KR20210073564A - 미세유로에 의한 혈구의 분급을 위한 혈액의 전처리 - Google Patents

미세유로에 의한 혈구의 분급을 위한 혈액의 전처리 Download PDF

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Abstract

혈액을 미세유로중에 흘림으로써 혈액중의 세포를 분급하기 전에, 세포를 포함하는 혈액을 다공질재가 가지는 다공질성의 표면에 접촉시킨다(S80)). 일예에 있어서, 다공질재를, 세포를 포함하는 혈액중에 첨가함과 동시에 혼합함으로써, 세포를 포함하는 혈액을 다공질성의 표면에 접촉시킨다. 일예에서, 다공질재는 다공질성의 표면이 다당류로 이루어지는 입자이다. 이러한 다공질재는 액체중에 현탁된 상태에서 세포를 포함하는 혈액중에 첨가된다. 일예에서, 입자는 소정의 입자 지름 분포를 가진다. 그의 체적 기준의 적산 분포에 있어서의 중앙 입자 지름 d50V가 25 내지 280㎛이다.

Description

미세유로에 의한 혈구의 분급을 위한 혈액의 전처리
본 발명은 혈액의 전처리에 관한 것으로서, 특히 미세유로에 의한 혈구의 분급을 위한 혈액의 전처리에 관한 것이다. 또한 혈액의 전처리의 평가 방법에 관한 것이다.
특허문헌 1에는 미세유로에 의한 혈구의 분급이 기재되어 있다.
국제 공개 제2018/123220호
혈액을 미세유로에 흘리면 미세유로중에서 막힘(clogging)이 생기는 일이 있다. 본 발명은 막힘의 해소에 적합한 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
＜1＞
혈액을 미세유로중에 흘림으로써 혈액중의 세포를 분급하기 전에,
상기 세포를 포함하는 혈액을 다공질재가 가지는 다공질성의 표면에 접촉시키는
혈액의 전처리 방법.
＜2＞
상기 다공질재를 상기 세포를 포함하는 혈액중에 첨가함과 동시에 이것과 혼합함으로써 상기 세포를 포함하는 혈액을 상기 다공질성의 표면에 접촉시키는
＜1＞에 기재된 전처리 방법.
＜3＞
상기 다공질재는 상기 다공질성의 표면이 다당류로 이루어지는 입자임과 동시에, 액체중에 현탁된 상태에서 상기 세포를 포함하는 혈액중에 첨가되는
＜2＞에 기재된 전처리 방법.
＜4＞
상기 입자는 입자 지름 분포를 가짐과 동시에, 그의 체적 기준의 적산(積算) 분포에 있어서의 중앙 입자 지름 d50V가 25 내지 280㎛인,
＜3＞에 기재된 전처리 방법.
＜5＞
상기 다공질재는 상기 다공질재를 겔 여과 크로마토그래피에 이용한 경우에 DNA를 분획(分畵)할 수 있는 것이고, 여기서 상기 다공질재의 상기 DNA에 대한 배제 한계는 45염기쌍 이상인,
＜4＞에 기재된 전처리 방법.
＜6＞
상기 다공질재는 상기 다공질재를 겔 여과 크로마토그래피에 이용한 경우에 단백질을 분획할 수 있는 것이고, 상기 다공질재의 상기 단백질에 대한 분획 범위 하한이 1×104Da 이상이거나, 상기 다공질재의 상기 단백질에 대한 분획 범위의 상한이 4×106Da 이상인 것 중의 적어도 어느 하나를 만족시키는
＜4＞에 기재된 전처리 방법.
＜7＞
상기 입자로부터는 컷오프 지름 이하의 입자 지름을 가지는 작은 입자가 미리 제거되어 있고,
상기 컷오프 지름은 25 내지 100㎛의 범위에 있는
＜4＞에 기재된 전처리 방법.
＜8＞
상기 다공질재의 표면에 접촉시키는 혈액은 다른 액체에 의해 희석되어 있지 않은 전혈(全血)임과 동시에 상기 다공질재의 표면에 접촉시킨 후에 전혈을 다른 액체로 희석하거나, 또는
상기 다공질재의 표면에 접촉시키는 혈액은 다른 액체에 의해 미리 희석된 전혈인,
＜3＞에 기재된 전처리 방법.
＜9＞
＜3＞에 기재된 전처리 방법에 기초하여, 상기 세포를 포함하는 혈액을 전처리한 후에,
상기 전처리한 혈액을 상기 미세유로중에 흘림으로써 상기 혈액중의 세포를 수력학적으로 분급하는
혈액중의 세포의 분급 방법.
＜10＞
상기 전처리에 있어서,
상기 입자는 입자 지름 분포를 가지고 있음과 동시에, 그의 체적 기준의 적산 분포에 있어서의 중앙 입자 지름 d50V가 25 내지 280㎛이고, 또
상기 입자로부터는 체가름(篩分, sieving)에 의해 컷오프 지름 이하의 작은 입자가 미리 제거되어 있고,
상기 분급에 있어서,
상기 미세유로중의 상기 수력학적인 분급을 행하는 개소의 상류에는 혈액의 흐름을 평면적인 것으로 하는 편평한 엔트리 유로가 마련되어 있고,
상기 컷오프 지름은 상기 엔트리 유로의 단면에 있어서의 짧은쪽 방향의 길이보다도 큰,
＜9＞에 기재된 분급 방법.
＜11＞
상기 엔트리 유로에는 상기 혈액의 흐름을 가로지르도록 필러(pillar) 밀집대가 마련되어 있고,
상기 필러 밀집대중의 각 필러는 상기 짧은쪽 방향을 따라 세워져 있는
＜10＞에 기재된 분급 방법.
＜12＞
상기 분급은 태아유래 유핵적혈구, 순환 종양세포(circulating tumor cell)(CTC) 및 골수종 세포 중의 어느 하나를 농축하는 것인,
＜11＞에 기재된 분급 방법.
＜13＞
혈액의 전처리에 대한 평가 방법으로서,
세포를 포함하는 혈액에 대해 전처리를 실시한 후에, 상기 혈액을 미세유로중에 흘리는데, 상기 미세유로의 도중에는 상기 혈액의 흐름을 가로지르도록 필러 밀집대가 마련되어 있고,
상기 필러 밀집대 및 그의 하류측에서 이것과 인접하는 필러가 희박하게 되어 있는 구획중에 생기는 데브리(debris)를, 혈액을 흘리기 시작하고 나서 일정 시간 경과 후에 관측하는
평가 방법.
＜14＞
상기 구획은 가장 상류의 필러 밀집대 및 그 다음에 위치하는 필러 밀집대와 상기 미세유로의 측벽에 의해 둘러싸여 있고,
상기 구획을 평면에서 보았을 때, 상기 구획에 대해 상기 데브리가 차지하는 비율을 면적비로 구하는
＜13＞에 기재된 평가 방법.
＜15＞
상기 세포를 포함하는 혈액을 피험재료의 표면에 접촉시킴으로써 상기 전처리를 행하는
＜14＞에 기재된 평가 방법.
＜16＞
상기 세포를 포함하는 혈액중에 피험재료를 첨가함과 동시에 이것과 혼합함으로써 상기 전처리를 행하는
＜14＞에 기재된 평가 방법.
본 발명에 의해 미세유로중의 막힘의 해소에 적합한 방법을 제공하는 것이 가능해진다.
도 1은 전처리 스텝을 포함하는 흐름도이다.
도 2는 다공질 입자의 입자 지름 분포이다.
도 3은 미세유로의 평면도이다.
도 4는 미세유로의 부분 평면도이다.
도 5는 미세유로의 상세한 부분 사시도이다.
도 6은 엔트리 유로의 사시도이다.
도 7은 미세유로의 관찰 이미지 1(상단) 및 그 스케치(하단)이다.
도 8은 전처리에 대한 평가 작업의 흐름도이다.
도 9는 미세유로의 관찰 이미지 2(상단) 및 그 스케치(하단)이다.
도 10은 막힘률의 그래프 1이다.
도 11은 막힘률의 그래프 2이다.
＜1.혈액의 전처리 방법의 위치결정＞
본 발명의 1양태는 혈액의 전처리에 관한 것이다. 혈액의 전처리의 상세를 설명하기 전에, 도면을 참조하면서 전처리의 위치결정을 설명한다. 도면에는 혈액의 전처리 스텝(S80)을 포함하는 흐름도가 도시되어 있다. 스텝(S80)을 실시함에 있어서, 사전에 스텝(S79))에서 생체로부터 혈액의 채취가 행해진다.
전처리 스텝(S80)은 혈액중의 세포에 대한 분급 스텝(S81)을 행하기 전에 실시한다. 혈액중의 세포에 대한 분급이란, 혈액중의 세포를 그 크기에 따라서 분획하는 것이다. 스텝(S81)은 특히 혈액을 미세유로중에 흘림으로써 행해지는 것이다. 스텝(S81)의 분급 예는 미세유로 내에서 행하는 수력학적 분급이다. 미세유로는 마이크로미터 정도의 유로 구조를 가진다. 이와 같은 마이크로 유로 구조는 혈액의 분급에 적합한 것이다(특허문헌 1). 혈액의 분급에 이용되는 미세유로를 가지는 칩을 특히 혈구분리 칩이라고 부르는 경우가 있다.
도 1에서 스텝(S81)의 분급에 의해 특정의 입자 지름 분포를 가지는 세포의 집단이 얻어진다. 혈액중의 세포는 다양한 크기의 세포가 서로 섞여 있다. 각 세포종은 세포의 크기와 관련하여 고유의 입자 지름 분포를 나타낸다. 따라서 분급에 의해 얻어진 세포의 집단에는 특정의 세포종이 농축되어 있다.
