TW202032122A - 血液的前處理方法、血液中的細胞分級方法及對血液的前處理進行評估的方法 - Google Patents

血液的前處理方法、血液中的細胞分級方法及對血液的前處理進行評估的方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202032122A
TW202032122A TW108138283A TW108138283A TW202032122A TW 202032122 A TW202032122 A TW 202032122A TW 108138283 A TW108138283 A TW 108138283A TW 108138283 A TW108138283 A TW 108138283A TW 202032122 A TW202032122 A TW 202032122A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
blood
cells
flow path
porous material
pretreatment
Prior art date
Application number
TW108138283A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI835899B (zh
Inventor
久保知大
金岩知之
山中洋昭
關亮平
Original Assignee
日商Ｔｌ基因體科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商Ｔｌ基因體科技股份有限公司 filed Critical 日商Ｔｌ基因體科技股份有限公司
Publication of TW202032122A publication Critical patent/TW202032122A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI835899B publication Critical patent/TWI835899B/zh

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5002—Partitioning blood components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N15/0255—Investigating particle size or size distribution with mechanical, e.g. inertial, classification, and investigation of sorted collections
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/4915—Blood using flow cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/52—Physical parameters

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

在藉由使血液在微細流路（micro flow channel）中流動來分級（classification）血液中的細胞之前，使含有細胞的血液與多孔質材料所具有的多孔質性的表面接觸（S80）。於一例中，將多孔質材料添加至含有細胞的血液中，並且與其混合，藉此使含有細胞的血液與多孔質性的表面接觸。於一例中，多孔質材料為多孔質性的表面由多醣類所構成的粒子。該多孔質材料以在液體中懸浮的狀態添加至含有細胞的血液中。於一例中，粒子具有規定的粒徑分布，其體積基準的累積分布中的中值粒徑d50V為25～280 μm。

Description

血液的前處理方法、血液中的細胞分級方法及對血液的前處理進行評估的方法
本發明是有關於一種血液的前處理，特別是有關於一種用於藉由微細流路（micro flow channel）進行血球分級（classification）的血液前處理。並且是有關於一種血液的前處理的評估方法。
專利文獻1記載有利用微細流路的血球分級。 ［現有技術文獻］ ［專利文獻］
專利文獻1：國際公開第2018/123220號
［發明所欲解決的課題］ 若使血液在微細流路中流動，則在微細流路中有時候會產生堵塞。本發明的課題在於提供一種適於消除堵塞的方法。
［用於解決課題的手段］ ＜1＞一種血液的前處理方法，其中， 於藉由使血液在微細流路中流動而分級血液中的細胞之前， 使含有所述細胞的血液接觸至多孔質材料所具有的多孔質性的表面。 ＜2＞如＜1＞所記載的前處理方法，其中， 將所述多孔質材料添加至含有所述細胞的血液中、並與其混合，藉此使含有所述細胞的血液接觸至所述多孔質性的表面。 ＜3＞如＜2＞所記載的前處理方法，其中， 所述多孔質材料為所述多孔質性的表面由多醣類所構成的粒子，並且以在液體中懸浮的狀態添加至含有所述細胞的血液中。 ＜4＞如＜3＞所記載的前處理方法，其中， 所述粒子具有粒徑分布，並且其體積基準的累積分布中的中值粒徑d50V為25～280 μm。 ＜5＞如＜4＞所記載的前處理方法，其中， 在將所述多孔質材料用於凝膠過濾層析法時，所述多孔質材料能夠區分DNA，其中所述多孔質材料相對於所述DNA的排除限制值為45鹼基對以上。 ＜6＞如＜4＞所述的前處理方法，其中， 在將所述多孔質材料用於凝膠過濾層析法時，在滿足以下至少任一種條件下，所述多孔質材料能夠區分蛋白質：所述多孔質材料相對於所述蛋白質的區分範圍的下限為1×104 Da以上、或者所述多孔質材料相對於所述蛋白質的區分範圍的上限為4×106 Da以下。 ＜7＞如＜4＞所記載的前處理方法，其中， 從所述粒子預先去除小於截取直徑的粒徑的小粒子， 所述截取直徑的範圍為25～100 μm。 ＜8＞如＜3＞所記載的前處理方法，其中， 與所述多孔質材料的表面接觸的血液，為未經由其他液體稀釋的全血，並且與所述多孔質材料的表面接觸後，藉由其他液體將全血稀釋；或者 與所述多孔質材料的表面接觸的血液，為預先藉由其他液體稀釋的全血。 ＜9＞一種血液中細胞的分級方法，其中， 根據如＜3＞所記載的前處理方法，對含有所述細胞的血液進行前處理後， 使經所述前處理的所述血液在所述微細流路中流動，藉此對所述血液中的細胞進行水力學（hydraulics）的分級。 ＜10＞如＜9＞所記載的分級方法，其中， 於所述前處理中，所述粒子具有粒徑分布，並且其體積基準的累積分布中的中值粒徑d50V為25～280 μm，並且藉由篩選，從所述粒子預先去除小於截取直徑的小粒子； 於所述分級中，於所述微細流路中進行所述水力學的分級處之上游，設置使所述血液的流動呈平面狀之扁平的入流通路，所述截取直徑則大於所述入流通路之剖面中的短邊方向的長度。 ＜11＞如＜10＞所記載的分級方法，其中， 於所述入流通路設置支柱密集帶，以橫切所述血液的流體， 所述支柱密集帶中的各支柱沿著所述短邊方向直立。 ＜12＞如＜11＞所記載的分級方法，其中，所述分級為對來自胎兒的有核紅血球、循環腫瘤細胞（CTC）及骨髓瘤細胞的任一者進行濃縮。 ＜13＞一種評估方法，其為對血液的前處理進行評估的方法，其中， 對含有細胞的血液實施前處理後，使所述血液在微細流路中流動時，於所述微細流路的途中設置支柱密集帶，以橫切所述血液的流體， 於使所述血液開始流動經過預設時間後，觀測在所述支柱密集帶及其下游側與其相鄰且支柱稀疏的區間中產生的碎屑（debris）。 ＜14＞如＜13＞所記載的評估方法，其中，所述區間是由最上游的支柱密集帶及位於其下游的支柱密集帶、與所述微細流路的側壁所包圍， 俯視所述區間時，藉由面積比求出所述碎屑相對於所述區間所佔的比例。 ＜15＞如＜14＞所記載的評估方法，其中，藉由使含有所述細胞的血液接觸至被檢驗材料的表面，以進行所述前處理。 ＜16＞如＜14＞所記載的評估方法，其中，於含有所述細胞的血液中添加被檢驗材料的同時與其混合，以進行所述前處理。
