◎ | ◎ | |
不易流向喉部之程度 | ◎ | ◎ | ◎ | |
300 | 採取之容易性 | ◎ | | |
呼吸不暢之程度 | ◎ | | ◎ | |
不易流向喉部之程度 | ◎ | ◎ | ◎ | |
400 | 採取之容易性 | ◎ | ◎ | ◎ |
呼吸不暢之程度 | ◎ | △ | ◎ | |
不易流向喉部之程度 | ◎ | △ | ◎ | |
500 | 採取之容易性 | ◎ | ◎ | ◎ |
呼吸不暢之程度 | ◎ | × | ◎ | |
不易流向喉部之程度 | | × | | |
600 | 採取之容易性 | ◎ | ◎ | |
呼吸不暢之程度 | | × | ◎ | |
不易流向喉部之程度 | △ | × | △ | |
700 | 採取之容易性 | | ◎ | △ |
呼吸不暢之程度 | | × | ◎ | |
不易流向喉部之程度 | △ | × | × | |
800 | 採取之容易性 | △ | ◎ | △ |
呼吸不暢之程度 | | × | ◎ | |
不易流向喉部之程度 | △ | × | × |
[實施例2]
1.簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體之SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)解析
使實施例1之2.中所採取到之簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體於200 μL之生理鹽水中懸浮。分取其中一部分,並以終濃度成為62.5 mM Tris-HCl(Tris hydrochloride,三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽)(pH值6.5)、10(w/v)%甘油、2.3(w/v)%SDS(Sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸鈉)、0.05(w/v)%BPB(Bromophenol blue,溴酚藍)(色素)之方式添加各試劑,於95℃下進行5分鐘加熱改性處理,並實施慣例之SDS-PAGE。
2.利用密度測定分析裝置之總蛋白質量解析
使用密度測定分析裝置(Bio-Rad公司製造),對上述1.之SDS-PAGE之CBB(Coomasie brilliant blue,考馬斯亮藍)染色完成之凝膠進行解析,對每條區帶中所有條帶之密度進行測定,將總密度之值作為密度得分。
3.比較研究
將密度得分之測定結果示於表2中。根據表2之結果可明確,雖存在個人差異,但於噴霧量400~700 μL時採取到之簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體中之蛋白質量較多。但,由於為成人健康者,故而若為有症狀者或兒童,則可能產生變化,又,根據人種亦可能有所不同,因此並不受其限定。
[表2]
噴霧量(μL) | 密度得分 | ||
3名健康者 | |||
A | B | C | |
200 | 106.4 | 104.6 | 107.5 |
300 | 110.5 | 105.9 | 119.0 |
400 | 109.5 | 110.1 | 152.4 |
500 | 119.2 | 106.1 | 113.4 |
600 | 129.5 | 102.0 | 100.0 |
700 | 100.0 | 103.8 | 127.8 |
800 | 106.8 | 100.0 | 101.1 |
[實施例3]
1.鼻腔抽吸液檢體與簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體之SDS-PAGE解析
根據鼻腔抽吸液檢體10,使用men-tip P1503(日本棉棒股份有限公司製造)來採取檢體,使其於200 μL之生理鹽水中懸浮,而製成SDS-PAGE用之樣本。又,將實施例1之2.中所採取到之向3名健康者噴霧400 μL所獲得之簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體加以混合,而製成SDS-PAGE用之樣本。分取出各樣本,以終濃度成為62.5 Mm Tris-HCl(pH值6.5)、10(w/v)%甘油、2.3(w/v)%SDS、0.05(w/v)%BPB(色素)之方式添加各試劑,於95℃下進行5分鐘加熱改性處理,實施慣例之SDS-PAGE。
2.利用密度測定分析裝置進行之總蛋白質量解析
使用密度測定分析裝置(Bio-Rad公司製造),對上述1.之SDS-PAGE之CBB染色完成之凝膠進行解析,對每條區帶中所有條帶之總密度(密度得分)進行測定。
3.比較研究
