TW202140541A - 均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群、及其製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種製作均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群的方法、及藉由該方法所獲得之具有左右非對稱之糖鏈之抗體均一的抗體群。
本發明係一種製造抗體群之方法,該抗體群均一含有如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體,本發明之方法包括如下步驟:
(i)藉由內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(ENGase)切割抗體組合物中之抗體之左右2條重鏈上所結合之糖鏈,純化兩條重鏈之糖鏈經切割之抗體並將之單離;
(ii)將步驟(i)中獲得之兩條重鏈之糖鏈經切割之抗體群、經㗁唑啉化之任意糖鏈X或產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈X之糖衍生物以及為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase加以混合,製作左右2條重鏈中僅一條重鏈上結合有糖鏈X之抗體,純化該抗體並將之單離;
(iii)將步驟(ii)中獲得之左右2條重鏈中僅一條重鏈上結合有糖鏈X之抗體、經㗁唑啉化之糖鏈Y即與糖鏈X結構不同之糖鏈Y或產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈Y之糖衍生物以及為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase加以混合,製作左右2條重鏈中另一條重鏈上結合有糖鏈Y,從而左右2條重鏈上所結合之糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體,純化該抗體並將之單離。
Description
本發明係關於一種雖左右之糖鏈結構不同但各糖鏈結構均一之抗體之抗體群、及其製造方法。
抗體之糖鏈係不均一且糖鏈結構各自略有不同之混合物。已知,抗體之糖鏈會對ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity,抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)活性等效應功能或免疫原性等抗體功能造成影響。為了製作更高功能之抗體而對糖鏈結構進行修飾,此情況受到關注。自藉由CHO(Chinese Hamster Ovary,中國倉鼠卵巢)細胞所製作之糖鏈結構不同之抗體中單離具有均一之糖鏈結構之抗體在目前不可能實現,原因在於上述抗體之糖鏈為微細結構不同之糖鏈結構之集合體,且物理化學性質非常相似。使用內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(ENGase)/修飾ENGase對糖鏈進行修飾並進行均一化,而製作具有左右對稱之均一結構之糖鏈之抗體。即,藉由ENGase切割不均一結構之糖鏈,其後,使用合成或者單離出之糖鏈及修飾ENGase來附加糖鏈,藉此製作出具有均一糖鏈結構之抗體(專利文獻1)。於目前為止之方法中,僅可合成具有左右對稱之糖鏈之抗體。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1:國際公開第WO2013/120066號公報
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種製作均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群的方法、及藉由該方法所獲得之具有左右非對稱之糖鏈之抗體均一的抗體群。
[解決問題之技術手段]
本發明人等發現,於附加糖鏈之反應中,適當調節糖鏈㗁唑啉X(㗁唑啉化糖鏈X)之量,並藉由擔載有FcγRIIIa之管柱單離僅附加有1條糖鏈之抗體,其後,使結構不同之糖鏈㗁唑啉Y(㗁唑啉化糖鏈Y)反應,藉此可獲得左右之糖鏈結構不同且糖鏈結構均一之抗體,從而完成本發明。至今為止尚不知有製作左右之糖鏈結構不同且糖鏈結構均一之抗體群之技術。
即,本發明如下所示。
[1]一種抗體群,其均一含有如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體。
[2]如[1]之抗體群,其含有90%以上之如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈互不相同的抗體。
[3]如[1]或[2]之抗體群,其中在與位於抗體之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)上結合有岩藻糖。
[4]一種製造抗體群之方法,該抗體群均一含有如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體,且上述方法包括如下步驟:
(i)藉由內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(ENGase)切割抗體組合物中之抗體之左右2條重鏈上所結合之糖鏈,純化兩條重鏈之糖鏈經切割之抗體並將之單離;
(ii)將步驟(i)中獲得之兩條重鏈之糖鏈經切割之抗體群、經㗁唑啉化之任意糖鏈X或產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈X之糖衍生物以及為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase加以混合,製作左右2條重鏈中僅一條重鏈上結合有糖鏈X之抗體,純化該抗體並將之單離;
(iii)將步驟(ii)中獲得之左右2條重鏈中僅一條重鏈上結合有糖鏈X之抗體、經㗁唑啉化之糖鏈Y即與糖鏈X結構不同之糖鏈Y或產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈Y之糖衍生物以及為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase加以混合,製作左右2條重鏈中另一條重鏈上結合有糖鏈Y,從而左右2條重鏈上所結合之糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體,純化該抗體並將之單離。
[5]如[4]之方法,其使用親和層析法來純化抗體並將之單離,上述親和層析法使用擔載Fcγ受體作為配體之載體。
[6]如[4]或[5]之方法,其中ENGase為EndoS。
[7]如[4]至[6]中任一項之方法,其中為了抑制糖鏈切割活性並保持糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase係選自由EndoS D233Q、Endo S2 D184M、Endo S2 D184Q、EndoS D233Q/Q303L、D233Q/A303L/E350Q及Endo M N175Q所組成之群。
[8]如[4]至[7]中任一項之方法,其中步驟(ii)中結合之糖鏈X之分子量大於步驟(iii)中結合之糖鏈Y之分子量。
[9]如[4]至[8]中任一項之方法,其製造抗體群,該抗體群含有90%以上之如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈互不相同的抗體。
[10]如[4]至[9]中任一項之方法,其製造在與位於抗體之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)上結合有岩藻糖的抗體群。
[11]一種將抗體群中之抗體區分為未附加有糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、及於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體的方法,其係利用使用擔載Fcγ受體作為配體之載體之親和層析法,而將抗體群中之抗體區分為未附加糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、及於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體。
