TW202120537A - 用於經改善的單鏈可變片段之材料及方法 - Google Patents

用於經改善的單鏈可變片段之材料及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202120537A
TW202120537A TW109127754A TW109127754A TW202120537A TW 202120537 A TW202120537 A TW 202120537A TW 109127754 A TW109127754 A TW 109127754A TW 109127754 A TW109127754 A TW 109127754A TW 202120537 A TW202120537 A TW 202120537A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cys
scfv
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
TW109127754A
Other languages
English (en)
Inventor
金泉 羅
勞倫 博謝
麥可 費爾德坎普
麥可 迪恩
安東尼 Ａ 阿姆斯壯
阿列克謝 特普利亞科夫
騏騏 黃
Original Assignee
美商健生生物科技公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商健生生物科技公司 filed Critical 美商健生生物科技公司
Publication of TW202120537A publication Critical patent/TW202120537A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Oxygen, Ozone, And Oxides In General (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Ropes Or Cables (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

所揭示者為用於經改善的單鏈可變片段之材料及方法。

Description

用於經改善的單鏈可變片段之材料及方法
所揭示者為用於經改善的單鏈可變片段之材料及方法。
抗原結合單鏈可變片段(scFv)係可經廣泛利用作為治療劑、顯像劑、診斷劑、或作為異源性分子諸如多特異性分子之部分的模組。ScFv的挑戰之一係低穩定性及聚集傾向（回顧於Worn and Pluckthun (2001)J Mol Biol 305: 989-1010；Rothlisbergeret al. , (2005)J Mol Biol 347: 773-789；Grosset al. , (1989)Transplant Proc 21(1 Pt 1): 127-130；Porteret al. , (2011) J Cancer 2: 331-332；Porteret al. , (2011)N Engl J Med 365: 725-733）。因此，需要可以可選地併入多特異性分子及異源性分子中之經改善的scFv設計。
在一態樣中，本揭露提供一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含： 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種經單離的scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之VH Cys且該L包含第一L Cys； 該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之VL Cys且該L包含第二L Cys；或 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之該VH Cys，該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之該VL Cys且該L包含該第一L Cys及該第二L Cys，其中該VH Cys及該第一L Cys能夠形成雙硫鍵且該VL Cys及該第二L Cys能夠形成雙硫鍵。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種醫藥組成物，其包含本揭露之spFv及醫藥上可接受之載劑。
本揭露亦提供一種多核苷酸，其編碼本揭露之spFv。
本揭露亦提供一種載體，其包含本揭露之多核苷酸。
本揭露亦提供一種宿主細胞，其包含本揭露之載體。
本揭露亦提供一種產生本揭露之spFv之方法，其包含在使該spFv產生之條件下培養本揭露之宿主細胞、及純化該spFv。
本揭露亦提供一種抗獨特型抗體(anti-idiotypic antibody)，其與本揭露之spFv結合。
本揭露亦提供一種套組，其包含本揭露之spFv。
在另一態樣中，本揭露提供一種多特異性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之VH Cys且該L包含第一L Cys； 該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之VL Cys且該L包含第二L Cys；或 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之該VH Cys，該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之該VL Cys且該L包含該第一L Cys及該第二L Cys，其中該VH Cys及該第一L Cys能夠形成雙硫鍵且該VL Cys及該第二L Cys能夠形成雙硫鍵。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種醫藥組成物，其包含本文提供之多特異性分子及醫藥上可接受之載劑。
在又另一態樣中，本揭露提供一種異源性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之VH Cys且該L包含第一L Cys； 該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之VL Cys且該L包含第二L Cys；或 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之該VH Cys，該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之該VL Cys且該L包含該第一L Cys及該第二L Cys，其中該VH Cys及該第一L Cys能夠形成雙硫鍵且該VL Cys及該第二L Cys能夠形成雙硫鍵。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種醫藥組成物，其包含本揭露之異源性分子及醫藥上可接受之載劑。
在又另一態樣中，本揭露提供一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合域的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)； 提供包含或經工程改造以包含第一L Cys之連接子(L)； 工程改造該VH以在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置包含VH Cys；及 形成在該VH Cys與該第一L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
本揭露亦提供一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合域的VH及VL； 提供包含或經工程改造以包含第二L Cys之L； 工程改造該VL以在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置包含VL Cys；及 形成在該VL Cys與該第二L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
本揭露亦提供一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合域的VH及VL； 提供包含或經工程改造以包含第一L Cys及第二L Cys之L； 工程改造該VH以在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置包含VH Cys； 工程改造該VL以在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置包含VL Cys；及 形成在該VH Cys與該第一L Cys之間的雙硫鍵及在該VL Cys與該第二L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
本揭露亦提供一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含 提供編碼VH、L、及VL之多核苷酸，其中 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L100之Cys；或 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L102之Cys，其中殘基編號係根據Chothia。 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 在宿主細胞中表現該多核苷酸以產生該穩定化scFv。
在又另一態樣中，本揭露提供一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含重鏈可變區(VH)、用於連接之構件(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含： 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含用於抗原結合之構件、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露抗原結合構件半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及用於抗原結合之構件，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、用於連接之構件(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含用於抗原結合之構件、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露抗原結合構件半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及用於抗原結合之構件(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、用於連接之構件(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含用於抗原結合之構件、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露抗原結合構件半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及用於抗原結合之構件，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供用於編碼本文提供之scFv之構件。
本揭露亦提供用於複製本文提供之載體之構件。
本揭露亦提供一種組成物，其包含用於穩定scFv之構件。
本揭露亦提供一種組成物，其包含用於增加scFv熱穩定性之構件。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含用於穩定scFv之構件。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含用於增加scFv熱穩定性之構件。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含用於穩定scFv之構件。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含用於增加scFv熱穩定性之構件。
相關申請案之交互參照
本申請案主張下列之優先權：美國臨時專利申請案62/946,897（2019年12月11日提出）、美國臨時專利申請案62/946,886（2019年12月11日提出）、美國臨時專利申請案62/946,882（2019年12月11日提出）、美國臨時專利申請案62/946,877（2019年12月11日提出）、美國臨時專利申請案62/946,865（2019年12月11日提出）、美國臨時專利申請案62/887,529（2019年8月15日提出）、美國臨時專利申請案62/887,527（2019年8月15日提出）、美國臨時專利申請案62/887,524（2019年8月15日提出）、美國臨時專利申請案62/887,519（2019年8月15日提出）、及美國臨時專利申請案62/887,514（2019年8月15日提出），彼等各者全文係以引用方式併入本文中。 序列表
本申請案以引用方式併入序列表，該序列表以文字格式與本申請案一起提交，標題為「14620-227-228_SL.txt」，於2020年8月5日建立，大小為258,724位元組。
所揭露之方法藉由參考下面的詳細描述結合附圖（其形成本揭露的一部分）可以更容易地理解。應當理解的是所揭露之方法不限於本文中所描述及/或顯示之特定方法，且本文中使用之用語目的是僅僅以示例的方式描述具體實施例並且不意圖限制。
在本文中所引用的所有專利、已公開專利申請案及公開案係以引用方式併入，猶如全文說明於本文中。
當呈現清單時，除非另有陳述，否則應理解該清單之各個別元件及該清單之每種組合皆係分開的實施例。舉例而言，呈現為「A 、B 、或C 」的實施例清單將解讀為包括實施例「A」、「B」、「C」、「A或B」、「A或C」、「B或C」、或「A、B、或C」。
如於本說明書及隨附的申請專利範圍中所使用，除非內文另有明確規定，否則單數形式的「一 (a/an) 」及「該 (the) 」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。
連接詞「包含 (comprising) 」、「基本上由 … 組成(consisting essentially of) 」、及「由 … 組成(consisting of) 」意欲意味著彼等在專利語言中一般公認的意義；亦即，(i)「包含(comprising)」與「包括(including)」、「含有(containing)」、或「其特徵在於(characterized by)」同義，係包括式或開放式，且不排除額外、未列舉之元件或方法步驟；(ii)「由…組成」排除請求項中未指明的任何元件、步驟、或成分；且(iii)「基本上由…組成」將請求項的範疇限制在所指明的材料或步驟「及不實質影響（所請發明的）（多個）基本及新穎特徵者」。以片語「包含」（或其均等詞）描述的實施例亦提供以「由…組成」及「基本上由…組成」所獨立描述之實施例。
「約 (about) 」意指在特定值的可接受誤差範圍內，如所屬技術領域中具有通常知識者所判定，其將部分地取決於該值是如何測量或判定的，即測量系統的限制。除非在實例或說明書中的其他地方在一特定檢定、結果或實施例的上下文中另有明確說明，「約(about)」意指根據本領域的實務在一個標準偏差內，或者至多5%的範圍，以較大者為準。
「替代支架 (alternative scaffold) 」係指一種單鏈蛋白質架構，其含有與具有高構形容許度之可變域相關聯的結構化核心。該等可變域容許變異引入而不會減損支架完整性，因而該等可變域可經工程改造且經選擇以結合至特定抗原。
「抗體依賴性細胞毒性 (antibody-dependent cellular cytotoxicity) 」、「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 」、或「ADCC 」係指誘導細胞死亡的機制，其取決於抗體包覆的目標細胞與具有裂解活性的效應細胞（諸如自然殺手細胞(NK)、單核球、巨噬細胞及嗜中性球）之間經由表現在效應細胞上的Fcγ受體(FcγR)的相互作用。
「抗體依賴性細胞吞噬作用 (antibody-dependent cellular phagocytosis) 」或「ADCP 」係指透過吞噬細胞（諸如巨噬細胞或樹突細胞）內化(internalization)以消滅抗體包覆的目標細胞的機制。
「抗原 (antigen) 」係指能夠介導免疫反應之任何分子（例如，蛋白質、肽、多醣、糖蛋白、醣脂、核酸、其部分、或其組合）。例示性免疫反應包括抗體產生及免疫細胞諸如T細胞、B細胞、或NK細胞的活化。
「抗原結合片段 (antigen binding fragment) 」或「抗原結合域 (antigen binding domain) 」係指與抗原結合之蛋白質之一部分。抗原結合片段可為合成的、可酶促獲得的、或經基因工程改造之多肽，且包括與抗原結合之免疫球蛋白的部分，諸如VH、VL、VH及VL、Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fd、及Fv片段、由一個VH域或一個VL域所組成之域抗體(dAb)、駱駝化VH域、VHH域、由模擬抗體之CDR（諸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3、以及LCDR1、LCDR2、及/或LCDR3）的胺基酸殘基所組成之最小識別單元、與抗原結合之替代支架、及包含抗原結合片段之多特異性蛋白質。抗原結合片段（諸如VH及VL）可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單抗體設計，其中VH/VL域可進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之單鏈所表現之情況下則可進行分子間配對，以形成單價抗原結合域，諸如單鏈Fv (scFv)或雙價抗體(diabody)。抗原結合片段亦可與可為單特異性或多特異性之其他抗體、蛋白質、抗原結合片段、或替代支架偶聯，以工程改造雙特異性及多特異性蛋白質。
「抗體 (antibody) 」係以廣義的方式意指並包括免疫球蛋白分子，其包括單株抗體（包括鼠類、人類、人源化(humanized)及嵌合單株抗體）、抗原結合片段、多特異性抗體（諸如雙特異性、三特異性、四特異性等）、二聚體、四聚體或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體及任何其他包含具有所需特異性之抗原結合部位的免疫球蛋白分子之修飾組態。「全長抗體(full length antibody)」包含藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)以及其多聚體（例如IgM）。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區（包含域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3）。每條輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL區可進一步細分成散佈於架構區(FR)的多個高變區，其被稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL係由三個CDR及四個FR區段組成，按照下列順序從胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。免疫球蛋白可被分為下列五大類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，視重鏈恆定域(constant domain)胺基酸序列而定。IgA及IgG係進一步被細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可被分為兩種明確不同類型（即kappa (κ)及lambda (λ)）中之一者，其視其恆定域的胺基酸序列而定。
「雙特異性分子 (bispecific) 」係指特異性結合兩種不同抗原或在相同抗原內的兩個不同表位之分子（諸如抗體）。雙特異性分子可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種（諸如人類或猴）的相同抗原（同源物(homolog)）具有交叉反應性，例如食蟹獼猴(Macaca cynomolgus , cynomolgus, cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes )，或者可結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。
「嵌合抗原受體 (chimeric antigen receptor) 」或「CAR 」係指經工程改造之T細胞受體，其將配體或抗原特異性移植至T細胞上（例如初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞或其組合）。CAR亦稱為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。CAR包含能夠與抗原結合之胞外域、跨膜域及至少一個胞內域。CAR胞內域包含已知作用為傳輸信號以造成細胞中之生物過程的活化或抑制之結構域的多肽。跨膜域包含已知橫跨細胞膜且可作用以連接胞外域及傳訊域之任何肽或多肽。嵌合抗原受體可選地可包含鉸鏈域，其作為胞外域與跨膜域之間的連接子。
「補體依賴性細胞毒性 (complement-dependent cytotoxicity) 」或「CDC 」係指誘導細胞死亡的機制，其中與目標結合之蛋白質的Fc效應域結合並活化補體成分C1q，其轉而活化補體級聯反應而導致目標細胞死亡。補體之活化亦可造成補體成分沉積在該目標細胞表面上，其藉由結合白血球上的補體受體（例如，CR3）而促進CDC。
「互補決定區 (complementarity determining region) 」(CDR)為結合抗原之抗體區。VH中有三個CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3），且VL中有三個CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）。CDR可使用各種描繪來定義，諸如Kabat (Wuet al., (1970)J Exp Med 132: 211-250; Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)、Chothia (Chothiaet al., (1987)J Mol Biol 196: 901-17)、IMGT (Lefrancet al., (2003)Dev Comp Immunol 27: 55-77)、及AbM (Martin and Thornton (1996)J Bmol Biol 263: 800-815)。描述各種描繪與可變區編號之間的對應性（參見，例如Lefrancet al. (2003)Dev Comp Immunol 27: 55-77；Honegger and Pluckthun, J Mol Biol (2001) 309:657-670；國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics, IMGT)資料庫；網路資源，http://www_imgt_org）。可用程式（諸如UCL Business PLC之abYsis）可用於描繪CDR。本文中所使用之用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」及「LCDR3」包括由上述Kabat、Chothia、IMGT、或AbM中的任何方法定義的CDR，除非在說明書中另有明確說明。
「下降 (decrease) 」、「降低 (lower) 」、或「減少 (reduce) 」通常係指當相較於對照或媒劑所介導之反應時，測試分子介導經減少之反應（即，下游效應）的能力。例示性反應包括蛋白質與其抗原或受體之結合、增強與FcγR之結合、或增強Fc效應功能（諸如增強ADCC、CDC、及/或ADCP）。下降可為測試分子與對照（或媒劑）之間所測量之反應具有統計顯著差異、或測量反應下降，諸如下降約1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或30倍、或更多倍，諸如500、600、700、800、900、或1000倍、或更多倍。
「增強 (enhance) 」、「促進 (promote) 」、或「增加 (increase) 」通常係指當相較於對照或媒劑所介導之反應時，測試分子介導較大反應（即，下游效應）的能力。例示性反應為蛋白質與其抗原或受體之結合、增強與FcγR之結合、或增強Fc效應功能（諸如增強ADCC、CDC、及/或ADCP）。增強可為測試分子與對照（或媒劑）之間所測量之反應具有統計顯著差異、或測量反應增加，諸如增加約1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或30倍、或更多倍，諸如500、600、700、800、900、或1000倍、或更多倍。
「表現載體 (expression vector) 」係指可在生物系統或重構生物系統中用以引導多肽轉譯的載體，該多肽係由存在於該表現載體中之多核苷酸序列編碼。
「異源性 (heterologous) 」係指包含二或更多個多肽或二或更多個多核苷酸的多肽或多核苷酸，其等本質上彼此找不到相同關係。
「異源性多核苷酸 (heterologous polynucleotide) 」係指包含二或更多個多核苷酸的多核苷酸，其等本質上彼此找不到相同關係。
「異源性多肽 (heterologous polypeptide) 」係指包含二或更多個多肽的多肽，其等本質上彼此找不到相同關係。
「人類抗體 (human antibody) 」係指經最佳化以在投予至人類對象時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體含有恆定區或恆定區的一部分，則該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。如果該人類抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重及輕鏈可變區。此等例示性系統係經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫(gene library)、及基因轉殖非人類動物（諸如帶有人類免疫球蛋白基因位點的小鼠或大鼠）。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時，「人類抗體」一般含有胺基酸差異，這是由於用於獲得人類抗體及人類免疫球蛋白基因位點之系統之間的差異、引入體細胞突變或向架構或CDR或兩者中刻意引入取代。一般而言，「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，「人類抗體(human antibody)」可含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如在Knappiket al. , (2000)J Mol Biol 296:57-86中所述，或併入經展示在噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如在Shiet al. , (2010)J Mol Biol 397:385-396及國際專利公開號WO2009/085462中所述。至少一種CDR係衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。
「人源化抗體 (humanized antibody) 」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代，所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。
「經單離 (isolated) 」係指已自生產出該分子的系統（諸如重組細胞）的其他組分實質上分離及/或純化出之均質分子族群（諸如本揭露之scFv或包含本揭露之scFv的異源性蛋白質）、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物之分子，且涵蓋經單離成更高純度之分子，諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%純度。
「調節 (modulate) 」係指當相較於對照或媒劑所介導之反應時，測試分子介導經增強或經減少之反應（即，下游效應）的能力增強或下降。
「單株抗體 (monoclonal antibody) 」係指自實質上均質的抗體分子族群獲得之抗體，即除了可能的熟知改變之外包含該族群之個別抗體係同一的，該等改變諸如自抗體重鏈移除C端離胺酸或轉譯後修飾，諸如胺基酸異構化或脫醯胺化、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺酸或麩醯胺酸脫醯胺化。單株抗體一般結合一種抗原表位。雙特異性單株抗體會結合兩種不同的抗原表位。單株抗體在抗體群內可能有異源醣化。單株抗體可係單特異性或多特異性的（諸如雙特異性的）、單價、二價、或多價的。
「多特異性分子 (multispecific) 」係指與二或更多種不同抗原或相同抗原內二或更多個不同表位結合之分子。多特異性分子可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如與來自其他物種（諸如人類或猴）的相同抗原（同源物）具有交叉反應性，例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis , cynomolgus, cyno)或黑猩猩，或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。
「多核苷酸 (polynucleotide) 」係指包含藉由糖-磷酸主鏈或其他等效共價化學共價連接之核苷酸鏈的分子。cDNA係多核苷酸的典型實例。
「蛋白質 (protein) 」或「多肽 (polypeptide) 」在本文中可互換使用，係指包含一或多個各包含至少二個藉由肽鍵連接之胺基酸殘基的多肽之分子。蛋白質可為單體，或可為二或更多個次單位之蛋白質複合體，該等次單位係相同或不同。少於50個胺基酸的小型多肽可稱為「肽(peptide)」。蛋白質可為異源性融合蛋白、糖蛋白、或藉由轉譯後修飾所修飾之蛋白質，該轉譯後修飾諸如磷酸化、乙醯化、豆蔻化、棕櫚醯化、糖基化、氧化、甲醯化、醯胺化、瓜胺酸化、聚麩胺醯化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化、或生物素化。
「重組 (recombinant) 」係指藉由重組方式製備、表現、建立、或單離之多核苷酸、多肽、載體、病毒、及其他巨分子。
「單鏈 Fv (single chain Fv) 」或「scFv 」係指包含VH、VL、及介於該VH與該VL之間之連接子的單鏈蛋白質。ScFv可具有呈任一定向之VL及VH可變區，例如關於VH及VL的N端至C端順序。因此scFv可呈VL-連接子-VH或VH-連接子-VL定向。ScFv可經工程改造以包含介於VH、VL、及連接子之間之雙硫鍵。
「特異性結合 (specifically bind /specific binding /specifically binding )」或「結合 (bind) 」係指蛋白質諸如scFv以比對其他抗原更高的親和性結合至抗原或抗原內之表位。一般而言，蛋白質諸如scFv以下列平衡解離常數(KD )結合至抗原或抗原內之表位：約1×10-6 M或更小、約1×10-7 M或更小、約5×10-8 M或更小、約1×10-8 M或更小、約1×10-9 M或更小、約1×10-10 M或更小、約1×10-11 M或更小、或約1×10-12 M或更小，一般以小於其結合至非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白）之KD 至少一百倍的KD 結合。
「經釘合單鏈 Fv (stapled single chain Fv) 」或「spFv 」係指在VH與連接子之間或VL與連接子之間包含一或多個雙硫鍵之scFv。一般而言，spFv可包含介於VH與連接子之間的一個雙硫鍵、介於VL與連接子之間的一個雙硫鍵、或介於VH與連接子之間及介於VL與連接子之間的二個雙硫鍵。包含介於VH與VL之間的雙硫鍵之scFv分子排除在用語「spFv」之外。
「對象 (subject) 」包括任何人類或非人類動物。「非人類動物(nonhuman animal)」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬蟲動物等。用語「對象」與「患者(patient)」在本文中可互換使用。
「治療有效量 (therapeutically effective amount) 」係指達到所欲治療成果所需之劑量及時間的有效量。治療有效量可依不同因素而異，諸如對象之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在對象中引發所欲反應的能力。
疾病或病症之「治療 (treat /treating /treatment )」係指達成下列一或多者：減少病症之嚴重性及/或持續時間、抑制所治療病症特有之症狀的惡化、限制或預防病症於先前已患有該病症之對象中復發、或限制或預防症狀於先前已有該病症症狀之對象中復發。
「三特異性分子 (trispecific) 」係指特異性結合三種不同抗原或在相同抗原內的三個不同表位之分子（諸如抗體）。三特異性分子可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種（諸如人類或猴）的相同抗原（同源物(homolog)）具有交叉反應性，例如食蟹獼猴(Macaca cynomolgus , cynomolgus, cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes )，或者可結合在三或更多種不同抗原之間共有的表位。
「變體 (variant) 」、「突變體 (mutant) 」、或「經改變 (altered) 」係指因一或多個修飾（例如一或多個取代、插入、或缺失）而與參考多肽或參考多核苷酸不同的多肽或多核苷酸。
整份說明書中抗體恆定區之胺基酸殘基編號係根據如Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)中所述的EU索引(EU index)，除非另有明確說明。
在Ig恆定區中所指稱之突變如下：L351Y_F405A_Y407V，其係指在一個免疫球蛋白恆定區中之L351Y、F405A、及Y407V突變。L351Y_F405A_Y407V/T394W係指存在該分子之第一Ig恆定區中之L351Y、F405A及Y407V突變及第二Ig恆定區中之T394W突變。
除非另有明確說明，否則可變區的編號係根據Chothia。
「VH 半胱胺酸(VH Cysteine) 」或「VH Cys 」係指存在於VH架構中的Cys殘基。
「VL 半胱胺酸(VL Cysteine) 」或「VL Cys 」係指存在於VL架構中的Cys殘基。
「穩定化 (stabilized) 」係指當相較於非加熱scFv樣本時，scFv保留與hK2可相比的結合稱為熱穩定。
「經改善的穩定性 (improved stability) 」係指當相較於不具有雙硫鍵及經導入spFv之Cys殘基的親代scFv時，本揭露之spFv具有上升的熔點(Tm)。上升的Tm可為上升2℃或更多，諸如3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、或15℃。
「錨點 (anchor point) 」係指scFv VH或VL架構Cys殘基，其可經突變誘發成Cys而不對整體scFv結構造成反效應且能夠與存在於scFv連接子中之Cys形成雙硫鍵。
「釘合序列 (staple) 」係指含有一或二個Cys殘基之scFv連接子，該一或二個Cys殘基能夠與錨點Cys形成雙硫鍵。
「表面暴露 (surface exposed) 」係指至少部分暴露至蛋白質表面且可接觸溶劑之胺基酸殘基，諸如可接觸氘化作用。所屬技術領域中熟知基於一級序列或蛋白質預測殘基表面可接觸性之演算法。替代地，表面暴露殘基可從蛋白質的結晶結構識別。
「LTBR 」係指一種多肽，其係涉及細胞凋亡及細胞介素釋放之淋巴毒素的細胞表面受體，且係腫瘤壞死因子受體超家族之成員。LTBR亦可被稱為「腫瘤壞死因子受體超家族成員3 (TNFRSF3)」。LTBR表現在許多細胞類型的表面，包括上皮細胞及骨髓樣譜系。LTBR可與淋巴毒素膜形式（淋巴毒素-α及淋巴毒素-β之錯合物）特異性結合。LTBR的活化可經由TRAF3及TRAF5觸發細胞凋亡且可導致介白素8的釋放。除非另有說明，較佳的LTBR是人類LTBR。UniProt編號P36941提供人類LTBR胺基酸序列。
「EDB 」或「外域 B (extra domain B) 」係指基於纖維黏連蛋白前體mRNA的剪切模式可包括於纖維黏連蛋白分子中之纖維黏連蛋白的結構域。外域B係完整的第III型纖維黏連蛋白(FN)重複，包含91個胺基酸殘基。通常，EDB在正常成人組織中不可偵測，但在胎兒及腫瘤組織的細胞外基質中展現較高表現，且在血管生成過程期間堆積在新生血管周圍，因此使EDB成為血管生成的潛在標誌及目標。除非另有說明，較佳的EDB是人類EDB。UniProt編號P02751提供人類含EDB之纖維黏連蛋白(fibronectin)胺基酸序列。
「纖維黏連蛋白 (fibronectin) 」係指一種多肽，其係細胞外基質之高分子量糖蛋白。纖維黏連蛋白可與膜跨受體蛋白質（稱為整合素）結合。纖維黏連蛋白亦可結合其他細胞外基質蛋白質，諸如膠原蛋白、纖維蛋白、及乙醯肝素硫酸鹽蛋白聚糖。纖維黏連蛋白可存在為由二個幾乎相同的單體所組成之蛋白質二聚體，該二個幾乎相同的單體由一對雙硫鍵連接。纖維黏連蛋白係由單一基因產生，但選擇性剪接纖維黏連蛋白前體mRNA分子導致產生數種纖維黏連蛋白異構體，其中一種係EDB纖維黏連蛋白。纖維黏連蛋白可在細胞黏著性、生長、遷移、及分化上發揮作用，且其對於諸如傷口癒合及胚胎發育的過程可為重要的。人類纖維黏連蛋白胺基酸序列係由下列提供：UniProt編號P02751（其含有外域B）及NCBI編號NP_001263337（異構體B）、NP_001263338（異構體c）、NP_001263339（異構體d）、NP_001263340（異構體e）、及NP_001263341（異構體f）、NP_001293058（異構體8）、NP_001293059（異構體9）、NP_001293060（異構體10）、NP_001293061（異構體11）、及NP_002017（異構體3）。5.1 物質組成
本揭露提供穩定化scFv分子（在本文中稱為spFv（經釘合Fv））、包含spFv之異源性及多特異性分子、編碼彼等之多核苷酸、製造及使用彼等之載體、宿主細胞、及方法。本揭露係（至少部分）基於識別VH及/或VL中之合適殘基位置（在本文中稱為VH錨點或VL錨點）及可撓性連接子中之合適殘基位置（在本文中稱為釘合序列），彼等可經工程改造成半胱胺酸殘基，導致介於scFv中之連接子與可變域之間的雙硫鍵形成。本文所述之「釘合(stapling)」策略係廣泛適用於所有VH/VL域及預先存在scFv分子，為scFv提供具有改善的穩定性之結構同一性。本文所述之spFv可經偶聯成雙特異性或多特異性格式之任何異源性蛋白質，包括嵌合抗原受體(CAR)、T細胞重導向分子、雙特異性及多特異性分子，且可用來作為治療性、診斷性、及偵測分子。本揭露之spFv
本揭露提供一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含： 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種經單離的scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之VH Cys且該L包含第一L Cys； 該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之VL Cys且該L包含第二L Cys；或 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之該VH Cys，該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之該VL Cys且該L包含該第一L Cys及該第二L Cys，其中該VH Cys及該第一L Cys能夠形成雙硫鍵且該VL Cys及該第二L Cys能夠形成雙硫鍵。雙硫鍵一般在本揭露之scFv的表現期間形成。