도 1에서, 스텝(S82)에서 농축한 세포종이 이용된다. 농축한 세포종으로부터, 예를 들면, 의사에 의한 진단에 이용가능한 데이터를 취득할 수 있다. 진단 대상자와 농축해야 할 세포종에는 이하의 조합을 들 수 있다. 이것들은 예시이다.
도 1에서 대상으로 하는 혈액에는 농축해야 할 세포종으로서 혈구가 포함된다. 혈구는 태아유래 유핵적혈구라도 좋다. 스텝(S79)에서 취득되는 혈액은 태아유래 유핵적혈구를 함유한다. 태아유래 유핵적혈구는 임산부혈(姙婦血)에 포함된다. 진단 대상자는 태아 및 임산부이다. 스텝(S80)에서 임산부혈을 전처리한다. 스텝(S81)에서 분급에 의해 태아유래 유핵적혈구를 농축한다. 스텝(S82)에서 태아에 대한 진단에 유용한 데이터를 취득한다.
도 1에서 대상으로 하는 혈액에는 농축해야 할 세포종으로서, 혈액중을 순환하는 세포로서 혈구가 아닌 다른 세포가 포함된다. 그것은 순환 종양세포(CTC) 라도 좋다. 스텝(S79)에서 취득되는 혈액은 CTC를 함유한다. CTC는 예를 들면 암이 의심되는 피험자, 암환자 및 암 치료를 이미 받은 피험자의 혈액에 포함될 가능성이 있다. 이와 같은 사람이 진단 대상자가 된다. 스텝(S80)에서 이들의 혈액을 전처리한다. 스텝(S81)에서 분급에 의해 CTC를 농축한다. CTC가 혈액에 포함되어 있는지의 여부에 관계없이 CTC를 농축하는데 필요한 공정을 실행한다. 스텝(S82)에서 암의 진단에 유용한 데이터를 취득한다.
도 1에서 대상으로 하는 혈액에 포함되는 세포로서 농축해야 할 세포종은 골수종 세포라도 좋다. 스텝(S79)에서 취득되는 혈액은 골수종 세포를 함유한다. 골수종 세포는 예를 들면 골수종의 치료를 행한 환자로부터 미소 잔존 병변(minimal residual disease)(MRD)으로서 검출될 가능성이 있다. 이런 사람들이 진단 대상자가 된다. 골수종의 일예는 다발성 골수종이다. 스텝(S80)에서 이러한 환자로부터 채취한 혈액을 전처리한다. 스텝(S81)에서 분급에 의해 골수종 세포를 농축한다. 골수종 세포가 혈액에 포함되어 있는지의 여부에 관계없이 골수종 세포를 농축하는데 필요한 공정을 실행한다. 스텝(S82)에서 MRD에 대한 진단에 유용한 데이터를 취득한다.
도 1에서, 스텝(S79), 스텝(S81) 및 스텝(S82)은 스텝(S80)의 기술적 의미를 이해하기 위해 설명했다. 따라서 이들 스텝은 본 양태에서 필수는 아니다. 또한 이들 스텝 사이에 다른 스텝이 도입되어도 좋다. 스텝(S80) 전과 후의 어느 하나에 다른 스텝이 도입되어도 좋다.
＜2.혈액의 전처리 방법의 상세＞
도 1에 도시하는 전처리 스텝(S80)을 더 상세하게 설명한다. 스텝(S80)에서는 혈액을 다공질재가 가지는 다공질성의 표면에 접촉시킨다. 혈액에는 혈구 및 혈액중을 순환하는 다른 세포가 포함된다. 혈액은 세포 및 혈장을 포함하고 있다. 혈액을 다공질성의 표면에 접촉시키기 위해서 다공질재를 혈액중에 첨가한다. 용기에 분취(分取)한 혈액에 대해 다공질재를 첨가함으로써 행해도 좋다. 미리 용기 중에 다공질재를 분취해 둠과 동시에, 또한 이러한 용기에 혈액을 집어넣음으로써 행해도 좋다. 또 다공질재와 혈액을 혼합한다. 다공질재가 혈액 전체에 흩어지도록 이들을 잘 혼합하는 것이 좋다.
다공질재는 혈액중에서 가라앉는 것이라도 좋다. 다공질재는 입자라도 좋다. 입자는 구상(球狀)이라도 좋다. 입자는 비드(bead)라도 좋다. 본 명세서에 있어서 비드라는 것은 각 입자가 구상으로 되는 바와 같은 수법으로 형성된 입자군을 말한다. 입자를 혈액에 현탁해도 좋다. 다공질재가 입자인 경우, 다공질재를 혈액이 아닌 액체에 미리 현탁해도 좋다. 혈액이 아닌 액체는 완충액이나 보존액이라도 좋다. 혈액이 아닌 액체에 혈청을 첨가해도 좋다. 혈청으로서 FBS를 사용해도 좋다. 다공질재 입자의 현탁액을 혈액중에 첨가함으로써, 혈액과 다공질재를 접촉시켜도 좋다.
다공질성의 표면에 접촉시키는 혈액은 다른 액체에 의해 희석되어 있지 않은 전혈이라도 좋다. 전혈이란 혈액이 혈액 성분마다 분리되어 있지 않고, 혈구, 혈장 등의 모든 성분을 포함하고 있는 것을 말한다.
도 1에 도시하는 스텝(S79)에서 전혈을 채취한 후에, 스텝(S80)에서 전처리할 때까지의 동안에 전혈을 일정 기간 보존해도 좋다. 보존 기간은 1 내지 72시간이라도 좋다. 보존 온도는 실온 1 내지 30℃(일본 약국방(Japanese Pharmacopoeia))이라도 좋다. 보존 온도는 4 내지 25℃가 바람직하고, 4℃가 특히 바람직하다. 또한 보존 온도에는 플러스마이너스 2℃ 범위 내의 변동(fluctuation)이 있어도 좋다. 변동의 범위는 플러스마이너스 1℃인 것이 바람직하다. 스텝(S79)에서 채혈 후에 채혈 시설 밖으로 전혈을 수송하고 나서 스텝(S80)의 전처리를 할 때는 전혈을 4℃로 유지하면서 수송하는 것이 바람직하다. 또 보존 공정을 사이에 개재시키는 일 없이, 스텝(S79)에서 전혈을 채취한 후에, 신속하게 스텝(S80)에서 전처리를 해도 좋다.
도 1에 도시하는 스텝(S80)의 전처리에서, 다공질재와 혈액을 혼합한 다음에, 소정의 시간, 소정의 온도에서 인큐베이트(incubation)하는 것이 바람직하다. 시간은 예를 들면 1 내지 60분으로 할 수 있다. 30분±5분으로 해도 좋다. 인큐베이트의 온도는 실온 1 내지 30℃(일본 약국방)라도 좋다. 인큐베이트의 온도는 4 내지 25℃라도 좋다. 인큐베이트의 온도는 전혈중의 세포나 물질의 상태를 현저하게 해치는 것이 아니면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 4℃의 환경하에서 전혈을 보존한 후에, 25℃의 환경하에서, 이미 차게 되어 있는 전혈을 인큐베이트해도 좋다.
다공질재가 입자인 경우, 다공질재의 첨가량은 희석하고 있지 않은 혈액 1mL당 10 내지 50μL이다. 희석혈의 희석 배율에 맞추어 다공질재의 첨가량을 조정해도 좋다. 이 경우, 희석률이 높을수록, 다공질재의 첨가량을 적게 해도 좋다. 예를 들면, 1mL의 혈액을 5배로 희석한 경우, 5mL의 희석혈에 대해 10μL의 다공질재를 첨가해도 좋다. 1mL의 혈액을 2.5배로 희석한 경우, 2.5mL의 희석혈에 대해 20μL의 다공질재를 첨가해도 좋다.
상기에서 다공질재의 체적을 특정함에 있어서 다공질재는 물로 팽윤(膨潤)하고 있는 것으로 한다. 다공질재의 비드인 경우는 다공질재를 비드액 상태에서 취급해도 좋다. 비드액은 다공질재를 인산 완충 생리 식염수(phosphate buffer normal saline)(PBS)중에 섞은 것이다. 여기서 비드 사이의 빈틈은 편의적으로 비드의 체적에 포함시킨 다음에, 다공질재의 비드를 계측하는 것으로 한다. 예로서 50%를 다공질재의 비드가 차지하고, 나머지 50%를 PBS가 차지하고 있는 비드액을 이용해도 좋다.
상기에 있어서 다공질재는 사전에 세정해 두어도 좋다. 세정은 PBS로 행해도 좋다. 세정은 혈액 희석용의 액체나 증류수로 행해도 좋다. 세정은 2회 행해도 좋고, 3회 이상 행해도 좋다.
도 1에서, 예를 들면 스텝(S79)의 혈액 채취와 동시에 스텝(S80)의 전처리를 행해도 좋다. 예를 들면 다공질재를 채혈관 내에 미리 배치해 둔다. 이것에 의해 혈액의 채취와 동시에 채취한 전혈과 다공질재를 채혈관 내에서 접촉시킨다. 채혈관을 흔들어서 혈액을 다공질재에 더욱 더 잘 접촉시켜도 좋다.
