TW202039822A - 分泌型之β－半乳糖苷酶之製造方法 - Google Patents

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Abstract

一種分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法，其特徵為將源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因導入至米麴菌，使其產生分泌型之β-半乳糖苷酶；及根據利用由該方法所製造之β-半乳糖苷酶的半乳寡糖之製造方法，即容易製造半乳寡糖。

Description

分泌型之β－半乳糖苷酶之製造方法
本發明係有關於一種容易利用於半乳寡糖的製造之分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法。
周知β-半乳糖苷酶會催化水解乳糖等的β-D-半乳糖苷鍵之反應，同時也會催化半乳糖轉移反應，而使用於在腸內選擇性地使雙叉乳酸桿菌繁殖之半乳寡糖的製造。
迄此，本案申請人既已報導利用β-半乳糖苷酶來製造半乳寡糖之技術(專利文獻1)，其中該β-半乳糖苷酶係源自屬擔子菌酵母之獨特擲孢酵母的高力價突變株。
然而，由於此技術所使用的β-半乳糖苷酶為非分泌型(細胞壁結合性)，而需調成包含產生其之獨特擲孢酵母之菌體的菌體濃縮液來使用於反應。
此菌體濃縮液由於為生菌而容易變質；而且，由於僅將菌體濃縮，從而比活性較低，且亦有菌體內容物漏出至半乳寡糖反應液而導致純化成本提高等問題。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2006-223268號公報
[發明所欲解決之課題]
本發明課題係提供一種解決上述問題之容易利用於半乳寡糖的製造之製造β-半乳糖苷酶之方法。 [解決課題之手段]
本案發明人等為解決上述課題而致力研究的結果發現，藉由將源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因導入至米麴菌，可產生分泌型之β-半乳糖苷酶，且其容易利用於半乳寡糖的製造，而完成本發明。
亦即，本發明為一種分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法，其特徵為將源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因導入至米麴菌，使其產生分泌型之β-半乳糖苷酶。
又，本發明為一種源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因，其為序列編號7、13、19所記載之序列。
再者，本發明為一種米麴菌之轉形體，其特徵為於米麴菌中導入有源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因，而產生分泌型之β-半乳糖苷酶。
甚而，本發明為一種半乳寡糖之製造方法，其特徵為使以前述β-半乳糖苷酶之製造方法所製造的β-半乳糖苷酶作用於至少含有乳糖的基質。
又，本發明為一種分泌型之β-半乳糖苷酶，其係藉由將源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因導入至米麴菌，再將其培養而得。 [發明之效果]
本發明之分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法可使源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶成為分泌型而得。
因此，以本發明之分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法所得到的β-半乳糖苷酶其β-半乳糖苷酶活性較高、熱穩定性亦高，而且容易分離、純化，而容易利用於半乳寡糖的製造。
[實施發明之形態]
本發明之分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法(下稱「本發明製法」)係將源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因導入至米麴菌，使其產生分泌型之β-半乳糖苷酶。
