TW202124413A - 減少病毒分子含量之方法 - Google Patents

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Abstract

減少病毒分子含量及/或治療病毒感染之方法包括使細胞與靶向細胞宿主因子之寡核苷酸抑制劑接觸，該細胞宿主因子為涉及病毒複製之靶RNA或靶蛋白。醫藥組合物可包括有效治療感染(諸如B型肝炎感染或呼吸道病毒感染，諸如冠狀病毒感染)之量的此寡核苷酸抑制劑。

Description

減少病毒分子含量之方法
本申請案係關於藉由使經病毒感染之細胞與靶向細胞宿主因子之治療劑接觸來減少病毒分子含量及/或治療病毒感染之方法，該細胞宿主因子為涉及病毒複製之靶RNA或靶蛋白。
B型肝炎病毒(HBV)為DNA病毒及肝DNA病毒科(Hepadnaviridae family)之成員。HBV在世界範圍內感染超過3億人且為肝癌及肝病(諸如慢性肝炎、肝硬化及肝細胞癌)之病原體。HBV感染可為急性及/或慢性的。急性HBV感染可為無症狀的或呈現為有症狀的急性肝炎。慢性B型肝炎之特徵為被HBV持續感染肝臟細胞可持續幾年及幾十年。HBV分為十個基因型，A至J。
HBV具有約3.2千鹼基(kb)對之部分雙股環狀DNA。已經極為詳細地研究HBV複製路徑(1)。一部分複製包括共價閉合環狀DNA(cccDNA)形式之形成。cccDNA之存在產生病毒在整個宿主生物體之生命中重新出現之風險。HBV攜帶者可傳播疾病持續許多年。據估計每年世界範圍內有超過750,000人死於B型肝炎。另外，免疫抑制之個體或經歷化學療法之個體尤其具有再活化HBV感染之風險。
HBV可藉由血液、精液及/或另一種含有病毒之體液傳播。此可經由直接血液與血液接觸、無保護性行為、共用針頭及在分娩過程期間自經感染母親至其嬰兒發生。HBV表面抗原(HBsAg)最常用於篩選此感染之存在，因為大部分HBsAg存在於HBV病毒粒子中。當前可用之藥物並未治癒HBV感染。更確切而言，藥物抑制病毒之複製。
冠狀病毒疾病2019(COVID-19)(亦稱為新型冠狀病毒肺炎或2019-nCoV急性呼吸道疾病)係由SARS-CoV2(嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(亦稱為新型冠狀病毒2019或2019-nCoV)感染引起。該疾病首先在2019年12月經鑑別且在全球範圍內擴散，引起大流行性。COVID-19之症狀包括發熱、咳嗽、呼吸短促、疲勞、頭痛、嗅覺喪失、鼻塞、喉嚨痛、痰形成、肌肉或關節疼痛、發冷、噁心、嘔吐及腹瀉。在嚴重情況下，症狀可包括行走困難、意識模糊、膚色發青、咳血、白血球計數降低及器官衰竭。併發症可包括肺炎、病毒敗血症、急性呼吸窘迫症候群及腎衰竭。
SARS-CoV-2並非為引發疾病之唯一冠狀病毒。其為β-冠狀病毒，一種包括其他人類病原體之冠狀病毒屬，該等人類病原體包括SARS-CoV(重度急性呼吸症候群之病原體)、MERS-CoV(中東呼吸症候群之病原體)及HCoV-OC43(一種常見感冒之病原體)。此等病毒之感染性及其引起之疾病之嚴重程度有很大差別。β-冠狀病毒亦可顯現為人畜感染，擴散至人類及動物且自人類及動物擴散。另外，非人類物種，諸如駱駝、蝙蝠、老虎、非人類靈長類動物及兔可感染β-冠狀病毒。現迫切需要治療或治癒多種冠狀病毒。
本發明提供適用於抗病毒的分子，該等病毒利用細胞宿主因子進行病毒複製，包括HBV及呼吸道病毒，諸如冠狀病毒。因此，本發明滿足此項技術中對可用於安全且有效地治療或預防人類中之此類感染之化合物的需要。
多種細胞因子現已鑑別為在產生由HBV及其他病毒利用之某些分子以便複製其基因體及/或調節病毒感染之結果中具有作用。已研發出寡核苷酸及siRNA以靶向此類細胞因子且從而減少由受感染細胞產生(一或多種)相應病毒分子。
一個實施例提供一種減少由受感染細胞產生之病毒分子的含量之方法，該方法包含：
使該受感染細胞與有效量之靶向細胞宿主因子之寡核苷酸抑制劑接觸，從而抑制由該受感染細胞產生該細胞宿主因子且減少由該受感染細胞產生之該病毒分子之量；
其中該受感染細胞產生(a)至少一種細胞宿主因子，其為選自以下之靶RNA或靶蛋白：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA及RPLP2蛋白；及(b)一定量之至少一種病毒分子，病毒利用其進行複製，其中該病毒分子為病毒蛋白、病毒DNA或病毒RNA。在一個實施例中，病毒為HBV。在另一個實施例中，病毒為冠狀病毒。在一個實施例中，如藉由對病毒分子之分析所測定，寡核苷酸抑制劑之EC50 值為小於100 nM。
另一個實施例提供一種治療病毒感染之方法，該方法包含：
向有需要之個體投與治療有效量之寡核苷酸抑制劑，其中該寡核苷酸抑制劑靶向細胞宿主因子從而減少由該個體之受感染細胞產生該細胞宿主因子；
其中該等受感染細胞產生至少一種細胞宿主因子，其為選自以下之靶RNA或靶蛋白：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA及RPLP2蛋白。在一個實施例中，引起感染之病毒為HBV。在另一個實施例中，引起感染之病毒為冠狀病毒。在一個實施例中，如藉由對病毒分子之分析所測定，寡核苷酸抑制劑之EC50 值為小於100 nM。
另一個實施例提供一種用於治療個體之病毒感染之醫藥組合物，其包含：
醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或其組合；及
治療有效量之寡核苷酸抑制劑，其靶向選自以下之靶RNA或靶蛋白中之至少一者：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA、RPLP2蛋白及前述任一者的組合。在一個實施例中，感染病毒為B型肝炎病毒。在另一個實施例中，病毒感染為COVID-19。在一個實施例中，如藉由針對由受感染細胞產生之病毒分子的分析所測定，寡核苷酸抑制劑之EC50 值為小於100 nM。
下文更詳細地描述此等及其他實施例。
以引用之方式併入優先權申請
本申請案主張2019年11月7日申請之美國臨時申請案第62/931,962號之優先權，其以全文引用之方式併人本文中。定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有如一般技術者通常理解相同之含義。除非另外說明，否則本文中所提及之所有專利、申請案、公開之申請案及其他公開案均以全文引用之方式併入。除非另有說明，否則在本文術語存在複數種定義之情況下，以本章節中之定義為凖。
如本文所用，術語「寡核苷酸」(或「oligo」)具有如熟習此項技術者所理解之其常見含義且因此係指包括寡去氧核苷酸、寡去氧核糖核苷酸及寡核糖核苷酸之一類化合物。因此，「寡核苷酸」係指核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)或其模擬物之寡聚物或聚合物，包括提及由天然存在之核鹼基、糖及磷酸二酯(PO)核苷間(主鏈)鍵構成之寡核苷酸，以及具有以類似方式起作用之非天然存在之部分及/或包括諸如GalNAc之修飾的「經修飾」或經取代之寡核苷酸，該等修飾增加寡核苷酸之循環半衰期及/或減少降解(例如由核酸內切酶產生之降解)，及增加細胞攝取。「寡核苷酸抑制劑」為至少部分地抑制由其所靶向之RNA或蛋白質之細胞而產生的寡核苷酸。
「反義」寡核苷酸(ASO)為以序列特異性方式識別或特異性黏接至靶RNA之合成寡核苷酸。由siRNA或ASO識別之靶RNA之序列由mRNA之蛋白編碼序列之核苷酸數目定義，其中起始密碼子(AUG)之腺苷酸命名為核苷酸1。本申請案中所用之序列具有可在細胞內識別具有高特異性之靶的長度及序列。特異性可由設定於生理鹽(155 mM)且使用最近相鄰參數之siRNA與靶RNA序列之雙螺旋體之1 nM 雙螺旋體的計算熔融溫度表示。特異性亦可表示為經黏接之雙螺旋體之熱力學常數，吉布斯自由能(Gibbs Free Energy)之變化(ΔG)。計算siRNA/靶雙螺旋體之Tm及熱力學常數的電腦程式可以The OligoCalc(19)獲得。
如本文所用，術語「siRNA」具有如熟習此項技術者所理解之其常見含義且因此係指稱為小干擾RNA、短干擾RNA及/或沉默RNA之一類寡核苷酸。此等化合物為長度通常為19至25個鹼基對之非編碼雙股RNA分子，其在RNA干擾(RNAi)路徑內操作且干擾特異性基因之表現，該等特異性基因含有與siRNA之反義股互補的核苷酸序列且介導mRNA之降解。mRNA之減少之含量將降低靶蛋白的轉譯及量。本文中對siRNA之提及應理解為包括提及由天然存在之核鹼基、糖及磷酸二酯(PO)核苷間(主鏈)鍵構成之siRNA以及具有以類似方式起作用之非天然存在之部分及/或包括諸如GalNAc之修飾的「經修飾」或經取代之siRNA，該等修飾增加寡核苷酸之循環半衰期及/或減少降解(例如由核酸內切酶產生之降解)，及增加細胞攝取。
如本文所用，術語「靶」、「靶向」及其類似術語，如在寡核苷酸抑制劑經由鹼基配對識別靶RNA之情形下所用，且具有如熟習此項技術者所理解之其常見含義用以指代寡核苷酸抑制劑與靶RNA雜交且至少部分地抑制其所靶向之RNA或蛋白質之產生的方法。舉例而言，siRNA可藉由減少mRNA來引起編碼mRNA之基因的沉默，且因此降低自彼靶RNA合成之產物，包括蛋白質。可使用各種分析技術測定寡核苷酸抑制劑至少部分地抑制其所靶向之RNA或蛋白質之產生的程度。此類siRNA及其靶向之各種RNA之非限制性實例闡述於表1及表2中。
