TW202120528A - 用於重塑抗體醣型之融合蛋白 - Google Patents

用於重塑抗體醣型之融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本揭示內容提供融合蛋白，其包含與內切醣苷酶或其截短片段或突變體之N-末端或C-末端融合之岩藻醣苷酶或其截短片段或突變體。本揭示內容亦提供表現該融合蛋白之核酸分子及用於重塑抗體Fc區之聚醣的方法。

Description

用於重塑抗體醣型之融合蛋白
本發明係關於醣型重塑；特定地，係關於用於重塑抗體醣型之融合蛋白。
抗體(亦稱為免疫球蛋白(Ig))係在免疫反應中發揮主要作用之醣蛋白。IgG抗體及IgG抗體之片段已開發為用於治療各種各樣疾病之重要生物療法。天然抗體之恆定(Fc)區通常N-醣基化。特定醣基化(即，醣型)顯著影響Fc效應物功能及抗體之穩定性。因此，改良抗體之治療效能之一種途徑係改質Fc區中之醣型。
Fc醣型通常包括核心岩藻醣殘基。在癌症療法之情形中，已報導在Fc區中具有醣型且具有較低核心岩藻醣含量之抗腫瘤抗體對NK細胞上之CD16 (FcγRIIIA)展示較高結合親和性。較高親和性導致對抗腫瘤細胞之抗體依賴性細胞毒性之經改良誘導。
為產生具有低含量核心岩藻醣之抗體，已開發多種策略。舉例而言，可將核心岩藻醣添加所需之岩藻醣基轉移酶的抑制劑添加至用於生長抗體產生細胞之培養基。在另一實例中，抗體產生細胞可經遺傳工程化以缺失岩藻醣基轉移酶活性。
在不同策略中，可在活體外使用純化酶以直接以可預測方式改良抗體醣型。此策略之一個優點係可產生抗體且然後經改良以具有明確定義之低核心岩藻醣Fc醣型以及期望之生物性質。此將有助於使用高產量之非哺乳動物表現系統代替通常用於確保適當核心糖基化之哺乳動物表現系統來產生抗體。US 20190185898提供岩藻醣苷酶突變體，該等突變體作為岩藻醣連接酶用於一系列生物醣肽及醣蛋白(包括完整的治療性抗體)之核心岩藻醣基化。
然而，現有岩藻醣苷酶在自Fc區裂解核心岩藻醣方面效率低下。業內需要開發可有效且可預測地重塑抗體醣型之酶。
融合蛋白提供於本揭示內容中。融合蛋白中多種酶之組裝促進酶之協同作用，並展現可預測地重塑抗體醣型之有利作用。
在一態樣中，本揭示內容提供融合蛋白，其包含與內切醣苷酶或其截短片段或突變體之N-末端或C-末端融合之岩藻醣苷酶或其截短片段或突變體；其中該融合蛋白展現岩藻醣苷酶活性及內切醣苷酶活性二者。
岩藻醣苷酶之某些實施例包括(但不限於)酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei ) α-L岩藻醣苷酶C (Alfc)、脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis )岩藻醣苷酶(BF3242)、多形類桿菌(Bacteroides thetaiotamicron ) α-L-岩藻醣苷酶(BT2970)、寡養菌保所桿菌(Emticicia oligotrophica ) α-L-岩藻醣苷酶(EO0918)及米爾伊麗莎白菌(Elizabethkingia miricola ) α-(1-6)岩藻醣苷酶(Emfuc3)、或其片段或其突變體。在一些實施例中，岩藻醣苷酶係酪蛋白乳酸桿菌α-L岩藻醣苷酶C、米爾伊麗莎白菌α-(1-6)岩藻醣苷酶(Emfuc3)、或其截短片段或突變體。
內切醣苷酶之某些實施例包括(但不限於)釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2或其片段或其突變體。特定地，內切醣苷酶係釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2 或其截短片段或突變體。
在一個實施例中，岩藻醣苷酶或內切醣苷酶係截短片段。內切醣苷酶之截短片段係其IgG結合結構域。在一些實施例中，內切醣苷酶之截短片段係釀膿鏈球菌內切醣苷酶S或釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2之IgG結合結構域。
在一個實施例中，岩藻醣苷酶或內切醣苷酶係突變體多肽。特定地，內切醣苷酶突變體係在胺基酸位置-D233處具有突變、較佳-D233Q之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S。在一些實施例中，內切醣苷酶突變體係在胺基酸位置T138、D182、D184、D186、D226或T227處具有突變；較佳具有T138E、T138M、T138Q、T138R、T138L、T138H、T138N、T138K、D182Q、D184M、D184Q、D184T、D184L、D184F、D184S、D184V、D184K、D184W、E186A、D226Q或T227Q之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
融合蛋白之某些實施例包括(但不限於)與以下各項融合之酪蛋白乳酸桿菌α-L岩藻醣苷酶C：釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S之IgG結合結構域、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2之IgG結合結構域、在胺基酸位置D233處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、在胺基酸位置T138處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D182處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D184處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D186處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D226處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2或在胺基酸位置T227處具有突變釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
特定地，融合蛋白包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、及204或其實質上類似之序列。較佳地，融合蛋白具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202及204或其實質上類似之序列。
在另一態樣中，本揭示內容提供表現本文所述融合蛋白之核酸分子。核酸之某些實施例包括(但不限於) SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201及203或其實質上相同之序列。在一些其他實施例中，核酸具有選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201及203或其實質上相同之序列。
在另一態樣中，本揭示內容提供包含本發明核酸之載體。本揭示內容亦提供包含載體之宿主細胞。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於重塑抗體之Fc區之聚醣之方法，其包含以下步驟：獲得在抗體之Fc區具有異質聚醣之抗體及使該抗體與本文所述之融合蛋白接觸。特定地，方法包含提供在其Fc區中具有異質聚醣之抗體、本文所述之融合蛋白及目標聚醣噁唑啉，其中抗體Fc區之聚醣包含N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基；及使抗體與融合蛋白接觸並將目標聚醣噁唑啉連結至該抗體Fc區；藉此可獲得抗體Fc區之重塑聚醣。
在本發明之一個實施例中，方法進一步包含純化在Fc區中具有重塑聚醣之抗體。
本揭示內容詳細闡述於以下部分中。本揭示內容之其他特徵、目的及優點可在詳細說明及申請專利範圍中發現。
所有IgG之Fc結構域均具有保守N-醣基化位點，二天線複合物型聚醣通常連接至該位點，但末端及核心改質導致顯著結構異質性。人類抗體之某些醣型展現經改良治療效應，而其他醣型具有不期望之性質。因此，控制醣基化過程之能力對於獲得包含期望醣型之抗體以改良其治療效能起到至關重要的作用。本揭示內容提供融合蛋白，其包含複數種用於重塑抗體醣型之酶，隨後可生成具有適於在哺乳動物中治療使用之醣基化模式之醣肽。
除非另外指示，否則本發明實踐將採用熟習此項技術者熟知之分子生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習用技術。該等技術充分闡釋於文獻中。參見例如Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第2版，由Sambrook、Fritsch及Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；DNA Cloning, 第I及II卷(D. N. Glover編輯, 1985)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；論文Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及M. P. Calos編輯, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, 第154及155卷(Wu等人編輯), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及Walker編輯, Academic Press, London, 1987)；Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow及Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)；及Handbook Of Experimental Immunology, 第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯, 1986)。
定義
藉由參考本揭示內容之各實施例之以下詳細描述、實例以及附圖及表格及其相關描述可更易於理解本揭示內容。應理解，除非由申請專利範圍另有明確說明，否則本揭示內容並不限於特定製備方法、載體或調配物，或將本揭示內容之提取物調配成意欲用於局部、經口或非經腸投與之產品或組合物之特定方式，此乃因熟習此項技術者很清楚，該等事情當然可以有所變化。亦應理解，本文中所使用之術語僅出於闡述特定實施例之目的且不意欲為限制性的。
如根據本揭示內容所用，除非另外指示，否則以下術語應理解為具有以下含義。
必須注意，除非上下文另有明確說明，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。
如本文所用，術語「可選的」或「視情况」意指隨後闡述之事件或情形可發生或可不發生，且該說明包括其中該事件或情形發生之示例及其中該事件或情形不發生之示例。舉例而言，片語「視情况包含藥劑」意指該藥劑可存在或可不存在。
