WO2022014563A1 - 簡易鼻腔粘膜表面付着粘液の採取方法および該検体中の被検出物を検出するための検査キット - Google Patents

簡易鼻腔粘膜表面付着粘液の採取方法および該検体中の被検出物を検出するための検査キット Download PDF

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nasal
sample
cleaning solution
test kit
nasal mucosa
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恭 宮澤
智方 田
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デンカ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
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    • A61B10/0045—Devices for taking samples of body liquids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Definitions

  • the present invention provides a method for collecting as a sample the mucus adhering to the surface of the nasal mucosa obtained by using a nasal drop device, and an analytical method for detecting an object to be detected in the sample obtained by the method. ..
  • the sample species are blood, saliva, stool, biopsy tissue, keratoconjunctival swab, nasal swab, pharyngeal swab, etc.
  • Various specimens such as nasal suction fluid, nasal cavity lavage fluid, and nasal discharge nasal discharge are used.
  • influenza virus in the sample is used by a test kit using the collected sample. Since the presence or absence of an antigen can be quickly and easily determined, a sample is collected on a daily basis during the influenza virus epidemic and used for testing (see Patent Document 1).
  • Nasal swabs are generally collected using a sterilized cotton swab for medical use, but while sampling using a cotton swab is said to be minimally invasive, in order to obtain sufficient samples for testing.
  • a cotton swab should be placed up to the nasopharynx and rubbed hard to collect a sufficient sample from the mucous membrane, sometimes with severe pain and bleeding.
  • nasal suction fluid can only be used in some medical institutions that have a dedicated suction device, and depending on the patient's condition, there may be almost no runny nose, making it difficult to collect a sufficient amount of sample. ..
  • a large amount of liquid is inserted into the nasal cavity with a syringe, and the flowing liquid is collected using a suction device like a paper cup or nasal suction fluid. It feels stuffy, and in some cases, the inserted liquid may flow from the nose to the throat, and it is not easy to collect it.
  • Nose-blowing nasal discharge is only available to patients older than the age at which they can blow their nose, and like nasal aspiration fluid, it may be difficult to collect a sufficient amount of sample depending on the patient's condition.
  • the above-mentioned five sample types of nasal swab, pharyngeal swab, nasal suction, nasal lavage and nasal nasal swab used for testing for influenza virus and their collection methods are generally burdensome to patients. Is by no means light, and depending on the patient's condition, the prescribed amount of sample cannot be obtained, which affects the accuracy of the test, so it is less invasive and a sample that can stably collect a certain amount of sample. A collection method and an inspection kit were required.
  • the five sample species used for the above-mentioned influenza virus test and their collection methods increase the amount of biological components brought in, and are prone to non-specific reactions such as false positives, false negatives, or undecidable due to biological components.
  • the nasal cavity lavage fluid has a problem that the sample is diluted by a large amount of the nasal cavity lavage fluid and the sensitivity is lowered.
  • the mucus adhering to the surface of the nasal mucosa is collected non-invasively and easily by using a nasal drop device, and by using this as a sample, a quick, simple and highly accurate analysis of the detected substance in the sample is performed. It provides a method.
  • the inventors of the present application sprayed a predetermined amount of physiological saline solution into the nasal cavity using a nasal drop device, washed the surface of the nasal mucosa, and collected the attached mucus, which was non-invasive.
  • a measurement system that can easily and stably collect the sample and obtain sufficient sensitivity when detecting a pathogen in the sample using the collected sample as a clinical sample of the sample.
  • the present invention has been completed, which enables the analysis of the detected substance in a sample by simple and non-invasive sample collection.
  • a method for detecting an infectious disease by using a cleaning solution containing mucus adhering to the surface of the nasal mucosa obtained by adding a cleaning solution into the nasal cavity of a subject suspected of having an infectious disease to clean the surface of the nasal mucosa.
  • the method of [1] wherein the amount of the cleaning solution added into the nasal cavity is 200 to 800 ⁇ L.
  • the method of [1] or [2], wherein the method of adding the cleaning solution into the nasal cavity is spraying.
  • a test kit for detecting infectious diseases using a cleaning solution containing mucus adhering to the surface of the nasal mucosa obtained by adding a cleaning solution into the nasal cavity of a subject suspected of having an infectious disease to clean the surface of the nasal mucosa.
  • the nasal drop device is a single-use type nasal drop device, and the test kit according to [7] contains 200 to 800 ⁇ L of a cleaning solution to be added into the nasal cavity as a single dose.
  • the test kit according to [7] or [8], wherein the method of adding the cleaning solution into the nasal cavity is spraying.
  • a nasal swab, a pharyngeal swab, a nasal suction liquid, a nasal lavage liquid and a nasal nasal discharge are used.
  • the infectious disease can be diagnosed with the same or better sensitivity as when the infectious disease is diagnosed by using it as a sample.
  • the present invention is characterized in that a predetermined amount of a washing solution such as a physiological saline solution is sprayed into the nasal cavity with a nasal drop device, and the adhered mucus obtained by washing the surface of the nasal mucosa is collected as a sample.
  • a washing solution such as a physiological saline solution
  • the adhered mucus obtained by washing the surface of the nasal mucosa is collected as a sample.
  • the attached mucus means the mucus attached to the surface of the nasal mucosa.
  • a predetermined amount of cleaning solution is added to a subject who is a patient suspected of having an infectious disease by interview or the like by spraying or dropping a predetermined amount of cleaning solution into the nasal cavity using a nasal drop device previously filled with a cleaning solution.
  • a nasal drop device previously filled with a cleaning solution.
  • the surface of the nasal mucosa is washed with a cleaning solution, and the cleaning solution containing the adhered mucus that has flowed out near the entrance of the nose is collected as a sample.
  • Various tests are carried out using the sample thus obtained.
  • the surface of the nasal mucosa can be washed with the cleaning solution by spraying the cleaning solution into the nasal cavity, and the cleaning solution containing the adhered mucus that has flowed out near the entrance of the nose can be collected as a sample.
  • the cleaning solution is poured into the nasal cavity with a dropper or an instrument with a nozzle, the inside of the nasal cavity will be locally cleaned, making it impossible to collect a wide range of mucus on the surface of the nasal mucosa.
  • the cleaning liquid is poured into the nasal cavity with a dropper or an instrument with a nozzle, the cleaning liquid will pass through the nasal cavity and flow into the throat from the momentum of the pouring liquid, making it impossible to efficiently collect the cleaning liquid.
