KR20210087015A - Hpv e6 특이성 및 pd-1 차단을 보유한 이중 기능 조작된 t 세포 - Google Patents

Hpv e6 특이성 및 pd-1 차단을 보유한 이중 기능 조작된 t 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 조작된 세포 및 이의 조성물, 특히, 유전자 조작된 T 세포 수용체 (TCRs) 및 체크포인트 억제제 (CPIs)를 포함하는 T 세포에 관한 것이다. 암을 치료하기 위한 이러한 조성물의 사용 방법 또한 본원에 개시되어 있다. 유전자 조작된 T 세포는 종양 항원 HPV E6을 인식하고 동시에 세포 예정사 단백질 1 (PD-1)을 차단하는 단일-사슬 항체를 분비한다. 또한 HPV E6 발현 관련 암을 위한 면역요법제가 제공된다.

Description

HPV E6 특이성 및 PD-1 차단을 보유한 이중 기능 조작된 T 세포
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 11일 출원된 미국 가 특허출원 제 62/717,787, 및 2018년 9월 14일 출원된 미국 가 특허출원 제 62/731,329호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 모두의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 조작된 세포 및 이의 조성물, 특히, 유전자 조작된 T 세포 수용체 (TCRs) 및 체크포인트 억제제 (CPIs)를 포함하는 T 세포에 관한 것이다. 암을 치료하기 위한 이러한 조성물의 사용 방법 또한 본원에 개시되어 있다.
발명의 배경
본 명세서의 모든 간행물은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다. 하기 설명은 본 발명을 이해함에 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본 출원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술임을 또는 본 출원에 청구된 발명과 관련되어 있음을, 또는 구체적으로 또는 명시적으로 인용된 임의의 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
일부 암 유형들, 가령, 예를 들어, 자궁 경부암의 주요 원인은 인간 유두종 바이러스 (HPV) 감염이다. 치료, 가령, 화학요법에 있어서의 진보에도 불구하고, HPV 관련 암들을 비롯한 많은 암들의 예후는 좋지 않을 수 있다. 따라서 암, 특히, HPV-관련 암에 대한 또 다른 치료법에 대하여 충족되지 않은 수요가 존재한다.
HPV16은 악성 종양과 가장 일반적으로 연관되는 HPV의 하위유형이다. 특정 이론이나 메커니즘에 얽매이지 않고 HPV16은 세포 주기 제어를 탈조절하는 종양-단백질 E6의 작용을 통해 적어도 부분적으로 암을 유발하는 것으로 여겨진다. HPV16 E6은 암세포에서 항시적으로 발현되며 감염되지 않은 정상 조직에서는 발현되지 않는다. HPV16E6는 자궁 경부암, 구강인두암, 항문암, 항문관암, 항문직장암, 질암, 외음부암 및 음경암을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 인간 암에서 발현된다.
T 세포 수용체는 HPV16 E6 단백질에 대한 항원 특이성을 가질 수 있다. 암에 대한 면역 요법의 한 양상인 입양 세포 전이 (ACT)는 혈액 악성종양 및 악성 흑색종을 치료하는데 놀라운 성공을 거두었다. CD19 및 GD2와 같은 종양-관련 항원 (TAA)을 특이적으로 표적하기 위해 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 유전자-변형 T 세포를 사용하는 특히 효과적인 형태의 ACT는 B 세포 악성종양 및 신경 모세포종과 같은 질환을 치료하기 위한 임상 시험에서 고무적인 결과를 보여주었다.
자연적으로 발생하는 T 세포 수용체 (TCR)와 달리 CAR은 세포내 T 세포 신호전달 및 공동자극 도메인들과 융합된 세포외 항원 인식 도메인으로 구성된 인공 수용체이다. CAR은 주조직 적합 클래스 (MHC)-독립 방식으로 세포 표면 TAA들을 직접 선택적으로 인식 할 수 있다. 혈액 악성종양 환자에서 CAR T 세포 요법의 성공에 관한 기록이 있음에도 불구하고 고형 종양에서는 보통의 반응들만이 관찰되었다. 이것은 부분적으로 고형 종양에서 면역억제 미세환경의 확립으로 인한 것일 수 있다. 이러한 환경은 종양 내의 동족 리간드들과 반응하는 T 세포에서 억제성 수용체 (IR)의 발현 증가에 의해 매개되는 여러 고유 억제성 경로들의 상향조절을 포함한다.
지금까지 여러 IR, 가령, CTLA-4, T 세포 Ig 뮤신-3 (TIM-3), 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) 및 예정사-1 (PD-1)이 T 세포에서 특성화되었다. 이러한 분자는 만성 질환 및 암에서 T 세포의 지속적인 활성화에 따라 상향조절되며, T 세포 기능장애 및 피로를 촉진하여, 종양을 면역 감시에서 벗어나게 한다. 다른 IR과 달리 PD-1은 T 세포 활성화 직후 상향조절되며, 이는 차례로 이의 두 리간드, PD-L1 또는 PD-L2와 상호작용하여 T 세포 효과기 기능을 억제한다. PD-L1은 T 세포, B 세포, 대식세포 및 수지상 세포 (DC)에서 항시적으로 발현된다. 이는 또한 다양한 고형 종양에서 풍부하게 발현되는 것으로 나타났다. 대조적으로, 정상 조직에서 PD-L1의 발현은 검출되지 않는다. 면역 억제에 중요한 역할을 하는 PD-1은 T 세포에 대한 부정적인 영향을 중화시키고 항종양 반응을 향상시키는 것을 목표로 하는 최근 연구의 초점이 되어 왔다. 임상 연구에 따르면 PD-1 차단은 결장암, 신장암 및 폐암 및 흑색종에서 종양 퇴행을 유의하게 향상시켰다.
발명의 요약
본 발명은 다음을 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다:
HPV의 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 인코드하는 핵산; 및
종양, 가령, 종양-침윤 림프구에서 억제성 수용체 (IRs)의 발현 기능을 감소시키는, 또는 이러한 발현 감소를 구현할 수 있는 억제성 단백질. 이러한 조작된 T 세포는 더 강력한 항-종양 반응과 감소된 T 세포 고갈을 보여준다.
본 발명의 한 양상에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체이고 억제성 단백질은 세포 예정사 단백질 1 (PD-1)을 차단하며, 이 때 단백질은 단일 사슬 항체 (scFv)이다.
본 발명의 항-PD-1 scFv 항체는 다음 모티프 서열들을 포함한다: 서열 번호 1에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR2; 서열 번호 3에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR3; 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열 번호 5에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열 번호 6에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR3.
본 발명의 한 양상에서, 억제성 핵산 분자는 PD1-인코딩 핵산에 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명의 한 양상에서, 억제성 핵산 분자는 PD1-인코딩 핵산에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 한 양상에서, 억제성 단백질 또는 항-PD-1 scFv는 항시적으로 발현된다.
본 발명의 한 양상에서, 항원은 HPV E6 또는 E7이다.
본 발명은 (a) HPV의 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 인코드하는 핵산; 및 (b) 종양 표적 발현을 감소시키는, 또는 이러한 발현 감소를 구현할 수 있는 억제성 핵산 분자를 포함하는 핵산을 추가로 제공한다. 한 양상에서, 항원은 HPV E6 또는 E7이다.
본 발명의 한 양상에서, 억제성 단백질은 세포 예정사 단백질 1 (PD-1)을 차단하며, 이 때 단백질은 단일 사슬 항체 (scFv)이다.
상기 항-PD-1 scFv 항체는 다음 모티프 서열들을 포함한다: 서열 번호 1에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR2; 서열 번호 3에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR3; 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열 번호 5에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열 번호 6에 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR3.
본 발명은 (a) HPV의 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 인코드하는 핵산; 및 (b) 종양에서 억제성 수용체의 발현을 감소시키는 단백질을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 제공하며, 이 때 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스 벡터이다. 상기 종양은 림프구 또는 종양-침윤된 림프구를 추가로 포함한다. 종양-침윤된 림프구는 억제성 수용체를 포함한다.
본 발명의 한 양상에서, 유전자 조작 T 세포의 제조 방법이 제공되며, 이 때 이 방법은 T 세포를 포함하는 세포들의 모집단에 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, 이러한 벡터는 (a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 인코드하는 핵산, (b) 하나 이상의 조건하에서 배양시 모집단의 T 세포에서 PD-1 또는 PD-L1의 발현을 감소 및/또는 PD-1 또는 PD-L1의 상향조절을 억제할 수 있는 억제성 단백질을 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 1 조작된 항원 수용체는 HPV의 E6 수용체를 특이적으로 표적한다.
본 발명의 한 양상에서, 상기 언급된 조작된 T 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 또한, 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법 또한 제공되며, 이 때 암은 자궁경부암 또는 두경부암이다.
도면의 간단한 설명
예시적 구체예들이 참고 도면에 도시되어 있다. 본 출원에 개시된 구체예 및 도면들은 제한을 위한 것이 아닌 설면을 위한 것으로 간주되어야 한다.
도 1은 P2A 및 T2A 서열에 의해 연결되는 3개 유전자들을 내포하는 핵산 구조체를 도식적으로 표현한다: (a) TCR 알파 사슬의 불변 영역에 융합된 인간 항-E6 TCR의 알파 사슬의 가변 영역; (b) TCR 베타 사슬의 불변 영역에 융합된 동일한 인간 항-E6 TCR의 베타 사슬의 가변 영역; (c) GS 링커(linker)로 연결된 항-PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들.
도 2는 항-PD1 항체 서열 (c)의 CDR 서열들을 보여준다.
도 3은 본 발명의 조작된 T 세포들로부터 유래한 세포 배양 상청액에서 분비된 항-PD-1 scFv의 시험관내 발현을 보여준다.
도 4는 본 발명의 조작된 인간 T 세포에서 항-E6 TCR의 시험관내 발현을 보여준다.
도 5는 세포 표면에서 과발현된 PD-1에 대한, 분비된 항-PD-1의 결합 활성을 보여준다.
도 6은 세포 표면에서 과발현된 PD-1에 대한, rhPD- L1에 대해 분비된 항-PD-1 scFv의 결합 활성을 보여준다.
도 7은 PD-L1-매개된 IFNγ생성 억제에 대한, 분비된 항-PD-1 scFv의 효과를 보여준다.
도 8은 항원-특이적 자극시 TCR-T 세포들의 IFNγ생성에 대한 분비된 항-PD-1 scFv의 효과를 보여준다.
도 9는 표적 세포들에 대한 TCR-T 세포들의 세포독성을 보여준다.
도 10은 항원-특이적 자극시 TCR-T 세포들의 증식을 보여준다.
도 11은 항원-특이적 자극시 다양한 TCR-T 세포들에서 PD-1의 발현을 보여준다.
발명의 상세한 설명
다음의 구체예들 및 이들의 양상들을 시스템, 조성물 및 방법들과 관련하여 설명 및 예시하며, 이들은 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 예시 및 설명을 위한 것이다.
