TW202015681A - 2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶化合物 - Google Patents

2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶化合物 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種式I化合物：

Description

2,3-二氫呋喃并[2,3-B]吡啶化合物
本發明係關於新穎的2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶化合物、包含該等化合物之醫藥組合物、使用該等化合物治療諸如阿茲海默症(Alzheimer's disease，AD)之神經退化性病症之方法及可用於合成該等化合物之中間物及方法。
本發明屬於治療以下之領域：AD、進行性核上麻痺(progressive supranuclear palsy，PSP)及其他涉及tau介導之神經退化的疾病及病症，其統稱為tau病變(tauopathy)。
AD為影響全世界數百萬患者之破壞性神經退化性病症。鑒於市場上目前批准的藥劑僅對患者提供短暫之症狀益處，對治療AD之需求遠未滿足。
微管相關蛋白tau寡聚形成絲狀結構諸如成對螺旋絲(paired helical filament，PHF)及直絲或扭曲絲，產生神經纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)及神經纖維網線(neuropil thread，NT)，為AD及其他tau病變之定義病理性特徵之一。已發現患有AD之個體大腦中的NFT之數目與疾病之嚴重程度密切相關，表明tau在神經元功能障礙及神經退化中起關鍵作用(Nelson等人,J Neuropathol Exp Neurol. ,71 (5), 362-381(2012))。已顯示tau病理學與PSP之疾病持續時間相關，此係因為具有更具侵襲性之疾病病程的病例比具有較慢進展之病例的tau負荷高。(Williams等人,Brain ,130 , 1566-76 (2007))。
過去的研究(Yuzwa等人,Nat Chem Biol ,4 (8), 483-490 (2008))支持O-GlcNAcase (OGA)抑制劑限制tau過磷酸化及聚集成病理性tau，用於治療AD及相關的tau介導之神經退化性病症的治療潛力。最近，已發現OGA抑制劑Thiamet-G與JNPL3 tau小鼠模型中之運動神經元損失減緩有關(Yuzwa等人,Nat Chem Biol ,8 , 393-399 (2012))，且與Tg4510 tau小鼠模型中之tau病理學及營養不良性神經突減少有關(Graham等人,Neuropharmacology ,79 , 307-313 (2014))。因此，認為OGA抑制劑為減少tau之過磷酸化病理形式之積聚的可行治療方法。
WO 2016/030443 A1揭示可用於治療tau病變之某些醣苷酶抑制劑。WO 2017/144639 A1及WO 2017/144633 A1揭示可用於治療tau病變及AD之某些醣苷酶抑制劑。
需要大腦滲透性OGA抑制劑為tau介導之神經退化性病症(諸如阿茲海默症及PSP)提供治療。本發明提供某些新穎化合物，其係OGA之強效抑制劑。另外，本發明提供某些新穎化合物，其係OGA之強效抑制劑，具有足夠的大腦滲透性潛力以有效治療tau病變，諸如AD及PSP。
因此，本發明提供一種式I化合物：
Figure 02_image005
式I 其中R為H或F，或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種治療需要此類治療之患者之阿茲海默症的方法，其包含向該患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明進一步提供一種治療需要此類治療之患者的輕度認知障礙向阿茲海默症之發展的方法，其包含向該患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種治療需要此類治療之患者的進行性核上麻痺之方法，其包含向該患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。本發明亦提供一種治療患者之tau介導之神經退化性病症的方法，其包含向需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
此外，本發明提供用於療法中，尤其用於治療阿茲海默症或用於預防輕度認知障礙向阿茲海默症發展之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。另外，本發明提供用於治療進行性核上麻痺之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。本發明亦提供用於治療tau介導之神經退化性病症之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
另外，本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療阿茲海默症或用於預防輕度認知障礙向阿茲海默症發展的藥物。另外，本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療進行性核上麻痺之藥物。本發明亦提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療tau介導之神經退化性病症之藥物。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明進一步提供一種用於製備醫藥組合物之方法，其包含摻合式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本申請案依據35 U.S.C. §119(e)主張2018年6月22日申請之美國臨時申請案序列號62/688,434之權益；其揭示內容以引用之方式併入本文中。
基於臨床表現及呈現輕度認知障礙之患者隨時間向阿茲海默症之發展，輕度認知障礙定義為與阿茲海默症有關之癡呆的潛在前驅階段。術語「預防輕度認知障礙向阿茲海默症發展」包括抑制、減緩、終止或逆轉患者之輕度認知障礙向阿茲海默症發展。
如本文所使用，術語「治療(treating)」或「治療(to treat)」包括抑制、減緩、終止或逆轉現存症狀或病症之發展或嚴重程度。
如本文所使用，術語「患者」係指人類。
如本文所使用，術語「有效量」係指本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的量或劑量，其在向患者投與單次或多次劑量後，在診斷或治療下向患者提供所需效果。
有效量可由熟習此項技術者藉由使用已知技術及藉由在類似情況下獲得的觀測結果來確定。在確定給患者之有效量時，考慮多種因素，包括(但不限於)：患者之物種；其體型、年齡及一般健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；疾病或病症之程度或者涉及或嚴重程度；個別患者之反應；所投與之特定化合物；投與模式；所投與之製劑的生物可用性特徵；所選劑量方案；伴隨藥物治療之使用；及其他相關情況。本發明之化合物在每日劑量下有效，其在每公斤體重約0.1至約15 mg範圍內。
本發明之化合物調配為醫藥組合物，其藉由使得化合物生物可用之任何途徑投與。較佳地，此類組合物係經口投藥。此類醫藥組合物及其製備方法為此項技術中所熟知的(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 編者L.V. Allen, 第22版, Pharmaceutical Press, 2012)。
式I化合物及其醫藥學上可接受之鹽尤其可用於本發明之治療方法，其中某些組態為較佳的。以下一系列本發明之化合物描述了此類組態。應瞭解，此等偏好可適用於治療方法及本發明之化合物。
本發明之化合物包括：
Figure 02_image007
式Ia(i)；
Figure 02_image009
式Ia(ii)；
Figure 02_image011
式Ib(i)；
Figure 02_image013
式Ib(ii)； (-)-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶； (+ )-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶； (-)-5-氟-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶；及 (+)-5-氟-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶； 及其醫藥學上可接受之鹽。
個別對映異構體可由一般熟習此項技術者在合成本發明之化合物的任何適宜時間點藉由諸如以下之方法分離或解析：選擇性結晶技術、對掌性層析(參見例如J. Jacques等人, 「Enantiomers, Racemates, and Resolutions 」, John Wiley and Sons, Inc., 1981，及E.L. Eliel與S.H. Wilen, 「Stereochemistry of Organic Compounds 」, Wiley-Interscience, 1994)，或超臨界流體層析(supercritical fluid chromatography，SFC) (參見例如T. A. Berger; 「Supercritical Fluid Chromatography Primer, 」 Agilent Technologies, 2015年7月)。
如本文所用，如下文所描繪之在對掌性位置1處具有波浪鍵之甲基：
Figure 02_image015
指示化合物為單一對映異構體；然而，尚未確定化合物上之此對掌性中心處之絕對組態(R)或(S)，且如以下相關製備方案及實例中之每一者之名稱所指示，化合物對應於(-)或(+)對映異構體。一般熟習此項技術者進一步理解，(-)或(+)標識為指示特定對映異構體呈現之旋光方向的經驗值，其可根據某些變數(諸如當量測旋光度時的溫度、所使用之溶劑、濃度及所使用之光的波長)而變化。
