TW202204420A - Ｋｒａｓ特異性抗體及其用途 - Google Patents

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約翰 杰拉德 奎恩
麥克 史戴夫克
煒如 王
約翰 勃朗寧
克里斯多福 威廉森 戴維斯
瑪麗 伊凡杰利斯塔
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Abstract

本文提供的是抗 KRas 抗體及使用彼之方法，該等抗 KRas 抗體與突變 KRas-GDP 及烷基化突變 KRas-GDP 結合。本文亦提供的是篩選 KRas 抑制劑之方法及測量 KRas 與如本文中所述之抗體的結合之方法。

Description

KRAS　特異性抗體及其用途
本發明涉及 KRas 特異性抗體及其使用方法。
KRAS 是癌症中最常見的突變致癌基因中之一者 (Kranenburg, O., Biochim.Biophys. Acta 2005 1756)。KRAS 編碼鳥苷三磷酸酶 (GTP 酶) 之 Ras 家族中之一者，其用於將信號從細胞表面受體傳送至細胞內效應物途徑 (Pylayeva-Gupta, Y. 等人 Nat Rev Cancer 2011 11)。Ras GTP 酶於活性鳥苷 5´-三磷酸 (GTP) 結合態與無活性鳥苷 5'-二磷酸 (GDP) 結合態之間循環。在癌症中，KRas 中之致癌突變 (包括 KRASG12C 驅動之腫瘤) 損害其 GTP 酶活性並導致 GTP 結合的活化形式之 KRas 的累積。因此，KRas 下游之途徑經組成性活化，導致促進增殖及細胞凋亡之抑制 (Pylayeva-Gupta, Y. 等人 Nat Rev Cancer 2011 11)。
儘管其在癌症中長期以來普遍存在，但多年來 KRas 不被視爲可藥物治療之標靶 (McCormick, F. Clin Cancer Res 2015 21:8)。除 KRASG12C 以外，還存在與癌症相關的其他 KRAS 對偶基因 (Haigis, KM, Trends Cancer 2017 3:10)。因此，在本領域中需要以比與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP) 更高的親和力特異性結合與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP) 之 KRas 特異性抗體。
在一個方面，本發明提供了一種與人 KRas 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體以比與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP) 更高的親和力特異性結合與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是 KRas 烷基化構形特異性抗體。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段打開並穩定 SWII 袋。
在一些實施例中，人 KRas 為選自由下列所組成之群組的 KRas 突變型：KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasQ61H 、KRasG12D 及 KRasG13D 。
在一些實施例中，人 KRas 為選自由下列所組成之群組的 KRas 突變型：KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12D 及 KRasG13D 。
在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12C 。
在一些實施例中，KRasG12C -GDP 用 KRasG12C 特異性共價抑制劑烷基化。
在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是烷基化構形特異性 KRas 抗體，其結合至用 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446 或 JNJ-74699157 烷基化之 KRasG12C -GDP。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段穩定 KRas 突變蛋白之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:12)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體包含 (a)  輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:1)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:2)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 LQDHDYPLT (SEQ ID NO:3)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:4)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:5)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GFYVRNWFDP (SEQ ID NO:6)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGISSYLA (SEQ ID NO:17)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:18)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQYYSYPFT (SEQ ID NO:19)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAMS (SEQ ID NO:20)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 AISSSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO:21)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 DQGGYGYPGESWFDY (SEQ ID NO:22)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQSISSYLN (SEQ ID NO:25)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:26)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQSYSPPWT (SEQ ID NO:27)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:28)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:29)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 AFYSYMDV (SEQ ID NO:30)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:33)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 LGSNRAS (SEQ ID NO:34)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 MQALQTPLT (SEQ ID NO:35)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:36)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:37)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 ERTILTGYYGFDY (SEQ ID NO:38)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:41)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:42)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGYV (SEQ ID NO:43)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:44)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:45)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:46)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:81)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:82)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDDSLSGWV (SEQ ID NO:83)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:84)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:85)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SFGPYAFDV (SEQ ID NO:86)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:87 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:88 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:49)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:50)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGWV (SEQ ID NO:51)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:52)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:53)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:54)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:57)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:58)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSSGNHWV (SEQ ID NO:59)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:60)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:61)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 TNNYGYRYFDY (SEQ ID NO:62)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:65)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:66)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSTDNHLWV (SEQ ID NO:67)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:68)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:69)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 ATSSGYYYFDY (SEQ ID NO:70)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:71 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:72 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含 (a)   輕鏈可變區，其包含： (i)     CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:73)； (ii)   CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:74)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDNSLSVWV (SEQ ID NO:75)；及 (b)  重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:76)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:77)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GKGIVGWGFFGMDV (SEQ ID NO:78)。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:79 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:80 之胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供了與人 KRas-GDP 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中分離抗體或其抗原結合片段結合至人 KRas 之胺基酸 W99、K5、L6、V7、S39、D54、L54、Y71、T74 及/或 G75。
在另一方面，本發明提供了編碼本文所提供之抗體或抗原結合片段之 KRas 抗體輕鏈可變域及重鏈可變域的分離核酸。在另一方面，本發明提供了包含核酸的載體。在另一方面，本發明提供了包含載體的宿主細胞。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是與可偵測標記共軛。
在一些實施例中，本發明提供了一種製備與 KRas-GDP 結合之抗體或其片段的方法，該方法包括在適於表現編碼抗體的載體的條件下培養該段落之宿主細胞，及回收抗體。
在另一方面，本發明提供了一種篩選以比與 KRasG12C -GTP 更高的親和力來與 KRasG12C -GDP 結合的抗體之方法，其包含 (a) 用下列者接觸抗體庫： i) KRasG12C -GDP， ii) 帶有 KRasG12C 特異性共價抑制劑之烷基化 KRasG12C -GDP，及 iii) 與非可水解之 GTP 類似物結合之　KRasG12C ，及 (b) 選擇以比與該非可水解之 GTP 類似物結合之 KRasG12C 更高的親和力來與烷基化 KRasG12C -GDP 和未烷基化 KRasG12C -GDP 結合之抗體。
在一些實施例中，該文庫是合成噬菌體庫。
在另一方面，本發明提供了一種偵測生物樣品中之 KRas-GDP 的方法，該方法包括使生物樣品與本文提供之 KRas 抗體或抗原結合片段接觸。
在一些實施例中，該方法進一步包括使生物樣品與結合至 KRas-GTP 的抗體接觸，其中 KRas-GDP 的量及 KRas-GTP 的量是經判定的。
在另一方面，本發明提供了一種套組，該套組包含與可偵測標記共軛之如段落 [0006]-[0037] 中任一項之 KRas 抗體或其抗原結合片段，以及偵測該抗體或其抗原結合片段之説明書。
在另一方面，本發明提供了一種獲得 KRas 突變型之抑制劑的方法，該方法包括使抗 KRas 抗體或其抗原結合片段與 KRas 突變型接觸，篩選化合物，及鑑定結合至與抗體或其抗原結合片段結合之 KRas 突變型的化合物。
在一些實施例中，化合物包含在 SWII 袋處共價修飾 KRas 的分子。
在一些實施例中，化合物包含共價抑制劑，該共價抑制劑在 SWII 袋中之至少一個殘基烷基化。
在一些實施例中，化合物包含在 SWII 袋處非共價修飾 KRas 的分子。
在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12D 、KRasG13D 、KRasG12R 或 KRasQ61H 。
在一個方面，本發明提供了一種偵測 KRas 之烷基化的方法，該方法包括使生物樣品與抗 KRas 抗體或抗原結合片段接觸，及偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，偵測包括 KRasG12C 之偵測。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是 KRas 烷基化構形特異性抗體。
在另一方面，本發明提供了一種偵測哺乳動物中 KRas 之烷基化的方法，該方法包括向哺乳動物投予抗 KRas 抗體或其抗原結合片段，及偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。
在另一方面，本發明提供了一種偵測經 KRas 抑制劑治療之患者中 KRas 之烷基化的方法，該方法包括： (a) 從該患者獲得樣品； (b) 使樣品與抗 KRas 抗體接觸； (c) 測量由抗體或其抗原結合片段結合的 KRas 之量。
在一些實施例中，KRas 抑制劑是 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446 或 JNJ-74699157。
在一些實施例中，由抗體或其抗原結合片段結合之 KRas 的含量判定投予患者之 KRas 抑制劑的劑量。
在一些實施例中，偵測包括 KRasG12C 之偵測。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是 KRas 烷基化構形特異性抗體。
在一些實施例中，哺乳動物是人。
在一個方面，本發明提供了一種偵測經 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療之受試者中 KRasG12C 之烷基化的方法，該方法包括： (a) 經 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療後，向受試者投予抗 KRas 抗體或抗原結合片段；及 (b) 偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-1952、ARS-853、ARS-1620、MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446 或 JNJ-74699157。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是 KRas 烷基化構形特異性抗體。
在一個方面，本發明提供了一種治療 KRasG12C 媒介之癌症的方法，該方法包括向患有此等癌症之患者投予抗 KRas 抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，KRasG12C 媒介之癌症是 NSCLC、大腸癌或胰臟癌。
在另一方面，本發明提供了一種結晶伴護蛋白，該結晶伴護蛋白包含抗 KRas 抗體或其抗原結合片段。
在另一方面，本發明提供了一種使 KRas 結晶的方法，其中 KRas 視情況與 KRas 抑制劑結合，該方法包括使抗 KRas 抗體或其抗原結合片段與 KRas 接觸及解析複合物之晶體結構。
在一些實施例中，KRas 是 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 。
在另一方面，本發明提供了一種測量化合物與 KRas 的結合之生物感測表面，其中： (i) 生物感測表面包含水凝膠，其中 KRas 蛋白質及抗 KRas 抗體或抗原結合片段共定位於該水凝膠中； (ii) KRas 和抗體或其抗原結合片段在水凝膠內具有足夠的自由度，以相互嚙合形成親和複合物； (iii) KRas 和抗體或其抗原結合片段之局部濃度超過解離親和力常數至少 10 倍，其中局部濃度促進親和複合物的形成； (iv) 未結合的 KRas 蛋白和抗 KRas 抗體的比例小於約 50%； (v) 將 KRas 抑制劑化合物注射在生物感測表面上至少 5 秒；以及 (vi) 其中 KRas 抑制劑化合物與抗 KRas 抗體的結合是在至少一個感測通道上測量的。
在一些實施例中，水凝膠之厚度是約 10 nm-500 nm、10 nm-300 nm、10 nm-250 nm 或約 10 nm-200 nm。
在一些實施例中，本發明提供了一種測量化合物與 KRas 的結合之生物感測表面，其中 KRas 經生物素化。
在一些實施例中，本發明提供了一種測量化合物與 KRas 的結合之生物感測表面，其中生物感測表面接附於 BIACORE 感測器晶片。
在另一方面，本發明提供了一種針對抗 KRas 抑制劑活性篩選化合物之方法，該方法包括測量化合物與 KRas 之結合，其中 KRas 與抗 KRas 抗體結合，且其中結合使用生物感測表面測得。
在另一方面，本發明提供了一種測量 KRas 突變蛋白與本文所述之抗 KRas 抗體之結合的方法，其中該方法包括： (i) 使生物感測表面與 KRas 接觸，以形成 KRas 結合之生物感測表面； (ii) 使 KRas 結合之生物感測表面與抗 KRas 抗體或其抗原結合片段接觸，其中抗體或其抗原結合片段相比於 KRas 蛋白質莫耳過剩；及 (iii) 使用表面電漿子共振來偵測抗體或其抗原結合片段與 KRas 的結合及親和力。
在另一方面，本發明提供了一種測量 KRas 突變蛋白與本文所述之抗 KRas 抗體之結合的方法，其中該方法包括： (i) 使生物感測表面與抗 KRas 抗體或其抗原結合片段接觸，以形成抗 KRas 抗體結合之生物感測表面； (ii) 將抗 KRas 抗體結合的生物感測表面與 KRas 接觸，其中抗體或其抗原結合片段與 KRas 蛋白相比是莫耳過剩的；以及 (iii) 使用表面電漿子共振來偵測該抗體或其抗原結合片段與 KRas 的該結合及親和力。
應理解，可組合本文所描述之各種具體實例的一種、一些或所有特性以形成本發明之其他具體實例。
相關申請之交叉引用
本申請案主張 2020 年 4 月 30 日遞交之美國臨時申請案第 63/018,356 號的權益，該臨時申請案的整體及所有目的併入本文。I. 定義
除非另有定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬技術領域之普通技術人員所一般理解之相同意義。在本文中引用的所有參考文獻，包括專利申請和公開，是藉由引用方式全部併入。
出於解釋本説明書之目的，將適用以下定義，且在任何適當的情況下，以單數使用的術語還將包括複數，反之亦然。應理解，本文所用之術語僅出於描述特定具體實施方式之目的，且不意欲作為限制性的。如果下文示出之任何定義與通過引用併入本文之任何文件相衝突，則以下文所示之定義爲準。
本文所用之「KRas」是指人 KRas 蛋白質。在一些實施例中，人 KRas 包含 SEQ ID NO:90 之胺基酸序列。在一些實施例中，KRas 蛋白質是突變型 (例如「突變型 KRas」或「KRas 突變型」)。在一些實施例中，突變 KRas 包含相對於 SEQ ID NO:90 之胺基酸序列的一個或多個突變。在一些實施例中，KRas 突變型是致癌突變型。在一些實施例中，KRas 蛋白質是天然生成之 KRas 突變型。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasG12C (即在位置 12 處包含半胱胺酸置換的 KRas)。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasG12V 、KRasG12R 、KRasQ61H 或 KRasG13D 。本文所用之「KRas-GDP」是指與鳥苷 5´-二磷酸 (GDP) 結合之 KRas。在一些實施例中，KRas-GDP 是無活性 KRas。在一些實施例中，無活性 KRas 無法結合 RAF 激酶，如 c-Raf，且異構地活化其激酶活性。在一些實施例中，無活性 KRas 不活化 KRas 下游之效應物途徑。在一些實施例中，無活性 KRas 不活化促分裂原活化蛋白 (MAP) 激酶級聯。在一些實施例中，無活性 KRas 不活化促進增殖之傳訊級聯。在一些實施例中，無活性 KRas 不活化抑制細胞凋亡之傳訊級聯。在一些實施例中，無活性 KRas 不活化促進葡萄糖運輸蛋白 GLUT1 之轉錄的傳訊級聯。
本文所用之「KRas-GTP」是指與鳥苷 5´-三磷酸 (GTP) 結合之 KRas。在一些實施例中，KRas-GTP 是活性 KRas。在一些實施例中，活性 KRas 能夠結合 RAF 激酶，如 c-Raf，且異構地活化其激酶活性。在一些實施例中，活性 KRas 活化 KRas 下游之效應物途徑。在一些實施例中，活性 KRas 活化促分裂原活化蛋白 (MAP) 激酶級聯。在一些實施例中，活性 KRas 活化促進增殖之傳訊級聯。在一些實施例中，活性 KRas 活化抑制細胞凋亡之傳訊級聯。在一些實施例中，活性 KRas 活化促進葡萄糖運輸蛋白 GLUT1 之轉錄的傳訊級聯。
本文所用之「抗 KRas 抗體」是指以足夠之特異性和親和力結合至人 KRas-GDP 的抗體，其可用於偵測 KRas-GDP、偵測烷基化 KRas-GDP 及/或穩定 KRas-GDP。在一個實施例中，抗 KRas 抗體與無關、KRas 蛋白質結合之程度低於該抗體與 KRas 結合約 10%，其藉由例如放射免疫測定 (RIA) 測量。在某些實施例中，與 KRas 結合之抗體具有 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如 10-8 M 或更小，例如 10-8 M 至 10-13 M，例如 10-9 M 至 10-13 M) 之解離常數 (KD )。
如本文所用之「穩定 KRas-GDP」之抗體是指能夠與 KRas-GDP 結合且優先將 KRas 鎖定在其 GDP 結合態而非其 GTP 結合態的抗體。在一些實施例中，穩定 KRas-GDP 之抗體也指 CLAMP (即，「用於分子探針發現之構形鎖定抗體」)。
「親和力」是指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原，如 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力 (binding affinity)」是指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (KD ) 來表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。本文描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施例。在一些實施例中，使用表面電漿子共振 (SPR) 測定來測量親和力。在一些實施例中，使用 BIACORE®-T200、BIACORE®-S200、BIACORE®-8k、BIACORE®-2000 或 BIACORE®-3000 儀器，藉由 SPR 測定法測量親和力。在一些實施例中，藉由酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 測量親和力。
如本文所用，當第一分子與第二分子結合之解離常數 (KD ) 低於與第三分子結合之解離常數，該第一分子與第二分子結合之「親和力高於」與第三分子之結合。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab’)2 、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如 scFv) 及抗原片段形成的多特異性抗體。抗體之番木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各自具有單一抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名字反映其容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生 F(ab’)2 片段，其具有兩個抗原組合位點且仍能夠與抗原交聯。
如本文所用的術語「單株抗體」是指獲自實質上同質抗體群體之抗體，即群體中包含的受試者抗體是相同的且/或結合相同抗原決定基，但不包括，例如，含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變體抗體，此等變體通常是以少量存在。與典型地包括針對不同決定子 (抗原決定基) 之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於雜交瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「裸抗體」是指未與異源部分 (例如，細胞毒性部分) 或放射性標記共軛之抗體。裸抗體可存在於醫藥製劑中。
「天然抗體」係指具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，Ig 天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體糖蛋白。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變區 (Vh)，亦稱為變異重鏈域或重鏈可變域，接著係三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變區 (VL)，亦稱為變異輕鏈域或輕鏈可變域，接著係輕鏈恆定 (CL) 域。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為亞型 (同型 (isotype))，例如 IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及 IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
術語"嵌合"抗體是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
「人共有骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自可變域序列的亞組。通常，序列之亞組是如 Kabat 等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷 中所述之亞組。在一個實施例中，對於 VL，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 κ I。在一個實施例中，對於 VH，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 III。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 HVR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 HVR (例如 CDR) 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」是指已經歷人源化之抗體。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個高度可變區 (HVR)。(參見例如，Kindt 等人，Kuby Immunology ，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007))。單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見例如，Portolano 等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson 等人，Nature 352:624-628 (1991)。
如本文所用，術語「高度可變區」或「HVR」是指序列具有高度變異性及/或形成結構上界定之環 (「高度變異環」) 的抗體可變域中的每個。一般而言，天然四鏈抗體包含六個 HVR；三個在 VH 中 (H1、H2、H3)，且三個在 VL 中 (L1、L2、L3)。HVR 通常包含來自高度變異環及/或「互補決定區」 (CDR) 的胺基酸殘基，後者具有最高之序列變異性及/或參與抗原識別。示例性高度變異環發生於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2) 及 96-101 (H3) 處。(Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。
示例性 CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2 及 CDR-H3) 發生於 L1 之胺基酸殘基 24-34、L2 之胺基酸殘基 50-56、L3 之胺基酸殘基 89-97、H1 之胺基酸殘基 31-35B、H2 之胺基酸殘基 50-65 及 H3 之胺基酸殘基 95-102 處(Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991))。除 VH 中之 CDR1 外，CDR 通常包含形成高度變異環之胺基酸殘基。CDR 還包含「特異性決定殘基」或「SDR」，它們是接觸抗原之殘基。CDR 之區域內所含 SDR 稱爲 abbreviated-CDR 或 a-CDR。示例性 a-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2 及 a-CDR-H3) 發生於 L1 之胺基酸殘基 31-34、L2 之胺基酸殘基 50-55、L3 之胺基酸殘基 89-96、H1 之胺基酸殘基 31-35B、H2 之胺基酸殘基 50-58 及 H3 之胺基酸殘基 95-102 處(參見 Almagro 及 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))。除非另有說明，否則可變域中之 HVR 殘基及其他殘基 (例如 FR 殘基) 在本文中根據 Kabat 等人 (同上文) 進行編號。
術語「偵測」以最廣義使用，包括對靶分子的定性和定量測量。在一個方面，如本文所述之偵測方法用於鑑定生物樣品中僅僅存在之 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas。在另一方面，該方法用於測試樣品中之 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas 是否以可偵測水平存在。在又一個方面，該方法可用於定量樣品中 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas 之含量，並進一步比較不同樣品中之 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas 水平。
術語「生物樣品」是指可包含 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas 的任何生物物質。樣品可以是生物流體，如全血或全血成分，包括紅細胞、白細胞、血小板、血清及血漿、腹水、透明液體、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚水、汗液、黏液、腦脊髓液及體內可包含 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas 之其他成分。在各種實施例中，樣品是來自任何動物之身體樣品。在一些實施例中，樣品來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品來自人受試者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或經治療性 KRas 抗體治療之患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或經 KRas 烷化劑治療之患者。在某些實施例中，生物樣品是血清或血漿。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者之血清。
術語「捕獲試劑」是指以下試劑 (例如抗體) 或此等試劑之混合物，該試劑結合至所關注之標靶 (例如 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas) 且能夠結合並捕獲生物樣品中所關注之標靶 (例如 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas)，使得在合適之條件下，捕獲試劑與所關注之標靶 (例如 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas) 的複合物可與樣品之其餘部分分離。在某些實施例中，捕獲試劑經固定或可固定。
「Fab」片段含有重鏈及輕鏈可變域，且亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域 (CH1)。Fab’ 片段與 Fab 片段不同之處在於，在重鏈 CH1 域之羧基端添加幾個殘基，包括來自抗體樞紐區之一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH 是指恆定域之半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基的 Fab'。F(ab')2 抗體片段最初作爲成對 Fab' 片段產生，其具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學耦聯也是已知的。
本文中的術語「Fc 域」或「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異 Fc 區域。在某些實施例中，人 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈的羧基端。然而，Fc 區域的 C 端離胺酸 (Lys447) 可以存在或可以不存在。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第 5 版，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。
「骨架 (framework)」或「FR」係指除高度可變區 (hypervariable region) (HVR) 殘基之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：  FR1、FR2、FR3 及 FR4。因此，HVR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：  FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，是指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有含有如本文中所定義的 Fc 區域的重鏈之抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」和「宿主細胞培養物」可互換使用，是指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉形體」和「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉形細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。
「免疫共軛物」是與一個或多個異源分子複合之抗體，其包括但不限於細胞毒性劑。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體或受試者是人類。
「分離的」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 來確定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗 KRas 抗體之分離核酸」是指編碼抗 KRas 抗體之重鏈及輕鏈 (或其片段) 的一種或多種核酸分子，包括在單個載體或單獨載體中之此等核酸分子，及存在於宿主細胞中的一個或多個位置處之此等核酸分子。
術語「藥品說明書」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、給藥途徑、聯合治療、禁忌症及/或警告等資訊。
相對於參考多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在排列序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守性置換作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的排列可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR) 軟體。本領域之技術人員可確定用於排列序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大排列所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生 ％ 胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的建南德克公司公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統 (包括數位 UNIX V4.0D) 上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。
在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性 (其可替代地表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性) 計算如下： 100 乘以分數 X/Y 其中 X 為序列排列程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式排列中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 為 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的 % 胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的 % 胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有 % 胺基酸序列同一性值。
「治療有效量」是至少實現特定病症之可測量改善或預防所需之最小濃度。本文中之治療有效量可根據諸如以下因素而變化：患者之疾病病況、年齡、性別及體重，以及抗體引發個體發生所需反應之能力。治療有效量亦是該抗體之任意毒性或有害效應被治療有益效應超過的含量。
術語「藥物製劑」或「醫藥組成物」是指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不包含對製劑將投予之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」或「有效量」是指醫藥製劑中除對受試者無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文中所使用的「治療 (treatment)」(及其語法變體，諸如「治療 (treat)」或「治療 (treating)」)，係指試圖改變受治療受試者之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態，及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病 (如癌症) 之發展或減慢疾病之進展。
如本文所用，術語「載體」係指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。此等載體在本文稱為「表現載體」。
在 KRasG12C 的情況下，本文所提及之「KRas 抑制劑」是指使 KRasG12C 烷基化 (特別在 Cys12 殘基處) 之共價抑制劑。如本文關於 KRasG12D 或 KRasG13D 所用，KRas 抑制劑可以是指特異性結合至如本文所述之給定 KRas 突變型的共價抑制劑 (例如共價結合至 Asp12 或 Asp13 之分子) 或非共價抑制劑。如本文關於 KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG12D 、KRasG13D 及 KRasQ61H 所用，KRas 抑制劑可以是指特異性結合至如本文所述之給定 KRas 突變型的非共價抑制劑。
AMG-510 是指具有以下結構：
Figure 02_image001
並具有化學名稱 4-((S )-4-丙烯醯基-2-甲基哌口井-1-基)-6-氟-7-(2-氟-6-羥苯基)-1-(2-異丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H )-酮之化合物。
MRTX-849 是指具有以下結構：
Figure 02_image003
並具有化學名稱 2-((S )-4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(((S )-1-甲基吡咯啶-2-基)甲氧基)-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d ]嘧啶-4-基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌口井-2-基)乙腈之化合物。
ARS-1620 是指具有以下結構：
Figure 02_image005
並具有化學名稱 (R )-1-(4-(6-氯-8-氟-7-(2-氟-6-羥苯基)喹唑啉-4-基)哌口井-1-基)丙-2-烯-1-酮之化合物。
ARS-853 是指具有以下結構：
Figure 02_image007
並具有化學名稱 1-(3-(4-((4-氯-2-羥基-5-(1-甲基環丙基)苯基)甘胺醯基)哌口井-1-基)四氫吖唉-1-基)丙-2-烯-1-酮之化合物。
GNE-1952 是指具有以下結構：
Figure 02_image009
並具有化學名稱 (R )-1-(4-(6-氯-7-(5-甲基-1H -吲唑-4-基)喹唑啉-4-基)哌口井-1-基)丙-2-烯-1-酮之化合物。
如本文所用，單數形式的「一種 (a)」、「一個 (an)」和「該 (the)」包括複數指示內容，除非上下文指出。
如本文所用，術語「約」係指本技術領域技術人員易於知曉的各個值的通常誤差範圍。本文提及「約」值或參數包括 (和描述) 針對該值或參數本身的實施例。
應理解，本文所述之本發明之態樣及具體實例包括「包含」態樣及具體實例、「由」態樣及具體實例「組成」及「基本上由」態樣及具體實例「組成」。II. 組成物及方法 A. 抗 KRas 抗體 i.    人 KRas 蛋白質
在一個方面，本披露提供了與人 KRas 蛋白質內區域如抗原決定基交互或以其他方式結合之抗體。KRas 蛋白質是 21 千道耳頓單體 GTP 酶，其是 RAS/MAPK 傳訊途徑之一部分。KRas 是原癌基因，且是人類癌症中最常見的突變致癌基因 (Haigis, KM,Trends Cancer 2017 3:10)。
在一些實施例中，人 KRas 被稱爲 C-K-RAS、c-K-ras 蛋白質、c-K-ras2 蛋白質、c-Kirsten-ras 蛋白質、細胞 c-Ki-ras2 原癌基因、K-ras p21 蛋白質、KI-RAS、Kirsten 大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物、KRAS1、PR310 c-K-ras 致癌基因、RASK2、RASK_人轉化蛋白 p21、v-Ki-ras2 Kirsten 大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物、NS、NS3、OES、CFC2、RALD、K-Ras、KRAS1、KRAS2、K-RAS2A、K_RAS2B 及 K-RAS4B。
存在人 KRas mRNA 之兩種剪接同功型，其導致 KRas 蛋白質之兩種變體。稱爲「KRas 同功型 b」之變體是主要變體，並由五個外顯子組成。同功型 b 缺乏外顯子 4a，並終止於外顯子 4b。第二變體 (同功型 a) 是稀有變體，由六個外顯子組成，包括外顯子 4a，並終止於外顯子 4a。在本披露中，除非另有說明，否則術語「KRas」是指同功型 b。
人 KRas 同功型 b 之胺基酸序列在下文中如 SEQ ID NO:90 所示。 MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
人 KRas 同功型 a 之胺基酸序列在下文中如 SEQ ID NO:89 所示。 MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
已描述了 KRas 中之突變及其與各種表型 (包括癌症表型) 之關係 (參見在線人類孟德爾遺傳登錄編號 190070)。人 KRas 之若干突變型對偶基因已被 FDA 公共人類遺傳變體資料庫之識別專家小組歸類爲致病性。其包括編碼序列變體 D153V、G60R、T58I、P34L、Q22R、V14I 及 K5N。在一些實施例中，KRas 是具有對應於 G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P、Q61R、A146T、A146P、A146V 或 A146T 之突變的突變型 KRas。在本披露之一些實施例中，使用 KRas 之其他突變型對偶基因，例如 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG13D 、KRasG13C 、KRasG12V 、KRasG12R 及 KRasQ61H 。
在一些實施例中，KRas 通過在「打開」和「關閉」構形 (分別藉由 GTP 及 GDP 之結合確認) 之間循環，使細胞表面受體偶合至細胞內效應物途徑。在一些實施例中，KRas 與 GDP 結合；在這些實施例中，其稱爲 KRas-GDP 或無活性 KRas。在其他實施例中，KRas 與 GTP 結合；在這些實施例中，其稱爲 KRas-GTP 或活性 KRas。這兩種狀態之間的過渡藉由鳥嘌呤核苷酸交換因子 (GEF) (其通過刺激 GDP 之 GTP 交換來促進 RAS 蛋白質之活化) 並藉由 GTP 酶活化蛋白 (GAP) (其加速 RAS 媒介之 GTP 水解) 來調節 (Pylayeva-Gupta, Y. 等人Nat Rev Cancer 2011 11)。在一些實施例中，KRas 中之致癌突變破壞其在 KRas-GDP 與 KRas-GTP 之間過渡之能力。在一些實施例中，殘基 G12 及 G13 中之致癌性置換防止通過立體阻礙在 KRas 與 GAP 之間形成凡得瓦鍵，從而擾亂 RAS 中催化麩醯胺酸 (Q61) 之正確取向，導致 GTP 水解顯著減弱 (Pylayeva-Gupta, Y. 等人Nat Rev Cancer 2011 11；Scheffzek K. 等人Science 1997 277)。因此，在一些實施例中，KRas 具有組成性活性。
KRas 具有別位袋，其僅在其 GDP 結合態下展現 (Ostream, J.M.等人，Nature 2013 28 503:7477)。此袋稱爲 switch-II 袋、S-IIP 或 SWII。KRas、KRasG12C 之一個示例性突變型對偶基因已經由抑制劑與 Cys12 殘基之共價結合而靶向。這些抑制劑穩定 SWII 袋之開口 (Ostream, J.M.等人，Nature 2013 28 503:7477；Patricelli, M.P. 等人，Cancer Discov .2016 6；Lito, P. 等人，Science 2016 351)。此等 SWII 共價結合物 (也稱為 SWII 配體) 之作用機理被視爲經由與瞬時 SWII 袋之初始弱結合及 Cys12 之烷基化實現該袋之穩定化 (Patricelli, M.P. 等人，Cancer Discov .2016 6)。這將 KRasG12C -GDP 鎖定至無活性狀態，抑制臨床前模型中之腫瘤生長，並已表現出有前景之臨床活動 (Patricelli, M.P. 等人，Cancer Discov .2016 6；Fakih, M. 等人，J Clin Oncol 2019 37)。 ii. 抗 KRas 抗體
