TW202118863A - 保加利亞乳桿菌tci904、其組合物及其用於減少體重的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種保加利亞乳桿菌TCI904(Lactobacillus bulgaricus TCI904),其具有抑制脂肪酶活性的功能。此外,該保加利亞乳桿菌TCI904及其代謝產物可進一步提供做為食品組合物。其中保加利亞乳桿菌TCI904寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910984)、以及寄存於德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM33505)。
Description
本發明關於一種保加利亞乳桿菌TCI904(Lactobacillus bulgaricus TCI904),特別是關於一種保加利亞乳桿菌TCI904或其代謝產物用於減少體重的用途。
益生菌(Probiotics)一般認為是指食入後對宿主(或稱受體,如動物或人類)有正面效益的食入性微生物。其命名源於希臘語「for life」(對生命有益),又稱為「原生保健性菌種」;並且,益生菌主要是指乳酸菌和部分酵母菌。
一般而言,「乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)」是指能利用碳水化合物進行發酵生產多量乳酸之細菌總稱,為一相當龐雜的菌群。在諸多乳酸菌的菌種中,部分乳酸菌菌種的菌株經研究發現其對於受體健康有益,故此些菌株被視為益生菌。換言之,益生菌大部分是乳酸菌,但乳酸菌中只有少數經研究證明對受體健康有益的菌株能被稱為益生菌。
舉例來說,常見的可作為益生菌的乳酸菌的菌種包括腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等,而可作為益生菌的酵母菌的菌種包括酵母菌屬(Saccharomyces)。
乳桿菌屬是一群具有發酵能力、兼性厭氧、不會產生孢子的革蘭氏陽性桿菌。乳桿菌因能夠將碳水化合物發酵成乳酸而得名,通常存在於發酵食物中,例如泡菜與味增等。
本發明之一目的,在於提供一種保加利亞乳桿菌TCI904,其寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號BCRC910984)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號DSM33505)。
在一些實施例中,保加利亞乳桿菌TCI904菌株包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
在一些實施例中,保加利亞乳桿菌TCI904具有抑制脂肪酶活性的能力。
在一些實施例中,保加利亞乳桿菌TCI904抑制脂肪酶的活性至少35%。
本發明之另一目的,在於提供一種組合物,其包含一保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus
)TCI904及/或其代謝產物,所述保加利亞乳桿菌係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號BCRC910984)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號DSM33505)。
在一些實施例中,組合物係用於製備減少一個體的體重或體脂的組合物。
在一些實施例中,體脂為軀幹體脂。
在一些實施例中,組合物係用於製備調節一個體的脂聯素、三酸甘油酯(Triglyceride)、極低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein)或高密度脂蛋白(High density lipoprotein)的組合物。
在一些實施例中,個體為身高體重指數(BMI)大於24或身體體脂率大於25%的個體。
在一些實施例中,組合物含有1X108
CFU個菌數的保加利亞乳桿菌TCI904。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣,將描述於以下內容中,以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
為了使本領域具有通常知識者能瞭解本發明的特點,以下就說明書及申請專利範圍中提及術語及用語進行一般性之說明及定義。除非另有說明,否則文中使用的所有技術及科學上的字詞,皆具有本領域技術人員對於本發明所瞭解的通常意義,當有衝突情形時,應以本說明書之定義為準。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示,各組之間的差異以學生t
檢驗(student'st
-test)進行分析。
本文中所使用數值為近似值,所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內,最佳為在正負5%的範圍內。
本文所述的用語「組合物」,組合物為食品、保養品或醫藥品,較佳是指食品組合物。