將密度得分之測定結果示於表3中。根據表3之結果,雖每個檢體存在差異,但於分別加以混合之條件下之比較中,在鼻腔抽吸液檢體與簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體中可採取到之蛋白質量並不存在較大差異。因此,認為使用本發明之簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體能夠進行流感病毒之檢查。
[表3]
樣本 | 密度得分 |
簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體 | 153.5 |
鼻腔抽吸液檢體1 | 144.0 |
鼻腔抽吸液檢體2 | 115.9 |
鼻腔抽吸液檢體3 | 201.0 |
鼻腔抽吸液檢體4 | 140.8 |
鼻腔抽吸液檢體5 | 96.5 |
鼻腔抽吸液檢體6 | 118.0 |
鼻腔抽吸液檢體7 | 120.2 |
鼻腔抽吸液檢體8 | 102.0 |
鼻腔抽吸液檢體9 | 187.5 |
鼻腔抽吸液檢體10 | 176.2 |
混合鼻腔抽吸液檢體1~10 | 161.0 |
[實施例4]
1.抗A型流感病毒抗體之製作
使BALB/c小鼠免疫不活化之A型流感病毒,自經過一定期間飼養之小鼠中摘除脾臟,並藉由Kohler等人之方法(Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497(1975))與小鼠骨髓瘤細胞(P3X63)融合。將所獲得之融合細胞(融合瘤)維持在37℃保溫箱中,藉由使用固相有自幽門螺桿菌提取之抗原之培養盤之ELISA,一面確認上清液之抗體活性,一面進行細胞之純化(單選殖化)。將所取得之2株該細胞分別腹腔投予至經姥鮫烷處理之BALB/c小鼠中,在約2週之後,採取含抗體之腹水。
藉由使用蛋白A管柱之親和層析法,自所獲得之腹水分別純化IgG(Immunoglobulin G,免疫球蛋白G),而獲得2種純化抗A型流感病毒抗體。
2.抗B型流感病毒抗體之製作
使BALB/c小鼠免疫不活化之B型流感病毒,自經過一定期間飼養之小鼠中摘除脾臟,並藉由Kohler等人之方法(Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497(1975))與小鼠骨髓瘤細胞(P3X63)融合。將所獲得之融合細胞(融合瘤)維持在37℃保溫箱中,藉由使用固相有自幽門螺桿菌提取之抗原之培養盤之ELISA,一面確認上清液之抗體活性,一面進行細胞之純化(單選殖化)。將所獲得之2株該細胞分別腹腔投予至經姥鮫烷處理之BALB/c小鼠中,在約2週之後,採取含抗體之腹水。
藉由使用蛋白A管柱之親和層析法,自所獲得之腹水分別純化IgG,而獲得2種純化抗B型流感病毒抗體。
3.標記抗A型流感病毒抗體之製作
利用50 mM MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate,2-嗎啉乙磺酸一水合物;同仁化學公司)緩衝液(pH值6.0)溶液對抗A型流感病毒抗體中之1種進行透析後,以成為O.D.280 nm=0.5之方式利用相同緩衝液進行稀釋,而製備成溶液10 mL。接著,以液量比成為40:1之方式與10(W/V)%藍色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.45 μm、表面官能基為羧基、官能基密度65 Å2/COOH基,Magsphere公司)加以混合,而進行反應。接著,將1(w/v)%之EDAC(N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride,N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽;Sigma公司)以終濃度成為0.1%之方式添加之後,進行2小時反應。洗淨後,於20 mL最終懸浮液(5 mM Tris、0.04(w/v)%BSA(牛血清白蛋白)、0.4 M海藻糖、0.2(v/v)%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚))中懸浮,置於超音波分散裝置(奧林巴斯公司)中,而使乳膠粒子分散。
4.標記抗B型流感病毒抗體之製作
利用50 mM MES(同仁化學公司)緩衝液(pH值6.0)溶液對抗B型流感病毒抗體中之1種進行透析之後,以成為O.D.280 nm=0.5之方式利用相同緩衝液進行稀釋,而製備成溶液10 mL。接著,以液量比成為40:1之方式與10(w/v)%藍色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.45 μm、表面官能基為羧基、官能基密度65 Å2/COOH基,Magsphere公司)加以混合,而進行反應。接著,將1(w/v)%之EDAC(Sigma公司)以終濃度成為0.1%之方式添加後,進行2小時反應。洗淨後,於20 mL最終懸浮液(5 mM Tris、0.04(w/v)%BSA(牛血清白蛋白)、0.4 M海藻糖、0.2(v/v)%TritonX-100)中懸浮,置於超音波分散裝置(奧林巴斯公司),使乳膠粒子分散。
