TW202126810A - 寡核苷酸組成物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露尤其提供了C9orf72寡核苷酸、其組成物及方法。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療與C9orf72相關的病症、障礙或疾病之方法，如肌肉萎縮性脊髓側索硬化症和額顳葉失智。

Description

寡核苷酸組成物及其使用方法
寡核苷酸可用於多種應用（例如治療性應用、診斷性應用和/或研究應用）中，包括但不限於多種病症、障礙或疾病之治療。
本揭露提供可降低C9orf72轉錄物（或其產物）的水平的寡核苷酸及其組成物。在一些實施方式中，相比於C9orf72的非疾病相關轉錄物或弱疾病相關轉錄物，所提供的寡核苷酸及組成物可優先降低C9orf72的疾病相關轉錄物（或其產物）的水平（例如參見圖1）。實例C9orf72轉錄物包括自C9orf72基因中的任一條股以及自各種起點產生的轉錄物。在一些實施方式中，至少一些C9orf72轉錄物翻譯成蛋白質；在一些實施方式中，至少一些C9orf72轉錄物不翻譯成蛋白質。在一些實施方式中，某些C9orf72轉錄物主要含有內含子序列。
據報導，C9orf72中的六核苷酸重複擴增（染色體9，開放閱讀框72）係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）及額顳葉失智（FTD）的最常見遺傳原因。包含該重複擴增的C9orf72基因變體和/或其編碼產物也與其他C9orf72相關障礙有關，諸如皮質基底節變性綜合症（CBD）、非典型帕金森氏（Parkinsonian）症候群、橄欖體橋腦小腦變性（OPCD）、原發性側索硬化症（PLS）、進行性肌萎縮症（PMA）、杭丁頓氏舞蹈症（HD）擬表型、阿茲海默氏症（AD）、雙極性障礙、精神分裂症及其他非運動病症。在一些實施方式中，本揭露提供與寡核苷酸有關的組成物及方法，該寡核苷酸靶向C9orf72靶標（例如C9orf72寡核苷酸），且能夠敲低或降低C9orf72靶標基因和/或其基因產物（轉錄物，尤其含有重複擴增的轉錄物，蛋白質等）的表現、水平和/或活性。
在一些實施方式中，一種寡核苷酸靶向包含重複擴增的病理性或疾病相關C9orf72突變或變異。在一些實施方式中，C9orf72基因產物係自C9orf72基因轉錄的RNA（例如mRNA、成熟RNA或mRNA先質）、自C9orf72 RNA轉錄物翻譯的蛋白質（例如自六核苷酸重複序列翻譯的二肽重複蛋白）或病灶（focus）（複數形式：病灶（foci））（據報導其包含由RNA結合蛋白結合的包含重複擴增的RNA）。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸能夠介導含重複擴增的C9orf72 RNA相對於不含重複擴增的C9orf72 RNA（不含重複擴增的C9orf72 RNA）的優先敲低。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸降低有害C9orf72基因產物（例如包含重複擴增的RNA、二肽重複蛋白或病灶）的表現、活性和/或水平，而不會降低（或降低到更低的程度）野生型或非有害C9orf72基因產物的表現、活性和/或水平。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸降低有害C9orf72基因產物的表現、活性和/或水平，但並未將野生型或非有害C9orf72蛋白質的表現、活性和/或水平降低至足以消除或明顯抑制C9orf72蛋白質的一種或多種有益和/或必要生物活性的程度。C9orf72蛋白質的有益和/或必要活性係眾所周知的，且包括但不限於限制發炎、預防自體免疫及預防過早死亡。
本揭露尤其涵蓋，控制C9orf72寡核苷酸的結構元件可對寡核苷酸特性和/或活性具有顯著影響，包括C9orf72靶標基因的敲低。在一些實施方式中，靶標基因的敲低係由影響翻譯的RNase H（核糖核酸酶H）或位阻介導。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的受控結構元件包括但不限於：鹼基序列、化學修飾（例如糖、鹼基和/或核苷酸間鍵聯的修飾）或其模式、立體化學（例如骨架手性核苷酸間鍵聯的立體化學）或其模式的改變、翼結構、核心結構、翼-核心結構、翼-核心-翼結構或核心-翼結構和/或與另外的化學部分（例如碳水化合物部分、靶向部分等）的軛合。在一些實施方式中，本揭露提供用於改善C9orf72寡核苷酸穩定性同時維持或提高寡核苷酸活性的技術（例如化合物、方法等），包括穩定性經改善的寡核苷酸的組成物。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸靶向C9orf72或其產物。在一些實施方式中，靶標基因為C9orf72。
在一些實施方式中，本揭露涵蓋，各種視需要的另外的化學部分（諸如碳水化合物部分、靶向部分等）在併入至C9orf72寡核苷酸中時可改善一個或多個特性。在一些實施方式中，另外的化學部分選自：葡萄糖、GluNAc（N-乙醯葡糖胺）及茴香醯胺部分。本文例如在實例1及2中更詳細地描述該等及其他部分。在一些實施方式中，寡核苷酸可包含兩個或更多個另外的化學部分，其中該另外的化學部分相同或不相同，或屬於同一類別（例如碳水化合物部分、糖部分、靶向部分等）或不屬於同一類別。在一些實施方式中，某些另外的化學部分有助於將寡核苷酸遞送至所需細胞、組織和/或器官，包括但不限於中樞神經系統的特定細胞、部位或部分（例如大腦皮質、海馬區、脊髓等）。在一些實施方式中，某些另外的化學部分促進寡核苷酸的內化。在一些實施方式中，某些另外的化學部分提高寡核苷酸穩定性。在一些實施方式中，本揭露提供用於將各種另外的化學部分併入至寡核苷酸中的技術。在一些實施方式中，本揭露提供例如經由核苷酸間鍵聯、糖和/或核鹼基引入另外的化學部分的試劑及方法（例如，視需要經由連接子藉由共價連接將另外的化學部分引入至糖、核鹼基或核苷酸間鍵聯上的位點）。
在一些實施方式中，本揭露證實，結構包括如本文中所描述的一個或多個特徵的寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）可實現出人意料的高靶標特異性[該一個或多個特徵包括但不限於本文中所揭露的鹼基序列（其中每個U可視需要且獨立地經T取代且反之亦然）和/或化學修飾和/或立體化學和/或其模式和/或其組合。
在一些實施方式中，本揭露證實，某些所提供的結構元件、技術和/或特徵尤其適用於敲低C9orf72的寡核苷酸。然而，無論如何，本揭露的教導不限於參與任何特定生物化學機制或經由任何特定生物化學機制起作用的寡核苷酸。在一些實施方式中，本揭露提供能夠經由某一機制起作用的寡核苷酸，該機制諸如雙股RNA干擾、單股RNA干擾或充當經由RNase H介導的機制或翻譯位阻而降低C9orf72基因或其基因產物的表現、活性和/或水平的反義寡核苷酸的機制。
此外，本揭露關於經由任何機制起作用且包含本文中所描述的任何序列、結構或形式（或其部分）的任何C9orf72寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含鹼基、糖或核苷酸間鍵聯的至少一個非天然存在的修飾。在一些實施方式中，本揭露關於包含至少一個立體受控核苷酸間鍵聯（包括但不限於呈Sp或Rp組態的硫代磷酸酯鍵聯）的任何C9orf72寡核苷酸。在一些實施方式中，本揭露關於經由任何機制起作用且包含至少一個立體受控核苷酸間鍵聯（包括但不限於呈Sp或Rp組態的硫代磷酸酯鍵聯）的任何C9orf72寡核苷酸。在一些實施方式中，本揭露提供一種C9orf72寡核苷酸，其包含：本文中所描述的任何序列、結構或形式（或其部分）；視需要的另外的化學部分（包括但不限於碳水化合物部分及靶向部分）；立體化學或立體化學模式；核苷酸間鍵聯或核苷酸間鍵聯模式；一種或多種糖修飾或糖修飾模式；一種或多種鹼基修飾或鹼基修飾模式。在一些實施方式中，糖、核鹼基或核苷酸間鍵聯的修飾係非天然存在的修飾。
在一些實施方式中，C9orf72障礙相關的靶標等位基因含有內含子1中的六核苷酸重複擴增，包括但不限於G4C2或(GGGGCC)ng，其中ng係30或更多。在一些實施方式中，ng係50或更多。在一些實施方式中，ng係100或更多。在一些實施方式中，ng係150或更多。在一些實施方式中，ng係200或更多。在一些實施方式中，ng係300或更多。在一些實施方式中，ng係500或更多。
據報導，在歐洲血統人群中的10例ALS中，內含子1中的C9orf72 G4C2重複擴增占1例。據報導，G4C2重複序列僅約係轉錄物的10%（例如圖1中所說明的病理性等位基因的轉錄物V3及V1），其具有至少部分地由二肽重複蛋白及病灶形成所介導的功能獲得性毒性，該病灶由例如含有重複擴增的轉錄物和/或剪接掉的含有重複擴增的內含子和/或含有重複擴增的區域及各種核酸結合蛋白的反義轉錄形成。在一些實施方式中，據報導，V1以極低的水平轉錄（約係總C9orf72轉錄物水平的1%），且不會明顯增加包含六核苷酸重複擴增的轉錄物的水平。據報導，含有重複擴增的內含子核酸可以mRNA先質、部分經剪接RNA和/或經剪接掉內含子的形式保留，且包含該等核酸的RNA病灶與RNA結合蛋白螯合相關。C9orf72 RNA病灶描述於例如Liu等人, 2017, Cell Chemical Biology[細胞化學生物學] 24, 1-8；Niblock等人Acta Neuropathologica Communications[神經病理學通訊] (2016) 4:18中。據報導，包含二肽重複蛋白質（DPR蛋白質）的異常蛋白質產物係由重複擴增產生，其具有神經元毒性。在一些實施方式中，本揭露提供寡核苷酸及其組成物及使用方法，其靶向接近G4C2重複序列的內含子序列，且可降低含有重複擴增的轉錄物、該轉錄物編碼的蛋白質和/或相關病灶的水平。在一些實施方式中，本揭露提供C9orf72寡核苷酸及其組成物，其靶向接近G4C2重複序列的內含子序列，以經由RNAse-H特異性地敲低含有重複擴增的轉錄物，其對正常C9orf 72轉錄物具有極小影響。在一些實施方式中，與現有數據進行比較，本揭露證實所提供的靶向內含子序列（例如重複序列與外顯子1b之間的內含子序列）的技術可有效和/或優先降低含有重複擴增的產物的水平。
不希望受任何特定理論束縛，本揭露指出，文獻中已經提出重複擴增的有害及疾病相關作用的若干種可能機制。參見例如：Edbauer等人 2016 Curr. Opin. Neurobiol.[神經生物學新見] 36: 99-106；Conlon等人 Elife. 2016年9月13日; 5. pii: e17820; Xi等人 2015 Acta Neuropathol.[神經病理學報] 129: 715-727；Cohen-Hada等人 2015 Stem Cell Rep.[幹細胞通訊] 7: 927-940；和Burguete等人 eLife 2015;4:e08881。本揭露尤其提供可減少或消除一種或多種或所有有害及疾病相關C9orf72產物和/或疾病相關作用的技術。
不希望受任何特定理論束縛，本揭露指出，含有重複擴增的C9orf72轉錄物的不利作用的可能機制係產生病灶。據報導，重複擴增使含有內含子1的C9orf72 mRNA保留。大部分保留內含子1的C9orf72 mRNA積聚在細胞核中，其在細胞核中靶向無法加工G4C2 RNA重複序列的特定降解途徑。該RNA隨後聚集形成病灶，該病灶也包含RNA結合蛋白，從而隱藏該RNA的正常功能。Niblock Acta Neuropathol Commun.[神經病理學通訊] 2016; 4: 18。據報導，包含反義C9orf72產物的反義病灶以明顯較高的頻率存在於小腦浦金埃氏（Purkinje）神經元及運動神經元中，而有義病灶以明顯較高的頻率存在於小腦顆粒神經元中。Cooper-Knock等人Acta Neuropathol [神經病理學報] (2015) 130:63-75。在一些實施方式中，本揭露提供用於降低病灶水平的技術。在一些實施方式中，所提供的技術降低一種或多種類型的神經元中的反義病灶和/或有義病灶的水平或消除該病灶。
不希望受任何特定理論束縛，本揭露指出，含有重複擴增的C9orf72轉錄物的不利作用的另一可能機制係產生二肽重複（DPR）蛋白質。小部分保留內含子1的C9orf72 mRNA輸出至所有六個閱讀框中用於RAN翻譯（重複序列相關的非AUG翻譯）的細胞質，形成DPR。Niblock Acta Neuropathol Commun.[神經病理學通訊] 2016; 4: 18。Cooper-Knock等人也報導，含有有義或反義所衍生二肽重複蛋白質的包涵體分別以明顯較高的頻率存在於小腦顆粒神經元或運動神經元中；且在作為ALS病變的主要靶標的運動神經元中，存在反義病灶但不存在有義病灶與TDP-43的定位錯誤有關，其係ALS神經退化的標誌。在一些實施方式中，所提供的技術降低一種或多種或所有C9orf72 DPR蛋白質產物的水平。
在一些實施方式中，功能獲得性和/或功能缺失性機制導致C9orf72相關障礙中的神經退化。參見，例如：Mizielinska等人2014 Science [科學] 345: 1192-94；Chew等人2015 Science [科學] 348: 1151-1154；Jiang等人2016 Neuron [神經元] 90: 535-550；及Liu等人2016 Neuron [神經元] 90: 521-534；Gendron等人冷泉港 Perspect. Med.[醫學觀點] 2017年1月27日. pii: a024224；Haeusler等人Nat Rev Neurosci.[自然神經科學評論] 2016年6月; 17(6):383-95；Koppers等人 Ann. Neurol.[神經學年報] 2015; 78:426-438；Todd等人 J. Neurochem.[神經化學] 2016 138 （增刊1）145-162。在一些實施方式中，所提供的技術減少非所要的獲得性功能，和/或恢復或增強所要功能。
在一些實施方式中，所提供寡核苷酸及其組成物及使用方法適用於治療若干C9orf72相關障礙中的任一者，包括但不限於肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）。在一些實施方式中，ALS係MIM：612069。據報導，肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）係一種致命的神經退化性疾病，其臨床特徵係進行性麻痹，其通常在症狀發作的兩至三年內由呼吸衰竭導致死亡（Rowland及Shneider, N. Engl. J. Med.[新英格蘭醫學雜誌], 2001, 344, 1688-1700）。據報導，ALS係西方世界中第三最常見的神經退化性疾病（Hirtz等人, Neurology[神經病學], 2007, 68, 326-337），且目前不存在有效療法。大約10%的病例在本質上係家族性的，而大部分經診斷患有該疾病的患者被分類係偶發性的，因為該患者看起來系在整個群體中隨機出現的（Chio等人, Neurology [神經病學], 2008, 70, 533-537）。據報導，臨床、遺傳及流行病學數據支持以下假設：ALS及額顳葉失智（FTD）表示病理特徵係整個中樞神經系統中存在TDP-43陽性包涵體的疾病的重疊連續體（Lillo及Hodges, J. Clin. Neurosci.[臨床神經科學雜誌], 2009, 16, 1131-1135；Neumann等人, Science [科學], 2006, 314, 130-133）。已發現多個基因潛在地引起典型家族性ALS，例如SOD1、TARDBP、FUS、OPTN及VCP（Johnson等人, Neuron [神經元], 2010, 68, 857-864；Kwiatkowski等人, Science [科學], 2009, 323, 1205-1208；Maruyama等人, Nature [自然], 2010, 465, 223-226；Rosen等人, Nature [自然], 1993, 362, 59-62；Sreedharan等人, Science [科學], 2008, 319, 1668-1672；Vance等人, Brain [腦], 2009, 129, 868-876）。據報導，對涉及多個ALS、FTD及ALS-FTD病例的家族的連鎖分析表明，染色體9的短臂上存在對該疾病而言重要的基因座，經鑒別是C9orf72（Boxer等人, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry [神經病學和神經外科和精神病學雜誌], 2011, 82, 196-203；Morita等人, Neurology [神經病學], 2006, 66, 839-844；Pearson等人J. Neurol.[神經病學], 2011, 258, 647-655；Vance等人, Brain [腦], 2006, 129, 868-876）。此突變被認為係ALS及FTD的最常見遺傳原因。在一些實施方式中，引起ALS-FTD的突變係染色體9上的C9orf72基因的第一內含子中的較大六核苷酸（例如GGGGCC或G4 C2 ）重複擴增（Renton等人, Neuron [神經元], 2011, 72, 257-268；DeJesus-Hernandez等人, Neuron [神經元], 2011, 72, 245-256）。涵蓋C9orf72基因的奠基單倍型（founder haplotype）存在於與此區域有關的大部分病例中（Renton等人, Neuron [神經元], 2011, 72, 257-268）。在一群405個芬蘭患者中，染色體9p21上的此基因座占家族性ALS的接近一半，且占所有ALS病例的接近四分之一（Laaksovirta等人, Lancet Neurol.[柳葉刀神經病學], 2010, 9, 978-985）。據報導，ALS的發病率係1 : 50,000。據報導，家族性ALS代表所有ALS病例的5%-10%；據報導，C9orf72突變可係ALS的最常見原因（40%-50%）。據報導，ALS與腦、腦幹及脊髓的運動皮質中的上運動神經元及下運動神經元兩者的退化相關。據報導，ALS的症狀包括：肌肉無力和/或肌肉萎縮、吞咽或呼吸困難、痙攣、僵硬。據報導，呼吸失效係主要死亡原因。在一些實施方式中，所提供的技術降低與ALS或其他C9orf72相關病症、障礙和/或疾病有關的一個或多個症狀的嚴重程度和/或消除該一個或多個症狀。
在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸及其組成物及使用方法適用於治療若干C9orf72相關障礙中的任一者，包括但不限於額顳葉失智（FTD）。在一些實施方式中，FTD被稱為額顳葉退化或FTLD，MIM：600274。據報導，額顳葉失智係第二最常見形式的初老期失智，據報導其與額葉或顳葉的病灶性萎縮相關。Boxer等人 2005 Alzheimer Dis. Assoc. Disord.[阿茲海默氏症相關障礙] 19 （增刊1）:S3-S6。FTD與肌肉萎縮性脊髓側索硬化症具有大量的臨床、病理學及分子重疊部分。如Gijselinck, Cold Spring Perspect. Med.[冷泉港醫學觀點] 2017年1月27日. pii: a026757所報導，據報導存在出現兩種疾病（ALS-FTD）的家庭及個別患者（Lomen-Hoerth等人2002 Neurology[神經病學] 59:1077-1079），並且儘管ALS及FTLD患者的病理學分佈不同，但ALS及FTLD患者中的TDP-43包涵體（Arai等人2006 Biochem. Biophys. Res. Comm.[生物化學與生物物理學研究通訊]351: 602-611; Neumann等人2006 Science [科學] 314: 130-133）無法區分（Tsuji等人2012 Brain [腦] 135: 3380-3391）。據報導，存在ALS及FTLD可涉及共同疾病路徑的證據，此係由於其臨床及病理學標誌重疊；因此，該等疾病的純形式被視係一個疾病連續體的兩個極端（Lillo及Hodges 2009 J. Clin. Neurosci.[臨床神經科學雜誌] 16: 1131-1135）。據報導，遺傳研究鑒別出FTLD及ALS中的相同基因突變，例如TBK1、TARDBP、FUS、VCP （Neumann等人2006；Kovacs等人2009 Mov. Disord.[運動障礙] 24: 1843-1847；Johnson等人2010 Neuron[神經元] 68: 857-864；Van Langenhove等人2010 Neurology [神經病學] 74: 366-371；Cirulli等人2015 Science[科學] 347: 1436-1441；Freischmidt等人2015 Nat. Neurosci.[自然神經科學] 18: 631-636；Pottier等人2015 Acta Neuropathol.[神經病理學報] 130: 77-92）。據報導，對患有ALS、FTLD及ALS-FTD的患者中的C9orf72的重複擴增突變的鑒別提供共同疾病病理機制的遺傳證據（Gijselinck等人2010 Arch. Neurol.[神經病學學報] 67: 606-616; De Jesus-Hernandez 等人2011 Neuron [神經元] 72: 245-256；Renton等人2011 Neuron [神經元] 72: 257-268）。
在一些實施方式中，C9orf72靶標係特定等位基因（例如具有重複擴增的等位基因），且意欲改變一種或多種產物（例如RNA和/或蛋白質產物，諸如二肽重複蛋白質或DPR）的水平、表現和/或活性。在許多實施方式中，C9orf72靶標等位基因為其存在和/或表現與一種或多種疾病和/或病症或其症狀的存在、發病率和/或嚴重程度相關（例如有關）的等位基因，該一種或多種疾病和/或病症包括但不限於ALS及FTD或其他C9orf72相關障礙。可替代地或另外，在一些實施方式中，C9orf72靶標等位基因為其一種或多種基因產物的表現、水平和/或活性的改變與疾病和/或病症的一個或多個方面的改善（例如發作延遲、嚴重程度降低、對其他治療的反應性等等）有關的等位基因，該疾病和/或病症包括但不限於ALS及FTD或其他C9orf72相關障礙。
在一些實施方式中，神經疾病的特徵在於神經元興奮過度。在一些實施方式中，據報導，由於（GGGGCC）n 擴增和/或在該擴增存在下，C9orf72活性降低50%，其增加經由麩胺酸受體NMDA、AMPA及紅藻胺酸（kainite）的神經傳遞。此外，據報導，麩胺酸受體積聚在神經元上。據報導，神經傳遞增加及麩胺酸受體積聚導致由神經元興奮過度引起的麩胺酸誘導型興奮性毒性。據報導，抑制麩胺酸受體將治療神經元興奮過度。據報導，對由擴增產生的二肽重複蛋白質的清除減弱，由此其神經毒性增強。據報導，C9orf72經由RAB5活化而促進及早內體運輸，該活化需要磷脂醯肌醇3-磷酸酶（PI3P）。PIKFYVE將PI3P轉化成磷脂醯肌醇(3,5)-二磷酸（PI(3,5)P2）。據報導，抑制PIKFYVE將藉由增加PI3P水平而補償改變的RAB5水平，以允許及早內體成熟，其最終將引起二肽重複蛋白質的清除。據報導，神經元還使用內體運輸來調節鈉及鉀離子通道定位。據報導，抑制PIKFYVE也可治療神經元興奮過度。在一些實施方式中，所提供的技術降低神經元興奮過度。在一些實施方式中，所提供的技術可作為與PIKFYVE抑制劑的同一治療方案的部分施用。
在一些實施方式中，本揭露提供一種寡核苷酸組成物，其包含第一多個寡核苷酸，該第一多個寡核苷酸共用： 1) 共同的鹼基序列； 2) 共同的骨架鍵聯模式；並且 3) 共同的骨架手性中心模式，該組成物係實質上純的單一寡核苷酸製劑，因為該組成物中非隨機或受控水平的寡核苷酸具有共同的鹼基序列及長度、共同的骨架鍵聯模式及共同的骨架手性中心模式。
在一些實施方式中，本揭露提供一種C9orf72寡核苷酸組成物，其包含能夠導引C9orf72敲低的第一多個寡核苷酸，其中寡核苷酸具有特定寡核苷酸類型，其特徵係： 1) 共同的鹼基序列和長度； 2) 共同的骨架鍵聯模式；並且 3) 共同的骨架手性中心模式； 該組成物係手性受控的，因為相對於具有相同鹼基序列和長度的寡核苷酸的基本上外消旋製劑而言，該組成物富集特定寡核苷酸類型的寡核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了包含具有相同構成或結構的多種寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸組成物，其中該等寡核苷酸包含一個或多個（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個）手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，多個寡核苷酸的每個寡核苷酸的鹼基序列包含與C9orf72基因或其轉錄物的鹼基序列或其一部分相同或互補的15、16、17、18、19、20或更多個連續的核鹼基。
在一些實施方式中，當所提供的寡核苷酸的鹼基序列與其靶序列比對以獲得最大互補性時，所提供的寡核苷酸的鹼基序列包含一個或多個錯配（例如，不是AT、AU或CG）。在一些實施方式中，錯配在3’端。在一些實施方式中，存在不超過1、2或3個錯配。如本文所證明的，與鹼基序列與其靶序列完全互補的寡核苷酸相比，其鹼基序列包含一個或多個錯配的寡核苷酸（當鹼基序列與靶序列比對時）可意外地提供更高的活性（例如，與靶標轉錄物和RNase H接觸以降低靶標轉錄物的水平時）、較低的毒性等。
在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸（其可靶向C9orf72或靶向C9orf72以外的靶標）包含一個或多個嵌段。在一些實施方式中，嵌段包含一個或多個連續核苷、和/或核苷酸、和/或糖、或鹼基、和/或核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含三個或更多個嵌段，其中兩端上的嵌段不相同，且由此該寡核苷酸係不對稱的。在一些實施方式中，嵌段係翼或核心。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸包含至少一個翼及至少一個核心，其中翼在結構上不同於核心，因為翼包含不同於核心的結構[例如立體化學、另外的化學部分，或糖、鹼基或核苷酸間鍵聯處的化學修飾（或其模式）]，或反之亦然。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含翼-核心-翼結構。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含翼-核心、核心-翼或翼-核心-翼結構，其中一個翼在結構[例如立體化學、另外的化學部分，或糖、鹼基或核苷酸間鍵聯處的化學修飾（或其模式）]上不同於另一翼及核心（例如，不對稱寡核苷酸）。在一些實施方式中，寡核苷酸具有或包含翼-核心、核心-翼或翼-核心-翼結構，且嵌段係翼或核心。在一些實施方式中，核心也稱為缺口。
一般而言，如本文所描述的寡核苷酸組成物的特性可使用任何適當分析評估。
熟悉該項技術者將清楚和/或將能夠容易地開發出用於特定寡核苷酸組成物的適當分析。
相關申請之交叉引用 本申請要求於2019年10月6日提交的美國臨時申請案號62/911,340、於2020年3月1日提交的美國臨時申請案號62/983,736、以及於2020年8月24日提交的美國臨時申請案號63/069,704、以及於2020年5月8日提交的國際申請案號PCT/US 2200/032244之優先權，其各自的全部內容藉由引用併入本文。
定義
如本文所用，除非另外指明，應應用下列定義。出於此揭露的目的，根據元素週期表（Periodic Table of the Elements）, CAS版本, 化學與物理手冊（Handbook of Chemistry and Physics）, 第75版來鑒別化學元素。另外，有機化學的一般原理描述於「Organic Chemistry [有機化學]」, Thomas Sorrell, University Science Books [大學科學書籍], 索薩利托（Sausalito）: 1999及「March's Advanced Organic Chemistry [馬奇高級有機化學]」，第5版，編輯：Smith, M.B.和March, J.,約翰威利父子公司（John Wiley & Sons）, 紐約: 2001。
如本文在本揭露中使用的，除非上下文另有明確說明，否則 (i) 術語「一個（a）」或「一種（an）」可以理解為係指「至少一個」；(ii) 術語「或」可以理解為「和/或」；(iii) 術語「含有（comprising）」，「包含（comprise）」，「包括（including）」（無論是否與「不限於」一起使用）和「包括（include）」（無論是否與「不限於」一起使用）可以理解為涵蓋逐項列出的組分或步驟，無論是單獨顯示還是與一個或多個其他組分或步驟一起顯示；(iv) 術語「另一個」可以理解為係指至少一個另外的/第二的一個或多個；(v) 術語「大約」和「約」可以理解為允許標準差，如熟悉該項技術者將理解的那樣；和 (vi) 提供範圍的情況下，包括端點。
除非另有說明，否則寡核苷酸及其元件的描述（例如鹼基序列、糖修飾、核苷酸間鍵聯、鍵聯磷立體化學等）係從5'至3'。如熟悉該項技術者將理解，在一些實施方式中，寡核苷酸可以作為鹽形式，特別是藥學上可接受的鹽形式（例如鈉鹽）提供和/或使用。如熟悉該項技術者也將理解的，在一些實施方式中，組成物中的單一寡核苷酸可被認為具有相同的構成和/或結構，即使在這樣的組成物（例如液體組成物）中，特別地，這樣的寡核苷酸在特定時間可能處於不同的一種或多種鹽形式（並且例如在液體組成物中時，其可以溶解並且寡核苷酸鏈可以陰離子形式存在）。例如，熟悉該項技術者將意識到，在給定的pH下，沿著寡核苷酸鏈的單個核苷酸間鍵聯可以呈酸（H）形式，或呈多種可能的鹽形式之一（例如鈉鹽或不同陽離子的鹽，取決於製劑或組成物中可能存在哪些離子），並且將會理解，只要它們的酸形式（例如，用H+ 替換所有陽離子，如果有的話）具有相同的構成和/或結構，這樣的單一寡核苷酸可以適當地認為具有相同的構成和/或結構。
脂肪族：如本文所用，「脂肪族」意指完全飽和或含有一個或多個不飽和單元的直鏈（即非支鏈）或支鏈的經取代或未經取代的烴鏈，或完全飽和或含有一個或多個不飽和單元（但非芳族）的經取代或未經取代的單環、雙環或多環烴環，或其組合。在一些實施方式中，脂肪族基團含有1-50個脂肪族碳原子。在一些實施方式中，脂肪族基團含有1-20個脂肪族碳原子。在其他實施方式中，脂肪族基團含有1-10個脂肪族碳原子。在其他實施方式中，脂肪族基團含有1-9個脂肪族碳原子。在其他實施方式中，脂肪族基團含有1-8個脂肪族碳原子。在其他實施方式中，脂肪族基團含有1-7個脂肪族碳原子。在其他實施方式中，脂肪族基團含有1-6個脂肪族碳原子。在還其他實施方式中，脂肪族基團含有1-5個脂肪族碳原子，且在又其他實施方式中，脂肪族基團含有1、2、3或4個脂肪族碳原子。合適的脂肪族基團包括但不限於直鏈或支鏈的經取代或未經取代的烷基、烯基、炔基基團及其雜合物，如(環烷基)烷基、(環烯基)烷基或(環烷基)烯基。
烷基：如本文中所用，術語「烷基」以本技術領域中的其一般含義給出，且可包括飽和脂肪族基，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環烷基（脂環族基）、經烷基取代的環烷基及經環烷基取代的烷基。在一些實施方式中，烷基具有1-100個碳原子。在某些實施方式中，直鏈或支鏈烷基的骨架中具有約1至20個碳原子（例如，直鏈係C1 -C20 ，支鏈係C2 -C20 ），且可替代地具有約1至10個碳原子。在一些實施方式中，環烷基環在這類環為單環、雙環或多環時在其環結構中具有約3-10個碳原子，且可替代地在環結構中具有約5、6或7個碳原子。在一些實施方式中，烷基可係低碳數烷基，其中低碳數烷基包含1至4個碳原子（例如，直鏈低碳數烷基係C1 -C4 ）。
動物：如本文中所用，術語「動物」係指動物界的任何成員。在一些實施方式中，「動物」係指處於任何發育階段的人類。在一些實施方式中，「動物」係指處於任何發育階段的非人類動物。在某些實施方式中，非人類動物係哺乳動物（例如，齧齒類動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、羊、牛、靈長類動物和/或豬）。在一些實施方式中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類和/或蠕蟲。在一些實施方式中，動物可係轉基因動物、經基因工程改造的動物和/或殖株。
大約：如本文所用，關於數字的術語「大約」或「約」通常用於包括在任一方向上（大於或小於）落入5%、10%、15%、或20%範圍的數字，除非數字另有指明或另外從上下文明顯可見（除了會小於可能值的0%或者超過可能值的100%的這種數字）。在一些實施方式中，關於劑量使用術語「約」意指± 5 mg/kg/天。
芳基：如本文所用，單獨使用或作為較大部分如「芳烷基」、「芳烷氧基」或「芳氧基烷基」的一部分使用的術語「芳基」係指總共具有五個至三十個環成員的單環、雙環或多環系統，其中系統中的至少一個環係芳族。在一些實施方式中，芳基為總共具有五個至十四個環成員的單環、雙環或多環系統，其中系統中的至少一個環係芳族的，且其中系統中的各環含有3至7個環成員。在一些實施方式中，芳基為聯芳基。術語「芳基」與術語「芳基環」可互換使用。在本揭露的某些實施方式中，「芳基」係指包括但不限於苯基、聯苯基、萘基、聯萘基、蒽基等的芳環系統，其可具有一個或多個取代基。如本文所用，還包括在術語「芳基」的範圍內的是其中芳環與一個或多個非芳環稠合的基團，如二氫茚基、鄰苯二甲醯亞胺基、口奈啶基、啡啶基或四氫萘基等。
可比較的：術語「可比較的」在本文中用於描述兩組（或更多組）彼此充分相似的條件或環境，以允許比較所獲得的結果或觀察到的現象。在一些實施方式中，可比較的條件或環境的組的特徵在於多個基本相同的特徵和一個或少數變化的特徵。熟悉該項技術者將理解，當由足夠數量和類型的基本相同的特徵表徵時，條件的組彼此係可比較的，以保證合理的結論，即在不同組的條件或環境下獲得的結果或觀察到的現象的差異係由那些變化的特徵的變化引起或指示的。
環脂肪族：術語「環脂肪族（cycloaliphatic）」、「碳環（carbocycle）」、「碳環基（carbocyclyl）」「碳環基團（carbocyclic radical）」和「碳環（carbocyclic ring）」可互換使用，且如本文所用，係指具有3至30個環成員的如本文所述之飽和或部分不飽和但非芳族的環脂肪族單環、雙環或多環系統，除非另有說明。環脂肪族基團包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環庚基、環庚烯基、環辛基、環辛烯基、降莰基、金剛烷基和環辛二烯基。在一些實施方式中，環脂肪族基團具有3-6個碳原子。在一些實施方式中，環脂肪族基團為飽和的且為環烷基。術語「環脂肪族」還可包括與一個或多個芳族或非芳族環稠合的脂肪族環，如十氫萘基或四氫萘基。在一些實施方式中，環脂肪族基團為雙環。在一些實施方式中，環脂肪族基團為三環。在一些實施方式中，環脂肪族基團為多環。在一些實施方式中，「環脂肪族」係指完全飽和或含有一個或多個不飽和單元但非芳族的C3 -C6 單環烴或C8 -C10 雙環或多環烴，其具有連至分子的其餘部分的單一連接點，或係指完全飽和或含有一個或多個不飽和單元但非芳族的C9 -C16 多環烴，其具有連至分子的其餘部分的單一連接點。
給藥方案：如本文所用，「給藥方案」或「治療方案」係指單獨施用受試者的一組單位劑量（通常多於一種），通常藉由一段時間分開。在一些實施方式中，指定治療劑具有推薦的給藥方案，其可涉及一個或多個劑量。在一些實施方式中，給藥方案包含多次給藥，其中的每一者彼此間隔開相同長度的時段；在一些實施方式中，給藥方案包含多個劑量及至少兩個用於隔開個別劑量的不同時間段。在一些實施方式中，給藥方案內的所有給藥具有相同單位給藥量。在一些實施方式中，給藥方案內的不同給藥具有不同的量。在一些實施方式中，給藥方案包含呈第一給藥量的第一次給藥，接著係呈不同於第一給藥量的第二給藥量的一次或多次其他給藥。在一些實施方式中，給藥方案包含呈第一給藥量的第一次給藥，接著係呈與第一給藥量相同的第二給藥量的一次或多次其他給藥。
雜脂肪族：如本文所用，術語「雜脂肪族」以它在本領域中的普通含義給出，並且是指其中一個或多個碳原子獨立地被一個或多個雜原子（例如，氧、氮、硫、矽、磷等）替換的如本文所述之脂肪族基團。在一些實施方式中，選自C、CH、CH2 及CH3 的一個或多個單元獨立地經一個或多個雜原子（包括其經氧化和/或經取代形式）替換。在一些實施方式中，雜脂肪族基團為雜烷基。在一些實施方式中，雜脂肪族基團為雜烯基。
雜烷基：如本文所用，術語「雜烷基」以它在本領域中的普通含義給出，並且是指其中一個或多個碳原子獨立地被一個或多個雜原子（例如，氧、氮、硫、矽、磷等）替換的如本文所述之烷基基團。雜烷基的實例包括但不限於烷氧基、聚(乙二醇)-、經烷基取代的胺基、四氫呋喃基、哌啶基、𠰌啉基等。
雜芳基：如本文所用，單獨使用或作為較大部分例如「雜芳烷基」或「雜芳烷氧基」的一部分使用的術語「雜芳基」和「雜芳-」係指總共具有五個至三十個環成員的單環、雙環或多環系統，其中系統中的至少一個環係芳族且至少一個芳環原子為雜原子。在一些實施方式中，雜芳基係具有5至10個環原子的基團（即，單環、雙環或多環），在一些實施方式中具有5、6、9或10個環原子。在一些實施方式中，雜芳基具有在環狀陣列中共用的6、10或14個π電子；並且除碳原子外，還具有一至五個雜原子。雜芳基包括但不限於噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、㗁唑基、異㗁唑基、㗁二唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、吡啶基、嗒𠯤基、嘧啶基、吡𠯤基、   吲口巾基、嘌呤基、口奈啶基和喋啶基。在一些實施方式中，雜芳基為雜聯芳基，如聯吡啶基等。如本文所用，術語「雜芳基」和「雜芳基-」還包括其中雜芳環與一個或多個芳基環、環脂肪族環或雜環基環稠合的基團，其中附接基團或附接點在雜芳環上。非限制性實例包括吲哚基、異吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、異喹啉基、口辛啉基、酞𠯤基、喹唑啉基、喹㗁啉基、4H-喹𠯤基、咔唑基、吖啶基、吩𠯤基、吩噻𠯤基、吩㗁𠯤基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、以及吡啶并[2,3-b]-1,4-㗁𠯤-3(4H)-酮。雜芳基可以是單環的、雙環的或多環的。術語「雜芳基（heteroaryl）」可以與術語「雜芳基環（heteroaryl ring）」、「雜芳基基團（heteroaryl group）」或「雜芳族（heteroaromatic）」互換使用，該術語中的任一者包括視需要經取代的環。術語「雜芳烷基」係指被雜芳基基團取代的烷基基團，其中烷基部分和雜芳基部分獨立地視需要被取代。
雜原子：如本文所用，術語「雜原子」意指不是碳或氫的原子。在一些實施方式中，雜原子係硼、氧、硫、氮、磷、或矽（包括氮、硫、磷、或矽的任何氧化的形式；任何鹼性氮或雜環的可取代氮的季銨化形式（例如，如在3,4-二氫-2H-吡咯基中的N）、NH（如在吡咯啶基中）或NR+ （如在N-取代的吡咯啶基中）；等）。
雜環：如本文所用，術語「雜環（heterocycle）」、「雜環基（heterocyclyl）」、「雜環基基團（heterocyclic radical）」和「雜環（heterocyclic ring）」可互換使用，並且是指飽和或部分不飽和且具有一個或多個雜原子環原子的單環、雙環或多環部分（例如，3-30員）。在一些實施方式中，雜環基基團係穩定的5員至7員單環或7員至10員雙環雜環部分，其係飽和或部分不飽和的且除碳原子外具有一個或多個、較佳的是一至四個如以上所定義的雜原子。當關於雜環的環原子使用時，術語「氮」包括取代的氮。作為實例，在具有0-3個選自氧、硫和氮的雜原子的飽和或部分不飽和環中，氮可以是N（如在3,4-二氫-2H-吡咯基中）、NH（如在吡咯啶基中）或+ NR（如在經N-取代的吡咯啶基中）。雜環可以在產生穩定結構的任何雜原子或碳原子處與其側基附接，並且任何環原子可以視需要被取代。此類飽和或部分不飽和的雜環基團的實例包括但不限於四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯啶基、哌啶基、吡咯啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、㗁唑烷基、哌𠯤基、二㗁𠮿基、二氧戊環基、二氮呯基、氧氮呯基、硫氮呯基、𠰌啉基和口昆啶基。術語「雜環（heterocycle）」、「雜環基（heterocyclyl）」、「雜環基環（heterocyclyl ring）」、「雜環基團（heterocyclic group）」、「雜環部分（heterocyclic moiety）」和「雜環基團（heterocyclic radical）」在本文中可互換使用，並且還包括其中雜環基環與一個或多個芳基、雜芳基或環脂肪族環稠合的基團，如吲哚啉基、3H-吲哚基、苯并二氫哌喃基、啡啶基或四氫喹啉基。雜環基可以是單環的、雙環的或多環的。術語「雜環基烷基」係指被雜環基取代的烷基基團，其中烷基部分和雜環基部分獨立地視需要被取代。
體外：如本文所用，術語「體外」係指在人造環境中（例如在試管或反應容器中、在細胞培養物中等）而不是在生物體（例如，動物、植物和/或微生物）內發生的事件。
體內：如本文所用，術語「體內」係指在生物體（例如，動物、植物和/或微生物）內發生的事件。
視需要經取代的：如本文所述，本揭露的化合物（例如寡核苷酸）可以含有視需要經取代的部分和/或經取代的部分。通常，術語「經取代的」，無論前面是否有術語「視需要」，均意指指定部分的一個或多個氫被合適的取代基替換。除非另外指明，否則「視需要經取代的」基團可以在該基團的每個可取代位置處具有合適的取代基，且當任何給定結構中的超過一個位置可以被選自指定基團的超過一個取代基取代時，在每一位置處的取代基可以相同或不同。在一些實施方式中，視需要經取代的基團係未經取代的。本揭露所設想的取代基的組合較佳的是導致形成穩定的或化學上可行的化合物的組合。如本文所用，術語「穩定」係指如下化合物，在出於本文所揭露的一個或多個目的而經歷其製備、檢測以及在某些實施方式中經歷其回收、純化和使用的條件時，它們基本上不發生改變。
在可取代原子（例如，合適的碳原子）上的合適的單價取代基獨立地是鹵素；-(CH2 )0-4 R°；-(CH2 )0-4 OR°；-O(CH2 )0-4 R°、-O-(CH2 )0-4 C(O)OR°；-(CH2 )0-4 CH(OR°)2 ；-(CH2 )0-4 Ph，其可經R°取代；-(CH2 )0-4 O(CH2 )0-1 Ph，其可經R°取代；-CH=CHPh，其可經R°取代；-(CH2 )0-4 O(CH2 )0-1 -吡啶基，其可經R°取代；-NO2 ；-CN；-N3 ；-(CH2 )0-4 N(R°)2 ；-(CH2 )0-4 N(R°)C(O)R°；-N(R°)C(S)R°；-(CH2 )0-4 N(R°)C(O)NR°2 ；-N(R°)C(S)NR°2 ；-(CH2 )0-4 N(R°)C(O)OR°；-N(R°)N(R°)C(O)R°；-N(R°)N(R°)C(O)NR°2 ；-N(R°)N(R°)C(O)OR°；-(CH2 )0-4 C(O)R°；-C(S)R°；-(CH2 )0-4 C(O)OR°；-(CH2 )0-4 C(O)SR°；-(CH2 )0-4 C(O)OSiR°3 ；-(CH2 )0-4 OC(O)R°；-OC(O)(CH2 )0-4 SR, -SC(S)SR°；-(CH2 )0-4 SC(O)R°；-(CH2 )0-4 C(O)NR°2 ；-C(S)NR°2 ；-C(S)SR°；-SC(S)SR°，-(CH2 )0-4 OC(O)NR°2 ；-C(O)N(OR°)R°；-C(O)C(O)R°；-C(O)CH2 C(O)R°；-C(NOR°)R°；-(CH2 )0-4 SSR°；-(CH2 )0-4 S(O)2 R°；-(CH2 )0-4 S(O)2 OR°；-(CH2 )0-4 OS(O)2 R°；-S(O)2 NR°2 ；-(CH2 )0-4 S(O)R°；-N(R°)S(O)2 NR°2 ；-N(R°)S(O)2 R°；-N(OR°)R°；-C(NH)NR°2 ；-Si(R°)3 ；-OSi(R°)3 ；-B(R°)2 ；-OB(R°)2 ；-OB(OR°)2 ；-P(R°)2 ；-P(OR°)2 ；-OP(R°)2 ；-OP(OR°)2 ；-P(O)(R°)2 ；-P(O)(OR°)2 ；-OP(O)(R°)2 ；-OP(O)(OR°)2 ；-OP(O)(OR°)(SR°)；-SP(O)(R°)2 ；-SP(O)(OR°)2 ；-N(R°)P(O)(R°)2 ；-N(R°)P(O)(OR°)2 ；-P(R°)2 [B(R°)3 ]；-P(OR°)2 [B(R°)3 ]；-OP(R°)2 [B(R°)3 ]；-OP(OR°)2 [B(R°)3 ]；-(C1-4 直鏈或支鏈伸烷基)O-N(R°)2 ；或-(C1-4 直鏈或支鏈伸烷基)C(O)O-N(R°)2 ，其中每個R°可如下文所定義取代且獨立地是氫；C1-20 脂肪族；具有1至5個獨立地選自氮、氧、硫、矽及磷的雜原子的C1-20 雜脂肪族；-CH2 -(C6-14 芳基)；-O(CH2 )0-1 (C6-14 芳基)；-CH2 -(5員至14員雜芳基環)；具有0至5個獨立地選自氮、氧、硫、矽及磷的雜原子的5員至20員單環、雙環或多環的飽和環、部分不飽和環或芳基環；或者不管上述定義，兩個獨立出現的R°與居於它們之間的一個或多個原子一起形成具有0至5個獨立地選自氮、氧、硫、矽及磷的雜原子的5員至20員單環、雙環或多環的飽和環、部分不飽和環或芳基環，其可如下文所定義取代。
R°（或由兩個獨立出現的R°與居於它們之間的原子共同形成的環）上的適合的單價取代基獨立地是鹵素、-(CH2 )0-2 R● 、-(鹵代R● )、-(CH2 )0-2 OH、-(CH2 )0-2 OR● 、-(CH2 )0-2 CH(OR● )2 、-O(鹵代R● )、-CN、-N3 、-(CH2 )0-2 C(O)R● 、-(CH2 )0-2 C(O)OH、-(CH2 )0-2 C(O)OR● 、-(CH2 )0-2 SR● 、-(CH2 )0-2 SH、-(CH2 )0-2 NH2 、-(CH2 )0-2 NHR● 、-(CH2 )0-2 NR● 2 、-NO2 、-SiR● 3 、-OSiR● 3 、-C(O)SR● 、 -(C1-4 直鏈或支鏈伸烷基)C(O)OR● 或-SSR● ，其中每個R● 係未經取代的或在前面有「鹵代」的情況下僅被一個或多個鹵素取代，且獨立地選自C1-4 脂肪族、-CH2 Ph、-O(CH2 )0-1 Ph以及具有0-4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子的5-6員飽和環、部分不飽和環或芳基環。在R°的飽和碳原子上的合適的二價取代基包括=O及=S。
例如在合適的碳原子上的合適的二價取代基獨立地是以下：=O、=S、=NNR* 2 、=NNHC(O)R* 、=NNHC(O)OR* 、=NNHS(O)2 R* 、=NR* 、=NOR* 、-O(C(R* 2 ))2-3 O-或-S(C(R* 2 ))2-3 S-，其中每個獨立出現的R* 選自氫、可以如下文所定義地被取代的C1-6 脂肪族、以及具有0-4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子的未經取代的5-6員飽和環、部分不飽和環或芳基環。與「視需要經取代的」基團的鄰位可取代碳結合的合適的二價取代基包括：-O(CR* 2 )2-3 O-，其中各獨立出現的R* 係選自氫、可如下文所定義經取代的C1-6 脂肪族基，以及具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫的雜原子的未經取代的5員至6員飽和環、部分不飽和環或芳基環。
R* 的脂肪族基團上的合適的取代基獨立地是鹵素、-R● 、-(鹵代R● )、-OH、-OR● 、-O(鹵代R● )、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR● 、-NH2 、-NHR● 、-NR● 2 或-NO2 ，其中每個R● 係未取代的或在前面有「鹵代」的情況下僅被一個或多個鹵素取代，且獨立地是C1-4 脂肪族、-CH2 Ph、-O(CH2 )0-1 Ph或具有0至4個獨立地選自氮、氧及硫的雜原子的5-6員飽和環、部分不飽和環或芳基環。
口服：如本文所用的短語「口服施用（oral administration和administered orally）」具有其領域所理解的含義，係指藉由口施用化合物或組成物。
腸胃外：如本文所用的短語「腸胃外施用（parenteral administration和administered parenterally）」具有其領域所理解的含義，係指除了腸內和局部施用之外的施用方式，通常是藉由注射，並且包括但不局限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊髓內以及胸骨內注射和輸注。
部分不飽和的：如本文使用的，術語「部分不飽和的」係指包括至少一個雙鍵或三鍵的環部分。術語「部分不飽和的」意在涵蓋具有多個不飽和的位點的環，但是如在此定義的不意在包括芳基或雜芳基部分。
藥物組成物：如本文所用，術語「藥物組成物」係指與一種或多種藥學上可接受的載體一起配製的活性劑。在一些實施方式中，活性劑以適合於在治療方案中施用的單位劑量存在，其顯示當施用於相關群體時實現預定的治療效果的統計學顯著概率。在一些實施方式中，藥物組成物能以固體或液體形式被特別配製以進行施用，包括適用於以下的那些：口服施用，例如，浸液（drench）（水性或非水性溶液或懸浮液）、片劑（例如針對口腔、舌下和全身吸收的那些）、大丸劑、粉劑、顆粒劑、糊劑（應用於舌）；腸胃外施用，例如，作為例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放的配製物藉由皮下、肌內、靜脈內或硬膜外注射；局部應用，例如，作為乳膏劑、軟膏劑、或控制釋放貼劑或噴霧劑應用於皮膚、肺或口腔；陰道內或直腸內，例如作為陰道栓劑、乳膏劑或泡沫劑；舌下；眼部；透皮；或經鼻、肺以及應用於其他黏膜表面。
藥學上可接受的：如本文所用，短語「藥學上可接受的」係指在合理醫學判斷的範圍內適合於與人類和動物的組織接觸使用而無過多毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的效益/風險比相稱的那些化合物、材料、組成物、和/或劑型。
藥學上可接受的載體：如本文所用，術語「藥學上可接受的載體」意指藥學上可接受的材料、組成物或媒劑，如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包封材料，其涉及將主題化合物從一個器官（或身體的一部分）攜帶或運輸到另一個器官或身體的一部分。在與配製物的其他成分相容並且對患者無害的意義上，每種載體必須是「可接受的」。可充當藥學上可接受的載體的材料的一些實例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉狀黃茋膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，如可可脂和栓劑蠟；油，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及在藥物配製物中採用的其他無毒相容的物質。
藥學上可接受的鹽：如本文所用，術語「藥學上可接受的鹽」係指適合於在製藥環境中使用的此類化合物的鹽，即，在合理醫學判斷的範圍內，適合於與人類和低等動物的組織接觸使用而無不當毒性、刺激、過敏反應等並且與合理的效益/風險比相稱的鹽。藥學上可接受的鹽係本領域公知的。例如，S. M. Berge等人在J. Pharmaceutical Sciences [藥物科學雜誌], 66: 1-19 (1977) 中詳細地描述了藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽包括但不限於無毒的酸加成鹽，其係使用無機酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和過氯酸或使用有機酸如乙酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸或藉由使用本領域中所使用的其他方法如離子交換形成的具有胺基基團的鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽包括但不限於己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽（hemisulfate）、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘化物、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽（lactobionate）、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽等。在一些實施方式中，所提供的化合物（例如寡核苷酸）包含一個或多個酸性基團，且藥學上可接受的鹽係鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或銨鹽（例如，N(R)3 的銨鹽，其中每個R在本揭露中被獨立地定義和描述）。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鈉鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鉀鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鈣鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽適當地包括使用平衡離子（如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有從1至6個碳原子的烷基、磺酸根以及芳基磺酸根）形成的無毒銨、季銨以及胺陽離子。在一些實施方式中，所提供的化合物包含多於一個酸性基團，例如，所提供的寡核苷酸可以包含兩個或更多個酸性基團（例如，天然磷酸酯鍵和/或經修飾的核苷酸間鍵聯）。在一些實施方式中，這種化合物的藥學上可接受的鹽（或者通常，鹽）包含兩個或更多個陽離子，該兩個或更多個陽離子可以是相同的或不同的。在一些實施方式中，在藥學上可接受的鹽（或者通常，鹽）中，酸性基團中的所有可電離氫被陽離子替換。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係所提供的寡核苷酸的鈉鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係所提供的寡核苷酸的鈉鹽，其中每個酸性鍵聯基團（例如，每個天然磷酸酯鍵聯、每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯等）獨立地以鈉鹽形式（所有鈉鹽）存在。
保護基團：如本文所用，術語「保護基團」係本領域熟知的並且包括在Protecting Groups in Organic Synthesis [有機合成中的保護基團] T. W. Greene和P. G. M. Wuts, 第3版, 約翰威利父子公司, 1999中詳細描述的那些，將該文獻的全部內容藉由引用併入本文。還包括那些特別適用於核苷和核苷酸化學的保護基團，該保護基團描述於由Serge L. Beaucage等人在2012年06月編輯的Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry [核酸化學實驗室指南] 中，將章節2的全部內容藉由引用併入本文。合適的胺基-保護基團包括胺基甲酸甲酯、胺基甲酸乙酯、9-茀基胺基甲酸甲酯（Fmoc）、9-(2-磺酸基)茀基胺基甲酸甲酯、9-(2,7-二溴)茀基胺基甲酸甲酯、2,7-二-三級丁基-[9-(10,10-二側氧基-10,10,10,10-四氫硫口山口星基)]胺基甲酸甲酯（DBD-Tmoc）、4-甲氧基苯醯基胺基甲酸酯（Phenoc）、2,2,2-三氯乙基胺基甲酸酯（Troc）、2-三甲基矽基乙基胺基甲酸酯（Teoc）、2-苯基乙基胺基甲酸酯（hZ）、1-(1-金剛烷基)-1-甲基乙基胺基甲酸酯（Adpoc）、1,1-二甲基-2-鹵代乙基胺基甲酸酯、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基胺基甲酸酯（DB-t-BOC）、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基胺基甲酸酯（TCBOC）、1-甲基-1-(4-聯苯基)乙基胺基甲酸酯（Bpoc）、1-(3,5-二-三級丁基苯基)-1-甲基乙基胺基甲酸酯（t-Bumeoc）、2-(2’-和4’-吡啶基)乙基胺基甲酸酯（Pyoc）、2-(N,N-二環己基甲醯胺基)乙基胺基甲酸酯、胺基甲酸三級丁酯（BOC）、1-金剛烷基胺基甲酸酯（Adoc）、胺基甲酸乙烯基酯（Voc）、胺基甲酸烯丙基酯（Alloc）、1-異丙基烯丙基胺基甲酸酯（Ipaoc）、肉桂基胺基甲酸酯（Coc）、4-硝基肉桂基胺基甲酸酯（Noc）、8-喹啉基胺基甲酸酯、N-羥基哌啶基胺基甲酸酯、烷基二硫胺基甲酸酯、苄基胺基甲酸酯（Cbz）、對甲氧基苄基胺基甲酸酯（Moz）、對硝基苄基胺基甲酸酯、對溴苄基胺基甲酸酯、對氯苄基胺基甲酸酯、2,4-二氯苄基胺基甲酸酯、4-甲基亞磺醯基苄基胺基甲酸酯（Msz）、9-蒽基胺基甲酸甲酯、聯苯基胺基甲酸甲酯、2-甲硫基乙基胺基甲酸酯、2-甲基磺醯基乙基胺基甲酸酯、2-(對甲苯磺醯基)乙基胺基甲酸酯、[2-(1,3-二噻𠮿基)]胺基甲酸甲酯（Dmoc）、4-甲硫基苯基胺基甲酸酯（Mtpc）、2,4-二甲硫基苯基胺基甲酸酯（Bmpc）、2-磷鎓基乙基胺基甲酸酯（Peoc）、2-三苯基磷鎓基異丙基胺基甲酸酯（Ppoc）、1,1-二甲基-2-氰基乙基胺基甲酸酯、間-氯-對醯氧基苄基胺基甲酸酯、對(二羥基硼烷基)苄基胺基甲酸酯、5-苯并異㗁唑基胺基甲酸甲酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基胺基甲酸甲酯（Tcroc）、間-硝基苯基胺基甲酸酯、3,5-二甲氧基苄基胺基甲酸酯、鄰-硝基苄基胺基甲酸酯、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基胺基甲酸酯、苯基(鄰-硝基苯基)甲基胺基甲酸酯、吩噻𠯤基-(10)-羰基衍生物、N’-對甲苯磺醯基胺基羰基衍生物、N’-苯基胺基硫代羰基衍生物、胺基甲酸三級戊酯、S-苯基硫胺基甲酸酯、對氰基苄基胺基甲酸酯、環丁基胺基甲酸酯、環己基胺基甲酸酯、環戊基胺基甲酸酯、環丙基胺基甲酸甲酯、對-癸氧基苄基胺基甲酸酯、2,2-二甲氧基羰基乙烯基胺基甲酸酯、鄰-(N,N-二甲基甲醯胺基)苄基胺基甲酸酯、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲醯胺基)丙基胺基甲酸酯、1,1-二甲基丙炔基胺基甲酸酯、二(2-吡啶基)胺基甲酸甲酯、2-呋喃基胺基甲酸甲酯、2-碘乙基胺基甲酸酯、異冰片基胺基甲酸酯、異丁基胺基甲酸酯、異煙基胺基甲酸酯、對-(對’-甲氧基苯基偶氮基)苄基胺基甲酸酯、1-甲基環丁基胺基甲酸酯、1-甲基環己基胺基甲酸酯、1-甲基-1-環丙基胺基甲酸甲酯、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基胺基甲酸酯、1-甲基-1-(對苯基偶氮基苯基)乙基胺基甲酸酯、1-甲基-1-苯基乙基胺基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基胺基甲酸酯、苯基胺基甲酸酯、對-(苯基偶氮基)苄基胺基甲酸酯、2,4,6-三-三級丁基苯基胺基甲酸酯、4-(三甲基銨)苄基胺基甲酸酯、2,4,6-三甲基苄基胺基甲酸酯、甲醯胺、乙醯胺、氯乙醯胺、三氯乙醯胺、三氟乙醯胺、苯基乙醯胺、3-苯基丙醯胺、氮苯醯胺、3-吡啶基甲醯胺、N-苯甲醯基苯基丙胺醯衍生物、苯甲醯胺、對-苯基苯甲醯胺、鄰-硝基苯基乙醯胺、鄰-硝基苯氧基乙醯胺、乙醯基乙醯胺、(N’-二硫苄氧基羰基胺基)乙醯胺、3-(對-羥基苯基)丙醯胺、3-(鄰-硝基苯基)丙醯胺、2-甲基-2-(鄰-硝基苯氧基)丙醯胺、2-甲基-2-(鄰-苯基偶氮基苯氧基)丙醯胺、4-氯丁醯胺、3-甲基-3-硝基丁醯胺、鄰-硝基肉桂醯胺、N-乙醯基甲硫胺酸衍生物、鄰-硝基苯甲醯胺、鄰-(苯甲醯基氧基甲基)苯甲醯胺、4,5-二苯基-3-㗁唑啉-2-酮、N-鄰苯二甲醯亞胺、N-二硫琥珀醯亞胺（Dts）、N-2,3-二苯基馬來醯亞胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二矽基氮雜環戊烷加合物（STABASE）、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮雜環己烷-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮雜環己烷-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲基胺、N-烯丙基胺、N-[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基胺（SEM）、N-3-乙醯氧基丙基胺、N-(1-異丙基-4-硝基-2-氧基-3-吡咯啉-3-基)胺、季銨鹽、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲基胺、N-5-二苯并環庚胺、N-三苯基甲基胺（Tr）、N-[(4-甲氧基苯基)聯苯基甲基]胺（MMTr）、N-9-苯基茀基胺（PhF）、N-2,7-二氯-9-茀基亞甲胺、N-二茂鐵基甲基胺基（Fcm）、N-2-吡啶甲基胺基N’-氧化物、N-1,1-二甲硫基亞甲胺、N-苄基亞甲胺、N-對甲氧基苄基亞甲胺、N-二苯基亞甲胺、N-[(2-吡啶基)三甲苯基]亞甲胺、N-(N’,N’-二甲基胺基亞甲基)胺、N,N’-異亞丙二胺、N-對-硝基苄基亞甲胺、N-亞水楊酸基胺、N-5-氯亞水楊酸基胺、N-(5-氯-2-羥基苯基)苯基亞甲胺、N-環己基亞甲胺、N-(5,5-二甲基-3-氧基-1-環己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基二取代硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基鉻-或鎢)羰基]胺、N-銅螯合物、N-鋅螯合物、N-硝胺、N-硝基胺、N-氧化胺、聯苯基膦醯胺（Dpp）、二甲硫基膦醯胺（Mpt）、聯苯基硫代膦醯胺（Ppt）、二烷基胺基磷酸酯、聯苄基胺基磷酸酯、聯苯基胺基磷酸酯、苯次磺醯胺、鄰-硝基苯次磺醯胺（Nps）、2,4-二硝基苯次磺醯胺、五氯苯次磺醯胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺醯胺、三苯基甲基次磺醯胺、3-硝基吡啶次磺醯胺（Npys）、對-甲苯磺醯胺（Ts）、苯磺醯胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺醯胺（Mtr）、2,4,6-三甲氧基苯磺醯胺（Mtb）、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺醯胺（Pme）、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺醯胺（Mte）、4-甲氧基苯磺醯胺（Mbs）、2,4,6-三甲基苯磺醯胺（Mts）、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺醯胺（iMds）、2,2,5,7,8-戊甲基色滿-6-磺醯胺（Pmc）、甲磺醯胺（Ms）、β-三甲基矽基乙磺醯胺（SES）、9-蒽磺醯胺、4-(4’,8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺醯胺（DNMBS）、苄基磺醯胺、三氟甲基磺醯胺、和苯醯基磺醯胺。
適當保護的羧酸進一步包括但不限於矽基-、烷基-、烯基-、芳基-、和芳基烷基-保護的羧酸。合適的矽基基團的實例包括三甲基矽基、三乙基矽基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基聯苯基矽基、三異丙基矽基等。合適的烷基基團的實例包括甲基、苄基、對甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、三苯甲基、三級丁基、四氫哌喃-2-基。合適的烯基基團的實例包括烯丙基。合適的芳基基團的實例包括視需要經取代的苯基、聯苯基、或萘基。合適的芳基烷基基團的實例包括視需要經取代的苄基（例如，對甲氧基苄基（MPM）、3,4-二甲氧基苄基、鄰硝基苄基、對硝基苄基、對鹵代苄基、2,6-二氯苄基、對氰基苄基）、以及2-吡啶甲基和4-吡啶甲基。
合適的羥基保護基團包括甲基、甲氧基甲基（MOM）、甲基硫代甲基（MTM）、三級丁基硫代甲基、(苯基二甲基矽基)甲氧基甲基（SMOM）、苄氧基甲基（BOM）、對甲氧基苄氧基甲基（PMBM）、(4-甲氧基苯氧基)甲基（對-AOM）、愈創木酚甲基（GUM）、三級丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基（POM）、矽烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基（MEM）、2,2,2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基矽基)乙氧基甲基（SEMOR）、四氫哌喃基（THP）、3-溴四氫哌喃基、四氫噻喃基、1-甲氧基環己基、4-甲氧基四氫哌喃基（MTHP）、4-甲氧基四氫噻喃基、4-甲氧基四氫噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯代-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基（CTMP）、1,4-二㗁𠮿-2-基、四氫呋喃基、四氫噻吩基（tetrahydrothiofuranyl）、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氫-7,8,8-三甲基-4,7-橋亞甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基矽基乙基、2-(苯基氫硒基)乙基、三級丁基、烯丙基、對氯苯基、對甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、對甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、鄰硝基苄基、對硝基苄基、對鹵代苄基、2,6-二氯苄基、對氰基苄基、對苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧化基、二苯基甲基、p,p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并環庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、對甲氧基苯基二苯基甲基、二(對甲氧基苯基)苯基甲基、三(對甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯醯基氧基苯基)二苯基甲基、4,4’,4’’-三(4,5-二氯鄰苯二甲醯亞胺基苯基)甲基、4,4’,4’’-三(乙醯丙醯基氧基苯基)甲基、4,4’,4’’-三(苯甲醯基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)二(4’,4’’-二甲氧基苯基)甲基、1,1-二(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)𠮿基、9-(9-苯基-10-側氧基)蒽基、1,3-苯并二硫烷-2-基、苯并異噻唑基S,S-二氧化基、三甲基矽基（TMS）、三乙基矽基（TES）、三異丙基矽基（TIPS）、二甲基異丙基矽基（IPDMS）、二乙基異丙基矽基（DEIPS）、二甲基三級己基（thexyl）矽基、三級丁基二甲基矽基（TBDMS）、三級丁基二苯基矽基（TBDPS）、三苄基矽基、三對二甲苯基矽基、三苯基矽基、二苯基甲基矽基（DPMS）、三級丁基甲氧基苯基矽基（TBMPS）、甲酸酯、苯甲醯甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、對氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-側氧基戊酸酯（乙醯丙酸酯）、4,4-(伸乙基二硫代)戊酸酯（乙醯丙醯基二硫代乙縮醛）、新戊酸酯、金剛酸酯（adamantoate）、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、對苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯（菜酸酯（mesitoate））、烷基甲基碳酸酯、9-茀基甲基碳酸酯（Fmoc）、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯（Troc）、2-(三甲基矽基)乙基碳酸酯（TMSEC）、2-(苯基磺醯基)乙基碳酸酯（Psec）、2-(三苯基磷鎓基)乙基碳酸酯（Peoc）、烷基異丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基對硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基對甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基鄰硝基苄基碳酸酯、烷基對硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-疊氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、鄰-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲醯基苯磺酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-二(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、異丁酸酯、單琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、對-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N’,N’-四甲基二胺基磷酸酯、烷基N-苯基胺基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2,4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲磺酸酯（methanesulfonate、mesylate）、苄基磺酸酯以及甲苯磺酸酯（Ts）。為了保護1,2-二醇或1,3-二醇，保護基團包括亞甲基縮醛、亞乙基縮醛、1-三級丁基亞乙基縮酮、1-苯基亞乙基縮酮、(4-甲氧基苯基)亞乙基縮醛、2,2,2-三氯亞乙基縮醛、縮丙酮、亞環戊基縮酮、亞環己基縮酮、亞環庚基縮酮、亞苄基縮醛、對-甲氧基亞苄基縮醛、2,4-二甲氧基亞苄基縮酮、3,4-二甲氧基亞苄基縮醛、2-硝基亞苄基縮醛、甲氧基亞甲基縮醛、乙氧基亞甲基縮醛、二甲氧基亞甲基原酸酯、1-甲氧基亞乙基原酸酯、1-乙氧基亞乙基原酸酯、1,2-二甲氧基亞乙基原酸酯、α-甲氧基亞苄基原酸酯、1-(N,N-二甲基胺基)亞乙基衍生物、α-(N,N’-二甲基胺基)亞苄基衍生物、2-氧雜亞環戊基原酸酯、二-三級丁基亞矽基基團（DTBS）、1,3-(1,1,3,3-四異丙基二矽氧烷亞基)衍生物（TIPDS）、四-三級丁氧基二矽氧烷-1,3-二亞基衍生物（TBDS）、碳酸酯、環硼酸酯、乙基硼酸酯、和苯基硼酸酯。
在一些實施方式中，羥基保護基團係乙醯基、三級丁基、三級丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫哌喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基矽基乙基、對氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲醯基、對苯基苯甲醯基、2,6-二氯苄基、聯苯基甲基、對硝基苄基、三苯基甲基（三苯甲基）、4,4'-二甲氧基三苯甲基、三甲基矽基、三乙基矽基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基聯苯基矽基、三苯基矽基、三異丙基矽基、苯甲醯基甲酸酯、氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、新戊醯基、9-茀基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基（MMTr）、4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMTr）和4,4',4''-三甲氧基三苯甲基（TMTr）、2-氰基乙基（CE或Cne）、2-(三甲基矽基)乙基（TSE）、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-氰基苯基)乙基、2-(4-硝基苯基)乙基（NPE）、2-(4-硝基苯基磺醯基)乙基、3,5-二氯苯基、2,4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2,4,6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫代羰基、4,4',4''-三(苯甲醯基氧基)三苯甲基、聯苯基胺基甲醯基、乙醯丙醯基、2-(二溴甲基)苯甲醯基（Dbmb）、2-(異丙基硫代甲氧基甲基)苯甲醯基（Ptmt）、9-苯基氧雜蒽-9-基（苯基二苯并哌喃基（pixyl））或9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基（MOX）。在一些實施方式中，每個羥基保護基團獨立地選自乙醯基、苄基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基聯苯基矽基、和4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些實施方式中，羥基保護基團選自由以下項組成之群組：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基和4,4'-二甲氧基三苯甲基基團。在一些實施方式中，磷鍵聯保護基團係在整個寡核苷酸合成中與磷鍵聯（例如核苷酸間鍵聯）附接的基團。在一些實施方式中，保護基團與硫代磷酸酯基團的硫原子附接。在一些實施方式中，保護基團與核苷酸間硫代磷酸酯鍵聯的氧原子附接。在一些實施方式中，保護基團與核苷酸間磷酸酯鍵聯的氧原子附接。在一些實施方式中，保護基團係2-氰基乙基（CE或Cne）、2-三甲基矽基乙基、2-硝基乙基、2-磺醯基乙基、甲基、苄基、鄰硝基苄基、2-(對硝基苯基)乙基（NPE或Npe）、2-苯基乙基、3-(N-三級丁基甲醯胺基)-1-丙基、4-側氧基戊基、4-甲硫基-l-丁基、2-氰基-1,1-二甲基乙基、4-N-甲基胺基丁基、3-(2-吡啶基)-1-丙基、2-[N-甲基-N-(2-吡啶基)]胺基乙基、2-(N-甲醯,N-甲基)胺基乙基、或4-[N-甲基-N-(2,2,2-三氟乙醯基)胺基]丁基。
樣本：如本文所用的「樣本」係特定生物體或自其獲得的物質。在一些實施方式中，樣本係獲得自或衍生自如本文所述之目的來源的生物樣本。在一些實施方式中，目的來源包含生物體，如動物或人類。在一些實施方式中，生物樣本包含生物組織或體液。在一些實施方式中，生物樣本係或包含：骨髓；血液；血細胞；腹水；組織或細針活檢樣本；含細胞的體液；自由浮動的核酸；痰；唾液；尿液；腦脊液，腹膜液；胸膜液；糞便；淋巴；婦科體液（gynecological fluid）；皮膚拭子；陰道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗滌液或灌洗液，如導管灌洗液或支氣管肺泡灌洗液；抽吸物；刮屑；骨髓樣本；組織活檢樣本；手術樣本；糞便、其他體液、分泌物和/或排泄物；和/或來自其的細胞等。在一些實施方式中，生物樣本係或包含獲得自個體的細胞。在一些實施方式中，樣本係藉由任何適當方法直接獲得自目的來源的「初級樣本」。例如，在一些實施方式中，初級生物樣本藉由選自以下群組之方法獲得，該群組由以下組成：活檢（例如，細針抽吸或組織活檢）、手術、收集體液（例如，血液、淋巴、糞便等）等。在一些實施方式中，如上下文可以清楚地看出，術語「樣本」係指藉由處理初級樣本（例如，藉由去除初級樣本的一種或多種組分和/或藉由向初級樣本中添加一種或多種試劑）而獲得的製備物。例如，使用半透膜進行過濾。這種「經處理的樣本」可以包含例如核酸或蛋白質，該核酸或蛋白質提取自樣本或藉由使初級樣本經受如擴增或mRNA的反轉錄、分離和/或某些組分的純化等技術而獲得。在一些實施方式中，樣本係生物體。在一些實施方式中，樣本係植物。在一些實施方式中，樣本係動物。在一些實施方式中，樣本係人類。在一些實施方式中，樣本係除人類以外的生物體。
受試者：如本文所用，術語「受試者」或「測試受試者」係指任何生物體，根據本揭露向該生物體施用所提供的化合物或組成物，例如用於實驗、診斷、預防和/或治療目的。典型的受試者包括動物（例如，哺乳動物，如小鼠、大鼠、兔、非人靈長動物和人；昆蟲；蠕蟲；等）和植物。在一些實施方式中，受試者可能患有和/或易患疾病、障礙和/或病症。
基本上：如在此所使用，術語「基本上」係指展示出一個所感興趣的特徵或特性的總體的或接近總體的範圍或程度的定性的狀態。生物領域的普通技術人員應當理解的是生物學和化學現象（如果有的話）很少會達到完成和/或進行到完成或實現或避免一個絕對的結果。因此，術語「基本上」被用在此處用來獲得在許多生物學和/或化學現象中潛在地缺少的內在的完全性。
患有：「患有」疾病、障礙和/或病症的個體已經診斷為和/或顯示出疾病、障礙和/或病症的一種或多種症狀。
易患：「易患」疾病、障礙和/或病症的個體係比一般公眾成員具有更高的發展疾病、障礙和/或病症的風險的個體。在一些實施方式中，易患疾病、障礙和/或病症的個體預先傾向於患有該疾病、障礙和/或病症。在一些實施方式中，易患疾病、障礙和/或病症的個體可以未被診斷出患有該疾病、障礙和/或病症。在一些實施方式中，易患疾病、障礙和/或病症的個體可以表現出該疾病、障礙和/或病症的症狀。在一些實施方式中，易患疾病、障礙和/或病症的個體可以不表現出該疾病、障礙和/或病症的症狀。在一些實施方式中，易患疾病、障礙、和/或病症的個體將會發展該疾病、障礙、和/或病症。在一些實施方式中，易患疾病、障礙、和/或病症的個體將不會發展該疾病、障礙、和/或病症。
全身：如本文所用，短語「全身施用」、「全身地施用」、「外周施用」、和「外周地施用」具有本領域理解的含義，係指施用化合物或組成物使其進入受體的系統。
治療劑：如本文所用，短語「治療劑」係指當施用受試者時具有治療效果和/或引發所希望的生物學和/或藥理效果的藥劑。在一些實施方式中，治療劑係任何物質，該物質可用於緩解、改善、減輕、抑制、預防、延遲疾病、障礙、和/或病症的一個或多個症狀或特徵的發作，降低疾病、障礙、和/或病症的一個或多個症狀或特徵的嚴重程度，和/或降低疾病、障礙、和/或病症的一個或多個症狀或特徵的發生率。
治療有效量：如本文所用，術語「治療有效量」意指當作為治療方案的一部分施用時引發所希望的生物反應的物質（例如，治療劑、組成物和/或配製物）的量。在一些實施方式中，物質的治療有效量係當施用於患有或易患疾病、障礙、和/或病症的受試者時，足以治療、診斷、預防、和/或延遲疾病、障礙、和/或病症的發作的量。如熟悉該項技術者將理解，物質的有效量可取決於以下這類因素變化：如所希望的生物學終點、待遞送的物質、靶細胞或組織等。例如，用於治療疾病、障礙、和/或病症的配製物中化合物的有效量係緩解、改善、減輕、抑制、預防、延遲疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的發作，降低疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的嚴重程度，和/或降低疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的發病率的量。在一些實施方式中，以單個劑量施用治療有效量；在一些實施方式中，需要多個單位劑量來遞送治療有效量。
治療：如本文所用，術語「治療（treat、treatment、或treating）」係指用於部分地或完全緩解、改善、減輕、抑制、預防、延遲疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的發作，降低疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的嚴重程度，和/或降低疾病、障礙、和/或病症的一種或多種症狀或特徵的發生率的任何方法。治療可以施用於未表現出疾病、障礙、和/或病症的跡象的受試者。在一些實施方式中，治療可以施用給僅表現出疾病、障礙、和/或病症的早期跡象的受試者，例如出於降低與疾病、障礙、和/或病症相關的病理學風險的目的。
不飽和的：如本文所用，術語「不飽和的」意指具有一個或多個不飽和單元的部分。
單位劑量：如本文所用，表述「單位劑量」係指作為單個劑量和/或以藥物組成物的物理離散單位給藥的量。在很多實施方式中，單位劑量含有預定量的活性劑。在一些實施方式中，單位劑量含有整個單個劑量的藥劑。在一些實施方式中，施用多於一個單位劑量以實現總單個劑量。在一些實施方式中，需要或預期需要施用多個單位劑量，以實現預期的效果。單位劑量可以是例如含有預定量的一種或多種治療劑、預定量的固體形式的一種或多種治療劑的一定體積的液體（例如，可接受的載體），含有預定量的一種或多種治療劑等的持續釋放配製物或藥物遞送裝置。應當理解，單位劑量可以存在於配製物中，該配製物除了一種或多種治療劑之外，還包括任何各種組分。例如，如下文所述，可以包括可接受的載體（例如，藥學上可接受的載體）、稀釋劑、穩定劑、緩衝劑、防腐劑等。熟悉該項技術者將理解，在很多實施方式中，特定的治療劑的總適當日劑量可包含一部分或多個單位劑量，並且可由例如在合理的醫學判斷範圍內的主治醫師決定。在一些實施方式中，對於任何特定患者或生物體的特定的有效劑量水平將取決於多種因素，該因素包括正在治療的障礙和障礙的嚴重程度；所採用的特定的活性化合物的活性；所採用的特定的組成物；受試者的年齡、體重、總體健康、性別和飲食；施用時間，和所採用的特定的活性化合物的排泄率；治療的持續時間；與所採用的特定化合物組合或一致使用的藥物和/或其他療法，以及醫學領域中熟知的相似因素。
野生型：如本文所用，術語「野生型」具有其本領域理解的含義，其係指具有如在「正常」（與突變體、患病、改變等對比）狀態或背景中在自然界中發現的結構和/或活性的實體。熟悉該項技術者將理解，野生型基因和多肽通常以多種不同形式（例如，等位基因）存在。
核酸：如本文所用，術語「核酸」包括任何核苷酸及其聚合物。如本文所用，術語「多核苷酸」係指具有任何長度的核苷酸（核糖核苷酸（RNA）或去氧核糖核苷酸（DNA））的聚合物形式。該等術語係指分子的一級結構，並且包括雙股和單股DNA、以及雙股和單股RNA。該等術語包括作為等效物的RNA或DNA的類似物，其由經修飾的核苷酸和/或經修飾的多核苷酸（例如但不限於甲基化、被保護和/或加帽的核苷酸或多核苷酸）製成。該術語涵蓋多核糖核苷酸或寡核糖核苷酸（RNA）和多去氧核糖核苷酸或寡去氧核糖核苷酸（DNA）；衍生自核鹼基和/或經修飾的核鹼基的N-糖苷或C-糖苷的RNA或DNA；衍生自糖和/或經修飾的糖的核酸；以及衍生自磷酸酯橋聯和/或經修飾的核苷酸間鍵聯的核酸。該術語涵蓋含有核鹼基、經修飾的核鹼基、糖、經修飾的糖、磷酸酯橋聯或經修飾的核苷酸間鍵聯的任何組合的核酸。實例包括且不限於含有核糖部分的核酸、含有去氧核糖部分的核酸、含有核糖部分和去氧核糖部分的核酸、含有核糖部分和經修飾的核糖部分的核酸。除非另有說明，否則前綴「聚（poly-）」係指含有2至約10,000個核苷酸單體單元的核酸，並且其中前綴「寡（oligo-）」係指含有2至約200個核苷酸單體單元的核酸。
核苷酸：如本文所用，術語「核苷酸」係指多核苷酸的單體單元，其由核鹼基、糖和一個或多個核苷酸間鍵聯組成。天然存在的鹼基（鳥嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、和尿嘧啶（U））係嘌呤或嘧啶的衍生物，但應該理解為還包括天然存在的和非天然存在的鹼基類似物。天然存在的糖係戊糖（五碳糖），即去氧核糖（其形成DNA）或核糖（其形成RNA），但應該理解，還包括天然存在的和非天然存在的糖類似物。將核苷酸經由核苷酸間鍵聯進行連接以形成核酸、或多核苷酸。許多核苷酸間鍵聯係本領域已知的（如但不限於磷酸酯、硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯等）。人工核酸包括PNA（肽核酸）、磷酸三酯、硫代磷酸酯、H-膦酸酯、胺基磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、膦醯乙酸酯（phosphonoacetate）、硫代膦醯乙酸酯、以及天然核酸的磷酸酯骨架的其他變體，如本文所述之那些。在一些實施方式中，天然核苷酸包含天然存在的鹼基、糖和核苷酸間鍵聯。如本文所用，術語「核苷酸」還涵蓋用於代替天然核苷酸或天然存在的核苷酸的結構類似物，如修飾的核苷酸和核苷酸類似物。