如本文所用，術語「病毒分子」具有熟習此項技術者所理解之其常見含義且因此係指由病毒基因體產生之一類分子。病毒分子通常為病毒蛋白、病毒DNA或病毒RNA。病毒可利用或需要此等分子來複製其基因體或調節病毒感染結果。舉例而言，術語「HBV分子」係指由HBV基因體產生之一類分子。HBV分子之實例包括S-抗原、E-抗原、核心-抗原、HBV RNA及HBV DNA。在一個實施例中，病毒分子為冠狀病毒分子，諸如冠狀病毒RNA。
如本文所用，術語「細胞宿主因子」、「細胞因子」、「宿主因子」及其類似術語具有其如熟習此項技術者所理解之其常用含義，且因此係指由細胞產生且由病毒複製利用之RNA或蛋白質。如上文所提及，多種細胞因子現已鑑別為在產生由HBV及其他病毒利用之某些病毒分子以便複製中具有作用。
如本文所用，術語「病毒分析」及「病毒性分析」具有熟習此項技術者所理解之其常見含義且因此係指定量評估病毒分子之分析。舉例而言，「HBV分析」係指定量評估HBV分子或HBV感染對受感染細胞之作用的分析。HBV分析之實例包括HBsAg分析、HBeAg分析、HBV核心分析、HBV RNA分析及HBV DNA分析。同樣，「冠狀病毒分析」為定量評估呼吸道病毒之一或多個分子或病毒感染對受感染細胞之作用的呼吸道病毒分析之實例。冠狀病毒分析之實例包括定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析及分支鏈DNA分析。適合之病毒分析可用於鑑別經病毒感染之細胞及/或個體。
如本文所用，「載劑」係指促進化合物通過、遞送及/或併入至細胞、組織及/或身體器官之化合物或粒子。舉例而言，但不限於，siRNA之脂質載劑可將siRNA遞送至細胞之細胞質。另一個實例為奈米粒子(LNP)，一種可囊封寡核苷酸及/或siRNA從而防止寡核苷酸抑制劑在穿過血流期間降解及/或有助於遞送至所需器官，諸如遞送至肝臟的載劑類型。
如本文所用，「稀釋劑」係指醫藥組合物中缺乏藥理學活性但可為醫藥學上必需或合乎需要之成分。舉例而言，可使用稀釋劑增加質量對於製造及/或投與而言太小之有效藥物的體積。其亦可為用於使待藉由注射、攝入或吸入而投與之藥物溶解的液體。此項技術中之常見稀釋劑形式為緩衝水溶液，諸如但不限於模擬人類血液組成之磷酸鹽緩衝鹽水。
如本文所用，「賦形劑」係指添加至醫藥組合物以向組合物非限制性地提供體積、稠度、穩定性、結合能力、潤滑、崩解能力等之惰性物質。「稀釋劑」為一種賦形劑類型。減少病毒分子及治療病毒感染之方法
如以下工作實例中所證實，細胞蛋白GRP78/BIP、SRSF1、HNRNPA2B1、RPLP1及RPLP2現已鑑別為在病毒複製及感染中起作用之細胞宿主因子。現已研發出各種藉由靶向此等宿主因子來減少病毒分子含量的方法。舉例而言，一個實施例提供一種減少受感染細胞產生之病毒分子之數量的方法，其包含使受感染細胞與有效量之如本文所述之靶向靶RNA或引起蛋白質減少之靶中之至少一者的寡核苷酸抑制劑接觸。此接觸有效抑制受感染細胞產生細胞宿主因子且減少受感染細胞產生之病毒分子之量。熟習此項技術者認知，本文所述之方法亦提供該寡核苷酸抑制劑之相應用途的描述。舉例而言，各種實施例提供一種用於如本文所述之方法，例如減少病毒含量及/或治療病毒感染之方法之寡核苷酸抑制劑。其他實施例提供一種用於製備藥物的寡核苷酸抑制劑，其可藉由如本文所述之方法，例如減少產生之病毒之量及/或治療病毒感染之方法投與個體。
一個實施例提供一種減少受感染細胞產生之病毒分子含量之方法，該方法包含： 使該受感染細胞與有效量之靶向細胞宿主因子之寡核苷酸抑制劑接觸，從而抑制該受感染細胞產生該細胞宿主因子且減少該受感染細胞產生該病毒分子之量； 其中該受感染細胞產生(a)至少一種細胞宿主因子，其為選自以下之靶RNA或靶蛋白：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA及RPLP2蛋白；及(b)一定量之至少一種病毒分子，該病毒利用以進行複製，其中該病毒分子為病毒蛋白、病毒DNA或病毒RNA。
在一個實施例中，經病毒感染之細胞為哺乳動物細胞。舉例而言，在一個實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。對於HBV感染，受感染細胞通常為肝臟之細胞，諸如肝細胞。
在一個實施例中，病毒為HBV且病毒分子為HBV分子。舉例而言，在各種實施例中，HBV分子為S-抗原(HBsAg)、E-抗原(HBeAg)、核心-抗原、HBV RNA或HBV DNA。在一個實施例中，HBV分子為S-抗原(HBsAg)。
在另一個實施例中，病毒為呼吸道病毒且病毒分子為呼吸道病毒分子。在一個實施例中，呼吸道病毒為冠狀病毒，例如，諸如SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43(亦稱為OC43)或SARS-CoV2(引起Covid-19之病毒)的冠狀病毒。在一個實施例中，冠狀病毒分子為冠狀病毒RNA或病毒基因體。
亦已研發出用於治療病毒感染之各種方法。舉例而言，一個實施例提供一種治療病毒感染之方法，該方法包含： 向有需要之個體投與治療有效量之寡核苷酸抑制劑，其中該寡核苷酸抑制劑靶向細胞宿主因子從而減少由該個體之受感染細胞產生該細胞宿主因子； 其中該等受感染細胞產生至少一種細胞宿主因子，其為選自以下之靶RNA或靶蛋白：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA及RPLP2蛋白。
除非上下文另外指明，否則本文中對各種本發明特徵或態樣之描述應理解為應用於減少由受感染細胞產生之病毒分子之含量的方法及治療病毒感染之方法的兩個此類實施例。在一個實施例中，經病毒感染之個體為哺乳動物個體，在此情況下受感染細胞為哺乳動物細胞。舉例而言，在一個實施例中，哺乳動物個體為人類個體且受感染細胞為人類細胞。在各種實施例中，方法進一步包含在使受感染細胞與有效量之寡核苷酸抑制劑接觸及/或向個體投與治療有效量之寡核苷酸抑制劑之前，鑑別由病毒感染的細胞及/或個體。
在各種實施例中，由個體之受感染細胞產生之細胞宿主因子為如本文所述之RNA或蛋白質。在各種實施例中，藉由測定由受感染細胞產生之病毒分子之減少來測定由個體的受感染細胞減少細胞宿主因子。在一個實施例中，寡核苷酸抑制劑減少由受感染細胞產生之病毒分子之含量且從而減少個體之病毒負荷。在一個實施例中，感染個體之病毒為HBV且細胞宿主因子之產生的減少由HBV分子之減少的含量指示。舉例而言，在各種實施例中，HBV分子為S-抗原(HBsAg)、E-抗原(HBeAg)、核心-抗原、HBV RNA或HBV DNA。在一個實施例中，HBV分子為S-抗原(HBsAg)。因此，在一個實施例中，細胞宿主因子之產生的減少由HBsAg之減少的含量指示，如藉由HBsAg分析所測定。
在另一個實施例中，感染個體之病毒為呼吸道病毒且病毒分子為呼吸道病毒分子。在一個實施例中，呼吸道病毒為冠狀病毒，例如人類冠狀病毒，且呼吸道病毒分子為人類冠狀病毒分子。舉例而言，在一個實施例中，冠狀病毒為β-冠狀病毒，諸如SARS-CoV、SARS-CoV2、MERS-CoV或HCoV-OC43。
在各種實施例中，寡核苷酸抑制劑靶向選自以下之靶RNA中之至少一者：GRP78/BIP RNA、SRSF1 RNA、HNRNPA2B1 RNA、RPLP1 RNA及RPLP2 RNA。在其他實施例中，寡核苷酸抑制劑靶向選自以下之靶蛋白中之至少一者：GRP78/BIP蛋白、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1蛋白及RPLP2蛋白。在一個實施例中，寡核苷酸抑制劑為識別靶RNA之反義寡核苷酸(ASO)，其中靶RNA包括mRNA。在另一個實施例中，寡核苷酸抑制劑為識別靶RNA之沉默RNA(siRNA)，其中靶RNA包括mRNA。在各種實施例中，寡核苷酸抑制劑包含一或多種經化學修飾之核苷酸，其增強寡核苷酸抑制劑與靶RNA或靶蛋白之結合。
靶向靶RNA或靶蛋白中之至少一者的寡核苷酸及siRNA可獲自商業來源，其藉由已知方法或其修改製備及/或如本文其他地方所述製備。靶向GRP78/BIP、HNRNPA2B1、RPLP1、RPLP2及SRSF1之siRNA的非限制性實例列於表1及表2中且描述於以下實例中。在一個實施例中，寡核苷酸抑制劑為表1及表2中所述之siRNA，或其經修改型式。在各種實施例中，寡核苷酸抑制劑經修飾以減少寡核苷酸由核酸酶之降解。在另一個實施例中，寡核苷酸抑制劑經修飾以增強寡核苷酸抑制劑與靶RNA或靶蛋白之結合。在另一個實施例中，寡核苷酸抑制劑與胺基糖或脂質結合。
在一個實施例中，寡核苷酸抑制劑靶向GRP78/BIP RNA及GRP78/BIP蛋白中之至少一者。在另一個實施例中，寡核苷酸抑制劑靶向SRSF1 RNA及SRSF1蛋白中之至少一者。在另一個實施例中，寡核苷酸抑制劑靶向HNRNPA2B1 RNA及HNRNPA2B1蛋白中之至少一者。在另一個實施例中，寡核苷酸抑制劑靶向RPLP1 RNA及RPLP1蛋白中之至少一者。在另一個實施例中，寡核苷酸抑制劑靶向RPLP2 RNA及RPLP2蛋白中之至少一者。