如本文所用，術語「聚醣」係指多醣或寡醣。聚醣在本文中亦用於係指醣偶聯物(例如醣蛋白、醣脂、醣肽、醣蛋白體、肽聚醣、脂多醣或蛋白聚醣)之碳水化合物部分。聚醣通常僅由單糖之間之O-糖苷鍵聯組成。舉例而言，纖維素係由β-1,4-連結之D-葡萄糖構成之聚醣(或更具體而言葡聚醣)，且甲殼質係由β-1,4-連結之N-乙醯基-D-葡糖胺構成之聚醣。聚醣可為單糖殘基之均聚物或異聚物，且可為直鏈或具支鏈。可發現聚醣連接至蛋白質，如在醣蛋白及蛋白聚醣中。其通常發現於細胞之外表面上。O-及N-連結聚醣極常見於真核細胞中，但亦可發現於(儘管較不常見)原核細胞中。N-連結聚醣發現連接至序列子中天門冬醯胺之R-基團氮(N)。序列子係Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X係除脯胺酸外之任一胺基酸。
如本文所用，術語「工程化」闡述描述了其胺基酸序列已經由人設計及/或其存在及產生需要人為干預和/或活動之多肽。
如本文所用，術語「多核苷酸」或「核酸」在本文可互換使用，係指任何長度之核苷酸的聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經改質核苷酸或鹼基及/或其類似物或任一可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應納入聚合物中之受質。多核苷酸可包括經改質核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，可在組裝聚合物之前或之後進行核苷酸結構之改質。核苷酸序列可雜有非核苷酸組分。多核苷酸可在合成後藉由(例如)與標記偶聯進一步改質。其他類型之改質包括(例如)「帽(cap)」，用類似物取代天然核苷酸中之一或多者；核苷酸間改質，例如彼等具有不帶電鍵聯(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵聯(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、彼等含有側接部分、例如蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)者、彼等具有嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)者、彼等含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)者、彼等含有烷基化劑者、彼等具有經改質鍵聯(例如，α變旋異構核酸等)者以及多核苷酸之未改質形式。此外，通常在糖中存在之羥基中之任一者皆可由(例如)膦酸酯基團、磷酸基團置換，由標準保護基團保護，或經活化以製備與額外核苷酸之額外鍵聯，或可偶聯至固體或半固體載體。5'及3'末端OH可經磷酸化或經胺或1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生化成標準保護基團。多核苷酸亦可含有通常業內已知之核糖或去氧核糖糖之類似形式，包括(例如) 2'-O-甲基-核糖、2'-O-烯丙基-核糖、2'-氟-核糖或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖(例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非環類似物及無鹼基核苷類似物(例如甲基核苷)。一或多個磷酸二酯鍵聯可由替代連結基團置換。該等替代連結基團包括(但不限於)如下實施例：其中磷酸酯由P(O)S(「硫代酯」)、P(S)S (「二硫代酯」)、(O)NR2 (「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲乙縮醛」)置換，其中每一R或R'獨立地係H或視情况含有醚(--O--)鍵聯之經取代或未經取代之烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。多核苷酸中之所有鍵聯並不需要均相同。前述說明適用於本文中提及之所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所使用，術語「載體」係指能够轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。
如本文所用，術語「宿主」係指其中存在所關注多肽之系統(例如，細胞、生物體等)。在一些實施例中，宿主係易於被特定傳染原感染之系統。在一些實施例中，宿主係表現所關注特定多肽之系統。
如本文所用，術語「胺基酸」係指天然及合成胺基酸以及以與天然胺基酸相似之方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係由基因代碼編碼之彼等以及隨後經改質之彼等胺基酸，例如，羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然胺基酸具有相同的基本化學結構之化合物(即，α碳連結至氫、羧基、胺基及R基團)，例如，高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經改質之R基團(例如正白胺酸)或經改質之肽骨架，但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指結構不同於胺基酸之一般化學結構但以類似於天然胺基酸之方式起作用的化學化合物。
如本文所用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，可用於指其中單體為胺基酸且藉助醯胺鍵接合在一起之聚合物，另一選擇稱為肽。另外，亦包括非天然胺基酸，例如β-丙胺酸、苯基甘胺酸及高精胺酸。非核酸編碼之胺基酸亦可用於本發明。此外，已經改質以包括反應性基團、醣基化位點、聚合物、治療性部分、生物分子及諸如此類之胺基酸亦可用於本發明。本發明中所用之所有胺基酸可為其D-或L-異構物。L-異構物通常係較佳的。另外，其他肽模擬物亦可用於本發明中。如本文所用，「肽」係寡肽、多肽、肽、蛋白質或醣蛋白。如本文所用，「多肽」係指醣基化及未醣基化之肽。亦包括由表現肽之系統不完全醣基化之肽。
如本文所用，術語「融合蛋白」(亦稱為「嵌合蛋白」)係指自兩個或更多個最初編碼為單獨蛋白質之基因的接合轉譯之蛋白質。
如本文所用，術語「抗體」亦包括完整抗體分子之抗原結合片段。抗體之抗原結合片段可使用任何適宜標準技術(例如蛋白酶解或涉及DNA編碼抗體可變結構域及視情况恒定結構域之操縱及表現之重組基因工程技術)自(例如)完整抗體分子衍生。該DNA係已知的及/或易於自(例如)商業來源、DNA文庫(包括例如噬菌體-抗體文庫)獲得，或可合成。DNA可經測序並以化學方式或藉由使用分子生物學技術操縱，例如以將一或多個可變及/或恒定結構域排列成適宜構形，或引入密碼子，產生半胱胺酸殘基，改質、添加或删除胺基酸等。
如本文所用，術語「抗體Fc區」係指可結晶區片段，其係抗體之尾區，其與稱為Fc受體之細胞表面受體及補體系統之一些蛋白質相互作用。Fc片段之醣基化係Fc受體介導之活性所必需的。
如本文所用，術語「醣型」係指包含特定醣基化狀態之抗體。術語「醣基化狀態」係指具有特定或期望醣基化模式之抗體。
如本文所用，術語「重塑抗體Fc區之聚醣」係指改變或改質抗體Fc區之聚醣中之殘基的類型、位置、數量、形式或鍵聯。在一個實施例中，重塑降低核心岩藻醣之數量或長度。
如本文所用，術語「目標聚醣噁唑啉」係指為欲重塑醣型之聚醣噁唑啉。
融合蛋白
醣基化途徑工程化已經開發用於改良生物功能及減少治療性抗體之異質性。獲得均質醣蛋白之途徑係基於醣蛋白重塑之策略。岩藻醣苷酶能夠催化α-L岩藻醣苷之水解。舉例而言，α-L岩藻醣苷之水解涉及使α-L-岩藻醣與N-乙醯基葡糖胺殘基之間之1,2-鍵聯、1,3-鍵聯或1,6-鍵聯裂解之化學反應。另一方面，內切醣苷酶催化寡醣自醣蛋白或醣酯之釋放。舉例而言，寡醣自醣蛋白之釋放係藉由水解天冬醯胺連結之聚醣之β-1,4-二-N-乙醯基幾丁二醣核心或水解AGP (α1-酸醣蛋白)之所有N-連結聚醣及二天線及唾液酸化聚醣上之內-β-N-乙醯基葡萄胺糖苷實施。岩藻醣苷酶及內切醣苷酶組合以處理抗體醣型可獲得在Fc區處具有明確定義之聚醣之均質抗體。
本揭示內容提供融合蛋白，其包含與內切醣苷酶或其截短片段或突變體之N-末端或C-末端融合之岩藻醣苷酶或其截短片段或突變體；其中該融合蛋白展現岩藻醣苷酶活性及內切醣苷酶活性二者。
岩藻醣苷酶或其截短片段或突變體及內切醣苷酶或其截短片段或突變體係直接或藉助連結體融合在一起。在一個實施例中，岩藻醣苷酶或其截短片段或突變體係直接或間接連結至內切醣苷酶或其突變體之截短片段之N-末端。在另一實施例中，岩藻醣苷酶或其截短片段或突變體係直接或間接連結至內切醣苷酶或其突變體之截短片段之C-末端。
岩藻醣苷酶可呈野生型形式或與其野生型形式相比呈經改質形式，例如其截短片段或突變體。岩藻醣苷酶之實例包括(但不限於)酪蛋白乳酸桿菌α-L岩藻醣苷酶C (Alfc)、脆弱類桿菌岩藻醣苷酶(BF3242)、多形類桿菌α-L-岩藻醣苷酶(BT2970)、寡養菌保所桿菌α-L-岩藻醣苷酶(EO0918)及米爾伊麗莎白菌α-(1-6)岩藻醣苷酶(Emfuc3)、或其片段或其突變體。在一些實施例中，岩藻醣苷酶係酪蛋白乳酸桿菌α-L岩藻醣苷酶C及米爾伊麗莎白菌α-(1-6)岩藻醣苷酶(Emfuc3)及其截短片段或突變體。
內切醣苷酶可呈野生型形式或與其野生型形式相比呈經改質形式，例如內切醣苷酶之截短片段或突變體。內切醣苷酶之實例包括(但不限於)釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2或其片段或其突變體。在一些實施例中，內切醣苷酶係釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2 或其截短片段或突變體。
岩藻醣苷酶或內切醣苷酶之截短片段亦可用於本揭示內容中。岩藻醣苷酶或內切醣苷酶之截短片段已在肽之N-末端、肽之C-末端或兩端或肽之內部區處截短。在一些實施例中，岩藻醣苷酶或內切醣苷酶之截短片段係其C-末端或N-末端截短片段。在一個實施例中，內切醣苷酶之截短片段係其IgG結合結構域。在一些其他實施例中，內切醣苷酶之截短片段係釀膿鏈球菌內切醣苷酶S或釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2之IgG結合結構域。
岩藻醣苷酶或內切醣苷酶可為其突變體形式。在一個實施例中，內切醣苷酶突變體係在胺基酸位置-D233處具有突變、較佳地具有在胺基酸位置D233Q處之突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S。在一些實施例中，內切醣苷酶突變體係在以下胺基酸位置處具有突變：T138、D182、D184、D186、D226或T227；較佳具有T138E、T138M、T138Q、T138R、T138L、T138H、T138N、T138K、D182Q、D184M、D184Q、D184T、D184L、D184F、D184S、D184V、D184K、D184W、E186A、D226Q或T227Q之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
