TW202021597A - 具有hpv e6 專一性及pd-1阻斷雙功能之經改造t細胞 - Google Patents

具有hpv e6 專一性及pd-1阻斷雙功能之經改造t細胞 Download PDF

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Abstract

本發明係關於經遺傳改造之T細胞，以識別腫瘤抗原HPV E6且同時分泌阻斷程式化細胞死亡蛋白1 (PD-1)之單鏈抗體。該等經改造之T細胞展現較強之抗腫瘤反應及降低之T細胞耗竭。本發明提供用於HPV E6表現相關癌症之免疫療法。

Description

具有HPV　E6　專一性及PD-1阻斷雙功能之經改造T細胞
本發明概言之係關於經改造之細胞及其組合物，具體而言係關於包含經遺傳改造之T細胞受體(TCR)及檢查點抑制劑(CPI)之T細胞。本文亦揭示使用該等組合物治療癌症之方法。
本文中之所有出版物均係以引用的方式併入，其併入程度如同每一個別出版物或專利申請案明確且個別地指示為以引用的方式併入一般。以下闡述包括可用於理解本發明之資訊。不承認本文所提供之任何資訊係先前技術或與本文所主張之發明相關，或所明確或含蓄引用之任一出版物係先前技術。
諸如子宮頸癌等一些癌症類型之主要原因係人類乳頭瘤病毒(HPV)感染。儘管在諸如化學療法等治療中已獲得進步，但許多癌症(包括HPV相關之癌症)之預後可能較差。因此，業內對於針對癌症、具體而言HPV相關之癌症之其他治療存在未滿足之需求。
HPV16係HPV之亞型，其最常與惡性病相關。不受特定理論或機制束縛，據信HPV16至少部分地經由致癌蛋白E6之作用引起癌症，該致癌蛋白E6使細胞週期控制失調。HPV16 E6在癌細胞中組成型地表現，且在正常未受感染之人類組織中不表現。HPV16E6在多種人類癌症中表現，包括(但不限於)子宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、肛門直腸癌、陰道癌、陰門癌及陰莖癌。
T細胞受體可對任一HPV16 E6蛋白具有抗原專一性。過繼性細胞轉移(ACT)作為針對癌症之免疫療法模式已在治療血液惡性病及惡性黑色素瘤方面展現顯著之成功。使用表現嵌合抗原受體(CAR)之基因修飾T細胞專一性地靶向諸如CD19及GD2等腫瘤相關抗原(TAA)之ACT之尤其有效形式已在治療諸如B細胞惡性病及神經胚細胞瘤等疾病之臨床試驗中展示出令人鼓舞之結果。
不同於天然T細胞受體(TCR)，CAR係人工受體，其係由與細胞內T細胞信號傳導及共刺激結構域融合之細胞外抗原識別結構域組成。CAR可以主要組織相容性類別(MHC)獨立性方式直接且選擇性地識別細胞表面TAA。儘管CAR T細胞療法在患有血液惡性病之患者中已獲得有記錄之成功，但在實體腫瘤中僅觀察到輕微之反應。此可部分地歸因於實體腫瘤中免疫抑制微環境之建立。此環境涉及若干固有抑制性路徑之上調，其係由腫瘤內與同源配體反應之T細胞中抑制性受體(IR)之表現增加所介導。
迄今為止，已在T細胞中表徵出若干種IR，例如CTLA-4、T細胞Ig黏蛋白-3 (TIM-3)、淋巴球活化基因3 (LAG-3)及程式化死亡-1 (PD-1)。在慢性疾病及癌症中，該等分子在T細胞之持續活化後上調，且其促進T細胞功能障礙及耗竭，由此導致腫瘤逃脫免疫監督。不同於其他IR，PD-1在T細胞活化後即刻上調，其進而經由與其兩種配體PD-L1或PD-L2相互作用而抑制T細胞效應功能。PD-L1在T細胞、B細胞、巨噬細胞及樹突細胞(DC)上組成型地表現。其亦顯示在眾多種實體腫瘤中大量表現。相比之下，在正常組織中PD-L1之表現係檢測不到的。由於其在免疫抑制中之關鍵作用，PD-1一直係近期研究之關注點，旨在中和其對T細胞之負面效應且增強抗腫瘤反應。臨床研究已證明，在結腸癌、腎癌及肺癌以及黑色素瘤中，PD-1阻斷顯著地增強腫瘤消退。
本發明提供經改造之T細胞，其包含編碼以下各項之核酸：(a) 專一性地結合至來自HPV之抗原的經遺傳改造之抗原受體；及(b) 降低腫瘤上抑制性受體(IR)之功能或能夠降低腫瘤上抑制性受體(IR)之表現之抑制性蛋白質，例如腫瘤浸潤性淋巴球。該等經改造之T細胞展現更強之抗腫瘤反應及降低之T細胞耗竭。
在本發明之一態樣中，經遺傳改造之抗原受體係T細胞受體且抑制性蛋白質阻斷程式化細胞死亡蛋白1 (PD-1)，其中該蛋白質係單鏈抗體(scFv)。
本發明之抗PD-1 scFv抗體包含以下基序序列：包含具有SEQ ID NO:1中所示序列之胺基酸之重鏈CDR1；包含具有SEQ ID NO:2中所示序列之胺基酸之重鏈CDR2；包含具有SEQ ID NO:3中所示序列之胺基酸之重鏈CDR3；包含具有SEQ ID NO:4中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR1；包含具有SEQ ID NO:5中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR2；及包含具有SEQ ID NO:6中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR3。
在本發明之一態樣中，抑制性核酸分子包含與PD1編碼核酸互補之序列。
在本發明之一態樣中，抑制性核酸分子包含與PD1編碼核酸互補之反義寡核苷酸。
在本發明之一態樣中，抑制性蛋白質或抗PD-1 scFv組成型地表現。
在本發明之一態樣中，抗原係HPV E6或E7。
本發明進一步提供核酸，其包含(a) 編碼專一性地結合至來自HPV之抗原的經遺傳改造之抗原受體之核酸；及(b) 降低或能夠降低腫瘤靶標之表現之抑制性核酸分子。在一態樣中，抗原係HPV E6或E7
在本發明之一態樣中，抑制性蛋白質阻斷程式化細胞死亡蛋白1 (PD-1)，其中該蛋白質係單鏈抗體(scFv)。
抗PD-1 scFv抗體包含以下基序序列：包含具有SEQ ID NO:1中所示序列之胺基酸之重鏈CDR1；包含具有SEQ ID NO:2中所示序列之胺基酸之重鏈CDR2；包含具有SEQ ID NO:3中所示序列之胺基酸之重鏈CDR3；包含具有SEQ ID NO:4中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR1；包含具有SEQ ID NO:5中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR2；及包含具有SEQ ID NO:6中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR3。
本發明進一步提供包含上文所提及核酸之載體，該核酸包含(a) 編碼專一性地結合至來自HPV之抗原的經遺傳改造之抗原受體之核酸；及(b) 編碼降低腫瘤中抑制性受體之表現之蛋白質之核酸分子，其中該載體較佳係反轉錄病毒載體。腫瘤進一步包含淋巴球或腫瘤浸潤淋巴球。腫瘤浸潤淋巴球包含抑制性受體。
在本發明之一態樣中，提供產生經遺傳改造之T細胞之方法，其中該方法包含將載體引入至包含T細胞之細胞群體中，該載體包含a) 編碼專一性地結合至第一抗原之經遺傳改造抗原受體之核酸，(b) 編碼在一或多種條件下培育時能夠導致該群體中T細胞中之PD-1或PD-L1之表現的降低及/或抑制PD-1或PD-L1之上調的抑制性蛋白質之核酸分子。在一些實施例中，第一經改造之抗原受體專一性地靶向至HPV之E6受體。
在本發明之一態樣中，提供包含上文所提及之經改造T細胞及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。此外，提供治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之醫藥組合物，其中該癌症係子宮頸癌或頭頸癌。
結合意欲為例示性及說明性而不限制範圍之系統、組合物及方法來闡述及說明以下實施例及其態樣。
定義
本文所使用，術語「包含(comprising或comprises)」係關於可用於實施例之組合物、方法及其各別組分使用，但對於納入未指定要素(不管是否有用)係開放的。熟習此項技術者將理解，一般而言，本文所使用之術語通常意欲作為「開放」術語(例如術語「包括(including)」應解釋為「包括(但不限於)」，術語「具有」應解釋為「具有至少」，術語「包括(includes)」應解釋為「包括(但不限於)」等)。
除非另外陳述，否則在闡述本申請案之特定實施例之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)所使用之術語「一(a及an)」及「該」以及類似引用可解釋為涵蓋單數及複數二者。本文列舉之數值範圍僅意欲作為個別提及屬此範圍內之每一單獨值之速記方法。除非本文另有指示，否則每一個別值均如同其在本文中個別引用一般併入本說明書中。除非本文另有指示或上下文另外明顯矛盾，否則本文所闡述之所有方法均可以任何適宜順序實施。本文關於某些實施例所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「例如」)僅意欲更佳地闡釋本申請案且不對以其他方式主張之本申請案之範圍加以限制。縮寫「例如(e.g.)」係衍生自拉丁文例如(exempli gratia)，且在本文中用以指示非限制性實例。因此，縮寫「例如(e.g.)」與術語「例如(for example)」同義。本說明書中之語言均不應解釋為指示任何未主張之要素對本申請案之實踐係必不可少的。
如本文所使用，術語「約」係指可量測之值，例如量、持續時間及諸如此類，且涵蓋自指定值±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或±0.1%之變化。
如本文所使用，術語「抗體」係指完整免疫球蛋白或係指具有Fc (可結晶片段)區或Fc區之FcRn結合片段之單株或多株抗原結合片段，其在本文中稱為「Fc片段」或「Fc結構域」。抗原結合片段可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學裂解完整抗體來產生。抗原結合片段尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb及互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、單結構域抗體、嵌合抗體、雙價抗體及含有免疫球蛋白之至少一部分之多肽，該免疫球蛋白之至少一部分足以賦予與該多肽之專一性抗原結合。Fc結構域包括兩條重鏈的多個部分，此促成兩類或三類抗體。Fc結構域可藉由重組DNA技術或藉由酶促(例如木瓜酶裂解)或經由化學裂解完整抗體來產生。