本文所述的用語「個體」是指人類或非人的哺乳動物,較佳為人類。
本案發明人自泡菜篩選出一新穎菌株,經16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)序列分析,依親緣關係鑑定為Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus
(又稱Lactobacillus bulgaricus,中文名稱為保加利亞乳桿菌),為德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的亞種,經命名為Lactobacillus bulgaricus TCI904(以下稱為保加利亞乳桿菌TCI904,簡稱TCI904),其係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC910984)、及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM33505)。該保加利亞乳桿菌TCI904係具有如SEQ ID NO: 1所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。
本案發明人研究發現,相較於本案發明人由泡菜篩選出的其他保加利亞乳桿菌(LF063、LF006、LF049),本案的保加利亞乳桿菌TCI904具有明顯更佳的抑制脂肪酶活性功效,可抑制至少35%的脂肪酶活性,更佳可抑制至少39%的脂肪酶活性。
本案發明人研究發現,保加利亞乳桿菌TCI904及/或其代謝產物係具有減少一個體的體重或體脂之功效。因此,本發明係提供一種保加利亞乳桿菌TCI904及/或其代謝產物在製備減少一個體的體重或體脂的組合物之用途,其中,該體脂所指可為軀幹體脂。
本案發明人研究發現,保加利亞乳桿菌TCI904及/或其代謝產物係具有減少一個體的脂聯素、三酸甘油酯、極低密度脂蛋白或高密度脂蛋白之功效。因此,本發明係提供一種保加利亞乳桿菌TCI904及/或其代謝產物在製備減少一個體的的脂聯素、三酸甘油酯、極低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的組合物之用途,其中,該個體所指可為身高體重指數(BMI)大於24或身體體脂率大於25%的個體。
根據本發明,所採用之保加利亞乳桿菌TCI904之代謝產物可以是透過在適於保加利亞乳桿菌TCI904生長的環境下進行培養所產生者。例如:先以適當之培養液對保加利亞乳桿菌TCI904進行培養,其後,視需要地去除前述培養液中之菌體等固體物,以獲得含有代謝產物之液體。或例如,先以適當之培養液對保加利亞乳桿菌TCI904進行培養,其後,以離心等方法使菌體沉降於底部,再直接吸取上清液所獲得含有代謝產物之液體。
可選用任意合宜之培養液以進行保加利亞乳桿菌TCI904之培養,以提供所欲之代謝產物,只要該培養液可提供保加利亞乳桿菌TCI904生長、代謝所需養分(如乳桿菌萃取物、蛋白質及葡萄糖)與條件(如酸鹼值)即可。此外,保加利亞乳桿菌TCI904之培養時間亦無特殊限制,只要足以使保加利亞乳桿菌TCI904完成至少一次代謝循環即可。舉例言之,於本發明一具體實施態樣中,係以MRS培養液對保加利亞乳桿菌TCI904進行培養,歷時18小時,使菌株進行代謝作用並產生代謝產物。
於本發明中,係可直接使用經歷保加利亞乳桿菌TCI904之代謝循環的含保加利亞乳桿菌TCI904與代謝產物的培養液,或使用經移除保加利亞乳桿菌TCI904等固體物之含代謝產物的液體。可採用任何合宜之操作以移除固體物,只要對培養後所產生的代謝產物之所欲效益沒有不利的影響即可。一般而言,係採用物理手段以移除固體物,該物理手段包括,例如:離心分離、濾膜過濾、沉澱傾析等操作。視需要地,可重複或合併進行前述物理操作,以盡可能去除培養液中的菌體等固體物。
根據本發明所提供之組合物可為食品組合物,食品組合物係可以為健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、或特殊營養食品,且可製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食類、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品,但不以此為限。
根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、及特殊營養食品係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用,端視投予個體之年齡、體重、及健康狀況而異。亦可針對特定族群之需要,調整據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、及特殊營養食品中的保加利亞乳桿菌TCI904及/或其代謝產物的含量,例如,調整至每日應服用的量。