  • the cleaning solution when the cleaning solution is poured into the nasal cavity with a device equipped with a dropper or nozzle, the force of the cleaning solution being poured locally into the nasal cavity puts a strain on the nasal cavity, causing pain and suffocation in the subject (especially children). I often feel it.
  • the burden on the nasal cavity can be reduced, and the subject (especially a child) is less likely to feel pain or suffocation.
  • the nasal drop device refers to a container filled with a cleaning solution such as a physiological saline solution.
  • a cleaning solution such as a physiological saline solution.
  • the nasal drop device of the present invention can be a commercially available nasal drop container, a spray device, a spray device for medical use, or the like, but is not limited thereto.
  • a physiological saline solution for example, a physiological saline solution can be mentioned.
  • physiological saline solution those commercially available as physiological saline solution of the Japanese Pharmacopoeia or those prepared according to the prescription of the Japanese Pharmacopoeia can be used, but the present invention is not limited to this.
  • an isotonic solution such as Ringer's solution, Lactated Ringer's solution, or glucose solution can be used as the cleaning solution.
  • 200 to 800 ⁇ L, preferably 400 to 700 ⁇ L, more preferably 300 to 500 ⁇ L of a cleaning solution may be sprayed or dropped into the nasal cavity by a nasal drop device.
  • the sampling instrument includes a cotton swab, a swab, a brush, and a device having a mesh tip.
  • the sampling instrument includes a cotton swab, a swab, a brush, and a device having a mesh tip.
  • Sponge-like instruments, cloth-like absorbers, and other instruments that can carry liquids can be used.
  • the liquid containing the adhered mucus may be absorbed by these instruments and collected.
  • the sample collected in this way is referred to as a simple nasal mucosa surface-adhering mucus sample.
  • the sample collected by the collection device may be used as the sample sample, for example, the liquid obtained by dissolving or suspending the sample in the liquid.
  • the sample collected by the sampling instrument is dissolved in the liquid by rubbing, squeezing, or rubbing the part that has absorbed the liquid containing the attached mucus of the sampling instrument, for example, the cotton part at the tip of the cotton swab. Can be suspended.
  • a buffer solution can be used as the liquid for dissolving or suspending the sample.
  • the sample can be directly used as a sample without any treatment such as concentration and culture operation.
  • it may be mixed with a buffer solution to prepare a sample.
  • a buffer solution for example, a phosphate buffer solution can be used, and a surfactant such as Tween 20 or serum albumin may be contained.
  • an assay is performed by an immunochromatography method, which is a lateral flow type immunoassay method using a membrane, a sample collected with a cotton swab is suspended in a buffer solution and used as a sample sample.
  • infectious diseases detected in the present invention are infectious diseases caused by pathogens such as viruses, bacteria, protozoa, fungi, mycoplasma, rickettsia, and chlamydia, and the purpose is particularly to detect infectious diseases caused by viruses.
  • infectious diseases include influenza virus; coronavirus such as SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2; RS virus; adenovirus; human metapneumovirus and the like.
  • the pathogen that causes these infectious diseases may be detected as a substance to be detected.
  • Examples of the method for detecting an object to be detected using the present invention include an immunoassay method (immunological measurement method), a genetic test method, a separation culture / identification method, and the like.
  • the virus in the sample is analyzed using the antibody-antigen reaction. Specifically, it can be analyzed using an antibody specific to the antigen of the virus.
  • Antibodies to viral antigens can be obtained by known methods. Immunoassays include immunostaining (including fluorescent antibody method, enzyme antibody method, heavy metal-labeled antibody method, and radioactive isotope-labeled antibody method), separation and fluorescence by electrophoresis, and detection methods using enzymes, radioactive isotopes, etc.
  • the sandwich method is preferable.
  • the sandwich method itself is well known in the field of immunoassay, and can be performed by, for example, an immunochromatography method or an ELISA method in which immunoassay is performed laterally. All of these sandwich methods themselves are well known, and the method of the present invention can be carried out by a well-known sandwich method.
  • any solid phase in which the antibody can be immobilized can be used as the solid phase in which the antibody can be immobilized by a known technique.
  • a porous thin film (membrane) having a capillary action can be used.
  • Particulate matter, test tube, resin flat plate, etc. can be arbitrarily selected.
  • an enzyme, a radioactive isotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, colored particles, colloidal particles and the like can be used.
  • the immunochromatography method which is a lateral flow type immunoassay method using a membrane, is particularly preferable from the viewpoint of simplicity and speed of clinical examination.
  • the lateral flow immunoassay according to the method of the present invention is a support having a detection region in which an antibody (antibody 1) that captures an object to be measured (antigen) is immobilized, an appropriate label such as colored polystyrene particles or colloidal gold. Labeled area with a mobile labeled antibody (antibody 2) labeled with a substance, a sample pad for dropping a sample, an absorption band for absorbing the developed sample solution, and a backing sheet for bonding these members together. It can be performed using an immunoassay device consisting of.
  • a sample which is a cleaning solution containing mucus adhering to the surface of the nasal mucosa obtained by adding a cleaning solution into the nasal cavity of a subject suspected of having an infectious disease and cleaning the surface of the nasal mucosa is added dropwise to the sample pad.
  • a complex of the immobilized substance-substance to be detected-labeling reagent is formed on the solid phase support, and the signal of the labeling reagent emitted from the complex (in the case of gold colloid, it can bind to the substance to be detected).
  • the substance to be detected can be detected by detecting (the solid-phase support portion on which the substance is immobilized turns red).
  • the immunoassay method can be carried out at 5 to 35 ° C., preferably at room temperature, and the pretreatment with the sample treatment liquid may be carried out within this temperature range.
  • the number of detection regions and the type of labeled antibody contained in the labeled region are not limited to one, and by using an antibody corresponding to a plurality of measurement objects, two or more antigens can be used in the same immunoassay instrument. Can be detected at.
  • the present invention also includes an immunoassay reagent, which is the above-mentioned immunoassay instrument for analyzing an object to be detected in a sample and detecting an infectious disease, and a test kit, which is an immunoassay kit including an immunoassay reagent and a nasal drop device. Include.
  • the number of substances to be detected such as viruses is small, it may be analyzed after culturing and increasing by the isolation culture / identification method.
  • Genetic testing methods include PCR (Polymerase Chain Reaction) method, LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) method, TMA (Transcription Mediated Amplification) method, SDA (Strand Displacement Amplification) method, and ICAN (Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification) method.