[12]如[11]之方法,其中在藉由內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(ENGase)處理抗體群後,利用使用擔載Fcγ受體作為配體之載體之親和層析法,而將抗體群中之抗體區分為未附加糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、及於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體。
本說明書包含成為本申請之優先權之基礎的日本專利申請號2020-002968號之揭示內容。
[發明之效果]
藉由ENGase切割不均一結構之糖鏈,其後,使用合成或者單離出之糖㗁唑啉及修飾ENGase來附加糖鏈,藉此可製作均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群。
以下,詳細地說明本發明。
現在,作為抗體醫藥,使用藉由CHO(Chinese Hamster Ovary,中國倉鼠卵巢)細胞所製作之單株抗體。如此製作之單株抗體之包含重鏈及輕鏈之蛋白質之結構雖均一,但糖鏈之結構於抗體間並不均一。此處,與抗體結合之糖鏈係指與位於抗體之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈。在自然界中亦存在與抗體之2條重鏈結合之各糖鏈為不同結構的抗體,即具有左右非對稱之結構之糖鏈的抗體。然而,於視為抗體群之情形時,亦存在具有左右對稱之糖鏈之抗體,該左右對稱之糖鏈係指與抗體之2條重鏈結合之各糖鏈具有相同結構。又,具有左右非對稱之結構之糖鏈之抗體亦根據抗體不同而糖鏈種類有所不同。因此,不存在均一含有與抗體之2條重鏈結合之各糖鏈具有不同結構之抗體的抗體群。另一方面,使用內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶及其修飾體將含有糖鏈不均一之抗體之抗體群中的抗體之糖鏈替換成其他糖鏈,藉此獲得了包含具有左右對稱且均一之糖鏈之抗體的抗體群。
本發明係製作藉由先前方法不可能製作之均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群(population of antibodies)的方法。又,本發明係均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群,該集群係經單離之集群。所謂抗體群係指含有多個抗體分子之抗體群。該抗體群係指以一定比率含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體的集群,或含有100%之具有左右非對稱之糖鏈之抗體之集群,即,僅包含具有左右非對稱之糖鏈之抗體的集群。所謂具有左右非對稱之糖鏈之抗體係指與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體。或指與作為二聚物之抗體之各單體部分結合之糖鏈不同的抗體。
所謂均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群係指如下集群,即,於抗體群中之各抗體分子中,與抗體之左右2條重鏈之CH域結合的糖鏈之種類均一。即,所謂均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群係指如下抗體群,即,於抗體群之各抗體中,與2條重鏈各自結合之糖鏈不同,但抗體間並無差異,與各抗體結合之糖鏈均一。
此處所謂均一,係指於抗體群中含有70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、較佳為98%以上、進而較佳為99%以上、尤佳為100%之左右重鏈上所結合之非對稱之糖鏈相同的抗體分子。亦可將抗體群稱為抗體組合物。於稱為抗體組合物之情形時,有時該組合物含有水、緩衝液成分、穩定成分等。抗體群可為液體狀抗體溶液,亦可為冷凍乾燥品或冷凍品。進而,由於均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群藉由層析法而單離,故而亦可稱為均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體區分。
於本發明之方法中,只要針對抗體群之糖鏈,利用修飾內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase:ENGase),用不同之糖鏈替代左右2條重鏈各自之糖鏈即可。
具體而言,例如藉由以下之方法替換糖鏈。以下,於抗體之左右2條重鏈上分別換上糖鏈X及與糖鏈X不同之糖鏈即糖鏈Y,並以此為例。
於以下之方法中,抗體自身可使用蛋白質A等進行純化。
(1)原本與抗體結合之糖鏈之切割
使用內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase:ENGase),切割原本與抗體結合之糖鏈。此時,切割與抗體之左右2條重鏈各自結合之兩條糖鏈。ENGase係使存在於抗體等糖蛋白質之N-結合型糖鏈之還原末端側的N,N'-二乙醯基殼二糖間發生水解,而使糖鏈游離成內型之酵素。藉由ENGase,會使與位於抗體之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)1個殘基殘留,糖鏈被切割。在還原末端之N-乙醯葡萄糖胺上可結合岩藻糖,亦可不結合岩藻糖。將切割糖鏈稱為去糖基化。其結果,生成未結合有糖鏈而僅結合有GlcNAc之抗體。
關於該酶促反應,只要於pH值6~9、較佳為pH值6~8且15~40℃、較佳為25~35℃下,將抗體與ENGase加以混合,並反應5~30小時、較佳為10~25小時即可。抗體與ENGase之添加量可適當設定,例如只要將5~100 μL之0.2~20 mg/mL之ENGase添加至5~100 mg/mL之抗體溶液0.1~10 mL中即可。
作為內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase:ENGase),較佳為源自釀膿鏈球菌之EndoS。關於EndoS,於Collin, M., Olsen, A. (2001), EndoS, a novel secreted protein from Streptococcus pyogenes with endoglycosidase activity on human IgG. EMBO J. 20, 3046-3055.中有所記載,亦揭示有胺基酸序列。
其後,只要純化糖鏈經切割之抗體並將之單離即可。純化可使用層析法來進行。此時,可藉由使用擔載Fcγ受體即FcγRIIIa作為配體之管柱等載體之親和層析法來進行純化。所謂Fcγ受體係針對免疫球蛋白之Fc部位之受體蛋白質,該受體蛋白質可識別由抗體之N結合型糖鏈所引起之Fc區域之結構變化。作為Fcγ受體,可例舉FcγRIIIa。藉由使用擔載Fcγ受體之管柱之親和層析法,具有不含岩藻糖之糖鏈結構之抗體或於糖鏈結構之末端存在半乳糖之抗體具有更大之結合親和性,溶出時間變慢。
作為擔載FcγRIIIa之管柱,可例舉:TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR(東曹股份有限公司)。
該步驟係如下之步驟,即,藉由內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(ENGase)切割抗體組合物中之抗體之左右2條重鏈上所結合之糖鏈,純化兩條重鏈之糖鏈經切割之抗體並將之單離。
(2)僅1條重鏈具有糖鏈之抗體之製備