정의
본 출원에서 사용되는 용어 “포함하는” 또는 “포함하다”는 구체예예 유용한 조성물들, 방법들, 및 이의 각각의 구성(들)을 언급함에 사용되지만, 유용하든 그렇지 않든 간에 명시되지 않은 요소들을 포함하는 것에 개방되어 있다. 당업자는, 본 명세서에서 사용되는 용어들이 일반적으로 “개방” 용어들을 의도함을 당업자는 이해할 것이다 (예컨대, 용어 “~을 포함하는”은 “~을 포함하지만 이에 제한되지 않는”으로 해석되어야 하고, 용어 “~을 가지는”은 “적어도 ~을 가지는”으로 해석되어야 하며, 용어 “~을 포함하다”는 “~을 포함하지만 이에 제한되지 않는”으로 해석되어야 하는 등).
달리 언급이 없는 한, 본 출원의 특정 구체예를 설명하는 내용에서 (특히 청구항들에 관한 내용에서)사용되는 용어 “하나(a, an)” 및 “그것” 그리고 이와 유사한 지칭들은 단수 및 복수형 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 출원에서 수치 범위의 언급은 해당 범위에 속하는 각각의 별도 수치를 개별적으로 언급하는 간단한 기재 방법으로 제공하고자 하는 것에 불과하다. 본 출원에 달리 언급이 없는 한, 각각의 개개의 값은 마치 본 출원에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 출원에 달리 언급이 없는 한 또는 내용상 달리 명확하게 반대의 언급이 없는 한, 본 출원에 기재된 모든 방법들은 임의의 적합한 순서로 실시될 수 있다. 본 출원의 특정 구체예들과 관련하여 제공되는 임의의 그리고 모든 예시들, 그리고 예시적인 언어 (예컨대, “가령”)의 사용은 본 출원을 보다 잘 설명하기 위한 것이며 청구범위에 기재된 출원발명의 범위를 달리 제한하고자 하는 것이 아니다. 약어 “예컨대”는 라틴어 예문에서 유래한 것이며, 비-제한적 예들을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 그러므로, 약어 “예컨대”는 용어 “예를 들어”의 유의어이다. 명세서의 어떠한 언어도 본원발명의 실시에 필수적인 비-청구범위 기재 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에서 사용되는 용어 “약”은 양, 지속 시간 등과 같은 측정가능한 값을 의미하며 지정된 값에서 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5% 또는 ±0.1%의 변동을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “항체”는 무손상 면역글로불린 또는 Fc (결정화가능한 단편) 영역 또는 본원에서 “Fc 단편” 또는 “Fc 도메인”으로 지칭되는 Fc 영역의 FcRn 결합 단편을 보유한 단클론 또는 다클론 항원-결합 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편들은 재조합 DNA 기술 또는 무손상 항체들의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 항원-결합 단편은, 즉, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-사슬 항체 (scFv), 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 디아바디 및 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 내포하는 폴리펩티드를 포함한다. Fc 도메인은 항체 중 2 또는 3개 분류에 기여하는 2개의 중쇄 부분을 포함한다. Fc 도메인은 재조합 DNA 기술 또는 무손상 항체들의 효소적 (예컨대, 파파인 절단) 또는 화학적 절단을 통해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “항체 단편”은, 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하여 항원에 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 일부만을 포함하는 단백질 단편을 지칭한다. 본 발명의 정의에 포함되는 항체 단편들의 예들은 다음을 포함한다: (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인들을 보유하는 Fab 단편; (ii) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 가지는 Fab 단편인, Fab' 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 가지는 Fd 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인 및 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 가지는 Fd' 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 가지는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward 외, Nature 341, 544-546 (1989)); (vii) 분리된 CDR 영역들; (viii) 힌지 영역에서 다이설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편들을 포함하는 이가 단편인, F(ab')2 단편; (ix) 단일 사슬 항체 분자 (예컨대, 단일 사슬 Fv; scFv) (Bird 외, Science 242:423-426 (1988); 및 Huston 외, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) 동일한 폴리펩티드 사슬에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위들을 가지는 “디아바디” (예컨대, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); (xi) 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역들을 형성하는, 한 쌍의 탠덤 Fd 세그먼트들 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 “선형 항체” (Zapata 외 Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); 및 미국 특허 제 5,641,870).
본원에 사용된 “단일 사슬 가변 단편”, “단일 사슬 항체 가변 단편”또는 “scFv”항체는 링커 펩티드에 의해 연결된 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역만을 포함하는 항체의 형태를 의미한다. scFv는 단일 사슬 폴리펩티드로 발현 될 수 있다. scFv는 그것이 유래된 무손상 항체의 특이성을 유지한다. 경쇄 및 중쇄는 표적 항원에 대한 scFv의 특이성이 유지되는 한 임의의 순서, 예를 들어 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 일 수 있다.
본원에 사용된 용어 “항원”은 MHC 분자에 의해 제공되는 경우 항체 또는 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 결합 될 수 있는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 “항원”은 또한 T-세포 수용체에 의해 인식되는 T-세포 에피토프를 포함한다. 이 인식은 T 세포의 활성화 및 후속 효과기 메커니즘, 가령, T 세포의 증식, 사이토카인 분비 등을 유발한다. 항원은 추가적으로 면역계에 의해 인식될 수 있고 및/또는 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있으며, 이는 B-림프구 및/또는 T-림프구의 활성화를 가져온다.
본원에서 사용되는 용어 “HPV 항원”은 인간 유두종 바이러스 (HPV)로부터 유래한 폴리펩티드 분자를 지칭하며, 바람직하게는 HPV는 HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV6, HPV10, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV33, HPV34, HPV35, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV45, HPV49, HPV51, HPV52, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV68, HPV69에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, HPV는 고 위험 HPV, 예를 들어, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV69에서 선택된다. HPV 폴리펩티드 분자는 E6 및 E7에서 선택된다.
본원에 사용된 용어 “말초 혈액 세포 하위유형”은 호산구, 호중구, T 세포, 단핵구, K 세포, 과립구 및 B 세포를 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 말초 혈액에서 일반적으로 발견되는 세포 유형을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “T 세포”는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 용어 T 세포는 또한 T 헬퍼 1형 T 세포 및 T 헬퍼 2형 T 세포 둘 모두를 포함한다. T 세포는 표적 세포의 표면에 있는 특정 항원성 모이어티를 인식하는 세포 표면 수용체를 발현한다. 세포 표면 수용체는 야생형 또는 재조합 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 표적 세포와 관련된 항원성 모이어티를 인식 할 수 있는 임의의 다른 표면 수용체 일 수 있다. 일반적으로 TCR에는 두 개의 단백질 사슬 (알파 및 베타 사슬)이 있으며, 이는 특정 세포 표면에서 MHC 단백질에 의해 제시되는 특정 펩티드와 결합한다. TCR은 표적 세포의 표면에서 발현된 MHC 분자와 관련된 펩티드를 인식한다. TCR은 또한 암세포 표면에서 직접적으로 제시되는 암 항원을 인식한다.
본원에 사용된 “유전자 변형된 세포”, “재지시된 세포”, “조작된 세포”, “유전자 조작된 세포” 또는 “변형된 세포”는 유전적으로 조작된 항원 수용체 및 체크포인트 억제제를 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 구체예에서, 유전자 변형된 세포는 유전자 조작된 TCR을 인코드하는 벡터 및 하나 이상의 체크포인트 억제제를 인코드하는 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전자 변형된 세포는 유전자 조작된 TCR을 인코드하는 벡터 및 하나 이상의 체크포인트 억제제를 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 T 세포는 T-림프구 세포 (T-세포)이다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 T 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다.
본원에 사용된 용어 “유전자 조작된”또는 “유전자 변형된”은 코딩 또는 비-코딩 영역 또는 이의 일부를 결실시키거나 코딩 영역 또는 이의 일부를 삽입하는 것을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 세포의 핵산 서열의 변형을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 “벡터”, “클로닝 벡터” 및 “발현 벡터”는, 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 외부 유전자)을 숙주 세포에 도입시켜, 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현 (예컨대, 전사 및 번역)을 촉진시킬 수 있는 운반체를 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 등을 포함한다. 가장 널리 사용되는 유형의 벡터는 “플라스미드”로서, 이는 관심 유전자를 포함하는 또 다른 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 폐쇄형 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 수송될 핵산 구조체는 바이러스 게놈에 결찰된다. 바이러스 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자기 복제가 가능하거나 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제 될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시 할 수 있다. 이러한 벡터를 본 명세서에서 “재조합 발현 벡터” 또는 간단히 “발현 벡터”라고 지칭한다. 본 발명은 균등한 기능을 제공하는 이러한 다른 형태의 발현 벡터들, 가령, 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하고자 하는 것을 알 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “레트로바이러스 벡터” 및 “재조합 레트로바이러스 벡터”는 관심 핵산 분자를 운반하는, 그리고, 특정 구체예들에서는, 관심 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 핵산 구조체를 지칭한다. 레트로 바이러스는 이의 바이러스 캡슐에서 RNA 형태로 존재하며 숙주 세포에서 복제 될 때 이중 가닥 DNA 중간체를 형성한다. 유사하게, 레트로바이러스 벡터는 RNA 및 이중 가닥 DNA 형태 모두에 존재하며, 두 형태 모두 “레트로바이러스 벡터”및 “재조합 레트로바이러스 벡터”라는 용어에 포함된다. 용어 “레트로바이러스 벡터” 및 “재조합 레트로바이러스 벡터”는 또한 재조합 DNA 단편을 포함하는 DNA 형태 및 재조합 RNA 단편을 포함하는 RNA 형태를 포함한다. 벡터는 적어도 하나의 전사 프로모터/인핸서, 또는 유전자 발현을 제어하는 다른 요소들을 포함 할 수 있다. 이러한 벡터는 또한 패키징 신호, 긴 말단 반복부 (LTR) 또는 이의 일부, 사용되는 레트로바이러스에 적합한 양성 및 음성 가닥 프라이머 결합 부위(이들이 레트로 바이러스 벡터에 아직 존재하지 않는 경우)를 포함 할 수 있다. 선택적으로, 벡터는 또한 폴리아데닐화를 지시하는 신호, 선택가능한 마커, 가령, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, TK, 하이그로마이신 내성, 플레오마이신 내성 히스티디놀 내성 또는 DHFR, 뿐만 아니라 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 벡터는 5' LTR, 리딩 서열, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제 2 가닥 DNA 합성의 원점 및 3' LTR 또는 이의 일부를 포함 할 수 있다.
본원에 사용된 “링커” (L) 또는 “링커 도메인” 또는 “링커 영역”은 약 1 내지 100개 아미노산 길이의 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 지칭하며, 본 발명의 CAR의 임의의 도메인들/영역들을 함께 연결한다. 링커들은 글리신 및 세린과 같은 가요성 잔기들로 구성될 수 있으며, 그리하여 인접한 단백질 도메인들은 또 다른 도메인에 대해 자유롭게 이동한다. 두 개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 하는 것이 바람직한 경우 더 긴 링커를 사용할 수 있다. 링커들은 절단가능하거나 절단불가능할 수 있다. 절단가능한 링커의 예는 2A 링커 (예를 들어 T2A), 2A-유사 링커 또는 이들의 기능적 균등물 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 피코나비랄 2A-유사 링커, 돼지 테초바이러스 (P2A)의 CHYSEL 서열, 토세아 아사인아 바이러스 (T2A) 또는 이들의 조합, 변이체 및 기능적 균등물을 포함한다. 다른 구체예들에서, 링커 서열들은 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-Pro(2B)모티프를 포함할 수 있으며, 이는 2A 글리신과 2B 프롤린 사이를 절단시킨다. 다른 링커는 당업자에게 자명 할 것이며 본 발명의 다른 구체예와 관련하여 사용될 수 있다.