도 1에서 전처리 스텝(S80)에서 다공질성의 표면에 접촉시키는 혈액은 다른 액체에 의해 희석된 전혈이라도 좋다. 예를 들면 스텝(S79)의 혈액의 채취 후에, 스텝(S80)에서 혈액을 다공질재에 접촉시키기 전에 생체로부터 채취된 혈액을 다른 액체로 희석한다. 본 명세서에서는 희석을 마친 전혈도 혈액에 포함하는 것으로 한다. 희석률은 1배보다 크고, 10배 이하라도 좋다. 즉, 전혈의 체적 1에 대해 체적 0보다 크고, 체적 9 이하의 다른 액체를 첨가해도 좋다. 희석률은 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 및 5.0배 중의 어느 하나라도 좋다. 희석률은 6, 7, 8 및 9배 중의 어느 하나라도 좋다.
일예에서, 전혈 1mL에 대해 50 내지 100μL의 비드액(비드 50 체적%)을 더하고, 30분, 25℃의 환경조건하에서 회전 혼화(混和)한다. 이 회전 혼화중에 다공질재의 비드와 혈구는 인큐베이트된다. 이것을 PBS로 희석한 것에 대해 혈구의 분급을 행한다. 다른 일예에서, 전혈을 PBS로 희석한 후에 다공질재를 더해도 좋다. 이 경우 인큐베이트는 행하지 않고 분급한다. 또한 다공질재를 큼지막한 튜브 내에 미리 첨가해 두고, 여기에 희석혈을 더 첨가해도 좋다. 또한 미리 준비한 희석 용액에 다공질재를 첨가해 두고, 여기에 전혈을 첨가함으로써 희석과, 다공질재와의 접촉을 동시에 행해도 좋다.
다공질재가 혈장중에 포함되는 성분과 반응해도 좋다. 예를 들면 다공질재가 혈장중에 포함되는 성분을 흡착해도 좋다. 흡착되는 성분은 직접 미세유로를 막히게 하는 것이더라도 좋다. 흡착되는 성분은 미세유로의 막힘을 간접적으로 촉진하는 것이더라도 좋다.
다공질재의 표면에는 다수의 미세구멍이 형성되어 있다. 다공질재는 다공질이 아닌 그밖의 재료와 결합하고 있어도 좋다. 예를 들면 다공질이 아닌 입자가 다공질재로 코팅되어 있음으로써 다공질성의 입자로 되어 있어도 좋다. 입자의 중심은 다공질성이 아니어도 좋다. 입자의 중심은 강자성체라도 좋다.
다공질재의 재질은 다당류라도 좋다. 다공질재의 미세구멍은 다당류로 형성된 것이라도 좋다. 다당류는 가교되어 있어도 좋다. 다당류는 아가로오스, 덱스트란 및 알릴 덱스트란 중의 어느 하나라도 좋다. 다당류는 개질(修飾)되어 있어도 좋다. 개질은 DEAE(Diethylethanolamine) 개질이라도 좋다.
입자상(粒子狀)의 다공질재는 겔 여과 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)에 이용할 수 있는 것이라도 좋다. 겔 여과 크로마토그래피란 이동상(移動相)이 수용액인 사이즈 배제 크로마토그래피이다. 또한 이 때에 DNA를 분획할 수 있는 것이라도 좋다. 다공질재의 DNA에 대한 배제 한계는 45 염기쌍(base pairs) 이상인 것이 바람직하다. 다공질재의 DNA에 대한 배제 한계는 165 염기쌍 이상이라도 좋고, 이하라도 좋다. 다공질재의 DNA에 대한 배제 한계는 1078 염기쌍 이상이라도 좋고, 이하라도 좋다.
입자상의 다공질재는 단백질을 분획할 수 있는 것이라도 좋다. 다공질재의 단백질에 대한 분획 범위의 하한이 1×104 Da 이상인 것이 바람직하다. 다공질재의 단백질에 대한 분획 범위의 상한이 4×106 Da 이상인 것이 바람직하다. 입자상의 다공질재는 적어도 상기한 것 중의 어느 하나를 만족시키는 것이 바람직하다.
도 2에는 다공질 입자의 입자 지름 분포가 체적 기준의 적산 분포로 도시되어 있다. 다공질재의 입자는 입자 지름 분포를 가진다. 다공질재의 중앙 입자 지름 d50V(Median particle size of the cumulative volume distribution)는 체적 기준의 적산 분포에서의 중앙 입자 지름이다. 입자가 다당류로 이루어지는 경우, 입자가 완충액중에서 팽윤한 상태에서의 입자 지름을 기준으로 한다. 입자 지름의 측정예는 레이저 회절·산란법으로 구한 유효 지름이나 콜터법(Coulter method)으로 구한 구(球) 체적에 상당하는 지름이다.
도 2에서, 중앙 입자 지름 d50V는 500㎛ 미만인 것이 바람직하다. 중앙 입자 지름 d50V는 바람직하게는 25 내지 280㎛, 보다 바람직하게는 25 내지 165㎛, 더욱더 바람직하게는 45 내지 165㎛이다. 중앙 입자 지름 d50V가 이러한 범위에 있음으로써, 다공질재의 표면적을, 혈액과의 접촉에 적합한 것으로 할 수 있다.
도 2에서 다공질재의 입자로부터는 필요에 따라서 작은 입자가 컷오프되어 있는 것이 바람직하다. 컷오프라는 것은 다공질재의 입자로부터, 작은 입자가 제거되는 것이다. 1양태에서, 컷오프 지름(CF) 이하의 입자 지름을 가지는 작은 입자가 미리 제거된다. 컷오프 지름(CF)의 범위는 25 내지 100㎛이다. 컷오프 지름(CF)은 40 내지 70㎛라도 좋다. 작은 입자의 제거는 메시에 의한 체가름으로 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면 셀 스트레이너(Cell Strainer)를 이용하여 다공질재 입자의 집단으로부터 작은 입자를 제거해도 좋다. 작은 입자가 제거되어 있음으로써, 혈중(血中)에 섞인 작은 입자에 의한 미세유로의 막힘을 억제할 수 있다. 미세유로의 종류에 따라서는 미세유로에 진입한 작은 입자가 아무 일도 없이 미세유로로부터 유출된다. 그러한 유로에서는 작은 입자에 의한 막힘을 고려하지 않아도 좋다. 그렇지만 그러한 미세유로에서도 혈중의 어떠한 화학적 성분에 의한 막힘(나중에 기술하는 데브리)은 생기는 일이 있다. 따라서 컷오프하고 있지 않은 입자의 사용은 막힘의 억제에 유효하다.
원래의 입자로부터 작은 입자가 제거되면 원래의 입자의 입자 지름 분포가 바뀐다. 즉 컷오프에는 사이즈 셀렉션의 효과가 있다. 사이즈 셀렉션 후에는 중앙 입자 지름도 변화한다. 편의상, 본 명세서에서 중앙 입자 지름 d50V는 컷오프에 의해 원래의 입자로부터 작은 입자를 제거하기 전의 입자 지름 분포에 기초하는 것으로 한다.
＜3. 혈액중의 세포의 분급 방법＞
도 1을 다시 참조한다. 본 발명의 1양태는 스텝(S80)과 스텝(S81)을 조합한 혈액중의 세포의 분급 방법이다. 우선 상술한 전처리 방법에 기초하여 세포를 포함하는 혈액을 처리한다(스텝(S80)). 다음에, 전처리한 혈액을 미세유로중에 흘림으로써 혈액중의 세포를 수력학적으로 분급한다(스텝(S81)).
도 1에서 혈액을 미리 희석하고 나서, 스텝(S81)에서 분급을 해도 좋다. 희석은 스텝(S80)의 전처리 전에 행해도 좋고, 나중에 행해도 좋다. 분급하는 시점에서의 전혈에 대한 희석률은 1배보다 크고, 10배 이하라도 좋다. 즉, 전혈의 체적 1에 대해 체적 0보다 크고, 체적 9 이하의 다른 액체를 첨가해도 좋다. 희석률은 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 및 5.0배 중의 어느 하나라도 좋다. 희석은 전처리 전과 후의 둘 다에서 행해도 좋다. 예를 들면, 전처리를 행하기 전에 2 내지 3배로 전혈을 희석해 두고, 전처리가 끝난 후에 또 이것을 희석해서 전혈에 대한 5배 희석으로 해도 좋다.
도 1에 도시하는 스텝(S80)에서 혈액의 전처리를 한 후에, 스텝(S81)에서 분급할 때까지의 동안에 전처리를 마친(전처리한) 혈액을 보존해도 좋다. 전처리 후의 보존 온도의 범위는 4±2℃라도 좋다. 보존 공정을 사이에 두는 일 없이, 전처리 후에 신속하게 스텝(S81)에서 분급을 해도 좋다.
＜4. 분급 디바이스＞
이하에는 수력학적인 분급을 위한 디바이스의 일예를 나타낸다. 도 3에는 평면에서 본 미세유로(20)가 도시되어 있다. 미세유로(20)는 혈구를 비롯한 부유 세포의 분리용 유로 칩이다. 도면중의 X, Y 및 Z의 각 축은 미세유로(20)의 기능을 이해하기 위해서 편의적으로 나타낸 것이다. 이들 축은 미세유로(20)의 형상을 구체적으로 제한하는 것은 아니다.
도 3에서 미세유로(20)는 주유로(主流路)(23)를 가진다. 주유로(23)의 한쪽 단(端)은 입구(21a)로 되어 있다. 주유로(23)의 또다른 한쪽 단은 출구(22c)로 되어 있다. 미세유로(20)는 또 부유로(副流路)(24)를 가진다. 부유로(24)의 단은 입구(21b)로 되어 있다. 부유로(24)의 단은 합류부(28)에서 주유로(23)에 접속하고 있다.