在一些實施例中，融合蛋白包含與以下各項融合之酪蛋白乳酸桿菌α-L岩藻醣苷酶C：釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、 釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S之IgG結合結構域、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2之IgG結合結構域、在胺基酸位置D233處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、在胺基酸位置T138處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D182處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D184處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D186處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D226處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2或在胺基酸位置T227處具有突變釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
在一些實施例中，融合蛋白包含與以下各項融合之米爾伊麗莎白菌α-(1-6)岩藻醣苷酶：釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S之IgG結合結構域、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2之IgG結合結構域、在胺基酸位置D233處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、在胺基酸位置T138處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D182處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D184處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D186處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D226處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2或在胺基酸位置T227處具有突變釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
融合蛋白之胺基酸序列實例包括(但不限於) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、及204或其實質上類似之序列。較佳地，融合蛋白具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、及204或其實質上類似之序列。
當應用於多肽時，術語「實質相似」或「實質上相似」係指兩個肽序列在最佳比對時(例如藉由使用預設空位權重之程式GAP或BESTFIT)具有至少95%序列一致性、甚至更佳至少98%或99%序列一致性。較佳地，不一致之殘基位置係因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基由具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。在兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同之情形中，序列一致性百分比或相似度可向上調整以校正取代之保守性質。作出此調整之方式已為熟習此項技術者熟知。具有相似化學性質之側鏈之胺基酸之基團的實例包括(1) 脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2) 脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3) 含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；(4) 芳香族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5) 鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6) 酸性側鏈：天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽，及(7) 含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代基團係：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸鹽-天冬胺酸鹽及天冬醯胺-麩醯胺酸。
突變可為編碼抗體或多肽之一或多個密碼子之取代、刪除或插入，與抗體或多肽之天然序列相比，此導致胺基酸序列中之改變。熟習此項技術者已知之標準技術可用於誘導編碼本文所提供分子之核苷酸序列中之突變，包括例如導致胺基酸取代之定點誘變及PCR介導之誘變。插入或刪除可視情況在約1至5個胺基酸之範圍內。在某些實施例中，與原始分子相比，取代、刪除或插入包括少於25個胺基酸取代、少於20個胺基酸取代、少於15個胺基酸取代、少於10個胺基酸取代、少於5個胺基酸取代、少於4個胺基酸取代、少於3個胺基酸取代或少於2個胺基酸取代。所允許之變異可藉由在序列中系統地作出胺基酸之插入、刪除或取代並針對全長或成熟天然序列所展現之活性測試所得變體來確定。
胺基酸序列插入包括胺基-及/或羧基末端融合(長度在一個殘基至含有100個或以上殘基之多肽範圍內)、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如，用於抗體導向之酶前體療法)或增加抗體之血清半衰期之多肽之融合。
保守胺基酸取代係胺基酸殘基經具有相似電荷之側鏈的胺基酸殘基置換者。業內已定義具有相似電荷之側鏈的胺基酸殘基家族。該等家族包括具有以下各項之胺基酸：鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷之極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-具支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。或者，突變可沿全部或部分編碼序列例如藉由飽和誘變隨機引入，且所得突變體可針對生物學活性篩選以鑑別保留活性之突變體。誘變之後，經編碼蛋白質可經表現且可測定蛋白質之活性。
抗體生物性質之實質改質係藉由選擇在維持以下各項之效應方面顯著不同之取代來實現：(a) 取代區域中多肽主鏈之結構，例如，呈折叠或螺旋構象，(b) 靶位點處分子之電荷或疏水性，或(c) 側鏈之大小。
非保守取代必需將該等類別中之一者之成員交換為另一類別。該等經取代殘基亦可引入保守取代位點或剩餘(非保守)位點。
突變可使用此項技術中已知之方法進行，例如寡核苷酸介導之(定點)誘變、丙胺酸掃描及PCR誘變。可在經選殖DNA上實施定點誘變(例如，參見Carter, 1986, Biochem J. 237:1-7；及Zoller等人，1982, Nucl.Acids Res. 10:6487-500)、盒式誘變(例如，參見Wells等人，1985, Gene 34:315-23)或其他已知技術以產生變體DNA。
編碼本揭示內容融合蛋白之核酸分子及產生本揭示內容融合蛋白之表現系統
本揭示內容亦提供表現本文所述融合蛋白之核酸分子。
在本揭示內容之一些實施例中，核酸分子具有選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、及203或其實質上相同之序列。在一些其他實施例中，核酸具有選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、及203或其實質上相同之序列。
當提及核酸或其片段時，術語「實質上一致性」或「實質上一致」指示當適當核苷酸插入或删除與另一核酸(或其互補鏈)最佳對齊時，至少95%且更佳至少96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基與該參考核酸序列之整個序列存在核苷酸序列一致性，如藉由序列一致性之任何熟知演算法(例如FASTA，BLAST或Gap)所量測，如下文所討論。在某些情形中，與參考核酸分子具有實質上一致性之核酸分子可編碼與由參考核酸分子編碼之多肽具有相同或實質上相似胺基酸序列之多肽。
融合蛋白可使用各種表現系統(包括原核及真核表現系統)產生。許多該等系統可自商業供應商廣泛獲得。在一個實施例中，融合蛋白可使用載體表現，其中編碼該融合蛋白之多核苷酸可操作連接至啓動子序列。在一個實施例中，啓動子係組成型啓動子。在另一實施例中，啓動子係誘導型啓動子。
在一個實施例中，多核苷酸或載體包含於病毒中。在另一實施例中，病毒係選自由以下組成之群：反轉錄病毒、慢病毒屬、腺病毒及腺相關病毒。在本揭示內容之一個較佳實施例中，多核苷酸或載體包含於腺相關病毒(AAV)穿梭質體。
本揭示內容融合蛋白之應用
本揭示內容提供重塑抗體Fc區之聚醣的方法，其包含以下步驟：獲得在抗體Fc區中具有異質聚醣之抗體，及使該抗體與本文所述之融合蛋白接觸。
在本揭示內容之一個實施例中，該方法包含： 提供在其Fc區具有異質聚醣之抗體、本揭示內容之融合蛋白及目標聚醣噁唑啉，其中抗體Fc區之聚醣包含連結至Fc區之Asn殘基之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基；較佳地，抗體Fc區之聚醣包含連結至Fc區之Asn-297之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基；及 使抗體與融合蛋白接觸並將目標聚醣噁唑啉連結至抗體Fc區； 藉此可獲得抗體Fc區之重塑聚醣。
在一個實施例中，目標聚醣噁唑啉替代Fc區之聚醣的一部分連結至抗體Fc區。據信，儘管不期望受任何理論限制，但本揭示內容之融合蛋白去除抗體Fc區之聚醣中之N-連接GlcNAc，且然後發生將目標聚醣噁唑啉添加至抗體Fc區之醣基化。因此，可獲得抗體Fc區之重塑聚醣。