可例如藉由在此項技術中所熟知之標準條件下使本發明之化合物之適當游離鹼與適當醫藥學上可接受之酸在適合溶劑中反應來形成本發明之化合物的醫藥學上可接受之鹽。參見例如Gould, P.L., 「Salt selection for basic drugs,」International Journal of Pharmaceutics ,33 : 201-217 (1986)；Bastin, R.J.等人. 「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,」Organic Process Research and Development ,4 : 427-435 (2000)；及Berge, S.M.等人, 「Pharmaceutical Salts,」Journal of Pharmaceutical Sciences ,66 : 1-19, (1977)。
本發明之化合物或其鹽可藉由一般熟習此項技術者已知的各種工序來製備，其中一些在以下流程、製備方案及實例中加以說明。以下流程中各步驟之產物可藉由此項技術中所熟知之習知方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。在以下流程中，除非另外指示，否則所有取代基均如先前所定義。試劑及起始物質為一般熟習此項技術者容易獲得的。在不限制本發明之範疇的情況下，提供以下流程、製備方案及實例以進一步說明本發明。另外，一般熟習此項技術者應瞭解，式I化合物可藉由使用熟習此項技術者可製備之具有相應所需立體化學組態之起始物質或中間物製備。
某些縮寫定義如下：「ACN」係指乙腈；「Ac」係指乙醯基；「AcOH」係指乙酸；「Ac2 O」係指乙酸酐；「dba」係指二亞苄基丙酮；「DCM」係指二氯甲烷(methylene chloride)或二氯甲烷(dichloromethane)；「DIPEA」係指二異丙基乙胺;「DMEA」係指二甲基乙基胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「dppf」係指二苯基膦基二茂鐵；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ES/MS」係指電噴質譜法(Electrospray Mass Spectrometry)；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「EtOH」係指乙醇(ethanol)或乙醇(ethyl alcohol);「h」係指小時(hour)或小時(hours)；「IPA」係指異丙醇(isopropanol)或異丙醇(isopropyl alcohol)；「IPAm」係指異丙胺；「LiHMDS」係指雙(三甲基矽烷基)胺基鋰；「KOt Bu」係指第三丁醇鉀；「Me」係指甲基；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「min」係指分鐘(minute)或分鐘(minutes)；「n-BuLi」係指正丁基鋰;「OAc」係指乙酸酯；「RT」係指室溫；「SFC」係指超臨界流體層析；「TEA」係指三乙胺；「THF」係指四氫呋喃；「TMA」係指三甲胺；「TMEDA」係指四甲基乙二胺；「Tris」係指參(羥基甲基)胺基甲烷或2-胺基-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇；「[α]D 20 」係指在20℃及589 nm下之特定旋光度，其中c為以g/100 mL為單位之濃度。
流程 1
Figure 02_image017
流程1描繪自2,6-二氯-3-碘吡啶合成2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙醇的若干合成。在步驟A中，可實現丙二酸二乙酯經由過渡金屬催化之交叉偶合芳基化，如此項技術中所熟知。舉例而言，可在約0.05-0.06當量之CuI及0.1-0.15當量之吡啶甲酸存在下，將約1當量之2,6-二氯-3-碘吡啶與約1.5至2.5當量之丙二酸二乙酯及約3當量之適合鹼(諸如Cs2 CO3 )在適合的極性有機溶劑(諸如1,4-二噁烷)中加熱至約80℃，維持約4-8 h。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術，諸如萃取方法分離。舉例而言，經冷卻之反應混合物可用適當鹽水溶液(諸如NH4 Cl)稀釋，且用適當有機溶劑(諸如DCM、Et2 O或EtOAc)萃取。合併之有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，以獲得2-(2,6-二氯-3-吡啶基)丙二酸二乙酯，即流程1步驟A之產物，其無需額外純化即足以供額外使用。
在流程1步驟B中，水解熱脫羧(hydrolytic thermal decarboxylation)係在此項技術中充分描述的。舉例而言，約1當量之2-(2,6-二氯-3-吡啶基)丙二酸二乙酯，即流程1步驟A之產物，可在回流下於諸如HCl之無機酸水溶液中加熱。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如過濾。舉例而言，可藉由過濾收集在經冷卻之脫羧反應混合物中觀測到之所得沈澱物，以獲得2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙酸，即流程1步驟B之產物，其無需額外純化即足以供額外使用。
流程1步驟C中之2-芳基乙酸之酸部分之還原為此項技術中所熟知的且可在各種還原狀態下實現。舉例而言，約1當量之2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙酸，即流程1步驟B之產物，可溶解於諸如THF或1,4-二噁烷之極性有機溶劑中，且在約0℃下用諸如1.2-2.2當量之硼烷-THF複合物之適合還原劑處理。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如蒸發。舉例而言，可用適合的極性質子溶劑(諸如MeOH)淬滅硼烷-反應混合物，且可在減壓下濃縮所得反應混合物，以獲得粗2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙醇，即流程1步驟C之產物，其無需額外純化即足以供額外使用。
或者，2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙醇可經由鈴木交叉偶合反應(Suzuki cross-coupling reaction)由2,6-二氯-3-碘吡啶製備，以獲得3-乙烯基-吡啶中間物且隨後硼氫化。舉例而言，在流程1步驟D中，約1當量之2,6-二氯-3-碘吡啶可在氬氣或氮氣下在約90℃下在適合的極性有機溶劑(諸如EtOH、DMF、DMSO或1,4-二噁烷)中加熱18-36 h，該極性有機溶劑含有約1-1.1當量之乙烯基三氟硼酸鉀、約0.1-0.2當量之適合的過渡金屬配位體催化劑，諸如[1,1ʼ-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀、肆(三苯基膦)鈀或雙(三苯基膦)二氯化鈀(II)及約0.2-0.3當量之適合的鹼，諸如K2 CO3 、Cs2 CO3 、Na2 CO3 或K3 PO4 。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約1:0至約0:1之環己烷/EtOAc)溶離，以在溶劑蒸發之後獲得流程1步驟D之必需的2,6-二氯-3-乙烯基-吡啶產物。
在流程1步驟E中，流程1步驟D之產物2,6-二氯-3-乙烯基-吡啶之乙烯基部分之後續硼氫化充分描述於此項技術中，且可藉由在約45℃下將約1當量之2,6-二氯-3-乙烯基-吡啶與約1.4至5當量之9-硼雜雙環[3.3.1]壬烷之混合物加熱約2 h來實現。所得混合物可用NaOH及H2 O2 水溶液處理。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約1:0至約1:1之環己烷及EtOAc)溶離，以在溶劑蒸發之後獲得必需的2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙醇。
或者，在流程1步驟F中，可以與流程1步驟D中所描繪類似之方式實現2-[(E)-2-乙氧基乙烯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼㖦及2,6-二氯-3-碘吡啶之鈴木交叉偶合反應，以獲得2,6-二氯-3-[(E)-2-乙氧基乙烯基]吡啶。對於乙烯醚，如此項技術中所熟知，可實現後續O-脫烷基化並將醛原位還原為醇，如流程1步驟G中所示。舉例而言，可將於極性有機溶劑(諸如丙酮或1,4-二噁烷)中之約1當量之2,6-二氯-3-[(E)-2-乙氧基乙烯基]吡啶(即流程1步驟F之產物)用約4-6當量之無機酸水溶液(諸如HCl)處理，且可將所得混合物加熱至約60℃維持3-8 h。所得醛可藉由此項技術中所熟知之技術回收，諸如萃取。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc)稀釋，且用無機鹼(諸如NaHCO3 )之水溶液淬滅。可分離所得層，水層可另外用EtOAc萃取；合併之有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可溶解於極性有機溶劑(諸如MeOH及THF)之適合混合物中，且用約1.3-1.8當量之適合的氫化鋁或硼氫化物還原劑(諸如氫化鋰鋁或NaBH4 )處理。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約1:0至約2:3之環己烷及EtOAc)溶離，以在溶劑移除之後獲得2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙醇，即流程1步驟G之產物。
流程 2
Figure 02_image019