在一個實施例中，以可有效減少由受感染細胞產生之病毒分子之含量且從而減少個體之病毒負荷之量向個體投與如本文所述之寡核苷酸抑制劑。靶向靶RNA或靶蛋白中之至少一者之寡核苷酸抑制劑的EC50 值可為小於100 nM、小於50 nM、小於30 nM或小於10 nM，如藉由適合之病毒分析，例如HBV分析或針對呼吸道病毒之分析所測定。各種適合之病毒分析為熟習此項技術者已知，且可基於針對減少而選擇之病毒分子來選擇。舉例而言，可藉由量測由受感染細胞而產生的病毒粒子的減少來測定冠狀病毒RNA之含量減少。HBV分子之實例包括S-抗原(HBsAg)、E-抗原(HBeAg)、核心-抗原、HBV RNA及HBV DNA。在一個實施例中，HBV分析定量評估HBsAg、HBeAg、HBV核心、HBV RNA或HBV DNA。在一些情況下，HBV分析之選擇不一定基於針對減少而選擇之HBV分子進行，包括舉例而言HBV分子未知、存在多種HBV分子及/或個體正在針對HBV而治療之情況。在此類情況下，選擇HBsAg分析作為預設HBV分析。舉例而言，在如本文所述之治療HBV感染之方法的一個實施例中，HBV分析為HBsAg分析。
在各種實施例中，病毒分子之含量可藉由使經病毒感染之細胞與有效量之如本文所述之寡核苷酸抑制劑接觸而顯著減少。舉例而言，經病毒感染之細胞與有效量之寡核苷酸抑制劑的接觸可使病毒分子之含量減少至少20%、至少30%、至少40%或至少50%。在一個實施例中，細胞經HBV感染且病毒分子為HBV分子。在另一個實施例中，細胞經冠狀病毒(諸如β-冠狀病毒)感染且病毒分子為冠狀病毒分子。病毒分子之含量的減少可使用如本文其他地方所述之適合之病毒分析來測定。此類分析可基於病毒分子來選擇，該病毒分子之含量減少經測定，其中HBsAg分析再次為預設HBV分析。
本文所述之一些實施例係關於一種治療病毒感染(例如，HBV感染或諸如冠狀病毒感染之呼吸道病毒感染)之方法，該方法可包括向鑑別為罹患病毒感染之個體投與有效量之如本文所述之寡核苷酸抑制劑或包括有效量之如本文所述之寡核苷酸抑制劑的醫藥組合物。本文所述之其他實施例係關於使用如本文所述之寡核苷酸抑制劑來製造用於治療病毒感染(例如，HBV感染或諸如冠狀病毒感染的呼吸道病毒感染)之藥物。本文所述之又其他實施例係關於如本文所述之寡核苷酸抑制劑或包括如本文所述之寡核苷酸抑制劑的醫藥組合物用於治療病毒感染(例如，HBV感染或諸如冠狀病毒感染的呼吸道病毒感染)之用途。
各種實施例提供如本文所述之藉由向個體投與有效量之寡核苷酸抑制劑來治療病毒感染的方法。其他實施例提供如本文所述之寡核苷酸抑制劑，其用於治療此類病毒感染及/或用於製造用於治療此類病毒感染之藥物。在各種實施例中，此類方法及用途進一步包含向個體投與有效量之第二療法以及寡核苷酸抑制劑。第二療法可選自用於治療病毒感染之各種治療模式。在一個實施例中，第二療法包含向個體投與有效量之第二治療分子以及寡核苷酸抑制劑。舉例而言，在各種實施例中，第二治療分子包含如本文所述之第二寡核苷酸抑制劑、核苷、核苷酸、核苷酸前藥、干擾素、衣殼組裝調節劑、蛋白酶抑制劑或其組合。舉例而言，在一個實施例中，第二治療分子為雷斯韋德。在一個實施例中，第二治療分子包含第二寡核苷酸抑制劑。在一個實施例中，第二寡核苷酸抑制劑靶向至少一個細胞宿主因子。第二寡核苷酸抑制劑所靶向之細胞宿主因子可與第一寡核苷酸抑制劑所靶向之細胞宿主因子相同或不同。在一個實施例中，第一寡核苷酸抑制劑靶向RPLP1且第二寡核苷酸抑制劑靶向RPLP2。在另一個實施例中，第一寡核苷酸抑制劑靶向GRP78且第二寡核苷酸抑制劑靶向RPLP1。在另一個實施例中，第一寡核苷酸抑制劑靶向GRP78且第二寡核苷酸抑制劑靶向RPLP2。
如本文其他地方所指示，可使用各種途徑向有需要之個體投與寡核苷酸抑制劑。在一個實施例中，藉由非經腸途徑向個體投與有效量之寡核苷酸抑制劑或包括寡核苷酸抑制劑之醫藥組合物。舉例而言，在一個實施例中，向個體靜脈內投與有效量之寡核苷酸抑制劑或包括寡核苷酸抑制劑之醫藥組合物。在另一個實施例中，向個體皮下投與有效量之寡核苷酸抑制劑或包括寡核苷酸抑制劑之醫藥組合物。在另一個實施例中，藉由吸入向個體投與有效量之寡核苷酸抑制劑或包括寡核苷酸抑制劑之醫藥組合物。經分離之合成寡核苷酸抑制劑
各種實施例提供一種具有反義股之經分離之合成寡核苷酸抑制劑，該反義股以高特異性與如本文所述之靶RNA雜交。此類寡核苷酸抑制劑之實例描述於表2中。雜交之高特異性可表示為至少約48℃、約49℃或約50℃之計算熔融溫度(Tm)。舉例而言，在一個實施例中，雜交之高特異性表示為50℃或更高之計算Tm。在一個實施例中，雜交之高特異性表示為大於或等於表2中所示之Tm之計算值中的任一者之計算Tm。
一個實施例提供一種具有反義股之經分離之合成寡核苷酸抑制劑，該反義股與靶RNA雜交，其中： 該靶RNA選自GRP78/BIP RNA、SRSF1 RNA、HNRNPA2B1 RNA、RPLP1 RNA、RPLP2 RNA；及 該反義股為可以高特異性與選自以下之靶RNA之15至21長度部分雜交之任何15至21聚體反義股： GRP78/BIP RNA之核鹼基1379至1397、 SRSF1 RNA之核鹼基51至69、 SRSF1 RNA之核鹼基523至541、 RPLP1 RNA之核鹼基286至305、 RPLP1 RNA之核鹼基81至101、 RPLP1 RNA之核鹼基283至303、 RPLP1 RNA之核鹼基331至351、 RPLP1 RNA之核鹼基-1至20、 RPLP1 RNA之核鹼基9至29、 RPLP1 RNA之核鹼基74至94、 RPLP1 RNA之核鹼基125至145、 RPLP1 RNA之核鹼基272至292、 RPLP1 RNA之核鹼基329至349、 RPLP2 RNA之核鹼基135至155、 RPLP2 RNA之核鹼基327至347、 RPLP2 RNA之核鹼基336至356、 RPLP2 RNA之核鹼基136至156、 RPLP2 RNA之核鹼基190至210、 RPLP2 RNA之核鹼基273至293、 RPLP2 RNA之核鹼基302至322、 RPLP2 RNA之核鹼基325至345、 RPLP2 RNA之核鹼基52至72、 RPLP2 RNA之核鹼基132至153、 RPLP2 RNA之核鹼基142至162、 RPLP2 RNA之核鹼基333至351、 RPLP2 RNA之核鹼基56至74、 RPLP2 RNA之核鹼基147至165、 RPLP2 RNA之核鹼基108至126及 RPLP2 RNA之核鹼基120至138。
核鹼基係根據如針對如圖1A中所示之各別靶RNA所示經編號之位置編號。在各種實施例中，雜交之高特異性表示為至少約48℃、約49℃或約50℃之計算Tm。舉例而言，在一個實施例中，雜交之高特異性表示為50℃或更高之計算Tm，諸如大於或等於表2中所示的Tm之計算值中的任一者之計算Tm。
在各種實施例中，經分離之合成寡核苷酸抑制劑之反義股為SEQ ID NOS. 21至52中的任一者之反義股內的任何15至21聚體、16至21聚體、17至21聚體、18至21聚體、19至21聚體或20至21聚體反義股，其限制條件為經分離之合成寡核苷酸之反義股不為SEQ ID NOS. 1至20中的任一者。舉例而言，在一個實施例中，經分離之合成寡核苷酸抑制劑之反義股為SEQ ID NOS. 21至42、44至45、47至50及52中的任一者之反義股內的任何15至21聚體反義股。在另一個實施例中，經分離之合成寡核苷酸抑制劑之反義股為SEQ ID NOS. 21至42、44至50及52中的任一者之反義股內的任何17至21聚體反義股。減少病毒分子及治療病毒感染之方法之論述
病毒為取決於多種代謝物之宿主細胞及繁殖及傳播所需之因子的胞內寄生蟲。細胞宿主因子為治療性干預之潛在靶，只要其對細胞健康而言並非必不可少即可。當與直接作用抗病毒劑相比較時，不大可能選擇靶向細胞蛋白以減少病毒感染來抵抗病毒，因為細胞分子之產生通常不經受作為病毒核酸合成之典型之易錯性合成(2)。
HBV為包膜病毒中之最小病毒(1)。HBV攻擊肝細胞及其感染可為急性的且被宿主清除，或為慢性的。慢性感染及所得發炎反應可導致患者患上肝炎、肝硬化及肝細胞癌。全世界範圍內超過1億8千萬人慢性感染有HBV。雖然可抑制HBV聚合酶之現有藥物為可用的且有效減少病毒負荷，但其不會治癒病毒感染。
HBV獲得經由稱為牛磺膽酸鈉共轉運多肽(NCTP)之肝臟特異性膽酸轉運蛋白而進入肝細胞(3)。釋放至細胞中之核衣殼含有共價連接於病毒聚合酶之鬆弛部分雙股DNA基因體，該病毒聚合酶可將部分雙股DNA轉化成共價封閉環，稱為cccDNA。cccDNA為用於轉錄可經加工且接著轉譯以形成若干種蛋白質之一巢HBV RNA，或可經複製以形成HBV DNA之HBV前基因體RNA的模板(1)。待發現之第一HBV蛋白為HBV表面抗原(HBsAg)，其經分泌以影響免疫反應以及在核衣殼周圍組裝以形成感染性病毒。核心蛋白(亦稱為核心抗原)為圍繞HBV基因體組裝以形成二十面體核衣殼之結構蛋白。E-抗原(HBeAg)由含有與核心融合之前導肽以使得能夠自受感染細胞分泌E-抗原的RNA剪接變異體產生，其中可能的結果為干擾宿主免疫反應。HBV亦產生其自身DNA聚合酶，即可自RNA或DNA模板合成DNA的逆轉錄酶。稱為HBX之HBV蛋白為可調節細胞信號傳導以及促成肝臟病況之多功能蛋白。
已在經培養細胞中充分地研究了HBV複製。人類肝母細胞瘤細胞株，HepG2細胞可感染有HBV病毒粒子，尤其在其過度表現NCTP受體時(4)。衍生自含有HBV基因體之整合複本之HepG2細胞的HepG.2.2.15細胞亦已用於產生HBV分子且形成感染性病毒粒子(5)。
