KR20230002598A - Kras 특이적 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Kras 특이적 항체 및 이의 용도 Download PDF

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메린다 엠 물비힐
존 제라드 퀸
미카 스테페크
웨이루 왕
존 브루닝
크리스토퍼 윌리엄슨 데이비스
마리 에반젤리스타
제임스 토마스 쾨르버
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제넨테크, 인크.
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Abstract

돌연변이체 KRas-GDP 및 알킬화된 돌연변이체 KRas-GDP에 결합하는 항-KRas 항체 및 이의 사용 방법이 본원에 제공된다. 또한 KRas 억제제에 대한 스크리닝 방법 및 본원에 기재된 항체에 대한 KRas의 결합을 측정하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

KRAS 특이적 항체 및 이의 용도
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 30일 출원된 미국 가특허출원 제 63/018,356호의 우선권의 이익을 주장하며, 이 출원은 모든 목적을 위해 본 출원에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일의 서열 목록 제출
다음과 같은 ASCII 텍스트 파일 제출 내용은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다: 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF)의 서열 목록 (파일명: P35630WO_SEQLIST.TXT, 기록일자: 2021년 3월 23일, 크기: 60,938 KB).
발명의 분야
본 발명은 KRas 특이적 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
KRAS는 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 종양 유전자 중 하나이다 (Kranenburg, O., Biochim. Biophys. Acta 2005 1756). KRAS는 세포 표면 수용체에서 세포내 효과기 경로로 신호를 전달하는 기능을 하는 구아노신 트리포스파타제(GTPase)의 Ras 계열 중 하나를 인코딩한다 (Pylayeva-Gupta, Y. 외, Nat Rev Cancer 2011 11). Ras GTPase는 활성 구아노신 5'-트리포스페이트(GTP)-결합 상태와 비활성 구아노신 5'-디포스페이트(GDP)-결합 상태 사이를 순환한다. 암에서 KRAS G12C -유도된 종양을 포함한 KRas의 발암성 돌연변이는 GTPase 활성을 손상시키고 GTP에 결합된 활성화된 형태의 KRas를 축적시킨다. 그 결과, KRas의 하류 경로가 항시적으로 활성화되어, 증식 촉진 및 세포자멸사 억제를 초래한다(Pylayeva-Gupta, Y. 외, Nat Rev Cancer 2011 11).
오랫동안 암에서 그 존재가 인정되었음에도 불구하고 KRas는 수년 동안 약물 투여 가능한 표적으로 간주되지 않았다(McCormick, F. Clin Cancer Res 2015 21:8). KRAS G12C 외에도, 암과 관련된 KRAS의 다른 대립유전자들이 있다(Haigis, KM, Trends Cancer 2017 3:10). 따라서, GTP에 결합된 KRas(KRas-GTP)보다 GDP에 더 높은 친화도로 결합된 KRas(KRas-GDP)에 특이적으로 결합하는 KRas-특이적 항체가 당업계에 필요하다.
발명의 요약
한 양상에서, 본 발명은 인간 KRas에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 GTP에 결합된 KRas(KRas-GTP)보다 GDP에 결합된 KRas(KRas-GDP)에 더 높은 친화도로 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체이다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SWII 포켓을 개방하여 안정화시킨다.
일부 실시형태들에서, 인간 KRas는 KRasG12C, KRas G12V, KRasG12R, KRasQ61H, KRasG12D, 및 KRasG13D로 이루어진 군으로부터 선택된 KRas 돌연변이체이다.
일부 실시형태들에서, 인간 KRas는 KRasG12C, KRas G12V, KRasG12D, 및 KRasG13D로 이루어진 군으로부터 선택된 KRas 돌연변이체이다.
일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12C이다.
일부 실시형태들에서, KRasG12C-GDP는 KRasG12C 특이적 공유 억제제로 알킬화된다.
일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, 또는 JNJ-74699157로 알킬화된 KRasG12C-GDP에 결합하는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 돌연변이 단백질의 SWII 포켓을 안정화시킨다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 12)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQGIRNDLG(서열번호 1)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 2)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 LQDHDYPLT(서열번호 3)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 4)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 5)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 GFYVRNWFDP(서열번호 6)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQGISSYLA(서열번호 17)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 18)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 QQYYSYPFT(서열번호 19)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 20)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 AISSSGSSTYYADSVKG(서열번호 21)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 DQGGYGYPGESWFDY(서열번호 22)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQSISSYLN(서열번호 25)을 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 26)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 QQSYSPPWT(서열번호 27)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 28)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 29)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 AFYSYMDV(서열번호 30)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RSSQSLLHSNGYNYLD(서열번호 33)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 LGSNRAS(서열번호 34)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 MQALQTPLT(서열번호 35)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 36)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 37)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 ERTILTGYYGFDY(서열번호 38)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 41)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 42)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 GTWDSSLTGYV(서열번호 43)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 44)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 45)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 46)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 81)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 82)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 AAWDDSLSGWV(서열번호 83)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 84)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 85)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 SFGPYAFDV(서열번호 86)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 49)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 50)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 GTWDSSLTGWV(서열번호 51)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 52)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 53)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 54)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 57)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 58)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 NSRDSSGNHWV(서열번호 59)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 60)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 61)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 TNNYGYRYFDY(서열번호 62)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 65)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 66)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 NSRDSTDNHLWV(서열번호 67)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 68)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 69)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 ATSSGYYYFDY(서열번호 70)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 73)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 74)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 GTWDNSSLSVWV(서열번호 75)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 76)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 77)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 GKGIVGWGFFGMDV(서열번호 78)를 포함하는 CDR-H3.
일부 실시형태들에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 KRas-GDP에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이때 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 KRas의 아미노산 W99, K5, L6, V7, S39, D54, L54, Y71, T74 및/또는 G75에 결합한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편의 KRas 항체 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 단리된 핵산(들)을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 핵산(들)을 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출가능한 표지에 접합된다.
일부 실시형태들에서, 본 발명은 KRas-GDP에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 항체를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 KRasG12C-GTP 보다 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 다음 단계를 포함한다:
(a) 항체 라이브러리를 다음과 접촉시키는 단계:
i) KRasG12C-GDP,
ii) KRasG12C 특이적 공유 억제제로 알킬화된 KRasG12C-GDP, 및
iii) 비가수분해성 GTP 유사체에 결합된 KRasG12C, 및
(b) 비가수분해성 GTP 유사체에 결합된 KRasG12C 보다 알킬화 KRasG12C-GDP 및 비알킬화 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 선택하는 단계.
일부 실시형태들에서, 라이브러리는 합성 파지 라이브러리이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내 KRas-GDP를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 생물학적 샘플을 본원에 제공된 Kras 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 KRas-GTP에 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 KRas-GDP의 양 및 KRas-GTP의 양이 결정된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 검출가능한 표지에 접합된 단락 [0006]-[0037] 중 어느 하나의 KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하기 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 KRas 돌연변이체의 억제제를 얻는 방법을 제공하며, 이 방법은 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 KRas 돌연변이체와 접촉시키는 단계, 화합물들을 스크리닝하는 단계, 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 KRas 돌연변이체에 결합하는 화합물들을 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 화합물들은 SWII 포켓의 KRas를 공유적으로 변형시키는 분자를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 화합물들은 SWII 포켓 내 적어도 하나의 잔기를 알킬화하는 공유 억제제를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 화합물들은 SWII 포켓의 KRas를 비공유적으로 변형시키는 분자를 포함한다.
일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12C, KRas G12V, KRasG12D, KRasG13D, KRasG12R, 또는 KRasQ61H이다.
한 양상에서, 본 발명은 KRas의 알킬화를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 생물학적 샘플을 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 검출은 KRasG12C의 검출을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 포유동물 내 KRas의 알킬화를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 포유동물에게 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계 및 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 KRas 억제제로 처리된 환자에서 KRas의 알킬화를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 샘플을 항-KRas 항체와 접촉시키는 단계;
(c) 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 결합된 KRas의 양을 측정하는 단계.
일부 실시형태들에서, KRas 억제제는 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, 또는 JNJ-74699157이다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 결합된 KRas의 양이 환자에게 투여할 KRas 억제제의 투여량을 결정한다.
일부 실시형태들에서, 검출은 KRasG12C의 검출을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체이다.
일부 실시형태들에서, 포유동물은 인간이다.
한 양상에서, 본 발명은 KRasG12C 특이적 공유 억제제로 처리된 대상체 내 KRasG12C의 알킬화를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) KRasG12C 특이적 공유 억제제로 치료한 후 항-KRas 항체 또는 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계; 및
(b) 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계.
일부 실시형태들에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-1952, ARS-853, ARS-1620, MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, 또는 JNJ-74699157이다.
일부 실시형태들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체이다.
한 양상에서, 본 발명은 KRasG12C 매개 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이러한 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, KRasG12C 매개 암은 NSCLC, 결장암 또는 췌장암이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 결정화 샤페론을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 KRas를 결정화하는 방법을 제공하며, 이때 KRas는 KRas 억제제에 선택적으로 결합되고, 이 방법은 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 KRas와 접촉시키는 단계 및 복합체의 결정 구조를 분해하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, KRas는 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 KRas에 대한 화합물들의 결합을 측정하기 위한 바이오센싱 표면을 제공하며, 여기서:
(i) 바이오센싱 표면은, KRas 단백질 및 항-KRas 항체 또는 항원 결합 단편이 내부에 공동-국재화된 하이드로겔을 포함하고;
(ii) KRas 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서로 결합하여 친화성 복합체를 형성하기에 충분한 수소 내부의 자유도를 갖고;
(iii) KRas 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 국소 농도가 해리 친화도 상수를 적어도 10배 초과하고, 여기서 국소 농도는 친화성 복합체의 형성을 촉진하며;
(iv) 결합되지 않은 KRas 단백질 및 항-KRas 항체의 분율이 약 50% 미만이고;
(v) KRas 억제제 화합물이 적어도 5초 동안 바이오센싱 표면에 주입되고; 및
(vi) 항-KRas 항체에 대한 KRas 억제제 화합물의 결합이 적어도 하나의 감지 채널을 통해 측정된다.
일부 실시형태들에서, 하이드로겔은 두께가 약 10 nm-500 nm, 10 nm-300 nm, 10-250 nm, 또는 약 10-200 nm이다.
일부 실시형태들에서, 본 발명은 KRas에 대한 화합물들의 결합을 측정하기 위한 바이오센싱 표면을 제공하며, 여기서 KRas는 비오티닐화된다.
일부 실시형태들에서, 본 발명은 KRas에 대한 화합물들의 결합을 측정하기 위한 바이오센싱 표면을 제공하며, 여기서 바이오센싱 표면은 BIACORE 센서 칩에 부착된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 화합물들을 항-KRas 억제제 활성에 대해 스크리닝하는 방법을 제공하며, 이 방법은 KRas에 대한 화합물의 결합을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 KRas는 항-KRas 항체에 결합되고, 결합은 바이오센싱 표면을 사용하여 측정된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-KRas 항체에 대한 KRas 돌연변이체 단백질의 결합을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) 바이오센싱 표면을 KRas와 접촉시켜 KRas-결합된 바이오센싱 표면을 형성하는 단계;
(ii) KRas-결합된 바이오센싱 표면을 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계(여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 단백질과 비교하여 몰 과량으로 존재함); 및
(iii) 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KRas에 대한 결합 및 친화도를 검출하는 단계.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-KRas 항체에 대한 KRas 돌연변이체 단백질의 결합을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) 바이오센싱 표면을 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시켜 항-KRas 항체-결합된 바이오센싱 표면을 형성하는 단계;
(ii) 항-KRas 항체-결합된 바이오센싱 표면을 KRas와 접촉시키는 단계(여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 단백질에 비해 몰 과량으로 존재함); 및
(iii) 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KRas에 대한 결합 및 친화도를 검출하는 단계.
본원에 기재된 다양한 실시형태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 실시형태를 형성할 수 있음을 이해해야 한다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 Ras 결정 구조의 오버레이를 보여준다. 도 1B는 알킬화된 KRasG12C-GDP 특이적 단클론 항체를 식별하기 위해 사용된 시험관내 파지 디스플레이 선별 전략을 보여준다. 도 1C는 KRasG12C-GDP+GNE1952에 결합하는 선별된 항-KRas 단클론 항체, 알킬화되지 않은 KRasG12C-GDP 및 음성 대조군에 대한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 데이터를 보여준다. 도 1D는 상이한 제제로 알킬화될 때, 선별된 항-KRas 항체 1A5(x-축의 좌측) 및 2H11(x-축의 우측) 결합 KRas의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석으로부터의 데이터를 보여준다. 도 1E는 KRasG12C-GDP+GNE1952 및 KRasG12C-GDP에 대한 선별된 항-KRas 항체 1A5 및 2H11의 대표적인 SPR 자취를 보여준다. 초 단위 시간은 x축에 표시되고 반응 단위는 y축에 표시된다. 도 1F는 선별된 항-KRas 항체에 대한 에피토프 비닝 결과를 나타낸다. 도 1G는 ARS-1620으로 처리된 세포로부터 선별된 항-KRas 항체 1A5 및 2H11에 의한 알킬화된 KRasG12C-GDP 및 알킬화되지 않은 KRasG12C-GDP의 면역침전을 보여준다.
도 2A는 면역형광(IF) 분석을 사용하여 H1171 KRASG12C 돌연변이체 암 세포에서, 다양한 공유 분자로 처리된 세포 내 KRasG12C에 결합하는 1A5 항-KRas 항체를 DMSO 대조군과 비교하여 나타낸다. 도 2B는 H1171 KRASG12C 돌연변이체 암 세포에서 ARS-1620 처리 시 일정 시간 범위(y축에 시간으로 표시) 및 ARS-1620의 용량(x-축에 μM으로 표시, DMSO 대조군과 비교)에 따른 KRasG12C의 1A5 항-KRas 항체에 의한 염색을 나타낸다. 도 2C는 KRasG12C 억제제 GNE-1952로 처리된 HCT116 KRasG13D 세포에서 1A5 항-KRas 항체에 의한 관찰가능한 KRas 염색이 없음을 보여준다. 도 2D는 H1171 KRASG12C 돌연변이 암 세포의 벌크 집단에서 KRas 경로 마커, pERK, pS6의 알킬화된 KRas 억제에 대한 면역블롯 분석을 보여준다. 표시된 바와 같이 세포들을 DMSO, 5μM ARS-853 및/또는 50μg/ml 사이클로헥사미드로 처리했다. 표시된 바와 같이, 처리 후 또는 처리 세척 후 6, 24 또는 48시간 후에 샘플을 수집했다. 도 2E는 면역형광 분석에서 상이한 KRASG12C 돌연변이체 암 세포 모델 전반에 걸친 1A5 결합 KRasG12C를 보여준다. 세포를 5μM ARS-1620으로 처리하였다. 각 암세포 모델에서 KRasG12C의 상대 발현량은 + 기호로 표시한다. 도 2F는 증가하는 용량의 ARS-1620으로 처리된 H1171 KRASG12C 돌연변이체 암 세포에서 1A5 염색(y-축) 및 pS6 염색(x-축)의 유세포 분석 측정결과를 DMSO 대조군(좌측)과 비교하여 보여준다.
도 3A는 DMSO 또는 ARS-1620으로 처리된 H1171 KRASG12C 돌연변이체 암 세포에서, 선별된 항-KRas 항체 1A5 및 2H11에 의한 알킬화된 및 알킬화되지 않은 KRasG12C의 차등 면역침전을 시판 항체 세트와 비교하여 보여준다. 도 3B는 KRasG12C-GDP+GNE1952에 대한 시판 항체 세트(x축에 표시됨)에 따른 ELISA를, 알킬화되지 않은 KRasG12C-GDP, KRasG12C-GMPcP 및 뉴트라비딘(NeutrAvidin) 단독과 비교하여 보여준다. 도 3C는 1A5 항-KRas 항체(상단 행) 및 iDab6(하단 행)을 사용한 면역형광을 ARS-1620의 용량 적정에 따라 보여준다. DAPI로 염색된 DNA는 파란색으로 표시된다. ARS-1620의 용량은 nM 단위로 각 이미지에 표시된다.
도 4A는 50 mg/kg 또는 200 mg/kg의 ARS-1620으로 8시간 및 24시간 처리한 후 암컷 C/B17 SCID 마우스에서 NCI-H358(높은 KRasG12C-발현) 이종이식편에 대한 1A5 항-KRas 항체를 사용한 면역조직화학을 비히클 단독 대조군과 비교하여 보여준다. 도 4B는 50 mg/kg 또는 200 mg/kg의 ARS-1620으로 8시간 처리한 후 암컷 CRL 누드 마우스에서의 NCI-H2122(낮은 KRasG12C-발현) 이종이식편을 비히클 단독 대조군과 비교하여 보여준다. 도 4C는 1A5에 대해 양성인 NCI-H358 이종이식 세포의 백분율을 유세포 분석으로 측정하여 회색 막대(좌측 y-축)로 보여준다. pS6(KRAS 경로 마커)의 상대 발현은 검은색 원(x축)으로 표시된다. 샘플을 50 mg/kg 또는 200 mg/kg ARS-1620 또는 비히클 단독 대조군으로 8시간 또는 24시간 동안 처리했다.
도 5A는 2H11 항-KRas 항체의 부재(상단 행) 또는 존재(하단 행)시 1 내지 50 μM 범위의 농도의 GNE-1952, ARS-853 또는 ARS-1620으로 처리된 KRasWT로부터의 SPR 데이터를 보여준다. 도 5B는 2H11 항-KRas 항체의 부재(상단 행) 또는 존재(하단 행)시 GNE-1952 또는 "비탄두" 형태의 GNE-1952(반응성 아크릴아미드 기능 결여)로 처리된 KRasG12C 또는 KRasWT의 SPR 데이터를 보여준다. 도 5A-5B의 각 SPR 플롯에서, 초 단위 시간은 x축에 표시되고 반응 단위는 y축에 표시된다.
도 6A-6F는 항-KRas 항체:KRasG12C 복합체의 결정 구조를 보여준다. 도 6A는 KRasG12C-GDP에 결합된 2H11 Fab(상부 구조)를 보여준다. KRas 구조는 리본으로 표시되고, SWII(SW2)는 표지되고, GDP는 막대로 도시되고, Mg2+는 구형으로 도시되고, Cys12 잔기는 더 두꺼운 막대로 표시된다. 2H11 Fab는 투명한 표면과 리본으로 도시된다. 도 6A의 2H11에 대한 KRas 에피토프의 표면 매핑이며, 하부 구조는 상부 구조에 비해 회전되어 있다. 도 6B는 항체-항원 경계면의 확대도를 보여준다. KRas와 직접 접촉하는 상보성 결정 영역(CDR)은 리본으로 도시된다. 점선은 수소결합을 표시하고, SWI, SWII, CDR, GDP, Cys12를 표시한다. 고정 HC.Trp99는 두꺼운 막대로 표시된다. 도 6C는 GNE-1952의 존재 및 부재시 KRasG12C/2H11 복합체의 비교를 보여준다. GNE-1952 화합물은 막대 다이어그램으로 도시된다. 두 구조의 SWII 잔기는 얇은 막대로 도시되고 Cys12 및 His95가 표시된다. 도 6D는 KRasG12C-GDP에 결합된 2H11 항-KRas 항체와 KRas에 결합된 DCAI 화합물의 정렬을 보여준다. 도 6E는 KRasG12C-GDP 및 GNE-1952 KRasG12C-GDP에 결합된 1A5 항-KRas 항체의 정렬을 보여준다. 도 6F는 KRas SWI를 결합함에 있어서 iDab6과 2H11의 구조를 비교하여 보여준다.
도 7은 KRas-GDP 돌연변이체들의 패널에 결합하는 1A5 및 2H11 항-KRas 항체를 사용한 ELISA 실험을 보여준다. KRas(또는 BSA 대조군)의 유전자형은 x축에 표시되고 OD650 nm는 y축에 표시된다.
도 8은 2H11이 동시 포획되지 않은 단일 SWII 결합 화합물의 동역학 분석을 위한 예시적인 단일 사이클 동역학 사이클을 나타낸다. x축에는 초 단위의 시간이 표시되고 y축에는 상대 단위(RU)의 반응이 표시된다. 단일 부위 유사일차 반응속도식을 핏팅하여 3.29 x 105(1/Ms)의 k on , 1.3(1/s)의 k off 및 ~4 μM의 K D 를 제공하였다.
도 9는 2H11 Fab가 공동 포획된 단일 SWII 결합 화합물의 동역학 분석을 위한 예시적인 단일 사이클 동역학 사이클을 나타낸다. x축에는 초 단위의 시간이 표시되고 y축에는 상대 단위(RU)의 반응이 표시된다. 2부위 유사일차 반응속도식을 데이터에 핏팅하여 고 친화도 부위에 대한 상호작용 상수들을 6.6 x 105(1/Ms)의 k on , 0.025(1/s)의 k off 및 ~0.04μM의 K D 로 얻었다.
도 10은 동시 포획 SPR 분석을 사용하여 결정된, KRasG12V-GDP(회색 막대) 및 KRasG13D-GDP(흰색 막대)에 결합하는, x축에 표시된 11개의 SWII 결합 화합물에 대한 2H11-Fab 공동-협동 인자 값을 보여준다.
도 11A는 Kabat 및 Chlothia 넘버링 모두로 표시한 L1, L2 및 L3 영역과 2H11 및 항체 변이체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7 및 Ab8의 경쇄 CDR 서열들의 정렬을 보여준다. 각 CDR에 대한 접촉 잔기들도 표시되어 있다. 도 11B는 Kabat 및 Chlothia 넘버링 모두로 표시한 H1, H2 및 H3 영역과 2H11 및 항체 변이체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7 및 Ab8의 중쇄 CDR 서열들의 정렬을 보여준다. 각 CDR에 대한 접촉 잔기들도 표시되어 있다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 특허 출원 및 간행물을 비롯하여 본원에서 인용된 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본원를 해석하기 위해서, 다음 정의들을 적용하며 적절한 경우 언제나 단수로 사용된 용어가 복수를 또한 포함할 것이며 이의 역도 마찬가지이다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 아래에 설명된 정의가 본원에 참조로 포함되는 문서와 상충하는 경우 아래에 설명된 정의가 우선한다.
본원에서 “KRas”는 인간 KRas 단백질을 의미한다. 일부 실시형태에서, 인간 KRas는 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, KRas 단백질은 돌연변이체(예를 들어, “돌연변이체 KRas” 또는 “KRas 돌연변이체”)이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 KRas는 서열번호 90의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, KRas 돌연변이체는 발암성 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, KRas 단백질은 자연 발생 KRas 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, KRas 단백질은 KRasG12C(즉, 위치 12에 시스테인 치환이 있는 KRas)이다. 일부 실시형태에서, KRas 단백질은 KRasG12V, KRasG12R, KRasQ61H, 또는 KRasG13D이다. 본원에서 “KRas-GDP”는 구아노신 5'-디포스페이트(GDP)에 결합된 KRas를 의미한다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 비활성 KRas이다. 일부 실시형태에서, 비활성 KRas는 c-Raf와 같은 RAF 키나제에 결합하여 이의 키나제 활성을 알로스테릭하게 활성화시킬 수 없다. 일부 실시형태에서, 비활성 KRas는 KRas에 대한 하류의 효과기 경로를 활성화시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 비활성 KRas는 미토겐 활성화 단백질(MAP) 키나제 캐스케이드를 활성화시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 비활성 KRas는 증식을 촉진하는 신호전달 캐스케이드를 활성화시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 비활성 KRas는 세포자멸사를 억제하는 신호전달 캐스케이드를 활성화시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 비활성 KRas는 글루코스 수송체 GLUT1의 전사를 촉진시키는 신호전달 캐스케이드를 활성화시키지 않는다.
본원에서 “KRas-GTP”는 구아노신 5'-트리포스페이트(GTP)에 결합된 KRas를 의미한다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 활성 KRas이다. 일부 실시형태에서, 활성 KRas는 c-Raf와 같은 RAF 키나제에 결합하여 이의 키나제 활성을 알로스테릭하게 활성화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서 활성 KRas는 KRas에 대한 하류의 효과기 경로를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 활성 KRas는 미토겐 활성화 단백질(MAP) 키나제 캐스케이드를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 활성 KRas는 증식을 촉진하는 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 활성 KRas는 세포자멸사를 억제하는 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 활성 KRas는 글루코스 수송체 GLUT1의 전사를 촉진시키는 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다.
본원에서 사용되는 “항-KRas 항체”는 KRas-GDP의 검출, 알킬화된 KRas-GDP의 검출 및/또는 KRas-GDP의 안정화에 유용한 충분한 특이성 및 친화도로 인간 KRas-GDP에 결합하는 항체이다. 한 실시형태에서, 관련없는, 관련없는 KRas 단백질에 대한 항-KRas 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역분석 (RIA)으로 측정시 KRas에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태들에서, KRas에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
본원에 사용된 “KRas-GDP를 안정화”하는 항체는 KRas-GDP에 결합할 수 있고 GTP 결합 상태보다 GDP 결합 상태의 KRas를 우선적으로 잠글 수 있는 항체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP를 안정화하는 항체는 CLAMP로도 지칭된다(즉, “분자 프로브 발견을 위한 형태 잠금 항체”, “Conformation Locking Antibodies for Molecular Probe discovery”).
“친화도”는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 짝(예를 들어, 항원, 예를 들어, KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 본원에 기재된 “결합 친화도”는 결합쌍(예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 그 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 해당 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정 될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시형태는 본원에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 친화도는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 친화도는 BIACORE®-T200, BIACORE®-S200, BIACORE®-8k, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 기기를 사용하는 SPR 분석을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 친화도는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정된다.
본원에서 사용되는, 제1 분자는 제3 분자보다 제2 분자에 결합함에 더 낮은 해리 상수(KD)를 가질 때 제3 분자보다 “더 높은 친화도로” 제2 분자에 결합한다.
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 단클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 항체 구조를 포함한다.
“항체 단편”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 항체의 파파인 분해는 “Fab” 단편이라고 불리는 두 개의 동일한 항원 결합 단편을 생성하며, 각각은 단일 항원 결합 부위와 잔류 “Fc” 단편을 가지는데, 이 명칭은 용이하게 결정화 할 수 있는 능력을 반영한다. 펩신 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원을 여전히 가교결합 할 수 있는F(ab')2 단편을 생성한다.
본원에서 사용되는 용어 “단클론 항체”는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 가령, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대항하는 상이한 항체를 일반적으로 함유하는 다중클론성 항체 제재들과 대조적으로, 단클론 항체 제재들의 각 단클론 항체는 항원에 있는 단일 결정인자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 “단클론(monoclonal)”은 실질적으로 동질성 항체 모집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
“네이키드(naked) 항체”는 이종 모이어티(예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 이러한 네이키드 항체는 약학 제형으로 존재할 수 있다.
“천연 항체”는 다양한 구조의 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 이종사량체 당단백질로써, 약 150,000 달톤이며, 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄를 포함하며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. 도메인 N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VH), 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VL), 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 (κ) 및 람다 (λ)라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
항체의 “분류”는 그 중쇄가 갖는 불변 영역 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있으며: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 면역글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 정의에서 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래되지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 잔부는 상이한 출처 또는 종들로부터 유래한 항체를 지칭한다.
“인간 공통 프레임워크”는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에 있어서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열들의 하위그룹들은 Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서와 같은 하위그룹이다. 한 실시형태에서, VL의 경우, 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 한 실시형태에서, VH의 경우, 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에서와 같은 하위그룹 III이다.
“인간화” 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시형태들에 있어서, 인간화 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVR들 (가령, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 “인간화 형태”, 예를 들어, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
“가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs)과 3개의 초가변 영역(HVR들)을 포함한다. (예컨대, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007)참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VH 또는 VL 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, Portolano 외, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991) 참조.
본원에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열이 초가변이고 및/또는 구조적으로 정의된 루프 (“초가변 루프”)를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로 천연 4쇄 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에 3개 (L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 “상보성 결정 영역” (CDR)의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 가장 높은 서열 가변성을 가지며 및/또는 항원 인식에 관여한다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 발생한다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).)
예시적인 CDR들 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에서 나타난다. (Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 “특이성 결정 잔기” 또는 “SDR”을 포함한다. SDR은, 축약된-CDR 또는 a-CDR이라 불리는 CDR들의 영역 내에 포함된다. 예시적인 a-CDR들 (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102에서 발생한다. (Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조.) 달리 명시되지 않는 한, 가변 도메인의 HVR 잔기 및 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 상기 Kabat 외의 문헌에 따라 넘버링된다.
“검출”이라는 용어는 표적 분자의 정성적 및 정량적 측정을 모두 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 한 양상에서, 본원에 기술된 검출 방법은 생물학적 샘플 내 KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas의 존재를 단순히 식별함에 사용된다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 샘플 내 KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas가 검출가능한 수준으로 존재하는지 여부를 테스트하기 위해 사용된다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 샘플 내 KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas의 양을 정량화하고 추가로 상이한 샘플의 KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas 수준을 비교하기 위해 사용될 수 있다.
“생물학적 샘플”이라는 용어는 KRas, KRas-GDP 및/또는 알킬화된 KRas를 포함할 수 있는 모든 생물학적 물질을 의미한다. 샘플은 전혈 또는, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 우유, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액과 같은 전혈 구성성분 및 KRas, KRas-GDP 및/또는 알킬화 KRas를 함유할 수 있는 기타 신체 구성성분 일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 임의의 동물로부터 얻은 신체 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 포유동물의 것이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 인간 대상체의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 치료적 KRas 항체로 치료받은 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRas 알킬화제로 치료받은 환자의 것이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 혈청이다.
“포획 시약”이라는 용어는 관심 표적(예를 들어, KRas, KRas-GDP 및/또는 알킬화된 KRas)에 결합하고 생물학적 샘플 내 관심 표적(예를 들어, KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas)에 결합하여 이를 포획할 수 있는, 시약(예를 들어, 항체) 또는 이러한 시약의 혼합물을 의미하므로, 적절한 조건하에서 포획 시약과 관심 표적(예를 들어, KRas, KRas-GDP 및/또는 알킬화된 KRas)의 복합체는 샘플의 나머지 부분으로부터 분리될 수 있다. 특정 실시형태에서, 포획 시약은 고정되거나 고정될 수 있다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge)의 영역으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개 잔기들을 부가함에 의해, Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 표시한다. F(ab')2 항체 단편은 최초에 이들 사이에 힌지 시스테인을 보유하는 Fab' 단편 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
본원에서 용어 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단에 이른다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 색인에 따른다.