如本文所使用，術語「抗體片段」係指僅包含完整抗體之一部分之蛋白質片段，其通常包括完整抗體之抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。本發明定義所涵蓋之抗體片段之實例包括：(i) Fab片段，其具有VL、CL、VH及CH1結構域；(ii) Fab'片段，其係在CH1結構域之C末端具有一或多個半胱胺酸殘基之Fab片段；(iii) Fd片段，其具有VH及CH1結構域；(iv) Fd'片段，其具有VH及CH1結構域且在CH1結構域之C末端具有一或多個半胱胺酸殘基；(v) Fv片段，其具有抗體單臂之VL及VH結構域；(vi) dAb片段(Ward等人，Nature 341, 544-546 (1989))，其係由VH結構域組成；(vii) 經分離之CDR區；(viii) F(ab')2片段，即包括兩個由在鉸鏈區之二硫橋連接之Fab'片段之二價片段；(ix) 單鏈抗體分子(例如單鏈Fv；scFv) (Bird等人，Science 242:423-426 (1988)；及Huston等人，PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988))；(x) 具有兩個抗原結合位點之「雙價抗體」，其包含連結至同一多肽鏈中之輕鏈可變結構域(VL)之重鏈可變結構域(VH) (例如，參見EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；(xi) 「線性抗體」，其包含一對串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，該等區段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)；及美國專利第5,641,870號)。
如本文所使用之「單鏈可變片段」、「單鏈抗體可變片段」或「scFv」抗體係指僅包含由連接體肽連結之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之抗體形式。scFv能夠作為單鏈多肽表現。scFv保留其所源自之完整抗體之專一性。輕鏈及重鏈可呈任何順序，例如VH-連接體-VL或VL-連接體-VH，只要scFv對靶抗原之專一性保留即可。
如本文所使用，術語「抗原」係指若由MHC分子呈遞，則能夠被抗體或T細胞受體(TCR)結合之分子。如本文所使用，術語「抗原」亦涵蓋由T細胞受體識別之T細胞表位。此識別引起T細胞之活化及後續效應機制，例如T細胞之增殖、細胞介素分泌等。抗原另外能夠由免疫系統識別及/或能夠誘導體液性免疫反應及/或細胞免疫反應，從而導致B-淋巴球及/或T-淋巴球之活化。
如本文所使用，術語「HPV抗原」係指源自人類乳頭瘤病毒(HPV)之多肽分子，較佳地其中HPV係選自HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6、HPV10、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV27、HPV28、HPV29、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV45、HPV49、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。更佳地，HPV係選自高風險HPV，例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。HPV多肽分子係選自 E6及E7。
如本文所使用，術語「外周血細胞亞型」係指通常在外周血中發現之細胞類型，包括(但不限於)嗜酸性球、嗜中性球、T細胞、單核球、K細胞、顆粒球及B細胞。
如本文所使用，術語「T細胞」包括CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。術語T細胞亦包括T輔助性1型T細胞及T輔助性2型T細胞二者。T細胞表現識別靶細胞表面上之特定抗原性部分之細胞表面受體。該細胞表面受體可係野生型或重組T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體(CAR)或能夠識別與靶細胞締合之抗原性部分之任何其他表面受體。通常，TCR具有兩條蛋白質鏈(α-鏈及β-鏈)，其與由某些細胞表面上之MHC蛋白呈遞之特定肽結合。在MHC分子在靶細胞表面上表現之情況下，TCR識別肽。TCR亦識別直接在癌細胞表面上呈遞之癌症抗原。
如本文所使用之「經遺傳修飾之細胞」、「重定向細胞」、「經改造細胞」、「經遺傳改造之細胞」或「經修飾細胞」係指表現經遺傳改造之抗原受體及檢查點抑制劑之細胞。在一些實施例中，經遺傳修飾之細胞包含編碼經遺傳改造之TCR之載體及編碼一或多種檢查點抑制劑之載體。在一些實施例中，經遺傳修飾之細胞包含編碼經遺傳改造之TCR及一或多種檢查點抑制劑之載體。在一個實施例中，經遺傳修飾之細胞係T-淋巴球細胞(T細胞)。在一個實施例中，經遺傳修飾之細胞係天然殺手(NK)細胞。
如本文所使用，術語「經遺傳改造」或「經遺傳修飾」係指對細胞之核酸序列之修飾，包括(但不限於)使編碼區或非編碼區或其一部分缺失或插入編碼區或其一部分。
如本文所使用，術語「載體」、「選殖載體」及「表現載體」係指藉由其可將多核苷酸序列(例如外源基因)引入至宿主細胞中以便轉化宿主且促進所引入序列之表現(例如轉錄及轉譯)之媒介。載體包括質體、噬菌體、病毒等。最常見之載體類型係「質體」，其係指其中可連接包含所關注基因之額外DNA區段之閉合環狀雙鏈DNA環。另一載體類型係病毒載體，其中將欲轉運之核酸構築體連接至病毒基因體中。病毒載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製或可將其自身整合至宿主細胞之基因體中且藉此連同宿主基因體一起複製。此外，某些載體能夠引導與其可操作連接之基因的表現。此等載體在本文中稱為「重組表現載體」或簡稱為「表現載體」。可注意到，本發明意欲包括提供等效功能之此等其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所使用，術語「反轉錄病毒載體」及「重組反轉錄病毒載體」係指攜帶所關注核酸分子在且某些實施例內能夠引導所關注核酸分子之表現之核酸構築體。反轉錄病毒係以RNA形成存在於其病毒莢膜中且在宿主細胞中複製時形成雙鏈DNA中間體。類似地，反轉錄病毒載體係以RNA及雙鏈DNA形式二者存在，該兩種形式均包括在術語「反轉錄病毒載體」及「重組反轉錄病毒載體」中。術語「反轉錄病毒載體」及「重組反轉錄病毒載體」亦涵蓋含有重組DNA片段之DNA形式及含有重組RNA片段之RNA形式。該等載體可包括至少一個轉錄啟動子/增強子，或控制基因表現之其他元件。此等載體亦可包括包裝信號、長末端重複序列(LTR)或其部分以及適合於所使用反轉錄病毒之正鏈及負鏈引子結合位點(若該等位點並非已經存在於反轉錄病毒載體中)。視情況，該等載體亦可包括引導多腺苷酸化之信號、可選標記物(例如胺苄青黴素(Ampicillin)抗性、新黴素(Neomycin)抗性、TK、潮黴素(hygromycin)抗性、腐草黴素(phleomycin)抗性、組胺醇抗性或DHFR)，以及一或多個限制位點及一個轉譯終止序列。舉例而言，此等載體可包括5' LTR、前導序列、tRNA結合位點、包裝信號、第二鏈DNA合成起點，及3' LTR或其一部分。
如本文所使用之「連接體」 (L)或「連接體結構域」或「連接體區」係指長約1至100個胺基酸之寡肽或多肽區，其將本發明之CAR之任一結構域/區連接在一起。連接體可由撓性殘基(如甘胺酸及絲胺酸)構成，從而使得毗鄰蛋白質結構域相對於彼此自由移動。當期望確保兩個毗鄰結構域不會在空間上彼此干擾時，可使用較長之連接體。連接體可係可裂解的或不可裂解的。可裂解連接體之實例包括2A連接體(例如T2A)、2A樣連接體或其功能等效形式及其組合。在一些實施例中，連接體包括小核糖核酸病毒2A樣連接體、豬鐵士古病毒(porcine teschovirus)(P2A)、明脈扁刺蛾β四體病毒(Thosea asigna virus)(T2A)之CHYSEL序列或其組合、變體及功能等效形式。在其他實施例中，連接體序列可包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-Pro(2B)基序，其導致2A甘胺酸與2B脯胺酸之間的裂解。其他連接體對熟習此項技術者將係顯而易見的且可與本發明之替代實施例結合使用。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其所呈之形式允許其中所含活性成分之生物活性有效，且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性之額外組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對個體無毒之成分。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所使用，「個體」係哺乳動物，例如人類或其他動物，且通常係人類。在一些實施例中，向其投與細胞、細胞群體或組合物之個體(例如患者)係哺乳動物，通常係靈長類動物，例如人類。在一些實施例中，靈長類動物係猴或猿。個體可為雄性或雌性且可為任一適宜年齡，包括嬰兒、少年、青少年、成年及老年個體。在一些實施例中，個體係非靈長類動物哺乳動物，例如齧齒類動物。
術語「對照」係指適於為測試樣品中之表現產物提供比較之任何參考標準。