流程2描繪式Ia之合成。在流程2步驟A中，熟習此項技術者將認識到，在約60℃之加熱下在適合的溶劑(諸如THF、1,4-二噁烷或2-甲基-2-丁醇)中，將約1當量之2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙醇用約1.5當量之強鹼(諸如第三丁醇鈉)處理，可產生所需之6-氯-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶(參見Ondachi, Pauline W; Comins, Daniel L.Journal of Organic Chemistry ; 75(5), 1706-16,2010 )。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取。舉例而言，反應混合物可用適合的混合物有機溶劑(諸如DCM或CHCl3 )及飽和鹽水溶液(諸如NH4 Cl)稀釋。可分離所得層，水層可另外用適當有機溶劑萃取，且合併之萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，以獲得6-氯-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶，即流程2步驟A之產物，其無需額外純化即適於額外使用。
在流程2步驟B中，經由過渡金屬催化用CN置換2-氯化物為文獻中所熟知的。舉例而言，可將約1當量之6-氯-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶、約0.1-0.5當量之亞鐵氰化鉀三水合物及約0.5當量之乙酸鉀於諸如1,4-二噁烷、THF、DMF或DMSO之適合的有機溶劑中之混合物加熱至約100℃維持約12-24 h，該有機溶劑含有約20%水及約0.025-0.05當量之適合的鈀源，諸如三氟甲磺酸烯丙基(2-二第三丁基膦基-2',4',6'-三異丙基-1,1'-聯苯)鈀(II)及約0.025-0.05當量之適合的配位體，諸如2-二第三丁基膦基-2',4',6'-三異丙基聯苯。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)及水稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約1:0至約2:3之環己烷及EtOAc)溶離，以在溶劑移除之後獲得2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-甲腈，即流程2步驟B之產物。
將氰基部分轉化為相應的甲基酮可藉由用格林納(Grignard)試劑或有機鋰試劑處理來實現，如此項技術中所熟知。舉例而言，在流程2步驟C中，可在約0℃下將約1當量之溶解於適合的有機溶劑(諸如Et2 O、THF或1,4-二噁烷)中之2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-甲腈用約2當量之含溴化甲基鎂溶液之Et2 O處理約1-4 h。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)及水稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約1:0至約2:3之環己烷及EtOAc)溶離，以在溶劑移除之後獲得1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮，即流程2步驟C之產物。
或者，在流程2步驟D中，6-氯-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶可在過渡金屬催化下轉化成1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮。舉例而言，可在適合的極性有機溶劑(諸如乙二醇或DMSO)中將約1當量之6-氯-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶及約3當量之乙二醇單乙烯基醚加熱至約110-170℃維持約30-240 min，該極性有機溶劑含有約0.05當量之適合的過渡金屬-配位體錯合物，諸如雙(三苯基膦)二氯化鈀(II)或[1,3-雙(二苯基膦基)-丙烷]二氯化鈀(II)，及約3-3.5當量之適當非親核胺，諸如TEA或DIPEA。所得混合物可在減壓下濃縮且用過量無機酸水溶液(諸如HCl)處理約5 min-2 h。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取。舉例而言，反應混合物可用水稀釋且用適當有機溶劑(諸如DCM、CHCl3 或EtOAc)萃取。合併之有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮，得到1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮，即流程2步驟D之產物，其無需額外純化即適於額外使用。
熟習此項技術者將認識到，酮之還原可在多種條件下完成，諸如藉由非立體選擇性鋁氫化物或硼氫化物，或藉由對映選擇性還原劑(諸如酶促還原)，以獲得外消旋或對映選擇性甲醇。舉例而言，在流程2步驟E中，用過量酶促對映選擇性對掌性還原劑(諸如酮還原酶P3-C12酶)及酮還原酶再循環混合物處理約1當量之1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮，可得到對映異構性增濃之1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇之混合物。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)及水稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約1:1至約0:1之異己烷及Et2 O)溶離，以在溶劑移除之後獲得分離之對映異構體1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇，即流程2步驟E之產物。熟習此項技術者將認識到，外消旋或對映異構性增濃之產物混合物之解析可另外經由管柱層析及/或對掌性層析分離來實現。
在流程2步驟F中，甲醇轉化成烷基氯可在此項技術中所熟知之多種SN 2型氯化條件下實現。舉例而言，約1當量之1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇溶解於諸如DCM之適合的有機溶劑中，且該有機溶劑含有約2.5當量之適合的非親核胺鹼(諸如TEA或DIPEA)，可在約0℃至室溫下用約2當量之甲磺醯氯處理約24 h至7天。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)及NaHCO3 飽和水溶液稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約7:3至約1:1之異己烷及Et2 O)溶離，以在溶劑移除之後獲得6-(1-氯乙基)-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶之外消旋混合物，即流程2步驟F之產物。熟習此項技術者將認識到，外消旋或對映異構性增濃之產物混合物之解析可另外經由管柱層析及對掌性層析(包括SFC方法)分離來實現。
流程2步驟G描繪式Ia之製備。在鹼性條件下用胺親核試劑對6-(1-氯乙基)-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶進行氯化物置換為此項技術中所熟知的。舉例而言，可在適當有機溶劑(諸如ACN、1,4-二噁烷、DMF或DMSO)中在約100-130℃下將約1當量之6-(1-氯乙基)-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶與約2當量之經適當取代之哌啶(例如4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)哌啶)之混合物以熱學方式加熱或在微波條件下加熱/輻射約90-240 min。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)及NH4 Cl飽和水溶液稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約1:0至約9:1之DCM及MeOH)溶離，且藉由在C-18矽膠上之SFC對掌性層析來進行額外純化，其用含有非親核胺(諸如DMEA或TEA)之醇溶劑(諸如異丙醇)/CO2 的適合混合物(例如約1:9至1:4之含有約0.2% DMEA之異丙醇/CO2 )溶離，以在溶劑移除之後獲得分離的6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶之對映異構體，即流程2步驟G之產物。
或者，如此項技術中所充分瞭解，可經由還原胺化技術製備式Ia，如流程2步驟H中所示。舉例而言，約1當量之1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮與約2當量之經適當取代之哌啶(例如4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)哌啶)於適合的有機溶劑(諸如MeOH、EtOH、THF、1,4-二噁烷、DCM、二氯乙烷或CHCl3 )中之混合物，該有機溶劑含有約2當量之適合的路易斯酸(Lewis acid)，諸如異丙醇鈦(IV)、氯化鋅(II)或乙酸鋅(II)。反應混合物可在約室溫至約回流下攪拌，且添加約3當量之適當還原劑，諸如硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉或三乙醯氧基硼氫化鈉。反應混合物可加熱至約40℃至約回流維持約12-24 h。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及對掌性管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合的有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)及NH4 Cl飽和水溶液稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在C-18矽膠上進行急驟對掌性層析，其用適合的約NH4 HCO3 水溶液/ACN之混合物溶離，且藉由在C-18矽膠上之SFC對掌性層析來進行額外純化，其用含有非親核胺(諸如DMEA或TEA)之醇溶劑(諸如異丙醇)/CO2 的適合混合物(例如約1:9至1:4之含有約0.2% DMEA之異丙醇/CO2 )溶離，以在溶劑移除之後獲得分離的6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶之對映異構體，即流程2步驟H之產物。熟習此項技術者將認識到，可視需要經由對掌性層析(包括SFC)在流程2之合成中的任何步驟分離任何對掌性物質。