도 3에서 주유로(23)는 입구(21a)로부터 출구(22c)를 향해 차례로 유로 파트(25a 내지 25d)를 가진다. 유로 파트(25a 내지 25d)는 입구(21a)로부터 출구(22c)까지 하나로 이어져 있다. 유로 파트(25a)와 유로 파트(25b) 사이에 합류부(28)가 있다.
도 3에서 미세유로(20)는 가지 유로(枝流路, branch channel)(26a 및 26b)를 가진다. 가지 유로(26a 및 26b)는 어느 것이나 주유로(23)로부터 분기하는 유로이다. 상류측으로부터 차례로 가지 유로(26a) 및 가지 유로(26b)가 이 순서대로 주유로(23)로부터 분기한다. 가지 유로(26a 및 26b)의 일단은 유로 파트(25c)에서 주유로(23)와 접속한다. 유로 파트(25c)에서, 부유로(24)와 대향하는 측에 가지 유로(26a 및 26b)가 배치되어 있다. 가지 유로(26a 및 26b)의 다른 단(他端)에 출구(22a) 및 출구(22b)가 있다.
도 3에서 가지 유로(26a 및 26b)는 어느것이나 주유로(23)로부터 분기하는 세유로(細流路, small channel)를 복수개 가진다. 각 세유로는 주유로(23)의 상류로부터 하류로의 방향을 따라 늘어선다. 각 세유로는 각각 출구(22a 및 22b)에 도달한다. 각 세유로는 각각 출구(22a 및 22b) 바로앞에서 합류한다. 유로 파트(25c)의 하류에는 유로 파트(25d)가 있다. 유로 파트(25d)는 출구(22c)에 도달한다.
도 3에서 입구(21a)는 전처리된 혈액(BL)을 넣은 시린지(syringe)(30)와 접속된다. 시린지(30)로부터는 소정의 유량으로 혈액(BL)을 입구(21a)에 보낸다. 혈액(BL)은 입구(21a)를 경유하여 유로 파트(25a)로 들어간다. 혈액(BL)의 전처리는 시린지(30) 내에서 행해도 좋다. 시린지(30) 내에서 혈액(BL)의 전처리를 행하고 나서 시린지(30)로부터 미세유로(20)로 혈액(BL)을 보낸다.
도 3에서 미세유로(20)는 부유로(24)를 가진다. 부유로(24)는 시린지(35)와 접속되어 있다. 시린지(35)에는 청징액(淸澄液, clarified liquid)(CL)이 들어 있다. 청징액(CL)은 부유 세포를 포함하지 않는 액체이다. 청징액(CL)은 혈구나 그밖의 세포에 대미지(damage)를 주지 않는 액체이다. 청징액(CL)은 완충액이다. 청징액(CL)은 PBS라도 좋다. 시린지(35) 내에 압력을 가함으로써 청징액(CL)은 입구(21b)로부터 부유로(24)에 들어간다. 청징액(CL)은 부유로(24)를 흐른다. 청징액(CL)은 유로 파트(25b)에 유입한다.
각 출구에는 세포 현탁액의 프랙션(畵分, fraction)이 배출된다. 출구(22c)에는 프랙션 F3이, 출구(22b)에는 프랙션 F2가, 출구(22a)에는 프랙션 F1이 얻어진다. 프랙션 F1 및 프랙션 F2에는 유로 파트(25c)에서 분급된 세포가 각각 포함된다. 프랙션 F3에는 유로 파트(25c)를 통과한 혈장이 포함된다.
도 4에는 평면시한 미세유로(20)가 도시되어 있다. 도면은 미세유로(20)에 의한 부유 세포의 분별(分別, fractionating) 과정을 모식적으로 도시하고 있다. 설명을 간단하게 하기 위해, 가지 유로(26a)에는 10개의 세유로가, 가지 유로(26b)에는 3개의 세유로가 도시되어 있다.
또한 도 4 및 도 5는 일본공개특허공보 특개2007－175684호에서 인용되고 일부가 변경된다. 분급의 메카니즘은 일본공개특허공보 특개2007－175684호에 특히 상세하게 설명되어 있다.
도 4에 도시하는 바와 같이, 유로 파트(25b)의 더욱더 상류로부터 혈액(BL)이 연속적으로 흘러 들어온다. 혈액(BL)은 세포를 대량으로 포함하고 있다. 혈액(BL)의 흐름에 대해, 그의 측방부터 청징액(CL)의 흐름을 연속적으로 접촉시킨다. 이것에 의해 주유로(23)를 흐르는 세포를, 주유로(23)의 측방으로부터 연속적으로 밀어넣는다. 결과로서 혈액(BL)의 흐름은 청징액(CL)의 흐름과는 반대측으로 연속적으로 밀어넣어진다. 유로 파트(25b 내지 25c)에서, 가지 유로(26a 및 26b)측으로 연속적으로 부유 세포가 밀어서 보내짐과 동시에, 이들 가지 유로에 부유 세포가 연속적으로 유입한다.
도 4에 도시하는 바와 같이, 가지 유로(26a)에는 무핵적혈구(27)가 연속적으로 흘러든다. 유로 파트(25b)에서 혈액(BL)중의 무핵적혈구(27)를 수력학적으로 분급한다. 분급은 혈액(BL)의 흐름 중에서, 청징액(CL)의 흐름과는 접촉하고 있지 않는 측에서 연속적으로 행해진다.
도 4에 도시하는 바와 같이, 가지 유로(26a)는 무핵적혈구(27)의 제거 유로로서 기능한다. 가지 유로(26a)가 가지는 세유로의 내접 지름은 12 내지 19㎛이다. 내접 지름은 13, 14, 15, 16, 17, 및 18㎛ 중의 어느 하나라도 좋다.
도 4에 도시하는 바와 같이 가지 유로(26b)에는 유핵 세포(29a 내지 29c)가 연속적으로 흘러든다. 유로 파트(25b)의 하류의 유로 파트(25c)에서, 혈액(BL)중의 유핵 세포(29a 내지 29c)를 수력학적으로 분급한다. 분급은 혈액(BL)의 흐름 가운데, 청징액(CL)의 흐름과는 접촉하고 있지 않는 측에서 연속적으로 행해진다. 특히 가지 유로(26b)로부터 유핵 세포의 세포 현탁액을 연속적으로 얻는다.
　도 4에 도시하는 바와 같이 가지 유로(26b)는 유핵 세포(29a 내지 29c)의 회수 유로로서 기능한다. 가지 유로(26b)가 가지는 세유로의 내접 지름은 20 내지 30㎛이다. 내접 지름은 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 및 29㎛ 중의 어느 하나라도 좋다. 유핵적혈구를 비롯한 유핵 세포의 지름의 크기는 11 내지 13㎛라고 생각된다.
도 4에 도시하는 가지 유로(26a 및 26b)의 각 세유로의 내접 지름은 세유로의 직교 단면(直交斷面)에서의 내접원의 직경이다. 세유로의 단면은 사각형이라도 다른 다각형이라도 원이라도 좋다. 다른 가지 유로에 있어서 마찬가지이다. 가지 유로(26a 및 26b)에 취입되지 않은 부유 세포나 혈장은 플로우 스루(flow-through)(FT)로서 연속적으로 유로 파트(25d)를 통과한다. 그 후에, 도 3에서 출구(22c)에 도달한다. 예를 들면 응집한 혈구 등이 플로우 스루(FT)에 포함된다.
도 5에서 유로 파트(25c)에 초점을 맞추면서 미세유로의 상세가 도시되어 있다. 본 실시예에 관계된 수력학적인 분급에서는 세유로의 내접 지름의 값이 분급되는 부유 세포의 지름의 최대값과 똑같게 되어 있는 것은 아니다. 따라서 본 실시예에 관계된 수력학적인 분급은 단순한 여과(濾過)와 다르다. 본 실시예에 관계된 수력학적인 분급을 이하에 설명한다.
도 5에는 유로 파트(25c)가 도시되어 있다. 또 가지 유로(26a)가 갖는 세유로가 도시되어 있다. 설명을 간단하게 하기 위해 가지 유로(26a)를 구성하는 세유로를 1개만으로 한다. 도 5의 설명에 있어서 가지 유로(26a)를 구성하는 세유로를 단지 가지 유로(26a)라고 칭한다.
도 5에 도시하는 바와 같이 유로 파트(25c)에는 액류 LF가 연속적으로 도입된다. 액류 LF는 상술한 혈액(BL)과 청징액(CL)을 포함한다. 액류 LF중에서 이들 액은 그의 계면에서 부분적으로 서로 섞여 있다. 액류 LF중에는 큰 세포로서 유핵 세포(29a)와, 작은 세포로서 무핵적혈구(27)가 포함되어 있다. 도면에서 유핵 세포(29a)는 다른 유핵 세포를 대표로 하여 도시되어 있다.
도 5에서 액류 LF 가운데, 가지 유로(26a)에 도입되는 부분을 액류 LE로 한다. 액류 LF 가운데, 가지 유로(26a)에 도입되지 않고, 하류를 향해 흘러 가는 부분을 액류 LG로 한다. 액류중, 액류 LG에만 빗금이 쳐져 있다. 여기서 액류 LE의 유량은 액류 LE의 단면에 비례한다. 액류 LE는 가지 유로(26a)측의 유로 파트(25c)의 내벽을 따라 흐른다. 액류 LE의 유량은 가지 유로(26a)중의 액류 LE의 유속에도 비례한다.