용어 “약학 제제 (pharmaceutical formulation)”란 이 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 제형이 투여되는 대상자에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
약학적으로 허용되는 담체는 활성 성분 이외에 약학 제제 안에 있는 성분을 지칭하며, 대상체에 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제다.
본원에 사용된 “대상체”는 포유동물, 가령, 인간 또는 다른 동물이고 전형적으로 인간이다. 일부 구체예에서, 세포, 세포 모집단 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예를 들어, 환자는 포유동물, 전형적으로 영장류, 가령, 인간이다. 일부 구체예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성 일 수 있으며 유아, 어린이, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함한 임의의 적절한 연령 일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 비 영장류 포유동물, 가령, 설치류이다.
용어 “대조군”은 테스트 샘플에서 발현 생성물과의 비교를 제공하기에 적합한 임의의 참조 표준을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 “억제하다”는 예를 들어 특정 작용, 기능 또는 상호작용의 임의의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 생물학적 기능, 가령, 단백질의 기능 및/또는 하나의 단백질의 또 다른 단백질에 대한 결합은, 참조 상태, 가령, 야생형 상태 또는 적용되는 제제가 없는 상태와 같은 대조에 비해 이것이 감소되는 경우 억제된다. 예를 들어, PD-1 단백질의 하나 이상의 리간드, 가령, PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합 및/또는 생성된 PD-1 신호전달 및 면역 효과는, 이러한 결합, 신호전달, 및 다른 면역 효과들이 제제, 가령, 항-PD-1 항체와 접촉으로 인해 감소되는 경우, PD-1 단백질이 이러한 제제와 접촉되지 않는 경우에 비해, 억제 또는 결핍된다. 이러한 억제 또는 결핍은, 가령, 특정 시간 및/또는 장소에서 제제를 적용함에 의해 유도될 수 있으며, 또는 가령, 연속 투여에 의해 항시적 일 수 있다. 그러한 억제 또는 결핍은 또한 부분적이거나 완전 할 수 있다 (예를 들어, 참조 상태, 가령, 야생형 상태와 같은 대조군과 비교하여 본질적으로 측정가능한 활성이 없음). 본질적으로 완전한 억제 또는 결핍을 차단이라 지칭한다.
본원에서 사용되는 “병태” 및 “질환 병태”는 암, 종양 또는 감염 질환을 포함할 수 있다. 예시적 구체예들에서, 병태는 임의의 형태의 악성 신생물 세포 증식성 장애 또는 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적 구체예들에서, 질환은 신장 암, 흑색 종, 전립선 암, 유방암, 교 모세포종, 폐암, 결장암 또는 방광암 중 하나 이상을 포함한다.
용어 “암” 및 “암성”은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 조건을 지칭하거나 또는 이를 기술한다. 용어 암은 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계와 관계없이, 모든 유형의 암 성장 또는 종양형성 과정들, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포들, 조직, 또는 장기를 포함하는 의미이다. 고형 종양의 예들에는 악성 종양, 예컨대, 육종, 선암종, 및 다양한 장기 시스템들의 암종, 가령, 간, 폐, 유방, 림프구, 위장관 (예컨대, 결장), 비뇨생식관 (예컨대, 신장, 요로상피 세포들), 전립선 및 인두에 영향을 주는 암종이 포함된다. 선암종에는 악성 종양, 가령, 대부분의 결장 암, 직장암, 신장-세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암이 포함된다. 한 구체예에서, 상기 암은 흑색종, 예컨대, 진행 단계 흑색종이다. 전술한 암들의 전이성 병변들은 또한 본 발명의 방법들 및 조성물들을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다. 치료될 수 있는 다른 암들의 예들에는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 자궁관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 음문의 암종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프구 백혈병을 비롯한 만성 또는 급성 백혈병, 소아기의 고형 종양, 림프구 림프종, 방광의 암, 콩팥 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 축 종양, 뇌줄기 신경아교종, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피유사낭 암, 편평 세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도되는 암을 비롯한 환경적으로 유도되는 암, 및 상기 암들의 조합이 포함된다. 전이성 암, 예컨대, PD-L1을 발현하는 전이성 암 (Iwai 외 (2005) Int. Immunol. 17:133-144)은 본원에 기재된 항체 분자를 사용하여 치료될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “치료하다”, “치료”, “치료하는” 또는 “개선”은 치료적 치료를 지칭하며, 이 때 목적은 질환 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전, 완화, 개선, 억제, 감속 또는 중단하는 것이다. 용어 “치료하는”은 암과 같은 상태, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상의 감소 또는 완화를 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상이나 임상 마커가 감소하는 경우 “유효”하다. 택일적으로, 치료는 질환의 진행이 감소 또는 중단되는 경우 “유효”하다. 즉, “치료”는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라 적어도, 치료가 없을 때 예상되는 증상의 진행을 늦추거나 악화시키는 것을 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과들에는 하나 이상의 증상들의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 저하, 질환 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도 (부분적이든 또는 전체적이든), 검출가능한지 또는 검출불가능한지 여부가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질환의 “치료”라는 용어는 또한 질환의 증상 또는 부작용의 경감을 제공하는 것을 포함한다 (완화 치료 포함). 일부 구체예에서, 암 치료는 종양 부피 감소, 암 세포 수 감소, 암 전이 억제, 기대 수명 증가, 암 세포 증식 감소, 암 세포 생존 감소, 또는 암 상태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함한다.
본원에서 사용되는, “질환의 발달 지연”은 질환 (예컨대 암)의 진행을 보류, 방해, 지체, 저지, 안정화, 억제 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질환의 이력 및/또는 치료받는 개체에 따라 시간의 길이가 다양할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은, 사실상, 개체에서 질환이 발병하지 않는다는 점에서, 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대 전이의 발병이 지연될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “예방”은 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환으로 진단되지 않은 대상체에서 질환의 발생 또는 재발과 관련하여 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제공된 세포 및 조성물은 질환 또는 질환의 발달을 지연 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 이용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 기능 또는 활성을 “억제”하는 것은 관심 조건 또는 파라미터를 제외하고 다른 동일한 조건과 비교할 때 또는 대안적으로 다른 조건과 비교할 때 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는 이러한 세포 부재시의 종양의 성장 속도에 비해 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
투여에 관한 내용에서, 제제, 가령, 약학 제제, 세포, 또는 조성물의 “유효량(effective amount)”이란 필요한 결과, 가령, 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량/양 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
제제, 예컨대, 약학 제제 또는 세포의 “치료적 유효량”은 원하는 치료 결과, 가령, 질환, 병태, 또는 장애의 치료, 및/또는 이러한 치료의 약동학적 또는 약력학적 효과를 구현하는데 필요한 용량으로 그리고 시기 동안 효과적인 양을 지칭한다. 이러한 치료적 유효량은 요인들, 가령, 대상체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 투여되는 세포의 모집단에 따라 달라질 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 세포 및/또는 조성물을 유효량, 예를 들어, 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
“예방적 유효량”이란 원하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 그러나, 반드시 그런 것은 아니지만, 예방적 투여량(dose)은 질환 전 또는 초기 단계에 이용되기 때문에, 예방적으로 효과적인 양은 치료요법적으로 효과적인 양보다 적을 것이다. 낮은 종양 부담과 관련하여, 일부 양상에서 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 높을 것이다.
본원에 기재된 다양한 구체예에 따라, 본 발명은 조작된 세포 및 조작된 세포를 함유하는 조성물/제제를 제공한다. 본 발명은 또한 병리학적 질환 또는 병태를 가진 환자를 치료하는데 유용 할 수 있는 조작된 세포를 제조하는 방법 또는 공정을 제공한다.
또한, 본원에 기재된 다양한 구체예에 따르면, 본 발명은 병리학적 질환 또는 병태의 치료에 사용될 수 있는 세포를 유전자 변형하는데 적합한 핵산 구조체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본원에 기재된 다양한 구체예에 따르면, 본 발명은 병리학적 질환 또는 병태의 치료에 사용될 수 있는 세포를 유전자 변형하는데 적합한 핵산 구조체를 포함하는 조작된 세포를 제공하며, 이 때 핵산은 다음을 인코드한다: (a) 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체; 및 (b)종양 표적의 발현을 감소, 또는 종양 표적의 발현 감소를 구현할 수 있는 억제성 단백질. 다양한 구체예에서, 세포는 유전자 조작된 항원 수용체 및 억제성 단백질을 발현한다. 다양한 구체예에서, 억제성 단백질은 항시적으로 발현된다.
제공된 세포, 조성물, 방법 및 용도로 치료하기 위한 질환, 병태, 및 장애들에는, 고형 종양, 혈액 악성종양 및 흑색종을 포함한 종양, 및 감염성 질환, 가령, 바이러스 또는 기타 병원체 (예컨대, HPV, HIV, HCV, HBV, EBV, HTLV-1, CMV, 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스, HHV-8, MCV 또는 기타 병원체), 및 기생충 질환이 있다. 일부 구체예에서, 질환 또는 병태는 종양, 암, 악성종양, 신생물 또는 기타 증식성 질환 또는 장애이다. 이러한 질환은 백혈병, 림프종, 예를 들어 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 여포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 저위험군 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 자궁경부암, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종, 뼈암, 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁경부암종, 결장직장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 골육종, 활액 육종 및/또는 중피종을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
조작된 세포
다양한 구체예에서, 조작된 세포는 박테리아, 진균, 인간, 쥐, 마우스, 토끼, 원숭이, 돼지 또는 임의의 다른 종으로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는, 세포는 인간, 랫트 또는 마우스로부터 얻는다. 보다 바람직하게는 세포는 인간으로부터 얻는다. 다양한 구체예에서, 조작된 세포는 혈액 세포이다. 바람직하게는, 세포는 백혈구, 림프구 또는 임의의 다른 적합한 혈액 세포 유형이다. 바람직하게는, 세포는 말초 혈액 세포이다. 보다 바람직하게는 세포는 T 세포, B 세포 또는 NK 세포이다.
바람직한 구체예에서, 세포는 T 세포이다. 본 발명에서 사용되는 T 세포의 예는 환자(들)로부터 분리된 T 세포 (예를 들어, 종양 침윤 림프구)의 시험관내 배양에 의해 수득된 세포; 환자(들)의 말초 혈액으로부터 분리된 T 세포를 바이러스 벡터로 형질도입하여 얻은 TCR 유전자 변형 T 세포; 및 CAR- 형질도입된 T 세포를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, T 세포는 TCR 유전자-변형 세포이다.
본 발명의 한 구체예에서, 세포는 NK 세포이다.