流程 3
Figure 02_image021
流程3描繪式Ib之合成。在流程3步驟A中，可在室溫下將約1當量之1-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)乙酮(US 8629270)用約0.25-0.5當量之三氟甲磺酸處理約48-96 h。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如蒸發及管柱層析。舉例而言，反應混合物可在減壓下濃縮，且所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約95:5至約85:15之異己烷及Et2 O)溶離，以在溶劑移除之後獲得2-氯-4-(1,1-二乙氧基乙基)-5-氟-嘧啶，即流程3步驟A之產物。
如此項技術中充分記載，可在不分離氯化物置換產物之情況下，用2個步驟依序實現2-氯-4-(1,1-二乙氧基乙基)-5-氟-嘧啶中氯化部分之親核置換，及隨後在4-位置脫除保護基成酮。舉例而言，溶解於非質子極性有機溶劑(諸如THF或1,4-二噁烷)中之約1當量之3-丁炔-1-醇可用約1當量之NaH於礦物油中之60%分散液處理約30 min-2 h，且可添加約0.95-1當量之2-氯-4-(1,1-二乙氧基乙基)-5-氟-嘧啶溶解於類似的非質子極性溶劑中之溶液。所得混合物可攪拌約60-180 min。所得粗反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術回收，諸如萃取方法。舉例而言，經冷卻之反應混合物可用適當鹽水溶液(諸如NH4 Cl)稀釋，且用適當有機溶劑(諸如DCM、Et2 O或EtOAc)萃取。合併之有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物可溶解於適當極性有機溶劑(諸如THF或1,4-二噁烷)中，且用過量無機酸(諸如HCl)處理，且攪拌約3-24 h。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術回收，諸如過濾。舉例而言，反應混合物可在減壓下濃縮至部分體積，所得殘餘物可用諸如己烷或環己烷之適合的非極性有機溶劑濕磨，且所得沈澱物可藉由過濾來收集，得到1-(2-丁-3-炔氧基-5-氟-嘧啶-4-基)乙酮，即流程3步驟B之產物。
文獻中已報導經由反電子需求雜狄爾斯-阿德(Diels-Alder)型反應來進行的分子內環化與隨後的嘧啶炔烴之反加成合環反應以獲得相應之四氫氮雜苯并呋喃(參見R.E. Martin等人,Eur. J. Org. Chem. 2012 , 47-52)。因而，在流程3步驟C中，可將1-(2-丁-3-炔氧基-5-氟-嘧啶-4-基)乙酮於適當高沸點溶劑(諸如N-甲基吡咯啶酮或環丁碸)中之溶液加熱至約235℃維持約30 min。所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如管柱層析。舉例而言，反應混合物可在矽膠上進行急驟層析，用適合的有機溶劑混合物(諸如約7:3至約1:4之異己烷及MTBE)溶離，以在溶劑蒸發之後獲得1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮，即流程3步驟C之產物。
流程3步驟D可在與流程2步驟E中所述類似的條件下實現。另外，可使用一系列對掌性催化劑實現酮不對稱還原成相應的對掌性甲醇，如此項技術中所充分瞭解。舉例而言，約1當量之1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮可在含有約0.05-0.1當量之基於釕之對掌性催化劑(例如[N -[(1S ,2S )-2-(胺基-κN )-1,2-二苯基乙基]-4-甲基苯磺醯胺基-κN ]氯[(1,2,3,4,5,6-η)-1-甲基-4-(1-甲基乙基)苯]-釕)的5:2 HCO2 H-TEA之複合物中加熱。可在氮氣下將混合物加熱至約35℃維持約2-4 h，且所得反應產物可藉由此項技術中所熟知之技術分離，諸如萃取及管柱層析。舉例而言，反應混合物可用適合有機溶劑(諸如EtOAc或DCM)及NaHCO3 飽和水溶液稀釋，可分離各相，有機萃取物可用NaCl飽和水溶液洗滌，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濾液可在減壓下濃縮。所得殘餘物可在矽膠上進行急驟層析，其用適合的有機溶劑混合物(諸如約1:1之己烷及EtOAc)溶離，以在溶劑移除後獲得分離的1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇之對映異構體，即流程3步驟D之產物。
在流程3步驟E-F中，可與流程2步驟F-G中所述之條件類似地製備式Ib的經分離之對映異構體。或者，在流程3步驟G中，可經由類似於流程2步驟H之還原胺化由1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮製備式Ib的經分離之對映異構體。如流程2中，熟習此項技術者將認識到，可視需要在流程3之合成中的任何步驟使用標準技術分離對掌性物質。
製備方案及實例 以下製備方案及實例進一步說明本發明且表示本發明化合物之典型合成。。試劑及起始物質易於獲得或可易於由一般熟習此項技術者合成。應理解，製備方案及實例係以說明而非限制之方式闡述，且一般熟習此項技術者可進行多種修改。
在AGILENT® HP1100液相層析系統上執行LC-ES/MS。在連接至HP1100 HPLC之質量選擇性偵測器(Mass Selective Detector)四極質譜儀上執行電噴質譜法分析量測(在正及/或負模式中獲得)。LC-MS條件(低pH)：管柱：PHENOMENEX® GEMINI® NX C18 2.1 × 50 mm 3.0 µm；梯度：在3 min內5-100% B，接著100% B維持0.75 min管柱溫度：50℃+/-10℃；流動速率：1.2 mL/min；溶劑A：具有0.1% HCOOH之去離子水；溶劑B：具有0.1%甲酸之ACN；波長214 nm。替代性LC-MS條件(高pH)：管柱：XTERRA® MS C18管柱2.1×50 mm，3.5 µm；梯度：5%溶劑A維持0.25 min，梯度在3 min內自5%至100%溶劑B且100%溶劑B維持0.5 min或在3 min內自10%至100%溶劑B且在100%溶劑B維持0.75 min； 管柱溫度：50℃+/-10℃；流動速率：1.2 mL/min；溶劑A：10 mM NH4 HCO3 pH 9；溶劑B：ACN；波長：214 nm。
在配備有質量選擇性偵測器質譜儀及LEAP®自動進樣器/溶離份收集器之AGILENT® 1200 LC-ES/MS上執行製備型逆相層析。高pH方法在75×30 mm PHENOMENEX® GEMINI® -NX 5 µ粒度管柱及10×20 mm保護管柱上進行。流動速率為85 mL/min。除非另外指出，否則溶離劑為含10 mM碳酸氫銨(pH 10)之乙腈。
NMR光譜在Bruker AVIII HD 400 MHz NMR光譜儀上執行，以CDCl3 或DMSO溶液形式獲得，以ppm為單位報告，使用殘餘溶劑[CDCl3 ，7.26 ppm；(CD3 )2 SO，2.05 ppm]作為參考標準。當報告峰多重性時，可使用以下縮寫：s (單重峰(singlet))、d (二重峰(doublet))、t (三重峰(triplet))、q (四重峰(quartet))、m (多重峰(multiplet))、br-s (寬單重峰(broad singlet))、dd (二重峰之二重峰(doublet of doublets))、dt (三重峰之二重峰(doublet of triplets))。當報告時，偶合常數(J)以赫茲(Hz)為單位報告。
製備方案 1 2-(2,6-二氯-3-吡啶基)丙二酸二乙酯
Figure 02_image023
流程1步驟A：在氮氣下在80℃下將丙二酸二乙酯(17.8 mL，117 mmol)、2,6-二氯-3-碘吡啶(21.8 g，78.1 mmol)、吡啶甲酸(1.2 g，10.1 mmol)、CuI (0.8 g，4.3 mmol)及Cs2 CO3 (74.8 g，229.6 mmol)於1,4-二噁烷(200 mL)中之混合物攪拌6 h。將反應混合物冷卻至室溫且添加NH4 Cl飽和水溶液(150 mL)。所得混合物用EtOAc萃取兩次，且合併之有機萃取物用NH4 Cl飽和水溶液及NaCl飽和水溶液依序洗滌。有機萃取物經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下蒸發濾液，得到呈棕色油狀之標題化合物(29.4 g，93%產率)，其無需進一步純化即適於使用。ES/MS (35 Cl/37 Cl)m/z : 306/308 (M+H)。
製備方案 2 2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙酸
Figure 02_image025
流程1步驟B：在回流下將2-(2,6-二氯-3-吡啶基)丙二酸二乙酯(1.2 g，2.5 mmol)於5 M HCl水溶液(11 mL)中之溶液加熱24 h。將反應物冷卻至室溫且藉由過濾收集所得白色沈澱，得到呈白色粉末狀之標題化合物(362 mg，64%產率)。ES/MS (35 Cl/37 Cl)m/z : 206/208 (M+H)。
製備方案 3 2,6-二氯-3-[(E)-2-乙氧基乙烯基]吡啶
Figure 02_image027