針對根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品及/或特殊營養食品,可於其外包裝上標示建議使用量、特定族群(例如高血脂患者、孕婦等)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項等,以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員的指導下自行服用而無安全虞慮。於根據本發明所提供之食品組合物中,有關該保加利亞乳桿菌TCI904及/或其代謝產物之態樣,係如上述之說明。
視需要地,可於根據本發明所提供之食品組合物、或飼料組合物中另外含有合宜用量之添加劑,例如可提高該醫藥組合物、食品組合物、或飼料組合物於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等,以及可改善該醫藥組合物、食品組合物、或飼料組合物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明,而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[製備實施例]
例1:保加利亞乳桿菌TCI904之篩選與鑑定
(1-1)篩選
取泡菜(產地:台灣)中的汁液分別與MRS培養液(BD Difco™ Lactobacilli MRS Broth,型號DF0881-17-5)以體積比1:100的比例混合,並置於37℃下進行厭氧培養(氧氣濃度介於10%至1%,較佳為低於5%),歷時18小時。其後,將前述培養液塗佈於MRS固態培養基(MRS agar)上,並置於37℃下進行厭氧培養,以生成不同的菌落。接著,為確保菌株的單一性,使用無菌接種環挑選一菌落,於固態培養基上進行分區劃線,再置於37°C之厭氧培養箱中培養直到單一菌落(single colony)出現。
(1-2)鑑定
取(1-1)泡菜樣品所分離出之單一菌落的菌株後,進行基因族譜分析(phylogenetic analysis),確認該菌株具有如SEQ ID NO:1所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO:1所示的基因序列分別與其他保加利亞乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他保加利亞乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此,將此分離菌株命名為保加利亞乳桿菌TCI904(後文以TCI904表示)。在此,將此保加利亞乳桿菌TCI904以寄存編號BCRC 910984寄存於財團法人食品工業發展研究所,以及以寄存編號DSM33505寄存於德國國家菌種保藏中心(DSMZ)。
取(1-1)泡菜樣品所分離出之另一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:2所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 2所示的基因序列分別與其他保加利亞乳桿菌亞種之16S rDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他保加利亞乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。在此,將此分離菌株命名為保加利亞乳桿菌LF063(後文以LF063表示)。
其中,取(1-1)泡菜樣品所分離出之再另一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:3所示之16S核糖體核糖核酸(16SrRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 3所示的基因序列分別與其他保加利亞乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他保加利亞乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。在此,將此分離菌株命名為保加利亞乳桿菌LF006(後文以LF006表示)。
其中,取(1-1)泡菜樣品所分離出之再另一個菌落的菌株後,進行基因族譜分析,確認該菌株具有如SEQ ID NO:4所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI線上資料庫進行比對,將SEQ ID NO: 4所示的基因序列分別與其他保加利亞乳桿菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後,可知分離菌株的16SrDNA序列與其他保加利亞乳桿菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此,將此分離菌株命名為保加利亞乳桿菌LF049(後文以LF049表示)。
表一
菌株編號 | 菌種名稱 | 菌種之序列 | 比較亞種(以亞種編號標示) | 相似度 |
TCI904 | Lactobacillus bulgaricus TCI904 | SEQ NO:1 | 4133 | 95.89% |