재조합 벡터
임의의 벡터 또는 벡터 유형을 사용하여 유전 물질, 예를 들어 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, BAC, YAC, HAC를 세포에 전달 할 수 있다. 따라서, 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 벡터, 거품 바이러스 벡터, 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터, 하이브리드 벡터 및/또는 플라스미드 트랜스포존 (예를 들어 수면 미용 트랜스포존 시스템) 또는 통합 기반 벡터 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 대안적인 구체예와 관련하여 사용될 수 있는 다른 벡터는 당업자에게 명백 할 것이다.
바람직한 구체예들에서, 사용되는 벡터는 재조합 레트로바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 제조에 특화된 배양 배지에서 성장할 수 있다. 바이러스 벡터를 성장시키기 위한 임의의 적합한 성장 배지 및/또는 보충제가 본원에 기재된 구체예에 따라 사용될 수 있다.
유전자 조작된 항원 수용체
유전자 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR), 킬러-세포 면역글로불린 유사 수용체 패밀리 (KIR), C-형 렉틴 수용체 패밀리, 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 패밀리 (LILR), 1형 사이토카인 수용체, 2형 사이토카인 수용체 패밀리, 종양 괴사 인자 패밀리, TGFβ수용체 패밀리, 케모카인 수용체, IgSF에서 선택되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구체예에서, 핵산 구조체에 의해 인코드된 유전자 조작된 항원 수용체는 유전자 조작된 NK 세포 수용체이다. 일부 구현예에서, NK 세포 수용체는 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 패밀리 (KIRs)에 속한다. 다른 구체예에서, NK 세포 수용체는 C-형 렉틴 수용체 패밀리에 속한다.
바람직한 구체예들에서, 핵산 구조체에 의해 인코드된 유전자 조작된 항원 수용체는 유전자 조작된 T 세포 수용체 (TCR)이다. 바람직하게는, 이 수용체를 발현하는 T 세포는 αβ-T 세포이다. 다른 구체예에서,이 수용체를 발현하는 T 세포는 γδ-T 세포이다.
표적되는 항원
일부 구체예에서, 질환 또는 장애와 관련된 항원은 HPV, HIV, HCV, HBV, EBV, HTLV-1, CMV, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, HHV-8, MCV 또는 기타 병원체, 고아 티로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메조텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메조텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 암태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2 및 MAGE A3 및/또는 비오티닐화된 분자에 의해 발현되는 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 유전자 조작된 항원 수용체는 인간 유두종 바이러스 (HPV)의 항원에 결합한다. HPV의 하위유형은, HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV6, HPV10, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV33, HPV34, HPV35, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV45, HPV49, HPV51, HPV52, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV68, HPV69에서 선택되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예들에서, 유전자 조작된 항원 수용체에 의해 표적된 HPV의 하위유형은 적어도 하나의 고위험 HPV, 예를 들어, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV69 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)로부터 선택된다.
일부 구체예들에서, HPV 항원은 E1, E2, E3, E4, E6 및 E7, L1 및 L2 단백질에서 선택되나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 항원은 E6 항원이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항원은 E7 항원이다. 보다 바람직한 구체예에서, 항원은 HPV16 E6 항원이다.
따라서, 치료되는 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 병태, 가령, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아 및 원생동물 감염, 면역결핍, 인간 유두종 바이러스 (HPV), 거대 세포 바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스이나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 질환 또는 병태는 바이러스 관련 악성종양, 예를 들어 HPV, HCV, EBV, HIV, HHV-8, HTLV-1, MCV이나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 제공된 조성물, 세포, 방법 및 용도로 치료하기 위한 바이러스 관련 악성종양은 HPV 관련 암이다. 보다 바람직하게는, 제공된 조성물, 세포, 방법은 HPV 관련 암에 의해 유발된 고형 종양의 치료에 사용될 수 있다. 구체적으로, 질환 또는 병태는 HPV 관련 암, 예를 들어, 자궁경부암, 구강인두암, 항문암, 항문관암, 항문직장암, 질암, 외음부암 및 음경암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로, 질환 또는 병태는 HPV 관련 두경부암, HPV 관련 자궁경부암을 포함한다.
체크포인트 억제제
다양한 구체예에서, 조작된 세포는 적어도 하나의 체크포인트 억제제를 발현한다 (CPI). 본 발명의 조작된 세포에 의해 발현되는 억제성 단백질 또는 CPI는 면역 체크포인트를 억제 또는 차단하고, 이 때 면역 체크포인트는 PD-1, PD-L1, PD-L2, 2B4 (CD244), 4-IBB, A2aR, B7.1, B7.2, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BTLA, 부티로필린, CD160, CD48, CTLA4, GITR, gp49B, HHLA2, HVEM, ICOS, ILT-2, ILT-4, KIR 패밀리 수용체, LAG-3, OX-40, PIR-B, SIRP알파 (CD47), TFM-4, TIGIT, TIM-1, TIM-3, TIM-4, VISTA 및 이의 조합으로 구성된 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 그룹에서 선택된다.
바람직한 구체예에서, 억제성 단백질은 PD-1 또는 PD-L1을 차단한다. 다양한 구체예들에서, 억제성 단백질은 항-PD-1 scFv이다. 억제성 단백질은 PD-1 또는 PD-L1의 발현을 감소시키고 및/또는 모집단의 T 세포에서 PD-1 또는 PD-L1의 상향 조절을 억제 할 수 있다. 바람직하게는, 억제성 단백질은 PD-1을 차단한다.
핵산 구조체
도 1을 보면, 다양한 바람직한 구체예들에 따르면, 핵산 구조체는 3개의 서열들을 포함한다. 바람직하게는, 3개의 서열들은 다음을 포함한다: (a) “aE6_Va-Ca”로 식별되는, TCR 알파 사슬의 불변 영역에 융합된 항-E6 TCR의 알파 사슬의 가변 영역, 이 때 aE6_Va는 항-E6 TCR의 알파 사슬의 가변 영역에 해당하며 Ca는 TCR 알파 사슬의 불변 영역에 해당하고; (b) “aE6_Vb-Cb”로 식별되는, TCR 베타 사슬의 불변 영역에 융합된 동일한 항-E6 TCR의 베타 사슬의 가변 영역, 이 때 aE6_Vb는 동일한 인간 항-E6 TCR의 베타 사슬의 가변영역에 해당하며 Cb는 TCR 베타 사슬의 불변 영역에 해당하고; 그리고, (c) “aPD1_VH”로 식별되는 항-PD-1 항체의 중쇄의 가변 영역 및 “aPD1_VL”로 식별되는 항-PD-1 항체의 경쇄의 가변 영역, 이 때 항-PD-1 항체 서열의 중요 영역은 다음을 포함한다: 중쇄 가변 영역의 프레임워크 FR1 영역; 서열 번호:1에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR1; 중쇄 가변 영역의 프레임워크 FR2 영역; 서열 번호:2에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR2; 중쇄 가변 영역의 프레임워크 FR3 영역; 서열 번호:3에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR3; 중쇄 가변 영역의 프레임워크 FR4 영역; 경쇄 가변 영역의 프레임워크 FR1 영역; 서열 번호:4에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR1; 경쇄 가변 영역의 프레임워크 FR2 영역; 서열 번호:5에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR2; 경쇄 가변 영역의 프레임워크 FR3 영역; 서열 번호:6에 제시된 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 경쇄 CDR3; 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 FR4 영역.
다양한 구체예에서, 억제성 단백질을 인코딩하는 억제성 핵산은 PD1-인코딩 핵산에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 억제성 단백질을 인코딩하는 억제성 핵산은 PD1-인코딩 핵산에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
핵산 구조체는 전술한 서열 (a), (b) 및 (c)를 연결하는 P2A 및 T2A 서열을 추가로 포함한다. 또한, 항-PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 (각각 aPD1_VH 및 aPD1_VL로 식별됨)은 GS 링커와 연결되어 있다.
핵산 구조체는 구조체의 형질감염, 형질도입, 통합, 복제, 전사, 번역, 발현 및/또는 안정화를 보조 및/또는 가능하게 할 수 있는 다른 서열을 추가로 포함 할 수 있다.
조작된 세포의 제조 방법
본 발명은 병리학적 질환 또는 병태의 치료를 위해 조작된 세포를 제조하고 사용하는 방법 또는 공정을 제공한다. 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: (I) 환자의 혈액에서 T 세포를 분리하는 단계; (II) 유전자 조작된 항원 수용체 및 억제성 단백질을 인코딩하는 핵산 구조체를 포함하는 바이러스 벡터로 모집단 T 세포를 형질도입하는 단계; (III) 시험관 내에서 형질도입된 세포를 확장시키는 단계; 및 (IV) 확장된 세포를 환자에게 주입하는 단계, 이 때 상기 조작된 T 세포는 항원 양성 종양 세포를 찾아서 파괴 할 것이다. 동시에, 이러한 조작된 T 세포는 PD-1/PD-L1 면역억제를 차단하고 항종양 면역 반응을 강화한다.
상기 방법은 다음을 추가로 포함한다: 단계 (II) 전에 본 발명의 핵산 구조체를 함유하는 바이러스 벡터로 T 세포를 형질감염시키는 단계.
T 세포의 형질감염은 임의의 표준 방법, 가령, 칼슘 포스페이트 방법, 전기천공, 리포솜 매개 전달, 미세주입, 생물학적 입자 전달 시스템 또는 임의의 다른 공지된 방법들을 사용하여 달성 될 수 있다. 일부 구체예들에서, T 세포의 형질감염은 칼슘 포스페이트 방법을 사용하여 실시된다.
본원에 기재된 다양한 구체예에 따르면, 본 발명은 HPV 관련 암, 특히 HPV16 E6+ 또는 HPV16 E7+ 암에 대한 면역요법을 제공한다. 조작된 T 세포는 종양 항원 HPV E6을 인식하고 동시에 세포 예정사 단백질 1 (PD-1)을 차단하는 단일-사슬 항체 (scFv)를 분비한다. 이러한 조작된 T 세포는 더 강력한 항종양 반응과 감소된 T 세포 고갈을 보여준다.
실험적으로 PD-1 체크포인트 차단은 (1) 항-PD-1 약물 전달이 종양 부위에 국소화되고 (2) 항-PD-1 단일-사슬 항체가 현재 존재하는 항체보다 더 강력하게 결합하기 때문에, 본 발명의 경우 더 효과적임이 밝혀졌다. 또한 항-PD-1 약물 전달이 종양 부위에 국소화되므로 비특이적 염증으로 인한 독성이 감소된다. 항-E6 TCR 및 항-PD-1의 조합은 기존 대안에 비해 T 세포 활성화를 개선하고 및/또는 T 세포 고갈을 방지하는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명을 사용하여 맞춤형 항-종양 면역요법을 생성할 수 있다. 항-E6+/항-PD-1 조작된 T 세포는 환자의 혈액으로부터 용이하게 생성될 수 있다. 이어서 이러한 조작된 T 세포는 세포 요법 생성물로서 환자에게 재주입된다. 이러한 생성물은 자궁경부암, 두경부암, 및 기타를 비롯한 HPVE6+ 종양을 가진 임의의 환자에게 사용될 수 있다.