流程1步驟F：在氮氣下，向具有攪拌器及空氣冷凝器之1頸圓底燒瓶中添加2,6-二氯-3-碘-吡啶(1.0 g，3.8 mmol)、2-[(E)-2-乙氧基乙烯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼㖦(0.9 g，4.8 mmol)、Cs2 CO3 (3.75 g，11.5 mmol)、1,4-二噁烷(19.2 mL)及水(4.26 mL)。在真空與氮氣之間交替吹掃此反應混合物3次，且添加[1,1'雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II) (0.2 g)。在90℃下攪拌所得混合物3 h，將反應物倒至NH4 Cl飽和水溶液上，且用EtOAc萃取水性混合物三次。合併之有機萃取物經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用0-100% EtOAc/環己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到標題化合物(748 mg，89%產率)。1 H NMR (300 MHz, CDCl3 ): δ 1.37 (m, 3H), 3.97 (m, 2H), 5.97 (m, 1H), 6.99 (m, 1H), 7.16 (m, 1H),7.60 (m, 1H)。
製備方案 4 2,6-二氯-3-乙烯基-吡啶
Figure 02_image029
流程1步驟D：向圓底燒瓶中添加2,6-二氯-3-碘-吡啶(6.3 g，22.9 mmol)、乙烯基三氟硼酸鉀(3.09 g，23 mmol)、雙(三苯基膦)二氯化鈀(II) (327 mg，0.46 mmol)及Na2 CO3 (4.85 g，45.7 mmol)。將燒瓶抽空且用氮氣回填三次。添加EtOH (75.1 mL)，再次抽空燒瓶且用氮氣回填三次。反應混合物在90℃下加熱隔夜，用EtOAc及水稀釋，分離各相，且用EtOAc萃取水相三次。合併有機萃取物，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用0-100% EtOAc/環己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後獲得標題化合物(3.0 g，69%產率)。1 H NMR (300 MHz, CDCl3 ): δ 5.53 (m, 1H), 5.78 (m, 1H), 6.97 (m, 1H), 7.26 (m, 1H),7.82 (m, 1H)。
製備方案 5 2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙醇
Figure 02_image031
流程1步驟C：在冰浴中冷卻2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙酸(8.1 g，37 mmol)於THF (100 mL)中之溶液。緩慢添加1 M BH3 -THF複合物於THF (55.5 mL，55.5 mmol)中之溶液。攪拌反應混合物1 h，升溫至室溫且再攪拌20 h。小心地添加MeOH (30 mL)，攪拌所得溶液5 min，且在減壓下濃縮。將所得殘餘物溶解於MeOH中且在減壓下再次濃縮，得到呈黏稠棕色油狀之標題化合物(7.7 g，98%產率)，其無需額外純化即適於使用。ES/MS (35 Cl/37 Cl)m/z : 192/194 (M+H)。
製備方案 5 之替代工序 流程1步驟G：在氮氣下，向具有攪拌器及空氣冷凝器之1頸圓底燒瓶中添加2,6-二氯-3-[(E)-2-乙氧基乙烯基]吡啶(748 mg，3.4 mmol)至丙酮(17.1 mL)且添加2 M HCl水溶液(8.6 mL)。在攪拌下在60℃下加熱所得混合物3.5 h。將所得混合物冷卻至室溫，用EtOAc稀釋，且用NaHCO3 飽和水溶液淬滅。所得水性混合物用EtOAc萃取三次，合併之有機萃取物經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。將所得殘餘物溶解於MeOH (8.6 mL)及THF (4.9 mL)中，且歷經5 min逐份添加NaBH4 (195 mg)。在室溫下攪拌反應混合物40 min，用水淬滅，用EtOAc萃取三次，且用NaCl飽和水溶液洗滌合併之有機萃取物，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用0-60% EtOAc/環己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後獲得標題化合物(315 mg，47%產率)。ES/MSm/z : 193 (M+H)。
製備方案 5 之替代工序 流程1步驟E：在室溫下向燒瓶中添加2,6-二氯-3-乙烯基-吡啶(3 g，17.5 mmol)及THF (1.5 mL)。在冰水浴中攪拌混合物且歷經2 min逐滴添加0.5 M 9-硼雜雙環[3.3.1]壬烷於THF (49.1 mL)中之溶液。在45℃加熱塊中攪拌反應混合物2 h。在冰水浴中攪拌反應混合物，且歷經5 min逐滴添加2 N NaOH水溶液(26.3 mL)，接著歷經2 min添加35% H2 O2 水溶液(4.87 mL)，且在室溫下攪拌所得反應混合物2 h。反應混合物用水稀釋且用EtOAc萃取三次，合併之有機萃取物用Na2 S2 O3 -5 H2 O飽和水溶液洗滌，經Na2 SO4 乾燥且在減壓下濃縮。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用0-50% EtOAc/環己烷溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後獲得標題化合物(1.8 g，55%產率)。ES/MSm/z : 193 (M+H)。
製備方案 6 6-氯-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶
Figure 02_image033
流程2步驟A：在60℃下將2-(2,6-二氯-3-吡啶基)乙醇(10.8 g，56.3 mmol)及第三丁醇鉀(9.5 g，84.5 mmol)於2-甲基-2-丁醇(200 mL)中之溶液加熱2 h。將反應混合物冷卻至室溫，在減壓下濃縮至部分體積，且所得混合物用CHCl3 及NH4 Cl飽和水溶液稀釋。分離所得層，用CH3 Cl額外萃取水相兩次，合併之有機萃取物經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，獲得呈棕色油狀之標題化合物(8.7 g，84%產率)，其在室溫下靜置時固化，無需額外純化即具有足夠純度以供使用。ES/MS (35 Cl/37 Cl)m/z : 156/158 (M+H)。
製備方案 7 2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-甲腈
Figure 02_image035
流程2步驟B：向圓底燒瓶中添加6-氯-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶(1.1 g，7.2 mmol)、2-二第三丁基膦基-2',4',6'-三異丙基聯苯(126 mg，0.3 mmol)、三氟甲磺酸烯丙基(2-二第三丁基膦基-2',4',,6',-三異丙基-1,1'-聯苯)鈀(II) (208 mg，0.3 mmol)、KOAc (353 mg，3.6 mmol)及亞鐵氰化鉀三水合物(492 mg，1.1 mmol)。向混合物中添加水(2.2 mL)及1,4-二噁烷(7.2 mL)且在室溫下將氮氣鼓泡通過混合物維持10 min。在100℃加熱塊中攪拌反應混合物隔夜。將反應混合物冷卻至室溫，用EtOAc稀釋，用水淬滅，分離各相，且用EtOAc額外萃取水相三次。合併之有機萃取物用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用0-40% EtOAc/環己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後獲得標題化合物(600 mg，57%產率)。ES/MSm/z : 147 (M+H)。
製備方案 8 1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮
Figure 02_image037
流程2步驟D：將6-氯-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶(8.6 g，47.4 mmol)、乙二醇單乙烯基醚(13 mL，145 mmol)、[1,3-雙(二苯基膦基)丙烷]二氯化鈀(II) (1.4 g，2.4 mmol)及TEA (23 mL，165 mmol)於乙二醇(100 mL)中之混合物加熱至160℃維持1 h。冷卻所得混合物且在減壓下濃縮。將5 N HCl水溶液(50 mL)添加至所得殘餘物中，攪拌混合物10 min，且用DCM萃取三次。在減壓下濃縮合併之有機萃取物且在EtOAc中將所得殘餘物製成漿液。過濾所得混合物且用水洗滌濾液三次。有機相經MgSO4 乾燥且在減壓下濃縮以得到呈棕色油狀之標題化合物，其在室溫下靜置後緩慢固化(7.0 g，82%產率)，其無需額外純化即適於使用。ES/MSm/z : 164 (M+H)。
製備方案 8 之替代工序 流程2步驟C：向燒瓶中添加含2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-甲腈(349 mg，2.4 mmol)之THF (4.7 mL)。在0℃下添加3 M溴化甲基鎂於Et2 O (1.5 mL)中之溶液且攪拌所得反應混合物2 h。用NH4 Cl飽和水溶液淬滅混合物且攪拌20 min。用EtOAc萃取混合物三次，且合併之有機萃取物用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用0-40% EtOAc/環己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後獲得標題化合物(339 mg，87%產率)。ES/MSm/z : 164 (M+H)。