5.乳膠粒子標記抗體乾燥墊之製作
將上述3.及4.中所獲得之乳膠粒子標記抗A型及B型流感病毒抗體加以混合,使用正壓噴霧裝置(BioJet,BioDot公司),以8 μL/cm之塗佈量向捲成卷盤狀之寬度15 mm之纖維素不織布整面進行噴霧。噴霧後,吹送1分鐘50℃之溫風來進行乾燥,而製作乳膠粒子標記抗體乾燥墊。
6.膜片固相用抗體之製備
將上述1.中所製得之純化抗A型流感病毒抗體中未用於標記之純化抗A型流感病毒抗體透析至固相液(10 mM Tris-HCl(pH值8.0)),透析後進行0.22 μm過濾,以成為O.D.280 nm=3.0之方式,利用固相液進行稀釋,而製得固相用抗A型流感病毒抗體。
將上述2.中所製得之純化抗B型流感病毒抗體中未用於標記之純化抗B型流感病毒抗體透析至固相液(10 mM Tris-HCl(pH值8.0)),透析後進行0.22 μm過濾,以成為O.D.280 nm=3.0之方式,利用固相液進行稀釋,而製得固相用抗B型流感病毒抗體。
7.流感病毒檢測用側流式膜片分析裝置之製作
膜片使用寬度3 cm×長度10 cm之硝化纖維素膜片(孔徑12 μm,WATT MANN公司製造)片材(白色)。於距離膜片長軸側之一端(將該端作為上游端、將相反側作為下游端)6 mm之位置處,使用正壓噴霧裝置(BioJet,BioDot公司),以1 μL/cm之塗佈量線狀地塗佈固相用抗A型流感病毒抗體,並於距離膜片長軸側之一端8 mm之位置處,使用正壓噴霧裝置(BioJet,BioDot公司),以1 μL/cm之塗佈量線狀地塗佈固相用抗B型流感病毒抗體,於距離長軸側之一端13 mm之位置處將抗小鼠IgG抗體稀釋成O.D.280 nm=1.0,使用正壓噴霧裝置(BioJet,BioDot公司),以1 μL/cm之塗佈量線狀地進行塗佈。塗佈後,吹送30分鐘45℃之溫風進行乾燥。
接著,為了固定構件且增加強度,將塑膠製之背襯片(BioDot公司製造)接著於膜片之抗體塗佈面(將該面作為上表面)之相反側(將該面作為下表面)。
接著,將上述5.中所製得之乳膠粒子標記抗體乾燥墊切割成寬度15 mm×長度10 cm,並將其以與膜片之上游端重疊2 mm之方式配置並貼付於膜片之上表面,進而將寬度23 mm×長度10 cm之纖維素濾紙(WATT MANN公司)以與乳膠粒子標記抗體乾燥墊之上表面重疊13 mm之方式配置並貼付於該上表面,而製得樣本滴加墊。
接著,將寬度30 mm×長度10 cm之纖維素濾紙(WATT MANN公司),以與膜片之下游端重疊5 mm之方式,配置並貼付於膜片之上表面,而製得樣本吸收墊。
接著,用透明塑膠層壓板(Adhesive Research公司),將除樣本滴加墊之上游端之寬度5 mm以外的整個上表面被覆。
最後,沿著長軸方向,每隔5 mm進行切割,而製得膜片分析裝置。
8.流感病毒之檢測
使用作為流感病毒抗原套組之QuickNavi(商標)-Flu2(DENKA SEIKEN製造),採取鼻拭子來進行流感病毒感染診斷,將綜合意見下被診斷為A型流感病毒陽性(+)之患者(5名)、被診斷為B型流感病毒陽性(+)之患者(5名)及被診斷為流感病毒陰性(-)之患者(5名)作為對象,使用實施例1之1.中所製得之滴鼻裝置,向對象者之鼻腔噴霧400 μL生理鹽水,使Ex swab 003T(DENKA SEIKEN製造)吸收流出至鼻部入口處之液體以進行採取,將其作為簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體。將採取到檢體之棉棒之棉球部浸漬於0.2 mL檢體懸浮用緩衝液(包含Tween20 0.05(w/v)%及牛血清白蛋白0.1(w/v)%之磷酸緩衝液(pH值7.4))中,搓揉前端附著物並使之提取到檢體懸浮用緩衝液中,將其作為檢體樣本。
檢體樣本中,將7.中所製得之流感病毒檢測用側流式膜片分析裝置之樣本滴加墊側浸漬於檢體樣本之液體中。10分鐘後,觀察分析裝置,將在塗佈有抗小鼠IgG抗體之位置(控制線)處觀察到顯色之情形視為有效,將在塗佈有固相用抗A型流感病毒抗體之位置處觀察到顯色之情形判定為A型流感病毒陽性(+),將在塗佈有固相用抗B型流感病毒抗體之位置處觀察到顯色之情形判定為B型流感病毒陽性(+),且將所有位置處均未觀察到顯色之情形判定為陰性(-)。又,將在控制線之位置處未確認出顯色之情形視為無效。
9.比較研究
將分析結果示於表4中。根據表4之結果,確認到使用利用本發明之檢體之檢查結果與使用QuickNavi-Flu2採取鼻拭子而實施之檢查結果及綜合意見均一致。
[表4]
檢體編號 | 側流式膜片分析裝置 | 綜合意見 | |
QuickNavi-Flu2鼻拭子 | 簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體 | ||
No.1 | - | - | - |
No.2 | A+ | A+ | A+ |
No.3 | - | - | - |
No.4 | B+ | B+ | B+ |