重塑聚醣之實例包括(但不限於) Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-3)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-3)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-3/α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-6/α2-3)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-3/α2-6)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-6/α2-3)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-3)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-6)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-3)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-6)GalGlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-3)GalGlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-6)GalGlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-3)GalGlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、GalGlcNAcMan3 GlcNAc2 、Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、GalGlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、GalGlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、GlcNAcMan3 GlcNAc2 或Man3 GlcNAc2 。
較佳地，方法進一步包含純化Fc區具有重塑聚醣之Fc區的抗體。
本發明之態樣另外藉助以下提供本發明實施例及其許多優點之更好理解之說明性非限制性實例闡述。以下實例意欲展示本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中揭示之技術代表用於本發明以在本發明實踐中良好發揮作用之技術，且因此可視為構成其實踐之較佳方式。然而，熟習此項技術者借助於本揭示內容應瞭解，可在不背離本發明之精神及範圍之情况下對所揭示具體實施例作出許多改變且仍獲得相同或相似結果。實例 融合蛋白
實例1：融合蛋白之產生
產生含有融合至岩藻醣苷酶BF3242 (表1)、Alfc (表2)、BT2970 (表3)、EO0918 (表4)及Emfuc3 (表5)之全長或截短(僅IgG結合基序) EndoS或EndoS2的融合蛋白，如下表1至5中所示。 表1. BF3242融合蛋白
酶代碼 構築體 N.A. SEQ ID NO A. A. SEQ ID NO
N -末端 C -末端
A-C101 EndoSIgG-BD (a) BF3242 1 2
A-C201 EndoS2IgG-BD (a) 3 4
D-C101 EndoSWT (b) 5 6
D-C201 EndoSD233Q 7 8
E-C101 EndoS2WT (b) 9 10
E-C201 EndoS2T138E 11 12
E-C204 EndoS2T138M 13 14
E-C401 EndoS2D184M 15 16
A-N101 BF3242 EndoSIgG-BD (a) 17 18
A-N201 EndoS2IgG-BD (a) 19 20
D-N101 EndoSWT (b) 21 22
D-N201 EndoSD233Q 23 24
E-N101 EndoS2WT (b) 25 26
E-N201 EndoS2T138E 27 28
E-N204 EndoS2T138M 29 30
E-N401 EndoS2D184M 31 32
              
a 僅endoS或endoS2之IgG結合結構域b 野生型endoS或endoS2 表1-1：BF3242及內切醣苷酶之融合蛋白的核酸序列
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表1-2：BF3242及内切醣苷酶之融合蛋白的胺基酸序列
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表2. Alfc融合蛋白
酶代碼 構築體 N.A. SEQ ID NO A. A. SEQ ID NO
N -末端 C -末端      
A-C102 EndoSIgG-BD Alfc 33 34
A-C202 EndoS2IgG-BD 35 36
B-C101 EndoSWT 37 38
B-C201 EndoSD233Q 39 40
C-C101 EndoS2WT 41 42
C-C201 EndoS2T138E 43 44
C-C202 EndoS2T138Q 45 46
C-C203 EndoS2T138R 47 48
C-C204 EndoS2T138M 49 50
C-C205 EndoS2T138L 51 52
C-C206 EndoS2T138H 53 54
C-C207 EndoS2T138N 55 56
C-C208 EndoS2T138K 57 58
C-C301 EndoS2D182Q 59 60
C-C401 EndoS2D184M 61 62
C-C402 EndoS2D184Q 63 64
C-C403 EndoS2D184T 65 66
C-C404 EndoS2D184L 67 68
C-C405 EndoS2D184F 69 70
C-C406 EndoS2D184S 71 72
C-C407 EndoS2D184V 73 74
C-C408 EndoS2D184K 75 76
C-C409 EndoS2D184W 77 78
C-C410 EndoS2D184M _L2(a) 79 80
C-C411 EndoS2D184M _L4(b) 81 82
C-C501 EndoS2E186A 83 84
C-C601 EndoS2D226Q 85 86
C-C701 EndoS2T227Q 87 88
A-N102 Alfc EndoSIgG-BD 89 90
A-N202 EndoS2IgG-BD 91 92
B-N101 EndoSWT 93 94
B-N201 EndoSD233Q 95 96
C-N101 EndoS2WT 97 98
C-N401 EndoS2D184M 99 100
C-N402 EndoS2D184Q 101 102
C-N403 EndoS2D184T 103 104
C-N404 EndoS2D184L 105 106
C-N405 EndoS2D184F 107 108
(a) [GGGGS]2 之L2鏈(融合蛋白之鍵聯)(b) [GGGGS]4 之L4鏈(融合蛋白之鍵聯) 表2-1：L23C及內切醣苷酶之融合蛋白的核酸序列
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表2-2：AlfC及內切醣苷酶之融合蛋白的胺基酸序列
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表3. BT2970融合蛋白
酶代碼 構築體 N. A. SEQ ID NO A.A. SEQ ID NO
N -末端 C -末端
A-C103 EndoSIgG-BD BT2970 109 110
A-C203 EndoS2IgG-BD 111 112
F-C101 EndoSWT 113 114
F-C201 EndoSD233Q 115 116
G-C101 EndoS2WT 117 118
G-C201 EndoS2T138E 119 120
G-C204 EndoS2T138M 121 122
G-C401 EndoS2D184M 123 124
A-N103 BT2970 EndoSIgG-BD 125 126
A-N203 EndoS2IgG-BD 127 128
F-N101 EndoSWT 129 130
F-N201 EndoSD233Q 131 132
G-N101 EndoS2WT 133 134
G-N201 EndoS2T138E 135 136
G-N204 EndoS2T138M 137 138
G-N401 EndoS2D184M 139 140
表3-1：F0003 (BT2970)及內切醣苷酶之融合蛋白的核酸序列
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表3-2：BT2970及内切醣苷酶之融合蛋白的胺基酸序列
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表4. EO0918融合蛋白
酶代碼 構築 N. A. SEQ ID NO A. A. SEQ ID NO
N -末端 C -末端
A-C104 EndoSIgG-BD EO0918 141 142
A-C204 EndoS2IgG-BD 143 144
H-C101 EndoSWT 145 146
H-C201 EndoSD233Q 147 148
I-C101 EndoS2WT 149 150
I-C201 EndoS2T138E 151 152
I-C204 EndoS2T138M 153 154
I-C401 EndoS2D184M 155 156
A-N104 EO0918 EndoSIgG-BD 157 158
A-N204 EndoS2IgG-BD 159 160
H-N101 EndoSWT 161 162
H-N201 EndoSD233Q 163 164
I-N101 EndoS2WT 165 166
I-N201 EndoS2T138E 167 168
I-N204 EndoS2T138M 169 170
I-N401 EndoS2D184M 171 172
表4-1：F0004 (Eo0918)及内切醣苷酶之融合蛋白的核酸序列
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表4-2：EO0918及内切醣苷酶之融合蛋白的胺基酸序列
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表5. Emfuc3融合蛋白
酶代碼 構築 N. A. SEQ ID NO A. A. SEQ ID NO
N -末端 C -末端
A-C105 EndoSIgG-BD Emfuc3 173 174
A-C205 EndoS2IgG-BD 175 176
J-C101 EndoSWT 177 178
J-C201 EndoSD233Q 179 180
K-C101 EndoS2WT 181 182
K-C201 EndoS2T138E 183 184
K-C204 EndoS2T138M 185 186
K-C401 EndoS2D184M 187 188
A-N105 Emfuc3 EndoSIgG-BD 189 190
A-N205 EndoS2IgG-BD 191 192
J-N101 EndoSWT 193 194
J-N201 EndoSD233Q 195 196
K-N101 EndoS2WT 197 198
K-N201 EndoS2T138E 199 200
K-N204 EndoS2T138M 201 202
K-N401 EndoS2D184M 203 204
表5-1：F005 (Emfuc3) 及內切醣苷酶之融合蛋白的核酸序列
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表5-2：Emfuc3及內切醣苷酶之融合蛋白的胺基酸序列
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重塑抗體 Fc 區之聚醣 .