製備方案 9 (-)-1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇
Figure 02_image039
(-)對映異構體 流程2步驟E：向1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮(1.8 g，11.2 mmol)於水(160 mL)及IPA (40 mL)中之溶液中添加KRED P3-C12酶(0.9 g)及KRED再循環混合物P (0.9 g)。在35℃下攪拌反應物18 h且用EtOAc萃取所得混合物三次。合併之有機萃取物用水及NaCl飽和水溶液依序洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物經由在矽膠上急驟層析來純化，其用50-100% Et2 O:異己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到標題化合物(1.35 g，73%產率)。ES/MSm/z : 166 (M+H)。[α]D 20 = -58.2° (c = 1, MeOH)。如上文所使用，用於製備方案9之術語「(-)」或「(-)對映異構體」係指製備方案9之對映異構體，其在20℃及589 nm下具有逆時針(或「(-)」)之旋光度，且在甲醇中具有所述之濃度「c」 (g/100 mL)。
製備方案 10 (+)-6-[1-氯乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶
Figure 02_image041
(+)對映異構體 流程2步驟F：將(-)-1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇(1.35 g，8.2 mmol)及TEA (2.8 mL，20 mmol)於DCM (35 mL)中之溶液在冰浴中冷卻，且逐滴添加甲烷磺醯氯(1.2 mL，15 mmol)。將反應物升溫至室溫，攪拌7天且用NaHCO3 飽和水溶液(20 mL)淬滅。將混合物傾倒通過相分離器筒，用DCM洗滌。在減壓下移除溶劑後，所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用Et2 O:異己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到標題化合物(1.2 g，76%產率)。ES/MS (35 Cl/37 Cl)m/z : 184/186 (M+H)。[α]D 20 = +88.2° (c = 1, DCM)。如上文所使用，用於製備方案10之術語「(+)」或「(+)對映異構體」係指製備方案10之對映異構體，其在20℃及589 nm下具有順時針(或「(+)」)之旋光度，且在DCM中具有所述之濃度「c」 (g/100 mL)。
製備方案 11 2-氯-4-(1,1-二乙氧基乙基)-5-氟-嘧啶
Figure 02_image043
流程3步驟A：向1-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)乙酮(46.4 g，266 mmol)於原甲酸三乙酯(120 mL)中之溶液中添加三氟甲磺酸(1 mL)。攪拌反應物72 h且在真空中濃縮。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用5-15% Et2 O/異己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到標題化合物(53.9 g，70%產率)。ES/MS (35 Cl/37 Cl)m/z : 249/251 (M+H)。
製備方案 12 1-(2-丁-3-炔氧基-5-氟-嘧啶-4-基)乙酮
Figure 02_image045
流程3步驟B：向3-丁炔-1-醇(17 mL，218 mmol)於THF (400 mL)中之冰浴冷卻之溶液中逐份添加60% NaH於礦物油(8.7 g，218 mmol)中之懸浮液。在室溫下攪拌所得混合物1 h且逐滴添加含2-氯-4-(1,1-二乙氧基乙基)-5-氟-嘧啶(53.9 g，217 mmol)之THF (200 mL)。攪拌暗紅色混合物90 min且用NH4 Cl飽和水溶液淬滅。水性混合物用EtOAc萃取三次，合併之萃取物用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。將所得殘餘物溶解於THF (400 mL)中且添加2 N HCl水溶液(100 mL)。將所得混合物攪拌3 h且在減壓下濃縮。所得沈澱藉由過濾收集且用環己烷濕磨，以在過濾之後得到標題化合物(39.6 g，85%產率)。ES/MSm/z : 209 (M+H)。
製備方案 13 1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮
Figure 02_image047
流程3步驟C：將1-(2-丁-3-炔氧基-5-氟-嘧啶-4-基)乙酮(3.25 g，14.8 mmol)於環丁碸(20 mL)中之溶液加熱至235℃維持30 min。混合物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用40-80% MTBE:異己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後獲得黃色油狀物。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來進一步純化，其用30-50% MTBE:異己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到呈黃色固體狀之標題化合物(739 mg，27%產率)。ES/MSm/z : 182 (M+H)。
製備方案 14 1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇
Figure 02_image049
流程3步驟D：將1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮(904 mg，4.9 mmol)於THF (30 mL)及EtOH (5 mL)中之溶液在冰浴中冷卻。添加NaBH4 (194 mg，5.1 mmol)且攪拌混合物1.5 h。藉由小心添加NH4 Cl飽和水溶液來淬滅反應物且在減壓下濃縮。將水及DCM依序添加至所得殘餘物中且經由相分離器筒過濾所得兩相混合物。在減壓下濃縮經分離之DCM濾液，得到標題化合物(845 mg，94%產率)。ES/MSm/z : 184 (M+H)。
製備方案 15 6-(1-氯乙基)-5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶
Figure 02_image051
流程3步驟E：將1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇(845 mg，4.6 mmol)及DIPEA (1.8 mL，10 mmol)於DCM (20 mL)中之溶液在冰浴中冷卻，且逐滴添加甲烷磺醯氯(0.8 mL，10 mmol)。將反應物升溫至室溫且攪拌16 h。混合物用DCM稀釋且使用NaHCO3 飽和水溶液(20 mL)淬滅。將混合物傾倒通過相分離器筒，用DCM洗滌。收集DCM相，在減壓下濃縮，且所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用50-100% Et2 O:異己烷之梯度溶離，在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到標題化合物(858 mg，83%產率)。ES/MS (35 Cl/37 Cl)m/z : 202.0/204 (M+H)。
製備方案 16 (-)-1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇
Figure 02_image053
(-)對映異構體 流程3步驟D：在HCOOH-TEA 5:2複合物(30 mL)中合併1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮(3.419 g，18.9 mmol)與[N -[(1S ,2S )-2-(胺基-κN )-1,2-二苯基乙基]-4-甲基苯磺醯胺基-κN ]氯[(1,2,3,4,5,6-η)-1-甲基-4-(1-甲基乙基)苯]-釕(1.0 g，1.6 mmol)且在攪拌下用氮氣吹掃5 min。在N2 下加熱所得混合物至35℃維持2 h。冷卻反應混合物且用EtOAc及NaHCO3 飽和水溶液稀釋。用EtOAc萃取混合物三次。合併之有機萃取物經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下自濾液移除溶劑。藉由在矽膠上急驟層析來純化粗產物，其使用50% EtOAc於己烷中之混合物，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到標題化合物(3.0 g，87%產率)。ES/MSm/z : 184 (M+H)。[α]D 20 = -16.8° (c = 2, MeOH)。如上文所使用，用於製備方案16之術語「(-)」或「(-)對映異構體」係指製備方案16之對映異構體，其在20℃及589 nm下具有逆時針(或「(-)」)之旋光度，且在甲醇中具有所述之濃度「c」 (g/100 mL)。
製備方案 17 (+)-6-[1-氯乙基]-5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶
Figure 02_image055
