TW202012614A - 一種從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充劑的組合物 - Google Patents

一種從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充劑的組合物 Download PDF

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Abstract

通過細胞破裂和蛋白質分餾/純化過程產生的來源於厭氧細菌過程的富含蛋白質的營養補充劑和動物飼料補充劑。本發明提供了使用含一氧化碳氣態底物從發酵過程中獲得一個或多個含蛋白質部分的細菌發酵系統和方法。本發明還提供富含蛋白質的營養補充劑的組合物，其可用於人類和各種不同種類動物的攝取。

Description

一種從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充劑的組合 物
本發明係關於一種從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充劑的組合物。相關申請的交叉引用：本申請主張2018年5月21日提交的美國臨時專利申請第62/674,604號的權益，上述引用的申請在此全文併入作為參考。
微生物發酵是指當向微生物提供有碳底物時，微生物可以利用和加工有碳底物以生成各種可被回收、分離、純化的產品。所選擇的碳底物取決於所使用的微生物的類型和它們的代謝途徑，並且所使用的微生物的類型是基於產生所需產品的能力的微生物種類進行識別和選擇。有碳底物可以包括一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、甲醇、甲基、乙醇、正烷烴、葡萄糖、纖維素、甘蔗渣、糖蜜和亞硫酸鹽廢液。由細菌發酵產生的有用的產物和物質包括乙醇、乳酸、乙酸鹽及其它可作為能量來源和各種附加應用的生物燃料和化學品
在一個態樣中，厭氧微生物包括產乙酸微生物，通過對氣態基質諸如一氧化碳(CO)，氫氣(H2)，以及/或二氧化碳(CO2)的細菌發酵，可以產生發酵產物(例如，乙醇、丁醇、乙酸、丁酸、丁酸、2，3-丁二醇和其它相關產物)。乙醇和丁醇通常用作與運輸有關的液體燃料，而乙酸酯和2,3-丁二醇可用於化學工業。用於微生物發酵生產生物乙醇產乙酸菌的實例包括梭菌屬和乙酸桿菌屬。例 如，美國專利案第5，173，429號描述了一種從合成氣產生乙醇和乙酸酯d額厭氧微生物梭菌屬俊達氏梭菌(Clostridium Ijungdahlii)ATCC編號49587。美國專利案第5，807，722號描述了一種使用俊達氏梭菌ATCC編號55380將廢氣轉化為有機酸和醇的方法和裝置。美國專利案第6，136，577號描述了一種使用俊達氏梭菌ATCC編號55988和55989將廢氣轉化為乙醇的方法和裝置。
除了發酵產物之外，大規模的微生物發酵還產生大量的微生物發酵培養肉湯並且可能需要排出大部分的死的或無活性的細胞。將多出的細菌細胞從過量的或排出的培養肉湯中回收到微生物生物質中以產生單細胞蛋白(SCP)和其他組分，進而用作蛋白質，氨基酸和碳水化合物的源，來生成動物飼料的原料，和/或動物飼料的營養物或補充劑。氨基酸是構成蛋白質的重要元素，所有動物都需要攝入氨基酸以維持生長，繁殖，哺育，以及留存。牛的小腸可以從被瘤胃消化分解的蛋白質中吸收穫得氨基酸，一般情況下，牛需要從消化系統中獲取10種不可自身合成的必需氨基酸，包括精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸。理想情況下，牛吸收每一種必需氨基酸的相對比例將完全匹配其所需的氨基酸的量，因為任一種必需氨基酸的短缺可能會限制牛對其它必需氨基酸的利用。
然而，目前獲取單細胞蛋白的方法常常是直接將微生物細胞整體作為細胞生物物質來用於動物飼料或水產養殖。在微生物發酵過程中，發酵肉湯包括細菌細胞以及細胞碎片。這些方法並不區分兩者，並且通常包含可能對動物或水產養殖(例如魚或蝦等)有害的生物質組成。例如，微生物整體細胞生物質可能含有高核酸含量或其他生物質組成，不適合於攝入或正常消化。大多數這些現有方法在將細胞整體作為動物飼料前並不通過額外的細胞破裂或細胞破碎技術對細胞生物質進行處理。此外，目前從細菌發酵中回收菌體蛋白的方法不能產出針對營養相關用途的蛋白質含量足夠高的生物質組成。因此，存在對於從細菌發酵 過程獲得富含蛋白質的補充物以及類似營養補充五和動物飼料的方法和系統以及組合物的需求。
本發明的實施方案提供用於生產和獲得富含蛋白質的營養補充物和/或動物飼料的方法、系統和合成物質，所述營養補充物和/或動物飼料源自經細胞破裂和蛋白質分離和純化技術處理的厭氧細菌發酵過程中的微生物細胞生物質。富含蛋白質的營養補充劑可以直接用作原料，也可以與其他營養素一起作為人類或動物的營養補充劑。
在一個實施方案中，提供一個用於從發酵過程中產生含蛋白質產物的細菌發酵系統，其包括一個或多個發酵器、一個或多個細胞分離器、一個或多個處理室、一個或多個細胞破裂裝置、以及一個或多個分餾器。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了一種富含蛋白質的營養補充劑合成物質，所述富含蛋白質的營養補充劑由厭氧細菌發酵過程產生，可提供給人及不同種類的動物用於攝入。
在另一個實施方案中，提供了一種用於從厭氧細菌發酵的微生物細胞生物質中提取出富含蛋白質的部分並使用富含蛋白質的部分作為營養補充物的方法。在一個方面，所述方法包括在包含液體培養基的發酵器中用厭氧細菌發酵固體、液體或氣體底物，從所述發酵器獲得一定量的包含第一濃度的第一批厭氧細菌細胞的發酵液體肉湯，將所述厭氧細菌的細胞從所述發酵液體肉湯分離成不含細胞的滲透溶液和包含第二濃度的第二批厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液。在一個實例中，第二批厭氧細菌細胞的第二濃度高於第一批厭氧細菌細胞的第一濃度。一旦獲得所述含細胞懸浮液，所述方法還包括使所述含細胞懸浮液內的厭氧細菌細胞的細胞膜破裂以產生勻漿，使用一個或多個分餾器將所述勻漿分 級成第一含蛋白質部分和一個含細胞碎片蛋白質部分；以及獲取所述第一含蛋白質部分。
在一個方面，所述第一含蛋白質部分和/或所述含蛋白質細胞碎片部分可被處理並產生作為營養補充物的富含蛋白質。在另一個方面，第一含蛋白質部分被生產為富含蛋白質的營養補充劑，其具有的蛋白質含量為約10%或更大，為40%或更大，50%或更大，60%或更大，70%或更大，或為80%或更大，90%或更大，或在約10%至約80%的蛋白質含量之間，或在約10%至約95%的蛋白質含量之間，或在約10%至約98%的蛋白質含量之間。
在另一個樣態中，所述方法還可以包括將含有厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液儲存在一個細胞存儲罐中並且以一定的遞送速率將含細胞懸浮液從細胞存儲罐中遞送到一個破裂裝置。所述細胞存儲罐可以充當所述含細胞懸浮液的儲存容器或預處理室。在一個實例中，所述細胞存儲罐用於對所述含厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液進行預處理，所述預處理步驟通過將一種或多種添加劑添加到與所述細胞存儲罐連接的一條入口管線處以實施。添加劑的實例包括但不限於表面活性劑、洗滌劑、EDTA、Tween-20、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉、CHAPS、酶、蛋白酶、溶菌酶、benzonase、核酸酶、pH-調節劑、以及它們的組合。
在另一個方面，所述方法還包括在使所述厭氧細菌細胞的細胞膜破裂之前用一種或多種添加劑處理所述含厭氧細菌細胞的細胞懸浮液。或者，所述方法包括在將第一含蛋白質部分從含細胞碎屑部分中分離之前用一種或多種添加劑處理所述含厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液。