“프레임워크” 또는 “FR”은 초가변 영역 (HVR) 잔기들 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 “전장 항체”, “온전한 항체” 및 “전 항체 (whole antibody)”는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다.
용어 “숙주 세포”, “숙주 세포주”, 및 “숙주 세포 배양물”은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 “형질전환체” 및 “형질전환된 세포”를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
“면역접합체”는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
“개체” 또는 “대상체”는 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예컨대, 인간 및 비인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태들에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
“단리된” 항체는 자연 환경의 구성요소에서 분리된 항체이다. 일부 실시형태들에 있어서, 항체는 예를 들면, 전기영동의 (예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프 (예로써, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토는 예로써, Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)를 참조한다.
“단리된” 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
“항-KRas 항체를 인코딩하는 단리된 핵산”은, 단일 벡터 또는 별도의 벡터에 있는 이러한 핵산 분자를 포함하는, 항-KRas 항체의 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 지칭한다.
“약품 설명서(package insert)”라는 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상용 패키지에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하는 데 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 “아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)”는, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에서 제작되었으며 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재한 Genentech, Inc.사로부터 공개적으로 이용가능하거나 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우에, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 아래와 같이 계산된다:
100 x 분율 X/Y
이때 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록되는 아미노산 잔기의 수를 말하며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기 수가 된다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않은 것으로 인정된다. 달리 특정 언급이 없는 한, 본원에서 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 전 단락에서 설명된 바와 같이 수득된다.
“치료적 유효량”은 특정 장애의 측정 가능한 개선 또는 예방에 영향을 미치는 데 필요한 최소한의 최소 농도이다. 본원의 치료적 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자 및 개인에서 원하는 반응을 유도하는 항체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 더 큰 양이다.
용어 “약학 제형 (pharmaceutical formulation)” 또는 “약학 조성물”이란 내부에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
“약학적으로 허용되는 담체” 또는 “유효량”은 활성 성분이 아닌, 대상체에게 무독성인 약학 제형의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 “치료(treatment)”(및 이의 문법적 변화형, 이를 테면 “치료하다(treat)” 또는 “치료하는(treating)”)라는 것은 치료될 개체의 자연적인 과정을 변경시키려는 시도에 있어서의 임상적 시술과정을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리학 과정 동안 실행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태들에 있어서, 본 발명의 항체는 질환 또는 질환의 발달을 지연 또는 질환, 예를 들어, 암의 진행을 느리게 하는데 이용된다.
본원에 사용된 용어 “벡터”는 이것이 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어에는 자가-복제 핵산 구조체로서의 벡터 그리고 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 “발현 벡터”로 지칭된다.
본원에 언급된 “KRas 억제제”는 KRasG12C의 경우, 특히 Cys12 잔기에서 KRasG12C를 알킬화하는 공유 억제제를 지칭한다. KRasG12D 또는 KRasG13D와 관련하여 본원에서 사용되는 KRas 억제제는 공유 억제제(예를 들어, Asp12 또는 Asp13에 공유적으로 결합하는 분자) 또는 본원에 기재된 바와 같은 주어진 KRas 돌연변이체에 특이적으로 결합하는 비공유 억제제를 지칭할 수 있다. KRasG12V, KRasG12R, KRasG12D, KRasG13D, 및 KRasQ61H와 관련하여 본원에서 사용되는 KRas 억제제는 본원에 기재된 바와 같이 주어진 KRas 돌연변이체에 특이적으로 결합하는 비공유 억제제를 지칭할 수 있다.
AMG-510은 다음 구조를 갖는 화합물을 지칭하며:
Figure pct00001
화학명은 4-((S)-4-아크릴로일-2-메틸피페라진-1-일)-6-플루오로-7-(2-플루오로-6-하이드록시페닐)-1-(2-이소프로필-4-메틸피리딘-3-일)피리도[2,3-d]피리미딘-2(1H)-온이다.
MRTX-849는 다음 구조를 갖는 화합물을 지칭하며:
Figure pct00002
화학명은 2-((S)-4-(7-(8-클로로나프탈렌-1-일)-2-(((S)-1-메틸피롤리딘-2-일)메톡시)-5,6이고, 7,8-테트라하이드로피리도[3,4-d]피리미딘-4-일)-1-(2-플루오로아크릴로일)피페라진-2-일)아세토니트릴이다.
ARS-1620은 다음 구조를 갖는 화합물을 지칭하며:
Figure pct00003
화학명은 (R)-1-(4-(6-클로로-8-플루오로-7-(2-플루오로-6-히드록시페닐)퀴나졸린-4-일)피페라진-1-일)프로프-2-엔-1-온이다.
ARS-853은 다음 구조를 갖는 화합물을 지칭하며:
Figure pct00004
화학명은 1-(3-(4-((4-클로로-2-하이드록시-5-(1-메틸시클로프로필)페닐)글리실)피페라진-1-일)아제티딘-1-일)프로프-2-엔-1-온이다.
GNE-1952는 다음 구조를 갖는 화합물을 지칭하며:
Figure pct00005
화학명은 (R)-1-(4-(6-클로로-7-(5-메틸-1H-인다졸-4-일)퀴나졸린-4-일)피페라진-1-일)프로프-2- 엔-1-온이다.
본원에서 사용되는, 단수 형태 “하나” 및 “그것”은 달리 지시되지 않는 한 복수의 지칭을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “약”은 본 발명의 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본원의 값 또는 매개변수에 대한 “약”의 지칭은 그 값 또는 매개변수 그 자체(per se)에 관한 실시형태들을 포함 (및 설명)한다.
본원에 기재된 본 발명의 양상들 및 실시형태들은 “포함하는(comprising)”, “구성되는(consisting) 및 “~로 본질적으로 구성되는”의 양상 및 실시형태를 포함하는 것으로 이해된다.
II. 조성물 및 방법
A. 항-KRas 항체
i. 인간 KRas 단백질
한 양상에서, 본 발명은 인간 KRas 단백질 내부의 영역, 예컨대, 에피토프와 상호작용하거나 그렇지 않으면 결합하는 항체를 제공한다. KRas 단백질은 RAS/MAPK 신호 전달 경로의 일부인 21킬로달톤 단량체 GTPase이다. KRas는 원암유전자(proto-oncogene)이며 인간 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 발암유전자이다(Haigis, KM, Trends Cancer 2017 3:10).
일부 실시형태에서, 인간 KRas는 C-K-RAS, c-K-ras 단백질, c-K-ras2 단백질, c-Kirsten-ras 단백질, 세포성 c-Ki-ras2 원암유전자, K-ras p21 단백질, KI-RAS, Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체, KRAS1, PR310 cK-ras 종양유전자, RASK2, RASK_HUMAN, 변형 단백질 p21, v-Ki-ras2 Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체, NS, NS3, OES, CFC2, RALD, K-Ras , KRAS1, KRAS2, K-RAS2A, K_RAS2B 및 K-RAS4B로서 다양하게 지칭된다.
인간 KRas mRNA에는 2개의 스플라이스 동형(isoform)이 있어 KRas 단백질의 2가지 변이체를 생성한다. “KRas 동형 b”라고 하는 변이체가 우세한 변이체이며 5개의 엑손으로 구성된다. 동형 b는 엑손 4a가 없고 엑손 4b에서 끝난다. 두 번째 변이체(동형 a)는 엑손 4a를 포함하고 엑손 4a로 끝나는 6개의 엑손으로 구성된 드문 변이체이다. 본원에서 “KRas”라는 용어는 특별한 언급이 없는 한 동형 b를 지칭한다.
인간 KRas 동형 b의 아미노산 서열은 서열번호 90으로 제시되며 다음과 같다.
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
인간 KRas 동형 a의 아미노산 서열은 서열번호 89로 제시되며 다음과 같다.
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
KRas의 돌연변이 그리고, 암 표현형을 포함한 다양한 표현형과 이들의 관계가 설명된 바 있다(Man 항목 번호 190070의 Online Mendelian Inheritance 참조). 인간 KRas의 여러 돌연변이 대립유전자는 공공 인간 유전자 변이 데이터베이스의 FDA 승인을 위한 전문가 패널에 의해 병원성으로 분류되었다. 여기에는 코딩 서열 변이체 D153V, G60R, T58I, P34L, Q22R, V14I 및 K5N이 포함된다. 일부 실시형태에서, KRas는 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61E, Q61H, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R, A146T, A146P, A146V, 또는 A146T에 상응하는 돌연변이를 갖는 돌연변이체 KRas이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 예를 들어 KRasG12C, KRasG12D, KRasG13D, KRasG13C, KRasG12V, KRasG12R, 및 KRasQ61H를 포함하는 KRas의 추가 돌연변이체 대립유전자들이 사용된다.
일부 실시형태에서, KRas는 각각 GTP 및 GDP의 결합에 의해 부여되는 “결합(on)” 및 “해리(off)” 형태 사이를 순환함으로써 세포 표면 수용체를 세포내 효과기 경로들에 커플링한다. 일부 실시형태에서, KRas는 GDP에 결합되고; 이들 실시형태들에서, 이는 KRas-GDP 또는 비활성 KRas로 지칭된다. 다른 실시형태들에서, KRas는 GTP에 결합되고; 이들 실시형태들에서, 이는 KRas-GTP, 또는 활성 KRas로 지칭된다. 이 두 상태 사이의 전환은 GTP 교환을 위해 GDP를 자극하여 Ras 단백질의 활성화를 촉진하는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)와 Ras 매개 GTP 가수분해를 가속화하는 GTPase-활성화 단백질(GAP)에 의해 조절된다(Pylayeva-Gupta, Y. 외, Nat Rev Cancer 2011 11). 일부 실시형태에서, KRas의 발암성 돌연변이는 KRas-GDP와 KRas-GTP 사이를 전이하는 이의 능력을 방해한다. 일부 실시형태에서, 잔기 G12 및 G13의 발암성 치환은 입체 장애를 통해 KRas와 GAP 사이의 반 데르 발스 결합의 형성을 방지하고, 따라서 RAS에서 촉매 글루타민(Q61)의 적절한 배향을 교란시키며, 이는 GTP 가수분해를 두드러지게 약화시킨다(Pylayeva-Gupta, Y. 외, Nat Rev Cancer 2011 11; Scheffzek K, 외, Science 1997 277). 그 결과, 일부 실시형태에서 KRas는 항시적으로 활성이다.
KRas는 GDP-결합된 상태에서만 나타나는 알로스테릭 포켓을 가지고 있다(Ostream, JM 외, Nature 2013 28 503:7477). 이 포켓은 스위치-II 포켓, S-IIP 또는 SWII로 알려져 있다. KRas의 한 가지 예시적인 돌연변이체 대립유전자인 KRasG12C는 Cys12 잔기에 대한 억제제들의 공유 결합을 통해 표적화되었다. 이들 억제제는 SWII 포켓의 개방을 안정화시킨다 (Ostream, J.M. 외, Nature 2013 28 503:7477; Patricelli, M.P., 외, Cancer Discov. 2016 6; Lito, P., 외, Science 2016 351). 이러한 SWII 공유 결합제(SWII 리간드로도 알려짐)의 작용 기전은 처음에 SWII 포켓에 약하게 결합한 후 Cys12의 알킬화를 통해 일시적으로 포켓 안정화되는 것에 의한 것으로 여겨진다(Patricelli, MP, 외, Cancer Discov 2016 6). 이것은 전임상 모델에서 KRasG12C-GDP를 종양 성장을 억제하는 비활성 상태로 잠금하여 유망한 임상 활성을 보여주었다 (Patricelli, M.P., 외, Cancer Discov. 2016 6; Fakih, M. 외, J Clin Oncol 2019 37).
ii. 항-KRas 항체
인간 KRas 단백질에 결합하는 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas 단백질에 결합하고, 여기서 KRas 단백질은 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 인간 KRas에 결합하고, 여기서 항체는 GTP에 결합된 KRas(KRas-GTP) 보다 GDP에 결합된 KRas(KRas-GDP)에 더 높은 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GTP 보다 KRas-GDP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 25℃에서 KRas-GTP 보다 KRas-GDP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 KRas-GTP 보다 KRas-GDP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 25℃에서 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 KRas-GTP 보다 KRas-GDP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 항-KRas 항체가 KRas-GTP에 결합하는 것보다 KRas-GDP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GTP에 결합하는 것보다 KRas-GDP에 더 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GTP 보다 KRas-GDP에 더 강하게 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GTP 보다 KRas-GDP에 더 높은 결합 상수 또는 친화도 상수로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GTP 보다 KRas-GDP에 우선적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas GTP에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GTP에 비해 KRas-GDP에 대해 최소 10배, 최소 100배, 최소 1000배, 또는 최소 10,000배 더 큰 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GTP에 비해 KRas-GDP에 대해 10 내지 10,000배 더 큰 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GTP에 비해 KRas-GDP에 대해 10 내지 1,000,000배 더 큰 친화도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 인간 KRas에 결합하고, 여기서 항체는 GDP에 결합된 KRas(KRas-GDP) 보다 GTP에 결합된 KRas(KRas-GTP)에 더 높은 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GDP 보다 KRas-GTP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 25℃에서 KRas-GDP 보다 KRas-GTP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 KRas-GDP 보다 KRas-GTP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 25℃에서 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 KRas-GDP 보다 KRas-GTP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 항-KRas 항체가 KRas-GDP에 결합하는 것보다 KRas-GTP에 더 낮은 해리 상수(KD)로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GDP에 결합하는 것보다 KRas-GTP에 더 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GDP 보다 KRas-GTP에 더 강하게 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GDP 보다 KRas-GTP에 더 높은 결합 상수 또는 친화도 상수로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas-GDP 보다 KRas-GTP에 우선적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 활성 KRas 보다 비활성 KRas에 더 높은 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 그것이 활성 KRas에 결합하는 것보다 비활성 KRas에 더 안정적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 활성 KRas 보다 비활성 KRas에 더 낮은 KD로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 비활성 KRas에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 활성 KRas 보다 비활성 KRas에 더 큰 특이성으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 활성 KRas 보다 비활성 KRas에 더 강하게 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 활성 KRas 보다 비활성 KRas에 우선적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 KRas의 특정 형태에 결합 및/또는 유도하는 항-KRas 항체를 제공한다. 특히, SWII 포켓을 개방 및/또는 안정화하는 항-KRas 항체가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 비활성 형태를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas 억제제가 결합할 수 있도록 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태에 우선적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 개방 또는 폐쇄 형태로 KRas-GDP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 개방 또는 폐쇄 형태로 KRas-GTP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓에 대한 분자의 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓에 대한 억제제의 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓에 대한 리간드의 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓에서 공유 KRas 억제제(예를 들어, Cys12를 알킬화하는 KRas 억제제)의 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12C에 결합하여 잔기 Cys12의 공유 결합(예를 들어, 알킬화)을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D에 결합하여 잔기 Asp12의 공유 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG13D에 결합하여 잔기 Asp13의 공유 결합을 개선한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓에서 비공유 KRas 억제제(예를 들어, 잔기 12 또는 13에 비공유적으로 결합하는 KRas 억제제)의 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D에 결합하여 잔기 Asp12의 비공유 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D에 결합하여 잔기 Asp12의 공유 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12V에 결합하여 잔기 Val12의 비공유 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12R에 결합하여 잔기 Arg12의 비공유 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG13D에 결합하여 잔기 Asp13의 비공유 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG13D에 결합하여 잔기 Asp13의 공유 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasQ61H에 결합하여 잔기 His61의 비공유 결합을 개선한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 KRas를 더 빈번하게 특정 형태로 존재하게 하는 항-KRas 항체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas가 특정 형태를 차지하게 한다. 특히, KRas가 개방 SWII 포켓을 더 빈번히 포함하게 하는 항-KRas 항체가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas를 보다 빈번하게 개방 형태로 존재하게 한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas SWII 포켓을 보다 빈번하게 개방 및/또는 안정화되게 한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓을 보다 빈번하게 개방시키고 안정화시켜, KRas 억제제가 결합할 수 있게 한다. 이러한 실시형태에서, 본원에 기재된 항-KRas 항체는 위치 12의 잔기를 억제제에 더 접근가능하고/하거나 억제제에 의해 안정화되도록 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 리간드가 SWII 포켓에 결합할 가능성을 더 높인다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓이 공유 KRas 억제제(예를 들어, 알킬화됨)에 의해 결합될 가능성을 더 높인다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12C에 결합하고 잔기 Cys12가 공유 억제제(예를 들어, 알킬화됨)에 의해 결합될 가능성을 더 높인다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓이 비공유 KRas 억제제에 의해 결합될 가능성을 더 높인다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D에 결합하고 잔기 Asp12가 비공유 억제제에 의해 결합될 가능성을 더 높인다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12V에 결합하고 잔기 Val12가 비공유 억제제에 의해 결합될 가능성을 더 높인다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12R에 결합하고 잔기 Arg12가 비공유 억제제에 의해 결합될 가능성을 더 높인다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG13D에 결합하고 잔기 Asp13이 비공유 억제제에 의해 결합될 가능성을 더 높인다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasQ61H에 결합하고 잔기 His61이 비공유 억제제에 의해 결합될 가능성을 더 높인다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 KRas의 형태에 영향을 미치는 항-KRas 항체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas 단백질의 구조에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas가 차지하는 특정 형태의 상대 빈도를 변경한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 특이적 형태에 대한 KRas의 선호도를 변경한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas 구조를 알로스테릭하게 조절한다. 특히, SWII 포켓의 개방을 촉진하는 항-KRas 항체가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 SWII 포켓의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12C에서 SWII 포켓의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12D에서 SWII 포켓의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12V에서 SWII 포켓의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12R에서 SWII 포켓의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG13D에서 SWII 포켓의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasQ61H에서 SWII 포켓의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓의 개방 및 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 비활성 형태의 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas 억제제가 결합할 수 있도록 SWII 포켓의 개방 및 안정화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓에 대한 리간드의 결합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓에 대한 억제제의 결합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓에 대한 리간드의 결합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓의 공유 알킬화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12C에 결합하고 잔기 Cys12의 알킬화를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 비공유 KRas 억제제에 의한 결합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D에 결합하고 항체는 비공유 억제제에 의해 잔기 Asp12에 대한 결합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12V에 결합하고 항체는 비공유 억제제에 의해 잔기 Val12에 대한 결합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12R에 결합하고 항체는 비공유 억제제에 의해 잔기 Arg12에 대한 결합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG13D에 결합하고 항체는 비공유 억제제에 의해 잔기 Asp13에 대한 결합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasQ61H에 결합하고 항체는 비공유 억제제에 의해 잔기 His61에 대한 결합을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 KRas의 특정 형태에 결합 및/또는 유도하는 항-KRas 항체를 제공한다. 특히, SWII 포켓의 폐쇄를 방해하는 항-KRas 항체가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 SWII 포켓의 폐쇄를 방지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12C에서 SWII 포켓의 폐쇄를 방지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12D에서 SWII 포켓의 폐쇄를 방지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12V에서 SWII 포켓의 폐쇄를 방지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12R에서 SWII 포켓의 폐쇄를 방지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG13D에서 SWII 포켓의 폐쇄를 방지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasQ61H에서 SWII 포켓의 폐쇄를 방지한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas가 폐쇄 형태를 채택하는 것을 방해하거나 방지한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓의 폐쇄 형태를 방해하거나 방지한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas 억제제가 결합할 수 있도록 SWII 포켓의 폐쇄를 방해하거나 방지한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 비폐쇄 형태에 우선적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 폐쇄되지 않은 KRas SWII 포켓의 형태에 우선적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas가 폐쇄 형태로 존재할 가능성을 더 적게 한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas를 덜 빈번하게 폐쇄 형태로 존재하게 한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항-KRas 항체의 결합은 KRas의 특정 형태를 유도한다. 특히, 본원에 개시된 항-KRas 항체의 결합은 개방 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12C에서 개방 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12D에서 개방 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12V에서 개방 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12R에서 개방 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG13D에서 개방 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasQ61H에서 개방 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 안정하게 개방된 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 개방될 가능성이 더 큰 SWII 포켓을 생성한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 SWII 포켓을 개방시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 KRas의 개방 형태를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 KRas의 비활성 형태를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 KRas 억제제가 결합할 수 있도록 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 SWII 포켓에 대한 억제제의 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 SWII 포켓에 대한 리간드의 결합을 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 SWII 포켓의 공유 알킬화를 개선한다. 일부 실시형태에서, KRasG12C에 대한 항-KRas 항체의 결합은 잔기 Cys12의 알킬화를 개선한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 KRas의 특정 형태에 특이적으로 결합하고/하거나 이를 유도하는 항-KRas 항체를 제공한다. 특히, SWII 포켓을 특이적으로 개방하는 항-KRas 항체가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 SWII 포켓을 특이적으로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12D의 SWII 포켓을 특이적으로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12V의 SWII 포켓을 특이적으로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG12R의 SWII 포켓을 특이적으로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasG13D의 SWII 포켓을 특이적으로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체는 KRasQ61H의 SWII 포켓을 특이적으로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태를 특이적으로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓을 특이적으로 개방하고 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 비활성 형태를 특이적으로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas 억제제가 결합할 수 있도록 SWII 포켓을 특이적으로 개방하고 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 클래스 I 항체로 지칭되고, 예를 들어, 항체 1A5, 1D6, 2C1, 1A6, 1F4, 및 1B7을 포함한다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 KRas 억제제에 공유 결합된 KRas에 결합한다(예를 들어, Cys12가 공유 억제제에 의해 알킬화된 경우). 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 공유 결합된 SWII 억제제의 존재시 결합한다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 공유 결합된 SWII 리간드의 존재시 결합한다. 일부 실시형태에서, KRas는 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157로 이루어진 군으로부터 선택된 KRas 억제제에 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 또 다른 실시형태에서, KRas는 ARS1620 또는 GNE1952와 같은 화합물에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 SWII 포켓이 개방 형태인 KRas에 결합한다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 KRasG12D의 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 KRasG12V의 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 KRasG12R의 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 KRasG13D의 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 KRasQ61H의 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 SWII 포켓을 개방 형태로 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체를 사용하여 KRas의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체를 사용하여 공유 억제제에 대한 KRasG12C의 결합을 검출한다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체를 사용하여 생체내 종양 세포에서 알킬화된 KRasG12C-GDP를 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체를 사용하여 생체내 종양 세포에서 알킬화된 KRasG12C-GTP를 검출할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 검출은 KRas 억제제(예를 들어, MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157)로 치료 중인 환자에서 KRasG12C의 알킬화를 모니터링하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태에 대하여 폐쇄 형태에 비해 최소 5배, 최소 2배, 최소 10배, 최소 50배, 최소 100배, 최소 1000배 더 큰 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태에 대하여 폐쇄 형태에 비해 2 내지 1000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태에 대하여 폐쇄 형태에 비해 10 내지 1000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태에 대하여 폐쇄 형태에 비해 10 내지 10000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 KRas의 개방 형태에 대하여 폐쇄 형태에 비해 10 내지 100000배 증가된 친화도를 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 본원에 기재된 바와 같이 KRas의 SWII 포켓의 개방 형태를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 클래스 I 또는 클래스 II 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1D6이다. 일부 실시형태에서, 항체는 2C1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A6이다. 일부 실시형태에서, 항체는 1B7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2A3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 3A12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 4G12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1F4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab2이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab8이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체는 KRas에 결합하고 SWII 포켓이 개방된 KRas의 형태를 유도한다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체는 초기에 SWII 포켓이 폐쇄된 KRas에 결합하여, KRas의 형태 변화를 유도하고 그 결과 SWII 포켓은 개방된다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체의 결합은 SWII 포켓이 개방되도록 한다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체는 SWII 포켓의 개방을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체는 KRas의 형태를 변경한다. 일부 실시형태에서, 알킬화-유도 KRas 항체는 클래스 II 항체이다. 일부 실시형태에서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체는 클래스 II 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 또는 4G12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2A3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 3A12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 4G12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1F4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab2이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab8이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체는 공유 결합된 KRasG12C 억제제 또는 SWII 리간드의 부재시 SWII 포켓의 개방 형태를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 초기에 SWII 포켓이 개방된 KRas에 결합하고, 본원에 기재된 바와 같이 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체는 비공유 결합된 KRasG12C 억제제 또는 SWII 리간드의 부재시 SWII 포켓의 개방 형태를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, SWII 포켓의 개방 형태는, 이러한 항체에 의해 결합되지 않은 야생형 KRas 단백질에서 보다 개방 상태로 존재할 가능성이 더 높을 때 안정화되는 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, SWII 포켓의 개방 형태는 개방 형태가 일반적인 경우보다 더 빈번하게 존재하는 경우 유도되는 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas SWII 포켓을 개방 형태로 잠근다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓이 폐쇄되는 것을 방지한다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체는 KRasG12C및 야생형 KRas에 대한 다수의 G12C 억제제의 비공유 친화도를 개선한다.
일부 실시형태에서, 알킬화-유도 항-KRas 항체는 비알킬화 KRas-GDP 및 알킬화 KRas-GDP에 거의 동일한 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 비알킬화 KRas-GDP 및 알킬화 KRas-GDP에 서로 10배 이내, 5배 이내, 또는 2배 이내의 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 비알킬화 KRas-GDP 및 알킬화 KRas-GDP에 서로 10 내지 2배 이내의 친화도로 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 인간 KRas에 결합하는 항-KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 인간 KRas는 KRas 돌연변이체이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12C이다. KRas의 코돈 12에서의 돌연변이는 KRAS가 가장 흔한 암(즉, 췌관 선암종(PDAC), 결장직장암(CRC) 및 비소세포폐암(NSCLC))에서 우세하다(Haigis, KM, Trends Cancer 2017 3:10). KRasG12C는 상기 설명한 바와 같이 돌연변이된 잔기 Cys12에 공유 결합하는 화합물들에 의해 표적화된 KRAS의 특정 대립유전자이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이 단백질에 결합한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12V이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12R이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasQ61H이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12D이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG13D이다.
일부 실시형태에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자와 공유 결합된(예를 들어, 알킬화된) KRasG12C-GDP에 결합하는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 소분자에 의해 공유 결합된 KRasG12C-GDP에 결합하는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 MRTX849와 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 AMG-510과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 GDC-6036과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 ARS-3248과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 LY3499446과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 JNJ-74699157과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다.
일부 실시형태에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 기재된 바와 같은 임상 샘플에서 소분자와 공유 결합된 (예를 들어, 알킬화된) KRasG12C-GDP에 결합하는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 본원에 기재된 바와 같이 환자로부터 채취한 종양 샘플의 소분자에 의해 공유 결합된 KRasG12CGDP에 결합하는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 이러한 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 MRTX849와 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 이러한 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 AMG-510과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 이러한 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 GDC-6036과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 이러한 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 ARS-3248과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 이러한 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 LY3499446과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 이러한 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 JNJ-74699157과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 이러한 실시형태에서, KRasG12C-GDP는 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157과 공유 결합(예를 들어, 알킬화)된다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 기재된 바와 같은 KRas-GDP에 결합하는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체로서, 본원에 기재된 바와 같은 표적 결합 수준을 결정하기 위한 바이오마커에서 사용된다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12C-GDP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12C-GDP가 알킬화되지 않을 때 보다 KRasG12C-GDP가 알킬화될 때 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D-GDP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12V-GDP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12R-GDP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG13D-GDP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasQ61H-GDP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 돌연변이체 KRas-GDP가 공유 또는 비공유 KRas 억제제에 의해 결합되지 않을 때 보다 돌연변이체 KRas-GDP가 공유 또는 비공유 KRas 억제제에 의해 결합될 때 상기 돌연변이체 KRas-GDP에 더 높은 친화도로 결합한다.
일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GDP에 비해 알킬화된 KRas-GDP에 대해 최소 5배, 최소 2배, 최소 10배, 최소 50배, 최소 100배, 최소 1000배 더 큰 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GDP에 비해 알킬화된 KRas-GDP에 대해 2 내지 1000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GDP에 비해 알킬화된 KRas-GDP에 대해 10 내지 1000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GDP에 비해 알킬화된 KRas-GDP에 대해 10 내지 1000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GDP에 비해 알킬화된 KRas-GDP에 대해 10 내지 10000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GDP에 비해 알킬화된 KRas-GDP에 대해 10 내지 100000배 증가된 친화도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GTP에 비해 알킬화된 KRas-GTP에 대해 최소 5배, 최소 2배, 최소 10배, 최소 50배, 최소 100배, 최소 1000배 더 큰 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GTP에 비해 알킬화된 KRas-GTP에 대해 2 내지 1000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GTP에 비해 알킬화된 KRas-GTP에 대해 10 내지 1000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GTP에 비해 알킬화된 KRas-GTP에 대해 10 내지 1000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GTP에 비해 알킬화된 KRas-GTP에 대해 10 내지 10000배 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 알킬화된 형태 특이적 항-KRas 항체는 알킬화되지 않은 KRas-GTP에 비해 알킬화된 KRas-GTP에 대해 10 내지 100000배 증가된 친화도를 갖는다.
일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasG12D-GDP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasG12D-GTP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasG12V-GDP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasG12V-GTP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasG12R-GDP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasG12R-GTP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasQ61H-GDP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasQ61H-GTP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasG13D-GDP에 결합하는 항-KRas 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 소분자에 비공유적으로 결합된 KRasG13D-GTP에 결합하는 항-KRas 항체이다.