經修飾的核苷酸：術語「修飾的核苷酸」包括在結構上與天然核苷酸不同但能執行天然核苷酸的至少一種功能的任何化學部分。在一些實施方式中，修飾的核苷酸包含在糖、鹼基和/或核苷酸間鍵聯處的修飾。在一些實施方式中，修飾的核苷酸包含修飾的糖、修飾的核鹼基、和/或修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸能夠具有核苷酸的至少一種功能，例如，在能夠與包含至少互補鹼基序列的核酸鹼基配對的聚合物中形成亞基。
類似物：術語「類似物」包括在結構上與參考化學部分或部分類別不同但能執行此類參考化學部分或部分類別的至少一種功能的任何化學部分。作為非限制性實例，核苷酸類似物在結構上與核苷酸不同，但能執行核苷酸的至少一種功能；核鹼基類似物在結構上與核鹼基不同，但能執行核鹼基的至少一種功能；等。
核苷：術語「核苷」係指其中核鹼基或修飾的核鹼基與糖或修飾的糖共價結合的部分。
經修飾的核苷：術語「經修飾的核苷」係指衍生自天然核苷或在化學上類似於天然核苷但包含使其與天然核苷有區別的化學修飾的部分。經修飾的核苷的非限制性實例包括在鹼基和/或糖處包含修飾的那些。經修飾的核苷的非限制性實例包括在糖處具有2'修飾的那些。經修飾的核苷的非限制性實例還包括無鹼基核苷（其缺乏核鹼基）。在一些實施方式中，經修飾的核苷能夠具有核苷的至少一種功能，例如，在能夠與包含至少互補鹼基序列的核酸鹼基配對的聚合物中形成部分。
核苷類似物：術語「核苷類似物」係指與天然核苷在化學上不同但能執行核苷的至少一種功能的化學部分。在一些實施方式中，核苷類似物包含糖的類似物和/或核鹼基的類似物。在一些實施方式中，經修飾的核苷能夠具有核苷的至少一種功能，例如，在能夠與包含互補鹼基序列的核酸鹼基配對的聚合物中形成部分。
糖：術語「糖」係指以封閉和/或開放形式的單糖或多糖。在一些實施方式中，糖係單糖。在一些實施方式中，糖係多糖。糖包括但不限於核糖、去氧核糖、戊呋喃糖、戊哌喃糖、和己哌喃糖部分。如本文所用，術語「糖」還涵蓋用於代替常規糖分子的結構類似物，如二醇、形成核酸類似物的骨架的聚合物、二醇核酸（「GNA」）等。如本文所用，術語「糖」還涵蓋用於代替天然核苷酸或天然存在的核苷酸的結構類似物，如修飾的糖和核苷酸糖。
經修飾的糖：術語「修飾的糖」係指可以替換糖的部分。修飾的糖模仿糖的空間排列、電子特性、或一些其他物理化學特性。
核鹼基：術語「核鹼基」係指參與氫鍵的核酸部分，其以序列特異性方式將一條核酸股與另一條互補股結合。最常見的天然存在的核鹼基係腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、尿嘧啶（U）、胞嘧啶（C）、和胸腺嘧啶（T）。在一些實施方式中，天然存在的核鹼基係經修飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些實施方式中，天然存在的核鹼基係甲基化的腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些實施方式中，核鹼基係「經修飾的核鹼基」，例如，除腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、尿嘧啶（U）、胞嘧啶（C）、和胸腺嘧啶（T）之外的核鹼基。在一些實施方式中，經修飾的核鹼基係甲基化的腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、或胸腺嘧啶。在一些實施方式中，經修飾的核鹼基模擬核鹼基的空間排列、電子特性或一些其他物理化學特性，並保留氫鍵合的特性，氫鍵合以序列特異性方式將一條核酸股與另一條核酸股結合。在一些實施方式中，經修飾的核鹼基可與所有五種天然存在的鹼基（尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、或鳥嘌呤）配對，而基本上不影響熔解行為、被細胞內酶識別、或寡核苷酸雙鏈體的活性。如本文所用，術語「核鹼基」還涵蓋用於代替天然的核苷酸或天然存在的核苷酸的結構類似物，如修飾的核鹼基和核鹼基類似物。
經修飾的核鹼基：術語「經修飾的核鹼基」、「經修飾的鹼基」等係指與核鹼基化學上不同但能執行核鹼基的至少一種功能的化學部分。在一些實施方式中，經修飾的核鹼基係包含修飾的核鹼基。在一些實施方式中，經修飾的核鹼基能夠具有核鹼基的至少一種功能，例如，在能夠與包含至少互補鹼基序列的核酸鹼基配對的聚合物中形成部分。
阻斷基團：術語「阻斷基團」係指掩蔽官能基反應性的基團。隨後可以藉由去除阻斷基團來除去官能基的掩蔽。在一些實施方式中，阻斷基團係保護基團。
部分：術語「部分」係指分子的特定的區段或官能基。化學部分通常是嵌入或附加於分子的公認的化學實體。
固體支持物：術語「固體支持物」係指能夠合成核酸的任何支持物。在一些實施方式中，該術語係指玻璃或聚合物，其不溶於在合成核酸進行的反應步驟中使用的介質，並且衍生化以包含反應性基團。在一些實施方式中，固體支持物係高度交聯的聚苯乙烯（HCP）或可控孔度玻璃（CPG）。在一些實施方式中，固體支持物係可控孔度玻璃（CPG）。在一些實施方式中，固體支持物係可控孔度玻璃（CPG）和高度交聯的聚苯乙烯（HCP）的雜合支持物。
同源性：「同源性」或「同一性」或「相似性」係指兩個核酸分子之間的序列相似性。可以藉由對在每個序列中用於比較目的而比對的位置進行比較來各自確定同源性和同一性。當所比較序列中的等同位置由同一鹼基佔據時，則該分子在該位置處係相同的；當等同位點由相同或類似核酸殘基（例如，在空間性質和/或電子性質方面係類似的）佔據時，則該分子在該位置處可稱為同源（相似）。作為同源性/相似性或同一性百分比的表述係指在被比較的序列共用的位置處的相同或相似核酸的數目的函數。「不相關」或「非同源」序列與本文所述之序列共用小於40%同一性、小於35%同一性、小於30%同一性、或小於25%同一性。在比較兩個序列時，不存在殘基（胺基酸或核酸）或存在另外的殘基也會降低同一性和同源性/相似性。
在一些實施方式中，術語「同源性」描述了基於數學的序列相似性的比較，其用於鑒定具有相似功能或模體的基因。本文所述之核酸序列可用作「查詢序列」來對公共數據庫進行搜索，例如以鑒定其他家族成員、相關序列或同源物。在一些實施方式中，可以使用Altschul等人, (1990) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 215:403-10的NBLAST和XBLAST程式（版本2.0）來進行這類搜索。在一些實施方式中，可以用NBLAST程式（評分 = 100，字長 = 12）進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本揭露的核酸分子同源的核苷酸序列。在一些實施方式中，為了獲得用於比較目的的有缺口的比對，可如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res.[核酸研究] 25(17):3389-3402中所描述地使用有缺口的BLAST。當使用BLAST和有缺口的BLAST程式時，可使用相應的程式（例如，XBLAST和BLAST）的預設參數（參見www.ncbi.nlm.nih.gov）。
同一性：如本文所用，「同一性」意指當將序列進行比對使序列匹配最大化時（即，考慮缺口和插入），在兩個或更多個序列中的相應位置處的相同核苷酸殘基的百分比。同一性可容易地藉由已知方法計算，包括但不限於本技術領域中已知的那些方法，包括但不限於WO 2017/192679中所引用的那些方法。
寡核苷酸：術語「寡核苷酸」係指核苷酸的聚合物或寡聚物，並且可以包含天然和非天然核鹼基、糖和核苷酸間鍵聯的任何組合。
寡核苷酸可以是單股或雙股的。單股寡核苷酸可以具有雙股區域（由單股寡核苷酸的兩個部分形成），並且包含兩個寡核苷酸鏈的雙股寡核苷酸可以具有單股區域，例如其中兩個寡核苷酸鏈彼此不互補的區域。示例寡核苷酸包括但不限於結構基因、包含控制區和終止區的基因、自我複製系統（如病毒DNA或質體DNA）、單股和雙股RNAi試劑和其他RNA干擾試劑（RNAi試劑或iRNA試劑）、shRNA、反義寡核苷酸、核酶、微小RNA、微小RNA模擬物、supermir、適體、antimir、antagomir、Ul銜接子、形成三股體的寡核苷酸、G-四股體寡核苷酸、RNA啟動子、免疫刺激性寡核苷酸和誘餌寡核苷酸。
核苷酸間鍵聯：如本文所用，短語「核苷酸間鍵聯」通常是指連接寡核苷酸或核酸的核苷單元的鍵聯。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯係如在天然存在的DNA和RNA分子中發現的磷酸二酯鍵聯（天然磷酸酯鍵聯）。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯包括經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯係「經修飾的核苷酸間鍵聯」，其中磷酸二酯鍵聯的每個氧原子視需要且獨立地被有機或無機部分替換。在一些實施方式中，這種有機或無機部分選自但不限於=S、=Se、=NR'、-SR'、-SeR'、-N(R')2 ,、B(R')3 、-S-、-Se-和-N(R')-，其中每個R'獨立地如本揭露中所定義和描述的。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯係磷酸三酯鍵聯、硫代磷酸二酯鍵聯（
Figure 02_image001
）、或經修飾的硫代磷酸三酯鍵聯。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯係例如PNA（肽核酸）或PMO（二胺基磷酸酯𠰌啉基寡聚物）鍵聯之一。熟悉該項技術者理解，由於鍵聯中存在酸或鹼部分，核苷酸間鍵聯可以在給定pH下作為陰離子或陽離子存在。
經修飾的核苷酸間鍵聯的非限制性實例係命名為s、s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10、s11、s12、s13、s14、s15、s16、s17和s18的經修飾的核苷酸間鍵聯，如WO 2017/210647中所述。
例如，(Rp, Sp)-ATsCs1GA具有1) 在T和C之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯（
Figure 02_image003
）；和2) 在C和G之間的具有
Figure 02_image005
結構的硫代磷酸三酯核苷酸間鍵聯。除非另有說明，否則在寡核苷酸序列之前的Rp/Sp標識描述了順序地從寡核苷酸序列的5'至3'的核苷酸間鍵聯中的手性鍵聯磷原子的組態。例如，在(Rp, Sp)-ATsCs1GA中，位於T和C之間的「s」鍵聯中的磷具有Rp組態，並且位於C和G之間的「s1」鍵聯中的磷具有Sp組態。在一些實施方式中，「全-(Rp)」或「全-(Sp)」分別用於表示寡核苷酸中的所有手性鍵聯磷原子分別具有相同的Rp或Sp組態。
寡核苷酸類型：如本文所用，短語「寡核苷酸類型」用於定義具有特定鹼基序列、骨架鍵聯模式（即，核苷酸間鍵聯類型（例如磷酸酯、硫代磷酸酯等）的模式）、骨架手性中心模式（即，鍵聯磷立體化學模式（Rp/Sp））、以及骨架磷修飾模式的寡核苷酸。在一些實施方式中，共同指定的「類型」的寡核苷酸彼此在結構上相同。
熟悉該項技術者將理解，本揭露的合成方法在合成寡核苷酸股期間提供一定程度的控制，使得可以提前設計和/或選擇寡核苷酸股的每個核苷酸單元以在鍵聯磷處具有特定的立體化學和/或在鍵聯磷處具有特定的修飾、和/或具有特定的鹼基、和/或具有特定的糖。在一些實施方式中，提前設計和/或選擇寡核苷酸股以在鍵聯磷處具有立體中心的特定組合。在一些實施方式中，設計和/或確定寡核苷酸股以在鍵聯磷處具有修飾的特定組合。在一些實施方式中，設計和/或選擇寡核苷酸股以具有鹼基的特定組合。在一些實施方式中，設計和/或選擇寡核苷酸股以具有一個或多個以上結構特徵的特定組合。在一些實施方式中，本揭露提供了包含多個寡核苷酸分子或由其組成的組成物（例如，手性受控的寡核苷酸組成物）。在一些實施方式中，所有此類分子屬於同一類型（即，在結構上彼此相同）。然而，在許多實施方式中，所提供的組成物包含多個不同類型的寡核苷酸（通常以預定的相對量）。
手性控制：如本文所用，「手性控制」係指控制寡核苷酸內的手性核苷酸間鍵聯中的手性鍵聯磷的立體化學標識。在一些實施方式中，藉由寡核苷酸的糖和鹼基部分中不存在的手性元件實現控制，例如，在一些實施方式中，藉由在寡核苷酸製備期間使用一種或多種手性助劑實現控制，如在本揭露中例示的，手性助劑通常是寡核苷酸製備期間使用的手性亞磷醯胺的一部分。與手性控制相反，熟悉該項技術者認識到，如果使用常規寡核苷酸合成來形成手性核苷酸間鍵聯，則不使用手性助劑的這樣的常規寡核苷酸合成不能控制手性核苷酸間鍵聯處的立體化學。在一些實施方式中，控制了寡核苷酸內手性核苷酸間鍵聯中每個手性鍵聯磷的立體化學標識。
手性受控的寡核苷酸組成物：如本文所用，術語「手性受控的寡核苷酸組成物」、「手性受控的核酸組成物」等係指包含多個寡核苷酸（或核酸）的組成物，該多個寡核苷酸（或核酸）共用：1) 共同的鹼基序列，2) 共同的骨架鍵聯模式，以及3) 共同的骨架磷修飾模式，其中該多個寡核苷酸（或核酸）在一個或多個手性核苷酸間鍵聯（手性受控的或立體定義的核苷酸間鍵聯，其手性鍵聯磷在組成物（「立體定義的」）中呈Rp或Sp，而非如同非手性受控的核苷酸間鍵聯一樣的隨機Rp和Sp混合物）處共用相同的鍵聯磷立體化學。手性受控的寡核苷酸組成物中該多個寡核苷酸（或核酸）的水平係預定的/受控的（例如，藉由手性受控的寡核苷酸製備以立體選擇性地形成一個或多個手性核苷酸間鍵聯）。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物中的所有寡核苷酸的約1%-100%（例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%，或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）係該多個寡核苷酸。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物中共用共同的鹼基序列、共同的骨架鍵聯模式以及共同的骨架磷修飾模式的所有寡核苷酸的約1%-100%（例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%，或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）係該多個寡核苷酸。在一些實施方式中，水平係組成物中的所有寡核苷酸的；或組成物中共用共同的鹼基序列（例如，多個寡核苷酸或一種寡核苷酸類型的鹼基序列）的所有寡核苷酸的；或組成物中共用共同的鹼基序列、共同的骨架鍵聯模式以及共同的骨架磷修飾模式的所有寡核苷酸的；或組成物中共用共同的鹼基序列、共同的鹼基修飾模式、共同的糖修飾模式、共同的核苷酸間鍵聯類型模式、和/或共同的核苷酸間鍵聯修飾模式的所有寡核苷酸的約1%-100%（例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%，或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）。在一些實施方式中，多個寡核苷酸約1-50個（例如，約1-10、1-20、5-10、5-20、10-15、10-20、10-25、10-30、或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20、或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個）手性核苷酸間鍵聯具有相同的立體化學。在一些實施方式中，該多個寡核苷酸在約1%-100%（例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、90%-100%、95%-100%、50%-90%，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%，或至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%）的手性核苷酸間鍵聯處共用相同的立體化學。在一些實施方式中，多個寡核苷酸（或核酸）具有相同的構成。在一些實施方式中，多個寡核苷酸（或核酸）的水平係組成物中的與多個寡核苷酸（或核酸）具有相同構成的所有寡核苷酸（或核酸）的約1%-100%（例如約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%，或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%，或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）。在一些實施方式中，每個手性核苷酸間鍵聯係手性受控的核苷酸間鍵聯，並且組成物係完全手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，多個寡核苷酸（或核酸）在結構上相同。在一些實施方式中，手性受控的核苷酸間鍵聯關於其手性連接磷具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%，典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的非鏡像異構純度（diastereopurity）。在一些實施方式中，手性受控的核苷酸間鍵聯鏈具有至少95%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，手性受控的核苷酸間鍵聯鏈具有至少96%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，手性受控的核苷酸間鍵聯鏈具有至少97%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，手性受控的核苷酸間鍵聯鏈具有至少98%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，手性受控的核苷酸間鍵聯鏈具有至少99%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，水平的百分比係或至少係(DS)nc ，其中DS係如本揭露中所述之非鏡像異構純度（例如，90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%或更高），並且nc係本揭露中描述的手性受控的核苷酸間鍵聯的數目（例如1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或更多個）。在一些實施方式中，水平的百分比係或至少係(DS)nc ，其中DS係95%-100%。例如，當DS係99%並且nc係10時，該百分比係或至少係90%（(99%)10 ≈ 0.90 = 90%）。在一些實施方式中，組成物中多個寡核苷酸的水平表示為寡核苷酸中每個手性受控的核苷酸間鍵聯鏈的非鏡像異構純度的乘積。在一些實施方式中，連接寡核苷酸（或核酸）中兩個核苷的核苷酸間鍵聯的非鏡像異構純度由連接相同兩個核苷的二聚體的核苷酸間鍵聯的非鏡像異構純度表示，其中使用可比較的條件（在某些情況下，相同的合成循環條件）製備二聚體（例如，對於寡核苷酸….NxNy….中Nx和Ny之間的鍵聯，二聚體為NxNy）。在一些實施方式中，不是所有的手性核苷酸間鍵聯皆為手性受控的核苷酸間鍵聯，並且組成物係部分地手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，如在立體隨機寡核苷酸組成物中通常觀察到的，非手性受控的核苷酸間鍵聯具有小於約80%、75%、70%、65%、60%、55%或約50%的非鏡像異構純度（例如，如熟悉該項技術者所知，來自傳統的寡核苷酸合成，例如亞磷醯胺方法）。在一些實施方式中，多個寡核苷酸（或核酸）具有相同的類型。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含非隨機水平或受控水平的個別寡核苷酸類型或核酸類型。例如，在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含一種且不超過一種寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含超過一種寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含多種寡核苷酸類型。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物係一種寡核苷酸類型的寡核苷酸的組成物，該組成物包含非隨機水平或受控水平的該寡核苷酸類型的多個寡核苷酸。
手性純：如本文所用，短語「手性純」用於描述寡核苷酸或其組成物，其中全部或幾乎所有的寡核苷酸分子（其餘為雜質）相對於鍵聯磷原子以單非鏡像異構形式存在。
預定：預定（predetermined/pre-determined）意指有意選擇的或非隨機或受控的，例如與隨機出現、隨機或在無控制的情況下達成相反。閱讀本說明書的熟悉該項技術者將理解，本揭露提供了以下技術，該技術允許對將併入寡核苷酸組成物中的特定化學特徵和/或立體化學特徵進行選擇且進一步允許具有這類化學特徵和/或立體化學特徵的寡核苷酸組成物的控制製備。此類所提供的組成物如本文所述地「預定」。由於藉由不受控制以有意產生特定化學特徵和/或立體化學特徵的過程而偶然產生某些寡核苷酸，可能含有該寡核苷酸的組成物則不是「預定」組成物。在一些實施方式中，預定組成物係可有意地複製（例如，藉由重複控制過程）的組成物。在一些實施方式中，組成物中多個寡核苷酸的預定水平意指該組成物中該多個寡核苷酸的絕對量和/或相對量（比率、百分比等）係控制的。在一些實施方式中，組成物中預定水平的多種寡核苷酸係藉由手性受控的寡核苷酸製備而獲得的。
鍵聯磷：如本文所定義，短語「鍵聯磷」用於指示所提及的特定磷原子係存在於核苷酸間鍵聯中的磷原子，該磷原子對應於如天然存在的DNA和RNA中所存在的磷酸二酯核苷酸間鍵聯的磷原子。在一些實施方式中，鍵聯磷原子位於經修飾的核苷酸間鍵聯中，其中磷酸二酯鍵聯的每個氧原子視需要且獨立地被有機或無機部分替換。在一些實施方式中，鍵聯磷原子係手性的。在一些實施方式中，鍵聯磷原子係非手性的。
P-修飾：如本文所用，術語「P-修飾」係指在鍵聯磷處除立體化學修飾以外的任何修飾。在一些實施方式中，P-修飾包含添加、取代或移除與鍵聯磷共價附接的側基部分。在一些實施方式中，「P-修飾」係-X-L-R1 ，其中X、L和R1中的每一個獨立地如本揭露所定義和描述。
嵌段體（Blockmer）：如本文所用，術語「嵌段體」係指寡核苷酸股，其表徵每個單個核苷酸單元的結構特徵模式的特徵在於，在核苷酸間磷鍵聯處存在至少兩個共用共同的結構特徵的連續核苷酸單元。共同的結構特徵意指在鍵聯磷處的共同立體化學或在鍵聯磷處的共同修飾。在一些實施方式中，該至少兩個在核苷酸間磷鍵聯處共用共同的結構特徵的連續核苷酸單元被稱為「嵌段」。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸係嵌段體。
在一些實施方式中，嵌段體係「立體嵌段體」，例如至少兩個連續核苷酸單元在鍵聯磷處具有相同的立體化學。這樣的至少兩個連續核苷酸單元形成「立體嵌段」。
在一些實施方式中，嵌段體係「P-修飾嵌段體」，例如至少兩個連續核苷酸單元在鍵聯磷處具有相同的修飾。這樣的至少兩個連續核苷酸單元形成「P-修飾嵌段」。例如，(Rp, Sp)-ATsCsGA係P-修飾嵌段體，因為至少兩個連續核苷酸單元Ts和Cs具有相同的P-修飾（即，均為硫代磷酸二酯）。在(Rp, Sp)-ATsCsGA的同一寡核苷酸中，TsCs形成嵌段，且該嵌段係P-修飾嵌段。
在一些實施方式中，嵌段體係「鍵聯嵌段體」，例如至少兩個連續核苷酸單元在鍵聯磷處具有相同的立體化學和相同的修飾。至少兩個連續核苷酸單元形成「鍵聯嵌段」。例如，(Rp, Rp)-ATsCsGA係鍵聯嵌段體，因為至少兩個連續核苷酸單元Ts和Cs具有相同的立體化學（均為Rp）及P-修飾（均為硫代磷酸酯）。在(Rp, Rp)-ATsCsGA的同一寡核苷酸中，TsCs形成嵌段，且該嵌段係鍵聯嵌段。
在一些實施方式中，嵌段體包含一個或多個獨立地選自立體嵌段、P-修飾嵌段和鍵聯嵌段的嵌段。在一些實施方式中，嵌段體就一個嵌段而言係立體嵌段體，和/或就另一嵌段而言係P-修飾嵌段體，和/或就又另一嵌段而言係鍵聯嵌段體。
本文關於本揭露的化合物和組成物之方法和結構也適用於藥學上可接受的酸或鹼加成鹽形式（除非另有說明）。
某些實施方式之描述
寡核苷酸提供適用於各種應用的分子工具。舉例而言，寡核苷酸（例如靶向C9orf72的寡核苷酸）適用於治療性、診斷性及研究性應用，包括各種病症、障礙及疾病之治療。天然產生的核酸（例如，未經修飾的DNA或RNA）的使用受到限制，例如由於其對核酸內切酶及核酸外切酶的易感性而受到限制。因此，已研發出各種合成對應物來避開該等缺點。該等合成對應物包括含有化學修飾的合成寡核苷酸，該化學修飾例如鹼基修飾、糖修飾、骨架修飾等，其尤其使得該等分子不太容易降解且改善了寡核苷酸的其他特性和/或活性。自結構觀點來看，核苷酸間鍵聯修飾可引入手性，且寡核苷酸的某些特性可能受到形成寡核苷酸骨架的磷原子的組態的影響。在很多實施方式中，本揭露提供了包含手性受控的手性核苷酸間鍵聯的技術（例如寡核苷酸、組成物、方法等）。尤其是，所提供的技術可以提供高活性（例如降低靶標核酸（例如多種轉錄物）和/或由其編碼的產物（例如多種蛋白質）的水平和/或活性）、選擇性（例如選擇性降低某些靶標核酸（例如多種轉錄物）和/或由其編碼的產物（例如多種蛋白質）相對於一種或多種其他核酸的水平和/或活性）、和/或低毒性（例如低水平的不良副作用，例如低水平的不良免疫活性）。
寡核苷酸
尤其是，本揭露提供了各種設計的寡核苷酸，其可包含本揭露中描述的各種核鹼基及其模式、糖及其模式、核苷酸間鍵聯及其模式和/或其他化學部分及其模式。在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸可指導C9orf72基因和/或其一種或多種產物（例如，轉錄物，mRNA，蛋白質等）的表現、水平和/或活性降低。在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸可降低與多種病症、障礙或疾病相關的C9orf72核酸（例如，可以是C9orf72基因的任一條股或從C9orf72基因的任一條股轉錄的基因、轉錄物、mRNA等）和/或由其編碼的產物（例如，多種蛋白質和/或肽等）的表現、水平和/或活性。在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸可指導受試者或患者的細胞中C9orf72基因和/或其一種或多種產物的表現、水平和/或活性降低。在一些實施方式中，細胞通常表現C9orf72或產生C9orf72蛋白質。在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸可以指導C9orf72靶標基因或基因產物的表現、水平和/或活性的降低，並且具有以下鹼基序列，該鹼基序列由本文揭露的C9orf72寡核苷酸的鹼基序列組成、包含本文揭露的C9orf72寡核苷酸的鹼基序列、或包含本文揭露的C9orf72寡核苷酸的鹼基序列的一部分（例如，序列段為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個連續鹼基），其中每個T可以獨立地被U取代並且反之亦然，並且該寡核苷酸包含鹼基、糖和/或核苷酸間鍵聯的至少一種非天然存在的修飾。在一些實施方式中，相較與病症、障礙或疾病較低相關或不相關的C9orf72核酸和/或由其編碼的產物的表現、水平和/或活性，與多種病症、障礙或疾病相關的C9orf72核酸（例如，可以是C9orf72基因的任一條股或從C9orf72基因的任一條股轉錄的基因、轉錄物、mRNA等）和/或由其編碼的產物（例如，多種蛋白質和/或肽等）的表現、水平和/或活性被選擇性地降低。在一些實施方式中，包含擴增的重複序列（例如，如圖1所示，反義或有義）的v1和/或v3轉錄物和/或其產物與多種病症、障礙或疾病相關。在一些實施方式中，與包含擴增的重複序列的v1和v3轉錄物相比，v2轉錄物與病症、障礙或疾病不相關或較低相關。如熟悉該項技術者所理解的，如果一個事件或實體的存在、水平和/或形式與另一事件或實體相關聯，則兩個事件或實體彼此「相關」（如此處使用的術語）。例如，如果一個實體（例如多肽、遺傳標記、代謝物、微生物、轉錄物等）的存在、水平和/或形式與特定疾病、障礙或病症的發生率和/或易感性（例如，在相關人群中）相關聯，則認為該實體與該疾病、障礙或病症相關。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可指導靶標基因例如C9orf72靶標基因或其產物的表現、水平和/或活性降低。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可以藉由RNase H介導的敲低來指導C9orf72靶標基因或其產物的表現、水平和/或活性的降低。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可藉由在結合C9orf72靶標基因mRNA後在空間上阻斷翻譯和/或藉由改變或干擾mRNA拼接來指導C9orf72靶標基因或其產物的表現、水平和/或活性降低。然而，無論如何，本揭露不限於任何特定機制。在一些實施方式中，本揭露提供了能夠藉由雙股RNA干擾，單股RNA干擾，RNase H介導的敲低，翻譯的空間位阻或兩個或多個這樣的機制的組合操作的寡核苷酸、組成物、方法等。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸能夠介導C9orf72的表現、水平和/或活性降低。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸能夠藉由涉及C9orf72 mRNA的mRNA降解和/或翻譯位阻的機制來介導C9orf72的表現、水平和/或活性的降低。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸能夠介導多於一個C9orf72等位基因的表現、水平和/或活性降低。在一些實施方式中，相較與病症、障礙或疾病較低相關或不相關的C9orf72等位基因的表現、水平和/或活性，C9orf72寡核苷酸能夠選擇性地介導與病症、障礙或疾病相關的C9orf72等位基因的表現、水平和/或活性的降低。在一些實施方式中，相較與病症、障礙或疾病較低相關或不相關的C9orf72轉錄物和/或由其編碼的產物的表現、水平和/或活性，C9orf72寡核苷酸能夠選擇性地介導與病症、障礙或疾病相關的C9orf72轉錄物和/或由其編碼的產物的表現、水平和/或活性的降低。
在一些實施方式中，本揭露關於治療與C9orf72相關的疾病、障礙或病症之方法，該方法包括施用治療有效量的能夠介導C9orf72的表現、水平和/或活性降低的C9orf72寡核苷酸的步驟。在一些實施方式中，可以存在C9orf72的多種形式（例如等位基因），並且所提供的技術可以降低兩種或更多種或所有形式和其產物的表現、水平和/或活性。在一些實施方式中，相較與病症、障礙或疾病較低相關或不相關的那些，所提供的技術選擇性地降低與病症、障礙或疾病相關的C9orf72轉錄物和/或由其編碼的產物的表現、水平和/或活性。
在一些實施方式中，本揭露關於治療與C9orf72相關的疾病、障礙或病症之方法，該方法包括向患有該疾病的受試者施用治療有效量的所提供的寡核苷酸或其組成物。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸包含例如在表中描述的結構元件或其一部分。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸包含本文所述之鹼基序列（或其一部分）（其中每個T可以獨立地被U取代，反之亦然），化學修飾或化學修飾模式（或其一部分）和/或本文所述之形式或其一部分。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸具有包含該鹼基序列（或其一部分）的鹼基序列（其中每個T可以獨立地被U取代），化學修飾模式（或其一部分）和/或本文中所揭露的（例如在表中，或本文中所描述的）寡核苷酸的形式。在一些實施方式中，這樣的寡核苷酸，例如C9orf72寡核苷酸降低了基因例如C9orf72基因或其基因產物的表現、水平和/或活性。
尤其是，C9orf72寡核苷酸可以與它們的靶標核酸（例如，mRNA先質，成熟mRNA等）雜交。例如，在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可以與衍生自DNA股（C9orf72基因的任一股）的C9orf72核酸雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與C9orf72轉錄物雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與處於任何RNA加工階段的C9orf72核酸雜交，包括但不限於mRNA先質或成熟mRNA。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與C9orf72核酸或其互補序列的任何元件雜交，包括但不限於：啟動子區域、增強子區域、轉錄終止區域、翻譯起始信號、翻譯終止信號、編碼區域、非編碼區域、外顯子、內含子、內含子/外顯子或外顯子/內含子連接，5'UTR或3'UTR。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可以與其具有不超過2個錯配的靶標雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可以與其具有不超過一個錯配的靶標雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可以與其不具有錯配（例如，當所有C-G和/或A-T/U鹼基配對時）的靶標雜交。
在一些實施方式中，寡核苷酸可與兩個或更多個轉錄物變體雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與兩個或更多個或所有C9orf72轉錄物變體雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與衍生自有義股的兩個或更多個或所有C9orf72轉錄物變體雜交。在一些實施方式中，寡核苷酸選擇性地同與病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，包含擴增的重複序列的那些轉錄物）雜交。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的C9orf72靶標係並非mRNA的C9orf72 RNA。
在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）含有增加水平的一種或多種同位素。在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）例如經一種或多種元素（例如氫、碳、氮等）的一種或多種同位素進行標記。在一些實施方式中，所提供的組成物中的寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）（例如，多種組成物的寡核苷酸）包含鹼基修飾、糖修飾和/或核苷酸間鍵聯修飾，其中該等寡核苷酸含有富集水平的氘。在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）在一個或多個位置處經氘標記（用-2 H替換-1 H）。在一些實施方式中，寡核苷酸鏈或與該寡核苷酸鏈軛合的任何部分（例如靶向部分等）的一個或多個1 H經2 H取代。此類寡核苷酸可用於本文所述之組成物及方法中。
在一些實施方式中，本揭露提供了包含多個寡核苷酸的寡核苷酸組成物，該寡核苷酸： 1) 具有與轉錄物中的靶標序列（例如，C9orf72靶標序列）互補的共同的鹼基序列；並且 2) 包含一個或多個修飾的糖部分和/或修飾的核苷酸間鍵聯。
在一些實施方式中，具有共同的鹼基序列的C9orf72寡核苷酸可以具有相同的核苷修飾（例如糖修飾、鹼基修飾等）模式。在一些實施方式中，核苷修飾模式可以由位置和修飾的組合表示。在一些實施方式中，骨架鍵聯模式包含每個核苷酸間鍵聯的位置和類型（例如磷酸酯、硫代磷酸酯、經取代的硫代磷酸酯等）。
在一些實施方式中，所提供的組成物包含多個寡核苷酸。在一些實施方式中，多個寡核苷酸係相同的寡核苷酸類型。在一些實施方式中，多個寡核苷酸共用共同的鹼基序列。在一些實施方式中，多個寡核苷酸共用共同的糖修飾模式。在一些實施方式中，多個寡核苷酸共用共同的鹼基修飾模式。在一些實施方式中，多個寡核苷酸共用共同的核苷修飾模式。在一些實施方式中，多個寡核苷酸具有相同的構成。在一些實施方式中，多個寡核苷酸係相同的。
在一些實施方式中，如本文所舉例說明的，C9orf72寡核苷酸，係手性受控的，包含一個或多個手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸係立體化學純的。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸與其他立體異構物基本上分開。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸包含一個或多個修飾的核鹼基、一個或多個修飾的糖和/或一個或多個修飾的核苷酸間鍵聯。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸包含一個或多個修飾的糖。在一些實施方式中，本揭露的寡核苷酸包含一個或多個修飾的核鹼基。根據本揭露，可以將各種修飾引入糖和/或核鹼基。例如，在一些實施方式中，修飾係US 9006198中描述的修飾。在一些實施方式中，修飾係描述於US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中的修飾，其各自的糖、鹼基和核苷酸間鍵聯修飾藉由引用獨立地併入本文。
如本揭露中使用的，在一些實施方式中，「一個或多個」係1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。在一些實施方式中，「一個或多個」係一個。在一些實施方式中，「一個或多個」係兩個。在一些實施方式中，「一個或多個」係三個。在一些實施方式中，「一個或多個」係四個。在一些實施方式中，「一個或多個」係五個。在一些實施方式中，「一個或多個」係六個。在一些實施方式中，「一個或多個」係七個。在一些實施方式中，「一個或多個」係八個。在一些實施方式中，「一個或多個」係九個。在一些實施方式中，「一個或多個」係十個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少一個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少兩個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少三個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少四個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少五個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少六個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少七個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少八個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少九個。在一些實施方式中，「一個或多個」係至少十個。
如本揭露中使用的，在一些實施方式中，「至少一個」係1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。在一些實施方式中，「至少一個」係一個。在一些實施方式中，「至少一個」係兩個。在一些實施方式中，「至少一個」係三個。在一些實施方式中，「至少一個」係四個。在一些實施方式中，「至少一個」係五個。在一些實施方式中，「至少一個」係六個。在一些實施方式中，「至少一個」係七個。在一些實施方式中，「至少一個」係八個。在一些實施方式中，「至少一個」係九個。在一些實施方式中，「至少一個」係十個。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸係或包含表中描述的C9orf72寡核苷酸。
如本揭露中所證明的，在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸（例如，C9orf72寡核苷酸）的特徵在於，當它與敲低系統中的轉錄物接觸時，其靶標的敲低（例如，C9orf72寡核苷酸的C9orf72轉錄物。
在一些實施方式中，寡核苷酸以鹽形式提供。在一些實施方式中，寡核苷酸以鹽的形式提供，該鹽包含作為鹽形式存在的帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，天然磷酸酯鍵聯等）。在一些實施方式中，寡核苷酸以藥學上可接受的鹽的形式提供。在一些實施方式中，寡核苷酸以金屬鹽的形式提供。在一些實施方式中，寡核苷酸以鈉鹽形式提供。在一些實施方式中，寡核苷酸以金屬鹽例如鈉鹽的形式提供，其中每個帶負電荷的核苷酸間鍵聯獨立地為鹽形式（例如針對鈉鹽，對於硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯係-O-P(O)(SNa)-O-，對於天然磷酸酯鍵聯係-O-P(O)(ONa)-O-，等）。
在一些實施方式中，本揭露提供包含一個或兩個翼及核心且包含或具有翼-核心-翼、核心-翼或翼-核心結構的寡核苷酸，其中每個翼和核心獨立地包含一個或多個核鹼基。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含或具有翼-核心-翼結構。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含或具有核心-翼結構。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含或具有翼-核心結構。在一些實施方式中，核心係如本揭露中所描述的連續核苷酸單元區域。在一些實施方式中，每個翼獨立地包含如本揭露中所描述的一個或多個核鹼基。
在一些實施方式中，翼-核心-翼模體被描述為「X-Y-Z」，其中「X」表示5'-翼的長度（除非另有說明，否則以核鹼基數表示），「Y」表示核心的長度，且「Z」表示3'-翼的長度。在一些實施方式中，X係1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，並且Z係1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些實施方式中，Y係1-50，例如5-50、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施方式中，X和Z具有相同或不同的長度，和/或具有相同或不同的修飾或修飾模式。在一個較佳的實施方式中，Y介於8與15個核苷酸之間。X、Y或Z可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多個核苷酸中的任一者。在一些實施方式中，本文所述之寡核苷酸具有或包含例如5-10-5、5-10-4、4-10-4、4-10-3、3-10-3、2-10-2、5-9-5、5-9-4、4-9-5、5-8-5、5-8-4、4-8-5、5-7-5、4-7-5、5-7-4或4-7-4的翼-核心-翼結構。在一些實施方式中，本文中所描述的寡核苷酸具有或包含例如5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、5-13、5-8或6-8的翼-核心或核心-翼結構。
在一些實施方式中，翼包含一個或多個糖修飾。在一些實施方式中，翼-核心-翼結構的兩個翼包含相同的糖修飾。在一些實施方式中，翼-核心-翼結構的兩個翼包含不同糖修飾。在一些實施方式中，翼-核心-翼結構的兩個翼包含不同糖修飾模式。在一些實施方式中，翼-核心-翼結構的兩個翼包含相同糖修飾的不同糖修飾模式。在一些實施方式中，翼-核心-翼結構的兩個翼包含相同的糖修飾模式。在一些實施方式中，翼包含兩個或更多個不同糖修飾。
在一些實施方式中，糖修飾係2'-修飾（例如2’-OR，其中R如本文所述但不是-H）、涉及2’-碳的雙環糖修飾（例如在LNA糖中）等。在一些實施方式中，翼中的每個糖修飾獨立地是2'-修飾。在一些實施方式中，翼-核心-翼的兩個翼中的每個糖修飾獨立地是2'-修飾。在一些實施方式中，翼或每個翼獨立地包含兩個或更多個不同的糖修飾，其中每個糖修飾獨立地是2’-修飾。在一些實施方式中，每個2′-修飾獨立地是2′-OR修飾，其中R如本文所述但不是-H。在一些實施方式中，每個2′-修飾獨立地是2′-OR修飾，其中R係視需要經取代的C1-6 烷基。在一些實施方式中，每個糖修飾獨立地是2'-OMe或2'-MOE。
在一些實施方式中，與不存在糖修飾相比，糖修飾提供改善的穩定性和/或雜交。在一些實施方式中，某些糖修飾（例如2'-MOE）在其他相同的條件下相比於2'-OMe提供更大穩定性。
在一些實施方式中，翼包含一個或多個天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，翼包含一個或多個連續的天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，翼包含一個或多個天然磷酸酯鍵聯以及一個或多個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼不包含天然磷酸酯鍵聯，並且翼的每個核苷酸間鍵聯獨立地是經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯係Sp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼包含一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼包含一個或多個中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，每個翼獨立地包含一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，每個翼獨立地包含一個或多個中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯或中性核苷酸間鍵聯獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，每個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯或中性核苷酸間鍵聯獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，翼包含1-5個，例如1、2、3、4、或5個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼包含1個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼包含2個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼包含3個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼包含4個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼包含5個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，每個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯獨立地是中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯或中性核苷酸間鍵聯係n001。在一些實施方式中，每個係001，並且視需要以及獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，每個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如n001）獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，n001係手性受控的且是Rp。在一些實施方式中，n001係手性受控的且是Sp。在一些實施方式中，翼包含一個或多個手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和一個或多個手性受控的中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼包含一個或多個手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和一個或多個天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，翼包含一個或多個手性受控的中性核苷酸間鍵聯和一個或多個天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，翼包含一個或多個手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和一個或多個手性受控的中性核苷酸間鍵聯和一個或多個天然磷酸酯鍵聯（例如表中某些寡核苷酸中的某些5'-翼）。在一些實施方式中，翼中的每個核苷酸間鍵聯獨立地選自天然磷酸酯鍵聯和硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，翼中的每個核苷酸間鍵聯獨立地選自天然磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯（如n001））。在一些實施方式中，翼中的每個核苷酸間鍵聯獨立地選自硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯（如n001））。在一些實施方式中，一個或多個或每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，一個或多個或每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地是手性受控的且是Sp。在一些實施方式中，一個或多個或每個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯（如n001））獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，一個或多個或每個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯（如n001））獨立地是手性受控的且是Rp。在一些實施方式中，翼（例如5'-翼）的模式（例如，包括核苷酸間鍵聯的類型和鍵聯磷立體化學）係或包含SOOO，其中S表示手性受控的且是Sp的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，並且O表示天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，翼（例如3'-翼）的模式係或包含SSSS。在一些實施方式中，翼（例如5'-翼）的模式係或包含SnROnR，其中nR表示不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯（如n001）），其係手性受控的且是Rp。在一些實施方式中，翼（例如3'-翼）的模式係或包含SnRSS。在一些實施方式中，翼（例如3'-翼）的模式係或包含SSnRS。在一些實施方式中，翼（例如3'-翼）的模式係或包含SSSnR。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯或中性核苷酸間鍵聯在兩個修飾的糖之間。在一些實施方式中，核心還可以具有一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯或中性核苷酸間鍵聯，它們中的每一個視需要以及獨立地是手性受控的；在一些實施方式中，每個獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，核心糖（在一些實施方式中，不包含2'-O-）不與中性核苷酸間鍵聯鍵合。
在一些實施方式中，對於包含或為翼-核心-翼結構的寡核苷酸，兩個翼的不同之處在於它們含有不同水平和/或類型的化學修飾、骨架手性中心立體化學、和/或其模式。在一些實施方式中，兩個翼的不同之處在於它們含有不同水平和/或類型的糖修飾、和/或核苷酸間鍵聯、和/或核苷酸間鍵聯立體化學、和/或其模式。舉例而言，在一些實施方式中，一個翼包含2'-OR修飾，其中R係視需要經取代的C1-6 烷基（例如2-MOE），而另一翼不包含此類修飾，或包含（例如以數目和/或百分比計）較低水平的此類修飾；另外地且可替代地，一個翼包含天然磷酸酯鍵聯，而另一翼不包含天然磷酸酯鍵聯或包含較低水平（例如以數目和/或百分比計）的天然磷酸酯鍵聯；另外地且可替代地，一個翼可包含特定類型的經修飾的核苷酸間鍵聯（例如硫代磷酸二酯核苷酸間鍵聯），而另一翼不包含天然磷酸酯鍵聯或包含較低水平（例如以數目和/或百分比計）的該類型的經修飾的核苷酸間鍵聯；另外地且可替代地，一個翼可包含含有特定組態（例如Rp或Sp）鍵聯磷原子的手性修飾的核苷酸間鍵聯，而另一翼不包含或包含較低水平的含有該特定組態鍵聯磷原子的手性修飾的核苷酸間鍵聯；另外地或可替代地，每個翼可包含糖修飾、核苷酸間鍵聯和/或骨架手性中心的不同模式。在一些實施方式中，一個翼包含一個或多個天然磷酸酯鍵聯和一個或多個2'-OR修飾，其中R不是-H或-Me，且另一翼不包含天然磷酸酯鍵聯且不包含2'-OR修飾，其中R不是-H或-Me。在一些實施方式中，一個翼包含一個或多個天然磷酸酯鍵聯和一個或多個2'-MOE修飾，且另一翼中的每個核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯鍵聯，且另一翼的每個糖單元包含2'-OMe修飾。在一些實施方式中，一個翼包含一個或多個天然磷酸酯鍵聯和一個或多個2'-MOE修飾，且另一翼中的每個核苷酸間鍵聯係Sp硫代磷酸酯鍵聯，且另一翼的每個糖單元包含2'-OMe修飾。
在一些實施方式中，核心不包含含有2'-修飾的糖。在一些實施方式中，核心不包含含有2’-OR的糖，其中R如本文所述。在一些實施方式中，每個核心糖包含兩個2'-H（例如，通常在天然DNA糖中發現的）。
在一些實施方式中，核心中不少於70%、80%、90%或100%的核苷酸間鍵聯係經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核心中不少於70%、80%或90%的核苷酸間鍵聯獨立地是具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯，且核心還含有1、2、3、4或5個核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯選自具有Rp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯和天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，核心中不少於70%、80%或90%的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地是具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯，且核心還含有1、2、3、4或5個具有Rp組態的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核心還含有1或2個核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯選自具有Rp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯和天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，核心還含有1個及不超過1個以下核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯選自具有Rp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯和天然磷酸酯鍵聯，且其餘核苷酸間鍵聯獨立地是具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核心還含有2個及不超過2個以下核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯各自獨立地選自具有Rp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯和天然磷酸酯鍵聯，且其餘核苷酸間鍵聯獨立地是具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核心還含有1個及不超過1個天然磷酸酯鍵聯，且其餘核苷酸間鍵聯獨立地是具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核心還含有2個及不超過2個天然磷酸酯鍵聯，且其餘核苷酸間鍵聯獨立地是具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核心還含有1個及不超過1個具有Rp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯，且其餘核苷酸間鍵聯獨立地是具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核心還含有2個及不超過2個具有Rp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯，且其餘核苷酸間鍵聯獨立地是具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，兩個天然磷酸酯鍵聯或兩個具有Rp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯由兩個或更多個具有Sp組態的經修飾的核苷酸間鍵聯間隔開。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯具有式I。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。如熟悉該項技術者所理解的，與翼糖和核心糖鍵合的核苷酸間鍵聯可以被認為係核心核苷酸間鍵聯。
核心及翼可具有各種長度。在一些實施方式中，核心包含不少於5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核鹼基。在一些實施方式中，翼包含不少於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核鹼基。在一些實施方式中，翼包含不超過2、3、4、5、6、7、8、9或10個核鹼基。在一些實施方式中，對於翼-核心-翼結構而言，兩個翼具有相同長度，例如具有5個核鹼基。在一些實施方式中，兩個翼具有不同長度。在一些實施方式中，核心不少於總寡核苷酸長度的40%、45%、50%、60%、70%、80%或90%，如藉由核心內的核苷單元百分比所測量的。在一些實施方式中，核心不少於總寡核苷酸長度的50%。
在一些實施方式中，寡核苷酸可以多種形式（包括多種鹽形式，特別是藥學上可接受的鹽形式）提供。在一些實施方式中，本揭露提供寡核苷酸的鹽及其藥物組成物。在一些實施方式中，鹽係藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，可以捐贈給鹼的每種氫離子（例如，在水溶液、藥物組成物等的條件下）被非H+ 陽離子替換。例如，在一些實施方式中，寡核苷酸的藥學上可接受的鹽係全金屬離子鹽，其中每個核苷酸間鍵聯（例如天然磷酸酯鍵聯、硫代磷酸二酯鍵聯等）的每個氫離子（例如-OH、-SH等）被金屬離子替換。在一些實施方式中，所提供的鹽係全鈉鹽。在一些實施方式中，所提供的藥學上可接受的鹽係全鈉鹽。在一些實施方式中，所提供的鹽係全鈉鹽，其中為天然磷酸酯鍵聯（酸形式-O-P(O)(OH)-O-）（如果存在的話）的每個核苷酸間鍵聯以其鈉鹽形式（-O-P(O)(ONa)-O-）存在，並且為硫代磷酸二酯鍵聯（酸形式-O-P(O)(SH)-O-）（如果存在的話）的每個核苷酸間鍵聯以其鈉鹽形式（O-P(O)(SNa)-O-）存在。
在一些實施方式中，所提供的化合物（例如寡核苷酸）可調節C9orf72靶標的活性和/或功能。在一些實施方式中，C9orf72靶標基因為意欲改變與其有關的一種或多種C9orf72基因產物（例如RNA和/或蛋白質產物）的表現和/或活性的基因。在一些實施方式中，C9orf72與病症、障礙或疾病相關。在許多實施方式中，意欲抑制C9orf72靶標基因。由此，在許多實施方式中，在如本文中所描述的C9orf72寡核苷酸作用於特定C9orf72靶標基因時，存在寡核苷酸時與不存在寡核苷酸時相比，該C9orf72基因的一種或多種基因產物的存在和/或活性降低（特別是與病症、障礙或疾病相關的那些）。
在一些實施方式中，C9orf72靶標係意欲改變與其有關的一種或多種產物（例如RNA和/或蛋白質產物）的表現和/或活性的特定等位基因（例如與病症、障礙或疾病相關的病理性等位基因）。在許多實施方式中，C9orf72靶標等位基因為其存在和/或表現與一種或多種疾病和/或病症（例如C9orf72相關障礙）的存在、發病率和/或嚴重程度相關（例如有關）的等位基因。替代地或另外，在一些實施方式中，C9orf72靶標等位基因為其一種或多種基因產物的水平和/或活性改變與疾病和/或病症的一個或多個方面的改善（例如發作延遲、嚴重程度降低、對其他治療的反應等）有關的等位基因。在一些此類實施方式中，相對於非病理性等位基因（例如一種或多種較不相關/不相關等位基因），如本文中所描述的C9orf72寡核苷酸及其使用方法可優先或特異性地靶向病理性等位基因。在一些實施方式中，C9orf72的病理性等位基因包含重複擴增，例如六核苷酸重複擴增（HRE），例如多於約30及直至500或1000或更多的六核苷酸重複擴增。在一些實施方式中，等位基因的轉錄物可能具有兩個或多個變體（例如來自不同剪接模式的變體）。在一些實施方式中，相較與病症、障礙或疾病較低相關或不相關的那些，所提供的技術選擇性地降低與病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如RNA）和/或由其編碼的產物（例如蛋白質）的表現、活性和/或水平。
在一些實施方式中，C9orf72靶標序列係如本文中所描述的寡核苷酸所結合的序列。在許多實施方式中，C9orf72靶標序列與所提供寡核苷酸或其中的連續殘基的序列一致或係其對應互補序列（例如，所提供的寡核苷酸包括與C9orf72靶標序列一致或係其對應互補序列的靶標結合序列）。在一些實施方式中，寡核苷酸（的相關部分）與其靶標序列之間容許少數差異/錯配（例如，不超過1、2或3個）。在許多實施方式中，C9orf72靶標序列存在於C9orf72靶標基因內。在許多實施方式中，C9orf72靶標序列存在於由C9orf72靶標基因產生的轉錄物（例如mRNA和/或mRNA先質）內。在一些實施方式中，C9orf72靶標序列包括一個或多個等位基因位點（亦即，C9orf72靶標基因內發生等位基因變異的位置）。在一些此類實施方式中，所提供的寡核苷酸相對於一個或多個其他等位基因優先或特異性地結合至一個等位基因。
在一些實施方式中，C9orf72（染色體9開放閱讀框72）係一種基因或其基因產物，也稱為C9ORF72、C9、ALSFTD、FTDALS、FTDALS1、DENNL72；外部ID：MGI：1920455 HomoloGene：10137 GeneCards：C9orf72。在一些實施方式中，C9orf72可以非正式地稱為C9。C9orf72直系同源物：物種：人類Entrez：203228；Ensembl：ENSG00000147894；UniProt：Q96LT7;  RefSeq（mRNA）：NM_145005 NM_001256054 NM_018325；RefSeq（蛋白質）：NP_001242983 NP_060795 NP_659442；位置（UCSC）：Chr 9: 27.55 - 27.57 Mb；物種：小鼠Entrez：73205；Ensembl：ENSMUSG00000028300；UniProt：Q6DFW0; RefSeq（mRNA）：NM_001081343; RefSeq（蛋白質）：NP_00107481;  位置（UCSC）：Chr 4: 35.19 - 35.23 Mb。編碼C9orf72的核苷酸包括但不限於GENBANK登錄號NM_001256054.1；GENBANK登錄號NT_008413.18；GENBANK登錄號BQ068108.1；GENBANK登錄號NM_018325.3；GENBANK登錄號DN993522.1；GENBANK登錄號NM_145005.5；GENBANK登錄號DB079375.1；GENBANK登錄號BU194591.1；序列識別符4141_014_A 5；序列識別符4008_73_A；以及GENBANK登錄號NT_008413.18。據報導，C9orf72係具有54328 Da的分子量的481個胺基酸的蛋白質，其可以經歷泛素化和磷酸化的翻譯後修飾。據報導，C9orf72的表現水平可能在中樞神經系統中最高，並且該蛋白質定位在神經元的細胞質以及突觸前末梢中。據報導，C9orf72在內體和溶酶體運輸調節方面起作用，且已顯示出與參與自噬和內吞轉運的RAB蛋白質相互作用。據報導，C9orf72激活RAB5，RAB5係介導早期內體運輸的GTP酶。據報導，C9orf72中的突變與ALS和FTD相關聯。DeJesus-Hernandez等人2011 Neuron [神經元] 72: 245-256；Renton等人2011 Neuron [神經元] 72: 257-268；以及Itzcovich等人2016.Neurobiol. Aging.[神經生物學與衰老]第40卷, 第192.e13-192.e15頁。據報導，C9orf72中的六核苷酸重複擴增（例如(GGGGCC)n）可存在於患有諸如C9orf72相關障礙的神經疾病的受試者中。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與來源於任一DNA股的C9orf72核酸雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與C9orf72反義或有義轉錄物雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與處於任何RNA加工階段的C9orf72核酸雜交，包括但不限於mRNA先質或成熟mRNA。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與C9orf72核酸或其互補序列的任何元件雜交，包括但不限於：C9orf72核酸的啟動子區域、增強子區域、轉錄終止區域、翻譯起始信號、翻譯終止信號、編碼區域、非編碼區域、外顯子、內含子、5' UTR、3' UTR、重複區域、六核苷酸重複擴增、剪接接點、內含子/外顯子或外顯子/內含子接點、外顯子: 外顯子剪接接點、外顯子剪接靜止子(ESS)、外顯子剪接增強子(ESE)、外顯子1a、外顯子1b、外顯子1c、外顯子1d、外顯子1e、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8、外顯子9、外顯子10、外顯子11、內含子1、內含子2、內含子3、內含子4、內含子5、內含子6、內含子7、內含子8、內含子9或內含子10。內含子與外顯子交替；內含子1在外顯子1（或1a或1b或1c等）與外顯子2之間；內含子2在外顯子2與外顯子3之間；等。在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列與內含子1中的靶序列相同或互補。在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列與包含來自外顯子1b的一部分和來自內含子1的一部分的靶序列相同或互補。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸跨越外顯子1b與內含子1之間的接點。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與由GENBANK保藏編號NT_008413.18表示的C9orf72 mRNA先質、核苷27535000至27565000或其互補序列的一部分雜交。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與內含子雜交。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可與包含六核苷酸重複的內含子雜交。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸與衍生自有義股的所有C9orf72變體雜交。在一些實施方式中，本文中所描述的反義寡核苷酸選擇性地與衍生自有義股的C9orf72變體雜交，該變體包括但不限於包含六核苷酸重複擴增的變體。在一些實施方式中，六核苷酸重複擴增包含任何六核苷酸的至少24次重複。在一些實施方式中，六核苷酸重複擴增包含任何六核苷酸的至少30次重複。在一些實施方式中，六核苷酸重複擴增包含六核苷酸中的任一者的至少50次重複。在一些實施方式中，六核苷酸重複擴增包含六核苷酸中的任一者的至少100次重複。在一些實施方式中，六核苷酸重複擴增包含任何六核苷酸的至少200次重複。在一些實施方式中，六核苷酸重複擴增包含任何六核苷酸的至少500次重複。在一些實施方式中，六核苷酸係GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC、GGGGCG、CCCCGG、CCCCCC、GCCCCC和/或CGCCCC。在一些實施方式中，六核苷酸GGGGCC稱為GGGGCCexp或(GGGGCC)n ，或係六核苷酸GGGGCC的重複。
在一些實施方式中，所提供寡核苷酸或其區域（例如核心）的骨架手性中心模式包含或係(Sp)m(Rp)n、(Rp)n(Sp)m、(Np)t[(Op)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y、(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y、或(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y（如本文所述），其中m、n、t、y各自獨立地是1-50。在一些實施方式中，至少一個n係1。在一些實施方式中，每個n獨立地是1。在一些實施方式中，y係1。在一些實施方式中，y係2。在一些實施方式中，骨架手性中心模式包含或係(Rp)n(Sp)m、(Np)t(Rp)n(Sp)m、或(Sp)t(Rp)n(Sp)m，其中m ＞ 2。在一些實施方式中，骨架手性中心模式包括或為(Rp)n(Sp)m、(Np)t(Rp)n(Sp)m或(Sp)t(Rp)n(Sp)m，其中n為1，t ＞ 1，並且m ＞ 2。在一些實施方式中，至少一個n係1，至少一個t不小於1，且至少一個m不小於2。在一些實施方式中，至少一個n係1，至少一個t不小於2，且至少一個m不小於3。在一些實施方式中，每個n係1。在一些實施方式中，至少一個t ＞ 1。在一些實施方式中，至少一個t ＞ 2。在一些實施方式中，至少一個t ＞ 3。在一些實施方式中，至少一個t ＞ 4。在一些實施方式中，至少一個m ＞ 1。在一些實施方式中，至少一個m ＞ 2。在一些實施方式中，至少一個m ＞ 3。在一些實施方式中，至少一個m ＞ 4。在一些實施方式中，骨架手性中心模式包含一個或多個非手性天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，m、t和n的總和（或在一種模式中無t時，m和n的總和）不小於5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施方式中，該總和為5。在一些實施方式中，該總和為6。在一些實施方式中，該總和為7。在一些實施方式中，該總和為8。在一些實施方式中，該總和為9。在一些實施方式中，該總和為10。在一些實施方式中，該總和為11。在一些實施方式中，該總和為12。在一些實施方式中，該總和為13。在一些實施方式中，該總和為14。在一些實施方式中，該總和為15。在一些實施方式中，Sp係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的組態。在一些實施方式中，每個Sp係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的組態。在一些實施方式中，Rp係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的組態。在一些實施方式中，每個Rp係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的組態。在一些實施方式中，對於核心的骨架手性中心模式，每個Sp係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的組態。在一些實施方式中，對於核心的骨架手性中心模式，每個Rp係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的組態。
鹼基序列
在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸能夠導引C9orf72基因或其基因產物的表現、水平和/或活性的降低。在一些實施方式中，C9orf72靶標基因包含重複擴增。在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何鹼基序列或其一部分，其中一部分係至少15個連續鹼基的序列段或具有1至5個錯配的至少15個連續鹼基的序列段。在一些實施方式中，當與其C9orf72靶標的鹼基序列（例如，C9orf72基因或轉錄物的具有相同長度的序列）進行比對時，所提供的寡核苷酸的鹼基序列與靶序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或完全互補或相同。在一些實施方式中，存在不超過1、2或3個錯配。在一些實施方式中，存在不超過2個錯配。在一些實施方式中，存在不超過1個錯配。在一些實施方式中，不存在錯配。在一些實施方式中，錯配在翼中。在一些實施方式中，錯配在5'-翼中。在一些實施方式中，錯配在3'-翼中。在一些實施方式中，錯配在核心中。在一些實施方式中，所有「錯配」係沃森-克裡克鹼基對。在一些實施方式中，存在一個或多個（例如1、2、3個）擺動鹼基對。在一些實施方式中，存在不超過1、2或3個擺動鹼基對。在一些實施方式中，存在不超過2個擺動鹼基對。在一些實施方式中，存在不超過1個擺動鹼基對。在一些實施方式中，不存在擺動鹼基對。在一些實施方式中，擺動鹼基對在翼中。在一些實施方式中，擺動鹼基對在5'-翼中。在一些實施方式中，擺動鹼基對在3'-翼中。在一些實施方式中，擺動鹼基對在核心中。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的鹼基序列具有充分長度及與C9orf72轉錄物靶標的同一性，以介導靶標特定性敲低。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸與轉錄物靶標序列的一部分互補。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的鹼基序列與C9orf72靶標轉錄物的鹼基序列互補。如本文中所用，「靶標轉錄物序列」、「靶標序列」、「靶標基因」以及其類似者係指在C9orf72基因的轉錄期間形成的mRNA分子（包括係原始轉錄產物的RNA加工產物的mRNA）的核苷酸序列的連續部分。
本文中的術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可在C9orf72寡核苷酸與C9orf72靶標序列之間的鹼基匹配方面使用，如將自其使用情境所理解。在一些實施方式中，當最大限度地比對，寡核苷酸的各鹼基能夠與靶標股上的順序鹼基進行鹼基配對時，C9orf72寡核苷酸的鹼基序列與C9orf72靶標序列的鹼基序列互補。作為非限制性實例，如果靶序列具有例如5'-GCAUAGCGAGCGAGGGAAAAC-3'的鹼基序列，則具有5'GUUUUCCCUCGCUCGCUAUGC-3'的鹼基序列的寡核苷酸與此靶序列互補或完全互補。當然，應注意，用U取代T或反過來都不會改變互補的量。
如本文中所使用，與C9orf72靶標序列「實質上互補」的聚核苷酸在很大程度上或基本上互補，但並非100%互補。在一些實施方式中，實質上互補的序列（例如C9orf72寡核苷酸）與同靶標序列100%互補的序列之間具有1、2、3、4或5個錯配。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的鹼模體列可以包含CpG模體，其可以充當免疫刺激劑（例如，當未甲基化時）。在一些實施方式中，修飾CpG模體的C或G以用另一個鹼基替換C和/或G。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的鹼基序列係或包含（或包含其至少15個連續鹼基的序列段）本文所述之任何C9orf72寡核苷酸的序列，除了CpG模體中的C或G（如果存在）被換為另一種核鹼基以外。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的鹼基序列係或包含（或包含其至少15個連續鹼基的序列段）本文所述之任何C9orf72寡核苷酸的序列，除了CpG模體中的C（如果存在）被換為另一種核鹼基以外。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的鹼基序列係或包含（或包含其至少15個連續鹼基的序列段）本文所述之任何C9orf72寡核苷酸的序列，除了CpG模體中的G（如果存在）被另一種核鹼基替換以外。如本文所用，與用替換鹼基替換寡核苷酸中的鹼基有關的短語或其他文本係指以下情況，其中：具有藉由沃森-克裡克鹼基配對（例如，每個U或T與A進行鹼基配對，以及每個G與C進行鹼基配對）與靶序列（例如mRNA）100%互補的鹼基序列的寡核苷酸，除了寡核苷酸中的一個鹼基（通常會與靶標核酸中的相應鹼基形成沃森-克裡克鹼基對）被不能與靶標核酸的相應鹼基形成沃森-克裡克鹼基對的替換鹼基（例如，核鹼基或核鹼基衍生物）替換，儘管替換核鹼基可視需要（但不一定）與靶標核酸序列中的相應鹼基形成非沃森-克裡克鹼基對[包括但不限於：擺動鹼基對，例如鳥嘌呤-尿嘧啶（G-U），次黃嘌呤-尿嘧啶（I-U），次黃嘌呤-腺嘌呤（I-A）和次黃嘌呤-胞嘧啶（I-C）]。在一些實施方式中，用替換鹼基替換寡核苷酸中的鹼基將錯配引入在該位置的靶序列。在一些實施方式中，C被T替換（例如，在核心中，或核苷C不包含2'-OR或在2'-碳上不包含取代基）。在一些實施方式中，C被U替換（例如，在翼中，或核苷在2'-碳上包含取代基）。在一些實施方式中，一個或多個C獨立地被替換。在一些實施方式中，寡核苷酸或其一部分（例如5’-翼、核心、3’-翼）中的每個C被獨立地被替換。
在一些實施方式中，在C9orf72寡核苷酸中，G被肌苷（I）替換。在一些實施方式中，本文所用的術語肌苷或I等同於核鹼基次黃嘌呤。在一些實施方式中，本文所用的術語肌苷等同於包含次黃嘌呤和糖或修飾的糖的核苷。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸包含CpI模體（例如其中核鹼基G已被I替換的CpG模體）。此類C9orf72寡核苷酸的非限制性實例包括但不限於：WV-21442和WV-21445。
在一些實施方式中，在具有CpG模體的C9orf72寡核苷酸中，C被修飾（例如甲基化成5mC）以例如降低CpG模體的免疫原性。在一些實施方式中，經修飾的C核苷（例如5mC核苷）包含2’-MOE修飾。在一些實施方式中，在翼中的CpG模體中，C被修飾（例如甲基化成5mC）。在一些實施方式中，在5’-翼中的CpG模體中，C被修飾（例如甲基化成5mC）。在一些實施方式中，在3’-翼中的CpG模體中，C被修飾（例如甲基化成5mC）。在一些實施方式中，在核心中的CpG模體中，C被修飾（例如甲基化成5mC）。在一些實施方式中，CpG模體的每個C被修飾（例如甲基化成5mC）。在一些實施方式中，一個或多個不在CpG模體中的C被獨立地修飾（例如甲基化成5mC）。此類寡核苷酸的非限制性實例包括：WV-21445、WV-21446、WV-23740、WV-23503和WV-23491。
在一些實施方式中，末端鹼基（例如，極端的5'或3'端之一）係CpG模體的組分（例如，寡核苷酸的CpG中5'端的C或CpG中3'端的G）。在一些實施方式中，與不是末端鹼基的鹼基（例如，非末端鹼基）相比，末端鹼基對寡核苷酸與靶標核酸的雜交的貢獻較小。在一些實施方式中，本揭露關於CpG寡核苷酸，其中末端鹼基係CpG模體中的組分，並且該末端鹼基被另一鹼基替換；並且在一些實施方式中，CpG寡核苷酸的末端鹼基係G並被I替換。
在考慮用於C9orf72寡核苷酸的設計和構建的鹼基序列的一些實施方式中，末端鹼基係CpG模體中的組分，並且因此末端鹼基不包括在寡核苷酸的鹼基序列中（例如，寡核苷酸被截短了一個鹼基）。此類寡核苷酸的非限制性實例包括WV-21557、WV-23486、WV-23435和WV-23487。