咸信細胞蛋白在整個HBV複製/感染過程中起重要作用。已鑑別出若干此等宿主因子，包括在HBV蛋白之合成、摺疊、修飾及運輸中起作用之宿主因子(6)。亦已鑑別出與HBV核酸之加工相互作用的宿主因子，但其在HBV感染方面之作用未充分研究及理解。已知宿主蛋白與ε元件相互作用，即存在於HBV前基因體RNA之兩個末端及HBV mRNA之3'末端的RNA模體(7)。HBV核酸合成及衣殼化需要ε元件(8)。
已知稱為GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA及RPLP2蛋白之RNA及蛋白質，但寡核苷酸抑制劑先前尚未鑑別為用於靶向以減少HBV或呼吸道病毒分子含量及/或用於治療HBV感染或呼吸道病毒感染之候選者。咸信GRP78/BIP蛋白(其可稱為GRP78或BIP)為調節摺疊異常蛋白質之識別的伴隨蛋白，該等摺疊異常蛋白質可影響細胞存活、蛋白質合成及蛋白質降解(9)。GRP78蛋白含量在HBV感染期間可升高，且可與過度表現之HBsAg相關(10)。SRSF1蛋白為影響RNA剪接、RNA轉運及可譯性的RNA-結合蛋白，且可調節無義介導之mRNA衰減(11)。HNRNPA2B1蛋白識別RNA，包括具有經N6-甲基化腺苷酸以調節RNA穩定性、加工及轉譯性之彼等RNA(12)。已顯示HBV RNA在位於牽涉HBV RNA穩定性、複製及轉譯性之ε元件之基部擁有N6-甲基腺苷酸(13)。HNRNPA2B1亦可牽涉到調節可活化針對病毒感染之宿主先天性免疫反應之促炎性細胞介素產生(14)。RPLP2蛋白為被認為調節轉譯延伸之效率的核糖體相關蛋白質(15)。RPLP2蛋白與兩種額外蛋白質-RPLP0及RPLP1複合起作用以包含稱為酸性核糖體柄之結構，該結構可與轉譯延伸因子相互作用以增強一些跨膜蛋白之轉譯(16)。RPLP1及RPLP2兩者牽涉到自若干正股RNA病毒產生包膜蛋白的野生型含量，且兩者均影響感染性(17、18)。醫藥組合物
本文所述之一些實施例係關於一種醫藥組合物，其可包括如本文所述之寡核苷酸抑制劑及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或其組合。舉例而言，一個實施例提供一種用於治療病毒感染(例如HBV感染或呼吸道病毒感染，諸如冠狀病毒感染)之醫藥組合物，其包含： 醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或其組合；及 有效量之一或多種寡核苷酸抑制劑，其靶向選自以下之靶RNA或靶蛋白中之至少一者：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA、RPLP2蛋白及前述任一者的組合。
在一個實施例中，寡核苷酸抑制劑之EC50 值為小於100 nM，如藉由適合的分析(例如HBV分析或呼吸道病毒之分析，諸如冠狀病毒分析)所測定。
熟習此項技術者應理解，醫藥組合物中所包括之寡核苷酸抑制劑可為如本文其他地方所述之靶向靶RNA或靶蛋白中至少一者的各種寡核苷酸抑制劑中之任一或多者。舉例而言，在一個實施例中，醫藥組合物中之siRNA為如表1中所述之siRNA或其經修飾型式。在另一個實施例中，醫藥組合物中之siRNA為如表2中所述之siRNA或其經修飾型式。
醫藥組合物之適當調配物視所選投與途徑而定。本文所述之寡核苷酸抑制劑之調配及投與技術為熟習此項技術者已知。此項技術中存在多種投與寡核苷酸抑制劑之技術，包括(但不限於)非經腸遞送，諸如藉由吸入、靜脈內或皮下遞送。醫藥組合物通常將經調適用於特定預期投與途徑。舉例而言，在一個實施例中，醫藥組合物呈適於經由非經腸遞送投與個體之形式。在各種實施例中，此非經腸遞送形式包括增強遞送之載劑。舉例而言，在一個實施例中，寡核苷酸抑制劑囊封於脂質中，保護該寡核苷酸抑制劑在通過血流期間免於發生降解及/或促進遞送至所需器官，諸如遞送至肝臟。 實例
額外實施例進一步詳細揭示於以下實例中，該等實例不意欲以任何方式限制申請專利範圍之範疇。 實例1至20
製備靶向細胞宿主因子以減少HBV分子含量之一系列siRNA或自商業來源獲得。表1描述了每一siRNA及其相應靶RNA之序列。 表1
siRNA SEQ ID NO siRNA 有義股 (5 至3 ') 靶 RNA 靶 核苷酸編號 1 Tm ( ℃ ) 2 ΔG ( 千卡 / 莫耳 )3
1 AAGCGCAUUGAUACUAGAAAU GRP78/BIP 1671至1689 56.5 21.4
2 AGGAACCAUCCCGUGGCAUAA GRP78/BIP 1147至1165 66.3 24.7
3 AAGAAAGAAGGUUACCCAUGC GRP78/BIP 485至503 62.6 22.6
4 AAAGAUGAAGCUGUAGCGUAU GRP78/BIP 1170至1188 61.8 22.6
5 AACGGUGGAAAUUUCGGACCA HNRNPA2B1 617至633 64.8 25.6
6 AAGCUGUUUGUUGGCGGAAUU HNRNPA2B1 301至321 62.5 24.6
7 AAGGAGAGUAGUUGAGCCAAA HNRNPA2B1 227至245 64.4 22.9
8 AAGAGGAGGAUCUGAUGGAUA HNRNPA2B1 646至665 63.8 21.8
9 AAUGACAUGGGCUUUGGUCUU RPLP1 317至335 65.2 23.9
10 AAAAGAAGAAUCCGAGGAGUC RPLP1 292至311 62.4 23.0
11 AACCUCAUUCUGCACGACGAU RPLP1 39至57 64.3 25.1
12 AAACGUCAACAUUGGGAGCCU RPLP1 157至176 67.3 25.3
13 AAGUAUCGAGGCGGACGACGA RPLP2 92至110 69.4 28.0
14 AAAAACAUUGAAGACGUCAUU RPLP2 245至165 53.5 21.2
15 AAAGAAGAUCUUGGACAGCGU RPLP2 70至89 64.0 23.9
16 AAAUGAGAAGAAGGAGGAGUC RPLP2 287至305 63.4 22.2
17 AACGUGGAGUUUGUACGGAAA SRSF1 477至495 62.2 24.4
18 AAUGACCUAUGCAGUUCGAAA SRSF1 502至522 61.4 23.2
19 AAUCUCGAAGCCGUAGUCGUA SRSF1 618至637 66.6 25.8
20 AACAGGAUUCAUGGAGCGGGA SRSF1 2246至2264 68.5 25.6
1 靶mRNA之起始密碼子(AUG)中之第一個腺苷酸命名為核苷酸1。2 於155 mM的鹽(Na+)中且使用最近相鄰參數(Nearest Neighbor parameter)測定1 nM雙股RNA之Tm。3 在熱力學恆定條件下(25℃之1 M NaCl，pH為7.0)計算1 nM經黏接之dsRNA的ΔG。 實例21至52
製備靶向細胞因子以減少病毒分子含量之一系列siRNA。表2描述了每一siRNA及其相應靶RNA之序列。 表2
siRNA SEQ ID NO 股 siRNA 序列 (5 ' 至3 ') 靶 RNA 靶核苷酸編號 1 Tm ( ℃ ) 2 ΔG ( 千卡/ 莫耳)3
21 有義 反義 CUGUUACAAUCAAGGUCUATT UAGACCUUGAUUGUAACAGTT GRP78 1379至1397 58.0 20.5
22 有義 反義 CAUCUACGUGGGUAACUUAUU UAAGUUACCCACGUAGAUGUU SRSF1 51至69 61.1 21.9
23 有義 反義 CUGGAUAACACUAAGUUUAUU UAAACUUAGUGUUAUCCAGUU SRSF1 523至541 54.8 19.4
24 有義 反義 GCAAAGAAAGAAGAAUCCGTT CGGAUUCUUCUUUCUUUGCTT RPLP1 286至305 57.1 22.5
25 有義 反義 GAUCAAUGCCCUCAUUAAAGCTT UUUAAUGAGGGCAUUGAUCUUTT RPLP1 81至101 62.8 24.8
26 有義 反義 GAAGCAAAGAAAGAAGAAUCCTT AUUCUUCUUUCUUUGCUUCCATT RPLP1 283至303 59.3 23.9
27 有義 反義 GGUCUUUUUGACUAAACCUCUTT AGGUUUAGUCAAAAAGACCAATT RPLP1 331至351 61.7 24.0
28 有義 反義 UAUGGCCUCUGUCUCCGAGCUUU AGCUCGGAGACAGAGGCCAUAUU RPLP1 -1至20 73.3 28.9
29 有義 反義 UGUCUCCGAGCUCGCCUGCAUUU AUGCAGGCGAGCUCGGAGACAUU RPLP1 9至29 74.5 31.1
30 有義 反義 AGGAUAAGAUCAAUGCCCUUCUU GAAGGGCAUUGAUCUUAUCCUUU RPLP1 74至94 64.3 24.7
31 有義 反義 UUUGGCCUGGCUUGUUUGCAAUU UUGCAAACAAGCCAGGCCAAAUU RPLP1 125至145 68.8 28.4
32 有義 反義 AGAAGAAAGUGGAAGCAAAGAUU UCUUUGCUUCCACUUUCUUCUUU RPLP1 272至292 62.5 25.0