일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 2H11의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 2H11의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 2H11의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 2H11의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 Ab1의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 Ab1의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 Ab1의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 Ab1의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab1은 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab1은 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 Ab2의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 Ab2의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 Ab2의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 Ab2의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab2는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab2는 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 Ab3의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 Ab3의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 Ab3의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 Ab3의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab3은 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab3은 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 Ab4의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 Ab4의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 Ab4의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 Ab4의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab4는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab4는 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 Ab5의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 Ab5의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 Ab5의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 Ab5의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab5는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab5는 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 Ab6의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 Ab6의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 Ab6의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 Ab6의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab6은 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab6은 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 Ab7의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 Ab7의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 Ab7의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 Ab7의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab7은 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab7은 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 Ab8의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 Ab8의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 Ab8의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 Ab8의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab8은 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 Ab8은 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 16의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 16의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 16을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태들에서, 서열번호 16에서 총 1 내지 13개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 99의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 99의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 99를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 99에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 100의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 100의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 100을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 100에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 101의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 101의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 101을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 101에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 102의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 102의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 102를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 102에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 103의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 103의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 103을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 103에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 104의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 104의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 104를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 104에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 105의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 105의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 105를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 105에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 106의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 106의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 106을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 106에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 15의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 15를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 15에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 16에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 99에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 100에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 101에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 102에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 103에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 104에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 105에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 106에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 15에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 1A5의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 1A5의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 1A5의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1A5의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 8을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 8에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 7의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 7을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 7에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 8에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 7에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 1D6의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 1D6의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 1D6의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1D6의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 24의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 24를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태들에서, 서열번호 24에서 총 1 내지 13개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 23의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 23을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 23에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 24에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 23에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 2C1의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 2C1의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 2C1의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 2C1의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 32의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 32를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 32에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 31의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 31을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 31에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 32에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 31에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 4G12의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 4G12의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 4G12의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 4G12의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 40의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 40을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 40에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 39의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 39를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 39에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 40에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 39에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 1A6의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 1A6의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 1A6의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1A6의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 48의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 48를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 48에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 47의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 47의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 47을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 47에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 48에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 47에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 1F4의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 1F4의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 1F4의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1F4의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 88의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 88의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 88을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 88에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 87의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 87의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 87을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 87에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 88에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 87에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 1B7의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 1B7의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 1B7의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1B7의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 56의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 56의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 56을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 56에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 55의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 55의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 55를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 55에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 56에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 55에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 1E5의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 1E5의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 1E5의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 1E5의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 64의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 64의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 64를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 64에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 63의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 63의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 63을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 63에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 64에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 63에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 2A3의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 2A3의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 2A3의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 2A3의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 72의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 72의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 72를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 72에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 71의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 71의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 71을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 71에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 72에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 71에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같은 항체 3A12의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같은 항체 3A12의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 3A12의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR, 및/또는 항체 3A12의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항-KRas 항체는 KRas 돌연변이체 KRasG12C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas의 SWII 포켓을 개방하고 안정화시킨다.
일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 80의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH 서열은 서열번호 80의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 80을 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호 80에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 79의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, VL 서열은 서열번호 79의 아미노산 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호 79를 포함하는 항-KRas 항체로서 KRas에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호 79에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되는데, 여기서 이 항체는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-KRas 항체가 제공되며, 여기서 이 항체는 서열번호 80에 제시된 서열을 가지는 VH 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및 서열번호 79에 제시된 서열을 가지는 VL 내부에 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함하는 항-KRas 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 임의의 상기 실시형태에 따른 항-KRas 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 단클론 항체이다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시형태에서, 항-KRas 항체는 전장 항체, 예를 들어, 온전한 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 분류 또는 아이소형이다.
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 실시형태에 따른 항-KRas 항체는 인간 KRas의 아미노산 에피토프 또는 에피토프들에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 인간 KRas의 아미노산 W99, K5, L6, V7, S39, D54, L54, Y71, T74, 및/또는 G75 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상, 또는 이들 모두에 결합하며, 여기서 인간 KRas는 아미노산 서열 서열번호 90을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 인간 KRas의 W99에 결합한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 인간 KRas의 SW1 및 SW2의 잔기에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 인간 KRas의 SW2에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 다음 표 A-D에 열거된 아미노산 잔기들에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 A에 열거된 잔기의 3.5, 4.0, 또는 4.5 옹스트롬(Å) 이내에서 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 B에 열거된 잔기의 3.5, 4.0, 또는 4.5 Å 이내에서 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 C에 열거된 잔기의 3.5, 4.0, 또는 4.5 Å 이내에서 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 표 D에 열거된 잔기의 3.5, 4.0, 또는 4.5 Å 이내에서 결합한다.
표 A: 2H11에 대한 접촉 잔기들
Figure pct00006
표 B: 2C1에 대한 접촉 잔기들
Figure pct00007
표 C: 1E5에 대한 접촉 잔기들
Figure pct00008
표 D: 3A12에 대한 접촉 잔기들
Figure pct00009
일부 실시형태에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 및 Ab8에 대한 접촉 잔기는 도 11A 및 도 11B에 제시된 바와 같다.
또 다른 양상에서 KRas 단백질(예를 들어, 서열번호 90) 또는 이의 단편 및 본원에 기재된 항체의 Fab, scFv, 또는 IgG를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 한 이러한 실시형태에서, 융합 단백질은 본원에 기재된 KRas 단백질 또는 이의 단편, (Gly-Ser)n (여기서 n은 최소 1임)을 포함하는 링커, 및 본원에 기재된 Fab, scFv 또는 IgG를 포함한다. 한 이러한 실시형태에서, n은 1-5, 1-8, 1-10, 또는 1-20의 정수이다. 한 실시형태에서, KRas 단백질 또는 이의 단편은 본원에 기재된 Fab의 N-말단에 융합된다. 한 이러한 실시형태에서, KRas와 Fab의 N-말단 사이에 링커가 존재한다. 또 다른 실시형태에서, KRas 단백질 또는 이의 단편은 Fab의 C-말단에 연결된다. 한 이러한 실시형태에서, KRas 단백질의 N-말단과 Fab의 C-말단 사이에 본원에 기재된 링커가 존재한다.
본원에 기재된 융합 단백질의 한 실시형태에서, Fab는 다음과 같은 HC 서열: EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (서열번호 107)
및 LC 서열을 포함한다: GLNDIFEAQKIEWHEGSENLYFQSTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 108).
본원에 기재된 융합 단백질의 또 다른 실시형태에서, Fab는 다음과 같은 HC 서열: GLNDIFEAQKIEWHEGSENLYFQSTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (서열번호 109)
및 LC 서열을 포함한다: SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 110).
본 발명의 추가 양상에서, 임의의 상기 실시형태에 따른 또는 본원에 기재된 항-KRas 항체는 이종 모이어티, 제제 또는 표지에 접합된다. 적합한 표지의 예는 형광색, 화학발광 및 방사성 표지와 같이 직접적으로 검출될 수 있는 모이어티, 뿐만 아니라, 검출되기 위해 반응하거나 유도체화되어야 하는 효소와 같은 모이어티를 비롯하여 면역분석에 사용되는 것으로 알려진 수많은 표지이다. 이러한 표지의 예는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 세균성 루시페라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, HRP, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 결합된 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴(예를 들어, MUG와 함께 아비딘, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘-HRP 및 스트렙타비딘-β-갈락토시다제에 의해 검출가능), 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등이 포함된다.
또 다른 양상에서, 임의의 상기 실시형태에 따른 또는 본원에 기재된 항-KRas 항체 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기재된 항-KRas 항체를 인코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 및 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 단리되거나 정제된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 세포 배양 배지이다.
iii. 생산 방법
1. 다클론항체
본 발명의 항체는 다클론 항체를 포함할 수 있다. 다클론 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다클론 항체는 예를 들어 면역화제 및, 필요한 경우, 보조제의 1회 이상의 주입에 의해 포유동물에서 생성될 수 있다. 전형적으로, 면역화제 및/또는 보조제는 다중 피하 또는 복강내 주입에 의해 포유동물에 주입될 것이다. 면역화제는 인간 KRas 또는 이의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로인트 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 그런 다음 포유동물을 채혈하고 항-KRas 항체 역가에 대해 혈청을 분석할 수 있다. 원하는 경우, 항체 역가가 증가하거나 안정될 때까지 포유동물을 추가접종 할 수 있다.
2. 단클론항체
본 발명의 항체는 대안적으로 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 Kohler 외, Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 만들 수 있거나 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 만들 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 전술한 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후 림프구를 단리한 다음 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제를 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986)).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를, 융합되지 않은 모체 골수종 세포(융합 파트너로도 지칭됨)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질들을 함유하는 적합한 배양 배지에 씨딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모체 골수종 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마에 대한 선택적 배양 배지는 일반적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하며(HAT 배지), 이러한 물질은 HGPRT- 결핍 세포의 성장을 방해한다.
융합 파트너 골수종 세포는, 효율적으로 융합하고 선택된 항체 생산 세포에 의한 안정적인 고수준 항체 생산을 지원하며 융합되지 않은 모체 세포들에 대해 선택하는 선택적 배지에 민감한 세포이다. 골수종 세포주는 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재 Salk Institute Cell Distribution Center에서 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 및 미국 버지니아주 매나사스 소재의 American Type Culture Collection에서 입수 가능한 SP-2 및 유도체, 예를 들어, X63-Ag8-653 세포에서 유래된 것과 같은 뮤린 골수종 세포주이다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 기술되어 있다(Kozbor, J. Irnmunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대한 단클론 항체의 생산에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침전법에 의해 또는 방사면역분석(RIA) 또는 효소결합 면역흡착분석(ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어, Munson 외, Anal. Biochem., 107:220(1980)에 기재된 스캐챠드 분석법에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 희석 절차를 제한하여 클론들을 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 예를 들어 세포를 마우스에 복강내 주입함으로써 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 단클론 항체는, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스 사용) 또는 이온 교환 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등과 같은 통상적인 항체 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자들에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있고, 그 다음 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 달리 항체 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포에 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체의 합성을 얻는다. 항체를 인코딩하는 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 대한 리뷰 논문에는 Skerra 외, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) and Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)가 포함된다.
추가 실시형태에서, 단클론 항체 또는 항체 단편은 McCafferty 외, Nature, 348:552-554 (1990)에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. Clackson 외, Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks 외, J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)은 각각 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리를 기술한다. 후속 간행물은 사슬 셔플링(Marks 외, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 생산, 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리 구축에 대한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합을 설명한다(Waterhouse 외, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266(1993)). 따라서, 이러한 기술은 단클론 항체를 단리하는 전통적인 단클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
원칙적으로 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 표시하는 파지를 포함하는 파지 라이브러리들을 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 원하는 항원에 대해 스크리닝된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편들을 발현하는 클론들은 항원에 흡착되어 라이브러리 내 비결합 클론들과 분리된다. 그런 다음 결합 클론들이 항원으로부터 용리되고 추가적인 항원 흡착/용리 주기에 의해 추가로 농축될 수 있다.
Winter 외, Ann. Immunol., 12: 433-455(1994)에 기재된 바와 같이, 가변 도메인은 VH와 VL이 짧고 유연한 펩티드를 통해 공유 연결되어 있는 단일 사슬 Fv(scFv) 단편으로서, 또는 Fab 단편으로서 파지에 기능적으로 표시될 수 있으며, 여기서 이들은 각각 불변 도메인에 융합되어 비공유적으로 상호작용한다.
VH 및 VL 유전자들의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝될 수 있고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있으며, 그런 다음 Winter 외, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론들에 대해 검색될 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 Griffiths 외, EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재된 바와 같이 복제되어, 면역화 없이 광범위한 자가 항원 및 자가 항원들에 대한 단일한 인간 항체 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재된 바와 같이 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V 유전자 절편들을 복제하고 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조될 수도 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 구현될 수 있다. 예를 들어, 인간 KRas는 흡착 플레이트의 웰을 코팅하거나, 흡착 플레이트에 부착된 숙주 세포에서 발현되거나 세포 분류에 사용되거나, 스트렙타비딘 코팅 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합되거나, 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에 사용될 수 있다.
느린 해리 동역학(및 우수한 결합 친화도)을 갖는 항체들의 선별은 Bass 외, Proteins, 8:309-314(1990) 및 WO 92/09690에 기재된 바와 같이 긴 세척 및 1가 파지 디스플레이를 사용하여 그리고 Marks 외, Biotechnol., 10: 779-783(1992)에 기재된 바와 같이 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용하여 촉진될 수 있다.
본 발명의 임의의 항-KRas 항체는 관심 파지 클론을 선택하기 위한 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후 관심 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 Kabat 외, Sequences of Proteins of lmmunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 기재된 적합한 불변 영역(Fc) 서열들을 사용하여 전장 항-KRas 항체 클론을 구축함으로써 얻을 수 있다.
3. 형태 특이적 항-KRas 항체의 선별
본원에 제공된 방법을 사용하여 인간 KRas의 특정 형태에 결합하는 항체를 스크리닝할 수 있다. 한 실시형태에서, 이 방법을 사용하여 KRasG12C-GTP보다 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 (a) 항체 라이브러리를 i) KRasG12C-GDP, ii) 알킬화된 KRasG12C-GDP, 및 iii) 비가수분해성 GTP 유사체에 결합된 KRasG12C와 접촉시키는 단계 및 (b) 비가수분해성 GTP 유사체에 결합된 KRasG12C보다 알킬화된 KRasG12C-GDP 및 알킬화되지 않은 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 합성 항체 라이브러리와 인간 KRasG12C를 별개의 형태로 사용하는 시험관 내 선별 전략이 사용될 수 있다. 예를 들어, 알킬화되거나 알킬화되지 않은 그리고 GDP에 결합된 KRasG12C, 및 GMPPcp에 결합된 알킬화되지 않은 KRasG12C(비가수분해성 GTP 모방체)가 사용될 수 있다. 바이오패닝은 합성 파지 라이브러리가 소분자 G12C 억제제인 GNE-1952로 알킬화된 비오티닐화된 KRasG12C-GDP가 있는 용액에서 인큐베이션되는 방식으로 수행될 수 있다(Li Liansheng 외, WO2017058768A1). ARS-853 및 ARS-1620과 같은 다른 소분자를 사용하여 Cys12에 공유 결합하여 KRasG12C를 개방 SWII 형태로 잠글 수 있다. 알킬화된 KRasG12C-GDP의 고유한 형태로의 선별을 유도하기 위해 용액 중에 비오티닐화되지 않은 KRasG12C-GDP 및 KRasG12C-GMPPcp가 과량 존재시 선별을 수행할 수 있다. 따라서, KRasG12C-GDP가 비오티닐화되고 수집될 수 있기 때문에 KRasG12C-GDP 및 KRasG12C-GMPPcp가 아닌 개방 형태 KRasG12C-GDP+ GNE-1952에 특이적인 항체가 농축될 수 있다.
형태 특이적 항-KRas 항체 선별은, 예를 들어, 기존의 합성 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 수행할 수 있다 (C. V. Lee 외, J Mol Biol 2004; 340:1073-1093; W. C. Liang 외, J Mol Biol 2007; 366:815-829). 풀링된 라이브러리는 비오티닐화된 KRasG12Ci-GDP+GNE1952(초기 500nM에서 10nM까지 범위)에 대한 용액에서 3 내지 4회 결합을 통해 순환될 수 있다. 용액을 뉴트라비딘(NeutrAvidin) 비드(Promega사)에 포획하고, 5uM 비오틴으로 차단하고, PBS + 0.5% BSA + 0.1% Tween 20(PBSBT)에서 각각 30초 동안 3회 세척하고, 100mM HCl로 용리할 수 있다. 용리된 파지는 1M TRIS-HCl pH 8.0으로 중화된 다음, M13-KO7 헬퍼 파지(New England Biolabs사)를 첨가하여 대장균 XL1-블루(Stratagene사)에서 밤새 증폭될 수 있다. 알킬화된 KRasG12C에 특이적인 결합제를 농축시키기 위해 1μM의 가용성 KRasG12C-GDP 또는 KRasG12C-GMPPcp가 과량 존재하는 상태에서 선별을 수행할 수 있다. 선별 후 개별 콜로니들이 선별되고 카르베니실린 및 헬퍼 파지가 보충된 2xYT 배지의 96웰 딥 웰 플레이트에서 30˚에서 밤새 성장될 수 있다. KRasG12Ci-GDP+GNE1952, KRasG12C-GDP, 및 KRasG12C-GMPPcp에 대한 파지 ELISA에서 파지 상층액을 사용하여 형태 특이적 KRas 표적에 특이적인 클론들을 식별 할 수 있다.
iv. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 한 실시형태에서, 본원에 기재된 항-KRas 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 추가 실시형태에 있어서, 이러한 핵산이 포함된 하나 또는 그 이상의 벡터(예로써, 발현 벡터)가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예를 들어, 다음에 의해 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예컨대, YO, NSO, Sp20 세포)다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 이 때 상기 방법은 상기에서 제공된, 상기 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 그리고 선택적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항체의 재조합 생산을 위하여, 예컨대, 상기 기재한 항-KRas 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포 안에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위하여 하나 이상의 벡터 안으로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 과정에 의해(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고, 시퀀싱된다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편들 및 폴리펩티드 발현과 관련하여 예컨대, 미국 특허 제5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523호를 참고하라. (대장균(E. coli)에서 항체 단편들의 발현을 설명하는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 또한 참고) 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가로 정제될 수 있다.
원핵세포 이외에도, 진핵 미생물, 이를 테면 섬유성 곰팡이 또는 효모는 항체-인코딩 벡터의 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 당화 경로가 “인간화되고”, 결과적으로 부분적으로 또는 온전하게 인간 당화 패턴을 가진 항체가 생산되는 곰팡이 및 효모 균주가 포함된다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li 외, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) 참조.
당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포들은 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 또한 유도된다. 무척추동물 세포들의 예로는 식물 및 곤충 세포들이 포함된다. 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들의 형질감염을 위하여 곤충 세포들과 병용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주들이 확인되었다. 식물 세포 배양물 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429호를 참고하라 (유전자삽입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIES™를 설명).
척추동물 세포들 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 개조시킨 포유동물 세포주들이 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV 1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham 외, J. Gen Viral. 36:59 (1977)에 설명된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에 설명된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV 1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VER0-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MOCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep 02), 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather 외, Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 설명된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFKCHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 (Urlaub 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 YO, NSO 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토는 예컨대, Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)를 참고하라.
v. 분석
본원에 제공된 항-KRas 항체들은 해당 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 그 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
1. 결합 분석 및 기타 분석
한 양상에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 테스트된다. 결합 친화도는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 한 실시형태에서, 항체의 KD는 다음에 기재된 바와 같은 분석법에 의해 항원 분자 및 항체의 Fab 버전을 사용하여 수행되는 방사능표지된 항원 결합 분석 (RIA)에 의해 측정되는데, 이는 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈들(titration series)의 존재하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 항원에 대한 Fab들의 용액 결합 친화도를 측정한다 (Chen, 외, (1999) J. Mol. Biol 293:865-881). 분석 조건을 설정하기 위해 미세역가 플레이트 (Dynex)를 50mM 소듐 카보네이트(pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체(Cappel Labs)로 밤새 코팅한 다음, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 실온(약 23°C)에서 2 내지 5시간 동안 차단시켰다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합된다 (Presta 외, (1997) Cancer Res. 57:4593-4599에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치). 관심 Fab는 그 다음 하룻밤 동안 배양되고; 그러나, 평형에 확실하게 이를 수 있도록 더 오랜 기간(예로써, 65 시간) 동안 배양이 지속될 수 있다. 그 이후, 상기 혼합물은 실온 배양 (1 시간 동안)을 위하여 포획 플레이트로 이전된다. 그런 다음 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 0.1% Tween-20으로 8회 세척하였다. 플레이트가 건조되어 있을 경우, 150 μL/웰의 발광제(scintillant; MicroScint-20; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 10분간 Topcount 감마 카운터(Packard) 상에서 계수하였다. 경쟁적 결합 분석에 사용하기 위하여 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab 농도가 선택된다.
또 다른 실시형태에 따르면, KD는 10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 기기(BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIAcore Inc.)은 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화된다. 항원은 예를 들어 pH 4.8의 10mM 소듐 아세테이트를 사용하여 약 3-10μg/ml(예를 들어, 5μg/ml(0.2μM))의 농도까지 희석된 다음, 커플링된 단백질의 약 10 반응 단위(RU)를 달성할 때까지 3-10 μL/분(예를 들어, 5 μL/분)의 유속으로 주입된다. 항원을 주입한 후 에탄올아민(예를 들어, 1mM)을 주입하여 미반응 그룹을 차단할 수 있다. 동역학 측정을 위해, 본원에 기술된 것과 같은 Fab의 2배 연속 희석액(예를 들어, 0.78 nM 내지 500 nM의 농도)을 25℃에서 TWEEN 20™ 계면활성제(PBST)가 포함된(예를 들어, 0.05 %) PBS에 주입할 수 있다. 주입은 대략 10-50μL/분(예를 들어, 25μL/분)의 유속일 수 있다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 예를 들어, 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 1:1 Langmuir 결합 모델(BIAcore® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산할 수 있다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon 비율로 계산할 수 있다. 예를 들어, Chen 외, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 참조. 상기 표면-플라즈몬 공명 분석에 의해 결합-속도가 106M1 s1를 초과하는 경우, 결합-속도는 25℃에서 예를 들어, 약 6.8-7.5(예를 들어, 7.2) pH의 PBS에서 10-50 nM (예를 들어, 20 nM) 농도의 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방출 강도(예를 들어, 여기 =295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 측정은 분광계, 예를 들어, 정지 흐름이 장착된 분광 광도계(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 있는 8000 시리즈 SLM-AMINCO™ 분광 광도계(ThermoSpectronic)에서 측정된 항원 농도 증가의 존재하에 수행될 수 있다.
또 다른 양상에서, 경쟁 분석법을 사용하여 본원에 기재된 임의의 항-KRas 항체와 인간 KRas의 결합에 대해 경쟁하는 또 다른 항-KRas 항체를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 경쟁 항체는 KRas의 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프들을 매핑하기 위한 상세한 예시적인 방법은 Morris(1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. Humana Press, Totowa, NJ)에 제공된다.
예시적인 경쟁 분석법에서, 고정화된 인간 KRas 단백질은 각각 KRas에 결합하는 표지된 제1 항체(예를 들어, 표지된 제1 항-KRas 항체) 및 KRas에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 테스트 될, 표지되지 않은 제2 항체(예를 들어, 표지되지 않은 제2 항-KRas 항체)를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상층액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 KRas는 표지된 제1 항체를 포함하지만 표지되지 않은 제2 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션된다. KRas에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 인큐베이션한 후, 과량의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정된 KRas와 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 KRas와 결합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 테스트 샘플에서 실질적으로 감소하면, 이는 제2 항체가 KRas에 대한 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 참조. 또한 경쟁 분석은 KRas로 형질감염되어 세포 표면에서 발현되는 세포를 사용하여 FACS를 사용하여 상기 설명한 방식으로 수행될 수 있다. 또한 KRas를 사용한 ELISA는 경쟁 분석에서도 사용할 수 있다.
또 다른 양상에서, 겔 이동 분석은 본 발명의 항-KRas 항체와 표적 단백질, 예를 들어, 인간 KRas 사이의 상호작용을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 겔 이동 분석에서, 인간 KRas는 항-KRas 항체와 함께 사전 인큐베이션된다. 사전 인큐베이션된 KRas 및 항-KRas 항체와 함께 사전 인큐베이션되지 않았던 대조군 KRas는 겔 전기영동 및 프로브된 2차 항체에 처리된다. 사전 인큐베이션된 KRas와 KRas의 이동성을 비교하며, 이때 사전 인큐베이션된 KRas와 대조군 KRas의 이동성의 차이는 KRas와 항-KRas 항체 사이의 상호작용을 나타낸다.
2. 결정 구조
일부 실시형태에서, 인간 KRas와 복합체를 이루는 본 발명의 항-KRas 항체의 결정 구조를 알아본다. 예를 들어, KRas와 항-KRas 항체는 복합체에서 정제 및 결정화될 수 있으며, 이들의 구조는 X선 결정학에 의해 결정될 수 있다.
B. 항-KRas 항체를 사용하는 방법
특정 실시형태에서, 임의의 항-KRas 항체, 또는 본원에 제공된 바와 같은 이러한 항체를 포함하는 조성물은 생물학적 샘플에서 KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas의 존재를 검출함에 유용하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 KRas, KRas-GDP 및/또는 알킬화된 KRas를 정량하는데 유용하다.특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 KRasG12C, KRasG12C-GDP 및/또는 알킬화된 KRasG12C를 정량하는데 유용하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 KRasG12V 또는 KRasG12V-GDP를 정량하는데 유용하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 KRasG12R 또는 KRasG12R-GDP를 정량하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같은 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 KRasG12D 또는 KRasG12D-GDP를 정량하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같은 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 KRasG13D 또는 KRasG13D-GDP를 정량하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같은 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 KRasQ61H 또는 KRasQ61H-GDP를 정량하는 데 유용하다.
특정 실시형태에서, 임의의 항-KRas 항체, 또는 본원에 제공된 바와 같은 이러한 항체를 포함하는 조성물은 생물학적 샘플에서 KRas, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas의 존재를 검출함에 유용하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 KRas, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas를 정량하는데 유용하다.특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 KRasG12C, KRasG12C-GTP 및/또는 알킬화된 KRasG12C를 정량하는데 유용하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 KRasG12V 또는 KRasG12V-GTP를 정량하는데 유용하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 샘플에서 KRasG12R 또는 KRasG12R-GTP를 정량하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 KRasG12D 또는 KRasG12D-GTP를 정량하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 KRasG13D 또는 KRasG13D-GTP를 정량하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 KRasQ61H 또는 KRasQ61H-GTP를 정량하는 데 유용하다.
한 양상에서 KRas 단백질(예를 들어, KRasG12C)에 대한 본원에 기재된 하나 이상의 KRas 억제제의 표적 결합을 측정하는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시형태에서, 이 방법은: (a) 본원에 기재된 환자로부터 샘플(예를 들어, 본원에 기재된 종양 샘플)을 수득하는 단계; (b) 샘플을 본원에 기재된 항-KRas 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (c) 항-KRas 항체에 의해 결합된 KRas의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 이러한 KRas 억제제는 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157이다.
일부 실시형태들에서 KRas 단백질(예를 들어, KRasG12C)에 대한 본원에 기재된 하나 이상의 KRas 억제제의 표적 결합을 측정하는 바이오마커 분석법이 본원에 제공된다. 일부 이러한 실시형태에서, 바이오마커 분석은 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 및 JNJ-74699157로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 KRas 억제제로 처리된 환자로부터 채취한 임상 샘플에서 임상 환경에서 표적 참여를 측정한다. 일부 이러한 실시형태에서, 바이오마커 분석은 이러한 환자에 대한 본원에 기재된 KRas 억제제의 투여량을 결정하는 데 사용된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas를 검출하거나 정량화하기 위해 사용될 수 있는 표지된 항-KRas 항체가 제공된다. 표지에는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(형광, 발색, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지와 같은), 뿐만 아니라 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호 작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 세균성 루시페라제(미국 특허 제4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토실라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 과산화수소를 사용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼, 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 KRas, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas를 검출하거나 정량화하기 위해 사용될 수 있는 표지된 항-KRas 항체가 제공된다. 표지에는 상기 설명한 표지들이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같은 임의의 항-KRas 항체, 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 면역분석에서 특히 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H를 비롯한 KRas, 예를 들어, KRas-GDP 및/또는 알킬화된 KRas의 존재를 검출함에 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 면역분석법에서 KRas, 알킬화된 KRasG12C의 존재를 검출함에 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 본원에 기재된 공유 KRas 억제제에 결합된 KRas, 예를 들어, KRas-GDP 및/또는 KRasG12D 또는 KRasG13D의 존재를 검출함에 유용하다.
하기 설명된 바와 같이, 항-KRas 항체, 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 ELISA 및 면역조직화학을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 서로 다른 분석법에서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같은 임의의 항-KRas 항체, 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 면역분석에서 특히 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H를 비롯한 KRas, 예를 들어, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas의 존재를 검출함에 유용하다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-KRas 항체 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 본원에 기재된 공유 KRas 억제제에 결합된 KRas, 예를 들어, KRas-GTP 및/또는 KRasG12D 또는 KRasG13D의 존재를 검출함에 유용하다.
i. ELISA (효소 결합 면역흡착 분석)
일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체들은 본원에 기재된 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas (구체적으로, KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)의 존재 및/또는 양을 검출하기 위해 ELISA 분석법에서 사용된다. 따라서, KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas에 대한 포획 시약으로서 항-KRas 항체들을 이용하는 ELISA 분석법을 포함하는 KRas, KRas GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRAS의 검출 방법이 본원에 제공된다. 분석의 첫 번째 단계에서 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 포획(또는 코팅) 항체와 접촉시키고 인큐베이션하여 포획 항체가 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas를 포획하거나 이에 결합하고, 그리하여 검출 단계에서 검출될 수 있다. 검출 단계는 검출 가능한 항체의 사용을 포함하는데, 이러한 항체는, 존재하는 경우, KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas 중 어느 하나와 접촉될 때, KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas에 결합한다. 검출 수단을 사용하여 항체 상의 표지, 그리고 이에 따른 존재하는 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas의 존재 또는 양을 검출한다.
특정 실시형태에서, 분석은 다음 단계들을 이용한다.
첫 번째 단계
본원의 분석의 첫 번째 단계에서, KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을, 항-KRas 항체인 고정화된 포획(또는 코트) 시약과 접촉 및 배양한다. 일부 실시형태에서, 이러한 항-KRas 항체는 단클론 항체이고, 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 항-KRas 항체는 설치류 항체, 추가 실시형태에서 뮤린 또는 래트, 추가 실시형태에서 뮤린 항체이다.
다양한 실시형태에서, 항-KRas는 본원에 개시된 임의의 항-KRas 항체이다. 항-KRas 항체는 본원에 개시된 클래스 I 또는 클래스 II 항체 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 12)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 91)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 92)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 93)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 94)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 95)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 96)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 97)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 98)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQGIRNDLG(서열번호 1)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 2)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 LQDHDYPLT(서열번호 3)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 4)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 5)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GFYVRNWFDP(서열번호 6)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQGISSYLA(서열번호 17)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 18)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 QQYYSYPFT(서열번호 19)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 20)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 AISSSGSSTYYADSVKG(서열번호 21)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 DQGGYGYPGESWFDY(서열번호 22)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQSISSYLN(서열번호 25)을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 26)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 QQSYSPPWT(서열번호 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 28)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 29)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 AFYSYMDV(서열번호 30)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RSSQSLLHSNGYNYLD(서열번호 33)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 LGSNRAS(서열번호 34)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 MQALQTPLT(서열번호 35)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 36)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 37)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 ERTILTGYYGFDY(서열번호 38)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 41)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 42)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDSSLTGYV(서열번호 43)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 44)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 45)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 46)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 81)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 82)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDDSLSGWV(서열번호 83)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 84)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 85)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 SFGPYAFDV(서열번호 86)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 49)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 50)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDSSLTGWV(서열번호 51)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 52)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 53)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 54)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 57)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 58)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 NSRDSSGNHWV(서열번호 59)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 60)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 61)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 TNNYGYRYFDY(서열번호 62)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 65)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 66)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 NSRDSTDNHLWV(서열번호 67)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 68)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 69)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 ATSSGYYYFDY(서열번호 70)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 73)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 74)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDNSLSVWV(서열번호 75)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 76)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 77)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GKGIVGWGFFGMDV(서열번호 78)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
고정화는 통상적으로, 분석 절차 전에, 수불용성 매트릭스 또는 표면에 흡착(미국 특허 제3,720,760) 또는 비공유 또는 공유 커플링(예를 들어, 미국 특허 제3,645,852호 또는 Rotmans 외, J. Immunol. Methods, 57:87-98(1983)에 기술된 바와 같이, 예를 들어 질산 및 환원제로 지지체를 사전 활성화하거나 활성화하지 않고 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드 가교결합 사용)에 의해 또는 그 후에, 예를 들어, 면역침강에 의해 포획 시약을 불용화함으로써 달성된다. 일부 실시형태에서, 포획 항체는 비오틴에 접합되고 스트렙타비딘 코팅된 표면에 결합된다. 다른 실시형태에서, 포획 항체는 His 태그 또는 GST와 같은 단백질 태그에 접합되고, 적합한 표면, 예를 들어 니켈 또는 구리 코팅된 표면, 또는 글루타티온 코팅된 표면에 결합된다.