4121 | 95.90% | |||
3798 | 95.96% | |||
3683 | 95.96% | |||
MGD1-2 | 95.82% | |||
LF063 | Lactobacillus bulgaricus | SEQ NO:2 | IMAU32011 | 96.05% |
4478 | 96.57% | |||
KLDS10.1011 | 96.57% | |||
SKB1083 | 96.57% | |||
MN-BM-F01 | 96.57% | |||
LF006 | Lactobacillus bulgaricus | SEQ NO:3 | IMAU40106 | 96.05% |
4161 | 95.97% | |||
KLDS1.1011 | 95.97% | |||
KLDS1.0207 | 95.97% | |||
L99 | 95.97% | |||
LF049 | Lactobacillus bulgaricus | SEQ NO:4 | IMAU40106 | 95.88% |
4161 | 95.80% | |||
KLDS1.0207 | 95.72% | |||
L99 | 95.72% | |||
MN-BM-F01 | 95.72% |
綜合以上,本發明自泡菜樣品共篩選出四種保加利亞乳桿菌,分別命名為TCI904、LF063、LF006、LF049。
(1-3)保存
使用液態培養的方式將(1-1)所獲得之具單一性之四種保加利亞乳桿菌菌株培養於MRS培養液中,以提供菌液,接著於菌液中添加25%之甘油,將所得混合液移至冷凍保存管中後,置於-80℃保存。
例2:保加利亞乳桿菌TCI904之活化與樣品製備
(2-1)活化
將存有保加利亞乳桿菌TCI904菌株之冷凍保存管解凍,以1%之植菌量(約1x104
CFU/mL)將TCI904菌株接種於MRS培養液中,並置於37℃下進行厭氧培養,歷時18小時,以提供保加利亞乳桿菌TCI904菌液,供後續實驗使用。其餘保加利亞乳桿菌LF063、LF006、LF049也是按照此方式進行活化,本處不再贅述。
(2-2)樣品製備
取(2-1)提供的保加利亞乳桿菌TCI904菌液,以1%之植菌量(約1x104
CFU/mL)接種於MRS培養液之中,並置於37℃下進行厭氧培養,歷時18小時。其後,以5000rpm轉速對培養後的菌液進行離心,歷時5分鐘,再使用0.2μm的濾膜對所獲得之上清液進行過濾,確保已將菌體去除,所得濾液即為TCI904樣品(即為TCI904的代謝產物,不含TCI904菌體)。其餘保加利亞乳桿菌LF063、LF006、LF049也是按照此方式進行樣品製備,本處不再贅述。
[實驗實施例]
例3:保加利亞乳桿菌TCI904抑制脂肪酶活性的試管實驗
(3-1)脂肪酶活性的分析原理
脂肪酶(lipase)是一種催化脂類中酯鍵水解反應的水溶性酵素,其與酯解酶(esterase)的主要差異為具有界面活化(interfacial activation)的特性,必須在油水界面(lipid-water interface)中進行水解催化反應,即:當受質呈乳化狀態(emulsion)時,酵素反應的速率為最高。大多數的脂肪酶係作用於脂類甘油骨架的特定位置,例如:脂肪酶能夠催化三酸甘油酯(triacylglycerols)水解成甘油、單酸甘油酯(monoacylglycerols)、雙醯基甘油酯(diacylglycerols)及游離脂肪酸。依脂肪酶水解三酸甘油酯的特異性,可分為:(1)非特異性脂肪酶(non-specific lipase)、(2)1,3-特異性脂肪酶(1,3-specific lipase)、(3)2-特異性脂肪酶(2-specific lipase)、(4)脂肪酸特異性脂肪酶(fatty acid specific lipase)等,而脂肪酶主要可進行的催化反應有酯解反應(ester hydrolysis)、酯化反應(ester synthesis)、以及轉酯化反應(interesterification)等。
本實施例是利用硝基苯酚(p
-nitrophenol,p
NP)生成量測定法來分析脂肪酶的活性。由於脂肪酶會將硝酸苯酚脂類基質(p
-nitrophenyl esters)進行水解,產生硝基苯酚(p
-nitrophenol,p
NP)及脂肪酸,可於波長約400nm測得硝基苯酚的吸光值定量,利用96孔盤進行分析後,計算脂肪酶活性。硝酸苯酚脂類基質的種類並不限制,在本發明一較佳實施例中,是以4-硝基苯基月桂酸酯(4-Nitrophenyl laurate)作為反應基質,脂肪酶能將其分解成硝基苯酚,再以硝基苯酚的生成量來分析脂肪酶的活性。
(3-2)脂肪酶活性實驗的試劑配製