  • Examples include gene amplification methods such as the Acids) method.
  • the PCR method can be preferably used.
  • a cleaning solution containing mucus adhering to the surface of the nasal mucosa obtained by adding a cleaning solution to the nasal cavity of a suspected infectious subject to clean the surface of the nasal mucosa is used as a sample, and the gene of the pathogen contained in the sample is amplified. Just do it.
  • the PCR method is a method of in vitro amplification of a gene region surrounded by a primer having a specific sequence by using the Taq DNA polymerase reaction.
  • the gene amplification reaction uses a pair of primers, a forward primer and a reverse primer, by repeating a three-step thermal cycle of a) double-stranded DNA heat denaturation, ii) primer annealing, and iii) extension reaction 30 to 40 times. The way it is done. Both methods are known.
  • the present invention also includes the above-mentioned gene amplification reagent for analyzing an object to be detected in a sample and detecting an infectious disease, and a test kit which is a gene amplification kit including a gene amplification reagent and a nasal drop device.
  • a test kit which is a gene amplification kit including a gene amplification reagent and a nasal drop device.
  • the nasal drip device of the kit contains a cleaning solution to be added into the nasal cavity.
  • the nasal drop device may be a single-use type, and the single-use type nasal drop device contains 200 to 800 ⁇ L, preferably 400 to 700 ⁇ L, and more preferably 300 to 500 ⁇ L of a cleaning solution to be added into the nasal cavity for one dose. I'm out.
  • Example 1 Preparation of nasal drop device A 20 mL capacity nasal drop container (manufactured by Kinpo Seisakusho) was filled with 10 mL of physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) to prepare a nasal drop device. 2. 2. Collection of simple mucus specimens adhering to the surface of the nasal mucosa 200 ⁇ L, 300 ⁇ L, 400 ⁇ L, 500 ⁇ L, 600 ⁇ L, 700 ⁇ L, 800 ⁇ L were sprayed on 3 healthy adult subjects using a nasal drop device, and the liquid that flowed out to the entrance of the nose was exswab 003T.
  • the sample was collected by sucking it into a simple nasal mucosa surface-adhering mucus sample. 3. 3. Sensory test at the time of collection 2. When collecting a simple mucus sample attached to the surface of the nasal mucosa, three healthy adult subjects were evaluated from the three viewpoints of ease of collection at each spray amount, difficulty in breathing, and difficulty in flowing into the throat. 4. Comparative study From the results in Table 1, it was considered that the optimum spray amount was 300 to 500 ⁇ L, although there were individual differences. However, since it is a healthy adult, it may change in children, and it may change depending on race, so it is not limited to this.
  • Example 2 SDS-PAGE analysis of a mucus sample adhering to the surface of a simple nasal mucosa
  • Example 1-2 The mucus sample adhering to the surface of the simple nasal mucosa collected in 1 was suspended in 200 ⁇ L of physiological saline. Part of this is fractionated and the final concentration is 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.5), 10 (w / v)% glycerol, 2.3 (w / v)% SDS, 0.05 (w / v)% BPB (dye). ) was added, heat denaturation treatment was performed at 95 ° C. for 5 minutes, and conventional SDS-PAGE was performed. 2. 2.
  • Example 3 1. SDS-PAGE analysis of nasal aspirate sample and simple nasal mucus surface-adhered mucus sample From 10 nasal aspirate samples, samples were collected using Mentip P1503 (manufactured by Nippon Cotton Swab Co., Ltd.) and floated in 200 ⁇ L of physiological saline. Then, it was used as a sample for SDS-PAGE. In addition, 2. A simple sample of mucus adhering to the surface of the nasal mucosa by spraying 400 ⁇ L of 3 healthy subjects collected in 1 was mixed and used as a sample for SDS-PAGE.
  • Example 4 Preparation of anti-influenza A virus antibody
  • the inactivated influenza A virus was immunized into BALB / c mice, and the spleen was removed from the mice bred for a certain period of time. , P495-497 (1975)) and fused with mouse myeloma cells (P3X63).
  • the obtained fusion cells (hybridoma) were maintained in a 37 ° C. incubator, and the cells were purified (single clone) while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using a plate on which the antigen extracted from Helicobacter pylori was immobilized. (Clone) was performed.
  • the obtained two strains of the cells were intraperitoneally administered to BALB / c mice treated with pristane, respectively, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected.
  • IgG was purified from the obtained ascites by an affinity chromatography method using a protein A column to obtain two types of purified anti-influenza virus antibodies.
  • EDAC N- (3-Dimethlaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma
  • EDAC N- (3-Dimethlaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • the final suspension 5 mM Tris, 0.04 (w / v)% BSA (bovine serum albumin), 0.4 M trehalose, 0.2 (v / v)% TritonX-100
  • the ultrasonic disperser 5 mM Tris, 0.04 (w / v)% TritonX-100 was used. It was subjected to Olympus) to disperse the latex particles.
  • EDAC N- (3-Dimethlaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma
  • EDAC N- (3-Dimethlaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • the final suspension 5 mM Tris, 0.04 (w / v)% BSA (bovine serum albumin), 0.4 M trehalose, 0.2 (v / v)% TritonX-100
  • the ultrasonic disperser 5 mM Tris, 0.04 (w / v)% TritonX-100 was used. It was subjected to Olympus) to disperse the latex particles.
  • Latex Particle Labeled Antibody Drying Pad 3 A cellulose non-woven fabric with a width of 15 mm, which was obtained by mixing the latex particle-labeled anti-A and B influenza virus antibodies obtained in 1 and winding them in a reel shape with a coating amount of 8 ⁇ L / cm using a positive pressure spraying device (BioJet; BioDot). It was sprayed on the entire surface. After spraying, warm air at 50 ° C. was blown for 1 minute to dry, and a latex particle-labeled antibody drying pad was prepared.
  • a positive pressure spraying device BioJet; BioDot
  • An anti-influenza B virus antibody for solid phase was prepared by diluting with a solid phase solution.
  • a nitrocellulose membrane (pore diameter 12 ⁇ m; manufactured by Whatman Co., Ltd.) sheet (white) having a width of 3 cm and a length of 10 cm was used.
  • Anti-influenza A virus antibody for solid phase at a position 6 mm away from one end on the long axis side (this end is the upstream end and the opposite end is the downstream end), and anti-influenza B virus for solid phase at a position 8 mm away.