［發明效果］ 藉由本發明能夠提供一種適於解決微細流路中的堵塞的方法。
＜1. 血液的前處理方法之用意＞
本發明的一種態樣是有關於一種血液的前處理。在對血液的前處理進行詳細說明之前，一邊參照圖式一邊說明前處理的用意。圖1表示包括血液的前處理的步驟S80的流程圖。於實施步驟S80時，事先在步驟S79中，從生物體進行血液的採集。
前處理的步驟S80是在進行針對血液中細胞的分級的步驟S81之前實施。所謂針對血液中細胞的分級，是指對血液中的細胞依據其大小來進行區分。步驟S81係特別藉由使血液在微細流路中流動所進行者。步驟S81的分級的例子，為在微細流路內進行的水力學之分級。微細流路具有微米級的流路結構。此種微流路結構適於血液的分級（專利文獻1）。有時，會特別將具有血液分級中所用的微細流路的晶片稱為血球分離晶片。
圖1中，藉由步驟S81的分級可獲得具有特定之粒徑分布的細胞集團。血液中的細胞混合有各種大小的細胞。各細胞種類的細胞大小表示固有的粒徑分布。因此，藉由分級所得的細胞集團中，濃縮有特定的細胞種類。
於圖1中，於步驟S82中利用經濃縮的細胞種類。從經濃縮的細胞種類可取得例如於醫師診斷中所能利用的資料。診斷的對象與應濃縮的細胞種類可列舉以下的組合。這些組合僅為例示。
圖1中，成為對象的血液中含有作為應濃縮的細胞種類之血球。血球可為來自胎兒的有核紅血球。於步驟S79中，取得的血液含有來自胎兒的有核紅血球。孕婦血液中含有來自胎兒的有核紅血球。診斷的對象為胎兒及孕婦。於步驟S80中對孕婦血液進行前處理。於步驟S81中，藉由分級以濃縮來自胎兒的有核紅血球。於步驟S82中，取得對胎兒的診斷有用的資料。
圖1中，於成為對象的血液中，作為應濃縮的細胞種類，含有在血液中循環且並非血球的其他細胞，其亦可為循環腫瘤細胞（CTC）。於步驟S79中，取得的血液含有CTC，例如在懷疑有癌症的被檢驗者、癌症患者及已經接受癌症治療的被檢驗者的血液中有可能含有CTC，這些人成為診斷的對象。於步驟S80中，對這些血液進行前處理。於步驟S81中，藉由分級來濃縮CTC。不論血液中是否含有CTC，都要執行濃縮CTC時的必要步驟。於步驟S82中，取得對癌症的診斷有用的資料。
於圖1中，在成為對象的血液中所含的細胞、且為應濃縮的細胞種類可為骨髓瘤細胞。於步驟S79中，取得的血液含有骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞有可能從例如進行骨髓瘤之治療的患者，作為微量殘存疾病（MRD）而被檢測出來，這些人成為診斷的對象。骨髓瘤的一例為多發性骨髓瘤。於步驟S80中，對從患者採取的血液進行前處理。於步驟S81中，藉由分級來濃縮骨髓瘤細胞。不論血液中是否含有骨髓瘤細胞，都要執行濃縮骨髓瘤細胞時的必要步驟。於步驟S82中，取得對MRD的診斷有用的資料。
圖1中，步驟S79、步驟S81及步驟S82是為了理解步驟S80的技術內涵而進行了說明。因此，這些步驟在本態樣中並非必須。並且，於這些步驟之間亦可導入其他步驟。於步驟S80之前或之後，亦可導入其他步驟。
＜2. 血液的前處理方法的詳細內容＞
對圖1所示的前處理的步驟S80進行更進一步的詳細說明。於步驟S80中，使血液接觸至多孔質材料所具有的多孔質性的表面。於血液中，含有血球以及在血液中循環的其他細胞。血液含有細胞及血漿。為了使血液接觸至多孔質性的表面，將多孔質材料添加至血液中。亦可藉由對從容器中分別取得的血液添加多孔質材料的方式來進行。亦可藉由預先在容器中分離（fractionation）多孔質材料，再於該容器中放入血液的方式來進行。進而，將多孔質材料及血液進行混合。以多孔質材料分散於全部血液中的方式，充分地將它們混合為佳。
多孔質材料可在血液中沉澱。多孔質材料可為粒子，粒子可為球狀，粒子亦可為珠粒。於本說明書中，所謂珠粒，是指各粒子以成為球狀的方式所形成的粒子群，亦可將粒子在血液中懸浮。在多孔質材料為粒子的情況下，亦可將多孔質材料預先懸浮在非血液的液體中，非血液的液體可為緩衝液或保存液。亦可在非血液的液體中添加血清，作為血清，可使用胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）。藉由在血液中添加多孔質材料的粒子的懸浮液，可使血液與多孔質材料接觸。
接觸至多孔質性之表面的血液，可為並未藉由其他液體所稀釋的全血。所謂全血，是指血液並未分離成各個血液成分，而是含有血球與血漿等全部成分。
於圖1所示的步驟S79中採取全血後，直到在步驟S80進行前處理之間，亦可將全血保存一定的期間。保存期間可為1～72小時。保存溫度可為室溫1～30℃（日本藥典）。保存溫度以4～25℃為佳，以4℃為較佳。此外，保存溫度亦可有±2℃的範圍內的誤差，誤差範圍以±1℃為佳。於步驟S79中採血、且將全血傳輸至採血的設施外後，於進行步驟S80的前處理時，以將全血保持在4℃進行傳輸為佳。另外，亦可未插入保存的步驟，而是在步驟S79中採取全血後，迅速在步驟S80中進行前處理。
於圖1所示的步驟S80的前處理中，將多孔質材料與血液混合後，以在預設的時間、預設的溫度下進行培養為佳。時間例如可設為1～60分，亦可設為30分±5分。培養的溫度可為室溫1～30℃（日本藥典），亦可為4～25℃。培養的溫度只要不顯著地危害全血中的細胞或物質的狀態，則並無特別限制。亦可例如在4℃的環境下保存全血後，在25℃的環境下培養已經冷卻的全血。
在多孔質材料為粒子的情況下，相對於未稀釋的血液1 mL，多孔質材料的添加量為10～50 μL，亦可配合稀釋血的稀釋倍率來調整多孔質材料的添加量。在此情況下，稀釋率愈高，多孔質材料的添加量可愈少。例如，在將1 mL的血液稀釋成5倍的情況下，相對於5 mL的稀釋血，可添加10 μL的多孔質材料。在將1 mL的血液稀釋成2.5倍的情況下，相對於2.5 mL的稀釋血，可添加20 μL的多孔質材料。
於上述中，當特定多孔質材料的體積時，多孔質材料係為經水膨潤之狀態。在多孔質材料為珠粒的情況下，可在珠粒液的狀態下處理多孔質材料。珠粒液是將多孔質材料混合至磷酸緩衝生理食鹽水（PBS）中而成。此處，為了方便起見，以珠粒的體積包括珠粒之間的間隙來計算多孔質材料的珠粒，例如，可使用多孔質材料的珠粒佔50%，而PBS佔剩餘的50%的珠粒液。
於上述中，多孔質材料亦可事前清洗，清洗可利用PBS來進行。清洗亦可利用血液的稀釋用的液體或蒸餾水來進行。清洗可進行2次，亦可進行3次以上。
圖1中，例如亦可在步驟S79的血液採取的同時進行步驟S80的前處理。例如，預先在採血管內配置多孔質材料，藉此，在血液的採取同時，在採血管內使經採取的全血與多孔質材料接觸。亦可振盪採血管，使血液進一步與多孔質材料充分地接觸。
圖1中，前處理的步驟S80中，與多孔質性的表面接觸的血液亦可為藉由其他液體稀釋的全血。例如，在步驟S79的血液採取之後，在步驟S80使血液與多孔質材料接觸之前，藉由其他液體來稀釋從生物體採取的血液。於本說明書中，稀釋完畢的全血亦包含在血液當中。稀釋率可為大於1倍，10倍以下，亦即，相對於全血的體積1，可添加大於體積0且體積9以下的其他液體。稀釋率可為1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍及5.0倍的任一者。稀釋率亦可為6倍、7倍、8倍及9倍的任一者。
於一例中，相對於全血1 mL，添加50～100 μL的珠粒液（珠粒50體積%），在30分、25℃的環境條件下進行旋轉混合。在該旋轉混合中培養多孔質材料的珠粒與血球。將混合液藉由PBS進行稀釋，並對其進行血球分級。於另一例中，亦可在藉由PBS稀釋全血後添加多孔質材料。在此情況下，不進行培養便進行分級。另外，亦可預先將多孔質材料添加至較大的試管內，並將稀釋血進一步添加於此。此外，亦可將多孔質材料添加至預先準備的稀釋溶液，並將全血添加於此，藉此同時進行稀釋、以及與多孔質材料的接觸。