如本文所使用，術語「抑制(inhibit)」係指(例如)特定作用、功能或相互作用之任何降低。舉例而言，若生物學功能(例如蛋白質之功能及/或一種蛋白質與另一種蛋白質之結合)與參考狀態(例如對照，如野生型狀態或在不存在所施加藥劑下之狀態)相比降低，則其被抑制。舉例而言，若PD-1蛋白與其配體中之一或多者(例如PD-L1及/或PD-L2)之結合及/或所產生之PD-1信號傳導及免疫效應與在PD-1蛋白不與諸如抗PD-1抗體等藥劑接觸時相比因與該藥劑接觸而降低，則該結合、信號傳導及其他免疫效應受抑制或缺乏。此抑制或缺乏可例如藉由在特定時間及/或位置施加藥劑來誘導，或可例如藉由連續投與而係組成性的。此抑制或缺乏亦可係部分或完全的(例如與參考狀態(例如如野生型狀態之對照)相比，基本上無可量測之活性)。基本上完全之抑制或缺乏稱為阻斷。
如本文所使用之「病狀」及「疾病病狀」可包括癌症、腫瘤或感染性疾病。在例示性實施例中，病狀包括但不決不限於任一形式之惡性贅瘤細胞增殖性病症或疾病。在例示性實施例中，病狀包括以下中之任一或多者：腎癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳癌、神經膠母細胞瘤、肺癌、結腸癌或膀胱癌。
「癌症」及「癌性」係指或闡述哺乳動物中特徵通常在於不受調控之細胞生長之生理學病狀。不論侵襲之組織病理類型或階段如何，術語「癌症」意欲包括所有類型之癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化細胞、組織或器官。實體腫瘤之實例包括惡性病，例如各種器官系統之肉瘤、腺癌及癌，例如影響肝、肺、乳房、淋巴、胃腸(例如，結腸)、生殖泌尿道(例如，腎、尿道上皮細胞)、前列腺及咽之彼等。腺癌包括惡性病，例如大部分結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺非小細胞癌、小腸癌及食道癌。在一個實施例中，癌症係黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。亦可使用本發明之方法及組合物來治療或預防以上所提及癌症之轉移性病灶。可治療之其他癌症之實例包括骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病)、兒童期實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括由石棉誘發之彼等)及該等癌症之組合。使用本文所闡述之抗體分子可實現治療轉移性癌症，例如表現PD-L1之轉移性癌症(Iwai等人(2005) Int. Immunol. 17:133-144)。
如本文所使用，術語「治療(treat、treatment、treating)」或「改善」係指治療性治療，其中目標係逆轉、緩和、改善、抑制、減慢或停止與疾病或病症相關之病狀之進展或嚴重程度。術語「治療」包括減少或緩和病狀、疾病或病症(例如癌症)之至少一種不良效應或症狀。若一或多種症狀或臨床標記物減少，則治療通常係「有效的」。或者，若疾病之進展降低或停止，則治療係「有效的」。亦即，「治療」不僅包括症狀或標記物之改良，且亦包括停止或至少減緩在無治療時預期之症狀之進展或惡化。有益或期望之臨床結果包括(但不限於)不論可檢測或不可檢測地緩和一或多種症狀、降低疾病之程度、穩定疾病狀態(即不惡化)、延遲或減緩疾病進展、改善或減輕疾病狀態，及緩解(無論部分或全部)。術語疾病之「治療」亦包括提供緩解該疾病之症狀或副作用(包括舒緩治療)。在一些實施例中，癌症之治療包括降低腫瘤體積、減少癌細胞數量、抑制癌症轉移、延長預期壽命、降低癌細胞增殖、降低癌細胞存活，或改善與癌病狀相關之各種生理症狀。
如本文所使用，「延遲疾病之發展」意指推遲、阻礙、減緩、阻滯、穩定、抑制及/或延緩疾病(例如癌症)之發展。此延遲可有不同時間長度，取決於所治療疾病及/或個體之病史。如熟習此項技術者所顯而易見，充分或顯著延遲實際上可涵蓋預防，因個體不發生該疾病。舉例而言，可延遲晚期癌症，例如轉移之發生。
如本文所使用，「預防」包括對於可能易患疾病但尚未診斷患有疾病之個體提供該疾病之發生或復發預防。在一些實施例中，使用所提供之細胞及組合物來延遲疾病之發展或減緩疾病之進展。
如本文所使用，「抑制(suppress)」功能或活性係與其他相同條件(所關注條件或參數除外)相比或替代地與另一條件相比降低功能或活性。舉例而言，與抑制腫瘤生長之細胞不存在下腫瘤之生長速率相比，該等細胞降低腫瘤之生長速率。
在投與之上下文中，藥劑(例如醫藥調配物、細胞或組合物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量/量有效地達成諸如治療或預防結果等期望結果之量。
藥劑(例如醫藥調配物或細胞)之「治療有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效地達成期望治療結果(例如用於治療疾病、病狀或病症)及/或達成治療之藥物動力學或藥效學效應之量。治療有效量可根據諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重以及所投與之細胞群體等因素而變化。在一些實施例中，所提供之方法涉及以有效量(例如，治療有效量)投與細胞及/或組合物。
「預防有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效地達成期望預防結果之量。通常但未必，由於預防劑量係在患病之前或患病早期用於個體中，故預防有效量將小於治療有效量。在降低腫瘤負荷之情況下，預防有效量在一些態樣中將高於治療有效量。
根據本文所闡述之各個實施例，本發明提供經改造細胞及含有該等經改造細胞之組合物/調配物。本發明亦提供用於製造該等經改造細胞之方法或製程，其可用於治療患有病理學疾病或病狀之患者。
此外，根據本文所闡述之各個實施例，本發明提供重組載體，其包含適於遺傳修飾細胞之核酸構築體，該重組載體可用於治療病理學疾病或病狀。
此外，根據本文所闡述之各個實施例，本發明提供經改造細胞，其包含適於遺傳修飾細胞之核酸構築體，該改造細胞可用於治療病理學疾病或病狀，其中該核酸編碼：(a) 專一性地結合至抗原之經遺傳改造之抗原受體；及(b) 降低或能夠降低腫瘤靶標之表現之抑制性蛋白質。在各個實施例中，該細胞表現經遺傳改造之抗原受體及抑制性蛋白質。在各個實施例中，抑制性蛋白質組成型地表現。
利用所提供之細胞、組合物、方法及用途治療之疾病、病狀及病症尤其係腫瘤，包括實體腫瘤、血液惡性病及黑色素瘤；及感染性疾病，例如病毒感染或其他病原體感染，例如HPV、HIV、HCV、HBV、EBV、HTLV-1、CMV、腺病毒、BK多瘤病毒、HHV-8、MCV或其他病原體；及寄生蟲病。在一些實施例中，疾病或病狀係腫瘤、癌症、惡性病、贅瘤或其他增殖性疾病或病症。此等疾病包括(但不限於)白血病、淋巴瘤(例如慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、難治性濾泡性淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、惰性B細胞淋巴瘤)、B細胞惡性病、子宮頸癌(cancer of the uterine cervix)、結腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌、黑色素瘤、骨癌及腦癌、卵巢癌、上皮癌、腎細胞癌、胰臟腺癌、霍奇金氏淋巴瘤、子宮頸癌(cervical carcinoma)、結腸直腸癌、神經膠母細胞瘤、神經胚細胞瘤、尤恩氏肉瘤(Ewing sarcoma)、髓母細胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤及/或間皮瘤。
經改造細胞
在各個實施例中，經改造之細胞可自細菌、真菌、人類、大鼠、小鼠、兔、猴、豬或任何其他物種獲得。較佳地，該細胞係來自人類、大鼠或小鼠。更佳地，該細胞係自人類獲得。在各個實施例中，經改造之細胞係血球。較佳地，該細胞係白血球、淋巴球或任何其他適宜血球類型。較佳地，該細胞係外周血細胞。更佳地，該細胞係T細胞、B細胞或NK細胞。
在較佳實施例中，細胞係T細胞。本發明中所使用之T細胞之實例包括(但不限於)：藉由活體外培養自患者分離之T細胞(例如腫瘤浸潤淋巴球)獲得的細胞；藉由利用病毒載體轉導自患者外周血分離之T細胞獲得的TCR基因修飾之T細胞；及經CAR轉導之T細胞。較佳地，T細胞係TCR基因修飾之T細胞。
在本發明之實施例中，細胞係NK細胞。
重組載體
可使用任何載體或載體類型將遺傳物質遞送至細胞中，例如(但不限於)質體載體、病毒載體、BAC、YAC、HAC。因此，可使用之病毒載體包括(但不限於)重組反轉錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體、泡沫病毒載體、重組腺相關病毒(AAV)載體、雜合載體及/或質體轉位子(例如睡美人轉位子系統)或基於整合酶之載體系統。可與本發明之替代實施例結合使用之其他載體對熟習此項技術者將係顯而易見的。
在較佳實施例中，所使用之載體係重組反轉錄病毒載體。該病毒載體可在特定針對病毒載體製造之培養基中生長。根據本文所闡述之實施例，可使用用於生長病毒載體之任何適宜生長培養基及/或補充物。
經遺傳改造之抗原受體
經遺傳改造之抗原受體係選自(但不限於) T細胞受體(TCR)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體家族(KIR)、C型凝集素受體家族、白血球免疫球蛋白樣受體家族(LILR)、1型細胞介素受體、2型細胞介素受體家族、腫瘤壞死因子家族、TGFβ受體家族、趨化介素受體、IgSF。
在本發明之實施例中，由核酸構築體編碼之經遺傳改造之抗原受體係經遺傳改造之NK細胞受體。在一些實施例中，NK細胞受體屬殺手細胞免疫球蛋白樣受體家族(KIR)。在替代實施例中，NK細胞受體屬C型凝集素受體家族。
在較佳實施例中，由核酸構築體編碼之經遺傳改造之抗原受體係經遺傳改造之T細胞受體(TCR)。較佳地，表現此受體之T細胞係αβ-T細胞。在替代實施例中，表現此受體之T細胞係γδ-T細胞。
所靶向之抗原