雖然特定實例揭示具有二個雙硫鍵之spFv，但可輕易設想到可製造及利用具有一個雙硫鍵（在連接子Cys與VH Cys或VL Cys之間形成）之spFv，而產製「半錨定(half-anchored)」分子。錨位置在具有一或二個雙硫鍵之spFv中相同。連接子Cys位置可在半錨定分子中變化，只要滿足與錨點形成雙硫鍵之距離及幾何需求即可。預期半錨定spFv將限制VL/VH的相對移動，類似於經二個雙硫鍵穩定之VL/VH對，且因此亦將穩定。
當相較於不具有雙硫鍵之親代scFv時，本揭露之spFv展現增加的熱穩定性。一般來說，當相較於不具有雙硫鍵之親代scFv時，不論親代scFv的Tm為何，spFv的Tm高出約10℃。大致上，穩定性可為熱穩定性或機械穩定性。可使用微差掃描熱量法(DSC)評估熱穩定性，其中使用經加熱蛋白質樣本（諸如加熱至60℃之樣本）執行DSC掃描，隨後使用2狀態或非2狀態轉變分析所得熱熔輪廓。對於非2狀態轉變，記錄兩個轉變（Tm1及Tm2），其分別對應於VL及VH域的熔融Tm。
在一些實施例中，VH Cys與VL Cys之間的距離係約7 Å至約9 Å。在一些實施例中，VH Cys與VL Cys之間的距離係約7 Å。在一些實施例中，VH Cys與VL Cys之間的距離係約8 Å。在一些實施例中，VH Cys與VL Cys之間的距離係約9 Å。
在一些實施例中，VH Cys係在H3、H5、H40、H43、H46或H105，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，VH Cys係在H3。
在一些實施例中，VH Cys係在H5。
在一些實施例中，VH Cys係在H40。
在一些實施例中，VH Cys係在H43。
在一些實施例中，VH Cys係在H46。
在一些實施例中，VH Cys係在H105
在一些實施例中，VL Cys係在L3、L5、L39、L42、L45、L100或L102，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L102。
VH及VL區域的殘基編號係根據Chothia。
Chothia編號係廣為周知。其他編號系統（諸如Kabat或IMGT編號）或依序編號可用於編號VH及VL殘基位置。表 1 顯示例示性VH（GLk1 VH (SEQ ID NO: 60 )）在Chothia、Kabat、及依序編號之間的對應性。表 2 顯示例示性VL（GLk1 VL (SEQ ID NO: 56 )）在Chothia、Kabat、及依序編號之間的對應性。[ 表1]
Chothia編號 Kabat編號 依序編號 位置的胺基酸殘基    Chothia編號 Kabat編號 依序編號 位置的胺基酸殘基
H1 H1 1 E    H60 H60 61 A
H2 H2 2 V    H61 H61 62 D
H3 H3 3 Q    H62 H62 63 S
H4 H4 4 L    H63 H63 64 V
H5 H5 5 L    H64 H64 65 K
H6 H6 6 E    H65 H65 66 G
H7 H7 7 S    H66 H66 67 R
H8 H8 8 G    H67 H67 68 F
H9 H9 9 G    H68 H68 69 T
H10 H10 10 G    H69 H69 70 I
H11 H11 11 L    H70 H70 71 S
H12 H12 12 V    H71 H71 72 R
H13 H13 13 Q    H72 H72 73 D
H14 H14 14 P    H73 H73 74 N
H15 H15 15 G    H74 H74 75 S
H16 H16 16 G    H75 H75 76 K
H17 H17 17 S    H76 H76 77 N
H18 H18 18 L    H77 H77 78 T
H19 H19 19 R    H78 H78 79 L
H20 H20 20 L    H79 H79 80 Y
H21 H21 21 S    H80 H80 81 L
H22 H22 22 C    H81 H81 82 Q
H23 H23 23 A    H82 H82 83 M
H24 H24 24 A    H82A H82A 84 N
H25 H25 25 S    H82B H82B 85 S
H26 H26 26 G    H82C H82C 86 L
H27 H27 27 F    H83 H83 87 R
H28 H28 28 T    H84 H84 88 A
H29 H29 29 F    H85 H85 89 E
H30 H30 30 S    H86 H86 90 D
H31 H31 31 S    H87 H87 91 T
H32 H32 32 Y    H88 H88 92 A
H33 H33 33 A    H89 H89 93 V
H34 H34 34 M    H90 H90 94 Y
H35 H35 35 S    H91 H91 95 Y
H36 H36 36 W    H92 H92 96 C
H37 H37 37 V    H93 H93 97 A
H38 H38 38 R    H94 H94 98 K
H39 H39 39 Q    H95 H95 99 Y
H40 H40 40 A    H96 H96 100 D
H41 H41 41 P    H97 H97 101 G
H42 H42 42 G    H98 H98 102 I
H43 H43 43 K    H99 H99 103 Y
H44 H44 44 G    H100 H100 104 G
H45 H45 45 L    H100A H100A 105 E
H46 H46 46 E    H100B H100B 106 L
H47 H47 47 W    H101 H101 107 D
H48 H48 48 V    H102 H102 108 F
H49 H49 49 S    H103 H103 109 W
H50 H50 50 A    H104 H104 110 G
H51 H51 51 I    H105 H105 111 Q
H52 H52 52 S    H106 H106 112 G
H52A H52A 53 G    H107 H107 113 T
H53 H53 54 S    H108 H108 114 L
H54 H54 55 G    H109 H109 115 V
H55 H55 56 G    H110 H110 116 T
H56 H56 57 S    H111 H111 117 V
H57 H57 58 T    H112 H112 118 S
H58 H58 59 Y    H113 H113 119 S
H59 H59 60 Y               
[ 表2]
Chothia編號 Kabat編號 依序編號 位置的胺基酸殘基    Chothia編號 Kabat編號 依序編號 位置的胺基酸殘基
L1 L1 1 D    L55 L55 55 Q
L2 L2 2 I    L56 L56 56 S
L3 L3 3 Q    L57 L57 57 G
L4 L4 4 M    L58 L58 58 V
L5 L5 5 T    L59 L59 59 P
L6 L6 6 Q    L60 L60 60 S
L7 L7 7 S    L61 L61 61 R
L8 L8 8 P    L62 L62 62 F
L9 L9 9 S    L63 L63 63 S
L10 L10 10 S    L64 L64 64 G
L11 L11 11 L    L65 L65 65 S
L12 L12 12 S    L66 L66 66 G
L13 L13 13 A    L67 L67 67 S
L14 L14 14 S    L68 L68 68 G
L15 L15 15 V    L69 L69 69 T
L16 L16 16 G    L70 L70 70 D
L17 L17 17 D    L71 L71 71 F
L18 L18 18 R    L72 L72 72 T
L19 L19 19 V    L73 L73 73 L
L20 L20 20 T    L74 L74 74 T
L21 L21 21 I    L75 L75 75 I
L22 L22 22 T    L76 L76 76 S
L23 L23 23 C    L77 L77 77 S
L24 L24 24 R    L78 L78 78 L
L25 L25 25 A    L79 L79 79 Q
L26 L26 26 S    L80 L80 80 P
L27 L27 27 Q    L81 L81 81 E
L28 L28 28 S    L82 L82 82 D
L29 L29 29 I    L83 L83 83 F
L30 L30 30 S    L84 L84 84 A
L31 L31 31 S    L85 L85 85 T
L32 L32 32 Y    L86 L86 86 Y
L33 L33 33 L    L87 L87 87 Y
L34 L34 34 N    L88 L88 88 C
L35 L35 35 W    L89 L89 89 Q
L36 L36 36 Y    L90 L90 90 Q
L37 L37 37 Q    L91 L91 91 S
L38 L38 38 Q    L92 L92 92 Y
L39 L39 39 K    L93 L93 93 S
L40 L40 40 P    L94 L94 94 T
L41 L41 41 G    L95 L95 95 P
L42 L42 42 K    L96 L96 96 L
L43 L43 43 A    L97 L97 97 T
L44 L44 44 P    L98 L98 98 F
L45 L45 45 K    L99 L99 99 G
L46 L46 46 L    L100 L100 100 Q
L47 L47 47 L    L101 L101 101 G
L48 L48 48 I    L102 L102 102 T
L49 L49 49 Y    L103 L103 103 K
L50 L50 50 A    L104 L104 104 V
L51 L51 51 A    L105 L105 105 E
L52 L52 52 S    L106 L106 106 I
L53 L53 53 S    L107 L107 107 K
L54 L54 54 L    L108 L108 108 R
在一些實施例中，L包含衍生自免疫球蛋白(Ig)鉸鏈區之毗連胺基酸序列。
在一些實施例中，Ig鉸鏈區係衍生自人類或非人類Ig鉸鏈區。例示性非人類Ig鉸鏈區係該些來自小鼠、大鼠、犬、雞、及非人類靈長動物（諸如猴）者。
在一些實施例中，Ig鉸鏈區係衍生自人類Ig鉸鏈區。
在一些實施例中，人類Ig鉸鏈區係IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、或IgE同型。
Ig鉸鏈區大致上係定義為包括人類IgG的殘基216且終止於殘基230，其中殘基編號係根據EU索引。在一些情況下，自約殘基231至約殘基237的下鉸鏈區亦可包括在鉸鏈中。因此，IgG1鉸鏈區可包含胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 63 )，或當包括下鉸鏈時，IgG1鉸鏈區可包含胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 64 )。其他Ig同型的鉸鏈區係廣為周知且彼等之胺基酸序列可在例如ImMunoGeneTics網站獲得。例如，IgG2鉸鏈包含胺基酸序列ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 65 )。
當L包含Ig鉸鏈區胺基酸序列的至少一部分或經工程改造之Ig鉸鏈區的至少一部分時，L包含「衍生自 (derived from) 」Ig鉸鏈區之毗連胺基酸序列。當相較於野生型Ig鉸鏈時，經工程改造之Ig鉸鏈區包含一或多個突變。可導入之例示性突變係Cys殘基之取代以將L中之Cys數量減少至一或二個、Pro殘基之取代、或任何保守修飾（諸如保守取代）。
「保守修飾 (conservative modification) 」係指不會顯著影響或改變含有胺基酸修飾之抗體之結合特性的胺基酸修飾。保守修飾包括胺基酸取代、添加(addition)及缺失(deletion)。保守胺基酸取代為胺基酸被具有相似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基的家族已有明確界定，且包括具有以下者之胺基酸：酸性側鏈（如天冬胺酸、麩胺酸）、鹼性側鏈（如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、非極性側鏈（如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、不帶電極性側鏈（如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸）、芳族側鏈（如苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸）、脂族側鏈（如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸）、醯胺（如天冬醯胺酸、麩醯胺酸）、β分支側鏈（如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）、及含硫側鏈（半胱胺酸、甲硫胺酸）。此外，多肽中的任何天然殘基亦可經丙胺酸取代，如先前已針對丙胺酸掃描式突變誘發(alanine scanning mutagenesis)所描述者(MacLennanet al. , (1988)Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67; Sasakiet al. , (1988)Adv Biophys 35:1-24)。胺基酸取代可藉由已知方法例如PCR突變誘發(US Pat. No. 4,683,195)來進行。所得之變體鉸鏈可併入本揭露之spFv建構體中，並使用已知檢定及本文所述之檢定來測試彼等之特徵，諸如穩定性及與抗原之結合。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 23 )，其中X係甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)、脯胺酸(Pro)、丙胺酸(Ala)、精胺酸(Arg)、天冬醯胺酸(Asn)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺酸(Gln)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、離胺酸(Lys)、苯丙胺酸(Phe)、蘇胺酸(Thr)、色胺酸(Trp)、或酪胺酸(Tyr)，且y係1至3之整數。可將Pro包括於連接子中以提供剛性。可將Gly包括於連接子中以允許最大可撓性。任何其他胺基酸亦可在L中使用，除了Cys及Met以外。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 24 )，其中X係Gly、Ser、或Pro，且y係1至3之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPC、CGC、CSC、CPPC (SEQ ID NO: 1 )、CGPC (SEQ ID NO: 28 )、CPGC (SEQ ID NO: 29 )、CGGC (SEQ ID NO: 30 )、CSPG (SEQ ID NO: 31 )、CPSC (SEQ ID NO: 32 )、CSSC (SEQ ID NO: 33 )、CGSC (SEQ ID NO: 34 )、CSGC (SEQ ID NO: 35 )、CPPPC (SEQ ID NO: 36 )、CGPPC (SEQ ID NO: 37 )、CPGPC (SEQ ID NO: 38 )、CPPGC (SEQ ID NO: 39 )、CGGPC (SEQ ID NO: 40 )、CPGGC (SEQ ID NO: 41 )、CGGGC (SEQ ID NO: 42 )、CSPPC (SEQ ID NO: 43 )、CPSPC (SEQ ID NO: 44 )、CPPSC (SEQ ID NO: 45 )、CSSPC (SEQ ID NO: 46 )、CPSSC (SEQ ID NO: 47 )、CSSSC (SEQ ID NO: 48 )、CGSPC (SEQ ID NO: 49 )、CPGSC (SEQ ID NO: 50 )、CSGPC (SEQ ID NO: 51 )、或CPSGC (SEQ ID NO: 52 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPC。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CGC。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CSC。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPPC (SEQ ID NO: 1 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CGPC (SEQ ID NO: 28 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPGC (SEQ ID NO: 29 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CGGC (SEQ ID NO: 30 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CSPG (SEQ ID NO: 31 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPSC (SEQ ID NO: 32 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CSSC (SEQ ID NO: 33 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CGSC (SEQ ID NO: 34 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CSGC (SEQ ID NO: 35 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPPPC (SEQ ID NO: 36 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CGPPC (SEQ ID NO: 37 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPGPC (SEQ ID NO: 38 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPPGC (SEQ ID NO: 39 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CGGPC (SEQ ID NO: 40 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPGGC (SEQ ID NO: 41 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CGGGC (SEQ ID NO: 42 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CSPPC (SEQ ID NO: 43 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPSPC (SEQ ID NO: 44 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPPSC (SEQ ID NO: 45 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CSSPC (SEQ ID NO: 46 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPSSC (SEQ ID NO: 47 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CSSSC (SEQ ID NO: 48 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CGSPC (SEQ ID NO: 49 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPGSC (SEQ ID NO: 50 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CSGPC (SEQ ID NO: 51 )。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPSGC (SEQ ID NO: 52 )。
在一些實施例中，L包含約14至約19個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約14個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約15個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約16個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約17個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約18個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約19個胺基酸。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 25 )，其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、leu、Lys、Phe、Thr、Trp、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 26 )，其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Thr、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 27 )；其中X係Gly或Pro，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露之spFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中，本揭露之spFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。包含本揭露之spFv 的異源性分子
本揭露之spFv可與第二分子偶聯，此類似於所屬技術領域中已知之不具有雙硫鍵之非穩定化scFv。例示性第二分子係於本文中揭示，且包括半衰期延長部份、顯像劑、治療劑、包含各種抗體格式之抗體及其片段、抗原結合域、Fc區、免疫球蛋白重鏈/輕鏈或其片段、多特異性分子、及嵌合抗原受體(CAR)。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之VH Cys且該L包含第一L Cys； 該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之VL Cys且該L包含第二L Cys；或 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之該VH Cys，該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之該VL Cys且該L包含該第一L Cys及該第二L Cys，其中該VH Cys及該第一L Cys能夠形成雙硫鍵且該VL Cys及該第二L Cys能夠形成雙硫鍵。
在一些實施例中，VH Cys與VL Cys之間的距離係約7 Å至約9 Å。
在一些實施例中，VH Cys係在H3、H5、H40、H43、H46或H105，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，VL Cys係在L3、L5、L39、L42、L45、L100或L102，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H3且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H5且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H40且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H43且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H46且VL Cys係在L102。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L3。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L5。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L39。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L42。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L45。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L100。
在一些實施例中，VH Cys係在H105且VL Cys係在L102。
VH及VL區域的殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，L包含衍生自免疫球蛋白(Ig)鉸鏈區之毗連胺基酸序列。
在一些實施例中，Ig鉸鏈區係衍生自人類或非人類Ig鉸鏈區。例示性非人類Ig鉸鏈區係該些來自小鼠、大鼠、犬、雞、及非人類靈長動物（諸如猴）者。
在一些實施例中，Ig鉸鏈區係衍生自人類Ig鉸鏈區。
在一些實施例中，人類Ig鉸鏈區係IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、或IgE同型。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 23 )，其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Thr、Trp、或Tyr，且y係1至3之整數。可將Pro包括於連接子中以提供剛性。可將Gly包括於連接子中以允許最大可撓性。任何其他胺基酸亦可在L中使用，除了Cys及Met以外。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 24 )，其中X係Gly、Ser、或Pro，且y係1至3之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPC、CGC、CSC、CPPC (SEQ ID NO: 1 )、CGPC (SEQ ID NO: 28 )、CPGC (SEQ ID NO: 29 )、CGGC (SEQ ID NO: 30 )、CSPG (SEQ ID NO: 31 )、CPSC (SEQ ID NO: 32 )、CSSC (SEQ ID NO: 33 )、CGSC (SEQ ID NO: 34 )、CSGC (SEQ ID NO: 35 )、CPPPC (SEQ ID NO: 36 )、CGPPC (SEQ ID NO: 37 )、CPGPC (SEQ ID NO: 38 )、CPPGC (SEQ ID NO: 39 )、CGGPC (SEQ ID NO: 40 )、CPGGC (SEQ ID NO: 41 )、CGGGC (SEQ ID NO: 42 )、CSPPC (SEQ ID NO: 43 )、CPSPC (SEQ ID NO: 44 )、CPPSC (SEQ ID NO: 45 )、CSSPC (SEQ ID NO: 46 )、CPSSC (SEQ ID NO: 47 )、CSSSC (SEQ ID NO: 48 )、CGSPC (SEQ ID NO: 49 )、CPGSC (SEQ ID NO: 50 )、CSGPC (SEQ ID NO: 51 )、或CPSGC (SEQ ID NO: 52 )。
在一些實施例中，L包含約14至約19個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約14個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約15個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約16個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約17個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約18個胺基酸。
在一些實施例中，L包含約19個胺基酸。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 25 )；其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、leu、Lys、Phe、Thr、Trp、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 26 )；其中X係Gly、Ser或Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Thr、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 27 )；其中X係Gly或Pro，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露之spFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中，本揭露之spFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種異源性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露之scFv係與第二蛋白質、多核苷酸、治療劑、細胞毒性劑、或可偵測標記偶聯。
在一些實施例中，第二蛋白質係半衰期延長部份。
在一些實施例中，第二蛋白質係抗體或其片段。
在一些實施例中，第二蛋白質係抗原結合片段。
在一些實施例中，第二蛋白質係治療分子。包含本揭露之spFv 及半衰期延長部份的異源性分子
在一些實施例中，本揭露之spFv係與半衰期延長部份偶聯。
例示性半衰期延長部份係免疫球蛋白(Ig)、Ig之片段、Ig恆定區、Ig恆定區之片段、Fc區、轉鐵蛋白、白蛋白、白蛋白變體、白蛋白結合域、或聚乙二醇。人類Ig之胺基酸序列係廣為周知，且包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、及IgE。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與Ig或Ig之片段偶聯。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與Fc區偶聯。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與轉鐵蛋白偶聯。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與白蛋白偶聯。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與白蛋白結合蛋白偶聯。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與聚乙二醇(PEG)偶聯。例示性PEG分子係PEG5000或PEG20,000。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與脂肪酸或脂肪酸酯偶聯。例示性脂肪酸及脂肪酸酯係用於所欲性質之月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、山榆酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸、及類似物、聚離胺酸、辛烷、碳水化合物（右旋糖苷、纖維素、寡醣、或多醣）。
半衰期延長部份可以直接與本揭露之spFv融合，且可藉由標準選殖及表現技術產製。或者，可使用習知的化學偶合方法，將該等部分連接至本揭露之重組產生的spFv。包含本揭露之spFv 及細胞毒性劑或可偵測標記的異源性分子
本揭露亦提供一種包含本揭露之spFv的異源性分子，其中本揭露之spFv係與第二蛋白質、多核苷酸、治療劑、細胞毒性劑、或可偵測標記偶聯。
包含本揭露之spFv的異源性分子可於體外(in vitro )或體內(in vivo )用於引導治療劑、介導殺滅、視覺化、識別或純化表現spFv所結合之抗原的細胞。
在一些實施例中，可偵測標記亦為細胞毒性劑。
可偵測標記包括在偶聯至本揭露之spFv時使得後者可經由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、或化學手段來偵測的組成物。
例示性可偵測標記包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠態粒子、螢光染料、電子緻密試劑、酶（例如，如通常用於ELISA中）、生物素、長葉毛地黃配質(digoxigenin)、半抗原、發光分子、化學發光分子、螢光染劑、螢光團、螢光淬熄劑、有色分子、放射性同位素、閃爍劑(scintillate)、卵白素、鏈黴親和素、蛋白A、蛋白G、抗體或其片段、多組胺酸、Ni2+ 、Flag標籤、myc標籤、重金屬、酶、鹼性磷酸酶、過氧化酶、螢光素酶、電子供體/受體、吖啶酯(acridinium ester)、及比色基質。
可偵測標示可自發地發射信號，諸如在可偵測標示為放射性同位素時。在其他情況下，可偵測標示由於外部場刺激而發射信號。
例示性放射性同位素可為γ發射性、鄂惹發射性(Auger-emitting)、β發射性、α發射性、或正電子發射性放射性同位素。例示性放射性同位素包括3 H、11 C、13 C、15 N、18 F、19 F、55 Co、57 Co、60 Co、61 Cu、62 Cu、64 Cu、67 Cu、68 Ga、72 As、75 Br、86 Y、89 Zr、90 Sr、94m Tc、99m Tc、115 In、123 1、124 1、125 I、131 1、211 At、212 Bi、213 Bi、223 Ra、226 Ra、225 Ac、及227 Ac。
例示性金屬原子係原子序大於20之金屬，諸如鈣、鈧、鈦、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、鎵、鍺、砷、硒、溴、氪、銣、鍶、釔、鋯、鈮、鉬、鎝、釕、銠、鈀、銀、鎘、銦、錫、銻、碲、碘、氙、銫、鋇、鑭、鉿、鉭、鎢、錸、鋨、銥、鉑、金、汞、鉈、鉛、鉍、鍅、鐳、錒、鈰、鐠、釹、鉕、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、鎦、釷、鏷、鈾、錼、鈽、鋂、鋦、鉳、鉲、鑀、鐨、鍆、鍩、或鐒原子。
在一些實施例中，金屬原子可為原子序大於二十之鹼土金屬。
在一些實施例中，金屬原子可為鑭系元素。
在一些實施例中，金屬原子可為錒系元素。
在一些實施例中，金屬原子可為過渡金屬。
在一些實施例中，金屬原子可為貧金屬(poor metal)。
在一些實施例中，金屬原子可為金原子、鉍原子、鉭原子、及釓原子。
在一些實施例中，金屬原子可為原子序為53（即，碘）至83（即，鉍）之金屬。
在一些實施例中，金屬原子可為適用於磁共振成像之原子。
金屬原子可為呈+1、+2、或+3氧化態形式之金屬離子，諸如Ba2+ 、Bi3+ 、Cs+ 、Ca2+ 、Cr2+ 、Cr3+ 、Cr6+ 、Co2+ 、Co3+ 、Cu+ 、Cu2+ 、Cu3+ 、Ga3+ 、Gd3+ 、Au+ 、Au3+ 、Fe2+ 、Fe3+ 、F3+ 、Pb2+ 、Mn2+ 、Mn3+ 、Mn4+ 、Mn7+ 、Hg2+ 、Ni2+ 、Ni3+ 、Ag+ 、Sr2+ 、Sn2+ 、Sn4+ 、及Zn2+ 。金屬原子可包含金屬氧化物，諸如氧化鐵、氧化錳、或氧化釓。
合適染料包括任何市售可得之染料，諸如例如5(6)-羧基螢光素、IRDye 680RD順丁烯二醯亞胺或IRDye 800CW、釕聚吡啶基染料、及類似者。
合適螢光團為螢光異硫氰酸鹽(FITC)、螢光素胺基硫脲(fluorescein thiosemicarbazide)、玫瑰紅(rhodamine)、德克薩斯紅(Texas Red)、CyDye（例如，Cy3、Cy5、Cy5.5）、Alexa Fluor（例如，Alexa488、Alexa555、Alexa594；Alexa647）、近紅外(NIR)（700至900 nm）螢光染料、及羰花青(carbocyanine)及胺基苯乙烯基染料。
包含偶聯至可偵測標記的本揭露之scFv的異源性分子可用於作為顯像劑。
在一些實施例中，細胞毒性劑為化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素（例如細菌、真菌、植物、或動物來源之酶促活性毒素或其片段）、或放射性同位素（即放射偶聯物）。
在一些實施例中，細胞毒性劑為道諾黴素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、胺甲喋呤(methotrexate)、長春地辛(vindesine)、細菌毒素諸如白喉毒素、蓖麻毒素、格爾德黴素(geldanamycin)、類美登素(maytansinoid)、或卡奇黴素(calicheamicin)。細胞毒性劑可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合、或拓撲異構酶抑制之機制來誘發其細胞毒性效應及細胞生長抑制效應。
在一些實施例中，細胞毒性劑為酶促活性毒素，諸如白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )）、蓖麻毒素A鏈、雞母珠毒蛋白A鏈、莫迪素(modeccin) A鏈、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii )蛋白、石竹(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolacca americana )蛋白（PAPI、PAPII、及PAP-S）、苦瓜(momordica charantia )抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis )抑制劑、多花白樹毒蛋白(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、及新月毒素(tricothecene)。
在一些實施例中，細胞毒性劑為放射性核種，諸如212 Bi、131 I、131 In、90 Y、及186 Re。
在一些實施例中，細胞毒性劑為尾海兔素(dolastatin)或尾海兔素肽類似物及衍生物、阿里他汀(auristatin)或單甲基阿里他汀苯丙胺酸。例示性分子係揭示於美國專利第5,635,483號及第5,780,588號中。已顯示尾海兔素及阿里他汀干擾微管動力學、GTP水解、以及核分裂及細胞分裂，且具有抗癌症及抗真菌活性。尾海兔素或阿里他汀藥物部分可透過肽藥物部分之N（胺基）端或C（羧基）端（見例如，WO02/088172），或經由工程改造至蛋白質中之任何半胱胺酸附接至本發明之抗體。
與可偵測標記偶聯可使用已知方法進行。
在一些實施例中，可偵測標示與螯合劑錯合。