本發明製法所使用之源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因係可編碼擔子菌酵母所產生之非分泌型之β-半乳糖苷酶者。此處所稱非分泌型，係指具有細胞壁結合性者，其可藉由活性染色等來確認。
又，可產生非分泌型之β-半乳糖苷酶的擔子菌酵母不特別限定，可舉出例如屬獨特擲孢酵母(Sporobolomyces singularis)等擲孢酵母菌屬、大鏈擔耳(Sirobasidium magnum)等鏈擔耳菌屬、小紅酵母菌(Rodotorula minuta)等紅酵母屬、Sterigmatomyces elviae等梗孢酵母屬、羅倫隱球菌(Cryptococcus laurentii)等隱球菌屬等之擔子菌酵母。此等擔子菌酵母當中，較佳為屬擲孢酵母菌屬或者梗孢酵母屬者，更佳為獨特擲孢酵母或Sterigmatomyces elviae。
再者，可編碼擔子菌酵母所產生之非分泌型之β-半乳糖苷酶的基因，首先可舉出由可產生上述之非分泌型之β-半乳糖苷酶的擔子菌酵母，依循PCR等常見方法所選殖的基因。此外，此基因較佳為由如前述方式所得之基因的資訊，配合宿主進行全合成而得者。
具體而言可舉出以下基因。此外，此基因中亦包含訊息序列。
・由序列編號1所記載之鹼基序列所構成的源自獨特擲孢酵母之β-半乳糖苷酶基因(序列中1～57號為訊息序列) ・由序列編號7所記載之鹼基序列所構成的源自大鏈擔耳之β-半乳糖苷酶基因(序列中1～48號為訊息序列) ・由序列編號13所記載之鹼基序列所構成的源自小紅酵母菌之β-半乳糖苷酶基因(序列中1～57號為訊息序列) ・由序列編號19所記載之鹼基序列所構成的源自Sterigmatomyces elviae之β-半乳糖苷酶基因(序列中1～57號為訊息序列)
又，上述基因之較佳者係將前述各擔子菌酵母的訊息序列取代為米麴菌的訊息序列者。米麴菌的訊息序列可舉出例如米麴菌之α-澱粉酶(Taka-amylase:TAA)的分泌訊息(TAA signal)序列(Okazaki, F., Aoki, J., Tabuchi, S., Tanaka, T., Ogino, C., and Kondo, A., Efficient heterologous expression and secretion in Aspergillus oryzae of a llama variable heavy-chain antibody fragment V(HH) against EGFR. Appl Microbiol Biotechnol 96, 81-88 (2012).)、米根黴之脂肪酶的分泌訊息(Hama, S., Tamalampudi, S., Shindo, N., Numata, T., Yamaji, H., Fukuda, H., and Kondo, A., Role of N-terminal 28-amino-acid region of Rhizopus oryzae lipase in directing proteins to secretory pathway of Aspergillus oryzae. Appl Microbiol Biotechnol 79, 1009-1018 (2008).)等。此類訊息序列的取代可依循常見方法來進行。
將此種前述各擔子菌酵母的訊息序列取代為米麴菌的訊息序列之β-半乳糖苷酶基因當中，較佳者可舉出以下基因。此等序列係由米麴菌的分泌訊息(TAA signal)序列與編碼天然之β-半乳糖苷酶之序列所構成。
・由序列編號3所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因(序列中1～63番為分泌訊息序列) ・由序列編號9所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因(序列中1～63號為分泌訊息序列) ・由序列編號15所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因(序列中1～63號為分泌訊息序列) ・由序列編號21所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因(序列中1～63號為分泌訊息序列)
上述基因當中，較佳為在不變更β-半乳糖苷酶之胺基酸序列的範圍內變更編碼天然之β-半乳糖苷酶之序列的密碼子者。此類β-半乳糖苷酶基因可舉出以下基因。此等序列係由米麴菌的分泌訊息(TAA signal)序列與在不變更β-半乳糖苷酶之胺基酸序列的範圍內變更編碼天然之β-半乳糖苷酶之序列的密碼子的序列所構成。