與人 KRas 蛋白質結合之抗 KRas 抗體或其抗原結合片段如本文所述。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRas 蛋白質，其中 KRas 蛋白質包含胺基酸序列 SEQ ID NO:90。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與人 KRas 結合，其中抗體以比與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP) 更高的親和力結合與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 結合之解離常數 (KD ) 低於與 KRas-GTP 結合之解離常數。在一些實施例中，抗 KRas 抗體於 25˚C 下與 KRas-GDP 結合之解離常數 (KD ) 低於與 KRas-GTP 結合之解離常數。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 結合之解離常數 (KD ) 低於與 KRas-GTP 結合之解離常數，此等解離常數藉由表面電漿子共振測得。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 結合之解離常數 (KD ) 低於與 KRas-GTP 結合之解離常數，此等解離常數藉由表面電漿子共振於 25˚C 下測得。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 結合之解離常數 (KD ) 低於抗 KRas 抗體與 KRas-GTP 結合之解離常數。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 結合之特異性高於與 KRas-GTP 結合之特異性。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 結合之强度高於與 KRas-GTP 結合之强度。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 結合之結合常數或親和力常數高於與 KRas-GTP 結合之結合常數或親和力常數。在一些實施例中，抗 KRas 抗體優先結合 KRas-GDP 而非 KRas-GTP。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體顯示，與 KRas GTP 無可偵測之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 之親和力相比於 KRas-GTP 高至少 10 倍、至少 100 倍、至少 1000 倍或至少 10,000 倍。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 之親和力相比於與 KRas-GTP 之親和力高 10 倍至 10,000 倍。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 之親和力相比於與 KRas-GTP 之親和力高 10 倍至 1,000,000 倍。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體與人 KRas 結合，其中抗體以比與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP) 更高的親和力結合與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GTP 結合之解離常數 (KD ) 低於與 KRas-GDP 結合之解離常數。在一些實施例中，抗 KRas 抗體於 25˚C 下與 KRas-GTP 結合之解離常數 (KD ) 低於與 KRas-GDP 結合之解離常數。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GTP 結合之解離常數 (KD ) 低於與 KRas-GDP 結合之解離常數，此等解離常數藉由表面電漿子共振測得。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GTP 結合之解離常數 (KD ) 低於與 KRas-GDP 結合之解離常數，此等解離常數藉由表面電漿子共振於 25˚C 下測得。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GTP 結合之解離常數 (KD ) 低於抗 KRas 抗體與 KRas-GDP 結合之解離常數。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GTP 結合之特異性高於與 KRas-GDP 結合之特異性。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GTP 結合之强度高於與 KRas-GDP 結合之强度。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRas-GTP 結合之結合常數或親和力常數高於與 KRas-GDP 結合之結合常數或親和力常數。在一些實施例中，抗 KRas 抗體優先結合 KRas-GTP 而非 KRas-GDP。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體以比與活性 KRas 結合更高的親和力來與無活性 KRas 結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與無活性 KRas 結合之穩定性高於與活性 KRas 結合之穩定性。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與無活性 KRas 結合之 KD 低於與活性 KRas 結合之 KD 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與無活性 KRas 特異性結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與無活性 KRas 結合之特異性高於與活性 KRas 結合之特異性。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與無活性 KRas 結合之强度高於與活性 KRas 結合之强度。在一些實施例中，抗 KRas 抗體優先結合無活性 KRas 而不是活性 KRas。
在一些實施例中，本披露提供了結合及/或誘導 KRas 之某些構形的抗 KRas 抗體。特別是，本文提供了打開及/或穩定 SWII 袋之抗 KRas 抗體。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體穩定 SWII 袋。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 KRas 之開放構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體打開並穩定 SWII 袋。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 KRas 之無活性構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體打開並穩定 SWII 袋，使得可結合 KRas 抑制劑。在一些實施例中，抗 KRas 抗體優先結合至 KRas 之開放構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合至開放構形或封閉構形之 KRas-GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合至開放構形或封閉構形之 KRas-GTP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了分子與 SWII 袋之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了抑制劑與 SWII 袋之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了配體與 SWII 袋之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 SWII 袋中共價 KRas 抑制劑 (例如使 Cys12 烷基化之 KRas 抑制劑) 之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12C ，並改善了殘基 Cys12 之共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12D ，並改善了殘基 Asp12 之共價結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG13D ，並改善了殘基 Asp13 之共價結合。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 SWII 袋中非共價 KRas 抑制劑 (例如非共價結合至殘基 12 或 13 之 KRas 抑制劑) 之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12D ，並改善了殘基 Asp12 之非共價結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12D ，並改善了殘基 Asp12 之共價結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12V ，並改善了殘基 Val12 之非共價結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12R ，並改善了殘基 Arg12 之非共價結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG13D ，並改善了殘基 Asp13 之非共價結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG13D ，並改善了殘基 Asp13 之共價結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasQ61H ，並改善了殘基 His61 之非共價結合。
在一些實施例中，本披露提供了抗 KRas 抗體，其引起 KRas 更常處於某種構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體引起 KRas 處於某種構形。特別是，本文提供了引起 KRas 更常包含開放 SWII 袋的抗 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體引起 KRas 更常處於開放構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體引起 KRas SWII 袋更常打開及/或穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體引起 SWII 袋更常打開並穩定，使得可結合 KRas 抑制劑。在此等實施例中，本文所述之抗 KRas 抗體可使位置 12 處殘基更易於被抑制劑觸及及/或穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體使配體更有可能與 SWII 袋結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體使 SWII 袋更有可能由共價 KRas 抑制劑結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12C ，並使殘基 Cys12 更有可能由共價抑制劑結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體使 SWII 袋更有可能由非共價 KRas 抑制劑結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12D ，並使殘基 Asp12 更有可能由非共價抑制劑結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12V ，並使殘基 Val12 更有可能由非共價抑制劑結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12R ，並使殘基 Arg12 更有可能由非共價抑制劑結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG13D ，並使殘基 Asp13 更有可能由非共價抑制劑結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasQ61H ，並使殘基 His61 更有可能由非共價抑制劑結合。
在一些實施例中，本披露提供了影響 KRas 之構形的抗 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體影響 KRas 蛋白質之結構。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改變了 KRas 處於特定構形之相對頻率。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改變了 KRas 特定構形之偏好。在一些實施例中，抗 KRas 抗體異構地調節 KRas 結構。特別是，本文提供了促進 SWII 袋之打開的抗 KRas 抗體。在一些實施例中，本文提供的抗 KRas 抗體促進了 SWII 袋之穩定。在一些實施例中，本文提供的抗 KRas 抗體促進了 KRasG12C 中 SWII 袋之穩定。在一些實施例中，本文提供的抗 KRas 抗體促進了 KRasG12D 中 SWII 袋之穩定。在一些實施例中，本文提供的抗 KRas 抗體促進了 KRasG12V 中 SWII 袋之穩定。在一些實施例中，本文提供的抗 KRas 抗體促進了 KRasG12R 中 SWII 袋之穩定。在一些實施例中，本文提供的抗 KRas 抗體促進了 KRasG13D 中 SWII 袋之穩定。在一些實施例中，本文提供的抗 KRas 抗體促進了 KRasQ61H 中 SWII 袋之穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了 KRas 之開放構形的穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了 SWII 袋之打開及穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了 KRas 之無活性構形的穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了 SWII 袋之打開及穩定，使得可結合 KRas 抑制劑。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了配體與 SWII 袋之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了抑制劑與 SWII 袋之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了配體與 SWII 袋之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了 SWII 袋之共價烷基化。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12C 並促進了殘基 Cys12 之烷基化。在一些實施例中，抗 KRas 抗體促進了非共價 KRas 抑制劑之結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12D 及抗體促進了藉由非共價抑制劑結合至殘基 Asp12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12V 及抗體促進了藉由非共價抑制劑結合至殘基 Val12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12R 及抗體促進了藉由非共價抑制劑結合至殘基 Arg12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG13D 及抗體促進了藉由非共價抑制劑結合至殘基 Asp13。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasQ61H 及抗體促進了藉由非共價抑制劑結合至殘基 His61。
在一些實施例中，本披露提供了結合及/或誘導 KRas 之某些構形的抗 KRas 抗體。特別是，本文提供了阻礙 SWII 袋之封閉的抗 KRas 抗體。在一些實施例中，本文所提供的抗 KRas 抗體防止 SWII 袋之封閉。在一些實施例中，本文所提供的抗 KRas 抗體防止 KRasG12C 中 SWII 袋之封閉。在一些實施例中，本文所提供的抗 KRas 抗體防止 KRasG12D 中 SWII 袋之封閉。在一些實施例中，本文所提供的抗 KRas 抗體防止 KRasG12V 中 SWII 袋之封閉。在一些實施例中，本文所提供的抗 KRas 抗體防止 KRasG12R 中 SWII 袋之封閉。在一些實施例中，本文所提供的抗 KRas 抗體防止 KRasG13D 中 SWII 袋之封閉。在一些實施例中，本文所提供的抗 KRas 抗體防止 KRasQ61H 中 SWII 袋之封閉。在一些實施例中，抗 KRas 抗體阻礙或防止 KRas 採用封閉構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體阻礙或防止 SWII 袋之封閉構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體阻礙或防止 SWII 袋之封閉，使得可結合 KRas 抑制劑。在一些實施例中，抗 KRas 抗體優先結合至 KRas 之非封閉構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體優先結合至非封閉之 KRas SWII 袋的構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體引起 KRas 更不太可能處於封閉構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體引起 KRas 更少處於封閉構形。
在一些實施例中，本文所披露之抗 KRas 抗體的結合誘導了 KRas 之某些構形。特別是，本文所披露之抗 KRas 抗體的結合得到開放 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體得到 KRasG12C 中之開放 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體得到 KRasG12D 中之開放 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體得到 KRasG12V 中之開放 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體得到 KRasG12R 中之開放 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體得到 KRasG13D 中之開放 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體得到 KRasQ61H 中之開放 SWII 袋。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 SWII 袋穩定打開。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 SWII 袋更有可能打開。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 SWII 袋之打開。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 SWII 袋之穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 KRas 之開放構形穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 SWII 袋之打開並穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 KRas 之無活性構形穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 SWII 袋打開並穩定，使得可結合 KRas 抑制劑。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致抑制劑與 SWII 袋之結合得到改善。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致配體與 SWII 袋之結合得到改善。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合導致 SWII 袋之共價烷基化得到改善。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與 KRasG12C 之結合導致殘基 Cys12 之烷基化得到改善。
在一些實施例中，本披露提供了特異性結合及/或誘導 KRas 之特定構形之抗 KRas 抗體。特別是，本文提供了特異性打開 SWII 袋之抗 KRas 抗體。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體特異性穩定 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體特異性穩定 KRasG12D 之 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體特異性穩定 KRasG12V 之 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體特異性穩定 KRasG12R 之 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體特異性穩定 KRasG13D 之 SWII 袋。在一些實施例中，本文所提供之抗 KRas 抗體特異性穩定 KRasQ61H 之 SWII 袋。在一些實施例中，抗 KRas 抗體特異性穩定 KRas 之開放構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體特異性打開並穩定 SWII 袋。在一些實施例中，抗 KRas 抗體特異性穩定 KRas 之無活性構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體特異性打開並穩定 SWII 袋，使得可結合 KRas 抑制劑。在一些實施例中，抗 KRas 抗體特異性結合至 KRas 之開放構形。
在本披露之一些實施例中，抗 KRas 抗體是 KRas 烷基化構形特異性抗體。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體是指 I 類抗體，且包括例如抗體 1A5、1D6、2C1、1A6、1F4 及 1B7。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體結合與 KRas 抑制劑共價結合之 KRas (例如，其中 Cys12 藉由共價抑制劑烷基化)。在一些實施例中，在存在共價結合 SWII 抑制劑的情況下，結合 KRas 烷基化構形特異性抗體。在一些實施例中，在存在共價結合 SWII 配體的情況下，結合 KRas 烷基化構形特異性抗體。在一些實施例中，KRas 共價結合 (例如烷基化) 至 KRas 抑制劑，該 KRas 抑制劑選自由下列所組成之群組：MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157。在另一個實施例中，KRas 共價結合至化合物 (如 ARS1620 或 GNE1952)。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體結合其中 SWII 袋處於開放構形之 KRas。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體穩定 SWII 袋。在一些實施例中，本文所述之 KRas 烷基化構形特異性抗體穩定 KRasG12D 之 SWII 袋。在一些實施例中，本文所述之 KRas 烷基化構形特異性抗體穩定 KRasG12V 之 SWII 袋。在一些實施例中，本文所述之 KRas 烷基化構形特異性抗體穩定 KRasG12R 之 SWII 袋。在一些實施例中，本文所述之 KRas 烷基化構形特異性抗體穩定 KRasG13D 之 SWII 袋。在一些實施例中，本文所述之 KRas 烷基化構形特異性抗體穩定 KRasQ61H 之 SWII 袋。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體使 SWII 袋穩定於開放構形。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體用於偵測 KRas 之烷基化。在一些實施例中，本文所述之 KRas 烷基化構形特異性抗體用於偵測 KRasG12C 與共價抑制劑之結合。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體可用於偵測腫瘤細胞中活體內之烷基化 KRasG12C -GDP。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體可用於偵測腫瘤細胞中活體內之烷基化 KRasG12C -GTP。在一些此等實施例中，偵測用於監測接受 KRas 抑制劑 (例如 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157) 治療之患者中 KRasG12C 之烷基化。
在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與 KRas 之開放構形的親和力相比於與封閉構形的親和力高至少 5 倍、至少 2 倍、至少 10 倍、至少 50 倍、至少 100 倍、至少 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與 KRas 之開放構形的親和力相比於與封閉構形的親和力高 2 至 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與 KRas 之開放構形的親和力相比於與封閉構形的親和力高 10 至 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與 KRas 之開放構形的親和力相比於與封閉構形的親和力高 10 至 10000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與 KRas 之開放構形的親和力相比於與封閉構形的親和力高 10 至 100000 倍。
在本披露之一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體使本文所述之 KRas 之 SWII 袋的開放構形穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 I 類或 II 類抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1D6。在一些實施例中，抗體是 2C1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A6。在一些實施例中，抗體是 1B7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2A3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 3A12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 4G12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1F4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab2。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab8。
在本披露之一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，烷基化構形特異性 KRas 抗體結合 KRas，並誘導其中 SWII 袋處於開放構形之 KRas 的構形。在一些實施例中，烷基化構形特異性 KRas 抗體初始結合包含封閉 SWII 袋之 KRas，並誘導 KRas 中之構形變化，使得 SWII 袋打開。在一些實施例中，烷基化構形特異性 KRas 抗體之結合引起 SWII 袋打開。在一些實施例中，烷基化構形特異性 KRas 抗體促進了 SWII 袋之打開。在一些實施例中，烷基化構形特異性 KRas 抗體改變了 KRas 之構形。在一些實施例中，烷基化誘導 KRas 抗體是 II 類抗體。在一些實施例中，KRas 烷基化構形特異性抗體是 II 類抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4 或 4G12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2A3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 3A12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 4G12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1F4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab2。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab8。
在一些實施例中，本披露之烷基化構形特異性 KRas 抗體在不存在共價結合之 KRasG12C 抑制劑或 SWII 配體的情況下，使 SWII 袋之開放構形穩定。在一些實施例中，抗 KRas 抗體初始結合包含開放 SWII 袋之 KRas，並穩定如本文所述之 SWII 袋。在一些實施例中，本披露之烷基化構形特異性 KRas 抗體在不存在非共價結合 KRasG12C 抑制劑或 SWII 配體的情況下，穩定 SWII 袋之開放構形。在一些實施例中，當 SWII 袋更有可能處於開放狀態而不是此等抗體不與之結合的野生型 KRas 蛋白質時，認爲 SWII 袋之開放構形是穩定的。在一些實施例中，當 SWII 袋之開放構形較正常情況更經常存在時，認爲其開放構形得到誘導。在一些實施例中，抗 KRas 抗體將 KRas SWII 袋鎖定在開放構形。在一些實施例中，抗 KRas 抗體防止 SWII 袋封閉。在一些實施例中，烷基化構形特異性 KRas 抗體改善了許多 G12C 抑制劑與 KRasG12C 及野生型 KRas 的非共價親和力。
在一些實施例中，烷基化誘導抗 KRas 抗體以大約相同之親和力結合至未烷基化 KRas-GDP 及烷基化 KRas-GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合至未烷基化 KRas-GDP 及烷基化 KRas-GDP 之親和力彼此相差 10 倍以內、5 倍以內或 2 倍以內。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合至未烷基化 KRas-GDP 及烷基化 KRas-GDP 之親和力彼此相差 10 倍至 2 倍以內。
在一些實施例中，本發明提供了與人 KRas 結合之抗 KRas 抗體或其抗原結合片段，其中人 KRas 是 KRas 突變型。在本披露之一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12C 。KRas 之密碼子 12 中之突變在癌症中佔主導，其中KRAS 最常見 (即，胰管腺癌 (PDAC)、大腸直腸癌 (CRC) 及非小細胞肺癌 (NSCLC)) (Haigis, KM,Trends Cancer 2017 3:10)。KRasG12C 是特定之KRAS 對偶基因，其已通過共價結合突變之殘基 Cys12 的化合物靶向，如上所述。
在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體結合 KRas 突變蛋白。在本披露之一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12V 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12R 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasQ61H 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12D 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG13D 。
在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是烷基化構形特異性 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子共價結合 (例如烷基化) 之 KRasG12C -GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體，該抗體結合至被小分子共價結合之 KRasG12C -GDP。在一些實施例中，KRasG12C -GDP 與 MRTX849 共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，KRasG12C -GDP 與 AMG-510 共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，KRasG12C -GDP 與 GDC-6036 共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，KRasG12C -GDP 與 ARS-3248 共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，KRasG12C -GDP 與 LY3499446 共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，KRasG12C -GDP 與 JNJ-74699157 共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，KRasG12C -GDP 與 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157 共價結合 (例如烷基化)。
在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是烷基化構形特異性 KRas 抗體，該抗體結合至與本文所述之臨床樣品中之小分子共價結合 (例如烷基化) 之 KRasG12C -GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體，該抗體結合至被本文所述之從患者採集之腫瘤樣品中之小分子共價結合之 KRasG12C -GDP。在一些此等實施例中，KRasG12C -GDP 與 MRTX849 共價結合 (例如烷基化)。在一些此等實施例中，KRasG12C -GDP 與 AMG-510 共價結合 (例如烷基化)。在一些此等實施例中，KRasG12C -GDP 與 GDC-6036 共價結合 (例如烷基化)。在一些此等實施例中，KRasG12C -GDP 與 ARS-3248 共價結合 (例如烷基化)。在一些此等實施例中，KRasG12C -GDP 與 LY3499446 共價結合 (例如烷基化)。在一些此等實施例中，KRasG12C -GDP 與 JNJ-74699157 共價結合 (例如烷基化)。在一些此等實施例中，KRasG12C -GDP 與 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157 共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是烷基化構形特異性 KRas 抗體，該抗體與本文所述之 KRas-GDP 結合，並用於生物標志物測定法中以確定本文所述之標靶嚙合水平。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12C -GDP。在一些實施例中，當 KRasG12C -GDP 烷基化時，與 KRasG12C -GDP 未烷基化相比，抗 KRas 抗體以更高的親和力與 KRasG12C -GDP 結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12D -GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12V -GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG12R -GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasG13D -GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合 KRasQ61H -GDP。在一些實施例中，當突變型 KRas-GDP 被共價或非共價 KRas 抑制劑結合時，與突變型 KRas-GDP 未被共價或非共價 KRas 抑制劑結合相比，抗 KRas 抗體以更高的親和力結合該突變型 KRas-GDP。
在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GDP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GDP 之親和力高至少 5 倍、至少 2 倍、至少 10 倍、至少 50 倍、至少 100 倍、至少 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GDP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GDP 之親和力高 2 至 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GDP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GDP 之親和力高 10 至 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GDP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GDP 之親和力高 10 至 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GDP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GDP 之親和力高 10 至 10000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GDP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GDP 之親和力高 10 至 100000 倍。
在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GTP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GTP 之親和力高至少 5 倍、至少 2 倍、至少 10 倍、至少 50 倍、至少 100 倍、至少 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GTP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GTP 之親和力高 2 至 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GTP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GTP 之親和力高 10 至 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GTP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GTP 之親和力高 10 至 1000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GTP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GTP 之親和力高 10 至 10000 倍。在一些實施例中，烷基化構形特異性抗 KRas 抗體與烷基化 KRas-GTP 之親和力相比於與未烷基化 KRas-GTP 之親和力高 10 至 100000 倍。
在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasG12D -GDP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasG12D -GTP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasG12V -GDP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasG12V -GTP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasG12R -GDP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasG12R -GTP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasQ61H -GDP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasQ61H -GTP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasG13D -GDP。在一些實施例中，分離抗體或抗原結合片段是抗 KRas 抗體，該抗體結合至與小分子非共價結合之 KRasG13D -GTP。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 2H11 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 2H11 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 2H11 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 2H11 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 Ab1 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 Ab1 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 Ab1 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 Ab1 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗體 Ab1 是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗體 Ab1 打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 Ab2 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 Ab2 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 Ab2 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 Ab2 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗體 Ab2 是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗體 Ab2 打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 Ab3 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 Ab3 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 Ab3 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 Ab3 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗體 Ab3 是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗體 Ab3 打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 Ab4 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 Ab4 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 Ab4 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 Ab4 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗體 Ab4 是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗體 Ab4 打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 Ab5 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 Ab5 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 Ab5 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 Ab5 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗體 Ab5 是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗體 Ab5 打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 Ab6 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 Ab6 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 Ab6 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 Ab6 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗體 Ab6 是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗體 Ab6 打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 Ab7 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 Ab7 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 Ab7 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 Ab7 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗體 Ab7 是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗體 Ab7 打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 Ab8 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 Ab8 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 Ab8 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 Ab8 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗體 Ab8 是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗體 Ab8 打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:16 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 16 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 12；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:99 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:99 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:99 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 99 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 91；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:100 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:100 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:100 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 100 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 92；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:101 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:101 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:101 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 101 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 93；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:102 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:102 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:102 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 102 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 94；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:103 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:103 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:103 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 103 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 95；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:104 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:104 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:104 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 104 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 96；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:105 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:105 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:105 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 105 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 97；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:106 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:106 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:106 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 106 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 98；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 13；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 14。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:15 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 15 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列。在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:99 之胺基酸序列。在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:100 之胺基酸序列。在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:101 之胺基酸序列。在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:102 之胺基酸序列。在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:103 之胺基酸序列。在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:104 之胺基酸序列。