其次,將與2條重鏈結合之兩條糖鏈經切割之抗體與經㗁唑啉化之糖鏈X或者產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈X之糖衍生物加以混合,使用ENGase而使糖鏈與上述抗體結合,上述ENGase係為了抑制糖鏈切斷活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾,即水解能力受到抑制,另一方面具有糖基轉移能力。作為產生㗁唑啉之糖衍生物,可例舉:糖肽、對硝基苯基寡醣等。關於為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase,包括所有抑制了糖鏈切割能力並保持了糖基轉移能力之所有ENGas。例如可例舉:具有D233Q突變(將第233號天冬醯胺酸(D)置換為麩醯胺(Q))之EndoS。將該突變抗體稱為EndoS D233Q。又,為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase還包括:Endo S2 D184M及Endo S2 D184Q(Li, T. et al., J. Biol. Chem. 291, 16508-16518,(2016))、以及Endo M N175Q(Katoh, T.et al., The Journal of Biological Chemistry, 291, 23305-23317)。進而還包括EndoS D233Q/Q303L、D233Q/A303L/E350Q(國際公開第WO2017/010559號公報)。
糖鏈之㗁唑啉化係藉由使用㗁唑啉化劑,使還原末端具有GlcNAc之糖鏈進行㗁唑啉化來進行。將經㗁唑啉化之糖鏈稱為㗁唑啉化糖鏈。以該㗁唑啉化糖鏈X作為受質,藉由本發明之修飾型ENGase使糖鏈轉移至GlcNAc-抗體,藉此使糖鏈X結合於抗體。即,以㗁唑啉糖鏈(疊氮㗁唑啉糖鏈)作為供體,使糖鏈結合於作為受納體之糖鏈經切割之抗體之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)殘基。於該反應中,供體之㗁唑啉環在抗體之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)殘基之4位上發生反應,形成殼二糖結構並結合。作為㗁唑啉化劑,可例舉:CDMBI(2-Chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium chloride,2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓氯化物,伏見製藥所)、DMC(2-Chloro-1,3-dimethyl-imidazolinium chloride,2-氯-1,3-二甲基-咪唑鎓氯化物)等。㗁唑啉化可藉由J. Org. Chem. 74,5,2210 (2009)所記載之方法來進行。又,㗁唑啉化糖鏈可自伏見製藥所股份有限公司獲取。
藉由修飾型ENGase來切割糖鏈時,亦可使用產生㗁唑啉之糖衍生物。由糖衍生物生成㗁唑啉化糖鏈,於原位以該㗁唑啉化糖鏈作為供體,使糖鏈結合於作為受納體之糖鏈經切割之抗體之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)殘基。使用產生㗁唑啉之糖衍生物之方法於Manabe, S. et al., R. Soc. Open Sci. 5, 171521 (2018)及Iwamoto, M. et al., PLoS One 13:e0193534 (2018)中有所記載。
無論是使用經㗁唑啉化之糖鏈之情形,還是使用產生㗁唑啉之糖衍生物之情形,均使用㗁唑啉化糖鏈作為中間物,因此可稱為「以㗁唑啉作為中間物而使糖基發生轉移」。
該酵素反應只要於pH值6~9、較佳為pH值6~8下且於15~40℃、較佳為25~35℃下,將左右兩條糖鏈經切割之抗體、㗁唑啉化糖鏈或者產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈X之糖衍生物及修飾ENGase加以混合,並反應5~30小時、較佳為10~25小時即可。抗體與ENGase之添加量可適當設定,例如可將0.1~100 μL之0.2~20 mg/mL之修飾ENGase添加至5~100 mg/mL之左右兩條糖鏈經切割之抗體溶液0.1~10 mL中。
此時,藉由調節㗁唑啉化糖鏈X或者產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈X之糖衍生物的量,可獲得左右2條重鏈中僅1條鏈具有糖鏈X之抗體作為主生成物。例如,只要以成為25 μM~5.0 mM之方式添加㗁唑啉化糖鏈X或者產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈X之糖衍生物即可。
藉由該反應,亦可獲得左右2條重鏈上均未附加糖鏈之抗體,亦可獲得左右2條重鏈上均附加有糖鏈X之雙鏈糖鏈抗體。關於溶出時間,按從長到短之順序,依序為未附加糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體。為了製作本發明的含有具有左右非對稱之均一結構之糖鏈之抗體群,需要僅純化左右2條重鏈中僅1條鏈具有糖鏈X之單鏈糖鏈抗體並將之單離。為了純化單鏈糖鏈抗體,只要藉由上述使用擔載作為Fcγ受體之FcγRIIIa之管柱的親和層析法進行純化即可。
該步驟係如下之步驟,即,將上述(1)之步驟中所獲得之兩條重鏈之糖鏈經切割之抗體群、經㗁唑啉化之任意糖鏈X或產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈X之糖衍生物以及為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase加以混合,製作左右2條重鏈中僅一條重鏈上結合有糖鏈X之抗體,純化該抗體並將之單離。
(3)具有左右非對稱之糖鏈之抗體之製備
藉由(2)之方法純化左右2條重鏈中僅1條鏈上具有糖鏈X之單鏈糖鏈抗體後,使糖鏈Y結合於另一條未結合有糖鏈之重鏈。糖鏈Y只要藉由與糖鏈X相同之方法結合即可。即,只要於pH值6~9、較佳為pH值6~8下且於15~40℃、較佳為25~35℃下,將抗體與修飾ENGase加以混合,進行酵素反應5~30小時、較佳為10~25小時即可。抗體與ENGase之添加量可適當設定,例如只要將5~100 μL之0.2~20 mg/mL之ENGase添加至5~100 mg/mL之抗體溶液0.1~10 mL中即可。
其結果,可製作具有左右非對稱之糖鏈之抗體,該左右非對稱之糖鏈係與左右2條重鏈結合之糖鏈之種類不同。利用使用擔載FcγRIIIa之管柱之親和層析法,純化具有與左右2條重鏈結合之糖鏈之種類不同的左右非對稱之糖鏈的抗體,藉此可單離並製造均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群,該左右非對稱之糖鏈係與左右2條重鏈結合之糖鏈之種類不同。
該步驟係如下之步驟,即,將上述(2)之步驟中所獲得之左右2條重鏈中僅一條重鏈上結合有糖鏈X之抗體、經㗁唑啉化之糖鏈Y即與糖鏈X結構不同之糖鏈Y或產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈Y之糖衍生物以及為了抑制糖鏈切割活性提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase加以混合,而製作左右2條重鏈中另一條重鏈上結合有糖鏈Y,從而左右2條重鏈上所結合之糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體,純化該抗體並將之單離。