首先,配置一第一緩衝溶液,該第一緩衝溶液是將17mg十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)與1g聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶於100mL水中;亦配置一第二緩衝溶液,該第二緩衝溶液係66mM三羥甲基氨基甲烷(Tris),並以鹽酸(Hydrochloric acid,HCl)滴定至pH 7.4後,補適量的水至體積為100ml,該第二緩衝溶液是作為製備脂肪酶溶液的緩衝液,以及作為酶解反應的終止劑。接著,取51.4mg的4-硝基苯基月桂酸酯加入100mL上述第一緩衝溶液,並於65℃下攪拌15分鐘使其均勻混合,待溶液呈澄清狀後,於室溫下冷卻後,獲得1.6mM之4-硝基苯基月桂酸酯溶液。該4-硝基苯基月桂酸酯溶液可置於4℃冷藏保存3天,使用時需再加熱至65℃待溶液呈透明澄清狀後,置於室溫下冷卻後即可使用。另一方面,秤取99.21mg脂肪酶(型號L3126,Sigma,來自豬胰臟之脂肪酶)加入上述第二緩衝溶液中,並定量至10mL後混合均勻,以獲得150U/mL的脂肪酶溶液。
(3-3)脂肪酶活性實驗的實驗步驟
取一96孔盤執行實驗,分為控制組及四組實驗組(以各種保加利亞乳桿菌的代謝產物做為測試樣品),下表二說明各組別採用的測試樣品、反應酵素及反應基質。
表二
測試組別 | 測試樣品 | 反應酵素 | 反應基質 |
控制組 | MRS培養液(未培養過菌,不含代謝產物,為單純的培養液) | 脂肪酶 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
控制組 (空白) | MRS培養液(未培養過菌,不含代謝產物,為單純的培養液) | 第二緩衝溶液 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
實驗組A | TCI904代謝產物 | 脂肪酶 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
實驗組A (空白) | TCI904代謝產物 | 第二緩衝溶液 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
實驗組B | LF063代謝產物 | 脂肪酶 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
實驗組B (空白) | LF063代謝產物 | 第二緩衝溶液 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
實驗組C | LF006代謝產物 | 脂肪酶 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
實驗組C (空白) | LF006代謝產物 | 第二緩衝溶液 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
實驗組D (0分鐘) | LF049代謝產物 | 脂肪酶 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
實驗組D(空白) | LF049代謝產物 | 第二緩衝溶液 | 4-硝基苯基月桂酸酯 |
將25μL的測試樣品加入96孔盤的孔中,接著在控制組及各實驗組(實驗組A、實驗組B、實驗組C、實驗組D)孔中加入脂肪酶,在各空白組(控制組(空白)、實驗組A(空白)、實驗組B(空白)、實驗組C (空白)、實驗組D(空白))中加入第二緩衝溶液,混合均勻。接著將50μL的1.6mM之4-硝基苯基月桂酸酯溶液加入孔中,混合均勻。封上塑膠膜防止揮發,置於37℃反應30分鐘,此時控制組及各實驗組中的脂肪酶會與4-硝基苯基月桂酸酯進行反應。最後,加入100μL的第二緩衝溶液來中止所有孔中的反應,接著以ELISA讀取儀(BioTek)讀取各組之OD400nm
讀值,以下列公式計算出脂肪酶活性抑制率。
脂肪酶活性抑制率(%)公式=[1-(A實驗組- A實驗組(空白)/ A控制組- A控制組(空白)]X100%,其中A代表OD400nm
讀值的讀值。
本發明之保加利亞乳桿菌TCI904及其他菌種抑制脂肪酶活性之效果如圖1所示,由圖1可見,將控制組的脂肪酶活性計為100%,實驗組A(TCI904)的脂肪酶活性為60.71%,代表TCI904可抑制脂肪酶活性高達約39.29%;實驗組B(LF063)的脂肪酶活性為78.03%,代表LF063可抑制脂肪酶活性約21.97%;實驗組C(LF006)的脂肪酶活性為76.10%,代表LF006可抑制脂肪酶活性約23.9%;實驗組D(LF049)的脂肪酶活性為71.0%,代表LF049可抑制脂肪酶活性約29.0%。
根據此數據,說明本發明的保加利亞乳桿菌TCI904相較於其他同種菌株,具有明顯更佳抑制脂肪酶活性的能力,表示本發明的保加利亞乳桿菌TCI904具有與其他同種菌株不同的菌學特徵。
例4:保加利亞乳桿菌TCI904刺激脂聯素分泌的細胞實驗
脂聯素(Adiponectin) 是脂肪細胞分泌的一種功能性胜肽,能夠促進肌肉細胞燃燒脂肪轉換成能量,減少體內脂肪堆積,為改善肥胖的關鍵因子,當脂聯素上升時,會促使肌肉燃燒脂肪產生能量維持身體所需。研究證實,中高強度的運動會促使脂聯素上升,幫助肌肉代謝脂肪產生能量,達到減脂的效果。可參見例如:Effects of exercise on adiponectin: a systematic review , Med Sci (Basel). 2018 Dec; 6(4): 97,該文獻之全文併於此處以供參考。