多孔質材料可與血漿中所含的成分反應，例如，多孔質材料亦可吸附血漿中所含的成分。被吸附的成分亦可直接堵塞微細流路。被吸附的成分亦可間接促進微細流路的堵塞。
於多孔質材料的表面形成有多數的微細孔。多孔質材料亦可與並非多孔質的其他材料結合，例如並非多孔質的粒子亦可經多孔質材料塗布而成為多孔質性的粒子。粒子的中心亦可不是多孔質性。粒子的中心可為強磁性體。
多孔質材料的材質可為多醣類，多孔質材料的微細孔亦可由多醣類形成。多醣類可經交聯。多醣類可為瓊脂糖、聚葡萄糖及烯丙基聚葡萄糖的任一者。多醣類可經修飾，修飾可為二乙基乙醇胺（Diethylethanolamine，DEAE）修飾。
粒子狀的多孔質材料亦可用於凝膠過濾層析法。所謂凝膠過濾層析法，是指移動相為水溶液的粒徑篩析層析法。另外，此時亦可區分DNA。多孔質材料相對於DNA的排除限制值以45鹼基對以上為佳。多孔質材料相對於DNA的排除限制值可為165鹼基對以上，亦可為165鹼基對以下。多孔質材料相對於DNA的排除限制值可為1078鹼基對以上，亦可為1078鹼基對以下。
粒子狀的多孔質材料亦可區分蛋白質。多孔質材料相對於蛋白質的區分範圍的下限以1×104 Da以上為佳。多孔質材料相對於蛋白質的區分範圍的上限以4×106 Da以下為佳。粒子狀的多孔質材料以至少滿足上述任一者為佳。
圖2中，多孔質的粒子的粒徑分布以體積基準的累積分布表示。 多孔質材料的粒子具有粒徑分布。多孔質材料的中值粒徑d50V（Median particle size of the cumulative volume distribution，累積體積分布的中值粒徑）為體積基準的累積分布中的中值粒徑。於粒子由多醣類構成的情況下，粒子以在緩衝液中膨潤的狀態中的粒徑為基準。粒徑的測定例為利用雷射繞射・散射法所求出的有效粒徑、或利用庫爾特法所求出的球體等效粒徑。
圖2中，中值粒徑d50V以未滿500 μm為佳。中值粒徑d50V以25～280 μm為佳，以25～165 μm為較佳，以45～165 μm為更佳。藉由使中值粒徑d50V處於該範圍，能夠使多孔質材料的表面積適於與血液的接觸。
圖2中，較佳為從多孔質材料的粒子視需要截取小粒子。所謂截取，是指從多孔質材料的粒子去除小粒子。於一態樣中，預先去除小於截取直徑CF之粒徑的小粒子。截取直徑CF的範圍為25～100 μm。截取直徑CF亦可為40～70 μm。小粒子的去除，較佳為藉由利用篩孔的篩選方式來進行。例如，可使用細胞過濾器（Cell Strainer），從多孔質材料的粒子集團去除小粒子。藉由去除小粒子，能夠抑制血中混雜的小粒子所導致的微細流路的堵塞。依據微細流路的種類，進入微細流路的小粒子平順地從微細流路流出。於此種流路中，可不考慮小粒子所導致的堵塞。然而，即便為如此的微細流路，有時候亦會產生血中的任意化學成分所導致的堵塞（後述的碎屑）。因此，使用未經截取的粒子能夠有效地抑制堵塞。
若從原始粒子去除小粒子，則原始粒子的粒徑分布改變，亦即，截取具有尺寸選擇的效果。尺寸選擇後，中值粒徑亦產生變化。為了方便，本說明書中，中值粒徑d50V是依據尚未藉由截取而從原始粒子中去除小粒子之前的粒徑分布。
＜3. 血液中的細胞的分級方法＞
再一次參照圖1。本發明的一態樣為組合步驟S80與步驟S81而成的血液中的細胞的分級方法。首先，根據上述前處理方法，對含有細胞的血液進行處理（步驟S80）。接著，使經前處理的血液在微細流路中流動，藉此對血液中的細胞進行水力學分級（步驟S81）。
圖1中，可預先稀釋血液後，在步驟S81進行分級。稀釋可在步驟S80的前處理之前進行，亦可在之後進行。於分級時點下對全血的稀釋率可大於1倍，10倍以下，亦即，相對於全血的體積1，可添加大於體積0且體積9以下的其他液體。稀釋率可為1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍及5.0倍的任一者。稀釋可在前處理之前與之後的兩者進行，例如，可在進行前處理之前，將全血稀釋至2～3倍，於前處理結束後，進一步對其進行稀釋，使成為對於全血的5倍稀釋。
在圖1所示的步驟S80進行血液的前處理之後，直到在步驟S81進行分級之間，可保存前處理完畢的血液。前處理後的保存溫度的範圍可為4±2℃。亦可不插入保存的步驟，而在前處理後迅速在步驟S81中進行分級。
＜4. 分級裝置＞
以下表示用於水力學分級的裝置的一例。圖3表示俯視的微細流路20。微細流路20是以血球為代表的懸浮細胞的分離用的流路晶片。圖中的X、Y及Z的各軸是為了方便理解微細流路20的功能所表示。這些軸並未具體限定微細流路20的形狀。
圖3中，微細流路20具有主流路23。主流路23的一端成為入口21a。主流路23的另一端成為出口22c。微細流路20還具有副流路24。副流路24的端部成為入口21b。副流路24的端部藉由合流部28而與主流路23連接。
圖3中，主流路23從入口21a朝著出口22c依序具有流路部25a～25d。流路部25a～25d從入口21a至出口22c為一體。於流路部25a與流路部25b之間具有合流部28。
於圖3中，微細流路20具有支流路26a及26b。支流路26a及26b均為從主流路23分支的流路。從上游側開始，支流路26a及支流路26b依序從主流路23分支。支流路26a及26b的一端藉由流路部25c而與主流路23連接。於流路部25c中，在與副流路24對向之側配置有支流路26a及26b。於支流路26a及26b的另一端具有出口22a及出口22b。
於圖3中，支流路26a及26b均具有多個從主流路23分支的細流路。各細流路沿著主流路23的上游至下游的方向並排。各細流路分別到達出口22a及22b。各細流路分別在出口22a及22b的近前合流。流路部25c的下游具有流路部25d。流路部25d到達出口22c。
於圖3中，入口21a與裝有經前處理的血液BL的注射器30連接。從注射器30以預設的流量將血液BL送至入口21a。血液BL經由入口21a而進入流路部25a。血液BL的前處理亦可在注射器30內進行。在注射器30內進行血液BL的前處理之後，藉由注射器30將血液BL送至微細流路20。
於圖3中，微細流路20具有副流路24。副流路24與注射器35連接。於注射器35中裝有澄清液CL。澄清液CL為不含懸浮細胞的液體。澄清液CL為不對血球或其他細胞造成傷害的液體。澄清液CL為緩衝液，澄清液CL亦可為PBS。藉由在注射器35內施加壓力，澄清液CL從入口21b進入副流路24。澄清液CL在副流路24流動，澄清液CL流入流路部25b。
於各出口排出細胞懸浮液的分離液。在出口22c獲得分離液F3，在出口22b獲得分離液F2，在出口22a獲得分離液F1。分離液F1及分離液F2分別含有經流路部25c分級的細胞。分離液F3含有通過流路部25c的血漿。
圖4表示俯視的微細流路20。圖4為概略性表示經由微細流路20的懸浮細胞的分離過程。為了簡單說明，於支流路26a示有10條細流路，於支流路26b示有3條細流路。
此外，圖4及圖5為引用日本專利特開2007-175684號公報、並變更了一部分內容。在日本專利特開2007-175684號公報中，特別詳細說明了分級的機制。
如圖4所示，血液BL從流路部25b的更上游連續地流來，血液BL含有大量細胞。針對血液BL的流體，使其與來自側方的澄清液CL的流體連續地接觸。藉此，將在主流路23流動的細胞從主流路23的側方連續地推入。結果，血液BL的流體被連續地推入與澄清液CL的流體相反之側。於流路部25b～25c中，懸浮細胞被連續地推入支流路26a及26b側，並且懸浮細胞連續地流入這些支流路。
如圖4所示，無核紅血球27連續地流入支流路26a。於流路部25b中，對血液BL中的無核紅血球27進行水力學分級。分級是在血液BL的流體之中未與澄清液CL的流體接觸之側連續地進行。
如圖4所示，支流路26a作為無核紅血球27的除去流路而發揮作用。支流路26a所具有的細流路的內接直徑為12～19 μm。內接直徑可為13 μm、14 μm、15 μm、16 μm、17 μm及18 μm的任一者。