  • influenza virus Quick Navi (trademark) -Flu2 (manufactured by Denka Seiken), which is an influenza virus antigen kit, is used to collect nasal swabs to diagnose influenza virus infection, and the overall findings are positive for influenza A virus (+). ), Patients diagnosed with influenza B virus positive (+) (5 patients), and patients diagnosed with influenza virus negative (-) (5 patients).
  • In the nasal cavity of Example 1 1. Using the nasal drop device prepared in the above, spray 400 ⁇ L of physiological saline, suck the liquid flowing out to the entrance of the nose with Ex Swab 003T (manufactured by Denka Seiken), and collect it. And said.
  • sample suspension buffer phosphate buffer (pH 7.4) containing Tween20 0.05 (w / v)% and bovine serum albumin 0.1 (w / v)%). After soaking, the deposits on the tip were rubbed out and extracted into a sample suspension buffer solution, which was used as a sample sample. For sample sample 7.
  • sample sample 7 The sample drop pad side of the lateral flow type membrane assay device for detecting influenza whistle prepared in 1 was immersed in the liquid.
  • the assay device After 10 minutes, the assay device was observed, and it was valid when color development was observed at the position (control line) where the anti-mouse IgG antibody was applied, and color development was observed at the position where the anti-influenza A virus virus antibody for solid phase was applied. Influenza A virus positive (+) if it is found, and influenza B virus positive (+) if color development is observed at the position where the anti-B influenza virus antibody for solid phase is applied. When no color development was observed, it was judged to be negative (-). In addition, the case where no color was observed at the position of the control line was invalidated.
  • Example 5 Sample collection for comparison of influenza virus amount A nasal swab was collected using Quick Navi (trademark) -Flu2 (manufactured by Denka Seiken), which is an influenza virus antigen kit, to diagnose influenza virus infection. From one patient diagnosed with influenza virus positive (+), 1. Using the nasal drop device prepared in the above, spray 400 ⁇ L of physiological saline, and let Ex Swab 003T (manufactured by Denka Seiken) inhale the liquid flowing out to the entrance of the nose to collect a simple nasal mucosa surface-adhering mucus sample. was suspended in 200 ⁇ L of physiological saline to prepare a sample for qPCR.
  • Quick Navi trademark
  • Denka Seiken an influenza virus antigen kit
  • the nasal swab test residual fluid of Quick Navi-Flu2 of the same patient was used as a sample.
  • 2. Analysis by Real-time PCR Using the QIAamp Viral RNA Mini Kit (nucleic acid extraction kit, manufactured by QIAGEN) 1. The nucleic acids of the two samples were extracted, a predetermined sample for PCR was added, and the measurement was performed with a PCR device of Applied Biosystems QuantStudio TM 3 (manufactured by thermo fisher scientific). 3. 3. Comparative study The measurement results are shown in Table 5.
  • the viral load of the mucus sample attached to the surface of the simple nasal mucosa was equivalent to 1.39x10 6 copies / mL, while the viral load of the control nasal swab sample was equivalent to 1.31x10 5 copies / mL.
  • the simple nasal mucosa surface-adhered mucus sample had a higher viral load, so it is possible to collect the virus more stably than the nasal swab, and it is used for clinical examinations. It became clear that we could do it.
  • the present invention can be used to detect respiratory infections. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Abstract

本発明は、点鼻デバイスを用いることで非侵襲的に簡便に鼻腔粘膜表面の付着粘液を採取し、これを検体として用いることで、迅速かつ簡便で精度の高い検体中の被検出物の分析方法を提供することを目的とする。　感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄して得られた鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液を検体として用いて、感染症を検出する方法。

Description

簡易鼻腔粘膜表面付着粘液の採取方法および該検体中の被検出物を検出するための検査キット
　本発明は、点鼻デバイスを用いて得られる鼻腔粘膜表面の付着粘液を検体として採取する方法および該方法により得られた検体中の被検出物を検出するための分析方法を提供するものである。
　従来、臨床検査、感染症等の検査を実施するために人体から検体を採取する場合、検体種として、血液、唾液、便、生検組織、角結膜ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻かみ鼻汁液など、様々な検体が利用されている。