在一些實施方式中，在C9orf72寡核苷酸中，末端鹼基係核鹼基A，且該鹼基被I或G替換。此類寡核苷酸的非限制性實例包括：WV-21445、WV-21446、WV-23740、WV-23503和WV-23491。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下鹼基序列、包含以下鹼基序列或包含以下鹼基序列的至少15個鹼基長的部分：CCCACACCTGCTCTTGCTAG、AACAGCCACCCGCCAGGATG、AACCGGGCAG CAGGGACGGC、ACAGGCTGCGGTTGTTTCCC、ACCCACACCTGCTCTTGCTA、ACCCACTCGCCACCGCCTGC、ACCCCAAACAGCCACCCGCC、ACCCCCATCTCATCCCGCAT、ACCCGAGCTGTCTCCTTCCC、ACCCGCCAGGATGCCGCCTC、ACCCGCGCCTCTTCCCGGCA、ACCCTCCGGCCTTCCCCCAG、ACCGGGCAGCAGGGACGGCT、ACCTCTCTTTCCTAGCGGGA、ACGCACCTCTCTTTCCTAGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、AGCAACCGGGCAGCAGGGAC、AGCCGTCCCTGCTGCCCGGT、AGCGCGCGACTCCTGAGTTC、AGCTTGCTACAGGCTGCGGT、AGGATGCCGCCTCCTCACTC、AGGCTGCGGTTGTTTCCCTC、AGGCTGTCAGCTCGGATCTC、AGGGCCACCCCTCCTGGGAA、ATCCCCTCACAGGCTCTTGT、ATGCCGCCTCCTCACTCACC、ATTGCCTGCATCCGGGCCCC、CACCCACTCGCCACCGCCTG、CACCCCCATCTCATCCCGCA、CACCCGCCAGGATGCCGCCT、CACCTCTCTTTCCTAGCGGG、CACTCACCCACTCGCCACCG、CAGGATGCCGCCTCCTCACT、CAGGCTGCGGTTGTTTCCCT、CAGGGTGGCATCTGCTTCAC、CCAAACAGCCACCCGCCAGG、CCACCCGCCAGGATGCCGCC、CCACCCTCCGGCCTTCCCCC、CCACTCGCCACCGCCTGCGC、CCAGGATGCCGCCTCCTCAC、CCCAAACAGCCACCCGCCAG、CCCACTCGCCACCGCCTGCG、CCCCAAACAGCCACCCGCCA、CCCGCCAGGATGCCGCCTCC、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCCGCGCCTCTTCCCGGCAG、CCCGGCAGCCGAACCCCAAA、CCGACTTGCATTGCTGCCCT、CCGCAGCCTGTAGCAAGCTC、CCGCCAGGATGCCGCCTCCT、CCGCCTCCTCACTCACCCAC、CCGCGCCTCTTCCCGGCAGC、CCGCTTCTACCCGCGCCTCT、CCGGGCAGCAGGGACGGCTG、CCTAGCGGGACACCGTAGGT、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCCGGCCTTCCCCCAGGC、CCTCCTCACTCACCCACTCG、CCTCTCTTTCCTAGCGGGAC、CCTCTGCCAAGGCCTGCCAC、CCTCTTCCCGGCAGCCGAAC、CCTGAGTTCCAGAGCTTGCT、CCTGCTCTTGCTAGACCCCG、CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT、CCTGGTTGCTTCACAGCTCC、CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC、CGCACCTCTCTTTCCTAGCG、CGCATAGAATCCAGTACCAT、CGCCAGGATGCCGCCTCCTC、CGCCTCCTCACTCACCCACT、CGCCTCTTCCCGGCAGCCGA、CGCGCGACTCCTGAGTTCCA、CGCTTCTACCCGCGCCTCTT、CGGGCAGCAGGGACGGCTGA、CGGTTGTTTCCCTCCTTGTT、CTACCCGCGCCTCTTCCCGG、CTCACCCACTCGCCACCGCC、CTCACTCACCCACTCGCCAC、CTCAGTACCCGAGGCTCCCT、CTCCTCACTCACCCACTCGC、CTCTTCCCGGCAGCCGAACC、CTCTTGCTAGACCCCGCCCC、CTCTTTCCTAGCGGGACACC、CTGCGGTTGTTTCCCTCCTT、CTGCTCTTGCTAGACCCCGC、CTTCCCGGCAGCCGAACCCC、CTTCCTTGCTTTCCCGCCCT、CTTCTACCCGCGCCTCTTCC、CTTGCTAGACCCCGCCCCCA、CTTGGTGTGTCAGCCGTCCC、CTTGTTCACCCTCAGCGAGT、CTTTCCTAGCGGGACACCGT、GACATCCCCTCACAGGCTCT、GAGAGCCCCCGCTTCTACCC、GAGCTGCCCAGGACCACTTC、GAGCTTGCTACAGGCTGCGG、GAGGCCAGATCCCCATCCCT、GATCCCCATTCCAGTTTCCA、GATGCCGCCTCCTCACTCAC、GCAACCGGGCAGCAGGGACG、GCACCTCTCTTTCCTAGCGG、GCAGGCGGTGGCGAGTGGGT、GCAGGCGTCTCCACACCCCC、GCAGGGACGG CTGACACACC、GCATCCGGGCCCCGGGCTTC、GCATCCTGGCGGGTGGCTGT、GCCACCCGCCAGGATGCCGC、GCCAGATCCCCATCCCTTGT、GCCAGGATGCCGCCTCCTCA、GCCCTCAGTACCCGAGCTGT、GCCGCCTCCTCACTCACCCA、GCCGGGAAGA GGCGCGGGTAG、GCCGTCCCTGCTGCCCGGTT、GCCTCCTCACTCACCCACTC、GCCTCTCAGTACCCGAGGCT、GCCTCTTCCCGGCAGCCGAA、GCGCAGGCGGTGGCGAGTG GGTGAGTGAGGAGGCGGCATC、GCGCAGGCGGTGGCGAGTGGGTGAGTGAGG、GCGCGACTCC TGAGTTCCAG、GCGCGCGACTCCTGAGTTCC、GCGGCATCCTGGCGGGTGGC、GCGGTTGCGGTGCCTGCGCC、GCGGTTGTTTCCCTCCTTGT、GCTACAGGCTGCGGTTGTTT、GCTAGACCCCGCCCCCAAAA、GCTCTGAGGAGAGCCCCCGC、GCTCTTGCTAGACCCCGCCC、GCTGCGATCCCCATTCCAGT、GCTGCGGTTGTTTCCCTCCT、GCTGGAGATGGCGGTGGGCA、GCTGGGTGTCGGGCTTTCGC、GCTGTTTGACGCACCTCTCT、GCTTCTACCCGCGCCTCTTC、GCTTGCTACAGGCTGCGGTT、GCTTGGTGTGTCAGCCGTCC、GCTTTCCCGCCCTCAGTACC、GGACCCGCTGGGAGCGCTGC、GGATGCCGCCTCCTCACTCA、GGCAGCAGGG ACGGCTGACA、GGCCTCTCAGTACCCGAGGC、GGCGGAGGCGCAGGCGGTGG、GGCGTCTCCACACCCCCATC、GGCTCCCTTTTCTCGAGCCC、GGCTGCGGTTGTTTCCCTCC、GGGAAGGCCGGAGGGTGGGC、GGGCAGCAGGGACGGCTGAC、GGGCTCTCCT CAGAGCTCGA、GGGTGTCGGGCTTTCGCCTC、GGTCCCTGCCGGCGAGGAGA、GTACCCGAGGCTCCCTTTTC、GTCAGCCGTCCCTGCTGCCC、GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT、GTCCGTGTGCTCATTGGGTC、GTCGCTGTTTGACGCACCTC、GTCGGTGTGCTCCCCATTCT、GTGCAGGCGTCTCCACACCC、GTGCTGCGATCCCCATTCCA、GTGGCAGGCCTTGGCAGAGG、GTTCACCCTCAGCGAGTACT、GTTGCGGTGCCTGCGCCCGC、GTTGTTTCCCTCCTTGTTTT、TACAGGCTGCGGTTGTTTCC、TACCCGCGCCTCTTCCCGGC、TCACCCACTCGCCACCGCCT、TCACCCTCAGCGAGTACTGT、TCACTCACCCACTCGCCACC、TCCCCTCACAGGCTCTTGTG、TCCCGGCAGCCGAACCCCAA、TCCTCACTCACCCACTCGCC、TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA、TCTCAGTACCCGAGGCTCCC、TCTTCCCGGCAGCCGAACCC、TCTTGCTAGACCCCGCCCCC、TGCCGCCTCCTCACTCACCC、TGCCTGCATCCGGGCCCCGG、TGCGGTTGTTTCCCTCCTTG、TGCTACAGGCTGCGGTTGTT、TGCTAGACCCCGCCCCCAAA、TGCTCTTGCTAGACCCCGCC、TGGAATGGGGATCGCAGCAC、TGGAATGGGGATCGCAGCACA、TGGCGAGTGG GTGAGTGAGGAGGCGGCATC、TGTGCTGCGATCCCCATTCC、TTCCAGAGCTTGCTACAGGC、TTCCCGGCAGCCGAACCCCA、TTCTACCCGCGCCTCTTCCC、TTGCTACAGGCTGCGGTTGT、TTGCTAGACCCCGCCCCCAA、TTTCCCCACACCACTGAGCT、ACCCACTCGCCA、ACCCACTCGCCA、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCACCCACTCGCCACCGC、ACTCGCCA、AUACUUACCUGG、CACTCGCCA、CCCACTCGCCA、CCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCC、CCTCACTCACCCACTCGCC、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCA、CCTCACTCACCCACTCGCCC、CCTCACTCACCCACTCGCCC、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCG、CCTCACTCACCCACTCGCCI、CCTCACTCACCCACTCGCCI、CCTCACTCACCCACTCGCCU、CCTCACTCACCCACTCGCCU、CCTCACTCACCCACUCGCC、CCTCACTCACCCACUCGCC、CCTCACTCACCCACUCGCC、CCTCACTCACCCACUCGCCA、CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT、CCTGCTGCCCGGTTGCUUCU、CCUGCTGCCCGGTTGCTTCT、CGCCUCCTCACTCACCCACU、CTCACTCACCCACTCGCCAC、CUCUGGAACUCAGGAGUCGCGCGC、GCGCGACTCC TGAGTTCCAG、GCUACCUAUAUG、GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT、GUCCCTGCTG CCCGGTTGCT、TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA、TGCCGCCTCCTCACTCACCC、UCCTCACTCA CCCACUCGCC、或UCCUTGCTTTCCCGCCCTCA，其中每個核鹼基T可獨立且視需要被核鹼基U取代，並且其中每個U可獨立且視需要被T取代，並且其中一個或多個CpG模體中的核鹼基C和/或核鹼基G（如果存在）被另一種核鹼基替換；並且在一些實施方式中，CpG模體中的G核鹼基被I替換。
在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列係、包含或包含ACTCACCCACTCGCCACCGC的至少15個鹼基的部分，其中每個核鹼基T可獨立且視需要被核鹼基U取代，並且其中每個U可獨立且視需要被T取代，並且其中一個或多個CpG模體中的核鹼基C和/或核鹼基G（如果存在）被另一種核鹼基替換；並且在一些實施方式中，CpG模體中的G核鹼基被I替換。在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列係、包含或包含ACTCACCCACTCGCCACCGC的至少15個鹼基的部分，其中每個核鹼基T可獨立且視需要被核鹼基U取代，並且其中每個U可獨立且視需要被T取代，並且CpG模體中的一個或多個G獨立地被I替換。在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列係、包含或包含ACTCACCCACTCGCCACCGC的至少15個鹼基的部分，其中每個核鹼基T可獨立且視需要被核鹼基U取代，並且其中每個U可獨立且視需要被T取代。在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列係、包含或包含ACTCACCCACTCGCCACCGC的至少15個鹼基的部分。如所述，本揭露的寡核苷酸可包含多種鹼基、糖和/或核苷酸間鍵聯修飾，例如在一些實施方式中，將5mC用作經修飾的C。
本揭露在表A1中及其他處提供各種寡核苷酸，其各自具有經定義的鹼基序列。在一些實施方式中，本揭露涵蓋具有以下鹼基序列的任何寡核苷酸，該鹼基序列係本文所揭露的寡核苷酸中的任一者的鹼基序列、包含本文所揭露的寡核苷酸中的任一者的鹼基序列、或包含本文所揭露的寡核苷酸中的任一者的鹼基序列的一部分。在一些實施方式中，本揭露涵蓋具有以下鹼基序列的任何寡核苷酸，該鹼基序列係本文所揭露的任何寡核苷酸的鹼基序列、包含本文所揭露的任何寡核苷酸的鹼基序列、或包含本文所揭露的任何寡核苷酸的鹼基序列的一部分，該寡核苷酸具有任何化學修飾、立體化學、形式、結構特徵（例如，任何結構或修飾模式或其部分）、和/或本文所述之任何其他修飾（例如，與另一部分（如靶向部分、碳水化合物部分等）軛合；和/或多聚體化）。在一些實施方式中，「一部分」（例如鹼基序列或修飾模式的一部分）係至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個長。在一些實施方式中，鹼基序列的「一部分」係至少5 nt長。在一些實施方式中，鹼基序列的「一部分」係至少10 nt長。在一些實施方式中，鹼基序列的「一部分」係至少15 nt長。在一些實施方式中，鹼基序列的「一部分」係至少20 nt長。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：ATACTTACCTGG，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CACTCGCCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：ACTCGCCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：ACCCACTCGCCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCCACTCGCCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：TGCCGCCTCCTCACTCACCC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：TGCCGCCTCCTCACTCACCC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：GCGCGACTCCTGAGTTCCAG，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：TCCTTGCTTTCCCGCCCTCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：GTCCCTGCTGCCCGGTTGCT，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTGCTGCCCGGTTGCTTCT，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：GCTACCTATATG，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CTCTGGAACTCAGGAGTCGCGCGC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCI，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCG，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：TCCTCACTCACCCACTCGCC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CTCACTCACCCACTCGCCAC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：ACTCACCCACTCGCCACCGC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CGCCTCCTCACTCACCCACT，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCA，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCC，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：CCTCACTCACCCACTCGCCT，其中每個T可以獨立地且視需要被U取代。
在一些實施方式中，寡核苷酸靶向C9orf72且其鹼基序列係以下、包含以下或包含以下的一部分：ACTCACCCACTCGCCACCGC，其中每個T可獨立且視需要被U取代，並且其中寡核苷酸的核苷酸間鍵聯從5’至3’，SnROnRSSSRSSSSRSSSnRSS,其中每個S獨立地表示Sp組態的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，每個nR獨立地表示Rp組態的n001，O表示天然磷酸酯鍵聯，並且每個R獨立地表示Rp組態的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
一種藥物組成物，該藥物組成物包含靶向如實施方式中任一項所述之C9orf72的寡核苷酸、和藥學上可接受的稀釋劑或載體。
一種藥物組成物，該藥物組成物包含靶向如實施方式中任一項所述之C9orf72的寡核苷酸，其中藥學上可接受的稀釋劑係磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）或人工CFS（aCFS）。
在一些實施方式中，藥物組成物包含靶向C9orf72並具有鹼基序列為ACTCACCCACTCGCCACCGC的寡核苷酸。
在一些實施方式中，藥物組成物包含靶向C9orf72並具有鹼基序列為ACTCACCCACTCGCCACCGC的寡核苷酸或其鹽、和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
在一些實施方式中，組成物包含靶向C9orf72並具有鹼基序列為ACTCACCCACTCGCCACCGC的寡核苷酸，其中該其鹽係鈉鹽。
在一些實施方式中，鹼基序列的一部分係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個或更多個相連（連續）鹼基的序列段。在一些實施方式中，鹼基序列的一部分係15、16、17、18、19個或更多個相連（連續）鹼基的序列段。在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列係或包含上述鹼基序列。在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列係上述鹼基序列。
在一些實施方式中，寡核苷酸5'端的核鹼基可視需要被替換核鹼基（如熟悉該項技術者所理解的，其與原始的5'端核鹼基不同）替換。在一些實施方式中，寡核苷酸5'端的核鹼基被替換核鹼基替換。在一些實施方式中，寡核苷酸3'端的核鹼基視需要被替換核鹼基（如熟悉該項技術者所理解的，其與原始的3'端核鹼基不同）替換。在一些實施方式中，寡核苷酸3'端的核鹼基被替換核鹼基替換。在一些實施方式中，替換核鹼基選自I、A、T、U、G和C。在一些實施方式中，替換核鹼基係I。在一些實施方式中，替換核鹼基係A。在一些實施方式中，替換核鹼基係T。在一些實施方式中，替換核鹼基係U。在一些實施方式中，替換核鹼基係G。在一些實施方式中，替換核鹼基係C。在一些實施方式中，當與靶序列比對時，替換核鹼基產生非沃森-克裡克（non-Watson-Crick）鹼基對。在一些實施方式中，替換核鹼基產生擺動鹼基對。
如本文所證明的，在許多實施方式中，替換可以提供改善的特性、活性、選擇性等。
在一些實施方式中，本揭露提供本文中所列舉的序列的C9orf72寡核苷酸。在一些實施方式中，本揭露提供本文中所列舉的序列的C9orf72寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠導引C9orf72基因或其基因產物的表現、水平和/或活性的降低。在一些實施方式中，所列舉序列的C9orf72寡核苷酸包含本文中所描述的任何結構。在各種序列中，U可經T替換或反過來，或序列可包含U與T的混合物。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的長度係至多約49、45、40、30、35、25、23個總核苷酸。在一些實施方式中，一部分係具有0至3個錯配的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個總核苷酸的序列段。在一些實施方式中，一部分係具有0至3個錯配的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個總核苷酸的序列段，其中具有0個錯配的序列段係互補的，且具有1個或更多個錯配的序列段係實質上互補的非限制性實例。在上文所述序列以5'端處的U開始的一些實施方式中，U可缺失和/或經另一鹼基替換。在一些實施方式中，本揭露涵蓋具有係以下或包含以下或包含以下的一部分的鹼基序列的任何寡核苷酸：本文中揭露的任何寡核苷酸的鹼基序列，該鹼基序列具有本文中揭示的形式或形式的一部分。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何鹼基序列。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何鹼基序列或其部分。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何鹼基序列或其部分，其中一部分係15個連續鹼基的序列段或具有1至5個錯配的15個連續鹼基的序列段。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述的任何鹼基序列或其部分與本文中所描述的任何其他結構元件或修飾的組合。表A1中描述了鹼基序列和有用的結構元件的某些實例（包括其修飾和模式）。
具有各種鹼基序列及修飾的C9orf72寡核苷酸的非限制性實例揭示於下表A1中。
[表A1].某些寡核苷酸和組成物，包括C9orf72寡核苷酸和組成物。
ID 描述 鹼基序列 立體化學/核苷酸間鍵聯
WV-8012 mC*Sm5CeoTeom5CeomA*SC*ST*SC*RA*SC*SC*RC*SA*SC*ST*SmC*SmG*SmC*SmC*SmA CCTCACTCACCCACTCGCCA SOOOSSSRSSRSSSSSSSS
WV-17819 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmC * RmG * RmC * RmC * RmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS RRRR
WV-17820 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5Ceo * SGeo * Sm5Ceo * Sm5Ceo * SAeo CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-17821 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5Ceo * RGeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RAeo CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS RRRR
WV-17822 mC * m5CeoTeom5CeomA * C * T * C * A * C * C * C * A * C * T * m5Ceo * Geo * m5Ceo * m5Ceo * Aeo CCTCACTCAC CCACTCGCCA XOOOX  XXXXX  XXXXX XXXX
WV-17885 mC * SmC * SmU * SmC * SmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5CeoGeom5Ceom5Ceo * RAeo CCUCACTCACCCAC TCGCCA SSSSS  SSRSS  SRSSS OOOR
WV-18851 rArUrArCrUrUrArCrCrUrGrG AUACUUACCUGG OOOOO  OOOOO O
WV-18852 mC * m5CeoTeom5CeomA * C * T * C * A * C * C * C * A * C * T * mC * mG * mC * mC * mAL004 CCTCACTCAC CCACTCGCCA XOOOX  XXXXX  XXXXX XXXX
WV-20761 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmCmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS OSSS
WV-20762 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5CeomG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS OSSS
WV-20763 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-20764 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Rm5CeomG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS RSSSROSSS
WV-20765 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Rm5Ceo * SmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS RS SSRSS SS
WV-20766 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-20767 C * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA CACTCGCCA SSSSS SSS
WV-20768 A * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA ACTCGCCA SSSSS SS
WV-20769 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5CeoGeomC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS OOSS
WV-20770 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Rm5CeoGeomC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS RSSSROOSS
WV-20771 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mCmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS OSSS
WV-20772 A * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA ACCCACTCGCCA SSR SSSSS SSS
WV-20773 C * SC * RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA CCCACTCGCCA SR SSSSS SSS
WV-20774 A * SC * SC * SC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA ACCCACTCGCCA SSSSS  SSSSS S
WV-20775 C * SC * SC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA CCCACTCGCCA SSSSS  SSSSS
WV-21145 Teo * RGeom5Ceom5CeoGeo * RC * SC * ST * SC * RC * ST * SC * RA * SC * ST * Rm5CeoAeom5Ceom5Ceo * Rm5Ceo TGCCGCCTCC TCACTCAC CC ROOORS SSRSS  RSSRO OOR
WV-21146 Teo * RGeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RGeo * RC * SC * ST * SC * RC * ST * SC * RA * SC * ST * Rm5Ceo * RAeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * Rm5Ceo TGCCGCCTCC TCACTCAC CC RRRRRS SSRSS  RSSRR RRR
WV-21147 Teo * RGeom5Ceom5CeoGeo * RC * SC * ST * SC * RC * ST * SC * RA * SC * ST * Rm5Ceo * RAeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * Rm5Ceo TGCCGCCTCC TCACTCAC CC ROOORS SSRSS  RSSRR RRR
WV-21148 Teo * RGeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RGeo * RC * SC * ST * SC * RC * ST * SC * RA * SC * ST * Rm5CeoAeom5Ceom5Ceo * Rm5Ceo TGCCGCCTCC TCACTCAC CC RRRRRS SSRSS  RSSRO OOR
WV-21149 Teo * RGeom5Ceom5CeoGeo * RC * SC * ST * SC * RC * ST * SC * RA * SC * ST * Rm5Ceo * SmA * SmC * SmC * SmC TGCCGCCTCC TCACTCAC CC ROOORS SSRSS R SSRSS SS
WV-21150 mU * SmG * SmC * SmC * SGeo * RC * SC * ST * SC * RC * ST * SC * RA * SC * ST * Rm5CeoAeom5Ceom5Ceo * Rm5Ceo UGCCGCCTCC TCACTCAC CC SS SSRSS SR SSRSS ROOOR
WV-21151 Geo * Rm5CeoGeom5CeoGeo * RA * SC * ST * SC * RC * ST * SG * RA * SG * ST * RTeom5Ceom5CeoAeo * RGeo GCGCGACTCC TGAGTTCCAG ROOORS SSRSS  RSSRO OOR
WV-21152 Geo * Rm5Ceo * RGeo * Rm5Ceo * RGeo * RA * SC * ST * SC * RC * ST * SG * RA * SG * ST * RTeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RAeo * RGeo GCGCGACTCC TGAGTTCCAG RRRRRS SSRSS  RSSRR RRR
WV-21153 Geo * Rm5CeoGeom5CeoGeo * RA * SC * ST * SC * RC * ST * SG * RA * SG * ST * RTeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RAeo * RGeo GCGCGACTCC TGAGTTCCAG ROOORS SSRSS  RSSRR RRR
WV-21154 Geo * Rm5Ceo * RGeo * Rm5Ceo * RGeo * RA * SC * ST * SC * RC * ST * SG * RA * SG * ST * RTeom5Ceom5CeoAeo * RGeo GCGCGACTCC TGAGTTCCAG RRRRRS SSRSS  RSSRO OOR
WV-21155 Geo * Rm5CeoGeom5CeoGeo * RA * SC * ST * SC * RC * ST * SG * RA * SG * ST * RTeo * SmC * SmC * SmA * SmG GCGCGACTCC TGAGTTCCAG ROOORS SSRSS R SSRSS SS
WV-21156 mG * SmC * SmG * SmC * SGeo * RA * SC * ST * SC * RC * ST * SG * RA * SG * ST * RTeom5Ceom5CeoAeo * RGeo GCGCGACTCC TGAGTTCCAG SS SSRSS SR SSRSS ROOOR
WV-21157 Teo * Rm5Ceom5CeoTeoTeo * RG * SC * ST * ST * RT * SC * SC * Rm5C * SG * SC * Rm5Ceom5CeoTeom5Ceo * RAeo TCCTTGCTTT CCCGCCCTCA ROOORS SSRSS  RSSRO OOR
WV-21158 Teo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RTeo * RTeo * RG * SC * ST * ST * RT * SC * SC * Rm5C * SG * SC * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RTeo * Rm5Ceo * RAeo TCCTTGCTTT CCCGCCCTCA RRRRRS SSRSS  RSSRR RRR
WV-21159 Teo * Rm5Ceom5CeoTeoTeo * RG * SC * ST * ST * RT * SC * SC * Rm5C * SG * SC * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RTeo * Rm5Ceo * RAeo TCCTTGCTTT CCCGCCCTCA ROOORS SSRSS  RSSRR RRR
WV-21160 Teo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RTeo * RTeo * RG * SC * ST * ST * RT * SC * SC * Rm5C * SG * SC * Rm5Ceom5CeoTeom5Ceo * RAeo TCCTTGCTTT CCCGCCCTCA RRRRRS SSRSS  RSSRO OOR
WV-21161 Teo * Rm5Ceom5CeoTeoTeo * RG * SC * ST * ST * RT * SC * SC * Rm5C * SG * SC * Rm5Ceo * SmC * SmU * SmC * SmA TCCTTGCTTT CCCGCCCUCA ROOORS SSRSS R SSRSS SS
WV-21162 mU * SmC * SmC * SmU * STeo * RG * SC * ST * ST * RT * SC * SC * Rm5C * SG * SC * Rm5Ceom5CeoTeom5Ceo * RAeo UCCUTGCTTT CCCGCCCTCA SS SSRSS SR SSRSS ROOOR
WV-21163 Geo * RTeom5Ceom5Ceom5Ceo * RT * SG * SC * ST * SG * RC * SC * Sm5C * RG * SG * STeoTeoGeom5Ceo * RTeo GTCCCTGCTG CCCGGTTGCT ROOORSS SSRSS RSSOOOR
WV-21164 Geo * RTeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RT * SG * SC * ST * SG * RC * SC * Sm5C * RG * SG * STeo * RTeo * RGeo * Rm5Ceo * RTeo GTCCCTGCTG CCCGGTTGCT RRRRRSS SSRSS  RSSRR RR
WV-21165 Geo * RTeom5Ceom5Ceom5Ceo * RT * SG * SC * ST * SG * RC * SC * Sm5C * RG * SG * STeo * RTeo * RGeo * Rm5Ceo * RTeo GTCCCTGCTG CCCGGTTGCT ROOORSS SSRSS  RSSRR RR
WV-21166 Geo * RTeo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * Rm5Ceo * RT * SG * SC * ST * SG * RC * SC * Sm5C * RG * SG * STeoTeoGeom5Ceo * RTeo GTCCCTGCTG CCCGGTTGCT RRRRRSS SSRSS RSSOOOR
WV-21167 Geo * RTeom5Ceom5Ceom5Ceo * RT * SG * SC * ST * SG * RC * SC * Sm5C * RG * SG * SmU * SmU * SmG * SmC * SmU GTCCCTGCTG CCCGGUUGCU ROOORSS SSRSS R SSSSS S
WV-21168 mG * SmU * SmC * SmC * Sm5Ceo * RT * SG * SC * ST * SG * RC * SC * Sm5C * RG * SG * STeoTeoGeom5Ceo * RTeo GUCCCTGCTG CCCGGTTGCT SS SSRSS  SSRSS RSSOOOR
WV-21169 m5Ceo * Rm5CeoTeoGeom5Ceo * RT * SG * SC * SC * Rm5C * SG * SG * RT * ST * SG * Rm5CeoTeoTeom5Ceo * RTeo CCTGCTGCCC GGTTGCTTCT ROOORS SSRSS  RSSRO OOR
WV-21170 m5Ceo * Rm5Ceo * RTeo * RGeo * Rm5Ceo * RT * SG * SC * SC * Rm5C * SG * SG * RT * ST * SG * Rm5Ceo * RTeo * RTeo * Rm5Ceo * RTeo CCTGCTGCCC GGTTGCTTCT RRRRRS SSRSS  RSSRR RRR
WV-21171 m5Ceo * Rm5CeoTeoGeom5Ceo * RT * SG * SC * SC * Rm5C * SG * SG * RT * ST * SG * Rm5Ceo * RTeo * RTeo * Rm5Ceo * RTeo CCTGCTGCCC GGTTGCTTCT ROOORS SSRSS  RSSRR RRR
WV-21172 m5Ceo * Rm5Ceo * RTeo * RGeo * Rm5Ceo * RT * SG * SC * SC * Rm5C * SG * SG * RT * ST * SG * Rm5CeoTeoTeom5Ceo * RTeo CCTGCTGCCC GGTTGCTTCT RRRRRS SSRSS  RSSRO OOR
WV-21173 m5Ceo * Rm5CeoTeoGeom5Ceo * RT * SG * SC * SC * Rm5C * SG * SG * RT * ST * SG * Rm5Ceo * SmU * SmU * SmC * SmU CCTGCTGCCC GGTTGCUUCU ROOORS SSRSS R SSRSS SS
WV-21174 mC * SmC * SmU * SmG * Sm5Ceo * RT * SG * SC * SC * Rm5C * SG * SG * RT * ST * SG * Rm5CeoTeoTeom5Ceo * RTeo CCUGCTGCCC GGTTGCTTCT SS SSRSS SR SSRSS ROOOR
WV-21206 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmCn001mG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS  nX SSS
WV-21207 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SmCn001mG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  SRSSS  nX SSS
WV-21208 m5Ceo * Rm5CeoTeom5CeoAeo * RC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmCn001mG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA ROOOR SSRSS  RSSSS  nX SSS
WV-21209 m5Ceo * Rm5CeoTeom5CeoAeo * RC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SmCn001mG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA ROOOR SSRSS  SRSSS  nX SSS
WV-21259 rGrCrUrArCrCrUrArUrArUrG GCUACCUAUAUG OOOOO  OOOOO O
WV-21344 rCrUrCrUrGrGrArArCrUrCrArGrGrArGrUrCrGrCrGrCrGrC CUCUGGAACU CAGGAGUCGC GCGC OOOOO  OOOOO  OOOOO  OOOOO OOO
WV-21345 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * Sm5mC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-21346 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * Sm5mC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-21347 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mCmG * SmC * Sm5mC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS OSSS
WV-21442 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmI CCTCACTCAC CCACTCGCCI SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-21443 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmG CCTCACTCAC CCACTCGCCG SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-21445 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * Sm5mC * SmI CCTCACTCAC CCACTCGCCI SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-21446 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * Sm5mC * SmG CCTCACTCAC CCACTCGCCG SOOOS  SSRSS R SSSSS SSS
WV-21506 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * Sm5mC * SmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS SR SSSSS SS
WV-21507 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmCn001RmG * SmC * SmCn001RmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  RSSSS  nR SS nR
WV-21508 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SmCn001RmG * SmC * SmCn001RmA CCTCACTCAC CCACTCGCCA SOOOS  SSRSS  SRSSS  nR SS nR
WV-21509 mU * Sm5Ceom5CeoTeomC * SA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * SmU * SmC * SmG * SmC * SmC UCCTCACTCAC CCACUCGCC SOOOS S SSRSS R SSSSS SS
WV-21510 mU * Sm5Ceom5CeoTeomC * SA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * SmU * SmC * SmG * SmC * SmC UCCTCACTCAC CCACUCGCC SOOOS S SSRSS SR SSSSS S
WV-21511 mU * Sm5Ceom5CeoTeomC * SA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * SmU * Sm5mC * SmG * SmC * SmC UCCTCACTCAC CCACUCGCC SOOOS S SSRSS R SSSSS SS
WV-21512 mU * Sm5Ceom5CeoTeomC * SA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * SmU * Sm5mC * SmG * SmC * SmC UCCTCACTCAC CCACUCGCC SOOOS S SSRSS SR SSSSS S
WV-21513 mU * Sm5Ceom5CeoTeomC * SA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * SmU * SmCn001RmG * SmC * SmC UCCTCACTCAC CCACUCGCC SOOOS S SSRSS  RSSSS  nR SS
WV-21514 mU * Sm5Ceom5CeoTeomC * SA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * SmU * SmCn001RmG * SmC * SmC UCCTCACTCAC CCACUCGCC SOOOS S SSRSS  SRSSS  nR SS
WV-21515 mC * STeom5CeoAeomC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SC * SmG * SmC * SmC * SmA * SmC CTCACTCACCCAC TCGCCAC SOOOS SRSSR SSSSS SSSS
WV-21516 mC * STeom5CeoAeomC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SC * SmG * SmC * SmC * SmA * SmC CTCACTCACCCAC TCGCCAC SOOOS  SRSSS R SSSSS SSS
WV-21517 mC * STeom5CeoAeomC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5C * SmG * SmC * Sm5mC * SmA * SmC CTCACTCACCCAC TCGCCAC SOOOS SRSSR SSSSS SSSS
WV-21518 mC * STeom5CeoAeomC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SmG * SmC * Sm5mC * SmA * SmC CTCACTCACCCAC TCGCCAC SOOOS  SRSSS R SSSSS SSS
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WV-28080 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SmU * SmG * SmC * SmC CCTCACTCACCCACTUGCC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSS
WV-28081 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * RG * SC * SC * SmA * SmC * Sm5mC * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28082 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * RG * SC * SC * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28083 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * RG * SC * SC * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACUGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28084 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * RG * SC * Sm5C * SmA * SmC * Sm5mC * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28085 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * RG * SC * Sm5C * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28086 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * RG * SC * Sm5C * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACUGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28087 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * SG * RC * SC * SmA * SmC * Sm5mC * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-28088 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * RC * SC * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-28089 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * SG * RC * SC * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACUGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-28090 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5mC * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-28091 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-28092 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACUGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-28303 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * RG * SC * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28304 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * RG * SC * SC * SmA * SmC * Sm5CeomG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSOS
WV-28305 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * RG * SC * Sm5C * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28306 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * RG * SC * Sm5C * SmA * SmC * Sm5CeomG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSOS
WV-28307 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * SG * RC * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-28308 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * ST * SG * RC * SC * SmA * SmC * Sm5CeomG * SmC ACTCACCCACTTGCCACCGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSOS
WV-28464 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmU * SmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCACCCACTUGCCA SOOOS SSRSS   RSSSS  SSSS
WV-28465 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmU * SmG * SmC * Sm5mC * SmA CCTCACTCACCCACTUGCCA SOOOS SSRSS   RSSSS  SSSS
WV-28466 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * SmU * SmA CCTCACTCACCCACTCGCUA SOOOS SSRSS   RSSSS  SSSS
WV-28467 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmU * SmG * SmC * SmU * SmA CCTCACTCACCCACTUGCUA SOOOS SSRSS   RSSSS  SSSS
WV-28478 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmC * Sm5Ceo * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SOOOS SSRSS   RSSSS  SSSS
WV-28479 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmC * SmC CCTCACTCACCCACTCGCC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSS
WV-28480 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5CeomG * SmC * SmC CCTCACTCACCCACTCGCC SOOOS SSRSS   SRSSS  OSS
WV-28481 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SmU * SmG * SmC * SmU * SmG CCTCACTCACCCACTUGCUG SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-28872 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * RC * SA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCACCCACTCGCCA SOOOS SRSSS  RSSSS  SSSS
WV-28873 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * RC * SA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * Sm5mC * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SOOOS SRSSS  RSSSS  SSSS
WV-28874 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * RC * SA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCACCCACTCGCCA SOOOS SRSSS  SRSSS SSSS
WV-28875 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * RC * SA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * Sm5mC * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SOOOS SRSSS  SRSSS SSSS
WV-28876 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * RC * SA * SC * RC * SC * SA * RC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCACCCACTCGCCA SOOOS SRSSR  SSRSS   SSSS
WV-28877 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * RC * SA * SC * RC * SC * SA * RC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * Sm5mC * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SOOOS SRSSR  SSRSS   SSSS
WV-30206 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-30207 mA * Sm5Ceon001RTeon001Rm5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnRnRnRS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-30208 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-30209 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmAn001RmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  nRSSS
WV-30210 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmCn001Rm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  SnRSS
WV-30211 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceon001RmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  SSnRS
WV-30212 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmGn001RmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  SSSnR
WV-30213 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-30214 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmAn001RmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  nRSSS
WV-30215 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmCn001RmU * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  SnRSS
WV-30216 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * SmUn001RmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  SSnRS
WV-30217 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * SmU * SmGn001RmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SnROnRS SSRSS   SSRSS  SSSnR
WV-30218 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmC * Sm5Ceo * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-30219 mC * Sm5Ceon001RTeon001Rm5Ceon001RmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmC * Sm5Ceo * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SnRnRnRS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-30220 mC * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmC * Sm5Ceo * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SnROnRS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-30221 mC * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5Ceon001RmG * SmC * Sm5Ceo * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SnROnRS SSRSS   SRSSS  nRSSS
WV-30222 mC * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5Ceo * SmGn001RmC * Sm5Ceo * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SnROnRS SSRSS   SRSSS  SnRSS
WV-30223 mC * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmCn001Rm5Ceo * SmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SnROnRS SSRSS   SRSSS  SSnRS
WV-30224 mC * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmC * Sm5Ceon001RmG CCTCACTCACCCACTCGCCG SnROnRS SSRSS   SRSSS  SSSnR
WV-30225 m5Ceo * Sm5CeoTeom5CeoAeo * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SmU * SmG * SmC * SmU * SmG CCTCACTCACCCACTUGCUG SOOOS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-30226 mC * SmC * SmU * SmC * SmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * STeoGeom5CeoTeo * SGeo CCUCACTCACCCACTTGCTG SSSSS SSRSS   SRSSS  OOOS
WV-30227 m5Ceo * Sm5CeoTeom5CeoAeo * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * STeoGeom5CeoTeo * SGeo CCTCACTCACCCACTTGCTG SOOOS SSRSS   SRSSS  OOOS
WV-30228 m5Ceo * Sm5Ceon001RTeon001Rm5Ceon001RAeo * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * SmU * SmG * SmC * SmU * SmG CCTCACTCACCCACTUGCUG SnRnRnRS SSRSS   SRSSS  SSSS
WV-30229 mC * SmC * SmU * SmC * SmA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * STeon001RGeon001Rm5Ceon001RTeo * SGeo CCUCACTCACCCACTTGCTG SSSSS SSRSS   SRSSS  nRnRnRS
WV-30230 m5Ceo * Sm5Ceon001RTeon001Rm5Ceon001RAeo * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * STeoGeom5CeoTeo * SGeo CCTCACTCACCCACTTGCTG SnRnRnRS SSRSS   SRSSS  OOOS
WV-30231 m5Ceo * Sm5CeoTeom5CeoAeo * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * STeon001RGeon001Rm5Ceon001RTeo * SGeo CCTCACTCACCCACTTGCTG SOOOS SSRSS   SRSSS  nRnRnRS
WV-30232 mA * Sm5Ceon001RTeon001Rm5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * SmU * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACUGC SnRnRnRS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-30237 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * STeo * SmG * SmC * SmC * SmA CCTCACTCACCCACTTGCCA SOOOS SSRSS   RSSSS  SSSS
WV-30238 mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * STeo * SmG * SmC * SmC CCTCACTCACCCACTTGCC SOOOS SSRSS   SRSSS  SSS
WV-30239 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * RC * SC * SmA * SmC * STeo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACTGC SOOOS SSRSS   SSRSS  SSSS
WV-30277 mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * RC * SA * SC * RT * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SOOOS SRSSR  SSRSS   SSSS
WV-30278 mA * Sm5Ceon001RTeon001Rm5Ceon001RmA * SC * SC * RC * SA * SC * RT * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnRnRnRS SRSSR  SSRSS   SSSS
WV-30279 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * RC * SA * SC * RT * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SRSSR  SSRSS   SSSS
WV-30280 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * RC * SA * SC * RT * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmAn001RmC * Sm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SRSSR  SSRSS   nRSSS
WV-30281 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * RC * SA * SC * RT * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmCn001Rm5Ceo * SmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SRSSR  SSRSS   SnRSS
WV-30282 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * RC * SA * SC * RT * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceon001RmG * SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SRSSR  SSRSS   SSnRS
WV-30283 mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * RC * SA * SC * RT * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmGn001RmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRS SRSSR  SSRSS   SSSnR
WV-34205 mAm5CeoTeom5CeomACCCACTm5CGm5CCmAmCm5CeomGmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SOOOSSSRSSSSRRSSSSS
WV-37246 mIm5Ceon001RTeom5Ceon001RmACCCACTm5CGm5CCmAmCn001Rm5CeomGmC ICTCICCCACTCGCCACCGC SnROnRSSSRSSSSRSSSnRSS
WV-38627 mA*m5CeoTeom5CeomA*C*C*C*A*C*T*m5C*G*m5C*C*mA*mC*m5Ceo*mG*mC ACTCACCCACTCGCCACCGC XOOOXXXXXXXXXXXXXXX
WV-39524 mA*m5Ceon001Teom5Ceon001mA*C*C*C*A*C*T*m5C*G*m5C*C*mA*mC*m5Ceo*mGn001mC ACTCACCCACTCGCCACCGC XnXOnXXXXXXXXXXXXXXXnX
WV-39526 mA*m5Ceon001Teom5Ceon001mA*C*C*C*A*C*T*m5C*G*m5C*C*mA*mC*m5Ceon001mG*mC ACTCACCCACTCGCCACCGC XnXOnXXXXXXXXXXXXXXnXX
WV-39527 mA*Sm5Ceon001Teom5Ceon001mA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceo*SmGn001mC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnXOnXSSSRSSSSRSSSSSnX
WV-39528 mA*Sm5Ceon001Teom5Ceon001mA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceon001mG*SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnXOnXSSSRSSSSRSSSSnXS
WV-39523 mA*Sm5Ceon001STeom5Ceon001SmA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceo*SmGn001SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnSOnSSSSRSSSSRSSSSSnS
WV-39525 mA*Sm5Ceon001STeom5Ceon001SmA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceon001SmG*SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnSOnSSSSRSSSSRSSSSnSS
WV-34452 mA*Sm5Ceon001STeom5Ceon001RmA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceo*SmGn001RmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnSOnRSSSRSSSSRSSSSSnR
WV-34453 mA*Sm5Ceon001RTeom5Ceon001SmA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceo*SmGn001RmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnSSSSRSSSSRSSSSSnR
WV-34466 mA*Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA*SC*SC*SC*RA*SC*ST*Sm5C*SG*Rm5C*SC*SmA*SmC*Sm5Ceo*SmGn001SmC ACTCACCCACTCGCCACCGC SnROnRSSSRSSSSRSSSSSnS
WV-39814 mC*Sm5Ceon001TeoTeon001mC*SC*SC*ST*RG*SA*SA*SG*SG*RT*ST*SmC*SmC*SmU*SmCn001mC CCTTCCCTGAAGGTTCCUCC SnXOnXSSSRSSSSRSSSSSnX
表A1的關鍵點： 本揭露指出，一些序列由於其長度原因而在表A1中分成多行；然而，該等序列以及表A1中的所有寡核苷酸皆係單股的（除非另外指出）。如熟悉該項技術者所理解的，當在兩個核苷單元之間未指定核苷酸間鍵聯時，核苷酸間鍵聯係磷酸二酯鍵聯（天然磷酸酯鍵聯），除非另有說明，否則糖係在其2'位上不包含取代的天然DNA糖（在2'-碳處兩個-H）。各表中所列出的部分和修飾（或用於構建包含該等部分或修飾的寡核苷酸的化合物）： I：肌苷； m：2'-OMe； m5：C的5位處的甲基（核鹼基係5-甲基胞嘧啶）； m5Ceo：5-甲基2'-O-甲氧基乙基C； m5mC：5-甲基2’-OMe C； eo：2'-MOE (2’-OCH2 CH2 OCH3 )； r：2’-OH； O、PO：磷酸二酯（磷酸酯）；可以是鍵聯，例如連接子與寡核苷酸鏈之間的鍵聯、核苷酸間鍵聯等。立體化學/核苷酸間鍵聯一欄中顯示的磷酸二酯可能沒有在描述欄中再現；如果在描述欄中未指出核苷酸間鍵聯，則其係磷酸二酯； *、PS：硫代磷酸酯；可以是鍵聯，例如連接子與寡核苷酸鏈之間的鍵聯、核苷酸間鍵聯等； R、Rp：呈Rp組態的硫代磷酸酯；應注意，*R表示呈Rp組態的單一硫代磷酸酯 S、Sp：呈Sp組態的硫代磷酸酯；應注意，*S表示呈Sp組態的單一硫代磷酸酯 n001：
Figure 02_image007
； nX：立體隨機n001； nR或n001R：呈Rp組態的n001； nS或n001S：呈Sp組態的n001； X：立體隨機硫代磷酸酯；以及 L004：具有結構-NH(CH2 )4 CH(CH2 OH)CH2 -的連接子，其中-NH-（經由-C(O)-）連接至Mod或-H，且-CH2 -連接位點連接至寡核苷酸鏈的3'端處的鍵聯，例如磷酸二酯鍵聯（-O-P(O)(OH)-O-，可以鹽形式存在，可在表中顯示為O或PO）、或硫代磷酸酯鍵聯（-O-P(O)(SH)-O-，可以鹽形式存在，可在表中顯示為*，若硫代磷酸酯非手性受控；顯示為*S、S或Sp，若係手性受控且具有Sp組態；以及顯示為*R、R或Rp，若係手性受控且具有Rp組態）。例如，L004前面未緊接星號表示鍵聯係磷酸二酯鍵聯。例如，在以mAL004結束的WV-18852中，連接子L004（經由-CH2 -位點）連接至3'-末端糖（其係2’-OMe且連接至核鹼基A）處的3'位置處的磷酸二酯鍵聯，且L004連接子經由-NH-連接至-H。
例如，在一些實施方式中，本揭露提供了具有以下結構的寡核苷酸： mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmCn001Rm5Ceo * SmG * SmC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾（例如，mA係2’-OMe A）； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； n001R代表Rp n001鍵聯，其中n001鍵聯具有
Figure 02_image007
的結構； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾（例如，Teo係2’-OCH2 CH2 OCH3 T）； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基（例如，在5mC中，核鹼基係5-甲基胞嘧啶）。
在一些實施方式中，本揭露提供了具有以下結構的寡核苷酸： mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceon001RmG * SmC，或其藥學上可接受的鹽， 其中m、*S、m5Ceo、n001R、eo、*R、m5等獨立地如本文所述。
在一些實施方式中，本揭露提供了具有以下結構的寡核苷酸： mA * Sm5Ceon001RTeom5Ceon001RmA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmGn001RmC，或其藥學上可接受的鹽， 其中m、*S、m5Ceo、n001R、eo、*R、m5等獨立地如本文所述。
在一些實施方式中，本揭露提供了具有以下結構的寡核苷酸： mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5mC * SmG * SmC * Sm5mC * SmG，或其藥學上可接受的鹽， 其中m、*S、m5Ceo、eo、*R、m5等獨立地如本文所述。
在一些實施方式中，本揭露提供了具有以下結構的寡核苷酸： mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5mC * SmG * SmC，或其藥學上可接受的鹽， 其中m、*S、m5Ceo、eo、*R、m5等獨立地如本文所述。
在一些實施方式中，本揭露提供了具有以下結構的寡核苷酸： mC * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * Sm5Ceo * SmG * SmC * Sm5Ceo * SmG，或其藥學上可接受的鹽， 其中m、*S、m5Ceo、eo、*R、m5等獨立地如本文所述。
在一些實施方式中，本揭露提供了具有以下結構的寡核苷酸： mA * Sm5CeoTeom5CeomA * SC * SC * SC * RA * SC * ST * Sm5C * SG * Rm5C * SC * SmA * SmC * Sm5Ceo * SmG * SmC，或其藥學上可接受的鹽， 其中m、*S、m5Ceo、eo、*R、m5等獨立地如本文所述。
手性受控的寡核苷酸及手性受控的寡核苷酸組成物
在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸能夠導引C9orf72靶標基因或其基因產物的表現、水平和/或活性的降低。在一些實施方式中，C9orf72靶標基因包含重複擴增。在一些實施方式中，C9orf72靶標基因包含六核苷酸重複擴增。
尤其是，本揭露提供具有高純度及高非鏡像異構純度的手性受控的C9orf72寡核苷酸及手性受控的C9orf72寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，本揭露提供具有高純度的手性受控的C9orf72寡核苷酸及手性受控的C9orf72寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，本揭露提供具有高非鏡像異構純度的手性受控的C9orf72寡核苷酸及手性受控的C9orf72寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸組成物係某一C9orf72寡核苷酸類型的實質上純製劑，該組成物中並非該寡核苷酸類型的寡核苷酸在所述寡核苷酸類型的製備過程中（在一些情況下在某些純化步驟之後）係雜質形式。
在一些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中該寡核苷酸內的個別核苷酸間鍵聯中的至少兩者相對於彼此具有不同的立體化學和/或不同的P修飾。在某些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中該寡核苷酸內的至少兩個個別核苷酸間鍵聯相對於彼此具有不同的P修飾。在某些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中該寡核苷酸內的個別核苷酸間鍵聯中的至少兩者相對於彼此具有不同的P修飾，且其中手性受控的C9orf72寡核苷酸包含至少一個磷酸二酯核苷酸間鍵聯。在某些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中該寡核苷酸內的個別核苷酸間鍵聯中的至少兩者相對於彼此具有不同的P修飾，且其中手性受控的C9orf72寡核苷酸包含至少一個磷酸二酯核苷酸間鍵聯及至少一個硫代磷酸二酯核苷酸間鍵聯。在某些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中該寡核苷酸內的個別核苷酸間鍵聯中的至少兩者相對於彼此具有不同的P修飾，且其中手性受控的C9orf72寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸三酯核苷酸間鍵聯。在某些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的C9orf72寡核苷酸，其中該寡核苷酸內的個別核苷酸間鍵聯中的至少兩者相對於彼此具有不同的P修飾，且其中手性受控的C9orf72寡核苷酸包含至少一個磷酸二酯核苷酸間鍵聯及至少一個硫代磷酸三酯核苷酸間鍵聯。
在一些實施方式中，所提供的化合物（例如所提供的寡核苷酸）具有60%-100%的純度。在一些實施方式中，純度為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些實施方式中，純度為至少60%。在一些實施方式中，純度為至少70%。在一些實施方式中，純度為至少80%。在一些實施方式中，純度為至少85%。在一些實施方式中，純度為至少90%。在一些實施方式中，純度為至少91%。在一些實施方式中，純度為至少92%。在一些實施方式中，純度為至少93%。在一些實施方式中，純度為至少94%。在一些實施方式中，純度為至少95%。在一些實施方式中，純度為至少96%。在一些實施方式中，純度為至少97%。在一些實施方式中，純度為至少98%。在一些實施方式中，純度為至少99%。在一些實施方式中，純度為至少99.5%。