在一些實施例中，與疾病或病症相關之抗原係選自由以下組成之群：由HPV、HIV、HCV、HBV、EBV、HTLV-1、CMV、腺病毒、BK多瘤病毒、HHV-8、MCV或其他病原體表現之分子、孤兒酪胺酸激酶受體ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、間皮素、CEA及B型肝炎表面抗原、抗葉酸鹽受體、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎兒乙醯膽鹼e受體、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ輕鏈、Lewis Y、L1細胞黏著分子、MAGE-A1、間皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配體、NY-ESO-1、MART-1、gp100、瘤胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺專一性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受體、助孕酮受體、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2及MAGE A3及/或生物素化分子。
較佳地，經遺傳改造之抗原受體結合至來自人類乳頭瘤病毒(HPV)之抗原。HPV之亞型係選自(但不限於) HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6、HPV10、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV27、HPV28、HPV29、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV45、HPV49、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。在一些實施例中，經遺傳改造之抗原受體所靶向之HPV之亞型係選自至少一種高風險HPV，例如(但不限於) HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。
在一些實施例中，HPV抗原係選自(但不限於) E1、E2、E3、E4、E6及E7、L1及L2蛋白。在較佳實施例中，該抗原係E6抗原。在另一較佳實施例中，該抗原係E7抗原。在更佳實施例中，該抗原係HPV16 E6抗原。
因此，所治療之疾病或病狀係感染性疾病或病狀，例如(但不限於)病毒、反轉錄病毒、細菌及原生動物感染、免疫缺失、人類乳頭瘤病毒(HPV)、巨細胞病毒(CMV)、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些實施例中，疾病或病狀係病毒相關之惡性病，例如(但不限於) HPV、HCV、EBV、HIV、HHV-8、HTLV-1、MCV。較佳地，利用所提供之組合物、細胞、方法及用途治療之病毒相關惡性病係HPV相關之癌症。更佳地，所提供之組合物、細胞、方法可用於治療由HPV相關之癌症引起的實體腫瘤。具體而言，疾病或病狀包括HPV相關之癌症，例如(但不限於)子宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、肛門直腸癌、陰道癌、陰門癌及陰莖癌。更具體而言，疾病或病狀包括HPV相關之頭頸癌、HPV相關之子宮頸癌。
檢查點抑制劑
在各個實施例中，經改造細胞表現至少一種檢查點抑制劑(CPI)。本發明之經改造細胞表現之抑制性蛋白質或CPI抑制或阻斷免疫檢查點，其中該免疫檢查點係選自由以下(但不限於以下)組成之群：PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4 (CD244)、4-IBB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受體、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPα (CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、VISTA及其組合。
在較佳實施例中，抑制性蛋白質阻斷PD-1或PD-Ll。在各個實施例中，抑制性蛋白質係抗PD-1 scFv。抑制性蛋白質能夠導致群體中之T細胞中PD-1或PD-L1之表現的降低及/或抑制PD-1或PD-L1之上調。較佳地，抑制性蛋白質阻斷PD-1。
核酸構築體
參考圖1，根據各個較佳實施例，核酸構築體包括三個序列。較佳地，該三個序列包括：(a) 與TCR α鏈之恆定區融合之抗E6 TCR之α鏈之可變區，其鑑別為「 aE6_Va-Ca 」 ，其中aE6_Va 對應於抗E6 TCR之α鏈之可變區且Ca 對應於TCR α鏈之恆定區；(b) 與TCR β鏈之恆定區融合之同一抗E6 TCR之β鏈之可變區，其鑑別為「 aE6_Vb-Cb 」 ，其中aE6_Vb 對應於同一人類抗E6 TCR之β鏈之可變區且Cb 對應於TCR β鏈之恆定區；及(c) 鑑別為「 aPD1_VH 」 之抗PD-1抗體重鏈之可變區及鑑別為「 aPD1_VL 」 之抗PD-1抗體輕鏈之可變區，其中抗PD-1抗體序列之關鍵區包含：重鏈可變區之框架FR1區；包含具有SEQ ID NO:1中所示序列之胺基酸之重鏈CDR1；重鏈可變區之框架FR2區；包含具有SEQ ID NO:2中所示序列之胺基酸之重鏈CDR2；重鏈可變區之框架FR3區；包含具有SEQ ID NO:3中所示序列之胺基酸之重鏈CDR3；重鏈可變區之框架FR4區；輕鏈可變區之框架FR1區；包含具有SEQ ID NO:4中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR1；輕鏈可變區之框架FR2區；包含具有SEQ ID NO:5中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR2；輕鏈可變區之框架FR3區；包含具有SEQ ID NO:6中所示序列之胺基酸之輕鏈CDR3；及輕鏈可變區之框架FR4區。
在各個實施例中，編碼抑制性蛋白質之抑制性核酸包含與PD1編碼核酸互補之序列。在一些實施例中，編碼抑制性蛋白質之抑制性核酸包含與PD1編碼核酸互補之反義寡核苷酸。
核酸構築體進一步包含連接上文所提及序列(a)、(b)及(c)之P2A 及 T2A 序列。此外，抗PD-1抗體之重鏈及輕鏈之可變區(分別鑑別為aPD1_VH 及aPD1_VL )以GS連接體連接。
核酸構築體可進一步包括可幫助及/或實現構築體之轉染、轉導、整合、複製、轉錄、轉譯、表現及/或穩定化之其他序列。
用於製備經改造細胞之方法
本發明提供用於製造及使用經改造細胞用於治療病理學疾病或病狀之方法或製程。該方法包含以下步驟：(I) 自患者血液分離T細胞；(II) 利用病毒載體轉導群體T細胞，該病毒載體包括編碼經遺傳改造之抗原受體及抑制性蛋白質之核酸構築體；(III) 在活體外擴增經轉導細胞；及(IV) 將擴增細胞輸注至患者體內，其中經改造T細胞將尋找並破壞抗原陽性腫瘤細胞。同時，該等經改造T細胞將阻斷PD-1/PD-L1免疫抑制且加強抗腫瘤免疫反應。
該方法進一步包含：在步驟(II)之前，利用含有本發明之核酸構築體之病毒載體轉染T細胞。
T細胞之轉染可使用任一標準方法來達成，例如磷酸鈣法、電穿孔、脂質體介導之轉移、顯微注射、生物彈射粒子遞送系統或任何其他已知方法。在一些實施例中，使用磷酸鈣法實施T細胞之轉染。
根據本文所闡述之各個實施例，本發明提供針對HPV相關癌症、具體而言HPV16 E6+或HPV16 E7+癌症之免疫療法。經改造之T細胞識別腫瘤抗原HPV E6且同時分泌阻斷程式化細胞死亡蛋白1 (PD-1)之單鏈抗體(scFv)。該等經改造之T細胞展現更強之抗腫瘤反應及降低之T細胞耗竭。
實驗已發現，在本發明中PD-1檢查點阻斷更有效，此乃因(1) 抗PD-1藥物遞送定位至腫瘤部位及(2) 抗PD-1單鏈抗體較目前現有抗體結合更強。此外，由於抗PD-1藥物遞送定位至腫瘤部位，因此由非專一性發炎所致之毒性降低。已發現，與現有替代方案相比，抗E6 TCR與抗PD-1之組合改良T細胞活化及/或防止T細胞耗竭。
此外，本發明可用於產生個人化抗腫瘤免疫療法。經抗E6+/抗PD-1改造之T細胞可容易地自患者血液產生。然後將該等經改造之T細胞作為細胞療法產品重新輸注至患者體內。此產品可應用於具有HPVE6+腫瘤之任何患者，包括子宮頸癌、頭頸癌及其他癌症。
組合物、調配物及投與方法
本發明提供含有藉由所揭示方法產生之經改造T細胞及其群體之組合物(包括醫藥及治療組合物)。亦提供方法，例如將該等經改造T細胞及其組合物投與給個體(例如患者)之治療方法。
A.組合物及調配物
提供包括用於投與之經改造T細胞之組合物，包括醫藥組合物及調配物，例如單位劑型組合物，其包括以給定劑量或其分率投與之數目的細胞。該等醫藥組合物及調配物可包括一或多種醫藥上可接受之可選載劑或賦形劑。在一些實施例中，組合物包括至少一種額外治療劑。
在一些實施例中，載劑之選擇部分地係由特定細胞(例如T細胞或NK細胞)及/或投與方法來決定。因此，存在多種適宜調配物。舉例而言，醫藥組合物可含有防腐劑。適宜防腐劑可包括(例如)對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及苯紮氯銨。在一些實施例中，使用兩種或更多種防腐劑之混合物。防腐劑或其混合物通常以總組合物之約0.0001重量%至約2重量%之量存在。載劑闡述於(例如) Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A.編輯(1980)中。醫藥上可接受之載劑在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。
本發明中所使用之適宜緩衝劑包括(例如)檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀及各種其他酸及鹽。在一些實施例中，使用兩種或更多種緩衝劑之混合物。緩衝劑或其混合物通常以總組合物之約0.001重量%至約4重量%之量存在。用於製備可投與之醫藥組合物之方法係已知的。例示性方法更詳細地闡述於(例如) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