在一些實施例中，可偵測標記係經由連接子與本揭露之spFv偶聯。
可使用已知方法將可偵測標記或細胞毒性部份直接或間接地連接至本揭露之spFv。合適連接子為所屬技術領域中已知的，且包括例如輔基、非酚連接子（N-琥珀醯亞胺基苯甲酸酯；十二硼酸酯之衍生物）、大環及非環狀螯合劑兩者之螯合部分，諸如1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)之衍生物、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)之衍生物、S-2-(4-異硫氰基苄基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)之衍生物、及1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)之衍生物、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫烷鹽(IT)、亞胺酯之雙官能衍生物（諸如己二亞胺二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCl)）、活性酯（諸如雙琥珀醯亞胺辛二酸酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮化合物（諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙(對重氮苯甲醯基)乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）、及雙活性氟化合物（諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）、及其他螯合部分。合適肽連接子為熟知的。包含本揭露之spFv 及免疫球蛋白(Ig) 恆定區或其片段的異源性分子
本揭露之spFv可與Ig恆定區或Ig恆定區之片段偶聯以授予類抗體性質，包括Fc效應功能C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或下調細胞表面受體（例如，B細胞受體；BCR）。Ig恆定區或Ig恆定區之片段亦作用為如本文所述之半衰期延長部份。本揭露之spFv亦可使用標準方法工程改造成全長抗體。包含本揭露之spFv的全長抗體可進一步經如本文所述之工程改造。
免疫球蛋白重鏈恆定區係包含子域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3。CH1域橫跨重鏈上的殘基118至215，CH2域橫跨殘基231至340，且CH3域橫跨殘基341至447，殘基編號根據EU索引。在一些情況下，殘基341被稱為CH2域殘基。鉸鏈通常定義為包括人類IgG1的殘基216且終止於230，但亦可包括如本文所述之自約殘基231至約殘基237的下鉸鏈區。Ig Fc區包含至少Ig恆定區的CH2及CH3域，且因此包含至少Ig重鏈恆定區約231至447的區域。
本發明亦提供與免疫球蛋白(Ig)恆定區或Ig恆定區之片段偶聯之本揭露之spFv。
在一些實施例中，Ig恆定區係重鏈恆定區。
在一些實施例中，Ig恆定區係輕鏈恆定區。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含Fc區。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含CH2域。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含CH3域。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含CH2域及CH3域。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含鉸鏈的至少一部分、CH2域、及CH3域。鉸鏈的一部分係指Ig鉸鏈的一或多個胺基酸殘基。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含鉸鏈、CH2域、及CH3域。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與Ig恆定區之N端或Ig恆定區之片段偶聯。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與Ig恆定區之C端或Ig恆定區之片段偶聯。
與Ig恆定區或Ig恆定區之片段偶聯之本揭露之spFv可使用數種已知檢定評估彼等之功能性。與目標抗原的結合可使用本文所述之方法評估。由Ig恆定域或Ig恆定區之片段諸如Fc區所授予之經改變的性質可在使用受體的可溶性形式（諸如FcγRI、FcγRII、FcγRIII、或FcRn）的Fc受體結合檢定中檢定，或使用基於細胞之檢定測量例如ADCC、CDC、或ADCP。
ADCC可使用體外檢定使用表現本揭露之spFv所結合之抗原的細胞作為目標細胞及NK細胞作為效應細胞來評定。細胞裂解可透過從裂解細胞中釋放的標記（如放射性基質、螢光染料、或天然的細胞內蛋白）來檢測。在一例示性檢定中，目標細胞係以1個目標細胞對4個效應細胞之比率使用。將目標細胞用BATDA預標記，並與效應細胞及測試抗體組合。將樣本培養2小時，且藉由測量釋放至上清液中之BATDA來測量細胞裂解。將數據相對於使用0.67% Triton X-100 (Sigma Aldrich)的最大細胞毒性及在沒有任何抗體的情況下由目標細胞自發釋放的BATDA所判定之最小對照值正規化。
ADCP可藉由使用衍生自單核球的巨噬細胞作為效應細胞並使用表現本揭露之spFv所結合之抗原的任何細胞作為目標細胞來評估，該等目標細胞亦經工程改造以表現GFP或其他標記分子。在一例示性檢定中，效應細胞:目標細胞比可為例如4:1。可將效應細胞與目標細胞在存在或不存在本發明之抗體的情況下一起培養4小時。培養後，使用細胞剝離液(accutase)將細胞分離。巨噬細胞可用偶接螢光標記的抗CD11b及抗CD14抗體來鑑定，且吞噬作用百分比可根據在該等CD11+ CD14+ 巨噬細胞中的GFP螢光百分比使用標準方法判定。
細胞的CDC可藉由例如下列步驟來測量：將道迪(Daudi)細胞以1×105 個細胞/孔（50 µl/孔）接種於RPMI-B（補充有1% BSA的RPMI）中、將50 µL的測試蛋白質添加至孔中使最終濃度在0至100 µg/mL之間、使反應在室溫下培養15 min、將11 µL的匯集人類血清添加至孔中、及使反應在37℃下培養45 min。裂解細胞百分比(%)可使用標準方法以FACS檢定中經碘化丙啶染色的細胞%來偵測。包含本揭露之spFv 及嵌合抗原受體(CAR) 或其片段的異源性分子
本揭露之spFv可與嵌合抗原受體(CAR)或CAR之片段偶聯。包含本揭露之spFv的CAR因此可為單特異性或多特異性，其包含本揭露之一或多個scFv分子作為其胞外域。
嵌合抗原受體(CAR)係經基因工程改造受體。這些經工程改造受體可根據所屬技術領域中已知之技術輕易插入免疫細胞並由免疫細胞表現，包括T細胞。利用CAR，單一受體可經設定(programmed)以辨識特異性抗原，且當與抗原結合時，活化免疫細胞以攻擊及摧毀帶有該抗原之細胞。當這些抗原存在於目標細胞上時，表現CAR之免疫細胞可靶向且殺滅目標細胞。
CAR一般包含與抗原結合之胞外域、可選的連接子、跨膜域、及包含共刺激域及/或傳訊域之胞質域。
CAR之胞外域可含有任何與所欲抗原結合之多肽，諸如本揭露之scFv。CAR亦可經工程改造以與二或更多個所欲抗原結合，其可經串聯配置且藉由連接子序列分離。例如，一或多個本揭露之scFv、域抗體、scFv、駱馬VHH抗體或其他僅VH抗體片段可經由連接子串聯組織，以產製雙特異性或多特異性CAR。
CAR之跨膜域可衍生自CD8之跨膜域、T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CDI la、CD18)、ICOS (CD278)、4-1 BB (CD137)、4-1 BBL、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRFI)、CD160、CD1 9、IL2R β、IL2R γ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDI Id、ITGAE、CD103、ITGAL、CDI la、LFA-1、ITGAM、CDI lb、ITGAX、CDI lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD1 8、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、及/或NKG2C。
CAR之細胞內共刺激域可衍生自一或多個共刺激分子之胞內域。共刺激分子係除抗原受體或Fc受體以外之廣為周知之細胞表面分子，其提供T淋巴細胞與抗原結合時有效活化及作動所需的第二信號。可用於CAR之例示性共刺激域係4-1BB、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70之胞內域。
CAR之細胞內傳訊域可衍生自例如CD3ζ、CD3ε、CD22、CD79a、CD66d或CD39之傳訊域。「細胞內傳訊域 (Intracellular signaling domain) 」係指參與轉導有效CAR與目標抗原結合之訊息至免疫效應細胞內部以誘發效應細胞功能的CAR多肽部分，該效應細胞功能例如活化、細胞介素產生、增生及細胞毒性活性，包括釋放細胞毒性因子至CAR結合的目標細胞，或在抗原與細胞外CAR域之後所誘發的其他細胞性反應。
位於胞外域與跨膜域之間的CAR內之可選的連接子可為約2至100個胺基酸長度的多肽。連接子可包括可撓性殘基或由可撓性殘基構成，諸如甘胺酸及絲胺酸，使得相鄰蛋白質域可相對於彼此自由移動。當確保二個相鄰結構域在空間上不互相干擾係為所欲時，可使用較長連接子。連接子可為可切割或不可切割。例示性可切割連接子包括2A。
例示性CAR包含本揭露之scFv、CD8跨膜域、及CD3ζ傳訊域。另一例示性CAR包含本揭露之scFv、CD8或CD28跨膜域、CD28、41BB或OX40共刺激域、及CD3ζ傳訊域。
CAR係藉由標準分子生物學技術產製。
本揭露之spFv可直接與第二分子偶聯或經由連接子偶聯。例示性連接子包括免疫球蛋白鉸鏈區部分、衍生自任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈同型之CL或CH1、富含Gly連接子、含Gly及Ser連接子、含Gly及Ala連接子、含Ala及Ser連接子、及含Pro連接子。可被包括至連接子中之例示性胺基酸係Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、及His。替代地，多種非蛋白質聚合物，包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物可用來作為連接子。例示性連接子係描述於例如國際專利公開號WO2019/060695中。
在一些實施例中，異源性分子係單特異性。
在一些實施例中，異源性分子係多特異性。
在一些實施例中，異源性分子係雙特異性。
在一些實施例中，異源性分子係三特異性。
在一些實施例中，異源性分子係四特異性。包含本揭露之spFv 的多特異性分子
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之VH Cys且該L包含第一L Cys； 該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之VL Cys且該L包含第二L Cys；或 該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之該VH Cys，該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之該VL Cys且該L包含該第一L Cys及該第二L Cys，其中該VH Cys及該第一L Cys能夠形成雙硫鍵且該VL Cys及該第二L Cys能夠形成雙硫鍵。
在一些實施例中，VH Cys與VL Cys之間的距離係約7 Å至約9 Å。
在一些實施例中，VH Cys係在H3、H5、H40、H43、H46或H105，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，VL Cys係在L3、L5、L39、L42、L45、L100或L102，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中， VH Cys係在H105且VL Cys係在L42； VH Cys係在H43且VL Cys係在L100； VH Cys係在H3且VL Cys係在L3； VH Cys係在H3且VL Cys係在L5； VH Cys係在H3且VL Cys係在L39； VH Cys係在H3且VL Cys係在L42； VH Cys係在H3且VL Cys係在L45； VH Cys係在H3且VL Cys係在L100； VH Cys係在H3且VL Cys係在L102； VH Cys係在H5且VL Cys係在L3； VH Cys係在H5且VL Cys係在L5； VH Cys係在H5且VL Cys係在L39； VH Cys係在H5且VL Cys係在L42； VH Cys係在H5且VL Cys係在L45； VH Cys係在H5且VL Cys係在L100； VH Cys係在H5且VL Cys係在L102； VH Cys係在H40且VL Cys係在L3； VH Cys係在H40且VL Cys係在L5； VH Cys係在H40且VL Cys係在L39； VH Cys係在H40且VL Cys係在L42； VH Cys係在H40且VL Cys係在L45； VH Cys係在H40且VL Cys係在L100； VH Cys係在H40且VL Cys係在L102； VH Cys係在H43且VL Cys係在L3； VH Cys係在H43且VL Cys係在L5； VH Cys係在H43且VL Cys係在L39； VH Cys係在H43且VL Cys係在L42； VH Cys係在H43且VL Cys係在L45； VH Cys係在H43且VL Cys係在L102； VH Cys係在H46且VL Cys係在L3； VH Cys係在H46且VL Cys係在L5； VH Cys係在H46且VL Cys係在L39； VH Cys係在H46且VL Cys係在L42； VH Cys係在H46且VL Cys係在L45； VH Cys係在H46且VL Cys係在L100； VH Cys係在H46且VL Cys係在L102； VH Cys係在H105且VL Cys係在L3； VH Cys係在H105且VL Cys係在L5； VH Cys係在H105且VL Cys係在L39； VH Cys係在H105且VL Cys係在L45； VH Cys係在H105且VL Cys係在L100；或 VH Cys係在H105且VL Cys係在L102； 其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，L包含衍生自免疫球蛋白(Ig)鉸鏈區之毗連胺基酸序列。
在一些實施例中，Ig鉸鏈區係衍生自人類或非人類Ig鉸鏈區。
在一些實施例中，Ig鉸鏈區係衍生自人類Ig鉸鏈區。
在一些實施例中，人類Ig鉸鏈區係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 23 )，其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Thr、Trp、或Tyr，且y係1至3之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 24 )，其中X係Gly、Ser、或Pro，且y係1至3之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPC、CGC、CSC、CPPC (SEQ ID NO: 1 )、CGPC (SEQ ID NO: 28 )、CPGC (SEQ ID NO: 29 )、CGGC (SEQ ID NO: 30 )、CSPG (SEQ ID NO: 31 )、CPSC (SEQ ID NO: 32 )、CSSC (SEQ ID NO: 33 )、CGSC (SEQ ID NO: 34 )、CSGC (SEQ ID NO: 35 )、CPPPC (SEQ ID NO: 36 )、CGPPC (SEQ ID NO: 37 )、CPGPC (SEQ ID NO: 38 )、CPPGC (SEQ ID NO: 39 )、CGGPC (SEQ ID NO: 40 )、CPGGC (SEQ ID NO: 41 )、CGGGC (SEQ ID NO: 42 )、CSPPC (SEQ ID NO: 43 )、CPSPC (SEQ ID NO: 44 )、CPPSC (SEQ ID NO: 45 )、CSSPC (SEQ ID NO: 46 )、CPSSC (SEQ ID NO: 47 )、CSSSC (SEQ ID NO: 48 )、CGSPC (SEQ ID NO: 49 )、CPGSC (SEQ ID NO: 50 )、CSGPC (SEQ ID NO: 51 )、或CPSGC (SEQ ID NO: 52 )。
在一些實施例中，L包含約14至約19個胺基酸，諸如約14、約15、約16、約17、約18、或約19個胺基酸。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 25 )；其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、leu、Lys、Phe、Thr、Trp、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 26 )；其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Thr、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 27 )；其中X係Gly或Pro，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露之spFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中，本揭露之spFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
本揭露亦提供一種多特異性分子，其包含scFv，該scFv包含VH、L、及VL，其中 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。
在一些實施例中，該多特異性分子包含抗體或抗體片段。在一些實施例中，多特異性分子包含抗體或抗體片段。
在一些實施例中，多特異性蛋白質包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段。
在一些實施例中，Ig恆定區包含Fc區。
在一些實施例中，Ig恆定區包含CH2域。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含CH3域。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含CH2域及CH3域。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含鉸鏈的至少一部分、CH2域、及CH3域。
在一些實施例中，Ig恆定區之片段包含鉸鏈、CH2域、及CH3域。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與Ig恆定區之N端或與Ig恆定區之片段的N端偶聯。
在一些實施例中，本揭露之spFv係與Ig恆定區之C端或與Ig恆定區之片段的C端偶聯。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG1、IgG2、及IgG3、或IgG4同型。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段包含至少一個突變，該突變導致多特異性分子與FcγR之結合減少。
在一些實施例中，導致多特異性分子與FcγR之結合減少的至少一個突變係選自由下列所組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-刪除/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S及S228P/F234A/L235A/G236-刪除/G237A/P238S，其中殘基編號係根據EU索引。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段包含至少一個突變，該突變導致多特異性分子與FcγR之結合增強。
在一些實施例中，導致多特異性分子與FcγR之結合增強之至少一個突變係選自由下列所組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、及G236A/S239D/I332E，其中殘基編號係根據EU索引。
在一些實施例中，FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、或FcγRIII。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段包含至少一個突變，該突變調節多特異性分子之半衰期。
在一些實施例中，調節多特異性分子之半衰期之至少一個突變係選自由下列所組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及H435R，其中殘基編號係根據EU索引。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段在CH3域中包含至少一個突變。
在一些實施例中，在CH3域中之至少一個突變係選自由下列所組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V、及T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基編號係根據EU索引。
在一些實施例中，多特異性分子係雙特異性。
在一些實施例中，多特異性分子係三特異性。
在一些實施例中，多特異性分子係四特異性。5.2 產製包含本揭露之spFv 的多特異性蛋白質
本揭露之spFv可使用已知重組技術、表現及純化規程經工程改造成任何已知格式的多特異性分子。
本揭露之spFv可經工程改造成CH3域具有一或多個突變之全長多特異性抗體，該一或多個突變促進二個半分子的穩定性。這些多特異性抗體可使用Fab臂交換或藉由共表現各種鏈來體外產製。對於體外Fab臂交換而言，將二個單特異性二價抗體工程改造成在CH3域具有一或多個突變，將該等抗體在足以允許鉸鏈區中的半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復至非還原性(non-reducing)。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol, DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且有至少25 mM之2-MEA存在下或於至少0.5 mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下（例如在7.0之pH下或在7.4之pH下）培養至少90 min。
可使用之CH3突變包括諸如下列之技術：鈕扣(Knob-in-Hole)突變(Genentech)、靜電吸引突變(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed)、鏈交換工程改造之域體(SEEDbody) (EMD Serono)、Duobody®突變(Genmab)、及其他不對稱突變（例如，Zymeworks）。
鈕扣結構突變係揭示於例如WO1996/027011中且包括在CH3區之界面上的突變，其中具有小側鏈之胺基酸（孔）被導入第一CH3區且具有大側鏈之胺基酸（鈕）被導入第二CH3區，導致在第一CH3區與第二CH3區之間的優先交互作用。形成鈕及孔之例示性CH3區突變係T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。
重鏈異二聚體形成可藉由使用藉由取代在第一CH3區上的帶正電殘基及在第二CH3區上的帶負電殘基之靜電交互作用來促進，如US2010/0015133、US2009/0182127、US2010/028637或US2011/0123532中所述。
可用來促進重鏈異二聚化之其他不對稱突變係L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如US2012/0149876或US2013/0195849 (Zymeworks)中所述。
SEEDbody突變涉及用IgA殘基取代選定IgG殘基以促進重鏈異二聚化，如US20070287170中所述。
可使用的其他例示性突變係R409D_K370E/D399K_E357K、S354C_T366W/Y349C_ T366S_L368A_Y407V、Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V、T366K/L351D、L351K/Y349E、L351K/Y349D、L351K/L368E、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、K392D/D399K、K392D/ E356K、K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D、K392D_K409D/D356K_D399K，如WO2007/147901、WO 2011/143545、WO2013/157954、WO2013/096291、及US2018/0118849中所述。
Duobody®突變(Genmab)係揭示於例如US2014/0303356中，且包括突變F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、及Y407LWQ/K409AGRH。
可於其中併入本揭露之spFv之額外雙特異性或多特異性結構包括雙可變域免疫球蛋白(Dual Variable Domain Immunoglobulin, DVD)（國際專利公開號WO2009/134776；DVD為全長抗體，其包含具有結構VH1-連接子-VH2-CH之重鏈及具有結構VL1-連接子-VL2-CL之輕鏈；連接子係可選的）、包括各種二聚化域以連接兩個具有不同特異性之抗體臂的結構（諸如白胺酸拉鍊或膠原蛋白二聚化域，國際專利公開號WO2012/022811、美國專利第5,932,448號；美國專利第6,833,441號）、偶聯在一起之二或更多個域抗體(dAb)、雙鏈抗體、僅重鏈抗體（諸如駱駝(camelid)抗體及經工程改造之駱駝抗體）、雙靶向(DT)-Ig (GSK/Domantis)、二合一抗體(Genentech)、交聯Mab (Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star)及CovX-body (CovX/Pfizer)、類IgG雙特異性(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab (MedImmune/AZ)及BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec)及TvAb (Roche)、ScFv/Fc融合(Academic Institution)、SCORPION（Emergent BioSolutions/Trubion、Zymogenetics/BMS）、雙親和性重靶向技術(Fc-DART) (MacroGenics)及雙(ScFv)2 -Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China)、雙作用或雙-Fab (Genentech)、Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics)、雙價雙特異性(Biotecnol)、及Fab-Fv (UCB-Celltech)。基於ScFv之抗體、基於雙價抗體之抗體及域抗體包括但不限於Bispecific T Cell Engager (BiTE) (Micromet)、Tandem Diabody (Tandab) (Affimed)、Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics)、Single-chain Diabody (Academic)、TCR-like Antibodies (AIT, ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion (Merrimack)及COMBODY (Epigen Biotech)、雙靶向奈米抗體(Ablynx)、僅雙靶向重鏈域抗體(dual targeting heavy chain only domain antibody)。
本揭露之scFv亦可經工程改造為包含三個多肽鏈之多特異性蛋白質。在此類設計中，至少一個抗原結合域係呈本揭露之scFv的形式。例示性設計包括（其中「1」指示第一抗原結合域，「2」指示第二抗原結合域，及「3」指示第三抗原結合域）： 設計1：鏈A）scFv1- CH2-CH3；鏈B）VL2-CL；鏈C）VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計2：鏈A）scFv1-鉸鏈-CH2-CH3；鏈B）VL2-CL；鏈C）VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計3：鏈A）scFv1-CH1-鉸鏈-CH2-CH3；鏈B）VL2-CL；鏈C）VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計4：鏈A）CH2-CH3-scFv1；鏈B）VL2-CL；鏈C）VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計1至4中可併入CH3工程改造，諸如突變L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如US2012/0149876或US2013/0195849 (Zymeworks)中所述。5.3 同型、同種異型、及Fc 工程改造
存在於本揭露之多特異性分子或異源性分子中之Ig恆定區或Ig恆定區之片段（諸如Fc區）可為任何同種異型或同型。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG1同型。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG2同型。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG3同型。
在一些實施例中，Ig恆定區或Ig恆定區之片段係IgG4同型。
Ig恆定區或Ig恆定區之片段可為任何同種異型。預期同種異型對於Ig恆定區之性質沒有影響，諸如結合或Fc介導之效應功能。包含Ig恆定區或其片段之治療性蛋白質的免疫原性與輸注反應(infusion reaction)的風險增加及治療反應的持續時間下降相關聯(Baertet al., (2003)N Engl J Med 348:602-608)。包含Ig恆定區或其片段之治療性蛋白質在宿主中誘導免疫反應的程度可部分地由該Ig恆定區之同種異型決定(Stickleret al., (2011)Genes and Immunity 12:213-221)。Ig恆定區同種異型與抗體恆定區序列中特定位置處的胺基酸序列變異相關。表 3 顯示所選之IgG1、IgG2、及IgG4同種異型。[ 表3]
同種異型 多樣性位置的胺基酸殘基（殘基編號：EU索引）
   IgG2 IgG4 IgG1
   189 282 309 422 214 356 358 431
G2m(n) T M                  
G2m(n-) P V                  
G2m(n)/(n-) T V                  
nG4m(a)       L R            
G1m(17)             K E M A
G1m(17,1)             K D L A
可藉由血流中的內源性循環羧肽酶從Ig恆定區中除去C端離胺酸(CTL) (Caiet al. , (2011)Biotechnol Bioeng 108:404-412)。在製造期間，藉由控制胞外Zn2+ 、EDTA或EDTA - Fe3+ 的濃度可將CTL去除控制在小於最大水平，如在美國專利公開號US2014/0273092中所述。蛋白質中之CTL含量可使用已知方法測量。
在一些實施例中，與Ig恆定區偶聯之本揭露之spFv具有約10%至約90%的C端離胺酸含量。在一些實施例中，C端離胺酸含量為約20%至約80%。在一些實施例中，C端離胺酸含量為約40%至約70%。在一些實施例中，C端離胺酸含量為約55%至約70%。在一些實施例中，C端離胺酸含量為約60%。
可在包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的本揭露之多特異性分子或異源性分子中進行Fc區突變以調節彼等之效應功能（諸如ADCC、ADCP、及/或ADCP）及/或藥物動力學性質。這可藉由將（多個）突變引入Fc中來達成，該（等）突變調節突變Fc與活化性FcγR（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII）、抑制性FcγRIIb、及/或FcRn之結合。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Ig恆定區或Ig恆定區之片段中包含至少一個突變。
在一些實施例中，至少一個突變係在Fc區中。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Fc中包含至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、或十五個突變。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Fc區中包含至少一個突變，該突變調節抗體與FcRn之結合。
可經突變以調節半衰期之Fc位置（例如，與FcRn之結合）包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434、及435。可單獨或組合進行之例示性突變為突變T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A、及H435R。可進行以增加半衰期的例示性單個或組合突變係突變M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、及T307A/E380A/N434A。可進行以減少半衰期的例示性單個或組合突變係突變H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及H435R。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Fc區中包含M252Y/S254T/T256E突變。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Fc區中包含至少一個突變，其減少該蛋白質與活化性Fcγ受體(FcγR)的結合且/或降低Fc效應功能（諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)）。
可經突變以減少本揭露之多特異性分子或異源性分子與活化性FcγR之結合且因而降低效應功能之Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331、及365。可單獨或組合進行之例示性突變為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之突變K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、D265S、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S、及P331S。導致具有減少之ADCC之本揭露之多特異性分子或異源性分子的例示性組合突變為下列突變：IgG1上之L234A/L235A、IgG1上之L234A/L235A/D265S、IgG2上之V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上之F234A/L235A、IgG4上之S228P/F234A/ L235A、所有Ig同型上之N297A、IgG2上之V234A/G237A、IgG1上之K214T/E233P/ L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上之H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上之S267E/L328F、IgG1上之L234F/L235E/D265A、IgG1上之L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上之S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及IgG4上之S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。亦可使用混成的IgG2/4 Fc域，諸如具有來自IgG2的殘基117至260及來自IgG4的殘基261至447的Fc。
導致具有減少之CDC之本揭露之多特異性分子或異源性分子的例示性突變係K322A突變。
可在IgG4中進行熟知的S228P突變以增強IgG4穩定性。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Fc區中包含至少一個突變，其係選自由下列所組成之群組：K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S、及P331S。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Fc區中包含L234A/L235A/D265S突變。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Fc區中包含L234A/L235A突變。
在一些實施例中，本揭露之多特異性分子或異源性分子在Fc區中包含至少一個突變，其增強本揭露之多特異性分子或異源性分子與FcγR的結合且/或增強Fc效應功能（諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及/或吞噬作用(ADCP)）。
可經突變以增加本揭露之多特異性分子或異源性分子與活化性FcγR之結合及/或增強Fc效應功能之Fc位置包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396、或430（根據EU索引之殘基編號）。可單獨或組合進行的例示性突變係G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T、及P396L。導致具有增加的ADCC或ADCP之蛋白質的例示性組合突變係239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、及G236A/S239D/I332E。
可經突變以增強CDC之Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345、及430。可單獨或組合進行的例示性突變係S267E、F1268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F、及E430T。導致具有增加的CDC之本揭露之多特異性分子或異源性分子的例示性組合突變係K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T、及S267E/H268F/S324T。
本文所述之特定突變係當相較於分別為SEQ ID NO: 66、67、及68之IgG1、IgG2、及IgG4野生型胺基酸序列時之突變。SEQ ID NO: 66 ，野生型IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 67 ；野生型IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 68 ；野生型IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