在一些實施方式中，所提供的化合物（例如所提供的寡核苷酸）具有60%-100%的立體化學純度。在一些實施方式中，所提供的化合物（例如所提供的寡核苷酸）具有60%-100%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些實施方式中，所提供的化合物（例如所提供的寡核苷酸）的手性元件（例如手性中心（碳、磷等））具有60%-100%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，手性元件（例如手性中心（碳、磷等））具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，手性受控的核苷酸間鍵聯的每個鍵聯磷獨立地具有85%-100%（例如90%-100%）或至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物中多個寡核苷酸的手性受控的核苷酸間鍵聯獨立地具有85%-100%（例如90%-100%）或至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。在一些實施方式中，每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少60%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少70%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少80%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少85%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少90%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少91%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少92%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少93%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少94%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少95%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少96%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少97%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少98%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少99%。在一些實施方式中，非鏡像異構純度為至少99.5%。
尤其是，本揭露提供了各種寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，本揭露提供了本文所述之寡核苷酸的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，寡核苷酸組成物（例如C9orf72寡核苷酸組成物）包含多個本揭露中描述的寡核苷酸。在一些實施方式中，寡核苷酸組成物（例如C9orf72寡核苷酸組成物）係手性受控的。在一些實施方式中，寡核苷酸組成物（例如C9orf72寡核苷酸組成物）不是手性受控的（係立體隨機性的）。
天然磷酸酯鍵聯的鍵聯磷係非手性的。許多修飾的核苷酸間鍵聯，例如硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的鍵聯磷係手性的。在一些實施方式中，在寡核苷酸組成物的製備期間（例如，在傳統的亞磷醯胺寡核苷酸合成中），沒有有目的地設計或控制手性鍵聯磷的組態，從而產生非手性受控（立體隨機）的寡核苷酸組成物（基本上係外消旋製劑），其係各種立體異構物的複雜的隨機的混合物（非鏡像異構物）-對於具有n個手性核苷酸間鍵聯（鍵聯磷係手性的）的寡核苷酸，通常是2n 個立體異構物（例如，當n係10時，210 = 1,032；當n為20時，220 = 1,048,576）。該等立體異構物具有相同的構成，但是其鍵聯磷的立體化學模式不同。
在一些實施方式中，本揭露涵蓋用於設計和製備手性受控的寡核苷酸組成物的技術。在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的寡核苷酸組成物，例如表A1中的在其立體化學/鍵聯中含有S和/或R的許多寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物包含受控/預定（不是如非立體隨機組成物中那樣隨機）水平的多個寡核苷酸，其中該寡核苷酸在一個或多個手性核苷酸間鍵聯（手性受控的核苷酸間鍵聯）處共用相同的鍵聯磷立體化學。在一些實施方式中，寡核苷酸共用相同的骨架手性中心模式（鍵聯磷的立體化學）。在一些實施方式中，骨架手性中心模式如本揭露中所述。在一些實施方式中，寡核苷酸共用相同的構成。在一些實施方式中，寡核苷酸係結構相同的。如熟悉該項技術者所理解的，除非另外指出，否則多種形式的寡核苷酸（例如多種鹽形式的寡核苷酸）可以被認為具有相同的構成和/或結構。
在一些實施方式中，寡核苷酸組成物係手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸共用： 1) 共同的鹼基序列； 2) 共同的骨架鍵聯模式；以及 3) 在一個或多個（例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個）手性核苷酸間鍵聯（手性受控的核苷酸間鍵聯）處相同的鍵聯磷立體化學， 其中相對於共用共同的鹼基序列和骨架鍵聯模式的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，該組成物富集該多個寡核苷酸。
在一些實施方式中，寡核苷酸組成物係手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸共用： 1) 共同的鹼基序列； 2) 共同的骨架鍵聯模式；以及 3) 共同的骨架手性中心模式，該模式包含至少一個Sp， 其中相對於共用共同的鹼基序列和骨架鍵聯模式的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，該組成物富集該多個寡核苷酸。
在一些實施方式中，寡核苷酸組成物係手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸共用： 1) 共同的鹼基序列； 2) 共同的骨架鍵聯模式；以及 3) 共同的骨架手性中心模式，該模式包含至少一個Rp， 其中相對於共用共同的鹼基序列和骨架鍵聯模式的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，該組成物富集該多個寡核苷酸。
在一些實施方式中，多個寡核苷酸具有相同的構成。
在一些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸共用： 1) 共同的構成，以及 2) 在一個或多個（例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個）手性核苷酸間鍵聯（手性受控的核苷酸間鍵聯）處相同的鍵聯磷立體化學， 其中相對於具有共同的構成的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，該組成物富集該多個寡核苷酸。
在一些實施方式中，多個寡核苷酸在結構上相同。在一些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸在結構上相同，並且相對於具有與該多個寡核苷酸相同的構成的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，該組成物富集該多個寡核苷酸。
在一些實施方式中，它們獨立地共用相同的立體化學，5-50個或更多個（例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個或更多個）手性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，多個寡核苷酸在每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯處共用相同的立體化學。
在一些實施方式中，相對於基本外消旋製劑的富集係組成物中所有寡核苷酸的至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%係多個寡核苷酸。在一些實施方式中，相對於基本外消旋製劑的富集係組成物中所有共用共同的鹼基序列的寡核苷酸的至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%係多個寡核苷酸。在一些實施方式中，相對於基本外消旋製劑的富集係組成物中所有共用共同的構成的寡核苷酸的至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%係多個寡核苷酸。在一些實施方式中，百分比為至少約10%。在一些實施方式中，百分比為至少約20%。在一些實施方式中，百分比為至少約30%。在一些實施方式中，百分比為至少約40%。在一些實施方式中，百分比為至少約50%。在一些實施方式中，百分比為至少約60%。在一些實施方式中，百分比為至少約70%。在一些實施方式中，百分比為至少約75%。在一些實施方式中，百分比為至少約80%。在一些實施方式中，百分比為至少約85%。在一些實施方式中，百分比為至少約90%。在一些實施方式中，百分比為至少約91%。在一些實施方式中，百分比為至少約92%。在一些實施方式中，百分比為至少約93%。在一些實施方式中，百分比為至少約94%。在一些實施方式中，百分比為至少約95%。在一些實施方式中，百分比為至少約96%。在一些實施方式中，百分比為至少約97%。在一些實施方式中，百分比為至少約98%。在一些實施方式中，百分比為至少約99%。如熟悉該項技術者所理解的，可以適當地認為多種形式的寡核苷酸具有相同的構成和/或結構，並且可以適當地認為共用相同構成的多種形式的寡核苷酸具有相同的構成。
控制手性受控的寡核苷酸組成物中的多個寡核苷酸的水平。相反，在非手性受控的（或立體隨機的、外消旋的）寡核苷酸組成物（或製劑）中，寡核苷酸的水平係隨機的且不受控的。在一些實施方式中，在手性受控的寡核苷酸組成物中，多個寡核苷酸的水平係手性受控的寡核苷酸組成物中所有寡核苷酸的、或手性受控的寡核苷酸組成物中與多個寡核苷酸共用共同的鹼基序列的所有寡核苷酸的、或手性受控的寡核苷酸組成物中與多個寡核苷酸共用共同的鹼基序列以及骨架鍵聯模式的所有寡核苷酸的、或手性受控的寡核苷酸組成物中與多個寡核苷酸共用共同的鹼基序列、骨架鍵聯模式以及骨架磷修飾模式的所有寡核苷酸的、或手性受控的寡核苷酸組成物中與多個寡核苷酸共用相同的構成的所有寡核苷酸的約1%-100%（例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%、或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）。在一些實施方式中，相對於基本上外消旋製劑的富集係本文描述的水平。
在一些實施方式中，百分比水平（例如，受控水平、預定水平、富集）為或至少為(DS)nc ，其中DS係90%-100%，並且nc係如本揭露中所描述的手性受控的核苷酸間鍵聯的數目（例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個）。在一些實施方式中，每個手性核苷酸間鍵聯係手性受控的，並且nc係手性核苷酸間鍵聯的數目。在一些實施方式中，DS係90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%或更大。在一些實施方式中，DS為或至少為90%。在一些實施方式中，DS為或至少為91%。在一些實施方式中，DS為或至少為92%。在一些實施方式中，DS為或至少為93%。在一些實施方式中，DS為或至少為94%。在一些實施方式中，DS為或至少為95%。在一些實施方式中，DS為或至少為96%。在一些實施方式中，DS為或至少為97%。在一些實施方式中，DS為或至少為98%。在一些實施方式中，DS為或至少為99%。在一些實施方式中，水平（例如，受控水平、預定水平、富集）係共用相同的構成的組成物中所有寡核苷酸的百分比，其中該百分比為或至少為(DS)nc 。例如，當DS係99%並且nc係10時，該百分比係或至少係90%（(99%)10 ≈ 0.90 = 90%）。如熟悉該項技術者所理解的，在立體隨機製劑中，百分比通常約為1/2nc - 當nc為10時，百分比約為1/210 ≈ 0.001 = 0.1%。
在一些實施方式中，寡核苷酸組成物係手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸共用： 1) 共同的鹼基序列； 2) 共同的骨架鍵聯模式；以及 3) 在一個或多個（例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個）手性核苷酸間鍵聯（手性受控的核苷酸間鍵聯）處相同的鍵聯磷立體化學， 其中組成物中所有共用共同的鹼基序列以及骨架鍵聯模式的寡核苷酸中的多個寡核苷酸的百分比至少為(DS)nc ，其中DS為90%-100%，並且nc為手性受控的核苷酸間鍵聯的數目。
在一些實施方式中，寡核苷酸組成物係手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸共用： 1) 共同的鹼基序列； 2) 共同的骨架鍵聯模式；以及 3) 共同的骨架手性中心模式，該模式包含至少一個Sp， 其中組成物中所有共用共同的鹼基序列以及骨架鍵聯模式的寡核苷酸中的多個寡核苷酸的百分比至少為(DS)nc ，其中DS為90%-100%，並且nc為手性受控的核苷酸間鍵聯的數目。
在一些實施方式中，寡核苷酸組成物係手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸共用： 1) 共同的鹼基序列； 2) 共同的骨架鍵聯模式；以及 3) 共同的骨架手性中心模式，該模式包含至少一個Rp， 其中組成物中所有共用共同的鹼基序列以及骨架鍵聯模式的寡核苷酸中的多個寡核苷酸的百分比至少為(DS)nc ，其中DS為90%-100%，並且nc為手性受控的核苷酸間鍵聯的數目。
在一些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸具有共同的構成，並且共用在一個或多個（例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個）手性核苷酸間鍵聯（手性受控的核苷酸間鍵聯）處相同的鍵聯磷立體化學，其中組成物中所有具有相同的構成的寡核苷酸中的多個寡核苷酸的百分比至少為(DS)nc ，其中DS為90%-100%，並且nc為手性受控的核苷酸間鍵聯的數目。
在一些實施方式中，多個寡核苷酸具有不同的鹽形式。在一些實施方式中，多個寡核苷酸包含單一寡核苷酸的一種或多種形式，例如多種藥學上可接受的鹽形式。在一些實施方式中，多個寡核苷酸包含兩個或更多個寡核苷酸的一種或多種形式，例如多種藥學上可接受的鹽形式。在一些實施方式中，多個寡核苷酸包含2NCC 個寡核苷酸的一種或多種形式，例如多種藥學上可接受的鹽形式，其中NCC係非手性受控的手性核苷酸間鍵聯的數目。在一些實施方式中，2NCC 個寡核苷酸在組成物內具有相對相似的水平，例如，沒有使用手性受控的寡核苷酸合成來特異性地富集它們。
在一些實施方式中，本揭露提供一種手性受控的寡核苷酸組成物，其包含多個寡核苷酸，其中該等寡核苷酸在結構上相同，並且組成物中所有與多個寡核苷酸具有相同的構成的寡核苷酸中的多個寡核苷酸的百分比至少為(DS)nc ，其中DS為90%-100%，並且nc為手性受控的核苷酸間鍵聯的數目。
在一些實施方式中，可以將組成物中的多個寡核苷酸的水平確定為寡核苷酸中每個手性受控的核苷酸間鍵聯的非鏡像異構純度的乘積。在一些實施方式中，連接寡核苷酸（或核酸）中兩個核苷的核苷酸間鍵聯的非鏡像異構純度由連接相同兩個核苷的二聚體的核苷酸間鍵聯的非鏡像異構純度表示，其中使用可比較的條件（在某些情況下，相同的合成循環條件）製備二聚體（例如，對於寡核苷酸….NxNy….中Nx和Ny之間的鍵聯，二聚體為NxNy）。
在一些實施方式中，所有手性核苷酸間鍵聯皆為手性受控的，並且該組成物係完全手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，不是所有的手性核苷酸間鍵聯皆為手性受控的核苷酸間鍵聯，並且組成物係部分地手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，所有手性核苷酸間鍵聯中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%係手性受控的。在一些實施方式中，所有手性核苷酸間鍵聯中的至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%係手性受控的。在一些實施方式中，每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯係手性受控的。
寡核苷酸可以包含骨架手性中心的各種模式（手性鍵聯磷的立體化學模式）或由其組成。在本揭露中描述了骨架手性中心的某些有用的模式。在一些實施方式中，多個寡核苷酸共用共同的骨架手性中心模式，其係或包含本揭露中描述的模式（例如，如「鍵聯磷立體化學及其模式」中所述，表A1中的手性受控的寡核苷酸的骨架手性中心模式）。
手性受控的寡核苷酸組成物相對於立體隨機的寡核苷酸組成物可以顯示許多優點。尤其是，就寡核苷酸結構而言，手性受控的寡核苷酸組成物比相應的立體隨機的寡核苷酸組成物更均勻。藉由控制立體化學，可以製備和評估各個立體異構物的組成物，從而可以開發具有所需特性和/或活性的立體異構物的手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，與例如相應的立體隨機的寡核苷酸組成物相比，手性受控的寡核苷酸組成物提供了更好的遞送、穩定性、清除率、活性、選擇性和/或毒性譜。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物提供更好的功效、更少的副作用和/或更方便和有效的劑量方案。尤其是，本文所述之骨架手性中心模式可用於提供寡核苷酸靶標（例如，轉錄物，例如mRNA先質，成熟mRNA等；包括控制切割位點，切割位點處的切割速率和/或程度，和/或總切割速率和程度等）的受控切割，並大大提高了靶標選擇性。在一些實施方式中，包含某些骨架手性中心模式的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸組成物可以在非常少的位置（在一些實施方式中，在單個位置（例如，在SNP位點、點突變位點等））區分具有核鹼基差異的序列。
如熟悉該項技術者所理解的，立體隨機或（基本上）外消旋製劑/非手性受控的寡核苷酸組成物通常在沒有手性受控的情況下（例如，不使用可以在寡核苷酸合成期間在鍵聯磷處提供高立體選擇性（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%或更高；在一些實施方式中，95%、96%、97%、98%、99%或99.5%或更高；在一些實施方式中，97%、98%、99%或99.5%或更高；在一些實施方式中，98%、99%或99.5%或更高）的手性助劑、手性修飾試劑、和/或手性催化劑）進行製備。在一些實施方式中，在基本上外消旋（或手性不受控制的）的寡核苷酸製劑中，偶聯步驟不是手性受控的，因為偶聯步驟沒有特異性地進行以提供增強的立體選擇性。寡核苷酸/非手性受控的寡核苷酸組成物的基本上外消旋製劑的實例係硫代磷酸酯寡核苷酸的製劑，藉由傳統的亞磷醯胺寡核苷酸合成和用非手性硫化試劑（例如二硫代四乙基秋蘭姆或（TETD），3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物（BDTD）等）硫化（本領域熟知之方法）。製備立體隨機寡核苷酸組成物/寡核苷酸的基本上外消旋製劑的多種方法係本領域眾所周知的和實踐的，並且可用於製備此類組成物和本揭露的製劑。
在例如實例中顯示某些數據，該數據顯示手性受控的寡核苷酸組成物，例如手性受控的C9orf72寡核苷酸組成物在降低C9orf72靶標基因或其基因產物的水平、活性和/或表現方面的特性和/或活性。
在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的寡核苷酸組成物，例如手性受控的C9orf72寡核苷酸組成物，其中至少一個手性受控的核苷酸間鍵聯的鍵聯磷係Sp。在一些實施方式中，本揭露提供了手性受控的寡核苷酸組成物，例如手性受控的C9orf72寡核苷酸組成物，其中手性受控的核苷酸間鍵聯的大部分鍵聯磷係Sp。在一些實施方式中，寡核苷酸或其一部分（例如5’-翼、3’-翼、核心等）的所有手性受控的核苷酸間鍵聯（或所有手性核苷酸間鍵聯、或所有核苷酸間鍵聯）的約50%-100%、55%-100%、60%-100%、65%-100%、70%-100%、75%-100%、80%-100%、85%-100%、90%-100%、55%-95%、60%-95%、65%-95%、或約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更高係Sp。在一些實施方式中，寡核苷酸或其一部分（例如5’-翼、3’-翼、核心等）的所有手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的約50%-100%、55%-100%、60%-100%、65%-100%、70%-100%、75%-100%、80%-100%、85%-100%、90%-100%、55%-95%、60%-95%、65%-95%、或約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更高係Sp。在一些實施方式中，百分比為60%或更高。在一些實施方式中，百分比為67%或更高。在一些實施方式中，百分比為70%或更高。在一些實施方式中，百分比為75%或更高。在一些實施方式中，百分比為80%或更高。在一些實施方式中，百分比為85%或更高。在一些實施方式中，百分比為90%或更高。在一些實施方式中，百分比為95%或更高。在一些實施方式中，寡核苷酸或其一部分（例如5’-翼、3’-翼、核心等）包含一個或多個Rp手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸或其一部分（例如5’-翼、3’-翼、核心等）包含一個或多個Rp手性受控的不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯，如n001）。在一些實施方式中，寡核苷酸或其一部分（例如5’-翼、3’-翼、核心等）包含一個或多個Rp手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，核心包含一個或多個Rp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，例如以本文所述之包含RpSpSp的骨架手性中心模式。
骨架手性中心的立體化學和模式
與天然磷酸酯鍵聯相反，手性修飾的核苷酸間鍵聯的例如硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的鍵聯磷係手性的。尤其是，本揭露提供了包括控制手性核苷酸間鍵聯中的手性鍵聯磷的立體化學的技術（例如，寡核苷酸、組成物、方法等）。在一些實施方式中，如本文所示，對立體化學的控制可以提供改善的特性和/或活性，包括所需的穩定性、降低的毒性、改善的靶標核酸還原等。在一些實施方式中，本揭露提供了對於寡核苷酸和/或其區域有用的骨架手性中心模式，該模式係手性鍵聯磷的每個手性鍵聯磷（Rp或Sp）的立體化學的組合，每個非手性鍵聯磷（Op，如有）等從5’到3’指示。在一些實施方式中，當在切割系統（例如，體外測定、細胞、組織、器官、生物體、受試者等）中與所提供的寡核苷酸或其組成物接觸時，骨架手性中心模式可以控制靶標核酸的切割模式。在一些實施方式中，當在切割系統中與所提供的寡核苷酸或其組成物接觸時，骨架手性中心模式改善了靶標核酸的裂解效率和/或選擇性。
在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）或其區域（例如核心）的骨架手性中心模式包含或係(Sp)m(Rp/Op)n、(Rp/Op)n(Sp)m、(Sp)m(Rp)n、(Rp)n(Sp)m、(Np)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y、[(Rp/Op)n(Sp)m]y(Np)t、(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y、[(Rp)n(Sp)m]y(Np)t、[(Op)n(Sp)m]y(Rp)k、[(Op)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Op)n(Sp)m]y(Rp)k、[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k、[(Rp)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y或(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y(Rp)k，其中每個Np獨立地是Sp或Rp，並且m、n、t、y和k各自獨立地是1-50。在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）或其區域（例如核心）的骨架手性中心模式包含或係Rp(Sp)m。在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）或其區域（例如核心）的骨架手性中心模式包含或係(Sp)tRp(Sp)m。在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）或其區域（例如核心）的骨架手性中心模式包含或係[Rp(Sp)m]y。在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）或其區域（例如核心）的骨架手性中心模式包含或係(Np)t[Rp(Sp)m]y。在一些實施方式中，寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）或其區域（例如核心）的骨架手性中心模式包含或係(Sp)t[Rp(Sp)m]y。在一些實施方式中，至少一個n係1。在一些實施方式中，每個n係1。在一些實施方式中，至少一個m係2或更大。在一些實施方式中，每個m獨立地是2或更大。在一些實施方式中，y係1。在一些實施方式中，y係2。在一些實施方式中，y係3。在一些實施方式中，t係1。在一些實施方式中，t係2或更大。在一些實施方式中，t係2或更大。在一些實施方式中，y係4或更大。在一些實施方式中，至少一個Rp/Op係Rp。在一些實施方式中，Np、Rp、Sp各自獨立地具有硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，Op代表天然磷酸酯鍵聯。
在一些實施方式中，m係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些實施方式中，在骨架手性中心模式中，每個m獨立地是2或更大。在一些實施方式中，每個m獨立地是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方式中，每個m獨立地是2-3、2-5、2-6或2-10。在一些實施方式中，m係2。在一些實施方式中，m係3。在一些實施方式中，m係4。在一些實施方式中，m係5。在一些實施方式中，m係6。在一些實施方式中，m係7。在一些實施方式中，m係8。在一些實施方式中，m係9。在一些實施方式中，m係10。在一些實施方式中，在存在兩個或更多個m的情況下，它們可以相同或不同，並且它們各自獨立地如本揭露中所描述。
在一些實施方式中，y係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些實施方式中，y係1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些實施方式中，y係1。在一些實施方式中，y係2。在一些實施方式中，y係3。在一些實施方式中，y係4。在一些實施方式中，y係5。在一些實施方式中，y係6。在一些實施方式中，y係7。在一些實施方式中，y係8。在一些實施方式中，y係9。在一些實施方式中，y係10。
在一些實施方式中，t係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些實施方式中，每個t獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方式中，t係2或更大。在一些實施方式中，t係3或更大。在一些實施方式中，t係4或更大。在一些實施方式中，t係1。在一些實施方式中，t係2。在一些實施方式中，t係3。在一些實施方式中，t係4。在一些實施方式中，t係5。在一些實施方式中，t係6。在一些實施方式中，t係7。在一些實施方式中，t係8。在一些實施方式中，t係9。在一些實施方式中，t係10。在一些實施方式中，在存在兩個或更多個t的情況下，它們可以相同或不同，並且它們各自獨立地如本揭露中所描述。
在一些實施方式中，n係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些實施方式中，n係1。在一些實施方式中，n係2。在一些實施方式中，n係3。在一些實施方式中，n係4。在一些實施方式中，n係5。在一些實施方式中，n係6。在一些實施方式中，n係7。在一些實施方式中，n係8。在一些實施方式中，n係9。在一些實施方式中，n係10。在一些實施方式中，在存在兩個或更多個n的情況下，它們可以相同或不同，並且它們各自獨立地如本揭露中所描述。在很多實施方式中，在骨架手性中心模式中，n的至少一次出現係1；在一些情況下，每個n係1。
在一些實施方式中，k係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些實施方式中，k係1。在一些實施方式中，k係2。在一些實施方式中，k係3。在一些實施方式中，k係4。在一些實施方式中，k係5。在一些實施方式中，k係6。在一些實施方式中，k係7。在一些實施方式中，k係8。在一些實施方式中，k係9。在一些實施方式中，k係10。
在一些實施方式中，至少一個n係1，且至少一個m不小於2。在一些實施方式中，至少一個n係1，至少一個t不小於2，且至少一個m不小於3。在一些實施方式中，每個n係1。在一些實施方式中，t係1。在一些實施方式中，至少一個t ＞ 1。在一些實施方式中，至少一個t ＞ 2。在一些實施方式中，至少一個t ＞ 3。在一些實施方式中，至少一個t ＞ 4。在一些實施方式中，至少一個m ＞ 1。在一些實施方式中，至少一個m ＞ 2。在一些實施方式中，至少一個m ＞ 3。在一些實施方式中，至少一個m ＞ 4。在一些實施方式中，骨架手性中心模式包含一個或多個非手性天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，m、t和n的總和（或在一種模式中無t時，m和n的總和）不小於5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施方式中，該總和為5。在一些實施方式中，該總和為6。在一些實施方式中，該總和為7。在一些實施方式中，該總和為8。在一些實施方式中，該總和為9。在一些實施方式中，該總和為10。在一些實施方式中，該總和為11。在一些實施方式中，該總和為12。在一些實施方式中，該總和為13。在一些實施方式中，該總和為14。在一些實施方式中，該總和為15。
在一些實施方式中，在手性受控的核苷酸間鍵聯中的許多鍵聯磷係Sp。在一些實施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的手性受控的核苷酸間鍵聯具有Sp鍵聯磷。在一些實施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯具有Sp鍵聯磷。在一些實施方式中，所有手性核苷酸間鍵聯中的至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所有手性核苷酸間鍵聯中的至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%係具有Sp鍵聯磷的手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所有核苷酸間鍵聯中的至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，百分比為至少20%。在一些實施方式中，百分比為至少30%。在一些實施方式中，百分比為至少40%。在一些實施方式中，百分比為至少50%。在一些實施方式中，百分比為至少60%。在一些實施方式中，百分比為至少65%。在一些實施方式中，百分比為至少70%。在一些實施方式中，百分比為至少75%。在一些實施方式中，百分比為至少80%。在一些實施方式中，百分比為至少90%。在一些實施方式中，百分比為至少95%。在一些實施方式中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少5個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少6個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少7個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少8個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少9個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少10個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少11個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少12個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少13個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少14個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少15個核苷酸間鍵聯係具有Sp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸間鍵聯係具有Rp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸間鍵聯係具有Rp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸中的一個且不超過一個核苷酸間鍵聯係具有Rp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸中的2個且不超過2個核苷酸間鍵聯係具有Rp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸中的3個且不超過3個核苷酸間鍵聯係具有Rp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸中的4個且不超過4個核苷酸間鍵聯係具有Rp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸中的5個且不超過5個核苷酸間鍵聯係具有Rp鍵聯磷的手性受控的核苷酸間鍵聯。
在一些實施方式中，寡核苷酸中所有、基本上所有或大部分核苷酸間鍵聯呈Sp組態（例如，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中、或所有手性核苷酸間鍵聯中、或所有核苷酸間鍵聯中約50%-100%、55%-100%、60%-100%、65%-100%、70%-100%、75%-100%、80%-100%、85%-100%、90%-100%、55%-95%、60%-95%、65%-95%、或約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多），除了一個或少數核苷酸間鍵聯（例如，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中、或所有手性核苷酸間鍵聯中、或所有核苷酸間鍵聯中1、2、3、4或5個、和/或少於50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%）呈Rp組態。在一些實施方式中，核心中所有、基本上所有或大部分核苷酸間鍵聯呈Sp組態（例如，核心中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中、或所有手性核苷酸間鍵聯中、或所有核苷酸間鍵聯中約50%-100%、55%-100%、60%-100%、65%-100%、70%-100%、75%-100%、80%-100%、85%-100%、90%-100%、55%-95%、60%-95%、65%-95%、或約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多），除了一個或少數核苷酸間鍵聯（例如，核心中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中、或所有手性核苷酸間鍵聯中、或所有核苷酸間鍵聯中1、2、3、4或5個、和/或少於50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%）呈Rp組態。在一些實施方式中，核心中所有、基本上所有或大部分核苷酸間鍵聯係呈Sp組態的硫代磷酸酯（例如，核心中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中、或所有手性核苷酸間鍵聯中、或所有核苷酸間鍵聯中約50%-100%、55%-100%、60%-100%、65%-100%、70%-100%、75%-100%、80%-100%、85%-100%、90%-100%、55%-95%、60%-95%、65%-95%、或約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多），除了一個或少數核苷酸間鍵聯（例如，核心中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中、或所有手性核苷酸間鍵聯中、或所有核苷酸間鍵聯中1、2、3、4或5個、和/或少於50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%）係呈Rp組態的硫代磷酸酯。在一些實施方式中，核心中每個核苷酸間鍵聯係呈Sp組態的硫代磷酸酯，除了一個係呈Rp組態的硫代磷酸酯。在一些實施方式中，核心中每個核苷酸間鍵聯係呈Sp組態的硫代磷酸酯，除了一個係呈Rp組態的硫代磷酸酯。
在一些實施方式中，寡核苷酸包含一個或多個Rp核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一個且不超過一個Rp核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含兩個或更多個Rp核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含三個或更多個Rp核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含四個或更多個Rp核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含五個或更多個Rp核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中約5%-50%係Rp。在一些實施方式中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中約5%-40%係Rp。在一些實施方式中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中約10%-40%係Rp。在一些實施方式中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中約15%-40%係Rp。在一些實施方式中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中約20%-40%係Rp。在一些實施方式中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中約25%-40%係Rp。在一些實施方式中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中約30%-40%係Rp。在一些實施方式中，寡核苷酸中所有手性受控的核苷酸間鍵聯中約35%-40%係Rp。
在一些實施方式中，鹼基序列包含或係與靶標核酸中的特徵序列元件互補的序列，該特徵序列元件可以區分靶標核酸（例如，來自特定等位基因的轉錄物或來自核酸的轉錄物的類型（例如，圖1中的V3），其通常與病症、障礙或疾病相關）與其他核酸（例如，來自不同等位基因的轉錄物或來自核酸的不同類型的轉錄物（例如，圖1中的V2），其通常與病症、障礙或疾病不相關或較低相關）。在一些實施方式中，共同的鹼基序列包含與特徵序列元件互補的序列。在一些實施方式中，共同的鹼基序列係與特徵序列元件互補的序列。在一些實施方式中，共同的鹼基序列包含或係與特徵序列元件100%互補的序列。在一些實施方式中，共同的鹼基序列包含與特徵序列元件100%互補的序列。在一些實施方式中，共同的鹼基序列係與特徵序列元件100%互補的序列。在一些實施方式中，Rp核苷酸間鍵聯（例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯）相對於特徵序列元件位於+5、+4、+3、+2、+1、-1、-2、-3、-4或-5位置。在一些實施方式中，這樣的Rp具有骨架手性中心模式的RpSpSp模體（例如，包含或由(Rp)n(Sp)m、(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y、(Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y、Rp(Sp)m、(Sp)tRp(Sp)m、[Rp(Sp)m]y、(Np)t[Rp(Sp)m]y或(Sp)t[Rp(Sp)m]y組成的那些，如本文所述）。除非另有說明，否則對於Rp核苷酸間鍵聯定位，「-」係從與特徵序列元件互補的序列的5'端的核苷朝向寡核苷酸的5'端計數，其中在-1位置的核苷酸間鍵聯係與同特徵序列元件互補的序列的5'端上的核苷的5'碳鍵合的核苷酸間鍵聯，並且「+」係從與特徵序列元件互補的序列的3'端的核苷朝向寡核苷酸的3'端計數，其中在+1位置的核苷酸間鍵聯係與同特徵序列元件互補的序列的3'端上的核苷的3'碳鍵合的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，特徵序列元件包含單個區分性位置（例如，點突變）。在一些實施方式中，特徵序列元件係點突變或SNP。如熟悉該項技術者所理解的，當特徵序列元件僅含有一個核苷時，與特徵序列元件互補的序列的5'端的核苷和與特徵序列元素互補的序列的3'端的核苷相同。在一些實施方式中，Rp在-5處。在一些實施方式中，Rp在-4處。在一些實施方式中，Rp在-3處。在一些實施方式中，Rp在-2處。在一些實施方式中，Rp在-1處。在一些實施方式中，Rp在+1處。在一些實施方式中，Rp在+2處。在一些實施方式中，Rp在+3處。在一些實施方式中，Rp在+4處。在一些實施方式中，Rp在+5處。在一些實施方式中，這樣的Rp係手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的組態。在一些實施方式中，這樣的Rp在核心區域中。
在一些實施方式中，Sp組態的核苷酸間鍵聯（具有Sp鍵聯磷）係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，非手性核苷酸間鍵聯係天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，Rp組態的核苷酸間鍵聯（具有Rp鍵聯磷）係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，Sp組態的每個核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，每個非手性核苷酸間鍵聯係天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，Rp組態的每個核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，Sp組態的每個核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，每個非手性核苷酸間鍵聯係天然磷酸酯鍵聯，並且Rp組態的每個核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，Rp組態的核苷酸間鍵聯係不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯（如n001））。在一些實施方式中，每個手性受控的不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯（如n001））係Rp。在一些實施方式中，每個n001係Rp。
在一些實施方式中，例如，當描述核心核苷酸間鍵聯的類型、修飾、數量和/或模式時，鍵合於翼核苷和核心核苷的核苷酸間鍵聯被認為係核心核苷酸間鍵聯之一。在一些實施方式中，例如，當描述核心核苷酸間鍵聯的類型、修飾、數量和/或模式時，鍵合至翼核苷和核心核苷的每個核苷酸間鍵聯被認為係核心核苷酸間鍵聯之一。在一些實施方式中，核心核苷酸間鍵聯鍵合至兩個核心核苷。在一些實施方式中，核心核苷酸間鍵聯鍵合至核心核苷和翼核苷。在一些實施方式中，每個核心核苷酸間鍵聯獨立地鍵合至兩個核心核苷、或者核心核苷和翼核苷。在一些實施方式中，每個翼核苷酸間鍵聯獨立地鍵合至兩個翼核苷。
在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸組成物中所提供的寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）各自包含不同類型的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少一個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少兩個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少三個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少四個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少五個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，每個經修飾的核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵聯係不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯係中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯係n001。在一些實施方式中，每個經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是硫代磷酸酯或中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，每個經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是硫代磷酸酯或n001。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
在一些實施方式中，經修飾的鍵聯包含手性助劑，其例如用於控制反應（例如在寡核苷酸合成循環中的偶聯反應）的立體選擇性。
核苷酸間鍵聯
在一些實施方式中，寡核苷酸包含鹼基修飾、糖修飾和/或核苷酸間鍵聯修飾。根據本揭露，可以利用各種核苷酸間鍵聯來連接包含核鹼基，例如核苷的單元。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸包含一個或多個修飾的核苷酸間鍵和一個或多個天然磷酸酯鍵兩者。如熟悉該項技術者所公知的，天然磷酸酯鍵聯廣泛存在於天然DNA和RNA分子中；它們具有-OP(O)(OH)O-的結構，連接DNA和RNA的核苷中的糖，並且可呈各種鹽形式，例如在生理pH值（約7.4）下，天然磷酸酯鍵聯主要是以具有-OP(O)(O- )O-陰離子的鹽形式存在。修飾的核苷酸間鍵聯或非天然磷酸酯鍵聯係不為天然磷酸酯鍵聯或其鹽形式的核苷酸間鍵聯。取決於它們的結構，修飾的核苷酸間鍵聯也可以呈它們的鹽形式。例如，如熟悉該項技術者所理解的，具有-OP(O)(SH)O-結構的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯可以處於各種鹽形式，例如在生理pH下（約7.4），具有-OP(O)(S- )O-陰離子。
在一些實施方式中，寡核苷酸包含核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯係修飾的核苷酸間鍵聯，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、硫代磷酸鹽、3’-硫代磷酸鹽或5’-硫代磷酸鹽。
在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵聯係包含手性鍵聯磷的手性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，手性核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，手性核苷酸間鍵聯係不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，手性核苷酸間鍵聯係中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，手性核苷酸間鍵聯就其手性鍵聯磷而言係手性受控的。在一些實施方式中，手性核苷酸間鍵聯就其手性鍵聯磷而言係立體化學純的。在一些實施方式中，手性核苷酸間鍵不是手性受控的。在一些實施方式中，骨架手性中心模式包含以下或由以下組成：手性受控的核苷酸間鍵聯（Rp或Sp）的位置和鍵聯磷組態以及非手性核苷酸間鍵聯（例如天然磷酸酯鍵聯）的位置。
在一些實施方式中，寡核苷酸包含如在以下中描述的經修飾的核苷酸間鍵聯（例如，具有式I、I-a、I-b、或I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的結構的經修飾的核苷酸間鍵聯，或其鹽形式）：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612、和/或WO 2020/191252，其各自的核苷酸間鍵聯（例如，具有式I、I-a、I-b、或I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的那些）藉由引用獨立地併入本文。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵聯係不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係帶正電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，本揭露提供了包含一個或多個中性核苷酸間鍵聯的寡核苷酸。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯或中性核苷酸間鍵聯（例如，具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等中的一個）如在以下中描述：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612、和/或WO 2020/191252。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯或中性核苷酸間鍵聯具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等中一個，如在以下中描述：WO 2018/223056、WO 2019/032607、WO 2019/075357、WO 2019/032607、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的此類核苷酸間鍵聯藉由引用獨立地併入本文。
在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯可以改善寡核苷酸的遞送和/或活性（例如，降低靶標基因或其基因產物的水平、活性和/或表現的能力、選擇性等）。
在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯具有-OP(=W)(-N=C(R”)2 )-O-或-OP(=W)(-N(R”)2 )-O-的結構，其中： W係O或S； 每個R”獨立地是R’或-N(R’)2 ； 每個R'獨立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2 R； 每個R獨立地是-H，或選自以下的視需要經取代的基團：C1-30 脂肪族、具有1-10個雜原子的C1-30 雜脂肪族、C6-30 芳基、C6-30 芳基脂肪族、具有1-10個雜原子的C6-30 芳基雜脂肪族、具有1-10個雜原子的5-30員雜芳基、以及具有1-10個雜原子的3-30員雜環基，或： 兩個R基團視需要且獨立地一起形成共價鍵，或 同一原子上的兩個或更多個R基團視需要且獨立地與該原子一起形成除該原子外具有0-10個雜原子的視需要經取代的3-30員單環、雙環或多環，或： 兩個或更多個原子上的兩個或更多個R基團視需要且獨立地與其插入原子一起形成除該插入原子外具有0-10個雜原子的視需要經取代的3員至30員單環、雙環或多環。
在一些實施方式中，W係O。在一些實施方式中，W係S。
在一些實施方式中，R”係R’。在一些實施方式中，R”係-N(R’)2 。
在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯具有-OP(=O)(-N=C(N(R’)2 )2 -O-的結構。在一些實施方式中，一個N(R’)2 的R'基團係R，另一個N(R’)2 的R'基團係R，並且兩個R基團與居於它們之間的原子一起形成視需要經取代的環，例如n001中的5員環。在一些實施方式中，每個R’獨立地是R，其中每個R獨立地是視需要經取代的C1-6 脂肪族。
在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯具有-OP(=W)(-N(R’)2 )-O-的結構。
在一些實施方式中，R’係R。在一些實施方式中，R’係H。在一些實施方式中，R’係-C(O)R。在一些實施方式中，R’係-C(O)OR。在一些實施方式中，R’係-S(O)2 R。
在一些實施方式中，R”係 -NHR’。在一些實施方式中，-N(R’)2 係-NHR’。
如本文所述，一些實施方式，R係H。在一些實施方式中，R係視需要經取代的C1-6 脂肪族。在一些實施方式中，R係視需要經取代的C1-6 烷基。在一些實施方式中，R係甲基。在一些實施方式中，R係取代的甲基。在一些實施方式中，R係乙基。在一些實施方式中，R係取代的乙基。
在一些實施方式中，如本文所述，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係中性核苷酸間鍵聯。
在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵聯（例如，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯）包含視需要經取代的三唑基。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵聯（例如，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯）包含視需要經取代的炔基。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵聯包含三唑或炔烴部分。在一些實施方式中，三唑部分（例如三唑基基團）係視需要經取代的。在一些實施方式中，三唑部分（例如三唑基基團）係經取代的。在一些實施方式中，三唑部分係未經取代的。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵包含視需要經取代的環狀胍部分。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵包含視需要經取代的環狀胍部分，並且具有以下結構：
Figure 02_image010
、
Figure 02_image012
、或
Figure 02_image014
，其中W係O或S。在一些實施方式中，W係O。在一些實施方式中，W係S。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係立體化學控制的。
在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯，例如不帶負電荷的核苷酸間鍵聯、中性核苷酸間鍵聯，包含環狀胍部分。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯包含具有結構
Figure 02_image016
的環狀胍部分。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯或中性核苷酸間鍵聯係或包含
Figure 02_image018
的結構，其中W係O或S。
在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯包含Tmg基團（
Figure 02_image020
）。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯包含Tmg基團並具有
Figure 02_image022
的結構（「Tmg核苷酸間鍵聯」）。在一些實施方式中，中性核苷酸間鍵聯包括PNA和PMO的核苷酸間鍵聯以及Tmg核苷酸間鍵聯。
在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-10個雜原子的視需要經取代的3-20員雜環基或雜芳基基團。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-10個雜原子的視需要經取代的3-20員雜環基或雜芳基基團，其中至少一個雜原子係氮。在一些實施方式中，此類雜環基或雜芳基基團具有5員環。在一些實施方式中，此類雜環基或雜芳基基團具有6員環。
在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-10個雜原子的視需要經取代的5-20員雜芳基基團。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-10個雜原子的視需要經取代的5-20員雜芳基基團，其中至少一個雜原子係氮。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-4個雜原子的視需要經取代的5-6員雜芳基基團，其中至少一個雜原子係氮。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-4個雜原子的視需要經取代的5員雜芳基基團，其中至少一個雜原子係氮。在一些實施方式中，雜芳基基團直接與鍵聯磷鍵合。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-10個雜原子的視需要經取代的5-20員雜環基基團。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-10個雜原子的視需要經取代的5-20員雜環基基團，其中至少一個雜原子係氮。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-4個雜原子的視需要經取代的5-6員雜環基基團，其中至少一個雜原子係氮。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含具有1-4個雜原子的視需要經取代的5員雜環基基團，其中至少一個雜原子係氮。在一些實施方式中，至少兩個雜原子係氮。在一些實施方式中，雜環基基團直接與鍵聯磷鍵合。在一些實施方式中，當雜環基基團係經由其=N-直接與鍵聯磷鍵合的胍部分的一部分時，該雜環基基團經由連接子（例如=N-）與鍵聯磷鍵合。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含視需要經取代的
Figure 02_image024
基團。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含經取代的
Figure 02_image024
基團。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含
Figure 02_image026
基團。在一些實施方式中，每個R1 獨立地是視需要經取代的C1-6 烷基。在一些實施方式中，每個R1 獨立地是甲基。
在一些實施方式中，寡核苷酸包含不同類型的核苷酸間磷鍵聯。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少一個經修飾的（非天然）核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少一個硫代磷酸酯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少一個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和至少一個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯、至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少一個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一個或多個（例如1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個）不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係不帶負電的，因為在給定pH下在水溶液中，少於50%、40%、40%、30%、20%、10%、5%或1%的核苷酸間鍵聯以帶負電的鹽形式存在。在一些實施方式中，pH為約pH 7.4。在一些實施方式中，pH為約4-9。在一些實施方式中，百分比小於10%。在一些實施方式中，百分比小於5%。在一些實施方式中，百分比小於1%。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯係不帶負電荷的核苷酸間鍵聯，因為核苷酸間鍵聯的中性形式於水中不具有不超過約1、2、3、4、5、6或7的pKa。在一些實施方式中，沒有pKa為7或更小。在一些實施方式中，沒有pKa為6或更小。在一些實施方式中，沒有pKa為5或更小。在一些實施方式中，沒有pKa為4或更小。在一些實施方式中，沒有pKa為3或更小。在一些實施方式中，沒有pKa為2或更小。在一些實施方式中，沒有pKa為1或更小。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯的中性形式的pKa可表示為具有結構CH3 -核苷酸間鍵聯-CH3 的化合物的中性形式的pKa。例如，
Figure 02_image028
的pKa可以由pKa
Figure 02_image030
表示。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係帶正電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含胍部分。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含雜芳基鹼基部分。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含三唑部分。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯包含炔基部分。
在一些實施方式中，寡核苷酸包含不同類型的核苷酸間磷鍵聯。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少一個經修飾的（非天然）核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少一個硫代磷酸酯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個天然磷酸酯鍵聯和至少一個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。
不希望受任何特定理論的束縛，本揭露指出，中性核苷酸間鍵聯可以比硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯（PS）更具疏水性，該硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯可以比天然磷酸酯鍵聯（PO）更具疏水性。通常，不同於PS或PO，中性核苷酸間鍵聯攜帶更少電荷。不希望受任何特定理論的束縛，本揭露指出，將一個或多個中性核苷酸間鍵聯摻入寡核苷酸中可以增加寡核苷酸被細胞攝取和/或寡核苷酸逸出內體的能力。不希望受任何特定理論的束縛，本揭露指出，摻入一個或多個中性核苷酸間鍵聯可用於調節在寡核苷酸與其靶標核酸之間形成的雙鏈體的解鏈溫度。
不希望受任何特定理論的束縛，本揭露指出，將一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如中性核苷酸間鍵聯）摻入寡核苷酸中能夠增加寡核苷酸介導例如基因敲低的功能的能力。在一些實施方式中，能夠介導核酸或由其編碼的產物的水平的敲低的寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）包含一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，能夠介導靶標基因的表現敲低的寡核苷酸（例如C9orf72寡核苷酸）包含一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。
在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯）不是手性受控的。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係手性受控的。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係手性受控的且其鍵聯磷為Rp。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係手性受控的且其鍵聯磷為Sp。
在許多實施方式中，如廣泛證明的，本揭露的寡核苷酸包含兩個或更多個不同的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯、不帶負電荷的核苷酸間鍵聯、和天然磷酸酯鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係中性核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係n001。在一些實施方式中，每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地是手性受控的。在一些實施方式中，每個手性經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是手性受控的。
在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，中性核苷酸間鍵聯）不是手性受控的。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係手性受控的。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係手性受控的且其鍵聯磷為Rp。在一些實施方式中，不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係手性受控的且其鍵聯磷為Sp。
如天然DNA和RNA中的典型連接係核苷酸間鍵聯與兩個糖（其可以是未修飾的或如本文所述之修飾的）形成鍵。在許多實施方式中，如本文所例舉的，核苷酸間鍵聯藉由其氧原子或雜原子與在其5'碳處的一個視需要修飾的核糖或去氧核糖和在其3'碳處的另一個視需要修飾的核糖或去氧核糖形成鍵。在一些實施方式中，藉由核苷酸間鍵聯連接的每個核苷單元獨立地包含核鹼基，該核鹼基獨立地是視需要經取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的視需要經取代的互變異構物。
如熟悉該項技術者所理解的，根據本揭露，可以利用許多其他類型的核苷酸間鍵聯，例如，在以下中描述的那些：美國專利號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,177,195；5,023,243；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,188,897；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,423；5,264,564；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,938；5,405,939；5,434,257；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,466,677；5,470,967；5,476,925；5,489,677；5,519,126；5,536,821；5,541,307；5,541,316；5,550,111；5,561,225；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,625,050；5,633,360；5,64,562；5,663,312；5,677,437；5,677,439；6,160,109；6,239,265；6,028,188；6,124,445；6,169,170；6,172,209；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；或RE39464。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯描述於以下中：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的核鹼基、糖、核苷酸間鍵聯，手性助劑/試劑以及寡核苷酸合成技術（試劑、條件、循環等）藉由引用獨立地併入本文。
各種類型的核苷酸間鍵聯可以與其他結構元件例如糖組合使用，以實現所需的寡核苷酸特性和/或活性。例如，本發明在設計寡核苷酸時通常利用修飾的核苷酸間鍵聯和修飾的糖，視需要具有天然磷酸酯鍵和天然糖。在一些實施方式中，本揭露提供了包含一個或多個修飾的糖的寡核苷酸。在一些實施方式中，本揭露提供了包含一個或多個修飾的糖和一個或多個修飾的核苷酸間鍵聯的寡核苷酸，其中一個或多個係天然磷酸酯鍵聯。 核鹼基
根據本揭露，各種核鹼基可用於所提供的寡核苷酸中。在一些實施方式中，核鹼基係天然核鹼基，最常見的是A、T、C、G和U。在一些實施方式中，核鹼基係修飾的核鹼基，因為它不是A、T、C、G或U。在一些實施方式中，核鹼基係視需要經取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的經取代的互變異構物。在一些實施方式中，核鹼基係視需要經取代的A、T、C、G或U，例如5mC、5-羥基甲基C等。在一些實施方式中，核鹼基係烷基取代的A、T、C、G或U。在一些實施方式中，核鹼基係A。在一些實施方式中，核鹼基係T。在一些實施方式中，核鹼基係C。在一些實施方式中，核鹼基係G。在一些實施方式中，核鹼基係U。在一些實施方式中，核鹼基係5mC。在一些實施方式中，核鹼基係取代的A、T、C、G或U。在一些實施方式中，核鹼基係A、T、C、G或U的經取代的互變異構物。在一些實施方式中，取代保護核鹼基中的某些官能基以最小化寡核苷酸合成過程中不希望的反應。在寡核苷酸合成中用於核鹼基保護的合適技術係本領域眾所周知的，並且可以根據本揭露使用。在一些實施方式中，修飾的核鹼基改善了寡核苷酸的特性和/或活性。例如，在許多情況下，可以使用5mC代替C來調節某些不希望的生物學效應，例如免疫應答。在一些實施方式中，當確定序列同一性時，將具有相同氫鍵模式的經取代的核鹼基與未取代的核鹼基相同處理，例如5mC可以與C相同處理[例如，具有5mC代替C（例如AT5mCG）的寡核苷酸被認為與在一個或多個相應位置（例如ATCG）具有C的寡核苷酸具有相同的鹼基序列]。
在一些實施方式中，寡核苷酸包含一個或多個A、T、C、G或U。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一個或多個視需要經取代的A、T、C、G或U。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一個或多個5-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、5-甲醯基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一個或多個5-甲基胞苷。在一些實施方式中，寡核苷酸中的每個核鹼基選自由以下項組成之群組：視需要經取代的A、T、C、G和U，以及A、T、C、G和U的視需要經取代的互變異構物。在一些實施方式中，寡核苷酸中的每個核鹼基係視需要受保護的A、T、C、G和U。在一些實施方式中，寡核苷酸中的每個核鹼基係視需要經取代的A、T、C、G或U。在一些實施方式中，寡核苷酸中的每個核鹼基選自由以下項組成之群組：A、T、C、G、U和5mC。在一些實施方式中，核鹼基係次黃嘌呤。
在一些實施方式中，核鹼基係視需要經取代的2AP或DAP。在一些實施方式中，核鹼基係視需要經取代的2AP。在一些實施方式中，核鹼基係視需要經取代的DAP。在一些實施方式中，核鹼基係2AP。在一些實施方式中，核鹼基係DAP。
在一些實施方式中，核鹼基係天然核鹼基或衍生自天然核鹼基的修飾的核鹼基。實例包括視需要其各自的胺基基團被醯基保護基團保護的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤，2-氟尿嘧啶，2-氟胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，2,6-二胺基嘌呤，氮雜胞嘧啶，嘧啶類似物（如假異胞嘧啶和假尿嘧啶），以及其他修飾的核鹼基（如8-取代的嘌呤、黃嘌呤、或次黃嘌呤，後兩個係天然降解產物）。修飾的核鹼基的某些實例揭露於Chiu和Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048；Limbach 等人 Nucleic Acids Research [核酸研究], 1994, 22, 2183-2196；以及Revankar和Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry [天然產物綜合化學], 第7卷, 313中。在一些實施方式中，經修飾的核鹼基係取代的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤。在一些實施方式中，修飾的核鹼基係尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤的例如就氫鍵合和/或鹼基配對而言的功能替換物。在一些實施方式中，核鹼基係視需要經取代的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鳥嘌呤。在一些實施方式中，核鹼基係尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鳥嘌呤。
在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸包含一個或多個5-甲基胞嘧啶。在一些實施方式中，本揭露提供了寡核苷酸，該寡核苷酸的鹼基序列在本文中例如在表A1中揭露，其中每個T可以獨立地被U替換，並且反之亦然。在一些實施方式中，在提供的寡核苷酸中，一個或多個C獨立地被修飾為5mC。如熟悉該項技術者所理解的，在一些實施方式中，就寡核苷酸的鹼基序列而言，可以將5mC視為C-這種寡核苷酸在C位置包含核鹼基修飾（例如，參見表A1中的各種寡核苷酸）。
在一些實施方式中，核鹼基係描述於US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中的核鹼基，其各自的核鹼基藉由引用併入本文。
糖
根據本揭露，可以使用各種糖，包括修飾的糖。在一些實施方式中，本揭露視需要與其他結構元件（例如，核苷酸間鍵聯修飾及其模式，其骨架手性中心模式等）組合地提供糖修飾及其模式，該其他結構元件在摻入寡核苷酸時可以提供改善的特性和/或活性。
最常見的天然存在的核苷包括連接到核鹼基腺苷（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）的核糖（例如在RNA中）或去氧核糖（例如在DNA中）。在一些實施方式中，糖，例如表A1中許多寡核苷酸中的各種糖（除非另外說明），係天然DNA糖（在DNA核酸或寡核苷酸中，具有結構
Figure 02_image032
，其中核鹼基連接至1'位並且3'和5'位連接至核苷酸間鍵聯（如熟悉該項技術者所理解的，如果在寡核苷酸的5'端，則5'位可以連接至5'端基（例如-OH），並且如果在寡核苷酸的3'端，則3'位可以連接至3'端基（例如-OH）。在一些實施方式中，糖係天然RNA糖（在RNA核酸或寡核苷酸中，具有結構
Figure 02_image034
，其中核鹼基連接至1'位並且3'和5'位連接至核苷酸間鍵聯（如熟悉該項技術者所理解的，如果在寡核苷酸的5'端，則5'位可以連接至5'端基（例如-OH），並且如果在寡核苷酸的3'端，則3'位可以連接至3'端基（例如-OH）。在一些實施方式中，糖係修飾的糖，因為它不是天然DNA糖或天然RNA糖。尤其是，修飾的糖可提供改善的穩定性。在一些實施方式中，修飾的糖可用於改變和/或優化一種或多種雜交特徵。在一些實施方式中，修飾的糖可用於改變和/或優化靶標識別。在一些實施方式中，修飾的糖可以用於優化Tm。在一些實施方式中，修飾的糖可用於改善寡核苷酸活性。
糖可以在各個位置結合到核苷酸間鍵聯上。作為非限制性實例，核苷酸間鍵聯可以鍵合至糖的2'、3'、4'或5'位。在一些實施方式中，如天然核酸中最常見的，核苷酸間鍵聯與在5'位的一個糖和在3'位的另一個糖連接，除非另有說明。
在一些實施方式中，糖係視需要經取代的天然DNA或RNA糖。在一些實施方式中，糖係視需要經取代的
Figure 02_image036
。在一些實施方式中，2’位置係視需要經取代的。在一些實施方式中，糖係
Figure 02_image036
。在一些實施方式中，糖具有
Figure 02_image038
或
Figure 02_image040
的結構，其中R1s 、R2s 、R3s 、R4s 和R5s 各自獨立地是-H、合適的取代基或合適的糖修飾（例如，US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO2019/032612、WO 2019/055951和/或WO 2019/075357中描述的那些，其各自的取代基、糖修飾、R1s 、R2s 、R3s 、R4s 和R5s 的描述和修飾的糖藉由引用獨立地併入本文）。在一些實施方式中，R1s 、R2s 、R3s 、R4s 和R5s 各自獨立地是Rs ，其中每個Rs 獨立地是-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-N3 、-NO、-NO2 、-Ls -R’、-Ls -OR’、-Ls -SR’、-Ls -N(R’)2 、-O-Ls -OR’、-O-Ls -SR’、或-O-Ls -N(R’)2 ，其中每個R’獨立地如本文所述，並且每個Ls 獨立地是共價鍵或視需要經取代的二價C1-6 脂肪族或具有1至4個雜原子的雜脂肪族；或兩個Rs 一起形成橋-Ls -。在一些實施方式中，R’係視需要經取代的C1-10 脂肪族。在一些實施方式中，糖具有
Figure 02_image040
的結構。在一些實施方式中，R4s 係-H。在一些實施方式中，糖具有
Figure 02_image042
的結構，其中R2s 係-H、鹵素、或-OR，其中R係視需要經取代的C1-6 脂肪族。在一些實施方式中，R2s 係-H。在一些實施方式中，R2s 係-F。在一些實施方式中，R2s 係-OMe。在一些實施方式中，經修飾的核苷係mA、mT、mC、m5mC、mG、mU等，其中R2s 係-OMe。在一些實施方式中，R2s 係-OCH2 CH2 OMe。在一些實施方式中，經修飾的核苷係Aeo、Teo、Ceo、m5Ceo、Geo、Ueo等，其中R2s 係-OCH2 CH2 OMe。
在一些實施方式中，糖具有
Figure 02_image040
的結構，其中R2s 和R4s 一起形成-Ls -，其中Ls 係共價鍵或視需要經取代的二價C1-6 脂肪族或具有1至4個雜原子的雜脂肪族。在一些實施方式中，每個雜原子獨立地選自氮、氧或硫）。在一些實施方式中，Ls 係視需要經取代的C2-O-CH2 -C4。在一些實施方式中，Ls 係C2-O-CH2 -C4。在一些實施方式中，Ls 係C2-O-(R)-CH(CH2 CH3 )-C4。在一些實施方式中，Ls 係C2-O-(S)-CH(CH2 CH3 )-C4。
在一些實施方式中，糖係雙環糖，例如如本揭露中所述之其中R2s 和R4s 一起形成連接的糖。在一些實施方式中，糖選自LNA糖、BNA糖、cEt糖等。在一些實施方式中，橋在2'和4'-碳原子之間（對應於R2s 和R4s 與居於它們之間的原子一起形成如本文所述之視需要經取代的環）。在一些實施方式中，雙環糖的實例包括α-L-亞甲基氧基（4'-CH2 -O-2’）LNA、β-D-亞甲基氧基（4'-CH2 -O-2'）LNA、亞乙基氧基（4' -(CH2 )2 -O-2’）LNA、胺基氧基（4' -CH2 -O-N(R)-2’）LNA和氧基胺基（4'-CH2 -N(R)-O-2’）LNA。在一些實施方式中，雙環糖，例如LNA或BNA糖，係在兩個糖碳之間具有至少一個橋的糖。在一些實施方式中，核苷中的雙環糖可以具有α-L-呋喃核糖或β-D-呋喃核糖的立體化學組態。在一些實施方式中，糖係WO 1999014226中描述的糖。在一些實施方式中，4’-2’雙環糖或4’至2’雙環糖係包含呋喃糖環的雙環糖，該呋喃糖環包含連接糖環的2’碳原子和4’碳原子的橋。在一些實施方式中，雙環糖，例如LNA或BNA糖，在兩個呋喃戊糖基糖碳之間包含至少一個橋。在一些實施方式中，LNA或BNA糖在4'和2'呋喃戊糖基糖碳之間包含至少一個橋。
在一些實施方式中，雙環糖係以下各項的糖：α-L-亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2’) BNA、β-D-亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2’) BNA、伸乙基氧基(4'-(CH2 )2 -O-2’) BNA、胺基氧基(4'-CH2 -O-N(R)-2’) BNA、氧胺基(4'-CH2 -N(R)-O-2’) BNA、甲基(亞甲基氧基) (4'-CH(CH3 )-O-2’) BNA（也稱為受限制的乙基或cEt）、亞甲基-硫基(4'-CH2 -S-2’) BNA、亞甲基-胺基(4'-CH2 -N(R)-2’) BNA、甲基碳環(4'-CH2 -CH(CH3 )-2’) BNA、亞丙基碳環(4'-(CH2 )3 -2’) BNA或乙烯基BNA。