고정화에 사용되는 고체상은 예를 들어, 표면, 입자, 다공성 매트릭스 등의 형태의 지지체를 비롯하여, 본질적으로 수불용성이고 면역 측정법에 유용한 임의의 비활성 지지체 또는 담체일 수 있다. 일반적으로 사용되는 지지체의 예로는 작은 시트, SEPHADEX® 겔, 폴리염화비닐, 플라스틱 비드, 및 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로 제조된 분석 플레이트 또는 시험관 (96웰 미세역가 플레이트 포함), 뿐만 아니라, 입자 물질, 예를 들어, 여과지, 아가로스, 가교 덱스트란 및 기타 다당류가 포함된다. 대안적으로, 미국 특허 제3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440호에 기재된 반응성 기질 및 시아노겐-브로마이드-활성화 탄수화물과 같은 반응성 수불용성 매트릭스는 포획 시약 고정화에 적합하게 사용된다. 일부 실시형태에서, 고정화된 포획 시약은 미세역가 플레이트 상에 코팅된다. 일부 실시형태에서, 사용된 고체상은 여러 샘플을 한 번에 분석하는 데 사용할 수 있는 다중 웰 미세역가 플레이트, 예를 들어 MICROTEST™ 또는 MAXISORP™ 96-웰 ELISA 플레이트, 예를 들어, NUNC MAXISORB™ 또는 IMMULONT™로 판매되는 것이다.
고체상은 원하는 대로 비공유 또는 공유 상호작용 또는 물리적 연결에 의해 연결될 수 있는 상기 정의된 포획 시약으로 코팅된다. 부착 기술은 미국 특허 제4,376,110호 및 이 분헌에 인용된 참고 문헌.에 기재되어 있는 것들을 포함한다. 공유결합인 경우, 플레이트 또는 다른 고체상은 당업계에 잘 알려진 조건하에서, 예를 들어, 실온에서 1시간, 포획 시약과 함께 가교제와 함께 인큐베이션된다.
포획 시약을 고체상 기질에 부착하기 위해 일반적으로 사용되는 가교제에는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산, 동종이작용기성 이미도에스테르 (예를 들어, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이작용기성 말레이미드를 포함)가 포함된다. 메틸-3-((p-아지도페닐)-디티오)프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 빛의 존재 하에 가교 결합을 형성할 수 있는 광활성화 가능한 중간체를 생성한다.
96-웰 플레이트가 사용되는 경우, 이들은 적어도 약 10시간 동안 인큐베이션함으로써 0.05M 소듐 카보네이트와 같은 완충액에서 전형적으로 희석된 포획 시약의 혼합물로 코팅될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 4-20℃또는 약 4-8℃의 온도 및 약 8-12, 약 9-10, 또는 약 9.6의 pH에서 적어도 밤새 수행된다. 더 짧은 코팅 시간(1-2시간)이 바람직한 경우, 니트로셀룰로오스 필터 바닥(Millipore MULTISCREEN™)이 있는 96웰 플레이트를 사용하거나 37℃에서 코팅할 수 있다. 플레이트는 분석 자체보다 오래 전에 적층되어 코팅될 수 있으며, 그런 다음 수동, 반자동 또는 자동 방식, 예를 들어, 로봇 공학을 사용하여 여러 샘플에서 분석을 동시에 수행할 수 있다.
그 다음 코팅된 플레이트를 차단제로 처리하는데, 이러한 차단제는 일반적으로 플레이트의 웰 상의 과잉 부위들에 대한 유리 리간드의 원치 않는 결합을 방지하기 위해 결합 부위에 비특이적으로 결합하여 이들을 포화시킨다. 이러한 목적을 위한 적절한 차단제의 예에는 젤라틴, 소혈청 알부민, 난백 알부민, 카제인 및 무지방 우유가 포함된다. 차단 처리는 일반적으로 주위 온도 조건 하에서 약 1-4시간, 또는 약 1.5-3시간 동안 일어난다.
코팅 및 차단 후 표준(정제된 KRas, KRas-GDP 및/또는 알킬화된 KRas) 또는 분석할 생물학적 샘플을 적절하게 희석하여 고정상에 추가한다. 특정 실시형태에서 희석율은 부피 기준으로 약 5-15%, 또는 약 10%이다. 이 목적을 위해 희석에 사용할 수 있는 완충액에는 (a) 0.5% BSA, 0.05% TWEEN 20TM 세제(P20), 0.05% PROCLINTM 300 항생제, 5mM EDTA, 0.25% 3-( (3-콜아미도프로필)디메틸암모니오)-1-프로판술포네이트(CHAPS) 계면활성제, 0.2% 베타-감마 글로불린, 및 0.35M NaCl을 함유하는 포스페이트-완충 식염수(PBS); (b) 0.5% 소 혈청 알부민(BSA), 0.05% P20, 및 0.05% PROCLIN™ 300을 함유하는 pH 7 PBS; (c) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLINTM 300, 5mM EDTA 및 0.35M NaCl을 함유하는 pH 6.35 PBS; (d) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN™ 300, 5mM EDTA, 0.2% 베타-감마 글로불린 및 0.35M NaCl을 함유하는 PBS; 및 (e) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN™ 300, 5mM EDTA, 0.25% CHAPS 및 0.35M NaCl을 함유하는 PBS가 포함된다. PROCLIN™ 300은 방부제 역할을 하고 TWEEN 20TM은 비특이적 결합을 제거하는 세제 역할을 한다.
사용된 포획 시약의 양은 표준과 비교하여 좋은 신호를 제공하기에 충분히 크지만, 샘플에서 KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로, 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H를 포함)의 최대 예상 수준에 비해 몰 과량은 아닌 양이다. 특정 실시형태에서, 첨가된 생물학적 샘플의 양은, 샘플의 적절한 희석 후 생물학적 샘플에서 예상되는, 고정된 포획 시약이 유리 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H를 포함)의 최대 몰 농도의 몰 과량으로 존재하도록 하는 양이다. 이러한 예상 수준은 환자의 임상 상태와 함께 분석되는 특정 생물학적 샘플내 유리 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)의 농도 수준들 사이의 알려진 상관 관계에 주로 의존한다. 따라서, 예를 들어, 성인 환자는 남성/여성 혈청에서 꽤 높은 유리 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)의 최대 예상 농도를 가지는 반면, whereas 소아는 주어진 용량에서 남아/여아 혈청에서 더 낮은 수준의 유리 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)를 가질 것으로 예상될 것이다.
포획 시약의 농도는 필요한 생물학적 샘플의 희석을 고려하여 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H를 포함)의 관심 농도 범위에 의해 결정될 수 있다. 포획 시약의 최종 농도는 또한 관심 범위에 걸쳐 분석의 감도를 최대화하기 위해 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 몰 과량은 샘플의 적절한 희석 후 생물학적 샘플에서 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H를 포함)의 최대 예상 몰 농도의 약 10배 미만인 것이 적합하다.
샘플 및 고정된 포획 시약의 인큐베이션 조건은 분석의 감도를 최대화하기 위해, 해리를 최소화하기 위해, 그리고 고정된 포획 시약에 결합하는 샘플에 임의의 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)가 존재하도록 하기 위해 선택된다. 인큐베이션은 약 0℃내지 약 40℃범위의 상당히 일정한 온도, 예를 들어 또는 대략 실온에서 수행된다. 인큐베이션 시간은 일반적으로 약 10시간 이하이다. 다양한 실시형태에서, 인큐베이션 시간은 포획 시약들에 대한 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)의 결합을 최대화하기 위해 실온 또는 대략 실온에서 약 0.5 내지 3시간, 또는 약 1.5 -3시간이다. 생물학적 유체의 프로테아제 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)를 분해하는 것을 방지하기 위해 프로테아제 억제제를 추가하는 경우, 인큐베이션 기간이 더 길어질 수 있다.
이 단계에서, 인큐베이션 혼합물의 pH는 일반적으로 약 4-9.5, 또는 약 6-9, 또는 약 7-8 범위에 있을 것이다. 인큐베이션 완충액의 pH는 포획되는 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas에 대한 포획 시약의 특이적 결합을 상당한 수준으로 유지하도록 선택된다. 보레이트, 포스페이트, 카보네이트, TRIS-HCl 또는 TRIS-포스페이트, 아세테이트, 바르비탈 등을 포함하는 다양한 완충액이 이 단계 동안 원하는 pH를 달성하고 유지하기 위해 사용될 수 있다. 사용된 특정 완충액은 본 발명에 중요하지 않지만, 개별 분석에서 하나의 완충액이 다른 완충액보다 선호될 수 있다.
선택적 두 번째 단계
분석 방법의 선택적인 두 번째 단계에서 생물학적 샘플은 고정된 포획 시약으로부터 (예를 들어 세척에 의해) 분리되어 포획되지 않은 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas를 제거한다. 세척에 사용되는 용액은 일반적으로 약 6-9의 pH 범위를 갖는 인큐베이션 단계에 대해 위에서 설명한 고려사항 및 완충액을 사용하여 결정된 pH를 갖는 완충액(“세척 완충액”)이다. 세척은 3회 이상 해도 된다. 세척 온도는 일반적으로 냉장고에서 중간 온도까지이며, 분석 기간 동안 일정한 온도가 유지되며, 일반적으로 약 0-40°C 또는 약 4-30°C이다. 예를 들어, 세척 완충액은 세척 전에 4°C 저장소에서 얼음에 둘 수 있으며 이 단계에서 플레이트 세척액을 사용할 수 있다. 포획된 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas가 후속 단계에서 어느 정도 해리될 수 있다는 문제가 있는 경우 현재 결합된 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas가 포획 시약에 공유적으로 부착되도록 이 단계에서 가교제 또는 기타 적절한 제제를 추가할 수도 있다.
세 번째 단계
다음 단계에서, 존재하는 임의의 결합된 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas가 있는 고정화된 포획 시약들은 약 20-40°C 또는 약 36-38°의 온도에서 검출 가능한 항체와 접촉되며, 이 두 가지를 접촉시키는 정확한 온도와 시간은 주로 사용되는 검출 수단에 따라 다르다. 예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-갈락토시드(MUG), 스트렙타비딘-HRP 또는 스트렙타비딘-β-갈락토시다제를 검출 수단으로 사용하는 경우, 신호를 최대로 증폭시키기 위해 접촉은 밤새(예를 들어, 약 15-17시간 이상) 수행될 수 있다. 검출가능한 항체는 다클론 또는 단클론 항체일 수 있지만, 배경 잡음을 감소시키기 위해 바람직하게는 단클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 분석에서 코팅 및 검출에 동일한 항-KRas 항체가 사용된다. 다른 실시형태에서, 코팅 및 검출을 위해 배경 잡음이 최소화되도록 선택된 상이한 항-KRas 항체가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출가능한 항체는 인간 항체에 결합하는 비-인간 종으로부터의 항체이다. 일부 실시형태에서, 검출가능한 항체는 항-huIgG Fc 항체이다. 일부 실시형태에서, 검출가능한 항체는 마우스 항-huIgG Fcγ 항체이다. 일부 실시형태에서, 검출가능한 항체는 직접 검출가능하다. 특정 실시형태에서, 검출가능한 항체는 비오티닐화된다. 이러한 경우에, 비오티닐화된 표지에 대한 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-HRP일 수 있고, 검출 수단의 판독은 형광 또는 비색일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 HRP에 접합되고, 검출 수단은 비색이다.
예상되는 유리 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화 KRas의 최대 농도에 대해 과량의 검출 가능한 항체가 세척 후 플레이트에 추가된다. 이 항체(직접적으로 또는 간접적으로 검출가능)는 단클론 항체이지만 임의의 항체를 사용할 수 있다. 검출가능한 항체의 친화도는 소량의 유리 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas가 검출될 수 있을 정도로 충분히 높아야 하지만 포획 시약들로부터 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas가 추출될 정도로 높아서는 안 된다.
네 번째 단계
분석 방법의 마지막 단계에서 검출가능한 항체에 대한 검출 수단을 사용하여 현재 포획 시약에 결합된 샘플의 유리 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas의 수준을 측정한다. 생물학적 샘플이 임상 환자로부터 유래한 경우, 측정 단계는 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas 수준을 얄려진 양과 비교하여 결정하기 위해, 위의 3단계의 결과로 발생하는 반응을 표준 곡선과 비교하는 단계를 포함한다.
고정된 포획 시약에 첨가된 항체는 직접 표지되거나 또는 과량의 제1 항체를 세척한 후 제1 항체의 동물 종의 IgG에 대해 지시되는 과량의 표지된 제2 항체를 첨가함으로써 간접적으로 검출될 것이다. 후자의 간접 분석법에서, 표지된 항체를 현장에서 생산하기 위해 제1 항체에 대해 표지된 항혈청을 샘플에 첨가한다.
제1 또는 제2 항체에 사용되는 표지는 유리 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)가 항-KRas 항체에 결합하는 것을 방해하지 않는 검출가능한 작용기(functionality)이다.
적합한 표지의 예는 형광색, 화학발광 및 방사성 표지와 같이 직접적으로 검출될 수 있는 모이어티, 뿐만 아니라, 검출되기 위해 반응하거나 유도체화되어야 하는 효소와 같은 모이어티를 비롯하여 면역분석에 사용되는 것으로 알려진 수많은 표지이다. 이러한 표지의 예는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 세균성 루시페라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, HRP, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 결합된 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴(예를 들어, MUG와 함께 아비딘, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘-HRP 및 스트렙타비딘-β-갈락토시다제에 의해 검출가능), 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등이 포함된다.
이들 표지를 단백질 또는 폴리펩티드에 공유적으로 결합시키는 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 디알데하이드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등과 같은 커플링제를 사용하여 전술한 형광성, 화학발광성 및 효소 표지로 항체를 태그할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제3,940,475 (형광측정법) 및 미국 특허 제 3,645,090 (효소); Hunter 외, Nature, 144:945 (1962); David 외, Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain 외, J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982)를 참고하라.
항체에 대한, 효소를 비롯한 이러한 표지의 접합은 면역분석 기술의 당업자에게는 표준 조작 절차이다. 예를 들어, O'Sullivan 외, “Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay,” in Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166를 참고하라. 적절한 시판 표지된 항체 또한 사용될 수 있다.
마지막 표지된 항체를 첨가한 후, 세척을 통해 결합되지 않은 과량의 표지된 항체를 제거한 후 표지에 적합한 검출 방법을 사용하여 부착된 표지의 양을 측정하고, 측정된 양을 생물학적 샘플 내 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas의 양과 상관시켜 결합된 항체의 양을 결정한다. 예를 들어, 효소의 경우 발색 및 측정된 색상의 양은 존재하는 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas의 양의 직접 측정이 될 것이다. 구체적으로, HRP가 표지인 경우, 450 nm 판독 파장 및 620 또는 630 nm 참조 파장을 사용하여 기질 TMD를 사용하여 색상을 검출할 수 있다.
한 예에서, 제1 비표지 항체에 대해 지시되는 효소-표지된 제2 항체가 고정된 상으로부터 세척된 후, 고정된 포획 시약을 효소의 기질과 함께 인큐베이션함으로써 색상 또는 화학발광이 발생되고 측정된다. 그 다음 동시에 실험된 표준 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas에 의해 생성된 색상 또는 화학발광과 비교함으로써 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas의 농도가 계산된다.
ii. 면역조직화학(IHC)
일부 실시형태들에서, 본 발명의 항-KRas 항체들은 본원에 기재된 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas (구체적으로, KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)를 검출하기 위해 사용된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 면역조직화학을 사용하여 조직 샘플 내 KRas, 예를 들어, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas를 검출하는 방법이 본원에 제공된다. 면역조직화학(IHC)은 직접 표지되거나(직접 IHC) 또는 간접적으로 표지된(간접 IHC) 결합 도메인(예를 들어, 항-KRas 항체)를 사용하여 조직 섹션 내 표적(예를 들어, KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas와 같은 항원) 및/또는 표적을 제시하는 세포들의 부분집합을 국재화하는 것으로, 이러한 결합 도메인은 특정 표적-결합 도메인 상호작용을 통해 표적과 반응한다. 이러한 상호 작용은 언급된 표지에 의해 시각화된다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 상기 면역조직화학은 다음 단계들을 특징으로 하는 것으로 예상된다:
(a) 세포들의 서브세트 및/또는 결합 도메인(예를 들어, 항-KRas 항체)이 결합되어 있는 상기 세포들의 서브세트를 포함하는 상기 조직 샘플을 포함하는 수단(예를 들어, 슬라이드)을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로 상기 조직 샘플을 고정하는 단계;
(c) 선택적으로 상기 조직 샘플을 탈수시키는 단계;
(d) 선택적으로 조직 샘플이 파라핀화되도록 허용하는 단계;
(e) 결합 도메인(예를 들어, 항-KRas 항체) 및 이에 의해 세포의 서브세트를 직접 또는 간접적으로 검출하는 단계.
“고정” 또는 “고정화”는 후속 IHC 절차를 위한 상기 세포들의 서브세트를 포함하는 세포/조직 샘플의 표적/서브세트를 준비하는 데 적합한 고정 절차를 의미한다. “고정화”는 특히 조직 구조 및 세포 형태의 보존을 위해 수행된다. 적합한 고정화 조건은 잘 알려져 있고 또한 본원에도 개시되어 있다. 대안적으로, 조직/서브세트는 급속 동결(예를 들어, 액체 질소에서)에 의해 보존되는 것으로 또한 예상된다.
위의 모든 전처리 단계/조치는 “고정화”라는 용어의 범위에 속한다, 즉, 고정은 구체적으로 포름알데히드, 파라포름알데히드와 같은 고정화제를 사용한 고정; 및/또는 조직 샘플/세포의 부분집합의 급속 동결, 및/또는 선택적으로 파라핀 또는 유사한 제제 내 조직/세포의 부분집합의 포매를 포함한다. 본 발명의 요지는 상기 표적을 제시하는 조직/서브세트 등이 고정화 절차를 거치기 전에 결합 도메인(예를 들어, 표적에 특이적인 1차 항체)이 그 표적에 결합하도록 하는 것이 유리하다는 놀라운 발견에 존재함을 이해하여야 하는데, 왜냐하면, 고정 절차는 표적의 양 및/또는 품질에 영향을 미쳐 결과를 원하지 않는 방식으로 변경할 수 있기 때문이다.
조직/서브세트는 또한 파라핀화될 수 있다(보통 고정 후).
다양한 IHC 프로토콜을 실행하기 위한 수단 및 방법이 당업자에게 잘 알려져 있으며 이들은 관심 대상의 특정 조직/세포들의 부분집합/표적에 대해 추가 고려사항없이 적응되었으며 적응될 것이다/적응 될 수 있다.
iii. 표면 플라즈몬 공명
한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기재된 약물 후보를 생산하기 위한 새로운 화학적 물질의 식별 및/또는 화학적 물질의 개발을 용이하게 할 수 있다. 한 실시형태에서, KRas의 SWII 포켓은 본원에 기재된 바와 같이 개방 및/또는 안정화된다. 한 실시형태에서, KRas의 SWII 포켓을 개방 및/또는 안정화하는 것은 더 높은 친화도의 화합물이 결합할 가능성을 증가시킬 수 있고, 이는 차례로 약하게 결합된 화합물이 더 높은 분율로 검출되게 할 수 있다. 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화합물 결합의 친화도를 증가시키지 않고 대신 KRas 형태를 안정화시킬 수 있다.
표면 플라즈몬 공명(SPR) 또는 다양한 형태의 표면 간섭계는 감지 표면에서 광학 소멸장을 생성하는데, 이는 감지 표면 근방에서 평균 굴절률의 관련 변화를 모니터링함으로써 감지 표면에서의 생체분자 축적에 민감하다. 소멸장은 표면에서 멀어지면서 기하급수적으로 감소하고 표면의 굴절률 감도 깊이를 정의한다. 일반적으로 이 소멸장의 침투 깊이는 200-300 nM 정도이며 3차원의 탐침된 용적(three dimensional probed volume)을 제공하는데, 이는 결합된 하이드로겔을 사용함으로써 온전히 활용되어 이분자 복합체 형성을 지원할 수 있으며 하이드로겔 코팅된 센서 칩이 널리 이용가능하다.
하이드로겔은 감지 표면으로부터 10-200nm로 확장되는 하이드로겔을 형성하기 위해 평면 표면에 다당류 사슬(예를 들어, 선형이지만 일부 분지는 허용가능)을 화학적으로 접목하여 생성될 수 있다. 한 실시형태에서, 이들 사슬은 표적 분자들이 하이드로겔에 커플링될 수 있게 하는 반응성 기를 함유하도록 유도체화된다. 한 실시형태에서, 표적은 하이드로겔 내에서 20-50mg/ml의 농도로 결합될 수 있지만, 이러한 한도의 5배 초과 및 미만이 가능하다. 수득된 반응은 결합된 분자의 분자 부피, 존재하는 표적 분자의 수 및 분자와 주변 완충액 사이의 굴절률 대비에 비례한다.
한 양상에서 본원에 기재된 KRas 돌연변이체에 대한 KRas 억제제 화합물의 결합을 측정하기 위한 바이오센싱 표면이 제공된다. 한 실시형태에서, 표면은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 미리 결합된다. 한 실시형태에서 본원에 기재된 KRas 돌연변이체에 대한 화합물의 결합을 측정하기 위한 바이오센싱 표면이 제공되며, 여기서:
바이오센싱 표면은 KRas 단백질 및 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 공동-국재화된 하이드로겔을 포함하고;
KRas 단백질 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서로 결합하여 친화성 복합체를 형성하기에 충분한 수소 내부의 자유도를 갖고;
KRas 단백질 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 국소 농도가 해리 친화도 상수를 적어도 10배 초과하고, 여기서 국소 농도는 친화성 복합체의 형성을 촉진하며;
결합되지 않은 KRas 단백질 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 분율은 약 50% 미만이고;
KRas 억제제 화합물은 적어도 5초 동안 바이오센싱 표면에 주입되고; 및
여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 KRas 억제제 화합물의 결합은 적어도 하나의 감지 채널을 통해 측정된다.
표면의 한 실시형태에서, 결합되지 않은 KRas 단백질 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 분율은 약 40%, 30%, 25%, 20%, 또는 10% 미만이다.
일부 실시형태에서, 하이드로겔은 두께가 약 10nm-500nm, 10nm-300nm, 10-250nm, 또는 약 10-200nm이다. 일부 실시형태에서, 수소는 스트렙타비딘을 포함한다.
한 실시형태에서, KRas 단백질은 비오티닐화된다. 일부 실시형태들에서, KRas 단백질은 KRasG12C이다. 일부 실시형태들에서, KRas 단백질은 KRasG12D이다. 일부 실시형태들에서, KRas 단백질은 KRasG12V이다. 일부 실시형태들에서, KRas 단백질은 KRasG12C이다. 일부 실시형태들에서, KRas 단백질은 KRasG12R이다. 일부 실시형태들에서, KRas 단백질은 KRasG13D이다. 일부 실시형태들에서, KRas 단백질은 KRasQ61H이다. 한 실시형태에서, KRas 단백질은 바이오센싱 표면에 처리하기 전에 완충액에 약 50-1000 nM, 50-750 nM, 50-500 nM, 100-1000 nM, 100-750 nM, 100-500 nM, 또는 약 100-250 nM의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중 KRas 단백질의 농도는 약 0.5-2mM, 0.5-1.5mM, 0.5-1mM, 0.75-2mM, 0.75-1.5mM, 0.75-1mM, 0.9-2mM, 또는 0.9-1.5mM이다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기재된 바와 같은 Fab이다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 50, 100, 150, 200, 250, 500, 또는 1000 nM의 농도로 주입된다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 150-200 nM의 농도로 주입된다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2H11의 Fab이다.
일부 실시형태에서, 바이오센싱 표면은 BIACORE 센서 칩에 부착된다. 일부 실시예에서, 측정은 최소 2개의 채널에 걸쳐 수행된다. 이러한 한 실시형태에서, 최소 하나의 채널은 기준(예를 들어, 바탕) 감지 채널이다.
한 실시형태에서, KRas 억제제 화합물은 약 0.025μM-500μM, 0.025μM-250μM, 0.025μM-100μM, 0.025μM-50μM, 0.025μM-25μM, 0.025μM-10μM, 0.03μM-500μM, 0.03μM-250μM, 0.03μM-100μM, 0.03μM-50μM, 0.03μM-25μM, 0.03μM-10μM, 0.05uM-500uM, 0.05μM-250μM, 0.05μM-100μM, 0.05μM-50μM, 0.05μM-25μM, 또는 0.05μM-10μM의 농도로 주입된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제 화합물은 약 10, 25, 50, 100, 150, 또는 약 250 μL/분의 속도로 상기 제시된 농도로 주입된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제 화합물은 본원에 기재된 속도 및 농도로 약 5, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 약 25초 동안 주입된다. 한 실시형태에서, KRas 억제제 화합물은 약 0.04-10μM의 농도에서 약 100μL/분의 속도로 약 10초 동안 하이드로겔 상에 주입된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제 화합물은 일련의 상이한 농도(예를 들어, 일련의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9가지 상이한 농도)로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 각각의 상이한 농도가 본원에 기재된 바와 같은 하이드로겔 상에 주입된다.
또 다른 양상에서 항-KRas 억제제 활성에 대해 화합물을 스크리닝하는 방법이 제공되며, 이 방법은 기재된 KRas 돌연변이체 단백질에 대한 화합물의 결합을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 KRas 돌연변이체 단백질은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합되며, 이 때 이러한 결합은 본원에 기재된 바이오센싱 표면을 사용하여 측정된다.
한 실시형태에서, KRas 및 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하이드로겔에서 동시에 커플링된다. 또 다른 실시형태에서, KRas는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 커플링 전에 첨가된다. 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas와의 커플링 전에 첨가된다.
본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 KRas 돌연변이체 단백질의 결합을 측정하는 방법이 본원에 추가로 제공되며, 여기서 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
본원에 기재된 바이오센싱 표면을 본원에 기재된 KRas 단백질과 접촉시켜 KRas-결합 바이오센싱 표면을 형성하는 단계;
KRas-결합된 바이오센싱 표면을 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 Fab와 접촉시키는 단계(여기서 항-KRas 항체는 KRas 단백질에 비해 몰 과량으로 존재함); 그리고
표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KRas 단백질에 대한 결합 및 친화도를 검출하는 단계.
이러한 한 실시형태에서, 바이오센싱 표면은 아비딘으로 코팅된다. 또 다른 이러한 실시형태에서, KRas 단백질은 비오티닐화된다.
또한 본원에 기재된 항-KRas 항체에 대한 KRas 돌연변이체 단백질의 결합을 측정하는 방법이 본원에 제공되며, 이때 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
본원에 기재된 바이오센싱 표면을 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시켜 항-KRas 항체-결합된 바이오센싱 표면을 형성하는 단계;
항-KRas 항체-결합된 바이오센싱 표면을 본원에 기재된 KRas 단백질과 접촉시키는 단계(여기서 항-KRas 항체는 KRas 단백질에 비해 몰 과량으로 존재함); 그리고
표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KRas 단백질에 대한 결합 및 친화도를 검출하는 단계.
이러한 한 실시형태에서, 바이오센싱 표면은 아비딘으로 코팅된다. 또 다른 이러한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비오티닐화된다.
iv. 샘플 내 KRas-GDP를 검출하는 방법
샘플 내 KRas-GDP를 검출하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 항-KRas 항체는 인간 KRas 에 결합하고, 여기서 항체는 GTP에 결합된 KRas(KRas-GTP)보다 GDP에 결합된 KR(KRas-GDP)에 더 높은 친화도로 결합한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 샘플 내 KRas-GDP를 검출한다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 상기 기재된 바와 같은, 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 ELISA를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 본원에 제공된 바와 같은 면역조직화학을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 BIOACORE SPR 기기를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 유세포 분석을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 면역침전법을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 친화성 전기영동, 예를 들어, 전기영동 이동성 변화 분석을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태들에서, KRas-GDP는 형광 편광/이방성을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 질량 분석법에 결합된 친화도 정제를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 생물층 간섭계를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 마이크로스케일 열영동(MST)을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 표지된 KRas 항체를 사용하여 검출된다.