實例 2 ：岩藻醣苷酶活性分析
測試抗體(即，曲妥珠單抗(TRZ))利用endoS2於Tris-HCl (pH 7.0)中在37℃下處理1小時。經處理抗體係藉由吸附於蛋白質A親和層析樹脂(MabSelectTM )上、利用Tris-HCl (pH 7.4)洗滌並用檸檬酸緩衝液(pH 3.0)溶析來純化。所得抗體之Fc區中之大多數殘餘聚醣係N-乙醯基葡糖胺-岩藻醣(GlcNAc-Fuc)。將純化抗體用融合蛋白或天然岩藻醣苷酶在Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)中於37℃處理16 h，隨後在55℃加熱20 min，以使酶活性不活化。將反應混合物藉助0.22 µm膜過濾且經處理抗體藉由親和層析純化。
殘餘岩藻醣之含量係藉由分析完整蛋白質質量確定。藉由每一質量峰之强度鑑別TRZ-N/N (在Fc區含有兩個GlcNAc之TRZ)、TRZ-N/NF (在Fc區含有一個GlcNAc及一個GlcNAc-Fuc之TRZ)及TRZ-NF/NF (在Fc區含有兩個GlcNAc-Fuc之TRZ)之比率。結果顯示於下表6及圖1中。 表6. 自測試抗體TRZ去除之岩藻醣的百分比
酶 岩藻醣藉由完整質量強度之分析
酶代碼 構築 N/N (%) N/NF (%) NF/NF (%) 岩藻醣含量(%) 藉由酶之去岩藻醣百分比(%)
N-末端 C-末端
無 無酶 7.16 15.29 77.55 85.2 0
BF3242 BF3242 12.34 35.99 51.67 69.67 18.22
E-C401 EndoS2D184M BF3242 10.78 32.5 56.72 72.97 14.35
E-N401 BF3242 EndoS2D184M 8.72 24.29 66.99 79.14 7.11
A-N201 BF3242 EndoS2IgG-BD 18.23 41.14 40.63 61.2 28.17
Alfc Alfc 13.76 37.38 48.86 67.55 20.72
C-C401 EndoS2D184M Alfc 80.96 14.85 4.18 11.61 86.37
C-C402 EndoS2D184Q Alfc 75.29 19.56 5.15 14.93 82.48
C-C403 EndoS2D184T Alfc 79.97 16.03 4 12.02 85.89
C-C404 EndoS2D184L Alfc 80.23 15.55 4.22 12 85.92
C-C405 EndoS2D184F Alfc 75.37 19.32 5.32 14.98 82.42
C-N401 Alfc EndoS2D184M 26.75 44.59 28.66 50.96 40.19
C-N402 Alfc EndoS2D184Q 29.94 45.13 24.93 47.5 44.25
C-N403 Alfc EndoS2D184T 32.9 45.14 21.96 44.53 47.73
C-N404 Alfc EndoS2D184L 25.85 46.22 27.93 51.04 40.09
C-N405 Alfc EndoS2D184F 26.67 44.25 29.08 51.21 39.89
結果顯示，脆弱類桿菌岩藻醣苷酶BF3242之岩藻醣苷酶活性並未因將其融合至釀膿鏈球菌(S. pyogenes ) endoS2 D184M突變體而改良。將BF3242 (18.22%岩藻醣去除)與E-C401 (14.35%)及E-N401 (7.11%)相比較。
令人驚訝地，Alfc之岩藻醣苷酶活性因將此酶融合至D184突變體endoS2酶之N-末端或C-末端而顯著增加。舉例而言，Alfc自測試抗體去除20.72%岩藻醣，而融合至EndoS2 D184M突變體之N-末端的Alfc去除40.19 %岩藻醣。將Alfc與C-N401相比較。更意外地，融合至EndoS2 D184M之C-末端的Alfc (C-C401)自測試抗體去除多達86.37%之岩藻醣。尤其，與在EndoS2突變體N-末端處之Alfc融合相比，所有在EndoS2 D184突變體(即，D184M、D184Q、D184T、D184L及D184F)之C-末端之經測試Alfc融體均顯示意外地高岩藻醣苷酶活性。
實例3 ：額外Alfc 融合蛋白之岩藻醣苷酶活性
測試具有融合至天然或位點特異性突變體EndoS2酶之C-末端之Alfc的額外融合蛋白針對TRZ之岩藻醣苷酶活性，如以上實例2中所述。結果顯示於下表7及圖2中。 表7. 自測試抗體TRZ去除之岩藻醣百分比
酶 岩藻醣藉由完整質量強度之分析
酶 代碼 構築 N/N N/NF NF/NF 岩藻醣含量 藉由酶之去岩藻醣百分比
N-末端 C-末端
無 無酶 7.26 15.29 77.55 85.20 0
L23C 僅Alfc 20.40 43.67 35.92 57.76 32.21
C-C101 EndoS2WT Alfc 84.65 12.76 2.60 8.98 89.46
C-C201 EndoS2T138E Alfc 84.78 12.67 2.55 8.89 89.57
C-C206 EndoS2T138H Alfc 83.56 13.48 2.96 9,7 88.62
C-C208 EndoS2T138K Alfc 84.76 12.46 2.77 9 89.44
C-C205 EndoS2T138L Alfc 85.68 11.62 2.70 8.51 90.01
C-C204 EndoS2T138M Alfc 86.63 11.08 2.29 7.83 90.81
C-C207 Endo52T138N Alfc 79.54 17.38 3.08 11.77 86.16
C-C202 EndoS2T138Q Alfc 85.30 12.11 2.59 8.65 89.85
C-C203 EndoS2T138R Alfc 85.75 11.71 2.55 8.41 90.13
C-C301 EndoS2D182Q Alfc 81.09 15.41 3.49 11.20 86.85
C-C408 Endo52D184K Alfc 85.30 11.86 2.84 8.77 89.71
C-C409 EndoS2D184W Alfc 81.55 14.39 4.06 11.26 86.78
C-C501 EndoS2E186A Alfc 84.67 12.74 2.59 8.96 89.48
C-C601 EndoS2D226Q Alfc 85.49 11.65 2.87 8.70 89.79
C-C701 EndoS2T227Q Alfc 76.58 19.91 3.51 13.47 84.19
結果顯示，與單獨的Alfc相比，所測試之所有Alfc/EndoS2融合蛋白均自TRZ去除顯著更多的岩藻醣。
測試具有截短EndoS2之五種岩藻醣苷酶之額外融合蛋白針對TRZ之岩藻醣苷酶活性，如以上實例2中所述。結果顯示於下表8及圖3中。 表8 自測試抗體TRZ去除之岩藻醣百分比
酶 岩藻醣藉由重鏈質量強度之分析
酶代碼 構築 N (%) NF (%) 藉由酶之去岩藻醣百分比(%)
N-末端 C-末端
無 無酶 11.78 88.22 0
Alfc Alfc 40.45 59.55 32.5
A-C201 EndoS2lgG-BD BF3242 23.29 76.71 13.05
A-C202 EndoS2lgG-BD Alfc 70.52 29.48 66.58
A-C203 EndoS2lgG-BD BT2970 11.99 88.01 0.24
A-C204 EndoS2lgG-BD E00918 11.6 88.4 -0.2
A-C205 EndoS2lgG-BD Emfuc3 33.79 66.21 24.95
A-N202 Alfc EndoS2lgG-BD 60.24 39.76 54.93
A-N203 BT2970 EndoS2lgG-BD 11 89 -0.88
A-N204 E00918 EndoS2lgG-BD 12.8 87.2 1.16
A-N205 Emfuc3 EndoS2lgG-BD 39.91 60.09 31.89
Alfc之去岩藻醣能力明顯改良。BT2970及EO0918之融合蛋白不能去除抗體之核心-岩藻醣。
實例4 具有融合至截短EndoS2 或位點特異性突變體EndoS2 酶之Alfc 或Emfuc3 的額外融合蛋白
具有融合至截短EndoS2或位點特異性突變體EndoS2酶之Alfc或Emfuc3的額外融合蛋白針對TRZ之岩藻醣苷酶活性，如以上實例2中所述。結果顯示於下表9及圖4中。 表9. 自測試抗體TRZ去除之岩藻醣百分比
酶 岩藻醣藉由重鏈質量強度之分析
酶 代碼 構築 N (%) NF (%) 藉由酶之去岩藻醣百分比(%)
N-末端 C-末端
無 無酶 12.19 87.81 0
Alfc Alfc 39.47 60.53 31.07
A-C202 EndoS2lgG-BD Alfc 69.02 30.98 64.72