在一些實施方式中，糖修飾係2’-OMe、2’-MOE、2’-LNA、2’-F、5’-乙烯基或S-cEt。在一些實施方式中，修飾的糖係FRNA糖、FANA糖或𠰌啉代糖。在一些實施方式中，寡核苷酸包含核酸類似物，例如GNA、LNA、PNA、TNA、F-HNA（F-THP或3'-氟四氫哌喃）、MNA（甘露醇核酸，例如Leumann 2002 Bioorg. Med. Chem.[生物有機化學與醫藥化學雜誌] 10: 841-854）、ANA（安尼妥（anitol）核酸）或𠰌啉代或其一部分。在一些實施方式中，糖修飾用另一個環狀或無環狀部分代替天然糖。此類部分的實例在本領域中是眾所周知的，例如用於𠰌啉代、二醇核酸等中的那些，並且可以根據本揭露使用。如熟悉該項技術者所理解的，當與修飾的糖一起使用時，在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯可以被修飾，例如在𠰌啉代、PNA等中。
在一些實施方式中，糖係在6-位具有(R)或(S)手性的6’-修飾的雙環糖，例如在US 7399845中描述的那些。在一些實施方式中，糖係在5-位具有(R)或(S)手性的5’-修飾的雙環糖，例如在US 20070287831中描述的那些。
在一些實施方式中，修飾的糖在2'位含有一個或多個取代基（通常是一個取代基，並且通常在軸向位置），其獨立地選自-F；-CF3 、-CN、-N3 、-NO、-NO2 、-OR'、-SR'、或-N(R')2 ，其中每個R'獨立地是視需要經取代的C1-10 脂肪族；-O-(C1 -C10 烷基)、-S-(C1 -C10 烷基)、-NH-(C1 -C10 烷基)、或-N(C1 -C10 烷基)2 ；-O-(C2 -C10 烯基)、-S-(C2 -C10 烯基)、-NH-(C2 -C10 烯基)、或-N(C2 -C10 烯基)2 ；-O-(C2 -C10 炔基)、-S-(C2 -C10 炔基)、-NH-(C2 -C10 炔基)、或-N(C2 -C10 炔基)2 ；或-O--(C1 -C10 伸烷基)-O--(C1 -C10 烷基)、-O-(C1 -C10 伸烷基)-NH-(C1 -C10 烷基)或-O-(C1 -C10 伸烷基)-NH(C1 -C10 烷基)2 、-NH-(C1 -C10 伸烷基)-O-(C1 -C10 烷基)、或-N(C1 -C10 烷基)-(C1 -C10 伸烷基)-O-(C1 -C10 烷基)，其中烷基、伸烷基、烯基和炔基各自獨立且視需要經取代。在一些實施方式中，取代基係-O(CH2 )n OCH3 、-O(CH2 )n NH2 、MOE、DMAOE或DMAEOE，其中n係1至約10。在一些實施方式中，修飾的糖描述於以下中的修飾的糖：WO 2001/088198；和Martin等人, Helv. Chim. Acta[赫爾維蒂卡化學雜誌], 1995, 78, 486-504。在一些實施方式中，經修飾的糖包含一個或多個選自以下的基團：取代的矽基、裂解RNA的基團、報告基團、螢光標記、嵌入劑、用於改善核酸的藥物動力學特性的基團、用於改善核酸的藥效學特性的基團、或其他具有類似特性的取代基。在一些實施方式中，在2'、3'、4'或5'位的一個或多個上進行修飾，包括在3'末端核苷上的糖的3'位或在5’末端核苷的5’位。
在一些實施方式中，修飾的糖係核糖，其2’-OH被選自以下的基團（例如，R2s ）替換：-F；-CF3 、-CN、-N3 、-NO、-NO2 、-OR'、-SR'、或-N(R')2 ，其中每個R'獨立地描述於本揭露中；-O-(C1 -C10 烷基)、-S-(C1 -C10 烷基)、-NH-(C1 -C10 烷基)、或-N(C1 -C10 烷基)2 ；-O-(C2 -C10 烯基)、-S-(C2 -C10 烯基)、-NH-(C2 -C10 烯基)、或-N(C2 -C10 烯基)2 ；-O-(C2 -C10 炔基)、-S-(C2 -C10 炔基)、-NH-(C2 -C10 炔基)、或-N(C2 -C10 炔基)2 ；或-O--(C1 -C10 伸烷基)-O--(C1 -C10 烷基)、-O-(C1 -C10 伸烷基)-NH-(C1 -C10 烷基)或-O-(C1 -C10 伸烷基)-NH(C1 -C10 烷基)2 、-NH-(C1 -C10 伸烷基)-O-(C1 -C10 烷基)、或-N(C1 -C10 烷基)-(C1 -C10 伸烷基)-O-(C1 -C10 烷基)，其中烷基、伸烷基、烯基和炔基各自獨立且視需要經取代。在一些實施方式中，2'-OH被-H（去氧核糖）替換。在一些實施方式中，2'-OH被-F替換。在一些實施方式中，2'-OH被-OR'替換。在一些實施方式中，2'-OH被-OMe替換。在一些實施方式中，2'-OH被-OCH2 CH2 OMe替換。
在一些實施方式中，糖修飾係2'-修飾。常用的2'-修飾包括但不限於2'-OR，其中R係視需要經取代的C1-6 脂肪族。在一些實施方式中，修飾係2’-OR，其中R係視需要經取代的C1-6 烷基。在一些實施方式中，修飾係2'-OMe。在一些實施方式中，修飾係2'-MOE。在一些實施方式中，2'-修飾係S-cEt。在一些實施方式中，修飾的糖係LNA糖。在一些實施方式中，2'-修飾係-F。在一些實施方式中，2'-修飾係FANA。在一些實施方式中，2'-修飾係FRNA。在一些實施方式中，糖修飾係5’-修飾，例如5’-Me。在一些實施方式中，糖修飾改變糖環的大小。在一些實施方式中，糖修飾係FHNA中的糖部分。
在一些實施方式中，糖修飾用另一個環狀或無環狀部分替換糖部分。這類部分的實例係本領域廣泛已知的，包括但不限於𠰌啉基（視需要具有其二胺基磷酸酯鍵聯）、二醇核酸等中所使用的那些部分。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的一個或多個糖被修飾。在一些實施方式中，寡核苷酸的每個糖被獨立地修飾。在一些實施方式中，修飾的糖包含2’-修飾。在一些實施方式中，每個修飾的糖獨立地包含2’-修飾。在一些實施方式中，2'-修飾係2'-OR，其中R係視需要經取代的C1-6 脂肪族。在一些實施方式中，2’-修飾係2’-OMe。在一些實施方式中，2’-修飾係2’-MOE。在一些實施方式中，2’-修飾係LNA糖修飾。在一些實施方式中，2’-修改係2’-F。在一些實施方式中，每個糖修飾獨立地是2’-修飾。在一些實施方式中，每個糖修飾獨立地是2'-OR。在一些實施方式中，每個糖修飾獨立地是2'-OR，其中R係視需要經取代的C1-6 烷基。在一些實施方式中，每個糖修飾係2’-OMe。在一些實施方式中，每個糖修飾係2’-MOE。在一些實施方式中，每個糖修飾獨立地是2'-OMe或2'-MOE。在一些實施方式中，每個糖修飾獨立地是2’-OMe、2’-MOE或LNA糖。
在一些實施方式中，修飾的糖係視需要經取代的ENA糖。在一些實施方式中，糖係在以下中描述的糖：例如Seth等人, J Am Chem Soc.[美國化學學會雜誌] 2010年10月27日; 132(42): 14942-14950。在一些實施方式中，修飾的糖係在XNA（異種核酸（xenonucleic acid））中的糖，例如阿拉伯糖、無水己糖醇、蘇糖、2'氟阿拉伯糖或環己烯。
修飾的糖包括代替呋喃戊糖基糖的環丁基或環戊基部分。這種修飾的糖的代表性實例包括在US 4,981,957、US 5,118,800、US 5,319,080或US 5,359,044中描述的那些。在一些實施方式中，核糖環內的氧原子被氮、硫、硒或碳替換。在一些實施方式中，-O-被-N(R’)-、-S-、-Se-或-C(R’)2 -替換。在一些實施方式中，修飾的糖係修飾的核糖，其中核糖環內的氧原子被氮替換，且其中氮視需要被烷基基團（例如甲基、乙基、異丙基等）取代。
在一些實施方式中，糖藉由核苷酸間鍵聯（在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵聯）連接。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯不包含鍵聯磷。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯係-L-。在一些實施方式中，核苷酸間鍵聯係-OP(O)(-C≡CH)O-、-OP(O)(R)O-（例如，R係-CH3 ）、3’-NHP(O)(OH)O-5’、3’-OP(O)(CH3 )OCH2 -5’、3’-CH2 C(O)NHCH2 -5’、3’-SCH2 OCH2 -5’、3’-OCH2 OCH2 -5’、3’-CH2 NR’CH2 -5’、3’-CH2 N(Me)OCH2 -5’、3’-NHC(O)CH2 CH2 -5’、3’-NR’C(O)CH2 CH2 -5’、3’-CH2 CH2 NR’-5’、3’-CH2 CH2 NH-5’、或3’-OCH2 CH2 N(R’)-5’。在一些實施方式中，5’碳可以視需要被=O取代。
在一些實施方式中，修飾的糖係視需要經取代的戊糖或己糖。在一些實施方式中，修飾的糖係視需要經取代的戊糖。在一些實施方式中，修飾的糖係視需要經取代的己糖。在一些實施方式中，修飾的糖係視需要經取代的核糖或己糖醇。在一些實施方式中，修飾的糖係視需要經取代的核糖。在一些實施方式中，修飾的糖係視需要經取代的己糖醇。
在一些實施方式中，糖修飾係5'-乙烯基（R或S）、5'-甲基（R或S）、2'-SH、2'-F、2'-OCH3 、2'-OCH2 CH3 、2'-OCH2 CH2 F或2’-O(CH2 )20 CH3 。在一些實施方式中，在2’位上的取代基，例如2’-修飾基團係烯丙基、胺基、疊氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1 -C10 烷基、OCF3 、OCH2 F、O(CH2 )2 SCH3 、O(CH2 )2 -O-N(Rm )(Rn )、O-CH2 -C(=O)-N(Rm )(Rn )和O-CH2 -C(=O)-N(R1 )-(CH2 )2 -N(Rm )(Rn )，其中每個烯丙基、胺基和烷基視需要經取代，並且Rl 、Rm 和Rn 各自獨立地是如本揭露中所述之R'。在一些實施方式中，Rl 、Rm 和Rn 各自獨立地是-H或視需要經取代的C1 -C10 烷基。
在一些實施方式中，糖係四氫哌喃或THP糖。在一些實施方式中，修飾的核苷係四氫哌喃核苷或THP核苷（其係用六員四氫哌喃糖替代典型的天然核苷中的呋喃戊糖基殘基的核苷）。THP糖和/或核苷包括用於己糖醇核酸（HNA）、安尼妥（anitol）核酸（ANA）、甘露醇核酸（MNA）（例如，Leumann, Bioorg. Med. Chem.[生物有機化學與醫藥化學], 2002, 10, 841-854）或氟代HNA（F-HNA）的那些。
在一些實施方式中，糖包含具有多於5個原子和/或多於一個雜原子的環，例如𠰌啉代糖。
如熟悉該項技術者將理解的，糖、核鹼基、核苷酸間鍵聯等的修飾可以並且經常與寡核苷酸（例如參見表A1中的各種寡核苷酸）組合使用。例如，糖修飾和核鹼基修飾的組合係2'-F（糖）5-甲基（核鹼基）修飾的核苷。在一些實施方式中，組合係用S替換核糖基環氧原子並在2'-位置取代。
在一些實施方式中，2'-修飾的糖係在2'位被修飾的呋喃糖基糖。在一些實施方式中，2’-修飾係鹵素、-R’（其中R’不是-H）、-OR’（其中R’不是-H）、-SR’、-N(R’)2 、視需要經取代的-CH2 -CH=CH2 、視需要經取代的烯基或視需要經取代的炔基。在一些實施方式中，2’-修飾選自-O[(CH2 )n O]m CH3 、-O(CH2 )n NH2 、-O(CH2 )n CH3 、-O(CH2 )n F、-O(CH2 )n ONH2 、-OCH2 C(=O)N(H)CH3 和-O(CH2 )n ON[(CH2 )n CH3 ]2 ，其中每個n和m獨立地是1至約10。在一些實施方式中，2'-修飾係視需要經取代的C1 -C12 烷基、視需要經取代的烯基、視需要經取代的炔基、視需要經取代的烷芳基、視需要經取代的芳烷基、視需要經取代的-O-烷芳基，視需要經取代的-O-芳烷基，-SH、-SCH3 、-OCN、-Cl、-Br、-CN、-F、-CF3 、-OCF3 、-SOCH3 、-SO2 CH3 、-ONO2 、-NO2 、-N3 、-NH2 、視需要經取代的雜環烷基，視需要經取代的雜環烷芳基、視需要經取代的胺基烷基胺基，視需要經取代的聚烷基胺基，經取代的矽基，報告基團，嵌入劑，用於改善藥物動力學特性的基團，用於改善藥效學特性的基團和其他取代基。在一些實施方式中，2’-修飾係2’-MOE修飾。
在一些實施方式中，2’-修飾的或2’-取代的糖或核苷係在糖的2’位包含除-H（通常不視為取代基）或-OH以外的取代基的糖或核苷。在一些實施方式中，2’-修飾的糖係雙環糖，其包含連接糖環的兩個碳原子（其中一個係2’碳）的橋。在一些實施方式中，2’-修飾係非橋聯的，例如烯丙基，胺基，疊氮基，硫代，視需要經取代的-O-烯丙基，視需要經取代的-O-C1 -C10 烷基，-OCF3 ，-O(CH2 )2 OCH3 、2’-O(CH2 )2 SCH3 、-O(CH2 )2 ON(Rm )(Rn )或-OCH2 C(=O)N(Rm )(Rn )，其中每個Rm 和Rn 獨立地是-H或視需要經取代的C1 -C10 烷基。
在一些實施方式中，糖係N-甲醇卡巴（N-methanocarba）、LNA、cMOE BNA、cEt BNA、α-L-LNA或相關類似物、HNA、Me-ANA、MOE-ANA、Ara-FHNA、FHNA、R-6'-Me-FHNA、S-6'-Me-FHNA、ENA或c-ANA。在一些實施方式中，修飾的核苷酸間鍵聯係C3-醯胺（例如，具有與C3’連接的醯胺修飾的糖，Mutisya  等人 2014 Nucleic Acids Res.[核酸研究] 2014年6月1日; 42(10): 6542-6551），甲縮醛，硫代甲縮醛，MMI [例如，亞甲基(甲基亞胺基)，Peoc'h 等人 2006 Nucleosides and Nucleotides[核苷與核苷酸] 16 (7-9)]，PMO（二胺基磷酸酯連接的𠰌啉代）鍵聯（其連接兩個糖）或PNA（肽核酸）鍵聯。
在一些實施方式中，糖係描述於US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中的糖，其各自的糖藉由引用併入本文。
可用於製備寡核苷酸或其類似物的各種另外的糖係本領域已知的，並且可以根據本揭露使用。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述或本技術領域中已知的任何糖。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可包含本文中所描述或本技術領域中已知的任何糖與本文中所描述的任何其他結構元件或修飾的組合，該任何其他結構元件或修飾包括但不限於鹼基序列或其部分、鹼基；核苷酸間鍵聯；立體化學或其模式；另外的化學部分，包括但不限於靶向部分等；糖、鹼基或核苷酸間鍵聯的修飾模式；其形式或任何結構元件；和/或本文所述之任何其他結構元件或修飾；且在一些實施方式中，本揭露關於任何此類寡核苷酸的多聚體。
寡核苷酸和組成物的產生
各種方法可以用於產生寡核苷酸和組成物，並且可以根據本揭露使用。例如，傳統的亞磷醯胺化學（例如，包含-CH2 CH2 CN和-N(i-Pr)2 的亞磷醯胺）可用於製備立體隨機的寡核苷酸和組成物，並且某些試劑和手性受控的技術可用於製備手性受控的寡核苷酸組成物，例如如以下中所描述：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的試劑和方法藉由引用併入本文。
在一些實施方式中，寡核苷酸及其組成物的手性受控/立體選擇性製備包括利用手性助劑，例如作為單體亞磷醯胺的一部分。此類手性助劑和亞磷醯胺的實例描述於以下中：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的手性助劑和亞磷醯胺藉由引用獨立地併入本文。在一些實施方式中，手性助劑係
Figure 02_image044
或
Figure 02_image046
（DPSE手性助劑）。在一些實施方式中，手性助劑係
Figure 02_image048
或
Figure 02_image050
。在一些實施方式中，手性助劑係
Figure 02_image052
或
Figure 02_image054
。在一些實施方式中，手性助劑包含-SO2 RAU ，其中RAU 係選自以下的視需要經取代的基團：C1-20 脂肪族、具有1-10個雜原子的C1-20 雜脂肪族、C6-20 芳基、C6-20 芳基脂肪族、具有1-10個雜原子的C6-20 芳基雜脂肪族、具有1-10個雜原子的5-20員雜芳基、以及具有1-10個雜原子的3-20員雜環基。在一些實施方式中，手性助劑係
Figure 02_image056
或
Figure 02_image058
。在一些實施方式中，RAU 係視需要經取代的芳基。在一些實施方式中，RAU 係視需要經取代的苯基。在一些實施方式中，RAU 係視需要經取代的C1-6 脂肪族。在一些實施方式中，手性助劑係
Figure 02_image060
或
Figure 02_image062
（PSM手性助劑）。在一些實施方式中，此類手性助劑，包含此類手性助劑的亞磷醯胺，包含此類助劑的中間寡核苷酸的利用（例如製備）、保護、去除等描述於US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中，並藉由引用併入本文。
在一些實施方式中，用於製備寡核苷酸和/或組成物之方法包括使用本文所述之手性助劑，例如用於構建一個或多個手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，使用DPSE手性助劑獨立地構建一個或多個手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，使用DPSE手性助劑獨立地構建每個手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，使用
Figure 02_image056
或
Figure 02_image058
或其鹽（其中RAU 如本文所述）獨立地構建一個或多個手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，使用
Figure 02_image056
或
Figure 02_image058
或其鹽獨立地構建每個手性受控的不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如n001）。在一些實施方式中，使用
Figure 02_image056
或
Figure 02_image058
或其鹽獨立地構建每個手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，RAU 係視需要經取代的C1-20 、C1-10 、C1-6 、C1-5 、或C1-4 脂肪族。在一些實施方式中，RAU 係視需要經取代的C1-20 、C1-10 、C1-6 、C1-5 、或C1-4 烷基。在一些實施方式中，RAU 係視需要經取代的芳基。在一些實施方式中，RAU 係苯基。在一些實施方式中，使用PSM手性助劑構建一個或多個手性受控的核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，使用PSM手性助劑獨立地構建每個手性受控的不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如n001）。在一些實施方式中，使用PSM手性助劑獨立地構建每個手性受控的核苷酸間鍵聯。如熟悉該項技術者所理解的，在亞磷醯胺中經常使用手性助劑（例如，
Figure 02_image064
或
Figure 02_image066
（DPSE亞磷醯胺），
Figure 02_image068
或
Figure 02_image070
（其中RAU 獨立地如本文所述；當RAU 係-Ph、PSM亞磷醯胺時），其中RNS 係視需要經取代/受保護的核苷（例如，視需要受保護用於寡核苷酸合成）或其鹽等）用於寡核苷酸製備。在一些實施方式中，方法包括提供DPSE和/或PSM亞磷醯胺或其鹽。在一些實施方式中，所提供之方法包括使DPSE和/或PSM亞磷醯胺或其鹽與-OH（例如核苷或寡核苷酸鏈的5'-OH）接觸。如熟悉該項技術者所理解的，接觸可以在多種合適的條件下進行，從而形成磷鍵聯。在一些實施方式中，每個手性受控的核苷酸間鍵聯的製備獨立地包括使DPSE或PSM亞磷醯胺或其鹽與-OH（例如核苷或寡核苷酸鏈的5'-OH）接觸。在一些實施方式中，每個手性受控的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯的製備獨立地包括使DPSE亞磷醯胺或其鹽與-OH（例如核苷或寡核苷酸鏈的5'-OH）接觸。在一些實施方式中，每個手性受控的不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（如n001）的製備獨立地包括使PSM亞磷醯胺或其鹽與-OH（例如核苷或寡核苷酸鏈的5'-OH）接觸。在一些實施方式中，每個手性受控的核苷酸間鍵聯的製備獨立地包括使PSM亞磷醯胺或其鹽與-OH（例如核苷或寡核苷酸鏈的5'-OH）接觸。在一些實施方式中，接觸形成P(III)鍵聯，該鍵聯包含鍵合至兩個糖的磷原子和手性助劑部分（例如
Figure 02_image072
或
Figure 02_image074
，或其鹽形式（例如，來自DPSE亞磷醯胺或其鹽），
Figure 02_image076
或
Figure 02_image078
，或其鹽形式（其中RAU 獨立地如本文所述；當RAU 係-Ph時，例如來自PSM亞磷醯胺或其鹽）等）。在一些實施方式中，寡核苷酸包含P(III)鍵聯，該鍵聯包含例如來自DPSE或PSM亞磷醯胺的手性助劑部分。在一些實施方式中，包含手性助劑部分的P(III)鍵聯係手性受控的。在一些實施方式中，可以例如在將P(III)鍵聯轉化為P(V)鍵聯之前（例如，在硫化、與疊氮化物反應等之前）保護手性助劑部分。在一些實施方式中，受保護的手性助劑具有
Figure 02_image080
或
Figure 02_image082
的結構，或其鹽形式（例如，其中R'獨立地如本文所述；例如，來自DPSE亞磷醯胺或其鹽），或
Figure 02_image084
或
Figure 02_image086
，或其鹽形式（其中每個R'和RAU 獨立地如本文所述；當RAU 係-Ph時，例如來自PSM亞磷醯胺或其鹽），其中每個R'獨立地如本文所述。在一些實施方式中，R'係-C(O)R，其中R如本文所述。在一些實施方式中，R係-CH3 。在一些實施方式中，寡核苷酸包含受保護的手性助劑。在一些實施方式中，寡核苷酸中的每個手性受控的核苷酸間鍵聯獨立地包含
Figure 02_image080
或
Figure 02_image082
，或其鹽形式，或
Figure 02_image084
或
Figure 02_image086
，或其鹽形式。在一些實施方式中，寡核苷酸中的每個手性受控的核苷酸間鍵聯獨立地包含
Figure 02_image084
或
Figure 02_image086
，或其鹽形式。在一些實施方式中，R'係-C(O)R。在一些實施方式中，R'係-C(O)CH3 。在一些實施方式中，RAU 係Ph。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image089
或其鹽形式（PIII-1），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image091
或其鹽形式（PIII-2），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image093
或其鹽形式（PIII-5），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image095
或其鹽形式（PIII-6），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，5’端核苷酸間鍵聯係PIII-1、PIII-2、PIII-5或PIII-6。在一些實施方式中，5’端核苷酸間鍵聯係PIII-1或PIII-2。在一些實施方式中，R’係-H。在一些實施方式中，R'係-C(O)R。在一些實施方式中，R'係-C(O)CH3 。在一些實施方式中，RAU 係-Ph。在一些實施方式中，將P(III)鍵聯轉化為P(V)鍵聯。在一些實施方式中，P(V)鍵聯包含鍵合至兩個糖的磷原子、手性助劑部分（例如
Figure 02_image080
或
Figure 02_image082
，或其鹽形式（其中R'如本文所述；例如來自DPSE亞磷醯胺或其鹽），
Figure 02_image084
或
Figure 02_image086
，或其鹽形式（其中R'和RAU 各自獨立地如本文所述；當RAU 係-Ph時，例如來自PSM亞磷醯胺或其鹽）等），以及S或
Figure 02_image097
。在一些實施方式中，P(V)鍵聯包含鍵合至兩個糖的磷原子、
Figure 02_image084
或
Figure 02_image086
，或其鹽形式（其中R’和RAU 各自獨立地如本文所述；當RAU 係-Ph時，例如來自PSM亞磷醯胺或其鹽）等），以及S或
Figure 02_image097
。在一些實施方式中，P(V)鍵聯包含鍵合至兩個糖的磷原子、
Figure 02_image084
或
Figure 02_image086
，或其鹽形式（其中R’和RAU 各自獨立地如本文所述；當RAU 係-Ph時，例如來自PSM亞磷醯胺或其鹽）等），以及S。在一些實施方式中，P(V)鍵聯包含鍵合至兩個糖的磷原子、
Figure 02_image084
或
Figure 02_image086
，或其鹽形式（其中R’和RAU 各自獨立地如本文所述；當RAU 係-Ph時，例如來自PSM亞磷醯胺或其鹽）等），以及
Figure 02_image097
。熟悉該項技術者將意識到，
Figure 02_image097
可以與平衡離子（例如在一些實施方式中為PF6 - ）一起存在。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image099
或其鹽形式（PV-1），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image101
或其鹽形式（PV-2），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image103
或其鹽形式（PV-3），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image105
或其鹽形式（PV-4），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image107
或其鹽形式（PV-5），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸包含一種或多種
Figure 02_image109
或其鹽形式（PV-6），其中每個變數獨立地如本文所述。在一些實施方式中，寡核苷酸的每個手性核苷酸間鍵聯或每個手性受控的核苷酸間鍵聯獨立地選自PIII-1、PIII-2、PIII-5、PIII-6、PV-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5和PV-6。在一些實施方式中，寡核苷酸的每個手性核苷酸間鍵聯或每個手性受控的核苷酸間鍵聯獨立地選自PIII-1、PIII-2、PV-1、PV-2、PV-3和PV-4。在一些實施方式中，PIII-1、PIII-2、PIII-5或PIII-6的鍵聯通常是5'端核苷酸間鍵聯。在一些實施方式中，寡核苷酸的每個手性核苷酸間鍵聯或每個手性受控的核苷酸間鍵聯獨立地選自PV-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5和PV-6。在一些實施方式中，寡核苷酸的每個手性核苷酸間鍵聯或每個手性受控的核苷酸間鍵聯獨立地選自PV-1、PV-2、PV-3或PV-4。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸係如本文所述之（例如表A1的）寡核苷酸，其中每個*S獨立地被PV-3或PV-5替換，每個*R獨立地被PV-4或PV-6替換，每個n001R獨立地被PV-1替換，並且每個n001S獨立地被PV-2替換。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸係如本文所述之（例如表A1的）寡核苷酸，其中每個*S獨立地被PV-3替換，每個*R獨立地被PV-4替換，每個n001R獨立地被PV-1替換，並且每個n001S獨立地被PV-2替換。在一些實施方式中，每個天然磷酸酯鍵聯獨立地被先質（例如
Figure 02_image111
）替換。在一些實施方式中，R’係-H。在一些實施方式中，R'係-C(O)R。在一些實施方式中，R'係-C(O)CH3 。在一些實施方式中，RAU 係-Ph。在一些實施方式中，方法包括除去一個或多個手性助劑部分，從而形成硫代磷酸酯和/或不帶負電荷的核苷酸間鍵聯（例如，n001）（例如，從V-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5、PV-6等）。在一些實施方式中，除去手性助劑（例如，PSM）包括在無水條件下使寡核苷酸與鹼（例如，N(R)3 ，例如DEA）接觸。
在一些實施方式中，如熟悉該項技術者所理解的，為了製備手性受控的核苷酸間鍵聯，通常以手性富集或純淨形式（例如，如本文所述之純度（例如，約或至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或約100%））使用亞磷醯胺（例如，DPSE或PSM亞磷醯胺）。
在一些實施方式中，手性受控的製備技術（包括寡核苷酸合成循環、試劑和條件）描述於以下中：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的寡核苷酸合成方法、循環、試劑和條件藉由引用獨立地併入本文。
一旦合成，通常將進一步純化寡核苷酸和組成物。合適的純化技術係熟悉該項技術者眾所周知的和實踐的，包括但不限於在以下中描述的那些：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的純化技術藉由引用獨立地併入本文。
在一些實施方式中，循環包括偶聯、加帽、修飾和解嵌段或由其組成。在一些實施方式中，循環包括偶聯、加帽、修飾、加帽和解嵌段或由其組成。該等步驟通常以其列出的循序執行，但是在一些實施方式中，如熟悉該項技術者所理解的，可以改變某些步驟的順序，例如加帽和修飾。如果需要，可以重複一個或多個步驟以提高轉化率、產率和/或純度，如熟悉該項技術者通常在合成中所進行的。例如，在一些實施方式中，可以重複進行偶聯；在一些實施方式中，可以重複進行修飾（例如，氧化以安裝＝ O，硫化以安裝＝ S，等等）；在一些實施方式中，在修飾後重複進行偶聯，其可以將P(III)鍵聯轉化為在某些情況下可以更穩定的P(V)鍵聯，並且偶聯後通常進行修飾以轉化新形成的P(III)鍵聯為P(V)鍵聯。在一些實施方式中，當重複步驟時，可以採用不同的條件（例如，濃度、溫度、試劑、時間等）。
在一些實施方式中，寡核苷酸連接至固體支持物。在一些實施方式中，固體支持物係寡核苷酸合成的支持物。在一些實施方式中，固體支持物包括玻璃。在一些實施方式中，固體支持物係CPG（可控孔度玻璃）。在一些實施方式中，固體支持物係聚合物。在一些實施方式中，固體支持物係聚苯乙烯。在一些實施方式中，固體支持物係高度交聯的聚苯乙烯（HCP）。在一些實施方式中，固體支持物係可控孔度玻璃（CPG）和高度交聯的聚苯乙烯（HCP）的雜合支持物。在一些實施方式中，固體支持物係金屬泡沫。在一些實施方式中，固體支持物係樹脂。在一些實施方式中，從固體支持物上切割寡核苷酸。
用於配製所提供的寡核苷酸和/或製備藥物組成物的技術，例如用於經由各種途徑施用給受試者的技術，在本領域中是容易獲得的，並且可以根據本揭露使用，例如描述於以下中的那些：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252。
生物應用
如本文中所描述，所提供的組成物及方法能夠改善RNA的敲低，包括C9orf72 RNA轉錄物的敲低。在一些實施方式中，所提供的組成物及方法相比於參考條件提供C9orf72轉錄物（包括但不限於包含重複擴增的那些轉錄物）的經改善敲低，該參考條件係選自由不存在該組成物、存在參考組成物及其組合組成之群組。
在一些實施方式中，相對於野生型或不含重複擴增的C9orf72基因或基因產物（例如，不含六核苷酸重複擴增的C9orf72基因或基因產物），C9orf72寡核苷酸能夠優先降低突變型或含有重複擴增的C9orf72基因或基因產物（例如，包含六核苷酸重複擴增的C9orf72基因或基因產物）的表現、水平和/或活性（敲低）。
在多個實施方式中，總轉錄物包括正常（健康的，不具有重複擴增）和突變型（病理性，包含重複擴增）的V2、V3和V1。各種轉錄物圖解說明於圖1中。據報導，V1以極低水平經轉錄（約係總C9orf72轉錄物的1%），且不會明顯增加包含六核苷酸重複擴增的轉錄物的水平，或增加V3轉錄物分析中所檢測的轉錄物水平。
V1、V2及V3係藉由替代性mRNA先質剪接所製造的C9orf72轉錄物的自然產生的mRNA先質變體。DeJesus-Hernandez等人 2011。在變體1及3中，經擴增GGGGCC重複位於兩個替代性地剪接外顯子之間的內含子中，而在變體2中，重複位於啟動子區域中且因此不存在於轉錄物中。V1係C9orf72變體1轉錄物，其代表最短的轉錄物且編碼較短的C9orf72蛋白質（同種型b），參見NM_145005.5。V2係C9orf72變體2轉錄物，其與變體1相比在5' UTR及3'編碼區及UTR中不同。所得C9orf72蛋白質（同種型a）與同種型1相比更長。變體2及3編碼相同的C9orf72蛋白質；參見NM_018325.3。V3係C9orf72變體3轉錄物，其與變體1相比在5' UTR及3'編碼區及UTR中不同。所得C9orf72蛋白質（同種型a）與同種型1相比更長；變體2及3編碼相同的蛋白質，參見NM_001256054.1。轉錄物變體1及3經預測編碼由C9orf72外顯子2-11編碼的481個胺基酸長的蛋白質（NP_060795.1；同種型a）；而變體2經預測編碼由外顯子2-5編碼的較短222個胺基酸的蛋白質（NP_659442.2；同種型b）。應注意，根據一些報導，V1、V2及V3轉錄物不是同等豐富的；據報導，V2係主要轉錄物，代表90%的總轉錄物，V3代表9%，且V1代表1%。因此，在不受任何特定理論限制的情況下，本揭示提出由一些C9orf72寡核苷酸介導的總轉錄物減少包括含有重複擴增的轉錄物的敲低的呈現。數據展示許多C9orf72寡核苷酸由此能夠介導含有重複擴增的C9orf72轉錄物相對於不含重複擴增的C9orf72轉錄物的較佳的敲低。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可較佳的是敲低或降低突變（例如，含有重複擴增的）V3 C9orf72轉錄物相對於總C9orf72轉錄物的表現、水平和/或活性。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸能夠介導自重複擴增翻譯的DPR蛋白質的表現、活性和/或水平降低。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸能夠介導C9orf72基因產物的表現、活性和/或水平降低。在一些實施方式中，C9orf72基因產物係蛋白質，諸如二肽重複(DPR)蛋白質。在一些實施方式中，DPR可藉由含有重複的C9orf72轉錄物的六個閱讀框中的任一者的RAN翻譯來製造。在一些實施方式中，二肽重複蛋白質經由六核苷酸重複區域的有義或反義股的RNA（重複相關及非ATG依賴性翻譯）來產生。DPR蛋白質描述於例如Zu等人 2011 Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院刊]108: 260-265；Zu等人 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.[美國科學院院刊] 2013 Dec 17;110(51):E4968-77；Lopez-Gonzalez等人, 2016, Neuron[神經元]92, 1-9；May等人 Acta Neuropathol[神經病理學報](2014) 128:485-503；和Freibaum等人 2017 Front. Mol. Neurosci.[分子神經科學前沿] 10, 文章35；和Westergard等人, 2016, Cell Reports[細胞報告] 17, 645-652中。在一些實施方式中，C9orf72二肽重複係或包含以下中的任一者：聚-(脯胺酸-丙胺酸) (聚PA或)或聚-(丙胺酸-脯胺酸)或(聚AP)；聚-(脯胺酸-精胺酸) (聚PR)或聚-(精胺酸-脯胺酸) (聚RP)；或聚-(脯胺酸-甘胺酸) (聚PG)或聚-(甘胺酸-脯胺酸) (聚GP)。據報導聚GA在C9orf72腦中充分表現，之後是聚GP及聚GR，而由反義轉錄物的翻譯造成的聚PA及聚PR係罕見的。據報導，聚GA及另一DPR物種在細胞之間傳輸且DPR攝取如何影響接受細胞。Zhou等檢測所有疏水性DPR物種係細胞至細胞傳輸且展示聚GA升高重複RNA水平及DPR表現，從而證實DPR傳輸可觸發惡性循環；用抗GA抗體處理細胞降低DPR的細胞內聚集。Zhou等人 2017. EMBO Mol. Med.[EMBO分子醫學] 9(5):687-702。Chang等人報導甘胺酸-丙胺酸二肽重複蛋白質形成具有細胞至細胞傳輸特性的毒性澱粉樣蛋白。Chang等人 2016.J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 291: 4903-4911。
在一些實施方式中，DPR蛋白質包含聚GA。在一些實施方式中，DPR蛋白質包含聚GP。在一些實施方式中，DPR蛋白質包含聚GR。在一些實施方式中，DPR蛋白質係聚GP。作為非限制性實例，DPR蛋白質的胺基酸序列係或包含以下中的任一者：GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAWSGRARGRARGGAAVAVPAPA-AAEAQAVASG、GPGPGPGPGPGPGPGPGPGRGRGGPGGGPGAGLRLRCLRPRRRRRRR-WRVGE、或GRGRGRGRGRGRGRGRGRGVVGAGPGAGPGRGCGCGACARGGGGAGG-GEWVSEEAASWRVAVWGSAAGKRRG（來自有義框）；或PRPRPRPRPR-PRPRPRPRPLARDS、GPGPGPGPGPGPGPGPGP、或PAPAPAPAPAPAPAPAPAPSARLLSS-RACYRLRLFPSLFSSG（來自反義框）。在一些實施方式中，DPR蛋白或其一部分（例如，DPR或其一部分）係或包含來自GGGGCC重複序列（或其反義框）的翻譯。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於降低DPR蛋白和/或在細胞群中包含DPR蛋白的病灶水平的技術（例如寡核苷酸、組成物、方法等），該技術藉由使細胞與本文所述之寡核苷酸或組成物接觸。在一些實施方式中，本揭露提供了用於降低DPR蛋白和/或在受試者中包含DPR蛋白的病灶水平的技術（例如寡核苷酸、組成物、方法等），該技術藉由向受試者施用本文所述之寡核苷酸或組成物。
C9orf72基因產物還包括病灶，據報導該病灶包含由多種RNA結合蛋白結合的C9orf72 RNA或其一部分的複合物（例如，經刪除內含子）。病灶描述於例如Mori等人，2013 Acta Neuropath.[神經病理學報] 125: 413-423中。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於降低在細胞群中病灶水平的技術（例如寡核苷酸、組成物、方法等），該技術藉由使細胞與本文所述之寡核苷酸或組成物接觸。在一些實施方式中，本揭露提供了用於降低在受試者中病灶水平的技術（例如寡核苷酸、組成物、方法等），該技術藉由向受試者施用本文所述之寡核苷酸或組成物。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸或組成物能夠介導包含病灶的細胞數目，和/或每個細胞的病灶數目降低。在一些實施方式中，病灶包含含有GGGGCC重複序列的RNA。在一些實施方式中，病灶包含含有擴增的GGGGCC重複序列的RNA。在一些實施方式中，病灶包含含有GGCCCC重複序列的RNA。在一些實施方式中，病灶包含含有擴增的GGCCCC重複序列的RNA。在一些實施方式中，如本文所述，擴增的重複序列包含約或至少約30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、或1600個重複序列。
在一些實施方式中，所提供的技術（例如寡核苷酸、組成物、方法等）增加、增強和/或恢復細胞或受試者中一種或多種RNA結合蛋白的活性水平。在一些實施方式中，所提供的技術降低C9orf72蛋白質和/或活性不足的水平或預防不足。在一些實施方式中，所提供的技術降低C9orf72蛋白質的單倍劑量不足水平或預防單倍劑量不足。在一些實施方式中，所提供的技術可以改善或恢復囊泡轉運。在一些實施方式中，所提供的技術可以減少麩胺酸引起的興奮性毒性。在一些實施方式中，所提供的技術可以被遞送到細胞核中，降低新轉錄的RNA水平和/或降低病灶中RNA水平。尤其是，如本文所證明的，所提供的技術可以有效和較佳的是敲低含有重複序列的C9orf72轉錄物（例如，V1和/或V3）和/或由其編碼的產物，和/或保留C9orf72蛋白質的表現、水平和/或活性。在一些實施方式中，所提供的技術可以降低含外顯子1a的變體（例如，V1和/或V3（例如，錯剪接並含有G4C2重複序列）、穩定的內含子1（或其部分），包含G4C2重複序列等）的表現和/或水平，改善剪接效率，降低含有重複序列的轉錄物的水平和/或降低反義轉錄物的水平。在一些實施方式中，所提供的技術可以減少與擴增相關的有義和/或反義轉錄物的DPR水平。在一些實施方式中，所提供的技術不從外顯子1b接點移開剪接機構，或者也不移開比參考技術小的程度。在一些實施方式中，所提供的技術可以例如在存在麩胺酸的情況下促進神經突生長（例如，神經突長度和/或神經突分支）和/或神經元（例如運動神經元）存活。在一些實施方式中，所提供的技術可以從含有擴增的G4C2重複序列的等位基因和/或不含擴增的G4C2重複序列的等位基因中降低轉錄物和/或由其編碼的產物的水平和/或活性。在一些實施方式中，所提供的技術可能不會增加或可能減少反義轉錄物和/或由其編碼的產物的水平和/或活性。
作為非限制性實例數據，在小鼠中施用C9orf72寡核苷酸WV-7658及WV-7659顯示脊髓前角中的每100個運動神經元細胞核計數的病灶數目降低51.8%及62.2% [與PBS（陰性對照）相比]；大於5個病灶/細胞的細胞數目分別降低58.3%及70.9%；及每100個運動神經元的病灶數目分別降低49.1%及55.0%。
在不希望受任何特定理論束縛的情況下，本揭露提出V3 C9orf72轉錄物的顯著敲低和/或DPR蛋白質的表現、活性和/或水平降低和/或包含病灶的細胞數目和/或每個細胞的病灶數目減少可導致細胞病理學的顯著抑制或與細胞病理學的顯著抑制相關，其中根本的生物學基本原理係經擴增六核苷酸重複等位基因致使預剪接C9orf72轉錄物及經剪接內含子的滯留時間更長，此使其更易受到靶向寡核苷酸的內含子的影響。在不希望受任何特定理論束縛的情況下，本揭露提出V3 C9orf72轉錄物的約50%敲低可導致對細胞病理學的約90%抑制或與細胞病理學的約90%抑制相關。
由C9orf72寡核苷酸介導的改善可係任何所需生物功能的改善，包括但不限於治療和/或預防C9orf72相關的障礙或其症狀。在一些實施方式中，C9orf72相關障礙係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）、額顳葉失智（FTD）、皮質基底節變性綜合症（CBD）、非典型帕金森氏症候群、橄欖體橋腦小腦變性（OPCD）、原發性側索硬化症（PLS）、進行性肌萎縮症（PMA）、擬表型杭丁頓氏舞蹈症（HD）、阿茲海默氏症（AD）、雙極性障礙、精神分裂症或其他非運動障礙。在一些實施方式中，C9orf72相關障礙的症狀係選自：躁動、焦慮、鈍化情緒、食物偏好改變、能量和/或動機減少、失智、抑鬱症、呼吸困難、吞咽困難、發音困難、呼吸困難、注意力分散、肌肉的束化和/或痙攣、平衡減弱、損傷的運動功能、不適當的社會行為、同理心缺乏、失去記憶、情緒波動、肌肉抽搐、肌無力、忽略個人衛生、重複或強迫行為、呼吸短促、言語不清、步態不穩、視覺異常、四肢虛弱。
在一些實施方式中，C9orf72相關障礙的症狀係詞義性失智、語言理解減弱或使用正確或精確的語言困難。在一些實施方式中，C9orf72相關障礙或其症狀係皮質基底節變性綜合症（CBD）、抖動、缺乏協調、肌肉僵硬和/或痙攣、進行性核上麻痹（PSP）、行走和/或平衡問題、頻繁跌倒、肌肉僵硬、頸和/或上部身體中的肌肉僵硬、生理功能喪失，和/或異常眼球運動。
在一些實施方式中，FTD係行為變型額顳葉失智（bvFTD）。在一些實施方式中，在bvFTD中，據報導最顯著的初始症狀與人格及行為相關。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸能夠降低受試者經歷抑制解除的程度或速率，其隨著個人關係及社會生命的限制喪失而呈現，如根據本技術領域中熟知之方法評定。
在一些實施方式中，本揭露提供一種治療疾病之方法，其係藉由施用包含第一多個共用共同的鹼基序列包含共同的鹼基序列的寡核苷酸的組成物，該核苷酸序列與靶標C9orf72轉錄物中的靶標序列互補， 改善包括使用立體控制的寡核苷酸組成物作為寡核苷酸組成物，該立體控制的寡核苷酸組成物的特徵在於，當其與寡核苷酸或敲低系統中的C9orf72轉錄物接觸時，C9orf72轉錄物的RNase H介導的敲低相對於在參考條件下觀測到的敲低得到改善，該參考條件選自由不存在該組成物、存在參考組成物及其組合組成之群組。
在一些實施方式中，在一種或多種合適條件（例如，實例中描述的一種或多種測定；在一種或多種濃度下，例如約1、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、7000或10000 nM）下，相比由參考技術（例如，包含立體隨機寡核苷酸組成物的技術，包含不同設計的寡核苷酸的手性受控的寡核苷酸組成物的技術等）提供的減少，本揭露的技術提供至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、或190%更多、或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多倍更多靶標核酸（例如轉錄物）和/或由其編碼的產物（例如蛋白質）（例如與病症、障礙或疾病相關的那些）的減少。
在一些實施方式中，藉由施用C9orf72寡核苷酸，C9orf72靶標基因或基因產物的表現或水平降低至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%或80%。在一些實施方式中，藉由施用C9orf72寡核苷酸，C9orf72轉錄物和/或由其編碼的產物（例如，與病症、障礙或疾病相關的產物）的表現或水平降低至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%或80%。在一些實施方式中，評估係在體外（例如在細胞中）進行的。在一些實施方式中，評估在體內進行。如熟悉該項技術者所理解的，根據本揭露，多種技術可用於評估所提供的技術（例如，寡核苷酸、組成物等）的性質和/或活性；本實例中介紹了某些此類技術）。在一些實施方式中，在某些寡核苷酸濃度下（例如約1、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、7000或10000 nM）實現降低。
在一些實施方式中，相較與病症、障礙或疾病不相關或較低相關的那些，本揭露的技術可以選擇性地降低與病症、障礙或疾病相關的C9orf72核酸和/或由其編碼的產物的表現、活性和/或水平。在一些實施方式中，選擇性至少為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500或1000倍或更多倍。在一些實施方式中，藉由IC50值的比率來評估選擇性，該比率可以藉由適合於評估根據本揭露的所提供技術的活性的多種技術（例如，實例中所述之那些）獲得。
在一些實施方式中，在一種或多種寡核苷酸濃度下（例如約1、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、7000或10000 nM）評估特性、活性、選擇性等。
在一些實施方式中，所提供技術的IC50係約或不超過約1、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、7000或10000 nM。在一些實施方式中，它不超過100 nM。在一些實施方式中，它不超過200 nM。在一些實施方式中，它不超過300 nM。在一些實施方式中，它不超過400 nM。在一些實施方式中，它不超過500 nM。在一些實施方式中，它不超過1 uM。在一些實施方式中，它不超過5 uM。在一些實施方式中，它不超過10 uM。在一些實施方式中，使用實例中描述的技術評估IC50。在一些實施方式中，在相關細胞中體外評估IC50。在一些實施方式中，IC50被評估為動物模型。
在一些實施方式中，活性和/或選擇性藉由轉錄物的水平來評估，例如與病症、障礙或疾病相關的那些轉錄物。在一些實施方式中，活性和/或選擇性藉由蛋白質和/或肽的水平來評估，例如與病症、障礙或疾病相關的那些轉錄物。在一些實施方式中，在細胞群和/或單個細胞中（例如，具有病灶的細胞百分比和/或單個細胞中病灶的水平），活性和/或選擇性藉由核酸病灶（例如，RNA病灶）水平來評估，例如與病症、障礙或疾病相關的那些核酸病灶。
在一些實施方式中，與病症、障礙或疾病相關的轉錄物包含擴增的重複序列（例如，G4C2重複序列）。在一些實施方式中，擴增的G4C2重複序列在C9orf72的內含子1中。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、或1600個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約30個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約50個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約100個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約150個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約200個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約300個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約400個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約500個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約600個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約700個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約800個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約900個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約1000個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約1100個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約1200個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約1300個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約1400個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約1500個重複序列。在一些實施方式中，擴增的重複序列包含約或至少約1600個重複序列。據報導稱，在健康人體內，C9orf72 GGGGCC重複序列的範圍為2-23個單位或0-15個單位；而在一些患者中約或至少約30-71或700-1600個重複序列（參見例如，Renton等人, Neuron[神經元], 2011, 72, 257-268；DeJesus-Hernandez等人, Neuron[神經元], 2011, 72, 245-256）。
在一些實施方式中，與病症、障礙或疾病相關的轉錄物係包含擴增的重複序列的V1和/或V3（例如，圖1中所說明的那些）。在一些實施方式中，相較不包含擴增的重複序列的轉錄物和/或由其編碼的產物，所提供的技術選擇性地降低包含擴增的重複序列的轉錄物和/或由其編碼的產物的表現、活性和/或水平（例如，圖1中所說明的包含擴增的重複序列的V1和/或V3）。
在一些實施方式中，本揭露提供用於降低病灶水平的技術。在一些實施方式中，病灶包含C9orf72轉錄物（來自一條或兩條股），其包含擴增的重複序列和/或由其編碼的肽）。在一些實施方式中，所提供的技術降低具有病灶的細胞的數量/百分比，和/或降低單個細胞中病灶的水平。 表徵與評估
包括但不限於本技術領域中已知的許多的各種技術及工具可用於評估及測試根目錄據本揭露的C9orf72寡核苷酸。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的功效的評估及測試可藉由量化C9orf72靶標核酸或在傳遞C9orf72寡核苷酸之後的相對應基因產物的水平、活性、表現、等位基因特異性表現和/或細胞內分佈的改變或改善來進行。在一些實施方式中，遞送可以經由轉染劑或不經由轉染劑（例如，體外（gymnotic））來進行。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的功效的評估及測試可藉由量化在引入C9orf72寡核苷酸之後的C9orf72基因產物（包括但不限於轉錄物、DPR或病灶）的水平、活性、表現和/或胞內改變來進行。C9orf72基因產物包括由C9orf72基因或基因座產生的RNA。
在一些實施方式中，本揭露提供了鑒定和/或表徵寡核苷酸組成物之方法，該方法包括以下步驟： 提供至少一種包含第一多個寡核苷酸的組成物；並且 相對於參考組成物評估傳遞。
在一些實施方式中，本揭露提供了鑒定和/或表徵寡核苷酸組成物之方法，該方法包括以下步驟： 提供至少一種包含第一多個寡核苷酸的組成物；並且 相對於參考組成物評估細胞攝取。
在一些實施方式中，將所提供的寡核苷酸組成物的特性與參考寡核苷酸組成物進行比較。
在一些實施方式中，參考寡核苷酸組成物係立體隨機寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，參考寡核苷酸組成物係所有核苷酸間鍵聯均為硫代磷酸酯的寡核苷酸的立體隨機組成物。在一些實施方式中，參考寡核苷酸組成物係具有所有磷酸酯鍵聯的DNA寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，參考組成物係具有相同鹼基序列和相同化學修飾的寡核苷酸的組成物。在一些實施方式中，參考組成物係具有相同鹼基序列和相同化學修飾模式的寡核苷酸的組成物。在一些實施方式中，參考組成物係具有相同鹼基序列和化學修飾的寡核苷酸的手性不受控（或立體隨機）組成物。
在一些實施方式中，參考組成物係具有相同鹼基序列但不同化學修飾（包括但不限於本文所述之化學修飾）的寡核苷酸的組成物。在一些實施方式中，參考組成物係具有相同鹼基序列但不同核苷酸間鍵聯模式和/或核苷酸間鍵聯的立體化學和/或化學修飾的寡核苷酸的組成物。
各種方法係本技術領域中已知的用於檢測C9orf72基因產物，該基因產物的表現、水平和/或活性可在引入施用C9orf72寡核苷酸之後經改變。作為非限制性實例：C9orf72轉錄物及其敲低可用qPCR量化，C9orf72蛋白質水平可經由蛋白質印跡法測定，RNA病灶藉由螢光原位雜交（FISH）測定，DPR藉由蛋白質印跡法、ELISA或質譜分析測定。可商購的C9orf72抗體包括抗C9orf72抗體GT779（1 : 2000；GeneTex, 爾灣（Irvine）, 加利福尼亞州）。另外，可藉由電生理學及NMJ形成對表現野生型和/或突變C9orf72的運動神經元（MN）執行功能測定。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的功效的評估及測試可在細胞中體外執行。在一些實施方式中，該細胞係表現C9orf72的細胞。在一些實施方式中，細胞係經工程改造以表現C9orf72的SH-SY5Y（人類神經母細胞瘤）的細胞。在一些實施方式中，細胞係工程改造以表現C9orf72的SH-SY5Y的細胞，如WO 2016/167780中所描述。在一些實施方式中，細胞係患者衍生的細胞、患者衍生的纖維母細胞、iPSC或iPSN。在一些實施方式中，細胞係iPSC衍生的神經元或運動神經元。適用於測試C9orf72寡核苷酸的各種細胞包括患者衍生的纖維母細胞、iPSC及iPSN且描述於例如Donelly等人 2013 Neuron[神經元]80, 415-428；Sareen等人 2013 Sci. Trans. Med.[科學轉化醫學] 5: 208ra149；Swartz等人 STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE [幹細胞轉化醫學] 2016;5:1-12；和Almeida等人 2013 Acta Neuropathol.[神經病理學報] 126: 385-399中。在一些實施方式中，細胞係BAC轉基因小鼠衍生的細胞，包括（但不限於）小鼠胚胎纖維母細胞或皮質原始神經元。在一些實施方式中，評估及測試涉及細胞群。在一些實施方式中，細胞群係iCell神經元群（還稱作iNeurons）、iPS細胞衍生的人類大腦皮質神經元的混合群，其呈現天然電力及生物化學活性，可購自細胞動力國際公司（Cellular Dynamics International）, 麥迪森, 威斯康辛州。包括脊髓運動神經元、中腦、多巴胺激導性神經元、麩胺酸激導性神經元、GABA能神經元、混合皮質神經元、中型多棘紋狀體GABA能神經元、富含小白蛋白的皮質GABA能神經元、V層皮質麩胺酸激導性神經元的另外細胞可購自BrainXell公司, 麥迪森, 威斯康辛州。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的評估可在動物中執行。在一些實施方式中，動物係小鼠。C9orf72小鼠模型及使用其的實驗性程序描述於Hukema等人 2014 Acta Neuropath. Comm.[神經病理學報通訊] 2: 166；Ferguson等人 2016 J. Anat.[解剖學雜誌] 226: 871-891；Lagier-Tourenne等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.[美國科學院院刊] 2013年11月19日;110(47):E4530-9；Koppers等人 Ann. Neurol.[神經病學年鑒] 2015;78:426-438；Kramer等人 2016 Science [科學] 353: 708；Liu等人, 2016, Neuron [神經元] 90, 521-534；Peters等人, 2015, Neuron [神經元] 88, 902-909；Picher-Martel等人 Acta Neuropathologica Communications [神經病理學報通訊] (2016) 4:70中。C9-BAC小鼠模型描述在本文中（參見實例9）。
在一些實施方式中，靶標核酸水平可藉由本領域已知的任何方法量化，其中的許多方法可使用可商購的套盒和材料完成，且該方法係本領域中熟知的且常規的。此類方法包括例如RNA印跡分析、競爭性聚合酶鏈式反應（PCR）或即時定量PCR。可對總細胞RNA或聚(A)+ mRNA執行RNA分析。探針及引物經設計以與C9orf72核酸雜交。用於設計即時PCR探針和引物之方法係本領域熟知的。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的功效的評估及測試可使用螢光素酶分析執行。此分析的非限制性實例詳述於以下實例3中。在一些實施方式中，螢光素酶分析採用包含鍵聯至有義C9orf72轉錄物的一部分的螢光素酶基因（或其有效部分）的構建體，諸如nt 1-374或nt 158-900（此兩者皆包含六核苷酸重複擴增）。在一些實施方式中，nt 1-374包含外顯子1a及外顯子1a與1b之間的內含子。在一些實施方式中，螢光素酶分析採用包含鍵聯至反義C9orf72轉錄物的一部分的螢光素酶基因（或其有效部分）的構建體，諸如nt 900至1（其包含六核苷酸重複擴增）。在一些實施方式中，螢光素酶分析在轉染COS-7細胞中執行。
在一些實施方式中，C9orf72蛋白質水平可以本技術領域中已知的任何方法評估或量化，包括但不限於酶聯免疫吸附分析（ELISA）、蛋白質印跡分析（免疫印跡法）、免疫細胞化學、螢光活化細胞分選（FACS）、免疫組織化學、免疫沈澱、蛋白質活性分析（例如半胱天冬酶活性分析）及定量蛋白質分析。適用於檢測小鼠、大鼠、猴及人類C9orf72的抗體係可商購的；對C9orf72的另外抗體可經由本技術領域中已知之方法來產生。
用於檢測寡核苷酸或其他核酸的水平的分析法描述於本文中（例如，在實例4中）。作為非限制性實例，此分析可用於檢測C9orf72寡核苷酸或所關注的任何其他核酸，包括並不靶向C9orf72及核酸的核酸或其他寡核苷酸。
C9orf72寡核苷酸的功效的評估及測試可藉由測定在傳遞C9orf72寡核苷酸之後在細胞中的重複RNA病灶（或RNA病灶）數目的改變來執行。重複RNA病灶係當包含六核苷酸重複的RNA隔離RNA結合蛋白時形成的結構，且是RNA介導的毒性的量度和/或原因。在一些實施方式中，RNA病灶可係有義或反義RNA病灶。當C9orf72寡核苷酸體內施用至動物時，可在動物的腦或其一部分（諸如但不限於小腦、大腦皮質、海馬區、丘腦、髓質或腦的任何其他部分）中測定或檢測RNA病灶的存在和/或數目。每個細胞的病灶數目（例如，多達5個或大於5個）或其平均值和/或包含病灶的細胞數目可在遞送C9orf72寡核苷酸之後經測定。該等數目中的任一者或所有減少表明C9orf72寡核苷酸的功效。RNA病灶可藉由本技術領域中已知之方法來檢測，包括但不限於螢光原位雜交（FISH）；FISH的非限制性實例呈現於實例4中。
C9orf72寡核苷酸的功效的評估及測試可藉由測定傳遞C9orf72寡核苷酸之後在細胞中的單倍劑量不足的改變來體外執行。舉例而言，當六核苷酸重複RNA對C9orf72轉錄和/或C9orf72基因的表現充當負面效應子時產生單倍劑量不足，由此減少C9orf72轉錄物或基因產物的總量。單倍劑量不足降低表明C9orf72寡核苷酸的功效。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸不顯著降低C9orf72蛋白質的表現、活性和/或水平。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸降低C9orf72重複擴增或其基因產物的表現、活性和/或水平，但不顯著降低C9orf72蛋白質的表現、活性和/或水平。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸 (a) 降低C9orf72重複擴增或其基因產物的表現、活性和/或水平，及 (b) 並不將C9orf72的表現、活性和/或水平降低至足以引起疾病病症的程度。與C9orf72的不充分產生相關的各種疾病病症包括不當的核內體移行、由骨髓擴增表徵的穩健免疫表型、T細胞活化、漿細胞增加、自體抗體升高、免疫介導性腎小球腎病和/或自體免疫反應，如例如Farg等人 2014 Human Mol. Gen.[人類分子遺傳學] 23: 3579-3595；及Atanasio等人 Sci Rep. 2016年3月16日; 6:23204. doi: 10.1038/srep23204中所描述。
C9orf72寡核苷酸的功效的評估及測試可體內執行。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可在動物中評估和/或測試。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸可在人體和/或其他動物內評估和/或測試以介導水平、活性、表現、等位基因特異性表現和/或胞內分佈的改變或改善和/或以預防、治療、減輕或減緩C9orf72相關障礙或C9orf72相關障礙中的至少一個症狀的進展。在一些實施方式中，此類體內評估和/或測試可在引入C9orf72寡核苷酸之後測定表型改變，諸如改善的運動功能及呼吸。在一些實施方式中，運動功能可藉由測定本技術領域中已知的各種測試中的任一者的改變來測量，該測試包括：平衡桿、握力強度、後肢足跡測試（例如，在動物中）、曠場性能、爬桿，及旋桿。在一些實施方式中，呼吸可藉由以本技術領域中已知的各種測試中的任一者測定改變來測量，包括：符合性測量、抗侵入性及全身體積描記。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸的功效的測試藉由使來自患有神經疾病的受試者的運動神經元細胞與C9orf72寡核苷酸接觸且判定運動神經元細胞是否退化來完成。若運動神經元細胞不退化，則C9orf72寡核苷酸可能夠降低或抑制運動神經元退化。該運動神經元細胞可衍生自多能幹細胞。多能幹細胞可能已經自受試者的細胞再程式化。來自受試者的細胞可以是例如體細胞。例如，體細胞可以是成纖維細胞、淋巴細胞或角質形成細胞。對運動神經元細胞是否退化的評估可以基於與對照的比較。在一些實施方式中，對照水平可以是預定值或參考值，其用作評估測量結果和/或可見結果的基準。預定或參考值可係來自未患有神經疾病的受試者樣本（例如運動神經元細胞）或來自患有神經疾病但其中運動神經元細胞不與C9orf72寡核苷酸接觸的受試者樣本中的水平。預定值或參考值可以是來自患有神經疾病的受試者的樣本的水平。在該等篩選方法中的任一者中，來自患有神經疾病的受試者的細胞可包含C9orf72中的(GGGGCC)n六核苷酸擴增。
C9orf72的功效還可在合適測試動物中經測試，諸如作為非限制性實例的Peters等人 2015 Neuron.[神經元] 88(5):902-9；O'Rourke等人 2015 Neuron.[神經元] 88(5): 892-901；和Liu等人 2016 Neuron.[神經元] 90(3):521-34中所描述的那些。在一些實施方式中，測試動物係C9-BAC小鼠。C9orf72的功效還可在具有450個重複擴增的C9-BAC轉基因小鼠中經測試，其也描述於Jiang等人 2016 Neuron[神經元] 90, 1-16中。
在一些實施方式中，在測試動物中，可測定各種C9orf72轉錄物的水平，可係C9orf72蛋白質水平、RNA病灶及DPR（二肽重複蛋白質）的水平。可在C9orf72寡核苷酸上執行測試且與參考寡核苷酸進行比較。本文所揭露的若干C9orf72寡核苷酸能夠降低包含RNAi病灶的細胞百分比及每個細胞的病灶平均數目。本文所揭露的若干C9orf72寡核苷酸能夠降低DPR，諸如聚GP的水平。
在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸能夠降低由ALS、FTD或其他C9orf72相關障礙引起的神經退化的程度或速率。在一些實施方式中，除了行為症狀中任何神經系統組織的退化的程度或速率的改善，或至少降低以外，C9orf72寡核苷酸在受試者或其他動物內的治療效果還可在腦掃描（例如CAT掃描、功能性MRI或PET掃描或本技術領域中已知的其他方法）下進行監測。
用於分析C9orf72寡核苷酸的各種分析法描述於本文中，例如於實例9、13及14中，且尤其包括報導子分析（螢光素酶分析），例如在ALS神經元中執行且測量例如對V3/內含子表現、活性和/或水平的分析；穩定性測定；TLR9測定；互補測定；PD（藥效學）（C9-BAC、icv或腦室內注射），例如在C9orf72-BAC（C9-BAC）小鼠模型中的測試的PD和/或功效；體內方法，包括但不限於注射至測試動物（如小鼠）的中樞神經系統的側腦室或其他區域（包括但不限於皮質和脊髓）；對病灶數目和/或包含病灶的細胞的數目的分析；聚GP（或pGP或DPR測定）。
在一些實施方式中，選擇標準用來評估由各種分析產生的數據且用來選擇特別期望的C9orf72寡核苷酸。在一些實施方式中，使用至少一個選擇標準。在一些實施方式中，使用兩個或大於兩個選擇標準。在一些實施方式中，螢光素酶分析的選擇標準（例如，V3/內含子敲低）係V3內含子的至少部分敲低和/或內含子轉錄物的至少部分敲低。在一些實施方式中，螢光素酶分析的選擇標準（例如，V3/內含子敲低）係V3內含子的50% KD（敲低）及內含子轉錄物的50% KD。在一些實施方式中，選擇標準包括對IC50 的測定。在一些實施方式中，選擇標準包括小於約10 nM、小於約5 nM或小於約1 nM的IC50 。在一些實施方式中，穩定性分析的選擇標準係第1天至少50%穩定性[寡核苷酸的至少50%水平仍係剩餘的和/或可檢測的]。在一些實施方式中，穩定性分析的選擇標準係第2天至少50%穩定性。在一些實施方式中，穩定性分析的選擇標準係第3天至少50%穩定性。在一些實施方式中，穩定性分析的選擇標準係第4天至少50%穩定性。在一些實施方式中，穩定性分析的選擇標準係第5天至少50%穩定性。在一些實施方式中，穩定性分析的選擇標準係第5天80% [至少80%的寡核苷酸剩餘]。在一些實施方式中，選擇標準係病灶數目和/或包含病灶的細胞數目中的至少部分敲低。在一些實施方式中，選擇標準係病灶數目和/或包含病灶的細胞數目中的至少50% KD（敲低）。在一些實施方式中，選擇標準包括TLR9測定中缺乏活化。在一些實施方式中，選擇標準包括互補測定中缺乏活化。在一些實施方式中，選擇標準包括測試動物（諸如小鼠）的中樞神經系統的橫向心室或其他區域（包括但不限於皮質及脊髓）中的敲低。在一些實施方式中，選擇標準包括測試動物（諸如小鼠）的中樞神經系統的橫向心室或其他區域（包括（但不限於）皮質及脊髓）中的至少50%敲低。在一些實施方式中，選擇標準包括DPR蛋白質的表現、活性和/或水平中的敲低。在一些實施方式中，選擇標準包括DPR蛋白質的表現、活性和/或水平中的敲低。在一些實施方式中，選擇標準包括DPR蛋白質的表現、活性和/或水平中的至少50%敲低。在一些實施方式中，選擇標準包括DPR蛋白質聚GP的表現、活性和/或水平中的至少50%敲低。
已經評估及測試敲低C9orf72的功效的寡核苷酸具有各種用途，包括施用以用於治療或預防C9orf72相關障礙或其症狀。
用於檢測所關注的靶標核酸的分析
在一些實施方式中，本揭露關於用於檢測和/或量化靶標核酸（例如，靶標寡核苷酸）的雜交分析，其中該分析利用捕獲探針（其與靶標核酸至少部分互補）及檢測探針；其中該檢測探針或包含該捕獲探針、檢測探針及靶標核酸的複合物能夠被檢測。此分析可用於檢測C9orf72寡核苷酸（例如，在組織或流體樣本中），或用於檢測任何樣本中的任何靶標核酸（任何靶標或序列）。在一些實施方式中，捕獲探針包含一級胺，其能夠餘胺基反應性固體載體反應，籍此將探針固定於固體載體上。在一些實施方式中，胺基反應性固體載體包含馬來酸酐。探針的不移動性可使用探針及固體載體上的炔烴及疊氮化物部分用點擊化學方法來執行。對於點擊化學方法，炔烴或疊氮化物可例如位於探針的5'或3'端，且可視需要經由連接子附接。對於點擊化學方法，固體載體例如包含炔烴或疊氮化物部分。在一些實施方式中，點擊化學方法包括作為非限制性實例的Kolb等人 2011 Angew.Chem. Int. Ed.[應用化學國際版] 40: 2004-2021中所描述的點擊化學方法。
在一些實施方式中，能夠直接地或間接地被檢測的探針或複合物參與產生可檢測信號。在一些實施方式中，探針或複合物係 (a) 能夠在不存在另一化學組分的情況下製備可檢測信號（作為非限制性實例，具有能夠製備可檢測信號的部分，諸如螢光染料或放射性標記），或 (b) 包含配位基、標記物或其他組分，其在與適當第二部分結合時能夠產生可檢測信號。在一些實施方式中，探針或複合物類型 (b) 包含標記物，諸如生物素、長葉毛地黃苷、半抗原、配位基等，其可與適當第二化學實體（諸如抗體）結合，當其結合至標記物時，能夠經由放射性標記、化學發光、染料、鹼性磷酸酶信號、過氧化酶信號等產生信號。
在一些實施方式中，將捕獲探針固定於固體載體上。在一些實施方式中，捕獲探針與靶標核酸雜交、結合或連接，且檢測探針也與靶標核酸雜交、結合或連接，且複合物能夠被檢測到。雜交分析的許多變化形式係本技術領域中已知的。在一些實施方式中，在雜交分析中，捕獲及檢測探針係同一探針，且單股核酸酶用於降解不與靶標核酸結合（或不完全結合）的探針。
在一些實施方式中，本揭露關於用於檢測和/或量化靶標核酸（例如，靶標寡核苷酸）的雜交分析，其中探針（例如，捕獲探針）與靶標核酸至少部分互補且包含一級胺，其中一級胺能夠與胺基反應性固體載體反應，籍此將探針固定於固體載體上。一級胺可例如位於探針的5'或3'端，且可視需要經由連接子附接。在一些實施方式中，胺基反應性固體載體包含馬來酸酐。
靶標寡核苷酸可係例如C9orf72寡核苷酸或到達所關注的任何靶標的寡核苷酸。
在一些實施方式中，該分析係雜交分析、夾心雜交分析、競爭性雜交分析、雙連接雜交分析、核酸酶雜交分析或電化學雜交分析。
在一些實施方式中，該分析係夾心雜交分析，其中捕獲探針結合至固體載體且能夠退火至靶標寡核苷酸的一部分；其中檢測探針能夠被檢測到且能夠退火至寡核苷酸的另一部分；且其中捕獲探針及檢測探針兩者與靶標寡核苷酸的雜交產生能夠被檢測到的複合物。
在一些實施方式中，該分析係核酸酶雜交分析且捕獲探針係與靶標寡核苷酸完全互補的切割探針，其中與全長靶標寡核苷酸結合的切割探針能夠被檢測到；且其中自由的（不結合至靶標寡核苷酸）或結合至靶標寡核苷酸的更短代謝物或降解產物的切割探針藉由S1核酸酶處理降解並且因此不產生可檢測信號。
在一些實施方式中，該分析係雜交連接分析，其中捕獲探針係與靶標寡核苷酸完全互補且意欲用作用於連接酶介導的靶標寡核苷酸及檢測探針的連接的底物的模板探針。
在一些實施方式中，本揭露關於檢測和/或量化例如樣本（例如組織或液體）中的靶標核酸（例如，靶標寡核苷酸）之方法，其包含以下步驟：(1) 提供捕獲探針，其中捕獲探針與靶標核酸至少部分互補且包含一級胺，其中該一級胺能夠與胺基反應性固體載體結合，籍此將探針固定於固體載體上；(2) 將捕獲探針固定於固體載體上；(3) 提供檢測探針，其中檢測探針與靶標核酸（例如，靶標核酸的區域不同於捕獲探針結合的區域）至少部分互補且能夠直接地或間接地產生信號；其中步驟 (2) 及 (3) 可以任一循序執行；(4) 在適用於探針與靶標核酸的雜交的條件下使組織或液體與捕獲探針及檢測探針接觸；(5) 去除不與靶標核酸雜交的檢測探針；以及 (6) 檢測由檢測探針直接地或間接地產生的信號，其中信號的檢測指示對靶標核酸的檢測和/或量化。
在一些實施方式中，靶標寡核苷酸係C9orf72寡核苷酸。在一些實施方式中，靶標寡核苷酸不是C9orf72寡核苷酸。在一些實施方式中，靶標核酸係寡核苷酸、反義寡核苷酸、siRNA劑、雙股siRNA劑、單股siRNA劑或與疾病相關的核酸（例如，在疾病病症中表現或過度表現的基因或基因產物，諸如在癌細胞中大量增加的轉錄物，或其核酸包含與疾病或障礙相關的突變）。
在一些實施方式中，胺基反應性固體載體包含馬來酸酐。
靶標寡核苷酸經重新退火至檢測探針，且接著與捕獲探針組合，該捕獲探針經由一級胺標記物附接至胺基反應性板。在捕獲探針、檢測探針與靶標寡核苷酸之間產生雙雜交（例如，夾心雜交）；缺口可允許在捕獲探針與檢測探針之間，從而殘留不結合至捕獲或檢測探針的靶標寡核苷酸的單股部分。固體載體（例如，板表面）包含自發地與捕獲探針的末端上的一級胺標記物反應（例如，在pH 8至9下）的馬來酸酐（例如，馬來酸酐活化的板），從而將探針固定至固體載體。在一些實施方式中，固體載體係板、管、過濾器、珠粒、聚合物珠粒、金、顆粒、孔或多孔板。
作為非限制性實例，可使用以下條件： 塗覆：500 nM於2.5% Na2 CO3 中，pH 9.0，50 ul/孔，37°C，2小時 樣本/檢測探針：300 nM檢測探針作為稀釋劑，4°C，O/N 鏈黴親和素-AP：1 : 2000於PBST中，50 ul/孔，室溫，1-2小時 底物AttoPhos：100 ul/孔，室溫，5分鐘讀取
舉例而言：靶標核酸經預退火至檢測探針，且接著與捕獲探針組合，使用探針及固體載體上的炔烴（疊氮化物）部分經由點擊化學方法附接至板。在捕獲探針、檢測探針與靶標核酸之間產生雙雜交（例如，夾心雜交）；缺口可允許在捕獲探針與檢測探針之間，從而殘留不結合至捕獲或檢測探針的靶標寡核苷酸的單股部分。固體載體（例如，板表面）包含炔烴（或疊氮化物）部分，其用點擊化學方法與捕獲探針的末端上的疊氮化物（或炔烴）部分標記物反應，從而將探針固定至固體載體。在一些實施方式中，固體載體係板、管、過濾器、珠粒、聚合物珠粒、金、顆粒、孔或多孔板。
分析的非限制性實例提供於下文中：
測量組織（包括動物活檢體）中的靶標寡核苷酸水平的雜交ELISA分析：
靶標寡核苷酸的反向互補序列可劃分成2個區段，各自由捕獲或檢測探針表示。（靶標寡核苷酸的）5'序列可以是5-15 nt；3'序列可以是5-15 nt。然而，5'-探針序列（與靶標寡核苷酸的3'部分雜交）在其均與靶標寡核苷酸雜交時不應與3'探針序列重疊。5'-探針及3'-探針之間的缺口係可允許的。各探針應具有至少25°C，較佳的是 ＞ 45°C，甚至更較佳的是 ＞ 50°C的熔融溫度（Tm）。係實現高Tm，可使用經修飾的核苷酸，諸如鎖核酸（LNA）或肽核酸（PNA）。探針中的其他核苷酸可係DNA或RNA核苷酸或任何其他形式的經修飾核苷酸，諸如具有2'-OMe、2'-F或2'-MOE修飾的那些核苷酸。
5'-探針也可用在5'-位置處具有連接子的檢測部分來標記。此探針係檢測探針。
5'-探針（與靶標寡核苷酸的3'-部分雜交）可用5'-位置處具有連接子的一級胺來標記。此探針係捕獲探針。連接子用於連接一級胺至探針核苷酸。連接子可係C6-連接子、C12-連接子、PEG、TEG或與寡核苷酸（諸如寡聚dT）無關的任何核苷酸序列。具有連接子的5'一級胺可在合成期間或合成後安置。
3'-探針也可用在3'-位置處具有連接子序列的一級胺標記。此探針係捕獲探針。
3'-探針（與靶標寡核苷酸的5'部分雜交）可用3'-位置處具有連接子的檢測部分標記。此探針係檢測探針。檢測部分可係生物素、長葉毛地黃苷、HaloTag®配位基（普洛麥格公司（Promega）, 麥迪森, 威斯康辛州）或任何其他半抗原。檢測部分也可係磺酸基標記（中尺度診斷公司（Meso Scale Diagnostics）, 羅克維爾, 馬里蘭州）。連接子用於連接具有探針核苷酸的檢測部分。連接子可係C6-連接子、C12-連接子、PEG、TEG或與寡核苷酸（諸如寡聚dT）無關的任何核苷酸序列。具有連接子的3'-一級胺可在合成期間或合成後安置。
捕捉探針（在探針的5'端或3'端處具有一級胺）可固定於經活化以與一級胺反應的固體表面上，諸如馬來酸酐活化板（皮爾斯公司（Pierce）；購自賽默飛世爾公司（ThermoFisher）, 沃爾瑟姆, 麻塞諸塞州）或N-氧基琥珀醯亞胺(NOS)活化的DNA-BIND板（康寧生命科學公司（Corning Life Sciences）, 圖克斯伯裡, 麻塞諸塞州）。板也可係經活化用於胺軛合的其他類別的板，諸如MSD板（中尺度診斷公司, 羅克維爾, 馬里蘭州）。表面可係固體載體，諸如珠粒、金顆粒、羧化的聚苯乙烯微米粒子（MagPlex微球, Luminex公司（Luminex Corporation）；購自購自賽默飛世爾公司, 沃爾瑟姆, 麻塞諸塞州）或戴諾珠粒（Dynabead）（賽默飛世爾科學公司（Thermo Fisher Scientific）, 沃爾瑟姆, 麻塞諸塞州），以使得可使用基於流動的分析平臺，諸如流式螢光檢測術或珠粒-陣列平臺（BD™-細胞學珠粒陣列（Cytometric Bead Array）-CBA, BD生物科學公司（BD Biosciences）, 聖約瑟, 加利福尼亞州）。
含有靶標寡核苷酸的生物樣本，諸如組織溶解物或液態生物流體（血漿、血液、血清、CSF、尿液或其他組織或流體）以恰當濃度的寡核苷酸及檢測探針與檢測探針混合，隨後對塗覆有捕捉探針的表面（板或微米粒子）進行加熱改性以促進在室溫或4°C下在適當雜交緩衝液中的序列特異性雜交持續一段時間（雜交）。過量檢測探針藉由洗滌表面（板或珠粒）來去除。隨後將表面與識別檢測部分的試劑，諸如用於生物素的抗生素蛋白/鏈黴親和素、針對DIG的抗體或半抗原，或針對其配位基的HaloTag一起溫育。
檢測試劑通常用酶標記，諸如辣根過氧化酶（HRP）或鹼性磷酸酶（AP）或螢光團或磺酸基標記。在廣泛洗滌之後，經酶標記的檢測試劑藉由添加對應的底物，諸如用於HRP的TMB或用於AP的AttoPhos來檢測，且藉由吸收模式或螢光模式（螢光底物）中的平板讀數器來讀取各板。在一些實施方式中，標記物包含螢光素、B-藻紅素、羅丹明、花青染料、別藻藍蛋白或其變體或衍生物。
經螢光團標記的檢測試劑可用於基於流動的檢測平臺，諸如流式螢光檢測或珠粒陣列平臺。
磺酸基標記的檢測試劑可藉由MSD讀取器（中尺度發現公司（Meso Scale Discovery））直接讀取。
寡核苷酸量可使用在相同分析中執行的測試物品的連續稀釋的標準曲線來計算。
雜交分析的另一非限制性實例提供於實例4中。
用於寡核苷酸（包括但不限於C9orf72寡核苷酸）的效用的各種分析描述於本文中和/或在本技術領域中是已知的。 寡核苷酸及組成物的施用
在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸能夠導引靶標基因或其基因產物的表現和/或水平的降低。
在一些實施方式中，靶標基因為包含六核苷酸重複擴增的C9orf72。
在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸組成物以比在改善靶標（作為非限制性實例包括C9orf72轉錄物）的敲低方面具有類似效應的其他方面類似的參考寡核苷酸組成物的劑量和/或頻率低的劑量和/或頻率進行施用。在一些實施方式中，立體受控的寡核苷酸組成物以比在改善靶標C9orf72轉錄物的敲低方面具有類似效應的其他方面類似的立體隨機參考寡核苷酸組成物的劑量和/或頻率低的劑量和/或頻率進行施用。
在一些實施方式中，所提供的技術提供更長的耐用性。在一些實施方式中，所提供的技術一旦施用，可以在最後一劑後的一段時間內（例如約或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60或更多天，約或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60或更多週，或約或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個月），以一定水平或以上（例如，有用和/或足以提供某些生物學和/或治療作用的水平）提供活性（例如減少靶標轉錄物和/或由此編碼的產物）。
在一些實施方式中，本揭露涵蓋，寡核苷酸及其組成物的特性（例如經改善的敲低活性等）可藉由化學修飾和/或立體化學優化。在一些實施方式中，本揭露提供用於經由化學修飾及立體化學使寡核苷酸特性優化之方法。
在一些實施方式中，本揭露提供一種施用包含第一多個寡核苷酸且具有共同核苷酸序列的寡核苷酸組成物之方法，改善包含： 施用包含第一多個寡核苷酸的寡核苷酸，其特徵在於遞送相對於具有相同共同核苷酸序列的參考寡核苷酸組成物而言改善。
在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸、組成物及方法提供改善的遞送。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸、組成物及方法提供改善的細胞質遞送。在一些實施方式中，改善的遞送係至細胞群中。在一些實施方式中，改善的遞送係至組織中。在一些實施方式中，改善的遞送係至器官中。在一些實施方式中，改善的遞送係至中樞神經系統或其一部分（例如CNS）中。在一些實施方式中，改善的遞送係至生物體中。提供改善的遞送的實例結構元件（例如，化學修飾、立體化學、其組合等）、寡核苷酸、組成物及方法詳述於本發明中。