如圖4所示，有核細胞29a～29c連續地流入支流路26b。於流路部25b的下游的流路部25c中，對血液BL中的有核細胞29a～29c進行水力學分級。分級是在血液BL的流體之中未與澄清液CL的流體接觸之側連續地進行。特別是藉由支流路26b能夠連續地獲得有核細胞的細胞懸浮液。
如圖4所示，支流路26b作為有核細胞29a～29c的回收流路而發揮作用。支流路26b所具有的細流路的內接直徑為20～30 μm。內接直徑可為21 μm、22 μm、23 μm、24 μm、25 μm、26 μm、27 μm、28 μm及29 μm的任一者。以有核紅血球為代表的有核細胞的直徑的大小被認為是11～13 μm。
如圖4所示的支流路26a及26b的各細流路的內接直徑為細流路的正交剖面中的內接圓的直徑。細流路的剖面可為四角形，亦可為其他多角形，亦可為圓。其他支流路亦同。未進入支流路26a及26b的懸浮細胞或血漿作為順流FT而連續地通過流路部25d，之後，於圖3中到達出口22c，例如順流FT中包含凝集的血球等。
於圖5中，聚焦在流路部25c而表示微細流路的詳細資訊。本實施例的水力學分級中，細流路的內接徑的值並非與經分級的懸浮細胞的直徑的最大值相等。因此，本實施例中的水力學分級與單純的過濾不同。以下說明本實施例的水力學分級。
圖5表示流路部25c，並且表示支流路26a所具有的細流路。為了簡單說明，使構成支流路26a的細流路僅有一條。於圖5的說明中，將構成支流路26a的細流路簡單稱作支流路26a。
如圖5所示，於流路部25c中連續地導入液流LF。液流LF含有上述的血液BL與澄清液CL。於液流LF中，這些液體在其界面部分混合。於液流LF中，含有作為大細胞的有核細胞29a，且含有作為小細胞的無核紅血球27。圖中，有核細胞29a是代表其他有核細胞而描繪。
於圖5中，將液流LF中導入至支流路26a的部分稱作液流LE。於液流LF中，將未導入至支流路26a而朝下游流去的部分稱作液流LG。於液流內，僅液流LG為影線，其中液流LE的流量與液流LE的剖面成比例。液流LE沿支流路26a側的流路部25c的內壁流動。液流LE的流量亦與支流路26a中的液流LE的流速成比例。
於圖5中，在液流LE中流動的無核紅血球27被導入至支流路26a。另一方面，有核細胞29a在液流LG側具有一半的體積以上。有核細胞29a僅部分與液流LE接觸。因此，有核細胞29a並未被導入至支流路26a。此時，有核細胞29a的直徑可小於支流路26a的內接直徑。假如液流LE的流量變大，則液流LE的剖面變大。此時，可以想見有核細胞29a被吞進液流LE，藉此被誘導至支流路26a。
於圖5中，有核細胞29a乘著液流LG而被進一步運送到下游。藉由以上方式，能夠從支流路26a回收不含某大小以上的懸浮細胞的流體。結果，無核紅血球27在此處接受分級。另外，有核細胞29a及其他的有核細胞在下游接受分級。
＜5. 入流通路＞
回到圖3。微細流路20中的流路部25a位於進行水力學分級的流路部25c的上游。流路部25a進一步位於澄清液CL的流體所合流的合流部28的上游。流路部25a與入口21a連接。以下有時候將流路部25a稱作入流通路。
圖6表示充當入流通路的流路部25a。血液從入口21a進入流路部25a。流路部25a為扁平。流路部25a中的血液的流動為平面。流路部25a的YZ剖面中的短邊方向的長度表示為尺寸SD。
根據圖6來說，尺寸SD充當流路部25a的高度。尺寸SD以25±5μm為佳。藉由選擇適當的尺寸SD，血球中的細胞容易流動。另外，在流路部25a可將血球中的細胞沿Y方向擴展。進而，尺寸SD以橫跨其他流路部來維持為佳。藉由該構成，藉由來自＋Y方向的澄清液的流體，可容易地將沿＋X方向流動的血液的流體推入－Y方向（參照圖4）。
回到圖2，如上所述，於前處理所用的多孔質的粒子具有粒徑分布。另外，於一態樣中，其中值粒徑d50V未滿500 μm。中值粒徑d50V以25～280 μm為佳，以25～165 μm為較佳，以45～165 μm為更佳。
於圖2中，如上所述，於前處理中，較佳為從粒子藉由篩選來預先去除小於截取直徑CF的小粒子。截取直徑CF的範圍為25～70 μm，且以25～40 μm為佳。
圖6表示多孔質的粒子PP。粒子PP具有大於截取直徑CF的粒徑。於一較佳的態樣中，截取直徑CF大於尺寸SD。換句話說，幾乎全部的粒子PP的粒徑皆大於尺寸SD。此處，即便有粒徑小於尺寸SD的粒子PP殘留，亦認為其是例如由於篩選的不完全等所偶然混入的粒子。
於圖6中，藉由將粒子PP的粒徑設定如上述，可防止粒子PP往流路部25a的侵入。於一較佳的態樣中，於流路部25a的途中設置支柱密集帶11。支柱密集帶11中的各支柱連接流路部25a的上面與下面。藉由將粒子PP的粒徑如上所述進行設定，能夠防止粒子PP堵塞支柱密集帶11。支柱密集帶11的構成與作用如下所述。
＜6. 支柱密集帶＞
圖7表示流路部25a的觀察影像及其謄寫圖。流路部25a具備支柱密集帶11。支柱密集帶11以橫切流路部25a中的血液的流體的方式設置。血液從圖中的上游的左側流至下游的右側。
於圖7中，流路部25a具有區間12。區間12在支柱密集帶11的下游側與支柱密集帶11相鄰。於區間12中，支柱較為稀疏。流路部25a還具備支柱密集帶13。在從支柱密集帶11觀察的下游方向中，支柱密集帶13為位於支柱密集帶11的下游的支柱密集帶。支柱密集帶13的構成可與支柱密集帶11相同。
於圖7中，區間12由支柱密集帶11、支柱密集帶13以及流路部25a的側壁即微細流路的側壁所包圍。流路部25a更具有區間14。區間14在支柱密集帶13的下游側與支柱密集帶13相鄰。流路部25a在區間14的下游更具備支柱密集帶。符號15～17在實施例中進行說明。
於圖7中，上述支柱密集帶11並未對血液的流體造成較大的阻力。另外，支柱密集帶11並未顯著降低血液的流速。支柱密集帶11作為過濾器的角色而發揮作用。支柱密集帶11以血液中的雜質，例如大於血球的不溶成分無法進入支柱密集帶11的下游的流路部的方式形成。另外，只要有成為凝聚體的血球，支柱密集帶11作為使其分散為一個一個血球的角色而發揮作用。
＜7. 前處理的實施例＞
於本實施例中，根據圖7～圖11來說明血液的前處理方法的例子與其效果。稍後描述圖7。圖8為針對前處理的評估作業的流程圖。於步驟S89中，從人體採取血液。於步驟S90中的前處理之前，血液是在4℃保存1～48小時。
於圖8的步驟S90中，藉由多孔質材料的多醣類珠粒對血液進行前處理。此時，事前對珠粒進行清洗。首先，於1.5 mL的試管中添加經PBS稀釋兩倍的珠粒。將PBS與珠粒混合後，藉由500 × g在2分鐘、RT（室溫，25℃）的條件下進行離心，由此捨棄上清液。進而，添加PBS重複進行清洗，由此總共進行3次清洗作業。清洗後，藉由PBS在量瓶中稀釋至原本兩倍稀釋時的體積。將該PBS與珠粒的混合物作為珠粒液而添加至血液中。
於圖8的步驟S90中，藉由在血液中添加珠粒來對血液進行前處理。於實施例中，對血液添加多醣類的多孔性的珠粒B01、B02及B03，分別進行混合。每1 mL的經稀釋的血液中，珠粒的添加量為50 μL。混合是在25℃下進行30分鐘的旋轉混合。經過30分鐘後，停止旋轉混合，進而在室溫下放置30分鐘。珠粒（Beads）的內容如下。
［表1］
Figure 02_image001
珠粒均可由默克（Merck）（西格瑪奧瑞奇（Sigma-Aldrich））取得。產品名稱（Product name）欄位所記載的Sepharose、Sephacryl及Sephadex均為商標。
DNA排除限制值（DNA Exclusion Limit, Fractionation Range [Mr] DNA Exclusion Limit）說明如下。亦即，大於珠粒的微細孔的直徑的最大值的溶質粒子由微細孔排除。在選擇DNA作為溶質粒子的情況下，具有將其鹼基數作為基準的排除之限制。Mr為相對分子質量（relative molecular mass）。