在此實施例中,利用細胞模式,檢測TCI904樣品調節脂聯素分泌的能力。
(4-1)實驗材料
1. 細胞株:小鼠骨髓基質細胞(後續簡稱OP9細胞),OP9細胞購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection,ATCC®
)之OP9細胞株 (ATCC CRL-2749)。
2. 培養基:MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium,購自Gibco,美國)細胞培養液、20%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum,購自Gibco,美國,Cat#10437-028),且加入0.1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin,購自Gibco,美國)。
3. 脂聯素檢測試劑套組(購自CUSABIO,型號CSB-E07272m),套組內含有以下溶液:
3-1:檢測盤(Assay plate)
3-2:標準品(Standard)
3-3:100倍生物素抗體(100X Biotin-antibody)
3-4:100倍HRP親和素(100X HRP-avidin)
3-5:生物素抗體稀釋劑(Biotin-antibody diluent)
3-6:HRP親和素稀釋劑(HRP-avidin diluent)
3-7:樣品稀釋劑(Sample diluent)
3-8:25倍洗滌緩衝液(25X Wash buffer)
3-9:TMB液(TMB substrate)
3-10:終止液(Stop solution)
3-11:清洗液(Wash buffer)
3-12:檢測盤封蓋(Plate sealers)
(4-2)操作前的試劑製備
1. 1倍生物素抗體:將 1 μl的100倍生物素抗體加入 999 μl 的生物素抗體稀釋劑,混和均勻備用
2. 1倍HRP親和素:將 1 μl的100倍HRP親和素加入 999 μl 的HRP親和素稀釋劑,混和均勻備用
3. 1倍洗滌緩衝液:將25倍洗滌緩衝液回溫後,輕搖至結晶全部溶解,將 20 ml 的25倍洗滌緩衝液加入 480 ml 的水,混和均勻備用
4. 標準液:將標準品小管以 6000-10000 rpm 離心 30 秒,使粉末聚集至底部。加入 1 ml樣品稀釋劑混和均勻,靜置 15 分鐘使其充分溶解,達最終濃度 10 ng/ml
5. 標準液序列稀釋:準備 7 個 1.5 ml 微量離心管,分別加入250 μl 樣品稀釋劑,取 250 μl 標準液至第 6 管,混和均勻後再從第 6 管取 250 μl 至第 5 管,序列稀釋至第 1 管,最終獲得濃度為10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.25 ng/ml、0.625 ng/ml、0.313 ng/ml、0.156 ng/ml的標準液
以下簡述脂聯素檢測步驟,詳細操作步驟可參照脂聯素檢測試劑套組所附的使用說明書執行,可參見https://www.cusabio.com/uploadfile/Ins/CSB-E07272m.pdf,該使用說明書之全文併於此處以供參考。
(4-3)脂聯素檢測前處理(細胞培養及分組方式)
首先,取24孔培養盤,將每孔接種8×104
個OP9細胞及500μL上述培養基,在37℃下培養7天。此7天的細胞培養期間每隔3天更換培養基。7天後,以顯微鏡(ZEISS;放大倍率400x)觀察細胞內油滴形成,藉以確認細胞已完全分化為脂肪細胞。
然後,將分化完成的脂肪細胞分為以下三組:控制組、空白組與實驗組,下列表三說明各組的添加成分、細胞實驗濃度以及處理時間。
表三
組別 | 添加成分 | 細胞實驗濃度(相對於培養基的體積百分比) | 處理時間 |
空白組 | 無 | 無 | 24小時 |
控制組 | MRS培養液 | 0.5%(v/v) | 24小時 |
實驗組 | TCI904樣品(由例(2-2 )所述方法所製備) | 0.5%(v/v) | 24小時 |
詳細來說,各組是以以下方式進行培養。
空白組:依照每孔500μL培養基體積量的方式培養分化後脂肪細胞,在37℃下培養24小時。
控制組:依照每孔500μL培養基含有2.5μL的MRS培養液(即,濃度為0.5%(v/v))的方式,培養分化後脂肪細胞,在37℃下培養24小時。
實驗組:依照每孔500μL培養基含有2.5μL的例(2-2)所製備的TCI904樣品(TCI904的代謝產物,不含TCI904菌體)(即,TCI904樣品濃度為0.5%(v/v))的方式,培養分化後脂肪細胞,在37℃下培養24小時。
(4-4)脂聯素檢測流程
上述細胞培養後,將孔內培養液移至 1.5 ml 微量離心管。於 2-8℃以 1000 xg 離心 15 分鐘,將離心後的上清液移至新的 1.5 ml 微量離心管,接著將上清液稀釋2000倍,接著以脂聯素檢測試劑套組進行檢測,操作方式如下。
取 100 μl 序列稀釋標準品和測試樣品(上清液)至檢測盤孔中,用檢測盤封蓋封好,於37℃靜置2小時。接著將孔內液體移除,不須沖洗。