투여 조성물, 제제 및 방법
본 발명은 개시된 방법에 의해 생성된 조작된 T 세포 및 이의 모집단을 함유하는 조성물 (약학 및 치료 조성물 포함)을 제공한다. 또한, 이러한 조작된 T 세포 및 이의 조성물을 대상체, 예컨대, 환자에게 투여하는 방법, 예컨대, 치료 방법이 제공된다.
A. 조성물 및 제제
약학 조성물 및 제제, 가령, 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여하기 위한 일정수의 세포를 포함하는 단위 투약형 조성물을 비롯한, 상기 조작된 T 세포를 포함하는 투여용 조성물이 제공된다. 이러한 약학 조성물 및 제제들은 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이러한 조성물은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
일부 구체예에서, 담체의 선택은 부분적으로 특정 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 여러 적합한 제제들이 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제에는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트, 및 벤잘코늄 클로라이드가 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 둘 이상의 보존제들의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이들의 혼합물은 일반적으로 총 조성물 중량의 약 0.0001% 내지 약 2%의 양으로 존재한다. 담체는, 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이며, 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 완충액, 가령, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (가령, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 가령, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 낮은 분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 가령, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 가령, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 가령, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 가령, EDTA; 당, 가령, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 가령, 나트륨; 금속 복합체 (예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 가령, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
본 발명에 사용되는 적합한 완충제는 예를 들어 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 구체예들에서, 둘 이상의 완충제들의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이들의 혼합물은 일반적으로 총 조성물 중량의 약 0.001% 내지 약 4%의 양으로 존재한다. 투여가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지이다. 예시적인 방법들은, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 보다 상세히 기재되어 있다.
상기 제제는 수용액을 포함할 수 있다. 상기 제제 또는 조성물은 또한 조작된 T 세포로 치료되는 특정 징후, 질환 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 각각의 활성이 서로 불리하게 영향을 미치지 않는, 세포들에 대해 보완적인 활성을 갖는 활성 성분들을 함유 할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도한 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 다른 약학적 활성 제제, 또는 약물, 가령, 화학요법제, 예컨대, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서 약학 조성물은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방함에 유효한 양, 예를 들어 치료적 유효 또는 예방적 유효량으로 세포를 함유한다. 일부 구체예에서 치료 또는 예방 효능은 치료 대상체의 주기적 평가에 의해 모니터링된다. 원하는 투여량은 세포의 단일 일시 투여, 세포의 다중 일시 투여, 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 전달 될 수 있다.
세포 및 조성물은 표준 투여 기술, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여 될 수 있다. 세포의 투여는 자가 또는 이종일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 T 세포 또는 전구세포는 하나의 대상체로부터 수득 될 수 있고, 본원에 기재된 다양한 구체예에 따라 이들을 유전적으로 변형 한 후 동일한 대상체 또는 상이한 호환가능한 대상체에게 투여 될 수 있다. 말초 혈액 유래 면역반응성 T 세포 또는 그 자손 (예를 들어, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여 될 수 있다. 일반적으로 치료 조성물 (예를 들어, 유전자 변형된 면역반응 세포를 포함하는 약학 조성물)을 투여 할 때, 이는 일반적으로 주사 가능한 단위 투여 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화된다.
본원에 개시된 제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하 또는 좌약 투여를 위한 제형을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 모집단은 비경구로 투여된다. 본원에서 사용된 용어 “비경구”는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다.
일부 구체예에서 조성물은 무균 액체 제제, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH까지 완충 될 수 있다. 액체 제제는 일반적으로 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기가 더 쉽다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사로 투여하는 것이 다소 더 편리하다. 반면에 점성 조성물은 특정 조직과의 더 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점도 범위내에서 제형화 될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 담체를 포함 할 수 있으며, 이는 예를 들어 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질 일 수 있다.
무균 주사가능한 용액은 용매에 세포를 혼입시켜, 가령, 적합한 담체, 희석제 또는 무균수, 또는 부형제, 가령, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물로 제조 될 수 있다. 조성물은 원하는 투여 경로 및 제제에 따라, 보조 물질, 가령, 습윤제, 분산제 또는 유화제 (예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 착향제 및/또는 착색제를 포함 할 수 있다. 일부 양상들에서 적절한 제재를 제조하는 표준 문헌내용들을 참고할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 포함하여 조성물의 안정성 및 무균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가 할 수 있다. 미생물 작용은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산에 의해 방지될 수 있다. 주사가능한 약학 형태의 흡수 지연은 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균은 컨대, 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현 될 수 있다.
B. 입양 세포 요법에서 조작된 T 세포의 투여 방법 및 용도
암을 포함한 질환, 병태 및 장애를 치료하거나 예방하기 위한 상기 세포, 모집단 및 조성물의 투여 방법, 그리고 이러한 세포, 모집단 및 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 세포, 모집단 및 조성물은 예를 들어, 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 치료될 특정 질환 또는 병태를 갖는 대상체 또는 환자에게 투여된다. 일부 구체예에서, 제공된 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물, 예컨대 배양 및/또는 기타 처리 단계 후 조작된 조성물 및 생산 종료 조성물이 대상체, 예컨대 질환 또는 병태를 갖거나 이의 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 일부 양상들에서, 상기 방법은 그리하여 가령, 조작된 T 세포가 인식한 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 감소시킴으로써, 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료한다, 예컨대 개선한다.
입양 세포 요법을 위한 세포 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법은, 예컨대, Gruenberg 외의 미국 공개 특허출원 제 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허 제 4,690,915; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85에 기재되어 있다. 예컨대, Themeli 외 (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara 외 (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila 외 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338을 참고하라.
일부 구체예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 자가 전달에 의해 수행되며, 여기서 T 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 이러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 분리 및/또는 달리 제조된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료를 필요로하는 대상체, 예를 들어 환자로부터 유래되고, 단리 및 가공 후에 세포는 동일한 대상체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 T 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 궁극적으로 이러한 세포 요법을 받는 대상체, 예컨대, 제 1 대상체 이외의 대상체로부터 분리 및/또는 달리 제조된다. 이러한 구체예에서, 이후 세포는 동일한 종의 상이한 대상체, 예컨대, 제 2 대상체에게 투여된다. 일부 구체예들에서, 제 1 및 제 2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구체예들에서, 제 1 및 제 2 대상체들은 유전적으로 유사하다. 일부 구체예들에서, 제 2 대상체는 제 1 대상체와 동일한 HLA 분류 또는 수퍼타입을 발현한다.
일부 구체예들에서, 대상체는 상기 세포 또는 세포를 포함하는 조성물 투여 이전에 해당 질환 또는 병태, 예컨대, 종양을 표적하는 치료제로 치료받은 바 있다. 일부 양상에서, 이러한 대상체는 다른 치료제에 대하여 불응성 또는 비-반응성이다. 일부 구체예에서, 대상체는 예를 들어, 화학 요법, 방사선 및/또는 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT), 예를 들어, 동종 HSCT를 포함하는 또 다른 치료적 개입으로 치료한 후 지속성 또는 재발성 질환을 갖는다. 일부 구체예에서, 투여는 대상체가 다른 요법에 대해 내성을 가지게 되었음에도 불구하고 대상체를 효과적으로 치료한다.
일부 구체예에서, 대상체는 그 외 다른 치료제에 반응하고, 이러한 치료제를 사용한 치료는 질환 부담을 감소시킨다. 일부 측면에서, 대상체는 초기에 치료제에 반응하지만 시간이 지남에 따라 질환 또는 상태의 재발을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 대상체는 재발하지 않았다. 일부 이러한 구체예에서, 대상체는 재발 위험이 있는 것, 가령, 재발 위험이 높은 것으로 결정되고, 따라서 세포는 예를 들어 재발 가능성을 감소시키거나 예방하기 위해 예방적으로 투여된다. 일부 구체예들에서, 대상체는 또 다른 치료제로 사전 치료를 받지 않았다.
일부 구체예에서, 세포는 원하는 용량으로 투여되며, 일부 측면에서 원하는 용량 또는 세포 수 또는 세포 유형 (들) 및/또는 원하는 비율의 세포 유형을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서 세포의 투여량은 개별 모집단 또는 하위유형의 총 세포 수 (또는 체중 kg 당 수) 및 원하는 비율, 가령, CD4+ 대 CD8+ 비율에 기초한다. 일부 구체예에서, 세포의 투여량은 개별 집단 또는 개별 세포 유형의 원하는 총 세포 수 (또는 체중 kg 당 수)에 기초한다. 일부 구체예에서, 투여량은 이러한 특징들의 조합, 가령, 개별 모집단에서 원하는 총 세포 수, 원하는 비율 및 원하는 총 세포 수에 기초한다.
일부 구체예들에서, 세포의 모집단 또는 하위 유형들, 가령, CD8+ 및 CD4+ T 세포는 원하는 총 세포 용량, 가령, 원하는 T 세포 용량으로 또는 이의 허용 오차 범위 이내로 투여된다. 일부 구체예들에서, 원하는 용량은 원하는 세포수 또는 세포들을 투여받는 대상체 체중 단위 당 또는 원하는 세포들의 수, 예컨대, 세포/kg이다. 일부 구체에들에서, 원하는 용량은 최소 세포수 또는 체중 단위 당 최소 세포수 이상이다. 일부 구체예들에서, 원하는 용량으로 투여되는 총 세포들 중에서, 개별 모집단 또는 하위유형들은 원하는 결과 비율 (가령, CD4+ 대 CD8+ 비율)로 또는 이러한 비율 근방으로, 예컨대, 이러한 비율의 특정한 허용 오차 또는 오류 이내로 존재한다.
일부 구체예에서, 세포는 원하는 용량의 CD4+ 세포 및/또는 원하는 용량의 CD8+ 세포와 같이, 원하는 하나 이상의 세포 개별 모집단 또는 세포 하위유형 용량의 허용 오차에서 또는 그 이내에서 투여된다. 일부 구체예들에서, 원하는 용량은 이러한 하위유형 또는 모집단의 원하는 세포수 또는 이러한 세포들을 투여받는 대상체 체중 단위 당 또는 원하는 세포들의 수, 예컨대, 세포/kg이다. 일부 구체에들에서, 원하는 용량은 해당 모집단 또는 하위유형의 최소 세포수 또는 체중 단위 당 해당 모집단 또는 하위유형의 최소 세포수 이상이다.
따라서, 일부 구체예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정 용량 및 원하는 비율에 기초하고 및/또는 하나 이상의, 예컨대, 각각의 개별 하위유형 또는 하위모집단의 원하는 고정 용량에 기초한다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 투여량은 원하는 고정 또는 최소 용량의 T 세포 및 원하는 CD4+ 대 CD8+ 세포 비율에 기초하며, 및/또는 원하는 고정 또는 최소 용량의 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포에 기초한다.