本揭露之多特異性分子或異源性分子與FcγR或FcRn之結合可在經工程改造以表現各受體之細胞上使用流動式細胞測量術來評定。在例示性結合檢定中，將每孔2×105 個細胞接種於96孔盤中，並以BSA染色緩衝劑(BD Biosciences, San Jose, USA)在4℃下阻斷30 min。在4℃下，將細胞與本揭露之測試多特異性分子或測試異源性分子於冰上培養1.5小時。用BSA染色緩衝劑洗滌兩次之後，將細胞用經R-PE標示的抗人類IgG二級抗體(Jackson Immunoresearch Laboratories)在4℃下培養45 min。將細胞以染色緩衝劑洗滌兩次，然後再懸浮於150 µL含有經1:200稀釋之DRAQ7 Live/Dead染料的染色緩衝劑(Cell Signaling Technology, Danvers, USA)中。經染色細胞之PE及DRAQ7信號係藉由Miltenyi MACSQuant流式細胞儀(Miltenyi Biotec, Auburn, USA)分別使用B2及B4通道來偵測。以DRAQ7排除對活細胞進行閘控(gated)，且判定收集之至少10,000個活事件之幾何平均螢光信號。將FlowJo軟體(Tree Star)用於分析。將數據繪製為抗體濃度之對數對平均螢光信號。執行非線性迴歸分析。5.4 醣工程改造(glycoengineering)
與Ig恆定區或Ig恆定區之片段偶聯之本揭露之多特異性分子或異源性分子介導ADCC的能力可藉由工程改造Ig恆定區或Ig恆定區之片段的寡醣組分來增強。人類IgG1或IgG3係在Asn297處經N-醣基化並且大部分聚醣係呈廣為周知之雙觸角(biantennary) G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式。可由未經工程改造之CHO細胞所產生之含Ig恆定區之蛋白質一般具有約至少85%之聚醣岩藻醣(glycan fucose)含量。自附接至Ig恆定區或Ig恆定區之片段之雙觸角複合型寡醣移除核心岩藻糖經由改善FcγRIIIa結合且不改變抗原結合或CDC活性來增強本揭露之多特異性分子或異源性分子之ADCC。此等多特異性分子或異源性分子可使用已報導會導致成功表現相對高量去海藻糖基化(defucosylated)免疫球蛋白（帶有雙觸角複合型之Fc寡醣）的不同方法來達成，諸如控制培養滲透壓(Konnoet al., (2012)Cytotechnology 64:249-265)、應用變異體CHO系Lec13作為宿主細胞系(Shieldset al., (2002)J Biol Chem 277:26733-26740)、應用變異體CHO系EB66作為宿主細胞系(Olivieret al., (2010)MAbs ; 2: 405-415)、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系(Shinkawaet al., (2003) J Biol Chem 278:3466-3473)、引入特異性針對1,6-海藻糖基轉移酶(FUT8 )基因的短小干擾RNA(Moriet al., (2004)Biotechnol Bioeng 88:901-908)、或共表現β-1,4-N -乙醯葡萄糖胺基轉移酶III (β-1,4-N -acetylglucosaminyltransferase III)與高基氏α-甘露糖苷酶II (Golgi α-mannosidase II)或基夫鹼（kifunensine，一種強效α-甘露糖苷酶I抑制劑）(Ferraraet al., (2006)J Biol Chem 281:5032-5036)。
在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的本揭露之多特異性分子或異源性分子具有雙觸角聚醣結構，其海藻糖含量為約介於1%至約15%之間，例如約15%、14%、13%、12%、11% 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%。在一些實施例中，包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的本揭露之多特異性分子或異源性分子具有聚醣結構，其海藻糖含量為約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%、或20%。
「岩藻糖含量 (fucose content) 」係指Asn297處糖鏈內岩藻糖單醣的量。岩藻糖的相對量係含岩藻糖結構相對於所有醣類結構的百分比。這些可藉由多種方法來表徵及定量，例如：1)使用經N-醣苷酶F處理過的樣本（例如，錯合、雜合及低聚及高甘露糖(oligo- and high-mannose)結構）的MALDI-TOF，如在國際專利公開號WO2008/077546中所述；2)酶促釋放Asn297聚醣，隨後衍生化並藉由HPLC (UPLC)以螢光檢測及/或HPLC-MS (UPLC-MS)來檢測/定量；3)天然或還原mAb的完整蛋白質分析，將Asn297聚醣以Endo S或其他會在第一與第二GlcNAc單醣之間切割而留下連接至第一GlcNAc之岩藻糖的酵素處理或不經處理；4)藉由酶消化法(enzymatic digestion)（例如胰蛋白酶或內肽酶Lys-C）將mAb消化成構成分肽(constituent peptide)，且隨後藉由HPLC-MS (UPLC-MS)分離、偵測、及定量；5)藉由以PNGase F在Asn 297處進行特異性酶促去醣化(specific enzymatic deglycosylation)以將mAb寡醣自mAb蛋白分離。因此釋放之寡醣可用螢光團標記，藉由各種互補技術分離及識別，該等技術允許：藉由基質輔助雷射脫附游離(MALDI)質譜術比較實驗質量與理論質量以精細表徵聚醣結構、藉由離子交換HPLC (GlycoSep C)判定唾液酸化(sialylation)程度、藉由正相HPLC (GlycoSep N)根據親水性標準分離及定量寡醣形式、及藉由高效毛細管電泳-雷射誘導螢光(HPCE-LIF)分離及定量寡醣。
「低岩藻糖 (low fucose) 」或「低岩藻糖含量 (low fucose content) 」係指包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的本揭露之多特異性分子或異源性分子的岩藻糖含量為約1%至15%之間。
「正常岩藻糖 (normal fucose) 」或「正常岩藻糖含量 (normal fucose content) 」係指包含Ig恆定區或Ig恆定區之片段的本揭露之多特異性分子或異源性分子的岩藻糖含量為約超過50%，通常約超過80%或超過85%。5.5 抗獨特型抗體
抗獨特型抗體係與本揭露之spFv特異性結合之抗體。
本發明亦提供一種抗獨特型抗體，其與本揭露之spFv特異性結合。
在一些實施例中，抗獨特型抗體與本揭露之spFv中的雙硫鍵結合。
在一些實施例中，抗獨特型抗體與本揭露之spFv中的抗原結合域結合。5.6 多核苷酸、載體、宿主細胞
本揭露亦提供一種經單離的多核苷酸，其編碼本揭露之spFv。
本揭露亦提供一種載體，其包含本揭露之多核苷酸。
在一些實施例中，載體係表現載體。表現載體可為質體載體、病毒載體、用於桿狀病毒表現之載體、用於原核表現之載體、用於真核表現之載體、基於轉位子之載體、或任何其他適用於將本揭露之多核苷酸導入給定細胞或有機體中之載體。編碼本揭露之spFv的多核苷酸可與表現載體中之控制序列可操作地連接以促進spFv的表現。此類調節元件可包括轉錄啟動子、編碼合適mRNA核糖體結合位之序列、及控制轉錄和轉譯之終止的序列。表現載體亦可包括一或多種非轉錄元件，諸如複製起源、其他5’或3’側翼(flanking)非轉錄序列、5’或3’非轉譯序列（諸如必要的核糖體結合位）、剪切供體及受體位點、或選擇標誌。多核苷酸可為cDNA。驅動spFv表現之啟動子可為強、弱、組織特異性、誘導性、或發育特異性啟動子。可使用的例示性啟動子係次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白、人類肌球蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、及其他。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中組成性地發揮作用，並且適合搭配所述實施例使用。此等病毒啟動子包括巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、SV40之早期及晚期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、莫洛尼白血病病毒(Maloney leukemia virus)之長末端重複(LTR)、人類免疫不全病毒(HIV)、艾巴二氏病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、及其他反轉錄病毒、和單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus)之胸苷激酶啟動子。誘導性啟動子諸如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導性啟動子、多西環素誘導性啟動子、含有一或多個干擾素刺激反應元件(ISRE)（諸如蛋白激酶R、2’,5’-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、及ADAR1）之啟動子。本揭露之載體亦可含有一或多個內部核糖體進入位點(IRES)。將IRES序列納入融合載體中可有利於增強一些蛋白質之表現。本揭露之載體可係環狀或線形的。可將其等製備為在原核或真核宿主細胞中含有複製系統功能。複製系統可衍生自例如ColE1、SV40、2 µ質體、λ、牛乳頭狀瘤病毒、及類似者。表現載體可經設計以用於暫時表現、或用於穩定表現、或用於兩者。表現載體可經製造以用於持續性表現(constitutive expression)或誘導性表現(inducible expression)。
可使用的例示性載體係細菌的：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)。真核的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL (Pharmacia)、pEE6.4 (Lonza)及pEE12.4 (Lonza)。額外載體包括pUC系列(Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md.)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, Calif.)、pET系列(Novagen, Madison, Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)、及pEX系列(Clontech, Palo Alto, Calif.)。可使用噬菌體載體，諸如λGT10、λGT11、λEMBL4、及λNM1149、λZapII (Stratagene)。例示性植物表現載體包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3、及pBIN19 (Clontech)。例示性動物表現載體包括pEUK-Cl、pMAM、及pMAMneo (Clontech)。表現載體可係病毒載體，例如反轉錄病毒載體，例如γ反轉錄病毒載體。
本揭露亦提供一種宿主細胞，其包含本揭露之載體。
「宿主細胞(host cell)」係指經引入載體的細胞。應瞭解到，用語宿主細胞不只意欲指特定對象細胞，亦意欲指此細胞之後裔，並且亦意欲指從該特定對象細胞產生之穩定細胞株。由於某些修飾可能會因為突變或環境影響而發生於後代中，使得後裔可能與親本細胞不同，但仍包括於如本文中所使用之用語「宿主細胞」的範疇內。此類宿主細胞可為真核細胞、原核細胞、植物細胞或古菌(archeal)細胞。大腸桿菌(Escherichia coli )、桿菌（諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis )、及其他腸桿菌(enterobacteriaceae)（諸如沙門桿菌(Salmonella)、鋸桿菌(Serratia)））、及各式假單胞菌(Pseudomonas)菌種皆為原核宿主細胞之實例。其他微生物（諸如酵母菌）對於表現亦為有用者。釀母菌屬(Saccharomyces)（例如釀酒酵母菌(S. cerevisiae )）及畢赤酵母菌屬(Pichia)皆為合適酵母菌宿主細胞之實例。例示性真核細胞可以是哺乳動物、昆蟲、鳥類或其它動物來源。哺乳動物真核細胞包括永生化細胞系(immortalized cell line)如融合瘤或骨髓瘤細胞系，諸如SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581)、NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503)、FO (ATCC CRL-1646)及Ag653 (ATCC CRL-1580)鼠類細胞系。例示性人類骨髓瘤細胞系為U266 (ATTC CRL-TIB-196)。其他有用之細胞系包括衍生自中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)細胞者，諸如CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD)、CHO-K1 (ATCC CRL-61)或DG44。
本揭露亦提供一種產生本揭露之spFv之方法，其包含在使該spFv產生之條件下培養本揭露之宿主細胞、及回收由該宿主細胞產生之該spFv。製造scFv及純化其之方法為已知的。一旦（以化學或重組方式）經合成，本揭露之spFv可根據標準程序來純化，包括硫酸銨沉澱、親和管柱、管柱層析、高效液相層析(HPLC)純化、凝膠電泳、及類似者（大致上請參見Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)）。本揭露之scFv可為實質上純，例如至少約80%至85%純、至少約85%至90%純、至少約90%至95%純、或至少約98%至99%純、或更純，例如除對象蛋白質外不含汙染物（諸如細胞碎屑、巨分子等）。
可使用標準分子生物方法將編碼本揭露之scFv的多核苷酸併入到載體中。宿主細胞轉形、培養、抗體表現及純化皆使用廣為人知的方法來進行。5.7 醫藥組成物及投予
本揭露亦提供一種醫藥組成物，其包含：本揭露之spFv、包含spFv之異源性分子、或包含spFv之多特異性分子、及醫藥上可接受之載劑。關於治療性用途，本揭露之spFv、包含spFv之異源性分子、或包含spFv之多特異性分子可經製備為於醫藥上可接受之載劑中含有有效量的spFv、包含spFv之異源性分子、或包含本揭露之spFv之多特異性分子作為活性成分的醫藥組成物。「載劑 (carrier) 」係指與本揭露之spFv、包含spFv之異源性分子、或包含spFv之多特異性分子一起投予之稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。此等媒劑可為液體如水及油，包括來自石油、動物、蔬菜或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似者。舉例而言，可使用0.4%鹽水及0.3%甘胺酸。這些溶液係無菌且通常不含顆粒物質。彼等可藉由習用、習知的滅菌技術（如過濾）來滅菌。該等組成物可含有如用以接近生理條件所需之醫藥上可接受的輔助物質，諸如pH調整及緩衝劑、穩定、增稠、潤滑、及著色劑等。在此類醫藥配方中本揭露之spFv、包含spFv之異源性分子、或包含spFv之多特異性分子之濃度可能會有所不同，從以重量計小於約0.5%、常達以重量計至少約1%至多達15或20%，且可主要基於所需劑量、流體體積、黏度等，根據所選擇之投予模式來選擇。合適的媒劑及配方（包含其他的人類蛋白質，例如人類血清白蛋白）例如係描述於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092中，請特別參見pp. 958-989。
本揭露之spFv、包含spFv之異源性分子、或包含spFv之多特異性分子的投予模式可係任何合適之途徑，諸如腸胃外(parenteral)投予，例如皮內、肌內、腹膜內(intraperitoneal)、靜脈內或皮下、經黏膜（口腔、鼻內、陰道內、直腸）、或所屬技術領域中具有通常知識者所理解以及在所屬技術領域中已知之其他手段。5.8 用於製備本揭露之spFv 的過程
本揭露亦提供一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合部位的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)； 提供包含或經工程改造以包含第一L Cys之連接子(L)； 工程改造該VH以在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置包含VH Cys；及 形成在該VH Cys與該第一L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
本揭露亦提供一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合部位的VH及VL； 提供包含或經工程改造以包含第二L Cys之L； 工程改造該VL以在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置包含VL Cys；及 形成在該VL Cys與該第二L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
本揭露亦提供一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合部位的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)； 提供包含或經工程改造以包含第一L Cys及第二L Cys之連接子(L)； 工程改造該VH以在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置包含VH Cys； 工程改造該VL以在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置包含VL Cys；及 形成在該VH Cys與該第一L Cys之間的雙硫鍵及在該VL Cys與該第二L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
雙硫鍵一般在scFv的表現期間形成。
形成抗原結合域的scFv之任何已知VH/VL對可經工程改造成本揭露之穩定化scFv。替代地，可使用已知方法重新(de novo )識別受到關注之抗原結合VH/VL對，且所得VH/VL對可經工程改造成spFv格式。
例如，可使用Kohler及Milstein之融合瘤方法來識別與受到關注之抗原結合的VH/VL對，且所得VH/VL對可經工程改造成spFv。替代地，在其基因體中攜帶人類免疫球蛋白(Ig)基因位點的基因轉殖動物（諸如小鼠、大鼠、或雞）可用於產生抗原結合片段，且係描述於例如下列文獻中：美國專利第6,150,584號、國際專利公開號WO1999/45962、國際專利公開號WO2002/066630、WO2002/43478、WO2002/043478、及WO1990/04036。可將此等動物中之內源性免疫球蛋白基因位點破壞或刪除，且可使用同源或非同源重組、使用轉染色體(transchromosome)、或使用袖珍基因(minigene)將至少一個完整或部分人類免疫球蛋白基因位點插入該動物基因體中。可聘用諸如Regeneron (http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net)、KyMab (http://_www_kymab_com)、Trianni (http://_www_trianni_com)及Ablexis (http://_www_ablexis_com)等公司來使用如上所述之技術提供針對所選抗原的人類抗體。亦可使用噬菌體展示來產製可經工程改造成spFv之抗原結合片段。
在一些實施例中，本揭露之spFv係人化(humanized)的。在一些實施例中，本揭露之spFv係人類的。在一些實施例中，本揭露之spFv係非人類的。
在一些實施例中，在穩定化scFv中VH Cys與VL Cys之間的距離係約7 Å至約9 Å。
在一些實施例中，VH Cys係在H3、H5、H40、H43、H46或H105，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，VL Cys係在L3、L5、L39、L42、L45、L100或L102，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中， VH Cys係在H105且VL Cys係在L42； VH Cys係在H43且VL Cys係在L100； VH Cys係在H3且VL Cys係在L3； VH Cys係在H3且VL Cys係在L5； VH Cys係在H3且VL Cys係在L39； VH Cys係在H3且VL Cys係在L42； VH Cys係在H3且VL Cys係在L45； VH Cys係在H3且VL Cys係在L100； VH Cys係在H3且VL Cys係在L102； VH Cys係在H5且VL Cys係在L3； VH Cys係在H5且VL Cys係在L5； VH Cys係在H5且VL Cys係在L39； VH Cys係在H5且VL Cys係在L42； VH Cys係在H5且VL Cys係在L45； VH Cys係在H5且VL Cys係在L100； VH Cys係在H5且VL Cys係在L102； VH Cys係在H40且VL Cys係在L3； VH Cys係在H40且VL Cys係在L5； VH Cys係在H40且VL Cys係在L39； VH Cys係在H40且VL Cys係在L42； VH Cys係在H40且VL Cys係在L45； VH Cys係在H40且VL Cys係在L100； VH Cys係在H40且VL Cys係在L102； VH Cys係在H43且VL Cys係在L3； VH Cys係在H43且VL Cys係在L5； VH Cys係在H43且VL Cys係在L39； VH Cys係在H43且VL Cys係在L42； VH Cys係在H43且VL Cys係在L45； VH Cys係在H43且VL Cys係在L102； VH Cys係在H46且VL Cys係在L3； VH Cys係在H46且VL Cys係在L5； VH Cys係在H46且VL Cys係在L39； VH Cys係在H46且VL Cys係在L42； VH Cys係在H46且VL Cys係在L45； VH Cys係在H46且VL Cys係在L100； VH Cys係在H46且VL Cys係在L102； VH Cys係在H105且VL Cys係在L3； VH Cys係在H105且VL Cys係在L5； VH Cys係在H105且VL Cys係在L39； VH Cys係在H105且VL Cys係在L45； VH Cys係在H105且VL Cys係在L100；或 VH Cys係在H105且VL Cys係在L102，其中殘基編號係根據Chothia。
在一些實施例中，L包含衍生自免疫球蛋白(Ig)鉸鏈區之毗連胺基酸序列。
在一些實施例中，Ig鉸鏈區係衍生自人類或非人類Ig鉸鏈區。
在一些實施例中，Ig鉸鏈區係衍生自人類Ig鉸鏈區。
在一些實施例中，人類Ig鉸鏈區係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 23 )，其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Thr、Trp、或Tyr，且y係1至3之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 24 )，其中X係Gly、Ser、或Pro，且y係1至3之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列CPC、CGC、CSC、CPPC (SEQ ID NO: 1 )、CGPC (SEQ ID NO: 28 )、CPGC (SEQ ID NO: 29 )、CGGC (SEQ ID NO: 30 )、CSPG (SEQ ID NO: 31 )、CPSC (SEQ ID NO: 32 )、CSSC (SEQ ID NO: 33 )、CGSC (SEQ ID NO: 34 )、CSGC (SEQ ID NO: 35 )、CPPPC (SEQ ID NO: 36 )、CGPPC (SEQ ID NO: 37 )、CPGPC (SEQ ID NO: 38 )、CPPGC (SEQ ID NO: 39 )、CGGPC (SEQ ID NO: 40 )、CPGGC (SEQ ID NO: 41 )、CGGGC (SEQ ID NO: 42 )、CSPPC (SEQ ID NO: 43 )、CPSPC (SEQ ID NO: 44 )、CPPSC (SEQ ID NO: 45 )、CSSPC (SEQ ID NO: 46 )、CPSSC (SEQ ID NO: 47 )、CSSSC (SEQ ID NO: 48 )、CGSPC (SEQ ID NO: 49 )、CPGSC (SEQ ID NO: 50 )、CSGPC (SEQ ID NO: 51 )、或CPSGC (SEQ ID NO: 52 )。
在一些實施例中，L包含約14至約19個胺基酸，諸如約14、約15、約16、約17、約18、或約19個胺基酸。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 25 )；其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、leu、Lys、Phe、Thr、Trp、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 26 )；其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Thr、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO: 27 )；其中X係Gly或Pro，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露之穩定化spFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中，本揭露之穩定化spFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H105之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H5之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L42之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L45之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H3之Cys； 該VL包含在L39之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VL-L-VH定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H43之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H40之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L100之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L102之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L5之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中， 該VH包含在H46之Cys； 該VL包含在L3之Cys； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 該scFv係呈VH-L-VL定向。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。
在一些實施例中，L包含SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。
在一些實施例中，當相較於不具有雙硫鍵之親代scFv時，本揭露之穩定化scFv以可相比之親和性與抗原結合。
本揭露亦提供一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含 提供編碼VH、L、及VL之多核苷酸，其中 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L42之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L100之Cys； 該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L102之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L3之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L5之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L39之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L45之Cys； 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L100之Cys；或 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L102之Cys，其中殘基編號係根據Chothia； 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 在宿主細胞中表現該多核苷酸以產生該穩定化scFv。
在一些實施例中，宿主細胞係原核細胞。
在一些實施例中，宿主細胞係真核細胞。
下列實例係經提供以進一步描述本文中所揭露之一些實施例。該等實例意欲說明而非限制所揭露之實施例。6. 實例 6.1 實例1 ：穩定化scFv 之設計
單株抗體(mAb)透過兩個可變域VL及VH辨識其目標抗原。單鏈Fv (scFv)最早係由Birdet al. (1988)Science 242:423-426 (1988)設計為VL及VH加上可撓性連接子而呈現VL-連接子-VH或VH-連接子-VL定向的基因融合。可撓性連接子一般係三或四個重複的甘胺酸-絲胺酸連接子，諸如(GGGGS)n；n=1至4（SEQ ID NO: 2 、SEQ ID NO: 53 、SEQ ID NO: 54 、SEQ ID NO: 55 ）。ScFv重現其親代mAb的抗原結合特異性及大部分的親和性。已發現這些scFv分子具有廣泛應用，如作為偵測/診斷試劑或作為製造更精密分子諸如雙-、多特異性治療劑(Brinkmann and Kontermann (2017)MAbs 9: 182-212)或CAR-T治療劑（Grosset al., (1989),Transplant Proc 21(1 Pt 1): 127-130；Porteret al., (2011)J Cancer 2: 331-332；Porteret al. , (2011)N Engl J Med 365: 725-733）的建構塊。
ScFv分子的挑戰之一係低穩定性及聚集傾向（回顧於Worn and Pluckthun (2001)J Mol Biol 305: 989-1010；Rothlisbergeret al. , (2005)J Mol Biol 347: 773-789）。已有一些企圖改善彼等之性質的策略（Arndet al., (2001)J Mol Biol 312: 221-228；Monsellieret al., (2006)J Mol Biol 362: 580-593；Zhaoet al., (2010)Int J Mol Sci 12: 1-11；Perchiacca and Tessier (2012)Annu Rev Chem Biomol Eng 3: 263-286；Asialet al., (2013)Nat Commmun 4: 2901；Gil and Schrum (2013)Adv Biosci Biteccchnol 4: 73-84；Tiller and Tessier (2015)Annu rev Biomed Eng 17: 191-216）。這些策略包括導入在VL/VH域之間的雙硫鍵、改善VL/VH域穩定性及/或界面交互作用、使用不同實驗方法、使用額外二聚化模體及其他。關鍵的難題是，大部分這些策略通常是針對特定VH/VL對，且無法輕易轉移至其他VH/VL對。有時，工程改造可負面影響VL/VH結構及scFv性質。近來，Zhanget al. 在抗黃麴毒素B1 scFv (H4)的VH之位置44與VL之位置100之間導入雙硫鍵且成功達成scFv的顯著穩定同時保存其結合親和性(Zhaoet al., (2010)Int J Mol Sci 12: 1-11)。然而，因為所選之二個位置之間的距離及角度限制，VL/VH間之雙硫鍵如果應用至其他VL/VH對，可能限制/扭曲二個結構域之間的相對定向，其通常係結合所需。
Fab片段之重鏈與輕鏈之間的界面包含VH/VL及CH1/CL交互作用。兩組獨立的交互作用提供協同的穩定效果。此外，V/C接面亦促成一些穩定效果。相較之下，在scFv中，VH/VL界面僅由VH/VL交互作用維持。連接子經設計為可撓性及非限制性（除非在其長度經設計成短以促進scFv間交互作用以形成二聚體及寡聚物的情況下），僅將兩者鬆散地偶接在一起。已知連接子的長度（當夠長時）及本質對scFv穩定性的影響極小。6.1.1 「釘合」設計
本實例的目的是藉由限制但不負面影響形成scFv之VH與VL之間的相對移動來設計及產製穩定化scFv。此係藉由工程改造VH與連接子之間及VL與連接子之間的雙硫鍵來穩定scFv而完成。當限制（即，雙硫鍵）經適當定位時，將接著扮演如上討論之CH1/CL及V/C交互作用所提供之協同效應的角色。為達此目的，識別二個結構保守之表面暴露架構位置（錨點），在VH及VL上各有一個，其與一般預測之抗原結合部位不重疊，且突變成半胱胺酸(Cys)殘基。後續在可撓性連接子中選擇兩個位置以用於Cys位置。當連接子Cys殘基之間的距離及位置係以促進連接子Cys與各錨點之間形成雙硫鍵之方式設計時，VH及VL將會以相較於在雙硫鍵不存在下繫鏈時更緊密地繫鏈在一起。此方案描繪於圖 1 中，其中例示性連接子含有CPPC序列(SEQ ID NO:1 )。在可撓性連接子與錨點之間形成雙硫鍵的概念在本文中稱為「釘合(stapling)」。所得之「經釘合(stapled)」scFv分子在本文中稱為spFv（「經釘合Fv (stapled Fv)」）。6.1.2 錨點選擇、釘合序列及連接子的設計
為了使釘合方案可廣泛應用，重要的是錨點係結構保守、暴露在VL及VH兩者之表面上，且其突變成Cys殘基將不會影響VL及VH的折疊或與抗原的結合。VL及VH域的錨點及N及C端的距離及幾何對於適當雙硫形成亦為重要考量。
SpFv的VL-連接子-VH及VH-連接子-VL定向之錨點係分開選擇。對於VL-連接子-VH定向，選擇VL之Chothia位置42及VH之Chothia位置105作為錨點。在人類種系抗體（pdb ID 5I19，以下稱為GLk1）之Fv內，spFv的VL-連接子-VH定向所選定之錨點的圖解說明顯示於圖 2 。在GLk1中，VL之Chothia位置42係離胺酸(K)且VH之Chothia位置105係麩醯胺酸(Q)。對於VH-連接子-VL定向，選擇VL之Chothia位置100及VH之Chothia位置43作為錨點。圖 3 顯示在人類種系抗體（pdb ID 5I19，GLk1）之Fv內，spFv的VH-連接子-VL定向所選定之錨點的圖解說明。在GLk1中，VL之Chothia位置100係麩醯胺酸(Q)且VH之Chothia位置43係離胺酸(K)。所選錨點係結構保守，且幾何非常類似於含有κ或λ輕鏈之抗體。錨點對之間的距離範圍從大約7 Å（對於VL-連接子-VH定向）至大約9 Å（對於VH-連接子-VL定向）。
包埋在連接VH及VL之連接子內的釘合序列係經設計以具有類似長度及spFv之錨點之間的距離。作為釘合序列之初始實例，選擇CPPC (SEQ ID NO: 1 )作為可能的釘合序列，部分是因為此序列天然存在於人類IgG1鉸鏈以及一些囓齒動物IgG中。人類及小鼠IgG分子之鉸鏈結構顯示，小鼠IgG鉸鏈（圖 4 ）及人類IgG（圖 5 ）之Cβ(cys1)-Cβ(cys2)距離範圍從約7 Å至9 Å。由於此範圍非常類似於VL-連接子-VH及VH-連接子-VL兩種定向之二個錨點之間的距離，因此CPPC (SEQ ID NO: 1 )釘合序列有潛力可提供用於釘合之正確幾何（即，有效且正確地形成錨點之間適當的雙硫鍵）。一般而言，釘合序列經設計以具有二個Cys殘基。為了適當釘合，釘合序列之N端Cys與spFv N端域錨點形成雙硫鍵，且釘合序列之C端Cys與spFv C端域錨點形成雙硫鍵。
連接VH及VL之連接子因而被設計成包含釘合序列且連接序列的N端及C端兩者至釘合序列，以延長連接子以提供足夠的連接子長度，允許VH及VL的鏈內折疊並且有助於釘合序列的適當定位。
在VL-連接子-VH設計中，VL錨點(K42)、VH錨點(Q105)、VL之C端(K107)與VH之N端(Q1)之間的距離係顯示於圖 2 。在VH-連接子-VL設計中，VL錨點(Q100)、VH錨點(K43)、VH之C端(S114)與VL之N端(D1)之間的距離係顯示於圖 3 。模型化暗示，這些距離可由約14至19個殘基之連接子長度涵蓋，其中4個殘基之釘合序列的旁側連接約6至9個殘基的N端連接子延長及約4至6個殘基的C端連接子延長。因此，所設計之連接子長度可表示為n+4+m，其中n=6至9個殘基及m=4至6個殘基，且4表示CPPC (SEQ ID NO: 1 )釘合序列之長度。該n及m個殘基可為甘胺酸或絲胺酸或其他胺基酸殘基。這些連接子長度被預期為具有足夠的長度及可撓性而允許釘合，但太短而不允許錯接(scrambling)。6.2 實例2 ：spFv 的產製及表徵
為了評估釘合設計，選擇三個人類抗體產製scFv及對應之spFv：具有κ輕鏈的二個抗體（GLk1及GLk2）來自合成的噬菌體抗體庫(Shiet al. , (2010)J Mol Biol 397:385-396)及一個含有λ之抗體(CAT2200)獲自公開案(Gerhardtet al. (2009)J Mol Biol 394:905-921)。對於CAT2200，將T28G突變導入親代VH產製變體(CAT2200a)以減少其與其目標IL-17之一些交互作用。此外，將S42Q突變(Chothia)工程改造至親代CAT2200 VL中並且與T28G VH配對以產製CAT2200b。GLk1、GLk2、CAT2200a、及CAT2200b之VL及VH域的胺基酸序列分別顯示於圖 6 及圖 7 。BAT2200a與CAT2200b之間的VH域胺基酸序列係相同。GLk1VH最接近人類IGHV2-23*01，GLk2VH最接近人類IGHV5-51，CAT2200VH最接近人類IGHV2-23*01。GLk1VL最接近人類IGKV1-39*01，GLk2VL最接近人類IGKV3-20*01，且CAT2200VL最接近人類IGLV6-57*01。
所有scFv及spFv分子皆經產製及表現為VL-連接子-VH及VH-連接子-VL兩種定向。對於scFv建構體，使用標準(GGGGS)4 (SEQ ID NO: 2 )連接子。對於spFv，使用在以上n 及m 範圍內不同連接子長度。對於GLk1 spFv，兩種定向皆使用9-4-5連接子。對於GLk2 spFv，VL-VH及VH-VL定向分別使用9-4-5及6-4-6連接子長度。對於CAT2200a spFv，VL-VH分子分別以8-4-4及9-4-4連接子製成，且CAT2200b spFv VH-VL係以9-4-4連接子製成。表 4 顯示所產製分子及其連接子序列。表 5 顯示胺基酸序列或所產製分子。[ 表4]
分子名稱(SEQ ID NO:) 連接子類型 連接子胺基酸序列 連接子SEQ ID NO:
     