A-N202 Alfc EndoS2lgG-BD 59.46 40.54 53.83
C-C204 EndoS2T138M Alfc 93.03 6.97 92.06
Emfuc3 Emfuc3 32.52 67.48 23.15
A-C205 EndoS2lBG-BD Emfuc3 35.52 64.48 26.57
A-N205 Emfuc3 EndoS2lgG-BD 47.38 52.62 40.08
當融合至完整EndoS2突變(C-C204)之C-末端時，Alfc之去岩藻醣能力較融合至截短EndoS2 (IgG結合結構域)、A-C202及A-N202增加更多。當融合至截短EndoS2 (IgG結合結構域)、A-N205之N-末端時，Emfuc3之去岩藻醣能力經改良，但當融合至截短EndoS2 (IgG結合結構域)、A-C205之C-末端時無改良。 實例5
測試具有融合至截短或位點特異性突變體EndoS或EndoS酶之N-末端之Alfc或Emfuc3e的額外融合蛋白針對TRZ之岩藻醣苷酶活性，如以上實例2中所述。結果顯示於下表10及圖5中。 表10. 自測試抗體TRZ去除之岩藻醣百分比
酶 岩藻醣藉由重鏈質量強度之分析
酶 代碼 構築 N (%) NF (%) 藉由酶之去岩藻醣百分比(%)
N-末端 C-末端
無 無酶 10.4 89.6 0
Alfc Alfc 30.04 66.96 25.27
B-N201 Alfc EndoSD233Q 36.09 63.91 28.67
Emfuc3 Emfuc3 21.6 78.4 12.5
J-N201 Emfuc3 EndoSD233Q 59.37 40.63 54.65
K-N204 Emfuc3 EndoS2T138M 46.17 53.83 39.92
K-N401 Emfuc3 EndoS2D184M 43.85 56.15 37.33
A-N105 Emfuc3 EndoSlgG-BD 46.17 53.83 39.92
Alfc之活性在與EndoS2融合後急劇經改良，但與EndoS融合後無改良。與此相比，Emfuc3之活性在與EndoS而非EndoS2融合後改良更明顯。
實例6 具有EndoS 或EndoS2/Emfuc3 、EndoS/BF3242 、Alfc 、Emfuc3 或BF3242 岩藻醣苷酶之額外融合蛋白
測試具有EndoS或EndoS2/Emfuc3、EndoS/BF3242、Alfc、Emfuc3或BF3242岩藻醣苷酶酶之額外融合蛋白針對TRZ之岩藻醣苷酶活性，如以上實例2中所述。結果顯示於下表11及圖6中。 表11. 自測試抗體TRZ去除之岩藻醣百分比
酶 岩藻醣藉由重鏈質量強度之分析
酶 代碼 構築 N (%) NF (%) 藉由酶之去岩藻醣百分比(%)
N-末端 C-末端
無 無酶 10.12 89.88 0
Alfc Alfc 33.81 66.19 26.36
Emfuc3 Emfuc3 22.48 77.52 13.75
K-C204 EndoS2T138M Emfuc3 37.19 62.81 30.12
K-C401 EndoS2D184M Emfuc3 38.13 61.87 31.16
J-C201 EndoSD233Q Emfuc3 25.32 74.68 16.91
BF3242 BF3242 19.72 80.28 10.68
D-C201 EndoSD233Q BF3242 21.83 78.17 13.03
與實例5相比，當Emfuc3與EndoS-突變及EndoS2-突變之N-末端融合時，觀察到較融合至內切醣苷酶之C-末端更顯著改良。
實例7 具有融合至截短或位點特異性突變體EndoS2 或EndoS 酶之BF3242 的額外融合蛋白
測試具有融合至截短或位點特異性突變體EndoS2或EndoS酶之BF3242的額外融合蛋白針對TRZ之岩藻醣苷酶活性，如以上實例2中所述。結果顯示於下表12及圖7中。 表12. 自測試抗體TRZ去除之岩藻醣百分比
酶 岩藻醣藉由重鏈質量強度之分析
酶 代碼 構築 N (%) NF (%) 藉由酶之去岩藻醣百分比(%)
N-末端 C-末端
無 無酶 13.05 86.95 0
BF3242 BF3242 33.67 66.33 23.71
A-C201 EndoS2lgG-BD BF3242 23.15 76.85 11.62
D-C201 EndoSD233Q BF3242 23.9 76.1 12.48
E-C401 EndoS2D184M BF3242 30.27 69.73 19.8
A-N201 BF3242 EndoS2lgG-BD 30.43 69.57 20
D-N201 BF3242 EndoSD233Q 32.95 67.05 22.89
E-N401 BF3242 EndoS2D184M 27.99 72.01 17.18
BF3242之去核心岩藻醣能力並未因與內切醣苷酶融合而改良。
實例8 TRZ 藉由融合蛋白C-C401 之醣基工程化
將測試抗體TRZ利用融合蛋白C-C401 (即，融合至endoS2 D184M之C-末端的Alfc)在Tris-HCl (pH 7.0)中在37℃處理16 h至20 h。將反應調整至30℃後，添加唾液酸化複合物型聚醣-噁唑啉(即，Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉)或未唾液酸化型式(Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉)並將反應培育30 min至1 h。將經醣基工程化之TRZ如以上實例2中所述純化。所得經醣基工程化之TRZ在Fc區中含有兩個Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 (G2S2)或兩個Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 (G2)。在不同時間間隔取出反應之樣品並藉由SDS-PAGE進行分析。該等結果圖解呈現於8A及8B中。
如圖8A中所示，TRZ (泳道1)利用C-C401處理達20 h去除除N-連結之GlcNAc (泳道4)以外之所有聚醣，以獲得TRZ-N/N (GlcNAc/GlcNac；泳道3)。調整溫度並添加Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉後醣基化之TRZ-N/N的量在10 min.、20 min.及30 min.後分別為95%、98%及98%。參見泳道5、6及7。經純化之醣基工程化TRZ-G2S2/G2S2顯示於泳道8中。
轉向圖8B，其顯示在TRZ去醣基化16 h後(泳道3)，在調整溫度並添加Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉後醣基化之TRZ-N/N的量在所有時間點均為98%。參見泳道4-7。經純化之醣基工程化TRZ-G2/G2顯示於泳道8中。
實例9 利妥昔單抗(RTX) 藉由融合蛋白C-C401 之醣基工程化
將測試抗體RTX利用融合蛋白C-C401在Tris-HCl中處理。將溫度調整至30℃之後，添加Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉並將反應培育1 h。如以上實例2中所述將經聚醣重塑之RTX純化。所得RTX在Fc區中含有兩個G2S2。在不同時間間隔取出反應之樣品並藉由SDS-PAGE進行分析。結果顯示於圖9中。
RTX (泳道4)利用C-C401處理20 h以去除除N-連結之GlcNAc以外之聚醣，以獲得RTX-N/N (GlcNAc/GlcNac；泳道5)。在調整溫度並添加Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉之後醣基化之RTX-N/N的量在10 min.、20 min.及30 min.後分別為95%、98%及98%。參見泳道6、7及8。經純化之醣基工程化RTX-G2S2/G2S2顯示於泳道9中。
實例10    TRZ 藉由融合蛋白C-C406 之醣基工程化
將測試抗體TRZ利用融合蛋白C-C406 (即，融合至endoS2 D184S之C-末端的Alfc)在Tris-HCl (pH 7.0)中在37℃處理16 h。將溫度調整至30℃之後，添加Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉並將反應培育1 h。將經聚醣重塑之TRZ如上述實例2中所述純化。所得TRZ在Fc區中含有兩個G2S2。在不同時間間隔取出反應之樣品並藉由SDS-PAGE進行分析。結果顯示於圖10中。
TRZ (泳道1)利用C-C406處理16 h以去除除N-連結之GlcNAc以外之聚醣，以形成TRZ-N/N (GlcNAc/GlcNac；泳道4)。在調整溫度並添加Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉之後醣基化之TRZ-N/N的量在30 min.、60 min.、90 min.及120 min.之後分別為90%、95%、98%及98%。參見泳道5、6、7及8。經純化之醣基工程化TRZ-G2S2/G2S2顯示於泳道9中。