・由序列編號5所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因(序列中1～63號為分泌訊息序列) ・由序列編號11所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因(序列中1～63號為分泌訊息序列) ・由序列編號17所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因(序列中1～63號為分泌訊息序列) ・由序列編號23所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因(序列中1～63號為分泌訊息序列)
上述基因當中，較佳為由序列編號5、11、23所記載之鹼基序列所構成的β-半乳糖苷酶基因。
本發明製法所使用之待導入上述β-半乳糖苷酶基因的米麴菌不特別限定，可舉出例如三磷酸腺苷硫酸化酶基因(sC)- 及硝酸還原酵素基因(niaD)- 之米麴菌NS4株(可由獨立行政法人 酒類綜合研究所 郵遞區號739-0046 廣島縣東廣島市鏡山3-7-1分售)、米麴菌niaD300、米麴菌RIB40、米麴菌ATCC11488。此等當中較佳為米麴菌NS4株。
本發明製法中，將上述基因導入至米麴菌的方法不特別限定，例如，只要以常見方法將上述基因導入至表現載體即可。表現載體的種類不特別限定，較佳為源自米麴菌之表現載體，尤以利用與澱粉酶系基因的表現控制有關之順式作用元件(Region III)的改良啟動子(藉由導入順式作用元件之Aspergillus oryzae烯醇化酶啟動子的改良，Tsuboi, H. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.,69, 206-208 (2005))與包含高轉譯效率的5’UTR序列之高表現載體(日本專利第4413557號)為佳。再者，此等載體中，為了選擇轉形體，亦可導入安比西林等抗生素的耐性基因，或者導入作為標記之三磷酸腺苷硫酸化酶表現片匣等。
上述表現載體可基於上述文獻所記載之方法來調製，亦可委託例如大關股份有限公司(郵遞區號663-8227 兵庫縣西宮市今津出在家町4番9號)之蛋白質委託表現服務來製作。
將上述基因導入於表現載體後，將其導入至米麴菌而使其進行轉形。使米麴菌進行轉形之方法不特別限定，只要以例如原生質體-PEG法、電穿孔法等常見方法來進行即可。進行轉形後，亦可依循常見方法適當進行洗淨、選擇、集菌等。
如此將源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因導入至米麴菌，可獲得可產生分泌型之β-半乳糖苷酶的米麴菌之轉形體。藉由對此轉形體適當以DPY培養基、CDD培養基等進行培養，可由米麴菌產生分泌型之β-半乳糖苷酶。
上述所得之β-半乳糖苷酶由於為分泌型，純化例如可僅將培養後的培養液過濾並進行離心分離等予以分離，並採取上清液。又，亦可使用超過濾膜等來濃縮上清液。此β-半乳糖苷酶有β-半乳糖苷酶的活性高、熱穩定性亦高且雜質較少之特點。
此種分泌型之β-半乳糖苷酶之胺基酸序列的較佳者係例如如下所示。 ・由序列編號2所記載之胺基酸序列所構成的源自獨特擲孢酵母之β-半乳糖苷酶(序列中1～575號)(序列編號4、6所記載之胺基酸序列亦同(序列中1～575號)) ・由序列編號8所記載之胺基酸序列所構成的源自大鏈擔耳之β-半乳糖苷酶(序列中1～685號)(序列編號10、12所記載之胺基酸序列亦同(序列中1～685號)) ・由序列編號14所記載之胺基酸序列所構成的源自小紅酵母菌之β-半乳糖苷酶(序列中1～581號)(序列編號16、18所記載之胺基酸序列亦同(序列中1～581號)) ・由序列編號20所記載之胺基酸序列所構成的源自Sterigmatomyces elviae之β-半乳糖苷酶(序列中1～581號)(序列編號22、24所記載之胺基酸序列亦同(序列中1～581號))
上述β-半乳糖苷酶當中，較佳為由序列編號2所記載之胺基酸序列所構成的源自獨特擲孢酵母之β-半乳糖苷酶、由序列編號8所記載之胺基酸序列所構成的源自大鏈擔耳之β-半乳糖苷酶、由序列編號20所記載之胺基酸序列所構成的源自Sterigmatomyces elviae之β-半乳糖苷酶。
