TW202145897A - 一種芽孢桿菌所屬之貝萊斯菌株、微生物製劑及該微生物製劑之使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明是提供一種芽孢桿菌所屬之貝萊斯菌株、微生物製劑及該微生物製劑之使用方法，本發明主要係包含一種貝萊斯菌株，其係台灣之寄存號碼為BCRC 910969之芽孢桿菌屬品種(Bacillus velezensis)RG BV-1菌株，且係具有序列號碼1的鹼基序列所示的16S rDNA；藉此創新獨特設計，使本發明芽孢桿菌屬品種(Bacillus velezensis)RG BV-1貝萊斯菌株通過對其鑒定、溶磷量的測定、培養條件的優化及發酵液中有機酸的分析，已螯合之磷元素分解為植物可吸收之磷元素，並具有植物病害防除作用、病蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果，以期減少化學磷肥的施用量者。

Description

一種芽孢桿菌所屬之貝萊斯菌株、微生物製劑及該微生物製劑之使用方法

本發明是有關一種芽孢桿菌所屬之貝萊斯菌株、微生物製劑及該微生物製劑之使用方法，尤其是一種通過對其鑒定、溶磷量的測定、培養條件的優化及發酵液中有機酸的分析，已螯合之磷元素分解為植物可吸收之磷元素，並具有植物病害防除作用、病蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果，以期減少化學磷肥的施用量之創新發明者。

按，自1903年Staltrom從土壤中發現溶磷微生物存在以來，國內外研究人員相繼開始了研究。各國研究人員對溶磷菌的種類、溶磷機制、應用效果等進行了大量研究。據不完全統計，目前全世界共篩選出36屬89種溶磷微生物，其中真菌27種，細菌58種，放線菌4種，對難溶磷具有較強溶解能力的菌株有芽孢桿菌屬、埃希氏菌屬、青黴菌屬。人們普遍認為，溶磷菌株溶磷機制與其產生低分子量有機酸有關，有機酸通過羥基和羥基與難溶性磷酸鹽上的金屬離子螯合，從而將難溶性磷轉化為可溶性磷。然而，溶磷菌對難溶性磷的溶解是一個複雜的現象，諸如營養成分、生理和生長的培養條件都會對其產生影響。

鑑於以上之現象，本案創作人乃基於多年製作之經驗，進而發明出最佳之實用性發明者。

即，本發明之主要目的，是在提供一種芽孢桿菌所屬之貝萊斯菌株、微生物製劑及該微生物製劑之使用方法；其所欲解決之問題點，是針對習知溶磷菌對難溶性磷的溶解是一個複雜的現象，諸如營養成分、生理和生長的培養條件都會對其產生影響問題點加以改良突破；

而其解決問題之技術特點，主要係包含一種貝萊斯菌株，其係台灣之寄存號碼為BCRC 910969之芽孢桿菌屬品種(Bacillus velezensis)RG BV-1菌株，且係具有序列號碼1的鹼基序列所示的16S rDNA；

藉此創新獨特設計，使本發明芽孢桿菌屬品種(Bacillus velezensis)RG BV-1貝萊斯菌株通過對其鑒定、溶磷量的測定、培養條件的優化及發酵液中有機酸的分析，已螯合之磷元素分解為植物可吸收之磷元素，並具有植物病害防除作用、病蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果，以期減少化學磷肥的施用量。

為使　貴審查委員對本發明有進一步之深入了解，茲列舉一較佳實施例說明如后：本發明之一種芽孢桿菌所屬之貝萊斯菌株、微生物製劑及該微生物製劑之使用方法：

本發明之貝萊斯菌株，係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910969。本發明為一種芽孢桿菌屬品種(Bacillus velezensis)RG BV-1貝萊斯菌株，且係具有序列號碼1的鹼基序列所示的16S rDNA；

本發明之貝萊斯菌株，其貝萊斯菌株本體及/或貝萊斯菌株的培養物顯示促使土壤中已螯合之磷元素分解為植物可吸收之磷元素，並具有植物病害防除作用、病蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果；