實例11    TRZ 藉由融合蛋白C-C407 之醣基工程化
測試抗體TRZ利用融合蛋白C-C407 (即，融合至endoS2 D184V之C-末端的Alfc)在Tris-HCl (pH 7.0)中在37℃處理12 h。添加Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉並將反應培育1 h。將經聚醣重塑之TRZ如上所述純化。所得TRZ在Fc區中含有兩個G2S2。在不同時間間隔取出反應之樣品並藉由SDS-PAGE進行分析。結果顯示於圖11中。
TRZ (泳道1)利用C-C407處理12 h以去除除N-連結之GlcNAc以外之聚醣，以獲得TRZ-N/N (GlcNAc/GlcNac；泳道8)。在調整溫度並添加Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉之後醣基化之TRZ-N/N的量在30 min.、60 min.、90 min.及120 min.之後分別為80%、95%、98%及98%。參見泳道4、5、6及7。經純化之醣基工程化TRZ-G2S2/G2S2顯示於泳道9中。
實例12    TRZ 藉由融合蛋白C-C204 之醣基工程化
測試抗體TRZ利用融合蛋白C-C204 (即，融合至endoS2 T138M之C-末端的Alfc)在Tris-HCl (pH 7.0)中在37℃處理16 h。添加Sia2 (a2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉並將反應培育4 h。將經聚醣重塑之TRZ (50 min)如上所述純化。所得TRZ在Fc區中含有兩個G2S2。在不同時間間隔取出反應之樣品並藉由SDS-PAGE進行分析。結果顯示於圖12中。
TRZ (泳道1)利用C-C204處理16以去除除N-連結之GlcNAc以外之聚醣，以獲得TRZ-N/N (GlcNAc/GlcNac；泳道3)。在調整溫度並添加Sia2 (a2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc-噁唑啉之後醣基化之TRZ-N/N的量在15 min、30 min、45 min、50 min、120 min及240 min之後分別為80%、95%、98%、98%、95%及90%。參見泳道4、5、6、7、8及9。經純化之醣基工程化TRZ-G2S2/G2S2 (50 min)顯示於泳道10中。
儘管已結合以上闡釋之特定實施例闡述本揭示內容，但對於熟習此項技術者而言，其許多替代及其修改及變化形式將係顯而易見的。所有該等替代、修改及變化形式均認為屬本揭示內容之範圍。
圖1顯示條形圖，其顯示藉由所指示酶(即，岩藻醣苷酶及岩藻醣苷酶/EndoS2融合蛋白)水解之岩藻醣之百分比，其表示為所去除起始岩藻醣之百分比。酶鑑別於下表1至5中。
圖2顯示條形圖，其顯示藉由Alfc岩藻醣苷酶或Alfc/EndoS2融合蛋白水解之岩藻醣之百分比，其表示為所去除起始岩藻醣之百分比。融合蛋白鑑別於下表1至5中。
圖3顯示條形圖，其顯示藉由Alfc岩藻醣苷酶或五種具有截短EndoS2之岩藻醣苷酶之融合蛋白水解之岩藻醣之百分比，其表示為所去除起始岩藻醣之百分比。融合蛋白鑑別於下表1至5中。
圖4顯示條形圖，其顯示藉由Alfc或Emfuc3岩藻醣苷酶或Alfc或Emfuc3/EndoS2融合蛋白水解之岩藻醣之百分比，其表示為所去除起始岩藻醣之百分比。融合蛋白鑑別於下表1至5中。
圖5顯示條形圖，其顯示藉由Alfc或Emfuc3岩藻醣苷酶、Alfc/EndoS或EndoS或EndoS2/Emfuc3融合蛋白水解之岩藻醣之百分比，其表示為所去除起始岩藻醣之百分比。融合蛋白鑑別於下表1至5中。
圖6顯示條形圖，其顯示藉由Alfc、Emfuc3或BF3242岩藻醣苷酶、EndoS或EndoS2/Emfuc3或EndoS/BF3242融合蛋白水解之岩藻醣之百分比，其表示為所去除起始岩藻醣之百分比。融合蛋白鑑別於下表1至5中。
圖7顯示條形圖，其顯示藉由BF3242岩藻醣苷酶、EndoS或EndoS2/BF3242融合蛋白水解之岩藻醣之百分比，其表示為所去除起始岩藻醣之百分比。融合蛋白鑑別於下表1至5中。
圖8A顯示曲妥珠單抗(trastuzumab, TRZ)藉由C-C401聚醣重塑之時程的SDS-PAGE分析。去除兩種天然聚醣且各自由Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 (G2S2)替代。泳道2：TRZ之標準品。泳道3：TRZ-N/N (含有兩個GlcNAc之TRZ)之標準品。泳道4：TRZ利用C-C401處理20小時以獲得TRZ-N/N。泳道5-7：分別為藉由C-C401利用SCT-噁唑啉經10、20及30分鐘之95%、98%及98%醣基化之TRZ-N/N。泳道8：經純化之醣基工程化TRZ (TRZ-G2S2/G2S2)。
圖8B顯示TRZ藉由C-C401聚醣重塑之SDS-PAGE分析。去除兩種天然聚醣且各自由Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 (G2)替代。泳道2：曲妥珠單抗之標準品。泳道3：TRZ利用C-C401處理16小時以獲得TRZ-N/N。泳道4-7：藉由C-C401利用CT-噁唑啉經15、30、45及60分鐘之98%醣基化之TRZ-N/N。泳道8：經純化之醣基工程化TRZ (TRZ-G2/G2)。泳道9：TRZ-G2S2/G2S2之標準品。
圖9顯示利妥昔單抗(rituximab, RTX)藉由C-C401聚醣重塑之SDS-PAGE分析。泳道2：曲妥珠單抗之標準品。泳道3：TRZ-N/N之標準品。泳道4：利妥昔單抗之標準品。泳道5：RTX利用C-C401處理20小時以獲得RTX-N/N。泳道6-8：藉由C-C401利用SCT-噁唑啉之95%、98%及98%醣基化之RTX-N/N。泳道9：經純化之醣基工程化RTX (RTX-G2S2/G2S2)。
圖10顯示TRZ藉由C-C406聚醣重塑之SDS-PAGE分析。泳道2：曲妥珠單抗之標準品。泳道3：TRZ-N/N之標準品。泳道4：TRZ利用C-C406處理16小時以獲得TRZ-N/N。泳道5-8：分別為藉由C-C406利用SCT-噁唑啉經30、60、90及120分鐘之90%、95%、98%及98%醣基化之TRZ-N/N。泳道9：經純化之醣基工程化TRZ (TRZ-G2S2/G2S2)。
圖11顯示TRZ藉由C-C407聚醣重塑之SDS-PAGE分析。泳道2：曲妥珠單抗之標準品。泳道3：TRZ-N/N之標準品。泳道4-7：分別為藉由C-C407利用SCT-噁唑啉經30、60、90及120分鐘之80%、95%、98%及98%醣基化之TRZ-N/N。泳道8：TRZ利用C-C407處理12小時以獲得TRZ-N/N。泳道9：經純化之醣基工程化TRZ (TRZ-G2S2/G2S2)。
圖12顯示TRZ藉由C-C204聚醣重塑之SDS-PAGE分析。泳道2：曲妥珠單抗之標準品。泳道3：TRZ利用C-C204處理16小時以獲得TRZ-N/N。泳道4-9：分別為藉由C-C204利用SCT-噁唑啉經15、30、45、60、90、120及240分鐘之85%、97%、98%、98%、97%及90%醣基化之TRZ-N/N。泳道10：經純化之醣基工程化TRZ (TRZ-G2S2/G2S2)。

Claims (21)

  1. 一種融合蛋白，其包含與內切醣苷酶或其截短片段或突變體之N-末端或C-末端融合之岩藻醣苷酶或其截短片段或突變體；其中該融合蛋白展現岩藻醣苷酶活性及內切醣苷酶活性二者。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該岩藻醣苷酶係酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei ) α-L岩藻醣苷酶C (Alfc)、脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis )岩藻醣苷酶(BF3242)、多形類桿菌(Bacteroides thetaiotamicron ) α-L-岩藻醣苷酶(BT2970)、寡養菌保所桿菌(Emticicia oligotrophica ) α-L-岩藻醣苷酶(EO0918)及米爾伊麗莎白菌(Elizabethkingia miricola ) α-(1-6)岩藻醣苷酶(Emfuc3)或其片段或其突變體。
  3. 如請求項1之融合蛋白，其中該岩藻醣苷酶係酪蛋白乳酸桿菌α-L岩藻醣苷酶C、米爾伊麗莎白菌α-(1-6)岩藻醣苷酶(Emfuc3)或其截短片段或突變體。