在另一方面，所述方法可進一步包括濃縮所述含厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液以生成第二含細胞懸浮液。在一個實例中，第二含細胞懸浮液被遞送至細胞存儲罐以被濃縮和/或儲存。在另一個實例中，第二含細胞懸浮液在存儲罐 中接受預處理，所述預處理步驟通過將一種或多種添加劑添加到與所述存儲罐連接的一條入口管線處以實施。然後，將第二含細胞懸浮液從存儲罐遞送到一個破裂裝置中。所述破裂裝置將第二含細胞懸浮液內的厭氧細菌細胞的細胞膜破裂並產生勻漿。額外的含蛋白質部分隨後與勻漿內的含細胞碎片部分分離。
在另一個方面，所述方法包括將所述第一含蛋白質部分遞送至一個或多個分餾器中，使用所述一個或多個分餾器將所述第一含蛋白質部分分餾成第二含蛋白質部分和/或第三含蛋白質部分，以及收集產生的第二和第三或多個含蛋白質部分。分餾器的實施例包括但不限於，固液分餾器、離心裝置、連續離心機、沉降式離心機、盤堆式離心機、過濾裝置、中空纖維過濾裝置、螺旋纏繞過濾裝置、陶瓷過濾裝置、錯流過濾裝置、體積排阻裝置、一個或一系列體積排阻柱、一個或一系列離子交換柱、一個或一系列碳聚合物柱、流通磁力分餾器、超濾裝置，一個或一系列親和層析柱，一個或一系列凝膠過濾柱及其組合。
在一個實施方案中，所述第一含蛋白質部分可被遞送至一個過濾裝置，以通過所述過濾裝置進行過濾並分餾成一個滲餘物部分和一個濾液部分。在另一個實施方案中，將所述滲餘物部分作為富含蛋白質的營養補充物。在又一實施方案中，第一含蛋白質部分可被遞送至離心機並分餾成含蛋白質部分的上層清液和含蛋白質部分的團粒，從而通過離心使含蛋白質部分的上層清液和/或含蛋白質部分的團粒被生產為富含蛋白質的營養補充物。
本發明另一個實施方案提供了一種用於從厭氧細菌發酵過程中產生富含蛋白質的營養補充物的細菌發酵系統。該細菌發酵系統包括一個發酵器與一個氣體入口管線和一個液體入口管線相連，該氣體入口管線用於將氣態底物輸送到發酵器中，該液體入口管線用於將培養基輸送到發酵器中，以使發酵器中的厭氧細菌將所述氣態底物和培養基發酵成發酵液體肉湯，一個或多個細胞分離器連接到發酵器的一個第一出口管線，以接收來自發酵器的一份第一發酵液 體肉湯並將所述第一發酵液體肉湯分離成第一含細胞懸浮液和第一不含細胞滲透液，以及一個處理室連接到所述第一細胞分離器的第二出口管線，以接收來自第一細胞分離器的第一不含細胞滲透液並處理第一不含細胞滲透液以產生一個含氧的烴化合物。
所述細菌發酵系統還包括一個或多個細胞破裂裝置，以接收所述第一含細胞懸浮液，破裂所述第一含細胞懸浮液內的細胞的細胞膜，並產生一份勻漿，以及一個或多個分餾器與所述一個或多個細胞破裂裝置的一個出口管線相連以從所述一個或多個細胞破裂裝置中接收所述勻漿，並將所述勻漿分餾成一份第一含蛋白質部分和一份含蛋白質細胞碎片部分。
在一個實施方案中，細胞破裂通過微流體裝置來完成。在另一個實施方案中，使用聲波處理裝置來完成細胞破裂。在又一個實施方案中，使用微流體裝置來完成細胞破裂，所述微流體裝置具有在5,000至25,000磅每平方英寸(psi)範圍內的處理壓力。在又一個實施方案中，所述微流體裝置具有在15,000至20,000磅每平方英寸(psi)範圍內的處理壓力。在又一個實施方案中，所述微流體裝置的處理壓力為15,000磅每平方英寸(psi)。
在一個方面，細菌發酵系統包括一個與發酵器相連的第一細胞分離器和一個破裂裝置。第一細胞分離器從發酵器中接收具有第一細胞濃度的一份發酵液體，並將發酵液體分離成一份具有第二細胞濃度的含細胞懸浮液和一份不含細胞的滲透液。在另一方面，所述細菌發酵系統還包括一個與所述細胞分離器相連的細胞存儲罐以接收一部分所述第一含細胞懸浮液。在另一個方面，所述細菌發酵系統還包括一個第二細胞分離器與所述發酵器的一個第四出口管線相連，以接收來自發酵器的一個第二發酵液體肉湯並將所述第二發酵液體肉湯分離成第二含細胞懸浮液和第二不含細胞滲透液。
在將一份或多份含細胞懸浮液進行處理並破裂成勻漿後，將所述勻漿通過所述一個或多個分餾器中分餾成一個或多個含蛋白質部分和一個或多個含蛋白質細胞碎片部分。此外，所述一種或多種含細胞懸浮液可從一個或多個細胞分離器的一個或多個出口遞送至破裂裝置和/或細胞存儲罐，其中細胞存儲罐可儲存、容納或濃縮所述一份或多份含細胞懸浮液，並以一定遞送速率遞送所述一份或多份含細胞懸浮液至破裂裝置或一個或多個分餾器以供進一步處理。
在另一方面，在通過厭氧細菌發酵氣態底物之後，第一細胞分離器接收一份第一部分的包含細菌細胞的第一液體發酵液肉湯。一個第二細胞分離器連接到發酵器以接收一份第二部分的包含細菌細胞的第二發酵液體肉湯。第二細胞分離器將所接收的第二發酵液體肉湯分離成一份含有厭氧細菌細胞的第二含細胞懸浮液和一份第二不含細胞滲透液。在該方面，破裂裝置被用於從第二細胞分離器接收第二含細胞懸浮液，破裂第二含細胞懸浮液中的細胞膜並產生勻漿。在另一個方面，一個存儲罐接收來自第二細胞分離器的第二含細胞懸浮液並且將第二含細胞懸浮液遞送到破裂裝置。
在又一個方面，細菌發酵系統包含一個或多個破裂裝置，以破裂細胞懸浮液內的厭氧細菌細胞的細胞膜。破裂裝置的實例包括但不限於微流體裝置、聲波處理裝置、超聲波裝置、機械破裂裝置、法式破碎機、冷凍機、加熱器、熱交換器、蒸餾柱、增加工藝流和存儲罐溫度的裝置、巴氏滅菌裝置、UV滅菌裝置、伽馬射線滅菌裝置、反應器、均質器及其組合。
在另一個實施方案中，本發明是一個使用產乙酸細菌培養物發酵過程而產生的富含蛋白質的營養補充物的組合物。在一個方面，該組合物包括一個從勻漿中分餾的含蛋白質部分，其中勻漿是從含有厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液中獲得的，並且所述含細胞懸浮液是從使用厭氧細菌對氣態底物進行發酵的發酵器地送出的發酵液體肉湯中獲得的，其中發酵液體肉湯中的厭氧細菌細胞被 分離成一份含細胞懸浮液和一份不含細胞的滲透液。在另一個方面，所述組合物包括從勻漿中分餾的含蛋白質細胞碎片部分。
在另一個方面，所述組合物包括發酵衍生的蛋白質，其中所述發酵衍生的蛋白質是來自在於一個使用天然存在或基因改造的細菌對固體、液體或氣體底物進行發酵的液體培養基，所述天然存在或基因改造的細菌包含產乙酸菌屬、梭菌屬、醋酸桿菌屬、丁狀桿菌屬、真桿菌屬和類似的變體。所述底物包括一種或多種液體、固體或氣體，所述液體、固體或氣體包括但不限於碳水化合物、羧酸、甲醇、甲烷、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、氫氣(H2)、氮氣(N2)、合成氣及其組合。在一個實施方案中，發酵是使用天然存在或非天然存在的嗜甲烷菌完成的。
作為又一個實施方案，所述組合物包括一份從一個第一部分的勻漿中的含蛋白質部分和一個第二部分的勻漿中含蛋白質細胞碎片部分分餾出的純化蛋白質產物，其中所述勻漿通過對含細胞懸浮液中厭氧細菌細胞進行破裂而獲得，其中所述含細胞懸浮液取自一個運用產乙酸菌對氣態底物進行發酵的發酵罐的輸出發酵液。
100‧‧‧方法
110‧‧‧步驟
120‧‧‧步驟
130‧‧‧步驟
135‧‧‧步驟
140‧‧‧步驟
145‧‧‧步驟
150‧‧‧步驟
160‧‧‧步驟
165‧‧‧步驟
200A‧‧‧方法
200B‧‧‧方法
202‧‧‧步驟
204‧‧‧步驟
206‧‧‧步驟
208‧‧‧步驟
210‧‧‧步驟
212‧‧‧步驟
214‧‧‧步驟
216‧‧‧步驟
218‧‧‧步驟
220‧‧‧步驟
300A‧‧‧細菌發酵系統
300B‧‧‧細菌發酵系統
302‧‧‧入口管線
304‧‧‧入口管線
310‧‧‧發酵器
312‧‧‧出口管線
314‧‧‧出口管線
316‧‧‧出口管線
320‧‧‧細胞分離器
322‧‧‧出口管線
324‧‧‧出口管線
330‧‧‧細胞分離器
332‧‧‧出口管線
334‧‧‧出口管線
336‧‧‧出口管線
340‧‧‧存儲罐