此β-半乳糖苷酶除了會朝菌體外分泌以外，尚具有即使經過長期保存，β-半乳糖苷酶的活性也不會降低，熱穩定性及保存性良好之性質。此外，β-半乳糖苷酶的活性能以後述實施例所記載之方法來確認。一般而言，為了有效地製造半乳寡糖，有時會使用多種β-半乳糖苷酶；而上述所得之β-半乳糖苷酶，單獨使用也能有效地製造半乳寡糖。
上述所得之β-半乳糖苷酶可與向來周知之β-半乳糖苷酶同樣地使用於例如使β-半乳糖苷酶作用於含有至少乳糖的基質來製造半乳寡糖。此外，此β-半乳糖苷酶由於為分泌型，在製造半乳寡糖時，無需特別進行菌體的去除等。
具體而言，要使上述所得之β-半乳糖苷酶作用於至少含有乳糖的基質，只要對至少含有乳糖的基質添加β-半乳糖苷酶，並維持既定的溫度即可。β-半乳糖苷酶的添加量不特別限定，例如相對於乳糖100g為1～50U，較佳為5～10U。再者，使β-半乳糖苷酶作用於基質的溫度不特別限定，係30～90℃，較佳為60～90℃，維持時間只要適宜設定即可。至少含有乳糖的基質中，亦可添加經半乳糖基化之糖類；此種糖類不特別限定，可舉出例如半乳糖、甘露糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、N-乙醯葡萄糖胺、α-甲基甘露糖苷、α-甲基半乳糖苷、α-甲基葡萄糖苷、2-脫氧葡萄糖、2-脫氧半乳糖等。
如上述所製造的半乳寡糖係富含5糖以下之半乳寡糖，尤為3糖之半乳寡糖。
此外，如上述所製造的半乳寡糖可直接使用，惟亦可使用一般的純化手法予以分離純化。純化方法無特殊限制，具體而言可藉由施予離子交換、凝膠過濾、活性碳、親和層析法等各種層析法而予以純化。
如此所得之半乳寡糖可利用於有用的食品素材、醫藥品原料或試劑。 [實施例]
以下舉出實施例對本發明詳細地說明，惟本發明不受此等實施例任何限定。
此等實施例中所使用之擔子菌酵母的寄存編號如下。 ・獨特擲孢酵母 ATCC 24193 ・小紅酵母菌 CBS 319 ・Sterigmatomyces elviae IFO 1843 ・大鏈擔耳 CBS 6803 ATCC：10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA CBS：Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands IFO：郵遞區號532-8686 大阪市淀川區十三本町2丁目17番85號
實施例1 源自獨特擲孢酵母之β-半乳糖苷酶基因的取得： 基於文獻(Ishikawa, E., Sakai, T., Ikemura, H., Matsumoto, K., and Abe, H., Identification, cloning, and characterization of a Sporobolomyces singularis beta-galactosidase-like enzyme involved in galacto-oligosaccharide production. J Biosci Bioeng 99, 331-339 (2005).)取得獨特擲孢酵母之β-半乳糖苷酶基因(序列編號1)。此基因包含訊息序列與編碼β-半乳糖苷酶之序列。於電腦上獲得將此基因的訊息序列取代為米麴菌之TAA signal序列的序列(序列編號3)，並進一步將β-半乳糖苷酶基因，取得在不變更β-半乳糖苷酶之胺基酸序列的範圍內變更編碼天然之β-半乳糖苷酶之序列的密碼子的序列(序列編號5)(SsGal)。將此SsGal委託GenScript公司來進行全合成。
實施例2 源自大鏈擔耳之β-半乳糖苷酶基因的取得： 由保存區域設計簡併引子(表1)(序列編號25～29)，以Forward2種×Reverse3種共計6種組合用RT-PCR選殖出部分序列。由該部分序列進行5’RACE及3’RACE，而取得全長cDNA。
Figure 02_image001
基於上述全長cDNA，由上游區域之起始密碼子(ATG)類推而獲得源自大鏈擔耳之β-半乳糖苷酶基因(序列編號7)。此基因包含訊息序列與編碼β-半乳糖苷酶之序列。於電腦上獲得將此基因的訊息序列取代為米麴菌之TAA signal序列的序列(序列編號9)，並進一步將β-半乳糖苷酶基因，取得在不變更β-半乳糖苷酶之胺基酸序列的範圍內變更編碼天然之β-半乳糖苷酶之序列的密碼子的序列(序列編號11)(SmGal)。將此SmGal委託GenScript公司來進行全合成。