加入 100 μl 1倍生物素抗體,用新的檢測盤封蓋封好,於37℃靜置1小時。將孔盤內液體移除,以 200 μl 1倍洗滌緩衝液潤洗2次。清洗完後將孔內液體移除,並倒置於紙巾上去除多餘液體。
加入 100 μl 1倍HRP親和素,用新的檢測盤封蓋封好,於37℃ 靜置1小時。將孔盤內液體移除,以 200 μl 1倍洗滌緩衝液潤洗2次。清洗完後將孔內液體移除,並倒置於紙巾上去除多餘液體。
加入 90 μl TMB液,於37℃避光反應15-30分鐘,接著加入50 μl 終止液,輕拍使其充分混和。以ELISA讀取儀(BioTek)讀取各組之OD548nm
讀值(O.D. 值越大,表示脂聯素的含量越高)。最後使用Excel軟體中的student t-test 進行統計分析。
經過吸光值的比較換算並乘回稀釋倍數,空白組所測得脂聯素含量為2254.75 ng/ml,控制組所測得脂聯素含量為1974.02 ng/ml,實驗組所測得脂聯素含量為2508.51 ng/ml。
請參閱圖2。將空白組的脂聯素含量為2254.75 ng/ml視為1(即100%)時,控制組的脂聯素的含量(1974.03 ng/ml)為0.87(即87%),實驗組的脂聯素的含量(2508.51 ng/ml)為1.11(即111%),代表細胞經TCI904樣品(TCI904之代謝產物,不含TCI904菌體)處理後,細胞分泌脂聯素的含量顯著增加,為空白組的1.11倍。
由此可知,當分化後脂肪細胞經TCI904樣品處理後,脂聯素的含量提升,代表TCI904能有效提升脂聯素的含量,具有減脂的潛力。
例5:保加利亞乳桿菌TCI904的人體實驗
為進一步確認保加利亞乳桿菌TCI904對於人體的影響,令9位受試者每日服用1顆保加利亞乳桿菌TCI904的活菌膠囊(每顆膠囊含有1X108
CFU(即1X108
CFU/cap)菌數的保加利亞乳桿菌TCI904),並服用4週。其中,9位受試者的身高體重指數(BMI)大於24,或為體脂高的族群(身體體脂率大於25%)。並且,每顆膠囊含有100毫克保加利亞乳桿菌TCI904之活菌粉。
於試驗前(即未開始服用TCI904活菌膠囊前,視為第0週)及於試驗後(即服用TCI904活菌膠囊4週後,視為第4週)分別進行體重、軀幹體脂率、腰圍、三酸甘油酯(Triglyceride,TG)、極低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein,VLDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)的檢測,各項數值的量測方式如下所述。
體重和軀幹體脂率是利用體重體脂計(TANITA四肢與軀幹體組成計,型號BC-545F)進行檢測,而腰圍是以皮尺進行量測,詳細來說,除去受試者腰部覆蓋衣物,受試者保持輕鬆站立,雙手自然下垂,檢測者將皮尺繞過受試者腰部,調整高度,以肚臍為水平量測點,同時注意皮尺與地面保持平,並緊貼、不擠壓皮膚,受試者維持正常呼吸。在吐氣結束時,量取腰圍數值。
三酸甘油酯、極低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的檢測方式是對受試者進行靜脈採血,並將血液樣本送至檢驗所(立人醫事檢驗所)測定三酸甘油脂、極低密度脂蛋白及高密度脂蛋白的數值。
需要特別說明的是,第0週的量測結果與第4週的量測結果之間的統計學顯著差異是藉由Excel 軟體中的 student t-test來統計分析。
請參閱圖3。於試驗前(即圖3中第0週),所有受試者的平均體重為86.3公斤,而在試驗後(即圖3第4週),所有受試者的平均體重為85.7公斤。換言之,經過4週每日服用一顆含有1X108
CFU 的TCI904的活菌膠囊後,受試者的平均體重下降0.6公斤。基此,保加利亞乳桿菌TCI904能降低體重。
請參閱圖4。於試驗前(即圖4的第0週),所有受試者的平均軀幹體脂率為36.9%,而在試驗後(即圖4的第4週),所有受試者的平均軀幹體脂率為36.3%。
請參閱圖5,於試驗前(即圖5的第0週),所有受試者的平均腰圍為99.9公分,而在試驗後(即圖5第4週),所有受試者的平均腰圍為98.2公分。
換言之,經過4週每日服用一顆含有1X108
CFU 的TCI904的活菌膠囊後,受試者的平均軀幹體脂率下降0.6%,腰圍平均減少1.7公分。基此,保加利亞乳桿菌TCI904能降低軀幹體脂率及腰圍。
因此,保加利亞乳桿菌TCI904具有降低體重、降低軀幹體脂率及腰圍的功效。
三酸甘油酯,又叫中性脂肪,是人體內的一種脂肪,也存在許多食物中。人體攝取油脂、蛋白質或碳水化合物產生的熱量,未被消耗掉的部份轉變成三酸甘油酯,儲存在肝臟或脂肪細胞中,作為備用能量。熱量過盛則增加三酸甘油酯,構成皮下脂肪主要成分,導致肥胖或動脈硬化等疾病。
請參閱圖6,於試驗前(即圖6的第0週),所有受試者的平均三酸甘油脂為113.8 mg/dL,而在試驗後(即圖6的第4週),所有受試者的平均三酸甘油脂為108.9 mg/dL,相當於三酸甘油脂降低了約4.3%。