No.5 | A+ | A+ | A+ |
No.6 | B+ | B+ | B+ |
No.7 | A+ | A+ | A+ |
No.8 | A+ | A+ | A+ |
No.9 | - | - | - |
No.10 | B+ | B+ | B+ |
No.11 | - | - | - |
No.12 | B+ | B+ | B+ |
No.13 | A+ | A+ | A+ |
No.14 | B+ | B+ | B+ |
No.15 | - | - | - |
[實施例5]
1.用以比較流感病毒數量之檢體採取
使用作為流感病毒抗原套組之QuickNavi(商標)-Flu2(DENKA SEIKEN製造),採取鼻拭子來進行流感病毒感染診斷,對綜合意見下被診斷為A型流感病毒陽性(+)之1名患者,使用實施例1之1.中所製得之滴鼻裝置,噴霧400 μL生理鹽水,使Ex swab 003T(DENKA SEIKEN製造)吸收流出至鼻部入口處之液體而採取簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體,使其於200 μL之生理鹽水中懸浮,而製得qPCR用樣本。作為對照,將同一患者之QuickNavi-Flu2之鼻拭子之檢查剩餘液作為樣本。
2.利用即時PCR之解析
使用QIAamp Viral RNA迷你套組(核酸提取套組,QIAGEN製造),提取1.之2個樣本之核酸,添加規定之PCR用樣本,利用Applied Biosystems QuantStudio(商標)3(thermos fisher scientific公司製造)之PCR裝置進行測定。
3.比較研究
將測定結果示於表5中。根據表5,獲得了如下結果:簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體之病毒數量相當於1.39×106
copies/mL,另一方面,對照法之鼻拭子檢體之病毒數量相當於1.31×105
copies/mL。相較於作為先前方法之鼻拭子檢體,簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體之病毒數量更多,由此可知,能夠相較於鼻拭子更加穩定地採取病毒,而可利用於臨床檢查。
[表5]
[產業上之可利用性]
檢體編號 | 利用即時PCR法之解析 | |
QuickNavi-Flu2鼻拭子 | 簡易鼻腔黏膜表面附著黏液檢體 | |
No.16 | 1.31×10^5 | 1.39×10^6 |
本發明可利用於檢測呼吸道感染症。
本說明書中所引用之所有發行物、專利及專利申請係直接藉由引用編入至本說明書中。
Claims (16)
- 一種檢測感染症之方法,其使用包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液作為檢體來檢測感染症,該鼻腔黏膜表面附著黏液係向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨所獲得。
- 如請求項1之方法,其中向鼻腔內添加之洗淨液之量為200~800 μL。
- 如請求項1或2之方法,其中向鼻腔內添加洗淨液之方法係噴霧。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中感染症係流感病毒感染症。
- 如請求項1至4中任一項之方法,其係免疫檢測法。
- 如請求項1至4中任一項之方法,其係基因擴增法。
- 一種用以檢測感染症之檢查套組,其使用包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液作為檢體,上述鼻腔黏膜表面附著黏液係向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨所獲得,上述檢查套組包括滴鼻裝置,該滴鼻裝置包含用以檢測感染症之檢查試劑、及用以洗淨鼻腔黏膜之洗淨液。
- 如請求項7之檢查套組,其中滴鼻裝置係一次性使用型之滴鼻裝置,該裝置中含有以1次量計為200~800 μL之供向鼻腔內添加之洗淨液。
- 如請求項7或8之檢查套組,其中向鼻腔內添加洗淨液之方法係噴霧。
- 如請求項7至9中任一項之檢查套組,其中感染症係流感病毒感染症。
- 如請求項7至10中任一項之檢查套組,其係免疫檢查套組。
- 如請求項7至10中任一項之檢查套組,其係基因擴增用檢查套組。
- 一種採取檢體之方法,其係藉由向疑似感染了感染症之受試者之鼻腔內添加洗淨液來對鼻腔黏膜表面進行洗淨,而採取含有包含鼻腔黏膜表面附著黏液之洗淨液的檢體。
- 如請求項13之方法,其中向鼻腔內添加之洗淨液之量為200~800 μL。
- 如請求項13或14之方法,其中向鼻腔內添加洗淨液之方法係噴霧。
- 如請求項13至15中任一項之方法,其中感染症係流感病毒感染症。
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