供與抗體結合之糖鏈可根據目的而適當選擇,可列舉:高甘露糖型糖鏈,其具有在包括還原末端之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)在內之二乙醯基殼二糖(GlcNAc-GlcNAc)上結合有甘露糖(Man)之低聚物的結構;複合(complex)型糖鏈,其於二乙醯基殼二糖上結合有Man以及GlcNAc、半乳糖(Gal)、唾液酸(Neu5Ac)之至少1者;及雜合(hybrid)型糖鏈,其具有於二乙醯基殼二糖上雜合有高甘露糖型與複合型之糖鏈結構。作為高甘露糖型糖鏈,例如有分別結合有3個、5個、6個、8個及9個甘露糖之被稱為Man3型、Man5型、Man6型、Man8型及Man9型之糖鏈。又,作為複合型糖鏈,例如有被稱為三鏈型、四鏈型、去唾液酸(Asialo)雙鏈型、去半乳糖(Agalacto)雙鏈型、平分型(Bisecting)雙鏈型、Sialo雙鏈型之糖鏈。根據有無唾液酸、有無核心岩藻糖、有無支鏈等而存在各種結構之糖鏈。糖鏈係以SG或M3等縮寫來表示,將具有唾液酸之糖鏈(唾液糖鏈)表示為SG,將高甘露糖型糖鏈表示為M3、M5等,將不含有半乳糖之糖鏈表示為G0,將含有1個半乳糖之糖鏈表示為G1,將含有2個半乳糖之糖鏈表示為G2。進而,於存在岩藻糖之情形時,表示為M3-F、G0-F、G2-F。又,於結合有平分型N-乙醯葡萄糖胺之情形時,附上B而表示為G0B、G0B等。作為整個抗體(IgG)分子之糖鏈結構如[SG-F/SG-F]、[SG-F/G2-F]、[SG-F/G0-F]、[G2-F/M3-F]所示,可使用與左右之各重鏈結合之糖鏈來表示。於該等例之情形時,[SG-F/SG-F]為具有左右對稱之糖鏈之抗體,[SG-F/G2-F]、[SG-F/G0-F]、[G2-F/M3-F]為具有左右非對稱之糖鏈之抗體。又,於該等顯示之前附上抗體之名稱,並如Herceptin[SG-F/G2-F]所示。該例係具有左右非對稱之糖鏈之賀癌平,即於一條重鏈上結合有SG-F且於另一條重鏈上結合有G2-F。
又,左右重鏈之兩條糖鏈經切割之抗體如[GlcNAc/GlcNAc]、[GlcNAc-Fucose/GlcNAc-Fucose]所示。前者表示左右兩條重鏈之糖鏈被切割並殘留有N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)1個殘基之抗體,後者表示在殘留之GlcNAc上結合有岩藻糖之抗體。又,左右重鏈中僅1條重鏈上結合有糖鏈之狀態的抗體如[SG-F/GlcNAc-Fucose]所示。該抗體表示僅一條重鏈上結合有SG-F,於另一條重鏈上未結合有糖鏈,且殘留有結合有岩藻糖之GlcNAc。
糖鏈亦可含有疊氮基或炔烴基等。具有該等基之糖鏈可用於合成抗體藥物複合體(ADC:Antibody-drug conjugate)。
進而,亦可導入化學合成之非天然型糖鏈。作為非天然型糖鏈,例如可例舉於非還原末端包含N-羥乙醯神經胺糖酸(NeuGc)或半乳糖α1-3半乳糖(Galα1-3Gal)等半乳糖之非人類型糖鏈來代替N-乙醯神經胺糖酸。該等糖鏈具有免疫原性,需要自抗體醫藥組合物中去除,藉由本發明之方法,可合成具有該等糖鏈之抗體作為標準品。
較理想的是(2)中第一個結合之糖鏈X之分子量小於第2個結合之糖鏈Y。其原因在於:若使分子量較小者第一個結合,則當結合第2個結合之糖鏈時,第一個結合之糖鏈容易因水解而被切割。
本發明還包括一種將抗體群中之抗體區分為未附加糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、及於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體的方法,其係利用使用擔載Fcγ受體作為配體之載體之親和層析法,而將抗體群中之抗體區分為未附加糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、及於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體,該方法例如可於藉由內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(ENGase)處理抗體群,將糖鏈部分切割後來進行。
藉由本發明之方法所製作之抗體並無限定,可為具有核心岩藻糖之抗體,亦可為不具有核心岩藻糖之抗體,上述具有核心岩藻糖之抗體係於N型糖鏈之根部之GlcNAc上結合有岩藻糖。上述抗體可來源於人類,亦可為來源於包含小鼠、大鼠等嚙齒類之非人類動物。又,抗體之類別可為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE中之任一種。
藉由本發明之方法,可製造用作抗體醫藥、抗體藥物複合體(ADC:Antibody-drug conjugate)、抗體標準品之抗體作為含有具有左右非對稱之均一結構之糖鏈的抗體。可藉由對抗體醫藥品之糖鏈進行修飾來製造生物類似藥或生物改良藥。又,可獲得糖鏈結構不同之抗體標準品。
作為抗體醫藥之例,可例舉以下之抗體,但並不限定於其等。
曲妥珠單抗(Herceptin(註冊商標))、利妥昔單抗(Rituxan(註冊商標))、莫加珠單抗(Poteligeo(註冊商標))、阿達木單抗、阿利庫單抗、阿侖單抗、伊西貝單抗、依達賽珠單抗、伊匹單抗、英夫利昔單抗、尤特克單抗、依庫珠單抗、依伏庫單抗、埃羅妥珠單抗、奧法木單抗、奧馬珠單抗、卡那單抗、吉妥珠單抗、戈利木單抗、蘇金單抗、西妥昔單抗、賽妥珠單抗、狄諾塞麥、托珠單抗、曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-美坦辛、那他珠單抗、納武單抗、巴利昔單抗、帕尼單抗、帕利珠單抗、本妥昔單抗、布羅達單抗、貝伐單抗、帕博利珠單抗、帕妥珠單抗、美泊利單抗、雷珠單抗、雷莫盧單抗等。
實施例
藉由以下之實施例具體地說明本發明,但本發明並不受該等實施例限定。
具有左右非對稱之糖鏈結構之抗體之製備
作為抗體,使用抗Her2抗體Herceptin(註冊商標)(曲妥珠單抗:Trastuzumab)。曲妥珠單抗為針對乳腺癌、胃癌之抗體醫藥。糖鏈部分之合成如下所示進行。
[實施例1]僅具有還原末端GlcNAc(Fucose結合)之抗體:Herceptin[GlcNAc-Fucose/GlcNAc-Fucose]之製備
1-1.使市售品Herceptin(中外製藥製造,注射用150,177 mg)溶解於100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)15 mL中。其後,藉由Sartorius Vivaspin Turbo 15(50 K)濃縮至5 mL左右(3,000×g、4℃)。將100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)10 mL加入至濃縮液中,反覆濃縮3次直至5 mL為止。
將藉由東曹TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR管柱對市售品Herceptin進行分析所得之結果示於圖1(分析條件1)。將此時之抗體之結構之概念圖示於圖2。
1-2.將EndoS(2.0 mg/mL)10 μL加入至Herceptin溶液中,於30℃下反應18小時。反應後,藉由HPLC(High Performance Liquid Chromatography,高效液相層析法)確認原料消失。
分析結果如圖3所示(分析條件1)。將去糖基化後之抗體之結構之概念圖示於圖4。
分析條件1
裝置:Shimadzu HPLC 系統 Prominence
管柱:Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR 4.6 mm I.D.×10 cm、5 μm
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:Ex. 280 nm、Em. 348 nm
流動相A:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值4.5)
梯度條件
1. 0-2 min A 100%
2. 2-45 min A 100-0%
3. 45-55 min A 0%
4. 55-60 min A 0-100%
5. 60-80 min A 100%
1-3.藉由蛋白質A管柱自反應溶液中純化抗體。將反應溶液分10次分取。
將純化抗體時之層析圖示於圖5。將保持時間25分鐘左右之波峰作為抗體來回收。
純化條件
裝置:Shimadzu HPLC系統
管柱:Tosoh ToyoScreen AF-ProteinA HC-650F 1 ml
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:0.1 M磷酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:0.1 M檸檬酸緩衝液(pH值3.5)