샘플 내 KRas-GDP를 검출하는 방법이 본원에 제공되며, 이때 KRas는 KRas 돌연변이체이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 발암성 KRas이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12C이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12R이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12V이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasQ61H이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG12D이다. 일부 실시형태들에서, KRas 돌연변이체는 KRasG13D이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 항-KRas 항체를 사용하여 샘플 내 KRas-GDP를 검출한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 클래스 I 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 클래스 II 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화된 형태 특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 알킬화-유도 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓을 개방한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2A3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 3A12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 4G12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1D6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2C1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1B7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1F4이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 12)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 91)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 92)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 93)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 94)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 95)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 96)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 97)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 98)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQGIRNDLG(서열번호 1)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 2)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 LQDHDYPLT(서열번호 3)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 4)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 5)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GFYVRNWFDP(서열번호 6)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQGISSYLA(서열번호 17)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 18)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 QQYYSYPFT(서열번호 19)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 20)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 AISSSGSSTYYADSVKG(서열번호 21)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 DQGGYGYPGESWFDY(서열번호 22)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQSISSYLN(서열번호 25)을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 26)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 QQSYSPPWT(서열번호 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 28)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 29)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 AFYSYMDV(서열번호 30)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RSSQSLLHSNGYNYLD(서열번호 33)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 LGSNRAS(서열번호 34)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 MQALQTPLT(서열번호 35)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 36)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 37)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 ERTILTGYYGFDY(서열번호 38)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 41)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 42)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDSSLTGYV(서열번호 43)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 44)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 45)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 46)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 81)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 82)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDDSLSGWV(서열번호 83)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 84)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 85)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 SFGPYAFDV(서열번호 86)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 49)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 50)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDSSLTGWV(서열번호 51)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 52)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 53)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 54)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 57)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 58)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 NSRDSSGNHWV(서열번호 59)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 60)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 61)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 TNNYGYRYFDY(서열번호 62)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 65)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 66)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 NSRDSTDNHLWV(서열번호 67)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 68)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 69)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 ATSSGYYYFDY(서열번호 70)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 73)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 74)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDNSLSVWV(서열번호 75)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 76)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 77)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GKGIVGWGFFGMDV(서열번호 78)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 샘플 내 KRas-GDP를 정량화(또는 이의 양을 결정)할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 샘플 내 KRas-GDP의 존재비를 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 샘플 내 본원에 기재된 바와 같은 KRas 억제제에 결합된 KRas-GDP의 존재비를 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 양은 표준에 대해 결정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, KRas-GDP 존재비를 정량화하기 위해 정량적 웨스턴 블롯이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 ELISA를 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 면역조직화학을 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 유세포 분석을 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 면역침전 후에 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 친화성 전기영동, 예를 들어, 전기영동 이동성 변화 분석을 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 질량 분석법에 결합된 친화도 정제를 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 정제 후에 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 정제 후 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제 후 정량화된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 샘플 내 KRas-GDP를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 생물학적 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 우유, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 소변과 같은 전혈 구성성분 및 KRas-GDP를 함유할 수 있는 기타 신체 구성성분이다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 임의의 동물로부터 얻은 신체 샘플이다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 인간으로부터 얻은 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 포유동물의 것이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 예를 들어 임상 샘플 내 KRas-GDP를 검출할 때 인간 대상체의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRas 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRas 돌연변이가 있는 환자의 것이며, 여기서 환자는 본원에 기재된 KRas 억제제를 투여받았다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12C 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12D 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12V 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12R 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG13D 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasQ61H 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 혈청이다. 특정 실시형태에서 생물학적 샘플은 소변이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 소변이다.
일부 실시형태에서, KRas-GDP는 암 환자로부터의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 KRasG12C 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 KRasG12D 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 KRasG12V 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 KRasG12R 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 KRasG13D 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 KRasQ61H 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 샘플 내 KRas-GTP를 정량화(또는 이의 양을 결정)할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 샘플 내 KRas-GTP의 존재비를 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 샘플 내 본원에 기재된 바와 같은 KRas 억제제에 결합된 KRas-GTP의 존재비를 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP의 양은 표준에 대해 결정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, KRas-GTP 존재비를 정량화하기 위해 정량적 웨스턴 블롯이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 ELISA를 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태들에서, KRas-GTP는 면역조직화학을 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 유세포 분석을 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 면역침전 후에 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 친화성 전기영동, 예를 들어, 전기영동 이동성 변화 분석을 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 질량 분석법에 결합된 친화도 정제를 사용하여 정량화된다. 일부 실시형태들에서, KRas-GTP는 정제 후 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 정제 후 정량화된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제 후 정량화된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 샘플 내 KRas-GTP를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 생물학적 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 우유, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 소변과 같은 전혈 구성성분 및 KRas-GTP를 함유할 수 있는 기타 신체 구성성분이다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 임의의 동물로부터 얻은 신체 샘플이다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 인간으로부터 얻은 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 포유동물의 것이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 예를 들어 임상 샘플 내 KRas-GTP를 검출할 때 인간 대상체의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRas 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRas 돌연변이가 있는 환자의 것이며, 여기서 환자는 본원에 기재된 KRas 억제제를 투여받았다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12C 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12D 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12V 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12R 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG13D 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasQ61H 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 혈청이다. 특정 실시형태에서 생물학적 샘플은 소변이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 소변이다.
일부 실시형태에서, KRas-GTP는 암 환자로부터의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 KRasG12C 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 KRasG12D 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 KRasG12V 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 KRasG12R 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 KRasG13D 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP는 KRasQ61H 발암성 돌연변이를 갖는 암 환자의 샘플에서 검출된다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG12C 공유 억제제(예를 들어, Cys12를 알킬화하는 화합물)로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG12C 공유 억제제(예를 들어, Cys12를 알킬화하는 화합물)로 처리된 환자의 것이고, KRasG12C의 알킬화 수준은 본원에 기재된 바와 같이 결정된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG12D 공유 억제제(예를 들어, Asp12에 공유적으로 결합하는 억제제)로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG12D 공유 억제제로 처리된 환자의 것이고 KRasG12D에 대한 억제제의 공유 결합 수준은 본원에 기재된 바와 같이 결정된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG13D 공유 억제제(예를 들어, Asp13에 공유적으로 결합하는 억제제)로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG13D 공유 억제제로 처리된 환자의 것이고 KRasG13D에 대한 억제제의 공유 결합 수준은 본원에 기재된 바와 같이 결정된다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG12D 비공유 억제제로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG12V 비공유 억제제로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG12R 비공유 억제제로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG13D 비공유 억제제로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasQ61H 비공유 억제제로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRasG12C SWII 리간드로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 KRas SWII 리간드로 처리된 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 항-KRas 항체로 치료받은 환자의 것이다.
일부 실시형태에서, KRas-GDP는 환자의 암 치료를 모니터링하는 방법의 일부로서 검출된다. 일부 이러한 실시형태에서, 환자에서 암의 치료를 모니터링하는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 분석을 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP는 본원에 기재된 바와 같이 환자에서 KRasG12C 매개 암의 치료를 모니터링하는 방법의 일부로서 검출된다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12C 특이적 공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-1952이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-853이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 MRTX849이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 AMG-510이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 GDC-6036이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-3248이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 LY3499446이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 JNJ-74699157이다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12D 특이적 공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12V 특이적 공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12R 특이적 공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG13D 특이적 공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasQ61H 특이적 공유 억제제로 치료받았다.
일부 실시형태에서, KRas-GDP 또는 KRas-GTP는 본원에 기재된 바와 같이 환자에서 KRasG12D 매개 암의 치료를 모니터링하는 방법의 일부로서 검출된다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12D 특이적 공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12D 특이적 비공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 또는 KRas-GTP는 본원에 기재된 바와 같이 환자에서 KRasG13D 매개 암의 치료를 모니터링하는 방법의 일부로서 검출된다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG13D 특이적 공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG13D 특이적 비공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 또는 KRas-GTP는 본원에 기재된 바와 같이 환자에서 KRasG12V 매개 암의 치료를 모니터링하는 방법의 일부로서 검출된다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12V 특이적 비공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 또는 KRas-GTP는 본원에 기재된 바와 같이 환자에서 KRasG12R 매개 암의 치료를 모니터링하는 방법의 일부로서 검출된다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12R 특이적 비공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 또는 KRas-GTP는 본원에 기재된 바와 같이 환자에서 KRasQ61H 매개 암의 치료를 모니터링하는 방법의 일부로서 검출된다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasQ61H 특이적 비공유 억제제로 치료받았다.
v. 샘플 내 KRas-GDP 및 KRas-GTP를 검출하는 방법
또한 샘플 내 KRas-GDP 및 KRas-GTP를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 샘플 내 KRas-GDP 및 KRas-GTP의 상대적인 양이 결정된다. 일부 실시형태에서, 샘플 내 KRas-GDP 및 KRas-GTP의 상대적인 존재비가 결정된다. 일부 실시형태에서, 샘플 내 KRas-GTP에 대한 KRas-GDP의 비율이 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항-KRas 항체는 KRas-GDP 보다 KRas-GTP에 더 높은 친화도로 결합하는 항-KRas 항체와 병용된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP에 결합하는 항-KRas 항체는 제1 표지로 표지되고, KRas-GTP에 우선적으로 결합하는 항-KRas 항체는 제2 표지로 표지된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 표지가 검출된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 표지 둘 모두로부터의 신호 검출 및 정량화는 샘플 내 KRas-GDP 및 KRas-GTP 수준 모두의 개별 정량화를 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP에 결합하는 항-KRas 항체 및 KRas-GTP에 우선적으로 결합하는 항-KRas 항체는 반드시 별도의 표지로 표지되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP의 양은 표준에 대하여 결정된다.
일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 상기 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 ELISA를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 본원에 제공된 바와 같은 면역조직화학을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 BIOACORE SPR 기기를 사용하여 검출된다. 이러한 일부 실시형태에서, KRas-GTP 및/또는 KRas-GDP는 본원에 제공된 바와 같은 바이오센싱 표면을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 유세포 분석을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 면역침전법을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 친화성 전기영동, 예를 들어, 전기영동 이동성 변화 분석을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 형광 편광/이방성을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 질량 분석에 결합된 친화도 정제를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 생물층 간섭계를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP 및 KRas-GTP는 마이크로스케일 열영동(MST)을 사용하여 검출된다.
상기 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 항-KRas 항체를 사용하여 샘플 내 KRas-GDP를 검출한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 항-KRas 항체를 사용하여 샘플 내 KRas-GTP를 검출한다. 일부 실시형태들에서, 항-KRas 항체는 클래스 I 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 클래스 II 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2A3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 3A12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 4G12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1D6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2C1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1B7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1F4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab2이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab8이다.
일부 실시형태에서, KRas-GTP에 결합하는 항-KRas 항체는 시판 항체이다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP에 결합하는 항-KRas 항체는 iDab6이다(Tanaka, T. 외, EMBO J 2007; 26:3250-3259). 일부 실시형태에서, KRas-GTP에 결합하는 항-KRas 항체는 항-Ras 항체 EP1125Y(Abcam, ab52939)이다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP에 결합하는 항-KRas 항체는 KRas-2B 특이적 토끼 다클론 항체(Proteintech, 카탈로그 번호 16155-1-AP)이다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP에 결합하는 항-KRas 항체는 Ras10(Millipore, 카탈로그 번호 05-516)이다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP에 결합하는 항-KRas 항체는 3B10-2F2(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 WH0003845M1)이다. 일부 실시형태에서, KRas-GTP에 결합하는 항-KRas 항체는 234-4.2(Millipore, 카탈로그 번호 OP24)이다.
vi. KRas 억제제를 얻는 방법
또한 KRas 억제제를 얻는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항-KRas 항체는 KRas SWII 포켓을 안정화 및/또는 개방한다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 항-KRas 항체는 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H의 KRas SWII 포켓을 안정화 및/또는 개방한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항-KRas 항체는 SWII 포켓의 개방 형태를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항-KRas 항체는 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H의 SWII 포켓의 개방 형태를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항-KRas 항체는 KRas 포켓을 개방 형태로 잠근다. 일부 실시형태에서, 이는 개방 SWII 포켓을 특이적으로 표적화하는 분자의 스크리닝을 허용한다. 일부 실시형태에서, 이는 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H의 개방 SWII 포켓을 특이적으로 표적화하는 분자의 스크리닝을 허용한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓의 개방 형태를 안정화시키고, SWII 포켓에 공유적으로 결합하는 소분자를 식별할 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 SWII 포켓의 개방 형태를 안정화시키고, KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H의 SWII 포켓에 공유적으로 결합하는 소분자를 식별할 수 있게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, KRas는 SWII 포켓의 개방 형태를 유도하는 본 발명의 항-KRas 항체에 의해 결합될 수 있고, 항-KRas 항체에 의해 결합된 KRas는 KRas 억제제를 얻기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 항-KRas 항체를 KRas와 접촉시키는 단계, 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 단계, KRas에 결합하는 화합물을 식별하는 단계를 포함하는 KRas 억제제를 얻는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, KRas에 결합하는 화합물은 KRas를 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas 돌연변이를 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 발암성 KRas를 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRasG12C를 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRasG12R을 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRasG12V를 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRasQ61H를 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRasG12D를 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRasG13D를 억제한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 임의의 항-KRas 항체는 본원에 기재된 KRas 돌연변이체의 KRas 억제제를 얻는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 본원에 제공된 클래스 I 또는 클래스 II 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2A3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 3A12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 4G12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1D6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2C1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1B7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1F4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab2이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab8이다.
일부 실시형태에서, 고속대량 스크리닝(HTS)을 수행하여 KRas 억제제를 식별한다. 일부 실시형태에서, 화학 라이브러리를 스크리닝하여 KRas 억제제를 식별한다. 일부 실시형태에서, 천연 산물 또는 천연 발생 화합물의 라이브러리를 스크리닝하여 KRas 억제제를 식별한다. 일부 실시형태에서, 펩티드 라이브러리를 스크래닝하여 KRas 억제제를 식별한다. 일부 실시형태에서, 펩티드모방 라이브러리를 스크리닝하여 KRas 억제제를 식별한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 라이브러리를 스크리닝하여 KRas 억제제를 식별한다. 일부 실시형태에서, 소분자 라이브러리가 스크리닝된다. 일부 실시형태에서, 공유 억제제의 라이브러리가 스크리닝된다. 일부 실시형태에서, 비공유 억제제의 라이브러리가 스크리닝된다.
일부 실시형태에서, KRas 억제제는 스크린에서 KRas 억제제의 식별로 인해 얻는다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas의 결합으로 인해 식별된다. 일부 실시형태에서, KRas의 결합은 단백질-소분자 상호작용을 검출하기 위해 당업계에 공지된 다양한 기술 중 하나를 통해 검출된다(예를 들어, McFedries, A., 외, Chem. Biol. 2013 20:5 참조). 일부 실시형태에서, KRas의 결합은 시차 주사 형광측정법(DSF)을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas의 결합은 열안정성 변화 분석을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas의 결합은 세포 배양물 중 아미노산의 안정한 동위원소 표지화(SILAC)와 결합된 친화성 포획을 사용하여 검출된다.
일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas 활성의 분석에서 돌연변이체 KRas(예를 들어, 본원에 기재된 돌연변이체 KRas) 활성의 변경으로 인해 식별된다. 일부 실시형태에서, KRas 활성의 분석은 KRas의 생물학에 기초하여 설계된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas의 뉴클레오티드-결합 친화도의 변경으로 인해 식별된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 RAF 키나제를 활성화하는 KRas의 능력의 변경으로 인해 식별된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas RAF 키나제 활성화의 차단으로 인해 식별된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 RAF 키나제를 결합시키는 KRas의 차단으로 인해 식별된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas 활성화를 나타내는 리포터, 예를 들어, GLUT1 전사 리포터의 차단으로 인해 식별된다.
일부 실시형태에서, KRas 억제제는 본원에 기재된 돌연변이체 KRas에 공유적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 공유 억제제(예를 들어, KRas를 알킬화하는 억제제)이다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 SWII 포켓의 잔기에 공유적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 SWII 포켓에 결합하여 이를 알킬화시킨다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 SWII 포켓이 개방될 때 KRas의 표면에 노출되는 잔기를 알킬화한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 SWII 포켓의 잔기를 공유적으로 변형시킨다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 본원에 기재된 돌연변이체 KRas의 SWII 포켓 내 시스테인 잔기에 결합한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 본원에 기재된 돌연변이체 KRas의 SWII 포켓 내 시스테인 잔기를 알킬화한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas SWII 포켓의 시스테인 잔기에 결합한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas SWII 포켓의 시스테인 잔기를 알킬화한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRas를 알로스테릭하게 억제한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 돌연변이체 KRas가 활성 GTP-결합 상태로 들어가는 것을 방지한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 돌연변이체 KRas를 비활성인 GDP-결합 상태로 잠근다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 돌연변이체 KRas의 뉴클레오티드-결합 친화도를 변경시킨다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 돌연변이체 KRas가 GTP보다 GDP에 우선적으로 결합하도록 한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 돌연변이체 KRas가 KRas의 비활성 형태로 들어가게 한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 GEF-촉매된 뉴클레오티드 교환을 차단한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 돌연변이체 KRas의 하류 신호전달을 차단한다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 알킬화제이다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRasG12C를 억제하고 잔기 Cys12에 결합한다.일부 실시형태에서, 본원에 기재된 돌연변이체 KRas는 KRasG12D, KRasG12R, KRasG12V, KRasG13C, 또는 KRasQ61H이다.
일부 실시형태에서, KRas 억제제가 식별되며, 여기서 이러한 억제제는 본원에 기재된 돌연변이체 KRas에 결합한다. 일부 실시형태에서, KRas의 분자 프로브가 식별된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 유기 화합물 또는 무기 화합물과 같은 소분자이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 천연 발생 소분자 또는 합성 소분자이다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 단백질이다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 펩티드이다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 핵산이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 KRas 억제제는 KRas 돌연변이와 관련된 암을 치료하기 위한 약물로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 KRasG12C 매개 암을 치료하기 위한 약물로서 사용된다.
vii. 생물학적 샘플 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출하는 방법
KRas의 알킬화된 형태에 특이적으로 결합하는 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체가 본원에서 제공된다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생물학적 샘플 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생물학적 샘플 내 공유 억제제의 결합에 의한 KRasG12C의 공유 결합(예를 들어, 알킬화)을 검출한다. 일부 실시형태에서, 표적 결합을 측정하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 분석을 사용하여 검출을 수행한다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasG12C의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasG12D의 공유 결합을 검출한다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasG12D의 비공유 결합을 검출한다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasG12V의 비공유 결합을 검출한다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasG12R의 비공유 결합을 검출한다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasG13D의 비공유 결합을 검출한다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasQ61H의 비공유 결합을 검출한다. 일부 실시형태에서, 1A5, 1D6, 2C1, 1A6, 1F4, 또는 1B7을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 KRas 비공유 억제제에 비공유적으로 결합된 KRas 또는 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 사용하여 본원에 기재된 KRas 비공유 억제제에 비공유적으로 결합된 KRas 또는 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, 2H11, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 사용하여 본원에 기재된 KRas 비공유 억제제에 비공유적으로 결합된 KRas 또는 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 사용하여 본원에 기재된 KRas 비공유 억제제에 비공유적으로 결합된 KRas 또는 알킬화된 KRas를 검출한다.
일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제로 처리된 대상체에서 KRasG12C의 공유 결합(예를 들어, 알킬화)을 검출하는 방법이 제공되며, 여기서 이 방법은 (a) 본원에 개시된 항-KRas 항체 중 어느 하나를 KRasG12C 특이적 공유 억제제로 처리한 후 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-1952이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-853이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-1620, MRTX849이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 AMG-510이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 GDC-6036이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-3248이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 LY3499446이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 JNJ-74699157이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 LY3537982이다.
일부 실시형태에서, KRasG12D 특이적 공유 억제제로 처리된 대상체에서 KRasG12D에 대한 공유 KRas 억제제의 공유 결합을 검출하는 방법이 제공되며, 여기서 이 방법은 (a) 본원에 개시된 항-KRas 항체 중 어느 하나를 KRasG12D 특이적 공유 억제제로 처리한 후 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, KRasG12D 특이적 비공유 억제제로 처리된 대상체에서 KRasG12D에 대한 비공유 KRas 억제제의 비공유 결합을 검출하는 방법이 제공되며, 여기서 이 방법은 (a) 본원에 개시된 항-KRas 항체 중 어느 하나를 KRasG12D 특이적 비공유 억제제로 처리한 후 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 상기 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 ELISA를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 본원에 제공된 바와 같은 면역조직화학을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 BIOACORE SPR 기기를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 유세포 분석을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 면역침전을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 친화성 전기영동, 예컨대 전기영동 이동성 변화 분석을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 형광 편광/이방성을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 질량 분석에 결합된 친화도 정제를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 바이오층 간섭계를 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 마이크로스케일 열영동(MST)을 사용하여 검출된다.
일부 실시형태에서, KRas-GDP의 알킬화는 생물학적 샘플에서 검출된다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 우유, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 소변과 같은 전혈 구성성분 및 알킬화된 KRas를 함유할 수 있는 기타 신체 구성성분이다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 임의의 동물로부터 얻은 신체 샘플이다. 다양한 실시형태에서, 샘플은 인간으로부터 얻은 샘플이다.
일부 실시형태에서, 샘플은 포유동물의 것이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 예를 들어 임상 샘플 내 KRas-GDP 알킬화 상태를 검출할 때 인간 대상체의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRas 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12C 돌연변이로 처리된 환자의 것이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 혈청이다. 특정 실시형태에서 생물학적 샘플은 소변이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 소변이다.
viii. 생체 내 KRas-GDP의 알킬화 검출 방법
본 발명의 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생체내 KRas-GDP의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, KRas-GDP의 검출은 그것이 살아있는 세포, 조직 또는 유기체에서 일어날 때 생체내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생체내에서 세포 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생체내에서 세포 배양물 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생체내에서 조직 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생체내에서 조직 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생체내에서 종양 세포 내 알킬화된 KRas-GDP를 검출한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 생체내에서 장기 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 유기체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 설치류이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 인간이다. 생체내 KRas-GDP의 알킬화의 검출은 상기 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체내 KRas-GDP의 알킬화는 면역조직화학에 의해 검출된다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasG12C의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 1A5, 1D6, 2C1, 1A6, 1F4, 또는 1B7을 사용하여 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 사용하여 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, 2H11, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 사용하여 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 사용하여 알킬화된 KRas를 검출한다.
ix. 치료 방법 및 치료 모니터링
본 발명의 일부 실시형태에서, KRas 매개 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 매개 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 임의의 항-KRas 항체를 이러한 암을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1E5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2A3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 3A12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 4G12이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1D6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2C1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1A6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 1B7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 2H11, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab1이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab2이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab3이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab4이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab5이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab6이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab7이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 Ab8이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 항-KRas 항체가 투여된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 매개 암은 NSCLC이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 매개 암은 결장암이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 매개 암은 췌장암이다. 일부 실시형태들에서, 환자는 인간 환자이다.
일부 실시형태에서, 환자는 이전에 KRas 억제제(예를 들어, 본원에 기재된 공유 KRas 억제제 또는 비공유 KRas 억제제)를 받았다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 환자에게 동시 투여된다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 SWII 억제제이다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 SWII 리간드이다. 일부 실시형태에서, KRas 억제제는 공유 KRas 억제제이다. 한 실시형태에서, 공유 KRas 억제제는 본원에 기재된 바와 같이 KRas의 SWII 포켓을 알킬화한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas에 대한 SWII 억제제의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas에 대한 SWII 리간드의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRas에 대한 KRas 억제제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 공유 또는 비공유 KRas 억제제)의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 환자는 이전에 KRasG12C 억제제를 투여받았다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 억제제가 환자에게 동시 투여된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 억제제는 SWII 억제제이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 억제제는 SWII 리간드이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 억제제는 공유 억제제이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12C에 대한 SWII 억제제의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12C에 대한 SWII 리간드의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12C에 대한 KRas 억제제의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 환자는 이전에 KRasG12D 공유 억제제를 투여받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 이전에 KRasG12D 비공유 억제제를 투여받았다. 일부 실시형태에서, KRasG12D 억제제(예를 들어, 공유 또는 비공유)는 환자에게 동시 투여된다. 일부 실시형태에서, KRasG12D 억제제는 SWII 억제제이다. 일부 실시형태에서, KRasG12D 억제제는 SWII 리간드이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D에 대한 SWII 억제제의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D에 대한 SWII 리간드의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12D에 대한 KRas 억제제의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12V에 대한 KRas 억제제의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG12R에 대한 KRas 억제제의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasG13D에 대한 KRas 억제제의 친화도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체는 KRasQ61H에 대한 KRas 억제제의 친화도를 개선한다.
일부 실시형태에서, 환자에서 암의 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 환자에서 KRasG12C 매개 암의 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 환자에서 KRasG12C 매개 암의 치료 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 직접적인 표적 결합(예를 들어, KRasG12C의 결합)이 모니터링된다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 매개 암의 치료를 모니터링한 후 독성을 최소화하면서 효능을 최대화하는 치료 용량을 선택한다. 일부 실시형태에서, 환자는 공유 KRasG12C 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12C SWII 리간드로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 환자는 KRasG12C 공유 억제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 KRasG12C의 알킬화를 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 클래스 I 항체를 사용하여 KRasG12C의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 1A5, 1D6, 2C1, 1A6, 1F4, 또는 1B7을 사용하여 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 사용하여 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, 2H11, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 사용하여 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태들에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8. 일부 실시형태에서, Ab1을 사용하여 알킬화된 KRas를 검출한다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합 검출은 상기 기재된 임의의 기술을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합 검출은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체를 사용하여 환자의 샘플 내 KRasG12C의 알킬화를 검출한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 임상 샘플이다. 특정 실시형태들에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 우유, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 소변과 같은 전혈 구성성분 및 알킬화된 KRasG12C를 함유할 수 있는 기타 신체 구성성분이다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 KRasG12C가 알킬화되었음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 KRasG12C가 투약되었음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 항-KRas 항체의 결합은 KRasG12C가 SWII 리간드에 의해 공유 결합되었음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 환자의 암 치료는 KRasG12C 알킬화의 상대적 수준을 평가함으로써 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 환자의 암 치료는 알킬화된 KRasG12C의 비율을 평가함으로써 모니터링된다.
x. KRas를 결정화하는 방법
또 다른 양상에서 KRas를 결정화하는 방법이 제공되며, 여기서 KRas는 본원에 기재된 바와 같은 KRas 억제제에 선택적으로 결합되며, 상기 방법은 본원에 기재된 항-KRas 항체를 KRas(예를 들어, KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H)와 접촉시키는 단계 및 복합체의 결정 구조를 분석하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 본원에 기재된 바와 같이 SWII 포켓을 개방 및/또는 안정화시킨다. 또 다른 실시형태에서, 항-KRas 항체는 본원에 기재된 바와 같이 KRas-GDP 형태를 안정화시킨다. 또 다른 실시형태에서, 항-KRas 항체는 본원에 기재된 바와 같이 SWII 포켓을 개방 및/또는 안정화시키며, 여기서 KRas 억제제는 SWII 포켓 내의 적어도 하나의 잔기에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다.
KRas와 공동 복합체를 형성하여 결정화 샤페론으로 작용하는 항-KRas 항체가 본원에 추가로 제공된다. 본원에 사용된 “결정화 샤페론”은 관심 표적에 결합하고, 결정 패킹을 향상 및 조절하고/하거나 고품질 단계화 정보를 제공하는 보조 단백질을 지칭한다. 한 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 KRas에 대한 항-KRas 항체의 결합은 KRas 단독과 비교할 때 결정 형성을 증가시킨다. 한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 본원에 기재된 바와 같은 Fab이다.
C. 키트
본 발명의 분석 방법은 키트 형태로 제공될 수 있다. 한 실시형태에서, 이러한 키트는 항-KRas 항체 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-KRas 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 돌연변이체 KRas, KRas-GDP 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H을 포함)에 대한 항-KRas 항체; 본원에 기재된 바와 같은 KRas, KRas-GDP, 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H을 포함)에 결합하는 검출 가능한(표지된 또는 표지되지 않은) 항체로 구성된 포획 시약; 및 이러한 시약들을 사용하여 분석 방법을 수행하는 방법에 대한 지침서의 기본 요소들을 포함하는 포장된 조합물이다. 이러한 기본 요소는 상기 정의되어 있다.
이러한 키트는, 별도의 요소로 제공될 수 있거나 또는 그 위에 포획 시약들이 이미 고정되어 있는 포획 시약용 고체 지지체를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 키트의 포획 항체는 고체 지지체에 고정될 수 있거나, 또는 키트에 포함되는 또는 키트와 별도로 제공되는 지지체에 고정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 포획 시약은 고체 물질(예를 들어, 미세역가 플레이트, 비드 또는 콤) 상에 또는 이에 코팅되거나 부착된다. 검출가능한 항체는 직접 검출된 표지된 항체 또는 상이한 종에서 발생된 표지되지 않은 항체에 대해 지시되는 표지된 항체에 의해 검출되는 표지되지 않은 항체일 수 있다. 표지가 효소인 경우, 키트에는 일반적으로 효소에 필요한 기질과 보조인자가 포함되는데; 표지가 형광단인 경우, 검출 가능한 발색단을 제공하는 염료 전구체이고; 표지가 비오틴인 경우, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 MUG와 함께 HRP 또는 β-갈락토시다제에 접합된 스트렙타비딘이다.
다양한 실시형태에서, 항-KRas 항체는 본원에 개시된 항-KRas 항체 중 하나 이상이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 12)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 91)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 92)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 93)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 94)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 95)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 96)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 97)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 GSSIWSSN(서열번호 98)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQGIRNDLG(서열번호 1)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 2)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 LQDHDYPLT(서열번호 3)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 4)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 5)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GFYVRNWFDP(서열번호 6)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQGISSYLA(서열번호 17)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 18)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 QQYYSYPFT(서열번호 19)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 20)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 AISSSGSSTYYADSVKG(서열번호 21)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 DQGGYGYPGESWFDY(서열번호 22)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RASQSISSYLN(서열번호 25)을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 26)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 QQSYSPPWT(서열번호 27)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 28)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 29)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 AFYSYMDV(서열번호 30)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 RSSQSLLHSNGYNYLD(서열번호 33)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 LGSNRAS(서열번호 34)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 MQALQTPLT(서열번호 35)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 36)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 37)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 ERTILTGYYGFDY(서열번호 38)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 41)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 42)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDSSLTGYV(서열번호 43)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 44)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 45)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 46)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 81)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 82)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 AAWDDSLSGWV(서열번호 83)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 84)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 85)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 SFGPYAFDV(서열번호 86)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 49)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 50)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDSSLTGWV(서열번호 51)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 52)를 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 53)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 54)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 57)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 58)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 NSRDSSGNHWV(서열번호 59)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 60)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 61)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 TNNYGYRYFDY(서열번호 62)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 65)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 66)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 NSRDSTDNHLWV(서열번호 67)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 68)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 69)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 ATSSGYYYFDY(서열번호 70)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-KRas 항체는 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 73)를 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 74)를 포함하는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 GTWDNSLSVWV(서열번호 75)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 76)을 포함하는 CDR-H1, 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 77)를 포함하는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 GKGIVGWGFFGMDV(서열번호 78)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또한 키트에는 일반적으로 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP 및/또는 알킬화된 KRas가 표준으로 포함되어 있을 뿐만 아니라 안정제, 세척 및 배양 완충액 등과 같은 기타 첨가제가 포함된다.