可採用各種給藥方案來施用所提供的手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，間隔一定時間段施用多個單位劑量。在一些實施方式中，指定組成物具有推薦的給藥方案，其可涉及一次或多次給藥。在一些實施方式中，給藥方案包含多次給藥，其中的每一者彼此間隔開相同長度的時段；在一些實施方式中，給藥方案包括多次給藥以及間隔開個別給藥的至少兩個不同時段。在一些實施方式中，給藥方案內的所有給藥具有相同單位給藥量。在一些實施方式中，給藥方案內的不同給藥具有不同的量。在一些實施方式中，給藥方案包含呈第一給藥量的第一次給藥，接著係呈不同於第一給藥量的第二給藥量的一次或多次其他給藥。在一些實施方式中，給藥方案包含呈第一給藥量的第一次給藥，接著係呈與第一次給藥（或另一先前給藥）量相同或不同的第二（或後續）給藥量的一次或多次其他給藥。在一些實施方式中，給藥方案包含施用至少一個單位劑量持續至少一天。在一些實施方式中，給藥方案包含在至少一天且有時超過一天的時間段內施用超過一個劑量。在一些實施方式中，給藥方案包含在至少一週的時間段內施用多個劑量。在一些實施方式中，時間段係至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多（例如約45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多）週。在一些實施方式中，給藥方案包含每週施用一個劑量，持續超過一週。在一些實施方式中，給藥方案包含每週施用一個劑量，持續2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多（例如約45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多）週。在一些實施方式中，給藥方案包含每兩週施用一個劑量，持續超過兩週時間。在一些實施方式中，給藥方案包含每兩週施用一個劑量，持續2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多（例如約45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多）週時間。在一些實施方式中，給藥方案包含每個月施用一個劑量，持續一個月。在一些實施方式中，給藥方案包含每個月施用一個劑量，持續超過一個月。在一些實施方式中，給藥方案包含每個月施用一個劑量，持續2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個月。在一些實施方式中，給藥方案包含每週施用一個劑量，持續約10週。在一些實施方式中，給藥方案包含每週施用一個劑量，持續約20週。在一些實施方式中，給藥方案包含每週施用一個劑量，持續約30週。在一些實施方式中，給藥方案包含每週施用一個劑量，持續26週。在一些實施方式中，寡核苷酸根據一給藥方案施用，該給藥方案不同於用於相同序列的非手性受控（例如立體隨機）的寡核苷酸組成物的給藥方案和/或用於相同序列的不同手性受控的寡核苷酸組成物的給藥方案。在一些實施方式中，寡核苷酸根據一給藥方案施用，該給藥方案相比於相同序列的非手性受控（例如立體隨機）的寡核苷酸組成物的給藥方案減少，其在給定單位時間內達成較低水平的總暴露、涉及一個或多個較低單位劑量和/或在給定單位時間內包括較少數目次給藥。在一些實施方式中，寡核苷酸根據一給藥方案施用，該給藥方案與相同序列的非手性受控（例如立體隨機）的寡核苷酸組成物的給藥方案相比延長較長時間段。不希望受理論限制，申請人指出，在一些實施方式中，較短給藥方案和/或給藥之間的較長時間段可根據手性受控的寡核苷酸組成物的改善的穩定性、生物可用性和/或功效來定。在一些實施方式中，寡核苷酸相比於對應的非手性受控的寡核苷酸組成物具有較長給藥方案。在一些實施方式中，寡核苷酸相比於對應的非手性受控的寡核苷酸組成物在至少兩次給藥之間具有較短時間段。不希望受理論限制，申請人指出，在一些實施方式中，較長給藥方案和/或各劑量之間的較短時間段可歸因於手性受控的寡核苷酸組成物的改善的安全性。
在一些實施方式中，憑藉改善的遞送（及其他特性），所提供組成物可以較低劑量和/或以較低頻率施用以達成生物作用，例如臨床功效。
單次給藥可含有各種量的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥可含有各種量的視應用需要適合的一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多（例如約350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多）mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約1 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約5 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約10 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約15 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約20 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約50 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約100 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約150 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約200 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約250 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，單次給藥含有約300 mg一種類型的手性受控的寡核苷酸。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸在單一給藥和/或總給藥中按比非手性受控的寡核苷酸低的量施用。在一些實施方式中，歸因於改善的功效，手性受控的寡核苷酸在單一給藥和/或總給藥中按比非手性受控的寡核苷酸低的量施用。在一些實施方式中，手性受控的寡核苷酸在單一給藥和/或總給藥中按比非手性受控的寡核苷酸高的量施用。在一些實施方式中，歸因於改善的安全性，手性受控的寡核苷酸在單一給藥和/或總給藥中按比非手性受控的寡核苷酸高的量施用。
與C9orf72相關的病症、障礙或疾病的治療
在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸能夠導引C9orf72靶標基因或其基因產物的表現、水平和/或活性的降低。在一些實施方式中，C9orf72相關障礙係與以下情形相關、引起以下情形和/或與以下情形相關聯的病症：C9orf72基因或其基因產物的異常或過高的活性、水平和/或表現、有害突變、或異常組織分佈、或細胞間或細胞內分佈。在一些實施方式中，C9orf72相關障礙係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）、額顳葉失智（FTD）、皮質基底節變性綜合症（CBD）、非典型帕金森氏症候群、橄欖體橋腦小腦變性（OPCD）、原發性側索硬化症（PLS）、進行性肌萎縮症（PMA）、擬表型杭丁頓氏舞蹈症（HD）、阿茲海默氏症（AD）、雙極性障礙、精神分裂症或其他非運動障礙。C9orf72相關障礙的症狀包括本文中所描述及本技術領域中已知的那些症狀。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療病症、障礙或疾病之方法，該方法包括向患有該疾病的受試者施用治療有效量的所提供的寡核苷酸，或包含或遞送治療有效量的所提供的寡核苷酸的組成物。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療病症、障礙或疾病之方法，該方法包括向患有該疾病的受試者施用治療有效量的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，組成物係包含寡核苷酸（在一些實施方式中，其藥學上可接受的鹽形式）和藥學上可接受的載體的藥物組成物。在一些實施方式中，病症、障礙或疾病係額顳葉型退化症（FTD）。在一些實施方式中，病症、障礙或疾病係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）。
不希望受任何特定理論或術語束縛，本發明指出，隨著對C9orf72相關疾病的理解不斷發展，各種C9orf72相關疾病的確切標誌也根據報導發展。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸適用於降低C9orf72的含有六核苷酸重複的突變型等位基因的水平（在蛋白質和/或mRNA層級），和/或降低由含有六核苷酸重複的突變型C9orf72 mRNA產生的二肽重複蛋白質的水平，其中該寡核苷酸適用於治療C9orf72相關疾病。
在一些實施方式中，C9orf72相關障礙係FTD。在一些實施方式中，FTD係額顳葉失智或額顳葉型退化症的縮寫。在一些實施方式中，額顳葉型退化症（FTD）係影響腦的額葉及顳葉的疾病過程。其引起特徵係行為、性格、語言和/或動作改變的一組障礙。FTD的臨床診斷包括以下中的任何一者或多者：行為變異型FTD（bvFTD）、原發性進行性失語（PPA）及運動障礙進行性核上麻痹 （PSP）及皮質基底節變性症（CBD）。在一些實施方式中，患有或易患上PPA、PSP或CBD的患者並不呈現失智或鑒定係失智。在一些實施方式中，額顳葉失智相當於或其特徵係bvFTD的症狀。
本揭露關於使用本文中所揭露的寡核苷酸之方法，該寡核苷酸能夠靶向C9orf72且適用於治療C9orf72相關障礙和/或製造用於C9orf72相關障礙的治療劑。在一些實施方式中，寡核苷酸的鹼基序列可以包含與指定鹼基序列具有指定最大數目個錯配的鹼基序列或由其組成。
在一些實施方式中，本揭露關於包含C9orf72寡核苷酸的組成物的用途，其系用於製造用以治療神經退化性疾病的藥劑。
在一些實施方式中，本揭露關於一種治療或改善患者的C9orf72相關障礙之方法，該方法包含以下步驟：將治療有效量的寡核苷酸施用至患者的C9orf72。
在一些實施方式中，本揭露關於一種方法，其包含向動物施用包含C9orf72寡核苷酸的組成物。
在一些實施方式中，動物係受試者，例如人類。
在一些實施方式中，專業醫護人員可鑒別或診斷適合於治療C9orf72相關障礙（諸如施用C9orf72寡核苷酸）的受試者或患者。C9orf72相關疾病係若干神經疾病中的一種。在一些實施方式中，可藉由評估一個或多個症狀，例如運動神經元退化症狀，而將受試者診斷係患有神經疾病。在一些實施方式中，為了診斷神經疾病，可在體檢之後進行徹底的神經檢查。在一些實施方式中，神經檢查可評估運動及感知技能、神經功能、聽覺及話語、視力、協調與平衡、精神狀態以及情感或行為變化。與神經疾病相關的疾病的非限制性症狀可係：手臂、腿部、腳部或腳踝無力；言語不清；腳前部及腳趾抬起困難；手部無力或笨拙；肌肉麻痹；肌肉僵硬；非自主性抖動或書寫動作（舞蹈症）；非自主性持續肌肉攣縮（肌張力障礙）；動作遲緩；自發運動喪失；姿勢及平衡減弱；缺少靈活性；身體部位麻刺；跟隨頭部動作出現的電擊感覺；手臂、肩部及舌頭抽搐；吞咽困難；呼吸困難；咀嚼困難；視力部分或完全喪失；複視；眼球運動緩慢或異常；震顫；步態不穩；疲勞；記憶喪失；眩暈；難以思考或注意集中；閱讀或書寫困難；空間關係誤判；迷失方向；抑鬱；焦慮；難以進行決定及判斷；衝動控制喪失；難以計畫及進行熟悉任務；攻擊性；煩躁；社交退縮；情緒波動；失智；睡眠習慣改變；神志恍惚；食欲改變。
在一些實施方式中，組成物預防、治療、改善C9orf72相關障礙的至少一個症狀或減緩其進程。
在一些實施方式中，動物或人類患有C9orf72相關障礙的症狀。
在一些實施方式中，本揭露關於一種用於將降低C9orf72基因表現的寡核苷酸引入細胞中之方法，該方法包含：使細胞與寡核苷酸或C9orf72寡核苷酸接觸。
在一些實施方式中，本揭露關於一種用於降低有需要的哺乳動物中的C9orf72基因表現之方法，該方法包含：向哺乳動物施用包含針對C9orf72的寡核苷酸的核酸-脂質顆粒。
在一些實施方式中，本揭露關於一種用於體內遞送靶向C9orf72基因表現的寡核苷酸之方法，該方法包含：向哺乳動物施用針對C9orf72的寡核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露關於一種用於治療和/或改善有需要的哺乳動物的與C9orf72相關障礙相關的一個或多個症狀之方法，該方法包含：向哺乳動物施用治療有效量的包含針對C9orf72的寡核苷酸的核酸-脂質顆粒。
在一些實施方式中，本揭露關於一種抑制細胞中的C9orf72表現之方法，該方法包含：(a) 使細胞與針對C9orf72的寡核苷酸接觸；以及 (b) 將產生的細胞維持在步驟 (a) 中達足以獲得C9orf72基因的mRNA轉錄物降解的一段時間，從而抑制C9orf72基因於細胞中的表現。
在一些實施方式中，將C9orf72表現抑制至少30%。
在一些實施方式中，本揭露關於一種治療由C9orf72表現介導的障礙之方法，其包含向需要此類治療的人類施用治療有效量的針對C9orf72的寡核苷酸。
在一些實施方式中，施用引起含有重複擴增的C9orf72轉錄物或其基因產物的表現、活性和/或水平降低。
在一些實施方式中，本揭露關於一種治療C9orf72相關障礙之方法。
在一些實施方式中，本揭露關於以下方法，該方法包括以下步驟：提供包含具有相同mRNA的兩種或更多種不同剪接產物的系統，其中至少一種剪接產物係疾病相關的且至少一種剪接產物係非疾病相關的；將寡核苷酸引入系統中，其中該寡核苷酸與在至少一種疾病相關剪接產物中存在但在至少一種非疾病相關剪接產物中不存在的序列互補，其中相對於該非疾病相關剪接產物的表現、水平和/或活性，該寡核苷酸能夠降低該疾病相關剪接產物的表現、水平和/或活性。
在該方法的一些實施方式中，寡核苷酸與疾病相關剪接產物上存在的內含子-外顯子接點互補，但不與非疾病相關剪接產物上存在的內含子-外顯子接點互補。
在該方法的一些實施方式中，寡核苷酸包含至少一個手性受控核苷酸間鍵聯。
在該方法的一些實施方式中，寡核苷酸係C9orf72寡核苷酸，且系統係患有和/或易患c9orfy2相關障礙的受試者。
在一些實施方式中，向受試者施用第二治療劑或方法。
在一些實施方式中，向受試者施用C9orf72寡核苷酸及一種或多種第二治療劑或方法。
在一些實施方式中，第二治療劑或方法能夠預防、治療、改善神經疾病或減緩其進程。
在一些實施方式中，第二治療劑或方法能夠預防、治療、改善C9orf72相關障礙或減緩其進程。
在一些實施方式中，第二治療劑或方法能夠預防、治療、改善神經疾病或減緩其進程，該第二治療劑或方法選自：內體和/或溶酶體運輸調節劑、麩胺酸受體抑制劑、PIKFYVE激酶抑制劑及鉀通道活化劑。
在一些實施方式中，第二治療劑或方法包含針對二肽重複蛋白質的抗體或者妨礙RNA病灶大量形成或減少RNA病灶數目的藥劑（例如抗體或小分子）。
在一些實施方式中，第二治療劑或方法藉由敲低增加C9orf72的表現、活性和/或水平的基因或其基因產物（作為非限制性實例）而間接降低C9orf72的表現、活性和/或水平。在一些實施方式中，第二治療劑或方法敲低SUPT4H1（人類Spt4直系同源物），其敲低減少了有義及反義C9orf72 RNA病灶以及DPR蛋白質的產生。Kramer等人 2016 Science [科學] 353: 708。在一些實施方式中，第二治療劑或方法係核酸、小分子、基因療法或文獻中描述的其他藥劑或方法，該文獻包括(作為非限制性實例) Mis等人 Mol Neurobiol.[分子神經生物學] 2017年8月; 54(6):4466-4476。
在一些實施方式中，第二治療劑以物理方式與C9orf72寡核苷酸軛合。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸以物理方式與第二寡核苷酸軛合，該第二寡核苷酸（直接或間接地）降低C9orf72的表現、活性和/或水平或適用於治療C9orf72相關障礙的症狀。在一些實施方式中，第一C9orf72寡核苷酸以物理方式與第二C9orf72寡核苷酸軛合，該第二C9orf72寡核苷酸可與第一C9orf72寡核苷酸相同或不同，且可與第一C9orf72寡核苷酸靶向不同或相同或重疊的序列。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸與敲低SUPT4H1的寡核苷酸軛合或共同施用或與其併入同一治療方案中。在一些實施方式中，C9orf72寡核苷酸與第二治療劑軛合或共同施用或與其併入同一治療方案中，該第二治療劑改善與C9orf72相關障礙（諸如ALS或FTD）相關的另一（非C9orf72）基因或基因產物的表現、活性和/或水平，該另一基因或基因產物諸如：SOD1、TARDBP、FUS/TLS、MAPT、TDP-43、SUPT4H1或FUS/TLS。
在一些實施方式中，改善此類基因或基因產物的表現、活性和/或水平尤其包括：降低在疾病病況中過高的此類基因或基因產物的表現、活性和/或水平；增加在疾病病況中過低的此類基因或基因產物的表現、活性和/或水平；和/或降低此類基因或基因產物的突變型和/或疾病相關變體的表現、活性和/或水平。在一些實施方式中，第二治療劑係寡核苷酸。在一些實施方式中，第二治療劑係以物理方式與C9orf72寡核苷酸軛合的寡核苷酸。在一些實施方式中，第二治療劑包含反丁烯二酸單甲酯（MMF）（據報導其活化Nrf2）和/或Ω-3脂肪酸。在一些實施方式中，第二治療劑包含反丁烯二酸單甲酯（MMF）和/或據報導抑制NF-κB的Ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA）。在一些實施方式中，第二治療劑包含反丁烯二酸單甲酯（MMF）與Ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA）的軛合物。在一些實施方式中，第二治療劑係CAT-4001（催化活性藥物公司（Catabasis Pharmaceuticals）, 劍橋, 麻塞諸塞州, 美國）。
在一些實施方式中，第二治療劑能夠預防、治療、改善神經疾病或減緩其進程，該第二治療劑選自：WO 2016/210372中所描述的內體和/或溶酶體運輸調節劑、麩胺酸受體抑制劑、PIKFYVE激酶抑制劑及鉀通道活化劑。在一些實施方式中，鉀通道活化劑係瑞替加濱。在一些實施方式中，麩胺酸受體位於運動神經元（MN）或脊髓運動神經元上。在一些實施方式中，麩胺酸受體係NMDA、AMPA或紅藻胺酸（kainite）。在一些實施方式中，麩胺酸受體抑制劑係AP5（(2R)-胺基-5-磷醯基戊酸；(2R)-胺基-5-磷醯基戊酸酯）、CNQX（6-氰基-7-硝基喹㗁啉-2,3-二酮）或NBQX（2,3-二羥基-6-硝基-7-胺磺醯基-苯并[f]喹㗁啉-2,3-二酮）。
在一些實施方式中，第二治療劑能夠降低與C9orf72相關障礙相關的基因（或其基因產物）的表現、水平和/或活性，該基因諸如SOD1、TARDBP、FUS/TLS、MAPT、TDP-43、SUPT4H1或FUS/TLS。在一些實施方式中，第二治療劑係一種藥劑，其降低與肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）或額顳葉失智（FTD）相關的基因（或其基因產物）的表現、水平和/或活性，該基因諸如SOD1、TARDBP、FUS/TLS、MAPT、TDP-43、SUPT4H1或FUS/TLS。在一些實施方式中，第二治療劑能夠控制過度氧化應激。在一些實施方式中，第二治療劑係Radicava®（依達拉奉）。在一些實施方式中，第二治療劑係熊去氧膽酸（UDCA）。在一些實施方式中，第二治療劑能夠影響神經元，其經由封閉進入神經元的Na+入口且封閉引起運動神經元活躍的化學物質的釋放來降低神經元活性。在一些實施方式中，第二治療劑係利魯唑。在一些實施方式中，第二治療劑能夠：減輕疲勞、緩解肌肉抽筋、控制痙攣和/或減少過多的唾液及痰。在一些實施方式中，第二治療劑能夠減輕疼痛。在一些實施方式中，第二治療劑係非類固醇和/或消炎藥物和/或阿片類。在一些實施方式中，第二治療劑能夠緩解抑鬱、睡眠障礙、吞咽困難、痙攣、唾液吞咽困難和/或便秘。在一些實施方式中，第二治療劑係巴氯芬或安定。在一些實施方式中，第二治療劑係或包含三己芬迪、阿米替林和/或格隆溴銨。在一些實施方式中，第二治療劑係dsRNA或siRNA，其股的序列包含本文中所揭露的任何寡核苷酸的序列中的至少15個連續nt。 藥物組成物
在一些實施方式中，本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含所提供的化合物（例如所提供的寡核苷酸）或其藥學上可接受的鹽、以及藥物載體。在一些實施方式中，寡核苷酸係C9orf72寡核苷酸。
當用作治療劑時，將本文所述之所提供的寡核苷酸或寡核苷酸組成物作為藥物組成物施用。在一些實施方式中，該藥物組成物適用於將寡核苷酸施用至身體中受障礙影響的區域，包括但不限於中樞神經系統。在一些實施方式中，該藥物組成物包含治療有效量的所提供的寡核苷酸或其藥學上可接受的鹽、以及至少一種藥學上可接受的非活性成分，該至少一種藥學上可接受的非活性成分選自藥學上可接受的稀釋劑、藥學上可接受的賦形劑以及藥學上可接受的載體。
如熟悉該項技術者所理解的，可以以其酸、鹼或鹽形式提供本揭露的寡核苷酸。在一些實施方式中，寡核苷酸可以是酸形式，例如對於天然磷酸酯鍵聯，-OP(O)(OH)O-的形式；對於硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，-OP(O)(SH)O-的形式；等。在一些實施方式中，所提供的寡核苷酸可以是鹽形式，例如對於天然磷酸酯鍵聯，以鈉鹽的-OP(O)(ONa)O-的形式；對於硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，以鈉鹽的-OP(O)(SNa)O-的形式；等。在一些實施方式中，每個酸性鍵聯（例如，每個天然磷酸酯鍵聯和每個硫代磷酸酯鍵聯（如果有的話））獨立地以鹽形式（所有鹽形式）存在。在一些實施方式中，寡核苷酸呈全鈉鹽形式。除非另有說明，否則本揭露的寡核苷酸可以以酸、鹼和/或鹽形式存在。
在一些實施方式中，藥物組成物包含治療有效量的所提供的寡核苷酸或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的非活性成分。在一些實施方式中，藥學上可接受的非活性成分選自藥學上可接受的稀釋劑、藥學上可接受的賦形劑和藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，藥學上可接受的非活性成分係藥學上可接受的載體。
在一些實施方式中，本揭露提供了藥物組成物，其包含與藥學上可接受的非活性成分（例如藥學上可接受的賦形劑，藥學上可接受的載體等）混合的手性受控的寡核苷酸或其組成物。熟悉該項技術者將認識到，藥物組成物包括所提供的寡核苷酸或組成物的藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，藥物組成物係手性受控的寡核苷酸組成物。在一些實施方式中，藥物組成物係立體純的寡核苷酸組成物。
在一些實施方式中，本揭露提供寡核苷酸的鹽及其藥物組成物。在一些實施方式中，鹽係藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，藥物組成物包含視需要以其鹽形式的寡核苷酸和鈉鹽。在一些實施方式中，藥物組成物包含視需要以其鹽形式的寡核苷酸和氯化鈉。在一些實施方式中，寡核苷酸的可以給至鹼的每個氫離子（例如，在水溶液、藥物組成物等的條件下）被非H+ 陽離子替換。例如，在一些實施方式中，寡核苷酸的藥學上可接受的鹽係全金屬離子鹽，其中每個核苷酸間鍵聯（例如天然磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯等）的每個氫離子（例如-OH、-SH等）被金屬離子替換。用於藥物組成物的各種合適的金屬鹽在本領域中是眾所周知的，並且可以根據本揭露使用。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鈉鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鎂鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鈣鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係鉀鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係銨鹽（陽離子N(R)4 + ）。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽包含一種且不超過一種類型的陽離子。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽包含兩種或更多種類型的陽離子。在一些實施方式中，陽離子係Li+ 、Na+ 、K+ 、Mg2+ 或Ca2+ 。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係全鈉鹽。在一些實施方式中，藥學上可接受的鹽係全鈉鹽，其中為天然磷酸酯鍵聯（酸形式-O-P(O)(OH)-O-）（如果存在的話）的每個核苷酸間鍵聯以其鈉鹽形式（-O-P(O)(ONa)-O-）存在，並且為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯（酸形式-O-P(O)(SH)-O-）（如果存在的話）的每個核苷酸間鍵聯以其鈉鹽形式（O-P(O)(SNa)-O-）存在。
藥學上可接受的鹽通常是熟悉該項技術者所熟知的，並且可以包括例如但不限於乙酸鹽、苯磺酸鹽（benzenesulfonate）、苯磺酸鹽（besylate）、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙二胺四乙酸鈣、牛磺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、丙酸酯月桂硫酸鹽（estolate）、酚磺乙胺（esylate）、延胡索酸鹽、葡萄糖酸鹽（gluceptate）、葡糖酸鹽（gluconate）、麩胺酸鹽、乙醇醯胺基苯胂酸鹽（glycollylarsanilate）、己基間苯二酚鹽（hexylresorcinate）、海巴明（hydrabamine）、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、苦杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、黏酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽（pamoate/embonate）、泛酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、鹼式乙酸鹽（subacetate）、琥珀酸鹽、硫酸鹽、丹寧酸鹽、酒石酸鹽、或茶氯酸鹽（teoclate）。其他藥學上可接受的鹽可以例如在，Remington, The Science and Practice of Pharmacy[雷明頓：藥學科學與實踐]，（第20版 2000）中找到。較佳的藥學上可接受的鹽包括，例如，乙酸鹽、苯甲酸鹽、溴化物、碳酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、萘磺酸鹽、雙羥萘酸鹽（pamoate、embonate）、磷酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽或酒石酸鹽。
根據本揭露，可以利用本領域已知的用於遞送核酸和/或寡核苷酸的各種技術。例如，多種超分子奈米載體可用於遞送核酸。示例奈米載體包括但不限於脂質體、陽離子聚合物複合物、和各種聚合物。核酸與各種聚陽離子的複合係用於細胞內遞送的另一種方法；這包括使用聚乙二醇化的聚陽離子、聚乙烯胺（PEI）複合物、陽離子嵌段共聚物、和樹狀聚合物。若干種陽離子奈米載體（包括PEI和聚醯胺樹狀聚合物）有助於從內體釋放內容物。其他方法包括使用聚合奈米粒子、微球、脂質體、樹狀聚合物、生物可降解聚合物、軛合物、前驅藥、如硫或鐵的無機膠體、抗體、移植物、生物可降解移植物、生物可降解微球、滲透受控移植物、脂質奈米粒子、乳液、油性溶液、水溶液、生物可降解聚合物、聚乳酸羥基乙酸共聚物（poly(lactide-coglycolic acid)）、聚(乳酸)、液體儲存物、聚合物微胞、量子點以及脂複合物。在一些實施方式中，寡核苷酸與另一分子軛合。
在治療和/或診斷應用中，本揭露的化合物例如寡核苷酸可以配製用於多種施用方式，包括全身和局部（topical或localized）施用。技術和配製物通常可以在Remington, The Science and Practice of Pharmacy [藥物科學與實踐]（第20版 2000年）中找到。
在一些實施方式中，所提供的C9orf72與適合用於遞送至中樞神經系統的另一化學部分軛合，該化學部分選自：葡萄糖、GluNAc（N-乙醯葡糖胺）及茴香醯胺。
在一些實施方式中，與寡核苷酸軛合的另外的化學部分能夠將寡核苷酸靶向神經系統中的細胞。
在一些實施方式中，與所提供的寡核苷酸軛合的另外的化學部分包含茴香醯胺或其衍生物或類似物，且能夠使所提供的寡核苷酸靶向表現特定受體（如σ 1受體）的細胞。
在一些實施方式中，對所提供的寡核苷酸進行配製以施用至表現其靶標的身體細胞和/或組織。
在一些實施方式中，與C9orf72寡核苷酸軛合的另一化學部分能夠使C9orf72寡核苷酸靶向神經系統中的細胞。
在一些實施方式中，與C9orf72寡核苷酸軛合的另一化學部分包含茴香醯胺或其衍生物或類似物，且能夠使C9orf72寡核苷酸靶向表現特定受體（諸如δ1受體）的細胞。
在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸經配製以用於施用至表現C9orf72的身體細胞和/或組織。在一些實施方式中，這樣的身體細胞和/或組織係中樞神經系統的神經元或細胞和/或組織。在一些實施方式中，本文中所描述的寡核苷酸及組成物在中樞神經系統內的廣泛分佈可利用腦實質內施用、鞘內施用或腦室內施用來達成。
在一些實施方式中，配製藥物組成物用於靜脈內注射、口服施用、口腔施用、吸入、鼻腔施用、局部施用、眼部施用或耳部施用。在一些實施方式中，藥物組成物係片劑、丸劑、膠囊、液體、吸入劑、鼻噴霧劑溶液、栓劑、懸浮液、凝膠、膠體、分散體、懸浮液、溶液、乳液、軟膏、洗液、滴眼液、或滴耳液。
在一些實施方式中，本揭露提供了藥物組成物，該藥物組成物包含與藥學上可接受的賦形劑混合的手性受控的寡核苷酸或其組成物。熟悉該項技術者將認識到，藥物組成物包括上文所述之手性受控的寡核苷酸的藥學上可接受的鹽、或其組成物。
多種超分子奈米載體可用於遞送核酸。示例奈米載體包括但不限於脂質體、陽離子聚合物複合物、和各種聚合物。核酸與各種聚陽離子的複合係用於細胞內遞送的另一種方法；這包括使用聚乙二醇化的聚陽離子、聚乙烯胺（PEI）複合物、陽離子嵌段共聚物、和樹狀聚合物。若干種陽離子奈米載體（包括PEI和聚醯胺樹狀聚合物）有助於從內體釋放內容物。其他方法包括使用聚合奈米粒子、微球、脂質體、樹狀聚合物、生物可降解聚合物、軛合物、前驅藥、如硫或鐵的無機膠體、抗體、移植物、生物可降解移植物、生物可降解微球、滲透受控移植物、脂質奈米粒子、乳液、油性溶液、水溶液、生物可降解聚合物、聚乳酸羥基乙酸共聚物（poly(lactide-coglycolic acid)）、聚(乳酸)、液體儲存物、聚合物微胞、量子點以及脂複合物。在一些實施方式中，寡核苷酸與另一分子軛合。
除本文所述之示例遞送策略以外，還已知另外的核酸遞送策略。
在治療和/或診斷應用中，本揭露的化合物可以配製用於多種施用方式，包括全身和局部（topical或localized）施用。技術和配製物通常可以在Remington, The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥學科學與實踐]，（第20版 2000）中找到。
所提供的寡核苷酸及其組成物在寬劑量範圍內有效。例如，在治療成年人時，每天約0.01至約1000 mg、約0.5至約100 mg、約1至約50 mg以及每天約5至約100 mg的劑量係可以使用的劑量實例。準確的劑量將取決於施用途徑、施用的化合物的形式、待治療的受試者、待治療的受試者的體重、以及主治醫師的偏好和經驗。
在一些實施方式中，所提供的C9orf72寡核苷酸配製於以下文獻中所描述d 藥物組成物中：美國申請案號61/774759；2013年12月19日提交的61/918,175、61/918,927；61/918,182；61/918941；62/025224；62/046487；或者國際申請案號PCT/US 04/042911、PCT/EP 2010/070412、或PCT/IB 2014/059503。
取決於所治療的具體病症，可將這類試劑配製成液體或固體劑型，並全身或局部施用。如熟悉該項技術者已知的，可以例如以定時或持續低釋放形式遞送該試劑。配製和施用的技術可以在Remington, The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥學科學與實踐], （第20版 2000）中找到。合適的途徑可包括口服、口腔、藉由吸入噴霧、舌下、直腸、透皮、陰道、穿黏膜、鼻或腸施用；腸外遞送，包括肌內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈內、關節內、胸骨內、滑膜內、肝內、病灶內、顱內、腹膜內、鼻內或眼內注射，或其他遞送方式。
對於注射劑，本揭露的試劑可以在水性溶液中進行配製和稀釋，如在生理相容性緩衝液中，例如漢克氏（Hank's）溶液、格林氏（Ringer's）溶液、或生理鹽水緩衝液。對於這種穿黏膜施用，在配製物中使用適於障礙物滲透的滲透劑。此類滲透劑係本領域公知的。
使用藥學上可接受的惰性載體將本文揭露的用於實施本揭露的化合物配製成適於全身施用的劑量在本揭露的範圍內。藉由適當選擇載體和合適的製造方法，本揭露的組成物，特別是配製成溶液的組成物，可以胃腸外施用，例如藉由靜脈內注射。
可以使用本領域熟知的藥學上可接受的載體將化合物（例如寡核苷酸）容易地配製成適於口服施用的劑量。此類載體使得本揭露的化合物被配製成片劑、丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，用於被待治療的受試者（例如患者）口服攝取。
對於鼻或吸入遞送，本揭露的試劑也可以藉由熟悉該項技術者已知之方法配製，並且可以包括例如但不限於增溶、稀釋或分散物質（如，鹽水、防腐劑（如苯甲醇）、吸收促進劑和碳氟化合物）的實例。
在一些實施方式中，寡核苷酸或組成物作為包含有效量的寡核苷酸或組成物和藥學上可接受的載體的藥物組成物施用。在一些實施方式中，組成物係手性受控的。在一些實施方式中，組成物包含寡核苷酸的一種或多種藥學上可接受的鹽形式。在一些實施方式中，組成物係液體組成物。在一些實施方式中，液體組成物具有約中性的pH（例如約pH 7）。在一些實施方式中，液體組成物的pH為約7.4。在一些實施方式中，液體組成物包含緩衝液。
在某些實施方式中，寡核苷酸和組成物遞送至CNS。在某些實施方式中，寡核苷酸和組成物遞送至腦脊液。在某些實施方式中，寡核苷酸和組成物施用至腦實質。在某些實施方式中，寡核苷酸和組成物藉由鞘內施用或腦室內施用而遞送至動物/受試者。本文所述之寡核苷酸和組成物在中樞神經系統內的廣泛分佈可藉由實質內施用、鞘內施用、或腦室內施用來實現。
在某些實施方式中，腸胃外施用藉由注射進行，例如藉由針筒、泵等進行。在某些實施方式中，注射係快速濃注。在某些實施方式中，注射直接施用至組織，如紋狀體、尾狀核、皮質、海馬、和小腦。
在某些實施方式中，特異性定位藥劑之方法（如，藉由快速濃注）將中值有效濃度（EC50）降低20、25、30、35、40、45或50倍。在某些實施方式中，藥劑係如本文中進一步描述的反義化合物。在某些實施方式中，靶組織係腦組織。在某些實施方式中，靶組織係紋狀體組織。在某些實施方式中，降低EC50係所希望的，因為這減少了在有需要的患者中實現藥理學結果所需的劑量。
在某些實施方式中，反義寡核苷酸藉由注射或輸注遞送，每個月、每兩個月、每90天、每3個月、每6個月一次；一年兩次或一年一次。
適於在本揭露中使用的藥物組成物包括以下組成物，其中該組成物包含有效量的活性成分以實現它的預期目標。有效量的確定完全在熟悉該項技術者的能力之內，尤其是根據於本文提供的具體揭露內容。
除活性成分外，該等藥物組成物可以含有合適的藥學上可接受的載體（包含賦形劑和助劑），該等載體有助於將活性化合物加工成可藥用的製劑。用於口服施用而配製的製劑可以呈片劑、糖衣丸、膠囊或溶液的形式。
用於口服使用的藥物製劑可藉由以下方法獲得：將活性化合物（例如，寡核苷酸）與固體賦形劑組合，視需要研磨所得混合物，並加工該顆粒混合物（如果希望的話，在添加合適的助劑之後），以獲得片劑或糖衣丸芯。合適的賦形劑尤其是填充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素製劑，例如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉（CMC）、和/或聚乙烯吡咯啶酮（PVP：聚維酮（povidone））。如果需要，可添加崩解劑，如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂、或海藻酸或其鹽（如海藻酸鈉）。
在一些實施方式中，糖衣丸芯提供有合適的包衣。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，該糖溶液可以視需要含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波姆膠、聚乙二醇（PEG）、和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。可以將染料或顏料添加到片劑或糖衣丸包衣中，以用於標識或表徵活性化合物劑量的不同組合。
可口服使用的藥物製劑包括由明膠製成的插接式膠囊（push-fit capsule）以及由明膠與增塑劑（如甘油或山梨醇）製成的密封式軟膠囊。插接式膠囊可以包含與填充劑（如乳糖）、黏合劑（如澱粉）和/或潤滑劑（如滑石或硬脂酸鎂）以及視需要穩定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解或懸浮在合適的液體，如脂肪油、液體石蠟、或液體聚乙二醇（PEG）中。此外，還可以添加穩定劑。
可藉由將活性化合物（例如，寡核苷酸）與脂質組合來獲得組成物。在一些實施方式中，脂質與活性化合物軛合。在一些實施方式中，脂質不與活性化合物軛合。在一些實施方式中，脂質包含C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂肪族鏈。在一些實施方式中，脂質包含視需要經一個或多個C1-4 脂肪族基團取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂肪族鏈。在一些實施方式中，脂質選自由以下組成之群組：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、二十二碳六烯酸（順-DHA）、喇叭藻酸和二亞油基。在一些實施方式中，活性化合物係本文所述之任何寡核苷酸或其他核酸。在一些實施方式中，活性化合物係具有包含表A1中所列的任何核酸的任何序列或由該序列組成的序列的核酸。在一些實施方式中，組成物包含脂質和活性化合物，且進一步包含選自以下的另一組分：另一脂質和靶向性化合物或部分。在一些實施方式中，脂質包括但不限於：胺基脂質；兩親脂質；陰離子脂質；載脂蛋白；陽離子脂質；低分子量陽離子脂質；如CLinDMA和DLinDMA的陽離子脂質；可電離陽離子脂質；掩蔽組分；輔助脂質；脂肽；中性脂質；中性兩性離子脂質；疏水性小分子；疏水性維生素；PEG-脂質；被一個或多個親水性聚合物修飾的不帶電脂質；磷脂；如1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺的磷脂；隱形脂質；固醇；膽固醇；以及靶向性脂質；以及本文所述或本領域所報導的任何其他脂質。在一些實施方式中，組成物包含脂質和能夠介導另一脂質的至少一種功能的另一脂質的一部分。在一些實施方式中，靶向性化合物或部分能夠使化合物（例如，包含脂質和活性化合物的組成物）靶向特定細胞或組織或者細胞或組織的亞組。在一些實施方式中，靶向性部分被設計成用於利用特定靶標、受體、蛋白質或其他亞細胞組分的細胞特異性或組織特異性表現；在一些實施方式中，靶向部分係將組成物靶向細胞或組織和/或結合至靶標、受體、蛋白質或其他亞細胞組分的配位基（例如，小分子、抗體、肽、蛋白質、碳水化合物、適體等）。
用於製備用於遞送活性化合物的組成物的某些示例脂質允許（例如，不阻止或干擾）活性化合物的功能。非限制性例示性脂質包括：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、二十二碳六烯酸（順-DHA）、喇叭藻酸（turbinaric acid）和二亞油基。
如本揭露中所述，脂質軛合（如與脂肪酸軛合）可改善寡核苷酸的一個或多個特性。
在一些實施方式中，用於遞送活性化合物的組成物能夠將活性化合物根據需要靶向特定細胞或組織。在一些實施方式中，用於遞送活性化合物的組成物能夠將活性化合物靶向肌肉細胞或組織。在一些實施方式中，本揭露關於與活性化合物的遞送相關的組成物及方法，其中組成物包含活性化合物、脂質。在關於肌肉細胞或組織的各種實施方式中，脂質選自：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、二十二碳六烯酸（順-DHA）、喇叭藻酸和二亞油基。
在一些實施方式中，將包含寡核苷酸的組成物凍乾。在一些實施方式中，將包含寡核苷酸的組成物凍乾，並將凍乾的寡核苷酸置於小瓶中。
根據待治療或預防的具體障礙，通常被施用以治療或預防該病症的另外的治療劑可與本揭露的C9orf寡核苷酸一起施用。
在一些實施方式中，與第一C9orf72寡核苷酸一起施用的第二治療劑係不同的第二C9orf72寡核苷酸。
在一些實施方式中，本文中所揭露的C9orf72寡核苷酸可用於用以預防和/或治療C9orf72相關障礙或其症狀之方法，或用於製造該方法中使用的藥劑。
在一些實施方式中，本揭露提供了以下示例實施方式： 1.  一種寡核苷酸，該寡核苷酸包含糖、鹼基或核苷酸間鍵聯的至少一種修飾，其中該寡核苷酸的鹼基序列係或包含與C9orf72基因或其轉錄物的鹼基序列至少80%相同或互補的鹼基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續鹼基，並且該寡核苷酸的3'端上的核鹼基視需要被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換。 2.  一種寡核苷酸，該寡核苷酸包含糖、鹼基或核苷酸間鍵聯的至少一種修飾，其中該寡核苷酸的鹼基序列包含與C9orf72基因或其轉錄物的鹼基序列相同或互補的鹼基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續鹼基。 3.  如實施方式1所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含與C9orf72基因或其轉錄物的鹼基序列相同或互補的鹼基序列的至少19個連續鹼基。 4.  如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列與C9orf72基因或其轉錄物的鹼基序列或其任何部分不完全相同或互補。 5.  如實施方式4所述之寡核苷酸，其中當該寡核苷酸的鹼基序列進行比對以獲得最大互補性時，在其3'端包含錯配，該錯配不是選自A和T、A和U、以及C和G的鹼基配對。 6.  如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3’端核苷係肌苷。 7.  如實施方式1-3所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列與C9orf72基因或其轉錄物的鹼基序列完全相同或互補。 8.  如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列係ACTCACCCACTCGCCACCGC。 9.  如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中在施用至包含含有重複擴增的C9orf72轉錄物的系統時，該寡核苷酸降低該C9orf72轉錄物的水平。 10.      如實施方式9所述之寡核苷酸，其中該含有重複擴增的C9orf72轉錄物包含至少30、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個GGGGCC重複序列。 11.      如實施方式10所述之寡核苷酸，其中如藉由百分比所測量，該含有重複擴增的C9orf72轉錄物的水平降低係不含重複擴增的C9orf72轉錄物的水平降低的至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10倍。 12.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸與C9orf72外顯子1a、內含子1、外顯子1b或外顯子2中的位點雜交。 13.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個核苷酸間鍵聯，其中該鍵聯磷呈Sp組態。 14.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含核心和至少兩個翼，其中每個核心和每個翼獨立地包含一個或多個核苷。 15.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含以下或由以下組成：5'-翼-核心-翼-3’結構。 16.      如實施方式14-15中任一項所述之寡核苷酸，其中5'-翼的糖修飾模式與3'-翼的糖修飾模式不同。 17.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中每個翼糖獨立地包含2'-修飾。 18.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中每個翼糖獨立地包含2’-OR修飾，其中R係視需要經取代的C1-6 脂肪族。 19.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中一個翼包含2’-OMe，且另一個翼不包含。 20.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中一個翼包含2’-MOE，且另一個翼不包含。 21.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中一個翼包含2’-OMe且不包含2’-MOE，且另一個翼包含2’-MOE且不包含2’-OMe。 22.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中該5'-翼包含一個或多個2'-OMe修飾的糖和一個或多個2’-MOE修飾的糖。 23.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中每個5’翼糖獨立地是2’-OR修飾的糖，其中R係視需要經取代的C1-6 脂肪族。 24.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中該3'-翼包含一個或多個2'-OMe修飾的糖和一個或多個2’-MOE修飾的糖。 25.      如實施方式15-16中任一項所述之寡核苷酸，其中該5'-翼在其5'端和3'端包含2'-OMe修飾的糖，並且在該5'-翼中的其他每個糖獨立地是2'-MOE修飾的糖。 26.      如實施方式15-25中任一項所述之寡核苷酸，其中該5'-翼包含一個或多個天然磷酸酯鍵聯。 27.      如實施方式15-26中任一項所述之寡核苷酸，其中該5'-翼包含一個或多個一個或多個修飾的核苷酸間鍵聯。 28.      如實施方式27所述之寡核苷酸，其中與該5'-翼的5'的兩個5'-翼核苷鍵合的第一核苷酸間鍵聯係經修飾的核苷酸間鍵聯。 29.      如實施方式26-28中任一項所述之寡核苷酸，其中鍵合到兩個5’-翼核苷的彼此的核苷酸間鍵聯係天然磷酸酯鍵聯。 30.      如實施方式26-29中任一項所述之寡核苷酸，其中每個經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。 31.      如實施方式26-29中任一項所述之寡核苷酸，其中一個或多個經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。 32.      如實施方式26-29和31中任一項所述之寡核苷酸，其中一個或多個經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。 33.      如實施方式30-32中任一項所述之寡核苷酸，其中每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯係Sp。 34.      如實施方式15-33中任一項所述之寡核苷酸，其中該5'-翼包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核鹼基。 35.      如實施方式15-33中任一項所述之寡核苷酸，其中該5'-翼含有5個且不超過5個核鹼基。 36.      如實施方式15-35中任一項所述之寡核苷酸，其中每個3’-翼糖獨立地是2’-OR修飾的糖，其中R係視需要經取代的C1-6 脂肪族。 37.      如實施方式15-35中任一項所述之寡核苷酸，其中該3'-翼包含一個或多個2'-OMe修飾的糖和一個或多個2’-MOE修飾的糖。 38.      如實施方式15-35中任一項所述之寡核苷酸，其中每個3’-翼糖獨立地是2’-OMe修飾的糖。 39.      如實施方式15-38中任一項所述之寡核苷酸，其中與兩個3’-翼糖鍵合的一個或多個核苷酸間鍵聯獨立地是經修飾的核苷酸間鍵聯。 40.      如實施方式15-39中任一項所述之寡核苷酸，其中與兩個3’-翼糖鍵合的一個或多個核苷酸間鍵聯係天然磷酸酯鍵聯。 41.      如實施方式15-38中任一項所述之寡核苷酸，其中鍵合到兩個3’-翼糖的每個核苷酸間鍵聯獨立地是經修飾的核苷酸間鍵聯。 42.      如實施方式39-41中任一項所述之寡核苷酸，其中每個經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。 43.      如實施方式39-41中任一項所述之寡核苷酸，其中一個或多個經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。 44.      如實施方式39-41和43中任一項所述之寡核苷酸，其中一個或多個經修飾的核苷酸間鍵聯獨立地是不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。 45.      如實施方式42-44中任一項所述之寡核苷酸，其中每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯係Sp。 46.      如實施方式14-45中任一項所述之寡核苷酸，其中該3'-翼包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核鹼基。 47.      如實施方式46所述之寡核苷酸，其中該3'-翼含有5個且不超過5個核鹼基。 48.      如實施方式46所述之寡核苷酸，其中該3'-翼含有4個且不超過4個核鹼基。 49.      如實施方式46所述之寡核苷酸，其中該3'-翼含有3個且不超過3個核鹼基。 50.      如實施方式14-49中任一項所述之寡核苷酸，其中該核心不包含含有2’-OR的糖。 51.      如實施方式14-50中任一項所述之寡核苷酸，其中每個核心糖獨立地包含兩個2’-H。 52.      如實施方式14-51中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸或該核心包含以下的骨架手性中心（鍵聯磷）模式： (Np)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y， 其中： t係1-50； n係1-10； m係1-50； y係1-10； Np係Rp或Sp； Sp表示手性修飾的核苷酸間鍵聯的手性鍵聯磷的S組態； Op表示天然磷酸酯鍵聯的非手性鍵聯磷；並且 Rp表示手性修飾的核苷酸間鍵聯的手性鍵聯磷的S組態；並且 y係1-10。 53.      如實施方式52所述之寡核苷酸，其中該核心包含(Np)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y的骨架手性中心模式。 54.      如實施方式52所述之寡核苷酸，其中該核心的骨架手性中心模式係(Np)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y。 55.      如實施方式52-54中任一項所述之寡核苷酸，其中每個Np係Sp。 56.      如實施方式52-55中任一項所述之寡核苷酸，其中該模式包含至少一個Rp。 57.      如實施方式52-55中任一項所述之寡核苷酸，其中該模式係(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y。 58.      如實施方式52-57中任一項所述之寡核苷酸，其中至少一個n係1。 59.      如實施方式52-57中任一項所述之寡核苷酸，其中每個n係1。 60.      如實施方式52-59中任一項所述之寡核苷酸，其中y係1。 61.      如實施方式52-59中任一項所述之寡核苷酸，其中y係2。 62.      如實施方式52-61中任一項所述之寡核苷酸，其中t係2或更大。 63.      如實施方式52-61中任一項所述之寡核苷酸，其中t係3或更大。 64.      如實施方式52-61中任一項所述之寡核苷酸，其中t係2-20。 65.      如實施方式52-61中任一項所述之寡核苷酸，其中t係3-20。 66.      如實施方式52-65中任一項所述之寡核苷酸，其中至少一個m係2-20。 67.      如實施方式52-66中任一項所述之寡核苷酸，其中至少一個m係2。 68.      如實施方式52-65中任一項所述之寡核苷酸，其中至少一個m係3、4、5、6、7、8、9或10。 69.      如實施方式52-68中任一項所述之寡核苷酸，其中每個m獨立地是2-20。 70.      如實施方式52-69中任一項所述之寡核苷酸，其中[(Op/Rp)n(Sp)m]y的第一次出現從5’係RpSpSp。 71.      如實施方式52-69中任一項所述之寡核苷酸，其中[(Op/Rp)n(Sp)m]y的第一次出現從5’係RpSpSpSp。 72.      如實施方式52-69中任一項所述之寡核苷酸，其中[(Op/Rp)n(Sp)m]y的第一次出現從5’係RpSpSpSpSp。 73.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列包含與該GGGGCC重複序列不相同或不互補的序列。 74.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列包含與任何重複序列不相同或不互補的序列。 75.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列與該GGGGCC重複序列不相同或不互補。 76.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列包含靶向C9orf72內含子序列的序列。 77.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列包含與C9orf72基因或其轉錄物的內含子的鹼基序列相同或互補的鹼基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續鹼基。 78.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列包含與C9orf72基因或其轉錄物的特徵鹼基序列相同或互補的鹼基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續鹼基。 79.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸優先降低疾病相關C9orf72產物的水平。 80.      如實施方式79所述之寡核苷酸，其中該產物係包含擴增的GGGGCC重複序列的轉錄物。 81.      如實施方式79所述之寡核苷酸，其中該產物係包含至少30、50、100、200、300、400或500個GGGGCC重複序列的轉錄物。 82.      如實施方式79所述之寡核苷酸，其中該產物係包含擴增的GGGGCC重複序列的反義轉錄物。 83.      如實施方式79所述之寡核苷酸，其中該產物係二肽重複蛋白質。 84.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中每個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯係n001。 85.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，該寡核苷酸包含具有PIII-1、PIII-2、PIII-5、PIII-6、PV-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5和PV-6結構的鍵聯。 86.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，該寡核苷酸包含具有PV-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5和PV-6結構的鍵聯。 87.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，該寡核苷酸包含具有PIII-1、PIII-2、PV-1、PV-2、PV-3或PV-4結構的鍵聯。 88.      如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，該寡核苷酸包含具有PV-1、PV-2、PV-3或PV-4結構的鍵聯。 89.      如實施方式1-142中任一項所述之寡核苷酸，其中每個手性核苷酸間鍵聯獨立地具有PIII-1、PIII-2、PIII-5、PIII-6、PV-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5和PV-6結構。 90.      如實施方式1-142中任一項所述之寡核苷酸，其中每個手性核苷酸間鍵聯獨立地具有PV-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5和PV-6結構。 91.      如實施方式1-142中任一項所述之寡核苷酸，其中每個手性核苷酸間鍵聯獨立地具有PIII-1、PIII-2、PV-1、PV-2、PV-3或PV-4結構。 92.      如實施方式1-142中任一項所述之寡核苷酸，其中每個手性核苷酸間鍵聯獨立地具有PV-1、PV-2、PV-3或PV-4結構。 93.      一種寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-17819、WV-17820、WV-17821、WV-17822、WV-17885、WV-18851、WV-18852、WV-20761、WV-20762、WV-20763、WV-20764、WV-20765、WV-20766、WV-20767、WV-20768、WV-20769、WV-20770、WV-20771、WV-20772、WV-20773、WV-20774、WV-20775、WV-21145、WV-21146、WV-21147、WV-21148、WV-21149、WV-21150、WV-21151、WV-21152、WV-21153、WV-21154、WV-21155、WV-21156、WV-21157、WV-21158、WV-21159、WV-21160、WV-21161、WV-21162、WV-21163、WV-21164、WV-21165、WV-21166、WV-21167、WV-21168、WV-21169、WV-21170、WV-21171、WV-21172、WV-21173、WV-21174、WV-21206、WV-21207、WV-21208、WV-21209、WV-21259、WV-21344、WV-21345、WV-21346、WV-21347、WV-21442、WV-21443、WV-21445、WV-21446、WV-21506、WV-21507、WV-21508、WV-21509、WV-21510、WV-21511、WV-21512、WV-21513、WV-21514、WV-21515、WV-21516、WV-21517、WV-21518、WV-21519、WV-21520、WV-21521、WV-21522、WV-21523、WV-21524、WV-21525、WV-21526、WV-21552、WV-21553、WV-21554、WV-21555、WV-21556、WV-21557、WV-21558、WV-21559、WV-21560、WV-21561、WV-21562、WV-21563、WV-21564、WV-21565、WV-21566、WV-21567、WV-21568、WV-21569、WV-21570、WV-23435、WV-23436、WV-23437、WV-23438、WV-23439、WV-23440、WV-23441、WV-23442、WV-23443、WV-23444、WV-23453、WV-23454、WV-23455、WV-23456、WV-23457、WV-23458、WV-23459、WV-23460、WV-23461、WV-23462、WV-23486、WV-23487、WV-23488、WV-23489、WV-23490、WV-23491、WV-23492、WV-23493、WV-23494、WV-23495、WV-23496、WV-23497、WV-23498、WV-23503、WV-23648、WV-23649、WV-23650、WV-23740、WV-23741、WV-23742、WV-26633、WV-27092、WV-27093、WV-27094、WV-27095、WV-27104、WV-27105、WV-27106、WV-27107、WV-27108、WV-27109、WV-27110、WV-27134、WV-27135、WV-27136、WV-27137、WV-27138、WV-27139、WV-27140、WV-27141、WV-27142、WV-27143、WV-27144、WV-30206、WV-30210、WV-30211、或WV-30212。 94.      如實施方式67所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23491、WV-21445、WV-23457、WV-23453、WV-23742、WV-23741、WV-21522、WV-21446、WV-23486、WV-23457、WV-21522、WV-23453、WV-23487、或WV-30206、WV-30210、WV-30211、或WV-30212。 95.      如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23491。 96.      如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-21445。 97.      如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23457。 98.      如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23453。 99.      如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23742。 100.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23741。 101.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-21522。 102.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-21446。 103.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23486。 104.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23457。 105.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-21522。 106.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23453。 107.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-23487。 108.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-30206。 109.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-30210。 110.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-30211。 111.    如實施方式93所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係WV-30212。 112.    如實施方式93-111中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸呈鹽形式。 113.    如實施方式93-111中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸呈藥學上可接受的鹽形式。 114.    一種寡核苷酸，其中該寡核苷酸係如實施方式93-113中任一項所述之或表A1的寡核苷酸，其中每個Sp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地被PV-3或PV-5替換。 115.    如實施方式114所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係如實施方式93-113中任一項所述之寡核苷酸，其中每個Sp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地被PV-3替換。 116.    一種寡核苷酸，其中該寡核苷酸係如實施方式93-115中任一項所述之或表A1的寡核苷酸，其中每個Rp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地被PV-4或PV-6替換。 117.    一種寡核苷酸，其中該寡核苷酸係如實施方式93-115中任一項所述之或表A1的寡核苷酸，其中每個Rp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地被PV-4替換。 118.    如實施方式114-115中任一項所述之寡核苷酸，其中每個Rp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地被PV-4或PV-6替換。 119.    如實施方式114-115中任一項所述之寡核苷酸，其中每個Rp硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地被PV-4替換。 120.    一種寡核苷酸，其中該寡核苷酸係如實施方式93-115中任一項所述之或表A1的寡核苷酸，其中每個Rp不帶負電荷的核苷酸間鍵聯獨立地被PV-1替換。 121.    如實施方式114-119中任一項所述之寡核苷酸，其中每個Rp不帶負電荷的核苷酸間鍵聯獨立地被PV-1替換。 122.    一種寡核苷酸，其中該寡核苷酸係如實施方式93-115中任一項所述之或表A1的寡核苷酸，其中每個Sp不帶負電荷的核苷酸間鍵聯獨立地被PV-2替換。 123.    如實施方式114-121中任一項所述之寡核苷酸，其中每個Sp不帶負電荷的核苷酸間鍵聯獨立地被PV-2替換。 124.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中每個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯獨立地是n001。 125.    如實施方式114-124中任一項所述之寡核苷酸，其中每個天然磷酸酯鍵聯獨立地被寡核苷酸合成中使用的先質替換。 126.    如實施方式114-125中任一項所述之寡核苷酸，其中每個天然磷酸酯鍵聯獨立地被
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替換。 127.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中RAU 的一次或多次出現獨立地是視需要經取代的苯基。 128.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中RAU 的一次或多次出現獨立地是視需要經取代的C1-6 脂肪族。 129.    如實施方式1-127中任一項所述之寡核苷酸，其中每個RAU 係-Ph。 130.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中R’的一次或多次出現獨立地是-C(O)R。 131.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中每個R’獨立地是-C(O)R。 132.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中每個R’獨立地是-C(O)CH3 。 133.    如實施方式1所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係如實施方式93-132中任一項所述之寡核苷酸。 134.    一種寡核苷酸，該寡核苷酸包含糖、鹼基或核苷酸間鍵聯的至少一種修飾，其中該寡核苷酸的鹼基序列包含與靶標基因或其轉錄物的鹼基序列相同或互補的鹼基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續鹼基，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基視需要被選自I、A、T、U、G和C的不同核鹼基替換。 135.    如實施方式1-134中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換。 136.    如實施方式1-135中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換，其中該替換在該寡核苷酸和在該位置的靶標核酸之間引入錯配。 137.    如實施方式1-135中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換，其中該替換在該寡核苷酸和在該位置的靶標核酸之間引入擺動鹼基對。 138.    如實施方式1-135中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換，其中該替換提高該寡核苷酸的活性。 139.    如實施方式1-138中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換，其中該替換將該寡核苷酸的活性提高至少25%。 140.    如實施方式1-138中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換，其中該替換將該寡核苷酸的活性提高至少50%。 141.    如實施方式1-138中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換，其中該替換將該寡核苷酸的活性提高至少100%。 142.    如實施方式1-138中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換，其中該替換將該寡核苷酸的活性提高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。 143.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸中的每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。 144.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸中的每個手性核苷酸間鍵聯獨立地具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。 145.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸，其非鏡像異構純度係至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。 146.    一種組成物，該組成物包含如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式。 147.    一種藥物組成物，該藥物組成物包含或遞送如實施方式1-145中任一項所述之寡核苷酸或其藥學上可接受的鹽形式。 148.    如實施方式147所述之組成物，該組成物進一步包含藥學上可接受的載體。 149.    如實施方式146-148中任一項所述之組成物，其中該鹽形式係寡核苷酸的鈉鹽。 150.    如實施方式146-149中任一項所述之組成物，其中該組成物係手性受控的。 151.    一種包含特定寡核苷酸類型的寡核苷酸的組成物，該寡核苷酸的特徵在於： a) 共同的鹼基序列； b) 共同的骨架鍵聯模式； c) 共同的骨架手性中心模式； 其中相對於具有相同共同的鹼基序列的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，組成物富集該特定寡核苷酸類型的寡核苷酸；並且 其中該寡核苷酸靶向C9orf72。 152.    一種包含特定寡核苷酸類型的寡核苷酸的寡核苷酸組成物，該寡核苷酸的特徵在於： a) 共同的鹼基序列； b) 共同的骨架鍵聯模式； c) 共同的骨架手性中心模式； 其中相對於具有相同共同的鹼基序列的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，該組成物富集該特定寡核苷酸類型的寡核苷酸；並且 其中該特定寡核苷酸類型的每個寡核苷酸獨立地是如實施方式1-145中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式。 153.    一種寡核苷酸組成物，該寡核苷酸組成物包含多個寡核苷酸，其中： 該多個寡核苷酸具有相同的構成； 該多個寡核苷酸在一個或多個（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多個）手性受控的核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學； 其中相對於具有相同共同的鹼基序列的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，該組成物富集該特定寡核苷酸類型的寡核苷酸；並且 該多個寡核苷酸各自獨立地是如實施方式1-145中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式。 154.    一種寡核苷酸組成物，該寡核苷酸組成物包含具有以下各項的多個寡核苷酸： a) 共同的鹼基序列； b) 共同的骨架鍵聯模式； c) 共同的骨架手性中心模式； 其中該組成物中該多個寡核苷酸的水平不是隨機的；並且 其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如實施方式1-145中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式。 155.    一種寡核苷酸組成物，該寡核苷酸組成物包含多個寡核苷酸，其中： 該多個寡核苷酸各自獨立地是如實施方式1-145中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式； 該多個寡核苷酸在一個或多個（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多個）手性受控的核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學，並且該組成物中的一個或多個（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多個）或每個手性受控的核苷酸間鍵聯獨立地具有約或至少約至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。 156.    如實施方式155所述之組成物，其中該多個寡核苷酸在5個或更多個核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學，其各自獨立地在該組成物中具有約或至少約至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。 157.    如實施方式155所述之組成物，其中該多個寡核苷酸在每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學，其各自獨立地在該組成物中具有約或至少約至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。 158.    如實施方式155所述之組成物，其中該多個寡核苷酸在每個手性核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學，其各自獨立地在該組成物中具有約或至少約至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。 159.    如實施方式151-158中任一項所述之組成物，其中富集該組成物，使得該組成物中所有與該特定類型的寡核苷酸或該多個寡核苷酸共用相同鹼基序列的寡核苷酸的1%-100%（例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%、或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%、或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%）係該特定類型的寡核苷酸或該多個寡核苷酸。 160.    一種寡核苷酸組成物，該寡核苷酸組成物包含多個寡核苷酸，其中： 該多個寡核苷酸具有相同的構成； 該多個寡核苷酸在一個或多個（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多個）手性受控的核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學； 在每個手性受控的核苷酸間鍵聯處，該組成物中所有共用相同構成的寡核苷酸中至少90%、95%、96%、97%、98%或99%共用相同的鍵聯磷立體化學；並且 該多個寡核苷酸各自獨立地是如實施方式1-145中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式。 161.    如實施方式153-160中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸在至少5個核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學。 162.    如實施方式153-161中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸獨立地在每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學。 163.    如實施方式153-162中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸獨立地在一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學。 164.    如實施方式153-162中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸獨立地在每個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學。 165.    如實施方式153-162中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸獨立地在每個手性核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學。 166.    如實施方式151-165中任一項所述之組成物，其中該多個或類型的寡核苷酸共用相同的結構。 167.    如實施方式151-166中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是具有以下結構的寡核苷酸： mA *S m5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC n001R m5Ceo *S mG *S mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； n001R代表Rp n001鍵聯，其中n001鍵聯具有
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的結構； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。 168.    如實施方式151-166中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是具有以下結構的寡核苷酸： mA *S m5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC *S m5Ceo n001R mG *S mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； n001R代表Rp n001鍵聯，其中n001鍵聯具有
Figure 02_image007
的結構； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。 169.    如實施方式151-166中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是具有以下結構的寡核苷酸： mA *S m5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC *S m5Ceo *S mG n001R mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； n001R代表Rp n001鍵聯，其中n001鍵聯具有
Figure 02_image007