梯度條件
1. 0-15 min A 100%
2. 15-15.01 min A 100-0%
3. 15.01-25 min A 0%
4. 25-25.01 min A 0-100%
5. 25.01-50 min A 100%
1-4.將回收區分藉由Sartorius Vivaspin Turbo 15 (50 K)進行超過濾並濃縮。其後,置換成50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)(2,460×g、4℃)。
1-5.使用Thermo Scientific公司製造之NanoDrop(商標)2000C(模式:附帶軟體;類型:蛋白質A280;藉由IgG進行測定)測定所獲得之Herceptin溶液之蛋白質濃度,結果為165 mg(30 mL、5.5 mg/mL)。
[實施例2]僅1個部位具有糖鏈之抗體之製備
2-1. Herceptin[SG-F/GlcNAc-Fucose]之製備
2-1-1.於100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)995 μL中添加經ENGase去糖基化之Herceptin(20 mg;2 mL)、SG-Oxazoline(伏見製藥所製造;1 mM;1000 μL,圖6,以下稱為SG-Ox)、EndoS D233Q(4.35 μg;1 μL),於30℃下反應12小時。
2-1-2.藉由蛋白質A管柱自反應溶液中純化抗體。將分取時之層析圖示於圖7。將保持時間25分鐘左右之波峰(圖7之抗體區分)作為抗體來回收。
純化條件
裝置:Shimadzu HPLC系統
管柱:Tosoh ToyoScreen AF-ProteinA HC-650F 1 ml
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:0.1 M磷酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:0.1 M檸檬酸緩衝液(pH值3.5)
梯度條件
1. 0-15 min A 100%
2. 15-15.01 min A 100-0%
3. 15.01-25 min A 0%
4. 25-25.01 min A 0-100%
5. 25.01-50 min A 100%
2-1-3.將回收區分藉由Sartorius Vivaspin Turbo 15(50 K)進行超過濾並濃縮。其後,置換成50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)(2,460×g、4℃)。
2-1-4.使用Thermo Scientific公司製造之NanoDrop(商標)2000C(模式:附帶軟體;類型:蛋白質A280;藉由IgG進行測定)測定所獲得之Herceptin溶液之蛋白質濃度,結果為19 mg(6 mL、3.3 mg/mL)。
2-1-5.使用Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR對純化所得之Herceptin進行分取。分取結果如圖8所示。分別分取圖8所示之波峰(圖8之Fr.1、Fr.2及Fr.3)。
分取條件
裝置:Shimadzu HPLC 系統 Prominence
管柱:Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR 4.6 mm I.D.×10 cm、5 μm
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值4.5)
梯度條件
1. 0-2 min A 100%
2. 2-45 min A 100-0%
3. 45-55 min A 0%
4. 55-60 min A 0-100%
5. 60-80 min A 100%
2-1-6.將所獲得之區分自保持時間較低者起設為Fr.1(2-10 min)、Fr.2(28-37 min)、Fr.3(48-55 min),分別藉由LC-MS/MS進行完整質量分析。
Intact Mass 分析
裝置:Waters Acquity H-Class Bio UHPLC System with Vion IMS Qtof
管柱:Waters MassPREP去鹽管柱
管柱溫度:80℃
流動相:A液 0.1% 甲酸
B液 乙腈
將梯度條件示於表1。
[表1]
m/z範圍:400-4000
毛細管電壓:3.00 kV
錐孔電壓:150 V
源溫度:150℃
去溶劑化溫度:600℃
逆摺積演算軟體:Waters UNIFI software v1.8.2.
No. | 時間(min) | 流速(ml/min) | A(%) | B(%) |
1 | 0 | 0.5 | 95 | 5 |
2 | 0.5 | 0.5 | 95 | 5 |
3 | 0.51 | 0.2 | 95 | 5 |
4 | 3 | 0.2 | 10 | 90 |
5 | 3.1 | 0.5 | 10 | 90 |
6 | 3.4 | 0.5 | 10 | 90 |
7 | 3.6 | 0.5 | 95 | 5 |
8 | 3.8 | 0.5 | 95 | 5 |
可知,Fr.1係質量為145865且於Asn297上帶有一對GlcNAc-Fucose之結構(圖9) (圖10)。
可知,Fr.2係質量為147868且於Asn297之GlcNAc-Fucose之1個部位上帶有SG之結構(圖11) (圖12)。
可知,Fr.3係質量為149872且於Asn297之GlcNAc-Fucose之2個部位上均帶有SG之結構(圖13) (圖14)。
如此,若使用Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR,則可對糖鏈僅為GlcNAc-Fucose者、僅1個部位具有糖鏈者、2個部位具有糖鏈者進行區分。
2-2. Herceptin[G2-F/GlcNAc-Fucose]之製備
2-2-1.於100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)98 μL中添加經ENGase去糖基化之Herceptin(2 mg;200 μL)、G2-Oxazoline(伏見製藥所製造;1 mM;1000 μL,圖15,以下稱為G2-Ox),添加EndoS D233Q(4.35 μg;2 μL),於30℃下反應12小時。反應後,以與2-1-2相同之順序純化溶液中之抗體。
2-2-2.使用Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR對純化後所得之Herceptin進行分取。分取結果如圖16所示。對保持時間36分鐘左右之波峰(圖16之G2F/GlcNAc-Fucose)進行分取。
分取條件
裝置:Shimadzu HPLC 系統 Prominence
管柱:Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR 4.6 mm I.D.×10 cm、5 μm
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值4.5)
梯度條件
1. 0-2 min A 100%
2. 2-45 min A 100-0%
3. 45-55 min A 0%
4. 55-60 min A 0-100%
5. 60-80 min A 100%
2-2-3.藉由LC-MS/MS對所分取之波峰進行完整質量(Intact Mass)分析。
完整質量分析
裝置:Waters Acquity H-Class Bio UHPLC System with Vion IMS Qtof
管柱:Waters MassPREP去鹽管柱
管柱溫度:80℃
流動相:A液 0.1% 甲酸
B液 乙腈
將梯度條件示於表2。
[表2]
m/z範圍:400-4000
毛細管電壓:3.00 kV
錐孔電壓:150 V
源溫度:150℃
去溶劑化溫度:600℃
逆摺積演算軟體:Waters UNIFI software v1.8.2.