在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:105 之胺基酸序列。在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:106 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:91 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:92 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:95 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:96 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:97 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:98 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:16 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:99 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:100 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:101 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:102 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:103 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:104 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:105 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:106 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:15 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 1A5 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 1A5 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 1A5 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 1A5 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:8 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 8 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 4；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 5；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 6。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:7 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 7 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:8 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:7 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 1D6 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 1D6 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 1D6 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 1D6 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:24 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 24 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 20；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 21；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 22。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:23 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 23 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:24 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:23 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 2C1 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 2C1 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 2C1 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 2C1 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:32 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 32 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 28；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 29；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 30。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:31 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 31 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:30 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:32 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:31 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 4G12 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 4G12 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 4G12 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 4G12 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:40 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 40 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 36；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 37；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 38。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:39 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 39 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:35 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:35 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:40 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:39 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 1A6 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 1A6 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 1A6 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 1A6 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:48 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 48 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 44；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 45；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 46。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:47 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 47 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:42 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:45 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:42 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:48 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:47 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體1F4 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體1F4 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體1F4 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體1F4 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:88 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:88 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:88 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 88 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 84；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 85；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 86。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:87 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:87 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:87 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 87 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:81 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:82 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:83 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:87 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:88 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:84 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:85 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:86 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:81 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:82 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:83 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:88 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:87 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 1B7 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 1B7 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 1B7 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 1B7 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:56 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 56 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 52；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 53；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 54。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:55 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 55 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:50 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:50 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:56 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:55 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 1E5 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 1E5 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 1E5 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 1E5 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:64 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 64 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 60；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 61；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 62。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:63 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 63 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:64 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:63 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體 2A3 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體 2A3 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體 2A3 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體 2A3 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:72 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:72 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:72 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 72 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 68；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 69；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 70。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:71 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:71 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:71 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 71 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:71 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:72 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:69 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:70 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:72 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:71 所示之序列。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 2 及表 3 所示之抗體3A12 的一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含如表 4 及表 5 所示之抗體3A12 的 VH 及/或 VL。在一個特定實施例中，包含抗體3A12 之一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR 的抗 KRas 抗體及/或抗體3A12 之 VH 及/或 VL 結合 KRas 突變型 KRasG12C 。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性 KRas 抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體打開並穩定 KRas 之 SWII 袋。
在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，該重鏈可變域序列與 SEQ ID NO:80 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VH 序列包含相對於 SEQ ID NO:80 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:80 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 80 中，共有 1 至 13 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VH 包含選自由下列所組成之群組的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 76；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 77；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 78。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL)，該輕鏈可變域與 SEQ ID NO:79 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在某些實施例中，VL 序列包含相對於 SEQ ID NO:79 之胺基酸序列的置換 (例如保守置換)、插入或缺失，但是保留作為包含 SEQ ID NO:79 的抗 KRas 抗體結合 KRas 之能力。在某些實施例中，在 SEQ ID NO: 79 中，共有 1 至 11 個胺基酸被置換、插入及/或缺失。在某些實施例中，置換、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即在 FR 中)。在一個特定實施例中，VL 包含一個、兩個或三個 CDR，該等 CDR 選自由下列所組成之群組：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:73 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:74 之胺基酸序列；及 (c) a CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:75 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗 KRas 抗體包含：VL，該 VL 包含 SEQ ID NO:79 之胺基酸序列；及 VH，該 VH 包含 SEQ ID NO:80 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含：VH，該 VH 包含：CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:76 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:77 之胺基酸序列；及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:78 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含：CDR-Ll，其包含 SEQ ID NO:73 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:74 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:75 之胺基酸序列。
在另一方面，提供了抗 KRas 抗體，其中抗體包含 VH CDR1、VH CDR2 及 VH CDR3，它們分別包含 VH 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VH 具有如 SEQ ID NO:80 所示之序列；及 VL CDR1、VL CDR2 及 VL CDR3，它們分別包含 VL 內 CDR1、CDR2 及 CDR3 之胺基酸序列，該 VL 具有 SEQ ID NO:79 所示之序列。
在另一方面，提供了一種抗 KRas 抗體，其中抗體包含上文提供之實施例中任一項之 VH 及上文提供之實施例中任一項之 VL。
在本發明的又一方面，根據以上實施例之任一項所述之抗 KRas 抗體是單株抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙抗體或 F(ab')2 片段。在另一個實施例中，抗 KRas 抗體是全長抗體，例如本文所定義之完整 IgG1 抗體或其他抗體類別或同型。
在本發明之一個實施例中，根據以上實施例所述之抗 KRas 抗體與人 KRas 之一個或多個胺基酸抗原決定基結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合至人 KRas 之胺基酸 W99、K5、L6、V7、S39、D54、L54、Y71、T74 及/或 G75 中之一個或更多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個或 6 個或更多個，其中人 KRas 包含胺基酸序列 SEQ ID NO:90。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與人 KRas 之 W99 結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合至人 KRas 之 SW1 及 SW2 之殘基。在一些實施例中，抗 KRas 抗體與人 KRas 之 SW2 結合。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合至下表 A-D 中列出之胺基酸殘基。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合表 A 中列出之 3.5、4.0 或 4.5 埃 (Å) 內的殘基。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合表 B 中列出之 3.5、4.0 或 4.5 Å 內的殘基。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合表 C 中列出之 3.5、4.0 或 4.5 Å 內的殘基。在一些實施例中，抗 KRas 抗體結合表 D 中列出之 3.5、4.0 或 4.5 Å 內的殘基。表 A ： 2H11 之接觸殘基
在 3.5Å 內 在 4.0Å 內 在 4.5Å 內
LYS-5 LYS-5 LYS-5
LEU-6 LEU-6 LEU-6
VAL-7 VAL-7 VAL-7
ILE-36 GLN-25 GLN-25
ASP-38 TYR-32 TYR-32
SER-39 ILE-36 ASP-33
ARG-41 ASP-38 ILE-36
ASP-54 SER-39 ASP-38
MET-67 TYR-40 SER-39
TYR-71 ARG-41 TYR-40
THR-74 ASP-54 ARG-41
LEU-56 ASP-54
SER-65 ILE-55
MET-67 LEU-56
TYR-71 SER-65
THR-74 MET-67
GLY-75 GLN-70
TYR-71
THR-74
GLY-75
表 B ： 2C1 之接觸殘基
在 3.5Å 內 在 4.0Å 內 在 4.5Å 內
GLU-62  GLU-62  GLU-62 
GLU-63  GLU-63  GLU-63 
TYR-64  TYR-64  TYR-64 
LYS-88  LYS-88  THR-87 
ASP-92  GLU-91  LYS-88 
HIS-94  ASP-92  GLU-91 
HIS-95  HIS-94  ASP-92 
GLU-98  HIS-95  HIS-94 
GLN-99  GLU-98  HIS-95 
ARG-102  GLN-99  GLU-98 
  ARG-102  GLN-99 
  TYR-137  LYS-101 
    ARG-102 
    TYR-137 
表 C ： 1E5 之接觸殘基
在 3.5Å 內 在 4.0Å 內 在 4.5Å 內
GLU-31  GLU-3  GLU-3 
TYR-32  LYS-5  LYS-5 
ASP-33  GLN-25  GLN-25 
GLU-37  GLU-31  GLU-31 
ASP-38  TYR-32  TYR-32 
SER-39  ASP-33  ASP-33 
TYR-40  PRO-34  PRO-34 
ARG-41  THR-35  THR-35 
ASP-54  ILE-36  ILE-36 
ALA-59  GLU-37  GLU-37 
GLN-61  ASP-38  ASP-38 
GLU-63  SER-39  SER-39 
ARG-68  TYR-40  TYR-40 
TYR-71  ARG-41  ARG-41 
  ASP-54  LYS-42 
  LEU-56  ASP-54 
  ALA-59  LEU-56 
  GLN-61  ALA-59 
  GLU-63  GLY-60 
  ARG-68  GLN-61 
  TYR-71  GLU-63 
    MET-67 
    ARG-68 
    TYR-71 
表 D ： 3A12 之接觸殘基
在 3.5Å 內 在 4.0Å 內 在 4.5Å 內
LYS-5  LYS-5  LYS-5 
LEU-6  LEU-6  LEU-6 
VAL-7  VAL-7  VAL-7 
GLU-37  TYR-32  TYR-32 
ASP-38  THR-35  ASP-33 
SER-39  GLU-37  THR-35 
TYR-40  ASP-38  ILE-36 
ARG-41  SER-39  GLU-37 
ASP-54  TYR-40  ASP-38 
GLU-63  ARG-41  SER-39 
TYR-64  ASP-54  TYR-40 
MET-67  LEU-56  ARG-41 
GLN-70  GLU-63  ASP-54 
TYR-71  TYR-64  ILE-55 
THR-74  MET-67  LEU-56 
  GLN-70  GLU-63 
  TYR-71  TYR-64 
  THR-74  MET-67 
  GLY-75  GLN-70 
    TYR-71 
    THR-74 
    GLY-75 
在一些實施例中，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 及 Ab8 之接觸殘基如圖 11A 及圖 11B 所示。
在另一方面，本文提供了一種融合蛋白，該融合蛋白包含 KRas 蛋白質 (例如 SEQ ID NO:90) 或其片段及本文所述之抗體之 Fab、scFv 或 IgG。在一個此等實施例中，融合蛋白包含如本文所述的 KRas 蛋白質或其片段、包含 (Gly-Ser)n 之連接基 (其中 n 是至少 1) 及如本文所述之 Fab、scFv 或 IgG。在一個此等實施例中，n 是 1-5、1-8、1-10 或 1-20 之整數。在一個實施例中，KRas 蛋白質或其片段融合至本文所述之 Fab 的 N 端。在一個此等實施例中，在 KRas 與 Fab 的 N 端之間存在連接基。在另一個實施例中，KRas 蛋白質或其片段連接至 Fab 的 C 端。在一個此等實施例中，在 KRas 蛋白質的 N 端與 Fab 的 C 端之間存在如本文所述之連接基。
在本文所述之融合蛋白之一個實施例中，Fab 包含 HC 序列：EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (SEQ ID NO:107) 及 LC 序列：GLNDIFEAQKIEWHEGSENLYFQSTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:108)。
在本文所述之融合蛋白之另一個實施例中，Fab 包含 HC 序列：GLNDIFEAQKIEWHEGSENLYFQSTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (SEQ ID NO:109) 及 LC 序列：SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:110)。
在本發明的又一方面，根據上述實施例中任一項或本文所述之抗 KRas 抗體共軛至異源部分、試劑或標記。合適的標記之實例是已知用於免疫測定的眾多標記，包括可直接偵測之部分，如螢光染料、化學發光標記和放射性標記及必須反應或衍生化以偵測的部分 (如酶)。此等標記之實例包括放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H 及131 I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；鹼性蕊香紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利第 4,737,456 號)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；HRP；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶偶合使用；生物素 (可藉由例如抗生物素蛋白、鏈黴親和素、鏈黴親和素-HRP 及鏈黴親和素-β-半乳糖苷酶與 MUG 進行偵測)；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。
在另一方面，本文提供了一種組成物，該組成物包含根據以上實施例中之任一項或本文所述之抗 KRas 抗體中之一項或多項。本文還提供了編碼本文所述之抗 KRas 抗體之核酸、包含該核酸之載體及包含載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞經分離或純化。在一些實施例中，宿主細胞是細胞培養基。 iii. 生產方法 1.  多株抗體
本發明之抗體可包含多株抗體。製備多株抗體之方法是技術人員所知的。多株抗體可通過一次或多次注入免疫劑及 (如果需要) 佐劑而在哺乳動物中產生。通常，通過多次皮下或腹膜內註射將免疫劑及/或佐劑注入哺乳動物中。免疫劑可包括人 KRas 或其融合蛋白。其可用於將免疫劑與已知在免疫的哺乳動物中具有免疫原性的蛋白質共軛。此等免疫原性蛋白質之實例包括但不限於鑰孔蟲血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用之佐劑的實例包括弗氏完全佐劑及 MPL-TDM 佐劑 (單磷醯基脂質 A、合成海藻糖二黴菌酸酯)。免疫方案可以由本領域之技術人員選擇而無需過多實驗。然後可採集哺乳動物血樣，並測定血清中抗 KRas 抗體效價。如果需要，可提高哺乳動物之免疫力，直至抗體效價增加或達到平台區。 2.  單株抗體
本發明之抗體可替代地是單株抗體。單株抗體可使用首先由 Kohler 等人在 Nature，256:495 (1975) 中描述的雜交瘤方法進行製備，或可以藉由重組 DNA 方法進行製備 (參見例如美國專利第 4,816,567 號)。
在雜交瘤方法中，如上所述對小鼠或其他適當的宿主動物 (如倉鼠) 進行免疫接種，以誘導產生或能夠產生與免疫蛋白質特異性結合之抗體的淋巴細胞。可替代地，可以在活體外免疫淋巴細胞。免疫後，分離淋巴細胞，然後使用合適的融合劑 (如聚乙二醇) 將其與骨髓瘤細胞系融合，以形成雜交瘤細胞 (Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第 59-103 頁 (Academic Press, 1986))。
將由此製備的雜交瘤細胞接種，並在合適的培養基中生長，該培養基包含一種或多種抑制未融合之親代骨髓瘤細胞生長或生存的物質 (亦稱為融合蛋白伴侶)。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (HGPRT 或 HPRT)，則用於雜交瘤之選擇性培養基通常包括次黃嘌呤、胺蝶呤及胸苷 (HAT 培養基)，該等物質阻止 HGPRT 缺陷細胞之生長。
融合蛋白伴侶骨髓瘤細胞是高效融合的細胞，其支持被選抗體產生細胞穩定地高水平產生抗體，並對選擇未融合的親代細胞的選擇性培養基敏感。骨髓瘤細胞是鼠骨髓瘤系，如可得自美國加利福尼亞大學聖地牙哥的 Salk Institute Cell Distribution Center 的 MOPC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤，及 SP-2 及衍生物，例如可得自美國弗吉尼亞州馬納薩斯市的 American Type Culture Collection 的 X63-Ag8-653 細胞。還描述了用於人單株抗體的生產的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系 (Kozbor，J. Irnmunol.，133:3001 (1984)；及 Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
測定雜交瘤細胞在其中生長的培養基針對抗原的單株抗體的產生。雜交瘤細胞產生的單株抗體的結合特異性可藉由免疫沉澱或活體外結合測定法 (如放射免疫測定 (RIA) 或酶聯免疫吸附測定 (ELISA)) 來確定。單株抗體之結合親和力可例如藉由 Munson 等人在 Anal. Biochem.，107:220 (1980) 中所述之 Scatchard 分析方法進行確定。
一旦鑑定出產生具有所需之特異性、親和力及/或活性之抗體的雜交瘤細胞，即可藉由有限稀釋方法將殖株亞選殖，並藉由標準方法使其生長 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第 59-103 頁 (Academic Press, 1986))。用於此目的的合適培養基包括例如 D-MEM 或 RPMI-1640 培養基。另外，藉由將細胞腹腔注射到小鼠體內，雜交瘤細胞可以在動物體內作為腹水腫瘤進行活體內生長。
藉由常規抗體純化方法，如親和層析法 (例如，使用蛋白 A 或蛋白 G-Sepharose) 或離子交換層析法、氫氧磷灰石層析法、凝膠電泳、透析等，適當地將亞選殖分泌之單株抗體與培養基、腹水或血清分離。
編碼單株抗體是之 DNA 可使用常規方法 (例如，藉由使用能夠與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並測序。利用雜交瘤細胞作爲此等 DNA 的來源。分離後，可將 DNA 放入表現載體中，然後將其轉染到宿主細胞 (如大腸桿菌細胞、猴 COS 細胞，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或不另外產生抗體蛋白的骨髓瘤細胞)，以獲得重組宿主細胞中單株抗體之合成。有關編碼抗體之 DNA 的細菌中之重組表現的綜述文章包括：Skerra 等人，Curr. Opinion in Immunol.，5:256-262 (1993)；及 Pliickthun，Immunol. Revs.130:151-188 (1992)。
在一進一步實施例中，可從使用 McCafferty 等人在 Nature，348:552-554 (1990) 中描述的技術生成的抗體噬菌體庫中分離單株抗體或抗體片段。Clackson 等人，Nature, 352:624-628 (1991) 及 Marks 等人，J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) 分別描述了使用噬菌體庫分離鼠和人抗體的方法。後續出版物描述了藉由鏈改組 (Marks 等人，Bio/Technology，10:779-783 (1992)) 產生高親和力 (處於 nM 範圍內) 人抗體以及組合感染和活體內重組作為構建非常大之噬菌體庫的策略 (Waterhouse 等人，Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))。因此，這些技術是用於分離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術的可行之替代方法。
原則上，藉由篩選包含噬菌體的噬菌體庫來選擇合成抗體殖株，該噬菌體展示與噬菌體外殼蛋白融合之抗體可變區 (Fv) 的各種片段。篩選此等噬菌體庫中所需的抗原。表達能夠與所需抗原結合之 Fv 片段的殖株被吸附，從而與文庫中之非結合殖株分離。然後將結合殖株從抗原上洗脫，並可藉由額外之抗原吸附/洗脫循環進一步富集。
可變域可功能性地展示於噬菌體上，既可以是單鏈 Fv (scFv) 片段，其中 VH 及 VL 藉由短而柔軟的肽共價連接，也可以是 Fab 片段，其中它們各自融合至恆定域並且非共價交互，如 Winter 等人在 Ann. Rev. Immunol.，12: 433-455 (1994) 中所述。
可藉由聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 分別選殖 VH 和 VL 基因庫，並在噬菌體庫中隨機重組，然後可按照以下文獻所述之方法搜索抗原結合殖株：Winter 等人，Ann. Rev. Immunol.，12: 433-455 (1994)。來自免疫源的庫無需構建雜交瘤即可向免疫原提供高親和力抗體。可替代地，可以在不進行任何免疫的情況下選殖天然譜系以向各種非自身及自身抗原提供人抗體的單一來源，如 Griffiths 等人在 EMBO J，12: 725-734 (1993) 中所述。最後，還可以透過選殖幹細胞中未重排的 V 基因片段，並使用包含隨機序列的 PCR 引子來編碼高變異性 CDR3 區域並在活體外完成重排，由此合成天然文庫，如 Hoogenboom 和 Winter 在 J. Mol. Biol.，227: 381-388 (1992) 中所述。
文庫之篩選可藉由本領域已知的各種技術完成。例如，人 KRas 可用於塗布吸附板的孔，在附著於吸附板的宿主細胞上表達或用於細胞分選，或與生物素共軛以藉由鏈黴親和素塗布的珠捕獲，或用於淘洗展示文庫的任何其他方法中。
具有緩慢解離動力學 (及良好的結合親和力) 之抗體的選擇可藉由使用長時間洗滌和單價噬菌體展示 (如以下文獻所述：Bass 等人，Proteins，8: 309-314 (1990)；及 WO 92/09690) 及低塗布密度之抗原 (如以下文獻所述：Marks 等人，Biotechnol.，10: 779-783 (1992)) 得到促進。
藉由設計合適的抗原篩選方法以選擇所關注之噬菌體殖株，然後使用來自所關注之噬菌體殖株的 Fv 序列和合適的恒定區 (Fc) 序列來構建全長抗 KRas 抗體殖株而獲得本發明的抗 KRas 抗體之任意者，如以下文獻所述：Kabat 等人，Sequences of Proteins of lmmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷。 3.  構形特異性抗 KRas 抗體之選擇
本文所提供之方法可用於篩選與人 KRas 之某些構形結合之抗體。在一個實施例中，該等方法可用於篩選以比與 KRasG12C -GTP 結合更高的親和力來與 KRasG12C -GDP 結合之抗體。例如，該方法可包括：(a) 使包含 i) KRasG12C -GDP、ii) 烷基化 KRasG12C -GDP 及 iii) KRasG12C 的抗體庫與非可水解之 GTP 類似物結合；及 (b) 選擇以比與非可水解之 GTP 類似物結合之 KRasG12C 更高的親和力來與烷基化 KRasG12C -GDP 和未烷基化 KRasG12C -GDP 結合之抗體。
例如，可使用活體外選擇策略，其中使用不同構形的合成抗體庫及人 KRasG12C 。例如，可使用烷基化或未烷基化且與 GDP 結合的 KRasG12C ，及與 GMPPcp (非可水解之 GTP 模擬物) 結合之未烷基化 KRasG12C 。可執行生物淘洗，其中在包含經 GNE-1952 (小分子 G12C 抑制劑) 烷基化之生物素化 KRasG12C -GDP 之溶液中孵育合成噬菌體庫 (Li Liansheng 等人，WO2017058768A1)。可使用其他小分子 (如 ARS-853 及 ARS-1620) 以共價結合 Cys12，並由此將 KRasG12C 鎖定為開放 SWII 構形。為推動選擇烷基化 KRasG12C -GDP 之獨特構形，可以在溶液中存在過量非生物素化 KRasG12C -GDP 及 KRasG12C -GMPPcp 的情況下進行選擇。因此，由於 KRasG12C -GDP 可經過生物素化並收集，可富集針對開放構形 KRasG12C -GDP+ GNE-1952 而非 KRasG12C -GDP 及 KRasG12C -GMPPcp 具有特異性的抗體。
可執行構形特異性抗 KRas 抗體選擇，例如使用現有之合成 Fab 噬菌體展示文庫來執行 (C. V. Lee 等人，J Mol Biol 2004;340:1073-1093；W. C. Liang 等人，J Mol Biol 2007; 366:815-829)。合併之文庫可以在溶液中與生物素化 KRasG12Ci -GDP+GNE1952 (濃度範圍從最初的 500 nM 降至 10 nM) 循環結合三至四輪。可以將溶液捕獲在 NeutrAvidin 珠 (Promega) 上，用 5 μM 生物素將其封閉，在 PBS + 0.5% BSA + 0.1% Tween 20 (PBSBT) 中洗滌 3 次，每次 30 秒，並用 100 mM HCl 進行洗脫。可以將洗脫後之噬菌體用 1M TRIS-HCl pH 8.0 中和，然後在大腸桿菌 XL1-blue (Stratagene) 中擴增過夜，並添加 M13-KO7 輔助噬菌體 (New England Biolabs)。為富集特異性結合至烷基化 KRasG12C 的結合物，可以在存在 1 μM 過量可溶性 KRasG12C -GDP 或 KRasG12C -GMPPcp 的條件下進行選擇。選擇後，可以挑選單個菌落，並於 30˚C 下在 96 孔深孔板中補充有卡本西林及輔助噬菌體的 2xYT 培養基中生長過夜。噬菌體上清液可用於針對 KRasG12Ci -GDP+GNE1952、KRasG12C -GDP 及 KRasG12C -GMPPcp 之噬菌體 ELISA 中，以鑑定構形特異性 KRas 標靶具有特異性的殖株。 iv.  重組方法和組成物
可使用重組方法和組成物來生產抗體，例如美國專利第 4,816,567 號中所述。在一個實施例中，提供了編碼本文所述之抗 KRas 抗體之分離核酸。此等核酸可編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體之 VH 之胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一進一步實施例中，提供一個或多個包含此等核酸之載體 (例如，表現載體)。在一進一步實施例中，提供包含此等核酸之宿主細胞。在此等實施例中，宿主細胞包含 (例如，已轉化)：(1) 包含核酸之載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列及包含抗體之 VH 之胺基酸序列，或 (2) 包含核酸之第一載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列及包含核酸之第二載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列。在一個實施例中，宿主細胞是真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如 YO、NSO、Sp20 細胞)。在一個實施例中，提供了一種製備抗 KRas 抗體之方法，其中該方法包括在適合於抗體表現的條件下培養包含上文所提供之編碼抗體的核酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收該抗體。
在重組生產抗 KRas 抗體時，將例如如上所述之編碼抗體之核酸分離並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可使用常規方法 (例如，藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並測序。
適用於克隆或表達編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效應功能的情況下。有關抗體片段和多肽在細菌中之表現，參見例如美國專利第 5,648,237、5,789,199 和 5,840,523 號。(另見 Charlton，Methods in Molecular Biology，第 248 卷 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可與可溶性部分中的細菌細胞糊分離，並可經過進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的抗體編碼載體的選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人醣基化模式的抗體的產生。參見：Gerngross，Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)；及 Li 等人，Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。
用於表現醣基化抗體的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda ) 細胞。植物細胞培養物也可以用作宿主。參見例如美國專利第 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 號 (描述了在基因轉殖植物中生產抗體的 PLANTIBODIES™ 技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。可用之哺乳動物宿主細胞系的其他實例是被 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV 1 系；人胎腎系 (如以下文獻中所述之 293 或 293 細胞，例如：Graham 等人，J Gen Viral.36:59 (1977)；幼倉鼠腎細胞 (BHK)；小鼠足細胞 (如以下文獻中所述之 TM4 細胞，例如 Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)；猴腎細胞 (CV l)；非洲綠猴腎細胞 (VER0-76)；人子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MOCK；水牛鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep 02)；小鼠乳腺瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞，如以下文獻中所述：例如 Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFK CHO 細胞 (Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如 YO、NSO 及 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如：Yazaki 和 Wu，Methods in Molecular Biology，第 248 卷 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa, NJ)，第 255-268 頁 (2003)。 v.   分析
可用此領域中所公知的各種分析法對本文所提供之抗 KRas 抗體的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑定、篩選或表徵。 1.結合分析及其他分析
在一個方面，測試本發明之抗體之抗原結合活性，例如藉由已知方法如 ELISA、西方墨點法等實現。結合親和力可藉由本領域中已知的常用方法進行測量。在一個實施例中，藉由用 Fab 形式的抗體和抗原分子執行的放射性標記的抗原結合測定法 (RIA) 來測量抗體之 KD ，其如以下測定法所述：藉由在存在一系列未標記抗原的滴定的情況下，以最小濃度 (125 I) 標記的抗原平衡 Fab；然後用抗 Fab 抗體塗布的板捕獲結合的抗原來測量 Fab 與抗原之結合親和力 (Chen 等人，(1999) J. Mol. Biol 293:865-881)。為了建立檢定條件，將微量滴定板 (Dynex) 用在 50 mM 碳酸鈉 (pH 9.6) 中的 5 μg/ml 捕獲抗 Fab 抗體 (Cappel Labs) 塗覆過夜，然後用在室溫 (大約 23℃) 下，用在 PBS 中 2% (w/v) 的牛血清白蛋白封閉兩至五小時。在非吸附板 (Nunc #269620) 中，將 100 pM 或 26 pM [125I]-抗原與所關注之 Fab 的連續稀釋液混合 (與 Presta 等人在 (1997) Cancer Res. 57:4593-4599 中之抗 VEGF 抗體 Fab-12 的評估結果一致)。隨後將所關注 Fab 孵育過夜；然而，孵育可持續較長時間段 (例如 65 小時) 以確保達到平衡。此後，將混合物轉移之捕獲板上，在室溫下孵育一小時。然後除去溶液，並用在 PBS 中的 0.1% Tween-20 將板洗滌八次。當板乾燥後，添加 150 μl/孔之閃爍劑 (MicroScint-20; Packard)，並利用 Topcount 伽瑪計數器 (Packard) 進行十分鐘計數。選擇提供小於或等於最大結合濃度的 20% 的各種 Fab 的濃度以用於競爭性結合測定中。