33 有義 反義 UUGGUCUUUUUGACUAAACCUUU AGGUUUAGUCAAAAAGACCAAUU RPLP1 329至349 60.1 23.9
34 有義 反義 GCUGAAUGGAAAAAACAUUGATT AAUGUUUUUUCCAUUCAGCUCTT RPLP2 135至155 57.5 23.9
35 有義 反義 GGGAUUUGGCCUUUUUGAUUATT AUCAAAAAGGCCAAAUCCCAUTT RPLP2 327至347 61.4 24.7
36 有義 反義 CCUUUUUGAUUAAAUUCCUGCTT AGGAAUUUAAUCAAAAAGGCCTT RPLP2 336至356 56.3 23.2
37 有義 反義 CUGAAUGGAAAAAACAUUGAAUU UUCAAUGUUUUUUCCAUUCAGUU RPLP2 136至156 54.0 22.8
38 有義 反義 AGUGUACCUGCUGGUGGGGCUUU AGCCCCACCAGCAGGUACACUUU RPLP2 190至210 77.5 29.8
39 有義 反義 AGAGGAGAAGAAAGAUGAGAAUU UUCUCAUCUUUCUUCUCCUCUUU RPLP2 273至293 62.3 24.0
40 有義 反義 AGUCUGAAGAGUCAGAUGAUGUU CAUCAUCUGACUCUUCAGACUUU RPLP2 302至322 63.7 24.3
41 有義 反義 AUGGGAUUUGGCCUUUUUGAUUU AUCAAAAAGGCCAAAUCCCAUUU RPLP2 325至345 62.2 25.2
42 有義 反義 CCCAGCGCCAAGGACAUCAAGUU CUUGAUGUCCUUGGCGCUGGGUU RPLP2 52至72 73.0 29.9
43 有義 反義 GUAUCGAGGCGGACGACGACCUU GGUCGUCGUCCGCCUCGAUACUU RPLP2 92至112 73.6 31.6
44 有義 反義 UGAGCUGAAUGGAAAAAACAUUU AUGUUUUUUCCAUUCAGCUCAUU RPLP2 132至153 59.1 24.2
45 有義 反義 GGAAAAAACAUUGAAGACGUCUU GACGUCUUCAAUGUUUUUUCCUU RPLP2 142至162 58.4 24.6
46 有義 反義 GAAAGAUGAGAAGAAGGAGGAUU UCCUCCUUCUUCUCAUCUUUCUU RPLP2 282至302 63.9 24.6
47 有義 反義 UGGCCUUUUUGAUUAAAUUTT AAUUUAAUCAAAAAGGCCAAA RPLP2 333至351 51.1 20.2
48 有義 反義 GCGCCAAGGACAUCAAGAATT UUCUUGAUGUCCUUGGCGCAA RPLP2 56至74 65.7 25.2
49 有義 反義 AAACAUUGAAGACGUCAUUTT AAUGACGUCUUCAAUGUUUTT RPLP2 147至165 53.5 21.2
50 有義 反義 CGACCGGCUCAACAAGGUUTT AACCUUGUUGAGCCGGUCGTC RPLP2 108至126 68.1 26.7
51 有義 反義 GAAGAUCUUGGACAGCGUGTT CACGCUGUCCAAGAUCUUCTT RPLP2 72至90 64.0 24.1
52 有義 反義 CAAGGUUAUCAGUGUGCUGTT CAGCACACUGAUAACCUUGTT RPLP2 120至138 62.4 22.6
1 靶mRNA之起始密碼子(AUG)中之第一個腺苷酸命名為核苷酸1。2 於155 mM的鹽(Na+)中且使用最近相鄰參數(Nearest Neighbor parameter)測定1 nM雙股RNA之Tm。3 在熱力學恆定條件下(25℃之1 M NaCl，pH為7.0)計算1 nM經黏接之dsRNA的ΔG。 實例A1
細胞蛋白GRP78/BIP、SRSF1、HNRNPA2B1、RPLP1及RPLP2經鑑別在HBV複製及感染中起作用。使靶向編碼此等蛋白質之RNA的各種siRNA及其組合與HepG2.2.15細胞接觸，最終濃度為7.5 nM。引入siRNA對細胞生存力具有最小作用(參見圖1B)。如圖1B及1C中所示，與模擬相比，此等siRNA使如藉由S-抗原(HBsAg)之減少所指示的HBV分子含量減少超過50%，如藉由HBsAg分析所測定。減弱RPLP1使HBsAg含量比減弱RPLP2減少更多。此外，與經獨自靶向RPLP1或RPLP2之siRNA處理的細胞相比，減弱HepG2.2.15細胞中之RPLP1與RPLP2兩者之siRNA導致額外降低HBsAg含量，表明細胞因子可共同起作用以實現最佳HBsAg積聚。同樣，靶向GRP78與RPLP2二者之siRNA使HBsAg含量比減弱任一個單獨因子減少更多。 實例A2
關於減少HepG2.2.15細胞中之HBsAg含量之能力測定靶向HNRNPA2B1、GRP78、RPLP1、RPLP2及/或SRSF1之若干siRNA及siRNA組合的EC50 值。參見圖2A至E。發現靶向GRP78之siRNA 以1 nM 的EC50 值使HBsAg含量減少，其中對HepG2.2.15細胞之生存力無作用(圖2A、2B及2E)。靶向RPLP1之siRNA對HBsAg含量的作用同樣非常巨大，產生約0.9 nM之EC50 值，其中CC50 超過100 nM(圖2C、2D及2E)。靶向RPLP1與RPLP2二者之SiRNA具有約0.3 nM之EC50 值及超過100 nM之CC50 值。靶向SRSF1及RPLP2之siRNA的EC50 值亦為約1.5 nM或更低，其中CC50 值超過100 nM(圖2D及2E)。 實例A3
藉由在與靶向HNRNPA2B1、GRP78、RPLP1、RPLP2及SRSF1之10 nM之siRNA接觸之後，定量由HepG2.2.15細胞產生之HBsAg、HBeAg及核心蛋白的量來評估靶向宿主因子的siRNA隨後導致多種HBV分子之產生減少的能力。吾人亦使細胞與5 nM靶向RPLP1與RPLP2二者之各組siRNA接觸。HBsAg、HBeAg及核心之含量均使用ELISA測定。引入siRNA對細胞生存力或細胞毒性具有最小作用(圖3A)。當與經模擬處理之細胞相比時，siRNA引起HBsAg含量減少，其中減弱GRP78及RPLP1引起最大減少，且減弱HNRNPA2B1具有中間作用(圖3B)。GRP78及RPLP1之減弱再次引起HBeAg含量最大減少(圖3C)，其中與HNRNPA2B1的減弱相關之HBeAg之降低更適中(圖3C)。對於核心抗原而言，SRSF1之減弱引起最明顯的降低。阻斷RPLP1與RPLP2二者之基因表現的siRNA產生HBsAg及HBeAg之最大減少，但未可辨別地影響核心蛋白之含量(圖3C至3D)。最後，RPLP1及RPLP2之減弱引起分泌之HBV DNA之量減少(圖3E)。
總而言之，此等結果顯示，細胞因子可促進用於HBV感染之肝細胞模型中多種HBV分子之含量，且(一或多個)特定宿主因子可促進HBV分子之積聚。重要的是，靶向編碼宿主因子之RNA的siRNA及寡核苷酸可降低成功感染所需的HBV分子的含量。 實例A4
吾人鑑別出影響HBV複製之宿主因子亦在冠狀病毒感染中具有作用。人類冠狀病毒OC43為β-冠狀病毒屬之一員，其與高度病原性SARSV-CoV及SARS-CoV2相同(20)。吾人建立OC43感染HCT8(人類結腸上皮細胞株)之程序，因為冠狀病毒可感染人類腸道且引起腹瀉。HCT8細胞表現GRP78、RPLP1/2、SRSF1及HNRNPA2B1且靶向此等宿主因子之siRNA的轉染導致此等宿主因子之特定減弱。為了檢查siRNA對OC43感染之作用，首先HCT8細胞經病毒感染且接著用siRNA轉染，且使用反轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)定量由感染產生之病毒的量，該反應具有對OC43 N基因具有特異性之引子(圖4A)。用於實驗之陽性對照為評估瑞德西韋(一種可抑制冠狀病毒複製之核苷酸前藥)之作用(21)。最後，亦使用CellTiter-Glo試劑評估細胞生存力。在此等實驗中，0.5 μm之瑞德西韋能夠將OC43病毒粒子的產生減少至小於5%。另外，靶向RPLP1及GRP78之siRNA減少OC43 RNA，而對HCT8細胞之生存力無明顯不利作用(圖4B及4C)。在其他實驗中，相對於經模擬處理之細胞，RPLP2及SRSF1之減弱亦減少OC43 RNA。此等結果表明RPLP1/2、GRP78及SRSF1在冠狀病毒感染方面具有作用且靶向HBV感染所需之宿主因子的siRNA亦可抑制冠狀病毒感染。 實例A5
設計且合成靶向GRP78、SRSF1、RPLP1及RPLP2之siRNA庫。此庫偏向於RPLP1及RPLP2，因為此等蛋白質在體細胞中為非必需的且其在GRP78上游起作用。亦即，由於RPLP1及RPLP2蛋白缺乏而不能合成病毒蛋白無法藉由伴隨蛋白GRP78修復。 實例A6
針對由HepG2.2.15細胞分泌之及HBV病毒粒子中HBsAg之減少測試實例A5的siRNA庫。如表3中所概述， siRNA中1個靶向GRP78、2個靶向SRSF2、10個靶向RPLP1及19個靶向RPLP2，且發現所有都減少HBsAg含量，EC50 值為小於10 nM。實際上，siRNA中之大部分具有小於1 nM之EC50 值。此外，siRNA中無一者在所測試之最高濃度80 nM下具有明顯細胞毒性(表3)。最後，有效siRNA減少另一關鍵HBV分子HBeAg之含量。HBsAg及HBeAg減少之劑量反應及兩種siRNA(SEQ ID NOS 24及34)之細胞毒性概況的實例示於圖5A中。 表3