No. | 時間(min) | 流速(ml/min) | A(%) | B(%) |
1 | 0 | 0.5 | 95 | 5 |
2 | 0.5 | 0.5 | 95 | 5 |
3 | 0.51 | 0.2 | 95 | 5 |
4 | 3 | 0.2 | 10 | 90 |
5 | 3.1 | 0.5 | 10 | 90 |
6 | 3.4 | 0.5 | 10 | 90 |
7 | 3.6 | 0.5 | 95 | 5 |
8 | 3.8 | 0.5 | 95 | 5 |
可知,檢測出之質量為147285,為於Asn297之GlcNAc-Fucose之1個部位上帶有G2-F之結構(圖17) (圖18)。
2-3. Herceptin[G0-F/GlcNAc-Fucose]之製備
2-3-1.於100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)98 μL中添加經ENGase去糖基化之Herceptin(2 mg;200 μL)、G0-Oxazoline(伏見製藥所製造;1 mM;1000 μL,圖19,以下稱為G0-Ox),添加EndoS D233Q(4.35 μg;2 μL),於30℃下反應12小時。反應後,以與2-1-2相同之順序純化溶液中之抗體。
2-3-2.使用Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR對純化所得之Herceptin進行分取。分取結果如圖20所示。對保持時間30分鐘左右之波峰(圖20之G0-F/GlcNAc-Fucose)進行分取。
分取條件
裝置:Shimadzu HPLC 系統 Prominence
管柱:Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR 4.6 mm I.D.×10 cm、5 μm
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值4.5)
梯度條件
1. 0-2 min A 100%
2. 2-45 min A 100-0%
3. 45-55 min A 0%
4. 55-60 min A 0-100%
5. 60-80 min A 100%
2-3-3.藉由LC-MS/MS對所分取之波峰進行完整質量分析。
完整質量分析
裝置:Waters Acquity H-Class Bio UHPLC System with Vion IMS Qtof
管柱:Waters MassPREP 去鹽管柱
管柱溫度:80℃
流動相:A液 0.1% 甲酸
B液 乙腈
將梯度條件示於表3。
[表3]
m/z範圍:400-4000
毛細管電壓:3.00 kV
錐孔電壓:150 V
源溫度:150℃
去溶劑化溫度:600℃
逆摺積演算軟體:Waters UNIFI software v1.8.2.
No. | 時間(min) | 流速(ml/min) | A(%) | B(%) |
1 | 0 | 0.5 | 95 | 5 |
2 | 0.5 | 0.5 | 95 | 5 |
3 | 0.51 | 0.2 | 95 | 5 |
4 | 3 | 0.2 | 10 | 90 |
5 | 3.1 | 0.5 | 10 | 90 |
6 | 3.4 | 0.5 | 10 | 90 |
7 | 3.6 | 0.5 | 95 | 5 |
8 | 3.8 | 0.5 | 95 | 5 |
可知,檢測出之質量為146961,為於Asn297之GlcNAc-Fucose之1個部位上帶有G0-F之結構(圖21) (圖22)。
2-4. Herceptin[M3-F/GlcNAc-Fucose]之製備
2-4-1.於100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)98 μL中添加經ENGase去糖基化之Herceptin(2 mg;200 μL)、M3-Oxazoline(伏見製藥所製造;1 mM;1000 μL,圖23,以下稱為M3-Ox),添加EndoS D233Q(4.35 μg;2 μL),於30℃下反應12小時。反應後,以與2-1-2相同之順序純化溶液中之抗體。
2-4-2.使用Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR對純化所得之Herceptin進行分取。分取結果示於圖24。對保持時間26分鐘左右之波峰(圖24之M3-F/GlcNAc-Fucose)進行分取。
分取條件
裝置:Shimadzu HPLC 系統 Prominence
管柱:Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR 4.6 mm I.D.×10 cm、5 μm
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值4.5)
梯度條件
1. 0-2min A 100%
2. 2-45min A 100-0%
3. 45-55min A 0%
4. 55-60min A 0-100%
5. 60-80min A 100%
2-4-3.藉由LC-MS/MS對所分取之波峰進行完整質量分析。
完整質量分析
裝置:Waters Acquity H-Class Bio UHPLC System with Vion IMS Qtof
管柱:Waters MassPREP去鹽管柱
管柱溫度:80℃
流動相:A液 0.1% 甲酸
B液 乙腈
將梯度條件示於表4。
[表4]
m/z範圍:400-4000
毛細管電壓:3.00 kV
錐孔電壓:150 V
源溫度:150℃
去溶劑化溫度:600℃
逆摺積演算軟體:Waters UNIFI software v1.8.2.
No. | 時間(min) | 流速(ml/min) | A(%) | B(%) |
1 | 0 | 0.5 | 95 | 5 |
2 | 0.5 | 0.5 | 95 | 5 |
3 | 0.51 | 0.2 | 95 | 5 |
4 | 3 | 0.2 | 10 | 90 |
5 | 3.1 | 0.5 | 10 | 90 |
6 | 3.4 | 0.5 | 10 | 90 |
7 | 3.6 | 0.5 | 95 | 5 |
8 | 3.8 | 0.5 | 95 | 5 |
可知,檢測出之質量為146554,為於Asn297之GlcNAc-Fucose之1個部位上帶有M3-F之結構(圖25) (圖26)。
[實施例3]具有左右非對稱之糖鏈之抗體之製備
使用僅1個部位具有SG之Herceptin[SG-F/GlcNAc-Fucose],使用與SG不同之G2-G2-Ox,製備抗體之左右具有不同糖鏈(左右非對稱)之抗體。
3-1. Herceptin[SG-F/G2-F]之製備
3-1-1.於100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)98 μL中添加藉由ENGase而僅於1個部位上帶有SG之Herceptin[SG-F/GlcNAc-Fucose](2 mg;200 μL)、G2-Ox(伏見製藥所製造;1 mM;100 μL)、EndoS D233Q(4.35 μg;2 μL),於30℃下反應12小時。
3-1-2.藉由蛋白質A管柱自反應溶液中純化抗體。將分取時之層析圖示於圖27。將保持時間25分鐘左右之波峰(圖27之抗體區分)作為抗體來回收。
純化條件
裝置:Shimadzu HPLC系統
管柱:Tosoh ToyoScreen AF-ProteinA HC-650F 1 ml
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:0.1 M磷酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:0.1 M檸檬酸緩衝液(pH值3.5)
梯度條件
1. 0-15 min A 100%
2. 15-15.01 min A 100-0%
3. 15.01-25 min A 0%
4. 25-25.01 min A 0-100%
5. 25.01-50 min A 100%
將回收區分藉由Sartorius Vivaspin Turbo 15(50 K)進行超過濾並濃縮。其後,置換成50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)(2,460×g、4℃)。
3-1-3.測定所獲得之Herceptin溶液之蛋白質濃度。Thermo Scientific公司製造,NanoDrop(商標)2000C(模式:附帶軟體;類型:蛋白質A280;藉由IgG進行測定)。回收量:2 mg(1.8 mL、1.1 mg/mL)。
3-1-4.使用Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR對純化所得之Herceptin進行分取。分取結果如圖28所示。對保持時間49分鐘左右之波峰(圖28之SG-F/G2-F)進行分取。
分取條件
裝置:Shimadzu HPLC 系統 Prominence
管柱:Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR 4.6 mm I.D.×10 cm、5 μm
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值4.5)
梯度條件
1. 0-2 min A 100%
2. 2-45 min A 100-0%
3. 45-55 min A 0%
4. 55-60 min A 0-100%
5. 60-80 min A 100%
3-1-5.藉由LC-MS/MS對所分取之波峰進行完整質量分析。
完整質量分析
裝置:Waters Acquity H-Class Bio UHPLC System with Vion IMS Qtof
管柱:Waters MassPREP 去鹽管柱
管柱溫度:80℃
流動相:A液 0.1% 甲酸
B液 乙腈
將梯度條件示於表5。
[表5]
m/z範圍:400-4000
毛細管電壓:3.00 kV
錐孔電壓:150 V
源溫度:150℃
去溶劑化溫度:600℃
逆摺積演算軟體:Waters UNIFI software v1.8.2.