根據另一個實施例，使用表面電漿子共振測定法，使用 BIACORE®-2000 或 a BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)，在 25℃ 下，用固定抗原 CM5 晶片，在約 10 個反應單位 (RU) 下測量 KD 。在一些實施例中，根據供應商的說明，用 N-乙基-N'-(3-二甲胺丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 和 N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 活化羧甲基化聚葡萄醣生物感測器晶片 (CM5, BIAcore Inc.)。可以用例如 10 mM 醋酸鈉 (pH 4.8) 將抗原稀釋至約 3-10 μg/ml (例如 5 μg/ml (0.2 μM)) 的濃度，然後以 3-10 μL/分鐘 (例如 5 μL/分鐘) 的流速注入，以獲得大約 10 反應單位 (RU) 的偶合蛋白。注入抗原後，可注入乙醇胺 (例如 1 mM) 以封閉未反應的基團。在動力學測量中，將 Fab (如本文所述的那些) 之兩倍連續稀釋液 (濃度是例如 0.78 nM 至 500 nM) 在 25℃ 下注入含 TWEEN 20™ 界面活性劑 (PBST) (例如 0.05%) 的 PBS 中。注入流速可以是約 10-50 μL/min (例如 25 μL/min)。可藉由同時擬合結合和解離感測圖，使用例如一對一 Langmuir 結合模型 (BIAcore® 評估軟體版本 3.2) 計算結合速率 (kon ) 及解離速率 (koff )。平衡解離常數 (KD ) 可透過 koff /kon 比率計算得出。參見例如 Chen 等人，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。如果藉由上述表面電漿子共振測定法測得的結合率 (on-rate) 超過 106 M− 1 s− 1 ，則可以使用螢光淬滅技術確定結合率，該技術可測量 25℃ 下在例如 PBS (pH 約 6.8-7.5，例如 7.2) 中濃度為 10-50 nM (例如 20 nM) 的抗原抗體 (Fab 形式) 的螢光發射強度的增加或減少 (例如，激發波長 = 295 nm；發射波長 = 340 nm，帶通 16 nm)。可在存在濃度增加的抗原的情況下進行該測量，該抗原濃度可藉由分光計如停流分光光度計 (Aviv Instruments) 或帶有攪拌比色皿的 8000 系列 SLM-AMINCO™ 分光光度計 (ThermoSpectronic) 測得。
在另一方面，競爭測定法可用於鑑定與本文所述之抗 KRas 抗體中之任一項競爭結合人 KRas 的另一種抗 KRas 抗體。在某些實施例中，此等競爭抗體結合至 KRas 之同一抗原決定基 (例如，線性或構形抗原決定基)。用於將抗原決定基映射至抗體結合的詳細示例性方法提供於 Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」 (在 Methods in Molecular Biology vol. (Humana Press, Totowa, NJ) 中)。
在一種示例性競爭測定中，將固定化人 KRas 蛋白質置於包含與 KRas 結合之第一標記抗體 (例如，第一標記抗 KRas 抗體) 及第二未標記抗體 (例如，第二未標記抗 KRas 抗體，正在測試其與第一抗體競爭與 KRas 結合的能力) 的溶液中進行孵育。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，將固定化 KRas 置於包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體的溶液中進行孵育。在允許第一抗體與 KRas 結合的條件下孵育後，去除過量的未結合抗體，並測量與固定化 KRas 相關聯之標記的含量。如果測試樣品中與固定化 KRas 相關的標記的數量相對於對照樣品而言明顯減少，則表明第二抗體正在與第一抗體競爭與 KRas 的結合。參見 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。也可以使用轉染有 KRas 並在細胞表面表現的細胞，按照上述方法用 FACS 進行競爭測定。另外，ELISA 與 KRas 也可用於競爭測定中。
在另一方面，可使用凝膠遷移率測定法鑑定本發明之抗 KRas 抗體與目標蛋白質 (如人 KRas) 之間的交互作用。在一個示例性凝膠遷移率測定中，用抗 KRas 抗體預孵育人 KRas。經預孵育之 KRas 及未經抗 KRas 抗體預孵育之對照 KRas 經凝膠電泳測定，並以二抗作爲探針。比較經預孵育之 KRas 及 KRas 的遷移率，其中經預孵育之 KRas 與對照 KRas 之間的遷移率差異指示 KRas 與抗 KRas 抗體之間的交互作用。 2.  晶體結構
在一些實施例中，解析與人 KRas 複合的本發明之抗 KRas 抗體的晶體結構。例如，可在複合物中純化並晶化 KRas 及抗 KRas 抗體，並可藉由 X 射線結晶學方法測定其結構。B. 使用抗 KRas 抗體之方法
在某些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於偵測生物樣品中是否存在 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas。在某些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量樣品中之 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量樣品中之 KRasG12C 、KRasG12C -GDP 及/或烷基化 KRasG12C 。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasG12V 或 KRasG12V -GDP。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasG12R 或 KRasG12R -GDP。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasG12D 或 KRasG12D -GDP。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasG13D 或 KRasG13D -GDP。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasQ61H 或 KRasQ61H -GDP。
在某些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於偵測生物樣品中是否存在 KRas、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas。在某些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量樣品中之 KRas、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量樣品中之 KRasG12C 、KRasG12C -GTP 及/或烷基化 KRasG12C 。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasG12V 或 KRasG12V -GTP。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasG12R 或 KRasG12R -GTP。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasG12D 或 KRasG12D -GTP。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasG13D 或 KRasG13D -GTP。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中之任一項用於定量 KRasQ61H 或 KRasQ61H -GTP。
在一個方面，本文提供了測量本文所述之一種或多種 KRas 抑制劑與 KRas 蛋白質 (例如 KRasG12C ) 之標靶嚙合的方法。在一個實施例中，該方法包括：(a) 從本文所述之患者獲得樣品 (例如本文所述之腫瘤樣品)；(b) 使該樣品與本文所述之抗 KRas 抗體或其抗原結合片段接觸；及 (c) 測量由抗 KRas 抗體結合之 KRas 的水平。在一個此等實施例中，KRas 抑制劑是 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157。
在一些實施例中，本文提供了測量本文所述之一種或多種 KRas 抑制劑與 KRas 蛋白質 (例如 KRasG12C ) 之標靶嚙合的生物標誌物測定法。在一些此等實施例中，生物標誌物測定法在從接受一種或多種 KRas 抑制劑 (選自由下列所組成之群組：MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 及 JNJ-74699157) 治療的患者採集的臨床樣品的臨床環境下測量標靶嚙合。在一些此等實施例中，生物標誌物測定法用於確定投予此等患者的如本文所述之 KRas 抑制劑的劑量。
在某些實施例中，提供了帶標記的抗 KRas 抗體，該等抗體可用於偵測或定量如本文所述之 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas。標記包括但不限於直接偵測的標記或部分 (例如螢光、髮色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接偵測 (例如，透過酶促反應或分子交互作用) 的部分，例如酶或配體。示例性標記包括但不限於：放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H 及131 I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；鹼性蕊香紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利第 4,737,456 號)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；J3-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶偶合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。
在某些實施例中，提供了帶標記的抗 KRas 抗體，該等抗體可用於偵測或定量如本文所述之 KRas、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas。標記包括但不限於上文所述的那些。
在某些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中任一項用於在免疫測定中偵測是否存在 KRas，如 KRas-GDP 及/或烷基化 KRas，具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物用於在免疫測定中偵測是否存在 KRas、烷基化 KRasG12C 。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物用於偵測是否存在 KRas (如 KRas-GDP) 及/或與如本文所述之共價 KRas 抑制劑結合之 KRasG12D 或 KRasG13D 。
如下文所述，抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物可用於多種不同的測定中，包括但不限於 ELISA 及免疫組織化學。
在某些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物中任一項用於在免疫測定中偵測是否存在 KRas，如 KRas-GTP 及/或烷基化 KRas，具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 。在一些實施例中，如本文所提供之抗 KRas 抗體或包含此等抗體之組成物用於偵測是否存在 KRas (如 KRas-GTP) 及/或與如本文所述之共價 KRas 抑制劑結合之 KRasG12D 或 KRasG13D 。 i.    ELISA (酶聯免疫吸附測定)
在一些實施例中，抗 KRas 抗體用於在 ELISA 測定中以偵測是否存在 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 及/或其存在的含量。因此，本文提供了偵測 KRas、KRas GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRAS 之方法，該方法包括 ELISA 測定，其利用抗 KRas 抗體作爲 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 之捕獲試劑。在測定之第一步，使包含或疑似包含 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 的生物樣品與捕獲 (或外殼) 抗體接觸並孵育，使得捕獲抗體捕獲或結合至 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas，以便可在偵測步驟中進行偵測。偵測步驟涉及使用可偵測抗體，該抗體與 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 中之任一項接觸時，結合至 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (如果存在)。偵測手段用於偵測抗體上之標記，從而偵測是否存在 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 及其存在的含量。
在某些實施例中，該測定利用以下步驟。 第一步
在本文之測定的第一步，使包含或疑似包含 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 的生物樣品與固定化捕獲 (或外殼) 試劑接觸並孵育，該等試劑是抗 KRas 抗體。在一些實施例中，這些抗 KRas 抗體是單株抗體，並可來自任何物種。在一些實施例中，這些抗 KRas 抗體是囓齒動物抗體，在進一步實施例中是鼠或大鼠，且在另外的實施例中是鼠抗體。
在各種實施例中，抗 KRas 是本文所披露之任何抗 KRas 抗體。抗 KRas 抗體可以為本文所披露之 I 類抗體或 II 類抗體中之任一者。例如，在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:12)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:91)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:92)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:93)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:94)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:95)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:96)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:97)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:98)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:1)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:2)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 LQDHDYPLT (SEQ ID NO:3)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:4)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:5)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GFYVRNWFDP (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGISSYLA (SEQ ID NO:17)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:18)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQYYSYPFT (SEQ ID NO:19)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAMS (SEQ ID NO:20)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 AISSSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO:21)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 DQGGYGYPGESWFDY (SEQ ID NO:22)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQSISSYLN (SEQ ID NO:25)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:26)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQSYSPPWT (SEQ ID NO:27)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:28)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:29)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 AFYSYMDV (SEQ ID NO:30)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:33)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 LGSNRAS (SEQ ID NO:34)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 MQALQTPLT (SEQ ID NO:35)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:36)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:37)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 ERTILTGYYGFDY (SEQ ID NO:38)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:41)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:42)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGYV (SEQ ID NO:43)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:44)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:45)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:46)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:81)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:82)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDDSLSGWV (SEQ ID NO:83)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:84)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:85)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SFGPYAFDV (SEQ ID NO:86)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:49)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:50)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGWV (SEQ ID NO:51)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:52)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:53)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:54)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:57)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:58)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSSGNHWV (SEQ ID NO:59)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:60)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:61)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 TNNYGYRYFDY (SEQ ID NO:62)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:65)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:66)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSTDNHLWV (SEQ ID NO:67)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:68)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:69)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 ATSSGYYYFDY (SEQ ID NO:70)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:73)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:74)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDNSLSVWV (SEQ ID NO:75)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:76)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:77)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GKGIVGWGFFGMDV (SEQ ID NO:78)。
固定化慣常藉由在測定程序之前使捕獲試劑不溶來實現，例如藉由吸附至不溶於水之基質或表面 (美國專利第 3,720,760 號) 或非共價或共價偶合 (例如，使用戊二醛或碳二亞胺交聯，其經過或未經事先用例如硝酸和還原劑活化載體，如以下文獻所述：美國專利第 3,645,852 號；或 Rotmans 等人，J. Immunol. Methods, 57:87-98 (1983)) 或之後例如藉由免疫沉澱法使捕獲試劑不溶來實現。在一些實施例中，捕獲抗體共軛至生物素，並與鏈黴親和素塗布之表面結合。在其他實施例中，捕獲抗體共軛至蛋白質標記，如 His 標記或 GST，並與合適之表面 (例如鎳或銅塗布之表面或麩胺基硫塗布之表面) 結合。
用於固定化之固相可以為基本上不溶於水且可用於免疫測定的任何惰性載體或載劑，包括例如呈表面、顆粒、多孔基質等形式的載體。常用載體之實例包括小片、SEPHADEX® 凝膠、聚氯乙烯、塑料珠及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等製成的測定板或試管，包括 96 孔微量滴定板以及顆粒材料，如濾紙、瓊脂糖、交聯之聚葡萄醣和其他多醣。可替代地，適合採用美國專利第 3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；及 4,330,440 號中所述之反應性水不溶性基質 (如溴化氰活化之碳水化合物和反應性受質) 使捕獲試劑固定化。在一些實施例中，將固定化捕獲試劑塗布於微量滴定板上。在一些實施例中，所用之固相是可同時分析多個樣品之多孔微量滴定板，例如 MICROTEST™ 或 MAXISORP™ 96 孔 ELISA 板，如作為 NUNC MAXISORB™ 或 IMMULONTTM 出售之板。
固相塗佈有如上文所定義之捕獲試劑，其可以根據需要藉由非共價或共價交互作用或物理鍵連接。附接技術包括美國專利第 4,376,110 號及其中引用之參考文獻中所描述的那些。如果是共價的，則將板或其他固相與交聯劑以及捕獲試劑一起在本領域眾所周知的條件下孵育，如在室溫下孵育一小時。
用於將捕獲試劑接附至固相受質的常用交聯劑包括例如：1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如與 4-疊氮水楊酸酯的酯；同雙官能醯亞胺酯，包括二琥珀醯亞胺酯，如 3,3'-二硫代雙(琥珀醯亞胺丙酸酯)，及雙官能馬來亞醯胺，如雙-N-馬來亞醯胺-1,8-辛烷。衍生劑 (如3-((對疊氮基苯基)-二硫代) 丙亞胺酸甲酯) 產生可光活化之中間體，該等中間體能夠在光的存在下形成交聯。
如果利用 96 孔板，則可以藉由孵育至少約 10 小時，用通常在緩衝液 (如 0.05 M 碳酸鈉) 中稀釋的捕獲試劑之混合物對其進行塗布。在一些實施例中，在約 4-20℃ 或約 4-8℃ 的溫度及約 8-12、約 9-10 或約 9.6 的 pH 下，至少孵育過夜。如果需要更短的塗布時間 (1-2 小時)，則可以使用帶有硝酸纖維素濾膜底部的 96 孔板 (Millipore MULTISCREEN™) 或在 37℃ 的溫度下進行塗布。可以將板堆疊並長時間塗布後進行測定，然後可通過手動、半自動或自動方式 (如使用機器人) 對多個樣品同時進行測定。
然後通常將經塗布之板用封閉劑處理，該封閉劑非特異性結合至結合位點並使其飽和，以防止游離配體不必要地結合至板孔上的過量位點。針對此目的合適的封閉劑的實例包括例如明膠、牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白及脫脂牛奶。封閉處理通常在環境溫度條件下進行約 1-4 小時，或約 1.5 至 3 小時。
塗布並封閉後，將待分析 (經過適當稀釋) 之標準品 (純化後之 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas) 或生物樣品加入固定相中。在某些實施例中，稀釋率是約 5 體積%-15 體積% 或約 10 體積%。可用於此目的之緩衝液包括 (a) 含 0.5% BSA、0.05% TWEEN 20TM detergent (P20)、0.05% PROCLINTM 300 抗生素、5 mM EDTA、0.25%3-((3-膽醯胺丙基)二甲基銨)-1-丙磺酸鹽 (CHAPS) 界面活性劑、0.2% β-γ 球蛋白及 0.35M NaCl 之磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS)；(b) 含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA)、0.05% P20 及 0.05% PROCLIN™ 300 之 PBS (pH 7)；(c) 含 0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLINTM 300、5 mM EDTA 及 0.35 M NaCl 之 PBS (pH 6.35)；(d) 含 0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLIN™ 300、5 mM EDTA、0.2% β-γ 球蛋白及 0.35 M NaCl 之 PBS；及 (e) 含 0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLIN™ 300、5 mM EDTA、0.25% CHAPS 及 0.35 M NaCl 之 PBS。PROCLIN™ 300 用作防腐劑，並以 TWEEN 20TM 用作清潔劑，以消除非特異性結合。
所採用之捕獲試劑之含量足夠大，相比於標準品可產生良好的信號，但與樣品中之 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 之最大預期水平相比未發生莫耳過剩。在某些實施例中，添加之生物樣品的含量使得固定化捕獲試劑相比於預期之經過適當稀釋後之生物樣品中游離 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 之最大莫爾濃度發生莫耳過剩。此預期水平主要取決於在患者之臨床條件下分析的特定生物樣品中之游離 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H )之濃度水平之間任何已知的相關性。因此，例如，成年患者在其血清中可具有相當高之游離 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 之最大預期濃度，而基於給予之劑量，預期兒童患者在其血清中具有較低水平之游離 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H )。
捕獲試劑之濃度可藉由 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H )之所關注濃度來測定，其中考慮到任何必要之生物樣品之稀釋。捕獲試劑之最終濃度也可以根據經驗確定，以在所關注之範圍內最大程度提高測定之靈敏度。通常，莫耳過剩適於低於生物樣品中經任何適當之樣品稀釋後 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 之最大預期莫爾濃度之約十倍。
樣品及固定化捕獲試劑之孵育條件選擇爲最大程度地提高測定之靈敏度並最大程度減小解離，並確保樣品中存在之任何 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 與固定化之捕獲試劑結合。孵育是在約 0℃ 至約 40℃ 範圍內之相當恆定的溫度下進行，例如在室溫下或約室溫下進行。孵育時間通常不超過約 10 小時。在各種實施例中，在室溫下或約室溫下，孵育時間是約 0.5 之 3 小時或約 1.5-3 小時，以最大程度提高 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 與捕獲試劑之結合。如果添加蛋白酶抑制劑以防止生物流體中之蛋白酶降解 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H )，則孵育持續時間可以更長。
在此階段，孵育混合物之 pH 通常在約 4-9.5 的範圍內，或在約 6-9 的範圍內，或是約 7 至 8。選擇孵育緩衝液之 pH，以保持捕獲試劑與所捕獲之 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 之間顯著的特異性結合水平。在此步驟中，可採用各種緩沖液以達到並保持所需之 pH，包括硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、TRIS-HCl 或 TRIS-磷酸鹽、醋酸鹽、巴比妥等。所採用之特定緩衝液對於本發明并非至關重要，但是在單獨測定中，一種緩衝液可能優於另一種。 可選之第二步
在測定方法之可選之第二步，將生物樣品與固定化捕獲試劑分離 (例如藉由洗滌)，以去除未捕獲之 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas。用於洗滌之溶液通常是緩衝液 (「洗滌緩衝液」)，其 pH 使用考慮因素及孵育步驟之上述緩衝液測得，pH 範圍是約 6-9。洗滌可進行三次或三次以上。洗滌之溫度通常是從冰箱到適中之溫度，並在測定期間保持恆定之溫度，通常是約 0-40℃ 或約 4-30℃。例如，在洗滌前將洗滌緩衝液在 4℃ 下置於貯藏器的冰中，並可以將洗板機用於此步驟。如果存在捕獲之 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 可能在後續步驟中發生某種程度之解離之擔憂，也可以在此階段添加交聯劑或其他合適的試劑，以使目前結合之 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 共價接附於捕獲試劑。 第三步
在下一步，使存在的具有任何結合之 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 的固定化捕獲試劑與可偵測抗體在約 20-40℃ 或約 36-38℃ 的溫度下接觸，其中接觸兩者的確切溫度和時間主要取決於所採用之偵測手段。例如，當使用 4-甲基傘形基-β-半乳糖苷 (MUG)、鏈黴親和素-HRP 或鏈黴親和素-β-半乳糖苷酶作為偵測手段時，可以過夜接觸 (例如，約 15-17 小時或更長時間)，以將信號放大至最大。儘管可偵測抗體可以是多株抗體或單株抗體，但其較佳地是單株抗體，以減小背景噪音。在一些實施例中，在測定法中利用相同的抗 KRas 抗體進行塗布及偵測。在其他實施例中，可使用不同的抗 KRas 抗體塗布及偵測，其選擇爲使得背景噪音最大程度降低。
在一些實施例中，可偵測抗體是來自非人物種之抗體，該抗體與人抗體結合。在一些實施例中，可偵測抗體是抗 huIgG Fc 抗體。在一些實施例中，可偵測抗體是小鼠抗 huIgG Fcγ 抗體。在一些實施例中，可偵測抗體可直接偵測。在某些實施例中，可偵測抗體經生物素化。在此等情況下，生物素化標記之偵測手段可以是抗生物素蛋白或鏈黴親和素-HRP，且偵測手段之讀數可以是螢光測定法或比色法。在一些實施例中，抗體共軛至 HRP，且偵測手段是比色法。
洗滌後，將相對於最大濃度的預期之游離 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (如上文所述) 的莫耳過剩之可偵測抗體加入板中。儘管可採用任何抗體，但是該抗體 (可直接或間接偵測) 是單株抗體。可偵測抗體之親和力必須足夠高，以使少量之游離 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 可偵測，但不得高至引起 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 從捕獲試劑中拉出。 第四步
在該測定方法之最後一步，使用用於可偵測抗體的偵測手段，測量樣品中目前與捕獲試劑結合之任何游離 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 的水平。如果生物樣品來自臨床患者，則測量步驟包括將上述三個步驟產生的反應與標準曲線進行比較，以測定 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 相比於已知含量之水平。
加入固定化捕獲試劑中之抗體將被直接標記，或藉由在洗掉過量之第一抗體後加入莫耳過剩之第二標記抗體來間接偵測，該第二標記抗體靶向第一抗體之動物物種之 IgG。在後者間接測定中，將針對第一抗體之帶標記的抗血清加入樣品中，以便原位產生標記抗體。
用於第一或第二抗體之標記是任何可偵測功能，該等任何可偵測功能不干擾游離 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 與抗 KRas 抗體之結合。
合適的標記之實例是已知用於免疫測定的眾多標記，包括可直接偵測之部分，如螢光染料、化學發光標記和放射性標記及必須反應或衍生化以偵測的部分 (如酶)。此等標記之實例包括放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H 及131 I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；鹼性蕊香紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利第 4,737,456 號)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；HRP；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶偶合使用；生物素 (可藉由例如抗生物素蛋白、鏈黴親和素、鏈黴親和素-HRP 及鏈黴親和素-β-半乳糖苷酶與 MUG 進行偵測)；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。
可使用常規方法將這些標記共價結合至蛋白質或多肽。例如，可使用偶合劑 (如二醛類、碳二亞胺、二馬來亞醯胺、雙亞氨酸酯、雙重氮化聯苯胺等) 以標記具有上述螢光、化學發光和酶標記之抗體。參見例如：美國專利第 3,940,475 號 (螢光測定法) 及美國專利第 3,645,090 號 (酶)；Hunter 等人，Nature，144:945 (1962)；David 等人，Biochemistry，13:1014-1021 (1974)；Pain 等人，J. Immunol. Methods，40:219-230 (1981)；及 Nygren，J. Histochem. and Cytochem.，30:407-412 (1982)。
此等標記 (包括酶) 與抗體相共軛為免疫體測定技術領域之普通技術人員所知之標準操作方法。參見例如：O’Sullivan 等人，「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay」，出自 Methods in Enzymology，J. J. Langone 及 H. Van Vunakis 主編，第 73 卷 (Academic Press, New York, New York, 1981)，第 147-166 頁。也可使用合適的市售的之帶標記的抗體。
添加最後標記的抗體後，通過洗滌除去過量之未結合的標記抗體，然後使用適合該標記的偵測方法測量接附之標記的含量，並將實測量與生物樣品中 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 的含量相關聯，從而測得結合抗體之含量。例如，在酶的情況下，形成並測量的顏色量將為存在的 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 之含量的直接測量指標。具體地，如果 HRP 是標記，則可以使用受質 TMD，使用 450 nm 讀數波長及 620 nm 或 630 nm 參比波長偵測顔色。
在一個實例中，在從固定相中洗滌出靶向第一未標記抗體的酶標記之第二抗體後，藉由將固定化捕獲試劑與酶的受質一起孵育來形成並測量顏色或化學發光。然後藉由與標準 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 并行運行所生成之顏色或化學發光進行比較，計算出 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 之濃度。 ii.   免疫組織化學 (IHC)
在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體用於在免疫組織化學 (IHC) 中偵測 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas，具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 。因此，在一些實施例中，本文提供了使用免疫組織化學偵測組織樣品中之 KRas (如 KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas) 的方法。免疫組織化學 (IHC) 通過使用直接標記 (直接 IHC) 或間接標記 (間接 IHC) 之結合域 (如抗 KRas 抗體)，來定位組織切片中的標靶 (例如抗原，如 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas) 及/或展現標靶之細胞亞群，其中結合域與其標靶通過特異性靶向—結合域交互作用反應。然後通過所提及之標記實現這些交互作用之可視化。
設想在本發明之方法的一些實施例中，該免疫組織化學法的特徵在於以下步驟： (a) 提供工具 (例如載玻片)，該工具包括該組織樣品，該組織樣品包含細胞亞群，及/或該細胞亞群，結合域 (例如，抗 KRas 抗體) 以與該細胞亞群結合； (b) 視情況固定該組織樣品； (c) 視情況使該組織樣品脫水； (d) 視情況使組織樣品被石蠟化； (e) 直接或間接偵測結合域 (例如，抗 KRas 抗體)，並由此偵測細胞亞群。
「固定」或「固定方法」意指一種固定程序，該固定程序適用於為隨後之 IHC 程式製備包含該細胞亞群的標靶/細胞亞群/組織樣品。特別執行「固定」，以便確保組織結構及細胞形態得以保存。合適的固定條件為眾所周知的，並且也在本文中披露。可替代地，還設想藉由超低溫冷凍 (例如在液氮中) 保存組織/亞群。
所有以上預處理步驟/措施均在術語「固定」的範圍內，即，固定具體包括：用甲醛、多聚甲醛等固定劑固定；及/或對組織樣品/細胞亞群進行超低溫冷凍；及/或視情況也將組織/細胞亞群包埋入石蠟或類似試劑中。必須理解，本發明之要旨在於以下令人驚訝的發現，即在展現該標靶之組織/亞群等經過固定程序處理之前允許結合域 (例如對標靶具有特異性之初級抗體) 結合至其標靶為有利的，因爲固定程序可能影響標靶之含量及/或質量，從而以不希望的方式改變結果。
組織/亞群也可以被石蠟化 (通常在固定之後)。
將不同 IHC 方案付諸實踐的手段和方法為本領域技術人員眾所周知的，並且已經且將會/可能適應於所關注之特定組織/細胞亞群/標靶，而無需費力。 iii.  表面電漿子共振
在一個實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段可有利於鑑定新化學物質及/或開發化學物質以生產如本文所述之候選藥物。在一個實施例中，如本文所述，打開及/或穩定 KRas 之 SWII 袋。在一個實施例中，打開及/或穩定 KRas 之 SWII 袋可提高以更高的親和力結合化合物的可能性，其繼而允許偵測更高比例之弱結合化合物。在實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段可能不提高化合物結合之親和力，而是使 KRas 構形穩定。
表面電漿子共振 (SPR) 或各種形式之表面乾涉測量法在感測表面上產生光衰減場，該光衰減場藉由監測靠近感測表面之平均折射率之相關變化，對感測表面上之生物分子的累積敏感。該衰減場從表面移開後呈指數衰減，並限定了表面的折射率敏感深度。通常，該衰減場之穿透深度為 200-300 nM，可提供三維探測體積，其藉由使用結合之水凝膠來支持雙分子複合物的形成得到充分利用，而水凝膠塗布之感測器晶片可廣泛獲得。
水凝膠可藉由以下方法形成：將多醣鏈 (例如線性的，但一些分支也可接受) 化學接枝到平坦表面上，以形成從感測表面延伸 10-200 nm 的水凝膠。在一個實施例中，這些鏈被衍生為包含反應性基團，使目標分子與水凝膠偶合。在一個實施例中，標靶可以在水凝膠中以 20-50 mg/ml 的濃度偶合，但可能高於和低於此限值 5 倍。所獲得的反應與所結合之分子的分子體積、存在的目標分子的數量以及分子與周圍緩衝液之間的折射率對比成正比。
在一個方面，本文提供了測量 KRas 抑制劑化合物與本文所述之 KRas 突變型的結合之生物感測表面。在一個實施例中，表面預結合至本文所述之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本文提供了測量化合物與本文所述之 KRas 突變型的結合之生物感測表面，其中： 生物感測表面包含水凝膠，其中 KRas 蛋白質及本文所述之抗體或其抗原結合片段共定位於該水凝膠中； KRas 蛋白質及抗體或其抗原結合片段在水凝膠內具有足夠之自由度以相互嚙合以形成親和複合物； 其中 KRas 蛋白質及抗體或其抗原結合片段之局部濃度超出解離親和力常數至少 10 倍，其中局部濃度促進親和複合物之形成； 其中未結合 KRas 蛋白質及抗體或其抗原結合片段之比例小於約 50%； 其中將 KRas 抑制劑化合物注射在生物感測表面上至少 5 秒；以及 其中 KRas 抑制劑化合物與抗體或其抗原結合片段的結合是在至少一個感測通道上測量的。
在該表面的一個實施例中，未結合 KRas 蛋白質及抗體或其抗原結合片段之比例小於約 40%、30%、25%、20% 或 10%。
在一些實施例中，水凝膠之厚度是約 10 nm-500 nm、10 nm-300 nm、10 nm-250 nm 或約 10 nm-200 nm。在一些實施例中，水凝膠包含鏈黴親和素。
在一個實施例中，KRas 蛋白質經生物素化。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasG12C 。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasG12D 。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasG12V 。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasG12C 。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasG12R 。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasG13D 。在一些實施例中，KRas 蛋白質是 KRasQ61H 。在一個實施例中，在施加于生物感測表面之前，緩衝液中之 KRas 蛋白質的濃度是約 50-1000 nM、50-750 nM、50-500 nM、100-1000 nM、100-750 nM、100-500 nM 或約 100-250 nM。在一些實施例中，水凝膠中之 KRas 蛋白質的濃度是約 0.5-2 mM、0.5-1.5 mM、0.5-1 mM、0.75-2 mM、0.75-1.5 mM、0.75-1 mM、0.9-2 mM 或 0.9-1.5 mM。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是本文所述之 Fab。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段以約 50、100、150、200、250、500 或 1000 nM 的濃度注入。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段以約 150-200 nM 的濃度注入。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段是 2H11 之 Fab。
在一些實施例中，生物感測表面接附於 BIACORE 感測器晶片。在一些實施例中，在至少 2 個通道中進行測量。在一個此等實施例中，至少一個通道是參比 (例如空白) 感測通道。
在一個實施例中，KRas 抑制劑化合物以約 0.025 µM-500 µM、0.025 µM-250 µM、0.025 µM-100 µM、0.025 µM-50 µM、0.025 µM-25 µM、0.025 µM-10 µM、0.03 µM-500 µM、0.03 µM-250 µM、0.03 µM-100 µM、0.03 µM-50 µM、0.03 µM-25 µM、0.03 µM-10 µM、0.05 µM-500 µM、0.05 µM-250 µM、0.05 µM-100 µM、0.05 µM-50 µM、0.05 µM-25 µM 或 0.05 µM-10 µM 之濃度注入。在一些實施例中，在約 10、25、50、100、150 或約 250 µL/min 的速率下，注入如上文所示的濃度的 KRas 抑制劑化合物。在一些實施例中，在本文所述之速率及濃度下，在約 5、7、8、9、10、15、20 或約 25 秒內注入 KRas 抑制劑化合物。在一個實施例中，在約 100 µL/min 的速率下，以約 0.04-10 µM 的濃度在約 10 秒內，將 KRas 抑制劑化合物注射在水凝膠上。在一些實施例中，KRas 抑制劑化合物提供為一系列不同濃度 (例如，一系列 2、3、4、5、6、7、8 或 9 種不同濃度)。在一些實施例中，將各種不同的濃度注射到如本文所述之水凝膠上。
在另一方面，本文提供了一種針對抗 KRas 抑制劑活性篩選化合物之方法，該方法包括測量化合物與所述之 KRas 突變蛋白之結合，其中 KRas 突變蛋白與本文所述之抗體或其抗原結合片段結合，其中結合使用本文所述之生物感測表面測得。
在一個實施例中，KRas 及本文所述之抗體或其抗原結合片段在水凝膠中同時偶合。在另一個實施例中，在與本文所述之抗體或其抗原結合片段偶合之前添加 KRas。在又一個實施例中，在與 KRas 偶合之前添加抗體或其抗原結合片段。
本文進一步提供了一種測量 KRas 突變蛋白與本文所述之抗體或其抗原結合片段的方法，其中該方法包括： 使本文所述之生物感測表面與本文所述之 KRas 蛋白質接觸，以形成 KRas 結合之生物感測表面； 使 KRas 結合之生物感測表面與本文所述之抗體或其抗原結合片段或其 Fab 接觸，其中抗 KRas 抗體相比於 KRas 蛋白質莫耳過剩；及 使用表面電漿子共振來偵測抗體或其抗原結合片段與 KRas 蛋白質之結合及親和力。
在一個此等實施例中，生物感測表面塗佈有抗生物素蛋白。在另一個此等實施例中，KRas 蛋白質經生物素化。
本文進一步提供了一種測量 KRas 突變蛋白與本文所述之抗 KRas 抗體之結合的方法，其中該方法包括： 使本文所述之生物感測表面與本文所述之抗體或其抗原結合片段接觸以形成抗 KRas 抗體結合之生物感測表面； 使抗 KRas 抗體結合之生物感測表面與本文所述之 KRas 蛋白質接觸，其中抗 KRas 抗體相比於 KRas 蛋白質莫耳過剩；及 使用表面電漿子共振來偵測抗體或其抗原結合片段與 KRas 蛋白質之結合及親和力。
在一個此等實施例中，生物感測表面塗佈有抗生物素蛋白。在另一個此等實施例中，抗體或其抗原結合片段經生物素化。 iv.  偵測樣品中之 KRas-GDP 的方法
本文提供了偵測樣品中之 KRas-GDP 的方法。在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體與人 KRas 結合，其中該抗體以比與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP) 更高的親和力結合與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP)。因此，在一些實施例中，利用抗 KRas 抗體偵測樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，KRas-GDP 使用如上文所述之本領域中已知的各種技術進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用 ELISA 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用如本文所提供之免疫組織化學法進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用表面電漿子共振 (SPR) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用 BIOACORE SPR 儀器進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用流式細胞術進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用螢光流式細胞分選儀 (FACS) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用免疫沉澱進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用親和力電泳 (如電泳遷移率改變測定法) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用螢光極化/異向性方法進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用親和純化與質譜聯用法進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用生物膜干涉技術進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用微尺度熱泳 (MST) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 使用帶標記的 KRas 抗體進行偵測。