342‧‧‧出口管線
344‧‧‧出口管線
350‧‧‧處理室
352‧‧‧出口管線
354‧‧‧出口管線
375‧‧‧脫水室
376‧‧‧出口管線
400A‧‧‧細菌發酵系統
400B‧‧‧細菌發酵系統
400C‧‧‧細菌發酵系統
400D‧‧‧細菌發酵系統
400E‧‧‧細菌發酵系統
400F‧‧‧細菌發酵系統
400G‧‧‧細菌發酵系統
400H‧‧‧細菌發酵系統
402‧‧‧入口管線
404‧‧‧入口管線
406‧‧‧入口管線
410‧‧‧發酵器
412‧‧‧出口管線
414‧‧‧出口管線
416‧‧‧出口管線
420‧‧‧細胞分離器
422‧‧‧出口管線
424‧‧‧出口管線
426‧‧‧出口管線
430‧‧‧細胞分離器
432‧‧‧出口管線
434‧‧‧出口管線
436‧‧‧出口管線
440‧‧‧不含細胞存儲罐
445‧‧‧含細胞存儲罐
442‧‧‧出口管線
444‧‧‧出口管線
446‧‧‧出口管線
450‧‧‧處理室
452‧‧‧出口管線
454‧‧‧出口管線
460‧‧‧破裂裝置
462‧‧‧出口管線
464‧‧‧再循環管線
470‧‧‧分餾器
472‧‧‧出口管線
474‧‧‧出口管線
475‧‧‧脫水室
475A‧‧‧脫水室
475B‧‧‧脫水室
476‧‧‧出口管線
476A‧‧‧出口管線
476B‧‧‧出口管線
480‧‧‧分餾器
482‧‧‧出口管線
484‧‧‧出口管線
485A‧‧‧脫水室
485B‧‧‧脫水室
486A‧‧‧出口管線
486B‧‧‧出口管線
500A‧‧‧細菌發酵系統
500B‧‧‧細菌發酵系統
500C‧‧‧細菌發酵系統
500D‧‧‧細菌發酵系統
500E‧‧‧細菌發酵系統
502‧‧‧入口管線
504‧‧‧入口管線
506‧‧‧入口管線
510‧‧‧發酵器
512‧‧‧出口管線
514‧‧‧出口管線
516‧‧‧出口管線
520‧‧‧細胞分離器
522‧‧‧出口管線
524‧‧‧出口管線
526‧‧‧出口管線
530‧‧‧細胞分離器
532‧‧‧出口管線
534‧‧‧出口管線
536‧‧‧出口管線
544‧‧‧出口管線
545‧‧‧含細胞存儲罐
542‧‧‧出口管線
548‧‧‧混合器
550‧‧‧處理室
552‧‧‧出口管線
554‧‧‧出口管線
560‧‧‧破裂裝置
562‧‧‧出口管線
564‧‧‧出口管線
570‧‧‧分餾器
572‧‧‧出口管線
574‧‧‧出口管線
575‧‧‧脫水室
575A‧‧‧脫水室
575B‧‧‧脫水室
576‧‧‧出口管線
576A‧‧‧出口管線
576B‧‧‧出口管線
580‧‧‧分餾器
582‧‧‧出口管線
584‧‧‧出口管線
585A‧‧‧脫水室
585B‧‧‧脫水室
586A‧‧‧出口管線
586B‧‧‧出口管線
590‧‧‧分餾器
590A‧‧‧分餾器
590B‧‧‧分餾器
592‧‧‧出口管線
592A‧‧‧出口管線
592B‧‧‧出口管線
594‧‧‧出口管線
594A‧‧‧出口管線
594B‧‧‧出口管線
595A‧‧‧脫水室
595B‧‧‧脫水室
595C‧‧‧脫水室
595D‧‧‧脫水室
596A‧‧‧出口管線
596B‧‧‧出口管線
596C‧‧‧出口管線
596D‧‧‧出口管線
600‧‧‧細菌發酵系統
602‧‧‧入口管線
604‧‧‧入口管線
606‧‧‧入口管線
610‧‧‧發酵器
612‧‧‧出口管線
614‧‧‧出口管線
616‧‧‧出口管線
620‧‧‧細胞分離器
622‧‧‧出口管線
624‧‧‧出口管線
630‧‧‧細胞分離器
632‧‧‧出口管線
636‧‧‧出口管線
640‧‧‧不含細胞存儲罐
645‧‧‧含細胞存儲罐
642‧‧‧出口管線
644‧‧‧出口管線
646‧‧‧出口管線
650‧‧‧處理室
652‧‧‧出口管線
654‧‧‧出口管線
660‧‧‧破裂裝置
662‧‧‧出口管線
670‧‧‧分餾器
672‧‧‧出口管線
674‧‧‧出口管線
675‧‧‧脫水室
676‧‧‧出口管線
690‧‧‧分餾器
692‧‧‧入口管線
694‧‧‧出口管線
695‧‧‧脫水室
696‧‧‧出口管線
802‧‧‧線
804‧‧‧線
806‧‧‧線
808‧‧‧線
812‧‧‧線
為使得能夠詳細地理解上述列舉的本發明的特徵，本發明的具體描述，簡要概括，可以通過參考實施例，或所附圖式示出。然而要指出的是，所附的圖式僅示出了本發明的典型實施例，因此不應被認為是對其範圍的限制，因為本發明可以允許其它等效的實施例。
圖1A圖示了根據本發明的一個或多個實施方案所示的通過處理厭氧細菌發酵過程所產生的含細胞懸浮液以獲得第一含蛋白質部分和/或含蛋白質細胞碎片部分作為富含蛋白質的營養物補充物的方法的流程圖。
圖1B圖示了根據本發明的一個或多個實施方案所示的通過處理厭氧細菌發酵過程所產生的含細胞懸浮液以獲得第一含蛋白質部分和/或含蛋白質細胞碎片部分作為富含蛋白質的營養物補充物的另一方法的流程圖。
圖2A圖示了根據本發明的一個或多個實施方案所示的通過處理厭氧細菌發酵過程所產生的含細胞懸浮液以獲得作為富含蛋白質的營養補充物的第二含蛋白質部分的方法的流程圖。
圖2B圖示了根據本發明的一個或多個實施方案所示的通過處理厭氧細菌發酵過程所產生的含細胞懸浮液以獲得第三含蛋白質部分作為富含蛋白質的營養補充物的另一種方法的流程圖。
示意圖3A圖示了根據本發明的一個或多個實施方案的一個細菌發酵系統300A用於通過厭氧細菌發酵產生含細胞懸浮液和一種或多種含氧的烴化合物，其中細菌發酵系統300A包括一個或多個細胞分離器、一個或多個處理室、以及可選地，一個或多個脫水室。
示意圖3B圖示了根據本發明的一個或多個實施方案的一個細菌發酵系統300B用於通過厭氧細菌發酵產生含細胞懸液懸浮液和一種或多種含氧的烴化合物其中所述細菌發酵系統300B包括兩個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室，和可選地，一個脫水室。
示意圖4A示出了根據本發明的一個或多個實施方案的利用厭氧細菌進行發酵的系統400A，其具有一個或多個細胞分離器、一個或多個處理室、一個或多個破裂裝置、一個或多個分餾器、以及一個或多個脫水室。
示意圖4B示出了根據本發明的一個或多個實施方案的利用厭氧細菌進行發酵系統400B，其具有兩個細胞分離器、一個處理室、一個破裂裝置、兩個分餾器和三個脫水室。
示意圖4C示出了根據本發明的一個或多個實施方案的利用厭氧細菌進行發酵的系統400C，其具有一個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個破裂裝置、一個分餾器和兩個或更多個脫水室。
示意圖4D顯示了根據本發明的一個或多個實施方案的利用厭氧細菌進行發酵的系統400D，其具有一個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個破裂裝置、兩個分級分離器、和可選地、額外的脫水室。
示意圖4E顯示了根據本發明的一個或多個實施方案的利用厭氧菌進行發酵的系統400E，其具有兩個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個破裂裝置、兩個分餾器、和可選地、三個脫水室。
示意圖4F顯示了根據本發明的一個或多個實施方案的利用厭氧細菌進行發酵的系統400F，其具有一個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個含細胞存儲罐、一個破裂裝置、兩個分餾器、和可選地、三個脫水室。
示意圖4G顯示了根據本發明的一個或多個實施方案的利用厭氧細菌進行發酵的系統4G，其具有兩個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個含細胞存儲罐、一個破裂裝置、兩個分餾器、和可選地、三個脫水室。
示意圖4H示出了根據本發明的一個或多個實施方案的利用厭氧細菌進行發酵的系統4H，其具有兩個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個破裂裝置、兩個分餾器、和可選地、三個脫水室。