No. | 時間(min) | 流速(ml/min) | A(%) | B(%) |
1 | 0 | 0.5 | 95 | 5 |
2 | 0.5 | 0.5 | 95 | 5 |
3 | 0.51 | 0.2 | 95 | 5 |
4 | 3 | 0.2 | 10 | 90 |
5 | 3.1 | 0.5 | 10 | 90 |
6 | 3.4 | 0.5 | 10 | 90 |
7 | 3.6 | 0.5 | 95 | 5 |
8 | 3.8 | 0.5 | 95 | 5 |
可知,檢測出之質量為149288,為於Asn297之GlcNAc-Fucose之2個部位上帶有SG-F及G2-F各1條之結構(圖29) (圖30)。
3-2. Herceptin[G0-F/SG-F]之製備
3-2-1.於100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)98 μL中添加藉由ENGase而僅於1個部位上帶有G0之Herceptin[G0-F/GlcNAc-Fucose](2 mg;200 μL)、SG-Ox(伏見製藥所製造;1 mM;100 μL)、EndoS D233Q(4.35 μg;2 μL),於30℃下反應12小時。反應後,以與3-1-2相同之順序純化溶液中之抗體。
3-2-2.使用Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR對純化所得之Herceptin進行分取。分取結果如圖31所示。對保持時間46分鐘左右之波峰(圖31之SG-F/G0-F)進行分取。
分取條件
裝置:Shimadzu HPLC 系統 Prominence
管柱:Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR 4.6 mm I.D.×10 cm、5 μm
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值4.5)
梯度條件
1. 0-2min A 100%
2. 2-45min A 100-0%
3. 45-55min A 0%
4. 55-60min A 0-100%
5. 60-80min A 100%
3-2-3.藉由LC-MS/MS對所分取之波峰進行完整質量分析。
完整質量分析
裝置:Waters Acquity H-Class Bio UHPLC System with Vion IMS Qtof
管柱:Waters MassPREP 去鹽管柱
管柱溫度:80℃
流動相:A液 0.1% 甲酸
B液 乙腈
將梯度條件示於表6。
[表6]
m/z範圍:400-4000
毛細管電壓:3.00 kV
錐孔電壓:150 V
源溫度:150℃
去溶劑化溫度:600℃
逆摺積演算軟體:Waters UNIFI software v1.8.2.
No. | 時間(min) | 流速(ml/min) | A(%) | B(%) |
1 | 0 | 0.5 | 95 | 5 |
2 | 0.5 | 0.5 | 95 | 5 |
3 | 0.51 | 0.2 | 95 | 5 |
4 | 3 | 0.2 | 10 | 90 |
5 | 3.1 | 0.5 | 10 | 90 |
6 | 3.4 | 0.5 | 10 | 90 |
7 | 3.6 | 0.5 | 95 | 5 |
8 | 3.8 | 0.5 | 95 | 5 |
可知,檢測出之質量為148964,為於Asn297之GlcNAc-Fucose之2個部位上帶有SG-F及G0-F各1條之結構(圖32) (圖33)。
3-3. Herceptin[G2-F/M3-F]之製備
3-3-1.於100 mM磷酸緩衝液(pH值6.5)98 μL中添加藉由ENGase而僅於1個部位上帶有G2之Herceptin[G2-F/GlcNAc-Fucose](2 mg;200 μL)、M3-Ox(伏見製藥所製造;1 mM;100 μL)、EndoS D233Q(4.35 μg;2 μL),於30℃下反應12小時。反應後,以與3-1-2相同之順序純化溶液中之抗體。
3-3-2.使用Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR對純化所得之Herceptin進行分取。分取結果所圖34所示。對保持時間45分鐘左右之波峰(圖34之G2-F/M3-F)進行分取。
分取條件
裝置:Shimadzu HPLC 系統 Prominence
管柱:Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR 4.6 mm I.D.×10 cm、5 μm
管柱溫度:25℃
流速:1 ml/min
檢測:UV 280 nm
流動相A:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.5)
流動相B:50 mM檸檬酸緩衝液(pH值4.5)
梯度條件
1. 0-2min A 100%
2. 2-45min A 100-0%
3. 45-55min A 0%
4. 55-60min A 0-100%
5. 60-80min A 100%
3-3-3.藉由LC-MS/MS對所分取之波峰進行完整質量分析。
完整質量分析
裝置:Waters Acquity H-Class Bio UHPLC System with Vion IMS Qtof
管柱:Waters MassPREP 去鹽管柱
管柱溫度:80℃
流動相:A液 0.1% 甲酸
B液 乙腈
將梯度條件示於表7。
[表7]
m/z範圍:400-4000
毛細管電壓:3.00 kV
錐孔電壓:150 V
源溫度:150℃
去溶劑化溫度:600℃
逆摺積演算軟體:Waters UNIFI software v1.8.2.