특정 구체예들에서, 세포 또는 세포 하위유형의 개별 모집단은 약 1백만 내지 약 1천억개 세포, 가령, 예컨대, 1백만 내지 약 500억개 세포 범위 (예컨대, 약 5백만개 세포, 약 2천5백만개 세포, 약 5억개 세포, 약 10억개 세포, 약 50억개 세포, 약 200억개 세포, 약 300억개 세포, 약 400억개 세포, 또는 전술한 값들 중 어느 둘에 의해 정의되는 범위), 가령, 약 1천만 내지 약 1천억개 세포 (예컨대, 약 2천만개 세포, 약 3천만개 세포, 약 4천만개 세포, 약 6천만개 세포, 약 7천만개 세포, 약 8천만개 세포, 약 9천만개 세포, 약 100억개 세포, 약 250억개 세포, 약 500억개 세포, 약 750억개 세포, 약 900억개 세포, 또는 전술한 값들 중 어느 둘에 의해 정의되는 범위), 그리고 일부 경우 약 1억개 세포 내지 약 500억개 세포 (예컨대, 약 1억 2천만개 세포, 약 2억 5천만개 세포, 약 3억5천만개 세포, 약 4억5천만개, 약 6억5천만개 세포, 약 8억개 세포, 약 9억개 세포, 약 30억개 세포, 약 300억개 세포, 약 450억개 세포) 또는 이들 범위들 사이의 임의의 값으로 대상체에 투여된다.
일부 구체예들에서, 총 세포 용량 및/또는 세포들의 개별 하위모집단의 용량은 약 104 내지 약 109개 세포/킬로그램 (kg) 체중 사이의 범위 내, 가령, 105 내지 106 세포/kg 체중, 예를 들면, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1×105 세포/kg, 1.5×105 세포/kg, 2×105 세포/kg, 또는 1×106 세포/kg 체중이다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 세포들은 약 104 내지 약 109개 T 세포/킬로그램 (kg) 체중으로, 또는 이의 특정 오차 범위 이내로, 가령, 105 내지 106 T 세포/kg 체중, 예를 들면, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1×105 T 세포/kg, 1.5×105 T 세포/kg, 2×105 T 세포/kg, 또는 1×106 T 세포/kg 체중으로 투여된다.
일부 구체예들에서, 세포들은 약 104 내지 약 109개 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/킬로그램 (kg) 체중으로, 또는 이의 특정 오차 범위 이내로, 가령, 105 내지 106 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg 체중, 예를 들면, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1×105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 1.5×105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 2×105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 또는 1×106 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg 체중으로 투여된다.
일부 구체예들에서, 세포들은 약 1×106, 약 2.5×106, 약 5×106, 약 7.5×106, 또는 약 9×106개 이상 및/또는 이하 또는 이의 특정 오차 범위 내 CD4+ 세포, 및/또는 약 1×106, 약 2.5×106, 약 5×106, 약 7.5×106, 또는 약 9×106개 이상 및/또는 이하 또는 이의 특정 오차 범위 내 CD8+ 세포, 및/또는 약 1×106, 약 2.5×106, 약 5×106, 약 7.5×106, 또는 약 9×106개 이상 및/또는 이하 또는 이의 특정 오차 범위 내 T 세포로 투여된다. 일부 구체예들에서, 세포들은 약 108 내지 1012개 또는 약 1010 내지 1011개 또는 이의 특정 오차 범위 내 T 세포로, 약 108 내지 1012개 또는 약 1010 내지 1011개 또는 이의 특정 오차 범위 내 CD4+ 세포로, 및/또는 약 108 내지 1012개 또는 약 1010 내지 1011개 또는 이의 특정 오차 범위 내 CD8+ 세포로 투여된다.
일부 구체예들에서, 세포들은 다수의 세포 모집단 또는 하위유형들, 가령, CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 하위유형들의 원하는 결과 비율로 또는 이의 허용 오차 범위 이내에서 투여된다. 일부 양상들에서, 원하는 비율은 특정 비율 일 수 있고 또는 비율의 범위일 수 있다, 예를 들어, 일부 구체예들에서, 원하는 비율 (예컨대, CD4+ 대 CD8+ 세포 비율)은 약 5:1 내지 약 5:1 (또는 약 1:5 초과 약 5:1 미만), 또는 약 1:3 내지 약 3:1 (또는 약 1:3 초과 약 3:1 미만), 가령, 약 2:1 내지 약 1:5 (또는 약 1:5 초과 약 2:1 미만, 가령, 약 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5)이다. 일부 양상들에서, 허용 오차는 원하는 비율의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% 이내이며, 이들 범위들 사이의 임의의 값을 포함한다.
질환의 방지 또는 치료를 위하여, 적절한 용량은 치료될 질환의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질환의 심각성 및 과정, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 치료, 대상체의 임상적 병력 그리고 세포에 대한 반응, 그리고 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 상기 조성물 및 세포는 일부 구체예들에서 대상체에게 1회에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절히 투여된다.
본원에 기재된 세포들은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어, 일시 주입으로, 주사로, 예컨대, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 안구주변 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 중격경유 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 추측하 주사, 결막하 주사, 테논하 주사, 안구후 주사, 안구 주위 주사, 또는 공막 뒤 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비강내로 투여되고, 국소 치료의 경우 필요에 따라 병변내 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구체예들에서, 주어진 용량은 해당 세포의 단일 일시 투여에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, 이는 예를 들어 3 일 이하의 기간에 걸쳐 세포의 다중 일시 투여에 의해 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
일부 구체예에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포독성제 또는 치료제와 같은 또 다른 치료적 개입과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 일부 구체예에서 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 공동 투여된다. 일부 내용에서, 세포는 세포 모집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대의 경우에 충분히 가까운 시간이후에 다른 요법과 공동 투여된다. 일부 구체예들에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제들 이전에 투여된다. 일부 구체예들에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제들 이후에 투여된다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 치료제들은 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 사이토카인, 가령, IL-2를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 화학요법제 투여를 포함한다.
세포 투여 후, 일부 구체예들에서 조작된 세포 모집단의 생물학적 활성이, 예컨대, 임의의 여러 공지된 방법에 의해 측정된다. 평가하기 위한 파라미터는, 생체내에서 예컨대, 이미징에 의한, 또는 생체외에서 예컨대, ELISA 또는 유세포분석에 의한, 조작된 T 세포의 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다. 특정 구체예들에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 해당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 가령, 예를 들어, Kochenderfer 외, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman 외 J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)에 기재된 세포독성 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구체예들에서, 세포의 생물학적 활성은 하나 이상의 사이토카인, 가령, CD107a, IFNγIL-2, 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성은 임상적 결과, 가령, 종양 부담 또는 부하의 감소를 평가함으로써 측정된다.
특정 구체예들에서, 조작된 세포들은 수많은 방식으로 추가 변형되어, 이들의 치료적 또는 예방적 효능이 증가된다. 예를 들어, 해당 모집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 표적화 모이어티에 접합될 수 있다. 화합물, 예컨대, CAR 또는 TCR을 표적화 모이어티에 접합시키는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Wadwa 외, J. Drug Targeting 3: 111 (1995), 및 미국 특허 제 5,087,616을 참고하라.
C. 투약 일정 또는 요법
일부 구체예들에서, 1차 투약의 세포가 제공된 후 하나 이상의 2차 후속 투약이 제공되는 반복형 투약 방법들이 제공된다. 세포의 다중 투여 시기 및 크기는 일반적으로, 입양 요법 방법으로 대상체에게 투여 될 때 TCR을 발현하는 조작된 T 세포의 효능 및/또는 활성 및/또는 기능을 증가시키도록 설계된다. 일부 구체예에서, 반복형 투여는 PD-1 및/또는 PD-L1과 같은 억제성 면역 분자가 TCR을 발현하는 조작된 T 세포에서 상향조절 될 때 발생할 수 있는 하향조절 또는 활성 억제를 감소시킨다. 이 방법들은 1차 투약을 투여 한 후, 일반적으로 후속하여 하나 이상의 후속 투약을 투여하는 것을 포함하며, 상이한 투약들 사이에 특정 시간 프레임이 존재한다.
입양 세포 요법과 관련하여, 주어진 “투약”의 투여는 주어진 양 또는 수의 세포를 단일 조성물 및/또는 단일 연속 투여, 예를 들어, 단일 주사 또는 연속 주입으로서 투여하는 것을 포함하고, 또한 3일 이하의 지정된 시기에 걸쳐 다수의 개별 조성물 또는 주입으로 제공되는 분할 투약으로서 주어진 양 또는 수의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 경우에서, 1차 또는 후속 투약은 단일 시점에서 제공되거나 시작되는 지정된 수의 세포의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나 일부 경우에서, 1차 또는 후속 투약은 3일 동안 또는 2일 동안 일일 1회 또는 하루 동안 수회 주입하는 것과 같이 3 일 이하의 기간에 걸쳐 다회 주사 또는 주입으로 투여된다.
그러므로, 일부 양상들에서, 1차 투약의 세포는 단일 약학 조성물로 투여된다. 일부 구체예들에서, 후속 투약의 세포들은 단일 약학 조성물로 투여된다.
일부 구체에들에서, 1차 투약의 세포는 1차 투약의 세포를 집합적으로 포함하는, 복수의 조성물로 투여된다. 일부 구체에들에서, 후속 투약의 세포는 후속 투약의 세포들을 집합적으로 포함하는, 복수의 조성물로 투여된다. 일부 양상들에서, 추가 후속 투약들은 3일 이하의 기간에 걸쳐 복수의 조성물로 투여될 수 있다.
용어 “분할 투약”은 1일 이상에 걸쳐 투여되도록 분할된 투약을 지칭한다. 이러한 투약 유형은 본 발명의 방법에 포함되며 단일 투약인 것으로 고려된다.
그러므로, 일부 양상에서 1차 투약 및/또는 후속 투약(들)은 분할 투약으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 투약은 2일 또는 3일에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 분할 투약의 예시적 방법들은 1일차에 투여량의 25%를 투여하고 2일차에 투여량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예들에서, 1차 투여량의 33%가 1일차에 투여되고 나머지 67%가 2일차에 투여될 수 있다. 일부 양상들에서, 투여량의 10%는 1일차에 투여되고, 투여량의 30%는 2일차에 투여되며, 투여량의 60%는 3일차에 투여된다. 일부 구체예들에서, 분할 투약은 3일 이상에 걸쳐 분포되지 않는다.
선행 투약, 가령, 1차 투약과 관련하여, 용어 “후속 투약”은 선행, 예컨대, 1차 이후 동일한 대상체에 투여되는 투약을 지칭하며, 그 중간에 임의의 개입 투약이 대상체에게 투여되지 않은 투약이다. 그럼에도 불구하고, 이 용어는 단일 분할 투약에 포함되는 2차, 3차, 및/또는 4차 주입 또는 주사를 포함하지 않는다. 그러므로, 달리 명시되지 않는 한, 1, 2, 또는 3일 기간 이내 2차 주입은 본원에서 사용되는 “후속” 투약인 것으로 고려되지 않는다. 마찬가지로, 분할 투약에 속하는 일련의 다회 투약에서 2차, 3차, 및 그 이후는 “후속”투약의 의미와 관련하여 “개입” 투약으로 간주되지 않는다. 그러므로, 달리 명시되지 않는 한, 1차 또는 선행 투약 시작 후, 3일 이상의 일정 시기에 걸쳐 투여되는 투약은 대상체가 1차 투약 시작 후 세포의 2차 또는 후속 주사 또는 주입을 받았다 하더라도, 2차 또는 후속 주사 또는 주입이 1차 또는 선행 투약 시작 후 3일 기간 이내에 발생하는 한, “후속” 투약인 것으로 간주된다.