(+)對映異構體 流程3步驟E：將(-)-1-(5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙醇(3.0 g，16.3 mmol)於DMF (75 mL)中之溶液用苯甲醯氯(2.9 mL，25 mmol)逐滴處理。在室溫下在氮氣下攪拌反應混合物16 h。混合物用EtOAc及NaHCO3 飽和水溶液稀釋。用EtOAc萃取混合物三次，合併之有機萃取物經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下自濾液移除溶劑。藉由在矽膠上急驟層析來純化粗產物，其使用5%至100% EtOAc/己烷之梯度，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到標題化合物(3.1 g，95%產率)。ES/MS (35 Cl/37 Cl)m/z : 202.0/204  (M+H)。[α]D 20 = + 68.2° (c = 0.2, DCM)。如上文所使用，用於製備方案17之術語「(-)」或「(-)對映異構體」係指製備方案17之對映異構體，其在20℃及589 nm下具有順時針(或「(+)」)之旋光度，且在DCM中具有所述之濃度「c」 (g/100 mL)。
製備方案 18 4-(乙醯胺基胺甲醯基)哌啶-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image057
向燒瓶中添加含1-第三丁氧基羰基哌啶-4-甲酸(15.0 g，65.8 mmol)之THF (150.8 mL)。在冰水浴中攪拌溶液且一次性添加1,1'-羰基二咪唑(15.2 g，92.1 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物2 h，且在0℃下一次性添加乙醯肼(6.5 g，85.5 mmol)。將反應混合物升溫至室溫且攪拌隔夜，且用NaHCO3 飽和水溶液(250 mL)及2-甲基四氫呋喃稀釋。將混合物轉移至分液漏斗中且分離各層。用2-甲基四氫呋喃萃取水層，用NaCl飽和水溶液洗滌合併之有機萃取物且經MgSO4 乾燥。用DCM萃取水層兩次，用NaCl飽和水溶液洗滌合併之有機萃取物且經MgSO4 乾燥。合併兩種有機溶液且在減壓下濃縮，得到殘餘物，其與MTBE (300 mL)合併。在50℃加熱塊中攪拌混合物1 h，在室溫下攪拌隔夜，過濾且濾餅用MTBE洗滌。在真空下在45℃下乾燥經過濾之固體3 h以獲得呈白色固體狀之標題化合物(14.5 g，48.5 mmol，73.7%產率)。ES/MSm/z : 308 (M+Na)。
製備方案 19 2-甲基-5-(4-哌啶基)-1,3,4-噁二唑
Figure 02_image059
向燒瓶中添加三苯基膦(16.4 g，61.9 mmol)及DCM (177 mL)。在室溫下攪拌溶液且逐份添加I2 (16.0 g，61.9 mmol)；添加TEA (10.9 mL，77.4 mmol)且在室溫下攪拌反應混合物15 min。在冰水浴中攪拌混合物且添加4-(乙醯胺基胺甲醯基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(9.3 g，31.0 mmol)。在冰水浴中攪拌反應混合物2 h，添加NaHCO3 飽和水溶液且將混合物轉移至分液漏斗中。分離各層且用DCM萃取水層。合併之有機萃取物經MgSO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物，將其溶解於DCM (186 mL)中。向溶液中添加TFA (46.5 mL)且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。在減壓下濃縮混合物且將所得殘餘物與DCM及水合併。分離各層且用EtOAc萃取水層兩次。用50% NaOH水溶液將水層鹼化至pH~14且用DCM萃取6次。合併之有機萃取物用NaCl飽和水溶液洗滌，經MgSO4 乾燥且在減壓下濃縮以得到固體，其在真空下在40℃下乾燥2 h，以獲得呈灰白色固體狀之標題化合物(4.3 g，25.9 mmol，83%產率)。ES/MSm/z : 168 (M+H)。
實例 1 (-)-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶
Figure 02_image061
(-)對映異構體 流程2步驟G：在微波中在120℃下將(+)-6-[1-氯乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶(247 mg，1.3 mmol)、4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)哌啶(476 mg，2.7 mmol)及K2 CO3 (195 mg，1.4 mmol)於ACN (18 mL)中之混合物輻射150 min。反應混合物用EtOAc稀釋且用NH4 Cl飽和水溶液淬滅。用EtOAc萃取混合物且經MgSO4 乾燥有機相。在減壓下蒸發濾液且所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用0-10% MeOH:DCM之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後獲得黃色油狀物(333 mg)。將此物質與藉由類似方法自額外實驗運行所產生之額外物質(在矽膠層析之後共540 mg)彙集，且藉由SFC對掌性層析(對掌性AD-H管柱250×30 mm，5 µm； 管柱溫度35℃；流動速率120 g/min)進一步純化，其用含18% IPA/0.2% DMEA之CO2 溶離，得到呈油狀之標題化合物(383 mg)。分析型HPLC：tR =2.35 min，＞99% ee (Amy1對掌性管柱，3.3×150 mm，流動速率1.5 mL/min，含18% IPA/0.2% IPAm之82% CO2 ，35℃管柱溫度，287 nM)。ES/MSm/z : 315.0 (M+H)。[α]D 20 = -12.7° (c = 0.24, MeOH)。如上文所使用，用於實例1之術語「(-)」或「(-)對映異構體」係指實例1之對映異構體，其在20℃及589 nm下具有逆時針(或「(-)」)之旋光度，且在甲醇中具有所述之濃度「c」 (g/100 mL)。
實例 1 之替代工序 流程2步驟H：向1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮(100 mg，0.6 mmol)及2-甲基-5-(4-哌啶基)-1,3,4-噁二唑(200 mg，1.2 mmol)於CHCl3 (5.2 mL)中之攪拌溶液中添加異丙醇鈦(IV) (363 µL，1.2 mmol)且攪拌反應混合物30 min。添加NaBH(OAc)3 (390 mg，1.8 mmol)且在40℃下攪拌反應物隔夜。反應混合物用EtOAc (5 mL)及NaHCO3 飽和水溶液(2 mL)稀釋20 min，混合物經由矽藻土床過濾，且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物藉由在C18矽膠上逆相層析(XBridge C18, 5 µm 19×100 mm；214 nm及300 nm；MS-ESI 100-800)來純化，其用10 mM NH4 HCO3 水溶液(pH：~9.0)於ACN (20%至40%，具有4 min之梯度時間)，流動速率：25 mL/min)中之混合物溶離，藉由SCF對掌性層析(CHIRALPAK® AD-H管柱，250×30 mm，5 µm；管柱溫度35℃；流動速率120 mL/min)額外純化，其用含18% IPA/0.2% DMEA之CO2 溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到標題化合物(27 mg，55%產率)。tR =0.096 min，＞99% ee (Amy1對掌性管柱，3.3×150 mm，流動速率1.5 mL/min，含18 % IPA/0.2% IPAm之82% CO2 ，35℃管柱溫度，287 nM)。ES/MSm/z : 315 (M+H)。
實例 2 (-)-5-氟-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶
Figure 02_image063
(-)對映異構體 流程3步驟F：在80℃下將6-(1-氯乙基)-5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶(111 mg，0.5 mmol)、4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)哌啶(107 mg，0.6 mmol)及K2 CO3 (85 mg，0.6 mmol)於ACN (8 mL)中之混合物加熱27 h。冷卻反應混合物，用DCM稀釋且用水淬滅。將所得兩相混合物傾倒通過相分離器筒。在減壓下蒸發DCM，且經由在矽膠上急驟層析來純化殘餘物，其用50-100% EtOAc/異己烷之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後獲得白色固體。另外藉由SFC對掌性層析(CHIRALPAK® AZ-3管柱150×3 mm，3 µm；管柱溫度35℃；流動速率1.5 mL/min)純化，其用含40% MeOH/0.2% IPA之CO2 溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後，得到＞99% ee之標題化合物(44 mg，39%產率)。分析型HPLC：tR =3.7 min，＞99% ee (對掌性AZ-3管柱，3.3×150 mm，流動速率1.5 mL/min，含40% MeOH/0.2% IPAm之60% CO2 ，35℃管柱溫度，220 nM)。ES/MSm/z : 333.0 (M+H)。[α]D 20 = -117.5° (c = 0.2, DCM)。