蛋白質區分範圍（Protein fractionation range）是有關於球狀蛋白質的分子尺寸（Da）的區分範圍（Fractionation range [Mr], Globular proteins）。
珠粒B01、Sepharose CL-6B的凝膠基質為由6%交聯瓊脂糖構成的球狀體，粒徑為45～165 μm。
珠粒B02、Sephacryl 500-HR（西格瑪奧瑞奇，產品號碼S500HR）的凝膠基質為由烯丙基聚葡萄糖與N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺的交聯性共聚物所構成。體積基準的累積分布中的中值粒徑（Median particle size of the cumulative volume distribution, Particle size, d50V ）為50 μm以下，粒徑為25～75 μm。以聚葡萄糖為基準的區分範圍（Fractionation [Mp] Dextrans）為4×104 ～2×107 。Mp為峰值分子量（Peak molecular weight）。對於聚葡萄糖的排除限制值為100×106 。
珠粒B03、Sephadex G-75的凝膠基質由交聯聚葡萄糖所構成。濕潤狀態的粒徑為90～280 μm。乾燥狀態的粒徑為40～120 μm。以聚葡萄糖為基準的區分範圍（Fractionation [Mp] Dextrans）為1×103 ～5×104 。對於聚葡萄糖的排除限制值大於7×104 。Sephadex G-50的DNA排除限制值為20 bp。另外，Sephadex G-100的DNA排除限制值為25 bp。Sephadex G-75被認為是具有這些的中間的DNA排除限制值。因此，Sephadex G-75的DNA排除限制值被推測為處於20以上、25以下的範圍。
接著，於圖8所示的步驟S91中，藉由PBS來稀釋血液。稀釋倍率為2～3倍。
繼而，於圖8所示的步驟S92中，在血球分離晶片（微細流路）使血液流動。此外，完全沒有從血液中去除珠粒的處理。
接著，於圖8所示的步驟S93中觀察晶片。觀察是在步驟S92中開始流動血液30～90分鐘之後進行。觀察是一邊使血液在血球分離晶片流動一邊進行。
回到圖7，對區間12進行觀察。在USB照相機（HOZAN股份有限公司）之下配置晶片。一邊俯視晶片一邊進行觀察。藉由HOZAN USB cam software對晶片進行攝影，獲得圖7的上段所示的圖像資料。在ImageJ軟體讀取圖像資料，並在相同軟體上進行解析。
於圖7中，從圖像資料中切除相當於區間12的區域15。將區域15中的總像素數作為區間12的總面積進行處理。藉由目視來區別區域15中的碎屑部16與流動部17。碎屑部16是由以支柱密集帶11為起點所累積的碎屑所佔據。若該碎屑進入至支柱密集帶11之中，則成為支柱密集帶11的堵塞的原因。血球的流體因碎屑部16而受到推擠。相對於此，於流動部17中，血球順暢地流動。
於圖7中，藉由目視，在碎屑部16與流動部17之間劃線，求出線所區隔出來的碎屑部16內的像素的數量。將區間12內的全部碎屑部16的像素數量的總和設為碎屑面積，以百分率求出在區間12的總面積中所佔的碎屑面積，並將該值設為堵塞率。
圖9表示比較例C01中的流路部25a的觀察影像及其謄寫圖。於比較例C01中並未添加珠粒，除此以外，與上述實施例相同地調製血液（無珠粒）。與上述相同，使該血液在血球分離晶片中流動。觀察亦與上述同樣地進行，結果在區域15中，碎屑部16佔有大部分（70%以上），並且碎屑被細分。
於圖9所示的比較例C01中變更堵塞率的計算方法，獲得從區域15去除碎屑部16的部分，亦即流動部17的像素數量的總和，並將其特定為流動部17的面積。從區域15的總面積減去流動部17的面積，而獲得碎屑部16的推定面積，並將該推定面積設定為碎屑面積。
圖9所示的區域15與區間12的全範圍一致，區域15亦可為區間12的一部分範圍。
於圖9中，可以推論碎屑從區間12與支柱密集帶11的邊界向支柱密集帶11的內部侵入，或者在支柱密集帶11的內部產生的碎屑延伸至區間12。
圖10為表示堵塞率的圖表1。經珠粒B01及珠粒B03前處理的血液與比較例C01的血液相較下，堵塞率較低。因此，可知具有多孔質性的表面的多醣類珠粒能夠帶來防止堵塞的效果。
圖11為表示堵塞率的圖表2。經珠粒B02及珠粒B03前處理的血液與比較例C02（對照組）的血液相較下，堵塞率較低。從圖11的結果亦可確認到具有多孔質性的表面的多醣類珠粒能夠帶來防止堵塞的效果。此外，於比較例C02的對照組中，並未對血液添加珠粒及PBS的混合物，僅對血液進行旋轉混合操作。
如圖10及圖11所示，珠粒B01及珠粒B02相較於珠粒B03具有更強的防止堵塞的效果。如表1所示，珠粒B01及珠粒B02的DNA排除限制值亦高於珠粒B03的DNA排除限制值。另外，與珠粒B03相較下，珠粒B01及珠粒B02的蛋白質區分範圍偏向較大的蛋白質那一側。
作為比較例C03，將不具多孔性的瓊脂糖粉末與上述同樣地混合至血液中進行前處理。作為比較例C04，使血液接觸將瓊脂糖粉末溶解形成的瓊脂糖凝膠的斜面培養（slant）型的凝膠的表面，藉此進行前處理。於任一個比較例中，與未進行前處理的情況相較下，並未看到顯著的防止堵塞的效果。可知相較於多醣類的化學性質，前處理中使用的材料具有多孔性在獲得防止堵塞的效果上是重要的。
作為其他例子，於圖8中，在步驟S90進行前處理之前，先進行步驟S91的稀釋，亦即將步驟S90與步驟S91的順序互換。珠粒使用B01（Sepharose CL-6B）。在此情況下亦可確認到具有防止堵塞的效果。
＜8. 前處理與分級的組合的實施例＞
（1）截取與前處理
於本實施例中，對前處理用的多孔質的粒子進行小粒子的截取。於本實施例中，使用珠粒B01的Sepharose CL-6B。將1 mL的珠粒放入尼龍製的Cell Strainer（FALCON，商標）。歷時一整晚的時間，藉由攪拌器一邊攪拌，一邊對珠粒進行過濾。過濾花費的時間可為數小時至24小時。過濾是在蒸餾水中進行。Cell Strainer的篩孔尺寸為40 μm、70 μm及100 μm，過濾分別是在各種篩孔尺寸的Cell Strainer進行。此處，對70 μm篩孔的Cell Strainer的使用例進行詳述。篩孔尺寸與截取直徑對應。將藉由截取所過濾得到的大粒子用於前處理。此外，篩孔尺寸愈小，較大粒子的產量愈多。藉由PBS進行兩次珠粒的清洗。
使各珠粒懸浮於與珠粒同體積的澄清液。對2 mL的澄清液添加珠粒的懸浮液20 μL，並將它們充分混合。澄清液為預先添加1%的FBS的PBS。將珠粒與澄清液的混合液進一步添加至澄清液中。使澄清液的一部分預先流至血球分離晶片，藉此在事前將血球分離晶片的內部浸沒在緩衝液。浸沒血球分離晶片的處理要進行40分鐘。
（2）截取直徑的評估
藉由顯微鏡觀察完成分級的血球分離晶片。在藉由截取直徑70 μm及100 μm的珠粒進行前處理的情況下，分別在圖6所示的入流通路（流路部25a）的內部或入口21a的附近觀察到碎屑。流路因碎屑而稍微阻塞。相對於此，在藉由截取直徑40 μm的珠粒進行前處理的情況下，並未看到碎屑。另外，歷經2小時40分持續進行了試樣血的分級，但是並未看到流路的阻塞。為了獲得對碎屑導致的流路阻塞的抑制效果，可知理想的是將截取直徑設為70 μm以下。截取直徑可為60 μm，亦可為50 μm。
此外，即便在截取直徑40 μm、70 μm及100 μm的任一者的情況下，可以藉由血球分離晶片來處理全部的試樣血。並且，不會有因碎屑使得血球分離晶片阻塞而無法區分的試樣血殘留。在以下的試驗中採用截取直徑70 μm。
（3）細胞摻入（spike）
於本實施例中，於全血中摻入K562細胞，藉此設為CTC的模型。從健康的人採取全血，並且在4℃下進行保管。對採血後第一天的全血添加K562細胞的懸浮液，藉此獲得試樣血。相對於血液2 mL，將添加量設為865.4個。K562細胞是來自慢性骨髓性白血病的患者的類淋巴球的浮游性的培養細胞。