그러믈, 달리 명시되지 않는 한, 2차 투약이 1차 투약에 “후속”인지 여부를 결정함에 있어서, 최대 3일의 기간에 걸친 동일한 세포의 다회 투여는 단일 투약으로 간주되며, 투여 시작 3일 이내 세포의 투여는 후속 투약으로 간주되지 않고, 개입 투약인 것으로 간주되지 않는다.
일부 구체예들에서, 일부 양상들에서 1차 투약 및 1차 후속 투약 사이의 시기에 관한 지침에서와 동일한 시기 지침을 사용하여, 예컨대, 1차 및 다회 후속 투약을 투여함으로써 다회 후속 투약들이 제공되며, 1차 투약 투여로부터 대상체의 세포에서 억제성 면역 분자, 가령, PD-1 및/또는 PD-L1이 상향조절되었던 시기 이내에 각 후속 투약이 제공된다. 가령, 말초 혈액 또는 기타 체액으로부터 항원을 발현하는, 가령, CAR-발현 세포 내 PD-1 및/또는 PD-L1 수준을 평가함으로써 후속 투약을 제공할 시기를 경험적으로 결정하는 것은 당업자의 능력 수준에 속한다.
일부 구체예들에서, 1차 투약과 1차 후속 투약, 또는 1차 및 다회 후속 투약 사이의 시기는, 각 후속 투약이 약 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일 이상 또는 그 이상인 시기 이내에 제공되도록 한다. 일부 구체예들에서, 후속 투약은 1차 또는 직전 투약의 투여 후 약 28일 미만인 시기 내에 제공된다. 추가적인 다회 추가 후속 투약 또는 투약들은 또한 후속 투약 또는 후속 연속 투약으로 지칭된다.
세포의 1차 및/또는 하나 이상의 후속 투약의 크기는 일반적으로 개선된 효능 및/또는 감소된 세포독성 위험을 제공하도록 설계된다. 일부 양상들에서, 1차 투약 또는 임의의 후속 투약의 투여량 또는 크기는 상기 임의의 투여량 또는 양이다. 일부 구체예들에서, 1차 투약 또는 임의의 후속 투약에서 세포의 수는 약 0.5×106 세포/대상체의 kg 체중 내지 5×106 세포/kg, 약 0.75×106 세포/kg 내지 3×106 세포/kg 또는 약 1×106 세포/kg 내지 2×106 세포/kg이며, 각각을 포함한다.
본원에서 사용되는, “1차 투약”은 주어진 투약의 시기가 연속 또는 후속 투약의 투여 이전임을 기재하기 위해 사용된다. 이 용어는 대상체가 이전에 세포 요법 투약을 받은 적이 없거나 심지어 대상체가 이전에 동일한 세포 또는 동일한 재조합 수용체를 발현하거나 동일한 항원을 표적으로 하는 세포의 투약을 받은 적이 없다는 것을 반드시 의미하지는 않는다.
일부 구체예들에서, 후속 투약의 세포에 의해 발현되는 수용체, 예컨대, TCR은 적어도 하나의 면역반응성 에피토프를 1차 투약의 세포에 의해 발현되는 수용체, 예컨대, TCR로서 포함한다. 일부 구체예들에서, 후속 투약에서 투여되는 세포에 의해 발현되는 수용체, 예컨대, TCR은 1차 투약에 의해 발현되는 수용체, 예컨대, TCR과 동일하고 또는 1차 투약에서 투여되는 세포에 의해 발현되는 수용체, 예컨대, TCR과 실질적으로 동일하다.
다양한 투약에서 투여되는 세포에 의해 발현되는 수용체들, 가령, TCR들은, 일반적으로 치료되는 질환 또는 병태 또는 이의 세포에서 발현되는 이와 관련되는, 및/또는 이에 특이적인 분자를 인식하거나 이에 특이적으로 결합한다. 상기 분자, 예컨대, 항원에 특이적 결합시, 수용체는 일반적으로 면역자극 신호, 가령, ITAM-전달 신호를, 세포 내부에 전달함으로써, 해당 질환 또는 병태에 표적되는 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 1차 투약의 세포는 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현시킨다.
실시예:
하기 실시예는 본 발명에 대한 청구범위를 제한하고자 하는 것이 아니라, 특정 구체예들을 예시하고자 하는 것이다. 예시된 방법들에 대하여 당업자가 생각하는 임의의 변형들은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 한다.
구조체 설계 3개의 코딩 영역들을 포함하는 MP71 레트로바이러스 벡터 구조체를 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생성하였으며, 이 때 3개 코딩 영역들은 다음과 같았다: (A) TCR 알파 사슬의 불변 영역에 융합된 인간 항-E6 TCR의 알파 사슬의 가변 영역 (aE6_Va-Ca로 표시); (B) TCR 베타 사슬의 불변 영역에 융합된 동일한 인간 항-E6 TCR의 베타 사슬의 가변 영역 (aE6_Vb-Cb로 표시); 및, (C) GS 링커로 연결된 새로운 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역 (aPD1_VH로 표시) 및 경쇄 가변 영역 (PD1_VL로 표시). 수득된 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 E6.αPD1_m11로 표시된다. 본 연구에서 사용된 레트로바이러스 벡터 구조체의 개략도가 도 1에 도시되어 있다.
세포주 및 배지. HEK-293T 및 CaSki 세포를 ATCC사로부터 구입하였다. 익명의 공여자로부터 얻은 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs)를 Hemacare사로부터 구입하였다. 293T-PD-1 세포는 인간 PD-1을 과발현하는 벡터로 293T 세포를 렌티바이러스 형질도입하여 제조되었다. 세포들을 DMEM + 10% FBS, RPMI + 10% FBS, 또는 X-Vivo + 5% 인간 혈청 A/B + 1% HEPES + 1% GlutaMAX에서 배양하였다.
레트로바이러스 벡터 제조. 표준 칼슘 포스페이트 침전 프로토콜을 사용하여 293T 세포를 일시 형질감염시켜 레트로바이러스 벡터들을 준비하였다. 바이러스 상청액들을 48h에서 수확하고 T 세포를 형질도입하기 위하여 사용하였다.
T 세포 형질도입 및 확장. 레트로바이러스 형질도입 이전에, PBMC들을 T 세포 활성화제 비드 및 인간 IL-2와 함께 배양하여 2일 동안 활성화시켰다. 형질도입을 위해, 새로이 수확한 레트로바이러스 상청액을 15 μg의 RetroNectin per/well (Clontech Laboratories)로 코팅된 비-조직 배양-처리된 24-웰 플레이트에 32C 2,000 g에서 2hr 원심분리하여 회전-부하하였다. 활성화된 PBMC들을 플레이트에 부하하고 32℃에서 30분 동안 600 g으로 회전시켰다. T 세포들을 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 배양 배지를 2일 마다 보충하였다.
TCR 및 PD-1 염색. 모든 항체들을 Biolegend사로부터 구입하였다. 형질감염 후 72h에 TCR 베타 사슬에 대한 항체 염색과 후속 유세포 분석으로 재조합 TCR의 발현을 검출하였다. CaSki 표적 세포와 공동 배양 후 72h에 PD-1에 대한 항체 염색에 의해 PD-1의 발현을 검출하였다. CD3, CD4, 및 CD8 염색을 동시에 수행하였다.
시험관내 항-PD-1 scFv 발현. E6, E6.αPD1_m11 또는 E6.αPD1_5C4 TCR 트랜스진을 인코딩하는 레트로바이러스 벡터들로 293T 세포들을 형질감염시켰다. 이어서 세포 배양 상청액을 형질감염 후 48hr에 수집하였다. 20μl 상청액 중 항-PD-1 scFv를 ELISA로 검출하였다.
결과: 도 3은세포 배양 상청액에서 분비된 항-PD-1 scFv의 발현을 보여준다. E6은 항-PD-1이 없는 E6 TCR을 표시하고; E6.aPD1_m11은 본 발명의 새로운 항-PD-1 단일 사슬 항체가 있는 E6 TCR을 표시하고; E6.αPD1_5C4는 공개된 서열로부터 유래된 대조 항-PD-1 단일 사슬 항체가 있는 E6 TCR을 표시한다.
시험관내 항-E6 TCR-T 발현. 일차 T 세포들에 지시된 구조체들을 형질도입하였다. 배양 72시간 후, 재조합 TCR의 발현을 TCR 베타 사슬에 대한 항체 염색에 의해 검출하였다. 생존가능한 CD3+ 림프구 게이팅 전략을 사용하였다.
결과: 도 4는 항-E6 TCR이 E6.αPD1_m11 구조체를 함유하는 T 세포에서 강력하게 발현되는 패널을 보여준다.
분비된 항-PD-1 scFv의 결합 활성. E6, E6.αPD1_m11 또는 E6.αPD1_5C4 TCR 트랜스진을 인코딩하는 레트로바이러스 벡터들로 293T 세포들을 형질감염시켰다. 이어서 형질감염 후 48hr에 세포 배양 상청액을 수집하였다. 293T-PD-1 세포를 300μl의 상청액과 함께 30분 동안 실온에서 배양한 다음 항-HA 태그 항체를 사용하여 세포를 염색하고, 293T- PD-1 세포에 결합된, 분비된 HA 태그된 항-PD-1 항체를 검출하였다.
결과: 도 5에서 보는 바와 같이, 두 가지 분비된 항-PD1 모두 293T- PD-1 세포에 강력하게 결합하였다. E6.αPD1_m11 및 E6.αPD1_5C4 항체들은 세포 표면에서 발현된 PD-1에 대하여 비등한 결합 친화도를 가진다.
재조합 PD-L1의 경쟁적 결합. 293T-PD1 세포들을 1μl의 100μg/ml rhPD-L1/Fc 및 E6, E6.αPD1_m11 또는 E6.αPD1_5C4 TCR-형질감염된 293T 세포의 30분 배양물의 상청액 300μl와 함께 배양하였다. 이어서 세포들을 PE-접합된 항-인간 Fc로 염색하였다.
결과: 도 6에서 보는 바와 같이, E6.αPD1_m11 및 E6.αPD1_5C4 TCR-T 세포로부터의 상청액은 재조합 PD-L1과 경쟁할 수 있었으므로, 이는 단일 사슬 항-PD1 항체가 PD-1과 이의 리간드 PD-L1 사이의 상호작용을 차단할 수 있음을 나타낸다.
시험관내 TCR-T IFNγ활성화. 96-웰 분석 플레이트들을 3 μg/ml의 항-인간 CD3 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 2일차에, 상기 웰들의 상청액을 흡인하고 웰들을 웰 당 100 μl PBS로 1회 세척하였다. 100 μl PBS 중의 10 μg/ml rhPD-L1/Fc를 첨가하였다. 각 웰에서, 이후 10 μl PBS 중 100 μg/ml의 염소 항-인간 IgG Fc 항체를 첨가하였다. 분석 플레이트를 4 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 인간 T 세포들을 수확하고, 1회 세척한 다음, TCM에서 1 × 106 세포/ml로 재현탁시켰다. 분석 플레이트의 웰들을 흡인하였다. 이어서, 100 μl의 인간 T-세포 현탁액 (1 × 105) 및 GolgiPlug로 보충된 형질감염 후 2일차 E6, E6.αPD1_m11 또는 E6.αPD1_5C4 TCR-형질감염된 293T 세포 배양액의 상청액 100 μl를 각 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 덮고 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 배양 후, T 세포들을 수확하고 FN-γ로 세포내 염색하였다.