圖5A是根據本發明的一個或多個實施方案的用於破裂從厭氧細菌發酵過程中收集的細胞並從勻漿獲得一個或多個含蛋白質部分的示例性細菌發酵系統的示意圖。
圖5B是根據本發明的一個或多個實施方式的用於破裂從厭氧細菌發酵過程中收集的細胞並從勻漿獲得一個或多個含蛋白質部分的另一個示例性細菌發酵系統的示意圖。
圖5C是根據本發明的一個或多個實施方案的用於破裂從厭氧細菌發酵過程中收集的細胞並從勻漿中獲得一個或多個含蛋白質部分的細菌發酵系統的另一個實例的示意圖。
圖5D是根據本發明的一個或多個實施方案用於破裂從厭氧細菌發酵過程中收集的細胞並從勻漿獲得一個或多個含蛋白質部分的細菌發酵系統的又一個實例的示意圖。
圖5E是根據本發明的一個或多個實施方式的用於破裂從厭氧細菌發酵過程中收集的細胞並從勻漿獲得一個或多個含蛋白質部分的另一個示例性細菌發酵系統的示意圖。
圖6是根據本發明的一個或多個實施方案用於破裂從厭氧細菌發酵過程中收集的細胞並從勻漿獲得一個或多個含蛋白質部分的細菌發酵系統的又一個實例的示意圖。
圖7A顯示了根據本發明的一個或多個實施例的在將含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞破裂以生成勻漿之前的所述含細胞懸浮液的電子顯微照片。
圖7B顯示了根據本發明的一個或多個實施例的在將一個從細菌發酵液體肉湯中獲得的含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞通過一個破裂裝置破裂後所生成的勻漿的電子顯微照片。
圖7C顯示了根據本發明的一個或多個實施方案的將含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞在破裂裝置中破裂後的又一示例的電子顯微照片。
圖7D是勻漿的另一個實例的電子顯微照片，顯示了根據本發明的一個或多個實施方案的在破裂裝置中通過高壓對含細胞懸浮液內的厭氧細菌進行破裂後的細菌細胞膜。
圖7E是勻漿的又一個實例的電子顯微照片，顯示了根據本發明的一個或多個實施方案在破裂裝置中通過非常高壓對含細胞懸浮液內的厭氧細菌細胞進行破裂後的細菌細胞膜。
圖8A示出了根據本發明的一個或多個實施例的在破裂裝置中通過對含細胞懸浮液內的厭氧細菌細胞進行破裂後產生的勻漿中的可溶性蛋白濃度的曲線圖。
圖8B示出了根據本發明的一個或多個實施例的在破裂裝置中通過對含細胞懸浮液內的厭氧細菌細胞的細胞膜進行破裂後獲得的可溶性蛋白濃度的另一個曲線圖。
本發明的實施方案提供了用於生產和獲得富含蛋白質的營養補充劑和/或動物飼料的方法、系統和組合物，所述富含蛋白質的營養補充劑和/或動物飼料通過細胞破裂和蛋白質分餾和純化技術由厭氧細菌發酵後的微生物細胞生物質中獲得。更具體地說，本發明涉及一種將微生物生物質從發酵過程中分離出來，將微生物生物質中的細胞破裂成勻漿，並從勻漿中分餾提純一個或多個含蛋白質，以將此一個或多個蛋白質處理為可供人類或動物攝取的營養補充物的方法。所述富含蛋白質補充物可以被人或動物直接攝取，也可以用於構成其他可攝入營養物的補充物。
富含蛋白質的營養物補充劑和動物飼料補充劑可以從細菌發酵系統中產生的一個或多個含蛋白質部分出獲得，所述細菌發酵系統使用一種或多種氣態底物，例如合成氣、碳源底物、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、氫氣(H2)，及其組合。本發明還提供富含蛋白質的營養補充劑的組合物用於動物和人類的攝取。
I.處理微生物生物質以產生發酵衍生的蛋白質
細菌發酵方法通常包括通過細菌，例如厭氧細菌或產乙酸細菌等，發酵氣態底物，例如合成氣或含一氧化碳(CO)氣態底物，以產生發酵產物，其包括二氧化碳(CO2)、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸等。更重要的是，經過厭氧細菌發酵過程可獲得大量的微生物生物質。細菌發酵過程當中或之後可排出大量的微生物生物質。在完成細胞排出或在細菌發酵過程期間，這些大量的微生物生物質可用於其它有用的應用用途。然而，提取可用的，例如作為營養補充劑或動物飼料，高數量的和高質量的(即，沒有有害物質或污染物)發酵衍生蛋白質則需要進行進一步的複雜處理。具體而言，本發明包括從細菌發酵過程所產生的細胞生物質中提取這種發酵衍生蛋白質的方法。更具體地，本發明包括用於細菌發酵工藝的系統，以從細胞質或微生物生物質中提取一種或多種發酵衍生的含蛋白質部分，用於加工成營養補充物和動物飼料。
流程圖1A示出了是從一個細菌發酵系統中生產富含蛋白質的營養補充劑的方法100的一個實例。方法100中對於氣態底物的細菌發酵過程可在有利於生成烴化合物、碳水化合物、特定蛋白質、特定氨基酸和/或其它所需組分的條件下操作，同時保持期望的發酵產物水平，例如醇的生產率水平。
在步驟110中，將一個發酵培養基加入到發酵器中進行細菌發酵處理。此外，將一種或多種氣態底物輸送到發酵器中，並通過細菌培養物進行發酵，例如含有厭氧菌的培養物。基本地，發酵器中包含的液體發酵培養基可以包括各種類型的合適細菌的培養基、發酵培養基或液體營養培養基。所述營養培養基包括適量的一種或多種維生素和幾種礦物質，以使得所使用的微生物生長和/或有利於產生的特定產品。
一種適合於厭氧細菌生長的培養基可以被用於在發酵過程中使用合成氣，諸如一氧化碳和氫氣或其他適用底物，產生一種或多種含氧烴化合物如乙 醇、丁醇、和乙酸等。適用的發酵培養基的一個實例係描述於美國專利案第7，285，402號，在此通過引用併入本文以供參考。其他適用培養基的實例描述於美國申請案案61/650,098和61/650,093之內，二者均通過引用併入本文以供參考。
此外，在方法100的細菌發酵過程中使用的一種或多種氣體底物可以包括各種合成氣體(即，合成氣)、來自鋼材生產過程的尾氣、來自鐵生產過程的尾氣、來自煤生產過程的尾氣、或來自工業生產工廠的任何其它適用的氣體源。在一個實施方案中，在細菌發酵方法中使用的氣態底物包括含一氧化碳(CO)的氣態底物和/或其他氣體，例如氫氣、二氧化碳(CO2)、氮氣(N2)及其組合。
在一個實例中，含一氧化碳的氣態底物可以是含高量一氧化碳的工業煙氣。在一些方面，包括一氧化碳的氣體源自含碳廢氣。含碳廢氣包括工業廢氣或其他城市固體或液體垃圾的氣化。因此，這種工業過程可以有效的進行碳捕捉，以捕捉會被排放到周圍環境中的碳。工業煙氣可由以下生產過程產生，包括黑色金屬產品製造、有色金屬產品製造、石油精煉工藝、煤的氣化、生物質的氣化、電力生產、炭黑生產、氨生產、甲醇生產和焦炭製造。
在一個實例中，根據所使用的發酵器的尺寸和類型來選則含一氧化碳的合成氣輸入發酵器的速率。在一個方面，合成氣通過氣體入口的速率約為10至50立方英尺/秒。在另一個方面，合成氣以約25至約35立方英尺/秒的速率輸入。術語"合成氣體"或"合成氣"包括但不限於富含一氧化碳(CO)和氫氣(H2)的混合合成氣體，例如通過對天然氣或烴蒸汽重整生產氫氣以生成的混合氣體、煤的氣化、或其他轉廢為能得氣化過程中產生得氣體。合成氣是可燃的，其通常被用作燃料源或作為生產其他化學品的中間物。合成氣可以從任何習知的來源獲取。
例如，合成氣可以從含碳材料的氣化中獲取。氣化技術為在氧氣供應受到限制的環境中對生物質進行部分燃燒。所得氣體主要包括一氧化碳氣體和氫氣。合成氣含有至少約10摩爾%一氧化碳，或至少約20摩爾%，或10至約100摩爾%，或20至約100摩爾%，30至約90摩爾%的一氧化碳，或約40至約80摩爾%的一氧化碳，或約50至約70摩爾%的一氧化碳。合成氣具有一氧化碳/二氧化碳摩爾比至少約0.75，或至少1.0，或至少約1.5。美國專利申請案第13/427,144號、13/427,193號和13/427,247號，以及美國專利申請案第61/516,667、61/516,704和61/516,646號，均描述了適用的氣化方法及裝置，所有這些文獻在此引入並作為參考。