實施例3 源自小紅酵母菌之β-半乳糖苷酶基因的取得： 以與源自大鏈擔耳之β-半乳糖苷酶基因同樣的手法獲得小紅酵母菌之β-半乳糖苷酶基因(序列編號13)。此基因包含訊息序列與編碼β-半乳糖苷酶之序列。於電腦上獲得將此基因的訊息序列取代為米麴菌之TAA signal序列的序列(序列編號15)，並進一步將β-半乳糖苷酶基因，取得在不變更β-半乳糖苷酶之胺基酸序列的範圍內變更編碼天然之β-半乳糖苷酶之序列的密碼子的序列(序列編號17)(RmGal)。將此RmGal委託GenScript公司來進行全合成。
實施例4 源自Sterigmatomyces elviae之β-半乳糖苷酶基因的取得： 以與源自大鏈擔耳之β-半乳糖苷酶基因同樣的手法獲得Sterigmatomyces elviae之β-半乳糖苷酶基因(序列編號19)。此基因包含訊息序列與編碼β-半乳糖苷酶之序列。於電腦上獲得將此基因的訊息序列取代為米麴菌之TAA signal序列的序列(序列編號21)，並進一步將β-半乳糖苷酶基因，取得在不變更β-半乳糖苷酶之胺基酸序列的範圍內變更編碼天然之β-半乳糖苷酶之序列的密碼子的序列(序列編號23)(SeGal)。將此SeGal委託GenScript公司來進行全合成。
實施例5 SsGal轉形體的取得： 將實施例1中所得之SsGal送託大關股份有限公司(郵遞區號663-8227 兵庫縣西宮市今津出在家町4番9號)之蛋白質委託表現服務，而導入至表現載體。
轉形用宿主係使用源自米麴菌之硝酸還原酵素基因(niaD)- 、屬三磷酸腺苷硫酸化酶基因(sC)- 株的NS4株(由獨立行政法人 酒類綜合研究所 郵遞區號739-0046 廣島縣東廣島市鏡山3-7-1分售)，對其以一般的原生質體-PEG法導入表現載體，而得到轉形體(SsGal株)。此外，轉形體的選拔係藉由sC- 的形質互補來進行。
實施例6 SmGal轉形體的取得： 除使用實施例2中所得之SmGal以外，係與實施例5同樣地獲得導入之表現載體及轉形體(SmGal株)。
實施例7 RmGal轉形體的取得： 除使用實施例3中所得之RmGal以外，係與實施例5同樣地獲得導入之表現載體及轉形體(RmGal株)。
實施例8 SeGal轉形體的取得： 除使用實施例4中所得之SeGal以外，係與實施例5同樣地獲得導入之表現載體及轉形體(SeGal株)。
實施例9 轉形體之產生β-半乳糖苷酶的評定： (1)活性測定 實施例5～8中所得之各轉形體當中，SsGal株係以CDD培養基(2% dextrin、0.2% glucose、0.2% NH4 Cl、0.002% KCl、0.001% K2 HPO4 、0.0005% MgSO4 ・7H2 O、2×10-5 % CuSO4 ・5H2 O、1×10-5 % FeSO4 ・7H2 O、1×10-6 % ZnSO4 ・7H2 O、1×10-6 % MnSO4 ・5H2 O、1×10-6 % AlCl3 、200 mM MOPS-NaOH buffer pH 7.0)於30℃培養144小時(15 mL/容積100 mL之三角燒瓶規模)。RmGal株係以2×DPY培養基(4% dextrin、2% hipolypepton、2% yeast extract、1% KH2 PO4 、0.1% MgSO4 ・7H2 O)於30℃培養144小時(150 mL/容積500 mL搖瓶規模)。SmGal株係以2×DPY培養基於30℃培養168小時(150 mL/容積500 mL搖瓶規模)。SeGal株則以DPY培養基(2% dextrin、1% hipolypepton、1% yeast extract、0.5% KH2 PO4 、0.05% MgSO4 ・7H2 O)於30℃培養168小時。回收培養上清液，與2×試樣緩衝液(125 mM Tris-HCl(pH 6.8)、20% 甘油、0.01% 溴酚藍、4% SDS、200 mM DTT)等量混合，於100℃進行處理10分鐘後，供予SDS-PAGE(CBB染色)。
又，以ONPG為基質的活性測定係依以下方法實施。調製對50mM的檸檬酸磷酸緩衝液(pH4.0)添加2-硝基苯基-β-半乳糖苷(ONPG)而調成12.5mM的溶液。對此溶液0.8mL添加50mM之檸檬酸磷酸緩衝液(pH4.0)中含有420nm的吸光度經稀釋成0.2～0.8的上述β-半乳糖苷酶之培養上清液0.2mL，於30℃使其反應10分鐘(試驗液)。添加0.25M碳酸鈉溶液4mL將反應中止後，進行離心分離(3,000g、10分)，以分光光度計測定420nm的吸光度來定量上清液中所含游離之2-硝基酚量。另一方面，對2-硝基苯基-β-半乳糖苷溶液添加50mM的檸檬酸磷酸緩衝液(pH4.0)後作為空白試劑，預先添加碳酸鈉溶液，與添加、混合含有上述β-半乳糖苷酶的培養上清液同時進行反應停止・發色後作為反應起始液(盲檢)。酵素活性1單位(U)係定為在此條件下1分鐘游離出1微莫耳的2-硝基酚的酵素量，以下式算出。