的結構； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。 170.    如實施方式151-166中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是具有以下結構的寡核苷酸： mC *S m5Ceo Teo m5Ceo mA *S C *S T *S C *R A *S C *S C *R C *S A *S C *S T *S m5mC *S mG *S mC *S m5mC *S mG，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。 171.    如實施方式151-166中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是具有以下結構的寡核苷酸： mA *S m5Ceo Teo m5Ceo mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC *S m5mC *S mG *S mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。 172.    如實施方式151-166中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是具有以下結構的寡核苷酸： mC *S m5Ceo Teo m5Ceo mA *S C *S T *S C *R A *S C *S C *R C *S A *S C *S T *S m5Ceo *S mG *S mC *S m5Ceo *S mG，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。 173.    如實施方式151-166中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是具有以下結構的寡核苷酸： mA *S m5Ceo Teo m5Ceo mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC *S m5Ceo *S mG *S mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。 174.    如實施方式151-173中任一項所述之組成物，其中每個寡核苷酸獨立地呈鹽形式。 175.    如實施方式151-173中任一項所述之組成物，其中每個寡核苷酸獨立地呈藥學上可接受的鹽形式。 176.    如實施方式174中任一項所述之組成物，其中該鹽形式係鈉形式。 177.    一種藥物組成物，該藥物組成物包含或遞送如實施方式151-176中任一項所述之組成物。 178.    如實施方式177所述之組成物，該組成物進一步包含藥學上可接受的載體。 179.    一種方法，該方法包括向患有或易患與C9orf72擴增的重複序列有關的病症、障礙和/或疾病的受試者施用有效量的如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物。 180.    如實施方式179所述之方法，其中該病症、障礙和/或疾病係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）、額顳葉失智（FTD）、皮質基底節變性綜合症（CBD）、非典型帕金森氏症候群、橄欖體橋腦小腦變性（OPCD）或阿茲海默氏症。 181.    如實施方式179所述之方法，其中該病症、障礙和/或疾病係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）。 182.    如實施方式179所述之方法，其中該病症、障礙和/或疾病係額顳葉失智（FTD）。 183.    一種用於預防或治療受試者的肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）之方法，該方法包括向易患或患有肌肉萎縮性脊髓側索硬化症的受試者施用如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物。 184.    一種用於預防或治療受試者的額顳葉失智（FTD）之方法，該方法包括向易患或患有額顳葉失智的受試者施用如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物。 185.    如實施方式183-184中任一項所述之方法，其中該受試者包含在C9orf72中擴增的GGGGCC重複序列。 186.    一種降低細胞中C9orf72靶標基因或其基因產物的活性、表現和/或水平之方法，該方法包括將如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物引入該細胞中。 187.    一種用於減少細胞群中病灶之方法，該方法包括使細胞與如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物接觸。 188.    一種用於降低細胞群中二肽重複（DPR）蛋白質水平之方法，該方法包括使細胞與如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物接觸。 189.    一種降低受試者中C9orf72靶標基因或其基因產物的活性、表現和/或水平之方法，該方法包括向該受試者施用如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物。 190.    一種用於減少受試者的病灶之方法，該方法包括向該受試者施用如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物。 191.    一種用於降低受試者中二肽重複（DPR）蛋白質水平之方法，該方法包括向該受試者施用如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物。 192.    如實施方式179-191中任一項所述之方法，其中具有病灶的細胞百分比降低。 193.    如實施方式179-192中任一項所述之方法，其中每個細胞的病灶數目降低。 194.    如實施方式179-193中任一項所述之方法，其中病灶包含含有GGGGCC重複序列的RNA。 195.    如實施方式179-194中任一項所述之方法，其中由GGGGCC重複序列編碼的DPR蛋白質的水平降低。 196.    如實施方式179-195中任一項所述之方法，其中包含聚GP的DPR蛋白質的水平降低。 197.    如實施方式179-196中任一項所述之方法，其中包含聚GA的DPR蛋白質的水平降低。 198.    如實施方式179-197中任一項所述之方法，其中包含聚GR的DPR蛋白質的水平降低。 199.    如實施方式179-198中任一項所述之方法，其中GGGGCC重複序列係擴增的GGGGCC重複序列（例如，約或至少約30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、或1600個重複序列）。 200.    如實施方式179-199中任一項所述之方法，其中受試者細胞群中的病灶減少。 201.    如實施方式179-200中任一項所述之方法，其中受試者細胞群中DPR蛋白質的水平降低。 202.    如實施方式179-201中任一項所述之方法，其中該受試者係在C9orf72中包含擴增的GGGGCC重複序列的人類。 203.    一種用於在細胞中相對於不含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物優先敲低含有重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物之方法，該方法包括使包含該含有重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物及該不含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物的細胞與如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物接觸， 其中該寡核苷酸包含存在於該含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物中的序列或與該含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物中的序列互補的序列， 其中該寡核苷酸在細胞中相對於不含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物指導含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物的優先敲低。 204.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約30個重複序列。 205.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約50個重複序列。 206.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約100個重複序列。 207.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約150個重複序列。 208.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約200個重複序列。 209.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約300個重複序列。 210.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約500個重複序列。 211.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約1000個重複序列。 212.    如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸、組成物或方法，其中擴增的GGGGCC重複序列包含約或至少約1500個重複序列。 213.    一種用於製備如前述實施方式中任一項所述之寡核苷酸或組成物之方法，該方法包括使具有
Figure 02_image064
、
Figure 02_image066
、
Figure 02_image068
、或
Figure 02_image070
結構的亞磷醯胺或其鹽與核苷或寡核苷酸的-OH接觸，其中RAU 係選自以下的視需要經取代的基團：C1-20 脂肪族、具有1-10個雜原子的C1-20 雜脂肪族、C6-20 芳基、C6-20 芳基脂肪族、具有1-10個雜原子的C6-20 芳基雜脂肪族、具有1-10個雜原子的5-20員雜芳基、以及具有1-10個雜原子的3-20員雜環基，並且RNS 係視需要經取代的或受保護的核苷。 214.    如實施方式213所述之方法，其中亞磷醯胺具有
Figure 02_image068
或
Figure 02_image070
的結構，或其鹽，具有核苷或寡核苷酸的-OH。 215.    如實施方式213-214中任一項所述之方法，其中RAU 係-Ph。 216.    如實施方式213-215中任一項所述之方法，其中RNS 係視需要受保護用於寡核苷酸合成的A、T、C或G。 217.    如實施方式213-216中任一項所述之方法，其中-OH係5’-OH。 218.    說明書中描述的化合物、寡核苷酸、組成物或方法。
實例
用於製備寡核苷酸和寡核苷酸組成物（立體隨機和手性受控的）的各種技術係已知的且可根據本揭露使用，該等技術包括例如US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9598458、US 9982257、US 10160969、US 10479995、US 2020/0056173、US 2018/0216107、US 2019/0127733、US 10450568、US 2019/0077817、US 2019/0249173、US 2019/0375774、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612、和/或WO 2020/191252中的那些，將該等文獻每一者中之方法和試劑藉由引用併入本文。
在一些實施方式中，使用合適的手性助劑例如DPSE和PSM手性助劑製備寡核苷酸。根據本揭露製備多種寡核苷酸（例如表A1中的那些寡核苷酸）及其組成物。
實例1. C9orf72寡核苷酸組成物在多種測定中具有活性和選擇性
尤其是，如本文所證明的，本揭露提供了可以有效地和/或選擇性地降低與病症、障礙或疾病相關並包含擴增的重複序列的C9orf72轉錄物和/或由其編碼的產物的表現、活性和/或水平的技術。在下表中：示出用C9orf72寡核苷酸處理後，多種C9orf72轉錄物[例如所有V轉錄物，僅V3轉錄物，等等]相對於HPRT1的剩餘水平，其中1.000將表示100%相對轉錄物水平（無敲低）且0.000將表示0%相對轉錄物水平（例如100%敲低）。顯示了重複實驗的結果。WV-12890係非靶向性對照。實驗係在ALS運動神經元中進行的。另外的測定條件在本文和/或WO 2019/032607中描述。
[表1A]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（僅V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸的數據。與其他「僅V3轉錄物」評估一樣，顯示了C9orf72/HPRT1中V3的相對倍數變化。WV-9491係對照，係一種立體隨機寡核苷酸組成物（描述：mC*m5CeoTeoTeomC*C*C*T*G*A*A*G*G*T*T*mC*mC*mU*mC*mC，鹼基序列：CCTTCCCTGAAGGTTCCUCC，立體化學/核苷酸間鍵聯：XOOOXXXXXXXXXXXXXXX，參見表A1的關鍵點）。
劑量（uM） WV-8012 WV-30206 WV-30210
0.0032 1.057 1.087 1.028 1.133 1.043 1.072 1.189 1.094 1.050
0.016 0.933 0.986 1.079 0.908 0.889 0.966 1.000 1.021 0.993
0.08 0.779 0.758 0.712 0.747 0.763 0.853 0.796 0.847 0.841
0.4 0.274 0.283 0.252 0.387 0.406 0.412 0.356 0.321 0.361
2 0.107 0.098 0.093 0.170 0.178 0.173 0.097 0.093 0.089
10 0.036 0.036 0.034 0.075 0.063 0.069 0.019 0.022 0.015
劑量（uM） WV-30211 WV-30212 WV-9491
0.0032 1.141 1.165 1.094 1.141 1.189 1.165
0.016 1.014 1.064 1.057 0.940 0.824 1.000 1.395 0.829 0.824
0.08 0.697 0.732 0.824 0.737 0.655 0.655 0.889 1.275 0.953
0.4 0.392 0.304 0.304 0.281 0.255 0.243 1.173 0.847 1.189
2 0.128 0.128 0.099 0.095 0.090 0.067 0.986 1.125 1.064
10 0.033 0.031 0.031 0.027 0.027 1.007 0.993 0.993
[表1B]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
劑量（uM） WV-8012 WV-30206 WV-30210
0.0032 0.954 0.987 1.058 1.008 0.954 1.095 0.980 0.859 0.994
0.016 0.921 0.947 1.058 0.928 1.015 0.890 0.848 0.775
0.08 0.688 0.708 0.733 0.748 0.813 0.665 0.775 0.890 0.819
0.4 0.583 0.670 0.651 0.660 0.743 0.780 0.563 0.608 0.670
2 0.467 0.529 0.490 0.708 0.591 0.625 0.500 0.579 0.567
10 0.321 0.332 0.473 0.379 0.427 0.461 0.377 0.310
劑量（uM） WV-30211 WV-30212 WV-9491
0.0032 0.921 0.987 0.902 0.994 0.819 1.065
0.016 0.796 0.947 0.853 0.842 0.865 0.902 0.987 0.954 1.008
0.08 0.791 0.884 0.987 0.819 0.733 0.902 0.908 1.073 0.877
0.4 0.670 0.629 0.642 0.522 0.708 0.733 1.058 0.785 1.349
2 0.461 0.540 0.385 0.567 0.511 0.525 1.001 1.088 0.871
10 0.401 0.349 0.306 0.433 0.407 0.954 1.029
如所證明的，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
[表2A]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（僅V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸的數據。與其他「僅V3轉錄物」評估一樣，顯示了C9orf72/HPRT1中V3的相對倍數變化。
濃度 WV-8012 WV-23486 WV-28080
0.2uM 0.38 0.59 0.49 0.26 0.34 0.43 0.68 0.73 0.74
1 uM 0.33 0.34 0.27 0.27 0.25 0.29 0.34 0.44 0.47
5uM 0.16 0.11 0.21 0.11 0.15 0.14 0.26 0.27 0.32
濃度 WV-28479 WV-23741
0.2uM 0.68 0.64 0.79 0.53 0.63 0.65
1 uM 0.30 0.22 0.29 0.38 0.29 0.38
5uM 0.13 0.13 0.15 0.14 0.16 0.22
濃度 WV-28086 WV-28305 WV-28089
0.2uM 0.96 0.89 1.10 1.02 1.06 0.98 0.89 0.87 0.92
1 uM 0.87 1.00 0.89 0.99 0.82 0.98 0.77 1.00 1.11
5uM 0.75 0.54 0.94 0.74 0.70 0.82 0.75 0.74 0.81
濃度 WV-28307 WV-9491
0.2uM 0.83 0.90 0.96 1.04 0.90 0.87
1 uM 0.78 0.68 0.79 1.02 1.11 1.07
5uM 0.62 0.65 0.81 0.99 0.92 1.07
[表2B]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
濃度 WV-8012 WV-23486 WV-28080
0.2uM 0.63 0.82 0.66 0.48 0.64 0.65 0.96 0.98 0.94
1 uM 0.77 0.77 0.96 0.84 0.79 0.84 0.74 0.83 0.96
5uM 0.60 0.42 0.67 0.63 0.72 0.69 0.67 0.76 0.83
濃度 WV-28479 WV-23741
0.2uM 0.87 0.89 0.91 0.94 0.91 0.88
1 uM 0.83 0.77 0.76 0.76 0.69 0.78
5uM 0.68 0.68 0.70 0.70 0.67 0.79
濃度 WV-28086 WV-28305 WV-28089
0.2uM 0.82 0.92 0.98 1.10 1.07 1.05 0.78 0.86 0.90
1 uM 0.87 1.11 0.87 1.14 0.96 0.94 0.94 0.95 0.90
5uM 0.86 0.69 1.09 0.90 1.05 1.06 0.89 0.93 0.89
濃度 WV-28307 WV-9491
0.2uM 0.70 0.92 0.97 1.05 0.96 0.84
1 uM 0.92 0.91 0.83 0.99 1.05 1.02
5uM 0.77 0.84 0.84 1.10 0.86 1.07
如所證明的，在多種寡核苷酸濃度下，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
[表3A]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（僅V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。與其他「僅V3轉錄物」評估一樣，顯示了C9orf72/HPRT1中V3的相對倍數變化。
WV-8012 WV-21446 WV-28077 WV-28078 WV-28079 WV-28478 WV-27140 WV-28481 WV-28464 WV-28465 WV-28466 WV-28467 WV-9491
0.33 0.17 0.58 0.29 0.71 0.24 0.46 0.53 0.60 0.63 0.42 0.75 1.02
0.34 0.17 0.65 0.26 0.70 0.22 0.53 0.46 0.59 0.64 0.39 0.66 1.11
0.27 0.18 0.57 0.35 0.74 0.23 0.53 0.53 0.63 0.65 0.43 0.86 1.07
[表3B]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（僅V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。與其他「僅V3轉錄物」評估一樣，顯示了C9orf72/HPRT1中V3的相對倍數變化。
WV-8012 WV-23486 WV-28080 WV-28479 WV-28480 WV-9491
0.33 0.27 0.34 0.30 0.44 1.02
0.34 0.25 0.44 0.22 0.40 1.11
0.27 0.29 0.47 0.29 0.42 1.07
[表3C]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
WV-8012 WV-21446 WV-28077 WV-28078 WV-28079 WV-28478 WV-27140 WV-28481 WV-28464 WV-28465 WV-28466 WV-28467 WV-9491
0.77 0.84 0.92 0.84 0.89 0.75 0.83 0.87 0.82 0.98 0.87 0.99 0.99
0.77 0.75 0.94 0.67 0.94 0.79 0.94 0.84 0.95 1.04 0.89 0.78 1.05
0.96 0.83 0.93 0.79 0.91 0.72 0.87 0.89 0.96 0.99 0.86 0.97 1.02
[表3D]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
WV-8012 WV-23486 WV-28080 WV-28479 WV-28480 WV-9491
0.77 0.84 0.74 0.83 0.84 0.99
0.77 0.79 0.83 0.77 0.75 1.05
0.96 0.84 0.96 0.76 0.81 1.02
如所證明的，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
[表4A]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（僅V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。與其他「僅V3轉錄物」評估一樣，顯示了C9orf72/HPRT1中V3的相對倍數變化。
WV-8012 WV-23741 WV-28081 WV-28082 WV-28083 WV-28084 WV-28085 WV-28086 WV-28087
0.33 0.38 0.88 0.73 0.98 0.98 0.64 0.87 0.72
0.34 0.29 0.86 0.70 1.18 1.00 0.73 1.00 0.74
0.27 0.38 0.85 0.68 1.05 1.11 0.68 0.89 1.00
WV-28088 WV-28089 WV-28303 WV-28304 WV-28305 WV-28306 WV-28307 WV-28308 WV-9491
0.50 0.77 0.45 0.79 0.99 0.92 0.78 0.89 1.02
0.45 1.00 0.87 0.77 0.82 0.98 0.68 0.81 1.11
0.54 1.11 0.91 0.87 0.98 0.83 0.79 0.81 1.07
[表4B]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
WV-8012 WV-23741 WV-28081 WV-28082 WV-28083 WV-28084 WV-28085 WV-28086 WV-28087
0.77 0.76 0.98 0.89 1.05 1.05 0.93 0.87 0.91
0.77 0.69 0.87 0.92 1.19 1.15 0.96 1.11 0.96
0.96 0.78 0.92 0.81 1.15 1.09 0.96 0.87 0.98
WV-28088 WV-28089 WV-28303 WV-28304 WV-28305 WV-28306 WV-28307 WV-28308 WV-9491
0.94 0.94 2.40 0.99 1.14 1.03 0.92 0.92 0.99
0.84 0.95 0.93 0.86 0.96 0.91 0.91 0.96 1.05
0.87 0.90 0.95 1.04 0.94 0.86 0.83 0.88 1.02
如所證明的，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
[表5A]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
濃度（uM） WV-8012 WV-28478 WV-26633
0.0032 0.97 0.93 0.96 1.09 1.00 1.08 1.04 1.15
0.016 0.84 0.88 0.90 1.12 0.86 0.61 0.99 0.92 0.94
0.08 0.71 0.69 0.72 0.76 0.62 0.61 0.74 0.79 0.76
0.4 0.29 0.29 0.28 0.22 0.27 0.23 0.37 0.37 0.39
2 0.11 0.10 0.09 0.06 0.08 0.06 0.19 0.17 0.18
10 0.03 0.03 0.03 0.02 0.01 0.02 0.07 0.08 0.07
濃度（uM） WV-30206 WV-30277
0.0032 1.08 0.90 0.94 1.08 0.88 1.08
0.016 0.79 0.82 0.98 1.06 1.06 1.03
0.08 0.75 0.82 0.76 1.00 0.96 0.92
0.4 0.35 0.33 0.35 0.71 0.66 0.71
2 0.12 0.14 0.13 0.44 0.48 0.43
10 0.06 0.06 0.05 0.33 0.34 0.35
[表5B]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
濃度（uM） WV-8012 WV-28478 WV-26633
0.0032 0.97 0.89 0.98 0.95 1.01 1.01 1.00 0.97
0.016 0.94 0.91 0.92 0.97 1.09 1.22 0.94 0.94 1.10
0.08 0.87 0.85 0.94 0.93 0.89 0.82 0.89 0.88 0.97
0.4 0.79 0.76 0.76 0.71 0.80 0.83 0.82 0.84 0.80
2 0.64 0.52 0.59 0.61 0.55 0.60 0.58 0.62 0.68
10 0.40 0.42 0.46 0.47 0.48 0.49 0.53 0.50 0.54
濃度（uM） WV-30206 WV-30277
0.0032 0.98 0.91 0.96 0.99 1.42 0.98
0.016 0.79 0.95 0.95 1.01 0.95 0.97
0.08 0.93 0.88 0.92 0.97 0.96 1.01
0.4 0.82 0.72 0.77 0.79 1.01 0.99
2 0.52 0.54 0.57 0.75 0.87 0.78
10 0.49 0.45 0.50 0.73 0.73 0.77
[表5C].某些寡核苷酸的活性。
測試了多種C9orf72寡核苷酸在敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（V3轉錄物）中的功效。一組結果中的數據如下所示。
ID IC50
WV-8012 184.9 nM
WV-28478 130.3 nM
WV-26633 171.3 nM
WV-30206 232.7 nM
WV-30277 459.0 nM
如所證明的，在多種寡核苷酸濃度下，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
[表6]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
WV-8012 0.22 0.21 0.26
WV-26633 0.29 0.42
WV-30206 0.25 0.27 0.32
WV-30207 0.29 0.38 0.32
WV-30208 0.22 0.24 0.26
WV-30209 0.31 0.23 0.23
WV-30210 0.21 0.21 0.23
WV-30211 0.24 0.22 0.22
WV-30212 0.16 0.21 0.17
WV-28091 0.54 0.50 0.56
WV-30232 0.56 0.52 0.61
WV-30213 0.51 0.45 0.39
WV-30214 0.20 0.32 0.37
WV-30215 0.47 0.47 0.38
WV-30216 0.45 0.43 0.51
WV-30217 0.38 0.45 0.45
WV-30277 0.73 0.88 0.71
WV-30278 0.81 0.74 0.75
WV-30279 0.55 0.67 0.51
WV-30280 0.60 0.59 0.61
WV-30281 0.53 0.68 0.71
WV-30282 0.77 0.74 0.81
WV-30283 0.78 0.72 0.70
[表7]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
WV-8012 0.62 0.67 0.69
WV-26633 0.66 0.70
WV-30206 0.69 0.67 0.65
WV-30207 0.77 0.69 0.66
WV-30208 0.72 0.74 0.72
WV-30209 0.69 0.64 0.68
WV-30210 0.61 0.59 0.70
WV-30211 0.67 0.72 0.68
WV-30212 0.65 0.58 0.60
WV-28091 0.84 0.76 0.87
WV-30232 0.86 0.86 0.85
WV-30213 0.84 0.84 0.76
WV-30214 0.49 0.79 0.80
WV-30215 0.68 0.73 0.80
WV-30216 0.73 0.76 0.79
WV-30217 0.82 0.83 0.80
WV-30277 0.98 0.86 0.98
WV-30278 1.03 0.90 1.02
WV-30279 0.83 0.87 0.87
WV-30280 1.00 0.75 0.92
WV-30281 0.89 0.92 0.82
WV-30282 0.90 0.95 1.06
WV-30283 1.05 0.97 1.00
如所證明的，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
[表8A]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
WV-8012 0.22 0.21 0.26
WV-28478 0.19 0.16 0.19
WV-30219 0.07 0.07 0.07
WV-30220 0.08 0.07 0.07
WV-30221 0.24 0.18 0.23
WV-30222 0.14 0.15 0.16
WV-30223 0.12 0.13 0.16
WV-30224 0.21 0.21 0.19
WV-30225 0.43 0.40 0.50
WV-30226 0.95 0.59 0.74
WV-30227 0.61 0.29 0.61
WV-30228 0.40 0.45 0.46
WV-30229 0.74 0.86 0.83
WV-30230 0.88 0.88 0.85
WV-30231 0.46 0.53 0.49
WV-30237 0.52 0.62 0.55
WV-30238 0.39 0.50 0.50
WV-30239 0.50 0.49 0.49
WV-9491 1.13 1.04 1.04
WV-17820 0.41 0.35 0.33
[表8B]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸（1 uM）的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
WV-8012 0.62 0.67 0.69
WV-28478 0.70 0.72 0.74
WV-30219 0.58 0.62 0.61
WV-30220 0.65 0.67 0.64
WV-30221 0.69 0.73 0.73
WV-30222 0.73 0.70 0.69
WV-30223 0.68 0.69 0.70
WV-30224 0.70 0.75 0.71
WV-30225 0.79 0.87 0.83
WV-30226 1.07 0.82 1.09
WV-30227 0.92 0.63 0.87
WV-30228 0.81 0.86 0.79
WV-30229 0.91 1.00 1.08
WV-30230 1.11 1.05 1.00
WV-30231 0.81 0.89 0.92
WV-30237 0.70 0.91 0.89
WV-30238 0.84 0.77 0.86
WV-30239 0.82 0.87 0.99
WV-9491 1.15 1.05 1.15
WV-17820 0.73 0.78 0.85
如所證明的，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物），包括含有3'端替換核鹼基和/或錯配/擺動的寡核苷酸的那些轉錄物。
[表9A]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（僅V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸的數據。與其他「僅V3轉錄物」評估一樣，顯示了C9orf72/HPRT1中V3的相對倍數變化。
劑量（uM） WV-8012 WV-30206 WV-30208
0.0032 1.06 1.09 1.03 1.13 1.04 1.07 1.06 1.04 1.04
0.016 0.93 0.99 1.08 0.91 0.89 0.97 0.91 0.82 0.93
0.08 0.78 0.76 0.71 0.75 0.76 0.85 0.67 0.62 0.70
0.4 0.27 0.28 0.25 0.39 0.41 0.41 0.31 0.24 0.26
2 0.11 0.10 0.09 0.17 0.18 0.17 0.08 0.09 0.10
10 0.04 0.04 0.03 0.08 0.06 0.07 0.03 0.03 0.03
劑量（uM） WV-30209 WV-30210 WV-30211
0.0032 1.20 1.09 0.91 1.19 1.09 1.05 1.14 1.16 1.09
0.016 1.01 1.01 1.09 1.00 1.02 0.99 1.01 1.06 1.06
0.08 0.57 0.27 0.54 0.80 0.85 0.84 0.70 0.73 0.82
0.4 0.34 0.30 0.23 0.36 0.32 0.36 0.39 0.30 0.30
2 0.09 0.10 0.09 0.10 0.09 0.09 0.13 0.13 0.10
10 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.01 0.03 0.03 0.03
劑量（uM） WV-30212 WV-30220 WV-9491
0.0032 1.14 1.19 1.16 1.15 0.98 1.09
0.016 0.94 0.82 1.00 1.03 0.93 0.97 1.39 0.83 0.82
0.08 0.74 0.66 0.66 0.56 0.62 0.61 0.89 1.27 0.95
0.4 0.28 0.26 0.24 0.15 0.14 1.17 0.85 1.19
2 0.10 0.09 0.07 0.02 0.02 0.02 0.99 1.13 1.06
10 0.03 0.03 0.01 0.01 0.01 1.01 0.99 0.99
[表9B]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
劑量（uM） WV-8012 WV-30206 WV-30208
0.0032 0.95 0.99 1.06 1.01 0.95 1.10 0.82 0.90 0.80
0.016 0.92 0.95 1.06 0.93 1.01 0.65 0.67 0.72
0.08 0.69 0.71 0.73 0.75 0.81 0.66 0.60 0.77 0.96
0.4 0.58 0.67 0.65 0.66 0.74 0.78 0.44 0.64 0.66
2 0.47 0.53 0.49 0.71 0.59 0.62 0.54 0.46 0.41
10 0.32 0.33 0.47 0.38 0.43 0.46 0.34 0.31 0.43
劑量（uM） WV-30209 WV-30210 WV-30211
0.0032 0.87 0.83 0.80 0.98 0.86 0.99 0.92 0.99 0.90
0.016 0.71 0.79 0.79 0.89 0.85 0.77 0.80 0.95 0.85
0.08 0.55 0.48 0.65 0.77 0.89 0.82 0.79 0.88 0.99
0.4 0.51 0.69 0.50 0.56 0.61 0.67 0.67 0.63 0.64
2 0.39 0.44 0.44 0.50 0.58 0.57 0.46 0.54 0.38
10 0.18 0.27 0.24 0.38 0.31 0.40 0.35 0.31
劑量（uM） WV-30212 WV-30220 WV-9491
0.0032 0.99 0.82 1.07 1.01 1.04 1.10
0.016 0.84 0.87 0.90 1.06 0.94 0.95 0.99 0.95 1.01
0.08 0.82 0.73 0.90 0.66 0.99 1.10 0.91 1.07 0.88
0.4 0.52 0.71 0.73 0.68 0.84 1.06 0.79 1.35
2 0.57 0.51 0.53 0.51 0.58 0.64 1.00 1.09 0.87
10 0.43 0.41 0.36 0.41 0.41 0.95 1.03
[表9C].某些寡核苷酸的活性。
測試了多種C9orf72寡核苷酸在敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（V3轉錄物）中的功效。一組結果中的數據如下所示。
ID IC50（nM）
WV-8012 151.4
WV-30206 207.4
WV-30208 123
WV-30209 65.24
WV-30210 201.7
WV-30211 145.9
WV-30212 90.17
WV-30220 92.28
WV-9491 沒有觀察到明顯的減少
如所證明的，在多種寡核苷酸濃度下，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
[表10A]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（僅V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸的數據。與其他「僅V3轉錄物」評估一樣，顯示了C9orf72/HPRT1中V3的相對倍數變化。
濃度 WV-30210 WV-37246
0.0032 1.19 0.98 1.03 1.17 1.16 0.84
0.016 0.84 0.72 1.08 1.02 1.33 0.85
0.08 0.75 0.99 0.94 0.70 0.78 0.77
0.4 0.45 0.38 0.39 0.79 0.76 0.66
2 0.07 0.07 0.10 0.22 0.19 0.23
10 0.01 0.01 0.02 0.05 0.05 0.05
[表10B]. C9orf72寡核苷酸的活性
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
濃度 WV-30210 WV-37246
0.0032 1.21 1.03 0.98 1.07 1.04 1.02
0.016 0.96 0.94 1.03 0.98 0.97 1.05
0.08 0.84 0.89 0.86 1.14 0.87 1.13
0.4 0.82 0.82 0.75 0.88 0.94 0.84
2 0.80 0.50 0.66 0.74 0.83 0.64
10 0.34 0.33 0.50 0.51 0.39 0.62
[表10C].某些寡核苷酸的活性。
測試了多種C9orf72寡核苷酸在敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（V3轉錄物）中的功效。一組結果中的數據如下所示。
ID IC50
WV-30210 318.2 nM
WV-37246 736.3 nM
如所證明的，在多種寡核苷酸濃度下，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
實例2.某些體外篩選方案
依照本揭露，可以利用多種技術來評估所提供技術的特性和/或活性。此實例描述C9orf72寡核苷酸的體外篩選方案。
在24孔盤中，將寡核苷酸裸式（gymnotically）遞送至ALS神經元後保持48小時。
RNA提取
根據以下方案用RNeasy Plus 96套盒（凱傑公司（Qiagen），沃爾瑟姆（Waltham），麻塞諸塞州（Mass.））進行RNA提取：使用真空/自旋技術自細胞純化總RNA（gDNA去除係關鍵）。對於每個孔，將總RNA在60 ul不含RNA酶的水中進行洗脫。
反轉錄
用大容量RNA-to-cDNA™套盒（應用生物系統公司（Applied Biosystems）；可購自賽默飛世爾公司, 沃爾瑟姆, 麻塞諸塞州）進行反轉錄
2X RT緩衝液混合物 9 ul
RNA樣本 13.5 ul
在72°C下進行5分鐘熱變性，在冰上使板冷卻至少2分鐘。 向具有熱變性的RNA的每個孔中添加：
2X RT緩衝液混合物 6
20X RT酶混合物 1.5 ul
cDNA的最終體積係30 ul。
即時PCR
Taqman探針：
C9orf72所有變體：Hs00376619_m1（FAM），目錄號4351368（賽默飛世爾公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州）
C9orf72 V3：Hs00948764_m1（FAM），目錄號4351368（賽默飛世爾公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州）
C9orf72外顯子1a：
正向引物 AGATGACGCTTGGTGTGTC
反向引物 TAAACCCACACCTGCTCTTG
探針 CTGCTGCCCGGTTGCTTCTCTTT
C9orf72反義RNA/內含子：
正向引物 GGTCAGAGAAATGAGAGGGAAAG
反向引物 CGAGTGGGTGAGTGAGGA
探針 AAATGCGTCGAGCTCTGAGGAGAG
內部對照：人類HPRT1（VIC） Hs02800695_m1，目錄號4448486（賽默飛世爾公司, 沃爾瑟姆, 麻塞諸塞州） PCR反應：
Lightcycler 480預混合液 10 ul
C9探針（FAM） 0.5 ul
HPRT 1（VIC） 0.5 ul
cDNA * 達9 ul
不含核酸酶的H2O 達20 ul
*2 ul cDNA用於所有變體探針。9 ul cDNA用於其他C9探針。 使用Bio-rad CFX96 Touch進行即時PCR 運行資訊： 1 95.0 C持續3:00 2 95.0 C持續0:10 3 60.0 C持續0:30 + 板讀取 4 GOTO 2，另外39次 結束
實例3. C9orf72寡核苷酸組成物在多種測定中具有活性和選擇性
在多種測定中評估所提供的寡核苷酸和組成物，尤其用以證明活性和/或選擇性。
所進行的各種測定的簡要說明：
報告子：
螢光素酶測定，如本文所述。對於一些寡核苷酸，給出兩個數字（例如，對於WV-6408的1.32/2.63）；該等數字表示重複實驗。
ALS神經元：
iPSC的神經元分化：自C9orf72相關的ALS患者（女性，64歲）的成纖維細胞衍生的iPSC獲得自RUCDR Infinite Biologics公司。將iPSC以集落形式維持在mTeSR1培養基（幹細胞技術公司（STEMCELL Technologies），溫哥華（Vancouver），不列顛哥倫比亞省（BC））中的Corning Matrigel基質（西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich），聖路易斯（St. Louis），密蘇里州（MO））上。使用STEMdiff神經系統（幹細胞技術公司，溫哥華，不列顛哥倫比亞省）產生神經祖細胞。將iPSC懸浮於AggreWell800平板中，並在STEMdiff神經誘導培養基中經5天生長成胚狀體，每天更換75%的培養基。使用37 μm細胞過濾器收集胚狀體，並將其鋪板至經Matrigel塗覆的平板上的STEMdiff神經誘導培養基中。每天更換培養基，持續7天，鋪板後2天85%-95%的胚狀體出現神經玫瑰結（rosette）。手動拾取玫瑰結，且將其轉移至用聚-L-鳥胺酸和層黏連蛋白塗覆的平板的STEMdiff神經誘導培養基（幹細胞技術公司，溫哥華，不列顛哥倫比亞省）中。每天更換培養基，持續7天，直至細胞達到90%匯合，且將其視為神經祖細胞（NPC）。將NPC用TrypLE（Gibco，可獲得自賽默飛世爾公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州）分離，並使其在補充有生長因子（20 ng/ml FGF2、20 ng/ml EGF、5 μg/ml肝素）的神經維持培養基（NMM、70% DMEM、30% Ham's F12、1X B27補充劑）中在聚-L-鳥胺酸/層黏連蛋白平板上以1 : 2或1 : 3的比率進行傳代。為了成熟為神經元，維持NPC且使其擴增少於五代，並在 ＞ 90%匯合下使其在補充有生長因子的NMM中在聚-L-鳥胺酸/層黏連蛋白塗覆的平板上以1:4進行傳代。第二天，即分化的第0天，將培養基更換成不含生長因子的新鮮NMM。將進行分化的神經元維持在NMM中，持續4週或更多週，每週兩次更換50%的培養基。根據需要用TrypLE以125,000個細胞/cm2 的密度重新鋪板細胞。
V3/內含子：在ALS神經元中測量V3 RNA轉錄物及內含子RNA轉錄物的敲低（KD）。野生型及含有重複序列的V3轉錄物（WO 2019/032607的圖1中表示為「健康等位基因」V3及「病理性等位基因」V3）均被敲低。然而，應注意，雖然本揭露不受任何特定理論束縛，但含重複序列的轉錄物在細胞核中可滯留更長時間，且因此可優先被敲低。內含子轉錄物由WO 2019/032607的圖1中向後的AS箭頭表示。兩個數字表示V3及內含子敲低；舉例而言，對於WV-6408，V3被敲低59%且內含子被敲低65%。
穩定性：
使用小鼠（Ms）腦勻漿進行體外穩定性測定。
TLR9：
TLR9報告子測定方案：使用人類TLR9或小鼠TLR9報告子測定（HEK-Blue™ TLR9細胞，英傑公司（InvivoGen），聖地牙哥（San Diego），加利福尼亞州（California））來分析NF-κB（NF-κB誘導型SEAP）活性的誘導。將濃度為50 μM（330 μg/mL）且2倍連續稀釋的寡核苷酸以在水中的20 µL的最終體積鋪板至96孔板中。將HEK-Blue™ TLR9細胞以7.2x104 個細胞的密度添加至各孔的180 µL體積的HEK Blue™檢測培養基中。該等孔中的寡核苷酸的最終工作濃度係5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078和0.0375 μM。將HEK-Blue™ TLR9細胞與寡核苷酸一起在37°C及5% CO2 下溫育16小時。溫育結束時，藉由Spectramax測量655 nM下的吸光度。水為陰性對照。陽性對照係WV-2021和ODN 2359（CpG寡核苷酸）。結果表現為相對於經媒劑對照處理的細胞的NF-κB活化倍數變化。參考：人類TLR9促效劑套盒（英傑公司，聖地牙哥，加利福尼亞州）。在此測定中，如果未檢測到或基本上未檢測到活性，則認為寡核苷酸被「清除」。在一些實驗中，WV-8005、WV-8006、WV-8007、WV-8008、WV-8009、WV-8010、WV-8011、WV-8012和WV-8321未顯示出可評估的hTLR9活性，但一些顯示出較小mTRL9活性。
補體：
在一些實施方式中，在食蟹猴（cynomolgus monkey）血清補體活化離體測定中對補體進行評估。在離體食蟹猴血清中測量寡核苷酸對補體活化的影響。合併來自3隻單獨雄性食蟹猴的血清樣本，並將合併物用於研究。
藉由在37°C下在新鮮解凍的食蟹猴血清（1 : 30比率，v/v）中溫育最終濃度為330 μg/mL的寡核苷酸或水對照物，來測量C3a產生的時程。具體而言，將9.24 µL的在媒介物中的10 mg/mL寡核苷酸原液或僅媒介物添加至270.76 µL的合併的血清中，並將所得混合物在37°C下溫育。在0、5、10和30分鐘處，收集20-µL等分試樣，並藉由添加2.2 µL的18 mg/mL EDTA而立即終止反應。
使用MicroVue C3a加酶免疫測定，以1 : 3000的稀釋度測量C3a濃度。結果呈現為，與用媒介物對照處理相比，在用寡核苷酸處理經合併的血清後，補體裂解產物的濃度增加。
PD（藥效學）（C9-BAC，icv或腦室內注射）：
在C9orf72-BAC（C9-BAC）小鼠模型中測試PD及效力：
用於體內藥理學研究的轉基因小鼠已描述於O'Rourke等人 2015 Neuron.[神經元] 88(5): 892-901中。簡言之，使用自患有肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）的患者的成纖維細胞衍生的細菌人工染色體（BAC）殖株來設計轉基因構建體，使得人類9號染色體的可讀框72基因（C9orf72）在交替剪接的非編碼第一外顯子1a與1b之間的內含子中具有六核苷酸重複擴增（GGGGCC）（變體3）。BAC分離出約166 kbp的序列（約36 kbp的人類C9orf72基因組序列，其中約110 kbp為上游序列且約20 kbp為下游序列）。在擴增不同BAC亞選殖之後，使用受限收縮成100-1000個GGGGCC重複序列的一個亞殖株。Tg（C9orf72_3）系112小鼠（JAX庫存編號023099，傑克遜實驗室公司（Jackson Laboratories），巴爾港（Bar Harbor），緬因州（Maine））具有C9orf72_3轉基因的若干串聯拷貝，其中每個拷貝具有100-1000個重複序列（[GGGGCC]100-1000）。然而，僅選擇表現500個或更多個重複序列的小鼠用於本文所使用的體內研究。
體內程序：
針對將寡核苷酸注射至側腦室中，麻醉小鼠且將其放置於齧齒動物立體定位設備上；然後在其側腦室之一中植入不銹鋼引導套管（座標：前囟後方-0.3 mm，橫向+1.0 mm及豎直-2.2 mm），使用牙黏固粉將該套管固定在適當的位置。在注射化合物之前，使小鼠度過一週恢復期。典型藥理學研究涉及在第1天注射達2.5 μl體積的50 μg寡核苷酸，接著在第8天進行相同量和體積的另一次注射。在第15天執行安樂死；將小鼠用阿佛丁深層麻醉且穿心灌注鹽水。自頭顱快速去除腦，一個半球經處理以用於組織學分析，另一半球經解剖且在乾冰上冷凍以用於生物化學分析。類似地，解剖脊髓且在乾冰上冷凍（腰脊髓）或處理脊髓以用於組織學分析（頸部/胸部脊髓）。
功效（C9-BAC）：病灶：
組織製備和組織學分析
將半腦和脊髓固定於4%多聚甲醛中保持24小時，然後將其轉移至30%蔗糖中保持24-48小時並在液氮中冷凍。在-18°C下於低溫恒溫器中切下20-μm厚的連續矢狀切片，並將其放置於Superfrost載玻片上。
功效（C9-BAC）：聚GP（DPR測定）：
用於蛋白質和聚GP量化的組織製備：
使用2步驟提取程序來處理腦和脊髓樣本；每個步驟之後，在4°C下以10,000 rpm離心10分鐘。第一步驟由以下組成：將樣本在RIPA（50 mM Tris、150 mM NaCl、0.5% DOC、1% NP40、0.1% SDS和Complete™，pH 8.0）中均質化。第二步驟由以下組成：將沈澱重新懸浮於5 M胍-HCl中。
使用基於中尺度的測定在各合併物中量化聚GP。簡言之，將多株抗體AB1358（密理博公司（Millipore），可獲得自密理博西格瑪公司（Millipore Sigma），比勒利卡（Billerica），麻塞諸塞州）用作捕獲和檢測抗體。在4°C下，將多陣列96 Sm點滴板包SECTOR板用直接在小點上的、在PBS中的1 μl的10 ug/ml純化的抗聚GP抗體（密理博公司，AB1358，可獲得自密理博西格瑪公司，比勒利卡，麻塞諸塞州）塗覆過夜。用PBST（在PBS中的0.05%吐溫-20）洗滌3次後，在室溫下，將板用MSD阻斷劑A套盒（R93AA-2）或10% FBS/PBS阻斷，持續1小時。將自HEK-293細胞純化（藉由在質體轉染之後進行抗FLAG親和純化，金斯瑞公司（Genescript）定製）的聚GP用10% FBS/PBS進行連續稀釋，且用作標準品。將25 μl的標準品聚GP和樣本（經稀釋或未經稀釋的）添加至各孔，在室溫下溫育1-2小時。用PBST洗滌3次後，每孔添加25 μl經磺基標記的抗GP（AB1358），且在室溫下再溫育一小時。然後洗滌板3次，向各孔中添加150 μl/孔的MSD讀取緩衝液T（1x）（R92TC-2，MSD），並根據製造商的預設設置藉由MSD（MESO QUICKPLEX SQ 120）進行讀數。
藉由蛋白質印跡法測定C9orf72蛋白質的表現。簡言之，藉由4%-12% SDS-PAGE（標準凝膠，伯樂公司（Bio-Rad））對來自RIPA提取物的蛋白質進行大小分級，且將其轉移至PVDF膜上。為了檢測C9orf72，使用小鼠單株抗C9orf72抗體GT779（1:2000；吉恩特克斯公司（GeneTex），爾灣市（Irvine），加利福尼亞州）然後使用DyLight軛合的二抗對膜進行免疫印跡。使用Odyssey/Li-Cor成像系統進行視覺化。 一些其他縮寫： Cx：皮質 HP：海馬 KD：敲低 SC：脊髓 Str：紋狀體
實例4.某些其他方案
熟悉該項技術者將理解，根據本揭露，多種技術可用於評估所提供的技術。下文呈現了實驗的某些其他可用方案。
本文中描述了用於檢測靶標核酸的雜交測定的非限制性實例。這種測定可用於檢測和/或量化C9orf72寡核苷酸、或針對任何靶標（包括並非C9orf72的靶標）的任何其他核酸或寡核苷酸。
藥物動力學研究：
用於寡核苷酸量化和轉錄物量化的組織製備：解剖組織，並新鮮冷凍於預先稱重的微量離心管中。藉由對管重新稱重來計算組織重量。將4體積的Trizol或裂解緩衝液（4 M胍；0.33% N-月桂肌胺酸；25 mM檸檬酸鈉；10 mM DTT）添加到一單位重量（1 mg組織添加4 μl緩衝液）中。在4 C下，藉由Precellys Evolution組織勻漿器（貝爾坦科技公司（Bertin Technologies），蒙蒂尼勒托訥（Montigny-le-Bretonneux），法國）進行組織裂解，直至所有組織塊溶解為止。將30-50 μl的組織裂解物保存於96孔板中以進行PK測量，並將其餘裂解物在-80 C下儲存（如果其處於裂解緩衝液中）或繼續進行RNA提取（如果其處於Trizol緩衝液中）。
轉錄物量化：
雜交探針（IDT-DNA） 捕獲探針：「C9-內含子-帽」/5AmMC12/TGGCGAGTGG 檢測探針：「C9-內含子-Det」：GTGAGTGAGG/3BioTEG/ 5AmC12係具有C12 連接子的5'-胺。 3BioTEG係生物素化的探針。
在37 C下，用含500 nM的50 μl捕獲探針的2.5% NaHCO3（吉博公司（Gibco），25080-094）塗布經馬來酸酐活化的96孔培養盤（Pierce 15110）後保持2小時。然後將板用PBST（PBS + 0.1%吐溫-20）洗滌3次，並用5%脫脂乳-PBST在37 C下阻斷1小時。將有效負載寡核苷酸連續稀釋至基質中。將該標準品與原始樣本一起用裂解緩衝液（4 M胍；0.33% N-月桂基肌胺酸；25 mM檸檬酸鈉；10 mM DTT）稀釋，使得所有樣本中的寡核苷酸量小於50 ng/ml。將20 μl的稀釋的樣本與PBST中稀釋的180 μl的333 nM檢測探針混合，然後在PCR機器（65°C 10 min，95°C 15 min，4°C ∞）中變性。50 μl變性的樣本在封閉的ELISA板中一式三份進行分配，並在4°C溫育過夜。在用PBST洗滌3次後，添加在PBST中的1 : 2000鏈黴親和素-AP（SouthernBiotech公司，7100-04），每孔50 μl，並在室溫下溫育1小時。用PBST充分洗滌後，添加100 μl的AttoPhos（普洛麥格公司（Promega）S1000），在室溫在黑暗中溫育10 min，並在平板讀數器（分子儀器公司（Molecular Device），M5）上讀取螢光通道：Ex435 nm，Em555 nm。根據標準曲線，藉由4參數回歸計算樣本中的寡核苷酸。
針對GGGGCC和GGCCCC RNA病灶的FISH方案
固定：
使載玻片在室溫下乾燥30分鐘，然後在4% PFA中固定20分鐘。固定後，將載玻片在PBS中洗滌3次，然後在4°C下於70%預冷卻乙醇中儲存至少30分鐘。
預雜交：
將載玻片在FISH洗滌緩衝液（40%甲醯胺、在DEPC水中的2XSSC）中再次水合，持續10分鐘。在載玻片上添加雜交緩衝液（40%甲醯胺、2X SSC、0.1 mg/ml BSA、0.1 g/ml硫酸葡聚糖、1%硫酸氧釩複合物、在DEPC水中的0.25 mg/ml tRNA），並在55°C下溫育30分鐘。
探針的製備：
使Cy3-(GGCCCC)3探針（檢測有義重複擴增）和Cy3-(GGGGCC)3探針（檢測反義重複擴增）在95°C下變性，持續10分鐘。在冰上冷卻後，用冷雜交緩衝液將探針稀釋至200 ng/ml。
雜交：
將載玻片簡單地用FISH洗滌緩衝液洗滌，且將經稀釋的探針添加至載玻片上。將載玻片在55°C下於雜交儀中溫育3小時。雜交後，將載玻片在55°C下用FISH洗滌緩衝液洗滌3次，每次洗滌15分鐘。然後將載玻片簡單地用1XPBS洗滌一次。
神經元核免疫螢光染色：
將載玻片用阻斷溶液（在PBS中的2%正常山羊血清）阻斷1小時。將抗NeuN抗體（MAB377，密理博公司）在阻斷溶液中以1 : 500稀釋，並在4°C應用於載玻片過夜。然後將載玻片用PBS洗滌3次，並與具有Alexa Fluor 488的1:500稀釋的山羊抗小鼠二抗（生命技術公司（Life technology））一起在室溫下溫育1小時。然後將載玻片用PBS洗滌3次。最後，將載玻片用DAPI封片以供成像。
成像和病灶量化：
用40X放大率的RPI旋轉盤共焦顯微鏡（蔡司公司（Zeiss））拍攝圖像。收集488、CY3和DAPI通道。利用ImageJ軟體（NIH）量化RNA病灶。
多種技術（試劑、方法、構建等）係合適的，並且被用於多種寡核苷酸的製造、表徵、測試等。某些此類技術如下所述。
實驗人員從第三方供應商那裡獲得了某些基於磷酸二酯和立體隨機的PS修飾寡核苷酸的合成；此類寡核苷酸也可以使用標準固相寡核苷酸合成方案來製備。實驗人員按照該方法製備了多種化學修飾的、手性受控的寡核苷酸和組成物，有時從製備到製備都有一定的修飾。可以用於手性受控的寡核苷酸合成的某些技術包括在以下中描述的那些技術：Iwamoto, N.等人Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides [硫代磷酸酯立體化學的控制實質上提高了反義寡核苷酸的功效].Nat Biotechnol [自然生物技術] 35, 845-851, doi: 10.1038/nbt.3948 (2017)；Butler, D. C. D.等人 Compounds, Compositions and Methods for Synthesis [化合物、組成物和合成方法]. WO 2018237194 (2018)；以及Butler, D., Iwamoto, N., Meena, M., Svrzikapa, N., Verdine, G.L., Zlatev, I. Chiral Control [手性控制]. WO 2014012081 (2014)。
在一些實施方式中，在Varian MERCURY 300、400或500 NMR光譜儀或Brukar BioSpin GmbH NMR光譜儀上以適當的參考記錄NMR光譜（1 H NMR、13 C NMR和31 P NMR）。ESI高分辨質譜記錄在Agilent 6230 ESI TOF上。
在一些實施方式中，用於分析/表徵某些寡核苷酸和組成物的有用技術係LC-HRMS和HPLC。下面以某些程序為例進行說明；熟悉該項技術者將理解，可以調整某些或所有參數。
反相HPLC。在60°C下，使用緩衝液A（200 mM六氟異丙醇和8 mM三乙胺的水溶液）和緩衝液B（甲醇）作為洗脫液，其中緩衝液B的梯度為5%-30%，將每種低聚物的10 µL 5 µM溶液注入分析HPLC柱（Poroshell 120 EC - C18, 2.7 µm, 2.1 x 50 mm, Agilent（安捷倫公司））。在254 nm和280 nm處記錄UV吸收。
DNA構建體。對於螢光素酶報導基因測定，在一些實施方式中，實驗人員將C9orf72序列引入到psiCHECK-2載體（Promega）的NotI位點，其位於hRluc基因的3′-UTR中間。C9orf72序列包含內含子1周圍約1 Kb的DNA，包括外顯子1a和1b以及該基因的下游區域。
動物。根據適當的動物護理和動物護理和使用指南使用動物進行多種動物實驗。對於體內研究，實驗人員使用了C9BAC轉基因小鼠[O'Rourke, J. G.等人 C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD [C9orf72 BAC轉基因小鼠顯示ALS/FTD的典型病理特徵]. Neuron [神經元] 88, 892-901, doi: 10.1016/j.neuron.2015.10.027 (2015)] Tg(C9orf72_3) 編號023099, 傑克遜實驗室公司（Jackson Laboratories）），它們具有C9orf72轉基因的幾個串聯拷貝，每個拷貝具有100至1,000個重複序列。為了進行本文的研究，實驗人員選擇了10到12週齡的表現 ≥ 500次重複序列的小鼠。實驗人員使用了雄性和雌性小鼠。對於立體定位手術下的腦室內（ICV）插管，實驗人員將小鼠（阿佛丁）麻醉並置於齧齒動物立體定位器上；然後在其側腦室之一中植入不銹鋼引導套管（座標：前囟後方-0.3 mm，橫向+1.0 mm及豎直-2.2 mm），實驗人員使用牙黏固粉將該套管固定在適當的位置。允許小鼠恢復一週。
在劑量遞增研究中，實驗人員在第1天和第8天以2.5 µL的劑量施用了8 µg、20 µg或50 µg的ASO，並在首次注射後2週對小鼠進行了屍檢。在為期2週的多劑量研究中，實驗人員在第1天和第8天以2.5 µL的劑量施用了50 µg寡核苷酸，並按照上述方法對小鼠進行了屍檢。在行動研究期間，實驗人員在給藥後的三個時間點（2、4和8週，每組每個時間點n = 5-8）對小鼠進行了評估。對於單劑量持續時間研究，實驗人員在第1天注射了2.5 µL的100 μg寡核苷酸，並在給藥後48小時（每組n = 6）、1週（n = 6）、2週（n = 6）、8週（n = 6）和12週（n = 6）對小鼠進行了評估。屍體剖檢時，在阿佛丁麻醉下對小鼠進行穿心灌注鹽水。實驗人員迅速從頭顱快速去除腦；實驗人員將一個半球進行組織學分析（滴定在10%福馬林中固定），而實驗人員將另一半解剖成皮質、海馬、紋狀體和小腦，並在乾冰上冷凍進行生化分析。同樣，實驗人員解剖脊髓並在乾冰上冷凍，或對其進行處理以進行組織學分析。
細胞模型。在一些實施方式中，使用細胞模型評估寡核苷酸和/或組成物。實驗人員從ATCC獲得了Cos-7細胞。源自患者成纖維細胞的iPSC來自一名C9orf72相關的ALS女性患者（64歲，RUCDR Infinite Biologics公司）。實驗人員在mTeSR1培養基（幹細胞技術公司（STEMCELL Technologies））中將iPSC保留為Corning Matrigel基質（密理博西格瑪公司）上的菌落。神經祖細胞係在STEMdiff神經系統（幹細胞技術公司）中生產的。將iPSC懸浮於AggreWell800平板中，並在STEMdiff神經誘導培養基中經5天生長成胚狀體，每天更換75%的培養基。實驗人員用37 μm的細胞過濾器收穫胚狀體，然後將其鋪板在STEMdiff神經誘導培養基中的Matrigel包被板上，該培養基每天更換持續7天，鋪板後2天有85%-95%的胚狀體出現神經玫瑰結（rosette）。手動選取玫瑰結，且將其轉移至用聚-L-鳥胺酸和層黏連蛋白塗覆的平板的STEMdiff神經誘導培養基（幹細胞技術公司）中。實驗人員每天更換培養基，直至細胞達到90%匯合（7天），且將其視為神經祖細胞（NPC）。實驗人員將NPC用TrypLE（賽默飛世爾公司）分離，並使其在補充有生長因子（20 ng/mL FGF2、20 ng/mL EGF、5 μg/mL肝素）的神經維持培養基（NMM、70% DMEM、30% Ham's F12、1X B27補充劑）中在聚-L-鳥胺酸/層黏連蛋白平板上以1 : 2或1 : 3的比率進行傳代。為了成熟為神經元，實驗人員維持NPC且使其擴增 ＜ 5代，並在 ＞ 90%匯合下實驗人員使其在補充有生長因子的NMM中在聚-L-鳥胺酸/層黏連蛋白塗覆的平板上以1 : 4進行傳代。第二天，即分化的第0天，實驗人員將培養基更換成不含生長因子的新鮮NMM。將進行分化的神經元維持在NMM中，持續 ≥ 4週，每週兩次更換50%的培養基。根據需要用TrypLE以125,000個細胞/cm2 的密度重新鋪板細胞。藉由BrainXell對源自同一患者iPSC系的運動神經元進行了區分，並植入了其標準方案。C9-ALS原代成纖維細胞係從兩個不相關的C9攜帶者的皮膚活檢中產生的，每個攜帶超過1,000個重複序列。簡而言之，實驗人員將活組織檢查的皮膚切成小塊，然後與補充有15% FBS的DMEM培養，以允許成纖維細胞擴增。實驗人員從E15.5 C9-BAC轉基因胚胎生成了原代皮層神經元。O'Rourke, J. G.等人 C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD [C9orf72 BAC轉基因小鼠顯示ALS/FTD的典型病理特徵]. Neuron [神經元] 88, 892-901, doi: 10.1016/j.neuron.2015.10.027 (2015)。實驗人員在冰冷的漢克（Hank）平衡鹽溶液（ThermoScientific公司）上解剖了每個胚胎的皮層組織。切碎合併的組織，並在37°C下用0.05%胰蛋白酶-EDTA（生命技術公司）消化12 min。藉由添加10% FBS/DMEM停止消化。研磨細胞，重懸於補充了Glutamax（ThermoScientific公司）、2%青黴素/鏈黴素和B27補充劑（ThermoScientific公司）的神經基礎培養基中，並以0.5 × 106 個細胞/孔的密度接種在預先塗有聚鳥胺酸（西格瑪公司（Sigma））的6孔板中。iCell神經元（iNeurons）可從細胞動力國際公司（Cellular Dynamics International）商購獲得。iPSC衍生的運動神經元可從BrainXell商購獲得。實驗人員在ALS運動神經元的全劑量反應測定（10、2.5、0.625、0.16、0.04和0.001 µM）中計算了IC50 。簡而言之，實驗人員在1週後藉由裸式遞送寡核苷酸並評估了上述轉錄水平。實驗人員使用GraphPad軟體對變數斜率（4個參數）使用非線性回歸來擬合數據。
DNA印跡。使用Gentra Puregene Tissue套盒（凱傑公司）從ALS iPSC、ALS運動神經元和C9 BAC轉基因小鼠中分離基因組DNA。將10 μg DNA在37°C下用AluI和DdeI消化過夜，然後在0.6%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，轉移到帶正電的尼龍膜（羅氏應用科學公司（Roche Applied Science））上，藉由暴露於紫外（UV）光下進行交聯，並在55°C在雜交緩衝液（EasyHyb，羅氏公司（Roche））中用長葉毛地黃苷標記的(G2 C4 )5 DNA探針雜交過夜。使用抗長葉毛地黃苷抗體（目錄號11093274910，羅氏公司）和CDP-Star試劑按照製造商的建議檢測探針。
熱變性（Tm）。將等莫耳量的替代RNA（5'-GGUGGCGAGUGGGUGAGUGAGGAG）、U1模擬物（5'-AUACUUACCUGG）或ASO溶解在1X PBS中，以獲得每條股1 μM的最終濃度。然後藉由在90°C加熱，然後緩慢冷卻至4°C並在4°C儲存的條件下對雙鏈樣本進行退火。使用Cary系列UV-Vis分光光度計（安捷倫科技公司（Agilent Technologies）），以每分鐘+0.5°C的速率將溫度從5°C或15°C升高到95°C，以30秒的間隔記錄254 nm處的UV吸收。將吸光度相對於溫度作圖，並藉由取每條曲線的一階導數來計算Tm值。
RNase H測定。對於某些RNase H測定，實驗人員將異源雙鏈體與人類RNase HC（如Iwamoto, N.等人 Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides [硫代磷酸酯立體化學的控制大大提高了反義寡核苷酸的功效]. Nat Biotechnol [自然生物技術] 35, 845-851, doi:10.1038/nbt.3948 (2017)所述製備）在37°C下溫育。實驗人員藉由混合等莫耳（每個20 µM）的ASO和/或U1模擬物和RNA溶液來製備雙鏈體。每個反應在RNase H緩衝液（75 mM KCl、50 mM Tris-HCl、3 mM MgCl2 、10 mM二硫蘇糖醇，pH = 8.3）中含有5.6 µM ASO-RNA、U1模擬RNA或ASO-U1模擬RNA雜合物，反應體積為90 µL。在添加酶+ U1模擬物、酶+ ASO或單獨的終濃度比率為2,000 : 1、1,000 : 1或500 : 1底物 : RNase HC的酶之前，將預混合物在37°C下溫育10分鐘。實驗人員使用7.0 µL的500 mM EDTA二鈉水溶液在5、10、15、30、45和60 min時淬滅了反應。對於0 min的時間點，實驗人員在酶之前將EDTA加入到反應混合物中。實驗人員在70°C下使用緩衝液A（200 mM HFIP和8 mM三乙胺）和緩衝液B（A +甲醇，50 : 50，v/v）的梯度，在注入Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（2.7 µm，2.1 x 50 mm）後記錄了每個反應在254 nm和280 nm處的UV吸收。實驗人員從層析圖中整合了與全長RNA低聚物相對應的峰面積，並將其與反義股進行了標準化。實驗人員繪製了剩餘的RNA百分比，其中將0 min時間點定義為100%，以顯示RNA裂解的相對速率（n = 3）。實驗人員使用雙向ANOVA分析數據。誤差條表示s.d.。
用於RNase H測定的雙鏈體分析。在一些實施方式中，實驗人員混合了等莫耳的ASO、RNA和/或U1溶液，以製備終濃度為20 µM的雙鏈體。實驗人員製備了三種複合物：ASO + RNA、RNA + U1和ASO + RNA + U1。將混合物加熱至90°C持續2 min，然後緩慢冷卻至室溫超過4 h。將D1000階梯和樣本緩衝液（7 mM KCl，20 mL磷酸鹽緩衝液，20 mM胍-HCl，80 mM NaCl，20 mM乙酸鹽）在室溫下平衡30 min。藉由將1 : 1與D1000樣本緩衝液混合來製備用於分析的樣本。使用IKA渦旋在2,000 rpm下徹底混合樣本和階梯1 min。將樣本離心以確保全部體積沈澱到試管底部。實驗人員根據製造商的方案，使用高靈敏度D1000篩選帶（尺寸範圍35-1,000 bp）在4200 Agilent TapeStation上分析了雙鏈體。
熱變性（Tm）。將等莫耳量的RNA和各ASO溶解在1X PBS中，以獲得每條股1 μM的最終濃度。然後藉由在90°C加熱，然後緩慢冷卻至4°C並在4°C儲存的條件下對雙鏈樣本進行退火。使用Cary系列UV-Vis分光光度計（安捷倫科技公司），以每分鐘+0.5°C的速率將溫度從15°C升高到95°C，以30秒的間隔記錄254 nm處的UV吸收。將吸光度相對於溫度作圖，並藉由取每條曲線的一階導數來計算Tm值。
螢光素酶篩選測定。實驗人員生成了螢光素酶構建體，該構建體含有來自psiCHECK2載體中海腎螢光素酶基因3'-UTR中人類C9orf72基因（158-900個鹼基對）的序列。靶向該序列的ASO應降低海腎螢光素酶信號而不影響螢火蟲螢光素酶信號。實驗人員將海腎標準化為螢火蟲螢光素酶信號，以比較ASO與非靶向對照ASO（WV-993）的相對活性。實驗人員藉由用Lipofectamine 2000轉染到Cos-7細胞中遞送了ASO（15或30 nM）和螢光素酶報告基因構建體（20 ng）。轉染後48小時，用平板讀數器（Molecular Devices Spectramax M5）對螢火蟲和海腎螢光素酶信號進行定量。實驗人員在每個實驗中進行了三個生物學重複。
ASO傳遞到細胞模型。將人類ALS皮質神經元在NMM中於24孔板中（每孔250,000個細胞）保持至少4週，然後用指定的1 µM ASO進行裸式治療（不使用轉染試劑）一週。在培養後5天，以指定的劑量用ASO對來自C9-BAC轉基因小鼠的原代神經元進行裸式治療，並在治療15天後收集。將人類ALS運動神經元從冷凍原種接種到12孔板中（每孔280,000個細胞），並在第7天進行裸式處理，並在第14天收穫。在第10天添加50 μL含有10 ng BDNF、10 ng GDNF和1 ng TGF-β1的生長因子混合物，而無需更換培養基。將C9患者衍生的成纖維細胞鋪在10 cm皿中，然後用Lipofectamine RNAiMax試劑（ThermoScientific公司）轉染ASO。處理72小時後收穫細胞。
C9orf72轉錄物定量測定。在人類C9-ALS皮質神經元和運動神經元中，根據製造商的方案，使用Trizol（英傑公司（Invitrogen））提取了總RNA。對於每個樣本，將總RNA洗脫在29.5 μL不含RNase的水中，然後添加2 μL（4 U）的DNase I（新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs），M0303L）和3.5 μL的10X反應緩衝液。將樣本在37°C溫育15 min以去除gDNA。加入EDTA至終濃度為5 mM，並將DNase I在75°C下熱滅活10 min。根據生產商的說明，使用High-Capacity RNA-to-cDNA™ Kit（應用生物系統公司）將RNA反轉錄。實驗人員使用了以下Taqman探針：Hs00376619_m1（FAM）（目錄號4351368，賽默飛世爾公司）用於C9orf72所有轉錄物（在V1、V2和V3上通用）；Hs00948764_m1（FAM）（目錄號4351368，賽默飛世爾公司）用於C9orf72 V3轉錄物；Hs02800695_m1用於人類HPRT1轉錄物（目錄號4448486，賽默飛世爾公司）。qPCR反應：在95°C下3 min，在95°C下10 sec和60°C下30 sec的40個循環。在源自C9患者的成纖維細胞和C9-BAC原代細胞系中，使用Trizol（ThermoScientific公司）分離總RNA，然後用DNase I（凱傑公司）處理。按照製造商的說明，使用隨機六聚體和MultiScribe逆轉錄酶（ThermoScientific公司）將1 µg總RNA反轉錄為cDNA。如上所述，使用SYBR Green Master Mix（應用生物系統公司）和0.2 μM正向和反向引物在StepOnePlus即時PCR（qRT-PCR）系統上進行定量PCR。Tran, H.等人 Differential Toxicity of Nuclear RNA Foci versus Dipeptide Repeat Proteins in a Drosophila Model of C9ORF72 FTD/ALS [在C9ORF72 FTD/ALS的果蠅模型中，核RNA病灶相對於二肽重複蛋白的毒性差異]. Neuron [神經元] 87, 1207-1214, doi: 10.1016/j.neuron.2015.09.015 (2015)。為了檢測Hprt，實驗人員使用了以下引物：正向5’-CAAACTTTGCTTTCCCTGGTT,反向5’-TGGCCTGTATCCAACACTTC。將每個樣本和轉錄物的Ct值標準化為Hprt。2exp（-ΔΔCt）方法用於確定每個轉錄物的相對表現。
藉由PCR進行轉錄物分析的組織處理，並且藉由雜交ELISA進行ASO定量。實驗人員解剖組織，並新鮮冷凍於預先稱重的微量離心管（Eppendorf tube）中。實驗人員藉由對管重新稱重來計算組織重量。對於裂解，實驗人員將四倍體積的Trizol或裂解緩衝液（4 M胍；0.33% N-月桂基肌胺酸；25 mM檸檬酸鈉；10 mM DTT）添加至1單位重量（用於1 mg組織的4 μL緩衝液）中並使用Precellys在4°C下使組織均質化，直至所有組織碎片溶解。將30-50 μL組織溶解產物保存在96孔板中，以進行藥物動力學（PK）測量。剩餘的裂解產物要麼存儲在-80°C（在裂解緩衝液中），要麼用於RNA提取（在Trizol中）。
實驗人員利用以下探針藉由雜交ELISA選擇性地量化本研究中使用的ASO：捕獲探針：「C9-內含子-帽」/5AmMC12/TGGCGAGTGG；檢測探針：「C9-內含子-Det」：GTGAGTGAGG/3BioTEG/。實驗人員將馬來酸酐活化的96孔板（Pierce 15110）用50 μL的捕獲探針在500 nM在2.5% NaHCO3 （吉博公司，25080-094）中在37°C塗覆2小時。然後將板用PBST（PBS + 0.1%吐溫-20）洗滌3次，並用5%脫脂乳-PBST在37°C下阻斷1小時。將有效負載ASO連續稀釋至基質中。將該標準品與原始樣本一起用裂解緩衝液（4 M胍；0.33% N-月桂基肌胺酸；25 mM檸檬酸鈉；10 mM DTT）稀釋，使得所有樣本中的ASO量小於50 ng/mL。將20 μL的稀釋的樣本與PBST中稀釋的180 μl的333 nM檢測探針混合，然後（65°C 10 min，95°C 15 min，4°C ∞）變性。50 μL變性的樣本在封閉的ELISA板中一式三份進行分配，並在4°C溫育過夜。在用PBST洗滌3次後，添加50 μL在PBST中的1:2000鏈黴親和素-AP（SouthernBiotech公司，7100-04），每孔50 μL，並在室溫下溫育1小時。用PBST充分洗滌後，添加100 μL的AttoPhos（普洛麥格公司（Promega）S1000），在室溫在黑暗中溫育10 min，並在平板讀數器（分子儀器公司（Molecular Device），M5）上讀取螢光通道：Ex435 nm，Em555 nm。根據標準曲線，藉由4參數回歸計算樣本中的ASO。檢測的下限係1.25 μg ASO/每克組織。
小鼠腦勻漿的穩定性。實驗人員藉由將5 µL每種低聚溶液（200 µM）加到45 µL小鼠腦勻漿中（內部製備，20 mg/mL），確定了ASO在小鼠腦勻漿中的穩定性。實驗人員在37°C下以400 rpm搖動溫育每個反應。實驗人員使用20-mer DNA序列作為陽性對照來評估測定的性能。因為它沒有結合化學修飾來防止核酸酶降解，所以DNA會迅速降解。實驗人員藉由在每個時間點（0-5天）先加入50 µL終止緩衝液（2.5% IGEPAL，0.5 M NaCl，10 mM EDTA，50 mM Tris，pH = 8.0）然後渦旋來終止反應（實驗人員一式三份地進行）。實驗人員隨後向每個試管中添加20 µL內標物（50 µM：5'-GCGTTTGCTCTTCTTCUUGCGTTTTUU-3’）、250 µL的2%氫氧化銨和100 µL苯酚 : 氯仿 : 異戊醇（25 : 24 : 1）。渦旋後，實驗人員在室溫下以17,000 rpm旋轉每個反應30分鐘，並使用150 µL氯仿對水層重複上述萃取操作。將新的水層轉移到新的試管中後，實驗人員進行乾燥，然後用水以100 µL的體積重構每個樣本。使用Agilent Poroshell柱（120，EC-C18 2.7 µm，2.1 x 50 mm）和流動相A（400 mM HFIP，水中15 mM TEA）和流動相B（甲醇）將2 µL混合物注入Q Exactive質譜儀（賽默飛世爾科學公司）。實驗人員使用Xcalibur TM（4.0.27.10版，賽默飛世爾科學公司）進行數據捕獲，並計算分析物與內標的峰面積和峰面積比。分析物量的減少用於評估體外穩定性的程度。實驗人員從三個技術重複中計算出均值和標準差。
RNA病灶的螢光原位雜交（FISH）檢測。實驗人員如前所述進行FISH。Tran, H.等人 Differential Toxicity of Nuclear RNA Foci versus Dipeptide Repeat Proteins in a Drosophila Model of C9ORF72 FTD/ALS [在C9ORF72 FTD/ALS的果蠅模型中，核RNA病灶相對於二肽重複蛋白的毒性差異]. Neuron [神經元] 87, 1207-1214, doi: 10.1016/j.neuron.2015.09.015 (2015)。實驗人員使用5'端Cy3軛合(G2 C4 )3-4 探針來檢測有義重複序列的擴增，並且使用Cy3軛合(G4 C2 )3 探針檢測反義重複序列的擴增（Integrated DNA Technologies公司的探針）。探針在55°C下在含有40%甲醯胺，2X SSC，0.1%吐溫-20和鮭魚精子DNA的雜交緩衝液中雜交。然後將樣本在預熱的緩衝液和嚴格的洗滌緩衝液（0.2 XSSC，0.1%吐溫20）中在55°C下洗滌兩次。然後將樣本安裝在帶有DAPI（賽默飛世爾公司）的Prolong Gold Antifade試劑中。用Leica TCS SP5 II雷射掃描共聚焦顯微鏡拍攝共聚焦圖像，並用Leica LAS AF軟體處理。實驗人員使用Alexa Fluor 488（生命技術公司（Life Technologies））以1:500稀釋的一抗（抗-NeuN抗體，MAB377，密理博公司）和1 : 500稀釋的山羊抗小鼠二抗。實驗人員使用RPI旋轉盤共聚焦顯微鏡（蔡司公司）放大40倍，並收集了488 nm，Cy3和DAPI通道的圖像。使用Z Project功能合併了來自紅色（Cy3）、綠色（488）和藍色（DAPI）的堆疊圖像。DAPI通道用於藉由具有設定閾值（為每個實驗設定，樣本之間恒定）的轉換為掩蔽（Convert to Mask）功能來製作核掩蔽（Nuclei mask）。
RNA病灶的定量。用掩蔽識別核，並測量每個核的面積。綠色通道被NeuN染色作為神經元標記。基於NeuN將前角區域較大的核染色的觀察，核大於78 μm2 的細胞被鑒定為運動神經元，用於高通量病灶計數。Cy3通道用於識別病灶，「查找最大值（Find Maximum）」功能用於識別具有設置的雜訊容限（30至90，為每個實驗設置，樣本之間恒定）的單個點。記錄每個核內的積分密度，並將其除以255，作為該核中的病灶數目。概率模型用於計算病灶/細胞的後驗；使用R::Stats包中的函數rpois，利用泊松分佈對病灶計數和細胞計數進行建模。使用蒙特卡洛（Monte Carlo）方法獲得後驗樣本。對於每次處理藉由從後驗減去PBS（即對照）後驗（包括其本身）來對後驗進行推斷。如果複合處理的最高後驗密度95%沒有覆蓋零，那麼在95%置信度下，該等處理被認為與PBS確實不同。
使用MSD平臺進行聚GP定量。藉由在Precellys儀器中用1.4 mm氧化鋯珠振盪，將腦和脊髓樣本在4體積RIPA（50 mM Tris，150 mM NaCl，0.5% DOC，1% NP40，0.1% SDS和完全蛋白酶抑制劑，pH 8.0）中勻漿。將樣本在4°C下以10,000 rpm離心10 min，然後用600 nm蛋白質分析試劑（皮爾斯公司）測定澄清裂解物的總蛋白濃度。MSD Small-Spot板用1 μL多株捕獲抗體（兔抗聚GP；AB1358，密理博公司）的10 μg/mL溶液包被，並在4°C溫育過夜。第二天，將板用PBST洗滌，在室溫下用10% FBS/PBST溶液封閉1小時，然後用PBST洗滌，並與50-120 μg的腦裂解液溫育（以1 : 4或1 : 5稀釋進10% FBS/PBST中）2-4小時。用PBST洗滌板，並與磺酸基標記軛合的檢測抗體（兔抗聚GP；AB1358，密理博公司）在室溫下溫育1小時。將板用PBST洗滌，並與150 μL MSD讀取緩衝液T 1X溫育，並在MSD QuickPlex SQ 120平板讀數器中讀取。在野生型小鼠皮質或脊髓勻漿的基質中製備了重組純化的聚GPx30的標準曲線。從空孔中減去測得的背景信號後，使用標準曲線的線性最佳擬合回歸線對每微克組織的聚GP濃度進行插值。
蛋白質印跡法。實驗人員藉由蛋白質印跡法定量了C9orf72蛋白質的表現。簡言之，用預製的4%-12% SDS-PAGE（標準凝膠，伯樂公司（Bio-Rad））對來自RIPA提取物的蛋白質進行大小分級，且將其轉移至PVDF膜上。為了檢測C9orf72，實驗人員使用小鼠單株抗C9orf72抗體GT779（1 : 2,000；吉恩特克斯公司（GeneTex Inc.））和DyLight軛合的二抗。實驗人員使用Odyssey成像系統（LI-COR Biosciences公司）視覺化並定量了印跡。分析2週數據和8週數據的全尺寸印跡。
組織製備。使用2步驟提取程序來處理腦和脊髓樣本；每個步驟之後，在4°C下以10,000 rpm離心10 min。實驗人員首先將樣本在RIPA（50 mM Tris，150 mM NaCl，0.5% DOC，1% NP40，0.1% SDS和Complete（完全），pH 8.0）緩衝液中勻漿，然後將沈澱重新懸浮在5 M胍-HCl中。實驗人員使用MSD阻斷劑A套盒（R93AA-2）（中尺度診斷公司）用磺基標記物軛合的抗聚GP進行Meso Scale Discovery（中尺度發現公司）分析，對每個池中的聚GP進行了定量。實驗人員使用多株抗GP抗體AB1358（密理博西格瑪公司）作為捕獲抗體和檢測抗體。MSD（MESO QUICKPLEX SQ 120）根據製造商的說明書（中尺度診斷公司）讀取測定值。與基於稀釋到野生型小鼠大腦RIPA裂解物中的親和純化的Flag-聚GP（GenScript公司）的標準曲線相比，實驗人員對聚GP進行了定量。