調配物可包括水溶液。調配物或組合物亦可含有一種以上可用於利用經改造T細胞治療之特定適應症、疾病或病狀之活性成分，較佳為活性與該等細胞互補之彼等活性成分，其中各別活性不會不利地影響彼此。此等活性成分適宜地以有效用於預期目的之量以組合形式存在。因此，在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包括其他醫藥活性劑或藥物，例如化學治療劑，例如天冬醯胺酶、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、胺甲喋呤(methotrexate)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)、長春鹼(vinblastine)及/或長春新鹼(vincristine)。
醫藥組合物在一些實施例中含有有效治療或預防疾病或病狀之量(例如治療有效或預防有效量)之細胞。治療或預防效能在一些實施例中係由定期評價所治療個體來監測。可藉由單次濃注投與細胞、藉由多次濃注投與細胞或藉由連續輸注投與細胞來遞送期望劑量。
細胞及組合物可使用標準投與技術、調配物及/或裝置來投與。細胞之投與可係自體的或異源的。舉例而言，可自一名個體獲得免疫反應性T細胞或祖細胞，且在根據本文所闡述之各個實施例對其進行遺傳修飾之後將其投與至同一個體或不同的相容性個體。源自外周血之免疫反應性T細胞或其子代(例如活體內、離體或活體外源)可經由局部注射來投與，包括導管投與、全身注射、局部注射、靜脈內注射或非經腸投與。通常，當投與治療組合物(例如含有經遺傳修飾之免疫反應細胞之醫藥組合物)時，通常將其調配於單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)中。
本文所揭示之調配物包括用於經口、靜脈內、腹膜內、皮下、經肺、經皮、肌內、鼻內、經頰、舌下或栓劑投與之彼等。在一些實施例中，細胞群體係以非經腸方式投與。如本文所使用，術語「非經腸」包括靜脈內、肌內、皮下、經直腸、經陰道及腹膜內投與。在一些實施例中，使用外周全身遞送藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射將細胞投與給個體。
在一些實施例中，組合物係以無菌液體製劑形式提供，例如等滲水溶液、懸浮液、乳液、分散液或黏性組合物，其在一些態樣中可緩衝至所選pH。通常液體製劑較凝膠、其他黏性組合物及固體組合物易於製備。另外，液體組合物略微更便於投與，尤其藉由注射。另一方面，可在適當黏度範圍內調配黏性組合物以提供與特定組織之更長之接觸時期。液體或黏性組合物可包含載劑，其可係含有(例如)水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其適宜混合物之溶劑或分散介質。
無菌可注射溶液可藉由將細胞納入溶劑中來製備，例如與諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或諸如此類等適宜載劑、稀釋劑或賦形劑混合。組合物可含有輔助性物質，例如潤濕劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、矯味劑及/或著色劑，此取決於期望之投與途徑及製劑。在一些態樣中，可參考標準文本以製備適宜製劑。
可添加增強組合物之穩定性及無菌性之各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。可藉由各種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚及山梨酸)來確保對微生物作用之預防。可藉由使用延遲吸收劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射醫藥形式之吸收。
欲用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由(例如)經由無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。
B. 經改造T細胞在過繼性細胞療法中之投與方法及用途
提供投與細胞、群體及組合物之方法，以及此等細胞、群體及組合物用以治療或預防疾病、病狀及病症(包括癌症)之用途。在一些實施例中，例如經由過繼性細胞療法(例如過繼性T細胞療法)將本文所闡述之細胞、群體及組合物投與給患有欲治療之特定疾病或病狀之個體或患者。在一些實施例中，將藉由所提供之方法製備之細胞及組合物(例如經改造組合物及在培育及/或其他處理步驟後之產生結束組合物)投與給個體，例如患有疾病或病狀或處於該疾病或病狀風險下之個體。在一些態樣中，該等方法藉此例如藉由在表現由經改造T細胞識別之抗原之癌症中減輕腫瘤負荷來治療疾病或病狀，例如改善其一或多種症狀。
投與用於過繼性細胞療法之細胞之方法係已知的，且可與所提供之方法及組合物結合使用。舉例而言，過繼性T細胞治療方法闡述於(例如)頒予Gruenberg等人之美國專利申請公開案第2003/0170238號；頒予Rosenberg之美國專利第4,690,915號；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)中。例如，參見Themeli等人(2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933；Tsukahara等人(2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila等人(2013) PLoS ONE 8(4): e61338。
在一些實施例中，藉由自體轉移來實施細胞療法(例如過繼性T細胞療法)，其中自欲接受該細胞療法之個體或自源自此一個體之樣品分離及/或以其他方式製備T細胞。因此，在一些態樣中，細胞係源自個體，例如需要治療之患者，且在分離及處理後將該等細胞投與給同一個體。
在一些實施例中，藉由同種異體轉移來實施細胞療法(例如過繼性T細胞療法)，其中自除欲接受或最終接受該細胞療法之個體(例如第一個體)以外之個體分離及/或以其他方式製備T細胞。在此等實施例中，然後將該等投與給同一物種之不同個體(例如第二個體)。在一些實施例中，該第一及第二個體在遺傳上相同。在一些實施例中，該第一及第二個體在遺傳上相似。在一些實施例中，該第二個體表現與該第一個體相同之HLA類別或超型。
在一些實施例中，在投與細胞或含有該等細胞之組合物之前，個體已用靶向疾病或病狀(例如腫瘤)之治療劑治療。在一些態樣中，個體對另一治療劑係難治的或無反應的。在一些實施例中，個體例如在經另一治療性干預治療後患有持續性或復發疾病，該另一治療性干預包括化學療法、輻射及/或造血幹細胞移植(HSCT)，例如同種異體HSCT。在一些實施例中，儘管個體對另一療法變得具有抗性，但該投與仍有效地治療個體。
在一些實施例中，個體對另一治療劑有反應，且利用該治療劑之治療降低疾病負擔。在一些態樣中，個體最初對該治療劑有反應，但隨時間展現疾病或病狀之復發。在一些實施例中，個體未復發。在一些此等實施例中，確定個體處於復發風險，例如處於高復發風險，且因此預防性地投與該細胞以例如降低復發之可能性或預防復發。在一些實施例中，個體尚未接受另一治療劑之先前治療。
在一些實施例中，以期望劑量投與細胞，在一些態樣中包括期望劑量或數目之細胞或細胞類型及/或期望比率之細胞類型。因此，在一些實施例中，細胞之劑量係基於細胞之總數目(或每kg體重之數目)及個別群體或亞型之期望比率(例如CD4+對CD8+比率)。在一些實施例中，細胞之劑量係基於個別群體中之細胞或個別細胞類型之期望總數目(或每kg體重之數目)。在一些實施例中，該劑量係基於此等特徵之組合，例如期望總細胞數目、期望比率，及個別群體中之期望總細胞數目。
在一些實施例中，以期望劑量之總細胞(例如期望劑量之T細胞)或在其容忍差異內投與細胞之群體或亞型(例如CD8+及CD4+ T細胞)。在一些實施例中，期望劑量係期望細胞數目，或投與該等細胞之個體的每單位體重之期望細胞數目，例如細胞/kg。在一些實施例中，期望劑量為或高於最小細胞數目或每單位體重之最小細胞數目。在一些實施例中，在以期望劑量投與之總細胞中，個別群體或亞型係以或接近期望輸出比率(例如CD4+對CD8+比率)存在，例如在此比率之某一容忍差異或誤差內。
在一些實施例中，細胞係以細胞之個別群體或亞型中之一或多者之期望劑量(例如CD4+細胞之期望劑量及/或CD8+細胞之期望劑量)或在其容忍差異內投與。在一些實施例中，期望劑量係亞型或群體之細胞之期望數目，或投與該等細胞之個體的每單位體重之此等細胞之期望數目，例如細胞/kg。在一些實施例中，期望劑量為群體或亞型之最小細胞數目或每單位體重之群體或亞型之最小細胞數目或在其之上。
因此，在一些實施例中，劑量係基於總細胞之期望固定劑量及期望比率，及/或係基於個別亞型或亞群體中之一或多者(例如每一者)之期望固定劑量。因此，在一些實施例中，劑量係基於T細胞之期望固定或最小劑量及CD4+對CD8+細胞之期望比率，及/或係基於CD4+及/或CD8+細胞之期望固定或最小劑量。
在某些實施例中，細胞或個別細胞亞型群體係以約1百萬至約100十億個細胞之範圍投與給個體，例如1百萬至約50十億個細胞(例如約5百萬個細胞、約25百萬個細胞、約500百萬個細胞、約1十億個細胞、約5十億個細胞、約20十億個細胞、約30十億個細胞、約40十億個細胞或由前述值中之任兩者所界定之範圍)、例如約10百萬至約100十億個細胞(例如約20百萬個細胞、約30百萬個細胞、約40百萬個細胞、約60百萬個細胞、約70百萬個細胞、約80百萬個細胞、約90百萬個細胞、約10十億個細胞、約25十億個細胞、約50十億個細胞、約75十億個細胞、約90十億個細胞或由前述值中之任兩者所界定之範圍)，且在一些情形中約100百萬個細胞至約50十億個細胞(例如約120百萬個細胞、約250百萬個細胞、約350百萬個細胞、約450百萬個細胞、約650百萬個細胞、約800百萬個細胞、約900百萬個細胞、約3十億個細胞、約30十億個細胞、約45十億個細胞)或該等範圍之間的任一值。