本文提供了偵測樣品中之 KRas-GDP 的方法，其中 KRas 是 KRas 突變型。在一些實施例中，KRas 突變型是致癌 KRas。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12C 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12R 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12V 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasQ61H 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG12D 。在一些實施例中，KRas 突變型是 KRasG13D 。
在一些實施例中，本文所述之抗 KRas 抗體中之任一項用於偵測樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 I 類抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 II 類抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化構形特異性抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是烷基化誘導抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體打開 SWII 袋。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 SWII 袋。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2A3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 3A12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 4G12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1D6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2C1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1B7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1F4。例如，在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:12)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:91)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:92)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:93)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:94)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:95)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:96)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:97)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:98)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:1)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:2)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 LQDHDYPLT (SEQ ID NO:3)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:4)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:5)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GFYVRNWFDP (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGISSYLA (SEQ ID NO:17)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:18)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQYYSYPFT (SEQ ID NO:19)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAMS (SEQ ID NO:20)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 AISSSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO:21)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 DQGGYGYPGESWFDY (SEQ ID NO:22)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQSISSYLN (SEQ ID NO:25)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:26)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQSYSPPWT (SEQ ID NO:27)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:28)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:29)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 AFYSYMDV (SEQ ID NO:30)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:33)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 LGSNRAS (SEQ ID NO:34)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 MQALQTPLT (SEQ ID NO:35)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:36)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:37)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 ERTILTGYYGFDY (SEQ ID NO:38)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:41)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:42)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGYV (SEQ ID NO:43)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:44)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:45)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:46)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:81)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:82)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDDSLSGWV (SEQ ID NO:83)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:84)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:85)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SFGPYAFDV (SEQ ID NO:86)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:49)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:50)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGWV (SEQ ID NO:51)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:52)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:53)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:54)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:57)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:58)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSSGNHWV (SEQ ID NO:59)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:60)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:61)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 TNNYGYRYFDY (SEQ ID NO:62)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:65)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:66)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSTDNHLWV (SEQ ID NO:67)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:68)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:69)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 ATSSGYYYFDY (SEQ ID NO:70)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:73)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:74)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDNSLSVWV (SEQ ID NO:75)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:76)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:77)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GKGIVGWGFFGMDV (SEQ ID NO:78)。
在一些實施例中，本文所提供之方法可用於定量樣品中之 KRas-GDP (或測定其含量)。在一些實施例中，本文所提供之方法可用於測量樣品中 KRas-GDP 的豐度。在一些實施例中，本文所提供之方法可用於測量樣品中與如本文所述之 KRas 抑制劑結合之 KRas-GDP 的豐度。在一些實施例中，KRas-GDP 之含量相對於標準品進行測定。例如，在一些實施例中，可使用定量西方墨點法定量 KRas-GDP 豐度。在一些實施例中，KRas-GDP 使用 ELISA 進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 使用免疫組織化學法進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 使用流式細胞術進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 使用螢光流式細胞分選儀 (FACS) 進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 在免疫沉澱後進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 使用親和力電泳 (如電泳遷移率改變測定法) 進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 使用親和純化與質譜聯用法進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 在純化後進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 在藉由高效能液相層析法 (HPLC) 純化後進行定量。在一些實施例中，KRas-GDP 在藉由粒徑篩析層析法純化後進行定量。
在一些實施例中，該方法包括偵測樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，偵測生物樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，生物樣品是生物流體，如全血或全血成分，包括紅細胞、白細胞、血小板、血清及血漿、腹水、透明液體、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚水、汗液、黏液、腦脊髓液、尿液及體內可包含 KRas-GDP 的其他成分。在各種實施例中，樣品是來自任何動物之身體樣品。在各種實施例中，樣品是來自人類之樣品。在一些實施例中，樣品來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品來自人受試者，例如當偵測臨床樣品中之 KRas-GDP 時。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生致癌性 KRas 突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生致癌性 KRas 突變的患者，其中患者已接受如本文所述之 KRas 抑制劑的給藥。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12C 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12D 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12V 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12R 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG13D 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasQ61H 致癌突變的患者。在某些實施例中，生物樣品是血清或血漿。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者之血清。在某些實施例中，生物樣品是尿液。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者的尿液。
在一些實施例中，偵測來自癌症患者的樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG12C 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG12D 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG12V 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG12R 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG13D 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasQ61H 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GDP。
在一些實施例中，本文所提供之方法可用於定量樣品中之 KRas-GTP (或測定其含量)。在一些實施例中，本文所提供之方法可用於測量樣品中 KRas-GTP 的豐度。在一些實施例中，本文所提供之方法可用於測量樣品中與如本文所述之 KRas 抑制劑結合之 KRas-GTP 的豐度。在一些實施例中，KRas-GTP 之含量相對於標準品進行測定。例如，在一些實施例中，可使用定量西方墨點法定量 KRas-GTP 豐度。在一些實施例中，KRas-GTP 使用 ELISA 進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 使用免疫組織化學法進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 使用流式細胞術進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 使用螢光流式細胞分選儀 (FACS) 進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 在免疫沉澱後進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 使用親和力電泳 (如電泳遷移率改變測定法) 進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 使用親和純化與質譜聯用法進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 在純化後進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 在藉由高效能液相層析法 (HPLC) 純化後進行定量。在一些實施例中，KRas-GTP 在藉由粒徑篩析層析法純化後進行定量。
在一些實施例中，該方法包括偵測樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，偵測生物樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，生物樣品是生物流體，如全血或全血成分，包括紅細胞、白細胞、血小板、血清及血漿、腹水、透明液體、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚水、汗液、黏液、腦脊髓液、尿液及體內可包含 KRas-GTP 的其他成分。在各種實施例中，樣品是來自任何動物之身體樣品。在各種實施例中，樣品是來自人類之樣品。在一些實施例中，樣品來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品來自人受試者，例如當偵測臨床樣品中之 KRas-GTP 時。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生致癌性 KRas 突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生致癌性 KRas 突變的患者，其中患者已接受如本文所述之 KRas 抑制劑的給藥。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12C 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12D 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12V 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12R 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG13D 致癌突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasQ61H 致癌突變的患者。在某些實施例中，生物樣品是血清或血漿。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者之血清。在某些實施例中，生物樣品是尿液。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者的尿液。
在一些實施例中，偵測來自癌症患者的樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG12C 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG12D 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG12V 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG12R 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasG13D 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，偵測來自具有 KRasQ61H 致癌突變的癌症患者的樣品中之 KRas-GTP。
在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG12C 共價抑制劑 (例如，使 Cys12 烷基化的化合物) 治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG12C 共價抑制劑 (例如，使 Cys12 烷基化的化合物) 治療的患者，且 KRasG12C 之烷基化水平如本文所述進行測定。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG12D 共價抑制劑 (例如共價結合至 Asp12 的抑制劑) 治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG12D 共價抑制劑治療的患者，且抑制劑與 KRasG12D 之共價結合水平如本文所述進行測定。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG13D 共價抑制劑 (例如共價結合至 Asp13 的抑制劑) 治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG13D 共價抑制劑治療的患者，且抑制劑與 KRasG13D 之共價結合水平如本文所述進行測定。
在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG12D 非共價抑制劑治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG12V 非共價抑制劑治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG12R 非共價抑制劑治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG13D 非共價抑制劑治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasQ61H 非共價抑制劑治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRasG12C SWII 配體治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受 KRas SWII 配體治療的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或接受抗 KRas 抗體治療的患者。
在一些實施例中，作爲監測患者之癌症治療的方法的一部分，對 KRas-GDP 進行偵測。在一些此等實施例中，使用如本文所述之生物標志物測定法實施監測患者之癌症治療的方法。在一些實施例中，作爲如本文所述之監測患者之 KRasG12C 媒介之癌症的方法的一部分，對 KRas-GDP 進行偵測。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12C 特異性共價抑制劑的治療。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-1952。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-853。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 MRTX849。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 AMG-510。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 GDC-6036。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-3248。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 LY3499446。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 JNJ-74699157。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12D 特異性共價抑制劑的治療。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12V 特異性共價抑制劑的治療。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12R 特異性共價抑制劑的治療。在一些實施例中，患者已接受 KRasG13D 特異性共價抑制劑的治療。在一些實施例中，患者已接受 KRasQ61H 特異性共價抑制劑的治療。
在一些實施例中，作爲如本文所述之監測患者之 KRasG12D 媒介之癌症的方法的一部分，對 KRas-GDP 或 KRas-GTP 進行偵測。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12D 特異性共價抑制劑的治療。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12D 特異性非共價抑制劑的治療。在一些實施例中，作爲如本文所述之監測患者之 KRasG13D 媒介之癌症的方法的一部分，對 KRas-GDP 或 KRas-GTP 進行偵測。在一些實施例中，患者已接受 KRasG13D 特異性共價抑制劑的治療。在一些實施例中，患者已接受 KRasG13D 特異性非共價抑制劑的治療。在一些實施例中，作爲如本文所述之監測患者之 KRasG12V 媒介之癌症的方法的一部分，對 KRas-GDP 或 KRas-GTP 進行偵測。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12V 特異性非共價抑制劑的治療。在一些實施例中，作爲如本文所述之監測患者之 KRasG12R 媒介之癌症的方法的一部分，對 KRas-GDP 或 KRas-GTP 進行偵測。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12R 特異性非共價抑制劑的治療。在一些實施例中，作爲如本文所述之監測患者之 KRasQ61H 媒介之癌症的方法的一部分，對 KRas-GDP 或 KRas-GTP 進行偵測。在一些實施例中，患者已接受 KRasQ61H 特異性非共價抑制劑的治療。 v.   偵測樣品中之 KRas-GDP 及 KRas-GTP 的方法
本文還提供了偵測樣品中之 KRas-GDP 及 KRas-GTP 的方法。在一些實施例中，樣品中之 KRas-GDP 及 KRas-GTP 的相對含量是經判定的。在一些實施例中，樣品中之 KRas-GDP 及 KRas-GTP 的相對豐度是經判定的。在一些實施例中，測定樣品中 KRas-GDP 對 KRas-GTP 的比例。在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體與以下抗 KRas 抗體組合使用，該抗 KRas 抗體以比與 KRas-GDP 更高的親和力來與 KRas-GTP 結合。在一些實施例中，結合 KRas-GDP 的抗 KRas 抗體標記有第一標記，且優先結合 KRas-GTP 的抗 KRas 抗體標記有第二標記。在一些實施例中，偵測第一標記及第二標記。在一些實施例中，偵測並定量來自第一標記及第二標記的信號允許單獨定量樣品中之 KRas-GDP 及 KRas-GTP 水平。在一些實施例中，結合 KRas-GDP 的抗 KRas 抗體及優先結合 KRas-GTP 的抗 KRas 抗體不必標記有單獨的標記。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 之含量相對於標準品進行測定。
在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 藉由如上文所述之本領域中已知的各種手段進行偵測。在一些實施例中，使用 ELISA 偵測 KRas-GDP 及 KRas-GTP。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用如本文所提供之免疫組織化學法進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用表面電漿子共振 (SPR) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用 BIOACORE SPR 儀器進行偵測。在一些此等實施例中，KRas-GTP 及/或 KRas-GDP 使用如本文所提供之生物感測表面進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用流式細胞術進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用螢光流式細胞分選儀 (FACS) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用免疫沉澱進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用親和力電泳 (如電泳遷移率改變測定法) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用螢光極化/異向性進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用親和純化與質譜聯用法進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用生物膜干涉技術進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 及 KRas-GTP 使用微尺度熱泳 (MST) 進行偵測。
如上文所述，在一些實施例中，本文所述之抗 KRas 抗體中之任一項用於偵測樣品中之 KRas-GDP。在一些實施例中，本文所述之抗 KRas 抗體中之任一項用於偵測樣品中之 KRas-GTP。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 I 類抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 II 類抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2A3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 3A12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 4G12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1D6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2C1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1B7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1F4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab2。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab8。
在一些實施例中，結合 KRas-GTP 之抗 KRas 抗體是市售的之抗體。在一些實施例中，結合 KRas-GTP 之抗 KRas 抗體是 iDab6 (Tanaka, T. 等人，EMBO J 2007；26:3250-3259)。在一些實施例中，結合 KRas-GTP 之抗 KRas 抗體是抗 Ras 抗體 EP1125Y (Abcam, ab52939)。在一些實施例中，結合 KRas-GTP 之抗 KRas 抗體是 KRas-2B 特異性兔多株抗體 (Proteintech，目錄號 16155-1-AP)。在一些實施例中，結合 KRas-GTP 之抗 KRas 抗體是 Ras10 (Millipore，目錄號 05-516)。在一些實施例中，結合 KRas-GTP 之抗 KRas 抗體是 3B10-2F2 (Sigma-Aldrich，目錄號 WH0003845M1)。在一些實施例中，結合 KRas-GTP 之抗 KRas 抗體是 234-4.2 (Millipore，目錄號 OP24)。 vi.  獲得 KRas 抑制劑之方法
本文還提供了獲得 KRas 抑制劑之方法。在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體穩定及/或打開 KRas SWII 袋。在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體穩定及/或打開 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 之 KRas SWII 袋。在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體可用於誘導 SWII 袋之開放構形。在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體可用於誘導 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 之 SWII 袋的開放構形。在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體將 KRas 袋鎖定為開放構形。在一些實施例中，這允許篩選特異性靶向開放之 SWII 袋的分子。在一些實施例中，這允許篩選特異性靶向 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 之開放 SWII 袋的分子。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 SWII 袋之開放構形，並允許鑑定共價結合 SWII 袋的小分子。在一些實施例中，抗 KRas 抗體穩定 SWII 袋之開放構形，並允許鑑定共價結合 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 之 SWII 袋的小分子。例如，在一些實施例中，KRas 可藉由本披露之抗 KRas 抗體結合，該抗體誘導 SWII 袋之開放構形，且藉由抗 KRas 抗體結合之 KRas 可用於獲得 KRas 抑制劑。
因此，本文提供了獲得 KRas 抑制劑的方法，該方法包括使抗 KRas 抗體與 KRas 接觸，篩選化合物之文庫，並鑑定與 KRas 結合之化合物。在一些實施例中，與 KRas 結合之化合物抑制 KRas。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制 KRas 突變型。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制致癌 KRas。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制 KRasG12C 。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制 KRasG12R 。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制 KRasG12V 。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制 KRasQ61H 。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制 KRasG12D 。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制 KRasG13D 。
在一些實施例中，本披露之抗 KRas 抗體中之任一項可用於獲得本文所述之 KRas 突變型之 KRas 抑制劑的方法。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是如本文所提供之 I 類抗體或 II 類抗體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2A3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 3A12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 4G12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1D6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2C1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1B7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1F4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab2。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab8。
在一些實施例中，執行高通量篩選 (HTS) 以鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，篩選化學文庫以鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，篩選天然產物或天然生成的化合物的文庫以鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，篩選肽文庫以鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，篩選擬肽文庫以鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，篩選抗體或抗原結合片段文庫以鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，篩選小分子文庫。在一些實施例中，篩選共價抑制劑文庫。在一些實施例中，篩選非共價抑制劑文庫。
在一些實施例中，因篩選中 KRas 抑制劑之鑑定而獲得 KRas 抑制劑。在一些實施例中，因其與 KRas 之結合而鑑定該 KRas 抑制劑。在一些實施例中，KRas 之結合通過本領域中已知的用於偵測蛋白質小分子交互作用的各種技術進行偵測 (參見例如 McFedries, A. 等人，Chem. Biol. 2013 20:5)。在一些實施例中，KRas 之結合使用差示掃描螢光測定法 (DSF) 進行偵測。在一些實施例中，KRas 之結合使用熱穩定性遷移率測定法進行偵測。在一些實施例中，KRas 之結合使用親和捕獲與細胞培養物中胺基酸之穩定同位素標記 (SILAC) 聯用法進行偵測。
在一些實施例中，因其在 KRas 活性測定中突變型 KRas (例如本文所述之突變型 KRas) 活性之改變而鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，KRas 活性之測定基於 KRas 之生物學性質進行設計。在一些實施例中，因其 KRas 之核苷酸結合親和力之改變而鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，因其 KRas 活化 RAF 激酶之能力的改變而鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，因其阻斷 KRas RAF 激酶活化而鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，因其阻斷 KRas 結合 RAF 激酶而鑑定 KRas 抑制劑。在一些實施例中，因其阻斷指示 KRas 活化之報告蛋白 (例如，GLUT1 轉錄報告蛋白) 而鑑定 KRas 抑制劑。
在一些實施例中，KRas 抑制劑共價結合至如本文所述之突變型 KRas。在一些實施例中，KRas 抑制劑是共價抑制劑 (例如烷基化 KRas 之抑制劑)。在一些實施例中，KRas 抑制劑共價結合 SWII 袋之殘基。在一些實施例中，KRas 抑制劑結合至 SWII 袋並使其烷基化。在一些實施例中，當 SWII 袋打開時，KRas 抑制劑使暴露於 KRas 表面之殘基烷基化。在一些實施例中，KRas 抑制劑共價修飾 SWII 袋之殘基。在一些實施例中，KRas 抑制劑結合本文所述之突變型 KRas 之 SWII 袋中之半胱胺酸殘基。在一些實施例中，KRas 抑制劑使本文所述之突變型 KRas 之 SWII 袋中之半胱胺酸殘基烷基化。在一些實施例中，KRas 抑制劑結合 KRas SWII 袋之半胱胺酸殘基。在一些實施例中，KRas 抑制劑使 KRas SWII 袋之半胱胺酸殘基烷基化。在一些實施例中，KRas 抑制劑異構地抑制 KRas。在一些實施例中，KRas 抑制劑防止突變型 KRas 進入活性 GTP 結合態。在一些實施例中，KRas 抑制劑將突變型 KRas 鎖定在無活性 GDP 結合態。在一些實施例中，KRas 抑制劑改變了突變型 KRas 之核苷酸結合親和力。在一些實施例中，KRas 抑制劑引起突變型 KRas 優先結合 GDP 而不為 GTP。在一些實施例中，KRas 抑制劑引起突變型 KRas 進入無活性形式的 KRas。在一些實施例中，KRas 抑制劑阻斷 GEF 催化之核苷酸交換。在一些實施例中，KRas 抑制劑阻斷突變型 KRas下游之傳訊。在一些實施例中，KRas 抑制劑是烷化劑。在一些實施例中，KRas 抑制劑抑制 KRasG12C 並結合殘基 Cys12。在一些實施例中，如本文所述之突變型 KRas 是 KRasG12D 、KRasG12R 、KRasG12V 、KRasG13C 或 KRasQ61H 。
在一些實施例中，鑑定 KRas 抑制劑，其中此等抑制劑結合至本文所述之突變型 KRas。在一些實施例中，鑑定 KRas 之分子探針。在一些實施例中，KRas 抑制劑是小分子，如有機化合物或無機化合物。在一些實施例中，小分子是天然生成的小分子或合成小分子。在一些實施例中，KRas 抑制劑是蛋白質。在一些實施例中，KRas 抑制劑是肽。在一些實施例中，KRas 抑制劑是抗體或抗體片段。在一些實施例中，KRas 抑制劑是核酸。在一些實施例中，藉由本披露之方法獲得的 KRas 抑制劑可用作藥物以治療與 KRas 突變型相關聯之癌症。在一些實施例中，KRas 抑制劑用作藥物以治療 KRasG12C 媒介之癌症。 vii. 偵測生物樣品中 KRas-GDP 之烷基化的方法
本文提供了 KRas 烷基化構形特異性抗體，該等抗體特異性結合烷基化形式的 KRas。因此，在本披露之一些實施例中，抗 KRas 抗體用於偵測生物樣品中 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，抗 KRas 抗體用於藉由共價抑制劑之結合偵測生物樣品中 KRasG12C 之共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，使用如本文所述之測量標靶嚙合之生物標志物測定法完成偵測。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasG12C 之烷基化。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasG12D 之共價結合。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasG12D 之非共價結合。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasG12V 之非共價結合。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasG12R 之非共價結合。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasG13D 之非共價結合。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasQ61H 之非共價結合。在一些實施例中，1A5、1D6、2C1、1A6、1F4 或 1B7 用於偵測如本文所述之烷基化 KRas 或與 KRas 非共價抑制劑非共價結合之 KRas。在一些實施例中，1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 用於偵測如本文所述之烷基化 KRas 或與 KRas 非共價抑制劑非共價結合之 KRas。在一些實施例中，2H11、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 用於偵測如本文所述之烷基化 KRas 或與 KRas 非共價抑制劑非共價結合之 KRas。在一些實施例中，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 用於偵測如本文所述之烷基化 KRas 或與 KRas 非共價抑制劑非共價結合之 KRas。
在一些實施例中，提供了一種在接受 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療之受試者中偵測 KRasG12C 之共價結合 (例如烷基化) 的方法，其中該方法包括 (a) 用 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療後，向受試者投予本文所披露之抗 KRas 抗體中之任一項；及 (b) 偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-1952。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-853。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-1620、MRTX849。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 AMG-510。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 GDC-6036。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-3248。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 LY3499446。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 JNJ-74699157。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 LY3537982。
在一些實施例中，提供了一種在接受 KRasG12D 特異性共價抑制劑治療之受試者中偵測共價 KRas 抑制劑與 KRasG12D 之共價結合的方法，其中該方法包括 (a) 用 KRasG12D 特異性共價抑制劑治療後，向受試者投予本文所披露之抗 KRas 抗體中之任一項；及 (b) 偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，提供了一種在接受 KRasG12D 特異性非共價抑制劑治療之受試者中偵測非共價 KRas 抑制劑與 KRasG12D 之非共價結合的方法，其中該方法包括 (a) 用 KRasG12D 特異性非共價抑制劑治療後，向受試者投予本文所披露之抗 KRas 抗體中之任一項；及 (b) 偵測與 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化藉由如上文所述之本領域中已知的各種手段進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用 ELISA 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用如本文所提供之免疫組織化學法進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用表面電漿子共振 (SPR) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用 BIOACORE SPR 儀器進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用流式細胞術進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用螢光流式細胞分選儀 (FACS) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用免疫沉澱進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用親和力電泳 (如電泳遷移率改變測定法) 進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用螢光極化/異向性方法進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用親和純化與質譜聯用法進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用生物膜干涉技術進行偵測。在一些實施例中，KRas-GDP 之烷基化使用微尺度熱泳 (MST) 進行偵測。
在一些實施例中，偵測生物樣品中 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，生物樣品是生物流體，如全血或全血成分，包括紅細胞、白細胞、血小板、血清及血漿、腹水、透明液體、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚水、汗液、黏液、腦脊髓液、尿液及體內可包含烷基化 KRas 的其他成分。在各種實施例中，樣品是來自任何動物之身體樣品。在各種實施例中，樣品是來自人類之樣品。
在一些實施例中，樣品來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品來自人受試者，例如當偵測臨床樣品中之 KRas-GDP 烷基化狀態時。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生致癌性 KRas 突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12C 致癌突變的治療後之患者。在某些實施例中，生物樣品是血清或血漿。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者之血清。在某些實施例中，生物樣品是尿液。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者的尿液。 viii.      偵測活體內 KRas-GDP 之烷基化的方法
在本發明之一些實施例中，利用抗 KRas 抗體偵測活體內 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，在活細胞、組織或生物中發生時，KRas-GDP 之偵測在活體內。在一些實施例中，利用抗 KRas 抗體偵測細胞中活體內 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，利用抗 KRas 抗體偵測細胞培養物中活體內 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，利用抗 KRas 抗體偵測組織中活體內 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，利用抗 KRas 抗體偵測組織中活體內 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，利用抗 KRas 抗體偵測腫瘤細胞中活體內之烷基化 KRas-GDP。在一些實施例中，利用抗 KRas 抗體偵測生物中活體內 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，生物是哺乳動物。在一些實施例中，生物是囓齒動物。在一些實施例中，生物是小鼠。在一些實施例中，生物是人。偵測活體內 KRas-GDP 之烷基化可藉由如上文所述之本領域中已知的各種手段完成。在一些實施例中，利用免疫組織化學偵測活體內 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasG12C 之烷基化。在一些實施例中，利用 1A5、1D6、2C1、1A6、1F4 或 1B7 偵測烷基化 KRas。在一些實施例中，利用 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 偵測烷基化 KRas。在一些實施例中，利用 2H11、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 偵測烷基化 KRas。在一些實施例中，利用 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 偵測烷基化 KRas。 ix.  治療及監測治療之方法