도 5에서 액류 LE중을 흐르는 무핵적혈구(27)가 가지 유로(26a)에 도입된다. 한편, 유핵 세포(29a)는 그의 체적의 절반 이상이 액류 LG측에 속해 있다. 유핵 세포(29a)는 액류 LE에 대해 일부 접촉하는 것에 불과하다. 이 때문에 유핵 세포(29a)는 가지 유로(26a)에는 도입되지 않는다. 이 때 유핵 세포(29a)의 지름은 가지 유로(26a)의 내접 지름보다 작아도 좋다. 만일 액류 LE의 유량이 커지면 액류 LE의 단면이 커진다. 이 경우, 유핵 세포(29a)가 액류 LE에 삼켜짐으로써, 가지 유로(26a)에 유도되는 것도 생각된다.
도 5에서 유핵 세포(29a)는 액류 LG를 타고 더욱더 하류로 운반된다. 이상에 의해, 가지 유로(26a)로부터는 일정 크기 이상의 부유 세포를 포함하지 않는 유체를 회수할 수 있다. 결과로서 무핵적혈구(27)가 여기서 분급된다. 또 유핵 세포(29a) 및 그밖의 유핵 세포는 하류에서 분급된다.
＜5.엔트리 유로＞
도 3으로 되돌아간다. 미세유로(20)중의 유로 파트(25a)는 수력학적인 분급을 행하는 유로 파트(25c)의 상류에 위치한다. 유로 파트(25a)는 또 청징액(CL)의 흐름이 합류하는 합류부(28)의 상류에 위치한다. 유로 파트(25a)는 입구(21a)에 접속한다. 이하 유로 파트(25a)를 엔트리 유로(entry channel)라고 하는 경우가 있다.
도 6에는 엔트리 유로에 해당하는 유로 파트(25a)가 도시되어 있다. 혈액은 입구(21a)로부터 유로 파트(25a)에 진입한다. 유로 파트(25a)는 편평하다. 유로 파트(25a)중의 혈액의 흐름은 평면적인 것으로 된다. 유로 파트(25a)의 YZ 단면에서의 짧은쪽 방향의 길이는 치수 SD로서 표시되어 있다.
도 6에 입각해서 말하면 치수 SD는 유로 파트(25a)의 높이에 해당한다. 치수 SD는 25±5㎛인 것이 바람직하다. 호적한 치수 SD를 선택함으로써 혈구중의 세포가 흐르기 쉬워진다. 또 유로 파트(25a)에서 혈구중의 세포를 Y 방향으로 넓힐 수 있다. 또 치수 SD는 다른 유로 파트에 걸쳐서 유지되고 있는 것이 바람직하다. 이러한 구성에 의해 +Y 방향으로부터 오는 청징액의 흐름에 의해 +X 방향으로 흐르는 혈액의 흐름을 -Y 방향으로 밀어넣기 쉬워진다(도 4 참조).
도 2로 되돌아간다. 앞에서 기술한 대로, 전처리에 이용하는 다공질의 입자는 입자 지름 분포를 가진다. 또한 1양태에서 그의 중앙 입자 지름 d50V가 500㎛ 미만이다. 중앙 입자 지름 d50V는 바람직하게는 25 내지 280㎛, 보다 바람직하게는 25 내지 165㎛, 더욱더 바람직하게는 45 내지 165㎛이다.
도 2에서, 앞에서 기술한 바에 따라서 전처리에 있어서 입자로부터는 체가름에 의해 컷오프 지름(CF) 이하의 작은 입자가 미리 제거되어 있는 것이 바람직하다. 컷오프 지름(CF)의 범위는 25 내지 70㎛이고, 바람직하게는 25 내지 40㎛이다.
도 6에는 다공질의 입자(PP)가 도시되어 있다. 입자 PP는 컷오프 지름(CF)보다도 큰 입자 지름을 가진다. 바람직한 1양태에서 컷오프 지름(CF)은 치수 SD보다도 크다. 바꾸어 말하면 거의 모든 입자 PP의 입자 지름은 치수 SD보다도 크다. 여기서 치수 SD보다도 작은 입자 지름을 가지는 입자 PP가 남아 있었다고 해도, 이것은 예를 들면 체가름의 불완전함 등에 의해 우발적으로 혼입한 입자라고 생각된다.
도 6에서, 입자 PP의 입자 지름을 상기한 대로 설정함으로써, 입자 PP의 유로 파트(25a)로의 침입을 방지할 수 있다. 바람직한 1양태에서 유로 파트(25a)의 도중에는 필러 밀집대(11)가 마련되어 있다. 필러 밀집대(11)중의 각 필러는 유로 파트(25a)의 상면과 하면을 접속하고 있다. 입자(PP)의 입자 지름을 상기한 대로 설정함으로써, 입자(PP)가 필러 밀집대(11)를 막는(차단하는) 것을 방지할 수 있다. 필러 밀집대(11)의 구성과 기능은 이하에 기술한다.
＜6. 필러 밀집대＞
도 7에는 유로 파트(25a)의 관찰 이미지 및 그 스케치가 도시되어 있다. 유로 파트(25a)는 필러 밀집대(11)를 구비한다. 필러 밀집대(11)는 유로 파트(25a) 중의 혈액의 흐름을 가로지르도록 마련되어 있다. 혈액은 도면중의 상류 좌측으로부터 하류 우측으로 흐른다.
도 7에서 유로 파트(25a)는 구획(section)(12)을 가진다. 구획(12)은 필러 밀집대(11)의 하류측에서 필러 밀집대(11)와 인접한다. 구획(12)에서는 필러가 희박하게 되어 있다. 유로 파트(25a)는 필러 밀집대(13)를 더 구비한다. 필러 밀집대(13)는 필러 밀집대(11)에서 본 하류 방향에 있어서 필러 밀집대(11)의 다음에 위치하는 필러 밀집대이다. 필러 밀집대(13)의 구성은 필러 밀집대(11)와 동등해도 좋다.
도 7에서, 구획(12)은 필러 밀집대(11)와, 필러 밀집대(13)와, 유로 파트(25a)의 측벽 즉 미세유로의 측벽에 의해 둘러싸여 있다. 유로 파트(25a)는 또 구획(14)을 가진다. 구획(14)은 필러 밀집대(13)의 하류측에서 필러 밀집대(13)와 인접한다. 유로 파트(25a)는 구획(14)의 하류에도 또 필러 밀집대를 구비한다. 부호 (15) 내지 (17)은 실시예에서 설명한다.
도 7에서, 상술한 필러 밀집대(11)는 혈액의 흐름에 대해 큰 저항으로 되는 것은 아니다. 또 필러 밀집대(11)는 혈액의 유속을 현저하게 저하시키는 것은 아니다. 필러 밀집대(11)는 필터의 역할을 한다. 필러 밀집대(11)는 혈액중의 불순물, 예를 들면, 혈구보다도 큰 불용 성분이 필러 밀집대(11)의 하류의 유로 파트에 들어가지 않게 한다. 또 응집덩어리로 되어 있는 혈구가 있으면, 하나 하나의 혈구를 뿔뿔이 흩어지게 한다고 하는 역할을 한다.
＜7. 전처리의 실시예＞
본 실시예에서는 도 7 내지 도 11에 기초하여 혈액의 전처리 방법의 예와 그 효과를 설명한다. 도 7은 후술한다. 도 8은 전처리에 대한 평가 작업의 흐름도이다. 스텝(S89)에 있어서 인체로부터 채혈한다. 혈액은 스텝(S90)에서의 전처리 전에 4℃에서, 1 내지 48시간 보존한 것이다.
도 8의 스텝(S90)에서 혈액을 다공질재의 다당류 비드로 전처리한다. 이 즈음에 비드를 사전에 세정한다. 우선 1.5mL 튜브에 PBS로 2배 희석한 비드를 더한다. PBS와 비드를 혼화한 후에, 500×g에서 2분, RT(실온, 25℃)에서 원심(遠心)함으로써 상청(上淸, supernatant)을 폐기한다. 또 PBS를 더해서 세정을 반복함으로써, 전부 3회의 세정 작업을 행한다. 세정 후에, 원래의 2배 희석시의 체적까지 PBS로 매스업한다. 이 PBS와 비드의 혼합물을 비드액으로서 혈액에 첨가한다.
도 8의 스텝(S90)에서 혈액에 비드를 첨가함으로써 혈액을 전처리한다. 실시예에서 혈액에 대해 다당류의 다공성의 비드 B01, B02 및 B03을 첨가하고 각각 혼합한다. 비드의 첨가량은 희석한 혈액 1mL당 50μL이다. 혼합은 25℃에서 30분간, 회전 혼화함으로써 행한다. 30분간 경과 후에, 회전 혼화를 멈추고, 또 30분간, RT에서 방치한다. 비드의 일람은 다음과 같다.
비드 제품명 DNA 배제 한계 단백질 분획 범위
B01 Sepharose CL-6B 45 - 165bp 1*104 - 4*106Da
B02 Sephacryl-500-HR 1078bp 4*104 - 2*107Da
B03 Sephadex G-75 20-25 bp 추정 3*103 - 8*104Da
비드는 모두 Merck(Sigma-Aldrich)에서 입수했다. 제품명(Product name)의 란에 기재된 Sepharose, Sephacryl 및 Sephadex는 모두 상표이다.
DNA 배제 한계(DNA Exclusion Limit, Fractionation Range [Mr] DNA Exclusion Limit)는 이하와 같이 설명된다. 즉 비드의 미세구멍의 지름의 최대치보다 큰 용질 입자는 미세구멍으로부터 배제된다. 용질 입자로서 DNA가 선택된 경우에는 그의 염기수를 기준으로 한 배제의 한계가 있다. Mr은 상대 분자 질량(relative molecular mass).
단백질 분획 범위(Protein fractionation range)는 구상 단백질의 분자 사이즈(Da)에 관한 분획 범위(Fractionation range [Mr], Globular proteins)이다.