결과: 도 7을 보면, E6 TCR을 포함하는 TCR-T 세포는 IFNγ발현에 의해 측정된 바와 같이 CD3 항체들에 의해 활성화될 수 있으나, 이러한 활성화는 재조합 PD-L1 (rhPD-L1)의 도입에 의해 감소되었다. 그러나, E6.αPD1_m11 및 E6.αPD1_5C4 모두에 있어서, PD-L1은 활성화를 감소시키지 못했다.
시험관내 TCR-T IFNγ분비. TCR-T 세포들을 48 시간 또는 72 시간동안 Ca Ski 세포와 함께 1:0, 1:2, 1:1, 및 3:1의 효과기-대-표적 비율로 공동배양하였다. 이어서 상청액을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 IFN-γ 생성을 인간 IFN-γ ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
결과: 항원-특이적 자극시 TCR-T 세포의 IFNγ생성에 대한 항-PD-1 scFv의 분비 효과가 도 8에 도시되어 있다 (NT는 대조군으로 사용되었던 비-형질도입 대조군을 표시한다). 도 8에서 보는 바와 같이, IFNγ분비는 E6.αPD1_m11 및 E6.αPD1_5C4 TCR-T 세포 모두의 상청액에서 검출되었으나, E6.αPD1_m11로부터 IFNγ생성이 유의하게 더 높았다.
특이적 세포 용해 (세포독성). Ca Ski 종양 세포들을 CFSE로 예비염색한 다음 E6, E6.αPD1_m11 또는 E6.αPD1_5C4 TCR-T 세포와 함께 1:2, 1:1, 및 3:1의 효과기-대-표적 비율로 밤새 공배양하였다. Ca Ski 세포에 대한 T 세포의 세포독성을 Annexin V/7-AAD 염색으로 측정하였다. 비-표적 293T 세포들을 대조군으로 사용하였다.
결과: 도 9에서 보는 바와 같이, E6 TCR-T 세포 모두는 E6+ 표적 세포 (CaSki)를 특이적 방식으로 사멸시켰다. E6.αPD1_m11 및 E6.αPD1_5C4는 E6 단독 보다 효과적으로 표적 세포를 사멸시켰다.
시험관내 TCR-T 증식. E6, E6.αPD1_m11 및 E6.αPD1_5C4 TCR-T 세포들을 CFSE로 예비염색하였다. 염색된 T 세포들을 72 시간 동안 Ca Ski 세포와 함께 공배양하고, CFSE의 강도를 유세포 분석으로 측정하였다. 비형질도입 (NT) T 세포들을 대조군으로 사용하였다.
결과: 도 10에서 보는 바와 같이, E6+ 표적 세포에 대한 노출은 E6 TCR-T 세포 모두를 자극하여, 또 다른 활성화 측정값을 증식시켰으나, E6.αPD1_m11 TCR-T 세포는 테스트된 다른 TCR-T 세포 보다 급속하게 증식하였다.
항원-특이적 자극시 PD-1의 시험관내 발현. TCR-T 세포 모두를 Ca Ski 세포와 함께 72시간 동안 공배양하였다. 이어서 T 세포를 수집하고 세포 표면 상의 PD-1 발현을 유세포 분석으로 측정하였다. PD-1-발현 CD8 T 또는 CD4 T 세포를 게이팅하고, 이들의 백분율을 총 CD8+ T 또는 CD4+ T 세포에 대한 이들의 백분율을 나타내었다. NT는 비형질도입 T 세포를 나타내고, 이는 대조군으로 사용되었다.
결과: 도 11에서 보는 바와 같이, 항원 자극 후, 억제성 수용체 PD-1은 E6 TCR 및 E6.αPD1_5C4를 함유하는 T 세포에서 상향조절된다. 그러나, PD-1은 E6.αPD1_m11을 발현하는 세포에서 상향조절되지 않는다.
생체내 TCR-T 효능. 6-8주령 암컷 NSG 마우스들에게 2e6 Ca Ski 종양 세포를 피하 이식하고, 12일 후, 10 ug의 Poly (I:C)를 각각의 종양-보유 마우스에게 i.p.로 제공하였다. 24 시간 후, 10e6 E6-TCR-T, E6.αPD1_m11-TCR-T 또는 비형질도입 대조군 PBMC들을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주사하였다. 주 2회 종양 크기를 측정하여 TCR-T 항-종양 효능, 마우스 신체 상태 및 체중을 주 2회 측정하여 TCR-T 관련 독성을 평가하였다.
결과 (데이터 없음): TCR-T 세포가 효과적인 경우, 종양 성장은 E6 및 비형질도입 대조군에 비해 E6.αPD1_m11에 있어서 더 느릴 것으로 예상된다. 또한, E6.αPD1_m11 TCR-T 세포의 T 세포 수는 비형질도입 대조군에 비해 증가할 수 있다.
본원에서 인용된 모든 문헌들은 그 전문이 제시된 것과 같이 그 전문이 참고로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. Allen 외, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22 nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012); Hornyak 외, Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3 rd ed., Wiley-Blackwell (November 28, 2012); 및 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)의 문헌들은 본 출원에서 사용되는 많은 용어들에 대한 일반적인 지침을 해당 분야의 숙련된 기술자에게 제공한다. 항체를 준비하는 방법에 관한 참고문헌으로, Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013); K
Figure pct00001
hler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7):511-9; Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, 미국 특허 제 5,585,089 (1996 Dec); 및 Riechmann 외, Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323-7을 참고하라.
숙련된 기술자는 본 명세서에서 설명된 것들에 유사한 또는 대등한 많은 방법 및 재료를 알고 있을 것이며, 이는 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 본 발명의 실시예의 다양한 특징을 예로서 예시하는 첨부 도면과 함께 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 실제로, 본 발명은 상기 설명된 방법 및 재료에 어떤 방식으로든지 제한되지 않는다. 편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 특정 용어들을 본원에 모아 설명한다.
달리 명시되지 않거나 문맥에서 암시하지 않는 한, 다음과 같은 용어 및 문구에는 아래 제공된 의미가 포함된다. 달리 명시적으로 언급되거나 문맥에서 명백하지 않는 한, 다음 용어 및 문구는 해당 용어 또는 문구가 관련된 기술에서 획득한 의미를 배제하지 않는다. 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 제한되므로 정의는 특정 구체예를 설명하는 것을 돕기 위해 제공되며 청구범위 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
SEQUENCE LISTING <110> TCRCURE BIOPHARMA CORP. Wang , Pin Li, Si <120> DUAL FUNCTION ENGINEERED T CELLS WITH HPV E6 SPECIFICITY AND PD-1 BLOCKADE <130> TCR001PCT <140> Unknown <141> 2019-08-10 <150> 62/717,787 <151> 2018-08-11 <150> 62/731,329 <151> 2018-09-14 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Arg Arg Asp Tyr Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Asn 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln His Gly Arg Glu Leu Pro Leu Thr 1 5

Claims (24)

  1. 다음을 포함하는 조작된 T 세포:
    (a) HPV의 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체; 및
    (b) 종양에서 억제성 수용체의 기능 또는 발현을 감소시키는 억제성 단백질
    을 인코드하는 핵산.
  2. 청구항 1에 있어서, 항원은 E6 또는 E7을 포함함을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 종양 표적은 하나 이상의 PD-1을 포함함을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  4. 청구항 3에 있어서, 억제성 단백질은 항 PD1 항체임을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  5. 청구항 4에 있어서, 항 PD1 항체는 단일 사슬 항체임을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 항 PD1 항체는 모티프 서열들 1) GYTFTNYY의 CDR1, INPSNGGT의 CDR2, 및 TRRDYNYDGGFDY의 CDR3의 중쇄; 2) KSVSTSGFN의 CDR1, LAS의 CDR2 및 QHGRELPLT의 CDR3의 경쇄를 포함함을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  7. 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산 분자는 PD1-인코딩 핵산에 상보적인 서열을 포함함을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  8. 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산 분자는 PD1-인코딩 핵산에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  9. 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 단백질 또는 항체는 항시적으로 발현됨을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  10. 청구항 9에 있어서, 억제성 단백질은 항시적으로 발현되는 항체 PD1임을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  11. (a) HPV의 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 인코드하는 핵산; 및
    (b) 종양에서 억제성 수용체의 발현을 감소시키는 억제성 핵산 분자
    를 포함하는 핵산.
  12. 청구항 11에 있어서, 항원 수용체는 HPV의 E6임을 특징으로 하는, 핵산.
  13. 청구항 12에 있어서, 종양 표적은 PD1임을 특징으로 하는, 핵산.
  14. 청구항 11-13 중 어느 한 항의 핵산에 의해 인코드되는 폴리펩티드.
  15. 청구항 11-13 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  16. 청구항 15에 있어서, 벡터는 레트로바이러스 벡터임을 특징으로 하는, 벡터.
  17. (a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 핵산, 이 때 제 1 항원 수용체는 HPV의 E6 수용체를 특이적으로 표적하고, (b) 하나 이상의 조건하에서 배양시 모집단 내 T 세포에서 PD-1 또는 PD-L1의 발현을 감소 및/또는 PD-1 또는 PD-L1의 상향조절을 억제 할 수 있는 억제성 단백질을 인코드하는 핵산 분자
    를 포함하는 벡터를 T 세포를 포함하는 세포의 모집단에 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포의 제조 방법.
  18. 청구항 1-10 중 어느 한 항의 조작된 T 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학 조성물.
  19. 필요로 하는 대상체에게 청구항 18의 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 암은 자궁경부암 또는 두경부암임을 특징으로 하는, 암 치료 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 화학요법 또는 방사선을 포함하는 기존 요법의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 암 치료 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 세포 및 기존 요법은 순차적으로 또는 동시에 투여됨을 특징으로 하는, 암 치료 방법.
  23. 청구항 1에 있어서, 종양은 림프구 또는 종양-침윤 림프구를 포함함을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  24. 청구항 11에 있어서, 종양은 림프구 또는 종양-침윤 림프구를 포함함을 특징으로 하는 핵산.
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MX2017015239A (es) * 2015-05-29 2018-02-19 Juno Therapeutics Inc Composicion y metodos para regular interacciones inhibitorias en celulas geneticamente modificadas.
KR20180040138A (ko) * 2015-07-13 2018-04-19 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 항pd-1 항체, 활성화 가능한 항pd-1 항체, 및 이들의 사용 방법
SG11201807489PA (en) * 2016-03-04 2018-09-27 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
CA3037086A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-12 Juno Therapeutics, Inc. Hpv-specific binding molecules
CN109071656B (zh) * 2017-01-05 2021-05-18 璟尚生物制药公司 检查点调节物拮抗剂

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