進一步地，在步驟110，將一個細菌培養物接種到發酵器中。將發酵培養基滅菌以除去不需要的微生物，並在細菌發酵器或發酵生物反應器中接種所需的微生物或混合細菌培養物。在一個方面，細菌培養中使用的細菌是厭氧細菌。所使用的厭氧細菌的實例包括產乙酸菌，例如梭菌屬細菌，包括描述於WO2000/68407、EP117309、美國專利案第5，173，429、5，593，886和6，368，819號、WO1998/00558和WO2002/08438的俊達氏梭菌Clostridium ljungdalii的菌株，包括描述於WO2007/117157和WO2009/151342的自行乙醇生成梭菌Clostridium autoethanogenum(德國DSMZ之DSM10061和DSM19630)的菌株，包括分別在美國專利no.7，704，723和"Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas",Hasan Atiyeh,presented in Oklahoma EPSCoR Annual State Conference,2010年4月29日的拉格拉氏梭菌Clostridium ragsdalei(P11，ATCC BAA-622)的菌株和巴奇產鹼菌Alkalibaculum bacchi(CP11，ATCC BAA-1772)的菌株，和美國專利申請案第2007/0276447號中所描述的羧基梭菌Clostridium Carboxidivorans(ATCC PTA-7827)的菌株。這些參考文獻中在此通過引用併入本文以供參考。其它合適的細菌包括莫雷拉氏菌Moorella屬細菌，包括Moorella sp. HUC22-1和嗜熱菌屬Carboxydothermus的細菌。在一個實施方案中，使用混合細菌培養物，其中所述混合細菌培養物包括兩種或更多種細菌微生物。
在該發酵方法100的過程中可用於培養的細菌包括凱伍產醋菌(Acetogenium kivui)，潮濕厭氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)，伍迪厭氧醋菌(Acetobacterium woodii)，巴奇產鹼菌(Alkalibaculum bacchi)CP11(ATCC BAA-1772)，產生性布洛堤菌(Blautia producta)，嗜甲醇丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)，地下厭氧卡拉菌(Caldanaerobacter subterraneous)，太平洋地下厭氧卡拉菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)，產氫羧基嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)，醋酸梭菌(Clostridium aceticum)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，丙酮丁醇梭菌P262(Clostridium acetobutylicum P262)(德國DSMZ之DSM 19630)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 19630)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 10061)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 23693)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DS MZ之DSM 24138)，羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans P7)(ATCC PTA-7827)，克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)，德可氏梭菌(Clostridium drakei)，俊達氏梭菌(Clostridium ljungdahlii PETC)(ATCC 49587)，俊達氏梭菌ER12(Clostridium ljungdahlii ER12)(ATCC 55380)，俊達氏梭菌C-01(Clostridium ljungdahlii C-01)(ATCC 55988)，俊達氏梭菌O-52(Clostridium ljungdahlii O-52)(ATCC 55889)，美格氏梭菌(Clostridium magnum)，巴斯德氏梭菌(Clostridium pasteurianum)(德國DSMZ之DSM 525)，拉格拉氏梭菌(Clostridium ragsdali P11)(ATCC BAA-622)，煎盤梭菌(Clostridium scatologenes)，熱醋梭菌(Clostridium thermoaceticum)，雅爾氏梭菌(Clostridium ultunense)，庫茲氏脫硫菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)，黏液真桿菌 (Eubacterium limosum)，硫還原地桿菌(Geobacter sulfurreducens)，乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)，巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)，熱醋莫雷拉氏菌(Morrella thermoacetica)，自嗜熱莫拉氏菌(Morrella thermoautotrophica)，芬尼氧菌(Oxobacter pfernnigii)，產生性腖鏈球菌(Peptostreptococcus productus)，產生性魯米諾球菌(Ruminococcus productus)，凱伍厭氧嗜熱菌(Thermoanaerobacter kivui)，及其組合。本文所述的方法100也可以選擇適用其它產乙酸或厭氧細菌。
在一個實例中，所使用的細菌包括細菌細胞基因組DNA中G+C含量為約50%或更低的產乙酸細菌。所述產乙酸細菌可以是活性的、非活性的或兩者的組合。在該方面，G+C含量可以通過本領域習知的任何方法確定。例如，可以使用如Sambrook等人在。(1989)分子複製：實驗室手冊(冷泉港實驗室出版社，冷泉港)(也稱為"Maniatis"，其通過引用併入本文以供參考)中所描述的方法對基因組進行測序。G+C含量之後可通過手動方法或任意數量的程序來確定，例如Bohlin等人"分析原核細胞內的同質性GC含量"，BMC Genomics2010,11：464，其通過引用併入本文以供參考。其它用於確定G+C含量的方法還包括美國專利案第8,143,037號，Mesbah等人的(1989)"根據Deoxyguanosine/Thymidine的比率在復雜混合物中通過高效液相色譜儀測定鳥嘌呤+胞嘧啶對DNA的摩爾百分比。J.Chromatogr.479：297-306，和Tanner等人的"Costridium ljungdahlii sp.11月，產乙酸菌種在梭菌rRNA同源組I"，國際系統細菌學雜誌，Apr.1993,p.232-236，所有這些文獻在此通過引入併入本文作為參考。