비드 B01, Sepharose CL-6B의 겔 매트릭스는 6% 가교 아가로오스로 이루어지는 구상체이다. 입자 지름은 45 내지 165㎛.
비드 B02, Sephacryl 500-HR(Sigma-Aldrich, 제품 번호 S500HR)의 겔 매트릭스는 알릴덱스트란과 N, N´－메틸렌비스아크릴아마이드와의 가교성 공중합체로 이루어진다. 체적 기준의 적산 분포에서의 중앙 입자 지름(Median particle size of the cumulative volume distribution, Particle size, d50V)은 50㎛ 이하. 입자 지름은 25 내지 75㎛. 덱스트란을 기준으로 한 분획 범위(Fractionation [Mp] Dextrans)는 4×104 내지 2×107. Mp는 피크 톱 분자량(Peak molecular weight). 덱스트란에 대한 배제 한계는 100×106.
비드 B03, Sephadex G-75의 겔 매트릭스는 가교 덱스트란으로 이루어진다. 웨트 상태의 입자 지름은 90 내지 280㎛. 드라이 상태의 입자 지름은 40 내지 120㎛. 덱스트란을 기준으로 한 분획 범위(Fractionation [Mp] Dextrans)는 1×103 내지 5×104. 덱스트란에 대한 배제 한계는 7×104보다도 크다. Sephadex G-50의 DNA 배제 한계는 20bp이다. 또 Sephadex G-100의 DNA 배제 한계는 25bp이다. Sephadex G-75는 이들의 중간의 DNA 배제 한계를 가진다고 생각된다. 따라서 Sephadex G-75의 DNA 배제 한계는 20 이상, 25 이하의 범위에 있다고 추정된다.
다음에 도 8에 도시하는 스텝(S91에서 혈액을 PBS로 희석한다. 희석 배율은 2 내지 3배이다.
다음에 도 8에 도시하는 스텝(S92에서 혈구분리 칩(미세유로)에 혈액을 흘린다. 또한 비드를 혈액중에서 없애는 처리는 일체 하지 않았다.
다음에 도 8에 도시하는 스텝(S93에서 칩을 관찰한다. 관찰은 스텝(S92에서 혈액을 흘리기 시작하고 나서 30 내지 90분 후에 행한다. 관찰은 혈액을 혈구분리 칩에 흘리면서 행한다.
도 7로 되돌아간다. 관찰은 구획(12)에 대해 행한다. USB 카메라(호잔 주식회사) 아래에 칩을 배치한다. 칩을 평면에서 보면서 관찰한다. 칩을 HOZAN USB cam software로 촬영해서 도 7의 상단에 도시하는 화상 데이터를 얻는다. 화상 데이터는 ImageJ 소프트웨어로 읽어들이고, 같은 소프트웨어 상에서 해석한다.
도 7에서 화상 데이터중으로부터 구획(12)에 상당하는 에리어(15)를 잘라낸다. 에리어(15)중의 총픽셀 수를 구획(12)의 총면적으로서 취급한다. 에리어(15)중의 데브리부(16)를 육안검사에 의해 유동부(17)와 구별한다. 데브리부(16)는 필러 밀집대(11)를 기점으로 축적한 데브리에 의해 차지되어 있다. 이 데브리가 필러 밀집대(11) 속으로까지 들어가면 필러 밀집대(11)의 막힘의 원인으로 된다. 데브리부(16)에 의해 혈구의 흐름이 떠밀린다. 이에 반해 유동부(17)에서는 혈구가 원활하게 흐르고 있다.
도 7에서 육안검사에 의해 데브리부(16)와 유동부(17) 사이에 선을 긋는다. 선으로 구획된 데브리부(16) 내의 픽셀 수를 구한다. 구획(12) 내의 모든 데브리부(16)의 픽셀수의 총합을 데브리 면적으로 한다. 구획(12)의 총면적에서 차지하는 데브리 면적을 백분율로 구한다. 이러한 값을 막힘률(clogging rate)로 한다.
도 9에는 비교예 C01에서의 유로 파트(25a)의 관찰 이미지 및 그 스케치가 도시되어 있다. 비교예 C01에서는 비드를 첨가하지 않는 것 이외는 상기 실시예와 마찬가지로 혈액을 조제한다(No beads). 이러한 혈액을 상기와 같이 혈구분리 칩에 흘린다. 관찰도 상기와 마찬가지로 행했더니, 에리어(15) 중에 데브리부(16)가 대부분(70% 이상)을 차지하고 있었다. 또 데브리가 세분화되어 있었다.
도 9에 도시하는 비교예 C01에서는 막힘률의 산출 방법을 변경한다. 에리어(15)로부터 데브리부(16)를 제외한 부분, 즉 유동부(17)의 픽셀수의 총합을 얻는다. 이것을 유동부(17)의 면적으로서 특정한다. 에리어(15)의 총면적으로부터 유동부(17)의 면적을 감산해서, 데브리부(16)의 추정 면적(estimated area)을 얻는다. 이 추정 면적을 데브리 면적으로 한다.
도 9에 도시하는 에리어(15)는 구획(12)의 전범위에 일치한다. 에리어(15)는 구획(12)의 일부 범위라도 좋다.
도 9에서 구획(12)과 필러 밀집대(11)와의 경계로부터, 필러 밀집대(11)의 내부로 향해 데브리가 침입하고 있다. 혹은 필러 밀집대(11)의 내부에 발생한 데브리가 구획(12)으로까지 이어져 있다고도 추측된다.
도 10은 막힘률을 도시하는 그래프 1이다. 비드 B01 및 비드 B03으로 전처리한 혈액은 비교예 C01의 혈액에 비해 막힘률이 낮다. 따라서, 다공질성의 표면을 가지는 다당류 비드는 막힘 방지 효과를 가져온다는 것을 알 수 있었다.
도 11은 막힘률을 도시하는 그래프 2이다. 비드 B02 및 비드 B03으로 전처리한 혈액은 비교예 C02(Control)의 혈액에 비해 막힘률이 낮다. 도 11의 결과로부터도 다공질성의 표면을 가지는 다당류 비드는 막힘 방지 효과를 가져온다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 비교예 C02의 Control에서는 혈액에 대해 비드 및 PBS의 혼합물을 더하는 일 없이, 혈액에 대해 회전 혼화 조작만 행한다.
도 10 및 도 11에 도시하는 바와 같이 비드 B01 및 비드 B02는 비드 B03보다도 강한 막힘 방지 효과를 가지고 있다. 표 1에 나타내는 바와 같이 비드 B01 및 비드 B02는 비드 B03보다도 DNA의 배제 한계가 높다. 또 비드 B01 및 비드 B02는 비드 B03과 비교해서, 단백질의 분획 범위가 보다 큰 단백질 측으로 치우쳐 있다.
비교예 C03으로서 다공성이 없는 아가로오스 분말을 상기와 같이 혈액에 혼합해서 전처리를 행했다. 비교예 C04로서 아가로오스 분말을 용해해서 형성한 아가로오스 겔의 슬랜트형(slant-type) 젤리의 표면에 혈액을 접촉시킴으로써 전처리를 행했다. 어느 비교예에서도 전처리를 행하지 않은 경우와 비교해서 현저한 막힘 방지 효과는 보이지 않았다. 다당류의 화학적 성질보다도, 전처리에 이용하는 재료에 다공성이 있는 것이 막힘 방지 효과를 얻는데 중요하다는 것을 알 수 있었다.
다른 일예로서 도 8에서 스텝(S90)에서 전처리하기 전에, 스텝(S91)의 희석을 먼저 행한다. 즉 스텝(S90)과 스텝(S91)의 순서를 바꾼다. 비드는 B01(Sepharose CL-6B)을 이용한다. 이 경우에도 막힘 방지 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
＜8. 전처리와 분급 조합의 실시예＞
(1) 컷오프와 전처리
본 실시예에서는 전처리용의 다공질 입자에 대해 작은 입자의 컷오프를 행한다. 본 실시예에서는 비드 B01의 Sepharose CL-6B를 이용한다. 1mL의 비드를 나일론제의 셀 스트레이너(FALCON, 상표)에 넣는다. 교반기(stirrer)로 교반하면서 하룻밤 동안 비드에 대한 여별(濾別, filtering)을 행한다. 여별에 걸리는 시간은 수시간 내지 24시간이라도 좋다. 여별은 증류수 중에서 행한다. 셀 스트레이너의 메시 사이즈는 40㎛, 70㎛ 및 100㎛이다. 여별은 각 메시 사이즈의 셀 스트레이너마다 행한다. 여기에서는 70㎛ 메시의 셀 스트레이너의 사용예에 대해 상세하게 기술한다. 메시 사이즈가 컷오프 지름에 대응한다. 컷오프에 의해 여별된 큰 입자를 전처리에 이용한다. 또한 메시 사이즈가 작을 수록, 큰 입자의 수량(收量, yield)이 많다. 비드의 세정을 PBS로 2회 행한다.
각 비드를, 비드와 같은 체적의 청징액으로 현탁한다. 2mL의 청징액에 대해 비드의 현탁액 20μL를 첨가해서, 이들을 잘 혼합한다. 청징액은 미리 1%의 FBS를 첨가한 PBS이다. 비드와 청징액의 혼합액을, 또 청징액에 첨가한다. 청징액의 일부를 미리 혈구분리 칩에 흘림으로써 사전에 혈구분리 칩의 내부를 완충액에 담근다. 혈구분리 칩을 담그는 처리는 40분 행한다.