在一些實施例中，總細胞之劑量及/或個別細胞亞群體之劑量係在介於104或約104與109或約109個細胞/公斤(kg)體重之間的範圍內，例如介於105與106個細胞/kg體重之間，例如至少或至少約1×105個細胞/kg、至少或至少約1.5×105個細胞/kg、至少或至少約2×105個細胞/kg或至少或至少約1×106個細胞/kg體重、或1×105個細胞/kg、1.5×105個細胞/kg、2×105個細胞/kg或1×106個細胞/kg體重、或約1×105個細胞/kg、約1.5×105個細胞/kg、約2×105個細胞/kg或約1×106個細胞/kg體重。舉例而言，在一些實施例中，細胞係以介於104或約104與109或約109個T細胞/公斤(kg)體重之間或在其一定誤差範圍內投與，例如介於105與106個T細胞/kg體重之間，例如至少或至少約1×105個T細胞/kg、至少或至少約1.5×105個T細胞/kg、至少或至少約2×105個T細胞/kg或至少或至少約1×106個T細胞/kg體重、或1×105個T細胞/kg、1.5×105個T細胞/kg、2×105個T細胞/kg或1×106個T細胞/kg體重、或約1×105個T細胞/kg、約1.5×105個T細胞/kg、約2×105個T細胞/kg或約1×106個T細胞/kg體重。
在一些實施例中，細胞係以介於104或約104與109或約109個CD4+及/或CD8+細胞/公斤(kg)體重之間或在其一定誤差範圍內投與，例如介於105與106個CD4+及/或CD8+細胞/kg體重之間，例如至少或至少約1×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg、至少或至少約1.5×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg、至少或至少約2×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg或至少或至少約1×106個CD4+及/或CD8+細胞/kg體重、或1×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg、1.5×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg、2×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg或1×106個CD4+及/或CD8+細胞/kg體重、或約1×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg、約1.5×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg、約2×105個CD4+及/或CD8+細胞/kg或約1×106個CD4+及/或CD8+細胞/kg體重。
在一些實施例中，細胞係以大於及/或至少約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106或約9×106個CD4+細胞及/或至少約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106或約9×106個CD8+細胞及/或至少約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106或約9×106個T細胞或在其一定誤差範圍內投與。在一些實施例中，細胞係以介於約108與1012個T細胞之間或介於約1010與1011個T細胞之間、介於約108與1012個CD4+細胞之間或介於約1010與1011個CD4+細胞之間及/或介於約108與1012個CD8+細胞之間或介於約1010與1011個CD8+細胞之間或在其一定誤差範圍內投與。
在一些實施例中，細胞係以多種細胞群體或亞型(例如CD4+及CD8+細胞或亞型)之期望輸出比率或在其容忍範圍內投與。在一些態樣中，期望比率可為特定比率或可為比率範圍。舉例而言，在一些實施例中，期望比率(例如CD4+對CD8+細胞之比率)介於1:5或約1:5與5:1或約5:1之間(或大於約1:5且小於約5:1)或介於1:3或約1:3與3:1或約3:1之間(或大於約1:3且小於約3:1)，例如介於2:1或約2:1與1:5或約1:5之間(或大於約1:5且小於約2:1，例如為以下或約以下：5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9: 1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些態樣中，容忍差異係在期望比率之約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%內，包括該等範圍之間的任一值。
對於疾病之預防或治療而言，適當劑量將取決於欲治療疾病之類型、細胞或重組受體之類型、疾病之嚴重程度及進程、投與細胞之目的係預防抑或治療、先前療法、個體之臨床病史及對細胞之反應以及主治醫師之決定。在一些實施例中，將組合物及細胞適宜地一次性或經一系列治療投與給個體。
本文所闡述之細胞可藉由任一適宜方式來投與，例如藉由濃注輸注、藉由注射，例如靜脈內或皮下注射、眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、經中隔注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房內注射、結膜下注射、特農囊下注射(sub-Tenon's injection)、眼球後注射、眼球周注射或後部鞏膜旁遞送。在一些實施例中，該等細胞藉由非經腸、肺內及鼻內投與，且若期望用於局部治療，則病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。在一些實施例中，給定劑量係藉由單次濃注投與細胞來投與。在一些實施例中，其係藉由多次濃注投與細胞(例如經不超過3天之時期)或藉由連續輸注投與細胞來投與。
在一些實施例中，細胞係作為組合治療之一部分投與，例如與另一治療性干預(例如抗體或經改造細胞或受體或藥劑，例如細胞毒性劑或治療劑)同時或以任何順序依序投與。在一些實施例中，細胞與一或多種額外治療劑同時或以任何順序依序共投與或與另一治療性干預同時或以任何順序依序結合共投與。在一些情況下，使細胞與另一療法共投與之時間充分接近，從而使得細胞群體增強一或多種額外治療劑之效應，或反之亦然。在一些實施例中，在該一或多種額外治療劑之前投與細胞。在一些實施例中，在該一或多種額外治療劑之後投與細胞。在一些實施例中，該一或多種額外藥劑包括細胞介素(例如IL-2)以例如增強持久性。在一些實施例中，該等方法包含投與化學治療劑。
在投與細胞後，在一些實施例中量測經改造細胞群體之生物活性，例如藉由多種已知方法中之任一者。評價參數包括經改造T細胞與抗原之專一性結合，在活體內例如藉由成像來評價或離體例如藉由ELISA或流式細胞術來評價。在某些實施例中，可使用業內已知之任一適宜方法來量測經改造細胞破壞靶細胞之能力，例如闡述於(例如) Kochenderfer等人，J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)及Herman等人，J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)中之細胞毒性分析。在某些實施例中，藉由分析一或多種細胞介素(例如CD107a、IFNγ、IL-2及TNF)之表現及/或分泌來量測細胞之生物活性。在一些態樣中，藉由評價臨床結果(例如腫瘤負荷或負載之降低)來量測生物活性。
在某些實施例中，以多種方式進一步修飾經改造細胞，使得其治療或預防性效能得以增加。舉例而言，可使由群體表現之經改造CAR或TCR直接或經由連接體間接地偶聯至靶向部分。將化合物(例如，CAR或TCR)偶聯至靶向部分之實踐為業內所已知。舉例而言，參見Wadwa等人，J. Drug Targeting 3: 111 (1995)及美國專利第5,087,616號。
C.投藥時間表或方案
在一些實施例中，提供重複劑量方法，其中給予第一劑量之細胞，之後給予一或多次第二連續劑量。當在過繼性治療方法中投與給個體時，通常設計多劑量細胞之時間及大小以增加表現TCR之經改造T細胞之效能及/或活性及/或功能。在一些實施例中，重複投藥降低在抑制性免疫分子(例如PD-1及/或PD-L1)在表現TCR之經改造T細胞上上調時可能會發生之下調或抑制活性。該等方法涉及投與第一劑量，通常之後投與一或多次連續劑量，在不同劑量之間具有特定時間範圍。
在過繼性細胞療法之情況下，投與給定「劑量」涵蓋以單一組合物及/或單一不間斷投與形式(例如以單次注射或連續輸注形式)投與給定量或數目之細胞，且亦涵蓋在不超過3天之指定時間段內，以提供於多個個別組合物或輸注中之分次劑量形式投與給定量或數目之細胞。因此，在一些情況下，第一或連續劑量係在單一時間點給予或起始之指定數目細胞之單次或連續投與。然而，在一些情況下，第一或連續劑量係以在不超過三天之時期內多次注射或輸注來投與(例如每天一次持續三天或持續兩天)或在一天時期內藉由多次輸注來投與。
因此，在一些態樣中，第一劑量之細胞係以單一醫藥組合物來投與。在一些實施例中，連續劑量之細胞係以單一醫藥組合物來投與。
在一些實施例中，第一劑量之細胞係以共同含有第一劑量之細胞之複數種組合物來投與。在一些實施例中，連續劑量之細胞係以共同含有連續劑量之細胞之複數種組合物來投與。在一些態樣中，額外之連續劑量可在不超過3天之時期內以複數種組合物來投與。
術語「分次劑量」係指分開以使得其經一天以上投與之劑量。本發明方法涵蓋此投藥類型且視為單一劑量。
因此，在一些態樣中，第一劑量及/或連續劑量可以分次劑量形式來投與。舉例而言，在一些實施例中，劑量可經2天或經3天投與給個體。分次投藥之例示性方法包括在第一天投與25%之劑量且在第二天投與剩餘75%之劑量。在其他實施例中，可在第一天投與33%之第一劑量且在第二天投與剩餘67%。在一些態樣中，在第一天投與10%之劑量，在第二天投與30%之劑量，且在第三天投與60%之劑量。在一些實施例中，分次劑量之分佈不超過3天。