【數1】
Figure 02_image003
將SDS-PAGE及活性測定的結果示於圖1～4。藉由CBB染色，RmGal株、SmGal株、SeGal株經檢測出母株所沒有的特殊譜帶，將其推定為各β-半乳糖苷酶。就SsGal株，在DPY培養基中雖未發現特殊譜帶，但在以CDD(pH 7.0)培養基培養時檢測出母株所沒有的特殊譜帶，而將其推定為β-半乳糖苷酶。茲探討可提高各β-半乳糖苷酶之分泌生產性的培養條件。其結果，SsGal株在CDD (pH 7.0)培養基、30℃、144小時，RmGal株在2×DPY培養基、30℃、144小時，SmGal株在2×DPY培養基、30℃、168小時，SeGal株在DPY培養基、30℃、168小時的條件下活性達最大。又，由SDS-PAGE之譜帶的濃度推定，SsGal株、RmGal株、SmGal株、SeGal株的生產性各為約200mg/L、約200mg/L、約200mg/L、約1g/L。
(2)拷貝數推定 又，以即時PCR法進行導入至轉形體之表現片匣數的推定。
由PCR的結果，推定SsGal株、RmGal株、SmGal株為插入有1拷貝，SeGal株則為插入有2拷貝表現片匣的株。
(3)熱失活試驗 將以(1)所記載之培養條件培養的各轉形體與母株(NS4株)的培養液1mL，於40℃、50℃、60℃、70℃、80℃各培養1小時，並實施酵素活性測定及SDS-PAGE。
將SDS-PAGE及活性測定的結果示於圖5～8。SsGal株在40℃前可維持活性，若於50℃培養1小時則活性減少約70%，於70℃活性消失。以相同條件培養之母株的活性在60℃前可微量地檢測出，於70℃消失。RmGal株在50℃前可保持活性，若於60℃培養1小時則活性消失。以相同條件培養之母株的活性在70℃前可檢測出，於80℃消失。SmGal株在50℃前可保持活性，若於60℃培養1小時則活性減少約20%，於80℃活性消失。以相同條件培養之母株的活性在70℃前可檢測出，於80℃消失。SeGal株在70℃前可保持活性。若於80℃培養1小時則活性減少約97%。以相同條件培養之母株的活性在40℃前可檢測出，於50℃消失。又，針對SeGal以短於1小時的時間(5分鐘、10分鐘、20分鐘)進行80℃處理。其結果，藉由在80℃進行處理5分鐘，活性減少約37%；藉由進行處理20分鐘則減少約98%。再者，測定活性的結果，40℃處理及50℃處理均顯示高於母株之活性。
由以上可知，SeGal株在高溫下也能保持活性。
實施例10 夾雜酵素的去除： 如實施例9之(3)所示，可知SeGal株在高溫下也能保持活性。另一方面，針對屬SeGal株之母株的源自米麴菌之夾雜酵素與實施例9之(3)同樣地進行熱失活試驗，可藉由70℃的熱處理使其失活。因此，可知SeGal株所產生的β-半乳糖苷酶可藉由熱處理來進行純化(圖9)。
實施例11 半乳寡糖的製造(1)： 對含有66%(w/v)之乳糖的溶液150mL添加使實施例9中所得之SsGal株、SmGal株、SeGal株的培養上清液分別相當於10U的量，於既定溫度使其反應既定時間，而製成半乳寡糖。糖組成與量係以高效液相層析法測定。將反應時間與溶液中的糖組成示於圖10～12(圖10：SsGal株，圖11：SmGal株，圖12：SeGal株)。
由圖可知，藉由SsGal株、SmGal株、SeGal株所產生的β-半乳糖苷酶，可由乳糖製造主要為3糖的半乳寡糖。
又，使用SsGal株所產生的β-半乳糖苷酶來製造半乳寡糖時，半乳寡糖含量為56.0%；使用SmGal株所產生的β-半乳糖苷酶來製造半乳寡糖時，半乳寡糖含量為66.7%；使用SeGal株所產生的β-半乳糖苷酶來製造半乳寡糖時，半乳寡糖含量為68.5%。
此外，由於上述β-半乳糖苷酶為分泌型，在製造半乳寡糖後，無需進行菌體的處理，而能夠有效地製造半乳寡糖。
實施例12 半乳寡糖的製造(2)： 對含有66%(w/v)之乳糖的溶液150mL添加使實施例9中所得之SeGal株的培養上清液相當於1.0U的量，於70℃、80℃、90度使其反應既定時間，而製成半乳寡糖。糖組成與量係以高效液相層析法測定。將反應時間與溶液中的糖組成示於圖13((a)：70℃、(b)：80℃)、圖14((c)：90℃)。