所添加的K562細胞的數量如下所述進行預估。首先，對K562細胞進行赫斯特染色。染色後，在顯微鏡下觀察細胞，藉此計算細胞數量。藉由上述，能夠確認每一個K562細胞的懸浮液的體積的K562細胞的數量。
藉由混合有上述珠粒的澄清液（1% FBS-PBS），將試樣血稀釋至5倍。藉由珠粒與試樣血接觸來進行前處理。使稀釋的試樣血迅速地在血球分離晶片流動，藉此分級血球。根據圖3及圖4說明分級的結果，在分離液F2可獲得較多的含有淋巴球的白血球。於分離液F1可獲得較多的無核的成熟紅血球。此外，流入至血球分離晶片的細胞之大部分（＞99.9%）流出至分離液F1中。於F3中並未獲得較多的血球。由於K562細胞為類淋巴球，因此預期包含於分離液F2中。
（4）分級的定量評估
將分級的定量結果示於表2。上段表示未使珠粒與試樣血接觸的情況（無珠粒）。下段表示使經70 μm截取的珠粒與試樣血接觸的情況（截取）。開始分級後的經過時間（Time course，分）被區分為0～15分、15～45分以及45～75分這三個時間區間。
［表2］
Figure 02_image003
表2的左側是關於全血（Whole blood），表示含有血球的試樣血中的細胞數量的總計。流入血球分離晶片的細胞數量（Input cell number，流入細胞數）是藉由測定稀釋血的每單位體積（mL）的血球數而獲得。測定是藉由TC20自動細胞計算器（美商伯瑞股份有限公司）來對經PBS稀釋至規定的稀釋率的全血10 μL進行處理。進而對所得的測定值乘上稀釋率與全血的體積來算出。
表2的左側表示流入至血球分離晶片的試樣血的細胞數量（Input cell number，流入細胞數）。進而，流入至血球分離晶片的試樣血的體積（Input volume，流入體積）是以換算為全血的狀態來表示。
進而，表2表示流出至分離液F1、分離液F2及分離液F3的細胞的合計數量（Output cell number，流出細胞數）（×109 ）。流出的細胞合計數量（流出細胞數）相對於流入的細胞數量（流入細胞數）的比表示為回收率（Rate of Collection，%）。表2中有幾個回收率（Rate of Collection，%）超過100%的樣本。這個原因推測為：由於進行區分的全血的體積較小，因此在細胞數量的測定時的稀釋或細胞數量的測定中產生誤差。
藉由全血中的細胞並未與珠粒接觸的方式進行分級。在此情況下，在血球分離晶片內產生堵塞。因此，超過45分鐘持續進行細胞分級是有困難的。另一方面，與經截取的珠粒接觸的全血中的細胞幾乎全部被回收。
（5）有核細胞的回收率的評估
表2的右側是關於所摻入的K562細胞，表示含有血球的試樣血中的細胞數量的總計。對流出至分離液F2及分離液F3的K562細胞的數量進行實測。此外，在每一次的細胞數量的實測中，有必要區分K562細胞以及來自全血的其他有核細胞。這是藉由以下方式進行：在進行摻入之前，預先藉由Hoechst33342（西格瑪奧瑞奇製造）對K562細胞進行染色，藉由基恩斯公司的一體成型螢光顯微鏡BZ-X710來觀察區分後經回收的區分細胞，將核有螢光標識的細胞區分為K562細胞，將沒有螢光標識的細胞區分為來自全血的其他有核細胞。
所得的數值（流出細胞數）用於回收率的算出。此處，所謂回收率，是表示實際上分離液F2及分離液F3中所回收的K562細胞的數量相對於流入血球分離晶片的K562細胞的數量（流入細胞數）的百分率。
流入血球分離晶片的K562細胞的數量（流入細胞數）如下所述進行說明。在無珠粒（Beads less）的試驗中，以在用於準備試樣血的全血每1 mL有443個的方式，於試樣血中混合K562細胞。該值作為流入的細胞濃度（Input cell cons.，流入細胞濃度）而表示在表2中。分級開始後0～15分中的經區分的試樣血的體積（流入細胞體積）為0.075 mL，其中該值為考慮稀釋而換算為全血的體積。在此時間區間中流入的細胞的數量（流入細胞數）為443×0.075=33.23個。在此時間區間中，若假設全部的K562細胞被回收至分離液F2及分離液F3的任一個中，則33.23個K562細胞被回收。在無珠粒（Beads less）的時間區間（經過時間，0～15分）中，流出至分離液F2及分離液F3的K562細胞的數量（流出細胞數）為34個。該值為經回收的K562細胞的數量的實測值，K562細胞的回收率（Rate of Collection）為34/33.23×100=102.3%。
於表2中，分級開始後15～45分鐘的經區分的試樣血的體積（流入細胞體積）為0.150 mL，其中該值是考慮稀釋而換算成全血的體積。在此時間區間中，流入的細胞的數量（流入細胞數）為443×0.150=66.45個。流出至分離液F2及分離液F3的K562細胞的數量（流出細胞數，實測值）為91個。K562細胞的回收率（Rate of Collection）成為91/66.45×100=136.9%。
於表2的下段進一步表示有截取直徑70 μm的情況下的K562細胞的回收率（Rate of Collection）。由分離液F2及分離液F3所構成的分離液中所找到的K562細胞的測定數（流出細胞數）在各時間區間中為26個、57個及54個。在截取直徑70 μm的珠粒的前處理中，K562細胞的回收率（Rate of Collection）在任一個時間區間皆為80%以上，因此判斷回收率（Rate of Collection）相當高。
本實施例是作為CTC的濃縮的模型實驗來進行。根據上述結果，可知前處理在CTC的濃縮中是有用的。具體而言，藉由防止晶片的堵塞，能夠進行長時間的分級。藉由本實施例的方法進行長時間的分級，能夠處理大量的試樣血，表示每一次的處理的CTC的取得量大。另外，與CTC同樣地，亦認為血液中僅含微量的細胞，例如孕婦血中的胎兒紅血球母細胞的濃縮中，這些亦是有效的。
＜9. 前處理的評估方法＞
本發明的另一態樣為針對血液的前處理的評估方法。回到圖8，一邊參照圖8一邊進行說明。於步驟S89中，採取含有細胞的血液。於步驟S90中，對含有細胞的血液實施前處理。
於步驟S90的前處理中，使含有細胞的血液與被檢驗材料的表面接觸。被檢驗材料可為粉末狀。被檢驗材料可為形成在容器表面的構造體。或者，在含有細胞的血液中添加被檢驗材料並與其混合。被檢驗材料可溶入血液中。
如圖8所示，在步驟S91中稀釋血液。稀釋倍率以至少2倍為佳，稀釋倍率例如為2～3倍。稀釋例如藉由PBS進行，稀釋可在步驟S90之前進行，亦即可替換步驟S90與步驟S91的順序。在步驟S90之前稀釋後，亦可在步驟S91進一步稀釋。
在步驟S92中使血液在微細流路中流動。如圖7所示，在微細流路的途中，以橫切血液的流體的方式，設有支柱密集帶11。對在支柱密集帶11及其下游側與其相鄰的區間12中產生的碎屑部16進行觀察。於區間12中並無支柱，或者支柱稀疏。
使血液開始流動後經過一定時間，對圖7所示的區間12中產生的碎屑部16進行觀測。時間的長度例如為30～90分。藉由面積比求出碎屑部16相對於區域15所佔的比例，求出方法可比照上述實施例。
此外，本發明並未限於上述實施型態，可在不脫離主旨的範圍內進行適當變更。
本發明主張2018年10月25日提出申請的日本專利申請號特願2018-200712為基礎的優先權，並將其全部揭露內容併入此說明書中。
11、13:支柱密集帶 12、14:區間 15:區域 16:碎屑部 17:流動部 20:微細流路 21a～21b:入口 22a～22c:出口 23:主流路 24:副流路 25a～25d:流路部 26a～26b:支流路 27:無核紅血球 28:合流部 29a～29c:有核細胞 30、35:注射器 B01～B03:珠粒 BL:血液 C01～C02:比較例 CF:截取直徑 CL:澄清液 d50V:中值粒徑 F1、F2、F3:分離液 FT:順流 LE、LF、LG:液流 PP:粒子 S79～S82、S89～S93:步驟 SD:尺寸