或者，將(+)-6-(1-氯乙基)-5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶(500 mg，2.5 mmol)、4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)哌啶(829 mg，5 mmol)及K2 CO3 (1.0 g，7.5 mmol)於ACN (25 mL)中之混合物加熱至65℃維持72 h。冷卻混合物，用水稀釋，用EtOAc萃取三次，且合併之有機萃取物經Na2 SO4 乾燥。隨後過濾萃取物，且在減壓下濃縮濾液。所得殘餘物藉由在矽膠上急驟層析來純化，其用0.5%至10% MeOH/DCM之梯度溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到586 mg 76.6% ee之標題化合物。標題化合物藉由SFC對掌性層析(CHIRALPAK® AD-H，21×250 mm，3 µm；管柱溫度40℃；流動速率80 mL/min)來進一步純化，其用含15% MeOH/0.2% IPAm)之85% CO2 溶離，以在所需層析溶離份之溶劑蒸發後得到96.5% ee之標題產物(457 mg，55%產率)。ES/MSm/z : 333.0 (M+H)。分析型HPLC tR =2.08 min，＞96.5% ee (CHIRALPAK® AD-H，4.6×150 mm，流動速率5 mL/min；含15% MeOH/0.2% IPAm之CO2 )。[α]D 20 = -109.9 ° (C=0.2, DCM)。如上文所使用，用於實例2之術語    「(-)」或「(-)對映異構體」係指實例2之對映異構體，其在20℃及589 nm下具有逆時針(或「(-)」)之旋光度，且在DCM中具有所述之濃度「c」 (g/100 mL)。
實例 3 (+)-6-[(1R)-1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶
Figure 02_image065
(+)對映異構體 標題化合物可以與實例1所闡述之工序類似的方式使用對掌性層析由(-)-6-[1-氯乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶及4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)哌啶，或由1-(2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶-6-基)乙酮及2-甲基-5-(4-哌啶基)-1,3,4-噁二唑來製備。[α]D 20 = +19.3° (c = 0.20, MeOH)。
如上文所使用，用於實例3之術語「(+)」或「(+)對映異構體」係指實例3之對映異構體，其在20℃及589 nm下具有順時針(或「(+)」)之旋光度，且在MeOH中具有所述之濃度「c」 (g/100 mL)。
實例 4 (+)-5-氟-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶
Figure 02_image067
(+)對映異構體 標題化合物可以與實例2中所闡述之操作類似的方式使用對掌性層析由6-(1-氯乙基)-5-氟-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶及4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)哌啶來製備。在描述於實例2中之相同分析型HPLC條件下，tR =2.0 min。[α]D 20 = +107.3° (c = 0.20, DCM)。
如上文所使用，用於實例4之術語「(+)」或「(+)對映異構體」係指實例4之對映異構體，其在20℃及589 nm下具有順時針(或「(+)」)之旋光度，且在DCM中具有所述之濃度「c」 (g/100 mL)。
活體外人類 OGA 酶分析 OGA 酶之產生 將編碼全長人類O-GlcNAc-β-N- 乙醯葡萄糖胺苷酶 之核苷酸序列(NM_012215)插入具有N端聚組胺酸(HIS)標籤之pFastBac1 (Invitrogen)載體中。根據Bac-to-Bac桿狀病毒表現系統(Invitrogen)方案來進行桿狀病毒之產生。使用每公升培養物10 mLP1 病毒以1.5×106 個細胞/mL感染Sf9細胞，且在28℃下培育48 h。將細胞短暫離心，用PBS沖洗且將離心塊儲存在-80℃下。以上OGA蛋白(His-OGA)如下純化：在4℃下將4 L細胞溶解於含有以下各者之200 mL緩衝劑中45 min：50 mM pH為8.0之Tris、300 mM NaCl、10%甘油、10 mM咪唑、1 mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.1% TritonTM X-100、4錠劑之蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)。接著在4℃下以16500 rpm旋轉此細胞溶解物40 min，且在4℃下將上清液與6 mL Ni-NTA樹脂(鎳-氮化三乙酸)一起培育2小時。
隨後將樹脂裝填至管柱上且用50 mM pH為8.0之Tris、300 mM NaCl、10%甘油、10 mM咪唑、0.1% TritonTM X-100、1 mM DTT洗滌，隨後用50 mM pH為8.0之Tris、150 mM NaCl、10 mM咪唑、10%甘油、1 mM DTT洗滌。用50 mM pH為8.0之Tris、150 mM NaCl、300 mM咪唑、10%甘油、1 mM DTT溶離蛋白。將彙集的含His-OGA之溶離份濃縮至6 ml且裝載至Superdex75 (16/60)上。用50 mM pH為8.0之Tris、150 mM NaCl、10%甘油、2 mM DTT溶離蛋白。彙集含His-OGA之溶離份且用BCA (布萊德福比色分析(Bradford Colorimetric Assay))量測蛋白濃度。
OGA 酶分析 OGA酶催化自核質蛋白移除O-GlcNAc 。為量測此活性，以最終濃度6.7 µM使用螢光素二-N-乙醯基-β-N-乙醯基-D-葡萄胺糖苷(FD-GlcNAc ，Kim，Eun Ju；Kang，Dae Ook；Love，Dona C.；Hanover, John A. Carbohydrate Research (2006), 341(8), 971-982)作為受質(以384孔分析形式)。此螢光受質在由OGA裂解時發螢光，從而可藉由在535 nm處偵測到(在485 nm處激發)之螢光增加來量測酶活性。
製備分析緩衝液以在pH 7下得到50 mM H2 NaPO3 -HNa2 PO3 、0.01%牛血清白蛋白及0.01% TritonTM X-100水溶液之最終濃度。使用十點濃度反應曲線將待測試之化合物於純二甲亞碸(DMSO)中稀釋。反應混合物中之最大化合物濃度為30或1 µM。將在適當濃度下之化合物與OGA酶一起預培育30 min，隨後藉由添加受質開始反應。對於30或1 µM最大化合物濃度，最終酶濃度分別為3.24 nM或0.5 nM。使反應在室溫下進行60分鐘。接著，在不停止反應的情況下，讀取螢光。藉由相對於化合物之對數繪製標準化資料且使用四參數邏輯方程式擬合資料來計算IC50 值。
實例1至4之化合物基本上如上文所述進行測試且展現如表1中所示之以下IC50 值：表 1
Figure 108119639-A0304-0001
此等結果表明實例1至4之化合物抑制活體外OGA酶活性。
Figure 108119639-A0101-11-0002-3

Claims (14)

  1. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image069
    ， 其中R為H或F；或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其中R為H，或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1之化合物，其中R為F，或其醫藥學上可接受之鹽。
  4. 如請求項1或請求項2之化合物，其中該化合物為(-)-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶或其醫藥學上可接受之鹽。
  5. 如請求項1或請求項2之化合物，其中該化合物為(+)-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶或其醫藥學上可接受之鹽。
  6. 如請求項1或請求項3之化合物，其中該化合物為(-)-5-氟-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶或其醫藥學上可接受之鹽。
  7. 如請求項6之化合物，其為： (-)-5-氟-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶。
  8. 如請求項1或請求項3之化合物，其中該化合物為(+)-5-氟-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶或其醫藥學上可接受之鹽。
  9. 如請求項8之化合物，其為： (+)-5-氟-6-[1-[4-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-1-哌啶基]乙基]-2,3-二氫呋喃并[2,3-b]吡啶。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  11. 一種如請求項1至9中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項10之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療阿茲海默症(Alzheimer's disease)之藥物。
  12. 一種如請求項1至9中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項10之醫藥組合物之用途，其用於製造用於預防輕度認知障礙向阿茲海默症發展的藥物。
  13. 一種如請求項1至9中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項10之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療進行性核上麻痺之藥物。
  14. 一種用於製備醫藥組合物之方法，其包含摻合如請求項1至9中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
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