No. | 時間(min) | 流速(ml/min) | A(%) | B(%) |
1 | 0 | 0.5 | 95 | 5 |
2 | 0.5 | 0.5 | 95 | 5 |
3 | 0.51 | 0.2 | 95 | 5 |
4 | 3 | 0.2 | 10 | 90 |
5 | 3.1 | 0.5 | 10 | 90 |
6 | 3.4 | 0.5 | 10 | 90 |
7 | 3.6 | 0.5 | 95 | 5 |
8 | 3.8 | 0.5 | 95 | 5 |
可知,檢測出之質量為147975,為於Asn297之GlcNAc-Fucose之2個部位上帶有G0-F及M3-F各1條之結構(圖35) (圖36)。
如此,若使用藉由Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR所分取之具有1條糖鏈之抗體,則可藉由導入第2條不同之糖鏈而製作具有非對稱糖鏈之抗體。
[產業上之可利用性]
可使用均一含有具有左右非對稱之糖鏈之抗體之抗體群作為抗體醫藥品等。可用作用於抗體醫藥品品質管理之標準品。
本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請係直接藉由引用而併入至本說明書中。
圖1係表示市售賀癌平(Herceptin)之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果之圖。
圖2係表示市售之賀癌平(Herceptin)之糖鏈結構之圖。圖中「不均一部分」意指市售之賀癌平中存在該部分之結構不同之抗體分子。
圖3係表示經去糖基化之抗體:Herceptin[GlcNAc-Fucose/GlcNAc-Fucose]之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果之圖。
圖4係表示經去糖基化之抗體:Herceptin[GlcNAc-Fucose/GlcNAc-Fucose]之圖。
圖5係表示去糖基化反應溶液之蛋白質A純化結果之圖。
圖6係表示糖基轉移反應所使用之SG-Oxazoline之結構之圖。
圖7係表示使用SG-Ox之糖鏈轉移反應溶液之蛋白質A純化結果之圖。
圖8係表示使用SG-Ox之糖基轉移反應溶液之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果的圖。
圖9係表示Fr.1之抗體:Herceptin[GlcNAc-Fucose/GlcNAc-Fucose]之圖。
圖10係表示Fr.1之完整質量分析結果;Herceptin[GlcNAc-Fucose/GlcNAc-Fucose]之圖。
圖11係表示Fr.2之抗體:Herceptin[SG-F/GlcNAc-Fucose]之圖。
圖12係表示Fr.2之完整質量分析結果;Herceptin[SG-F/GlcNAc-Fucose]之圖。
圖13係表示Fr.3之抗體:Herceptin[SG-F/SG-F]之圖。
圖14係表示Fr.3之抗體:Herceptin[SG-F/SG-F]之完整質量分析結果之圖。
圖15係表示糖基轉移反應中所使用之G2-Oxazoline之結構之圖。
圖16係表示使用了G2-Ox之糖基轉移反應溶液之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果的圖。
圖17係表示經分取之抗體之結構:Herceptin[G2-F/GlcNAc-Fucose]之圖。
圖18係表示經分取之抗體:Herceptin[G2-F/GlcNAc-Fucose]之完整質量分析結果之圖。
圖19係表示糖基轉移反應中所使用之G0-Oxazoline之結構之圖。
圖20係表示使用G0-Ox之糖基轉移反應溶液之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果的圖。
圖21係表示所分取之抗體之結構:Herceptin[G0-F/GlcNAc-Fucose]之圖。
圖22係表示所分取之抗體:Herceptin[G0-F/GlcNAc-Fucose]之完整質量分析結果之圖。
圖23係表示糖基轉移反應所使用之SG-Oxazoline之結構之圖。
圖24係表示使用M3-Ox之糖基轉移反應溶液之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果的圖。
圖25係表示所分取之抗體之結構:Herceptin[M3-F/GlcNAc-Fucose]之圖。
圖26係表示所分取之抗體:Herceptin[M3-F/GlcNAc-Fucose]之完整質量分析結果之圖。
圖27係表示針對SG單鏈抗體使用G2-Ox之糖鏈轉移反應溶液之蛋白質A純化結果之圖。
圖28係表示針對SG單鏈抗體之G2轉移反應溶液之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果的圖。
圖29係表示所分取之抗體:Herceptin[SG-F/G2-F]之結構之圖。
圖30係表示所分取之抗體:Herceptin[SG-F/G2-F]之完整質量分析結果之圖。
圖31係表示針對G0單鏈抗體之SG轉移反應溶液之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果之圖。
圖32係表示所分取之抗體:Herceptin[SG-F/G0-F]之結構之圖。
圖33係表示所分取之抗體:Herceptin[SG-F/G0-F]之完整質量分析結果之圖。
圖34係表示針對M3單鏈抗體之G2轉移反應溶液之Tosoh TSKgel(註冊商標)FcR-IIIA-NPR之分析結果的圖。
圖35係表示所分取之抗體:Herceptin[G2-F/M3-F]之結構之圖。
圖36係表示所分取之抗體:Herceptin[G2-F/M3-F]之完整質量分析結果之圖。
Claims (12)
- 一種抗體群,其均一含有如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體。
- 如請求項1之抗體群,其含有90%以上之如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈互不相同的抗體。
- 如請求項1或2之抗體群,其中在與位於抗體之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)上結合有岩藻糖。
- 一種製造抗體群之方法,該抗體群均一含有如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體,且上述方法包括如下步驟: (i)藉由內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(ENGase)切割抗體組合物中之抗體之左右2條重鏈上所結合之糖鏈,純化兩條重鏈之糖鏈經切割之抗體並將之單離; (ii)將步驟(i)中獲得之兩條重鏈之糖鏈經切割之抗體群、經㗁唑啉化之任意糖鏈X或產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈X之糖衍生物以及為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase加以混合,製作左右2條重鏈中僅一條重鏈上結合有糖鏈X之抗體,純化該抗體並將之單離; (iii)將步驟(ii)中獲得之左右2條重鏈中僅一條重鏈上結合有糖鏈X之抗體、經㗁唑啉化之糖鏈Y即與糖鏈X結構不同之糖鏈Y或產生㗁唑啉之糖衍生物即糖衍生物之糖鏈為糖鏈Y之糖衍生物以及為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase加以混合,製作左右2條重鏈中另一條重鏈上結合有糖鏈Y,從而左右2條重鏈上所結合之糖鏈為結構互不相同之糖鏈的抗體,純化該抗體並將之單離。
- 如請求項4之方法,其使用親和層析法來純化抗體並將之單離,上述親和層析法使用擔載Fcγ受體作為配體之載體。
- 如請求項4或5之方法,其中ENGase為EndoS。
- 如請求項4至6中任一項之方法,其中為了抑制糖鏈切割活性並提高糖鏈轉移活性而經過修飾之ENGase係選自由EndoS D233Q、Endo S2 D184M、Endo S2 D184Q、EndoS D233Q/Q303L、D233Q/A303L/E350Q及Endo M N175Q所組成之群。
- 如請求項4至7中任一項之方法,其中步驟(ii)中結合之糖鏈X之分子量大於步驟(iii)中結合之糖鏈Y之分子量。
- 如請求項4至8中任一項之方法,其製造抗體群,該抗體群含有90%以上之如下抗體,即與抗體之左右2條重鏈之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈互不相同的抗體。
- 如請求項4至9中任一項之方法,其製造在與位於抗體之Fc區域之CH域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N型複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)上結合有岩藻糖的抗體群。
- 一種將抗體群中之抗體區分為未附加糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、及於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體的方法,其係利用使用擔載Fcγ受體作為配體之載體之親和層析法,而將抗體群中之抗體區分為未附加糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、及於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體。
- 如請求項11之方法,其中在藉由內-β-N-乙醯葡萄糖胺糖苷酶(ENGase)處理抗體群後,利用使用擔載Fcγ受體作為配體之載體之親和層析法,而將抗體群中之抗體區分為未附加糖鏈之抗體、於1條重鏈上附加有糖鏈之抗體、及於2條重鏈上附加有糖鏈之抗體。
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