圖1為包括前處理的步驟的流程圖。 圖2為多孔質的粒子的粒徑分布。 圖3為微細流路的俯視圖。 圖4為微細流路的部分俯視圖。 圖5為微細流路的詳細的部分斜視圖。 圖6為入流通路的斜視圖。 圖7為微細流路的觀察影像1（上段）及其謄寫圖（下段）。 圖8為針對前處理的評估作業的流程圖。 圖9為微細流路的觀察影像2（上段）及其謄寫圖（下段）。 圖10為堵塞率的圖表1。 圖11為堵塞率的圖表2。
S79~S82:步驟

Claims (16)

  1. 一種血液的前處理方法，其特徵在於， 於藉由使血液在微細流路中流動而分級血液中的細胞之前， 使含有所述細胞的血液接觸至多孔質材料所具有的多孔質性的表面。
  2. 如請求項1記載的前處理方法，其中， 將所述多孔質材料添加至含有所述細胞的血液中、並與其混合，藉此使含有所述細胞的血液接觸至所述多孔質性的表面。
  3. 如請求項2所記載的前處理方法，其中， 所述多孔質材料為所述多孔質性的表面由多醣類所構成的粒子，並且以在液體中懸浮的狀態添加至含有所述細胞的血液中。
  4. 如請求項3所記載的前處理方法，其中， 所述粒子具有粒徑分布，並且其體積基準的累積分布中的中值粒徑d50V為25～280 μm。
  5. 如請求項4所記載的前處理方法，其中， 在將所述多孔質材料用於凝膠過濾層析法時，所述多孔質材料能夠區分DNA，其中所述多孔質材料相對於所述DNA的排除限制值為45鹼基對以上。
  6. 如請求項4所記載的前處理方法，其中， 在將所述多孔質材料用於凝膠過濾層析法時，在滿足以下至少任一種條件下，所述多孔質材料能夠區分蛋白質：所述多孔質材料相對於所述蛋白質的區分範圍的下限為1×104 Da以上、或者所述多孔質材料相對於所述蛋白質的區分範圍的上限為4×106 Da以下。
  7. 如請求項4所記載的前處理方法，其中， 從所述粒子預先去除小於截取直徑之粒徑的小粒子， 所述截取直徑的範圍為25～100 μm。
  8. 如請求項3所記載的前處理方法，其中， 與所述多孔質材料的表面接觸的血液，為未經由其他液體稀釋的全血，並且與所述多孔質材料的表面接觸後，藉由其他液體將全血稀釋；或者 與所述多孔質材料的表面接觸的血液，為預先藉由其他液體稀釋的全血。
  9. 一種血液中的細胞分級方法，其特徵在於， 根據如請求項3所記載的前處理方法，對含有所述細胞的血液進行前處理後， 使經所述前處理的所述血液在所述微細流路中流動，藉此對所述血液中的細胞進行水力學（hydraulics）的分級。
  10. 如請求項9所記載的分級方法，其中， 於所述前處理中，所述粒子具有粒徑分布，並且其體積基準的累積分布中的中值粒徑d50V為25～280 μm，並且藉由篩選，從所述粒子預先去除小於截取直徑的小粒子； 於所述分級中，於所述微細流路中進行所述水力學的分級處之上游，設置使所述血液的流動呈平面狀之扁平的入流通路，所述截取直徑則大於所述入流通路之剖面中的短邊方向的長度。
  11. 如請求項10所記載的分級方法，其中， 於所述入流通路設置支柱密集帶，以橫切所述血液的流體， 所述支柱密集帶中的各支柱沿著所述短邊方向直立。
  12. 如請求項11所記載的分級方法，其中， 所述分級為對來自胎兒的有核紅血球、循環腫瘤細胞（CTC）及骨髓瘤細胞的任一者進行濃縮。
  13. 一種評估方法，其為對血液的前處理進行評估的方法，其特徵在於， 對含有細胞的血液實施前處理後，使所述血液在微細流路中流動時，於所述微細流路的途中設置支柱密集帶，以橫切所述血液的流體， 於使所述血液開始流動經過預設時間後，觀測在所述支柱密集帶及其下游側與其相鄰且支柱稀疏的區間中產生的碎屑（debris）。
  14. 如請求項13所記載的評估方法，其中， 所述區間是由最上游的支柱密集帶及位於其下游的支柱密集帶、與所述微細流路的側壁所包圍， 俯視所述區間時，藉由面積比求出所述碎屑相對於所述區間所佔的比例。
  15. 如請求項14所記載的評估方法，其中， 藉由使含有所述細胞的血液接觸至被檢驗材料的表面，以進行所述前處理。
  16. 如請求項14所記載的評估方法，其中， 於含有所述細胞的血液中添加被檢驗材料的同時與其混合，以進行所述前處理。
TW108138283A 2018-10-25 2019-10-23 血液的前處理方法及血液中的細胞分級方法 TWI835899B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018200712 2018-10-25
JP2018-200712 2018-10-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202032122A true TW202032122A (zh) 2020-09-01
TWI835899B TWI835899B (zh) 2024-03-21

Family

ID=70330681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108138283A TWI835899B (zh) 2018-10-25 2019-10-23 血液的前處理方法及血液中的細胞分級方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210382035A1 (zh)
EP (1) EP3872488A4 (zh)
JP (1) JP7316674B2 (zh)
KR (1) KR102526641B1 (zh)
CN (1) CN112912725A (zh)
CA (1) CA3115966C (zh)
SG (1) SG11202104030TA (zh)
TW (1) TWI835899B (zh)
WO (1) WO2020085000A1 (zh)

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1041424A (en) * 1974-05-09 1978-10-31 Lars-Olov Andersson Isolation of coagulation factors from biological material
CN1055880A (zh) * 1991-06-07 1991-11-06 北京市海淀四达技术开发中心 血液综合回收法
JPH105329A (ja) * 1996-06-21 1998-01-13 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 直接血液灌流に用いる吸着体用担体およびその小粒径化法
WO2001006244A2 (en) * 1999-07-16 2001-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System General signaling protocols for chemical receptors in immobilized matrices
GB2355717A (en) * 1999-10-28 2001-05-02 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd DNA isolation method
JP4138488B2 (ja) * 2001-01-30 2008-08-27 株式会社カネカ 直接血液灌流が可能な体液処理器
CA2504603C (en) * 2002-11-19 2012-11-13 Sekisui Chemical Co., Ltd. Plasma or serum separation membrane and filter apparatus including the plasma or serum separation membrane