在本披露之一些實施例中，提供了一種治療 KRas 媒介之癌症的方法。在一些實施例中，提供了一種治療 KRasG12C 媒介之癌症的方法。在一些實施例中，該方法包括向患有此等癌症的患者投予如本文所披露之抗 KRas 抗體中之任一項。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1E5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2A3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 3A12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 4G12。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1D6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2C1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1A6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 1B7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 2H11、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab1。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab2。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab3。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab4。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab5。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab6。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab7。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是 Ab8。在一些實施例中，投予治療有效量之抗 KRas 抗體。在一些實施例中，KRasG12C 媒介之癌症是 NSCLC。在一些實施例中，KRasG12C 媒介之癌症是大腸癌。在一些實施例中，KRasG12C 媒介之癌症是胰臟癌。在一些實施例中，患者是人類患者。
在一些實施例中，患者先前接受過 KRas 抑制劑 (例如本文所述之共價 KRas 抑制劑或非共價 KRas 抑制劑)。在一些實施例中，向患者共同投予 KRas 抑制劑。在一些實施例中，KRas 抑制劑是 SWII 抑制劑。在一些實施例中，KRas 抑制劑是 SWII 配體。在一些實施例中，KRas 抑制劑是共價 KRas 抑制劑。在一個實施例中，共價 KRas 抑制劑使如本文所述之 KRas 的 SWII 袋烷基化。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 SWII 抑制劑對 KRas 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 SWII 配體對 KRas 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 KRas 抑制劑 (例如本文所述之共價或非共價 KRas 抑制劑) 對 KRas 之親和力。在一些實施例中，患者先前接受過 KRasG12C 抑制劑。在一些實施例中，向患者共同投予 KRasG12C 抑制劑。在一些實施例中，KRasG12C 抑制劑是 SWII 抑制劑。在一些實施例中，KRasG12C 抑制劑是 SWII 配體。在一些實施例中，KRasG12C 抑制劑是共價抑制劑。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 SWII 抑制劑對 KRasG12C 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 SWII 配體對 KRasG12C 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 KRas 抑制劑對 KRasG12C 之親和力。在一些實施例中，患者先前接受過 KRasG12D 共價抑制劑。在一些實施例中，患者先前接受過 KRasG12D 非共價抑制劑。在一些實施例中，向患者共同投予 KRasG12D 抑制劑 (例如共價或非共價)。在一些實施例中，KRasG12D 抑制劑是 SWII 抑制劑。在一些實施例中，KRasG12D 抑制劑是 SWII 配體。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 SWII 抑制劑對 KRasG12D 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 SWII 配體對 KRasG12D 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 KRas 抑制劑對 KRasG12D 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 KRas 抑制劑對 KRasG12V 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 KRas 抑制劑對 KRasG12R 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 KRas 抑制劑對 KRasG13D 之親和力。在一些實施例中，抗 KRas 抗體改善了 KRas 抑制劑對 KRasQ61H 之親和力。
在一些實施例中，提供了一種監測患者之癌症治療的方法。在一些實施例中，提供了一種監測患者之 KRasG12C 媒介之癌症的方法。在一些實施例中，提供了一種監測患者之 KRasG12C 媒介之癌症的治療進展的方法。在一些實施例中，監測直接標靶嚙合 (例如 KRasG12C 之結合)。在一些實施例中，在監測 KRasG12C 媒介之癌症之治療後，選擇治療劑量以最大程度提高功效，同時最大程度降低毒性。在一些實施例中，患者已接受共價 KRasG12C 抑制劑的治療。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12C SWII 配體的治療。在一些實施例中，患者已接受 KRasG12C 共價抑制劑的治療。在一些實施例中，可利用抗 KRas 抗體偵測 KRasG12C 之烷基化。在一些實施例中，利用 I 類抗體偵測 KRasG12C 之烷基化。在一些實施例中，利用 1A5、1D6、2C1、1A6、1F4 或 1B7 偵測烷基化 KRas。在一些實施例中，利用 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 偵測烷基化 KRas。在一些實施例中，利用 2H11、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 偵測烷基化 KRas。在一些實施例中，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8。在一些實施例中，利用 Ab1 偵測烷基化 KRas。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合之偵測使用上文所述之任意技術進行測量。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合之偵測使用表面電漿子共振進行測量。在一些實施例中，抗 KRas 抗體是用於偵測來自患者之樣品中 KRasG12C 之烷基化。在一些實施例中，樣品是臨床樣品。在某些實施例中，生物樣品是生物流體，如全血或全血成分，包括紅細胞、白細胞、血小板、血清及血漿、腹水、透明液體、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚水、汗液、黏液、腦脊髓液、尿液及體內可包含烷基化 KRasG12C 的其他成分。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合指示 KRasG12C 已烷基化。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合指示 KRasG12C 已給藥。在一些實施例中，抗 KRas 抗體之結合指示 KRasG12C 已被 SWII 配體共價結合。在一些實施例中，藉由評估 KRasG12C 烷基化之相對水平來監測患者中之癌症治療。在一些實施例中，藉由評估烷基化 KRasG12C 之比例來監測患者中之癌症治療。 x.   使 KRas 結晶的方法
在另一方面，本文提供了使 KRas 結晶的方法，其中 KRas 視情況與如本文所述之 KRas 抑制劑結合，該方法包括：使本文所述之抗 KRas 抗體與 KRas (例如 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 接觸，及解析複合物之晶體結構。在一個實施例中，抗 KRas 抗體打開及/或穩定如本文所述之 SWII 袋。在另一個實施例中，抗 KRas 抗體穩定如本文所述之 KRas-GDP 形式。在又一個實施例中，抗 KRas 抗體打開及/或穩定如本文所述之 SWII 袋，其中 KRas 抑制劑與 SWII 袋中之至少一個殘基共價或非共價結合。
另外，本文提供了與 KRas 共複合物並由此用作結晶伴護蛋白的抗 KRas 抗體。如本文所用之「結晶伴護蛋白」是指與所關注之標靶結合、增強並調節晶體堆積及/或提供高質量定相信息的輔助蛋白。在一個實施例中，與單獨的 KRas 相比，如本文所述之抗 KRas 抗體與 KRas 之結合增加了晶體形成。在一個實施例中，抗 KRas 抗體是本文所述之 Fab。C. 套組
本發明之測定方法可提供為套組的形式。在一個實施例中，此等套組包含抗 KRas 抗體或包含如本文所述之抗 KRas 抗體的組成物。在一些實施例中，此等套組是包裝之組合，其包括以下基本要素：捕獲試劑，其包含靶向突變型 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 之抗 KRas 抗體；與 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 結合之可偵測 (帶有標記或未標記) 抗體；及有關如何使用這些試劑執行測定方法之説明書。這些基本要素如上文所定義。
套組可進一步包含捕獲試劑之撐體，其可以作爲單獨要素提供，或在其上已固定捕獲試劑。
因此，套組中之捕獲抗體可固定於撐體上，或者它們可固定於此等撐體上，此等撐體包含於套組中或獨立於該套組提供。在一些實施例中，捕獲試劑塗布於或接附於固體材料 (例如，微量滴定板、珠或梳)。可偵測抗體可以是直接偵測之標記抗體，或者是未標記抗體，該未標記抗體藉由針對不同物種中產生之未標記抗體之標記抗體進行偵測。在標記是酶的情況下，則套組通常包含酶所需之受質及輔因子；在標記是螢光團的情況下，包含一種提供可偵測發色團之染料前體；且在標記是生物素的情況下，包含與 MUG 共軛至 HRP 或 β-半乳糖苷酶抗生物素蛋白 (如抗生物素蛋白、鏈黴親和素或鏈黴親和素)。
在各種實施例中，抗 KRas 抗體是本文所披露之抗 KRas 抗體中任一項中的一者或多者。例如，在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:12)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:91)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:92)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:93)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:94)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:95)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:96)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:97)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 GSSIWSSN (SEQ ID NO:98)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:1)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:2)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 LQDHDYPLT (SEQ ID NO:3)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:4)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:5)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GFYVRNWFDP (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGISSYLA (SEQ ID NO:17)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:18)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQYYSYPFT (SEQ ID NO:19)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAMS (SEQ ID NO:20)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 AISSSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO:21)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 DQGGYGYPGESWFDY (SEQ ID NO:22)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQSISSYLN (SEQ ID NO:25)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:26)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQSYSPPWT (SEQ ID NO:27)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:28)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:29)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 AFYSYMDV (SEQ ID NO:30)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:33)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 LGSNRAS (SEQ ID NO:34)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 MQALQTPLT (SEQ ID NO:35)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:36)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:37)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 ERTILTGYYGFDY (SEQ ID NO:38)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:41)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:42)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGYV (SEQ ID NO:43)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:44)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:45)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:46)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:81)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:82)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDDSLSGWV (SEQ ID NO:83)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:84)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:85)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SFGPYAFDV (SEQ ID NO:86)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:49)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:50)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGWV (SEQ ID NO:51)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:52)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:53)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:54)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:57)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:58)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSSGNHWV (SEQ ID NO:59)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:60)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:61)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 TNNYGYRYFDY (SEQ ID NO:62)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:65)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:66)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSTDNHLWV (SEQ ID NO:67)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:68)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:69)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 ATSSGYYYFDY (SEQ ID NO:70)。在一些實施例中，抗 KRas 抗體包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:73)；CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:74)；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDNSLSVWV (SEQ ID NO:75)；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含：CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:76)；CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:77)；及 CDR-H3，其包含胺基酸序列 GKGIVGWGFFGMDV (SEQ ID NO:78)。
套組通常還包含 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 作爲標準品，並包含其他添加劑 (如穩定劑、洗滌和孵育緩衝液等)。
套組之組分將以預定之比率提供，其中各種試劑之相對量發生適當變化以提供試劑溶液中之濃度，從而使測定之靈敏度實質上得到最大程度提高。特別地，試劑可以乾粉 (通常是凍乾粉) 形式提供，包括賦形劑，其在溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液以與待測之樣品組合。
在一些實施例中，提供了包含如本文所述之抗 KRas 抗體的套組，其用於如本文所述之方法中，例如用於偵測 KRas、KRas-GDP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 的方法中。在一些實施例中，套組進一步包含塗布或接附於梳的抗 KRas 抗體，其用於偵測 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas 的方法中。
在一些實施例中，提供了用於以下方法的套組：該方法監測如本文所述之患者的癌症治療。在一些實施例中，提供了用於測量本文所述之一種或多種 KRas 抑制劑與如本文所述之 KRas 蛋白質(例如 KRasG12C ) 之標靶嚙合的生物標誌物測定法中的套組。在一些實施例中，提供了用於偵測如本文所述之生物樣品中之 KRas-GDP 或 KRas-GTP 之烷基化的方法中的套組。在一些實施例中，套組包含特異性結合烷基化形式的 KRas 的一種或多種 KRas 烷基化構形特異性抗體。因此，在本披露之一些實施例中，套組包含用於偵測生物樣品中 KRas-GDP 之烷基化的一種或多種抗 KRas 抗體。在一些實施例中，套組包含一種或多種抗 KRas 抗體，該等抗體用於藉由共價抑制劑之結合偵測生物樣品中 KRasG12C 之共價結合 (例如烷基化)。在一些實施例中，套組包含根據如本文所述之生物標志物測定法偵測 KRas、KRas-GDP、KRas-GTP 及/或烷基化 KRas (具體包括如本文所述之 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H ) 以測量標靶嚙合的試劑。在一些實施例中，套組包含用於偵測 KRasG12C 之烷基化的 I 類抗體。在一些實施例中，套組包含用於偵測 KRasG12D 之共價結合的 I 類抗體。在一些實施例中，套組包含用於偵測 KRasG12D 之非共價結合的 I 類抗體。在一些實施例中，套組包含用於偵測 KRasG12V 之非共價結合的 I 類抗體。在一些實施例中，套組包含用於偵測 KRasG12R 之非共價結合的 I 類抗體。在一些實施例中，套組包含用於偵測 KRasG13D 之非共價結合的 I 類抗體。在一些實施例中，套組包含用於偵測 KRasQ61H 之非共價結合的 I 類抗體。在一些實施例中，套組包含 1A5、1D6、2C1、1A6、1F4 或 1B7，用於偵測如本文所述之烷基化 KRas 或與 KRas 非共價抑制劑非共價結合之 KRas。在一些實施例中，套組包含 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8，用於偵測如本文所述之烷基化 KRas 或與 KRas 非共價抑制劑非共價結合之 KRas。在一些實施例中，套組包含 2H11、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8，用於偵測如本文所述之烷基化 KRas 或與 KRas 非共價抑制劑非共價結合之 KRas。在一些實施例中，套組包含 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8，用於偵測如本文所述之烷基化 KRas 或與 KRas 非共價抑制劑非共價結合之 KRas。
在一些實施例中，提供了用於在接受 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療之受試者中偵測 KRasG12C 之共價結合 (例如烷基化) 的方法中的套組，其中該方法包括 (a) 用 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療後，向受試者投予本文所披露之抗 KRas 抗體中之任一項；及 (b) 偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-1952。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-853。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-1620、MRTX849。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 AMG-510。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 GDC-6036。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-3248。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 LY3499446。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 JNJ-74699157。在一些實施例中，KRasG12C 特異性共價抑制劑是 LY3537982。
在一些實施例中，提供了用於在接受 KRasG12D 特異性共價抑制劑治療之受試者中偵測共價 KRas 抑制劑與 KRasG12D 之共價結合的方法中的套組，其中該方法包括 (a) 用 KRasG12D 特異性共價抑制劑治療後，向受試者投予本文所披露之抗 KRas 抗體中之任一項；及 (b) 偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，提供了用於在接受 KRasG12D 特異性非共價抑制劑治療之受試者中偵測非共價 KRas 抑制劑與 KRasG12D 之非共價結合的方法中的套組，其中該方法包括 (a) 用 KRasG12D 特異性非共價抑制劑治療後，向受試者投予本文所披露之抗 KRas 抗體中之任一項；及 (b) 偵測與 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，套組包含使用如本文所述之本領域中已知的各種手段中之一者或多者偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用 ELISA 偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用如本文所提供之免疫組織化學法偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用表面電漿子共振 (SPR) 偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用 BIOACORE SPR 儀器偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用流式細胞術偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用螢光流式細胞分選儀 (FACS) 偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用免疫沉澱法偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用親和力電泳 (如電泳遷移率改變測定法) 偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用螢光極化/異向性偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用親和純化與質譜聯用法偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用生物膜干涉技術偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。在一些實施例中，套組包含使用微尺度熱泳 (MST) 偵測 KRas-GDP 之烷基化的試劑及説明書。
在一些實施例中，套組用於偵測生物樣品中之 KRas-GDP 之烷基化。在一些實施例中，提供了用於偵測生物樣品中之 KRas-GDP 之烷基化的套組，其中生物樣品是生物流體，如全血或全血成分，包括紅細胞、白細胞、血小板、血清及血漿、腹水、透明液體、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚水、汗液、黏液、腦脊髓液、尿液及體內可包含烷基化 KRas 的其他成分。在一些實施例中，樣品是來自任何動物之身體樣品。在一些實施例中，樣品是來自人類之樣品。
在一些實施例中，提供了用於偵測來自哺乳動物的樣品中之 KRas-GDP 之烷基化的套組。在一些實施例中，樣品來自人受試者，例如當偵測臨床樣品中之 KRas-GDP 烷基化狀態時。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生致癌性 KRas 突變的患者。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或發生 KRasG12C 致癌突變的治療後之患者。在某些實施例中，生物樣品是血清或血漿。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者之血清。在某些實施例中，生物樣品是尿液。在某些實施例中，生物樣品是來自臨床患者的尿液。實施例
實施例 1.  一種與人 KRas 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體以比與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP) 更高的親和力特異性結合與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP)。
實施例 2.  一種與人 KRas 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體以比與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP) 更高的親和力特異性結合與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP)。
實施例 3.  如實施例 1 或實施例 2 之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段為 KRas 烷基化構形特異性抗體。
實施例 4.  如實施例 1-3 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段打開並穩定 SWII 袋。
實施例 5.  如實施例 1-4 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中人 KRas 是選自由下列所組成之群組的 KRas 突變型：KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasQ61H 、KRasG12D 及 KRasG13D 。
實施例 6.  如實施例 5 之分離抗體或其抗原結合片段，其中人 KRas 是選自由下列所組成之群組的 KRas 突變型：KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12D 及 KRasG13D 。
實施例 7.  如實施例 6 之分離抗體或其抗原結合片段，其中 KRas 突變型是 KRasG12C 。
實施例 8.  如實施例 7 之分離抗體或其抗原結合片段，其中 KRasG12C -GDP 用 KRasG12C 特異性共價抑制劑烷基化。
實施例 9.  如實施例 8 之分離抗體或其抗原結合片段，其中分離抗體或抗原結合片段是烷基化構形特異性 KRas 抗體，其與以 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157 烷基化的 KRasG12C -GDP 結合。
實施例 10.  如實施例 1-9 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段穩定 KRas 突變蛋白之 SWII 袋。
實施例 11.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:12)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。
實施例 12.  如實施例 11 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列。
實施例 13.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:9； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:10； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:11；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含選自由下列所組成之群組之胺基酸序列中之一者：SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97 及 SEQ ID NO:98； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:13；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:14。
實施例 14.  如實施例 13 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列中之一者：SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105 及 SEQ ID NO:106。
實施例 15.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:1)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:2)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 LQDHDYPLT (SEQ ID NO:3)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:4)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:5)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GFYVRNWFDP (SEQ ID NO:6)。
實施例 16.  如實施例 15 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列。
實施例 17.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGISSYLA (SEQ ID NO:17)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:18)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQYYSYPFT (SEQ ID NO:19)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAMS (SEQ ID NO:20)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 AISSSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO:21)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 DQGGYGYPGESWFDY (SEQ ID NO:22)。
實施例 18.  如實施例 17 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
實施例 19.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQSISSYLN (SEQ ID NO:25)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:26)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQSYSPPWT (SEQ ID NO:27)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:28)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:29)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 AFYSYMDV (SEQ ID NO:30)。
實施例 20.  如實施例 19 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列。
實施例 21.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:33)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 LGSNRAS (SEQ ID NO:34)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 MQALQTPLT (SEQ ID NO:35)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:36)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:37)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 ERTILTGYYGFDY (SEQ ID NO:38)。
實施例 22.  如實施例 21 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列。
實施例 23.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:41)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:42)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGYV (SEQ ID NO:43)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:44)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:45)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:46)。
實施例 24.  如實施例 23 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。
實施例 25.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:81)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:82)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDDSLSGWV (SEQ ID NO:83)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:84)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:85)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SFGPYAFDV (SEQ ID NO:86)。
實施例 26.  如實施例 25 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:87 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:88 之胺基酸序列。
實施例 27.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:49)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:50)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGWV (SEQ ID NO:51)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:52)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:53)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:54)。
實施例 28.  如實施例 27 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。
實施例 29.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:57)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:58)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSSGNHWV (SEQ ID NO:59)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:60)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:61)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 TNNYGYRYFDY (SEQ ID NO:62)。
實施例 30.  如實施例 29 之分離抗體或抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列。
實施例 31.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:65)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:66)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSTDNHLWV (SEQ ID NO:67)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:68)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:69)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 ATSSGYYYFDY (SEQ ID NO:70)。
實施例 32.  如實施例 31 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:71 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:72 之胺基酸序列。
實施例 33.  如實施例 1-10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:73)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:74)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDNSLSVWV (SEQ ID NO:75)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:76)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:77)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GKGIVGWGFFGMDV (SEQ ID NO:78)。
實施例 34.  如實施例 33 之分離抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:79 之胺基酸序列，且重鏈可變區包含 SEQ ID NO:80 之胺基酸序列。
實施例 35.  一種與人 KRas-GDP 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中分離抗體或其抗原結合片段與人 KRas 之胺基酸 W99、K5、L6、V7、S39、D54、L54、Y71、T74 及/或 G75 結合。
實施例 36.  一種與人 KRas-GTP 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中該分離抗體或其抗原結合片段與人 KRas 之胺基酸 W99、K5、L6、V7、S39、D54、L54、Y71、T74 及/或 G75 結合。
實施例 37.  編碼如實施例 1-36 中任一項之抗體或抗原結合片段之輕鏈可變域及重鏈可變域的分離核酸。
實施例 38.  一種載體，其包含如實施例 37 之核酸。
實施例 39.  一種宿主細胞，其包含如實施例 28 之載體。
實施例 40.  如實施例 1-36 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段與可偵測標記共軛。
實施例 41.  一種製備與 KRas-GDP 結合之抗體或其片段的方法，該方法包括在適於表現編碼抗體的載體的條件下培養如實施例 36 之宿主細胞，及回收抗體。
實施例 42.  一種製備與 KRas-GtP 結合之抗體或其片段的方法，該方法包括在適於表現編碼抗體的載體的條件下培養如實施例 36 之宿主細胞，及回收抗體。
實施例 43.  一種篩選以比與 KRasG12C -GTP 更高的親和力來與 KRasG12C -GDP 結合的抗體之方法，其包含 (a) 用下列者接觸抗體庫： i) KRasG12C -GDP， ii) 帶有 KRasG12C 特異性共價抑制劑之烷基化 KRasG12C -GDP，及 iii) 與非可水解之 GTP 類似物結合之 KRasG12C ，及 (b) 選擇以比與該非可水解之 GTP 類似物結合之 KRasG12C 更高的親和力來與烷基化 KRasG12C -GDP 和未烷基化 KRasG12C-GDP 結合之抗體。
實施例 44.  一種篩選以比與 KRasG12C -GDP 更高的親和力來與 KRasG12C -GTP 結合的抗體之方法，其包含 (a) 用下列者接觸抗體庫： i) KRasG12C -GTP， ii) 帶有 KRasG12C 特異性共價抑制劑之烷基化 KRasG12C -GTP，及 iii) 與非可水解之 GDP 類似物結合之 KRasG12C ，及 (b) 選擇以比與該非可水解之 GDP 類似物結合之 KRasG12C 更高的親和力來與烷基化 KRasG12C -GTP 和未烷基化 KRasG12C -GTP 結合之抗體。
實施例 45.  如實施例 43 或實施例 44 之方法，其中文庫是合成噬菌體庫。
實施例 46.  一種偵測生物樣品中 KRas-GDP 的方法，該方法包括使生物樣品與如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
實施例 47.  如實施例 46 之方法，進一步包括使生物樣品與結合至 KRas-GTP 的抗體接觸，其中 KRas-GDP 的量及 KRas-GTP 的量是經判定的。
實施例 48.  一種偵測生物樣品中 KRas-GTP 的方法，該方法包括使生物樣品與如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
實施例 49.  如實施例 46 之方法，進一步包括使生物樣品與結合至 KRas-GDP 的抗體接觸，其中 KRas-GTP 的量及 KRas-GDP 的量是經判定的。
實施例 50.  一種套組，其包含與可偵測標記共軛之如實施例 1-36 中任一項之 KRas 抗體或其抗原結合片段，以及偵測該抗體或其抗原結合片段之説明書。
實施例 51.  一種獲得 KRas 突變型之抑制劑的方法，該方法包括將如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段與 KRas 突變型接觸，篩選化合物，及鑑定結合至與抗體或其抗原結合片段結合之 KRas 突變型的化合物。
實施例 52.  如實施例 51 之方法，其中化合物包含在 SWII 袋處共價修飾 KRas 的分子。
實施例 53.  如實施例 52 之方法，其中化合物包含共價抑制劑，該共價抑制劑將 SWII 袋中的至少一個殘基烷基化。
實施例 54.  如實施例 51 之方法，其中化合物包含在 SWII 袋處非共價修飾 KRas 的分子。
實施例 55.  如實施例 51-54 中任一項之方法，其中 KRas 突變型是 KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12D 、KRasG13D 、KRasG12R 或 KRasQ61H 。
實施例 56.  一種偵測 KRas 之烷基化的方法，該方法包括使生物樣品與如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸，及偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。
實施例 57.  如實施例 56 之方法，其中偵測包括偵測 KRasG12C 。
實施例 58.  如實施例 56 或 57 之方法，其中抗體或其抗原結合片段是 KRas 烷基化構形特異性抗體。
實施例 59.  一種偵測哺乳動物中 KRas 之烷基化的方法，該方法包括向哺乳動物投予如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段，及偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。
實施例 60.  一種偵測用 KRas 抑制劑治療的患者中 KRas 的烷基化之方法，該方法包含： (a) 從該患者獲得樣品； (b) 使樣品與如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸； (c) 測量由抗體或其抗原結合片段結合的 KRas 之量。
實施例 61.  如實施例 60 之方法，其中 KRas 抑制劑是 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446\LY3537982 或 JNJ-74699157。
實施例 62.  如實施例 60 或 61 之方法，其中由抗體或其抗原結合片段結合之 KRas 的含量判定投予患者之 KRas 抑制劑之劑量。
實施例 63.  如實施例 59-62 中任一項之方法，其中偵測包括偵測 KRasG12C 。
實施例 64.  如實施例 59-63 中任一項之方法，其中抗體或其抗原結合片段是 KRas 烷基化構形特異性抗體。
實施例 65.  如實施例 59-63 中任一項之方法，其中哺乳動物是人。
實施例 66.  一種偵測用 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療的受試者中 KRasG12C 的烷基化之方法，該方法包含： (a) 用 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療後，向受試者投予抗體 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 中任一項之抗體或其抗原結合片段；及 (b) 偵測與烷基化 KRas 結合之抗體或其抗原結合片段。
實施例 67.  如實施例 66 之方法，其中 KRasG12C 特異性共價抑制劑是 ARS-1952、ARS-853、ARS-1620、MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157。
實施例 68.  如實施例 67 之方法，其中抗體或其抗原結合片段是 KRas 烷基化構形特異性抗體。
實施例 69.  一種治療 KRasG12C 媒介之癌症的方法，該方法包括向患有此等癌症的患者投予如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段。