  4. 如請求項1之融合蛋白，其中該內切醣苷酶係釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes )內切醣苷酶S、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2或其片段或突變體。
  5. 如請求項1之融合蛋白，其中內切醣苷酶之該截短片段係其IgG結合結構域。
  6. 如請求項1之融合蛋白，其中該內切醣苷酶之該截短片段係釀膿鏈球菌內切醣苷酶S或釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2之IgG結合結構域。
  7. 如請求項1之融合蛋白，其中該內切醣苷酶突變體係在胺基酸位置D233處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S。
  8. 如請求項7之融合蛋白，其中該內切醣苷酶突變體係在胺基酸位置D233Q處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S。
  9. 如請求項1之融合蛋白，其中該內切醣苷酶突變體係在胺基酸位置T138、D182、D184、D186、D226或T227處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
  10. 如請求項1之融合蛋白，其中該內切醣苷酶突變體係在胺基酸位置T138E、T138M、T138Q、T138R、T138L、T138H、T138N、T138K、D182Q、D184M、D184Q、D184T、D184L、D184F、D184S、D184V、D184K、D184W、E186A、D226Q或T227Q處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
  11. 如請求項1之融合蛋白，其包含與以下各項融合之酪蛋白乳酸桿菌α-L岩藻醣苷酶C：釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、 釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S之IgG結合結構域、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2之IgG結合結構域、在胺基酸位置D233處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、在胺基酸位置T138處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D182處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D184處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D186處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D226處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2或在胺基酸位置T227處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
  12. 如請求項1之融合蛋白，其包含與以下各項融合之米爾伊麗莎白菌α-(1-6)岩藻醣苷酶：釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S之IgG結合結構域、釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2之IgG結合結構域、在胺基酸位置D233處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S、在胺基酸位置T138處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D182處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D184處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D186處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2、在胺基酸位置D226處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2或在胺基酸位置T227處具有突變之釀膿鏈球菌內切醣苷酶S2。
  13. 如請求項1之融合蛋白，其包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、及204或其實質上類似之序列。
  14. 如請求項1之融合蛋白，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、及204或其實質上類似之序列。
  15. 一種核酸分子，其表現如請求項1至14中任一項之融合蛋白。
  16. 如請求項15之核酸分子，其包含選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、及203或其實質上相同之序列。
  17. 一種載體，其包含如請求項15或16之核酸分子。
  18. 一種用於重塑抗體Fc區之聚醣的方法，其包含以下步驟：獲得抗體之該Fc區具有異質聚醣之該抗體及使該抗體與如請求項1至14中任一項之融合蛋白接觸。
  19. 如請求項18之方法，其包含： 提供在其Fc區具有異質聚醣之抗體、如請求項1至14中任一項之融合蛋白及目標聚醣噁唑啉，其中該抗體Fc區之該聚醣包含N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基；及 使該抗體與如請求項1至14中任一項之融合蛋白接觸並將該目標聚醣噁唑啉連結至該抗體Fc區； 由此可獲得該抗體Fc區之重塑聚醣。
  20. 如請求項18之方法，其進一步包含純化在該Fc區中具有該重塑聚醣之該抗體。
  21. 如請求項18之方法，其中該重塑聚醣係Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-3)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-3)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-3/α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-6/α2-3)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-3/α2-6)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia2 (α2-6/α2-3)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-3)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-6)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-3)Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-6)GalGlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-3)GalGlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-6)GalGlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Sia(α2-3)GalGlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、GalGlcNAcMan3 GlcNAc2 、Gal2 GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、GalGlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、GalGlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、GlcNAc3 Man3 GlcNAc2 、GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、GlcNAcMan3 GlcNAc2 或Man3 GlcNAc2 。
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