SEQ ID NO 靶 EC50 ， 細胞外HBsAg 減少 (pM ) CC50 ，HepG2 .2 .15 細胞生存力 (nM ) HepG2 .2 .15 細胞之HbeAg 減少 * (%) HepG2 .2 .15 細胞中之靶RNA 減少 * (%) HepG2 .2 . 15 細胞中之靶蛋白減少 * (%) OC43 vRNA 減少 * (%) siRNA 及siGRP78 之OC43 vRNA 減少 * (%)
21 GRP78 1600 ＞80 61.5+ 10 90+ 3 59+ 2 89+ 8 90+ 4
22 SRSF1 900 ＞80 33.5+ 5 71+ 1 92+ 20 36+ 3 85+ 4
23 SRSF1 3900 ＞80 29.8+ 3 ND 81+ 11 ND ND
24 RPLP1 359 ＞80 66+ 2 80+ 1 48+ 3 89+ 8 94+ 4
25 RPLP1 1830 ＞80 60+ 3 74+ 6 53+ 12 80+ 7 88+ 3
26 RPLP1 376 ＞80 64+ 3 86+ 1 72+ 17 91+ 3 95+ 1
27 RPLP1 110 ＞80 55+ 5 72+ 7 51+ 9 94+ 4 95+ 2
28 RPLP1 190 ＞80 30+ 4 80+ 2 58+ 7 48+ 12 71+ 6
29 RPLP1 386 ＞80 58+ 3 75+ 1 52+ 4 87+ 10 92+ 3
30 RPLP1 690 ＞80 58+ 4 78+ 3 45+ 8 90+ 6 84+ 6
31 RPLP1 12 ＞80 ND 84+ 4 37+ 7 82+ 4 82+ 6
32 RPLP1 525 ＞80 32+ 6 80+ 7 71+ 8 87+ 4 86+ 4
33 RPLP1 1537 ＞80 ND 83+ 6 28+ 4 ND ND
34 RPLP2 150 ＞80 74+ 4 93+ 1 62.5+ 3 86+ 3 86+ 5
35 RPLP2 10 ＞80 69+ 3 98+ 0 78+ 16 94+ 6 96+ 1
36 RPLP2 9200 ＞80 26+ 5 94+ 1 57+ 3 ND 87+ 6
37 RPLP2 49 ＞80 53+ 3 98+ 1 71+ 10 94+ 2 88+ 5
38 RPLP2 76 ＞80 ND 96+ 1 55+ 2 39+ 6 61+ 14
39 RPLP2 103 ＞80 59+ 4 96+ 1 48+ 9 91+ 2 86+ 6
40 RPLP2 114 ＞80 56+ 3 98+ 1 54+ 2 89+ 5 79+ 15
41 RPLP2 208 ＞80 40+ 4 97+ 1 58+ 2 89+ 5 81+ 7
42 RPLP2 385 ＞80 42+ 2 95+ 1 50+ 4 57+ 5 85+ 7
43 RPLP2 182 ＞80 70+ 5 94+ 2 45+ 4 94+ 1 92+ 2
44 RPLP2 84 ＞80 30+ 4 99+ 1 59+ 11 ND 92+ 2
45 RPLP2 13 ＞80 42+ 5 98+ 1 61+ 7 ND 89+ 2
46 RPLP2 1100 ＞80 44+ 5 98+ 1 56+ 8 ND 87+ 4
47 RPLP2 70 ＞80 38+ 5 97+ 3 67+ 5 ND 89+ 2
48 RPLP2 100 ＞80 32+ 5 97+ 0 54+ 8 ND 88+ 5
49 RPLP2 26 ＞80 32+ 6 98+ 1 59+ 4 ND 91+ 3
50 RPLP2 95 ＞80 42+ 5 98+ 1 48+ 2 ND 91+ 2
51 RPLP2 100 ＞80 32+ 4 98+ 0 56+ 5 ND 90+ 2
52 RPLP2 60 ＞80 54+ 5 98+ 1 58+ 1 ND 91+ 2
* 10 nM siRNA經轉染至細胞中 ND：未測定 實例A7
如實例A6中所述鑑別之siRNA的作用機制應包括：裝載於RISC複合物中以裂解同源mRNA，從而引起mRNA降解。為檢查siRNA是否有效減少靶mRNA，吾人使用與定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)耦合之反轉錄來評估HepG2.2.15細胞中靶mRNA之含量。表2中所述之所有32種siRNA減少mRNA超過75% (表3)。siRNA減少靶mRNA之百分比之取樣示於圖5B中。 實例A7
宿主因子可能在病毒感染中作為蛋白質起作用。因此，吾人測定siRNA是否可降低靶蛋白之量。溶解用10 nM之每一siRNA轉染72小時之細胞且使用經靶特異性抗體探測之西方墨點鑑別靶蛋白。表3中所述之有效siRNA使蛋白質之含量減少至經模擬處理樣品之28%與92%之間。蛋白質之減少小於靶mRNA之減少，其可能歸因於蛋白質具有延長半衰期且其降解需要更多時間。使用西方墨點分析偵測之RPLP1及RPLP2之減少的實例示於圖5D中。值得注意的是，RPLP1之減弱不僅減少RPLP1之含量，且亦導致RPLP2的降低，且反之亦然。吾人推論此係由於RPLP1及RPLP2充當雜二聚體，使得一種蛋白質之降低增加了另一種蛋白質降解之弱點。蛋白質之類似伴隨降低由Campos等人報告(17)。最後，未經siRNA靶向之兩種細胞蛋白，P54nrb及GAPDH之含量不受影響。結果表明siRNA對其靶具有特異性。 實例A8
將表2中所列之siRNA轉染至人類結腸上皮HCT8細胞中且定量所產生之OC43病毒粒子的量。在此等分析中，使用分支鏈DNA分析(QuantiGene基因表現分析：ThermoFisher)定量OC43 vRNA。作為陽性抑制對照，受感染細胞用瑞德西韋處理。在0.9 μm下用瑞德西韋進行之處理導致OC43 vRNA減少超過98%。另外，轉染至HCT8細胞中最終濃度為10 nM之siRNA導致OC43 vRNA減少36%與94%之間(表3)。OC43 vRNA之抑制之實例說明於圖5A中。此等結果證實靶向宿主因子之siRNA可抑制人類冠狀病毒感染。 實例A9
共同用於HBV複製功能之宿主因子及多種宿主因子之減弱導致HBV複製及HBsAg產生更顯著地減少(圖1B)。靶向宿主因子之siRNA之組合應更穩固地減少OC43病毒粒子產生。為了說明此情況，用來自表2之10 nM之siRNA以及靶向GRP78的10 nM之siRNA轉染HCT8細胞。使用分支鏈DNA分析來定量所產生之病毒粒子RNA。結果顯示靶向GRP78之siRNA以及靶向SRSF1、RPLP1或RPLP2之siRNA 導致OC43病毒粒子顯著減少(表3)。此活性之實例示於圖6B中。靶向宿主因子GRP78、SRSF1、RPLP1及RPLP2之siRNA的組合可引起自受感染細胞產生的人類冠狀病毒病毒粒子RNA顯著減少。
表3及圖1至6中所說明之結果證明藉由使受感染細胞與有效量之靶向細胞宿主因子的寡核苷酸抑制劑接觸，從而抑制受感染細胞產生細胞宿主因子且減少由受感染細胞產生之病毒分子的量來減少由受感染細胞產生之病毒分子之含量的方法。在一些實施例中，寡核苷酸抑制劑為具有表示為SEQ ID NOS 1至20之結構的siRNA。在其他實施例中，寡核苷酸抑制劑為具有表示為表2中之SEQ ID NOS 21至52之結構的siRNA。所引用之參考文獻
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圖1A展示宿主因子mRNA、其在美國國家生技資訊中心(National Center of Biotechnology Information；NCBI)處之寄存編號及用於鑑別本申請案中之siRNA之靶序列的核鹼基之編號的示意圖。蛋白編碼開放閱讀框架表示為矩形且起始密碼子之第一個腺苷酸命名為核苷酸1。
圖1B展示siRNA減弱對細胞生存力及HBsAg含量之作用的概述。細胞生存力係藉由使用CellTiter-Glo試劑測定之ATP含量來評估且結果相對於經模擬處理細胞中之含量而標準化。HBsAg含量係使用ELISA來定量且資料相對於經模擬處理細胞中之含量而標準化。結果顯示，靶向GRP78、SRSF1、HNRNPA2B1及RPLP2之siRNA減少由HepG2.2.15細胞所產生之HBsAg含量。
圖1C說明樣品西方墨點(Western blot)影像，其展示siRNA減少其靶向之細胞蛋白之含量。用對靶具有特異性之抗血清探測墨點。L.C.表示內參考物。
圖2A為說明可減弱HepG2.2.15細胞中之細胞因子之siRNA的細胞毒性(CC50 )之樣本分析之曲線。
圖2B為說明可減弱HepG2.2.15細胞中之細胞因子之兩種siRNA的有效濃度(EC50 )之樣本分析之曲線，如藉由可將HBsAg含量減少至模擬處理樣品之50%的siRNA所表明。
圖2C為說明可減弱HEpG2.2.15細胞中之細胞因子之siRNA的細胞毒性(CC50 )之樣本分析之曲線。
圖2D為說明可減弱HepG2.2.15細胞中之細胞因子之兩種siRNA的有效濃度(EC50 )之樣本分析之曲線，如藉由可將HBsAg含量減少至模擬處理樣品之50%的siRNA所表明。