　例えば、インフルエンザウイルスを代表とする感染症の検査においては、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、鼻かみ鼻汁液が広く利用され、採取した検体を用いた検査キットにより検体中のインフルエンザウイルス抗原の有無を迅速且つ簡便に判定できるため、インフルエンザウイルスの流行期には日常的に検体が採取され、検査に利用されている(特許文献１を参照）。
　鼻腔ぬぐい液は、医科用の滅菌綿棒を用いた採取が一般的であるが、綿棒を用いた検体採取は低侵襲性であると言われている一方で、検査に十分な検体を得るために鼻咽頭まで綿棒を入れ、且つ粘膜から十分な検体を採取するために強く擦過する必要があり、時に強い痛みと出血を伴うことがある。また、咽頭ぬぐい液の採取においては、口蓋扁桃や咽頭後壁を十分に擦過して検体を採取する必要があり、時に嘔吐反射を起こし、嘔吐とともに十分な量の検体を採取することは困難な場合がある。また、鼻腔吸引液は専用の吸引装置を持つ一部の医療機関でしか利用できず、また、患者の状態によっては鼻水がほとんどなく、十分な量の検体を採取することが困難な場合がある。鼻腔洗浄液はシリンジで液体を多量に鼻腔内部に挿入し、流れ出てくる液体を紙コップや鼻腔吸引液と同様に吸引装置を使って回収するが、多量に液体を鼻腔内に入れることで患者は息苦しく感じ、場合によっては挿入した液体が鼻から喉に流れてしまうことがあり、その採取は容易ではない。鼻かみ鼻汁液は鼻をかむことのできる年齢以上の患者に対してしか利用できず、鼻腔吸引液と同様に患者の状態によっては十分な量の検体を採取することが困難な場合がある。上記の理由より、インフルエンザウイルスの検査に利用される上記の鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液および鼻かみ鼻汁液の5つの検体種およびその採取方法は、総じて患者への負担は決して軽いものではなく、また、患者の状態によっては所定の検体量が得られず、検査の精度への影響があるため、より侵襲性が低く、一定量の検体を安定的に採取できる検体の採取方法、検査キットが求められていた。
　また、上記のインフルエンザウイルスの検査に利用される5つの検体種およびその採取方法は、生体成分の持ち込み量が多くなり、生体成分による偽陽性、偽陰性または判定不可といった非特異反応が起きやすく、特に鼻腔洗浄液は多量の洗浄液により検体が希釈化され感度が低下する問題があった。
国際公開第WO2005/121794号公報
　本発明は、点鼻デバイスを用いることで非侵襲的に簡便に鼻腔粘膜表面の付着粘液を採取し、これを検体として用いることで、迅速かつ簡便で精度の高い検体中の被検出物の分析方法を提供するものである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、点鼻デバイスを用いて所定量の生理食塩水液を鼻腔内に噴霧し、鼻腔粘膜表面を洗って得られる付着粘液を採取することで、非侵襲的に簡便かつ安定的に該検体を採取することができ、該採取物を検体として検体中の病原体を検出するときに十分な感度が得られる測定系を確立することで、該検体の臨床検体としての有用性を見出し、簡便かつ非侵襲的な検体採取による検体中の被検出物の分析が可能となる本発明を完成した。
　本発明の態様は、以下のとおりである。
[１]　感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄して得られた鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液を検体として用いて、感染症を検出する方法。
[２]　鼻腔内に添加する洗浄液の量が２００～８００μＬである、[１]の方法。
[３]　鼻腔内に洗浄液を添加する方法が噴霧である、[１]または[２]の方法。
[４]　感染症がインフルエンザウイルス感染症である、[１]～[３]のいずれかの方法。
[５]　免疫学的検出法である、[１]～[４]のいずれかの方法。
[６]　遺伝子増幅法である、[１]～[４]のいずれかの方法。
[７]　感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄して得られた鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液を検体として用いる感染症を検出するための検査キットであって、感染症を検出するための検査試薬、および鼻腔粘膜を洗浄するための洗浄液を含む点鼻デバイスを含む検査キット。
[８]　点鼻デバイスは１回使い切りタイプの点鼻デバイスであり、該デバイス中に、鼻腔内に添加する洗浄液が１回分として２００～８００μＬ含まれる、[７]の検査キット。
[９]　鼻腔内に洗浄液を添加する方法が噴霧である、[７]または[８]の検査キット。
[１０]　感染症がインフルエンザウイルス感染症である、[７]～[９]のいずれかの検査キット。
[１１]　免疫学的検査キットである、[７]～[１０]のいずれかの検査キット。
[１２]　遺伝子増幅用検査キットである、[７]～[１０]のいずれかの検査キット。
[１３]　感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄することにより、鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液を含む検体を採取する方法。
[１４]　鼻腔内に添加する洗浄液の量が２００～８００μＬである、[１３]の方法。
[１５]　鼻腔内に洗浄液を添加する方法が噴霧である、[１３]または[１４]の方法。
[１６]　感染症がインフルエンザウイルス感染症である、[１３]～[１５]のいずれかの方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-122106号の開示内容を包含する。
　本発明の方法により、鼻腔粘膜表面を洗って得られる付着粘液を含む検体から感染症の診断をおこなう方法を確立することができた。
　本発明の方法で、鼻腔粘膜表面を洗って得られる付着粘液を検体として用いて感染症の診断を行った場合、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液および鼻かみ鼻汁液を検体として用いて感染症の診断を行った場合と同程度か、あるいはよりよい感度で感染症の診断を行うことができる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は点鼻デバイスにより所定量の生理食塩水液等の洗浄液を鼻腔内に噴霧し、鼻腔粘膜表面を洗って得られる付着粘液を検体として採取することを特徴とする。ここで、付着粘液とは鼻腔粘膜表面に付着している粘液をいう。
　例えば、問診等により感染症の疑われる患者である被験体に対し、予め洗浄液を充填した点鼻デバイスを用いて、その鼻腔内に所定量の洗浄液を噴霧または滴下により添加する。噴霧または滴下後、洗浄液により鼻腔粘膜表面を洗って、鼻の入り口付近に流れ出てきた付着粘液を含む洗浄液を検体として回収する。このようにして得られた検体を用いて、各種検査を実施する。
　本発明は鼻腔内に洗浄液を噴霧することにより洗浄液により鼻腔粘膜表面を洗って、鼻の入り口付近に流れ出てきた付着粘液を含む洗浄液を検体として回収することができる。
　鼻腔内にスポイトやノズルのついた器具で洗浄液を流し込むと鼻腔内を局所的に洗浄するので、広い範囲の鼻腔粘膜表面粘液を採取できなくなる。
　それに対し、鼻腔内に洗浄液を噴霧することにより、広い範囲の鼻腔粘膜表面粘液を採取することができる。
　また、鼻腔内にスポイトやノズルのついた器具で洗浄液を流し込むと、洗浄液が流し込まれる勢いから鼻腔を通過して喉へ流れ、洗浄液を効率よく回収できなくなる。
　それに対し、鼻腔内に洗浄液を噴霧することにより、洗浄液が鼻腔を通過して喉へ流れることを防ぐことができ、洗浄液を効率よく回収できる。
　また、鼻腔内にスポイトやノズルのついた器具で洗浄液を流し込むと、鼻腔内を局所的に洗浄液が流し込まれる勢いから、鼻腔内に負担がかかり、被験者（特に小児）が痛みや息苦しさ等を感じることが多い。
　それに対し、鼻腔内に洗浄液を噴霧することにより、鼻腔内の負担が軽減でき、被験者（特に小児）が痛みや息苦しさ等を感じにくくなる。
　本発明において、点鼻デバイスは生理食塩水液等の洗浄液を充填した容器をいう。本発明の点鼻デバイスは点鼻容器として市販されているものや噴霧装置、医科用の噴霧デバイス等を利用できるがこれに限定されない。
　また、洗浄液として例えば生理食塩水液が挙げられる。生理食塩水も日本薬局方の生理食塩水で市販されているものや日本薬局方の処方により調製したもの等が利用できるがこれに限定されない。また、洗浄液としてリンゲル液、乳酸リンゲル液、ブドウ糖液等の等張液を用いることもできる。
　鼻腔内の洗浄は、２００～８００μＬ、好ましくは４００～７００μＬ、さらに好ましくは３００～５００μＬの洗浄液を点鼻デバイスにより鼻腔内に噴霧または滴下すればよい。
　鼻の入り口付近に流れ出てきた付着粘液を含む液体を検体として回収する方法には、種々の採取器具により採取する方法が挙げられ、採取器具として、綿棒、スワブ、ブラシ、先端が網目状の器具、スポンジ状の器具、布状等の吸収体など、液体を担持することができる器具を利用することができる。付着粘液を含む液体をこれらの器具に吸収させて採取すればよい。