GLk1 scFv VL-VH (8) 4x G4S GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 2
GLk1 spFv VL-VH (9) 9+4+5 GGGSGGSGGCPPCGGSGG 3
GLk1 scFv VH-VL (10) 4x G4S AGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 2
GLk1 spFv VH-VL (11) 9+4+5 GGGSGGSGGCPPCGGSGG 3
     
GLk2 scFv VL-VH (12) 4x G4S GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 2
GLk2 spFv VL-VH (13) 9+4+5 GGGSGGSGGCPPCGGSGG 3
GLk2 scFv VH-VL (14) 4x G4S GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 2
GLk2 spFv VH-VL (15) 6+4+6 GGGSGGCPPCGGGSGG 4
     
CAT2200a scFv VL-VH (16) 4x G4S GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 2
CAT2200a spFv VL-VH (17) 8+4+4 GGSGGSGGCPPCGSGG 5
CAT2200b scFv VL-VH (18) 4x G4S GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 2
CAT2200a spFv VL-VH (19) 9+4+4 GGGSGGSGGCPPCGSGG 6
CAT2200a scFv VH-VL (20) 4x G4S GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 2
           
CAT2200b spFv VH-VL (21) 9+4+4v2 GGGSGGGSGCPPCGGGG 7
[ 表5]
分子名稱 蛋白質序列 SEQ ID NO:
  
GLk1 scFv VL-VH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYDGIYGELDFWGQGTLVTVSSGHHHHHH 8
GLk1 spFv VL-VH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGCAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKRGGGSGGSGGCPPCGGSGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYDGIYGELDFWGCGTLVTVSSGHHHHHH 9
GLk1 scFv VH-VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYDGIYGELDFWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKRGHHHHHH 10
GLk1 spFv VH-VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGCGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYDGIYGELDFWGQGTLVTVSSGGGSGGSGGCPPCGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIKRGHHHHHH 11
  
GLk2 scFv VL-VH EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVSSGHHHHHH 12
GLk2 spFv VL-VH EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGCAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKGGGSGGSGGCPPCGGSGGEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGCGTLVTVSSGHHHHHH 13
GLk2 scFv VH-VL EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKGHHHHHH 14
GLk2 spFv VH-VL EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGCGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVSSGGGSGGCPPCGGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGCGTKVEIKGHHHHHH 15
  