(2) 컷오프 지름의 평가
분급을 끝낸 혈구분리 칩을 현미경으로 관찰한다. 컷오프 지름 70㎛ 및 100㎛의 비드로 전처리한 경우, 각각 도 6에 도시하는 바와 같은 엔트리 유로(유로 파트(25a))의 내부나 입구(21a) 근방에서 데브리가 관찰되었다. 유로는 데브리에 의해 약간 폐색(閉塞)되어 있었다. 이에 반해, 컷오프 지름 40㎛의 비드로 전처리한 경우 데브리는 보이지 않았다. 또 2시간 40분에 걸쳐서 시료혈의 분급을 계속했지만 유로의 폐색이 보이지 않았다. 데브리에 의한 유로 폐색에 대한 억제 효과를 얻으려면 컷오프 지름을 70㎛ 이하로 하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다. 컷오프 지름은 60㎛라도 좋고, 50㎛라도 좋다.
또한 컷오프 지름 40㎛, 70㎛ 및 100㎛의 어느 경우에 있어서도, 시료혈은 전량을 혈구분리 칩으로 처리할 수 있었다. 데브리에 의해 혈구분리 칩이 폐색되어 분획할 수 없는 시료혈이 남아도는 일은 없었다. 이하의 시험에서는 컷오프 지름 70㎛를 채용한다.
(3) 세포 스파이크
본 실시예에서는 K562 세포를 전혈에 스파이크함으로써 CTC의 모델로 한다. 건강한 사람으로부터 전혈을 채취함과 동시에 4℃에서 보관한다. 채혈 후 1일째의 전혈에 대해 K562 세포의 현탁액을 첨가함으로써 시료혈을 얻는다. 첨가량은 혈액 2mL에 대해 865.4개로 한다. K562 세포는 만성 골수성 백혈병의 환자에서 유래하는 림프구모양(lymphoid)의 부유성 배양 세포이다.
첨가하는 K562 세포의 수는 다음과 같이 해서 미리 추정해 둔다. 우선 K562 세포를 훽스트 염색(Hoechst-stain)한다. 염색 후에, 현미경으로 세포를 관찰함으로써 세포수를 카운트한다. 이상에 의해 K562 세포의 현탁액의 체적당의 K562 세포의 수를 확인할 수 있다.
시료혈을 상술한 비드를 혼합한 청징액(1% FBS-PBS)으로 5배로 희석한다. 비드와 시료혈이 접촉함으로써 전처리가 행해진다. 희석한 시료혈을 신속하게 혈구분리 칩에 흘림으로써 혈구를 분급한다. 분급의 결과를 도 3 및 도 4에 따라 설명하면 프랙션 F2에는 림프구를 포함하는 백혈구가 많이 얻어진다. 프랙션 F1에 무핵의 성숙 적혈구가 많이 얻어진다. 또한 혈구분리 칩에 유입한 세포는 대부분(＞99. 9%)이 프랙션 F1로 유출한다. F3에는 많은 혈구는 얻어지지 않는다. K562 세포는 림프구모양이기 때문에 프랙션 F2에 포함되는 것이 기대된다.
(4) 분급의 정량 평가
분급의 정량 결과를 표 2에 나타낸다. 상단은 비드를 시료혈에 접촉시키지 않은 경우(Beads less)를 나타낸다. 하단은 70㎛로 컷오프한 비드를 시료혈에 접촉시킨 경우(Cut off)를 나타낸다. 분급을 개시 후의 경과 시간(Time course, 분(min))은 0 내지 15분, 15 내지 45분, 45 내지 75분의 3개의 시간 구간으로 구획지어져 있다.
전혈 K562 세포
시간
구간		 유입 시료혈 세포수(*109) 유입 시료혈
체적(mL)		 유출 시료혈 체적(F1, F2,F3)
(mL)		 유출 시료혈 세포수(F1,F2,F3)
(*109)		 회수율 유입 세포의
농도
(Cells/mL)		 유입 시료혈 세포수 유출 시료혈 세포수(F2,F3) 회수율
비드
없음		 0 - 15 3.18 0.075 0.065 3.56 111.9% 443.0 33.23 34 102.3%
15 - 45 6.36 0.150 0.146 8.67 136.3% 443.0 66.45 91 136.9%
45 - 75 - - - - - - - - -
컷
오프		 0 - 15 3.18 0.075 0.065 3.39 106.6% 432.7 32.45 26 80.1%
15 - 45 6.36 0.150 0.153 7.92 124.5% 432.7 64.91 57 87.8%
45- 75 6.36 0.150 0.155 8.66 136.2% 432.7 64.91 54 83.2%
표 2의 좌측에는 전혈(Whole blood)에 관련하여, 혈구를 포함하는 시료혈중의 세포 수의 집계가 나타내어져 있다. 혈구분리 칩에 유입하는 세포수(Input cell number)는 희석혈의 단위체적(mL)당의 혈구수를 측정함으로써 얻는다. 측정은 PBS로 소정의 희석률로 희석한 전혈 10μL를, TC20 Automated Cell Counter (BIO RAD)로 처리함으로써 행한다. 또 얻어진 측정치에 희석률과 전혈의 체적을 곱해서(승산해서) 산출한다.
표 2의 좌측에는 혈구분리 칩에 유입하는 시료혈중의 세포수(Input cell number)가 나타내어져 있다. 또 혈구분리 칩에 유입하는 시료혈의 체적(Input volume)이 전혈로 환산된 상태로 나타내어져 있다.
또 표 2에는 프랙션 F1, F2 및 프랙션 F3에 유출하는 세포의 합계수(Output cell number)(×109)가 나타내어져 있다. 유입하는 세포수(Input cell number)에 대한, 유출하는 세포의 합계수(Output cell number)의 비가 회수율(Rate of Collection, %)로서 나타내어져 있다. 표 2중에는 회수율(Rate of Collection, %)이 100%를 넘고 있는 샘플이 몇개 있다. 이것은 분획을 행한 전혈의 체적이 작은 것으로 인해, 세포수 측정시의 희석이나 세포수의 측정에서 오차가 발생하는 것에 기인한다고 추측된다.
전혈중의 세포를 비드와의 접촉 없음으로 분급한다. 이 경우는 혈구분리 칩 내에 막힘이 발생해 버린다. 따라서 45분을 넘어 세포의 분급을 계속하는 것은 곤란하다. 반면에 컷오프한 비드에 접촉시킨 전혈중의 세포는 그의 거의 모두가 회수된다.
(5) 유핵 세포의 회수율의 평가
표 2의 우측에는 스파이크한 K562 세포에 관련하여, 혈구를 포함하는 시료혈중의 세포 수의 집계가 나타내어져 있다. 프랙션 F2 및 프랙션 F3에 유출하는 K562 세포의 수를 실측한다. 또한 세포수의 실측에 있어서 K562 세포와, 전혈에서 유래하는 다른 유핵 세포를 분간할 필요가 있다. 이것은 스파이크하기 전에 미리 K562 세포를 Hoechst33342(Sigma-Aldrich제)로 염색해 두고, 분획 후에 회수된 프랙션의 세포를 키엔스사(KEYENCE CORPORATION)의 올인원 형광 현미경 BZ-X710으로 관찰하고, 핵이 형광 표식되어 있는 세포를 K562 세포, 없는 것을 전혈에서 유래하는 다른 유핵 세포와 구별하는 것에 의해 행한다.
얻어진 수치(Output cell number)는 회수율(Rate of Collection)의 산출에 이용한다. 여기서 회수율이란, 실제로 프랙션 F2 및 프랙션 F3중에 회수된 K562 세포의 수를 혈구분리 칩에 유입하는 K562 세포의 수(Input cell number)에 대한 백분율로 나타낸 것이다.
혈구분리 칩에 유입하는 K562 세포의 수(Input cell number)는 다음과 같이 설명된다. 비드 없음(Beads less)의 시험에서는 시료혈을 준비하기 위해 이용한 전혈 1mL당 443개로 되도록 K562 세포를 시료혈에 혼화한다. 이 값은 유입하는 세포의 농도(Input cell conc.)로서 표 2에 나타내어져 있다. 분급 개시 후 0 내지 15분에서, 분획된 시료혈의 체적(Input cell volume)은 0.075mL이다. 다만 이 값은 희석을 고려하여, 전혈의 체적으로 환산되어 있다. 이 시간 구간에서 유입하는 세포의 수(Input cell number)는 443×0.075=33.23개이다. 이 시간 구간에 있어서 모든 K562 세포가 프랙션 F2 및 프랙션 F3 중의 어느 하나에 회수된다고 가정하면, 33.23개의 K562 세포가 회수된다. 비드 없음(Beads less)의 이 시간 구간(Time course, 0 내지 15분)에서는 프랙션 F2 및 프랙션 F3에 유출하는 K562 세포의 수(Output cell number)가 34개이다. 이 값은 회수된 K562 세포의 수의 실측치이다. K562 세포의 회수율(Rate of Collection)은 34/33.23×100=102.3%로 된다.
표 2에서 분급 개시 후 15 내지 45분에서 분획된 시료혈의 체적(Input cell volume)은 0.150mL이다. 다만 이 값은 희석을 고려하여, 전혈의 체적으로 환산되어 있다. 이 시간 구간에서 유입하는 세포의 수(Input cell number)는 443×0.150=66.45개이다. 프랙션 F2 및 프랙션 F3에 유출하는 K562 세포의 수(Output cell number, 실측치)는 91개이다. K562 세포의 회수율(Rate of Collection)은 91/66.45×100=136.9%로 된다.