　本発明においては、このようにして採取した検体を簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体と呼ぶ。
　採取器具で採取した検体を、例えば、液体中に溶解または懸濁させて得られた液体を検体試料とすればよい。採取器具で採取した検体は、採取器具の付着粘液を含む液体を吸収した部分、例えば綿棒の先端の綿部を液体中に揉みだしたり、しごいたり、こすったりすることにより液体中に溶解または懸濁させることができる。検体を溶解または懸濁させる液体として、緩衝液を用いることができる。
　本発明においては、検体を濃縮、培養操作等の処理をせずに直接試料として用いることができる。また、緩衝液と混合し試料としてもよい。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液を用いることができ、Tween20等の界面活性剤や血清アルブミンを含んでいてもよい。例えば、メンブレンを用いたラテラルフロー式の免疫測定法であるイムノクロマト法でアッセイを行う場合、綿棒で採取された検体を緩衝液に浮遊し検体試料として用いる。
　本発明において検出する感染症は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア等の病原体による感染症であり、この中でも特にウイルスによる感染症の検出を目的とする。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス；SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2などのコロナウイルス；RSウイルス；アデノウイルス；ヒトメタニューモウイルス等が挙げられる。これらの感染症の原因となる病原体を被検出物として検出すればよい。
　本発明を用いた被検出物の検出方法としては、免疫測定法（免疫学的測定法）、遺伝子検査法、分離培養・同定法等が挙げられる。
　免疫測定法においては、検体中のウイルスを抗体抗原反応を利用して分析する。具体的には、ウイルスの抗原に特異的な抗体を用いて分析することができる。ウイルスの抗原に対する抗体は公知の方法により得ることができる。免疫測定法としては、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素などによる検出方法とを組み合わせた方法（ウエスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（LA：Latex　Agglutination-Turbidimetric　Immunoassay）、イムノクロマト法など、当業者にとって周知のいずれの方法も用いることができる。なお、本発明において、「分析」には、定量、半定量、検出のいずれもが包含される。
　上記の免疫測定法の中でも、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばラテラルフロー式に免疫測定を行うイムノクロマト法やELISA法により行うことができる。これらのサンドイッチ法自体はいずれも周知であり、本発明の方法は周知のサンドイッチ法により行うことができる。
　サンドイッチ法を検出原理とする免疫測定において、抗体が固定化される固相としては、抗体を公知技術により固定可能なものは全て用いることができ、例えば、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）、粒子状物質、試験管、樹脂平板など公知のものを任意に選択できる。また、抗体を標識する物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色粒子、コロイド粒子などを用いることができる。また、２種類以上の抗体を用いてもよい。２種類以上の抗体は、サンドイッチ法に用いられ、互いに異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。
　前述の種々の材料による免疫測定法の中でも、特に臨床検査の簡便性と迅速性の観点から、メンブレンを用いたラテラルフロー式の免疫測定法であるイムノクロマト法が好ましい。
　本発明の方法によるラテラルフロー式免疫測定法は、測定対象物（抗原）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の適当な標識物質で標識した移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を滴加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートから成る免疫測定器具を用いて行うことができる。該方法においては、感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄して得られた鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液である検体をサンプルパッドに滴加し、抗体１を固定化した固相支持体に毛管現象を利用して、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の適当な標識物質で標識した被検出物質（標識試薬）と結合し得る抗体２と被検出物質の複合体を展開移動させる。この結果、固定化した物質-被検出物質-標識試薬の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナル（金コロイドの場合は、被検出物質と結合し得る物質を固定化した固相支持体部分が赤くなる）を検出することにより、被検出物質を検出することができる。該免疫測定方法は、５～３５℃、好ましくは室温で行うことができ、検体処理液による前処理を実施する場合もこの温度範囲内で行えばよい。
　なお、検出領域の数および標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１に限られるものではなく、複数の測定対象物に対応する抗体を用いることで、２以上の抗原を同一の免疫測定器具にて検出することができる。
　本発明は、検体中の被検出物を分析し、感染症を検出するための上記の免疫測定器具である免疫測定試薬、および免疫測定試薬と点鼻デバイスを含む免疫測定キットである検査キットも包含する。
　ウイルス等の被検出物の数が少ない場合は、分離培養・同定法により培養して増やしてから分析してもよい。
　遺伝子検査法としては、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、LAMP（Loop Mediated Isothermal Amplification)法、TMA（Transcription Mediated Amplification)法、SDA (Strand Displacement Amplification)法、ICAN(Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)法等の遺伝子増幅法が挙げられる。この中でもPCR法を好適に用いることができる。感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄して得られた鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液を検体とし、該検体中に含まれる病原体の遺伝子を増幅すればよい。PCR法は、Taq DNA polymerase反応を利用して特定の配列を有するプライマーで囲まれた遺伝子領域をin vitro で増幅させる方法である。遺伝子増幅反応はフォワードプライマーとリバースプライマーの１対プライマーを用い、a)　二本鎖DNAの熱変性、ii)　プライマーのアニーリング、iii)　伸長反応の３ステップの熱サイクルを30～40回繰り返すことによって行われる方法である。いずれの方法も公知である。
　本発明は、検体中の被検出物を分析し、感染症を検出するための上記の遺伝子増幅用試薬、および遺伝子増幅用試薬と点鼻デバイスを含む遺伝子増幅用キットである検査キットも包含する。該キットの点鼻デバイスは、鼻腔内に添加する洗浄液を含んでいる。該点鼻デバイスは使い切りタイプであってもよく、１回使い切りタイプの点鼻デバイスは、１回分の鼻腔内に添加する洗浄液２００～８００μＬ、好ましくは４００～７００μＬ、さらに好ましくは３００～５００μＬを含んでいる。
　以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は実施例だけに限定されるものではない。
[実施例１]
１．点鼻デバイスの作製
　20mL容量の点鼻容器（金鵄製作所製）に生理食塩液（大塚製薬製）を10mL充填し、点鼻デバイスとした。
２．簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体の採取
　成人健常者3名に点鼻デバイスを用いて、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL噴霧し、鼻の入り口に流れ出てきた液体をExスワブ003Tに吸わせて採取し、これを簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体とした。