CAT2200a scFv VL-VH NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSLANYYVQWYQQRPGSSPTIVIFANNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQTYDPYSVVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFGFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLIHGVTRNWGQGTLVTVSSGHHHHHH 16
CAT2200a spFv VL-VH NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSLANYYVQWYQQRPGCSPTIVIFANNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQTYDPYSVVFGGGTKLTVLGGSGGSGGCPPCGSGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFGFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLIHGVTRNWGCGTLVTVSSGHHHHHH 17
CAT2200b scFv VL-VH NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSLANYYVQWYQQRPGQSPTIVIFANNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQTYDPYSVVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFGFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLIHGVTRNWGQGTLVTVSSGHHHHHH 18
CAT2200a spFv VL-VH NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSLANYYVQWYQQRPGCSPTIVIFANNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQTYDPYSVVFGGGTKLTVLGGGSGGSGGCPPCGSGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFGFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLIHGVTRNWGCGTLVTVSSGHHHHHH 19
CAT2200a scFv VH-VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFGFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLIHGVTRNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSLANYYVQWYQQRPGSSPTIVIFANNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQTYDPYSVVFGGGTKLTVLGHHHHHH 20
CAT2200b spFv VH-VL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFGFSSYAMSWVRQAPGCGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLIHGVTRNWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSLANYYVQWYQQRPGQSPTIVIFANNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQTYDPYSVVFGCGTKLTVLGHHHHHH 21
將除了CAT2200a scFv VL-VH以外的所有scFv及spFv分子選殖至CMV啟動子驅使哺乳動物表現載體中。使用製造商規程將這些建構體轉染至Expi293細胞中，並且將細胞培養5天。各蛋白質係經由AKTAXPRESS系統(GE Healthcare)在1 ml His-TRAP HP管柱(GE Healthcare)上自澄清上清液純化。管柱係經0至100%洗提緩衝液之梯度製備（洗滌緩衝液：50 mM Tris，pH 7.5，500 mM NaCl，20 mM咪唑；洗提緩衝劑：50 mM Tris，pH 7.5，500 mM NaCl，500 mM咪唑）以移除鬆散結合之鎳，接著在DPBS中再平衡。首先將澄清上清液調整成50 mM Tris，pH 7.5及20 mM咪唑，接著裝載至1 mL HisTRAP HP管柱4℃0.8 mL/min。接著將管柱用PBS洗滌直到獲得穩定基線。接著將管柱用20 CV的洗滌緩衝液進一步洗滌，用洗提緩衝液洗提至單一注射迴路，並在1X DPBS中通過26/10 HiPrep去鹽管柱去鹽並收集流份。接著將含有經純化蛋白質之流份彙集並濃縮。將Glk2 scFv及spFv蛋白質透析至DPBS中進行熱穩定性測量（DSC及NanoDSF）及25 mM Tris，pH 7.5及100 mM NaCl中進行其他研究。其他scFv及spFv蛋白質係於25 mM MES，pH 6.0及100 mM NaCl中透析。
CAT2200a scFv VL-VH係購自供應商。在DPBS中濃度為0.77 mg/mL，pH 7.2。IL-17之突變體（12-132具有K70Q A132Q C106S突變，為了簡單起見以下稱為IL-17）(SEQ ID NO: 22 )係購自Accelagen (CA)。遵照他們的專有再摺疊規程將蛋白質自大腸桿菌(E. Coli )包涵體再摺疊並以1.50 mg/mL提供於20 mM NaCl，20 mM MES，pH 6.0中。SEQ ID NO: 22 （IL-17A 突變體） MNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAQCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHSPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVQ6.2.1 所產製scFv 及spFv 分子之熱穩定性
藉由微差掃描熱量法(DSC)探討scFv及spFv分子之熱穩定性。將scFv及spFv蛋白質透析隔夜，GLk1及CAT2200a/CAT2200b以1x DPBS (Gibco)進行或GLk2以MES (25 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl)進行。透析緩衝劑接著經0.22微米過濾且用來作為DSC實驗中的參考溶液及緩衝劑-緩衝劑空白。將蛋白質於經過濾之緩衝劑中稀釋至約0.5 mg/mL，並將400 µL之各蛋白質或緩衝劑樣本裝載至96深孔盤(MicroLiter Analytical Supplies, 07-2100)，且在實驗的時間內保持在4℃下自動取樣器抽屜中。使用具有自動取樣器之MicroCal Capillary DSC (Malvern)執行DSC實驗。DSC掃描係在60℃/h掃描速率下從25至95℃執行，且無樣本再掃描。不選擇回饋且過濾時間設定為15 s。在每次取樣後，以10% Contrad-70溶液清潔孔格並運行緩衝劑-緩衝劑空白。使用Origin 7.0搭配MicroCal VP-Capillary DSC自動化分析附加元件(Malvern)執行數據分析。手動選擇基線範圍及類型，接著減去。將先前緩衝劑空白自樣本曲線減去，隨後進行濃度依賴性正規化。使用2狀態及非2狀態轉變兩者分析熱熔輪廓。2狀態擬合（一個轉變）與實驗曲線的一致性不佳。因此，二個轉變（Tm1及Tm2）係藉由手動執行非2狀態擬合計算。Tm數據係記述於表 6 。所有scFv及spFv蛋白質之DSC輪廓展現僅可擬合非2狀態轉變之偏斜。因此，對於各scFv或spFv記述兩個轉變（Tm1及Tm2）（表 6 ）。最可能的是，這兩個轉變分別對應於VL及VH域的熔融Tm。一般而言，在比較時，scFv與spFv之Tm1或Tm2之間的差異因為釘合有大約10℃的增加，無論起始scFv的Tm為何。只有一個例外，亦即GLk2 scFv與spFv（VH-VL定向）之間大約7℃的差異。此可能是因為較短的6+4+6連接子所致，其在釘合幾何中可能造成稍微應變。事實上ΔTm1 (VL)及ΔTm2 (VH)幾乎相同，暗示除了強化VL/VH交互作用之外，釘合導致結構域本身的穩定。替代地，較強的VH/VL交互作用傳輸穩定效應至VL/VH域的穩定。總結來說，如本實例中所述之釘合顯著增加scFv的穩定性。[ 表6]
分子名稱(SEQ ID NO:) 連接子類型 DSC穩定性
Tm1 (℃) SD(Tm1) (℃) Tm2 (℃) SD(Tm2) (℃) ΔTm1 (℃) ΔTm2 (℃) Δ (Tm1-Tm2)
GLk1 scFv VL-VH (8) 4x G4S 68.9 0.2 72.1 0.0 9.7 9.0 3.3
GLk1 spFv VL-VH (9) 9+4+5 78.5 0.2 81.1 0.0 2.6
GLk1 scFv VH-VL (10) 4x G4S 67.7 0.3 70.9 0.0 10.0 9.2 3.3
GLk1 spFv VH-VL (11) 9+4+5 77.7 0.2 80.1 0.1 2.4
GLk2 scFv VL-VH (12) 4x G4S 56.6 0.2 58.6 0.1 10.9 10.5 2.0
GLk2 spFv VL-VH (13) 9+4+5 67.6 0.3 69.2 0.1 1.6
GLk2 scFv VH-VL (14) 4x G4S 56.4 0.1 58.3 0.1 7.3 7.1 1.9
GLk2 spFv VH-VL (15) 6+4+6 63.7 0.3 65.4 0.1 1.7
CAT2200a scFv VL-VH (16) 4x G4S
CAT2200a spFv VL-VH (17) 8+4+4
CAT2200b scFv VL-VH (18) 4x G4S 54.7 0.3 57.6 0.0 12.0 11.7 2.9
CAT2200a spFv VL-VH (19) 9+4+4 66.7 0.3 69.3 0.0 2.6
CAT2200a scFv VH-VL (20) 4x G4S 52.6 0.3 56.4 0.0 12.9 11.4 3.8
CAT2200b spFv VH-VL (21) 9+4+4 65.5 0.3 67.9 0.0 2.4
ΔTm1 (℃)：Tm1 (spFv)與Tm1 (scFv)的差異
ΔTm2 (℃)：Tm2 (spFv)與Tm2 (scFv)的差異
Δ (Tm1-Tm2)：scFv或spFv之Tm2及Tm1的差異
測試CAT2200 spFv與IL-17之結合。當與CAT2200 scFv相比時，結合係可相比的。6.3 實例3 ：藉由所產製scFv 及spFv 分子的結晶來驗證正確釘合
將蛋白質於其等各別緩衝劑中濃縮：GLk1 spFv VL-VH濃縮至8.67 mg/ml於25 mM MES，pH 6.0，100 mM NaCl中；GLk1 spFv VH-VL濃縮至5 mg/ml於25 mM MES，pH 6.0，100 mM NaCl中；GLk2 spFv VH-VL濃縮至8.66 mg/ml於25 mM Tris，pH7.5，100 mM NaCl中；cat2200b spFv VH-VL濃縮至25 mM MES，pH 6.0，100 mM NaCl中。各蛋白質的結晶設定為使用Mosquito機器人在Corning 3550結晶盤中的坐滴格式。各孔含有100 nl的蛋白質及100 nl的貯槽溶液且在20℃下對70 µl的貯槽溶液培育。貯槽溶液係IH1及IH2客製化條件以及PEG Ion Screen HT (Hampton Research)。在最佳化嘗試中，一些初始條件係藉由變化貯槽溶液組分來精修。獲得一些scFv及spFv蛋白質的繞射品質結晶。表 7 顯示使用條件摘要。將結晶在母液（用20%甘油增補）中浸泡幾秒鐘，然後在液態N2中急速冷凍。X射線數據係在Argonne National Lab的IMCA-CAT Beamline 17ID收集。[ 表7]
分子名稱 蛋白質 結晶條件 二硫化物? 解析度(Å)
GLk1 spFv VL-VH 8.67 mg/mL, 25 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl 0.1 M Na Acet 4.5 pH, 18%w/v PEG 3350, 1 M LiCl 是 1.65
Glk1 spFv VH-VL 5 mg/mL, 25 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl 0.1 M MES 6.5 pH, 5%v/v PEG 400, 0.75 M (NH4)2SO4 是 2.10
GLk2 spFv VH-VL 8.66 mg/mL , 25 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl 0.1 M Na Acet 4.5 pH, 0.75 M (NH4)2SO4 是 1.50
CAT2200b spFv VH-VL 4.91 mg/mL, 25 mM MES, pH 6.0 100 mM NaCl 0.1 M Na Acet 4.5 pH, 1.5 M (NH4)2SO4 是 2.40
CAT2200a scFv VL-VH/IL-17錯合物 2.69 mg/mL, 20 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM NaCl 0.1 M Tris, pH 8.5, 18% PEG3K, 0.2M LiSO4 非釘合 2.30
CAT2200a spFv VL-VH/IL-17錯合物 6.0 mg/ml, 20 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM NaCl 15.5% PEG 3350, 0.4 M NaH2PO4 是 2.00
6.3.1 CAT2200a scFv VL-VH 及CAT2200a spFv VL-VH 與IL-17 之錯合物的結晶
IL-17/ CAT2200a scFv VL-VH錯合物係藉由混合333 µL的IL17 (SEQ ID NO: 22 ) (1.5 mg/ml)與1.74 ml的Cat2200a scFv (0.69 mg/mL)且在4℃下培育3小時產製。將混合物用10 kDa臨界值Amicon超濃縮器濃縮至約400 µL並裝載至以250 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.5平衡之Superdex75管柱上。將對應於錯合物之流份匯合並濃縮至150 µL之體積。將樣本稀釋並濃縮4次：添加350 µL 50 mM NaCl，20 mM HEPES，pH 7.5並濃縮至剛好低於150 µL。使體積達到約105 µL且濃度經判定為2.69 mg/mL。結晶設定為使用Mosquito結晶機器人之坐滴格式，在Corning3550盤中為150 nL蛋白質+ 150 nL貯槽溶液對80 µL貯槽溶液，貯槽溶液係一組實驗室內部預先調配的緩衝劑及析出劑條件。將盤在20℃下培育。一種條件（乙酸鈉，pH 4.5，25% PEG 3K，0.2M乙酸銨）產生非常小的結晶。收集這些，並使用Hampton Seed Bead在含有100 µL 27% PEG 3350、200 mM乙酸銨、100 mM乙酸鈉，pH 4.5之Hampton Seed Bead試管中將其轉成晶種。
繞射品質結晶係藉由除了添加上述晶種以外相同的程序獲得：150 nL蛋白質+ 100 nL貯槽溶液+ 50 µL晶種。結晶自0.1 M Tris 8.5，18% PEG3K，0.2M LiSO4生長且被轉移至合成的母液（0.1 M Tris，pH 8.5，10% PEG 3350，0.2 M LiSO4及20%甘油）並在液態氮中急速冷凍。X射線繞射數據係在Argonne National Laboratory的IMCA-CAT ID17收集。
IL-17/ CAT2200a spFv VL-VH錯合物係藉由混合167 µl的IL-17 (250 µg)與154 µl MSCW274（467 µg於250 mM NaCl，20 mM MES，pH 6.5中）且在4℃下培育隔夜產製。將混合物用10kDa MWCO Amicon Ultra 0.5 mL濃縮器濃縮至約100 µL，接著重複稀釋並濃縮5次：濃縮至約150 µL且添加350 µL 50 mM NaCl，20 mM HEPES，pH 7.5。錯合物的最終體積為100 µL且濃度經判定為6.0 mg/ml。結晶的設定類似於使用Mosquito機器人之坐滴中的scFv/IL-17錯合物。坐滴係由150 nL蛋白質+ 120 nL貯槽溶液+ 30 nL晶種（上述scFv/IL-17）構成。貯槽溶液係一組變化PEG 3350濃度及鹽的條件。將結晶盤在20℃下培育。小晶體係獲自15.5% PEG 3350，0.4 M NaH2PO4。將結晶轉移至16% PEG 3350，0.2 M NaH2PO4，20%甘油中，且以LN2急速冷凍。X射線繞射數據係在Argonne National Laboratory的IMCA-CAT ID17收集。
所有X射線繞射數據係經XDS (Kabschet al. (2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt. 2):125-132; Monsellier and Bedouelle (2006)J Mol Biol 362:580-593)及CCP4 (Collaborative Computational Project, N. (1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:240-255)處理。所有結晶結構係使用Phaser (Read (2001)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57(Pt 10):1373-1382)及在MOE (Montreal, Canada)中產製之同源性模型藉由分子置換(MR)解出，除了scFv CAT2200a scFv VL-VH/IL-17錯合物以外，其使用pdb id 2vxs之結構(Gerhardtet al. (2009)J Mol Biol 394:905-921)作為搜尋模型。結構模型係於PHENIX (Adamset al. (2004)J Synchrotron Radiat 11(Pt 1):53-55)中精修並於Coot (Emsleyet al. (2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt 4):486-501)中手動調整。在PyMol (www_schrodinger_com)中產製分子圖形圖。6.3.2 結構
未結合scFv及spFv分子的結構顯示於圖8、圖9、圖10、及圖11。圖8顯示GLk1 spFv VL-VH之結構。圖9顯示GLk1 spFv VH-VL之結構。圖10顯示GLk2 spFv VH-VL之結構。圖11顯示CAT2200b spFv VH-VL之結構。結構與典型Fv結構一致，其中VL及VH域兩者彼此緊密堆積。一般來說，大多數連接子殘基係有序且在電子密度圖解出。介於釘合序列與錨點之間的雙硫鍵在兩個VL-VH定向中大致上井然有序。除了未結合scFv及spFv結構以外，我們也嘗試揭露對抗原結合的任何結構影響。CAT2200 scFv及spFv變體分子係與其同源目標IL-17形成結晶錯合物。針對結晶的CAT2200變體之scFv及spFv而言，在結合及未結合目標的情況下結構幾乎相同（圖12、圖13、圖14）。圖12顯示未結合CAT2200b spFv VH-VL與結合IL-17之CAT2200a scFv VL-VH的比較。圖13顯示未結合CAT2200b spFv VH-VL與結合IL-17之CAT2200a spFv VL-VH的結構前視圖比較。圖14顯示未結合CAT2200b spFv VH-VL與結合IL-17之CAT2200a spFv VL-VH的結構後視圖比較。無論定向為何或釘合序列不存在，結構亦完全相同。結構對之間所有相匹配Cα原子的rmsd非常小：未結合spFv-VH-VL與結合抗原scFv-VL-VH之間為0.41 Å（圖12）、未結合spFv-VH-VL與spFv-VL-VH之間為0.46 Å（分別為圖13及圖14）、及結合scFv與結合spFv之間為0.37 Å。結構證據顯示釘合如所設計地作用。此外，釘合不影響VL及VH的域結構或相對VL/VH堆積。6.4 實例4 ：額外錨點之設計
使用實例1中描述之方案來識別用於釘合之任何額外錨點。識別下列錨點：
對於VL-連接子-VH定向：VL Chothia位置42、45及39及VH Chothia位置105、5及3。在圖 6 中，GLk1VL上之VL殘基係K42、K45、K39且GLk1上之VH殘基係Q105、L5及Q3。該釘合序列在所指示之任何位置之間形成。
對於VH-連接子-VL定向：VH Chothia位置43、40及46，VL Chothia位置102、5及3，該釘合序列在任何位置之間形成。
具有在此實例中描述之錨點的spFv係經選殖、表現並使用本文及實例2所述之檢定來測試釘合序列的形成及彼等之熱穩定性。6.5 實例5 ：半釘合
產製及表現在VH與連接子之間或在VL與連接子之間含有一個釘合序列的建構體。所產製建構體係使用本文所述之方法表現、純化及分析。6.6 實例6 ：包含spFv 之多特異性建構體
在此實例中建構及測試併入本文提供之spFv結構的例示性多特異性結合分子。具體而言，衍生自表 8 顯示之目標結合序列的雙特異性抗體及對照分子係暫時表現於無血清/無動物組分培養基中之CHO懸浮培養中，且藉由使用ÄKTA PURE儀器(GE Healthcare)進行蛋白質A親和性層析法及隨後在SUPERDEX 200 10/300 GL管柱(GE Healthcare)上進行製備型粒徑排阻層析法(SEC)來純化。重鏈含有鈕扣(KiH)突變以促進異二聚化(Ridgwayet al. ,Protein Eng . 9(7):617-21 (1996); Atwellet al. ,J. Mol. Biol. 270(1):26-35 (1997); Merchantet al. ,Nat. Biotechnol. 16(7):677-81 (1998))。抗體含有IgG1σ Fc，該IgG1σ Fc包含一組七個Fc突變（L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及P331S），相較於野生型IgG1減少Fc受體交互作用(Tamet al. , Antibodies (2017))。
產製具有IgG1σ突變及KiH突變之雙特異性抗體。[ 表8] ：用於實例6之建構體的目標結合序列。
抗體/ 配體名稱 目標/ 受體 VH 或鏈1 VL 或鏈2
LTBRmAb1 (BHA10) 人類LTBR WO2004002431/SEQ ID NO: 69 WO2004002431/SEQ ID NO: 70
EDBmAb1* (L19) 人類纖維黏連蛋白之外域B (EDB) WO9745544/SEQ ID NO: 71 WO9745544/SEQ ID NO: 72
B21M RSV Vafa Oet al. (2014) Methods 65(1)/SEQ ID NO: 73 Vafa Oet al. (2014) Methods 65(1)/SEQ ID NO: 74
MSLNmAb1 人類間皮素 EP2322560/SEQ ID NO: 75 EP2322560/SEQ ID NO: 76
*：此處使用之EDBmAb1(WO9745544)係一種已在臨床上測試之抗ED-B抗體，其他與ED-B或相鄰結構域結合之抗體已於先前描述(Carnemollaet al. Int. J. Cancer 68:397-405 (1996))
表8 中的序列如下：SEQ ID NO: 69 (VH BHA10) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSSEQ ID NO: 70 (VL BHA10) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKSEQ ID NO: 71 (VH L19) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO: 72 (VL L19) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSEQ ID NO: 73 (VH B21M) QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO: 74 (VL B21M) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKSEQ ID NO: 75 (VH MSLNmAb1) QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSSSEQ ID NO: 76 (VL MSLNmAb1) DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIK
蛋白質濃度係藉由在280 nm (OD280)的吸光度測量判定並判定純化產率。分析型SEC係在Thermo VANQUISH HPLC系統上使用Bio SEC-5管柱（Agilent，5 µm粒徑，300 Å）執行。將10 µl經純化的蛋白質裝載在管柱上並藉由OD280記錄洗提。
表9 顯示此實例中所述之雙特異性抗體及對照分子之結構性質的概述。粗體字的分子為根據本發明之例示性分子，而其他者則為不同態樣的對照。表 10 顯示另一個比較性雙特異性抗體之結構性質，其靶向LTBR及間皮素（在細胞外基質中不存在的腫瘤相關抗原），如實例9所討論。[ 表9] ： EDB/LTBR雙特異性抗體及對照分子之結構性質概述
         結合部位 Fc域 scFv特徵 註解
   名稱 形式 LTBRmAb1 EDBmAb1 B21M（同型對照mAb） 蛋白質A突變* 經釘合連接子 雙硫鍵穩定化 定向   
不對稱抗體；2:1格式 COVA1480 2:1 1 (scFv) 2 (mAb) - 是 是 - VH-VL scFv融合至EDBmAb1 HC之N端
COVA1481 2:1 1 (scFv) 2 (mAb) - 是 是 - VL-VH scFv融合至EDBmAb1 HC之N端
COVA1482 2:1 1 (scFv) 2 (mAb) - 是 是 - VH-VL scFv融合至EDBmAb1 HC之C端
COVA1483 2:1 1 (scFv) 2 (mAb) - 是 是 - VL-VH scFv融合至EDBmAb1 HC之C端
COVA1484 2:1 1 (scFv) - 2 (mAb) 是 是 - VH-VL COVA1480之LTBR/空(null)對照
COVA1485 2:1 1 (scFv) - 2 (mAb) 是 是 - VL-VH COVA1481之LTBR/空對照
COVA1486 2:1 1 (scFv) - 2 (mAb) 是 是 - VH-VL COVA1482及COVA14146之LTBR/空對照
COVA1487 2:1 1 (scFv) - 2 (mAb) 是 是 - VL-VH COVA1483之LTBR/空對照
COVA14107 2:1 1 (scFv) 2 (mAb) - 是 是 否 VH-VL scFv（C端融合至EDBmAb1 HC）含有減少對LTBR親和性之突變(VL3: Y36F_S49Y_F87)
COVA14108 2:1 1 (scFv) 2 (mAb) - 是 是 否 VH-VL scFv（C端融合至EDBmAb1 HC）含有減少對LTBR親和性之突變(VH_CDR1_Y33A)
   COVA14133 2:1 1 (scFv) 2 (mAb) - 否 是 否 VH-VL scFv融合至EDBmAb1 HC之C端
   COVA14136 2:1 1 (scFv) - 2(mAb) 否 是 否 VH-VL COVA14133之LTBR/空對照
*：WO2010151792中描述之Fc部分的突變，其廢除與蛋白質A之結合且促進異二聚體的純化。[ 表10] ： MSLN/LTBR雙特異性抗體之結構性質概述
      結合部位 Fc域 scFv特徵 註解
名稱 形式 LTBRmAb1 MSLNmAb1 蛋白質A突變 經釘合連接子 雙硫鍵穩定化 定向   
COVA14146 2:1 1 (scFv) 2(mAb) 是 是 否 VH-VL 衍生自LTBRmAb1之scFv的HC C端融合至MSLNmAb1。用於此建構體之同型對照分子係COVA1486
上列具有2:1化學計量之不對稱抗體（所有皆為IgG1σ，所有皆具有KiH突變）係產製如下： i.       COVA1484係藉由共表現攜帶N端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗RSV B21M抗體重鏈融合（SEQ ID NO: 78，包含SEQ ID NO: 79）與抗RSV B21M抗體的重鏈(HC; SEQ ID NO: 80)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 81)來產製（圖 15A ）。SEQ ID NO: 77 [經釘合scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 78 （HC B21M N 端釘合BHA10 (VH-VL) ，IgG1s ，鈕，具有pA 突變） QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 79 （HC B21M (RSV) IgG1s鈕具有pA突變） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 80 （HC B21M (RSV) IgG1s 孔） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 81 [LC B21M (RSV)] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ii.      COVA1485係藉由共表現攜帶N端經釘合scFv BHA10（VL-VH定向SEQ ID NO: 82）之抗RSV B21M抗體重鏈融合（SEQ ID NO: 83，包含SEQ ID NO: 79）與抗RSV B21M抗體的重鏈(HC; SEQ ID NO: 80)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 81)來產製（圖 15B ）。SEQ ID NO: 82 [ 經釘合 scFv BHA10 (VL-VH)] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSSEQ ID NO: 83 （ HCB21M N 端釘合 BHA10 (VL-VH) ， IgG1s ， 鈕 ， 具有 pA 突變 ） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 79 （ HC B21M (RSV) IgG1s 鈕具有 pA 突變 ） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 80 （ HC B21M (RSV) IgG1s 孔 ） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 81 [LC B21M (RSV)] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC iii.     COVA1486係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗RSV B21M抗體重鏈融合（SEQ ID NO: 84，包含SEQ ID NO: 79）與抗RSV B21M抗體的重鏈(HC; SEQ ID NO: 80)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 81)來產製（圖 15C ）。SEQ ID NO: 77 [ 經釘合 scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 84 （ HC B21M C 端釘合 BHA (VH-VL) ， IgG1s ， 鈕 ， 具有 pA 突變 ） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 79 （HC B21M (RSV) IgG1s鈕具有pA突變） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 80 （HC B21M (RSV) IgG1s孔） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 81 [LC B21M (RSV)] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC iv.     COVA1487係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VL-VH定向SEQ ID NO: 82）之抗RSV B21M抗體重鏈融合（SEQ ID NO: 85，包含SEQ ID NO: 79）與抗RSV B21M抗體的重鏈(HC; SEQ ID NO: 80)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 81)來產製（圖 15D ）。SEQ ID NO: 82 [經釘合scFv BHA10 (VL-VH)] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSSEQ ID NO: 85 （HC B21M C端釘合BHA (VL-VH)，IgG1s，鈕，具有pA突變） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSSEQ ID NO: 79 （HC B21M (RSV) IgG1s鈕具有pA突變） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 80 （HC B21M (RSV) IgG1s孔） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 81 [LC B21M (RSV)] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC v.      COVA1480係藉由共表現攜帶N端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗EDB抗體EDBmAb1重鏈融合（SEQ ID NO: 86，包含SEQ ID NO: 87）與抗EDB抗體EDBmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 88)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 89)來產製（圖 15E ）。SEQ ID NO: 77 [經釘合scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 86 （HC L19 N端釘合BHA10 (VH-VL)，IgG1s，鈕，具有pA突變） QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 87 （HC L19 IgG1s鈕具有pA突變） VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 88 （HC L19 IgG1s孔） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 89 (LC L19) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC vi.     COVA1481係藉由共表現攜帶N端經釘合scFv BHA10（VL-VH定向SEQ ID NO: 82）之抗EDB抗體EDBmAb1重鏈融合（SEQ ID NO: 90，包含SEQ ID NO: 87）與抗EDB抗體EDBmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 88)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 89)來產製（圖 15F ）。SEQ ID NO: 82 [經釘合scFv BHA10 (VL-VH)] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSSEQ ID NO: 90 （HC L19 N端釘合BHA10 (VL-VH)，IgG1s，鈕，具有pA突變） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 87 （HC L19 IgG1s鈕具有pA突變） VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 88 （HC L19 IgG1s孔） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 89 (LC L19) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC vii.    COVA1482係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗EDB抗體EDBmAb1重鏈融合（SEQ ID NO: 91，包含SEQ ID NO: 87）與抗EDB抗體EDBmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 88)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 89)來產製（圖 15G ）。SEQ ID NO: 77 [經釘合scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 91 （HC L19 C端釘合BHA10 (VH-VL)，IgG1s，鈕，具有pA突變） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 87 （HC L19 IgG1s鈕具有pA突變） VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 88 （HC L19 IgG1s孔） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 89 (LC L19) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC viii.   COVA1483係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VL-VH定向SEQ ID NO: 82）之抗EDB抗體EDBmAb1重鏈融合（SEQ ID NO: 92，包含SEQ ID NO: 87）與抗EDB抗體EDBmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 88)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 89)來產製（圖 15H ）。SEQ ID NO: 82 [經釘合scFv BHA10 (VL-VH)] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSSEQ ID NO: 92 （HC L19 C端釘合BHA10 (VL-VH)，IgG1s，鈕，具有pA突變） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGCAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGQGTKVEIKGGSGGSGGCPPCGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGCGTTVTVSSSEQ ID NO: 87 （HC L19 IgG1s鈕具有pA突變） VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 88 （HC L19 IgG1s孔） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 89 (LC L19) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ix.     COVA14107係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向，VL3 Y36F_S49Y_F87Y SEQ ID NO: 93）之抗EDB抗體EDBmAb1重鏈融合（SEQ ID NO: 94，包含SEQ ID NO: 87）與抗EDB抗體EDBmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 88)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 89)來產製（圖 15I ）。SEQ ID NO: 93 [經釘合scFv (VL3_Y36F_S49Y_F87Y) BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWFQQKPGKAPKSLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 94 （HC L19 C端釘合(VL3_Y36F_S49Y_F87Y) BHA (VH-VL)，IgG1s，鈕，具有pA突變） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWFQQKPGKAPKSLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 87 （HC L19 IgG1s鈕具有pA突變） VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 88 （HC L19 IgG1s孔） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 89 (LC L19) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC x.      COVA14108係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向，VH_CDR1_Y33A SEQ ID NO: 95）之抗EDB抗體EDBmAb1重鏈融合（SEQ ID NO: 96，包含SEQ ID NO: 87）與抗EDB抗體EDBmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 88)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 89)來產製（圖 15J ）。SEQ ID NO: 95 [經釘合scFv (VH_CDR1_Y33A) BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYALHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 96 （HC L19 C端釘合(VH_CDR1_Y33A) BHA10 (VH-VL)，IgG1s，鈕，具有pA突變） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYALHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 87 （HC L19 IgG1s鈕具有pA突變） VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 88 （HC L19 IgG1s孔） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 89 (LC L19) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC xi.     COVA14133係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗EDB抗體EDBmAb1重鏈融合（SEQ ID NO: 97，包含SEQ ID NO: 98）與抗EDB抗體EDBmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 88)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 89)來產製（圖 15K ）。SEQ ID NO: 77 [經釘合scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 97 （HC L19 C端釘合BHA10 (VH-VL)，IgG1s，鈕，無pA突變） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 98 （HC L19 IgG1s鈕） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 88 （HC L19 IgG1s孔） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 89 (LC L19) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC xii.    COVA14136係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗RSV B21M抗體重鏈融合（SEQ ID NO: 99，包含SEQ ID NO: 100）與抗EDB抗體EDBmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 80)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 81)來產製（圖 15L ）。SEQ ID NO: 77 [經釘合scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 99 （HC B21M C端釘合BHA10 (VH-VL)，IgG1s，鈕，無pA突變） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 100 （HC B21M (RSV) IgG1s鈕） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 80 （HC B21M (RSV) IgG1s孔） QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 81 [LC B21M (RSV)] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC xiii.   COVA14146係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗間皮素抗體MSLNmAb1重鏈融合（SEQ ID NO: 101，包含SEQ ID NO: 102）與抗間皮素抗體MSLNmAb1的重鏈(HC; SEQ ID NO: 103)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 104)來產製（圖 15M ）。SEQ ID NO: 77 [經釘合scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 101 （MSLNmAb1 HC C端釘合BHA10 (VH-VL)，IgG1s，鈕，具有pA突變） QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 102 （MSLNmAb1 HC，IgG1s，鈕，具有pA突變） QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 103 （HC MSLNmAb1 IgG1s孔） QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 104 (LC MLSNmAb1) DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