표 2의 하단에는 컷오프 지름 70㎛인 경우의 K562 세포의 회수율(Rate of Collection)이 또 나타내어져 있다. 프랙션 F2 및 프랙션 F3으로 이루어지는 프랙션중에 발견된 K562 세포의 측정수(Output cell number)는 각 시간 구간에어서 26, 57 및 54 개였다. 컷오프 지름 70㎛의 비드에 의한 전처리에 있어서 K562 세포의 회수율(Rate of Collection)은 어느 시간 구간에서도 80% 이상인 것으로 인해, 회수율(Rate of Collection)은 충분히 높은 것이라고 판단된다.
본 실시예는 CTC의 농축의 모델 실험으로서 행해진다. 상기의 결과로부터 전처리는 CTC의 농축에 있어서 유용하다는 것이 나타내어진다. 구체적으로는 칩의 막힘을 방지함으로써 장시간의 분급을 행할 수 있다는 것이 나타내어진다. 본 실시예의 방법에 의해 장시간의 분급을 행함으로써 대량의 시료혈을 처리할 수 있다. 이것은 1회의 처리당의 CTC의 취득량이 크다는 것을 나타낸다. 또 CTC와 마찬가지로 혈액중에 미량밖에 포함되지 않는 세포, 예를 들면 임산부혈중의 태아적아구(胎兒赤芽球)의 농축에도 이들이 유효하다고 생각된다.
＜9. 전처리의 평가 방법＞
본 발명의 다른 1양태는 혈액의 전처리에 대한 평가 방법이다. 도 8로 되돌아가서, 이것을 참조하면서 설명한다. 스텝(S89)에서 세포를 포함하는 혈액을 채취한다. 스텝(S90에서 세포를 포함하는 혈액에 대해 전처리를 실시한다.
스텝(S90의 전처리에서는 세포를 포함하는 혈액을 피험재료의 표면에 접촉시킨다. 피험재료는 분말상(粉末狀)이라도 좋다. 피험재료는 용기의 표면에 형성된 구조체라도 좋다. 혹은 세포를 포함하는 혈액중에 피험재료를 첨가함과 동시에 이것과 혼합한다. 피험재료는 혈액에 용해하는 것이라도 좋다.
도 8에 도시하는 바와 같이 스텝(S91)에서 혈액을 희석한다. 희석 배율은 적어도 2배인 것이 바람직하다. 희석 배율은 예를 들면 2 내지 3배이다. 희석은 예를 들면 PBS로 행한다. 희석은 스텝(S90) 전에 행해도 좋다. 즉 스텝(S90)과 스텝(S91)의 순서를 바꿔도 좋다. 스텝(S90) 전에 희석하고 나서 스텝(S91)에서 또 희석해도 좋다.
스텝(S92)에서 혈액을 미세유로중에 흘린다. 도 7에 도시하는 바와 같이 미세 유로의 도중에는 혈액의 흐름을 가로지르도록 필러 밀집대(11)가 마련되어 있다. 필러 밀집대(11) 및 그의 하류측에서 이것과 인접하는 구획(12)중에 생기는 데브리부(16)를 관찰한다. 구획(12)에서는 필러가 없거나, 필러가 희박하게 되어 있다.
혈액을 흘리기 시작하고 나서 일정 시간 경과 후에, 도 7에 도시하는 구획(12)중에 생기는 데브리부(16)를 관측한다. 시간의 길이는 예를 들면 30 내지 90분이다. 에리어(15)에 대해 데브리부(16)가 차지하는 비율을 면적비로 구한다. 구하는 방법은 상술한 실시예를 따라해도 좋다.
또한, 본 발명은 상기 실시 형태에 제한된 것은 아니고, 취지를 일탈하지 않는 범위에서 적당히 변경하는 것이 가능하다.
이 출원은 2018년 10월 25일에 출원된 일본출원 특원(特願) 2018－200712를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시내용의 모두를 여기에 포함시킨다.
11: 필러 밀집대, 12: 구획, 13: 필러 밀집대, 14: 구획, 15: 에리어, 16: 데브리부, 17: 유동부, 20: 미세유로, 21a 내지 21b: 입구, 22a 내지 22c: 출구, 23: 주유로, 24: 부유로, 25a 내지 25d: 유로 파트, 26a 내지 26b: 가지 유로, 27: 무핵적혈구, 28: 합류부, 29a 내지 29c: 유핵 세포, 30: 시린지, 35: 시린지, B01 내지 B03: 비드, BL: 혈액, C01 내지 C04: 비교예, CF: 컷오프 지름, CL: 청징액, d50V: 중앙 입자 지름, LE: 액류, LF: 액류, LG: 액류, PP: 입자, S79) 내지 S82): 스텝, S89 내지 S93: 스텝, SD: 치수.

Claims (16)

  1. 혈액을 미세유로중에 흘림으로써 혈액중의 세포를 분급하기 전에,
    상기 세포를 포함하는 혈액을 다공질재가 가지는 다공질성의 표면에 접촉시키는,
    혈액의 전처리 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다공질재를, 상기 세포를 포함하는 혈액중에 첨가함과 동시에 혼합함으로써, 상기 세포를 포함하는 혈액을 상기 다공질성의 표면에 접촉시키는,
    혈액의 전처리 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 다공질재는 상기 다공질성의 표면이 다당류로 이루어지는 입자임과 동시에, 액체중에 현탁된 상태에서 상기 세포를 포함하는 혈액중에 첨가되는,
    혈액의 전처리 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 입자는 입자 지름 분포를 가짐과 동시에, 그의 체적 기준의 적산 분포에 있어서의 중앙 입자 지름 d50V가 25 내지 280㎛인,
    혈액의 전처리 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 다공질재는 상기 다공질재를 겔 여과 크로마토그래피에 이용한 경우에 DNA를 분획(分畵)할 수 있는 것이고, 여기서, 상기 다공질재의 상기 DNA에 대한 배제 한계는 45염기쌍 이상인,
    혈액의 전처리 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 다공질재는 상기 다공질재를 겔 여과 크로마토그래피에 이용한 경우에 단백질을 분획할 수 있는 것이고, 상기 다공질재의 상기 단백질에 대한 분획 범위의 하한이 1×104 Da 이상이거나, 상기 다공질재의 상기 단백질에 대한 분획 범위의 상한이 4×106 Da 이상인 것 중의 적어도 어느 하나를 만족시키는,
    혈액의 전처리 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 입자로부터는 컷오프 지름 이하의 입자 지름을 가지는 작은 입자가 미리 제거되어 있고,
    상기 컷오프 지름은 25 내지 100㎛의 범위에 있는,
    혈액의 전처리 방법.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 다공질재의 표면에 접촉시키는 혈액은 다른 액체에 의해 희석되어 있지 않은 전혈(全血)임과 동시에 상기 다공질재의 표면에 접촉시킨 후에 전혈을 다른 액체로 희석하거나, 상기 다공질재의 표면에 접촉시키는 혈액은 다른 액체에 의해 미리 희석된 전혈인,
    혈액의 전처리 방법.
  9. 제3항에 기재된 전처리 방법에 기초하여, 상기 세포를 포함하는 혈액을 전처리한 후에,
    상기 전처리한 혈액을 상기 미세유로중에 흘림으로써 상기 혈액중의 세포를 수력학적으로 분급하는,
    혈액중 세포의 분급 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 전처리에 있어서,
    상기 입자는 입자 지름 분포를 가지고 있음과 동시에, 그의 체적 기준의 적산 분포에 있어서의 중앙 입자 지름 d50V가 25 내지 280㎛이고, 상기 입자로부터는 체가름(sieving)에 의해 컷오프 지름 이하의 작은 입자가 미리 제거되어 있고,
    상기 분급에 있어서,
    상기 미세유로중의 상기 수력학적인 분급을 행하는 개소의 상류에는 혈액의 흐름을 평면적인 것으로 하는 편평한 엔트리 유로가 마련되어 있고,
    상기 컷오프 지름은 상기 엔트리 유로의 단면에 있어서의 짧은쪽 방향의 길이보다도 큰,
    혈액중 세포의 분급 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 엔트리 유로에는 상기 혈액의 흐름을 가로지르도록 필러(pillar) 밀집대가 마련되어 있고,
    상기 필러 밀집대중의 각 필러는 상기 짧은쪽 방향을 따라 세워져 있는,
    혈액중 세포의 분급 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 분급은 태아유래 유핵적혈구, 순환 종양세포(CTC) 및 골수종 세포 중의 어느 하나를 농축하는 것인,
    혈액중 세포의 분급 방법.
  13. 혈액의 전처리에 대한 평가 방법으로서,
    세포를 포함하는 혈액에 대해 전처리를 실시한 후에, 상기 혈액을 미세유로중에 흘리는데, 상기 미세유로의 도중에는 상기 혈액의 흐름을 가로지르도록 필러 밀집대가 마련되어 있고,
    상기 필러 밀집대 및 그의 하류측에서 인접하는 필러가 드문드문하게 되어 있는 구획중에 생기는 데브리(debris)를, 혈액을 흘리기 시작하고 나서 일정 시간 경과 후에 관측하는,
    혈액의 전처리에 대한 평가 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 구획은 가장 상류의 필러 밀집대 및 그 다음에 위치하는 필러 밀집대와 상기 미세유로의 측벽에 의해 둘러싸여 있고,
    상기 구획을 평면에서 보았을 때, 상기 구획에 대해 상기 데브리가 차지하는 비율을 면적비로 구하는,
    혈액의 전처리에 대한 평가 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포를 포함하는 혈액을 피험 재료의 표면에 접촉시킴으로써 상기 전처리를 행하는,
    혈액의 전처리에 대한 평가 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 세포를 포함하는 혈액중에 피험재료를 첨가함과 동시에 혼합함으로써 상기 전처리를 행하는,
    혈액의 전처리에 대한 평가 방법.
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