키트의 성분들은 분석의 감도를 실질적으로 최대화하는 시약 용액의 농도를 적절히 다양하게 제공하기 위해 다양한 시약들의 상대적인 양을 미리 결정된 비율로 제공될 것이다. 특히, 시약은 일반적으로 부형제를 포함하여 동결건조된 건조 분말로 제공될 수 있으며, 이는 용해 시 테스트 할 샘플과 조합하기에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법(예를 들어, KRas, KRas-GDP, and/or alkylated KRas(구체적으로 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H 포함)에 사용하기 위한 본원에 기재된 항-KRas 항체를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas를 검출하는 방법에 사용하기 위해 콤(comb)에 코팅되거나 부착된 항-KRas 항체를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 환자의 암 치료를 모니터링하는 방법에 사용하기 위한 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은, KRas 단백질(예를 들어, KRasG12C)에 대한 본원에 기재된 하나 이상의 KRas 억제제의 표적 결합을 측정하기 위한 바이오마커 분석에 사용하기 위한 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 생물학적 샘플 내 KRas-GDP 또는 KRas-GTP의 알킬화를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRas의 알킬화된 형태에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태에서, 키트는 생물학적 샘플에서 KRas-GDP의 알킬화를 검출하는 데 사용되는 하나 이상의 항-KRas 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 생물학적 샘플에서 공유 억제제의 결합에 의해 KRasG12C의 공유 결합(예를 들어, 알킬화)을 검출하는 데 사용되는 하나 이상의 항-KRas 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 표적 결합을 측정하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 분석에 따라 KRas, KRas-GDP, KRas-GTP, 및/또는 알킬화된 KRas(구체적으로 본원에 기재된 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H를 포함)를 검출하기 위한 시약들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRasG12C의 알킬화를 검출하는 데 사용되는 클래스 I 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRasG12D의 공유 결합을 검출하는 데 사용되는 클래스 I 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRasG12D의 비공유 결합을 검출하는 데 사용되는 클래스 I 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRasG12V의 비공유 결합을 검출하는 데 사용되는 클래스 I 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRasG12R의 비공유 결합을 검출하는 데 사용되는 클래스 I 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRasG13D의 비공유 결합을 검출하는 데 사용되는 클래스 I 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 KRasQ61H의 비공유 결합을 검출하는 데 사용되는 클래스 I 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 KRas 비공유 억제제에 비공유적으로 결합된 KRas 또는 알킬화된 KRas를 검출하기 위해 사용되는 1A5, 1D6, 2C1, 1A6, 1F4, 또는 1B7을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 KRas 비공유 억제제에 비공유적으로 결합된 KRas 또는 알킬화된 KRas를 검출하기 위해 사용되는, 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 KRas 비공유 억제제에 비공유적으로 결합된 KRas 또는 알킬화된 KRas를 검출하기 위해 사용되는, 2H11, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 KRas 비공유 억제제에 비공유적으로 결합된 KRas 또는 알킬화된 KRas를 검출하기 위해 사용되는, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8을 포함한다.
일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제로 처리된 대상체에서 KRasG12C의 공유 결합(예를 들어, 알킬화)을 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트가 제공되며, 여기서 이 방법은 (a) 본원에 개시된 항-KRas 항체 중 어느 하나를 KRasG12C 특이적 공유 억제제로 처리한 후 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-1952이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-853이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-1620, MRTX849이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 AMG-510이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 GDC-6036이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-3248이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 LY3499446이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 JNJ-74699157이다. 일부 실시형태에서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 LY3537982이다.
일부 실시형태에서, KRasG12D 특이적 공유 억제제로 처리된 대상체에서 KRasG12D에 대한 공유 KRas 억제제의 공유 결합을 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트가 제공되며, 여기서 이 방법은 (a) 본원에 개시된 항-KRas 항체 중 어느 하나를 KRasG12D 특이적 공유 억제제로 처리한 후 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, KRasG12D 특이적 비공유 억제제로 처리된 대상체에서 KRasG12D에 대한 공유 KRas 억제제의 비유 결합을 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트가 제공되며, 여기서 이 방법은 (a) 본원에 개시된 항-KRas 항체 중 어느 하나를 KRasG12D 특이적 비공유 억제제로 처리한 후 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 다양한 수단 중 하나 이상을 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 ELISA를 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 제공된 바와 같이 면역조직화학을 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 BIOACORE SPR 기기를 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 유세포 분석을 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 면역침전을 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 친화성 전기영동, 예컨대 전기영동 이동성 변화 분석을 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 형광 편광/이방성을 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 질량 분석에 결합된 친화성 정제를 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 생물층 간섭계를 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 마이크로스케일 열영동(MST)을 사용하여 KRas-GDP의 알킬화를 검출하기 위한 시약 및 지침서를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출하는데 사용하기 위한 키트. 일부 실시형태들에서, 생물학적 샘플 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출함에 사용하기 위한 키트가 제공되며, 이때 생물학적 샘플은 전혈 또는, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장, 복수, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 우유, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 소변과 같은 전혈 구성성분 및 알킬화된 KRas를 함유할 수 있는 기타 신체 구성성분이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 임의의 동물로부터 얻은 신체 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 인간으로부터 얻은 샘플이다.
일부 실시형태에서, 포유동물의 샘플 내 KRas-GDP의 알킬화를 검출하는데 사용하기 위한 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 예를 들어 임상 샘플 내 KRas-GDP 알킬화 상태를 검출할 때 인간 대상체의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRas 돌연변이를 갖는 환자의 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자 또는 발암성 KRasG12C 돌연변이로 처리된 환자의 것이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 혈청이다. 특정 실시형태에서 생물학적 샘플은 소변이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 환자의 소변이다.
실시형태
실시형태 1. 인간 KRas에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 항체는 GTP에 결합된 KRas(KRas-GTP) 보다 GDP에 더 높은 친화도로 결합된 KRas(KRas-GDP)에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 2. 인간 KRas에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 항체는 GDP에 결합된 KRas(KRas-GDP) 보다 GTP에 더 높은 친화도로 결합된 KRas(KRas-GTP)에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 4. 실시형태 1-3 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SWII 포켓을 개방하여 안정화시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 5. 실시형태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 인간 KRas는 KRasG12C, KRas G12V, KRasG12R, KRasQ61H, KRasG12D, 및 KRasG13D로 이루어진 군으로부터 선택된 KRas 돌연변이체인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 6. 실시형태 5에 있어서, 인간 KRas는 KRasG12C, KRas G12V, KRasG12D, 및 KRasG13D로 이루어진 군으로부터 선택된 KRas 돌연변이체인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 7. 실시형태 6에 있어서, KRas 돌연변이체는 KRasG12C인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 8. 실시형태 7에 있어서, KRasG12C-GDP는 KRasG12C 특이적 공유 억제제로 알킬화되는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 9. 실시형태 8에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982 또는 JNJ-74699157로 알킬화된 KRasG12C-GDP에 결합하는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 10. 실시형태 1-9 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 돌연변이 단백질의 SWII 포켓을 안정화시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 11. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 AAWDERLSGWV(서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 12)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY(서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 12. 실시형태 11에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 13. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 서열번호 9를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 서열번호 10을 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 서열번호 11을 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 서열번호 13을 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 서열번호 14를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 14. 실시형태 13에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 및 서열번호 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열들 중 하나를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 15. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체는 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQGIRNDLG(서열번호 1)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 2)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 LQDHDYPLT(서열번호 3)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 4)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 5)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 GFYVRNWFDP(서열번호 6)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 16. 실시형태 15에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 17. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQGISSYLA(서열번호 17)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 18)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 QQYYSYPFT(서열번호 19)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 20)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 AISSSGSSTYYADSVKG(서열번호 21)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 DQGGYGYPGESWFDY(서열번호 22)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 19. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQSISSYLN(서열번호 25)을 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 26)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 QQSYSPPWT(서열번호 27)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 28)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 29)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 AFYSYMDV(서열번호 30)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 20. 실시형태 19에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 21. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RSSQSLLHSNGYNYLD(서열번호 33)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 LGSNRAS(서열번호 34)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 MQALQTPLT(서열번호 35)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SSNWWS(서열번호 36)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS(서열번호 37)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 ERTILTGYYGFDY(서열번호 38)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 22. 실시형태 21에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 23. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 41)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 42)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 GTWDSSLTGYV(서열번호 43)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 44)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 45)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 46)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 24. 실시형태 23에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 25. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체는 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY(서열번호 81)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 RNNQRPS(서열번호 82)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 AAWDDSLSGWV(서열번호 83)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 84)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 85)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 SFGPYAFDV(서열번호 86)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 26. 실시형태 25에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 27. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 49)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 50)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 GTWDSSLTGWV(서열번호 51)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYAIS(서열번호 52)를 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG(서열번호 53)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV(서열번호 54)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 28. 실시형태 27에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 29. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 57)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 58)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 NSRDSSGNHWV(서열번호 59)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 60)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 61)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 TNNYGYRYFDY(서열번호 62)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 30. 실시형태 29에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 31. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 65)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 GKNNRPS(서열번호 66)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 NSRDSTDNHLWV(서열번호 67)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 68)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호 69)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 ATSSGYYYFDY(서열번호 70)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 32. 실시형태 31에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 33. 실시형태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS(서열번호 73)를 포함하는 CDR-L1;
(ii) 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 74)를 포함하는 CDR-L2;
(iii) 아미노산 서열 GTWDNSSLSVWV(서열번호 75)를 포함하는 CDR-L3; 및
(b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 SYSMN(서열번호 76)을 포함하는 CDR-H1;
(ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 77)를 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 GKGIVGWGFFGMDV(서열번호 78)를 포함하는 CDR-H3.
실시형태 34. 실시형태 33에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 영역은 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 35. 인간 KRas-GDP에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 인간 KRas의 아미노산 W99, K5, L6, V7, S39, D54, L54, Y71, T74 및/또는 G75에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 36. 인간 KRas-GTP에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 인간 KRas의 아미노산 W99, K5, L6, V7, S39, D54, L54, Y71, T74 및/또는 G75에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 37. 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 단리된 핵산(들).
실시형태 38. 실시형태 37의 핵산(들)을 포함하는 벡터.
실시형태 39. 실시형태 28의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
실시형태 40. 실시형태 1-36 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출가능한 표지에 접합된, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시형태 41. KRas-GDP에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법으로서, 항체를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건하에 실시형태 36의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 42. KRas-GtP에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법으로서, 항체를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건하에 실시형태 36의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 43. KRasG12C-GTP 보다 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 항체 라이브러리를 다음과 접촉시키는 단계:
i) KRasG12C-GDP,
ii) KRasG12C 특이적 공유 억제제로 알킬화된 KRasG12C-GDP, 및
iii) 비가수분해성 GTP 유사체에 결합된 KRasG12C, 및
(b) 비가수분해성 GTP 유사체에 결합된 KRasG12C 보다 알킬화 KRasG12C-GDP 및 비알킬화 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 선택하는 단계.
실시형태 44. KRasG12C-GDP 보다 KRasG12C-GTP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 항체 라이브러리를 다음과 접촉시키는 단계:
i) KRasG12C-GTP,
ii) KRasG12C 특이적 공유 억제제로 알킬화된 KRasG12C-GTP, 및
iii) 비가수분해성 GDP 유사체에 결합된 KRasG12C, 및
(b) 비가수분해성 GDP 유사체에 결합된 KRasG12C 보다 알킬화 KRasG12C-GTP 및 비알킬화 KRasG12C-GTP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 선택하는 단계.
실시형태 45. 실시형태 43 또는 실시형태 44에 있어서, 라이브러리는 합성 파지 라이브러리인, 방법.
실시형태 46. 생물학적 샘플 내 KRas-GDP를 검출하는 방법으로서, 생물학적 샘플을 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 47. 실시형태 46에 있어서, 생물학적 샘플을 KRas-GTP에 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 KRas-GDP의 양 및 KRas-GTP의 양이 결정되는, 방법.
실시형태 48. 생물학적 샘플 내 KRas-GTP를 검출하는 방법으로서, 생물학적 샘플을 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 49. 실시형태 46에 있어서, 생물학적 샘플을 KRas-GDP에 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 KRas-GTP의 양 및 KRas-GDP의 양이 결정되는, 방법.
실시형태 50. 검출가능한 표지에 접합된 실시형태 1-36 중 어느 하나의 KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하기 위한 지침서를 포함하는 키트.
실시형태 51. KRas 돌연변이체의 억제제를 얻는 방법으로서, 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 KRas 돌연변이체와 접촉시키는 단계, 화합물들을 스크리닝하는 단계, 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 KRas 돌연변이체에 결합하는 화합물들을 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 52. 실시형태 51에 있어서, 화합물들은 SWII 포켓의 KRas를 공유적으로 변형시키는 분자를 포함하는, 방법.
실시형태 53. 실시형태 52에 있어서, 화합물들은 SWII 포켓 내 적어도 하나의 잔기를 알킬화하는 공유 억제제를 포함하는, 방법.
실시형태 54. 실시형태 51에 있어서, 화합물들은 SWII 포켓의 KRas를 비공유적으로 변형시키는 분자를 포함하는, 방법.
실시형태 55. 실시형태 51-54 중 어느 하나에 있어서, KRas 돌연변이체는 KRasG12C, KRas G12V, KRasG12D, KRasG13D, KRasG12R, 또는 KRasQ61H인, 방법.
실시형태 56. KRas의 알킬화를 검출하는 방법으로서, 생물학적 샘플을 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 57. 실시형태 56에 있어서, 검출은 KRasG12C의 검출을 포함하는, 방법.
실시형태 58. 실시형태 56 또는 57에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체인, 방법.
실시형태 59. 포유동물 내 KRas의 알킬화를 검출하는 방법으로서, 포유동물에게 실시형태 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계 및 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 60. KRas 억제제로 처리된 환자에서 KRas의 알킬화를 검출하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 샘플을 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
(c) 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 결합된 KRas의 양을 측정하는 단계.
실시형태 61. 실시형태 60에 있어서, KRas 억제제는 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982 또는 JNJ-74699157인, 방법.
실시형태 62. 실시형태 60 또는 61에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 결합된 KRas의 양이 환자에게 투여할 KRas 억제제의 투여량을 결정하는, 방법.
실시형태 63. 실시형태 59-62 중 어느 하나에 있어서, 검출은 KRasG12C의 검출을 포함하는, 방법.
실시형태 64. 실시형태 59-63 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체인, 방법.
실시형태 65. 실시형태 59-63 중 어느 하나에 있어서, 포유동물은 인간인, 방법.
실시형태 66. KRasG12C 특이적 공유 억제제로 처리된 대상체 내 KRasG12C의 알킬화를 검출하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
(a) KRasG12C 특이적 공유 억제제로 치료한 후 대상체에게 항체 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계; 및
(b) 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계.
실시형태 67. 실시형태 66에 있어서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-1952, ARS-853, ARS-1620, MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157인, 방법.
실시형태 68. 실시형태 67에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체인, 방법.
실시형태 69. KRasG12C 매개 암을 치료하는 방법으로서, 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이러한 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 70. 실시형태 69에 있어서, KRasG12C 매개 암은 NSCLC, 결장암 또는 췌장암인, 방법.
실시형태 71. 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 결정화 샤페론.
실시형태 72. KRas를 결정화하는 방법으로서, 여기서 KRas는 KRas 억제제에 선택적으로 결합되고, 이 방법은 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 KRas와 접촉시키는 단계 및 복합체의 결정 구조를 분해하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 73. 실시형태 72에 있어서, KRas는 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H인, 방법.
실시형태 74. KRas에 대한 화합물들의 결합을 측정하기 위한 바이오센싱 표면으로서, 여기서:
(i) 바이오센싱 표면은, KRas 단백질 및 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 내부에 공동-국재화된 하이드로겔을 포함하고;
(ii) KRas 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서로 결합하여 친화성 복합체를 형성하기에 충분한 하이드로겔 내부의 자유도를 갖고;
(iii) KRas 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 국소 농도가 해리 친화도 상수를 적어도 10배 초과하고, 여기서 국소 농도는 친화성 복합체의 형성을 촉진하며;
(iv) 결합되지 않은 KRas 단백질 및 항-KRas 항체의 분율이 약 50% 미만이고;
(v) KRas 억제제 화합물이 적어도 5초 동안 바이오센싱 표면에 주입되고; 및
(vi) 항-KRas 항체에 대한 KRas 억제제 화합물의 결합이 적어도 하나의 감지 채널을 통해 측정되는, 바이오센싱 표면.
실시형태 75. 실시형태 74에 있어서, 하이드로겔은 두께가 약 10 nm-500 nm, 10 nm-300 nm, 10-250 nm, 또는 약 10-200 nm인, 바이오센싱 표면.
실시형태 76. 실시형태 74 또는 75에 있어서, KRas는 비오티닐화된, 바이오센싱 표면.
실시형태 77. 실시형태 74-76 중 어느 하나에 있어서, 바이오센싱 표면은 BIACORE 센서 칩에 부착되는, 바이오센싱 표면.
실시형태 78. 화합물들을 항-KRas 억제제 활성에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 이 방법은 KRas에 대한 화합물의 결합을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 KRas는 항-KRas 항체에 결합되고, 결합은 실시형태 74-77 중 어느 하나의 바이오센싱 표면을 사용하여 측정되는, 방법.
실시형태 79. 본원에 기재된 항-KRas 항체에 대한 KRas 돌연변이체 단백질의 결합을 측정하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
(i) 실시형태 74-77 중 어느 하나의 바이오센싱 표면을 KRas와 접촉시켜 KRas-결합된 바이오센싱 표면을 형성하는 단계;
(ii) KRas-결합된 바이오센싱 표면을 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계(여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 단백질과 비교하여 몰 과량으로 존재함); 및
(iii) 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KRas에 대한 결합 및 친화도를 검출하는 단계.
실시형태 80. 본원에 기재된 항-KRas 항체에 대한 KRas 돌연변이체 단백질의 결합을 측정하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
(i) 실시형태 74-77 중 어느 하나의 바이오센싱 표면을 실시형태 1-36 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시켜 항-KRas 항체-결합된 바이오센싱 표면을 형성하는 단계;
(ii) 항-KRas 항체-결합된 바이오센싱 표면을 KRas와 접촉시키는 단계(여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 단백질에 비해 몰 과량으로 존재함); 및
(iii) 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KRas에 대한 결합 및 친화도를 검출하는 단계.
실시형태 81. KRas 단백질에 대한 KRas 억제제의 표적 결합을 측정하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 샘플을 본원에 기재된 항-KRas 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
(c) 항-KRas 항체에 의해 결합된 KRas의 수준을 측정하는 단계.
실시예
본 발명은 다음과 같은 실시예에서 보다 상세히 설명되며, 이러한 실시예는 어떠한 방식으로든 청구범위에 기재된 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 첨부된 도면은 본 발명의 명세서 및 설명의 필수적인 부분으로 간주하는 것으로 한다. 다음 실시예는 설명을 위해 제공되며, 청구범위 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: 항-KRas 항체의 선별 및 에피토프 매핑
다음 실시예는 KRasG12C의 개방 형태를 인식하거나 유도하는 항-KRas 항체의 선별 및 특성화를 설명한다.
재료 및 방법
파지 선별
시험관내 선별 전략은 합성 항체 라이브러리와 3가지 별개의 KRasG12C 형태: 알킬화 및 비알킬화 KRasG12C-GDP 및 KRasG12C-GMPPcp(비가수분해성 GTP 모방체)를 사용하여 개발되었다(도 1B). KRas 동형 B의 아미노산 잔기 T2 내지 K169를 사용하였다. 4회의 바이오패닝을 수행했으며 여기서 GNE-1952로 알킬화된 비오티닐화된 KRasG12C-GDP가 있는 용액에서 합성 파지 라이브러리가 인큐베이션되었다. KRasG12C-GDP의 알킬화된 개방 형태로의 선별을 유도하기 위해 용액 중에 비오티닐화되지 않은 KRasG12C-GDP 및 KRasG12C-GMPPcp가 과량 존재하는 상태에서 선별을 수행했다.
기존의 합성 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 선별을 수행했다 (C. V. Lee 외, J Mol Biol 2004; 340:1073-1093; W. C. Liang 외, J Mol Biol 2007; 366:815-829). 풀링된 라이브러리는 비오티닐화된 KRasG12Ci-GDP+GNE1952(초기 500nM에서 10nM까지 범위)에 대한 용액에서 3 내지 4회 결합을 통해 순환되었다. 용액을 뉴트라비딘(NeutrAvidin) 비드(Promega사)에 포획하고, 5uM 비오틴으로 차단하고, PBS + 0.5% BSA + 0.1% Tween 20(PBSBT)에서 각각 30초 동안 3회 세척하고, 100mM HCl로 용리되었다. 용리된 파지는 1M TRIS-HCl pH 8.0으로 중화된 다음, M13-KO7 헬퍼 파지(New England Biolabs사)를 첨가하여 대장균 XL1-블루(Stratagene사)에서 밤새 증폭되었다. 알킬화된 KRasG12C에 특이적인 결합제를 농축시키기 위해 1μM의 가용성 KRasG12C-GDP 또는 KRasG12C-GMPPcp가 과량 존재하는 상태에서 선별을 수행하였다. 선별 후 개별 콜로니들이 선별되고 카르베니실린 및 헬퍼 파지가 보충된 2xYT 배지의 96웰 딥 웰 플레이트에서 30˚에서 밤새 성장되었다. 파지 상층액을 KRasG12Ci-GDP+GNE1952, KRasG12C-GDP 및 KRasG12C-GMPPcp에 대한 파지 ELISA에 사용하여 표적 특이적 클론을 식별했다.
항체 및 Fab 생산
11개의 특유한 클론에 대한 IgG가 생성되었다. 리드 파지 클론들의 서열들은 Sanger 시퀀싱으로 얻었다. 각 클론의 경쇄 및 중쇄에 대한 IgG(인간 IgG1) 발현 구조체를 유전자 합성에 의해 얻었다. IgG는 293 세포의 일시적 형질감염에 의해 생산되었고 표준 방법(MabSelect SuRe; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 이어 SEC로 정제되었다. 박테리아 발현 Fab 구조체들을 유전자 합성에 의해 생성하였다. 재조합 Fab는 이전에 기술된 바와 같이 생성되었다 (T. N. Lombana, M. Dillon, J. Bevers, 3rd, C. Spiess, Sci Rep 2015; 5:17488).
알킬화된 KRas G12C 에 대한 항체 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)
GNE-1952 결합된 KRasG12C-GDP를 인식하는 항-KRas 항체를 식별하기 위해, 2개의 추가 화합물(ARS-853 및 ARS-1620)로 알킬화된 KRasG12C를 인식하는 11개의 단클론 항체(mAb)의 능력이 측정되었다(MP Patricelli 외, Cancer Discov 2016; 6:316-329; P. Lito 외, Science 2016; 351:604-608). 비오티닐화된 KRasG12C-GDP + GNE-1952 및 KRasG12C-GDP를 뉴트라비딘(NeutrAvidin) ELISA 플레이트(Thermo Scientific)에 PBS에서 0.3μg/mL로 4℃에서 밤새 코팅했다. 플레이트를 PBSBT로 세척하고 10μg/mL에서 시작하여 항-KRas 항체(본원에 기술된 선택된 항-KRas 항체 및 시판되는 항체 모두)의 연속 희석액을 25℃에서 진탕하면서 1-2시간 동안 첨가하였다. 세척 후, 종 매칭된 Fc-특이적 HRP 2 항체를 25˚C에서 1시간 동안 진탕하면서 첨가하였다. PBSBT로 세척한 후 플레이트를 TMB 기질로 5분 동안 전개시키고 650nm에서 검출했다.
항체 표면 플라즈몬 공명 (SPR)
SPR 실험은 HBS-P+ (GE Healthcare) 실행 완충액을 사용하여 25℃에서 Mass-1(Bruker)에서 수행되었다. 1μg/mL의 항-KRas 항체를 항-HuIgG1 Fc 포획 키트(GE Healthcare)를 사용하여 포획하였다. KRasG12C-GDP+GNE-1952, KRasG12C-GDP, KRasG12C-GDP+ARS1620, KRasG12C-GDP+ARS853, 및 KRasWT-GDP를 30μL/분의 유속으로 용액에 분석물질로서 첨가했다. KRasG12-GDP+GNE-1952는 500-0nM의 희석 시리즈를 사용하여 적정되었다. KRasG12C-GDP는 5000-0 nM의 희석 시리즈를 사용하여 적정되었다. KRasG12C-GDP+ARS1620은 1000-0 nM의 희석 시리즈를 사용하여 적정되었다. KRasG12C-GDP+ARS853은 200-0 nM의 희석 시리즈를 사용하여 적정되었다. KRasWT-GDP는 2000-0 nM의 희석 시리즈를 사용하여 적정되었다. 동역학 매개변수를 식별하기 위해 센서그램들을 1:1 Langmuir 모델에 피팅하였다.
에피토프 비닝
에피토프 비닝 실험은 이전에 기술된 바와 같이 어레이-기반 이미저(IBIS MX96, 네덜란드, YN Abdiche 외, PLoS One 2014; 9:e92451)에서 25˚의 HBS-P+(GE Healthcare) 실행 완충액에서 수행되었다. 간단히 말해서, 10μg/mL의 항-KRas 항체를 pH 4.5의 10mM 소듐 아세테이트에서 표면에 아민 커플링하였고, 표면을 1M 에탄올아민으로 퀀칭하였다. 에피토프 비닝 실험은 먼저 고정된 항체들 위에 2 μM KRasG12C-GDP+GNE1952를 흐르게 한 다음, 용액에 각각의 항-KRas 항체 10 μg/mL를 첨가하여 수행되었다. 항원이 회합되기에 충분한 시간을 둔 후 항체를 첨가하였다. 용액에 다음 항체를 첨가하기 전에, 표면을 10mM 글리신 pH 2.5로 재생시켰다(도 1F).
면역침전
ARS-1620 또는 DMSO 대조군으로 처리된 세포에 대해 1A5 및 2H11을 사용하여 면역침전 실험을 수행하였다(도 1G).
결과
파지 디스플레이 선별은 SWII 공유 억제제에 의한 공유 변형 시 알킬화된 KRasG12C의 특유한 형태에 결합하는 항-KRas 항체를 선별하기 위해 수행되었다. 특이성을 확인하기 위한 파지 ELISA 스크리닝 후, 11가지 특유의 클론들에 대한 IgG가 생성되었고 이들의 결합 특이성은 ELISA(도 1C) 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 특성화되었다(도 1D, 도 1E 및 표 1A). 모든 mAb는 KD ~1-139 nM 범위의 친화도로 GNE-1952-알킬화된 KRasG12C-GDP에 결합되었다(표 1A). 선별된 mAb 및 KRas-GTP에 대한 시판 항-KRas 항체 iDab6(Tanaka, T. 외, EMBO J 2007; 26:3250-3259)의 결합 특이성을 또한 측정하였다(표 1B).
한 그룹(클론 1D6, 1B7, 2C1, 1A6 및 1F4)은 GNE-1952-결합된 KRasG12C-GDP 형태에 선택적인 반면 두 번째 그룹(클론 1A5, 1E5, 2A3, 2H11, 3A12 및 4G12)은 범-알킬화 선택적인 것으로 보였으며, GNE-1952, ARS-853 및 ARS-1620 결합 KRasG12C-GDP 형태를 인식한다(표 1A). 에피토프 매핑 분석은 이 두 그룹이 GNE-1952-결합된 KRasG12C-GDP에서 2가지 별개의 그러나 부분적으로 중첩되는 에피토프에 결합하였음을 나타내었다(도 1F).
표 1A: GDP에 결합된 다양한 KRas 단백질에 대한 항-KRas 항체의 친화도(“NB”는 결합 없음을 나타내고 “ND”는 데이터 없음을 나타냄)
Figure pct00010
표 1B: GTP에 결합된 KRas 단백질에 대한 항-KRas 항체의 친화도(“NB”는 결합 없음을 나타내고 “ND”는 데이터 없음을 나타냄)
Figure pct00011
클래스 I 항-KRas 항체 1A5는 알킬화되지 않은 KRasG12C-GDP에 비해 친화도가 >100배 개선된 알킬화된 KRasG12C-GDP에 대해 높은 특이성을 가졌다. 클래스 I 항-KRas 항체는 공유 결합된 SWII 리간드의 존재를 결합에 필요로 하였으며, 높은 특이도로 이 형태를 인식하고 결합했다. 대조적으로, 클래스 II 항-KRas 항체(1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 및 4G12)는 ELISA 및 SPR에 의해 알킬화된 KRasG12C-GDP 및 비알킬화된 KRasG12C-GDP 둘 모두에 대한 결합을 나타내었다(도 1C, 도 1D 및 표 1A). ). 클래스 II 항-KRas 항체는 공유 결합된 SWII 리간드의 존재를 결합에 필요로 하지 않았다.
ARS-1620 또는 DMSO 대조군으로 처리된 세포에 대해 1A5 및 2H11을 사용하여 면역침전 실험을 수행하였다. 클래스 I 및 II 항-KRas 항체 두 가지 모두는 알킬화된 KRasG12C-GDP를 특이적으로 면역침전시켰지만 알킬화되지 않은 KRasG12C-GDP는 그렇지 않았다(도 1G).
본원에 기술된 방법은 다양한 화학형을 갖는 KRasG12C의 알킬화에 의해 유도된 독특한 개방 형태를 검출하는 신규 항-KRas 항체 패널을 생성하였다.
실시예 2: 항-KRas 항체의 아미노산 서열
선별된 항-KRas 항체의 아미노산 서열은 표준 기술을 사용하여 결정하였다. 항-KRas 항체의 경쇄 상보적 결정 영역(CDR)은 표 2에 제공되고, 항-KRas 항체의 중쇄 CDR은 표 3에 제공된다. 항-KRas 항체의 경쇄 상보적 결정 영역(CDR)은 표 4에 제공되고, 항-KRas 항체의 중쇄 CDR은 표 5에 제공된다.
표 2: 항-KRas 항체의 경쇄 CDR 서열
Figure pct00012
표 3: 항-KRas 항체의 중쇄 CDR 서열
Figure pct00013
표 4: 항-KRas 항체의 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00014
표 5: 항-KRas 항체의 중쇄 가변 영역 서열
Figure pct00015
Figure pct00016
2H11 항체의 결정 구조에 기초하여 KRas-GDP 및 KRas-GTP에 대한 결합 친화도가 더욱 향상되었다. 항체의 일부들을 NNK 코돈을 사용하여 무작위화하고 시험관내 파지 선별을 수행하여 친화도가 개선된 변이체들을 식별한다. 특유한 서열들은 IgG로 재포맷되었다. 각각의 변이체의 해리-속도를 본원에 기재된 바와 같이 SPR에 의해 상이한 KRas 단백질에 대해 측정하였다. 표 6은 각 변이체가 KRas 단백질 중 적어도 하나에 대해 더 느린 해리 속도를 나타내며, 이는 친화도가 개선되었음을 나타낸다.