藥物動力學（PK）分析。使用具有一階吸收率和一階消除率的單室模型對C9orf72-631的平均組織濃度-時間曲線進行建模。組織濃度藉由以下方式描述： Ct = 劑量*Ka/V*(Ka-Ke) *(exp(-Ka*t)-exp(-Ke*t) 其中Ct 代表組織濃度，劑量代表施用量，Ka代表吸收率，V代表體積分佈，Ke代表消除率，並且t代表給藥後時間。組織的終末半衰期推導為ln2/Ke。還對2室模型進行了測試，但似乎參數過高。所有低於定量限值的均設置為零進行分析。使用Phoenix® WinNonlin® 8.1軟體程式（Certara，普林斯頓，新澤西州，美國）估算模型參數。
ViewRNA ISH測定。
實驗人員採用了ViewRNA ISH組織1-Plex測定（賽默飛世爾科學公司，目錄號QVT0051）來原位檢測ASO。簡而言之，在停止小鼠後，將半腦和脊髓活檢在10%中性緩衝福馬林中於2°C至8°C固定過夜，進行處理並包埋在石蠟中。製備石蠟切片（厚度為5 μm），並在室溫下保存直至使用。將載玻片在60°C烘烤至少1小時後，將切片在二甲苯（VWR Chemicals公司）中溫育10分鐘，然後在100%乙醇（賽默飛世爾科學公司）中漂洗以進行脫蠟。在室溫下將載玻片風乾至少30分鐘後，創建疏水屏障並乾燥，然後繼續執行ViewRNA ISH標準方案。用預熱的靶標回收試劑對再水化的載玻片在95°C（確定的溫度）下進行10分鐘的進行加熱處理，然後在37°C的蛋白酶消化（Protease QF 1 : 100在1X PBS中，預熱）15分鐘。將處理過的載玻片在1X PBS中攪動沖洗，然後用QuantiGene ViewRNA miRNA探針組處理WVE-3972-01，肽基脯胺醯異構酶B（PPiB）（陽性對照）和/或二氫二吡啶甲酸酯還原酶（dapB）（陰性對照）（賽默飛世爾科學公司）在40°C下於預熱的探針組稀釋液（Probe Set Diluent）QT（每部分300 µL）中稀釋至12.5 nM，持續2 h。漂洗過的載玻片可以在室溫下保存長達24 h。為了進行信號放大和檢測，將載玻片在預熱的放大稀釋劑（Amplifier Diluent）QF中以1 : 200稀釋的PreAmp1 QF工作溶液中於40°C溫育30分鐘；並在攪拌下在洗滌緩衝液中漂洗，然後在預熱的放大稀釋劑（Amplifier Diluent）QF中以1 : 200稀釋的Amp1 QF工作溶液中在40°C下溫育20分鐘並在攪拌下在洗滌緩衝液中漂洗，然後將其在Label Probe-AP工作溶液（在Label Probe Diluent QF中以1 : 1000稀釋）在40°C下溫育20分鐘，並在洗滌緩衝液中攪拌沖洗。添加AP-Enhancer溶液並在室溫下溫育5分鐘，然後添加Fast Red底物，將其在40°C下溫育30分鐘以形成紅色沈澱。之後，將核酸DNA用蘇木精和/或Hoechst 33342染料複染。將載玻片用ProLong Gold Antifade固定介質進行固定，並蓋上薄玻璃蓋玻片。對於每個半腦/脊髓橫截面，在明場或螢光場下，使用Zeiss Axio Observer顯微鏡（蔡司公司，索恩伍德（Thornwood），紐約州（NY），美國）生成代表性的數字圖像。
進行了體內視覺化，並使用旨在檢測8週治療組組織切片上的WV-30210的ViewRNA探針來評估寡核苷酸在腦和脊髓組織中的分佈。證實了WV-30210可以廣泛分佈在整個組織中並富含神經元。
統計分析。除非另有說明，否則藉由單向方差分析（ANOVA），然後使用SigmaPlot 13.0對Student-Newman-Keuls事後分析進行體內數據分析。
使用Capillary Western Immunoassay（毛細管Western免疫測定法）（Wes）定量C9orf72蛋白質表現。
以下以使用Was的評估為例進行說明。材料： RIPA裂解和提取緩衝液（賽默飛世爾科學公司（Thermo Scientific），目錄號89901） 皮爾斯蛋白酶抑制劑迷你片劑（Pierce Protease Inhibitor Mini Tablet）（生命技術公司，目錄號A32953） Bertin技術公司Precellys Evolution組織勻漿器（Bertin Technologies Precellys Evolution Tissue Homogenizer） 皮爾斯（Pierce）BCA試劑A和B（飛世爾科學公司（Fisher Scientific），目錄號PI23228和目錄號PI23224） 皮爾斯牛血清白蛋白標準品（Pierce Bovine Serum Albumin standards）（賽默飛世爾科學公司，目錄號23208） Wes系統（普諾森生物科技公司（ProteinSimple），目錄號004-600） Jess/Wes分離套盒12-230 kDa（普諾森生物科技公司，目錄號SM-W004） 抗C9orf72抗體，小鼠（吉恩特克斯公司（GeneTex），目錄號GTX632041） 抗HPRT抗體，兔（安諾倫生物科技公司（Novus Biologics），目錄號NBPI-33527） 抗兔檢測模組（普諾森生物科技公司，目錄號DM-001） 抗小鼠檢測模組（普諾森生物科技公司，目錄號DM-002）
方法：
來自脊髓和皮質組織的蛋白裂解物係藉由在片劑中加入10倍重量體積的RIPA緩衝液和一小勺裂解珠來製備的。然後將樣本在Precellys Evolution組織勻漿器上進行勻漿2-4個循環（3 x 20秒；6800 rpm），並在4度以14000 rpm離心10 min。將上清液小心地轉移到新管中。為了測量總蛋白濃度，根據製造商的方案，使用帶有BSA標準品的Pierce BCA蛋白測定套盒對20 µl裂解液的15倍稀釋液進行定量。將裂解液在0.1X樣本緩衝液中標準化為0.5 ug/uL。根據製造商的說明書，使用12-230 kDa分離模組、抗兔檢測模組和抗小鼠檢測模組，在Wes系統上進行C9orf72定量。將裂解液與Fluorescent Master Mix混合，並在95°C下變性5分鐘。將樣本、封閉劑（抗體稀釋劑）、一抗（抗體稀釋劑中的1 : 100抗C9orf72、1 : 250 抗HPRT）、HRP軛合的二抗（即用型抗小鼠與即用型抗兔以1:1的比率結合）和化學發光底物移入平板中。使用儀器的預設設置：在475 V下堆疊和分離30 min；封閉劑持續5 min，一抗和二抗均持續30 min；魯米諾/過氧化物化學發光檢測持續約15 min（暴露1-2-4-8-16-32-64-128-512s）。藉由Compass軟體自動量化產生的化學發光（曲線下的面積或檢測到的峰的「AUC」），並顯示為電泳圖或虛擬印跡樣圖像。藉由將C9orf72峰的AUC除以HPRT峰的AUC來分析計算出的濃度。然後將PBS處理的動物組平均，並將所有數據點除以該值。 實例5. C9orf72寡核苷酸組成物在體內具有活性
根據本揭露，包括動物模型在內的多種技術可用於評估所提供的技術。在一些實施方式中，在小鼠模型中評估了所提供的技術。例如，進行了藥效學研究，以評估敲低C9orf72產物時的某些C9orf72寡核苷酸組成物。
測試的C9orf72寡核苷酸係：WV-8012、WV-23741、WV-26633、WV-30206和WV-28478。陰性對照係PBS（磷酸鹽緩衝鹽水）。
所使用的動物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2-3月齡，6個組，38隻小鼠。表11A示出了劑量設計。
[表11A].體內研究設計
組 測試物品 劑量 給藥方案 劑量體積 小鼠總數/每組* 屍體剖檢時間點
1 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 uL 5 2週
2 WV-8012 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 uL 5 2週
3 WV-23741 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 uL 7 2週
4 WV-26633 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 uL 7 2週
5 WV-30206 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 uL 7 2週
6 WV-28478 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 uL 7 2週
進行ICV套管插入術。在第1天在清醒的動物中經ICV注射PBS或50 μg寡核苷酸。在第7天，第二次劑量的PBS或50 μg寡核苷酸。劑量體積2.5 uL。第一次注射後2週進行屍體剖檢。
屍體剖檢：
時間點：2週
組織：
一個半腦在福馬林中（組織學，石蠟）。
在稱重的試管中（PK/PD），將皮質（CX）、海馬、小腦和腰脊髓（SC）的上半部分快速冷凍。
腰脊髓的下半部分，在未稱重的試管（DPR）中快速冷凍。
頸和胸脊髓，福馬林（RNA病灶定量，OCT冷凍塊）
結果示於表11B-11I中。
從脊髓（SC）（所有轉錄物表11B，V3表11C）和大腦皮質（CX）（所有轉錄物表11D，V3表11E）分析轉錄物。從大腦皮質（CX）（表11F）和脊髓（SC）（表11G）分析了所有劑量組的聚GP水平。從脊髓（SC）（表11H）和大腦皮質（CX）（表11I）分析了C9orf72蛋白質。實例4中揭露了C9orf72蛋白質分析的方案（使用毛細管Western免疫測定法（Wes）定量C9orf72蛋白質表現）。
[表11B].轉錄物分析，脊髓（SC），所有轉錄物
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
1.1263 1.022 0.743 0.656 0.830
1.3581 0.934 0.689 0.525 0.748
0.9604 0.629 0.748 0.583 0.994
0.7587 0.825 0.442 0.738 0.477 1.396
0.7964 0.536 0.647 0.764 0.515 0.718
0.436 0.515 0.504 1.015
0.759 0.522 0.454 0.775
[表11C].轉錄物分析，脊髓（SC），V3
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
0.999 0.287 0.297 0.466 0.248
1.172 0.308 0.349 0.334 0.607
0.959 0.233 0.182 0.255 0.212
0.870 0.323 0.138 0.299 0.303 0.230
0.999 0.291 0.262 0.507 0.240 0.525
0.216 0.361 0.374 0.301
0.312 0.236 0.182 0.260
[表11D].轉錄物分析，大腦皮質（CX），所有轉錄物
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
0.8727 0.604 0.776 0.922 0.648 0.776
0.9289 0.776 0.671 0.948 0.942 0.680
1.1436 0.639 0.675 0.809 0.484 0.621
1.0523 0.685 0.803 0.588 0.694 0.714
1.0025 0.661 0.699 0.724 0.680 0.699
0.739 0.714 0.666 0.760
0.584 0.661 0.481 0.704
[表11E].轉錄物分析，大腦皮質（CX），V3
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
1.063 0.582 0.806 0.876 0.659 0.547
1.034 0.711 0.641 1.034 0.711 1.063
1.155 0.641 0.570 0.706 0.558 0.637
0.789 0.637 0.778 0.752 0.852 0.594
0.958 0.532 0.811 0.664 0.716 0.562
0.768 0.870 0.602 0.692
0.687 0.882 0.414 0.650
[表11F].聚GP水平（所有劑量），大腦皮質（CX）
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28748
2.1830 0.680 1.239 1.119 1.387 0.690
2.3560 0.735 1.179 1.188 0.499 1.250
3.8870 0.894 0.882 1.344 0.703 0.481
0.9520 1.007 0.927 0.180 1.420 0.458
1.1490 0.662 0.789 0.910 0.518 0.622
0.913 0.896 0.543 0.889
1.162 1.641 1.134 1.220
[表11G].聚GP水平（所有劑量），脊髓（SC）
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28748
0.968 0.000 0.000 0.284 0.482 0.454
2.868 0.000 0.198 0.502 0.000 0.361
1.445 0.000 0.645 1.117 0.000 0.000
2.165 0.130 0.416 0.088 0.000 0.000
1.345 0.210 0.193 0.382 0.000 0.100
0.173 0.373 0.287 0.469
0.000 0.181 0.121 0.262
[表11H]. C9orf72蛋白質分析脊髓（SC）
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
1.1419 1.158 0.973 0.793 0.536 0.966
0.6477 1.178 0.945 0.988 0.617 1.058
0.9952 1.013 0.584 0.764 0.932 1.353
1.0976 0.756 0.846 0.865 0.812 1.287
1.1176 0.975 1.007 0.642 0.555 0.699
0.686 0.712 0.418 0.806
1.051 0.539 0.867 1.208
[表11I]. C9orf72蛋白質分析大腦皮質（CX）
PBS WV-8012 WV-23741 WV-26633 WV-30206 WV-28478
0.983 1.041 0.944 0.957 0.829 1.148
0.959 1.023 1.071 1.082 0.996 1.055
1.088 1.138 1.002 0.946 0.879 1.095
0.894 1.089 1.007 0.984 0.972 1.022
1.077 1.148 1.092 1.096 0.701 1.062
0.982 1.020 0.989 1.062
1.008 0.822 1.064 0.964
如本文所證明，多種C9orf72寡核苷酸組成物可以敲低與病症、障礙或疾病相關的C9orf72產物。
實例6. C9orf72寡核苷酸組成物在體內具有活性
在另一個實例中，進行了藥效學研究，以評估敲低C9orf72產物時的某些C9orf72寡核苷酸組成物。
測試的C9orf72寡核苷酸係：WV-30206、WV-30210、WV-30211和WV-30212。陰性對照係PBS（磷酸鹽緩衝鹽水）。
所使用的動物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2-4月齡，15個組，102隻小鼠。表12A示出了劑量設計。
[表12A].體內研究設計
組 測試物品 劑量 給藥方案 劑量體積 小鼠總數/每組* 屍體剖檢
時間點
1 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 ul 6 8週
2 WV-30206 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 8週
3 WV-30210 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 8週
4 WV-30211 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 8週
5 WV-30212 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 8週
6 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 ul 6 4週
7 WV-30206 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 4週
8 WV-30210 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 4週
9 WV-30211 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 4週
10 WV-30212 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 4週
11 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 ul 6 2週
12 WV-30206 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 2週
13 WV-30210 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 2週
14 WV-30211 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 2週
15 WV-30212 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ul 7 2週
進行ICV套管插入術。在第1天在清醒的動物中經ICV注射PBS或50 μg寡核苷酸。在第7天，第二次劑量的PBS或50 μg寡核苷酸。劑量體積2.5 uL。首次注射後2週、4週和8週進行屍體剖檢。
屍體剖檢：
時間點：2週、4週和8週
組織：
一個半腦在福馬林中（組織學，石蠟）。
在稱重的試管中（PK/PD），將皮質（CX）、海馬、小腦、肝、腎和腰脊髓（SC）的上半部分快速冷凍。
腰脊髓的下半部分，在未稱重的試管（DPR）中快速冷凍。
頸和胸脊髓，福馬林（RNA病灶定量，OCT冷凍塊）。
結果示於表12B-12I中。
從脊髓（SC）（所有轉錄物表12B，V3表12C）和大腦皮質（CX）（所有轉錄物表12D，V3表12E）分析轉錄物。從大腦皮質（CX）（表12F）和脊髓（SC）（表12G）分析了所有劑量組的聚GP水平。從脊髓（SC）（表12H）和大腦皮質（CX）（表12I）分析了C9orf72蛋白質。實例4中揭露了C9orf72蛋白質分析的方案（使用毛細管Western免疫測定法（Wes）定量C9orf72蛋白質表現）。
[表12B].轉錄物分析，脊髓（SC），所有轉錄物
PBS 2 wk WV-30206 2 wk WV-30210 2 wk WV-30211 2 wk WV-30212 2 wk PBS 4 wk WV-30206 4 wk WV-30210 4 wk WV-30211 4 wk WV-30212 4 wk
0.90 0.64 0.56 0.58 0.51 0.98 0.63 0.58 0.51 0.56
1.17 0.71 0.49 0.41 0.58 0.93 0.98 0.65 0.59 0.51
1.05 0.70 0.53 0.55 0.53 1.06 0.59 0.42 0.62 0.53
0.94 0.83 0.65 0.46 0.50 0.98 0.57 0.78 0.57
0.90 0.72 0.52 0.50 0.47 1.09 0.79 0.43 0.62 0.72
1.04 0.83 0.49 0.50 0.50 0.96 0.39 0.42 0.54 0.51
0.74 0.69 0.51 0.62 0.87 0.81 0.49 0.54
PBS 8 wk WV-30206 8 wk WV-30210 8 wk WV-30211 8 wk WV-30212 8 wk
0.97 0.84 0.68 0.56 0.37
1.11 1.03 0.55 0.49 0.50
0.91 0.88 0.41 0.42 0.58
1.01 1.09 0.63 0.57 0.51
1.06 0.98 0.45 0.65 0.47
0.93 1.01 0.47 0.72 0.71
1.00 0.39 0.51 0.43
[表12C].轉錄物分析，脊髓（SC），V3
PBS 2 wk WV-30206 2 wk WV-30210 2 wk WV-30211 2 wk WV-30212 2 wk PBS 4 wk WV-30206 4 wk WV-30210 4 wk WV-30211 4 wk WV-30212 4 wk
0.86 0.73 0.60 0.63 0.47 0.86 0.59 0.42 0.47 0.53
1.24 0.76 0.47 0.19 0.53 1.11 0.91 0.60 0.55 0.41
0.84 0.71 0.47 0.59 0.47 0.95 0.64 0.34 0.59 0.41
0.99 0.82 0.71 0.39 0.45 1.03 0.45 0.67 0.47
0.90 0.68 0.48 0.52 0.58 0.99 0.88 0.17 0.73 0.75
1.17 0.99 0.44 0.57 0.50 1.06 0.27 0.27 0.37 0.43
0.90 0.66 0.43 0.74 0.78 0.76 0.52 0.39
PBS 8wk WV-30206 8wk WV-30210 8wk WV-30211 8wk WV-30212 8wk
0.94 0.72 0.47 0.47 0.09
1.07 0.92 0.41 0.33 0.28
1.01 0.80 0.13 0.16 0.33
0.91 0.96 0.46 0.42 0.31
1.22 1.00 0.32 0.34 0.33
0.86 0.83 0.19 0.59 0.63
0.94 0.09 0.26 0.13
[表12D].轉錄物分析，大腦皮質（CX），所有轉錄物
PBS 2 wk WV-30206 2 wk WV-30210 2 wk WV-30211 2 wk WV-30212 2 wk PBS 4 wk WV-30206 4 wk WV-30210 4 wk WV-30211 4 wk WV-30212 4 wk
0.90 0.64 0.56 0.58 0.51 0.98 0.63 0.58 0.51 0.56
1.17 0.71 0.49 0.41 0.58 0.93 0.98 0.65 0.59 0.51
1.05 0.70 0.53 0.55 0.53 1.06 0.59 0.42 0.62 0.53
0.94 0.83 0.65 0.46 0.50 0.98 0.57 0.78 0.57
0.90 0.72 0.52 0.50 0.47 1.09 0.79 0.43 0.62 0.72
1.04 0.83 0.49 0.50 0.50 0.96 0.39 0.42 0.54 0.51
0.74 0.69 0.51 0.62 0.87 0.81 0.49 0.54
PBS 8 wk WV-30206 8 wk WV-30210 8 wk WV-30211 8 wk WV-30212 8 wk
0.97 0.84 0.68 0.56 0.37
1.11 1.03 0.55 0.49 0.50
0.91 0.88 0.41 0.42 0.58
1.01 1.09 0.63 0.57 0.51
1.06 0.98 0.45 0.65 0.47
0.93 1.01 0.47 0.72 0.71
1.00 0.39 0.51 0.43
[表12E].轉錄物分析，大腦皮質（CX），V3
PBS 2 wk WV-30206 2 wk WV-30210 2 wk WV-30211 2 wk WV-30212 2 wk PBS 4 wk WV-30206 4 wk WV-30210 4 wk WV-30211 4 wk WV-30212 4 wk
0.86 0.73 0.60 0.63 0.47 0.86 0.59 0.42 0.47 0.53
1.24 0.76 0.47 0.19 0.53 1.11 0.91 0.60 0.55 0.41
0.84 0.71 0.47 0.59 0.47 0.95 0.64 0.34 0.59 0.41
0.99 0.82 0.71 0.39 0.45 1.03 0.45 0.67 0.47
0.90 0.68 0.48 0.52 0.58 0.99 0.88 0.17 0.73 0.75
1.17 0.99 0.44 0.57 0.50 1.06 0.27 0.27 0.37 0.43
0.90 0.66 0.43 0.74 0.78 0.76 0.52 0.39
PBS 8 wk WV-30206 8 wk WV-30210 8 wk WV-30211 8 wk WV-30212 8 wk
0.94 0.72 0.47 0.47 0.09
1.07 0.92 0.41 0.33 0.28
1.01 0.80 0.13 0.16 0.33
0.91 0.96 0.46 0.42 0.31
1.22 1.00 0.32 0.34 0.33
0.86 0.83 0.19 0.59 0.63
0.94 0.09 0.26 0.13
[表12F].聚GP水平（所有劑量），大腦皮質（CX）
PBS 2 wk PBS 4 wk PBS 8 wk WV-30206 2 wk WV-30206 4 wk WV-30206 8 wk WV-30210 2 wk WV-30210 4 wk WV-30210 8 wk
1.10 0.66 0.52 0.44 0.25 0.10
0.22 0.71 0.27 0.18 0.63 0.09 0.42 0.00
1.08 0.57 0.91 0.60 0.09 0.68 0.00 0.00 0.25
0.89 2.06 1.16 0.73 0.17 0.46 0.18 0.10 0.00
0.97 1.05 0.59 0.93 0.41 0.34 0.09 0.00 0.00
0.96 1.10 1.98 0.69 0.46 0.48 0.10 0.00 0.00
0.45 0.34 0.69 0.50 0.29 0.00
PBS 2 wk PBS 4 wk PBS 8 wk WV-30211 2 wk WV-30211 4 wk WV-30211 8 wk WV-30212 2 wk WV-30212 4 wk WV-30212 8 wk
1.10 0.66 0.57 0.00 0.28 0.00
0.22 0.71 0.16 0.00 0.09 0.24 0.00 0.05
1.08 0.57 0.91 0.36 0.77 0.00 0.26 0.09 0.05
0.89 2.06 1.16 2.25 0.57 0.10 0.26 0.00 0.06
0.97 1.05 0.59 0.27 0.80 0.19 0.27 0.35 0.00
0.96 1.10 1.98 0.38 0.16 0.47 0.42 0.34 0.08
0.11 0.24 0.00 0.45 0.13 0.00
[表12G].聚GP水平（所有劑量），脊髓（SC）
PBS 2 wk PBS 4 wk PBS 8 wk WV-30206 2 wk WV-30206 4 wk WV-30206 8 wk WV-30210 2 wk WV-30210 4 wk WV-30210 8 wk
1.10 0.81 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
0.57 0.94 0.88 0.00 0.13 0.00 0.23 0.00
1.22 1.79 1.40 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
1.12 0.67 0.84 0.24 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
1.08 1.11 1.00 0.00 0.00 0.26 0.00 0.00 0.00
0.90 0.68 0.89 0.23 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
0.00 0.00 0.00 0.00 0.20 0.00
PBS 2 wk PBS 4 wk PBS 8 wk WV-30211 2 wk WV-30211 4 wk WV-30211 8 wk WV-30212 2 wk WV-30212 4 wk WV-30212 8 wk
1.10 0.81 0.23 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
0.57 0.94 0.88 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
1.22 1.79 1.40 0.00 1.06 0.00 0.00 0.00
1.12 0.67 0.84 1.79 0.24 0.00 0.00 0.00 0.00
1.08 1.11 1.00 0.30 0.23 0.13 0.00 0.00 0.00
0.90 0.68 0.89 0.35 0.00 0.30 0.00 0.00
0.00 0.00 0.00 0.23 0.00 0.00
[表12H]. C9orf72蛋白質分析脊髓（SC）
PBS WV-30206 WV-30210 WV-30211 WV-30212
0.77 1.02 0.90 1.18 1.01
1.07 1.02 0.95 1.05 1.14
1.09 0.77 1.03 0.89
1.02 1.03 0.73 1.04 1.15
1.13 1.07 1.05 0.92 0.99
0.92 1.00 1.06 0.99 1.16
0.85 0.89 1.08 0.88
[表12I]. C9orf72蛋白質分析大腦皮質（CX）
PBS WV-30206 WV-30210 WV-30211 WV-30212
1.01 0.95 1.11 1.02 0.93
1.13 1.12 0.97 1.14 0.97
0.85 1.04 0.93 0.91 1.10
0.78 1.05 1.00 0.98 0.93
1.08 0.88 0.87 0.96 0.99
1.15 1.08 0.74 1.11 1.06
1.08 0.90 0.96 0.97
如本文所證明，多種C9orf72寡核苷酸組成物可以敲低與病症、障礙或疾病相關的C9orf72產物。
實例7. C9orf72寡核苷酸組成物在體內具有活性
在另一個實例中，進行了藥效學研究，以評估敲低C9orf72產物時的某些C9orf72寡核苷酸組成物。
所測試的C9orf72寡核苷酸係WV-8012和WV-21446。陰性對照係PBS（磷酸鹽緩衝鹽水）。
所使用的動物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2月齡。表13A示出了劑量設計。
[表13A].體內研究設計
組 測試物品 劑量 給藥方案 劑量體積 小鼠總數/每組* 屍體剖檢時間點
1 PBS NA ICV，第0天 2.5 ml 5 2週
2 WV-8012 25 ug ICV，第0天 2.5 ml 4 2週
3 WV-8012 50 ug ICV，第0天 2.5 ml 5 2週
4 WV-8012 100 ug ICV，第0天 2.5 ml 5 2週
5 WV-21446 25 ug ICV，第0天 2.5 ml 7 2週
6 WV-21446 50 ug ICV，第0天 2.5 ml 7 2週
7 WV-21446 100 ug ICV，第0天 2.5 ml 7 2週
8 NA NA NA NA 4 2週
屍體剖檢：
時間點：2週
組織：
一個半腦在福馬林中（組織學，石蠟）。
在稱重的試管中（PK/PD），將皮質、海馬、小腦和一半腰脊髓快速冷凍。
另一半腰脊髓，在未稱重的試管（DPR）中快速冷凍。
頸和胸脊髓，福馬林（RNA病灶定量，OCT冷凍塊）。結果示於表13B-13G中。
從大腦皮質（CX）（所有轉錄物表13B，V3表13C）和脊髓（SC）（所有轉錄物表13D，V3表13E）分析轉錄物。
[表13B].轉錄物分析，大腦皮質（CX），所有轉錄物
PBS WV-8012（25 ug） WV-8012（50 ug） WV-8012（100 ug） WV-21446（25 ug） WV-21446（50 ug） WV-21446（100 ug）
1.04 1.02 0.87 0.89 0.79 0.85 0.68
1.07 0.86 0.81 0.77 0.91 0.81 0.76
0.87 0.89 1.00 0.83 0.89 0.96 0.78
1.02 0.89 0.97 0.93 0.86 0.91
0.75 1.17 0.77 0.76
0.92 0.61 0.66
1.06 0.56 0.69
[表13C].轉錄物分析，大腦皮質（CX），V3
PBS WV-8012（25 ug） WV-8012（50 ug） WV-8012（100 ug） WV-21446（25 ug） WV-21446（50 ug） WV-21446（100 ug）
0.97 0.89 0.91 0.74 0.59 0.47 0.39
0.94 0.96 0.85 0.80 1.12 0.85 0.77
0.97 1.10 1.05 0.93 1.05 0.98 0.90
1.11 0.92 1.05 0.87 0.95 0.89
0.73 1.18 0.72 0.47
1.03 0.64 0.44
0.98 0.46 0.61
[表13D].轉錄物分析，脊髓（SC），所有轉錄物
PBS WV-8012（25 ug） WV-8012（50 ug） WV-8012（100 ug） WV-21446（25 ug） WV-21446（50 ug） WV-21446（100 ug）
1.05 0.66 1.07 0.99 0.83 0.93 1.11
1.07 0.73 1.05 0.76 0.79 1.03 0.90
0.79 0.76 0.86 1.26 1.28 0.75 0.83
1.10 0.83 0.72 0.74 0.68 0.91
0.93 0.79 0.79 0.94
0.58 0.79 0.83
0.61 0.70 0.86
[表13E].轉錄物分析，脊髓（SC），V3轉錄物
PBS WV-8012（25 ug） WV-8012（50 ug） WV-8012（100 ug） WV-21446（25 ug） WV-21446（50 ug） WV-21446（100 ug）
1.08 0.54 1.23 1.04 0.22 0.90 0.16
1.16 0.60 0.45 0.33 0.24 0.20 0.13
0.71 0.52 0.90 1.20 1.33 0.59 0.22
1.05 0.68 0.35 0.45 0.39 0.50
0.36 0.96 0.13 0.16
0.27 0.13 0.15
0.24 0.14 0.14
評估了WV-8012和WV-21446的CNS組織暴露。在腦和脊髓組織中觀察到劑量依賴性增加（2週屍體剖檢）。平均組織濃度： WV-8012：腦（0.4-2.1 µg/g），脊髓：（1.5-2.7 µg/g）；以及 WV-21446：腦（0.4-2.9 µg/g），脊髓：（1.8-6.3 µg/g）。
[表13F].組織暴露，腦（ug寡核苷酸/g組織）
PBS WT WV-8012 25 μg WV-8012 50 μg WV-8012 100 μg
0.00 0.00 0.40 1.11 2.97
0.40 0.67 0.95 2.16 1.41
0.00 0.40 0.74 0.42 0.61
0.36 0.35 0.64 1.15 0.72
4.77
PBS WT WV-21446 25 μg WV-21446 50 μg WV-21446 100 μg
0.00 0.00 0.64 10.76 6.29
0.00 0.40 0.00 0.46 0.78
0.00 0.00 0.00 0.32 0.39
0.00 0.00 0.38 0.44 0.00
0.00 1.16 3.92
0.00 1.15 7.33
0.00 3.04 1.41
[表13G].組織暴露，脊髓（ug寡核苷酸/g組織）
PBS WT WV-8012 25 μg WV-8012 50 μg WV-8012 100 μg
0.00 0.32 2.42 0.39 0.55
0.00 0.00 0.70 5.42 5.32
0.00 0.00 1.21 0.74 0.81
0.00 0.00 1.78 2.99 2.57
4.26
PBS WT WV-21446 25 μg WV-21446 50 μg WV-21446 100 μg
0.00 0.00 1.72 0.34 13.34
0.00 0.00 4.48 4.16 6.44
0.00 0.00 0.00 0.68 2.64
0.00 0.00 2.04 0.66 0.12
0.32 1.92 8.58
1.54 5.12 6.30
2.20 2.00 6.40
如本文所證明，C9orf72寡核苷酸組成物可被遞送並可以敲低與病症、障礙或疾病相關的C9orf72產物。
實例8. C9orf72寡核苷酸組成物在體內具有活性
在另一個實例中，進行了藥效學研究，以評估敲低C9orf72產物時的某些C9orf72寡核苷酸組成物。
所測試的C9orf72寡核苷酸係WV-30210和WV-30212。陰性對照係PBS（磷酸鹽緩衝鹽水）。
所使用的動物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2-4月齡。表14A示出了劑量設計。
[表14A].體內研究設計
組 測試物品 劑量 給藥方案 劑量體積 小鼠總數/每組* 屍體剖檢時間點
1 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
2 WV-30210 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
3 WV-30210 15/15 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
4 WV-30210 5/5 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
5 WV-30210 1.5/1.5 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
6 WV-30212 50/50 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
7 WV-30212 15/15 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
8 WV-30212 5/5 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
9 WV-30212 1.5/1.5 ug ICV，第0天，第7天 2.5 ml 8 6週
時間點：6週。
來自每隻動物的組織：
皮質：將來自兩個半腦的皮質組合，快速冷凍，放入一個稱重的試管中。
脊髓：將上腰椎脊髓和下腰椎脊髓分離，快速冷凍，放入兩個試管中，上腰椎放入稱重的試管（RNAPD和Trizol PK）中，下腰椎放入未稱重的試管（DPR）中。頸+胸脊髓，在稱重的試管中快速冷凍（蛋白酶K PK）。
海馬和小腦：將來自兩個半腦的海馬和小腦分開，快速冷凍，放入兩個未稱重的試管中。
結果示於表14B-14G中。
從大腦皮質（CX）（所有轉錄物表14B，V3表14C，組織暴露表14D）和脊髓（SC）（所有轉錄物表14E，V3表14F，組織暴露表14G）分析轉錄物。
[表14B].轉錄物分析，大腦皮質（CX），所有轉錄物
PBS WV-30210 50,50 WV-30210 15,15 WV-30210 5, 5 WV-30210 1.5, 1.5 WV-30212 50,50 WV-30212 15,15 WV-30212 5, 5 WV-30212 1.5, 1.5
0.68 0.45 0.77 0.86 1.08 0.44 0.55 0.80 0.71
0.90 0.49 0.81 1.14 1.04 0.69 0.83 0.64 0.49
1.22 0.59 1.00 1.20 0.57 0.62 0.67 0.65
1.16 0.52 0.86 1.16 1.27 0.93 0.74 0.73 0.85
0.99 0.53 0.86 0.59 1.31 0.63 0.71 0.56 0.91
0.99 0.73 1.18 0.94 1.24 0.67 1.02 0.69 1.07
1.09 0.45 0.31 1.09 1.09 0.58 0.73 1.08 0.87
0.96 1.32 0.89 1.01 1.36 0.55 1.06 1.04 1.15
[表14C].轉錄物分析，大腦皮質（CX），V3轉錄物
PBS WV-30210 50,50 WV-30210 15,15 WV-30210 5, 5 WV-30210 1.5, 1.5 WV-30212 50,50 WV-30212 15,15 WV-30212 5, 5 WV-30212 1.5, 1.5
0.89 0.30 0.75 0.76 0.91 0.23 0.61 0.69 0.63
0.90 0.49 0.83 0.98 0.94 0.57 0.81 0.78 0.47
0.98 0.70 0.82 0.91 0.55 0.51 0.73 0.50
0.90 0.26 0.78 0.84 0.94 0.69 0.48 0.66 0.64
1.04 0.37 0.77 0.56 0.98 0.66 0.70 0.66 0.82
1.18 0.60 0.90 0.92 1.14 0.62 0.92 0.71 1.03
1.06 0.42 0.19 0.93 1.10 0.39 0.79 0.92 0.76
1.05 1.19 0.93 1.02 1.09 0.52 0.93 0.89 1.11
[表14D].組織暴露，大腦皮質（CX）（ug寡核苷酸/g組織）
PBS WV-30210 50/50 ug WV-30210 15/15 ug WV-30210 5/5 ug WV-30210 1.5/1.5 ug WV-30212 50/50 ug WV-30212 15/15 ug WV-30212 5/5 ug WV-30212 1.5/1.5 ug
0.00 15.38 1.42 0.20 0.04 21.97 1.48 0.21 0.04
0.00 4.04 0.67 0.09 0.04 2.20 1.03 0.24 0.05
0.00 0.29 0.18 2.15 1.90 0.21 0.07
0.00 7.71 0.46 0.38 0.03 0.92 2.61 0.35 0.06
0.00 4.37 0.62 1.69 0.04 1.52 0.54 0.97 0.06
0.00 1.47 0.46 0.27 0.01 3.54 0.36 0.13 0.07
4.00 0.91 0.34 0.11 3.38 0.46 0.15 0.05
0.00 1.26 0.36 0.06 0.01 4.39 0.45 0.23 0.08
[表14E].轉錄物分析，脊髓（SC），所有轉錄物
PBS WV-30210 50/50 ug WV-30210 15/15 ug WV-30210 5/5 ug WV-30210 1.5/1.5 ug WV-30212 50/50 ug WV-30212 15/15 ug WV-30212 5/5 ug WV-30212 1.5/1.5 ug
1.44 0.38 0.51 0.72 1.05 0.45 0.25 0.34 0.65
0.82 0.41 0.45 1.25 0.87 0.25 0.64 0.99 0.83
0.79 0.41 0.64 1.32 0.37 0.38 0.92 0.73
0.82 0.36 0.76 0.71 1.15 0.50 0.48 1.01 1.06
1.00 0.30 0.39 0.92 1.03 0.69 0.57 0.65 0.91
1.10 0.52 0.14 0.90 1.12 0.33 0.52 1.10 1.01
1.01 0.31 0.40 0.67 1.03 0.24 0.26 1.09 0.71
1.02 0.74 0.50 0.74 0.94 0.40 0.87 0.98 0.94
[表14F].轉錄物分析，脊髓（SC），V3轉錄物
PBS WV-30210 50,50 WV-30210 15,15 WV-30210 5, 5 WV-30210 1.5, 1.5 WV-30212 50,50 WV-30212 15,15 WV-30212 5, 5 WV-30212 1.5, 1.5
1.42 0.30 0.57 0.78 1.19 0.48 0.15 0.62 0.88
0.84 0.13 0.37 1.14 0.84 0.13 0.76 0.97 0.93
0.81 0.35 0.71 1.28 0.27 0.24 1.23 0.90
0.88 0.09 0.73 0.67 1.23 0.42 0.30 1.18 1.25
1.11 0.10 0.37 0.94 1.04 0.86 0.66 0.65 0.96
1.04 0.11 0.16 0.95 1.25 0.16 0.49 1.31 1.12
0.88 0.08 0.42 0.70 1.36 0.10 0.39 1.26 0.80
1.02 0.29 0.32 0.71 1.02 0.08 0.77 0.99 1.21
[表14G].組織暴露，脊髓（SC）（ug寡核苷酸/g組織）
PBS WV-30210 50/50 ug WV-30210 15/15 ug WV-30210 5/5 ug WV-30210 1.5/1.5 ug WV-30212 50/50 ug WV-30212 15/15 ug WV-30212 5/5 ug WV-30212 1.5/1.5 ug
0.00 2.36 1.41 0.29 0.11 2.82 3.00 0.71 0.05
0.00 3.30 2.04 0.15 0.19 4.24 0.73 0.72 0.14
0.00 2.59 0.55 0.04 3.30 3.68 0.48 0.13
0.00 8.13 0.68 0.72 0.13 2.05 2.94 0.48 0.03
0.00 6.97 2.54 0.63 0.23 1.99 2.16 1.61 0.07
0.00 3.50 2.20 0.35 0.11 4.92 1.93 0.48 0.10
0.00 10.59 1.38 0.71 0.11 7.97 2.15 0.46 0.08
0.00 3.62 3.19 0.66 0.07 6.65 1.69 1.50 0.11
[表14H].聚GP蛋白測量，皮質（CX）
PBS WV-30210 50/50 ug WV-30210 15/15 ug WV-30210 5/5 ug WV-30210 1.5/1.5 ug WV-30212 50/50 ug WV-30212 15/15 ug WV-30212 5/5 ug WV-30212 1.5/1.5 ug
0.69 0.05 0.56 1.45 1.14 0.12 0.48 0.88 2.01
0.55 0.13 0.68 1.09 1.07 0.16 0.76 0.80 0.96
1.15 0.32 0.64 0.71 0.12 0.60 0.89 1.01
1.17 0.00 0.98 0.31 0.54 0.27 0.18 1.07 0.91
0.89 0.07 1.09 0.21 1.74 0.47 0.26 0.66 1.38
1.08 0.46 0.10 0.80 1.50 0.09 0.80 0.51 0.40
1.41 0.10 0.37 0.83 0.96 0.08 0.27 1.76 0.22
1.08 0.59 0.31 1.33 0.30 0.09 1.40 1.67 0.50
[表14I].聚GP蛋白測量，脊髓（SC）
PBS WV-30210 50/50 ug WV-30210 15/15 ug WV-30210 5/5 ug WV-30210 1.5/1.5 ug WV-30212 50/50 ug WV-30212 15/15 ug WV-30212 5/5 ug WV-30212 1.5/1.5 ug
1.13 0.18 0.00 0.88 1.62 0.00 0.00 0.27 0.46
0.61 0.00 0.00 0.59 0.89 0.00 0.29 0.14 0.24
1.40 0.00 0.34 0.57 0.09 0.09 0.35 1.19
0.64 0.00 0.21 0.22 0.48 0.00 0.00 0.45 3.11
0.51 0.08 0.12 0.48 1.29 0.21 0.13 0.35 2.41
0.00 0.00 0.24 0.78 0.00 0.11 1.07 2.26
1.79 0.00 0.10 0.26 0.85 0.00 0.00 1.04 0.74
0.92 0.00 0.00 0.10 1.01 0.00 0.21 0.31 0.95
如本文所證明，C9orf72寡核苷酸組成物可被遞送並可以敲低與病症、障礙或疾病相關的C9orf72產物。
實例9. WV-30210在施用後至少24週提供體內活性
在一些實施方式中，進行了藥效學研究，以評估敲低C9orf72產物時的C9orf72寡核苷酸組成物WV-30210。這證實WV-30210可以在施用後至少4、12、18和24週（最後一次劑量後至少23週）降低C9orf72轉錄物和由其編碼的產物的水平。熟悉該項技術者意識到降低可以持續甚至超過24週。PBS（磷酸鹽緩衝鹽水）用作陰性對照。
所使用的動物：雄性和雌性C9-BAC小鼠，2-4月齡，8個組，64隻小鼠。表15A示出了劑量設計。
[表15A].體內研究的設計。
組 測試物品 劑量 給藥方案 劑量體積 小鼠總數/每組 屍體剖檢
時間點
1 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 ul 8 4週
2 WV-30210 50/50 µg ICV，第0天，第7天 2.5 ul 8 4週
3 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 ul 8 12週
4 WV-30210 50/50 µg ICV，第0天，第7天 2.5 ul 8 12週
5 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 ul 8 18週
6 WV-30210 50/50 µg ICV，第0天，第7天 2.5 ul 8 18週
7 PBS NA ICV，第0天，第7天 2.5 ul 8 24週
8 WV-30210 50/50 µg ICV，第0天，第7天 2.5 ul 8 24週
進行ICV套管插入術。在第0天在清醒的動物中經ICV注射PBS或50 μg寡核苷酸。在第7天，第二次劑量的PBS或50 μg寡核苷酸。劑量體積2.5 uL。首次注射後4週、12週、18週和24週進行屍體剖檢。
組織：
皮質（CX）：將來自兩個半腦的皮質組合，快速冷凍，放入一個稱重的試管中。
脊髓（SC）：將上腰椎脊髓和下腰椎脊髓分離，快速冷凍，放入兩個試管中，上腰椎放入稱重的試管（RNAPD和Trizol PK）中，下腰椎放入未稱重的試管（DPR）中。頸+胸脊髓，在稱重的試管中快速冷凍（蛋白酶K PK）。
海馬和小腦：將來自兩個半腦的海馬和小腦分開，快速冷凍，放入兩個未稱重的試管中。
某些結果示於表15B-15I中。
從脊髓（SC）（所有轉錄物表15B，V3表15C）和大腦皮質（CX）（所有轉錄物表15D，V3表15E）分析轉錄物。從大腦皮質（CX）（表15F）和脊髓（SC）（表15G）分析了所有劑量組的聚GP水平。從脊髓（SC）（表15H）和大腦皮質（CX）（表15I）分析了組織暴露。在大腦皮質（CX）（表15J）和脊髓（SC）（表15K）中分析了總C9orf72蛋白質。實例4中揭露了C9orf72蛋白質分析的方案（使用毛細管Western免疫測定法（Wes）定量C9orf72蛋白質表現）。
[表15B].轉錄物分析，脊髓（SC），所有轉錄物
PBS 4wk WV-30210 4wk PBS 12wk WV-30210 12wk PBS 18wk WV-30210 18wk PBS 24wk WV-30210 24wk
1.34 0.49 1.03 0.52 1.07 0.69 1.18 0.50
0.95 1.03 0.53 0.95 0.57 0.76 0.51
0.87 0.43 0.96 0.50 0.84 0.54 1.36 0.47
0.93 0.43 0.92 0.57 1.17 0.92 0.50
0.98 0.55 1.07 0.54 1.02 0.58 0.89 0.46
1.21 0.45 0.91 0.55 0.94 0.55 0.93 0.67
0.89 0.64 0.97 0.54 0.99 0.80 0.96
0.82 0.45 1.11 0.51 1.02 0.61 1.00 0.43
[表15C].轉錄物分析，脊髓（SC），V3
PBS 4wk WV-30210 4wk PBS 12wk WV-30210 12wk PBS 18wk WV-30210 18wk PBS 24wk WV-30210 24wk
1.09 0.17 1.07 0.11 1.13 0.49 1.01 0.28
0.97 1.01 0.16 0.86 0.17 0.83 0.23
0.97 0.09 0.98 0.10 1.05 0.19 1.48 0.21
1.03 0.09 0.99 0.15 1.01 0.82 0.37
0.95 0.18 1.00 0.09 1.01 0.37 0.88 0.25
1.17 0.09 0.91 0.22 1.05 0.26 1.01 0.54
0.99 0.43 0.94 0.10 0.97 0.69 0.95
0.82 0.10 1.10 0.14 0.93 0.21 1.01 0.32
[表15D].轉錄物分析，大腦皮質（CX），所有轉錄物
PBS 4wk WV-30210 4wk PBS 12wk WV-30210 12wk PBS 18wk WV-30210 18wk PBS 24wk WV-30210 24wk
0.99 0.54 0.90 0.53 1.10 0.82 0.89 0.64
1.07 0.91 0.65 1.00 0.52 0.88 0.56
0.91 0.54 0.87 0.54 0.98 0.58 1.23 0.61
1.07 0.54 1.00 0.53 0.99 1.11 0.77
0.85 0.56 1.16 0.52 1.00 0.73 0.91 0.64
1.03 0.51 1.04 0.48 0.96 0.61 0.95 0.62
0.88 0.65 1.06 0.80 1.01 0.83 1.14
1.22 0.54 1.07 0.61 0.96 0.62 0.89 0.73
[表15E].轉錄物分析，大腦皮質（CX），V3
PBS 4wk WV-30210 4wk PBS 12wk WV-30210 12wk PBS 18wk WV-30210 18wk PBS 24wk WV-30210 24wk
1.00 0.58 0.90 0.44 0.92 0.79 0.81 0.52
1.09 1.06 0.58 1.02 0.38 0.91 0.62
0.96 0.58 0.90 0.51 1.02 0.64 1.38 0.46
0.92 0.46 0.87 0.53 1.05 1.02 0.77
1.03 0.56 1.03 0.45 0.95 0.72 0.89 0.56
1.07 0.47 1.07 0.28 0.94 0.64 0.97 0.47
0.87 0.77 1.02 0.64 1.12 0.83 0.95
1.06 0.48 1.14 0.66 0.98 0.56 1.07 0.63
[表15F].聚GP水平（所有劑量），大腦皮質（CX）
PBS 4wk WV-30210 4wk PBS 12wk WV-30210 12wk PBS 18wk WV-30210 18wk PBS 24wk WV-30210 24wk
0.45 0.09 0.76 0.05 0.69 0.21 0.92 0.06
0.97 0.97 0.08 0.33 0.06 1.2 0.08
0.93 0.14 1.28 0.03 1.33 0.08 0.08
1.22 0.03 0.5 0.05 1.33 0.53 0.17
0.86 0.1 1.34 0.12 1.3 0.18 0.91 0.16
0.74 0.15 0.99 0.04 0.96 0.13 0.88 0.17
1.32 0.2 0.54 0.04 1.03 0.29 1.32
1.5 0.15 1.61 0.09 1.02 0.16 1.23 0.18
[表15G].聚GP水平（所有劑量），脊髓（SC）
PBS 4wk WV-30210 4wk PBS 12wk WV-30210 12wk PBS 18wk WV-30210 18wk PBS 24wk WV-30210 24wk
1.07 0 0.87 0 1.09 0.01
0 1.33 0 0.44 0
1.64 0 2.17 0 1.48 0 2.22 0.01
0 0.7 0 0.44 0.62
1.37 0.7 0 1.4 0 1.07
0.35 0 0.46 0.01 0.6 0.02 0.47 0.25
0.64 0 1.31 0 0.81 0.08 1.56
0 0.6 0 1.07 0 0.53 0.02
[表15H].脊髓（SC）中的組織暴露（ug寡核苷酸/g組織）
PBS 4wk WV-30210 4wk PBS 12wk WV-30210 12wk PBS 18wk WV-30210 18wk PBS 24wk WV-30210 24wk
0.00 3.25 0.00 1.32 0.00 0.64 0.00 0.86
0.00 2.67 0.00 1.88 0.00 3.54 0.00 2.03
0.00 9.96 0.00 3.70 0.00 3.69 0.00 1.69
0.00 9.27 0.00 3.07 0.00 0.00 0.42
0.00 3.24 0.00 5.01 0.00 1.82 0.00 0.80
0.00 7.02 0.00 1.16 0.00 1.74 0.00 0.14
0.00 1.61 0.00 2.60 0.00 0.56 0.00 0.82
0.00 5.66 0.00 1.88 0.00 1.46 0.00 0.35
[表15I].大腦皮質（CX）中的組織暴露（ug寡核苷酸/g組織）
PBS 4wk WV-30210 4wk PBS 12wk WV-30210 12wk PBS 18wk WV-30210 18wk PBS 24wk WV-30210 24wk
0.00 1.71 0.00 1.87 0.07 0.40 0.00 1.36
0.00 4.56 0.00 1.29 0.00 1.83 0.00 0.63
0.00 2.64 0.00 2.90 0.00 1.44 0.00 0.95
0.00 5.08 0.00 2.57 0.00 0.00 0.30
0.00 2.29 0.00 1.48 0.00 0.90 0.00 0.52
0.00 3.38 0.00 0.85 0.00 0.69 0.00 1.24
0.00 1.15 0.00 0.70 0.00 0.33 0.00 0.91
0.00 2.47 0.00 0.67 0.00 0.48 0.00 0.42
[表15J]. 24週時大腦皮質（CX）的C9orf72蛋白質分析
PBS WV-30210
1.0173 0.9617
0.9275 0.981
0.9412 0.8581
1.0999 1.0275
1.036 0.9953
0.9894 0.9102
0.9887 0.918
[表15K]. 24週時脊髓（SC）的C9or72蛋白質分析
PBS WV-30210
1.1115 0.88
0.9836 0.8175
1.0792 0.6414
0.9599 0.8703
0.9427 1.1028
0.9101 1.0617
1.013 0.8591
如本文所證明的，WV-30210可以提供C9orf72轉錄物和由其編碼的產物（其可以與多種病症、障礙或疾病相關）的持久降低。
實例10. C9orf72寡核苷酸組成物在多種測定中具有活性和/或選擇性
尤其是，如本文所證明的，本揭露提供了可以有效地和/或選擇性地降低與病症、障礙或疾病相關並包含擴增的重複序列的C9orf72轉錄物和/或由其編碼的產物的表現、活性和/或水平的技術。下表中示出用C9orf72寡核苷酸組成物處理後，多種C9orf72轉錄物[例如所有V轉錄物，僅V3轉錄物，等等]相對於HPRT1的一定剩餘水平，其中1.000將表示100%相對轉錄物水平（無敲低）且0.000將表示0%相對轉錄物水平（例如100%敲低）。顯示了重複實驗的某些結果。實驗係在ALS運動神經元中進行的。另外的測定條件在本文和/或WO 2019/032607中描述。
[表16A]. 某些C9orf72寡核苷酸組成物的活性。
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（僅V3轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸組成物的某些數據。與其他「僅V3轉錄物」評估一樣，顯示了C9orf72/HPRT1中V3的相對倍數變化。
劑量（uM） WV-38627 WV-39524 WV-39526 WV-30206 WV-39527 WV-39528 WV-30212
0.89 0.94 0.96 0.75 0.45 0.55 0.57
0.08 0.81 0.88 0.85 0.76 0.45 0.52 0.56
0.82 0.88 0.81 0.85 0.45 0.55 0.49
0.66 0.67 0.56 0.39 0.15 0.20 0.26
0.4 0.66 0.61 0.66 0.41 0.13 0.25 0.27
0.71 0.60 0.61 0.41 0.14 0.21 0.24
0.44 0.32 0.30 0.17 0.03 0.05 0.07
2 0.43 0.36 0.32 0.18 0.03 0.05 0.07
0.43 0.30 0.32 0.17 0.03 0.06 0.09
劑量（uM） WV-30211 WV-39523 WV-39525 WV-34452 WV-34453 WV-34466 WV-39814
0.65 0.37 0.53 0.34 0.47 0.54 0.96
0.08 0.59 0.34 0.53 0.33 0.49 0.50 0.91
0.61 0.35 0.48 0.38 0.45 0.52 1.02
0.27 0.09 0.18 0.09 0.15 0.19 0.91
0.4 0.25 0.08 0.16 0.08 0.14 0.17 1.01
0.24 0.09 0.17 0.09 0.14 0.17 0.91
0.08 0.01 0.04 0.02 0.04 0.05 0.87
2 0.08 0.02 0.03 0.02 0.03 0.04 1.01
0.07 0.02 0.04 0.02 0.04 0.05 0.89
[表16B].某些C9orf72寡核苷酸組成物的活性。
此表顯示了敲低ALS運動神經元中的C9orf72轉錄物（所有V轉錄物）時多種C9orf72寡核苷酸組成物的數據。示出了C9orf72/HPRT1的相對倍數變化。
劑量（uM） WV-38627 WV-39524 WV-39526 WV-30206 WV-39527 WV-39528 WV-30212
0.94 0.96 0.85 0.75 0.84 0.86 0.81
0.08 0.90 0.94 0.91 0.81 0.83 0.83 0.79
0.86 0.92 0.88 0.66 0.78 0.77 0.78
0.95 0.83 0.84 0.66 0.69 0.63 0.71
0.4 0.88 0.92 0.79 0.74 0.65 0.68 0.74
0.83 0.88 0.92 0.78 0.67 0.68 0.64
0.65 0.66 0.68 0.71 0.41 0.51 0.56
2 0.77 0.65 0.60 0.59 0.47 0.48 0.50
0.70 0.64 0.76 0.62 0.47 0.47 0.57
劑量（uM） WV-30211 WV-39523 WV-39525 WV-34452 WV-34453 WV-34466 WV-39814
0.96 0.77 0.85 0.82 0.79 0.84 0.95
0.08 0.89 0.79 0.76 0.75 0.83 0.82 0.92
0.89 0.82 0.82 0.79 0.87 0.83 1.05
0.76 0.63 0.69 0.69 0.72 0.70 1.00
0.4 0.72 0.62 0.59 0.66 0.73 0.69 1.04
0.75 0.62 0.63 0.67 0.63 0.70 0.90
0.52 0.37 0.38 0.42 0.48 0.45 1.09
2 0.58 0.37 0.39 0.42 0.52 0.46 1.00
0.57 0.37 0.46 0.44 0.55 0.41 1.23
如所證明的，多種寡核苷酸組成物可以有效地和選擇性地減少靶標轉錄物，例如可以含有擴增的重複序列並與多種病症、障礙或疾病相關的轉錄物（例如，V3轉錄物）。
除非另有說明，否則在各種實驗中，實驗中使用的細胞和動物用於對於那些細胞或動物典型的條件。除非另有說明，否則在體外實驗中，各種細胞在標準條件下生長（例如，用於特定細胞類型、細胞系或相似細胞類型或細胞系的最常見條件），例如，使用普通生長培養基、常溫（37°C），以及典型的麻塞諸塞州劍橋的重力和大氣壓力。將動物保持在標準實驗室條件下，通常在室溫或幾度較冷，具有正常的飼養條件、籠子大小、典型的麻塞諸塞州的重力和大氣壓力等。除非另有說明，否則細胞和動物都不會經受極端溫度（例如，冷休克或熱休克）、壓力、重力、環境聲音、食物、或營養物質剝奪等。
雖然本文中已描述且說明各種實施方式，但熟悉該項技術者將容易想到，用於執行本揭露中所描述的功能和/或獲得本揭露中所描述的結果和/或一個或多個優勢的各種其他方法和/或結構、以及此類變化形式和/或修改中的每一者均被視為包括在內。更一般而言，熟悉該項技術者將容易理解，本文所述之所有參數、尺寸、材料和組態意指實例，並且實際參數、尺寸、材料和/或組態將取決於使用本揭露的教導的一個或多個特定應用。熟悉該項技術者將認識到，或能夠使用不超出常規的實驗來確定，本揭露中所述之本揭露的特定實施方式的許多等效物。因此，應理解，上述實施方式僅藉由實例方式呈現，且在所附申請專利範圍及其等效物的範圍內，可以與具體描述和要求的不同的方式實踐所要求的技術。另外，如果特徵、系統、物品、材料、套盒和/或方法不是相互不相容的，則在本揭露的範圍內包括兩個或更多個此類特徵、系統、物品、材料、套盒和/或方法的任何組合。
無
[圖1]. 圖1描述實例C9orf72轉錄物。示出了由健康和病理性C9orf72等位基因產生的V3、V2和V1轉錄物，其中該病理性等位基因含有六核苷酸重複擴增[(GGGGCC)30+ 指示的水平條]。指向下的箭頭指示一些實例C9orf72寡核苷酸靶向內含子1的位置。
無

Claims (57)

  1. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸包含糖、鹼基或核苷酸間鍵聯的至少一種修飾，其中該寡核苷酸的鹼基序列係或包含與C9orf72基因或其轉錄物的鹼基序列至少80%相同或互補的鹼基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續鹼基，並且該寡核苷酸的3'端上的核鹼基視需要被選自I、A、T、U、G和C的替換核鹼基替換。
  2. 如請求項1所述之寡核苷酸，該寡核苷酸包含糖、鹼基或核苷酸間鍵聯的至少一種修飾，其中該寡核苷酸的鹼基序列包含與C9orf72基因或其轉錄物的鹼基序列相同或互補的鹼基序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續鹼基。
  3. 如請求項2所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的鹼基序列係ACTCACCCACTCGCCACCGC。
  4. 如請求項3所述之寡核苷酸，其中在施用至包含含有重複擴增的C9orf72轉錄物的系統時，該寡核苷酸降低該C9orf72轉錄物的水平，其中該含有重複擴增的C9orf72轉錄物包含至少30、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個GGGGCC重複序列。
  5. 如請求項4所述之寡核苷酸，其中如藉由百分比所測量，該含有重複擴增的C9orf72轉錄物的水平降低係不含重複擴增的C9orf72轉錄物的水平降低的至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
  6. 如請求項3所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含5'-翼-核心-翼-3’結構或由其組成，其中每個翼糖獨立地包含2’-OR修飾，其中R係視需要經取代的C1-6 脂肪族。
  7. 如請求項6所述之寡核苷酸，其中該5'-翼包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。
  8. 如請求項7所述之寡核苷酸，其中該3'-翼包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯和一個或多個不帶負電荷的核苷酸間鍵聯。
  9. 如請求項8所述之寡核苷酸，其中該5'-翼和該3'-翼各自獨立地包含3、4、5、6、7、8、9或10個核鹼基。
  10. 如請求項9所述之寡核苷酸，其中每個核心糖獨立地包含兩個2'-H。
  11. 如請求項10所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸或該核心包含以下的骨架手性中心（鍵聯磷）模式： (Np)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y， 其中： t係1-50； n係1-10； m係1-50； y係1-10； Np係Rp或Sp； Sp表示手性修飾的核苷酸間鍵聯的手性鍵聯磷的S組態； Op表示天然磷酸酯鍵聯的非手性鍵聯磷；並且 Rp表示手性修飾的核苷酸間鍵聯的手性鍵聯磷的S組態；並且 y係1-10。
  12. 如請求項11所述之寡核苷酸，其中每個Np係Sp。
  13. 如請求項12所述之寡核苷酸，其中該模式係(Np)t[(Rp)n(Sp)m]y。
  14. 如請求項13所述之寡核苷酸，其中每個n係1。
  15. 如請求項14所述之寡核苷酸，其中y係1。
  16. 如請求項14所述之寡核苷酸，其中y係2。
  17. 如請求項14所述之寡核苷酸，其中t係2或更大。
  18. 如請求項14所述之寡核苷酸，其中t係3或更大。
  19. 如請求項14所述之寡核苷酸，其中每個m獨立地是2-20。
  20. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有以下結構： mA *S m5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC n001R m5Ceo *S mG *S mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； n001R代表Rp n001鍵聯，其中n001鍵聯具有
    Figure 03_image007
    的結構； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。
  21. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有以下結構： mA *S m5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC *S m5Ceo n001R mG *S mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； n001R代表Rp n001鍵聯，其中n001鍵聯具有
    Figure 03_image007
    的結構； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。
  22. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有以下結構： mA *S m5Ceo n001R Teo m5Ceo n001R mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC *S m5Ceo *S mG n001R mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； n001R代表Rp n001鍵聯，其中n001鍵聯具有
    Figure 03_image007
    的結構； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。
  23. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有以下結構： mC *S m5Ceo Teo m5Ceo mA *S C *S T *S C *R A *S C *S C *R C *S A *S C *S T *S m5mC *S mG *S mC *S m5mC *S mG，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。
  24. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有以下結構： mA *S m5Ceo Teo m5Ceo mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC *S m5mC *S mG *S mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。
  25. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有以下結構： mC *S m5Ceo Teo m5Ceo mA *S C *S T *S C *R A *S C *S C *R C *S A *S C *S T *S m5Ceo *S mG *S mC *S m5Ceo *S mG，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。
  26. 一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有以下結構： mA *S m5Ceo Teo m5Ceo mA *S C *S C *S C *R A *S C *S T *S m5C *S G *R m5C *S C *S mA *S mC *S m5Ceo *S mG *S mC，或其藥學上可接受的鹽，其中： m代表對核苷的2’-OMe修飾； *S代表Sp硫代磷酸酯鍵聯； m5Ceo代表5-甲基 2'-O-甲氧基乙基C； eo代表對核苷的2’-OCH2 CH2 OCH3 修飾； *R代表Rp硫代磷酸酯鍵聯；並且 m5代表C的5位處的甲基。
  27. 如請求項1-26中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸呈藥學上可接受的鹽形式。
  28. 如請求項1-27中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的3'端上的核鹼基視需要被選自I、A、T、U、G和C的不同核鹼基替換。
  29. 如請求項1-28中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸中的每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯獨立地具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的非鏡像異構純度。
  30. 一種寡核苷酸組成物，該寡核苷酸組成物包含具有以下各項的多個寡核苷酸： a) 共同的鹼基序列； b) 共同的骨架鍵聯模式； c) 共同的骨架手性中心模式； 其中該組成物中該多個寡核苷酸的水平不是隨機的；並且 其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項1-28中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式；或 一種寡核苷酸組成物，該寡核苷酸組成物包含多個寡核苷酸，其中： 該多個寡核苷酸具有相同的構成； 該多個寡核苷酸在一個或多個（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多個）手性受控的核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學； 其中相對於具有相同共同的鹼基序列的寡核苷酸的基本上外消旋製劑，該組成物富集該特定寡核苷酸類型的寡核苷酸；並且 該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項1-28中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式；或 一種寡核苷酸組成物，該寡核苷酸組成物包含多個寡核苷酸，其中： 該多個寡核苷酸具有相同的構成； 該多個寡核苷酸在一個或多個（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多個）手性受控的核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學； 在每個手性受控的核苷酸間鍵聯處，該組成物中所有共用相同構成的寡核苷酸中至少90%、95%、96%、97%、98%或99%共用相同的鍵聯磷立體化學；並且 該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項1-28中任一項所述之寡核苷酸或其鹽形式。
  31. 如請求項30所述之組成物，其中富集該組成物，使得該組成物中所有與該特定類型的寡核苷酸或該多個寡核苷酸共用相同鹼基序列的寡核苷酸的1%-100%（例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%、或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%、或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%）係該特定類型的寡核苷酸或該多個寡核苷酸。
  32. 如請求項30-31中任一項所述之組成物，其中該多個寡核苷酸在至少5個核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學。
  33. 如請求項32所述之組成物，其中該多個寡核苷酸獨立地在每個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學。
  34. 如請求項33所述之組成物，其中該多個寡核苷酸獨立地在每個手性核苷酸間鍵聯處共用相同的鍵聯磷立體化學。
  35. 如請求項34所述之組成物，其中該多個或類型的寡核苷酸共用相同的結構。
  36. 如請求項31所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項20所述之寡核苷酸。
  37. 如請求項31所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項21所述之寡核苷酸。
  38. 如請求項31所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項22所述之寡核苷酸。
  39. 如請求項31所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項23所述之寡核苷酸。
  40. 如請求項31所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項24所述之寡核苷酸。
  41. 如請求項31所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項25所述之寡核苷酸。
  42. 如請求項31所述之組成物，其中該多個寡核苷酸各自獨立地是如請求項26所述之寡核苷酸。
  43. 如請求項35-42中任一項所述之組成物，其中每個寡核苷酸獨立地呈鹽形式。
  44. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含或遞送如請求項1-43中任一項的寡核苷酸或組成物，並且包含藥學上可接受的載體。
  45. 一種方法，該方法包括向患有或易患與C9orf72擴增的重複序列有關的病症、障礙和/或疾病的受試者施用有效量的如請求項1-44中任一項所述之寡核苷酸或組成物。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該病症、障礙和/或疾病係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）。
  47. 如請求項45所述之方法，其中該病症、障礙和/或疾病係額顳葉失智（FTD）。
  48. 一種降低細胞中C9orf72靶標基因或其基因產物的活性、表現和/或水平之方法，該方法包括將如請求項1-44中任一項所述之寡核苷酸或組成物引入該細胞中。
  49. 一種用於減少細胞群中病灶之方法，該方法包括使細胞與如請求項1-44中任一項所述之寡核苷酸或組成物接觸。
  50. 如請求項49所述之方法，其中具有病灶的細胞百分比降低。
  51. 如請求項49-50中任一項所述之方法，其中每個細胞的病灶數目降低。
  52. 一種用於降低細胞群中二肽重複（DPR）蛋白質水平之方法，該方法包括使細胞與如請求項1-44中任一項所述之寡核苷酸或組成物接觸。
  53. 如請求項52所述之方法，其中該DPR蛋白質包含聚GP、聚GA或聚GR。
  54. 如請求項49-53中任一項所述之方法，其中該細胞在人類受試者中。
  55. 一種用於在細胞中相對於不含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物優先敲低含有重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物之方法，該方法包括使包含該含有重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物及該不含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物的細胞與如請求項1-44中任一項所述之寡核苷酸或組成物接觸， 其中該寡核苷酸包含存在於該含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物中的序列或與該含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物中的序列互補的序列， 其中該寡核苷酸在細胞中相對於不含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物指導含重複擴增的C9orf72 RNA轉錄物的優先敲低。
  56. 一種用於製備如前述請求項中任一項所述之寡核苷酸或組成物之方法，該方法包括使具有
    Figure 03_image064
    、
    Figure 03_image066
    、
    Figure 03_image068
    或
    Figure 03_image070
    結構的亞磷醯胺或其鹽與核苷或寡核苷酸的-OH接觸，其中RAU 係選自以下的視需要經取代的基團：C1-20 脂肪族、具有1-10個雜原子的C1-20 雜脂肪族、C6-20 芳基、C6-20 芳基脂肪族、具有1-10個雜原子的C6-20 芳基雜脂肪族、具有1-10個雜原子的5-20員雜芳基、以及具有1-10個雜原子的3-20員雜環基，並且RNS 係視需要經取代的或受保護的核苷。
  57. 如實施方式1-218中任一項所述之化合物、寡核苷酸、組成物或方法。
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