貝萊斯菌株及/或貝萊斯菌株的培養物做為有效成分；

本發明中，該微生物製劑可為粉末、溶液、懸浮液或顆粒型態，且該微生物製劑係為一種植物病害防除劑、線蟲防除劑、植物成長促進劑。

本發明中，該微生物製劑可進一步添加通用的肥料添加劑，其包含有機肥料或微生物肥料等，例如胺基酸、海藻萃取物、腐植酸、鳥糞、糖蜜、骨粉、魚精、海草粉、木削、石灰、油粕、米糠、草木灰或其等之組合，且本發明不限於此等。本發明人進行下方試驗IAA之感度：以水稻及萵苣為例，將水稻的幼苗進行消毒及催芽後設置在墊有濾紙的滅菌培養皿中，分別添加3 mL之0.03μM、3μM、30μM及300μM之IAA水溶液，並將培養皿移至植物生長箱中，4日後測量水稻幼苗的平均芽高及根長；同時，將萵苣種以5%次氯酸鈉進行表面消毒後，同樣置於墊有濾紙的滅菌培養皿中，添加3mL之0.03μM、3μM、30μM及300μM之IAA水溶液，並安置於植物生長箱中，3日後量測萵苣之發芽率、株高及根長。試驗結果，如第1圖所示，低濃度之IAA(即0.03μM~30μM)對水稻幼苗生長並無顯著地促進作用，但當IAA濃度為300μM則顯著地對水稻幼苗根部生長限制，因此可見，低濃度(0.00003~0.003 μM) IAA對水稻根系發展並無顯著影響；又，如第2圖及第3圖所示，在無IAA時，萵苣幼苗的芽高及根長分別為5.3 mm及14.8 mm，但當最低濃度之IAA為0.03μM時，萵苣幼苗的芽高及根長分別降低至3.5 mm及8.8 mm，顯示低濃度之IAA即會顯著地對萵苣幼苗生長造成不良影響；此外，萵苣種子之發芽率則在IAA濃度為300μM開始受到影響，當無IAA存在時，萵苣種子發芽率為78%，但當IAA濃度為300μM時，萵苣種子則降至13%。由此可知，適當量的濃度之IAA會抑制雙子葉作物的幼苗生長，從而，由於本發明之貝萊斯菌株所分泌IAA，即可抑制雙子葉作物的幼苗生長，因此可作為雙子葉除草劑。

本發明之微生物製劑之使用方法，包含將該微生物製劑與植物之種子或作物幼苗的根部接觸；例如，微生物製劑可為溶液或懸浮微粒噴灑在植物種子或植物幼苗的根部，且本發明之微生物製劑與該植物種子或作物幼苗的根部接觸之步驟，包含將該微生物製劑接種於該植物種子或幼苗所生長的土壤中，例如，可直接將微生物製劑倒入於土壤中並接觸植物種子或幼苗根部，即本發明之微生物製劑可使用通用施予微生物肥料於種子或幼苗根部之方法，以與種子或幼苗根部接觸。

本發明之具體實施例如下：

貝萊斯菌株的培養：稱取10g新鮮土壤溶於100ｍＬ的無菌水中，採用平板稀釋法製備土壤稀釋液，塗布至PVK培養基上，以30℃培養48小時，挑取具有明顯溶磷圈的菌落進行純化。將純化後的菌株分別於4℃和-80℃保存備用。利用PVK固體培養基分離玉米根際土壤中的溶磷細菌，再經過多次傳代培養，獲得1株具有穩定溶磷能力的貝萊斯菌株。

貝萊斯菌株之IAA分泌能力：將貝萊斯菌株接種於含有色胺酸濃度100 mg/L之100mL LB培養基(Lysogeny broth，LB)中，30℃震盪培養24小時，取5 mL菌液以9000 g離心15分鐘，取1 mL上清液與1 mL反應試劑(Salkowsky reagent)混合，避光反應1小時後，測量540 nm之吸光值，利用標準曲線進行對照求得上清液IAA濃度度為8.2 mg/L。

貝萊斯菌株之固氮能力：無氮培養基成分，將貝萊斯菌株於無氮培養基上進行塗盤，若貝萊斯菌株具有固氮能力，可將氮氣還原形成銨態氮，使培養基呈現由綠色轉變為藍色，意即培養兩周後可使培養基呈現藍色，則判定此貝萊斯菌株具固氮能力。試驗結果，貝萊斯菌株具備固氮能力，能於無氮培養基上生長，並使培養基由綠色變為藍色。

貝萊斯菌株之溶磷能力：以培養基(Pikovskaya agar)將以純化之貝萊斯菌株進行塗盤，若貝萊斯菌株具溶磷能力可將培養基中固態磷酸鈣溶解，會使培養基呈現半透明狀，若培養7日後菌落周圍出現溶磷透明環則判定貝萊斯菌株具溶磷能力。試驗結果，貝萊斯菌株的溶磷能力呈現陰性反應，沒有於磷酸鈣培養基上形成半透明溶磷圈。