實施例 70.  如實施例 69 之方法，其中 KRasG12C 媒介之癌症是 NSCLC、大腸癌或胰臟癌。
實施例 71.  一種結晶伴護蛋白，其包含如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段。
實施例 72.  一種使 KRas 結晶之方法，其中 KRas 視情況與 KRas 抑制劑結合，該方法包括使如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段與 KRas 接觸，及解析複合物之晶體結構。
實施例 73.  如實施例 72 之方法，其中 KRas 是 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 。
實施例 74.  一種測量化合物與 KRas 的結合之生物感測表面，其中： (i) 生物感測表面包含水凝膠，其中 KRas 蛋白質及如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段共定位於該水凝膠中； (ii) KRas 及抗體或其抗原結合片段在水凝膠內具有足夠之自由度以相互嚙合以形成親和複合物； (iii) KRas 和抗體或其抗原結合片段之局部濃度超過解離親和力常數至少 10 倍，其中局部濃度促進親和複合物的形成； (iv) 未結合的 KRas 蛋白和抗 KRas 抗體的比例小於約 50%； (v) 將 KRas 抑制劑化合物注射在生物感測表面上至少 5 秒；以及 (vi) 其中 KRas 抑制劑化合物與抗 KRas 抗體的結合是在至少一個感測通道上測量的。
實施例 75.  如實施例 74 之生物感測表面，其中水凝膠之厚度是約 10 nm-500 nm、10 nm-300 nm、10 nm-250 nm 或約 10 nm-200 nm。
實施例 76.  如實施例 74 或 75 之生物感測表面，其中 KRas 經生物素化。
實施例 77.  如實施例 74-76 中任一項之生物感測表面，其中生物感測表面接附於 BIACORE 感測器晶片。
實施例 78.  一種針對抗 KRas 抑制劑活性篩選化合物之方法，該方法包括測量化合物與 KRas 之結合，其中 KRas 與抗 KRas 抗體結合，且其中該結合使用如實施例 74-77 中任一項之生物感測表面測得。
實施例 79.  一種測量 KRas 突變蛋白與如本文中所述之抗 KRas 抗體的結合之方法，其中該方法包含： (i) 使如實施例 74-77 中任一項之生物感測表面與 KRas 接觸，以形成 KRas 結合之生物感測表面； (ii) 使 KRas 結合之生物感測表面與如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸，其中抗體或其抗原結合片段與 KRas 蛋白質相比莫耳過剩；及 (iii) 使用表面電漿子共振來偵測抗體或其抗原結合片段與 KRas 的結合及親和力。
實施例 80.  一種測量 KRas 突變蛋白與如本文中所述之抗 KRas 抗體的結合之方法，其中該方法包含： (i) 使如實施例 74-77 中任一項之生物感測表面與如實施例 1-36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸，以形成抗 KRas 抗體結合之生物感測表面； (ii) 將抗 KRas 抗體結合的生物感測表面與 KRas 接觸，其中抗體或其抗原結合片段與 KRas 蛋白相比是莫耳過剩的；以及 (iii) 使用表面電漿子共振來偵測抗體或其抗原結合片段與 KRas 的結合及親和力。
實施例 81.  一種測量 KRas 抑制劑與 KRas 蛋白的標靶嚙合之方法，其包含 (a) 從患者獲得樣品； (b) 使樣品與本文所述之抗 KRas 抗體或其抗原結合片段接觸；及 (c) 測量由抗 KRas 抗體結合之 KRas 的水平。實例
在以下實例中進一步詳細描述本披露，但該等實例并非旨在以任何方式限制所要求保護之本披露的範圍。附圖意在被視爲本披露之說明書和描述之組成部分。提供以下實例以舉例說明，但不限制本披露。實例 1 ：抗 KRas 抗體之選擇及抗原決定基映射
以下實例描述了識別或誘導 KRasG12C 之開放構形的抗 KRas 抗體的選擇和表徵。 材料及方法 噬菌體選擇
使用合成抗體庫及三種不同的 KRasG12C 構形：烷基化及未烷基化 KRasG12C -GDP 及 KRasG12C -GMPPcp (非可水解之 GTP 模擬物) 開發出一種活體外選擇策略 (圖 1B)。使用 KRas 同功型 B 之胺基酸殘基 T2 至 K169。執行四輪生物淘洗，其中在包含經 GNE-1952 烷基化之生物素化 KRasG12C -GDP 的溶液中孵育合成噬菌體庫。為推動選擇 KRasG12C -GDP 之烷基化開放構形，在溶液中存在過量非生物素化 KRasG12C -GDP 及 KRasG12C -GMPPcp 的情況下進行選擇。
使用現有的合成 Fab 噬菌體展示文庫進行選擇 (C. V. Lee 等人，J Mol Biol 2004; 340:1073-1093；W. C. Liang 等人，J Mol Biol 2007; 366:815-829)。合併之文庫在溶液中與生物素化 KRasG12Ci -GDP+GNE1952 (濃度範圍從最初的 500 nM 降至 10 nM) 循環結合三至四輪。將溶液捕獲在 NeutrAvidin 珠 (Promega) 上，用 5 μM 生物素將其封閉，在 PBS + 0.5% BSA + 0.1% Tween 20 (PBSBT) 中洗滌 3 次，每次 30 秒，並用 100 mM HCl 進行洗脫。將洗脫後之噬菌體用 1M TRIS-HCl pH 8.0 中和，然後在大腸桿菌 XL1-blue (Stratagene) 中擴增過夜，並添加 M13-KO7 輔助噬菌體 (New England Biolabs)。為富集特異性結合至烷基化 KRasG12C 的結合物，在存在 1 μM 過量可溶性 KRasG12C -GDP 或 KRasG12C -GMPPcp 的條件下進行選擇。選擇後，挑選單個菌落，並於 30˚C 下在 96 孔深孔板中補充有卡本西林及輔助噬菌體的 2xYT 培養基中生長過夜。噬菌體上清液用於針對 KRasG12Ci -GDP+GNE1952、KRasG12C -GDP 及 KRasG12C -GMPPcp 之噬菌體 ELISA 中，以鑑定目標特異性殖株。抗體及 Fab 生產
生成十一個獨特殖株之 IgG。藉由 Sanger 測序獲得先導噬菌體殖株之序列。藉由基因合成獲得各種殖株之輕鏈和重鏈的 IgG (人 IgG1) 表現構建體。藉由瞬時轉染 293 細胞產生 IgG，並使用標準方法，通過親和層析法及之後的 SEC 進行純化 (MabSelect SuRe；GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)。藉由基因合成生成細菌表現 Fab 構建體。按照先前所述之方法生成重組 Fab (T. N. Lombana, M. Dillon, J. Bevers, 3rd, C. Spiess,Sci Rep 2015; 5:17488)。針對烷基化 KRasG12C 之抗體酶聯免疫吸附測定 (ELISA)
為鑑定識別結合 GNE-1952 之 KRasG12C -GDP 的抗 KRas 抗體，測量十一種單株抗體 (mAbs) 識別經兩種額外化合物 (ARS-853 及 ARS-1620) 烷基化之 KRasG12C 的能力 (M. P. Patricelli 等人，Cancer Discov 2016; 6:316-329；P. Lito 等人，Science 2016; 351:604-608)。在 4°C 下，將 PBS 中 0.3 μg/mL 生物素化 KRasG12C -GDP + GNE-1952 及 KRasG12C -GDP 過夜塗布於 NeutrAvidin ELISA 板 (Thermo Scientific) 上，一式三份。將板用 PBSBT 洗滌，並在 25℃ 及不斷搖動下，在 1-2 小時內添加從 10 μg/mL 開始之抗 KRas 抗體之連續稀釋液 (包括本文所述之被選抗 KRas 抗體及市售的之抗體)。洗滌後，在 25℃ 及不斷搖動下，在 1 小時內添加物種匹配之 Fc 特異性 HRP 2° 抗體。用 PBSBT 洗滌後，用 TMB 受質使板顯影 5 分鐘，並在 650 nm 處偵測。抗體表面電漿子共振 (SPR)
使用 HBS-P+ (GE Healthcare) 運行緩衝劑，在 Mass-1 (Bruker) 上於 25˚C 下進行 SPR 實驗。使用抗 HuIgG1 Fc 捕獲套組 (GE Healthcare)，捕獲 1 μg/mL 抗 KRas 抗體。在 30 μL/min 的流速下，添加 KRasG12C -GDP+GNE-1952、KRasG12C -GDP、KRasG12C -GDP+ARS1620、KRasG12C -GDP+ARS853 及 KRasWT -GDP 作爲溶液中之分析物。使用 500-0 nM 之連續稀釋滴定 KRasG12 -GDP+GNE-1952。使用 5000-0 nM 之連續稀釋滴定 KRasG12C -GDP。使用 1000-0 nM 之連續稀釋滴定 KRasG12C -GDP+ARS1620。使用 200-0 nM 之連續稀釋滴定 KRasG12C -GDP+ARS853。使用 2000-0 nM 之連續稀釋滴定 KRasWT-GDP。將感測圖擬合到 1:1 Langmuir 模型以鑑定動力學參數。抗原決定基聚類
在基於陣列之成像儀 (IBIS MX96, Netherlands) 上，使用 HBS-P+ (GE Healthcare) 運行緩衝液於 25℃ 下進行抗原決定基聚類實驗，如先前所述 (Y. N. Abdiche 等人，PLoS One 2014; 9:e92451)。簡言之，在 10 mM 醋酸鈉 (pH 4.5) 中，將 10 μg/mL 抗 KRas 抗體胺偶合到表面，並用 1 M 乙醇胺將表面淬滅。藉由首先使 2 μM KRasG12C -GDP+GNE1952 流過固定化抗體，然後向溶液中添加 10 μg/mL 各種抗 KRas 抗體，完成抗原決定基聚類實驗。在添加抗體之前，留出足夠的時間使抗原結合。在向溶液中添加下一種抗體之前，用 10 mM 甘氨酸 pH 2.5 使表面再生 (圖 1F)。免疫沉澱
在經過 ARS-1620 或 DMSO 對照處理後的細胞上，用 1A5 及 2H11 執行免疫沉澱實驗 (圖 1G)。 結果
執行噬菌體展示選擇，以選擇結合經 SWII 共價抑制劑共價修飾後發生烷基化之 KRasG12C 之獨特構形的抗 KRas 抗體。在噬菌體 ELISA 篩選以確認特異性後，生成十一個獨特殖株之 IgG，並藉由 ELISA (圖 1C) 及表面電漿子共振 (SPR) (圖 1D、圖 1E 及 表 1A) 表徵其結合特異性。與 GNE-1952-烷基化 KRasG12C -GDP 結合之所有 mAb 之親和力在 KD 約 1-139 nM 的範圍內 (表 1A)。還測量被選 mAb 及市售的抗 KRas 抗體 iDab6 (Tanaka, T. 等人，EMBO J 2007; 26:3250-3259) 與 KRas-GTP 之結合特異性 (表 1B)。
一組 (殖株 1D6、1B7、2C1、1A6 及 1F4) 對與 GNE-1952 結合之 KRasG12C -GDP 構形具有選擇性，而第二組 (殖株 1A5、1E5、2A3、2H11、3A12 及 4G12) 似乎具有全烷基化選擇性，可識別與 GNE-1952、ARS-853 及 ARS-1620 結合之 KRasG12C -GDP 構形 (表 1A)。抗原決定基映射分析顯示，這兩個基團結合與 GNE-1952 結合之 KRasG12C -GDP 上之兩個不同但部分重叠之抗原決定基 (圖 1F)。表 1A ： 抗 KRas 抗體對結合至 GDP 之不同 KRas 蛋白質的親和力，其中「NB」指示無結合，且「ND」指示無資料。
KRasG12Ci -GDP+GNE-1952 KRasG12Ci -GDP+ARS-853 KRasG12Ci -GDP+ARS-1620 KRasG12C -GDP KRasWT -GDP
殖株 親和力 (nM) 親和力 (nM) 親和力 (nM) 親和力 (nM) 親和力 (nM)
1D6 10 NB NB NB NB
1B7 139 NB NB NB NB
2C1 7 NB NB NB NB
1A6 61 NB NB NB NB
1F4 39 NB NB NB NB
1A5 2 4 2 513 159
1E5 5 NB 107 1700 411
2A3 10 195 21 216 71
2H11 5 4 54 230 42
3A12 2 772 94 121 24
4G12 1 441 NB 366 61
iDab6 924 ND ND 35 12900
表 1B ： 抗 KRas 抗體對結合至 GTP 之 KRas 蛋白質的親和力，其中「NB」指示無結合，且「ND」指示無資料。
KRasG12C -GTP KRasWT -GTP
殖株 親和力 (nM) 親和力 (nM)
1D6 NB ND
1B7 NB ND
2C1 NB ND
1A6 NB ND
1F4 NB ND
1A5 535 NB
1E5 1800 NB
2A3 313 7
2H11 344 NB
3A12 123 NB
4G12 215 NB
iDab6 172 172
I 類抗 KRas 抗體 1A5 對烷基化 KRasG12C -GDP 具有高特異性，其親和力相比於未烷基化 KRasG12C -GDP 改善了 ＞100 倍。I 類抗 KRas 抗體需要存在共價結合 SWII 配體以結合，且它們識別並以高特異性與此等形式結合。相比之下，藉由 ELISA 及 SPR，II 類抗 KRas 抗體 (1E5、2H11、2A3、3A12 及 4G12) 表現出與烷基化 KRasG12C -GDP 及未烷基化 KRasG12C -GDP 兩者之結合 (圖 1C、圖 1D 及表 1A)。II 類抗 KRas 抗體無需存在共價結合 SWII 配體以結合。
在經過 ARS-1620 或 DMSO 對照處理後的細胞上，用 1A5 及 2H11 執行免疫沉澱實驗。I 類及 II 類抗 KRas 抗體均特異性免疫沉澱烷基化 KRasG12C -GDP，但不導致未烷基化 KRasG12C -GDP 發生免疫沉澱 (圖 1G)。
本文所述之方法生成一組新型抗 KRas 抗體，該組抗體偵測由具有不同化學型之 KRasG12C 之烷基化所誘導之獨特的開放構形。實例 2 ：抗 KRas 抗體之胺基酸序列
被選抗 KRas 抗體之胺基酸序列使用標準技術測得。抗 KRas 抗體之輕鏈互補決定區 (CDR) 提供於表 2 中，且抗 KRas 抗體之重鏈 CDR 提供於表 3 中。抗 KRas 抗體之輕鏈可變區序列提供於表 4 中，且抗 KRas 抗體之重鏈可變區序列提供於表 5 中。表 2 ： 抗 KRas 抗體之輕鏈 CDR 序列
抗體 CDR L1 CDR L2 CDR L3
1A5 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:1) AASSLQS (SEQ ID NO:2) LQDHDYPLT (SEQ ID NO:3)
1D6 RASQGISSYLA (SEQ ID NO:17) AASSLQS (SEQ ID NO:18) QQYYSYPFT (SEQ ID NO:19)
2C1 RASQSISSYLN (SEQ ID NO:25) AASSLQS (SEQ ID NO:26) QQSYSPPWT (SEQ ID NO:27)
4G12 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:33) LGSNRAS (SEQ ID NO:34) MQALQTPLT (SEQ ID NO:35)
1A6 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:41) DNNKRPS (SEQ ID NO:42) GTWDSSLTGYV (SEQ ID NO:43)
1B7 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:49) DNNKRPS (SEQ ID NO:50) GTWDSSLTGWV (SEQ ID NO:51)
1E5 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:57) GKNNRPS (SEQ ID NO:58) NSRDSSGNHWV (SEQ ID NO:59)
2A3 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:65) GKNNRPS (SEQ ID NO:66) NSRDSTDNHLWV (SEQ ID NO:67)
2H11 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
3A12 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:73) DNNKRPS (SEQ ID NO:74) GTWDNSLSVWV (SEQ ID NO:75)
1F4 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:81) RNNQRPS (SEQ ID NO:82) AAWDDSLSGWV (SEQ ID NO:83)
Ab1 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
Ab2 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
Ab3 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
Ab4 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
Ab5 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
Ab6 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
Ab7 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
Ab8 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9) RNNQRPS (SEQ ID NO:10) AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)
表 3 ： 抗 KRas 抗體之重鏈 CDR 序列
抗體 CDR H1 CDR H2 CDR H3
1A5 SYSMN (SEQ ID NO:4) YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:5) GFYVRNWFDP (SEQ ID NO:6)
1D6 SYAMS (SEQ ID NO:20) AISSSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO:21) DQGGYGYPGESWFDY (SEQ ID NO:22)
2C1 SYSMN (SEQ ID NO:28)  SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:29) AFYSYMDV (SEQ ID NO:30)
4G12 SSNWWS (SEQ ID NO:36) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:37) ERTILTGYYGFDY (SEQ ID NO:38)
1A6 SYAIS (SEQ ID NO:44) GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:45) YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:46)
1B7 SYAIS (SEQ ID NO:52) GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:53) YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:54)
1E5 SYSMN (SEQ ID NO:60) SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:61) TNNYGYRYFDY (SEQ ID NO:62)
2A3 SYSMN (SEQ ID NO:68) SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:69) ATSSGYYYFDY (SEQ ID NO:70)
2H11 SSNWWS (SEQ ID NO:12) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
3A12 SYSMN (SEQ ID NO:76) YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:77) GKGIVGWGFFGMDV (SEQ ID NO:78)
1F4 SYSMN (SEQ ID NO:84) YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:85) SFGPYAFDV (SEQ ID NO:86)
Ab1 GSSIWSSN* (SEQ ID NO:91 ) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
Ab2 GSNISSSN* (SEQ ID NO:92 ) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
Ab3 GSSIFSSN* (SEQ ID NO:93 ) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
Ab4 GSSIMSSN* (SEQ ID NO:94 ) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
Ab5 GSSIYSSN* (SEQ ID NO:95 ) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
Ab6 GGNIWSSN* (SEQ ID NO:96 ) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
Ab7 KGSIWASH* (SEQ ID NO:97 ) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
Ab8 KGSIWSSN* (SEQ ID NO:98 ) EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13) GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)
* = Chothia 編號
表 4 ： 抗 KRas 抗體之輕鏈可變區序列
抗體 輕鏈可變區序列
1A5 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDHDYPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:7)
1D6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:23)
2C1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSPPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:31)
4G12 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:39)
1A6 SVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLTGYVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:47)
1B7 SVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLTGW VFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:55)
1E5 LTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:63)
2A3 ELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSTDNHLWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:71)
2H11 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
3A12 SVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDNSLSVWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:79)
1F4 VLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:87)
Ab1 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
Ab2 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
Ab3 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
Ab4 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
Ab5 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
Ab6 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
Ab7 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
Ab8 SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:15)
表 5 ： 抗 KRas 抗體之重鏈可變區序列
抗體 重鏈可變區序列
1A5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFYVRNWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8)
1D6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGGYGYPGESWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:24)
2C1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAFYSYMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:32)
4G12 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERTILTGYYGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:40)
1A6 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDFWSGYPGGLFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:48)
1B7 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDFWSGYPGGLFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:56)
1E5 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTNNYGYRYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:64)
2A3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATSSGYYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:72)
2H11 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:16)
3A12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGIVGWGFFGMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:80)
1F4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSFGPYAFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:88)
Ab1 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGSSIWSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:99 )
Ab2 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGSNISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:100 )
Ab3 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGSSIFSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:101 )
Ab4 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGSSIMSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:102 )
Ab5 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGSSIYSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:103 )
Ab6 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGNIWSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:104 )
Ab7 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSKGSIWASHWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:105 )
Ab8 EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSKGSIWSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:106 )
基於 2H11 抗體之晶體結構，進一步改善與 KRas-GDP 及 KRas-GTP 之結合親和力。使用 NNK 密碼子使抗體部分隨機化，并執行活體外噬菌體選擇，以鑑定具有改善之親和力的變體。將獨特序列重新格式化為 IgG。藉由如本文所述之 SPR 兩側不同 KRas 蛋白質之各種變體的解離速率。表 6 表明，各種變體對 KRas 蛋白質中的至少一種表現出較慢之解離速率，表明親和力得到改善。表 6 ： CLAMP 變體對不同 KRas 蛋白質之解離速率
KRasG12Ci -GDP+GNE-1952 KRasG12C GDP KRasG12C GMPPcP
kd (1/s) 倍數改善 kd (1/s) 倍數改善 kd (1/s) 倍數改善
2H11 5.60E -03 1.00 2.10E -02 1.00 1.70E -02 1.00
Ab1 5.90E -04 9.49 1.70E -03 12.35 1.80E -03 9.44
Ab2 2.70E -02 0.21 5.40E -03 3.89 5.90E -03 2.88
Ab3 8.40E -04 6.67 5.20E -03 4.04 5.30E -03 3.21
Ab4 8.50E -04 6.59 6.20E -03 3.39 6.30E -03 2.70
Ab5 6.80E -04 8.24 4.80E -03 4.38 4.80E -03 3.54
Ab6 3.10E -03 1.81 2.20E -02 0.95 2.10E -02 0.81
Ab7 8.40E -04 6.67 4.10E -03 5.12 4.00E -03 4.25
Ab8 6.60E -04 8.48 3.80E -03 5.53 3.50E -03 4.86
實例 3 ：將 KRas 連繫至 CLAMP 以改善親和力
還製備了包含 KRas 蛋白質與本文所述之 CLAMP 之 Fab、scFv 或 IgG 的融合體。該融合蛋白可導致 Fab 附近之 KRas 局部濃度增加，並可能表現出更高之親和力。構建以下序列，其中 KRas 融合至 2H11 Fab 之 LC 或 HC 的 N 端。
Avi.TEV.KRas.G4S4.2H11.Fab.LC
重鏈序列：
EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (Seq ID No:107)
輕鏈序列：
GLNDIFEAQKIEWHEGSENLYFQSTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (Seq ID No:108)
Avi.TEV.KRas.G4S4.2H11.Fab.HC
重鏈序列：
GLNDIFEAQKIEWHEGSENLYFQSTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (Seq ID No:109)
輕鏈序列：
SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (Seq ID No:110)實例 4 ：偵測細胞中之 KRasG12C 烷基化
以下實例描述了使用抗 KRas 抗體 1A5 對 KRasG12C 突變癌細胞中烷基化 KRasG12C 之偵測。 材料及方法
免疫螢光及高通量成像 將細胞 (根據細胞系不同，每孔包含 20000 至 40000 個細胞) 接種到塗布有聚-L-賴氨酸的 96 孔板 (Cell Carrier Ultra; Perkin Elmer) 中，並補充以完全培養基 (包含 2% L-麩醯胺酸及 10% FBS 之 RPMI)。第二天，將細胞用指定濃度之 KRasG12C 抑制劑處理，並孵育指定的時間。處理結束後，將細胞用冷的 1X PBS 洗滌兩次，在室溫下用 3% 多聚甲醛固定 20 分鐘，用 1X PBS 洗滌 10 分鐘，並在室溫下用 50 mM NH4 Cl 在 10 分鐘內淬滅 PFA。將細胞用 1X PBS 再次洗滌 5 分鐘，然後於室溫下用 1X Perm/洗滌緩衝液 (BD, Fisher Scientific) 洗滌 20 分鐘。然後於室溫下將細胞與 Perm/洗滌緩衝液中以指定濃度稀釋之初級抗體一起孵育 2 小時。然後將細胞用 Perm/洗滌緩衝液洗滌三次，每次 10 分鐘，然後與共軛之螢光二級抗體一起孵育 20 分鐘至 60 分鐘 (比率為 1:500 之 Alexa488 抗人與 Alexa647 抗兔或抗大鼠，得自 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。將 100 ml 300 nM DAPI 在 15 分鐘內加入各個孔中，然後將孔用 Perm/洗滌緩衝液洗滌兩次，並用 1X PBS 洗滌一次，然後進行成像。
在 Opera PhenixTM HCS 儀器 (PerkinElmer Inc.) 上使用 40X 水浸鏡頭及共焦模式進行成像，以提高膜掃描能力。對於每個孔，採集 4-5 個視野，以便更好地定量分析螢光強度，並利用 Harmony® (PerkinElmer Inc.) 軟體進行分析和定量。
西方墨點法。 將 HCC1171 細胞 (20000/mL) 接種到包含完全培養基 (含 2% L-麩醯胺酸及 10% FBS 之 RPMI) 的 T-75 超低粘附 ULA 板 (Corning® Inc.) 中，並使其生長過夜。第二天，將細胞用 5 mM ARS853 處理 18-24 小時。第二天，將細胞沉澱並用 1X PBS 洗滌兩次，並補充不含化合物之完全培養基，該培養基中添加或不添加 50 mg/mL 環己醯亞胺 (Sigma) 作為新蛋白質合成之對照，持續 24 或 48 小時。然後在處理結束時收集細胞，用 1X PBS 洗滌一次，然後用包含 Halt™ 蛋白酶及磷酸酶抑制劑 (Thermofisher Scientific™) 的 Ripa 緩衝液 (Thermofisher Scientific™) 溶解，以收集蛋白質。利用穿刺™ BCA 測定 (Thermofisher Scientific™) 定量蛋白質，其然後在 100 V 下於 Novex™ 4-20% Tris-甘氨酸凝膠上運行 3 小時，並使用 Trans-Blot® Turbo™ 轉移系統 (Bio-Rad Laboratories) 進行轉移。將膜用 Li-Cor Odyssey® TBS 封閉緩衝液封閉 1 小時，與初級抗體 (Proteintech: KRAS 抗體 #12063-1-AP，Cell Signaling Technology：pERK(Thr 202/Tyr 204) #9101，總 ERK #9102，pS6 (Ser 235/236) #2211 及 HSP90 #4874) 孵育過夜，然後在 10 min 內用 TBST 洗滌 3 次，然後添加二級抗體 (Li-Cor)。膜最終用 TBST 緩衝液洗滌 3 次，並在 Li-Cor Odyssey® CLx 儀器上成像。
活體內螢光流式細胞分選儀 (FACS) 。 為評估腫瘤藥效學，使用 gentleMACS™ 解離器 (Miltenyi Biotec)，於 37℃ 下將收穫的腫瘤用 Liberase DL (0.2 U /ml, Sigma-Aldrich, SKU No. 5466202001) 及 DNase I (40 U/ml, Sigma-Aldrich, SKU No. 10104159001) 消化 30 分鐘。製備單細胞懸液，並於 4℃ 下對 EpCAM (殖株 EBA1，BD Biosciences，目錄號 743544) 及 Fixable Viability 染料 (ebioscience) 染色 30 分鐘並洗滌。於 4℃ 下，將細胞用 Cytofix 緩衝液 (BD Biosciences，目錄號 51-2090KZ) 固定 30 分鐘，並用 Perm/洗滌緩衝液 (BD Biosciences，目錄號 51-2091KZ) 進行洗滌。於 4℃ 下對 1A5-488，pS6 (殖株 N7-548，BD Biosciences，目錄號 561457) 進行細胞內染色 60 分鐘，並用 perm 洗滌緩衝液洗滌，並重懸於 FACS 緩衝液中。利用 BD Symphony FACS 儀器分析細胞。使用 GraphPad prism 軟體第 7 版 (GraphPad, San Diego, CA)；Flowjo 10.5.3 (FlowJo, BD, CA) 對資料進行分析。
測試 1A5 抗 KRas 抗體能否用於 KRasG12C 突變癌細胞中烷基化 KRasG12C 之特異性可視化。使用 1A5 抗 KRas 抗體 (圖 2A-2C) 以劑量依賴性方式偵測經各種 G12C 共價分子(包括 GNE-1952、ARS-853、ARS-1620 及 AMG 510) 處理之 H1171 KRasG12C 細胞而非 HCT116 KRasG13D 細胞之免疫螢光 (IF) 染色，進一步確認 1A5 識別由多個 KRasG12C 共價分子誘導之共同構形的能力。
定量分析細胞中 KRasG12C 烷基化之動力學 (圖 2B)。這些結果與藉由免疫墨點法獲得的大量細胞群中烷基化 KRas (圖 2D) 及抑制 KRas 途徑標誌物 (如 pERK 和 pMEK) 所獲得的值相符。在各個細胞中用 1A5 對烷基化 KRasG12C 進行 IF 染色，提供了額外信息，表明 KRasG12C 烷基化之動力學令人驚訝地同時發生於細胞膜及點狀隔室中 (圖 2A，圖 2B)。由於不存在針對 RAS-GDP 之特異性抗體，因此用 1A5 抗 KRas 抗體進行染色，提供了有關 KRasG12C -GDP 在烷基化時在細胞中之定位的信息。1A5 抗 KRas 抗體也可以偵測表現極低水平之 KRasG12C 蛋白質的許多 KRasG12C 細胞系中之烷基化 KRasG12C -GDP (圖 2E)。
由於 FACS 能夠實現單細胞分析，並可能將烷基化水平與對下游傳訊的藥效學效應相關聯，因此評估了 1A5 抗 KRas 抗體在 FACS 染色中之應用。1A5 抗 KRas 抗體特異性偵測烷基化 KRasG12C -GDP 水平隨化合物水平的提高而提高 (圖 2F)。此外，將細胞與抗 pS6 抗體 (KRAS 活性之下游標誌物) 共染色，且正如預期的那樣，大多數細胞群中之 pS6 水平呈劑量依賴性下降 (圖 2F)。實例 5 ：被選抗 KRas 抗體與市售的抗 KRas 抗體的比較
以下實例描述了本文所披露之被選抗 KRas 抗體與一組市售的的抗 KRas 抗體的 KRas 結合之構形特異性的比較。 材料及方法
市售的之抗 KRas 抗體。 所用市售抗體如下：iDab6 (Tanaka, T. 等人，EMBO J 2007; 26:3250-3259) 與兔 IgG 抗 Ras 抗體 (EP1125Y) (Abcam, ab52939)、KRas-2B 特異性兔多株抗體 (Proteintech，目錄號 16155-1-AP)、Ras10 (Millipore，目錄號 05-516)、3B10-2F2 (Sigma-Aldrich，目錄號 WH0003845M1) 及 234-4.2 (Millipore，目錄號 OP24) (圖 3A-3D)。針對烷基化 KRasG12C 之抗體 ELISA 。 於 4℃ 下，將 PBS 中 0.3 μg/mL 生物素化 KRasG12C -GDP + GNE-1952 及 KRasG12C -GDP 過夜塗布到 NeutrAvidin ELISA 板 (Thermo Scientific) 上，一式三份。將板用 PBSBT 洗滌，並在 25℃ 及不斷搖動下，在 1-2 小時內添加從 10 μg/mL 開始的連續稀釋之抗 KRas 抗體。洗滌後，在 25℃ 及不斷搖動下，在 1 小時內添加物種匹配之 Fc 特異性 HRP 2 抗體。用 PBSBT 洗滌後，用 TMB 受質使板顯影 5 分鐘，並在 650 nm 處偵測。
免疫沉澱。 利用被選抗 KRas 抗體 1A5 及 2H11 及一組市售的的抗體對經過 DMSO 或 ARS-1620 處理的 H1171 KRASG12C 突變癌細胞中烷基化及未烷基化 KRasG12C 進行免疫沉澱。
考察一組市售的的 KRas 之抗體，以測定其構形特異性。藉由免疫沉澱及 ELISA (圖 3A，圖 3B) 鑑定對未烷基化與烷基化 KRasG12C 具有可比之親和力的兩種抗體 (Abcam EP1125Y 及 Ras10)，表明這些抗體無構形特異性。相比之下，據報道對 HRasGTP 具有高特異性之 iDab6 抗體幾乎不與烷基化 KRasG12C -GDP 結合，但同時結合 GDP 及 GMPPcP 結合形式，藉由 ELISA 表明優先結合 GDP (圖 3B)，且可能僅使細胞中之未烷基化 KRasG12C 形成免疫沉澱 (圖 3A) (Tanaka, T. 等人，EMBO J 2007; 26:3250-3259)。由於 iDab6 抗體結合同時涵蓋 SWI 及 SWII 區域之抗原決定基，因此由 KRasG12C -GDP 之烷基化所誘導之 SWII 構形可能會阻止 iDab6 結合。僅 1A5 及 2H11 優先結合至烷基化 KRasG12C 。實例 6 ： 1A5 抗 KRas 抗體結合細胞中之 KRas
以下實例提供了被選抗 KRas 抗體 1A5 與市售的抗 KRas 抗體結合細胞中之 KRas 的能力之比較。 材料及方法
免疫螢光及高容量成像。 將細胞 (根據細胞系不同，每孔包含 20000 至 40000 個細胞) 接種到塗布有聚-L-賴氨酸的 96 孔板 (Cell Carrier Ultra; Perkin Elmer) 中，並補充以完全培養基 (包含 2% L-麩醯胺酸及 10% FBS 之 RPMI)。第二天，將細胞用指定濃度之 KRASG12C 抑制劑處理，並孵育指定的時間。處理結束後，將細胞用冷的 1X PBS 洗滌兩次，在室溫下用 3% 多聚甲醛固定 20 分鐘，用 1X PBS 洗滌 10 分鐘，並在室溫下用 50 mM NH4 Cl 在數分鐘內淬滅 PFA。將細胞用 1X PBS 再次洗滌 5 分鐘，然後於室溫下用 1X Perm/洗滌緩衝液 (BD, Fisher Scientific) 洗滌 20 分鐘。然後於室溫下將細胞與 Perm/洗滌緩衝液中以指定濃度稀釋之初級抗體 (1A5 或 iDab6 或兩者) 一起孵育 2 小時。然後將細胞用 Perm/洗滌緩衝液洗滌三次，每次 10 分鐘，然後與共軛之螢光二級抗體一起孵育 20 分鐘至 60 分鐘 (比率為 1:500 之 Alexa488 抗人與 Alexa647 抗兔或抗大鼠，得自 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。將 100 ml 300 nM DAPI 在 15 分鐘內加入各個孔中，然後將孔用 Perm/洗滌緩衝液洗滌兩次，並用 1X PBS 洗滌一次，然後進行成像 (圖 3C)。
在 Opera PhenixTM HCS 儀器 (PerkinElmer Inc.) 上使用 40X 水浸鏡頭及共焦模式進行成像，以提高膜掃描能力。對於每個孔，採集 4-5 個視野，以便更好地定量分析螢光強度，並利用 Harmony® (PerkinElmer Inc.) 軟體進行分析和定量。
在沖洗實驗中，如先前所述將細胞鋪板，並用 KRASG12C 抑制劑處理 18-24 小時。24 小時後，對一塊板成像以作爲對照，并將其他板用冷的 1X PBS 洗滌兩次，並與 150 mL 完全不含化合物之培養基孵育 24 小時或 48 小時，然後如上所述進行染色及成像。
測試 1A5 及 iDab6 (Tanaka, T. 等人，EMBO J 2007; 26:3250-3259) 抗體是否能夠結合使用以共染色並可視化同一細胞內的未烷基化及烷基化 KRasG12C 。使用 1A5 抗 KRas 抗體及 iDab6 抗體兩者，對經過 ARS-1620 劑量滴定處理後的 H1171 細胞進行免疫螢光 (IF) 實驗。與之前的 1A5 IF 實驗相似，偵測到 1A5 染色之增加與高濃度 ARS-1620 處理相關。相比之下，1A5 染色之增加與 iDab6 抗體染色之下降相一致 (圖 3C)。
用兩種抗體共染色，可以監測 KRasG12C 之重新合成。藉由 IF 及免疫墨點分析表明，用 ARS-1620 處理 KRasG12C 細胞 16 小時，導致 KRasG12C 幾乎完全烷基化 (圖 2D)。在沖洗藥物後，未烷基化 KRasG12C 開始出現於 24 小時後 (圖 2D)，這與 1A5 抗 KRas 抗體之下降及 iDab6 抗體染色之增加相一致。
因此，1A5 抗 KRas 抗體可用於研究 KRasG12C 烷基化以及跟踪細胞中之 KRasG12C -GDP。實例 7 ：在高及低 KRasG12C 表現小鼠模型中， ARS-1620 治療之烷基化 KRasG12C 的劑量依賴性活體內偵測
以下實例描述了小鼠模型中抗 KRas 抗體與 KRasG12C 之活體內結合。 材料及方法
活體內腫瘤研究。 從 Charles River Lab 獲得 16-17 周齡且重 24-27 g 之雌性 C.B-17 SCID (近親雜交) 小鼠。它們在皮下左右側接種五百萬 NCI-H358 非小細胞肺癌細胞 (懸浮於 1:1 Hanks 平衡鹽溶液的混合物中，其包含 1:1 比率之 Matrigel)。監測腫瘤，直至其平均腫瘤體積達到 400-600 mm3 。藉由管飼法經胃管灌食法給予小鼠單劑量 0 (載體 – 100% Labrasol)、50 mg/kg 或 200 mg/kg ARS1620 口服 (PO)，給藥體積為 100 μL。在給藥後 8 小時或 24 小時，收集血漿及腫瘤樣品。
活體內 FACs 測定。 為評估腫瘤藥效學，使用 gentleMACS™ 解離器 (Miltenyi Biotec)，於 37℃ 下將收穫的腫瘤用 Liberase DL (0.2 U /ml, Sigma-Aldrich) 及 DNase I (40 U/ml, Sigma-Aldrich) 消化 30 分鐘。製備單細胞懸液，並於 4℃ 下對 EpCAM (殖株 EBA1，BD Biosciences) 及 Fixable Viability 染料 (ebioscience) 染色 30 分鐘並洗滌。於 4℃ 下，將細胞用 Cytofix 緩衝液 (BD Biosciences) 固定 30 分鐘，並用 Perm/洗滌緩衝液 (BD Biosciences) 進行洗滌。於 4℃ 下對 1A5-488，pS6 (殖株 N7-548，BD Biosciences) 進行細胞內染色 60 分鐘，並用 perm 洗滌緩衝液洗滌，並重懸於 FACS 緩衝液中。利用 BD Symphony FACS 儀器分析細胞。使用 GraphPad prism 軟體第 7 版 (GraphPad, San Diego, CA)；Flowjo 10.5.3 (FlowJo, BD, CA) 對資料進行分析。
在製成新鮮冷凍 (FP) 組織的腫瘤樣品中，易於偵測到烷基化 KRasG12C (圖 4A)。還藉由 1A5 抗 KRas 抗體偵測表現較低含量之烷基化 KRasG12C 的腫瘤 (圖 4B)。與活體外細胞實驗類似，1A5 抗 KRas 抗體還可在 FACS 實驗中偵測離體腫瘤樣品中之烷基化 KRasG12C ，且可與 MAPK 標誌物 pS6 多重複合 (圖 4C)。這些結果表明，1A5 抗 KRas 抗體能夠測量 KRasG12C 腫瘤樣品中 KRasG12C 抑制劑之直接標靶嚙合，並使用 RAS 途徑活化之標誌物進行多重分析。
以下實例描述了如下實驗：該等實驗測試 II 類被選抗 KRas 抗體 (例如 2H11) 識別烷基化所誘導之 KRas 未烷基化 KRasG12C 的能力是否可用於改善袋中之小分子化合物結合之親和力。
實例 8 ：被選抗 KRas 抗體改善了 SWII 配體與 KRasG12C 及 KRasWT 之親和力 材料及方法
使用 2H11 抗 KRas 抗體的表面電漿子共振 (SPR) 實驗。 將一系列 S SA (鏈黴親和素) 晶片插入 Biacore T200 (GE Health Sciences) 中。將儀器灌注運行緩衝液 (50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl，0.2% (w/v) PEG-3350、0.1% CM-聚葡萄醣 (w/v)、0.1 mM TCEP、10 mM MgCl2、100 nM GDP 及 2% (v/v) DMSO)。用共價結合將 KRasG12C 預先封閉在 12 位，捕獲 KRasG12C 烷基化劑以在流道 1 (FC1) 及 FC3 上產生 2000-2500 反應單位 (RU)，用作 KRasWT 及 KRasG12C 之參比，並僅允許 Switch II (SWII) 袋處進行親和力測量。在 FC2 及 FC4 上捕獲 KRasWT 或 KRasG12C ，其處於參比通道捕獲水平之 100 RU 以內，並在 FC 2-1、FC 4-3 模式下採集資料。隨後通過注入 100 μg/mL 胺-PEG-生物素 (Thermo Fisher)，封閉所有通道。在運行開始時，以 200 nM 注入 2 次 2H11，持續 120 秒，以使 FC3 和 FC4 達到飽和，並在整個運行過程中每 14 個週期注入 100 nM，以確保完全佔用。在 2 倍劑量反應及 20-30 秒接觸時間和 30 秒解離的條件下，對 50 3M – 1.75 3M 之分析物樣品進行測試。在 Biacore S200 評估軟體 1.0 中利用 1:1 親和力模型分析資料，並在 Scrubber 2 (Biologic Software) 中作圖 (圖 5A 及圖 5B )。
開發出一種表面電漿子共振 (SPR) 測定法特異性偵測與 SWII 袋之結合，其中使用 SWII 封閉之參比。測試各種 SWII 共價分子 (即 GNE-1952、ARS-853、ARS-1620) 以及缺少丙烯醯胺功能之 GNE-1952 形式在存在及不存在 2H11 抗 KRas 抗體的情況下與 KRasG12C -GDP 之親和力。另外，包括 KRasWT -GDP 以測試 2H11 能否穩定其他 KRas 變體之 SWII 袋。在存在 2H11 抗 KRas 抗體的情況下，親和力大大增强 (圖 5A 及 圖 5B)。2H11 抗 KRas 抗體提高了化學上多樣化的 KRasG12C 烷基化劑的親和力，進一步確認其不偏向某種特定之化學型，並表明它可以在不存在配體的情況下穩定 SWII 袋之開放構形。實例 9 ：抗 KRas 抗體 :KRasG12C 複合物之晶體結構
以下實例描述了與抗 KRas 抗體複合的 KRasG12C 之晶體結構的測定。 材料及方法
KRasG12C 蛋白質表現及純化。 將帶有和不帶有半胱胺酸突變 (S39C、C51S、C80L、C118S) 之 N 末端 His 標記之 KRasG12C (1-169) 構建體選殖到 pET-52b 載體中，並轉化到 BL21 (DE3) 細胞中。細胞於 37℃ 下在包含 50 μg/mL 卡本西林的 LB 培養基中生長至 OD600 吸光度達到 0.5，然後轉移至 16℃ 下，並在 OD600 吸光度是 0.8 的條件下用 0.3 mM IPTG 進行誘導。誘導後 16 小時收穫細胞，並藉由在包含 50 mM Hepes pH 8.0、500 mM NaCl、5 mM MgCl2、10 mM 咪唑、10% 甘油、1 mM TCEP、1 mM PMSF、benzonase 及無 EDTA 之蛋白酶抑制劑的緩衝液中流過微細流體均質機來溶解沉澱。藉由在 12,000K 下旋轉 1 小時，使細胞裂解物澄清。在包含 20 mM Hepes pH 8.0、300 mM NaCl、10% Glycerol、5 mM MgCl2、1 mM TCEP 之緩衝液中，將澄清後之細胞裂解物上樣至 HiTrap 柱，並用 300 mM 咪唑洗脫結合之 KRas 蛋白質。藉由與 TEV 蛋白酶孵育將 N 端的 His 標記裂解，並藉由鎳柱將其去除。藉由尺寸排阻 S75 柱 (GE Healthcare) 在包含 20 mM Hepes pH 8.0、150 mM NaCl、5 mM MgCl2 之緩衝液中對 KRas 蛋白質進行净化。藉由 SDS-PAGE 測定，KRas 之純度大於 95%。為了將 GDP 負載到 KRas 上，首先將其與 40 mM EDTA 及 2 mM GDP 在 20℃ 下孵育 1-2 小時。然後將其緩衝液交換到無 EDTA 且無核苷酸之緩衝液中。然後將 KRas 與 2H11 Fab 按 1:1 複合，並藉由尺寸排阻 S75 柱在包含 20 mM Hepes pH 8.0、150 mM NaCl、5 mM MgCl2 之緩衝液中進一步純化。