上述之所有建構體可以高產率及純度來表現及純化（見下表 11 ），表示併入本文提供之spFv之雙特異性建構體具有良好的生物物理學性質。[ 表11] ：所選EBD/LTBR雙特異性分子的產率及純度
雙特異性分子名稱 說明 產率[mg/L] 純度[單體%]
COVA1482 2:1異二聚體，其係由與經釘合scFv BHA10 (VH-VL)融合之EDBmAb1 HC（Fc中含有廢除與蛋白質A結合以促進異二聚體純化之突變）配對EDBmAb1 HC及EDBmAb1 LC所組成 53 100
COVA14133 2:1異二聚體，其係由與經釘合scFv BHA10 (VH-VL)融合之EDBmAb1 HC配對EDBmAb1 HC及EDBmAb1 LC所組成 64.3 100
6.7 實例7 ：EDB 依賴性體外LTBR 活化 -NF- κB 螢光素酶報導子檢定
為了顯示EDB/LTBR雙特異性分子能夠以EDB依賴性方式活化LTBR，在A549細胞NF-κB螢光素酶報導子檢定中在含EDB之纖維黏連蛋白（EDB+纖維黏連蛋白）存在或不存在下測試化合物活性。NF-κB傳訊在調節細胞發展及免疫恆定上扮演樞軸角色。經由腫瘤壞死因子受體(TNFR)或TNFR超家族成員（例如，LTBR）活化NF-κB發生在與彼等之各別配體銜接時。A549肺上皮細胞系天然表現LTBR，且NF-κB螢光素酶報導子建構體係經穩定整合至A549肺上皮細胞系基因體中。在藉由刺激劑活化之後，內源性NF-κB轉錄因子與DNA反應元件結合以誘導螢光素酶基因的轉錄。
為了證明LTBR的EDB依賴性活化，將高結合96孔µClear平底盤(Greiner; Monroe, NC)以150 ng/孔人類重組EDB+纖維黏連蛋白域7-B-8-9 (EDB+; SEQ ID NO: 105)或150 ng/孔人類重組纖維黏連蛋白域7-8-9 (EDB-; SEQ ID NO: 106)包覆隔夜，其序列係列示於下。SEQ ID NO: 105 （纖維黏連蛋白域7B89） PLSPPTNLHLEANPDTGVLTVSWERSTTPDITGYRITTTPTNGQQGNSLEEVVHADQSSCTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPEVPQLTDLSFVDITDSSIGLRWTPLNSSTIIGYRITVVAAGEGIPIFEDFVDSSVGYYTVTGLEPGIDYDISVITLINGGESAPTTLTQQTAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTHHHHHHSEQ ID NO: 106 （纖維黏連蛋白域789） PLSPPTNLHLEANPDTGVLTVSWERSTTPDITGYRITTTPTNGQQGNSLEEVVHADQSSCTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTHHHHHH
在隔夜培育之後，將經包覆之盤用PBS洗滌且在37℃下用檢定培養基（DMEM + 10%熱去活化FBS）阻斷2小時。在檢定培養基中製備測試化合物之1:5稀釋系列為2倍濃度原液（測試最終濃度範圍為200 nM至2.6 pM）。抽吸移除阻斷溶液之後，將50 µl經稀釋之化合物添加至預先阻斷盤。將50 µl的A549細胞懸浮液（細胞懸浮液濃度= 0.4 Mio細胞/ml檢定培養基）添加至各孔（20,000個細胞/孔）。A549細胞係藉由使用Accutase/EDTA先自細胞培養瓶剝離且接著在檢定培養基中轉移。將細胞與化合物在37℃/5% CO2 下培育18至20小時。
在培育18小時後，使用BIO-GLO螢光素酶檢定系統(Promega; Madison, WI)偵測螢光素酶活性。使用具有500毫秒積分時間之TECAN M1000 Pro儀器測量發光。從所得之相對光單位(RLU)，LTBR傳訊之誘導倍數係計算如下：誘導倍數= RLU刺激 細胞/平均RLU未刺激 細胞（未刺激細胞包括於各測試盤作為對照）。
劑量反應曲線（包括標準差）係使用GRAPHPAD Prism作圖，且如果適用的話應用非線性擬合（log(促效劑)相對於反應(可變斜率-三個參數)）。為了擬合數據，使用GRAPHPAD Prism之X=Log(x)函數來轉化x值（化合物濃度）。
COVA1482與COVA1456係於相同A549 NF-κB報導子檢定中比較。COVA1482與COVA1456的不同處僅在於用於scFv的穩定方法。COVA1482中之scFv亦衍生自LTBRmAb1，其係使用本文所述之釘合平台穩定（即，經由VH/連接子及VL連接子雙硫鍵穩定），其中COVA1456係藉由VH與VL之間的雙硫鍵穩定（即，經由VH/VL雙硫鍵穩定）。圖 16A 顯示COVA1482及COVA1456以EDB依賴性方式有效活化LTBR。對應的同型對照COVA1486及COVA1462不活化LTBR（圖 16A ）。這些結果證明將spFv併入多特異性分子對於該多特異性分子的活性沒有負面影響。2:1雙特異性EDB/LTBR抗體（COVA1482或COVA1456）在此報導子檢定中顯示增加誘導NF-κB傳訊的效力。在數個具有相同實驗設定的檢定中所計算之COVA1482的平均EC50 約為30 pM ± 10 pM，然而對照1:1異二聚體建構體在檢定中顯示約3 nM之EC50 （此處未顯示數據），表示2:1雙特異性分子比起1:1雙特異性分子可更有效100倍。此可藉由2個TAA結合部位所達成之增加LTBR結合部位的叢聚而解釋。
為了研究對LTBR之親和性對於此類雙特異性分子TAA依賴性活化LTBR的能力之效應，衍生自LTBRmAb1之scFv片段的較低親和性變體（SEQ ID NO: 107，KD ≈ 60 nM及SEQ ID NO: 108，KD ≈ 600 nM）係經產製及用於建構2:1雙特異性分子COVA14107及COVA14108（見表 9 ）。SEQ ID NO: 107 [經釘合scFv (VL3_Y36F_S49Y_F87Y) BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWFQQKPGKAPKSLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 108 [經釘合scFv (VH_CDR1_Y33A) BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYALHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIK
所產製雙特異性分子係於A549 NF-κB報導子檢定中測試以瞭解親和性對於LTBR活化之效應。圖 16B 顯示在此檢定中，對LTBR之較低親和性對應於較低的雙特異性分子以TAA依賴性方式活化LTBR的能力。數據亦證明將spFv併入多特異性分子對於該分子的活性沒有負面影響。
如實例6所述，為了促進所欲異二聚體的純化，將廢除與蛋白質A（用於純化抗體）結合之突變(WO2010151792)導入一些建構體之Fc中。COVA14133係產製為不具有這些突變，且將其活性與COVA1482比較以顯示在Fc區的突變不影響雙特異性分子的活性。在A549 NF-κB報導子檢定中比較COVA14133及COVA1482及彼等之各別同型對照COVA14136及COVA1486。圖 16C 顯示COVA14133以TAA依賴性方式活化LTBR且效率類似於COVA1482，證明Fc中之突變不影響雙特異性分子活化LTBR之能力且對於spFv的功能不具效應。
總結來說，COVA14133顯示具有以TAA依賴性方式活化LTBR之優異能力。6.8 實例8 ：EDB 依賴性體外LTBR 活化 -A375/WI38VA 子系2RA 共培養細胞檢定
執行A375/WI38VA子系2RA共培養檢定以驗證LTBR在EDB+纖維黏連蛋白（由WI38VA細胞產生及沉積於細胞外基質中(Zardi, L.,et al., EMBO J , 6, 2337-42 (1987)）存在下的活化是否導致A375細胞之細胞介素及趨化激素的釋放及黏著性分子ICAM-1的上調以及併入spFv是否對於活性不具負面影響。將WI38VA子系2RA (ATCC® CCL75.1™)細胞以5000個細胞/孔之密度接種於96孔盤且在彼等之生長培養基（MEM不含麩醯胺酸+ 10%熱去活化FBS + 0.1 mM NEAA + 2 mM L-Gln + 1 mM丙酮酸鈉）中在37℃/5% CO2 下培育48小時。在檢定培養基（DMEM + 10%熱去活化FBS）中製備測試化合物之1:5稀釋系列為2倍濃度原液（測試最終濃度範圍為40 nM至0.5 pM）。在與WI38VA子系2RA細胞之共培養中培育之前，將A375細胞(ATCC® CRL-1619™)標示CELLTRACE violet (CTV, Invitrogen; Carlsbad, CA)合成cDNA。為了進行標示，將濃度10x106 個細胞/mL之細胞懸浮液及2.5 µM CTV於5% FBS於PBS中在RT下培育5分鐘同時避免光照。接著將細胞洗滌並再懸浮於檢定培養基中，密度為0.4x106 個細胞/ml。將培養基自含有48小時WI38VA子系2RA培養之盤中小心移除，隨後添加50 µl A375細胞懸浮液（20,000個細胞/孔；CTV+或CTV-）於各孔中。將50 µl之連續稀釋化合物（每孔最終體積為100 µl）添加至細胞且在37℃/5% CO2 下培育24小時。
在培育24小時後，藉由離心使上清液澄清且儲存用於使用MSD檢定之細胞介素及趨化激素測量。藉由流動式細胞測量術進一步處理細胞以進行ICAM-1測量。6.8.1 藉由流動式細胞測量術偵測ICAM-1
小心移除留在96孔盤中的任何培養基，使用Accutase將細胞剝離、轉移至深孔96孔盤（將三重複匯合於1孔）、洗滌、再懸浮於100 µl FACS緩衝劑(PBS + 1% FBS + 0.1% NaN3 )中且轉移至圓底96孔盤。抗體（即，經PE標示之抗人類ICAM-1（選殖株1H4，Thermo；Waltham, MA）或經PE標示之同型對照抗體(MPC-11, BioLegend; San Diego, CA)）及LIVE/DEAD可固定近IR染料(Invitrogen)之單一染色或組合染色係如表 12 所示稀釋。[ 表12] ： 單一染色或組合染色於FACS緩衝劑中之稀釋方案
   抗體或染料 所使用最終濃度(µg/ml) 稀釋倍數
單一染色 ICAM-1 1.25 20
同型對照 1.25 160
LIVE/DEAD - 400
組合染色 ICAM-1+LIVE/DEAD ICAM-1 1.25 20
LIVE/DEAD - 400
將細胞在4℃下以400 × g離心4分鐘，將上清液丟棄，且如表 12 所述製備50 µl抗體溶液。將細胞及抗體在黑暗中在4℃下培育30分鐘。在培育之後，在各孔中加入120 µl，然後將細胞在4℃下以400 × g離心4分鐘。將細胞用FACS緩衝劑洗滌一次、離心、且再懸浮於90 µl FACS緩衝劑中。接著將細胞藉由添加90 µl的3.7%福馬林溶液於PBS中固定且在黑暗中在冰上培育15分鐘。固定後，將細胞在4℃下以400 × g離心4分鐘，且再懸浮於100 µl FACS緩衝劑中。細胞係使用MACS Quant儀器在高流速篩選模式下測量，獲得49 µl/孔。使用FLOWLOGICS軟體（版本700.2A）分析數據並用GraphPad Prism作圖。6.8.2 使用MSD 平台測量經處理細胞之上清液中的細胞介素
使用MSD平台及多工MSD盤測量數種已知在NF-κB傳訊控制下的細胞介素。此處列示的是測量細胞介素的一些實例： ▪     RANTES：使用R-Plex抗體組人類RANTES (MSD)； ▪     I-TAC、IP-10、MIP-3b：使用3-PLEX細胞介素釋放檢定(MSD)； ▪     IL-8、IP-10、MIP-3b：使用3-PLEX細胞介素釋放檢定(MSD)；及 ▪     IL-12p70、IL-6、TNF-a、MIP-3a、SDF-1a：使用5-PLEX細胞介素釋放檢定(MSD)
遵照製造商說明，使用MSD平台測量經處理細胞之上清液中的細胞介素濃度。簡言之，規程涉及下列步驟： (1)    盤的製備涉及用偶接連接子之捕捉抗體包覆所提供之盤。將盤在2至8℃下震盪培育隔夜。在下列天數，使用盤清洗機(Biotek; Winoosine, VT)用PBST（PBS加上0.05% Tween-20）洗滌盤； (2)    製備校準器標準及偵測抗體溶液； (3)    取決於材料的可用性，上清液經稀釋1:3或1:5。6.8.3 檢定規程： ○   步驟1：將樣本或校準器標準添加至盤，且將盤在RT下震盪培育1小時； ○   步驟2：洗滌盤，且添加偵測抗體。將盤在RT下震盪培育1小時。 ○   步驟3：洗滌盤且添加2x讀取緩衝劑。將該盤於MSD儀器上分析
使用MESOSCALE軟體(MSD discovery work bench program v 4.0.12.1)分析數據並使用GRAPHPAD Prism作圖。6.8.4 結果- 藉由流動式細胞測量術偵測ICAM-1
先前已顯示，NF-κB傳訊可導致細胞表面上之ICAM-1的上調(da Silva Antunes,et al. Front Immunol, 9:576, (2018))。因此，在與EDB/LTBR雙特異性分子共培養培育之後測量A375細胞表面上ICAM-1之表現水平。作為一實例，圖 17 顯示ICAM-1在與EDB/LTBR雙特異性COVA1482培育後上調，證明LTBR結合性spFv的功能。同型對照分子COVA1486不造成ICAM-1的上調。這些發現指示，經由與EDB結合而叢聚LTBR scFv的能力係LTBR活化的先決條件，且因此ICAM-1上調。6.8.5 結果- 經處理細胞之上清液中的細胞介素測量
由於LTBR活化而表現的數種細胞介素及趨化激素係於經上述EDB/LTBR雙特異性及對照分子處理之共培養的上清液中測量。圖 18A 至18D 顯示藉由COVA14133活化LTBR而上調之細胞介素的4個代表性實例（圖 18A ：RANTES，圖 18B ：IL-6，圖 18C ：IL-8，及圖 18D ：MIP-3b）。COVA14136中之非靶向LTBRmAb1衍生性scFv不活化LTBR，且因此上清液中細胞介素的濃度不增加超過背景。背景係由B21M抗體或COVA1440（一種2(mAb) B21M同型對照mAb）所達成之水平表示（在圖表中顯示為單一濃度）。結果證明，LTBR結合性spFv在體外具有功能。
綜上所述，LTBR活化所致之ICAM-1上調及細胞介素分泌證實LTBR活化對於細胞可具有的預期效應。
在此實例中，證明本文提供之分子達成LTBR的有效腫瘤相關抗原（此處為含EDB之纖維黏連蛋白）依賴性活化。6.9 實例9 ：間皮素依賴性體外LTBR 活化- 使用A549 NF-κB 報導子細胞及CHOK1-huMSLN 或H226 的共培養細胞檢定
在實例7及8中，證明包含本文提供之spFv結構的靶向EDB（在細胞外基質中之腫瘤相關抗原）及LTBR之雙特異性抗體以腫瘤抗原依賴性方式非常有效地活化LTBR。為了驗證此發現是否適用於不論其位置所在的任何腫瘤抗原（沉積在細胞外基質中或腫瘤細胞的細胞表面上），如實例6中所述設計及產生靶向間皮素（MSLN，一種在不同類型的腫瘤上表現之腫瘤相關抗原）(Hassan and Ho,Eur.J. Cancer , 44:46-53 (2008))及LTBR的雙特異性2:1抗體。COVA14146係2:1 MSLN/LTBR雙特異性抗體，其係由與衍生自LTBRmAb1之spFv片段融合之抗間皮素抗體(MSLNmAb1)所組成。為了顯示靶向LTBR及存在腫瘤細胞的細胞表面上之腫瘤相關抗原（例如，間皮素）的LTBR雙特異性抗體是否能夠以腫瘤依賴性方式有效活化LTBR，使用共培養細胞檢定。所用之共培養檢定係A549細胞NF-κB螢光素酶報導子細胞檢定（在實例7中描述）及H226細胞（間皮瘤細胞系；ATCC® CRL-5826），已知H226細胞表現間皮素(Fanet al. Mol. Canc. Ther. 1:595-600 (2002))及LTBR。6.9.1 H226 細胞的製備
將每孔10,000個細胞（在75 µl檢定培養基中：DMEM + 10% FBS-HI）的H226細胞（表現約200,000拷貝數的間皮素及10,000拷貝數的LTBR）懸浮液接種於96孔組織培養盤且在37℃/5% CO2 下在彼等之生長培養基（分別為MEM + 2 mM麩醯胺酸+ 10% FBS-HI + 10 µg/ml嘌呤黴素及RPMI-1640 + 10% FBS + 1 mM丙酮酸鈉）中培育6小時以允許細胞附接至盤。6.9.2 化合物的製備
化合物的測試濃度範圍從100 nM降至1.3 pM。在檢定培養基(DMEM + 10% FBS-HI)中製備化合物的4倍1於5系列稀釋且儲存在4℃下直到使用。6.9.3 A549 報導子細胞的製備及添加
使用Accutase/EDTA將A549報導子細胞自細胞培養瓶剝離且轉移至檢定培養基(DMEM + 10% FBS-HI)中。在添加每孔總共20,000個A549報導子細胞至含有H226細胞之盤後，將50 µL的預先稀釋化合物添加至各孔且在37℃/ 5% CO2 下培育20 hrs。6.9.4 經處理共培養之發光測量
在培育20小時後，使用BIO-GLO螢光素酶檢定系統(Promega; Madison, WI)，根據製造商說明偵測螢光素酶活性。使用具有500毫秒積分時間之TECAN M1000 Pro儀器測量發光。從所得之相對光單位(RLU)，LTBR傳訊之誘導倍數係計算如下：誘導倍數= RLU刺激 細胞/平均RLU未刺激 細胞（未刺激細胞包括於各測試盤作為對照）。
劑量反應曲線（包括標準差）係使用GRAPHPAD Prism作圖，且如果適用的話應用非線性擬合（log(促效劑)相對於反應(可變斜率-三個參數)）。為了擬合數據，使用GRAPHPAD Prism之X=Log(x)函數來轉化x值（化合物濃度）。6.9.5 使用MSD 平台測量經處理細胞之上清液中的細胞介素
可使用MSD平台及多工MSD盤測量數種已知在NF-κB傳訊控制下的細胞介素。作為一實例，本文中描述使用R-Plex抗體組人類RANTES (MSD)測量RANTES的方法。
遵照製造商說明，使用MSD平台測量經處理細胞之上清液中的RANTES濃度。簡言之，規程涉及下列步驟： (1)      盤的製備涉及用偶接連接子之捕捉抗體包覆所提供之盤。將盤在2至8℃下震盪培育隔夜。在下列天數，使用盤清洗機(Biotek; Winoosine,VT)用PBST（PBS加上0.05% Tween-20）洗滌盤； (2)      製備校準器標準及偵測抗體溶液； (3)      取決於材料的可用性，上清液經稀釋1:3或1:5。6.9.6 檢定規程： ○ 步驟1： 將樣本或校準器標準添加至盤，且將盤在RT下震盪培育1小時； ○ 步驟2： 洗滌盤，且添加偵測抗體。將盤在RT下震盪培育1小時。 ○ 步驟3： 洗滌盤且添加2x讀取緩衝劑。將該盤於MSD儀器上分析 使用MESOSCALE軟體(MSD discovery work bench program v 4.0.12.1)分析數據並使用GRAPHPAD Prism作圖。6.9.7 結果- LTBR 在A549 報導子細胞/ H226 共培養檢定中的間皮素依賴性活化
執行使用A549報導子細胞及H226細胞的共培養檢定以驗證COVA14146是否能夠在更生理系統中活化LTBR，其中，因為其廣泛表現(Lukashev,et al. Cancer Res., 66(19):9617-24 (2006))，預期LTBR及間皮素（及腫瘤細胞的細胞表面上之其他腫瘤相關抗原，例如EGFR）可共表現於腫瘤細胞的細胞表面上。圖 19A 顯示在這些條件下，COVA14146無法有效活化LTBR。測量經分泌於經處理細胞之上清液中的RANTES濃度以證實COVA14146無法有效活化LTBR。如預期般，圖 19B 顯示經COVA14146處理之細胞所分泌的RANTES與經同型對照分子COVA1486處理的細胞所分泌的程度相同，證實LTBR在這些條件下無法被活化。6.10 實例10 ：與LTBR 及其他存在於細胞外基質中之TAA 特異性結合的雙特異性抗體
以上實例證明靶向LTBR及表現於細胞外基質中之TAA（其中為纖維黏連蛋白之EDB）之雙特異性抗體可在表現EDB之腫瘤組織中選擇性活化LTBR。此實例證明，此更普遍地適用於靶向LTBR及存在於細胞外基質中之另一種TAA之雙特異性抗體，此實例藉由再提供二個該等TAA的實例（亦即腱生蛋白C之A2域及纖維黏連蛋白之外域A）來證明。
大致上遵照以上實例中所述的方法，製備與LTBR及其他存在於細胞外基質中之TAA（亦即腱生蛋白C之A2域(TnCA2)或纖維黏連蛋白之外域A (EDA)）結合之進一步雙特異性抗體。這些TAA的序列例如已描述於： -       TnCA2：UniProt編號P24821.3； -       EDA：UniProt編號P02751。
此外，針對這些TAA的抗體例如先前已描述於： -       TnCA2：WO2011/020783； -       EDA：EP2142567。
本實例所使用之針對這些目標的結合域之例示性序列（藉由與LTBR scFv組合以產生本發明之多特異性結合分子）係提供為： -       TnCA2：VH SEQ ID NO: 109及VL SEQ ID NO: 110； -       EDA：VH SEQ ID NO: 111及VL SEQ ID NO: 112。
這些序列如下：SEQ ID NO: 109 （抗TnCA2 Ab 2B10之VH） QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSSEQ ID NO: 110 （抗TnCA2 Ab 2B10之VL） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQGTKVEIKSEQ ID NO: 111 （抗EDA Ab F8之VH） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO: 112 （抗EDA Ab F8之VL） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
與LTBR及這些TAA結合之雙特異性抗體係經製備且在TAA依賴性體外LTBR活化之NF-κB螢光素酶報導子檢定中遵照如實例7所述之類似程序測試LTBR的TAA特異性活化。
具有2:1化學計量之不對稱抗體係產製如下：
COVA14198係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗EDA抗體重鏈融合（SEQ ID NO: 113，包含SEQ ID NO: 114）與抗EDB抗體的重鏈(HC; SEQ ID NO: 115)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 116)來產製。該等序列係列示於下。SEQ ID NO: 77 [經釘合scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 113 （F8 HC與BHA10經釘合(VH-VL) scFv C端融合，IgG1σ，鈕突變） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 114 （F8 HC，IgG1σ，鈕突變） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 115 （F8 HC，IgG1σ及孔突變） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 116 (F8 LC) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
COVA14202係藉由共表現攜帶C端經釘合scFv BHA10（VH-VL定向SEQ ID NO: 77）之抗腱生蛋白C之A2域抗體重鏈融合（SEQ ID NO: 117，包含SEQ ID NO: 118）與抗腱生蛋白C之A2域抗體的重鏈(HC; SEQ ID NO: 119)及輕鏈(LC; SEQ ID NO: 120)來產製。該等序列係列示於下。SEQ ID NO: 77 [經釘合scFv BHA10 (VH-VL)] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 117 （2B10 HC與BHA10經釘合(VH-VL) scFv C端融合，IgG1σ，鈕突變） QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYLHWVRQAPGCGLEWMGWIYPGNVHAQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWEGFPYWGQGTTVTVSSGGGSGGGSGCPPCGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGINVAWYQQKPGKAPKSLISSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDTYPFTFGCGTKVEIKSEQ ID NO: 118 （2B10 HC，IgG1σ，鈕突變） QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 119 （2B10 HC，IgG1σ及孔突變） QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 120 (2B10 LC) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
為了證明LTBR的TAA依賴性活化，將高結合96孔µClear平底盤(Greiner; Monroe, NC)用下列包覆隔夜： - 150 ng/孔之含重組A2域(A2+ )腱生蛋白C A1-A2-A3域(TnCA2+ ; SEQ ID NO: 121)或150 ng/孔人類重組腱生蛋白A1至A3域（即，缺乏A2域，指示為A2- ）(TnCA2- ; SEQ ID NO: 122)；或 - 150 ng/孔之含重組EDA (EDA+ )纖維黏連蛋白11-A-12域(EDA+ ; SEQ ID NO: 123)或150 ng/孔人類重組纖維黏連蛋白11-12域（即，不含EDA，指示為EDA- ）(EDA- ; SEQ ID NO: 124)。
上文提及之序列如下：SEQ ID NO: 121 （Hu腱生蛋白C A1-A2-A3域，包括用於純化之(His)6 標籤） EQAPELENLTVTEVGWDGLRLNWTAADQAYEHFIIQVQEANKVEAARNLTVPGSLRAVDIPGLKAATPYTVSIYGVIQGYRTPVLSAEASTGETPNLGEVVVAEVGWDALKLNWTAPEGAYEYFFIQVQEADTVEAAQNLTVPGGLRSTDLPGLKAATHYTITIRGVTQDFSTTPLSVEVLTEEVPDMGNLTVTEVSWDALRLNWTTPDGTYDQFTIQVQEADQVEEAHNLTVPGSLRSMEIPGLRAGTPYTVTLHGEVRGHSTRPLAVEVVTHHHHHHSEQ ID NO: 122 （Hu腱生蛋白C A1-A3域，包括用於純化之(His)6 標籤） EQAPELENLTVTEVGWDGLRLNWTAADQAYEHFIIQVQEANKVEAARNLTVPGSLRAVDIPGLKAATPYTVSIYGVIQGYRTPVLSAEEEVPDMGNLTVTEVSWDALRLNWTTPDGTYDQFTIQVQEADQVEEAHNLTVPGSLRSMEIPGLRAGTPYTVTLHGEVRGHSTRPLAVEVVTHHHHHHSEQ ID NO: 123 （Hu纖維黏連蛋白11-A-12域，包括用於純化之(His)6 標籤） EIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQTEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGTQSTAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDSSSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLEHHHHHHSEQ ID NO: 124 （Hu纖維黏連蛋白11-12域，包括用於純化之(His)6 標籤） EIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQTEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTTIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDSSSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLEHHHHHH
這些檢定的結果與以上EDB/LTBR雙特異性分子顯示之結果一致，即，彼等顯示LTBR主要在各別雙特異性結合分子所靶向之細胞外基質之腫瘤抗原存在下活化（表 13 ）。[ 表13] ： COVA14198及COVA14202分別在EDA或TnCA2存在或不存在下的NF-κB傳訊最大誘導倍數。
名稱 在TAA存在下 的最大誘導倍數 在TAA不存在下 的最大誘導倍數 比率（TAA+ 最大誘導倍數/TAA- 最大誘導倍數）
COVA14198 (EDA/LTBR) 4.5 1.3 3.5
COVA14202 (TnCA2/LTBR) 4.2 1.2 3.5
具體而言，TnCA2/LTBR雙特異性結合分子在TnCA2抗原存在下可強烈活化LTBR，且因此觸發NF-κB傳訊，而EDA/LTBR雙特異性結合分子在EDA抗原存在下可強烈活化LTBR，且因此觸發NF-κB傳訊。在各別TAA不存在下，這些雙特異性分子不活化或僅最小活化LTBR。
此實例證明，經由本文提供之多特異性結合分子活化LTBR之方案（例如，與LTBR及細胞外基質相關性腫瘤相關抗原兩者結合）適用於目前為止所測試的所有三種不同的細胞外基質之腫瘤相關抗原，因此大致上適用於存在於細胞外基質中之腫瘤相關抗原。該實例亦證明併入spFv之分子具有功能。
〔圖 1 〕顯示穩定化scFv (spFv)之例示性設計。VL及VH係藉由圖中顯示為虛線的可撓性連接子連接，該連接子含有釘合序列CPPC (SEQ ID NO: 1 )。「SS」指示介於連接子中之釘合序列與錨點之間的雙硫鍵。 〔圖 2 〕顯示呈VL-連接子-VH定向之spFv的錨點選擇圖解說明。圖形及例示性距離測量使用種系人類抗體(pdb id 5I19, GLk1)之Fv。虛線所示之距離(Å)係介於殘基的Cβ原子之間。選擇具有所欲距離之結構保守之架構位置作為用於突變成Cys的錨點。用於VL-連接子-VH定向之錨點係VL的Chothia位置42（圖中之K42）及VH的位置105（圖中之Q105）。亦顯示C端VL殘基(K107)及N端VH殘基(Q1)。 〔圖 3 〕顯示呈VH-連接子-VL定向之spFv的錨點選擇圖解說明。圖形及例示性距離測量使用種系人類抗體(pdb id 5I19, GLk1)之Fv。虛線所示之距離(Å)係介於殘基的Cβ原子之間。選擇具有所欲距離之結構保守之架構位置作為用於突變成Cys的錨點。用於VH-連接子-VL定向之錨點係VH的Chothia位置43（圖中之K43）及VL的位置100（圖中之Q100）。亦顯示C端VH殘基(S114)及N端VL殘基(D1)。 〔圖 4 〕的圖解說明顯示介於小鼠二個重鏈IgG2a (pdb id 1igt)鉸鏈CPPC (SEQ ID NO: 1 )的二個Cys殘基之間的Cβ(Cys1)-Cβ(Cys2)距離。圖中之該等距離係顯示為埃(Ångstrom)。 〔圖 5 〕的圖解說明顯示介於人類IgG (pdb id 5dk3)的二個重鏈鉸鏈CPPC (SEQ ID NO: 1 )的二個Cys殘基之間的Cβ(Cys1)-Cβ(Cys2)距離。圖中之該等距離係顯示為埃(Ångstrom)。 〔圖 6 〕顯示所選的VL錨點，其以灰色強調且在胺基酸排比之下編號為1及2。VL序列係根據Chothia編號方案編號。VL錨點1（Chothia位置42）係用於呈VL-連接子-VH定向之spFv且VL錨點2（Chothia位置100）係用於呈VH-連接子-VL定向之spFv。GLk1VL：SEQ ID NO: 56 ；GLk2VL：SEQ ID NO: 57 ；CAT2200VL：SEQ ID NO: 58 ；CAT2200bVL：SEQ ID NO: 59 。 〔圖 7 〕顯示所選的VH錨點，其以灰色強調且在胺基酸排比之下編號為1及2。VH序列係根據Chothia編號方案編號。VH錨點1（Chothia位置105）係用於呈VL-連接子-VH定向之spFv且VH錨點2（Chothia位置43）係用於呈VH-連接子-VL定向之spFv。GLk1VH：SEQ ID NO: 60 ；GLk2VH：SEQ ID NO: 61 ；CAT2200aVH：SEQ ID NO: 62 。 〔圖 8 〕顯示GLk1 spFv VL-VH之結構。介於VH與VL錨點之間的釘合序列及連接子的形成從結構上明顯可見。 〔圖 9 〕顯示GLk1 spFv VH-VL之結構。介於VH與VL錨點之間的釘合序列及連接子的形成從結構上明顯可見。 〔圖 10 〕顯示GLk2 spFv VH-VL之結構。介於VH與VL錨點之間的釘合序列及連接子的形成從結構上明顯可見。 〔圖 11 〕顯示CAT2200b spFv VH-VL之結構。介於VH與VL錨點之間的釘合序列及連接子的形成從結構上明顯可見。 〔圖 12 〕顯示未結合CAT2200b spFv VH-VL（上圖）與結合IL-17A之CAT2200a scFv VL-VH（下圖）的比較。 〔圖 13 〕顯示未結合CAT2200b spFv VH-VL（上圖）與結合IL-17A之CAT2200a spFv VL-VH（下圖）的結構前視圖比較。 〔圖 14 〕顯示未結合CAT2200b spFv VH-VL（上圖）與結合IL-17A之CAT2200a spFv VL-VH（下圖）的結構後視圖比較。 〔圖 15A 〕至 〔圖 15M 〕顯示抗體與經釘合scFv融合的示意圖。圖 15A 至圖15D 顯示2:1異二聚體，其中同型對照抗體與衍生自LTBRmAb1之經釘合scFv融合。圖 15E 至圖15H 顯示2:1異二聚體，其中EDBmAb1與衍生自LTBRmAb1之經釘合scFv融合。圖 15I 至圖15J 顯示2:1異二聚體，其中EDBmAb1與衍生自LTBRmAb1較低親和性變體之經釘合scFv融合。圖 15K 至圖15L 顯示2:1異二聚體，其中EDBmAb1或B21M與衍生自LTBRmAb1之經釘合scFv融合且Fc區不含蛋白質A突變。圖 15M 顯示2:1異二聚體，其中MSLNmAb1與衍生自LTBRmAb1之經釘合scFv融合。 〔圖 16A 〕至 〔圖 16C 〕的圖表顯示使用2:1雙特異性抗體進行A549 NF-κB報導子檢定的結果。圖 16A ： COVA1456及COVA1482、彼等之各別對照分子COVA1462及COVA1486、及重組人類LIGHT所致之TAA依賴性LTBR活化的比較；圖 16B ： COVA1482及含有LTBRmAb1較低親和性變體之雙特異性分子COVA14107及COVA14108、及COVA1486所致之TAA依賴性LTBR活化的比較；圖 16C ： COVA1482及COVA14133（不含蛋白質A突變之建構體）、及彼等之各別對照分子COVA1486及COVA14136所致之TAA依賴性LTBR活化的比較。 〔圖 17 〕顯示在共培養實驗後A375細胞上ICAM-1之流動式細胞測量術染色結果。COVA1482及其對照分子COVA1486係與重組人類LIGHT比較。 〔圖 18A 〕至 〔圖 18D 〕的圖表顯示經抗EDB/抗LTBR雙特異性抗體COVA14133處理相較於COVA14136及COVA1440之共培養的上清液細胞介素測量。使用MSD平台執行檢定。圖 18A ： 人類RANTES之濃度；圖 18B ： 人類IL-6之濃度；圖 18C ： 人類IL-8之濃度；圖 18D ： 人類MIP-3b之濃度。 〔圖 19A 〕至 〔圖 19B 〕顯示在A549 NF-κB報導子/CHOK1MSLN或A549 NF-κB報導子/H226共培養細胞檢定中MSLN/LTBR雙特異性分子所致之LTBR活化。圖 19A ：在A549 NF-κB報導子/H226共培養檢定中LTBR的活化。COVA14146 (2:1 MSLNmAb1 × LTBRmAb1)係與LIGHT及同型對照2:1建構體COVA1486比較；圖 19B ：在A549 NF-κB報導子/H226共培養檢定中LTBR活化後所分泌的RANTES之濃度。COVA14146 (2:1 MSLNmAb1 × LTBRmAb1)係與LIGHT及同型對照2:1建構體COVA1486比較。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090
Figure 12_A0101_SEQ_0091
Figure 12_A0101_SEQ_0092
Figure 12_A0101_SEQ_0093
Figure 12_A0101_SEQ_0094
Figure 12_A0101_SEQ_0095
Figure 12_A0101_SEQ_0096
Figure 12_A0101_SEQ_0097
Figure 12_A0101_SEQ_0098
Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102
Figure 12_A0101_SEQ_0103
Figure 12_A0101_SEQ_0104
Figure 12_A0101_SEQ_0105
Figure 12_A0101_SEQ_0106
Figure 12_A0101_SEQ_0107
Figure 12_A0101_SEQ_0108
Figure 12_A0101_SEQ_0109
Figure 12_A0101_SEQ_0110
Figure 12_A0101_SEQ_0111
Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 12_A0101_SEQ_0119
Figure 12_A0101_SEQ_0120
Figure 12_A0101_SEQ_0121
Figure 12_A0101_SEQ_0122
Figure 12_A0101_SEQ_0123
Figure 12_A0101_SEQ_0124
Figure 12_A0101_SEQ_0125
Figure 12_A0101_SEQ_0126
Figure 12_A0101_SEQ_0127
Figure 12_A0101_SEQ_0128
Figure 12_A0101_SEQ_0129
Figure 12_A0101_SEQ_0130
Figure 12_A0101_SEQ_0131
Figure 12_A0101_SEQ_0132
Figure 12_A0101_SEQ_0133
Figure 12_A0101_SEQ_0134
Figure 12_A0101_SEQ_0135
Figure 12_A0101_SEQ_0136
Figure 12_A0101_SEQ_0137
Figure 12_A0101_SEQ_0138
Figure 12_A0101_SEQ_0139
Figure 12_A0101_SEQ_0140
Figure 12_A0101_SEQ_0141
Figure 12_A0101_SEQ_0142
Figure 12_A0101_SEQ_0143
Figure 12_A0101_SEQ_0144
Figure 12_A0101_SEQ_0145
Figure 12_A0101_SEQ_0146
Figure 12_A0101_SEQ_0147
Figure 12_A0101_SEQ_0148
Figure 12_A0101_SEQ_0149
Figure 12_A0101_SEQ_0150
Figure 12_A0101_SEQ_0151
Figure 12_A0101_SEQ_0152
Figure 12_A0101_SEQ_0153
Figure 12_A0101_SEQ_0154
Figure 12_A0101_SEQ_0155
Figure 12_A0101_SEQ_0156
Figure 12_A0101_SEQ_0157
Figure 12_A0101_SEQ_0158
Figure 12_A0101_SEQ_0159
Figure 12_A0101_SEQ_0160
Figure 12_A0101_SEQ_0161
Figure 12_A0101_SEQ_0162
Figure 12_A0101_SEQ_0163
Figure 12_A0101_SEQ_0164
Figure 12_A0101_SEQ_0165
Figure 12_A0101_SEQ_0166
Figure 12_A0101_SEQ_0167
Figure 12_A0101_SEQ_0168
Figure 12_A0101_SEQ_0169
Figure 12_A0101_SEQ_0170
Figure 12_A0101_SEQ_0171
Figure 12_A0101_SEQ_0172
Figure 12_A0101_SEQ_0173
Figure 12_A0101_SEQ_0174
Figure 12_A0101_SEQ_0175
Figure 12_A0101_SEQ_0176
Figure 12_A0101_SEQ_0177