在步驟110中，在將細菌培養物接種到發酵器中時，向發酵器提供一個初始進料氣體速率以用於初始微生物種群(例如，厭氧細菌)的有效生長和隨後發酵。該發酵器提供了一個培養厭氧細菌的環境。合適的發酵器可以包括但不限於以下的一種或多種：連續攪拌反應器(CSTR)，固定化細胞反應器(ICR)， 滴流床反應器(TBR)，移動床生物膜反應器(MBBR)，泡罩塔，氣體提升發酵器，薄膜反應器(例如，中空纖維薄膜反應器(HFMBR))，靜態混合器，容器，管道裝置，塔，環管反應器及其組合。在方法100中，可以使用任何習知的發酵器或發酵生物反應器。發酵器的例子系描述於美國專利申請案61/571,654和61/571,565之內、二者皆係於2011年6月30日提申，美國專利申請案61/573,845之內、係於2011年9月13日提申，美國專利申請案13/471,827和13/471,858之內、二者皆係於2012年5月15日提申，及美國專利申請案13/437,167之內、係於2012年5月16日提申，此等之全體均併入本文以供參考。
在一個實施方案中，發酵器包括連接到一個第二生物反應器的一個第一生物反應器，其中第一生物反應器將發酵液體作為進料遞送到第二生物反應器中，其中在第二生物反應器中產生乙醇。例如，所述發酵器可以是兩級CSTR系統，用於提高培養穩定性。作為實例，可選地，所述發酵器可以包括在第一CSTR室中的第一生長階段和在第二CSTR室中的第二生產階段。
在一個實例中，液體培養基和來自生產階段CSTR的未轉化底物氣體被輸送到所述生長階段CSTR中。一般來說，新鮮的氣體進料，新鮮的培養基進料以和/或自生長階段CSTR的一個細菌培養基進料可以被遞送到生產階段CSTR中。可選地，可使用細胞再循環將從生產階段CSTR中獲取的細菌細胞，經與發酵產物分離後以送回到生產階段CSTR中以獲得高的細菌發酵效率。一般而言，細菌細胞不再循環到生長階段CSTR中。美國專利案第10/311,655號中描述了一個連續發酵方法並在此併入本文以供參考。術語"發酵"、發酵過程"、"細菌發酵過程"、"發酵反應"、"細菌發酵反應"等旨在涵蓋生長階段和產物生物合成階段的過程。在一個方面，發酵是指將一氧化碳轉化為醇。在一個方面，細菌發酵過程開始於向含有細菌的發酵器中添加合適的發酵培養基和一種或多種氣態底物。
通常，發酵液體肉湯伴隨著發酵器內的細菌發酵過程的開始而產生。所述發酵器內部的發酵液體肉湯包括一種或多種，除所述培養基、所述一種或多種氣態底物、和所述細菌之外，的發酵產物。由發酵器內的細菌發酵過程而產生的發酵液體肉湯中可以包含一種或多種含氧的烴化合物，例如醇類等，包括但不限於乙醇、2-丁醇、2-丁酮、2，3-丁二醇、丙酮、丁二烯、丁烷、丁醇、丁酸鹽、丁酸、乙烯、和脂肪酸、乙酸、以及它們的組合。
在一個方面，一種乙醇和乙酸的混合物可以被產生。在另一個方面，乙醇和丁醇的混合物可以被產生。在一個實例中，乙醇在發酵器中以大於10g/L每天的生產率產生，而游離乙酸的濃度則保持在小於5g/L。發酵液體肉湯中的乙醇對醋酸鹽的比率範圍可以是從1：1到20：1。
發酵器中的發酵液體肉湯可以包含在稀釋濃度下的乙醇並且可以在需要時對其質量和/或其濃度上進行進一步處理。例如，發酵器中包含發酵產物的發酵液體肉湯可以被輸送至一個蒸餾室或其它類型的反應器中，以被蒸餾成較高濃度的最終蒸餾產物，並進一步進行處理和回收。
發酵液體肉湯還可以包括死的或無活性的細菌細胞。這些細菌細胞也稱為細菌細胞或厭氧細菌細胞。從細菌發酵過程中大量積累的細胞也被稱為細胞質或廢生物質。術語"無活性的產乙酸細菌"或"無活性的細菌細胞"是指在經歷細菌發酵過程後已失去複制能力的死細胞。術語"細胞質"是指形成微生物生物質整體的細菌細胞。所述微生物生物質可在細菌發酵期間積聚並且可通過本文所述的方法和系統加工成發酵衍生的蛋白質。發酵液體肉湯還可以包括各種蛋白質、氨基酸、碳水化合物、核酸和其它組分。核酸的實例包括核苷酸，如DNA、RNA及其任何衍生物和類似物。由於細胞質或微生物生物質在發酵肉湯中的積累，發酵肉湯本身可提供顯著的熱量值。所述發酵液體肉湯具有的干物質含量可達大約0.5%,1%,5%,10%,20%,25%,30%,35%,40%,45%，和大約50%。
如圖1A所示，在方法100的步驟120處，具有第一濃度的含厭氧細菌細胞的發酵液體肉湯和發酵產物被遞送出細菌發酵器。一般而言，當細胞在發酵器內達到穩態生長時，含有細菌細胞的發酵液體肉湯可被輸送出發酵器。對於在穩態細菌生長階段之後的發酵過程，發酵液體肉湯內所含的第一種細菌細胞的第一濃度可以是0.5g/L(乾細胞質)或更高，或1.0g/L或更高，或2.0g/L或更高，或5.0g/L或更高，或15.0g/L或更高，或30.0g/L或更高。
接下來，在步驟130中，使用諸如一個或多個細胞分離器將發酵液體肉湯中的厭氧細菌細胞分離成不含細胞的滲透液和含細胞的懸浮液。該步驟的目標是將細菌細胞從發酵液體肉湯中分離出去，並分別獲得不含細胞的滲透液和含細胞的懸浮液。不含細胞滲透液主要包含發酵過程產生的發酵產物，並可通過蒸餾和其他工藝進一步處理。含細胞的懸浮液主要由發酵過程後的細菌細胞組成。所述含細胞的懸浮液內的細菌細胞可以測定為第二濃度(或第二細胞密度)，並且在一個實施方案中，所述含細胞的懸浮液內的細菌細胞的第二濃度等於或高於所述發酵液體肉湯內所含的細菌細胞的第一濃度。
為了在發酵器中維持微生物培養所需的細胞濃度，所述細菌發酵過程包括排出發酵液體肉湯的一部分。細胞濃度的增加可能引起發酵過程中的操作相關的問題，例如，不需要的游離乙酸濃度的增加，使得乙酸鹽的生產變得比乙醇的生產更有利。因此，監測細胞密度並定期或連續地排出發酵液體肉湯中的細胞變得尤為重要。術語"細胞密度"是指發酵培養基中每單位體積的微生物細胞的質量，例如，克/升。
在細菌發酵器中的細胞濃度的穩定是通過從發酵器中排出細菌細胞至細胞濃度低於穩定狀態時的濃度來完成的，其利用了反應器中減少的氣體或營養底物，並在發酵液體肉湯中乙酸鹽表像中游離乙酸濃度高於一個高濃度值(例如，游離乙酸濃度為1g/L或更高，或者2g/L或更高)時增加液體加料速率。 無需額外的培養補充，通過在發酵器內保持恆定的細胞濃度，大規模、連續的細菌發酵可以維持很長的時間(例如，許多個月)。在此期間內，一種或多種氣體(例如CO、CO2、H2和其它碳源底物)連同含有維生素和其它必需營養物的液體營養培養基被送入發酵器的細菌培養物中。
可用於從發酵液體肉湯中分離無細胞滲透液和含細胞懸浮液的合適的細胞分離器包括但不限於任何過濾裝置、中空纖維過濾裝置、螺旋纏繞過濾裝置、超濾裝置、陶瓷過濾裝置、錯流過濾裝置、體積排阻柱過濾裝置及其組合。可用於本發明的過濾型細胞分離器的合適的過濾裝置包括，但不限於，螺旋纏繞膜/過濾器、錯流過濾器等。此外，分離無細胞滲透液的另一個合適的方法是通過使用一個或多個離心裝置。
在一個實施方案中，在步驟130中使用的細胞分離器可以將細菌細胞分離成含細胞懸浮液和不含細胞的滲透液和/或濃縮所述含細胞懸浮液，使其細胞濃度高於進入細胞分離器前的發酵液體肉湯內的細胞濃度。在另一個實施方案中，發酵液體肉湯內的細胞可通過將其多次輸入細胞分離器來進行分離和濃縮(例如，多次通過一個或多個過濾型過濾裝置或多次以相同或不同的離心速度通過離心機)。
在一個較佳的實施方案中，在細胞分離後，含細胞懸浮液內的細胞濃度(或細胞密度)高於發酵液體肉湯的細胞濃度。在本發明的一個方面，使用一個或多個具有螺旋纏繞過濾器的過濾裝置，通過使發酵液體肉湯多次通過螺旋纏繞過濾器，來進行細胞濃縮。
在另一個方面，細胞被再循環，再循環一般是指將無細胞滲透液和含細菌細胞的懸浮液分離並將所有或部分分離出的細菌細胞送回到發酵器中。在一個實施方案中，細胞分離器為一個超濾裝置，例如過濾器，用於完成細胞分離和/或細胞再循環。
仍然在另一個方面，在發酵器內培養的細菌的穩態細菌生長期間，從發酵器中將細胞排出，以將細菌細胞收集到較高濃度的含細胞懸浮液或半乾微生物生物質中。在一個實施方案中，細胞排出需要一定量的發酵液體肉湯和發酵培養基中的其它物質。例如，細胞排出可以通過在細菌發酵期間從發酵器中取出發酵液體或發酵肉湯來達成。在另一個實施方案中，細胞排出可以通過從發酵器中移除處於第一細胞濃度的發酵液體並進一步濃縮以獲得濃縮的含第二細胞濃度的含細胞懸浮液。所述含細胞的懸浮液具有比從發酵器中取出的發酵液體的細胞密度更高的細胞密度。這些步驟提供了有效去除某些顆粒，並且在從方法100中最終產生高蛋白質含量的富含蛋白質的營養補充物的方法。