關於先前劑量(例如第一劑量)，術語「連續劑量」係指在先前(例如第一)劑量之後投與給同一個體之劑量，而在中間時期內不向該個體投與任何中間劑量。但是，該術語不涵蓋在單一分次劑量內所包含之一系列輸注或注射中之第二次、第三次等等注射或輸注。因此，除非另外規定，否則在一天、兩天或三天時期內之第二次輸注不視為如本文所使用之「連續」劑量。同樣，就「連續」劑量之含義而言，在分次劑量內之多劑量系列中之第二次、第三次等亦不視為「中間」劑量。因此，除非另外規定，否則在起始第一或先前劑量後大於三天之一定時間段投與之劑量視為「連續」劑量，即使個體在起始第一劑量後接受細胞之第二或後續注射或輸注亦如此，只要該第二或後續注射或輸注係在起始第一或先前劑量後之三天時期內進行即可。
因此，除非另外規定，否則在最多3天之時期內多次投與相同細胞視為單一劑量，且在初始投與3天內投與細胞不視為連續劑量，且出於確定第二劑量是否為第一劑量之「連續」之目的，亦不視為中間劑量。
在一些實施例中，多個連續劑量在一些態樣中係使用與關於第一劑量與第一連續劑量之間的時間之彼等相同的時間指南藉由例如投與第一及多個連續劑量來給予，其中每一連續劑量係在其中抑制性免疫分子(例如PD-1及/或PD-L1)自所投與之第一劑量開始個體之細胞中已上調之一段時期內給予。根據經驗確定何時提供連續劑量(例如藉由評價來自外周血或其他體液之抗原表現細胞(例如CAR表現細胞)中之PD-1及/或PD-L1含量)係在熟習此項技術者之能力範圍內。
在一些實施例中，第一劑量與第一連續劑量或第一與多個連續劑量之間的時間使得每一連續劑量係在大於約5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或更長時間之一段時期內給予。在一些實施例中，在投與第一或緊接之先前劑量後小於約28天之時期內給予連續劑量。額外之一或多個連續劑量亦稱為後續劑量或後續連續劑量。
通常設計細胞之第一及/或一或多個連續劑量之大小以改良效能及/或降低毒性風險。在一些態樣中，第一劑量或任一連續劑量之劑量量或大小係如上文所闡述之任一劑量或量。在一些實施例中，第一劑量中或任一連續劑量中之細胞數目介於約0.5×106個細胞/kg個體體重與5×106個細胞/kg之間、介於約0.75×106個細胞/kg與3×106個細胞/kg之間或介於約1×106個細胞/kg與2×106個細胞/kg之間，包括上述每一數值。
如本文所使用，「第一劑量」用於描述在投與連續或後續劑量之前所給予劑量之時間。該術語不一定暗示個體之前從未接受一定劑量之細胞療法或甚至個體之前未接受一定劑量之相同細胞或表現相同重組受體或靶向相同抗原之細胞。
在一些實施例中，由連續劑量中之細胞表現之受體(例如TCR)含有至少一個與由第一劑量之細胞表現之受體(例如TCR)相同的免疫反應性表位。在一些實施例中，由在連續劑量中投與之細胞表現之受體(例如TCR)與由第一劑量表現之受體(例如TCR)相同或與由在第一劑量中投與之細胞表現之受體(例如TCR)實質上相同。
由在各個劑量中投與給個體之細胞表現之受體(例如TCR)通常識別或專一性地結合至在所治療疾病或病狀或其細胞中表現、與所治療疾病或病狀或其細胞相關及/或所治療疾病或病狀或其細胞所特有之分子。在專一性結合至該分子(例如抗原)後，受體通常將免疫刺激信號(例如ITAM轉導之信號)遞送至細胞中，藉此促進針對疾病或病狀之免疫反應。舉例而言，在一些實施例中，第一劑量中之細胞表現專一性地結合至所表現抗原之CAR。工作實例 ：
以下實例不意欲限制本發明之申請專利範圍之範圍，而是意欲為某些實施例之例示。熟習此項技術者所想到之例示方法中之任何變化形式均意欲屬本發明之範圍內。
構築體設計 。使用標準分子生物學技術產生含有三個編碼區之MP71反轉錄病毒載體構築體，其中該三個編碼區為：(A) 與TCR α鏈之恆定區融合之人類抗E6 TCR之α鏈之可變區(命名為aE6_Va-Ca)；(B) 與TCR β鏈之恆定區融合之同一人類抗E6 TCR之β鏈之可變區(命名為aE6_Vb-Cb)；及(C) 新穎抗PD-1抗體之重鏈(命名為aPD1_VH )及輕鏈(命名為aPD1_VL )之可變區，其以GS連接體連接。所獲得之反轉錄病毒載體通常命名為E6.αPD1_m11。此研究中所使用之反轉錄病毒載體構築體之示意圖示於圖1中。
細胞系及培養基 。HEK-293T及CaSki細胞係購自ATCC。來自無名供體之外周血單核細胞(PBMC)係購自Hemacare。293T-PD-1細胞係利用過表現人類PD-1之載體藉由慢病毒轉導293T細胞來產生。將細胞培養於DMEM + 10% FBS、RPMI + 10% FBS或X-Vivo + 5%人類血清A/B + 1% HEPES + 1% GlutaMAX中。
反轉錄病毒載體產生 。使用標準磷酸鈣沈澱方案，藉由瞬時轉染293T細胞來製備反轉錄病毒載體。在48 h收穫病毒上清液且使用其轉導T細胞。
T 細胞轉導及擴增 。在反轉錄病毒轉導之前，藉由與T細胞活化劑珠粒及人類IL-2一起培養使PBMC活化2天。對於轉導，藉由在32C下以2,000 g離心2小時將新鮮收穫之反轉錄病毒上清液旋轉裝載至每孔塗覆有15 µg RetroNectin (Clontech Laboratories)之非組織培養物處理之24孔板上。將活化之PBMC裝載至板上且在32C下以600 g旋轉30 min。在37C及5% CO2下培育T細胞。每2天補充培養基。
TCR 及 PD-1 染色 。所有抗體均係購自Biolegend。在轉染後72 h藉由針對TCR β鏈之抗體染色檢測重組TCR之表現，之後進行流式細胞術。在與CaSki靶細胞一起共培養後72 h，藉由針對PD-1之抗體染色檢測PD-1之表現。同時實施CD3、CD4及CD8染色。
活體外抗 PD-1 scFv 表現。 利用編碼E6、E6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4 TCR轉基因之反轉錄病毒載體轉染293T細胞。然後在轉染後48小時收集細胞培養上清液。藉由ELISA檢測20 µl上清液中之抗PD-1 scFv。
結果：圖3顯示所分泌之抗PD-1 scFv在細胞培養上清液中之表現。E6表示沒有抗PD-1之E6 TCR；E6.aPD1_m11表示具有本發明之新穎抗PD-1單鏈抗體之E6 TCR；E6.αPD1_5C4表示具有源自公開序列之對照抗PD-1單鏈抗體之E6 TCR。
活體外抗 E6 TCR-T 表現。 利用所指示之構築體轉導原代T細胞。培養72小時後，藉由針對TCR β鏈之抗體染色檢測重組TCR之表現。使用可行之CD3+淋巴球門控策略。
結果：圖4顯示一組圖，其中抗E6 TCR在含有E6.αPD1_m11構築體之T細胞中強烈表現。
所分泌抗 PD-1 scFv 之結合活性 。利用編碼E6、E6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4 TCR轉基因之反轉錄病毒載體轉染293T細胞。在轉染後48小時收集細胞培養上清液。使293T-PD-1細胞與300 µl上清液在室溫下一起培育30 min，且然後使用抗HA標籤抗體對細胞染色並檢測結合至293T-PD-1細胞之所分泌之帶HA標籤之抗PD-1抗體。
結果：如圖5中所見，兩種分泌之抗PD1均強烈結合至293T-PD-1細胞。E6.αPD1_m11及E6.αPD1_5C4抗體對在細胞表面上表現之PD-1具有相當之結合親和力。
重組 PD-L1 之競爭性結合 。使293T-PD1細胞與1 µl 100 µg/ml rhPD-L1/Fc及300 µl經E6、E6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4 TCR轉染之293T細胞培養上清液一起培育30 min。然後利用偶聯PE之抗人類Fc對細胞進行染色。
結果：如圖6中所見，來自E6.αPD1_m11及E6.αPD1_5C4 TCR-T細胞之上清液能夠與重組PD-L1競爭，由此證實單鏈抗PD1抗體可阻斷PD-1與其配體PD-L1之間的相互作用。
活體外 TCR-T IFNγ 活化 。將96孔分析板在4℃下用3 µg/ml抗人類CD3抗體塗覆過夜。在第二天，將各孔之上清液吸出，且利用每孔100 µl PBS將各孔洗滌一次。添加於100 µl PBS中之10 µg/ml rhPD-L1/Fc。在每一孔中，然後添加於10 µl PBS中之100 µg/ml山羊抗人類IgG Fc抗體。將分析板在37℃下培育4小時。收穫人類T細胞，洗滌一次且然後於TCM中重懸至1 × 106 個細胞/ml。將分析板之各孔吸乾。然後，將100 µl人類T細胞懸浮液(1 × 105 )及補充有GolgiPlug之100 µl經E6、E6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4 TCR轉染之轉染後2天的293T細胞培養上清液添加至每一孔。將板覆蓋且在37℃及5% CO2下培育過夜。培育後，收穫T細胞且在細胞內對IFN-γ染色。
結果：參考圖7，如藉由IFNγ表現所量測，含有E6 TCR之TCR-T細胞可由CD3抗體活化，但引入重組PD-L1 (rhPD-L1)降低該活化。然而，對於E6.αPD1_m11及E6.αPD1_5C4二者，PD-L1不降低活化。
活體外 TCR-T IFNγ 分泌 。將TCR-T細胞與Ca Ski細胞以1:0、1:2、1:1及3:1之效應物對靶標比率一起共培養48小時或72小時。然後收集上清液，且使用人類IFN-γ ELISA套組根據製造商之說明書量測IFN-γ產生。
結果：在抗原專一性刺激後，分泌抗PD-1 scFv對TCR-T細胞之IFNγ產生之效應示於圖8中(NT表示用作對照之未經轉導之對照)。如自圖8所見，自E6.αPD1_m11及E6.αPD1_5C4 TCR-T細胞二者中之上清液均檢測到IFNγ分泌，然而，來自E6.αPD1_m11之IFNγ產生顯著更高。