JP2004294388A (ja) * 2003-03-10 2004-10-21 Arkray Inc 成分分析装置
WO2005107802A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Biopheresis Technologies, Llc Method and system to remove soluble tnfr1, tnfr2, and il2 in patients
AU2005269067B2 (en) * 2004-07-30 2012-02-16 Pluriselect Gmbh Device and method for isolating cells, bioparticles and/or molecules from liquids for use with animals, in biotechnology, (including biotechnological research) and medical diagnostics
US20070196820A1 (en) * 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
JP2007071711A (ja) * 2005-09-07 2007-03-22 Fujifilm Corp 分析チップ
JP2007175684A (ja) 2005-12-26 2007-07-12 Minoru Seki 微粒子の濃縮・分級のための流路構造および方法
ES2538121T3 (es) * 2006-01-17 2015-06-17 Somalogic, Inc. Métodos de detección usando aptámeros
WO2012142180A1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Tianxin Wang Methods to detect and treat diseases
JP5834559B2 (ja) * 2011-07-12 2015-12-24 コニカミノルタ株式会社 目的細胞の検査方法
JP6326582B2 (ja) * 2012-10-15 2018-05-23 国立大学法人名古屋大学 微粒子分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法
EP2912434B1 (en) * 2012-10-24 2019-12-04 The Regents of The University of California System and method for deforming and analyzing particles
WO2015002975A1 (en) * 2013-07-05 2015-01-08 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods, compositions and systems for microfluidic assays
JP6386567B2 (ja) 2013-10-11 2018-09-05 ビザ インターナショナル サービス アソシエーション ネットワーク・トークン・システム
JP6234542B1 (ja) 2016-12-27 2017-11-22 株式会社 ＴＬ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ 胎児細胞由来染色体ｄｎａの取得方法
CN107262171A (zh) * 2017-07-12 2017-10-20 华讯方舟科技有限公司 一种血液分离预处理芯片及血液分离装置
CN107702973A (zh) * 2017-09-08 2018-02-16 深圳市太赫兹科技创新研究院有限公司 一种全血血浆分离系统及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3115966A1 (en) 2020-04-30
JPWO2020085000A1 (ja) 2021-09-09
KR20210073564A (ko) 2021-06-18
JP7316674B2 (ja) 2023-07-28
US20210382035A1 (en) 2021-12-09
CA3115966C (en) 2023-03-14
KR102526641B1 (ko) 2023-04-26
EP3872488A1 (en) 2021-09-01
SG11202104030TA (en) 2021-05-28
CN112912725A (zh) 2021-06-04
TWI835899B (zh) 2024-03-21
WO2020085000A1 (ja) 2020-04-30
EP3872488A4 (en) 2022-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lim et al. Microsieve lab-chip device for rapid enumeration and fluorescence in situ hybridization of circulating tumor cells
Okano et al. Enrichment of circulating tumor cells in tumor-bearing mouse blood by a deterministic lateral displacement microfluidic device
JP6425250B2 (ja) 体液中の固形腫瘍の新たなバイオマーカーの捕獲、特定及び使用
JP7096589B2 (ja) 癌の層別化及び診断における末梢循環腫瘍細胞有糸分裂指数の使用
CN110431423B (zh) 使用循环癌症相关巨噬细胞样细胞(caml)预测患癌对象总生存期和无进展生存期的方法
CN112074742A (zh) 使用循环细胞监测受试者治疗应答和疾病进展的方法
JP6924210B2 (ja) 試料中の標的細胞をエンリッチするシステムおよび方法
KR101794218B1 (ko) 비침습적 산전 진단을 위한 산모 혈액 내 유핵 적혈구의 농축 분리 방법
JP2013017429A (ja) 血球溶解後のサイズ分離により血液から希少な目的細胞を回収する方法
TW202032122A (zh) 血液的前處理方法、血液中的細胞分級方法及對血液的前處理進行評估的方法
TW202130378A (zh) 血液用裝置
US20220042970A1 (en) Capture, identification and use of a new biomarker of solid tumors in body fluids
Ouyang Segregation, Capture and Recovery of circulating Clonal Plasma Cells in Peripheral Blood of MM patients using Micropillar-Integrated Microfluidic device and its clinical applicability
CN113189040A (zh) 高效无损检测样本中肿瘤细胞数量与活性的方法与系统
Małecka-Giełdowska et al. MYELODYSPLASTIC SYNDROME NOT OTHERWISE CLASSIFIED. DO AUTOMATIC METHODS CORRELATE WITH THE MICROSCOPIC METHOD OF BLOOD SMEAR ASSESSMENT?