Claims (127)

  1. 一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含： a)  在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c)  在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  2. 一種經單離的scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之VH Cys且該L包含第一L Cys； b) 該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之VL Cys且該L包含第二L Cys；或 c)  該VH包含在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置之該VH Cys，該VL包含在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置之該VL Cys且該L包含該第一L Cys及該第二L Cys，其中該VH Cys及該第一L Cys能夠形成雙硫鍵且該VL Cys及該第二L Cys能夠形成雙硫鍵。
  3. 如請求項1或2之scFv，其中該VH Cys與該VL Cys之間的距離係約7 Å至約9 Å。
  4. 如請求項1至3中任一項之scFv，其中該VH Cys係在H3、H5、H40、H43、H46或H105，其中殘基編號係根據Chothia。
  5. 如請求項1至4中任一項之scFv，其中該VL Cys係在L3、L5、L39、L42、L45、L100或L102，其中殘基編號係根據Chothia。
  6. 如請求項1至5中任一項之scFv，其中 a)  該VH Cys係在H105且該VL Cys係在L42； b) 該VH Cys係在H43且該VL Cys係在L100； c)  該VH Cys係在H3且該VL Cys係在L3； d) 該VH Cys係在H3且該VL Cys係在L5； e)  該VH Cys係在H3且該VL Cys係在L39； f)  該VH Cys係在H3且該VL Cys係在L42； g) 該VH Cys係在H3且該VL Cys係在L45； h) 該VH Cys係在H3且該VL Cys係在L100； i)  該VH Cys係在H3且該VL Cys係在L102； j)  該VH Cys係在H5且該VL Cys係在L3； k) 該VH Cys係在H5且該VL Cys係在L5； l)  該VH Cys係在H5且該VL Cys係在L39； m) 該VH Cys係在H5且該VL Cys係在L42； n) 該VH Cys係在H5且該VL Cys係在L45； o) 該VH Cys係在H5且該VL Cys係在L100； p) 該VH Cys係在H5且該VL Cys係在L102； q) 該VH Cys係在H40且該VL Cys係在L3； r)  該VH Cys係在H40且該VL Cys係在L5； s)  該VH Cys係在H40且該VL Cys係在L39； t)  該VH Cys係在H40且該VL Cys係在L42； u) 該VH Cys係在H40且該VL Cys係在L45； v) 該VH Cys係在H40且該VL Cys係在L100； w) 該VH Cys係在H40且該VL Cys係在L102； x) 該VH Cys係在H43且該VL Cys係在L3； y) 該VH Cys係在H43且該VL Cys係在L5； z)  該VH Cys係在H43且該VL Cys係在L39； aa) 該VH Cys係在H43且該VL Cys係在L42； bb) 該VH Cys係在H43且該VL Cys係在L45； cc) 該VH Cys係在H43且該VL Cys係在L102； dd) 該VH Cys係在H46且該VL Cys係在L3； ee) 該VH Cys係在H46且該VL Cys係在L5； ff) 該VH Cys係在H46且該VL Cys係在L39； gg) 該VH Cys係在H46且該VL Cys係在L42； hh) 該VH Cys係在H46且該VL Cys係在L45； ii) 該VH Cys係在H46且該VL Cys係在L100； jj) 該VH Cys係在H46且該VL Cys係在L102； kk) 該VH Cys係在H105且該VL Cys係在L3； ll) 該VH Cys係在H105且該VL Cys係在L5； mm) 該VH Cys係在H105且該VL Cys係在L39； nn) 該VH Cys係在H105且該VL Cys係在L45； oo) 該VH Cys係在H105且該VL Cys係在L100；或 pp) 該VH Cys係在H105且該VL Cys係在L102，其中殘基編號係根據Chothia。
  7. 如請求項1至6中任一項之scFv，其中該L包含衍生自免疫球蛋白(Ig)鉸鏈區之毗連胺基酸序列。
  8. 如請求項7之scFv，其中該Ig鉸鏈區係衍生自人類或非人類Ig鉸鏈區。
  9. 如請求項8之scFv，其中該Ig鉸鏈區係衍生自該人類Ig鉸鏈區。
  10. 如請求項9之scFv，其中該人類Ig鉸鏈區係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
  11. 如請求項1至10中任一項之scFv，其中該L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 23 )，其中X係甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)、脯胺酸(Pro)、丙胺酸(Ala)、精胺酸(Arg)、天冬醯胺酸(Asn)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺酸(Gln)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、離胺酸(Lys)、苯丙胺酸(Phe)、蘇胺酸(Thr)、色胺酸(Trp)、或酪胺酸(Tyr)，且y係1至3之整數。
  12. 如請求項11之scFv，其中該L包含胺基酸序列C(X)y C (SEQ ID NO: 24 )，其中X係Gly、Ser、或Pro，且y係1至3之整數。
  13. 如請求項1至12中任一項之scFv，其中該L包含胺基酸序列CPC、CGC、CSC、CPPC (SEQ ID NO: 1)、CGPC (SEQ ID NO: 28)、CPGC (SEQ ID NO: 29)、CGGC (SEQ ID NO: 30)、CSPG (SEQ ID NO: 31)、CPSC (SEQ ID NO: 32)、CSSC (SEQ ID NO: 33)、CGSC (SEQ ID NO: 34)、CSGC (SEQ ID NO: 35)、CPPPC (SEQ ID NO: 36)、CGPPC (SEQ ID NO: 37)、CPGPC (SEQ ID NO: 38)、CPPGC (SEQ ID NO: 39)、CGGPC (SEQ ID NO: 40)、CPGGC (SEQ ID NO: 41)、CGGGC (SEQ ID NO: 42)、CSPPC (SEQ ID NO: 43)、CPSPC (SEQ ID NO: 44)、CPPSC (SEQ ID NO: 45)、CSSPC (SEQ ID NO: 46)、CPSSC (SEQ ID NO: 47)、CSSSC (SEQ ID NO: 48)、CGSPC (SEQ ID NO: 49)、CPGSC (SEQ ID NO: 50)、CSGPC (SEQ ID NO: 51)、或CPSGC (SEQ ID NO: 52)。
  14. 如請求項1至13中任一項之scFv，其中該L包含約14至約19個胺基酸，諸如約14、約15、約16、約17、約18、或約19個胺基酸。
  15. 如請求項1至14中任一項之scFv，其中該L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO:25 )；其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、leu、Lys、Phe、Thr、Trp、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
  16. 如請求項15之scFv，其中該L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO:26 )；其中X係Gly、Ser、Pro、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Thr、或Tyr，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
  17. 如請求項16之scFv，其中該L包含胺基酸序列(X)m C(X)y C(X)n (SEQ ID NO:27 )；其中X係Gly或Pro，m係6至9之整數，y係1至3之整數，且n係4至6之整數。
  18. 如請求項1至17中任一項之scFv，其中該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項之scFv，其中該scFv係呈VL-L-VH定向。
  20. 如請求項1至18中任一項之scFv，其中該scFv係呈VH-L-VL定向。
  21. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H105之Cys； b) 該VL包含在L42之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  22. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H105之Cys； b) 該VL包含在L45之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  23. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H105之Cys； b) 該VL包含在L39之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  24. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H5之Cys； b) 該VL包含在L42之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  25. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H5之Cys； b) 該VL包含在L45之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  26. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H5之Cys； b) 該VL包含在L39之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  27. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H3之Cys； b) 該VL包含在L42之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  28. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H3之Cys； b) 該VL包含在L45之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  29. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H3之Cys； b) 該VL包含在L39之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VL-L-VH定向。
  30. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H43之Cys； b) 該VL包含在L100之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  31. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H43之Cys； b) 該VL包含在L102之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  32. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H43之Cys； b) 該VL包含在L5之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  33. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H43之Cys； b) 該VL包含在L3之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  34. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H40之Cys； b) 該VL包含在L100之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  35. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H40之Cys； b) 該VL包含在L102之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  36. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H40之Cys； b) 該VL包含在L5之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  37. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H40之Cys； b) 該VL包含在L3之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  38. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H46之Cys； b) 該VL包含在L100之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  39. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H46之Cys； b) 該VL包含在L102之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  40. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H46之Cys； b) 該VL包含在L5之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  41. 一種scFv，其包含VH、L、及VL，其中 a)  該VH包含在H46之Cys； b) 該VL包含在L3之Cys； c)  該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 d) 該scFv係呈VH-L-VL定向。
  42. 如請求項21至41中任一項之scFv，其中該L包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
  43. 如請求項21至41中任一項之scFv，其中該L包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。
  44. 如請求項21至41中任一項之scFv，其中該L包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
  45. 如請求項1至44中任一項之scFv，其中該scFv係與第二分子偶聯。
  46. 如請求項45之scFv，其中該第二分子係半衰期延長部份。
  47. 如請求項46之scFv，其中該半衰期延長部份係免疫球蛋白(Ig)、該Ig之片段、Ig恆定區、該Ig恆定區之片段、Fc區、轉鐵蛋白、白蛋白、白蛋白結合域、或聚乙二醇。
  48. 如請求項45之scFv，其中該第二分子係細胞毒性劑或可偵測標記。
  49. 如請求項48之scFv，其中該第二分子係抗體或其片段。
  50. 如請求項49之scFv，其中該scFv及該抗體或其片段與不同抗原結合。
  51. 如請求項45之scFv，其中該第二分子係嵌合抗原受體(CAR)。
  52. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至51中任一項之scFv及醫藥上可接受之載劑。
  53. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至44中任一項之scFv。
  54. 一種載體，其包含如請求項53之多核苷酸。
  55. 一種宿主細胞，其包含如請求項54之載體。
  56. 一種產生如請求項1至44中任一項之scFv的方法，其包含在使該scFv產生之條件下培養如請求項55之宿主細胞、及純化該scFv。
  57. 如請求項56之方法，其中該宿主細胞係原核細胞。
  58. 如請求項56之方法，其中該宿主細胞係真核細胞。
  59. 一種抗獨特型抗體，其與如請求項1至44中任一項之scFv結合。
  60. 一種套組，其包含如請求項1至44中任一項之scFv。
  61. 一種多特異性分子，其包含如請求項1至44中任一項之scFv。
  62. 如請求項61之多特異性分子，其中該多特異性分子包含抗體或抗體片段。
  63. 如請求項61之多特異性分子，其中該多特異性蛋白質包含Ig恆定區或該Ig恆定區之片段。
  64. 如請求項63之多特異性蛋白質，其中該Ig恆定區之該片段包含Fc區。
  65. 如請求項63之多特異性分子，其中該Ig恆定區之該片段包含CH2域。
  66. 如請求項63之多特異性分子，其中該Ig恆定區之該片段包含CH3域。
  67. 如請求項63之多特異性分子，其中該Ig恆定區之該片段包含該CH2域及該CH3域。
  68. 如請求項63之多特異性分子，其中該Ig恆定區之該片段包含鉸鏈的至少一部分、該CH2域及該CH3域。
  69. 如請求項63之多特異性分子，其中該Ig恆定區之該片段包含該鉸鏈、該CH2域及該CH3域。
  70. 如請求項63至69中任一項之多特異性分子，其中該scFv係與該Ig恆定區之N端或與該Ig恆定區之該片段的N端偶聯。
  71. 如請求項63至69中任一項之多特異性分子，其中該scFv係與該Ig恆定區之C端或與該Ig恆定區之該片段的N端偶聯。
  72. 如請求項63至71中任一項之多特異性分子，其中該Ig恆定區或該Ig恆定區之該片段係IgG1、IgG2、及IgG3、或IgG4同型。
  73. 如請求項63至72中任一項之多特異性分子，其中該Ig恆定區或該Ig恆定區之該片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性分子與FcγR之結合減少。
  74. 如請求項73之多特異性分子，其中導致該多特異性分子與FcγR之結合減少的該至少一個突變係選自由下列所組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-刪除/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S及S228P/F234A/L235A/G236-刪除/G237A/P238S，其中殘基編號係根據EU索引。
  75. 如請求項63至72中任一項之多特異性分子，其中該Ig恆定區或該Ig恆定區之該片段包含至少一個突變，該突變導致該多特異性分子與FcγR之結合增強。
  76. 如請求項75之多特異性分子，其中導致該多特異性分子與FcγR之結合增強之該至少一個突變係選自由下列所組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、及G236A/S239D/I332E，其中殘基編號係根據EU索引。
  77. 如請求項73至76中任一項之多特異性分子，其中FcγR係FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、或FcγRIII、或彼等之任何組合。
  78. 如請求項63至72中任一項之多特異性分子，其中該Ig恆定區或該Ig恆定區之片段包含至少一個突變，該突變調節該多特異性分子之半衰期。
  79. 如請求項78之多特異性分子，其中調節該多特異性分子之半衰期之該至少一個突變係選自由下列所組成之群組：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及H435R，其中殘基編號係根據EU索引。
  80. 如請求項63至72中任一項之多特異性分子，其中該Ig恆定區或該Ig恆定區之片段在該CH3域中包含至少一個突變。
  81. 如請求項80之多特異性分子，其中在該CH3域中之該至少一個突變係選自由下列所組成之群組：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V、及T350V/T366L/K392L/T394W，其中殘基編號係根據EU索引。
  82. 如請求項61至81中任一項之多特異性分子，其中該多特異性分子係雙特異性。
  83. 如請求項61至81中任一項之多特異性分子，其中該多特異性分子係三特異性。
  84. 如請求項61至81中任一項之多特異性分子，其中該多特異性分子係四特異性。
  85. 一種醫藥組成物，其包含如請求項61至84中任一項之多特異性分子及醫藥上可接受之載劑。
  86. 一種異源性分子，其包含如請求項1至44中任一項之scFv。
  87. 如請求項86之異源性分子，其中該scFv係與第二蛋白質、多核苷酸、治療劑、細胞毒性劑、或可偵測標記偶聯。
  88. 如請求項87之異源性分子，其中該第二蛋白質係抗體或其片段。
  89. 如請求項87之異源性分子，其中該第二蛋白質係替代支架。
  90. 如請求項87之異源性分子，其中該第二蛋白質係嵌合抗原受體(CAR)或其片段。
  91. 如請求項86至90中任一項之異源性分子，其中該異源性分子係單特異性。
  92. 如請求項86至90中任一項之異源性分子，其中該異源性分子係多特異性。
  93. 如請求項92之異源性分子，其中該異源性分子係雙特異性。
  94. 如請求項92之異源性分子，其中該異源性分子係三特異性。
  95. 如請求項92之異源性分子，其中該異源性分子係四特異性。
  96. 一種醫藥組成物，其包含如請求項86至95中任一項之異源性分子及醫藥上可接受之載劑。
  97. 一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合域的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)； 提供包含或經工程改造以包含第一L Cys之連接子(L)； 工程改造該VH以在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置包含VH Cys；及 形成在該VH Cys與該第一L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
  98. 一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合域的VH及VL； 提供包含或經工程改造以包含第二L Cys之L； 工程改造該VL以在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置包含VL Cys；及 形成在該VL Cys與該第二L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
  99. 一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： 提供形成抗原結合域的VH及VL； 提供包含或經工程改造以包含第一L Cys及第二L Cys之L； 工程改造該VH以在結構保守之表面暴露VH架構殘基位置包含VH Cys； 工程改造該VL以在結構保守之表面暴露VL架構殘基位置包含VL Cys；及 形成在該VH Cys與該第一L Cys之間的雙硫鍵及在該VL Cys與該第二L Cys之間的雙硫鍵以製備該穩定化scFv。
  100. 如請求項97至99中任一項之過程，其中該穩定化scFv係如請求項1至44中任一項之scFv。
  101. 如請求項97至100中任一項之過程，其中當相較於不具有該雙硫鍵之對照scFv時，該穩定化scFv以可相比之親和性與抗原結合。
  102. 一種用於製備穩定化scFv之過程，其包含： a)  提供編碼VH、L、及VL之多核苷酸，其中 i.          該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L42之Cys； ii.         該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L100之Cys； iii.        該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L3之Cys； iv.        該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L5之Cys； v.         該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L39之Cys； vi.        該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L42之Cys； vii.       該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L45之Cys； viii.      該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L100之Cys； ix.        該VH包含在H3之Cys且該VL包含在L102之Cys； x.         該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L3之Cys； xi.        該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L5之Cys； xii.       該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L39之Cys； xiii.      該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L42之Cys； xiv.       該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L45之Cys； xv.        該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L100之Cys； xvi.      該VH包含在H5之Cys且該VL包含在L102之Cys； xvii.     該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L3之Cys； xviii.    該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L5之Cys； xix.      該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L39之Cys； xx.       該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L42之Cys； xxi.      該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L45之Cys； xxii.     該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L100之Cys； xxiii.    該VH包含在H40之Cys且該VL包含在L102之Cys； xxiv.     該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L3之Cys； xxv.      該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L5之Cys； xxvi.     該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L39之Cys； xxvii.    該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L42之Cys； xxviii.   該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L45之Cys； xxix.     該VH包含在H43之Cys且該VL包含在L102之Cys； xxx.      該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L3之Cys； xxxi.     該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L5之Cys； xxxii.    該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L39之Cys； xxxiii.   該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L42之Cys； xxxiv.   該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L45之Cys； xxxv.    該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L100之Cys； xxxvi.   該VH包含在H46之Cys且該VL包含在L102之Cys； xxxvii.  該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L3之Cys； xxxviii. 該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L5之Cys； xxxix.   該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L39之Cys； xl.        該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L45之Cys； xli.       該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L100之Cys；或 xlii.      該VH包含在H105之Cys且該VL包含在L102之Cys， 其中殘基編號係根據Chothia； b) 該L包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7之胺基酸序列；及 c)  在宿主細胞中表現該多核苷酸以產生該穩定化scFv。
  103. 如請求項102之方法，其中該宿主細胞係原核細胞。
  104. 如請求項102之方法，其中該宿主細胞係真核細胞。
  105. 一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含重鏈可變區(VH)、用於連接之構件(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含： a) 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  106. 一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含用於抗原結合之構件、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 a) 在結構保守之表面暴露抗原結合構件半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  107. 一種經單離的單鏈可變片段(scFv)，其包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及用於抗原結合之構件，其中該scFv包含 a) 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  108. 一種多特異性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、用於連接之構件(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 a) 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  109. 一種多特異性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含用於抗原結合之構件、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 a) 在結構保守之表面暴露抗原結合構件半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  110. 一種多特異性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及用於抗原結合之構件(VL)，其中該scFv包含 a) 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  111. 一種異源性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、用於連接之構件(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 a) 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  112. 一種異源性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含用於抗原結合之構件、連接子(L)、及輕鏈可變區(VL)，其中該scFv包含 a) 在結構保守之表面暴露抗原結合構件半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露VL Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露VL Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  113. 一種異源性分子，其包含單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變區(VH)、連接子(L)、及用於抗原結合之構件，其中該scFv包含 a) 在結構保守之表面暴露VH半胱胺酸(Cys)與第一L Cys之間的第一雙硫鍵； b) 在結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與第二L Cys之間的第二雙硫鍵；或 c) 在該結構保守之表面暴露VH Cys與該第一L Cys之間的該第一雙硫鍵及在該結構保守之表面暴露抗原結合構件Cys與該第二L Cys之間的該第二雙硫鍵。
  114. 一種用於編碼如請求項105至113中任一項之scFv之構件。
  115. 一種用於複製如請求項114之載體之構件。
  116. 一種組成物，其包含用於穩定scFv之構件。
  117. 一種組成物，其包含用於增加scFv的熱穩定性之構件。
  118. 如請求項116或117之組成物，其中該構件包括形成在VH與L之間、在VL與該L之間、或在該VH與該L之間及在該VL與該L之間的雙硫鍵。
  119. 一種多特異性分子，其包含用於穩定scFv之構件。
  120. 一種多特異性分子，其包含用於增加scFv的熱穩定性之構件。
  121. 如請求項119或120之多特異性分子，其中該構件包括形成在VH與L之間、在VL與該L之間、或在該VH與該L之間及在該VL與該L之間的雙硫鍵。
  122. 一種異源性分子，其包含用於穩定scFv之構件。
  123. 一種異源性分子，其包含用於增加scFv的熱穩定性之構件。
  124. 如請求項122或123之異源性分子，其中該構件包括形成在VH與L之間、在VL與該L之間、或在該VH與該L之間及在該VL與該L之間的雙硫鍵。
  125. 一種用於產生如請求項116至118中任一項之組成物之構件。
  126. 一種用於產生如請求項119至121中任一項之多特異性分子之構件。
  127. 一種用於產生如請求項122至124中任一項之異源性分子之構件。
TW109127754A 2019-08-15 2020-08-14 用於經改善的單鏈可變片段之材料及方法 TW202120537A (zh)

Applications Claiming Priority (20)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962887527P 2019-08-15 2019-08-15
US201962887514P 2019-08-15 2019-08-15
US201962887529P 2019-08-15 2019-08-15
US201962887519P 2019-08-15 2019-08-15
US201962887524P 2019-08-15 2019-08-15
US62/887,514 2019-08-15
US62/887,527 2019-08-15
US62/887,519 2019-08-15
US62/887,529 2019-08-15
US62/887,524 2019-08-15
US201962946882P 2019-12-11 2019-12-11
US201962946897P 2019-12-11 2019-12-11
US201962946877P 2019-12-11 2019-12-11
US201962946865P 2019-12-11 2019-12-11
US201962946886P 2019-12-11 2019-12-11
US62/946,877 2019-12-11
US62/946,882 2019-12-11
US62/946,865 2019-12-11
US62/946,897 2019-12-11
US62/946,886 2019-12-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202120537A true TW202120537A (zh) 2021-06-01

Family

ID=72243247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109127754A TW202120537A (zh) 2019-08-15 2020-08-14 用於經改善的單鏈可變片段之材料及方法

Country Status (18)

Country Link
US (2) US11787875B2 (zh)
EP (1) EP4013783A1 (zh)
JP (1) JP2022544760A (zh)
KR (1) KR20220062494A (zh)
CN (1) CN114258400A (zh)
AU (1) AU2020328049A1 (zh)
BR (1) BR112022002540A2 (zh)
CA (1) CA3148121A1 (zh)
CO (1) CO2022001222A2 (zh)
CR (1) CR20220054A (zh)
DO (1) DOP2022000032A (zh)
EC (1) ECSP22011199A (zh)
IL (1) IL290436A (zh)
JO (1) JOP20220035A1 (zh)
MX (1) MX2022001799A (zh)
PE (1) PE20220299A1 (zh)
TW (1) TW202120537A (zh)
WO (1) WO2021030657A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115087670A (zh) * 2019-12-11 2022-09-20 西拉格国际有限责任公司 包含ltbr和edb结合结构域的多特异性结合分子及其用途
WO2023089587A1 (en) * 2021-11-22 2023-05-25 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising enhanced multispecific binding agents for an immune response
WO2023152581A1 (en) 2022-02-09 2023-08-17 Janssen Biotech, Inc. Method of treating cancer with psmaxcd3 antibody
WO2023164510A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-psma antibodies
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
EP1999154B1 (en) 2006-03-24 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered heterodimeric protein domains
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
AU2008234615B2 (en) 2007-04-02 2013-10-10 Philogen S.P.A. The ED-A antigen of fibrinogen is associated with the neovasculature of tumour metastases
WO2009085462A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Design and generation of human de novo pix phage display libraries via fusion to pix or pvii, vectors, antibodies and methods
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2304033B1 (en) * 2008-06-30 2016-09-07 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC Functionalized polypeptides
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
PL2975051T3 (pl) 2009-06-26 2021-09-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Wyizolowane z łatwością dwuswoiste przeciwciała o formacie natywnej immunoglobuliny
JP5764127B2 (ja) 2009-08-17 2015-08-12 ロシュ グリクアート アーゲー 標的化イムノコンジュゲート
ES2667258T3 (es) * 2009-09-10 2018-05-10 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos multivalentes
SG181814A1 (en) * 2009-12-23 2012-07-30 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them 2
SG184427A1 (en) 2010-04-20 2012-11-29 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
TWI743461B (zh) * 2011-03-28 2021-10-21 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
LT2771364T (lt) 2011-10-27 2019-09-10 Genmab A/S Heterodimerinių baltymų gamyba
PL2773671T3 (pl) 2011-11-04 2022-01-24 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerycznego z mutacjami w domenie fc
PT2794905T (pt) 2011-12-20 2020-06-30 Medimmune Llc Polipéptidos modificados para estrutura de anticorpos bispecíficos
NZ630551A (en) 2012-04-20 2017-11-24 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
JP5550797B2 (ja) 2012-05-24 2014-07-16 パナソニック株式会社 ヒト心筋由来トロポニンｉに特異的にかつ速やかに結合できる変異体タンパク質
CA2907140A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods to control c-terminal lysine, galactose and sialic acid content in recombinant proteins
ES2897217T3 (es) 2016-09-30 2022-02-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos frente a p95HER2
US20190092818A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Kite Pharma, Inc. Chimeric polypeptides and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20210047435A1 (en) 2021-02-18
EP4013783A1 (en) 2022-06-22
CA3148121A1 (en) 2021-02-18
CR20220054A (es) 2022-06-06
WO2021030657A1 (en) 2021-02-18
PE20220299A1 (es) 2022-03-07
CN114258400A (zh) 2022-03-29
CO2022001222A2 (es) 2022-03-08
KR20220062494A (ko) 2022-05-17
JOP20220035A1 (ar) 2023-01-30
US20240067754A1 (en) 2024-02-29
JP2022544760A (ja) 2022-10-21
DOP2022000032A (es) 2022-07-31
AU2020328049A1 (en) 2022-02-17
BR112022002540A2 (pt) 2022-06-14
IL290436A (en) 2022-04-01
ECSP22011199A (es) 2022-03-31
US11787875B2 (en) 2023-10-17
MX2022001799A (es) 2022-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11787875B2 (en) Materials and methods for improved single chain variable fragments
TW202118788A (zh) 包含血管舒緩素相關肽酶2抗原結合域之蛋白質及其用途
US11827708B2 (en) Proteins comprising HLA-G antigen binding domains and their uses
TW202146449A (zh) 用於體內生物靶向之材料及方法
US20230040715A1 (en) Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
TW202210510A (zh) 包含ｃｄ３抗原結合域之蛋白質及其用途
TW202144418A (zh) 唾液酸結合Ｉｇ樣凝集素結合的材料及方法
US20240025992A1 (en) Proteins comprising delta-like ligand 3 (dll3) antigen binding domains and their uses
US20220306738A1 (en) Antibody targeting cd22 and cd79b
WO2023089587A1 (en) Compositions comprising enhanced multispecific binding agents for an immune response
TW202302648A (zh) Cd79b抗體於自體免疫治療應用之用途
CA3229822A1 (en) Cd33 x v?2 multispecific antibodies for the treatment of cancer
US20240158499A1 (en) Uses of cd79b antibodies for autoimmune therapeutic applications
WO2023046322A1 (en) Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof
CN117999286A (zh) 用于治疗癌症的CD33 x Vδ2多特异性抗体