GNE-1952 引起之 KRasG12C 蛋白質烷基化。 爲了用 GNE-1952 使 KRas 烷基化，將 KRasG12C 在 20℃ 下與 5 mM GDP、20 mM EDTA 及 150 μM GNE-1952 在包含 20 mM Hepes pH 8.0、150 mM NaCl、10% 甘油及 2 mM TCEP 之緩衝液中孵育過夜。通過質譜觀察質量偏移，確認實現了完全烷基化。藉由尺寸排阻 S75 16/60 柱將 KRas 緩衝液交換為包含 20 mM Hepes pH 7.0、150 mM NaCl 及 10% 甘油之緩衝液。然後將 KRas G12C 與 2H11 Fab 按 1:1 複合，並藉由尺寸排阻 S75 柱在包含 20 mM Hepes pH 8.0、150 mM NaCl 之緩衝液中進一步純化。
KRasG12C 與 2H11 Fab 之結晶。 KRasG12C /2H11 之衍射質量晶體在 19℃ 下由 1.0 μL + 1.0 μL 蒸氣擴散沉滴形成，該沉滴包含 10 mg/mL KRas 及 24 mg/mL 2H11 Fab，針對包含 0.1 M 二甲胂酸鈉 pH 6.5、40% 2-甲基2,4-戊二醇 (MPD)、7% Peg 8000、0.5% 醋酸乙酯、10 mM 精胺四鹽酸鹽之結晶緩衝液。晶體在兩週內出現，且通常生長至 150 x 20 x 30 μM。
KRasG12C /GNE-1952/2H11 之衍射質量晶體在 19℃ 下由 1.0 μL + 1.0 μL 蒸氣擴散沉滴形成，該沉滴包含 15 mg/mL KRas/2H11 複合物，針對包含 0.1 M MES pH 6.0、21% Peg 4K 及 0.2 M 硫酸鋰之結晶緩衝液。晶體在 10 天內出現，且生長至大小 100 x 15 x 30 μM。
KRasG12C /GNE-1952 晶體在 19℃ 下由 1.0 μL + 1.0 μL 蒸氣擴散沉滴形成，該沉滴包含 KRasG12C /GNE-1952，針對包含 0.10% 正辛基-B-D-葡萄糖苷、0.1 M 檸檬酸鈉 pH 5.5、22% PEG 3350 之結晶緩衝液。
為準備採集繞射資料，在上述三種情況下，將 10% 甘油作為低溫緩衝液加入結晶緩衝液中，然後快速凍結晶體。繞射資料採集及結構確定。
使用 PILATUS3 6M 偵測器，在斯坦福同步輻射光源 (SSRL) 光束或先進光源 (ALS) 光束 5.0.2 上使用單色 X 射線採集 KRasG12C /GNE-1952、KRasG12C /2H11 及 KRasG12C /GNE-1952/2H11 晶體之繞射資料。對於每個完整資料集，將旋轉方法應用於單晶。在整個資料採集過程中，晶體均保持在低溫下。使用程式 XDS (Kabsch, W.,Acta crystallographica.Section D, Biological crystallography 2010; 66:125-132) 及 CCP4 程式套裝 (A.J.McCoy 等人，Journal of applied crystallography 2007; 40: 658-674) 完成資料簡化。
資料簡化統計量如表 7 所示。在表 7 中，括號中的值具有最高解析度之外殼，Rsym = Σ|Ih i - Ih|/ΣIhi (其中 Ihi 是第i 個與對稱有關的反射h 的觀測的標度強度，Ih 是平均值)，Rcryst = Σh |Foh - Fch |/Σh Foh (其中 Foh 及 Fch 是觀察及計算出的反射h 的結構因子振幅)，且 Rfree 值針對不包含在細化中之 5% 隨機選擇的反射計算得出。表 7 ：結晶學統計數據
蛋白複合物 KRasG12C /GNE-1952 KRasG12C /2H11 KRasG12C /GNE-1952/2H11
PDB 代碼 TBD (2016_02_03_SSRL_122, CRY21253) TBD (2018_02_28_ALS_502, CRY25665) TBD (2019_07_24_SSRL_122, CRY30160)
空間群 P1 C2 P21
晶胞 a =33.6Å，b =44.0Å，c =65.3Å， α=89.0°，β=85.0°，γ=80.0° a =149.9Å，b =68.8Å，c =101.0Å， α=γ=90°，β=114.1° a =59.2Å，b =51.9Å，c =107.5Å， α=γ=90°，β=131.0°
解析度 2.15 Å 2.20 Å 2.00 Å
實測總反射 69746 (639) 317770 (3618) 151246 (1545)
完整性 (%) 89.3 (92.2) 99.7 (97.3) 97.9 (99.3)
冗餘 3.9 (3.9) 6.7 (6.9) 3.5 (3.6)
I/σ 8.4 (1.7) 11.6 (1.9) 15.5 (2.1)
Rsym 0.118 (0.782) 0.075 (0.945) 0.045 (0.592)
CC1/2 0.996 (0.745) 0.997 (0.807) 0.999 (0.778)
細化
解析度範圍 50-2.15 Å 50-2.20 Å 50-2.00 Å
Rcryst/Rfree 0.213/0.257 0.208/0.225 0.216/0.255
非氫原子 2978 4788 4888
水分子 148 104 257
平均 B 39.1 Å 79.7 Å 41.5Å
r.m.s.d. 鍵長 0.002 Å 0.004 Å 0.006 Å
r.m.s.d. 鍵角 0.539° 0.991° 0.863°
Ramachandran 0.915/0.078/0.003/0.003 0.883/0.110/0.002/0.006 0.892/0.100/0/0.008
使用以下程式，藉由分子置換 (MR) 對結構進行定相：Phaser (A.J.McCoy 等人，Journal of applied crystallography 2007; 40: 658-674)。利用先前發表的 KRasG12D 之晶體結構 (PDB 代碼 4DSU) 及 Fab 結構 Fab 結構 (PDB 代碼 3R1G) 作爲 MR 搜索模型。使用圖形程式 COOT (P. Emsley, K. Cowtan,Acta crystallographica.Section D, Biological crystallography 2004; 60:2126-2132) 進行手動重建。使用程式 REFMAC5 (G.N.Murshudov, A.A.Vagin, E.J.Dodson,Acta crystallographica.Section D, Biological crystallography 1997; 53:240-255) 及 PHENIX (P.D.Adams 等人，Acta crystallographica.Section D, Biological crystallography 2010；66:213-221)，通過最大似然目標函數、各向異性單個 B 因子細化及 TLS 細化，對結構進行進一步迭代細化，以獲得表 7 中所示之最終統計量。
為進一步瞭解 2H11 抗 KRas 抗體之獨特的作用模式，以 2.2Å 的解析度測定與 2H11 Fab 複合的 KRasG12C -GDP 的晶體結構 (圖 6A)。2H11 從 SWII 之外表面逼近 KRasG12C ，並確實穩定 SWII 袋之開放構形。Fab 結合掩蓋了約 745Å2 的表面積，形狀互補分數為 0.64。抗原決定基包含來自 SWI、SWII 及中心核心 β-折疊的殘基。2H11 互補決定區 (CDR) H1 及 H3 構成與 KRasG12C 的大部分直接接觸 (圖 6B)。13-殘基長 H3 環結合至 SWII 區。在抗原決定基的中心，HC.Trp99 錨定於小的疏水袋中，該疏水袋被 KRasG12C 殘基 Lys5、Leu6、Val7、Ser39、Asp54、Leu56、Tyr71、Thr74、Gly75 (圖 6C) 包圍。先前發現該袋結合包含小分子之吲哚，該等小分子抑制 SOS 依賴性核苷酸交換 (T. Maurer 等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:5299-5304；Q. Sun 等人，Angew Chem Int Ed Engl 2012; 51:6140-6143)。有趣的是，抗體利用化學上相似的色胺酸側鏈開發了該位點。CDRH1 藉由與一部分 Ras 結合域 (RBD) 結合位點堆積而結合至 SWI 區域附近。與 iDab6 不同，2H11 與 SWI 殘基幾乎沒有直接接觸 (圖 6F)，因此對結合之核苷酸類型較不敏感。CDR L2 及 H2 藉由形成少量范德華接觸而參與 KRas 識別。L2 特別引人關注，因為它接觸 SWII 螺旋之 C 端，從而為 SWII 環提供額外的穩定性，但並不過度限制構形。如圖 6E 所示，SWII 之最柔韌的部分 Gln60-Ala66 完全不與 2H11 直接接觸，因此其保持一定程度的構形柔韌性，可以結合 SWII 袋中的各種配體。例如，KRasG12C -GDP/2H11 複合物結構與結合 GNE-1952 之 KRasG12C -GDP 結構的比較 (圖 6D) 表明，穩定後之 SWII 袋足夠打開以容納抑制劑，且 SWII 之柔韌性允許向內略微閉合以完全包裹配體。為驗證該假設，測定與 GNE-1952 烷基化 KRasG12C 複合的 2H11 之晶體結構。GNE-1952 的存在確實與 SWII 殘基中主鏈及側鏈構形的變化相關 (圖 6C)，而其餘 KRas 及 Fab CDR 結構則保持不變。在化合物結合後，His95 發生重要側鏈翻轉，與喹唑啉氮形成氫鍵。該交互作用對於喹唑啉支架化合物似乎是常見的，且不受 2H11 Fab 結合而改變 (M.P. Patricelli 等人，Cancer Discov 2016; 6:316-329)。實例 10 ：被選抗 KRas 抗體擴展至其他 KRas 突變型
以下實例描述了被選抗 KRas 抗體結合各種 KRas 突變型的能力。 材料及方法
針對烷基化 KRasG12C 之抗體 ELISA。於 4℃ 下，將 PBS 中 0.3 μg/mL 生物素化 KRasG12C -GDP + GNE-1952 及 KRasG12C -GDP 過夜塗布到 NeutrAvidin ELISA 板 (Thermo Scientific) 上，一式三份。將板用 PBSBT 洗滌，並在 25℃ 及不斷搖動下，在 1-2 小時內添加從 10 μg/mL 開始的連續稀釋之抗 KRas 抗體。洗滌後，在 25℃ 及不斷搖動下，在 1 小時內添加物種匹配之 Fc 特異性 HRP 2 抗體。用 PBSBT 洗滌後，用 TMB 受質使板顯影 5 分鐘，並在 650 nm 處偵測。
針對突變型 KRas-GDP 蛋白質之抗體 ELISA 。 於 4℃ 下，在 PBS 中將 KRas-GDP 蛋白質以 10 μg/mL 一式三份直接過夜塗布到 Maxisorb 板 (Thermo Scientific) 上。在 25℃ 下用 4% BSA 將板封閉 2 小時。在 25℃ 及不斷搖動下，在 1-2 小時內添加從 10 μg/mL 開始的 1A5 及 2H11 抗體的連續稀釋液。如上所述，使板顯影並讀取板。
為探討 2H11 能否還可以識別 GDP 結合態並可能穩定除 KRasG12C 以外之 KRas 突變型中 SWII 區域的開放構形，藉由 ELISA 評估抗體 1A5 及 2H11 與一組 KRas 突變型之結合 (圖 7)。令人驚訝的是，2H11 對 KRasG12V -GDP、KRasG12R -GDP 及 KRasQ61H -GDP 表現出強結合，且與 KRasG13D -GDP 及 KRasWT -GDP 之結合弱得多 (圖 7)。鑑於 2H11 抗 KRas 抗體結合了多種 KRas 突變型，並可能增加 SWII 袋結合物之親和力，因此它使鑑定靶向其他 RAS 突變之新型配體成為可能。實例 11 ：使用標靶及 CLAMP 共捕獲進行 CLAMP 協同 SPR 測定
將 BIACORE S200 (GE Healthcare Life Sciences) 設定爲分析溫度是 20℃，然後對接一系列 S SA 感測器晶片 (即帶有預塗布之鏈黴親和素的水凝膠塗布的感測器晶片)。用測定緩衝液將系統灌注三次，該緩衝液包含：50 mM (4-(2-羥乙基)-1-哌口井乙烷磺酸)，pH 7.5；150 mM NaCl；0.2% 聚乙二醇 (平均分子量 3350 Da)；0.1% 羧甲基化聚葡萄醣；10 mM 氯化鎂；100 nM 核苷酸 (GDP、GTP 或核苷酸類似物)；0.1 mM (三(2-羧乙基)膦)。重組表現生物素化突變型 KRas (即 KRasG12V -GDP、KRasG12D -GDP、KRasG12R -GDP 及 KRasG13D -GDP) 並在內部純化，對於給定之突變型 KRas，用測定緩衝液將其稀釋至最終濃度在 100-500 nM 範圍內。然後將該突變型 KRas 樣品注入感測通道，得到處於 2000 RU 至 3000 RU 範圍內的捕獲密度。這相當於在光學解析之水凝膠體積內的水凝膠濃度為約 0.9-1.5 mM。第二感測通道未經塗布，以提供參比感測通道。藉由注入 1 µM 生物素，使過量之未佔用生物素位點飽和。
使用測定緩衝液作為稀釋劑，由 10 mM 測試化合物 (與 SWII 袋結合之化合物) 儲備液 (溶於二甲基亞砜中) 製備一系列九倍稀釋液，其濃度範圍為 0.039 µM 至 10 µM。每個樣品及運行緩衝液中的二甲亞砜濃度均匹配為 1% (v/v)。以這種方式製備所有測試化合物之一組稀釋液。由包含各種濃度之二甲亞砜的測定緩衝液製備的一系列六個樣品，以便提供溶劑校正標樣。按照濃度從低到高之順序，將每個連續稀釋以 100 µL/min 的流速在 10 秒內注入所有感測通道，得到單個包含完整劑量反應的循環。藉由首先減去未塗布之感測通道的循環，然後減去單個空白循環 (其為不包含化合物之樣品) 對該循環進行雙重參考。每個化合物注入系列之後為空白注入循環，以便將近鄰之空白用於空白選擇。
將資料導出到 Biaevaluation 軟體 (GE Healthcare Life Sciences)，並進行動力學模型擬合以獲取交互作用常數。單個化合物之資料如圖 8 所示。該測定無需使用 2H11 Fab，因此返回與 KRasG12V -GDP 結合之化合物的交互作用常數，而無需協作擴增親和力。
如圖 8 所示，化合物濃度的增加導致劑量依賴性反應接近塗布有 KRasG12V -GDP 之表面的飽和。擬合單位點偽一級模型，得到kon 是 3.29 x 105 (1/Ms)，koff 是 1.3 (1/s)，且KD 是約 4 µM。可以觀察到，擬合之模型曲線與實驗反應循環很好地重疊。
為確定 2H11 Fab 之協同增強因子，重複上述測定，但包括在捕獲 KRas 突變型後及生物素封閉之前的 2H11-Fab 生物素捕獲步驟。
將 2H11-Fab 生物素以 200 nM 注入，直至結合反應達到近似平台區，並在預塗布之突變型 KRas 表面上產生約 2500-3000 RU (0.5 mM Fab) 之共捕獲 2H11。這表示 2H11 Fab: KRas 莫爾比是 1:2，並有效導致相等比例之弱結合位點 (即未結合 2H11 Fab 之 KRas) 與高親和力結合位點 (即 KRas-2H11 Fab 複合物)。共捕獲足夠之 Fab 以產生化學計量當量或過量 Fab，得到同質 KRas-2H11 Fab 複合物，並有可能進一步優化。
如上所述進行分析，但是將 1:1 模型置換為雙位點結合模型 (異質配體)，該模型可藉由擬合單週期動力學曲線來確定兩種位點的動力學及親和力，如圖 9 所示。如圖 9 所示，化合物濃度的增加導致雙相劑量依賴性反應。利用雙位點偽一級模型擬合資料，並返回高親和位點之交互作用常數，其中kon 是 6.6 x 105 (1/Ms)，koff 是 0.025 (1/s)，且 KD 是約 0.04 µM。可以觀察到，擬合之模型曲線與實驗反應循環很好地重疊。根據每次注入結束時較慢的解離相曲率，容易鑑定化合物與高親和力穩定之 SWII 位點之結合，該解離相曲率表明複合物更穩定。與弱親和力、未穩定之 SWII 位點的結合似乎為重疊的，但解離速度快。正如預期的那樣，與較高親和力穩定之 SWII KRas 之結合在低濃度下仍然達到飽和，而即使在最高測試濃度 10 µM 的情況下，與未穩定之弱親和力位點之結合仍然不飽和。重複該分析以選擇 SWII 結合化合物。協同因子表示為穩定後:未穩定之 SWII 結合的KD 比，且圖 10 總結了用於選擇化合物的共協同因子。
在圖 8 中，每次注入開始和結束時的曲率包含動力學信息，並有助於定義動力學速率常數，每次注入中間的平台區定義了每種劑量下的平衡反應。利用 1:1 偽一級模型擬合資料，疊加顯示以獲得結合速率常數、解離速率常數及親和力常數。
在非共捕獲之 SPR 中，可以在暴露於待測化合物之前預先結合抗體，並可以將其注入塗布有標靶之感測表面上，其中選擇濃度和接觸時間以使本文所述之抗體完全飽和 (即基本上無剩餘的未結合標靶)。但是，這種方法有其缺點。在高標靶濃度下，不可能將化學計量當量 (例如，每個標靶一個 Fab 臂) 的全尺寸抗體 (150 kDa) 濃度加載至塗布有標靶的水凝膠中。該上樣限值可能為過度擁擠及複合物交互作用 (分子尺寸排斥、等電點、靜電、水凝膠鏈密度及標靶密度) 而導致的水凝膠排斥效應的結果。
用於篩選的基於生物傳感器之測定和化合物結合表徵通常需要幾個小時或更長時間才能完成，在此期間，抗體可自由地從表面解離成連續流動的緩衝液流。因此，需要定期注入抗體以便使表面重新飽和。當抗體 KRas 複合物之半衰期相對較短 (例如 ＜ 15 min) 時，定期重新飽和為不切實際的，並且在測定過程中最多只能得到高度可變之佔用。因此，本文所述之共捕獲技術在確定交互作用及化合物親和力方面更有效且更出色。
圖 1A 示出 Ras 晶體結構的重疊。圖 1B 示出用於鑑定烷基化 KRasG12C -GDP 特異性單株抗體之活體外噬菌體展示選擇策略。圖 1C 示出與 KRasG12C -GDP+GNE1952、未烷基化 KRasG12C -GDP 及負調控結合之被選抗 KRas 單株抗體的酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 資料。 圖 1D 示出用不同藥劑烷基化時，來自結合 KRas 之被選抗 KRas 抗體 1A5 (x 軸左側) 及 2H11 (x 軸右側) 的表面電漿子共振 (SPR) 分析資料。圖 1E 示出被選抗 KRas 抗體 1A5 及 2H11 相對 KRasG12C -GDP+GNE1952 及 KRasG12C -GDP 的代表性 SPR 記錄曲線。將時間 (以秒為單位) 繪製於 x 軸上，並將反應單位繪製於 y 軸上。圖 1F 示出被選抗 KRas 抗體之抗原決定基聚類結果。圖 1G 示出來自經 ARS-1620 及未烷基化 KRasG12C -GDP 處理之細胞的被選抗 KRas 抗體 1A5 及 2H11 對烷基化 KRasG12C -GDP 的免疫沉澱。圖 2A 示出使用免疫螢光 (IF) 測定法之 H1171 KRASG12C 突變癌細胞中，與 DMSO 對照相比，經各種共價分子處理之細胞中的結合 KRasG12C 的 1A5 抗 KRas 抗體。圖 2B 示出 H1171 KRASG12C 突變癌細胞中經 ARS-1620 處理後 KRasG12C 之 1A5 抗 KRas 抗體在一定時間範圍 (在 y 軸上以小時指示) 內的染色及 ARS-1620 的劑量 (沿 x 軸以 μM 表示，與 DMSO 對照相比)。圖 2C 示出經 KRasG12C 抑制劑 GNE-1952 處理的 HCT116 KRasG13D 細胞中缺少 1A5 抗 KRas 抗體所引起之可觀察到的 KRas 染色。圖 2D 示出大量 H1171 KRASG12C 突變癌細胞群中 KRas 途徑標誌物、pERK、pS6 之烷基化 KRas 抑制的免疫墨點分析。如圖所示，用 DMSO、5 μM ARS-853 及/或 50 μg/ml 環己醯胺處理細胞。如圖所示，在處理後或在處理的沖洗後 6 小時、24 小時或 48 小時後收集樣品。圖 2E 示出免疫螢光測定中不同 KRASG12C 突變癌細胞模型中的 1A5 結合 KRasG12C 。用 5 μM ARS-1620 處理細胞。KRasG12C 表現的相對量在各個癌細胞模型中以 + 標記指示。圖 2F 示出經劑量增加之 ARS-1620 處理的 H1171 KRASG12C 突變癌細胞中 1A5 染色 (y 軸) 及 pS6 染色 (x 軸) 的流式細胞術測量結果，及與 DMSO 對照的對比 (左圖)。圖 3A 示出被選抗 KRas 抗體 1A5 及 2H11 對經過 DMSO 或 ARS-1620 處理的 H1171 KRASG12C 突變癌細胞中烷基化及未烷基化 KRasG12C 的差異免疫沉澱結果，及與一組市售的抗體的對比。圖 3B 示出 KRasG12C -GDP+GNE1952 相比於未烷基化 KRasG12C -GDP、KRasG12C -GMPcP 及單獨 NeutrAvidin 上一組市售的的抗體 (在 x 軸上表示) 的 ELISA 結果。圖 3C 示出在 ARS-1620 的劑量滴定中 1A5 抗 KRas 抗體 (頂部行) 和 iDab6 (底部行) 的免疫螢光測定結果。DAPI 染色的 DNA 以藍色顯示。ARS-1620 的劑量以 nM 為單位，顯示在各個圖片中。圖 4A 示出與僅載體對照對比，雌性 C/B17 SCID 小鼠中經 50 mg/kg 或 200 mg/kg ARS-1620 處理 8 小時及 24 小時後 NCI-H358 (KRasG12C 表達高) 異種移植物上 1A5 抗 KRas 抗體之免疫組織化學結果。圖 4B 示出與僅載體對照對比，雌性 CRL 裸小鼠中經 50 mg/kg 或 200 mg/kg ARS-1620 處理 8 小時後 NCI-H2122 (KRasG12C 表達低) 異種移植物。圖 4C 示出通過流式細胞術測得的對 1A5 呈陽性的 NCI-H358 異種移植細胞的百分比，以灰色條顯示 (左側 y 軸)。pS6 (一種 KRAS 途徑標誌物) 的相對表現以黑色圓圈顯示 (x 軸)。樣品經 50 mg/kg 或 200 mg/kg ARS-1620 或僅載體對照處理 8 小時或 24 小時。圖 5A 示出在不存在 (頂部行) 或存在 (底部行) 2H11 抗 KRas 抗體的情況下，經濃度在 1 μM 至 50 μM 範圍內的 GNE-1952、ARS-853 或 ARS-1620 處理後的 KRasWT 的 SPR 資料。圖 5B 示出在不存在 (頂部行) 或存在 (底部行) 2H11 抗 KRas 抗體的情況下，經 GNE-1952 或「非彈頭」形式之 GNE-1952 (缺乏反應性丙烯醯胺功能) 處理後的 KRasG12C 或 KRasWT 的 SPR 資料。在圖 5A -5B 的每個 SPR 圖中，將時間 (以秒為單位) 繪製於 x 軸上，並將反應單位繪製於 y 軸上)。圖 6A-6F 示出抗 KRas 抗體:KRasG12C 複合物之晶體結構。圖 6A 示出與 KRasG12C -GDP (上部結構) 結合之 2H11 Fab。KRas 結構以條帶顯示，標記出 SWII (SW2)，GDP 以條棒顯示，Mg2+ 以球形顯示，且 Cys12 殘基用較厚之條棒突出顯示。2H11 Fab 以透明表面和條帶顯示。圖 6A 的下部結構是 2H11 的 KRas 抗原決定基的表面映射，其相對於上部結構旋轉。圖 6B 示出抗體-抗原界面之特寫圖。與 KRas 直接接觸之互補決定區 (CDR) 以條帶顯示。虛線表示氫鍵，且示出 SWI、SWII、CDR、GDP 及 Cys12。錨定 HC.Trp99 以厚棒顯示。圖 6C 示出在存在和不存在 GNE-1952 的情況下 KRasG12C /2H11 複合物之比較。GNE-1952 化合物以棒狀圖顯示。兩種結構之 SWII 殘基以薄棒顯示，且示出 Cys12 及 His95。圖 6D 示出與 KRasG12C -GDP 結合之 2H11 抗 KRas 抗體及與 KRas 結合之 DCAI 化合物之排列。圖 6E 示出與 KRasG12C -GDP 及 GNE-1952 KRasG12C -GDP 結合之 1A5 抗 KRas 抗體之排列。圖 6F 示出結合 KRas SWI 中 iDab6 與 2H11 結構的比較。圖 7 示出結合至一組 KRas-GDP 突變之 1A5 和 2H11 抗 KRas 抗體的 ELISA 實驗結果。KRas (或 BSA 對照) 之基因型顯示於 x 軸上，且 OD650 nm 顯示於 y 軸上。圖 8 示出用於不含 2H11 共捕獲的單個 SWII 結合化合物的動力學分析之示例性單循環動力學循環。將時間 (以秒為單位) 顯示於 x 軸上，並將相對單位 (RU) 顯示於 y 軸上。擬合單位點偽一級模型，得到kon 是 3.29 x 105 (1/Ms)，koff 是 1.3 (1/s)，且KD 是約 4 µM。圖 9 示出用於包含 2H11 Fab 共捕獲的單個 SWII 結合化合物的動力學分析之示例性單循環動力學循環。將時間 (以秒為單位) 顯示於 x 軸上，並將相對單位 (RU) 顯示於 y 軸上。利用雙位點偽一級模型擬合資料，並返回高親和位點之交互作用常數，其中kon 是 6.6 x 105 (1/Ms)，koff 是 0.025 (1/s)，且KD 是約 0.04 µM。圖 10 示出如 x 軸所示之結合至 KRasG12V -GDP (灰色條) 及 KRasG13D -GDP (白色條) 的十一種 SWII 化合物的 2H11-Fab 共協同因子值，如使用共捕獲 SPR 測定所確定的。圖 11A 示出 2H11 及抗體變體 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 及 Ab8 (包含 L1、L2 及 L3 區域，同時註明 Kabat 及 Chlothia 編號) 的輕鏈 CDR 序列的排列。還註明每種 CDR 之接觸殘基。圖 11B 示出 2H11 及抗體變體 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 及 Ab8 (包含 H1、H2 及 H3 區域，同時註明 Kabat 及 Chlothia 編號) 的重鏈 CDR 序列的排列。還註明每種 CDR 之接觸殘基。

Claims (83)

  1. 一種與人 KRas 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體以比與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP) 更高的親和力特異性結合與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP)。
  2. 一種與人 KRas 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體以比與 GDP 結合的該 KRas (KRas-GDP) 更高的親和力特異性結合與 GTP 結合的該 KRas (KRas-GTP)。
  3. 如請求項 1 或請求項 2 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為 KRas 烷基化構形特異性抗體。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段開啟並穩定 SWII 袋。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該人 KRas 為選自由下列所組成之群組之 KRas 突變型：KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasQ61H 、KRasG12D 及 KRasG13D 。
  6. 如請求項 5 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該人 KRas 為選自由下列所組成之群組之 KRas 突變型：KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12D 及 KRasG13D 。
  7. 如請求項 6 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該 KRas 突變型為 KRasG12C 。
  8. 如請求項 7 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該 KRasG12C -GDP 是以 KRasG12C 特異性共價抑制劑來烷基化。
  9. 如請求項 8 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該分離抗體或抗原結合片段為烷基化構形特異性 KRas 抗體，其與以 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157 烷基化的 KRasG12C -GDP 結合。
  10. 如請求項 1 至 9 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段穩定 KRas 突變蛋白之該 SWII 袋。
  11. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:9)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:10)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDERLSGWV (SEQ ID NO:11)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:12)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:13)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GSSSWYDLGPFDY (SEQ ID NO:14)。
  12. 如請求項 11 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列。
  13. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:9； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:10； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:11；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含選自由下列所組成之群組之胺基酸序列中之一者：SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97 及 SEQ ID NO:98； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:13；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:14。
  14. 如請求項 13 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含選自由下列所組成之群組之胺基酸序列中之一者：SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO :103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105 及 SEQ ID NO:106。
  15. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:1)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:2)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 LQDHDYPLT (SEQ ID NO:3)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:4)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:5)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GFYVRNWFDP (SEQ ID NO:6)。
  16. 如請求項 15 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列。
  17. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQGISSYLA (SEQ ID NO:17)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:18)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQYYSYPFT (SEQ ID NO:19)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAMS (SEQ ID NO:20)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 AISSSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO:21)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 DQGGYGYPGESWFDY (SEQ ID NO:22)。
  18. 如請求項 17 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
  19. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RASQSISSYLN (SEQ ID NO:25)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 AASSLQS (SEQ ID NO:26)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 QQSYSPPWT (SEQ ID NO:27)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:28)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:29)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 AFYSYMDV (SEQ ID NO:30)。
  20. 如請求項 19 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列。
  21. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:33)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 LGSNRAS (SEQ ID NO:34)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 MQALQTPLT (SEQ ID NO:35)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SSNWWS (SEQ ID NO:36)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 EIYHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:37)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 ERTILTGYYGFDY (SEQ ID NO:38)。
  22. 如請求項 21 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列。
  23. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:41)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:42)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGYV (SEQ ID NO:43)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:44)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:45)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:46)。
  24. 如請求項 23 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。
  25. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO:81)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 RNNQRPS (SEQ ID NO:82)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 AAWDDSLSGWV (SEQ ID NO:83)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:84)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:85)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SFGPYAFDV (SEQ ID NO:86)。
  26. 如請求項 25 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:87 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:88 之胺基酸序列。
  27. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:49)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:50)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDSSLTGWV (SEQ ID NO:51)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYAIS (SEQ ID NO:52)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:53)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 YYDFWSGYPGGLFDV (SEQ ID NO:54)。
  28. 如請求項 27 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。
  29. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:57)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:58)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSSGNHWV (SEQ ID NO:59)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:60)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:61)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 TNNYGYRYFDY (SEQ ID NO:62)。
  30. 如請求項 29 之分離抗體或抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列。
  31. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:65)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 GKNNRPS (SEQ ID NO:66)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 NSRDSTDNHLWV (SEQ ID NO:67)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:68)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:69)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 ATSSGYYYFDY (SEQ ID NO:70)。
  32. 如請求項 31 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:71 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:72 之胺基酸序列。
  33. 如請求項 1 至 10 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含 (a) 輕鏈可變區，其包含： (i) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:73)； (ii) CDR-L2，其包含胺基酸序列 DNNKRPS (SEQ ID NO:74)； (iii) CDR-L3，其包含胺基酸序列 GTWDNSLSVWV (SEQ ID NO:75)；及 (b) 重鏈可變區，其包含： (i) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SYSMN (SEQ ID NO:76)； (ii) CDR-H2，其包含胺基酸序列 YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:77)；及 (iii) CDR-H3，其包含胺基酸序列 GKGIVGWGFFGMDV (SEQ ID NO:78)。
  34. 如請求項 33 之分離抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO:79 之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含 SEQ ID NO:80 之胺基酸序列。
  35. 一種與人 KRas-GDP 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中該分離抗體或其抗原結合片段與人 KRas 之胺基酸 W99、K5、L6、V7、S39、D54、L54、Y71、T74 及/或 G75 結合。
  36. 一種與人 KRas-GTP 結合之分離抗體或其抗原結合片段，其中該分離抗體或其抗原結合片段與人 KRas 之胺基酸 W99、K5、L6、V7、S39、D54、L54、Y71、T74 及/或 G75 結合。
  37. 一種編碼如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或抗原結合片段的輕鏈可變域及重鏈可變域之分離核酸。
  38. 一種載體，其包含如請求項 37 之核酸。
  39. 一種宿主細胞，其包含如請求項 28 之載體。
  40. 如請求項 1 至 36 中任一項之分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段經共軛至可偵測標記。
  41. 一種製造與 KRas-GDP 結合的抗體或其片段之方法，其包含將如請求項 36 之宿主細胞培養在適合表現編碼該抗體的載體之條件下及回收該抗體。
  42. 一種製造與 KRas-GtP 結合的抗體或其片段之方法，其包含將如請求項 36 之宿主細胞培養在適合表現編碼該抗體的載體之條件下及回收該抗體。
  43. 一種篩選以比與 KRasG12C -GTP 更高的親和力來與 KRasG12C -GDP 結合的抗體之方法，其包含 (a) 用下列者接觸抗體庫： i) KRasG12C -GDP， ii) 帶有 KRasG12C 特異性共價抑制劑之烷基化 KRasG12C -GDP，及 iii) 與非可水解之 GTP 類似物結合之 KRasG12C ，及 (b) 選擇以比與該非可水解之 GTP 類似物結合之 KRasG12C 更高的親和力來與烷基化 KRasG12C -GDP 和未烷基化 KRasG12C -GDP 結合之抗體。
  44. 一種篩選以比與 KRasG12C -GDP 更高的親和力來與 KRasG12C -GTP 結合的抗體之方法，其包含 (a) 用下列者接觸抗體庫： i) KRasG12C -GTP， ii) 帶有 KRasG12C 特異性共價抑制劑之烷基化 KRasG12C -GTP，及 iii) 與非可水解之 GDP 類似物結合之 KRasG12C ，及 (b) 選擇以比與該非可水解之 GDP 類似物結合之 KRasG12C 更高的親和力來與烷基化 KRasG12C -GTP 和未烷基化 KRasG12C -GTP 結合之抗體。
  45. 如請求項 43 或請求項 44 之方法，其中該庫為合成噬菌體庫。
  46. 一種偵測生物樣品中的 KRas-GDP 之方法，其包含將該生物樣品與如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
  47. 如請求項 46 之方法，其進一步包含將該生物樣品接觸與 KRas-GTP 結合之抗體，其中 KRas-GDP 的量及 KRas-GTP 的量是經判定的。
  48. 一種偵測生物樣品中的 KRas-GTP 之方法，其包含將該生物樣品與如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
  49. 如請求項 46 之方法，其進一步包含將該生物樣品接觸與 KRas-GDP 結合之抗體，其中該 KRas-GTP 的量及該 KRas-GDP 的量是經判定的。
  50. 一種套組，其包含共軛至可偵測標記之如請求項 1 至 36 中任一項之 KRas 抗體或其抗原結合片段，以及偵測該抗體或其抗原結合片段之說明書。
  51. 一種獲得 KRas 突變型的抑制劑之方法，其包含將如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段與該 KRas 突變型接觸、篩選化合物、並鑑定結合至該 KRas 突變型之化合物，該 KRas 突變型是與該抗體或其抗原結合片段結合。
  52. 如請求項 51 之方法，其中該等化合物包含在該 SWII 袋處共價修飾 KRas 之分子。
  53. 如請求項 52 之方法，其中該等化合物包含共價抑制劑，該抑制劑將該 SWII 袋中的至少一個殘基烷基化。
  54. 如請求項 51 之方法，其中該等化合物包含在該 SWII 袋處非共價修飾 KRas 之分子。
  55. 如請求項 51 至 54 中任一項之方法，其中該 KRas 突變型為 KRasG12C 、KRasG12V 、KRasG12D 、KRasG13D 、KRasG12R 或 KRasQ61H 。
  56. 一種偵測 KRas 的烷基化之方法，其包含將生物樣品與如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸，並偵測與烷基化 KRas 結合之該抗體或其抗原結合片段。
  57. 如請求項 56 之方法，其中該偵測包含偵測 KRasG12C 。
  58. 如請求項 56 或 57 之方法，其中該抗體或其抗原結合片段為 KRas 烷基化構形特異性抗體。
  59. 一種如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段在製造用於偵測哺乳動物中 KRas 的烷基化之藥劑中之用途，其中該偵測包含偵測與烷基化 KRas 結合之該抗體或其抗原結合片段。
  60. 如請求項 59 之用途，其中該偵測包含偵測 KRasG12C 。
  61. 如請求項 59 或 60 之用途，其中該抗體或其抗原結合片段為 KRas 烷基化構形特異性抗體。
  62. 如請求項 59 至 61 中任一項之用途，其中該哺乳動物為人。
  63. 一種偵測用 KRas 抑制劑治療的患者中 KRas 的烷基化之方法，該方法包含： (a) 將來自該患者之樣品與如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸； (b) 測量由該抗體或其抗原結合片段結合的 KRas 之量。
  64. 如請求項 63 之方法，其中該 KRas 抑制劑為 MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157。
  65. 如請求項 63 或 64 之方法，其中由該抗體或其抗原結合片段結合的 KRas 之該量判定該 KRas 抑制劑投予該患者之劑量。
  66. 如請求項 63 至 65 中任一項之方法，其中該偵測包含偵測 KRasG12C 。
  67. 如請求項 63 至 66 中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段為 KRas 烷基化構形特異性抗體。
  68. 一種抗體 1E5、2H11、2A3、3A12、1F4、4G12、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7 或 Ab8 中的任一者之抗體或其抗原結合片段在製造用於偵測用 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療的個體中 KRasG12C 的烷基化之藥劑中之用途，其中該藥劑是在用 KRasG12C 特異性共價抑制劑治療後投予該個體，並且其中該偵測包含偵測與烷基化 KRas 結合之該抗體或其抗原結合片段。
  69. 如請求項 68 之用途，其中該 KRasG12C 特異性共價抑制劑為 ARS-1952、ARS-853、ARS-1620、MRTX849、AMG-510、GDC-6036、ARS-3248、LY3499446、LY3537982 或 JNJ-74699157。
  70. 如請求項 69 之用途，其中該抗體或其抗原結合片段為 KRas 烷基化構形特異性抗體。
  71. 一種如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段在製造用於治療 KRasG12C 媒介的癌症之藥劑中之用途。
  72. 如請求項 71 之用途，其中該 KRasG12C 媒介的癌症為 NSCLC、大腸癌或胰臟癌。
  73. 一種結晶伴護蛋白，其包含如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  74. 一種使 KRas 結晶之方法，其中該 KRas 是視情況與 KRas 抑制劑結合，該方法包含將如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段與 KRas 接觸，並解析複合物的晶體結構。
  75. 如請求項 74 之方法，其中該 KRas 為 KRasG12C 、KRasG12D 、KRasG12V 、KRasG12R 、KRasG13D 或 KRasQ61H 。
  76. 一種測量化合物與 KRas 的結合之生物感測表面，其中： (i) 該生物感測表面包含水凝膠，其中 KRas 蛋白和如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段是經共定位至該水凝膠中； (ii) 該 KRas 和該抗體或其抗原結合片段在該水凝膠內具有足夠的自由度，以相互嚙合形成親和複合物； (iii) 該 KRas 和該抗體或其抗原結合片段之局部濃度超過解離親和力常數至少 10 倍，其中該局部濃度促進該親和複合物的形成； (iv) 未結合的 KRas 蛋白和抗 KRas 抗體的比例小於約 50%； (v) 將 KRas 抑制劑化合物注射在該生物感測表面上至少 5 秒；以及 (vi) 其中該 KRas 抑制劑化合物與該抗 KRas 抗體的結合是在至少一個感測通道上測量的。
  77. 如請求項 76 之生物感測表面，其中該水凝膠的厚度為約 10 nm 至 500 nm、10 nm 至 300 nm、10 nm 至 250 nm、或約 10 nm 至 200 nm。
  78. 如請求項 76 或 77 之生物感測表面，其中 KRas 是經生物素化的。
  79. 如請求項 76 至 78 中任一項之生物感測表面，其中該生物感測表面經接附至 BIACORE 感測器晶片。
  80. 一種針對抗 KRas 抑制劑活性篩選化合物之方法，該方法包含測量化合物與 KRas 的結合，其中該 KRas 與抗 KRas 抗體結合，且其中該結合是使用如請求項 76 至 79 中任一項之生物感測表面來測量的。
  81. 一種測量 KRas 突變蛋白與如本文中所述之抗 KRas 抗體的結合之方法，其中該方法包含： (i) 將如請求項 76 至 79 中任一項之生物感測表面與 KRas 接觸以形成 KRas 結合的生物感測表面； (ii) 將該 KRas 結合的生物感測表面與如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸，其中該抗體或其抗原結合片段與該 KRas 蛋白相比是莫耳過剩的；以及 (iii) 使用表面電漿子共振來偵測該抗體或其抗原結合片段與 KRas 的該結合及親和力。
  82. 一種測量 KRas 突變蛋白與如本文中所述之抗 KRas 抗體的結合之方法，其中該方法包含： (i) 將如請求項 76 至 79 中任一項之生物感測表面與如請求項 1 至 36 中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸，以形成抗 KRas 抗體結合的生物感測表面； (ii) 將該抗 KRas 抗體結合的生物感測表面與 KRas 接觸，其中該抗體或其抗原結合片段與該 KRas 蛋白相比是莫耳過剩的；以及 (iii) 使用表面電漿子共振來偵測該抗體或其抗原結合片段與 KRas 的該結合及親和力。
  83. 一種測量 KRas 抑制劑與 KRas 蛋白的標靶嚙合之方法，其包含 (a) 將來自患者之樣品與如本文所述之抗 KRas 抗體或其抗原結合片段接觸；以及 (b) 測量由該抗 KRas 抗體結合的 KRas 之水平。
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