표 6: 다른 KRas 단백질에 대한 CLAMP 변이체의 해리 속도
Figure pct00017
실시예 3: KRas를 CLAMP에 테더링하여 친화도를 향상
본원에 기재된 CLAMP의 Fab, scFv, 또는 IgG에 대한 KRas 단백질을 포함하는 융합물 또한 제조되었다. 이 융합 단백질은 Fab 근방에서 KRas의 국소 농도를 증가시킬 수 있고 증가된 친화도를 나타낼 수 있다. KRas가 2H11 Fab의 LC 또는 HC의 N-말단에 융합된 아래 서열들이 제작되었다.
Avi.TEV.KRas.G4S4.2H11.Fab.LC
중쇄 서열:
EVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (서열번호 107)
경쇄 서열:
GLNDIFEAQKIEWHEGSENLYFQSTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 108)
Avi.TEV.KRas.G4S4.2H11.Fab.HC
중쇄 서열:
GLNDIFEAQKIEWHEGSENLYFQSTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETSLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLLVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKSDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSSSWYDLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT (서열번호 109)
경쇄 서열:
SVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDERLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 110)
실시예 4: 세포 내 KRas G12C 알킬화 검출
다음 실시예는 항-KRas 항체 1A5를 사용하여 KRasG12C 돌연변이체 암 세포에서 알킬화된 KRasG12C의 검출을 기재한다.
재료 및 방법
면역형광 및 대용량 이미징 세포들(세포주에 따라 웰 당 20000 내지 40000개 세포)을 폴리-L-리신 코팅된 96웰 플레이트(Cell Carrier Ultra; Perkin Elmer)에 씨딩하고 완전 배지(2% L-글루타민 및 10% FBS 포함 RPMI)를 보충했다. 다음 날, 세포들을 표시된 농도의 KRasG12C 억제제로 처리하고 표시된 길이의 시간 동안 인큐베이션하였다. 처리가 끝나면 세포들을 차가운 1X PBS로 2회 세척하고, 실온에서 20분 동안 3% 파라포름알데히드로 고정하고, 1X PBS로 10분 동안 세척하고, PFA를 실온에서 50mM NH4Cl로 10분 동안 퀀칭하였다. 세포들을 다시 1X PBS로 5분 동안 2회 세척한 다음, 실온에서 1X Perm/Wash 완충액(BD, Fisher Scientific)을 20분 동안 침투시켰다. 그 다음, 세포들을 실온에서 2시간 동안 표시된 농도에서 Perm/Wash 완충액에 희석시킨 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포들을 각각 10분 동안 Perm/Wash 완충액으로 3회 세척하고 접합된 형광 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.사의 1:500의 Alexa488 항-인간 및 Alexa647 항-토끼 또는 항-쥐)와 함께 20 내지 60분 동안 인큐베이션했다. 300nM DAPI 100ml를 각 웰에 15분 동안 첨가한 다음 세포들을 Perm/Wash 세척액으로 2회 세척하고 이미징하기 전에 1X PBS로 1회 세척했다.
더 나은 멤브레인 스캐닝 능력을 위해 40X 수침 렌즈와 공초점 모드를 사용하여 Opera PhenixTM HCS 기기(PerkinElmer Inc.)에서 이미징을 수행했다. 보다 우수한 형광 강도 정량 분석을 가능하게 하기 위해 각 웰에 대해 4-5개 필드를 획득하고 Harmony®(PerkinElmer Inc.) 소프트웨어에서 분석 및 정량화를 수행했다.
웨스턴 블롯팅. HCC1171 세포(20000/mL)를 완전 배지(2% L-글루타민 및 10% FBS를 포함하는 RPMI)가 있는 T-75 초저 접착성 ULA 플레이트(Corning® Inc.)에 씨딩하고 밤새 성장시켰다. 다음 날, 세포들을 18-24시간 동안 5mM ARS853으로 처리하였다. 다음 날 세포들을 펠렛화하고 1X PBS로 2회 세척하고 새로운 단백질 합성을 위한 대조군으로서 50mg/mL 사이클로헥스이미드(Sigma)를 포함하거나 포함하지 않는 무화합물 완전 배지를 24시간 또는 48시간 동안 보충했다. 그런 다음 처리가 끝날 때까지 세포를 수집하고 1X PBS로 1회 세척하고 Halt™ 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Thermofisher Scientific™)가 있는 Ripa 완충액(Thermofisher Scientific™)으로 용해하여 단백질을 수집했다. Pierce™ BCA 분석(Thermofisher Scientific™)을 사용하여 단백질을 정량화한 다음, 이를 Novex™ 4-20% 트리스-글리신 겔에서 100V에서 3시간 동안 실행하고 Trans-Blot® Turbo™ 전송 시스템(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 옮겼다. 멤브레인을 Li-Cor Odyssey® TBS 차단 완충액으로 1시간 동안 차단하고 1차 항체(Proteintech: KRAS 항체 #12063-1-AP, Cell Signaling Technology: pERK(Thr 202/Tyr 204) #9101, 총 ERK #9102, pS6 (Ser 235/236) #2211, 및 HSP90 #4874)와 함께 밤새 인큐베이션한 다음, TBST로 10분 동안 3회 세척한 후 2차 항체(Li-Cor)를 추가하였다. 멤브레인을 최종적으로 TBST 완충액으로 3회 세척하고 Li-Cor Odyssey® CLx 기기에서 이미징하였다.
생체 내 형광-활성화된 세포 분류(FACS). 종양 약력학을 평가하기 위해, 수확된 종양들을 GentleMACS™ 세포분리기(Miltenyi Biotec)를 사용하여 리버라제(Liberase) DL(0.2U/ml, Sigma-Aldrich, SKU 번호 5466202001) 및 DNase I(40U/ml, Sigma-Aldrich, SKU 번호 10104159001)로 37℃에서 30분 동안 분해시켰다. 단일 세포 현탁액을 준비하고 EpCAM(클론 EBA1, BD Biosciences, 카탈로그 번호 743544) 및 고정가능 생존성 염료(ebioscience)에 대해 4℃에서 30분 동안 염색하고 세척했다. 세포들을 Cytofix 완충액(BD Biosciences, 카탈로그 번호 51-2090KZ)으로 4℃에서 30분 동안 고정하고 Perm/Wash 완충액(Perm/Wash buffer)(BD Biosciences, 카탈로그 번호 51-2091KZ)으로 세척했다. 1A5-488, pS6(클론 N7-548, BD Biosciences, 카탈로그 번호 561457)에 대해 4℃에서 60분 동안 세포내 염색을 수행하고 펌 세척 완충액으로 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 세포들을 BD Symphony FACS 기기에서 분석하였다. 데이터는 GraphPad 프리즘 소프트웨어 버전 7(GraphPad, San Diego, CA); Flowjo 10.5.3(FlowJo, BD, CA)을 사용하여 분석되었다.
1A5 항-KRas 항체가 KRasG12C 돌연변이체 암 세포에서 알킬화된 KRasG12C를 특이적으로 가시화하는 데 사용될 수 있는지 여부를 테스트했다. GNE-1952, ARS-853, ARS-1620 및 AMG 510을 포함한 다양한 G12C 공유 분자들을 용량 의존적 방식으로 처리한 H1171 KRasG12C 세포들(그러나 HCT116 KRasG13D 세포들은 아님)의 면역형광(IF) 염색이 1A5 항-KRas 항체로 검출되었으며(도 2A-2C) 다중 KRasG12C 공유 분자에 의해 유도된 공통 형태를 인식하는 1A5의 능력을 추가로 확인한다.
세포 내 KRasG12C 알킬화의 동역학을 정량화하였다(도 2B). 이러한 결과는 알킬화된 KRas에 대한 면역블롯팅으로 얻은 값(도 2D) 및 대량의 세포 집단에서 pERK 및 pMEK와 같은 KRas 경로 마커들의 억제와 일치했다. 개별 세포에서 알킬화된 KRasG12C를 1A5로 IF 염색하여 추가 정보를 제공하였으며, KRasG12C 알킬화의 동역학이 놀랍게도 세포의 막 및 점상 구획 둘 모두에서 매우 동시적인 방식으로 발생했음을 나타냈다(도 2A, 도 2B). RAS-GDP에 특이적인 항체가 존재하지 않기 때문에 1A5 항-KRas 항체로 염색하면 KRasG12C-GDP가 알킬화되었을 때 세포 내 어디에 이것이 위치했었는지에 대한 국재화에 대한 정보를 제공한다. 1A5 항-KRas 항체는 또한 매우 낮은 수준의 KRasG12C 단백질을 발현하는 다수의 KRasG12C 세포주에서 알킬화된 KRasG12C-GDP를 검출할 수 있었다(도 2E).
FACS는 단일 세포 분석을 가능하게 하고 하류 신호 전달에 대한 약력학적 효과와 알킬화 수준을 상관시킬 가능성이 있기 때문에 FACS 염색을 위한 1A5 항-KRas 항체의 적용을 평가했다. 1A5 항-KRas 항체는 화합물의 수준이 증가함에 따라 알킬화된 KRasG12C-GDP의 증가하는 수준을 특이적으로 검출하였다(도 2F). 또한, 세포를 KRAS 활성의 하류 마커인 항-pS6 항체로 동시 염색하였고, 예상대로 대부분의 집단에서 pS6 수준의 용량 의존적 감소가 있었다(도 2F).
실시예 5: 선별된 항-KRas 항체와 시판 항-KRas 항체의 비교
다음 실시예는 시판 항-KRas 항체 세트에 대한 본원에 개시된 선별된 항-KRas 항체에 의한 KRas-결합의 형태적 특이성의 비교를 기재한다.
재료 및 방법
시판 항-KRas 항체. 사용된 시판 항체들은 다음과 같았다: 토끼 IgG를 보유한 iDab6 (Tanaka, T. 외, EMBO J 2007; 26:3250-3259), 항-Ras 항체 (EP1125Y) (Abcam, ab52939), KRas-2B 특이적 토끼 다클론 (Proteintech, 카탈로그 번호 16155-1-AP), Ras10 (Millipore, 카탈로그 번호 05-516), 3B10-2F2 (Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 WH0003845M1), 및 234-4.2 (Millipore, 카탈로그 번호 OP24) (도 3A-3D).
알킬화된 KRas G12C 에 대한 항체 ELISA. 비오티닐화된 KRasG12C-GDP + GNE-1952 및 KRasG12C-GDP를 뉴트라비딘(NeutrAvidin) ELISA 플레이트(Thermo Scientific)에 PBS 중의 0.3μg/mL로 삼중으로 4℃에서 밤새 코팅했다. 플레이트를 PBSBT로 세척하고 10 μg/mL에서 시작하는 항-KRas 항체의 연속 희석액을 25℃에서 1-2시간 동안 진탕하면서 첨가하였다. 세척 후, 종 매칭된 Fc-특이적 HRP 2˚항체를 25℃에서 1시간 동안 진탕하면서 첨가하였다. PBSBT로 세척한 후 플레이트를 TMB 기질로 5분 동안 전개시키고 650nm에서 검출했다.
면역침전. 선별된 항-KRas 항체 1A5 및 2H11 및 시판 항체 세트에 의해 DMSO 또는 ARS-1620으로 처리된 H1171 KRASG12C 돌연변이체 암 세포들에서 알킬화 및 알킬화되지 않은 KRasG12C의 면역침전을 수행하였다.
KRas에 대한 시판 항체 세트를 조사하여 구조적 특이성을 결정했다. 면역침전 및 ELISA(도 3A, 도 3B)에 의해 알킬화되지 않은 및 알킬화된 KRasG12C 둘 모두에 대해 비등한 친화도를 갖는 2개의 항체가 식별되었으며(Abcam EP1125Y 및 Ras10), 이는 이들 항체가 형태 특이적이지 않음을 시사한다. 대조적으로, HRasGTP에 대해 매우 특이적인 것으로 보고되었던 iDab6 항체는 ELISA시 알킬화된 KRasG12C-GDP에 대한 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않았지만, GDP 및 GMPPcP 결합 형태 모두에 결합하여 GDP 결합 형태에 선호도를 가졌으며(도 3B), 세포에서 알킬화되지 않은 KRasG12C만을 면역침전시킬 수 있었다(도 3A)(Tanaka, T. 외, EMBO J 2007; 26:3250-3259). iDab6 항체는 SWI 및 SWII 영역 모두에 걸쳐 있는 에피토프에 결합하기 때문에 KRasG12C-GDP의 알킬화에 의해 유도된 SWII 형태는 iDab6 결합을 방지할 가능성이 있다. 1A5 및 2H11만이 알킬화된 KRasG12C에 우선적으로 결합되었다.
실시예 6: 1A5 항-KRas 항체는 세포 내 KRas에 결합한다
다음 실시예는 선별된 항-KRas 항체 1A5의 세포 내 KRas에 결합하는 능력을 시판 항-KRas 항체와 비교하여 제공한다.
재료 및 방법
면역형광 및 고 콘텐츠 이미징. 세포들(세포주에 따라 웰 당 20000 내지 40000개 세포)을 폴리-L-리신 코팅된 96웰 플레이트(Cell Carrier Ultra; Perkin Elmer)에 씨딩하고 완전 배지(2% L-글루타민 및 10% FBS 포함 RPMI)를 보충했다. 다음 날, 세포들을 표시된 농도의 KRasG12C 억제제로 처리하고 표시된 길이의 시간 동안 인큐베이션하였다. 처리가 끝나면 세포들을 차가운 1XPBS로 2회 세척하고, 실온에서 20분 동안 3% 파라포름알데히드로 고정하고, 1X PBS로분 동안 세척하고, PFA를 실온에서 50mM NH4Cl로 10분 동안 퀀칭하였다. 세포들을 다시 1X PBS로 5분 동안 2회 세척한 다음, 실온에서 1X Perm/Wash 완충액(BD, Fisher Scientific)을 20분 동안 침투시켰다. 그 다음, 세포들을 실온에서 2시간 동안 표시된 농도에서 Perm/Wash 완충액에 희석시킨 1차 항체(1A5 또는 iDab6 또는 둘 모두)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포들을 각각 10분 동안 Perm/Wash 완충액으로 3회 세척하고 접합된 형광 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.사의 1:500의 Alexa488 항-인간 및 Alexa647 항-토끼 또는 항-쥐)와 함께 20 내지 60분 동안 인큐베이션했다. 300nM DAPI 100ml를 각 웰에 15분 동안 첨가한 다음 세포를 Perm/Wash 완충액으로 2회 세척하고 이미징 전에 1XPBS로 1회 세척했다(도 3C).
더 나은 멤브레인 스캐닝 능력을 위해 40X 수침 렌즈와 공초점 모드를 사용하여 Opera PhenixTM HCS 기기(PerkinElmer Inc.)에서 이미징을 수행했다. 보다 우수한 형광 강도 정량 분석을 가능하게 하기 위해 각 웰에 대해 4-5개 필드를 획득하고 Harmony®(PerkinElmer Inc.) 소프트웨어에서 분석 및 정량화를 수행했다.
세척 실험을 위해 세포를 이전에 설명한 대로 플레이팅하고 18-24시간 동안 KRASG12C 억제제로 처리했다. 하나의 플레이트는 24시간 후에 대조군으로 이미징되었고 다른 플레이트는 차가운 1X PBS로 2회 세척되었으며, 150mL의 완전한 무화합물 배지와 함께 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션되고 위에서 설명한 대로 염색 및 이미징되었다.
1A5 및 iDab6(Tanaka, T. 외, EMBO J 2007; 26:3250-3259) 항체를 병용하여 동일한 세포 내에서 알킬화된 그리고 알킬화되지 않은 KRasG12C를 동시 염색하고 시각화할 수 있는지 여부를 테스트했다. 면역형광(IF) 실험은 1A5 항-KRas 항체와 iDab6 항체를 모두 사용하여 ARS-1620의 용량 적정으로 처리된 H1171 세포로 수행되었다. 1A5를 사용한 이전 IF 실험과 유사하게, 고농도 ARS-1620 처리와 상관관계가 있는 1A5 염색의 증가가 검출되었다. 대조적으로, 1A5 염색의 증가는 iDab6 항체에 의한 염색 감소와 일치하였다(도 3C).
두 항체를 이용하여 동시 염색하면 KRasG12C의 재합성을 모니터링할 수 있다. KRasG12C 세포를 ARS-1620으로 16시간 처리하면 IF 및 면역블롯 분석시 KRasG12C가 거의 완전히 알킬화되었다(도 2D). 약물을 세척했을 때, 24시간시에 알킬화되지 않은 KRasG12C가 보이기 시작하며(도 2D), 이는 1A5 항-KRas 항체의 감소 및 iDab6 항체 염색의 증가와 일치하였다.
따라서, 1A5 항-KRas 항체를 사용하여 KRasG12C 알킬화를 연구하고 세포에서 KRasG12C-GDP를 추적할 수 있다.
실시예 7: 고 및 저 KRas G12C 발현 마우스 모델에서 ARS-1620 처리에 따른 알킬화된 KRas G12C 의 용량 의존적 생체내 검출
다음 실시예는 마우스 모델에서 생체내 KRasG12C에 대한 항-KRas 항체의 결합을 기재한다.
재료 및 방법
생체 내 종양 연구. 16-17주령이고 체중이 24-27g인 암컷 C.B-17 SCID(근친교배) 마우스를 Charles River Lab로부터 입수하였다. 왼쪽과 오른쪽 옆구리에 500만 개의 NCI-H358 비소세포 폐암종 세포(Matrigel을 1:1 비율로 포함하는 Hank 균형 염 용액의 1:1 혼합물에 현탁)를 피하 접종했다. 400-600 mm3의 평균 종양 부피에 도달할 때까지 종양을 모니터링하였다. 마우스에게 0(비히클 - 100% Labrasol), 50 또는 200mg/kg의 ARS1620을 경구(PO)로 100μL의 부피의 위관영양법으로 단일 용량으로 제공했다. 혈장 및 종양 샘플을 투여 후 8 또는 24시간에 수집하였다.
생체 내 FAC 분석. 종양 약력학을 평가하기 위해, 수확된 종양들을 GentleMACS™ 세포분리기(Miltenyi Biotec)를 사용하여 리버라제(Liberase) DL(0.2U/ml, Sigma-Aldrich) 및 DNase I(40U/ml, Sigma-Aldrich)로 37℃에서 30분 동안 분해시켰다. 단일 세포 현탁액을 준비하고 EpCAM(클론 EBA1, BD Biosciences) 및 고정가능 생존성 염료(ebioscience)에 대해 4℃에서 30분 동안 염색하고 세척했다. 세포들을 Cytofix 완충액(BD Biosciences)으로 4℃에서 30분 동안 고정하고 Perm/Wash 완충액(Perm/Wash buffer)(BD Biosciences)으로 세척했다. 1A5-488, pS6(클론 N7-548, BD Biosciences)에 대해 4℃에서 60분 동안 세포내 염색을 수행하고 펌 세척 완충액으로 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 세포들을 BD Symphony FACS 기기에서 분석하였다. 데이터는 GraphPad 프리즘 소프트웨어 버전 7(GraphPad, San Diego, CA); Flowjo 10.5.3(FlowJo, BD, CA)을 사용하여 분석되었다.
알킬화된 KRasG12C는 신선 동결(FP) 조직으로 제조된 종양 샘플에서 쉽게 검출될 수 있었다(도 4A). 더 적은 양의 알킬화된 KRasG12C를 발현하는 종양들 또한 1A5 항-KRas 항체에 의해 검출되었다(도 4B). 시험관내 세포 실험과 유사하게, 1A5 항-KRas 항체 또한 생체외 종양 샘플에서 FACS 실험에서 알킬화된 KRasG12C를 검출할 수 있고 MAPK 마커 pS6을 사용하여 다중화될 수 있다(도 4C). 이러한 결과는 1A5 항-KRas 항체가 KRasG12C 종양 샘플에서 KRasG12C 억제제의 직접적인 표적 결합을 측정하고 RAS 경로 활성화 마커를 사용한 다중 분석을 가능하게 한다는 것을 보여준다.
다음 실시예는 알킬화-유도된 KRas 비알킬화 KRasG12C를 인식하는 선별된 클래스 II 항-KRas 항체(예를 들어, 2H11)의 능력이 포켓에서 소분자 화합물 결합에 대한 친화도를 개선하기 위해 사용될 수 있는지 여부를 테스트하는 실험을 기재한다.
실시예 8: 선별된 항-KRas 항체는 KRas G12C 및 KRas WT 에 대한 SWII 리간드 친화도를 향상시킨다
재료 및 방법
2H11 항-KRas 항체를 이용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 실험. 시리즈 S SA(스트렙타비딘) 칩을 Biacore T200(GE Health Sciences)에 삽입하였다. 이 기기를 실행 완충액(50mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl, 0.2%(w/v) PEG-3350, 0.1% CM-덱스트란(w/v), 0.1mM TCEP, 10mM MgCl2, 100nM GDP 및 2%(v/v) DMSO)으로 프라이밍했다. KRasG12C는 공유 결합으로 12번 위치에서 사전 차단되었다. KRasG12C 알킬화기를 포획하여 KRasWT 및 KRasG12C에 대한 참조 역할을 하고 스위치 II(SWII) 포켓에서만 친화도 측정을 허용하는 흐름 채널 1(FC1) 및 FC3에서 2000-2500 반응 단위(RU)를 생성하였다. KRasWT 또는 KRasG12C는 FC2 및 FC4에서 참조 채널 포획 수준의 100RU 이내로 포획되었으며 데이터는 FC 2-1, FC 4-3 모드에서 수집되었다. 모든 채널은 이후에 100μg/mL 아민-PEG-비오틴(Thermo Fisher)을 주입하여 차단되었다. 실험 시작 시 2H11을 120초 동안 200nM로 2회 주입하여 FC3 및 FC4를 포화시켰고, 실험 전체에 걸쳐 100nM로 14주기마다 주입하여 완전히 점유되게 하였다. 분석 샘플을 20-30초 접촉 시간 및 30초 해리하여 2배 용량 반응에서 50 3M - 1.75 3M을 테스트했다. 데이터는 Biacore S200 평가 소프트웨어 1.0에서 1:1 친화도 모델로 분석되었고 수치들은 Scrubber 2(Biologic Software)에서 작성되었다(도 5A 및 5B).
SWII 차단 참조를 사용하여 SWII 포켓에 대한 결합을 특이적으로 검출하기 위한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석이 개발되었다. 2H11 항-KRas 항체의 존재 및 부재 시 KRasG12C-GDP를 사용하여, 다양한 SWII 공유 분자(즉, GNE-1952, ARS-853, ARS-1620) 및 아크릴아미드 기능이 없는 GNE-1952 버전의 친화도를 테스트했다. 또한 2H11이 다른 KRas 변이체들에서 SWII 포켓을 안정화할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 KRasWT-GDP가 포함되었다. 2H11 항-KRas 항체의 존재시 친화도가 크게 향상되었다(도 5A 및 5B). 2H11 항-KRas 항체는 화학적으로 다양한 KRasG12C 알킬화기의 친화도를 증가시켰으며, 이로부터 이 항체는 하나의 특정 화학형으로 편향되지 않았음이 추가로 확인되며 리간드가 없을 때 SWII 포켓의 개방 형태를 안정화할 수 있음을 시사한다.
실시예 9: 항-KRas 항체:KRas G12C 복합체의 결정 구조
다음 실시예는 항-KRas 항체들이 있는 복합체에서 KRasG12C의 결정 구조의 결정을 기재한다.
재료 및 방법
KRas G12C 단백질 발현 및 정제. 시스테인 돌연변이(S39C, C51S, C80L, C118S)가 있거나 없는 N-말단 His-태그된 KRasG12C(1-169) 구조체들을 pET-52b 벡터에 클로닝하고 BL21(DE3) 세포들로 형질전환시켰다. 세포를 50μg/mL의 카르베니실린을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 0.5의 OD600 흡광도까지 성장시킨 다음, 16℃가 되게 한 후 0.8의 OD600 흡광도에서 0.3mM IPTG로 유도하였다. 세포를 유도 후 16시간에 수확하고 펠렛을 50mM Hepes pH 8.0, 500mM NaCl, 5mM MgCl2, 10mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 1mM TCEP, 1mM PMSF, 벤조나제 및 EDTA가 없는 프로테아제 억제제를 함유하는 완충액에서 미세유동화기를 통과시켜 용해시켰다. 세포 용해물을 12,000K에서 1시간 동안 원심분리하여 정제하였다. 정제된 세포 용해물들을 20mM Hepes pH 8.0, 300mM NaCl, 10% 글리세롤, 5mM MgCl2, 1mM TCEP를 함유하는 완충액에서 HiTrap 컬럼에 로딩하고 결합된 KRas 단백질을 300mM 이미다졸로 용리했다. N-말단 His-태그를 TEV 프로테아제와 함께 인큐베이션하여 절단하고 니켈 컬럼을 통해 제거하였다. KRas 단백질은 20mM Hepes pH 8.0, 150mM NaCl, 5mM MgCl2의 완충액에서 크기 배제 S75 컬럼(GE Healthcare)에 의해 폴리싱되었다. KRas의 순도는 SDS-PAGE에 의해 분석된 바와 같이 95% 이상이다. KRas에 GDP를 로딩하기 위해, KRas를 먼저 40mM EDTA 및 2mM GDP와 함께 20℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 완충액을 무-EDTA 및 무-뉴클레오티드 완충액으로 교환했다. 그런 다음 KRas 및 2H11 Fab를 1:1로 복합화하고 20mM Hepes pH 8.0, 150mM NaCl, 5mM MgCl2의 완충액에서 크기 배제 S75 컬럼에 의해 추가로 정제했다.
GNE-1952에 의한 KRas G12C 단백질 알킬화. GNE-1952로 KRas를 알킬화하기 위해, KRasG12C를 20mM Hepes pH 8.0, 150mM NaCl, 10% 글리세롤 및 2mM TCEP의 완충액에서 5mM GDP, 20mM EDTA 및 150uM GNE-1952와 함께 20℃에서 밤새 인큐베이션했다. 완전한 알킬화는 질량 분석을 통해 질량 변화를 관찰함으로써 확인되었다. KRas는 크기 배제 S75 16/60 컬럼에 의해 20mM Hepes pH 7.0, 150mM NaCl 및 10% 글리세롤의 완충액으로 완충액 교환되었다. 그런 다음 KRas G12C 및 2H11 Fab를 1:1로 복합화하고 20mM Hepes pH 8.0, 150mM NaCl의 완충액에서 크기 배제 S75 컬럼에 의해 추가로 정제했다.
KRas G12C 및 2H11 Fab의 결정화. KRasG12C/2H11의 회절 품질 결정은, 0.1M 소듐 카코딜레이트 pH 6.5, 40% 2-메틸 2,4-펜탄디올(MPD), 7% Peg 8000, 0.5% 에틸 아세테이트, 10mM 스페르민 테트라하이드로클로라이드의 결정화 완충액에 대해 10mg/mL KRas 및 24mg/mL 2H11 Fab를 포함하는 1.0μL + 1.0μL 증기 확산 침전 방울들로부터 19℃에서 성장되었다. 결정은 2주만에 나타났고 일반적으로 150 x 20 x 30 μM으로 성장했다.
KRasG12C/GNE-1952/2H11의 회절 품질 결정들은 0.1 M MES pH 6.0, 21% Peg 4K 및 0.2M 리튬 설페이트의 결정화 완충액에 대해 15 mg/mL의 KRas/2H11 복합체를 포함하는 1.0 μL + 1.0 μL 증기 확산 침전 방울들로부터 19℃에서 성장되었다. 결정은 10일만에 나타났고 100 x 15 x 30μM의 크기로 성장했다.
KRasG12C/GNE-1952 결정은 0.10% n-옥틸-BD-글루코시드, pH 5.5의 0.1M 소듐 시트레이트, 22% PEG 3350의 결정화 완충액에 대해 KRasG12C/GNE-1952를 포함하는 1.0μL + 1.0μL 증기 확산 침전 방울들로부터 19℃에서 성장되었다.
회절 데이터 수집을 준비하기 위해, 위의 세 가지 경우에서 결정들을 급속 동결하기 전에 결정화 완충액에 10% 글리세롤을 동결완충제(cryobuffer)로 첨가했다.
회절 데이터 수집 및 구조 결정.
KRasG12C/GNE-1952, KRasG12C/2H11 및 KRasG12C/GNE-1952/2H11 결정의 회절 데이터는 PILATUS3 6M 검출기를 사용하는 스탠포드 싱크로트론 방사 광원(Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SSRL) 빔라인 또는 어드밴스드 광원 (Advanced Light Source, ALS) 빔 라인 5.0.2의 단색 X선을 사용하여 수집되었다. 완전한 데이터 세트 각각에 대해 단일 결정에 회전 방법을 적용했다. 결정은 데이터 수집 과정 전반에 걸쳐 극저온으로 유지되었다. 데이터 축소는 프로그램 XDS(Kabsch, W., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 2010; 66:125-132) 및 CCP4 CCP4 프로그램 제품군(A.J. McCoy 외, Journal of applied crystallography 2007; 40: 658-674)을 사용하여 수행되었다.
데이터 축소 통계를 표 7에 나타낸다. 표 7에서 괄호 안의 값은 가장 높은 분해능 쉘의 값이고, Rsym = Σhi - Ih|/Σhi (여기서 Ihi는 반사 h의 i번째 대칭 관련 관찰값의 스케일링 강도이고 Ih는 평균값임), Rcryst = Σh|Foh - Fch| /ΣhFoh(Foh 및 Fch는 반사 h에 대해 관찰 및 계산된 구조 인자 진폭임)이고 Rfree 값은 미세 조정에 포함되지 않은 무작위로 선택된 5% 반사에 대해 계산된다.
표 7: 결정학 통계
Figure pct00018
상기 구조들을 프로그램 Phaser를 사용하여 분자 치환법(MR)에 의해 단계화하였다 (A.J. McCoy 외, Journal of applied crystallography 2007; 40: 658-674). 이전에 공개된 KRasG12D의 결정 구조(PDB 코드 4DSU) 및 Fab 구조 Fab 구조(PDB 코드 3R1G)를 MR 검색 모델로 사용했다. 그래픽 프로그램 COOT로 수동 재구축을 수행했다 (P. Emsley, K. Cowtan, Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 2004; 60:2126-2132). 상기 구조들은 프로그램 REFMAC5 (G.N. Murshudov, A.A. Vagin, E.J. Dodson, Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 1997; 53:240-255) 및 PHENIX (P.D. Adams 외, Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 2010; 66:213-221) 최대 가능도 목표 함수, 이방성 개별 B-인자 정련 및 TLS 정련을 사용하여 반복하여 추가 정련되었으며 표 7에 나타낸 최종 통계에 도달하였다.