使用貝萊斯菌株接種水稻幼苗(本發明之貝萊斯菌株之生物製劑之使用方法)將貝萊斯菌株接種至水稻幼苗之實施例，觀察其對水稻幼苗的影響。台南12號水稻種子以62℃進行15分鐘熱消毒去除水稻種子內病原真菌，隨後將種子浸水置於40℃避光生長箱中進行催芽。於滅菌培養皿中放入適當修剪之濾紙，取根長小於1.0cm之幼苗15顆排入培養皿中。取1 mL貝萊斯菌株液離心去除培養液，以等體積0.85%氯化鈉溶液重新懸浮菌體再加入培養皿中進行水稻幼苗濾紙試驗。菌液濃度大於106CFUm/L。將培養皿移至植物生長箱中，4日後測量水稻幼苗平均芽高及根長。生長箱條件為光週期L:D (光照:無光照)為12小時:12小時，溫度與相對濕度分別28℃及72%。試驗結果，接種貝萊斯菌株幼苗之平均芽高及根長分別為10.2 mm及28.7 mm，如第4圖所示。

對照例：無使用貝萊斯菌株接種水稻幼苗：將台南12號水稻種子以62℃進行15分鐘熱消毒去除水稻種子內病原真菌，隨後將種子浸水置於40℃避光生長箱中進行催芽。於滅菌培養皿中放入適當修剪之濾紙，取根長小於1.0 cm之幼苗15顆排入培養皿中；培養皿中，僅使用0.85%鹽溶液進行培養。培養皿會移至植物生長箱中，4日後測量水稻幼苗平均芽高及根長。生長箱條件為光週期L:D (光照:無光照)為12小時:12小時，溫度與相對濕度分別28℃及72%。試驗結果，幼苗平均芽高與根長為5.9 mm及13.9 mm，如第4圖所示。

統計分析: 比較實施例及對照例之幼苗的芽高與根長，以t-test於95%信心水準下進行統計分析，實施例之接種貝萊斯菌株之水稻幼苗根長顯著大於對照例，顯示貝萊斯菌株具促進水稻幼苗根生長之能力。

綜上所述，本發明之貝萊斯菌株及其微生物製劑，能有效促使土壤中已螯合之磷元素分解為植物可吸收之磷元素，並具有植物病害防除作用、病蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果。是以，本發明之貝萊斯菌株及其微生物製劑可有效促進植物生長，利於農業發展。

以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者，僅惟本發明之一較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即凡依本發明申請專利範圍所作之均等變化與修飾，皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。

無

第1圖：為外加IAA對水稻幼苗之芽高及根長影響之折線圖。 第2圖：為外加IAA對萵苣之芽高及根長影響之折線圖。 第3圖：為外加IAA對萵苣之發芽率影響之折線圖。 第4圖：是本發明貝萊斯菌株接種至水稻幼苗之實施例實驗圖表。

TW中華民國      食品工業發展研究所    2020/01/08           BCRC 910969

Claims (8)

1. 一種貝萊斯菌株，其係台灣之寄存號碼為BCRC 910969之芽孢桿菌屬品種(Bacillus velezensis)RG BV-1菌株，且係具有序列號碼1的鹼基序列所示的16S rDNA。
2. 如請求項1所述之貝萊斯菌株，其貝萊斯菌株本體及/或貝萊斯菌株的培養物顯示促使土壤中已螯合之磷元素分解為植物可吸收之磷元素，並具有植物病害防除作用、病蟲防除作用及/或植物成長促進作用的效果。
3. 一種微生物製劑，係含有申請專利範圍請求項1至請求項2中任一項所述之貝萊斯菌株及/或貝萊斯菌株的培養物做為有效成分。
4. 如請求項3所述之微生物製劑，係植物病害防除劑、線蟲防除劑、植物成長促進劑。
5. 如請求項3所述之微生物製劑可為粉末、溶液、懸浮液或顆粒型態。
6. 一種如請求項3至5任一項所述微生物製劑之使用方法，包含將該微生物製劑與植物之種子或幼苗之根部接觸。
7. 如第請求項6所述之使用方法，其中該植物為水稻。
8. 如第請求項6或7所述之使用方法，其中該微生物製劑與該植物之種子或幼苗之根部接觸之步驟，包含將該微生物製劑接種於該植物之種子或幼苗所生長的土壤中。

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