３．採取時の官能試験
　２．で簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体を採取する際に成人健常者3名に各噴霧量での採取のしやすさ、息苦しさ、喉への流れにくさの3つの観点で評価を行った。
４．比較検討
　表１の結果より、個人差はあるものの、噴霧量300～500μLが最適な噴霧量と考えられた。ただし、成人健常者であるため、小児では変わる可能性があり、また、人種によっても変わる可能性があるため、これに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
[実施例２]
１．簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体のSDS-PAGE解析
　実施例１の２．で採取した簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体を200μLの生理食塩水に浮遊した。この一部を分取し、終濃度が62.5mM Tris-HCl（pH6.5）、10(w/v)%グリセロール、2.3(w/v)%SDS、0.05(w/v)%BPB（色素）となるように各試薬を添加し、95℃で5分間加熱変性処理を行い、定法のSDS-PAGEを行った。
２．デンシトメトリー分析装置による総タンパク量解析
　デンシトメトリー分析装置（バイオ・ラッド社製）を用いて、上記１．のSDS-PAGEのCBB染色済みのゲルを解析し、各レーン毎に全てのバンドのDensityを測定し、総Densityの値をDensity Scoreとする。
３．比較検討
　Density Scoreの測定結果を表２に示した。表２の結果より、個人差はあるものの、噴霧量400～700μLで採取した簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体中のタンパク量が多いことが明らかになった。ただし、成人健常者であり、有症状者や小児では変わる可能性があり、また、人種によっても変わる可能性があるため、これに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
[実施例３]
１．鼻腔吸引液検体と簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体のSDS-PAGE解析
　鼻腔吸引液検体10検体より、メンティップP1503（日本綿棒株式会社製）を用いて検体を採取し、200μLの生理食塩水に浮遊し、SDS-PAGE用のサンプルとした。また、実施例１の２．で採取した健常者3名の400μL噴霧による簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体を混合し、SDS-PAGE用のサンプルとした。各サンプルを分取し、終濃度が62.5mM Tris-HCl（pH6.5）、10(w/v)%グリセロール、2.3(w/v)%SDS、0.05(w/v)%BPB（色素）となるように各試薬を添加し、95℃で5分間加熱変性処理を行い、定法のSDS-PAGEを行った。
２．デンシトメトリー分析装置による総タンパク量解析
　デンシトメトリー分析装置（バイオ・ラッド社製）を用いて、上記１．のSDS-PAGEのCBB染色済みのゲルを解析し、各レーン毎の全てのバンドの総Density(Density Score)を測定した。
３．比較検討
　Density Scoreの測定結果を表３に示した。表３の結果より、検体毎に差はあるものの、それぞれ混合した条件での比較では、鼻腔吸引液検体と簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体で採取できるタンパク量には大きな差はなかった。このことから、本発明の簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体を用いてインフルエンザウイルスの検査を行うことは可能であると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
[実施例４]
１．抗A型インフルエンザウイルス抗体の作製
　不活化したA型インフルエンザウイルスをBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（P3X63）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、37℃インキュベーター中で維持し、ヘリコバクター・ピロリから抽出した抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。
　得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれIgGを精製し、２種類の精製抗A型インフルエンザウイルス抗体を得た。
２．抗B型インフルエンザウイルス抗体の作製
　不活化したB型インフルエンザウイルスをBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（P3X63）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、37℃インキュベーター中で維持し、ヘリコバクター・ピロリから抽出した抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。
　得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれIgGを精製し、２種類の精製抗B型インフルエンザウイルス抗体を得た。
３．標識抗A型インフルエンザウイルス抗体の作製
　抗A型インフルエンザウイルス抗体のうち１種類を50mM MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate；同仁化学社）緩衝液（pH6.0）溶液で透析後、O.D.280nm=0.5になるように同じ緩衝液で希釈した溶液を10mL調製した。次に10(W/V)％青色ポリスチレンラテックス粒子（粒径0.45μm、表面官能基はカルボキシル基、官能基密度65Å2/COOH基；Magsphere社）と液量比40：１になるように混合し、反応させた。次に、１(w/v)％のEDAC（N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride；Sigma社）を最終濃度0.1％になるように添加した後、２時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液（5mM Tris,0.04(w/v)% BSA（ウシ血清アルブミン）,0.4Mトレハロース,0.2(v/v)% TritonX-100）20mL中に浮遊し、超音波分散装置（オリンパス社）にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
４．標識抗B型インフルエンザウイルス抗体の作製
　抗B型インフルエンザウイルス抗体のうち１種類を50mM MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate；同仁化学社）緩衝液（pH6.0）溶液で透析後、O.D.280nm=0.5になるように同じ緩衝液で希釈した溶液を10mL調製した。次に10(w/v)％青色ポリスチレンラテックス粒子（粒径0.45μm、表面官能基はカルボキシル基、官能基密度65Å2/COOH基；Magsphere社）と液量比40：１になるように混合し、反応させた。次に、１(w/v)％のEDAC（N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride；Sigma社）を最終濃度0.1％になるように添加した後、２時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液（5mM Tris,0.04(w/v)% BSA（ウシ血清アルブミン）,0.4Mトレハロース,0.2(v/v)% TritonX-100）20mL中に浮遊し、超音波分散装置（オリンパス社）にかけ、ラテックス粒子を分散させた。
５．ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの作製
　上記３．および４．で得られたラテックス粒子標識抗A型およびB型インフルエンザウイルス抗体を混合し、陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社）を用いて８μL/cmの塗布量でリール状に巻いた幅15mmのセルロース不織布全面に噴霧した。噴霧後、50℃の温風を１分間吹きつけて乾燥させ、ラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを作製した。
６．メンブレン固相用抗体の調製
　上記１．で作製した精製抗A型インフルエンザウイルス抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液（10mM Tris-HCl(pH8.0)）に透析し、透析後に0.22μmろ過を行い、O.D.280nm=3.0になるように固相液で希釈して固相用抗A型インフルエンザウイルス抗体を調製した。