圖2E為概述可單獨或組合地減弱HepG2.2.15細胞中之細胞因子之siRNA之細胞毒性(CC50 )及有效濃度(EC50 )的表。
圖3A為說明靶向HNRNPA2B1、GRP78、RPLP1、RPLP2及SRSF1之siRNA對HepG2.2.15細胞之生存力具有最小作用的曲線。使用CellTiter-Glo試劑定量對細胞生存力之作用。所有資料係相對於由經模擬處理細胞產生之蛋白質的量而標準化。
圖3B為說明靶向HNRNPA2B1、GRP78、RPLP1、RPLP2及SRSF1之siRNA在與模擬處理之HepG2.2.15細胞相比時引起HBsAg含量減少的曲線。使用ELISA定量在用siRNA處理之後由HepG2.2.15細胞產生之HBV蛋白。
圖3C為說明靶向HNRNPA2B1、GRP78、RPLP1、RPLP2及SRSF1之siRNA在與模擬處理之HepG2.2.15細胞相比時引起HBeAg含量減少的曲線。結果說明在用siRNA處理之後由HepG2.2.15細胞產生之HBV蛋白之定量。使用ELISA評估細胞培養基中之HBeAg。
圖3D為說明靶向HNRNPA2B1、GRP78及SRSF1之siRNA在與模擬處理之HepG2.2.15細胞相比時引起核心含量減少的曲線。結果說明在用siRNA處理之後由HepG2.2.15細胞產生之HBV蛋白之定量。
圖3E為說明靶向HNRNPA2B1、RPLP1、RPLP2及RPLP1及RPLP2之組合之siRNA在與模擬處理的HepG2.2.15細胞相比時引起分泌的HBV DNA含量減少的曲線。結果說明在細胞培養基中發現之HBV DNA的量之定量。使用qPCR測定DNA之複本數。
圖3A至E展示靶向宿主因子之siRNA可減少HepG2.2.15細胞中之多種HBV分子的含量。除了用siRNA 對RPLP1及RPLP2處理之細胞之外，該等細胞用5 nM最終濃度之各組siRNA處理，所有siRNA均以10 nM之最終濃度引入細胞中。
圖4A至C展示靶向宿主因子之siRNA可抑制冠狀病毒產生。
圖4A展示用於評估靶向宿主因子之siRNA是否可影響由HCT8細胞之HCoV-OC43感染產生之病毒粒子RNA的實驗之示意圖。
圖4B展示在經OC43感染之HCT 8細胞中測試之宿主因子siRNA當在10 nM或5 nM下測試時，不影響細胞生存力。使用CellTiter-Glo試劑獲得細胞生存力結果。
圖4C展示經轉染至HCT8細胞中之宿主因子siRNA及添加至經培養細胞中之瑞德西韋(Remdesivir)可減少HCoV-OC43病毒粒子RNA產生。使用反轉錄及定量聚合酶鏈反應來定量vRNA。
圖5A至5C說明靶向RPLP1及RPLP2之siRNA中之若干者的特性。
圖5A展示抑制HBsAg及HBeAg之含量而不影響細胞生存力之siRNA的兩個實例。曲線說明了多種特性：HBV S-抗原(HBsAg)及HBV E-抗原(HBeAg)之劑量依賴性減少及對細胞生存力之作用，如藉由使用CellTiter-Glo(CTG)試劑所測定。例示之siRNA為編號24及34，其分別靶向RPLP1及RPLP2(參見表2)。
圖5B.藉由siRNA靶向之RNA之減少的實例。靶mRNA之量係藉由qPCR定量。
圖5C.藉由siRNA靶向之蛋白質之減少的實例。凝膠影像來自用抗原特異性抗體探測之西方墨點。RPLP1及RPLP2充當雜二聚體且減少一種蛋白質之豐度引起另一蛋白質相當大的減少。P54nrb及GAPDH之含量充當內參考物。
圖6說明靶向宿主因子之siRNA可減少冠狀病毒病毒粒子RNA之量。
圖6A展示靶向宿主因子之siRNA之實例可減少由受感染細胞產生之HCoV-OC43病毒粒子RNA。在HCT8細胞中以10 nM之最終濃度轉染siRNA。在0.9 μm下使用用於抑制冠狀病毒感染之陽性對照，瑞德西韋(Remdesivir/Rem)。使用對OC43 RNA具有特異性之分支鏈DNA分析來定量病毒粒子RNA(vRNA)。
圖6B展示藉由用每一siRNA之濃度分別為10 nM之兩種siRNA處理的細胞產生之HCoV-OV43病毒粒子RNA之減少的實例。兩種siRNA為藉由水平條中之化合物編號(參見表2)提及之siRNA，以及靶向GRP78之siRNA，siGRP78。在0.9 μm下使用用於抑制冠狀病毒感染之陽性對照，瑞德西韋(Rem)。使用對OC43 RNA具有特異性之分支鏈DNA分析來定量vRNA。

Claims (65)

  1. 一種減少受感染細胞產生之病毒分子含量之方法，該方法包含： 使該受感染細胞與有效量之靶向細胞宿主因子之寡核苷酸抑制劑接觸，從而抑制該受感染細胞產生該細胞宿主因子且減少該受感染細胞產生之該病毒分子之量； 其中該受感染細胞產生(a)至少一種細胞宿主因子，其為選自以下之靶RNA或靶蛋白：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA及RPLP2蛋白；及(b)一定量至少一種病毒分子，該病毒利用以進行複製，其中該病毒分子為病毒蛋白、病毒DNA或病毒RNA。
  2. 如請求項1之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  3. 如請求項2之方法，其中該哺乳動物細胞為人類細胞。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該病毒為B型肝炎病毒(HBV)或呼吸道病毒。
  5. 如請求項4之方法，其中該病毒分子為HBV分子。
  6. 如請求項5之方法，其中該HBV分子係S-抗原、E-抗原、核心抗原、HBV RNA或HBV DNA。
  7. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該受影響之病毒分子為呼吸道病毒分子。
  8. 如請求項7之方法，其中該呼吸道病毒為冠狀病毒。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該受感染細胞與有效量之寡核苷酸抑制劑接觸使該受感染細胞產生之病毒分子之量減少至少20%，如藉由對該病毒分子之分析所測定。
  10. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該受感染細胞與有效量之寡核苷酸抑制劑接觸使該受感染細胞產生之病毒分子之量減少至少30%，如藉由對該病毒分子之分析所測定。
  11. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該受感染細胞與有效量之寡核苷酸抑制劑接觸使該受感染細胞產生之病毒分子之量減少至少40%，如藉由對該病毒分子之分析所測定。
  12. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該受感染細胞與有效量之寡核苷酸抑制劑接觸使該受感染細胞產生之病毒分子之量減少至少50%，如藉由對該病毒分子之分析所測定。
  13. 如請求項9至12中任一項之方法，其中對該病毒分子之分析為HBV分析，定量評估HBsAg、HBeAg、HBV核心抗原、HBV RNA或HBV DNA。
  14. 如請求項9至12中任一項之方法，其中對該病毒分子之分析為呼吸道病毒分析，其定量評估該呼吸道病毒之病毒分子或該呼吸道病毒對該受感染細胞之作用。
  15. 如請求項14之方法，其中該呼吸道病毒分析為冠狀病毒分析。
  16. 如請求項9至15中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑之EC50 值為小於100 nM，如藉由對該病毒分子之分析所測定。
  17. 一種治療病毒感染之方法，該方法包含： 向有需要之個體投與治療有效量之寡核苷酸抑制劑，其中該寡核苷酸抑制劑靶向細胞宿主因子，從而減少該個體之受感染細胞產生該細胞宿主因子； 其中該等受感染細胞產生至少一種細胞宿主因子，其為選自以下之靶RNA或靶蛋白：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA及RPLP2蛋白。
  18. 如請求項17之方法，其中該病毒為HBV。
  19. 如請求項17之方法，其中該病毒為呼吸道病毒。
  20. 如請求項19之方法，其中該呼吸道病毒為冠狀病毒。
  21. 如請求項17至20中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。
  22. 如請求項21之方法，其中該個體為人類。
  23. 如請求項17至22中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑減少該等受感染細胞產生之病毒分子的含量且從而減少該個體之病毒負荷。
  24. 如請求項23之方法，其中該寡核苷酸抑制劑之EC50 值為小於100 nM，如藉由對該病毒分子之分析所測定。
  25. 如請求項24之方法，其中該EC50 值為小於50 nM。
  26. 如請求項24之方法，其中該EC50 值為小於30 nM。
  27. 如請求項24之方法，其中該EC50 值為小於10 nM。
  28. 如請求項24至27中任一項之方法，其中對該病毒分子之分析定量評估HBsAg、HBeAg、HBV核心抗原、HBV RNA或HBV DNA。
  29. 如請求項24至27中任一項之方法，其中對該病毒分子之分析為對呼吸道病毒之分析，其定量評估該呼吸道病毒之分子或該病毒感染對該細胞之作用。