在一個方面，細胞排出在連續細菌發酵期間發生。在另一個方面，細胞排出發生在細菌發酵之後，其中細菌發酵過程被暫停或停止以允許從發酵器中排出微生物生物質。
在方法100的步驟140處，將包含在含細胞懸浮液內的細菌細胞破裂以生成勻漿。一個破裂裝置可被用於破裂和/或裂解含細胞懸浮液內的細菌細胞的細胞膜。用於破裂細菌細胞的破裂裝置的實例包括但不限於各種類型的微流體裝置、聲波處理裝置、超聲波裝置、機械破裂裝置、法式破碎機、冷凍機、加熱器、高溫反應器、均質器、熱交換器、高溫反應器、蒸餾柱、增加工藝流和存儲罐溫度的設備、巴氏滅菌裝置、UV滅菌裝置、伽馬射線滅菌裝置、反應器及其組合。
如圖1A所示，在含細胞懸浮液內的細菌細胞被破碎-打開和/或破裂之後，所得到的破裂的細胞混合物，例如，勻漿，可以通過步驟150進行進一步處理，以將勻漿分離成一個含蛋白質部分和一個含蛋白質細胞碎片部分，進而淨化並萃取出額外的含蛋白質部分以生成富含蛋白質的營養補充劑。所述分離通過 使用一個或多個分餾器來進行。在一個方面，一個或多個含蛋白質的部分被獲取並且所述一個或多個蛋白質還可以包括游離氨基酸、總氨基酸和肽。
在步驟150處，用於分餾勻漿的一個或多個分餾器的可用實例包括但不限於，各種類型的固液分餾器、離心裝置、連續離心裝置、沉降式離心機、盤堆式離心機、過濾裝置、中空纖維過濾裝置、螺旋纏繞過濾裝置、陶瓷過濾裝置、錯流過濾裝置、體積排阻裝置、一個或一系列體積排阻柱、一個或一系列離子交換柱、一個或一系列碳聚合物柱，流通式磁力分餾器、超濾裝置、一個或一系列親和層析柱、一個或一系列凝膠過濾柱及其組合。
在一個實施方案中，在步驟150中，將通過一個或多個破裂裝置進行細菌細胞破裂之後獲得的勻漿遞送至一個第一分餾器，以獲得一個第一含蛋白質部分和一個第一含蛋白質細胞碎片部分。在一個方面，第一含蛋白質部分具有的蛋白質含量為至少為1%或更多、3%或更多、5%或更多、10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、或95%或更多。
在一個實施方案中，在步驟160中，來自勻漿的第一含蛋白質部分可以直接摻入到富含蛋白質的營養補充物組合物、細胞生長培養基補充物/組合物、藥物組合物、和/或動物飼料(例如，魚飼料、蝦飼料、雞飼料等)中。這樣的摻入可能需要將第一含蛋白質部分乾燥成低水分含量(例如，糊劑或粉末形式)並直接將第一含蛋白質部分與其它成分(例如，額外的動物飼料營養物、藥物填充物、混合劑、塑化劑等)混合用於製作一種或多種營養補充劑。本文所述的步驟160可以包括另外的處理步驟，如調節第一含蛋白質部分的pH值，添加一種或多種溶解度增強劑，從第一含蛋白質部分去除有害蛋白質，和/或它們的組合以增強第一含蛋白質部分的質量和增加其濃度。此外，含第一蛋白質的部分可以通過對 細菌發酵衍生的蛋白質的提取和純化而經歷進一步的下游加工，並且將其用作富含蛋白質的營養補充劑。這樣的示例在圖2A和2B中示出。
可選地，在步驟165中，來自勻漿的第一含蛋白質細胞碎片部分可以直接摻入到富含蛋白質的營養補充物組合物、藥物組合物、細胞生長培養基補充物/組合物、和/或動物飼料(例如，魚飼料、蝦飼料、雞飼料等)中。類似地，額外的處理步驟，如調節第一含蛋白質細胞碎片部分的pH值、向第一含蛋白質細胞碎片部分添加一種或多種溶解度增強劑、從第一含蛋白質細胞碎片部分中去除有害蛋白、和/或它們的組合可按需進行以增強第一含蛋白細胞碎片部分的質量和增加其濃度。在一個方面，如果第一含蛋白質細胞碎片部分可作為可溶性蛋白被單獨回收，那麼所回收的蛋白可以被直接獲得併被摻入到用於動物攝入或人類攝入的富含營養物的補充物中。然而，如果要將所述第一含蛋白質細胞碎片部分摻入到高品質的用於人類攝入的富含營養物的補充劑中，可能需要對其進行進一步的下游處理以純化和回收營養物和蛋白質。在另一個方面，可以對該方法中回收的不溶性蛋白質進行進一步的下游加工，然後與第一含蛋白質部分混合併作為富含蛋白質的營養補充物。
圖1B是一個從細菌發酵系統生產富含蛋白質的營養補充物的方法100的另一個實例的流程圖。方法100中的對於氣態底物的細菌發酵可在有利於形成烴化合物、碳水化合物、特定蛋白質、特定氨基酸和/或其它所需組分的條件下操作，同時保持所需的發酵產物的生產水平，例如醇的生產率水平。
方法100的步驟130包括將所述含厭氧細菌細胞的發酵液分離成不含細胞的滲透液和一份含有第二濃度的厭氧細菌細胞的含細胞的懸浮液。可選地，方法100的步驟135包括將含細胞的懸浮液儲存在一個第一存儲罐中。在一個方面，所述細菌細胞可經歷預處理以製備產生具有高蛋白質含量且適於消耗的富含蛋白質的補充物。在另一個方面，在步驟130處通過添加的一種或多種添加劑 而進行的預處理可有助於優化用於使細菌細胞破裂的條件並生成高質量的勻漿。
在步驟130中使用的合適的添加劑包括但不限於洗滌劑、pH調節劑、酶、核酸酶、蛋白酶、水解酶、鹼性緩衝液、酸性緩衝液或其組合。在一個實施方案中，方法100的步驟130包括降低含細胞懸浮液中經發酵衍生的細菌細胞的核酸含量。這種預處理過程是通過用核酸酶處理細菌細胞來完成的。使用的核酸酶的實例包括但不限於脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、benzonases、和核酸酶。含細胞懸浮液的核酸酶處理可以進一步通過鹼水解和化學提取進行輔助，例如硫酸銨沉澱、乙醇沉澱、聚乙烯亞胺沉澱等。
方法100的步驟140包括通過破裂裝置對含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞的細胞膜進行破裂以生成勻漿。可選地，方法100的步驟145包括在第一存儲罐中儲存破裂後的含細胞的懸浮液。在一個方面，細菌細胞可經歷預處理以製備產生具有高蛋白質含量並適於消耗的富含蛋白質的補充物。在另一個方面，在方法步驟145處可添加的一種或多種添加劑以優化細菌細胞破裂後的條件。
在步驟145中使用的合適的添加劑包括但不限於洗滌劑、pH調節劑、酶、核酸酶、蛋白酶、水解酶、鹼性緩衝液、酸性緩衝液或其組合。在一個實施方案中，方法100的步驟145包括降低勻漿中的來自發酵的細菌細胞的核酸含量。這種預處理過程是通過用核酸酶處理細菌細胞來完成的。使用的核酸酶的實例包括但不限於脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、benzonases、和核酸酶。含細胞懸浮液的核酸酶處理可以進一步通過鹼水解和化學提取進行輔助，例如硫酸銨沉澱、乙醇沉澱、聚乙烯亞胺沉澱等。
方法100的步驟150包括使用一個第一分餾器將勻漿分餾成一個第一含蛋白質部分和一個含蛋白質細胞碎片部分。方法100的步驟160包括獲取所述第一含蛋白質部分並將其作為富含蛋白質的營養物的補充物。方法100的步驟 165包括獲取所述含有蛋白質細胞碎片部分並將其作為富含蛋白質的營養物的補充物。
圖2A是方法200A的一個實例，其示出了通過對從發酵過程獲得的含厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液(例如，方法100步驟130中含有第二濃度的含細胞懸浮液)的處理來獲得一個第二含蛋白質部分，並將其作為富含蛋白質的營養補充劑。在所述方法中，在將含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞的細胞膜破裂以生成勻漿前，可選地，可在步驟202中用一種或多種添加劑對含細胞懸浮液進行處理。
在步驟202的細胞預處理過程中，含有細胞的懸浮液可以在一個預處理室或一個存儲罐中進行預處理，所述預處理包括使用一種或多種添加劑進行處理以輔助並提高步驟204中通過打破厭氧細菌細胞的細胞壁和細胞膜進行的細胞破裂的效率。在一個方面，濃縮的細菌細胞進入並儲存在一個存儲罐中，直到累積到一定體積的細胞時被送入破裂裝置中一併處理。在另一個方面，儲存於存儲罐中的同時，細菌細胞可以經歷預處理以製備產生具有高蛋白質含量並適於消耗的富含蛋白質的補充物。在又一方面，在步驟202中通過加入一種或多種添加劑進行的預處理可有助於優化在步驟204處破裂細菌細胞的條件並產生高質量的勻漿。