　上記２．で作製した精製抗B型インフルエンザウイルス抗体のうち標識に用いなかった方を、固相液（10mM Tris-HCl(pH8.0)）に透析し、透析後に0.22μmろ過を行い、O.D.280nm=3.0になるように固相液で希釈して固相用抗B型インフルエンザウイルス抗体を調製した。
７．インフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置の作製
　メンブレンは、幅３cm×長さ10cmのニトロセルロースメンブレン（孔径12μm；ワットマン社製）シート（白色）を用いた。その長軸側の一端（この端を上流端、反対側を下流端とする）から６mm離れた位置に固相用抗A型インフルエンザウイルス抗体、８mm離れた位置に固相用抗B型インフルエンザウイルス抗体をそれぞれ1μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布し、長軸側の一端から13mm離れた位置に抗マウスIgG抗体をO.D.280nm=1.0に希釈し、１μL/cmの塗布量で陽圧噴霧装置（BioJet;BioDot社）を用いて線状に塗布した。塗布後、45℃の温風を30分間吹き付けて乾燥した。
　次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、メンブレンの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（BioDot社製）を接着した。
　次に、上記５．で作製したラテックス粒子標識抗体乾燥パッドを幅15mm×長さ10cmに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が２mm重なる様に配置して貼り付け、さらに幅23mm×長さ10cmのセルロースろ紙（ワットマン社）をラテックス粒子標識抗体乾燥パッドの上面に13mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴加パッドとした。
　次に、幅30mm×長さ10cmのセルロースろ紙（ワットマン社）をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と５mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッドとした。
　次にサンプル滴下パッドの上流端の幅５mmを除いて、上面全面を透明プラスチックラミネート（Adhesive　Research社）で被覆した。
　最後に長軸方向に沿って、５mmずつ切断し、メンブレンアッセイ装置を作製した。
８．インフルエンザウイルスの検出
　インフルエンザウイルス抗原キットであるクイックナビ（商標）-Flu2（デンカ生研製）を用いて鼻腔ぬぐい液を採取してインフルエンザウイルス感染診断を行い、総合所見にてA型インフルエンザウイルス陽性（＋）と診断された患者（5名）、B型インフルエンザウイルス陽性（＋）と診断された患者（5名）およびインフルエンザウイルス陰性（－）と診断された患者（5名）を対象として、対象者の鼻腔に実施例１の１．で作製した点鼻デバイスを用いて生理食塩水を400μL噴霧し、鼻の入り口に流れ出てきた液体をExスワブ003T（デンカ生研製）に吸わせて採取し、これを簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体とした。　検体を採取した綿棒の綿球を検体浮遊用緩衝液（Tween20 0.05(w/v)％およびウシ血清アルブミン0.1(w/v)％を含むリン酸緩衝液(pH7.4)）0.2ｍＬ中に浸けて、先端付着物を揉みだして検体浮遊用緩衝液中に抽出してこれを検体試料とした。
　検体試料に７．で作製したインフルエンザウイス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴加パッド側を液に浸した。10分後、アッセイ装置を観察し、抗マウスIgG抗体を塗布した位置（コントロールライン）に発色が認められた場合を有効とし、固相用抗A型インフルエンザウイルス抗体を塗布した位置に発色が認められた場合にはA型インフルエンザウイルス陽性（＋）、固相用抗B型インフルエンザウイルス抗体を塗布した位置に発色が認められた場合にはB型インフルエンザウイルス陽性（＋）、いずれの位置にも発色が認められない場合は陰性（－）と判定した。またコントロールラインの位置に発色が認められない場合を無効とした。
９．比較検討
　アッセイ結果を表４に示した。表４の結果より、クイックナビ-Flu2を用いて鼻腔ぬぐい液を採取して実施した検査結果および総合所見と比較し、本発明による検体を用いた検査結果は全て一致することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
[実施例５]
１．インフルエンザウイルス量の比較のための検体採取
　インフルエンザウイルス抗原キットであるクイックナビ（商標）-Flu2（デンカ生研製）を用いて鼻腔ぬぐい液を採取してインフルエンザウイルス感染診断を行い、総合所見にてA型インフルエンザウイルス陽性（＋）と診断された患者1名より、実施例１の１．で作製した点鼻デバイスを用いて生理食塩水を400μL噴霧し、鼻の入り口に流れ出てきた液体をExスワブ003T（デンカ生研製）に吸わせて簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体を採取し、これを200μLの生理食塩水に浮遊し、qPCR用サンプルとした。対照として、同一患者のクイックナビ-Flu2の鼻腔ぬぐい液検査残液をサンプルとした。
２．Real-time PCRによる解析
　QIAamp Viral RNA Mini Kit(核酸抽出キット、QIAGEN製)を用いて１．の２つのサンプルの核酸を抽出し、所定のPCR用試料を添加しApplied Biosystems QuantStudio（商標） 3（thermo fisher scientific社製）のPCR装置で測定した。
３．比較検討
　測定結果を表５に示した。表５より、簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体のウイルス量が1.39x106copies/mL相当、一方、対照法の鼻腔ぬぐい液検体のウイルス量が1.31x105 copies/mL相当という結果が得られた。従来法である鼻腔ぬぐい液検体と比較し、簡易鼻腔粘膜表面付着粘液検体の方がウイルス量が多かったことから、鼻腔ぬぐい液よりも安定的にウイルスの採取が可能であり、臨床検査に利用できることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明は、呼吸器感染症の検出に利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄して得られた鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液を検体として用いて、感染症を検出する方法。
  2. 　鼻腔内に添加する洗浄液の量が２００～８００μＬである、請求項１に記載の方法。
  3. 　鼻腔内に洗浄液を添加する方法が噴霧である、請求項１または２の方法。
  4. 　感染症がインフルエンザウイルス感染症である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　免疫学的検出法である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　遺伝子増幅法である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄して得られた鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液を検体として用いる感染症を検出するための検査キットであって、感染症を検出するための検査試薬、および鼻腔粘膜を洗浄するための洗浄液を含む点鼻デバイスを含む検査キット。
  8. 　点鼻デバイスは１回使い切りタイプの点鼻デバイスであり、該デバイス中に、鼻腔内に添加する洗浄液が１回分として２００～８００μＬ含まれる、請求項７記載の検査キット。
  9. 　鼻腔内に洗浄液を添加する方法が噴霧である、請求項７または８に記載の検査キット。
  10. 　感染症がインフルエンザウイルス感染症である、請求項７～９のいずれか１項に記載の検査キット。
  11. 　免疫学的検査キットである、請求項７～１０のいずれか１項に記載の検査キット。
  12. 　遺伝子増幅用検査キットである、請求項７～１０のいずれか１項に記載の検査キット。
  13. 　感染症の疑われる被験体の鼻腔内に洗浄液を添加して鼻腔粘膜表面を洗浄することにより、鼻腔粘膜表面付着粘液を含む洗浄液を含む検体を採取する方法。
  14. 　鼻腔内に添加する洗浄液の量が２００～８００μＬである、請求項１３に記載の方法。
  15. 　鼻腔内に洗浄液を添加する方法が噴霧である、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 　感染症がインフルエンザウイルス感染症である、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
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