特定細胞溶解 ( 細胞毒性 ) 。 利用CFSE對Ca Ski腫瘤細胞進行預染色，且然後將其與E6、E6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4 TCR-T細胞以1:2、1:1及3:1之效應物對靶標比率一起共培養過夜。藉由膜聯蛋白V/7-AAD染色量測T細胞針對Ca Ski細胞之細胞毒性。使用非靶標293T細胞作為對照。
結果：如圖9中所見，所有E6 TCR-T細胞均以專一性方式殺死E6+靶細胞(CaSki)。E6.αPD1_m11及E6.αPD1_5C4較單獨之E6更有效地殺死靶細胞。
活體外 TCR-T 增殖 。利用CFSE對E6、E6.αPD1_m11及E6.αPD1_5C4 TCR-T細胞進行預染色。然後將經染色之T細胞與Ca Ski細胞一起共培養72小時，且藉由流式細胞術量測CFSE之強度。使用未經轉導(NT)之T細胞作為對照。
結果：如圖10中所見，暴露於E6+靶細胞刺激所有E6 TCR-T細胞增殖，此為活化之另一措施，然而，E6.αPD1_m11 TCR-T細胞之增殖較所測試之其他TCR-T細胞快。
在抗原專一性刺激後 PD-1 之活體外表現。 將所有TCR-T細胞與Ca Ski細胞一起共培養72小時。然後收集T細胞，且藉由流式細胞術量測細胞表面上之PD-1表現。對表現PD-1之CD8 T或CD4 T細胞進行門控，且其相對於總CD8+ T或CD4+ T細胞之百分比示出。NT指示未經轉導之T細胞，其用作對照。
結果：如圖11中所見，在抗原刺激後，抑制性受體PD-1在含有E6 TCR及E6.αPD1_5C4之T細胞上上調。然而，PD-1在表現E6.αPD1_m11之細胞上不上調。
活體內 TCR-T 效能 。將6-8週雌性NSG小鼠皮下植入2e6 Ca Ski腫瘤細胞，12天後，經由i.p.給予每一荷瘤小鼠10 ug聚(I:C)。24小時後，經由尾靜脈將10e6 E6-TCR-T、E6.αPD1_m11-TCR-T或未經轉導之對照PBMC注射於小鼠中。每週兩次量測腫瘤大小以評價TCR-T抗腫瘤效能，每週兩次量測小鼠體況及體重以評價TCR-T相關之毒性。
結果(無數據)：若TCR-T細胞有效，則與E6及未經轉導之對照相比，預期E6.αPD1_m11之腫瘤生長更慢。另外，與未經轉導之對照相比，E6.αPD1_m11 TCR-T細胞之T細胞計數可增加。
本文所引用之所有參考文獻均係以全文引用的方式併入，如同充分陳述一般。除非另有定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之含義。Allen等人，Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第 22 版 ，Pharmaceutical Press (2012年9月15日)；Hornyak等人，Introduction to Nanoscience and Nanotechnology , CRC Press (2008)；Singleton及Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第 3 版 ，修訂版， J. Wiley & Sons (New York, NY 2006)；Smith，March’s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 第 7 版 ， J. Wiley & Sons (New York, NY 2013)；Singleton，Dictionary of DNA and Genome Technology 第 3 版， Wiley-Blackwell (2012年11月28日)；以及Green及Sambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第 4 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)為熟習此項技術者提供本申請案中所用許多術語之一般指南。關於如何製備抗體之參考文獻，參見Greenfield，Antibodies A Laboratory Manual 第 2 版 ，Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013)；Köhler及Milstein，Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion , Eur. J. Immunol. 1976年7月，6(7):511-9；Queen及Selick，Humanized immunoglobulins ， 美國專利第5,585,089號(1996年12月)；及Riechmann等人，Reshaping human antibodies for therapy , Nature 1988年3月24日，332(6162):323-7。
熟習此項技術者將瞭解多種與本文所闡述之方法及材料類似或等效之彼等，其可用於實踐本發明。結合附圖自以下詳細闡述將明瞭本發明之其他特徵及優點，該等附圖以實例方式圖解說明本發明實施例之各種特徵。實際上，本發明決不受限於所闡述之方法及材料。為便捷起見，在此收集本文說明書、實例及隨附申請專利範圍中所採用之某些術語。
除非另外陳述或自上下文暗示，否則以下術語及片語包括下文所提供之含義。除非另外明確陳述或自上下文顯而易見，否則下文術語及片語不排除其所屬領域中獲取之術語或片語的含義。提供定義以幫助闡述特定實施例，且並不意欲限制所主張之發明，此乃因本發明之範圍僅由申請專利範圍限制。除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之含義。
在參考圖中圖解說明例示性實施例。意欲將本文所揭示之實施例及圖視為說明性的而非限制性的。
圖1係含有由P2A及T2A序列連接之三個基因之核酸構築體之示意圖：(a) 與TCR α鏈之恆定區融合之人類抗E6 TCR之α鏈之可變區；(b) 與TCR β鏈之恆定區融合之同一人類抗E6 TCR之β鏈之可變區；(c) 抗PD-1抗體之重鏈及輕鏈之可變區，其以GS連接體連接。
圖2顯示抗PD1抗體序列(c)之CDR序列。
圖3顯示源自本發明之經改造T細胞之細胞培養上清液中所分泌抗PD-1 scFv之活體外表現。
圖4顯示抗E6 TCR在本發明之經改造人類T細胞上之活體外表現。
圖5顯示所分泌之抗PD-1 scFv對細胞表面上過表現之PD-1之結合活性。
圖6顯示所分泌之抗PD-1 scFv相對於rhPD-L1與在細胞表面上過表現之PD-1之競爭性結合活性。
圖7顯示所分泌之抗PD-1 scFv對PD-L1介導之抑制IFNγ產生之效應。
圖8顯示在抗原專一性刺激後，所分泌之抗PD-1 scFv對TCR-T細胞之IFNγ產生之效應。
圖9顯示TCR-T細胞針對靶細胞之細胞毒性。
圖10顯示在抗原專一性刺激後TCR-T細胞之增殖。
圖11顯示在抗原專一性刺激後各種TCR-T細胞上之PD-1表現。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (24)

  1. 一種經改造T細胞，其包含： 編碼以下之核酸： (a) 專一性地結合至來自HPV之抗原的經遺傳改造之抗原受體；及 (b) 降低腫瘤中抑制性受體之功能或表現之抑制性蛋白質。
  2. 如請求項1之經改造T細胞，其中該抗原包含E6或E7。
  3. 如請求項1之經改造T細胞，其中腫瘤靶標包含PD-1中之一或多者。
  4. 如請求項3之經改造T細胞，其中該抑制性蛋白質係抗PD1抗體。
  5. 如請求項4之經改造T細胞，其中該抗PD1抗體係單鏈抗體。
  6. 如請求項5之經改造T細胞，其中該抗PD1抗體包含基序(motif)序列1) GYTFTNYY之重鏈CDR1、INPSNGGT之CDR2及TRRDYNYDGGFDY之CDR3；2) KSVSTSGFN之輕鏈CDR1、LAS之CDR2及QHGRELPLT之CDR3。
  7. 如請求項1至6中任一項之經改造T細胞，其中該抑制性核酸分子包含與PD1編碼核酸互補之序列。
  8. 如請求項1至6中任一項之經改造T細胞，其中該抑制性核酸分子包含與PD1編碼核酸互補之反義寡核苷酸。
  9. 如請求項1至6中任一項之經改造T細胞，其中該抑制性蛋白質或抗體係組成地表現。
  10. 如請求項9之經改造T細胞，其中該抑制性蛋白質係組成表現之抗體PD1。
  11. 一種核酸，其包含(a) 編碼專一性地結合至來自HPV之抗原的經遺傳改造之抗原受體之核酸；及(b) 降低腫瘤中抑制性受體之表現之抑制性核酸分子。
  12. 如請求項11之核酸，其中該抗原受體係HPV之E6。
  13. 如請求項12之核酸，其中腫瘤靶標係PD1。
  14. 一種多肽，其係由如請求項11至13中任一項之核酸編碼。
  15. 一種載體，其包含如請求項11至13中任一項之核酸。
  16. 如請求項15之載體，其中載體係反轉錄病毒載體。
  17. 一種產生經遺傳改造之T細胞之方法，其包含將載體引入至包含T細胞之細胞群體中，該載體包含a) 編碼專一性地結合至第一抗原之經遺傳改造抗原受體之核酸，其中該第一抗原受體專一性地靶向HPV之E6受體，以及(b) 編碼在一或多種條件下培育時能夠導致該群體中T細胞中之PD-1或PD-L1表現降低及/或抑制PD-1或PD-L1上調的抑制性蛋白質之核酸分子。
  18. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之經改造T細胞及醫藥上可接受之載劑。
  19. 一種如請求項18之醫藥組合物之用途，其用於製備用於治療有需要個體之癌症之藥劑，其中向該個體投與治療有效量之該醫藥組合物。
  20. 如請求項19之用途，其中該癌症係子宮頸癌或頭頸癌。
  21. 如請求項20之用途，其中進一步向該個體投與治療有效量之包含化學療法或輻射之現有療法。
  22. 如請求項21之用途，其中該醫藥組合物及該現有療法係依序或同時投與。
  23. 如請求項1之經改造T細胞，其中該腫瘤包含淋巴球或腫瘤浸潤性淋巴球。
  24. 如請求項11之核酸，其中該腫瘤包含淋巴球或腫瘤浸潤性淋巴球。
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