源自SeGal株之β-半乳糖苷酶其耐熱性高，可於70℃～90℃製造GOS。 [產業上可利用性]
以分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法所得到的β-半乳糖苷酶容易分離、純化，而能夠利用於半乳寡糖的製造。
[圖1]為表示使用SsGal株之SDS-PAGE及活性測定的結果的圖。 [圖2]為表示使用SmGal株之SDS-PAGE及活性測定的結果的圖。 [圖3]為表示使用RmGal株之SDS-PAGE及活性測定的結果的圖。 [圖4]為表示使用SeGal株之SDS-PAGE及活性測定的結果的圖。 [圖5]為表示使用SsGal株之SDS-PAGE及活性測定(熱失活)的結果的圖。 [圖6]為表示使用SmGal株之SDS-PAGE及活性測定(熱失活)的結果的圖。 [圖7]為表示使用RmGal株之SDS-PAGE及活性測定(熱失活)的結果的圖。 [圖8]為表示使用SeGal株之SDS-PAGE及活性測定(熱失活)的結果的圖。 [圖9]為表示使用SeGal株與母株之熱處理後之活性測定的結果的圖。 [圖10]為表示使用SsGal株之半乳寡糖製造時之反應時間與溶液中的糖組成的圖。 [圖11]為表示使用SmGal株之半乳寡糖製造時之反應時間與溶液中的糖組成的圖。 [圖12]為表示使用SeGal株之半乳寡糖製造時之反應時間與溶液中的糖組成的圖。 [圖13]為表示使用SeGal株之半乳寡糖製造時之反應時間與溶液中的糖組成的圖((a)：70℃、(b)：80℃)。 [圖14]為表示使用SeGal株之半乳寡糖製造時之反應時間與溶液中的糖組成的圖((c)：90℃)。
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Claims (12)

  1. 一種分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法，其特徵為將源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因導入至米麴菌(Aspergillus oryzae)，使其產生分泌型之β-半乳糖苷酶。
  2. 如請求項1之分泌型之β-半乳糖苷酶之製造方法，其中擔子菌酵母係屬擲孢酵母菌屬、鏈擔耳菌屬、紅酵母屬或梗孢酵母屬(Sterigmatomyces)。
  3. 如請求項1或2之β-半乳糖苷酶之製造方法，其中源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因包含訊息序列與編碼β-半乳糖苷酶之序列。
  4. 如請求項3之β-半乳糖苷酶之製造方法，其中源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因的訊息序列為米麴菌的訊息序列。
  5. 如請求項3或4之β-半乳糖苷酶之製造方法，其中編碼β-半乳糖苷酶之序列係在不變更β-半乳糖苷酶之胺基酸序列的範圍內變更編碼天然之β-半乳糖苷酶之序列的密碼子者。
  6. 如請求項3之β-半乳糖苷酶之製造方法，其中訊息序列與編碼β-半乳糖苷酶之序列為序列編號1、7、13、19所記載之序列。
  7. 如請求項3或4之β-半乳糖苷酶之製造方法，其中訊息序列與編碼β-半乳糖苷酶之序列為序列編號3、9、15、21所記載之序列。
  8. 如請求項5之β-半乳糖苷酶之製造方法，其中訊息序列與編碼β-半乳糖苷酶之序列為序列編號5、11、17、23所記載之序列。
  9. 一種源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因，其為序列編號7、13、19所記載之序列。
  10. 一種米麴菌之轉形體，其特徵為於米麴菌中導入有源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因，而產生分泌型之β-半乳糖苷酶。
  11. 一種半乳寡糖之製造方法，其特徵為使以如請求項1～8中任一項之β-半乳糖苷酶之製造方法所製造的β-半乳糖苷酶作用於至少含有乳糖的基質。
  12. 一種分泌型之β-半乳糖苷酶，其係藉由將源自擔子菌酵母之非分泌型之β-半乳糖苷酶基因導入至米麴菌，再將其培養而得。
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