極低密度脂蛋白,主要成分為三酸甘油脂,於肝臟或小腸內合成。若食入大量的脂肪或醣類,則會增加極低密度脂蛋白的合成。低密度脂蛋白其主要的作用是將膽固醇由肝臟帶到週邊組織。若血液中的低密度脂蛋白過高,容易造成冠狀動脈硬化及心臟病。
請參閱圖7,於試驗前(即圖7的第0週),所有受試者的平均極低密度脂蛋白為19.9 mg/dL,而在試驗後(即圖7第4週),所有受試者的平均極低密度脂蛋白為17.7 mg/dL,相當於極低密度脂蛋白降低了約11.0%。
高密度脂蛋白主要的功能是將週邊組織的膽固醇帶回肝臟代謝。血液中高密度脂蛋白越高,罹患冠狀動脈硬化及心臟病的機率越低。
請參閱圖8,於試驗前(即圖8的第0週),所有受試者的平均高密度脂蛋白為53.2 mg/dL,而在試驗後(即圖8第4週),所有受試者的平均高密度脂蛋白為59.3 mg/dL,相當於高密度脂蛋白提升了約11.4%。
換言之,經過4週每日服用一顆含有1X108
CFU 的TCI904的活菌膠囊後,受試者的三酸甘油脂降低了約4.3%,極低密度脂蛋白降低了約11.0%,高密度脂蛋白提升了約11.4%。基此,保加利亞乳桿菌TCI904能降低三酸甘油脂、極低密度脂蛋白以及提升高密度脂蛋白。
綜上,透過例3可知,在試管模式中證實,保加利亞乳桿菌TCI904可抑制脂肪酶活性,且抑制程度明顯多於其他保加利亞乳桿菌菌株。透過例4可知,保加利亞乳桿菌TCI904有提升脂聯素的能力。透過例5可知,保加利亞乳桿菌TCI904能降低體重、降低軀幹體脂、降低腰圍、減少三酸甘油脂、減少極低密度脂蛋白、提升高密度脂蛋白。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾,皆應涵蓋於本發明的範疇內,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1是試管實驗中的脂肪酶活性檢測的結果圖;
圖2是細胞實驗中的脂聯素含量檢測的結果圖(*表示與空白組比較有顯著差異,p<0.05);
圖3是人體實驗中的體重檢測的結果圖(*表示與第0週比較有顯著差異,p<0.05);
圖4是人體實驗中的軀幹體脂檢測的結果圖;
圖5是人體實驗中的腰圍檢測的結果圖(*表示與第0週比較有顯著差異,p<0.05);
圖6是人體實驗中的三酸甘油酯含量檢測的結果圖(***表示與第0週比較有顯著差異,p<0.001);
圖7是人體實驗中的極低密度脂蛋白含量檢測的結果圖(*表示與第0週比較有顯著差異,p<0.05);
圖8是人體實驗中的高密度脂蛋白含量檢測的結果圖(**表示與第0週比較有顯著差異,p<0.01)。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所 2020/03/27 BCRC 910984
DE德國 德國國家菌種保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) 2020/4/17 DSM33505
Claims (10)
- 一種保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus )TCI904,其寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號BCRC910984)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號DSM33505)。
- 如請求項1所述之保加利亞乳桿菌TCI904,其包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
- 如請求項1所述之保加利亞乳桿菌TCI904,其具有抑制脂肪酶活性的能力。
- 如請求項3所述之保加利亞乳桿菌TCI904,其抑制脂肪酶的活性至少35%。
- 一種組合物,其包含一保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus )TCI904及/或其代謝產物,所述保加利亞乳桿菌係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號BCRC910984)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號DSM33505)。
- 一種如請求項5所述之組合物的用途,其係用於製備減少一個體的體重或體脂的組合物。
- 如請求項6所述之用途,所述體脂為軀幹體脂。
- 一種如請求項5所述之組合物的用途,其係用於製備調節一個體的脂聯素、三酸甘油酯(Triglyceride)、極低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein)或高密度脂蛋白(High density lipoprotein)的組合物。
- 如請求項6或8所述之用途,所述個體為身高體重指數(BMI)大於24或身體體脂率大於25%的個體。
- 如請求項6或8所述之用途,其中所述組合物含有1X108 CFU個菌數的保加利亞乳桿菌TCI904。
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