  30. 如請求項29之方法，其中對該呼吸道病毒之分析為冠狀病毒分析。
  31. 如請求項17至30中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與有效量之第二治療分子與該寡核苷酸抑制劑組合。
  32. 如請求項31之方法，其中該第二治療分子包含第二寡核苷酸抑制劑、核苷、核苷酸、核苷酸前藥、干擾素、衣殼組裝調節劑、蛋白酶抑制劑，或其組合。
  33. 如請求項32之方法，其中該第二治療分子包含第二寡核苷酸抑制劑。
  34. 如請求項33之方法，其中該第二寡核苷酸抑制劑靶向至少一種細胞宿主因子，其與該第一寡核苷酸抑制劑所靶向之細胞宿主因子相同或不同。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑靶向該GRP78/BIP RNA及該GRP78/BIP蛋白中之至少一者。
  36. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑靶向該SRSF1 RNA及該SRSF1蛋白中之至少一者。
  37. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑靶向該HNRNPA2B1 RNA及該HNRNPA2B1蛋白中之至少一者。
  38. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑靶向該RPLP1 RNA及該RPLP1蛋白中之至少一者。
  39. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑靶向該RPLP2 RNA及該RPLP2蛋白中之至少一者。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑為特異性識別該靶RNA之反義寡核苷酸，其中該靶RNA包括mRNA。
  41. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑為沉默RNA，與該靶RNA特異性雜交，其中該靶RNA包括mRNA。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑為表1或表2中所述之siRNA。
  43. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該寡核苷酸抑制劑包含一或多種經化學修飾之核苷酸，其增強該寡核苷酸抑制劑與該靶RNA或靶蛋白之結合。
  44. 一種用於治療個體之病毒感染之醫藥組合物，其包含： 醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑，或其組合；及 治療有效量之靶向細胞宿主因子之寡核苷酸抑制劑，該細胞宿主因子為選自以下之靶RNA或靶蛋白中之至少一者：GRP78/BIP RNA、GRP78/BIP蛋白、SRSF1 RNA、SRSF1蛋白、HNRNPA2B1 RNA、HNRNPA2B1蛋白、RPLP1 RNA、RPLP1蛋白、RPLP2 RNA、RPLP2蛋白，及前述任一者的組合。
  45. 如請求項44之醫藥組合物，其中該病毒感染由HBV引起。
  46. 如請求項44之醫藥組合物，其中該病毒感染由呼吸道病毒引起。
  47. 如請求項46之醫藥組合物，其中該呼吸道病毒為冠狀病毒。
  48. 如請求項44至47中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑減少投與該醫藥組合物之個體的受感染細胞產生GRP78/BIP RNA及GRP78/BIP蛋白中之至少一者。
  49. 如請求項44至47中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑減少投與該醫藥組合物之個體的受感染細胞產生該SRSF1 RNA及該SRSF1蛋白中之至少一者。
  50. 如請求項44至47中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑減少投與該醫藥組合物之個體的受感染細胞產生該HNRNPA2B1 RNA及該HNRNPA2B1蛋白中之至少一者。
  51. 如請求項44至47中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑減少投與該醫藥組合物之個體的受感染細胞產生該RPLP1 RNA及該RPLP1蛋白中之至少一者。
  52. 如請求項44至47中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑減少投與該醫藥組合物之個體的受感染細胞產生該RPLP2 RNA及該RPLP2蛋白中之至少一者。
  53. 如請求項44至52中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑為識別該靶RNA之反義寡核苷酸，其中該靶RNA包括mRNA。
  54. 如請求項44至52中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑為沉默RNA，識別該靶RNA，其中該靶RNA包括mRNA。
  55. 如請求44至52中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑為表1或表2中所述之siRNA。
  56. 如請求項44至55中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑包含一或多種經化學修飾之核苷酸，其增強該寡核苷酸抑制劑與該靶RNA或靶蛋白之結合。
  57. 如請求項44至56中任一項之醫藥組合物，其中該寡核苷酸抑制劑包含經組態以減少該寡核苷酸抑制劑經核酸酶降解的修飾。
  58. 如請求項44至57中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物呈適於經由非經腸遞送投與個體之形式。
  59. 如請求項58之醫藥組合物，其中該非經腸遞送包含靜脈內遞送。
  60. 如請求項58之醫藥組合物，其中該非經腸遞送包含皮下遞送。
  61. 如請求項44至60中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之載劑包含囊封該寡核苷酸抑制劑之脂質體。
  62. 一種經分離之合成寡核苷酸抑制劑，其包含與靶RNA雜交之反義股，其中： 該靶RNA選自GRP78/BIP RNA、SRSF1 RNA、HNRNPA2B1 RNA、RPLP1 RNA、RPLP2 RNA；及 該反義股為可以高特異性與選自以下之靶RNA之15至21長度部分雜交之任何15至21聚體反義股： 該GRP78/BIP RNA之核鹼基1379至1397、 該SRSF1 RNA之核鹼基51至69、 該SRSF1 RNA之核鹼基523至541、 該RPLP1 RNA之核鹼基286至305、 該RPLP1 RNA之核鹼基81至101、 該RPLP1 RNA之核鹼基283至303、 該RPLP1 RNA之核鹼基331至351、 該RPLP1 RNA之核鹼基-1至20、 該RPLP1 RNA之核鹼基9至29、 該RPLP1 RNA之核鹼基74至94、 該RPLP1 RNA之核鹼基125至145、 該RPLP1 RNA之核鹼基272至292、 該RPLP1 RNA之核鹼基329至349、 該RPLP2 RNA之核鹼基135至155、 該RPLP2 RNA之核鹼基327至347、 該RPLP2 RNA之核鹼基336至356、 該RPLP2 RNA之核鹼基136至156、 該RPLP2 RNA之核鹼基190至210、 該RPLP2 RNA之核鹼基273至293、 該RPLP2 RNA之核鹼基302至322、 該RPLP2 RNA之核鹼基325至345、 該RPLP2 RNA之核鹼基52至72、 該RPLP2 RNA之核鹼基132至153、 該RPLP2 RNA之核鹼基142至162、 該RPLP2 RNA之核鹼基333至351、 該RPLP2 RNA之核鹼基56至74、 該RPLP2 RNA之核鹼基147至165、 該RPLP2 RNA之核鹼基108至126及 該RPLP2 RNA之核鹼基120至138； 其中該等核鹼基係根據圖1A中所示之各別靶RNA所示編號之位置編號；及 其中雜交之高特異性係以50℃或更高之計算熔融溫度(Tm)表示。
  63. 如請求項62之經分離之合成寡核苷酸抑制劑，其中該反義股為SEQ ID NOS. 21至42、44至45、47至50及52中任一者之反義股內的任何15至21聚體反義股。
  64. 如請求項62之經分離之合成寡核苷酸抑制劑，其中該反義股為SEQ ID NOS. 21至42、44至50及52中任一者之反義股內的任何17至21聚體反義股。
  65. 一種用於治療個體之病毒感染之醫藥組合物，其包含： 醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑，或其組合；及 治療有效量之如請求項62至64中任一項之經分離之合成寡核苷酸抑制劑。
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