2H11 항-KRas 항체의 독특한 작용 방식에 대한 더 많은 통찰력을 얻기 위해, 2H11 Fab와 복합체를 형성하는 KRasG12C-GDP의 결정 구조를 2.2Å 분해능에서 결정하였다(도 6A). 2H11은 SWII의 외부 표면으로부터 KRasG12C에 접근하고 SWII 포켓의 개방 형태를 안정화한다. Fab 결합은 ~745Å2의 표면적을 보유하며 모양 상보성 점수는 0.64이다. 에피토프는 SWI, SWII 및 중심 코어 베타 시트의 잔기로 구성된다. 2H11 상보성 결정 영역(CDR) H1 및 H3은 KRasG12C에 대한 대부분의 직접 접촉에 원인이 된다(도 6B). 13개 잔기의 긴 H3 루프는 SWII 영역에 결합한다. 에피토프의 중심에서, HC.Trp99는 KRasG12C 잔기 Lys5, Leu6, Val7, Ser39, Asp54, Leu56, Tyr71, Thr74, Gly75로 둘러싸인 작은 소수성 포켓에 고정된다(도 6C). 이 포켓은 SOS 의존성 뉴클레오티드 교환을 억제하는 소분자를 함유하는 인돌에 결합하는 것으로 이전에 발견되었다(T. Maurer 외, Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109:5299-5304; Q. Sun 외, Angew Chem Int Ed Engl 2012; 51:6140-6143). 흥미롭게도 항체는 화학적으로 유사한 트립토판 측쇄가 있는 이 부위를 이용했다. CDRH1은 Ras-결합 도메인(RBD) 결합 부위의 일부에 대해 패킹함으로써 SWI 영역 부근에 결합한다. iDab6과 달리, 2H11은 SWI 잔기와 거의 직접 접촉하지 않으므로(도 6F), 따라서 결합된 뉴클레오티드 유형에 덜 민감하였다. CDR L2와 H2는 소수의 반 데르 발스 접촉을 만들어 KRas 인식에 참여한다. L2는 SWII 나선의 C-말단 팁에 닿아 SWII 루프에 추가적인 안정화를 제공하지만 형태를 과도하게 제한하지 않기 때문에 특히 흥미로웠다. 도 6E에서 보는 바와 같이. SWII의 가장 유연한 부분인, Gln60-Ala66은 2H11과의 직접적인 접촉이 전혀 없었기 때문에 SWII 포켓에서 다양한 리간드의 결합을 허용하는 특정 수준의 형태적 유연성을 유지한다. 예를 들어, KRasG12C-GDP/2H11 복합체 구조와 GNE-1952 결합된 KRasG12C-GDP 구조의 비교(도 6D) 결과 안정화된 SWII 포켓이 억제제를 수용하기에 충분히 개방되어 있었고 SWII의 유연성은 리간드를 완전히 감싸도록 안쪽으로 약간의 폐쇄를 허용함을 나타낸다. 이 가설을 검증하기 위해 GNE-1952 알킬화된 KRasG12C와 복합체를 형성하는 2H11의 결정 구조가 결정되었다. GNE-1952의 존재는 실제로 SWII 잔기에서 주쇄 및 측쇄 형태의 변화와 관련되어 있는 반면(도 6C), 나머지 KRas 및 Fab CDR 구조는 일정하게 유지된다. 중요한 측쇄 플립은 화합물 결합 시 His95에서 발생하며, 이는 퀴나졸린 질소와 수소 결합을 형성한다. 이 상호작용은 퀴나졸린 스캐폴드 화합물에 대해 일반적인 것으로 보이며 2H11 Fab 결합에 의해 변경되지 않았다(MP Patricelli 외, Cancer Discov 2016; 6:316-329).
실시예 10: 선별된 항-KRas 항체의, 다른 KRas 돌연변이체로의 확장
다음 실시예는 선별된 항-KRas 항체가 다양한 KRas 돌연변이체에 결합하는 능력을 기재한다.
재료 및 방법
알킬화된 KRas G12C 에 대한 항체 ELISA. 비오티닐화된 KRasG12C-GDP + GNE-1952 및 KRasG12C-GDP를 뉴트라비딘(NeutrAvidin) ELISA 플레이트(Thermo Scientific)에 PBS 중의 0.3μg/mL로 삼중으로 4℃에서 밤새 코팅했다. 플레이트를 PBSBT로 세척하고 10 μg/mL에서 시작하는 항-KRas 항체의 연속 희석액을 25℃에서 1-2시간 동안 진탕하면서 첨가하였다. 세척 후, 종 매칭된 Fc-특이적 HRP 2˚항체를 25℃에서 1시간 동안 진탕하면서 첨가하였다. PBSBT로 세척한 후 플레이트를 TMB 기질로 5분 동안 전개시키고 650nm에서 검출했다.
돌연변이체 KRas-GDP 단백질에 대한 항체 ELISA. KRas-GDP 단백질은 4℃에서 밤새 PBS의 Maxisorb 플레이트(Thermo Scientific)에서 10μg/mL로 삼중으로 직접 코팅되었다. 플레이트들을 4% BSA를 사용하여 25℃에서 2시간 동안 차단시켰다. 10 μg/mL에서 시작하는 1A5 및 2H11 항체의 연속 희석액을 25℃에서 1-2시간 동안 진탕하면서 첨가했다. 플레이트를 위에서 설명한 대로 전개하고 판독했다.
또한 2H11이 GDP 결합 상태를 인지하여 KRasG12C 이외의 KRas 돌연변이체에서 SWII 영역의 개방 형태를 잠재적으로 안정화할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, KRas 돌연변이체 패널에 대한 항체 1A5 및 2H11의 결합을 ELISA에 의해 평가하였다(도 7). 상당히 놀랍게도, 2H11은 KRasG12V-GDP, KRasG12R-GDP, 및 KRasQ61H-GDP에 대하여 강한 결합을 나타내었고, KRasG13D-GDP 및 KRasWT-GDP에 대하여는 훨씬 약한 결합을 나타냈다(도 7). 2H11 항-KRas 항체가 여러 KRas 돌연변이체에 결합하고 SWII 포켓 결합제의 친화도를 증가시킬 수 있다는 점을 감안할 때, 이는 다른 RAS 돌연변이체를 표적으로 하는 새로운 리간드의 식별을 가능하게 할 수 있다.
실시예 11: 표적 및 CLAMP 동시 포획을 사용한 CLAMP 협동성 SPR 분석
BIACORE S200(GE Healthcare Life Sciences)의 분석 온도를 20º로 설정하고 시리즈-S SA 센서 칩(즉, 스트렙타비딘이 사전 코팅된 하이드로겔 코팅 감지 칩)을 도킹했다. 이 시스템을 50mM(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), pH 7.5; 150mM NaCl; 0.2% 폴리에틸렌 글리콜(3350 Da의 평균 분자량), 0.1% 카르복시메틸화-덱스트란; 10mM 마그네슘 클로라이드, 100nM 뉴클레오티드(GDP, GTP 또는 뉴클레오티드 유사체), 0.1mM(트리스(2-카르복시에틸)포스핀)을 함유하는 분석 완충액으로 3회 프라이밍하였다. 비오티닐화된 돌연변이체 KRas(즉, KRasG12V-GDP, KRasG12D-GDP, KRasG12R-GDP 및 KRasG13D-GDP)가 재조합으로 발현되었고 인하우스 그리고 주어진 돌연변이체 KRas에 대해 정제되고, 100-500 nM 범위 내의 최종 농도를 제공하도록 분석 완충액에서 희석되었다. 다음으로 이 돌연변이체 KRas 샘플을 감지 채널을 통해 주입하여 2000RU에서 3000RU 범위의 포획 밀도를 제공한다. 이것은 광학적으로 조사된 하이드로겔 부피 내부에서 ~0.9-1.5mM의 하이드로겔 농도와 동일하다. 참조 감지 채널을 제공하기 위해 두 번째 감지 채널은 코팅되지 않은 채로 남겨 두었다. 1 μM 비오틴을 주입하여 비어 있는 과량의 비오틴 부위를 포화시켰다.
SWII 포켓 결합 화합물인 테스트 화합물의 10mM 스톡(디메틸설폭사이드에 용해)으로부터 얻은 일련의 9배 희석액을 0.039 내지 10μM 농도 범위를 제공하는 희석제로서 분석 완충액을 사용하여 준비했다. 각 샘플과 실행 완충액의 디메틸설폭사이드 농도는 1%(v/v)로 일치했다. 테스트된 모든 화합물에 대해 이러한 방식으로 희석액 세트를 제조했다. 용매 보정 표준을 제공하기 위해 다양한 농도의 디메틸설폭사이드 농도를 함유하는 분석 완충액으로부터 제조된 일련의 6개 샘플을 제조했다. 각 희석 시리즈는 저농도로부터 고농도까지 모든 감지 채널에 걸쳐 100μL/분으로 10초 동안 주입되어 전체 용량 반응을 포함하는 단일 주기를 생성했다. 먼저 코팅되지 않은 감지 채널의 주기를 뺀 다음 화합물을 포함하지 않은 샘플인 바탕 단일 주기를 뺌으로써, 주기를 이중 참조했다. 각 화합물 주입 시리즈에 대해 바탕 주입 주기가 후속되었는데, 이는 근방의 이웃 바탕들을 바탕 선택에 사용할 수 있게 한다.
데이터를 Biaevaluation 소프트웨어(GE Healthcare Life Sciences)로 내보내고 상호작용 상수들을 얻기 위해 동역학적 모델 피팅을 수행했다. 단일 화합물에 대한 데이터를 도 8에 나타낸다. 이 분석은 2H11 Fab를 사용하지 않고 수행되었으므로 친화도의 협동적 증폭없이 KRasG12V-GDP에 대한 화합물 결합에 관한 상호작용 상수들을 반환했다.
도 8에서 보는 바와 같이, 화합물의 농도가 증가하면 KRasG12V-GDP 코팅된 표면의 포화에 접근하는 용량 의존적 반응이 나타났다. 단일 부위 유사일차 반응속도식을 핏팅하여 3.29 x 105(1/Ms)의 k on , 1.3(1/s)의 k off 및 ~4 μM의 K D 를 제공하였다. 피팅된 모델 곡선이 실험 반응 주기에 잘 중첩되어 있음을 관찰할 수 있다.
2H11 Fab의 공동 협동성 증강 인자를 결정하기 위해, KRas 돌연변이체(들)의 포획 후 비오틴 차단 전에 2H11-Fab-비오틴 포획 단계를 포함시켜 상기 분석을 반복하였다.
결합 반응이 대략적인 안정기에 도달할 때까지 2H11-Fab-비오틴을 200nM에서 주입하여 사전 코팅된 돌연변이체 KRas-표면에서 동시 포획된 ~2500-3000RU(0.5mM Fab)의 2H11을 생성했다. 이것은 1:2의 2H11 Fab:KRas 몰 비율을 나타내며 약한 결합 부위(즉, 2H11 Fab가 결합되지 않은 KRas) 및 높은 친화도 결합 부위(즉, KRas-2H11 Fab 복합체)를 동일한 분율로 효과적으로 생성한다. 화학량론적 등가물을 생성하기에 충분한 Fab 또는 과량의 Fab를 동시 포획하여 균질한 KRas-2H11 Fab 복합체가 생성되었으며 추가 최적화가 가능했다.
분석은 위에서 설명한 대로 수행되었지만, 1:1 모델은 2-부위 부위 결합 모델(이종 리간드)로 대체되었는데, 이는 도 9에서 보는 바와 같이, 이들 2개 부위들 모두의 동역학 및 친화도를 단일 주기 동역학 곡선에 대한 피팅으로부터 결정할 수 있게 한다. 도 9에 도시된 바와 같이, 화합물의 농도 증가는 2상 용량 의존적 반응을 초래하였다. 2-부위 유사 일차 반응속도식이 데이터에 피팅되었으며 고친화도 부위에 대한 상호작용 상수들이 6.6 x 105(1/Ms)의 k on , 0.025(1/s)의 k off 및 ~0.04μM의 KD로서 반환되었다. 피팅된 모델 곡선이 실험 응답 주기에 잘 중첩되어 있음을 관찰할 수 있다. 고 친화도 안정화된 SWII 부위에 대한 화합물 결합은 각 주입이 끝날 때 더욱 느린 해리 단계 곡률로부터 쉽게 식별되며, 이는 더 안정적인 복합체를 나타낸다. 약한 친화도의 안정화되지 않은 SWII 부위에 대한 결합은 중첩된 것으로 보이지만 빠르게 해리된다. 예상대로, 더 높은 친화도의 안정화된 SWII KRas에 대한 결합은 낮은 농도에서 포화되는 반면, 안정화되지 않은 약한 친화도 부위에 대한 결합은 가장 높은 10μM의 테스트 농도에서 조차도 불포화 상태를 유지한다. SWII 결합 화합물들을 선별하기 위해 이 분석을 반복하였다. 협동 인자들은 안정화된:안정화되지 않은 SWII 결합에 대한 K D 비율로 표현되었고, 도 10은 화합물 선별을 위한 협동 인자들을 요약한다.
도 8에서 각 주입의 시작과 끝에서의 곡률은 동역학 정보를 포함하고 동역학 속도 상수를 정의하는 데 도움이 되며 각 주입 중간의 안정기 영역은 각 용량에서 평형 반응을 정의한다. 1:1 유사 일차 반응속도식을 중첩된 것으로 표시된 데이터에 피팅하여, 결합 속도 상수, 해리 속도 상수 및 친화도 상수를 얻었다.
비-공동 포획 SPR에서, 항체는 테스트할 화합물에 노출되기 전에 사전에 결합될 수 있고 표적-코팅된 센싱 표면에 주입될 수 있는데, 여기서 농도와 접촉 시간 모두는 본원에 기재된 항체가 완전히 포화(즉, 본질적으로 결합되지 않은 대상이 남아 있지 않음) 될 수 있도록 선택된다. 그러나 이 접근 방식에는 단점이 있다. 높은 표적 농도에서는 화학양론적 등가 (예를 들어, 표적당 하나의 Fab 팔) 농도의 전체 크기 항체(150kDa)를 표적-코팅된 하이드로겔 내부에 로딩할 수 없었다. 이러한 로딩 제한은 과밀화 및 분자 크기 배제, 등전점, 정전기, 하이드로겔 사슬 밀도 및 표적 밀도의 복잡한 상호작용으로 인한 하이드로겔 배제 효과의 결과일 수 있다.
스크리닝 및 화합물 결합 특성화를 위한 바이오센서 기반 분석은 일반적으로 완료까지 몇 시간 또는 그 이상을 필요로 하며, 이 시간 동안 항체는 표면으로부터 연속적으로 흐르는 완충액 스트림으로 자유롭게 해리된다. 따라서 표면을 재포화하기 위해 항체의 주기적인 주입이 필요하다. 항체 KRas 복합체가 상대적으로 짧은 반감기(예를 들어, < 15분)를 갖는 경우 주기적인 재포화는 비실용적이며, 기껏해야 분석하는 동안 매우 가변적인 점유상태를 생성할 뿐이다. 따라서, 본원에 설명된 공동 포획 기술은 상호 작용 및 화합물 친화도를 결정하는 데 더 효율적이고 더 우수하다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> KRAS SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> P35630-WO <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/018,356 <151> 2020-04-30 <160> 110 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Leu Gln Asp His Asp Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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410 415 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 420 425 <210> 109 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 109 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly 1 5 10 15 Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val 20 25 30 Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln 35 40 45 Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg 50 55 60 Lys Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Ser Leu Leu Asp Ile Leu Asp 65 70 75 80 Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg 85 90 95 Thr Gly Glu Gly Phe Leu Leu Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser 100 105 110 Phe Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp 115 120 125 Ser Glu Asp Val Pro Met Val Leu Val Gly Asn Lys Ser Asp Leu Pro 130 135 140 Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr 145 150 155 160 Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp 165 170 175 Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys 180 185 190 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 210 215 220 Lys Pro Pro Gly Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser 225 230 235 240 Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys 245 250 255 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr 260 265 270 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys 275 280 285 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 290 295 300 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ser Ser Trp Tyr Asp Leu Gly Pro 305 310 315 320 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 325 330 335 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 340 345 350 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 355 360 365 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 370 375 380 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 385 390 395 400 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 405 410 415 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 420 425 430 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 435 440 <210> 110 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 110 Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg 1 5 10 15 Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser 65 70 75 80 Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Glu Arg Leu Ser 85 90 95 Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215

Claims (81)

  1. 인간 KRas에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며,
    GTP에 결합된 KRas(KRas-GTP)보다 GDP에 결합된 KRas(KRas-GDP)에 더 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 인간 KRas에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며,
    GDP에 결합된 KRas(KRas-GDP)보다 GTP에 결합된 KRas(KRas-GTP)에 더 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, KRas 알킬화된 형태 특이적 항체인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 1-3 중 어느 한 항에 있어서, SWII 포켓을 개방하여 안정화시키는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 인간 KRas는 KRasG12C, KRasG12V, KRasG12R, KRasQ61H, KRasG12D, 및 KRasG13D로 이루어진 군으로부터 선택된 KRas 돌연변이체인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 청구항 5에 있어서, 인간 KRas는 KRasG12C, KRasG12V, KRasG12D, 및 KRasG13D로 이루어진 군으로부터 선택된 KRas 돌연변이체인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 청구항 6에 있어서, KRas 돌연변이체는 KRasG12C인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 청구항 7에 있어서, KRasG12C-GDP는 KRasG12C 특이적 공유 억제제로 알킬화되는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 청구항 8에 있어서, MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157로 알킬화된 KRasG12C-GDP에 결합하는 알킬화된 형태 특이적 KRas 항체인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 청구항 1-9 중 어느 한 항에 있어서, KRas 돌연변이 단백질의 SWII 포켓을 안정화시키는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY (서열번호 9)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 RNNQRPS (서열번호 10)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 AAWDERLSGWV (서열번호 11)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SSNWWS (서열번호 12)를 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS (서열번호 13)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 GSSSWYDLGPFDY (서열번호 14)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 청구항 11에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 서열번호 9를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 서열번호 10을 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 서열번호 11을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 서열번호 13을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 서열번호 14를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 청구항 13에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 및 서열번호 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 RASQGIRNDLG (서열번호 1)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 AASSLQS (서열번호 2)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 LQDHDYPLT (서열번호 3)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYSMN (서열번호 4)을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG (서열번호 5)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 GFYVRNWFDP (서열번호 6)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 청구항 15에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 RASQGISSYLA (서열번호 17)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 AASSLQS (서열번호 18)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 QQYYSYPFT (서열번호 19)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYAMS (서열번호 20)를 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 AISSSGSSTYYADSVKG (서열번호 21)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 DQGGYGYPGESWFDY (서열번호 22)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 청구항 17에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 RASQSISSYLN (서열번호 25)을 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 AASSLQS (서열번호 26)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 QQSYSPPWT (서열번호 27)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYSMN (서열번호 28)을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG (서열번호 29)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 AFYSYMDV (서열번호 30)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 청구항 19에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 RSSQSLLHSNGYNYLD (서열번호 33)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 LGSNRAS (서열번호 34)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 MQALQTPLT (서열번호 35)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SSNWWS (서열번호 36)를 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 EIYHSGSTNYNPSLKS (서열번호 37)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 ERTILTGYYGFDY (서열번호 38)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 청구항 21에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS (서열번호 41)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 DNNKRPS (서열번호 42)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 GTWDSSLTGYV (서열번호 43)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYAIS (서열번호 44)를 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG (서열번호 45)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV (서열번호 46)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 청구항 23에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVY (서열번호 81)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 RNNQRPS (서열번호 82)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 AAWDDSLSGWV (서열번호 83)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYSMN (서열번호 84)을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG (서열번호 85)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 SFGPYAFDV (서열번호 86)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 청구항 25에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS (서열번호 49)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 DNNKRPS (서열번호 50)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 GTWDSSLTGWV (서열번호 51)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYAIS (서열번호 52)를 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 GIIPIFGTANYAQKFQG (서열번호 53)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 YYDFWSGYPGGLFDV (서열번호 54)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 청구항 27에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS (서열번호 57)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 GKNNRPS (서열번호 58)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 NSRDSSGNHWV (서열번호 59)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYSMN (서열번호 60)을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG (서열번호 61)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 TNNYGYRYFDY (서열번호 62)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 청구항 29에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS (서열번호 65)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 GKNNRPS (서열번호 66)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 NSRDSTDNHLWV (서열번호 67)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYSMN (서열번호 68)을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 SISSSSSYIYYADSVKG (서열번호 69)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 ATSSGYYYFDY (서열번호 70)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 청구항 31에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 아미노산 서열 SGSSSNIGNNYVS (서열번호 73)를 포함하는 CDR-L1,
    (ii) 아미노산 서열 DNNKRPS (서열번호 74)를 포함하는 CDR-L2, 및
    (iii) 아미노산 서열 GTWDNSLSVWV (서열번호 75)를 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (b) (i) 아미노산 서열 SYSMN (서열번호 76)을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 아미노산 서열 YISSSSSTIYYADSVKG (서열번호 77)를 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 아미노산 서열 GKGIVGWGFFGMDV (서열번호 78)를 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 청구항 33에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하고,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 인간 KRas-GDP에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 인간 KRas의 아미노산 W99, K5, L6, V7, S39, D54, L54, Y71, T74 및/또는 G75에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  36. 인간 KRas-GTP에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 인간 KRas의 아미노산 W99, K5, L6, V7, S39, D54, L54, Y71, T74 및/또는 G75에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  37. 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 단리된 핵산(들).
  38. 청구항 37의 핵산(들)을 포함하는 벡터.
  39. 청구항 28의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  40. 청구항 1-36 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 표지에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  41. KRas-GDP에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법이며,
    상기 항체를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건하에 청구항 36의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  42. KRas-GTP에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법이며,
    상기 항체를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건하에 청구항 36의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  43. KRasG12C-GTP보다 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법이며,
    (a) 항체 라이브러리를
    i) KRasG12C-GDP,
    ii) KRasG12C 특이적 공유 억제제로 알킬화된 KRasG12C-GDP, 및
    iii) 비가수분해성 GTP 유사체에 결합된 KRasG12C
    와 접촉시키는 단계, 및
    (b) 비가수분해성 GTP 유사체에 결합된 KRasG12C보다 알킬화 KRasG12C-GDP 및 비알킬화 KRasG12C-GDP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 선별하는 단계
    를 포함하는 방법.
  44. KRasG12C-GDP보다 KRasG12C-GTP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법이며,
    (a) 항체 라이브러리를
    i) KRasG12C-GTP,
    ii) KRasG12C 특이적 공유 억제제로 알킬화된 KRasG12C-GTP, 및
    iii) 비가수분해성 GDP 유사체에 결합된 KRasG12C
    와 접촉시키는 단계, 및
    (b) 비가수분해성 GDP 유사체에 결합된 KRasG12C보다 알킬화 KRasG12C-GTP 및 비알킬화 KRasG12C-GTP에 더 높은 친화도로 결합하는 항체를 선별하는 단계
    를 포함하는 방법.
  45. 청구항 43 또는 청구항 44에 있어서, 라이브러리는 합성 파지 라이브러리인 방법.
  46. 생물학적 샘플 내 KRas-GDP를 검출하는 방법이며,
    생물학적 샘플을 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  47. 청구항 46에 있어서,
    생물학적 샘플을 KRas-GTP에 결합하는 항체와 접촉시키는 단계
    를 추가로 포함하고,
    KRas-GDP의 양 및 KRas-GTP의 양이 결정되는 것인 방법.
  48. 생물학적 샘플 내 KRas-GTP를 검출하는 방법이며,
    생물학적 샘플을 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  49. 청구항 46에 있어서,
    생물학적 샘플을 KRas-GDP에 결합하는 항체와 접촉시키는 단계
    를 추가로 포함하고,
    KRas-GTP의 양 및 KRas-GDP의 양이 결정되는 것인 방법.
  50. 검출가능한 표지에 접합된 청구항 1-36 중 어느 한 항의 KRas 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하기 위한 지침서
    를 포함하는 키트.
  51. KRas 돌연변이체의 억제제를 얻는 방법이며,
    청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 KRas 돌연변이체와 접촉시키는 단계,
    화합물을 스크리닝하는 단계, 및
    항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 KRas 돌연변이체에 결합하는 화합물을 식별하는 단계
    를 포함하는 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 화합물은 SWII 포켓에서 KRas를 공유적으로 변형시키는 분자를 포함하는 것인 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 화합물은 SWII 포켓 내 적어도 하나의 잔기를 알킬화하는 공유 억제제를 포함하는 것인 방법.
  54. 청구항 51에 있어서, 화합물은 SWII 포켓에서 KRas를 비공유적으로 변형시키는 분자를 포함하는 것인 방법.
  55. 청구항 51-54 중 어느 한 항에 있어서, KRas 돌연변이체는 KRasG12C, KRasG12V, KRasG12D, KRasG13D, KRasG12R, 또는 KRasQ61H인 방법.
  56. KRas의 알킬화를 검출하는 방법이며,
    생물학적 샘플을 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및
    알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 검출은 KRasG12C의 검출을 포함하는 것인 방법.
  58. 청구항 56 또는 57에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체인 방법.
  59. 포유동물 내 KRas의 알킬화를 검출하는 방법이며,
    포유동물에게 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계, 및
    알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  60. KRas 억제제로 처리된 환자에서 KRas의 알킬화를 검출하는 방법이며,
    (a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계,
    (b) 샘플을 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및
    (c) 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 결합된 KRas의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, KRas 억제제는 MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157인 방법.
  62. 청구항 60 또는 61에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 결합된 KRas의 양이 환자에게 투여할 KRas 억제제의 투여량을 결정하는 것인 방법.
  63. 청구항 59-62 중 어느 한 항에 있어서, 검출은 KRasG12C의 검출을 포함하는 것인 방법.
  64. 청구항 59-63 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체인 방법.
  65. 청구항 59-63 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 인간인 방법.
  66. KRasG12C 특이적 공유 억제제로 처리된 대상체 내 KRasG12C의 알킬화를 검출하는 방법이며,
    (a) KRasG12C 특이적 공유 억제제로 치료한 후 대상체에게 항체 1E5, 2H11, 2A3, 3A12, 1F4, 4G12, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, 또는 Ab8 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계, 및
    (b) 알킬화된 KRas에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, KRasG12C 특이적 공유 억제제는 ARS-1952, ARS-853, ARS-1620, MRTX849, AMG-510, GDC-6036, ARS-3248, LY3499446, LY3537982, 또는 JNJ-74699157인 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 알킬화된 형태 특이적 항체인 방법.
  69. KRasG12C 매개 암을 치료하는 방법이며,
    청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이러한 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, KRasG12C 매개 암은 NSCLC, 결장암 또는 췌장암인 방법.
  71. 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 결정화 샤페론.
  72. KRas를 결정화하는 방법이며,
    KRas는 KRas 억제제에 선택적으로 결합되고,
    상기 방법은
    청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 KRas와 접촉시키는 단계, 및
    복합체의 결정 구조를 분해하는 단계
    를 포함하는 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, KRas는 KRasG12C, KRasG12D, KRasG12V, KRasG12R, KRasG13D, 또는 KRasQ61H인 방법.
  74. KRas에 대한 화합물의 결합을 측정하기 위한 바이오센싱 표면이며,
    (i) 바이오센싱 표면은, KRas 단백질 및 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 내부에 공동-국재화된 하이드로겔을 포함하고,
    (ii) KRas 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서로 결합하여 친화성 복합체를 형성하기에 충분한 수소 내부의 자유도를 갖고,
    (iii) KRas 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 국소 농도가 해리 친화도 상수를 적어도 10배 초과하고, 여기서 국소 농도는 친화성 복합체의 형성을 촉진하며,
    (iv) 결합되지 않은 KRas 단백질 및 항-KRas 항체의 분율이 약 50% 미만이고,
    (v) KRas 억제제 화합물이 적어도 5초 동안 바이오센싱 표면에 주입되고,
    (vi) 항-KRas 항체에 대한 KRas 억제제 화합물의 결합이 적어도 하나의 감지 채널을 통해 측정되는 것인
    바이오센싱 표면.
  75. 청구항 74에 있어서, 하이드로겔은 두께가 약 10 nm-500 nm, 10 nm-300 nm, 10-250 nm, 또는 약 10-200 nm인 바이오센싱 표면.
  76. 청구항 74 또는 75에 있어서, KRas는 비오티닐화된 것인 바이오센싱 표면.
  77. 청구항 74-76 중 어느 한 항에 있어서, BIACORE 센서 칩에 부착되는 바이오센싱 표면.
  78. 화합물을 항-KRas 억제제 활성에 대해 스크리닝하는 방법이며,
    KRas에 대한 화합물의 결합을 측정하는 단계
    를 포함하며,
    KRas는 항-KRas 항체에 결합하고,
    결합은 청구항 74-77 중 어느 하나의 바이오센싱 표면을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  79. 본원에 기재된 항-KRas 항체에 대한 KRas 돌연변이체 단백질의 결합을 측정하는 방법이며,
    (i) 청구항 74-77 중 어느 한 항의 바이오센싱 표면을 KRas와 접촉시켜 KRas-결합된 바이오센싱 표면을 형성하는 단계,
    (ii) KRas-결합된 바이오센싱 표면을 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계이며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 단백질에 비해 몰 과량으로 존재하는 것인 단계, 및
    (iii) 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KRas에 대한 결합 및 친화도를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  80. 본원에 기재된 항-KRas 항체에 대한 KRas 돌연변이체 단백질의 결합을 측정하는 방법이며,
    (i) 청구항 74-77 중 어느 한 항의 바이오센싱 표면을 청구항 1-36 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시켜 항-KRas 항체-결합된 바이오센싱 표면을 형성하는 단계,
    (ii) 항-KRas 항체-결합된 바이오센싱 표면을 KRas와 접촉시키는 단계이며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KRas 단백질에 비해 몰 과량으로 존재하는 것인 단계, 및
    (iii) 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KRas에 대한 결합 및 친화도를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  81. KRas 단백질에 대한 KRas 억제제의 표적 결합을 측정하는 방법이며,
    (a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계,
    (b) 샘플을 본원에 기재된 항-KRas 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계, 및
    (c) 항-KRas 항체에 의해 결합된 KRas의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하는 방법.
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