在步驟202中使用的合適的添加劑包括但不限於洗滌劑、pH調節劑、酶、核酸酶、蛋白酶、水解酶、鹼性緩衝液、酸性緩衝液或其組合。在一個實施方案中，方法200A步驟202包括降低含細胞懸浮液中經發酵衍生的細菌細胞的核酸含量。這種預處理過程是通過用核酸酶處理細菌細胞來完成的。使用的核酸酶的實例包括但不限於脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、benzonases、和核酸酶。含細胞懸浮液的核酸酶處理可以進一步通過鹼水解和化學提取進行輔助，例如硫酸銨沉澱、乙醇沉澱、聚乙烯亞胺沉澱等。在一個方面，含細胞懸浮液中的核酸含量可降低至約1.5%-5%，或約2%到18%。
在步驟206處，在細胞破裂之後，可以進一步地對勻漿進行另外的提取和純化，例如使用一個第一分餾器將勻漿分餾成一個第一含蛋白質部分和一個含蛋白質細胞碎片部分。用於將勻漿進行分餾的第一分餾器的示例包括但不限於各種類型的固液分餾器、離心裝置、連續離心裝置、沉降式離心機、盤堆式離心機、過濾裝置、中空纖維過濾裝置、螺旋纏繞過濾裝置、陶瓷過濾裝置、錯流過濾裝置、體積排阻裝置、一個或一系列體積排阻柱、一個或一系列離子交換柱、一個或多個碳聚合物柱、流通式磁力分餾器，超濾裝置，一個或一系列親和層析柱、一個或一系列凝膠過濾柱、以及它們的組合。
或者，含有濃縮的細菌細胞含細胞懸浮液在經過步驟202中所提到的預處理後可以直接進入在步驟204處的破裂裝置以幫助和優化於步驟206處對勻漿進行分離和分餾的條件。在另一個方面，可對從方法200A中回收的蛋白質進行進一步的下游加工，然後將其與所述第一含蛋白質部分混合併產生富含蛋白質的營養補充物。
在步驟208處，將所述第一含蛋白質部分遞送到一個第二分餾器，並且在步驟210處使用所述第二分餾器將第一含蛋白質部分分餾成第二含蛋白質部分。用於分餾含蛋白質部分的第二分餾器的實例包括，但不限於，各種類型的固液分餾器、離心裝置、連續離心裝置、沉降式離心機、盤堆式離心機、過濾裝置、中空纖維過濾裝置、螺旋纏繞過濾裝置、陶瓷過濾裝置、錯流過濾裝置、體積排阻裝置、一個或一系列體積排阻柱、一個或一系列離子交換柱、一個或多個碳聚合物柱、流通式磁力分餾器，超濾裝置，一個或一系列親和層析柱、一個或一系列凝膠過濾柱、以及它們的組合。
在步驟212處，可以將獲得的第二含蛋白質部分配製成富含蛋白質的營養補充劑、藥物組合物、細胞生長培養基/組合物、和/或動物飼料(例如，魚飼料、蝦飼料、雞飼料等)。這樣的摻入可能需要將第二含蛋白質部分乾燥成低水 分含量(例如，糊劑或粉末形式)並直接將第二含蛋白質部分與其它成分(例如，額外的動物飼料營養物、藥物填充物、混合劑、塑化劑等)混合用於製作一種或多種類型的營養補充劑。
作為一個實例，來自步驟204的勻漿可以進入一個過濾設備以產生第一含蛋白質部分(例如，經過濾設備過濾後的含蛋白質部分的濾液)。含蛋白質部分的濾液是一個部分純化的蛋白質產物。在一個實施方案中，將含蛋白質部分的濾液進行離心(例如通過第二分餾器/離心裝置)以產生額外的可溶性蛋白質級分和細胞固體部分。這樣的第二含蛋白質部分可以單獨或組合使用以作為富含蛋白質的營養補充劑。
作為另一個實例，可以來自步驟204的勻漿進行離心，並在之後收集含有蛋白質部分的上清液。含蛋白質部分的上清液進入過濾裝置，並在其中收集一個第二含蛋白質部分濾液。作為一個實例，第一含蛋白質部分僅進入一個過濾裝置，並在之後收集一個含蛋白質部分的濾液並將其用作富含蛋白質的補充物。作為又一個實例，僅對第一含蛋白質部分進行離心，並在之後收集蛋白質分餾物或上清液中的含蛋白質部分。一個或多個含蛋白質部分和細胞碎片蛋白質的分離是通過一個或多個分餾器完成的。
在一個方面，使用一個擁有兩個分餾器的發酵系統。在另一個實施方案中，使用一個具有三個分餾器的發酵系統。圖2B是根據本發明的一個或多個實施方案處理來自發酵過程的含細胞懸浮液的方法200B的一個實例，其使用三個分餾器來獲得一個第三含蛋白質部分並將其作為富含蛋白質的營養補充物。
如圖2B中所示，方法200B包括在步驟214中將第二含蛋白質部分遞送到第三分餾器和在步驟216中從所述第二含蛋白質部分分餾並提取出一個第三 含蛋白質部分。在步驟218處收集所述第三含蛋白質部分並且在步驟220中獲取所述第三含蛋白質部分並且將其作為富含蛋白質的補充物。
作為一個實例，來自步驟210的第二含蛋白質部分可以被遞送進入第三分餾器(例如，過濾裝置)以產生一個含蛋白質部分的濾液並將其收集以用作富含蛋白質的補充物。作為另一個實例，對第二含蛋白質部分進行離心，並在之後收集含蛋白質部分的上清液和細胞碎片的團粒部分。從過濾裝置中收集含蛋白質部分的濾液，並將其作為富含蛋白質的營養補充劑，其蛋白質含量為1%~3%、3%~7%、7%~10%、10%~14%左右、11%~20%左右、21%~35%左右、35%左右或更多。
在一個實施方案中，從步驟160、165、212、220獲得的一個或多個含蛋白質部分被遞送至一個脫水室，收集脫水之後的含蛋白質部分並將其作為富含蛋白質的營養補充劑。或者，存在兩個或更多個脫水室，其中來自每個步驟的每個含蛋白質部分都被遞送至單獨的脫水室中。脫水室接收含蛋白質的部分，並將它們乾燥成低水分糊劑形式或乾粉形式，以使其混合入富含蛋白質的營養補充劑中，用於人類攝入和/或動物飼料。合適的脫水室的實例包括但不限於烘箱乾燥器、噴霧乾燥室、滾筒乾燥器、冷凍乾燥器、凍乾裝置及其組合。
在一個實施方案中，本發明是一種利用厭氧細菌發酵過程產生富含蛋白質的營養補充劑的方法。所述方法包括：在發酵器中用厭氧細菌發酵氣態底物；從所述發酵器中獲得一定量的包含第一濃度的厭氧細菌細胞的發酵液；將所述含厭氧細菌細胞的發酵液分離成不含細胞的滲透液和包含第二濃度的厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液；將所述含細胞懸浮液中厭氧細菌細胞的細胞膜破裂以生成勻漿，並從勻漿中分離出細胞碎片部分和第一含蛋白質部分。
在一個方面，所述方法包括在發酵器中用厭氧細菌發酵氣態底物。所述氣態底物是含一氧化碳和一種或多種氣體的氣態底物，其流入發酵器中。所用 的一種或多種氣體選自由碳源底物、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、氫(H2)氣體、合成氣及其組合組成的組。厭氧細菌包括，但不限於，一種或多種產乙酸菌株，如來自梭菌屬的產乙酸菌，以及它們的類似變體。所述發酵器提供了一種對梭菌屬細菌友好的培養環境，，其中存在一種發酵培養基，該發酵培養基流入所述發酵器以向所述細菌提供營養、維生素和其它所必需礦物質。
該方法還包括從發酵器獲得一定量的處於第一細胞濃度的含厭氧細菌細胞的發酵液體。收集發酵液體可以被遞送到細菌發酵系統內的一個或多個裝置中。在一個方面，隨後對發酵液體的操縱是在第二、第三和第四細胞濃度中進行的。在大多數方面，所操縱發酵液體的第二細胞濃度大於發酵液體的第一細胞濃度。
該方法還包括在第一細胞分離器中接收一定量的包含厭氧細菌細胞的發酵液體。第一細胞分離器將發酵液分離成一個含有厭氧細菌細胞的第一含細胞懸浮液和一個第一不含細胞的滲透液。輸送至第一細胞分離器的發酵液體具有第一細胞濃度。由第一細胞分離器產生的第一含細胞的懸浮液具有第二細胞濃度。第一含細胞的懸浮液的第二細胞濃度高於發酵液體的第一細胞濃度。第一無細胞滲透溶液被送到與第一細胞分離器連接的一個處理室中。在一些方面，一部分第一含細胞的懸浮液被送回到發酵器中。
在另一個方面，第一發酵液體的第一部分被送到第一細胞分離器以進一步處理而產生乙醇。將第二發酵液體的第二部分送至第二細胞分離器，以進一步處理而產生可用作富含蛋白質的營養補充劑的含蛋白質產品。
本發明的方法提供了一種在進行高生產率的乙醇生產的同時，再利用發酵過程中產生的細菌細胞的有用的結構部分的方法。所收集的發酵液包含處於第一濃度的厭氧細菌細胞。所述細胞分離器產生含有第二濃度的厭氧細胞的細胞懸浮液。在一個實施方案中，細胞分離器將含有第二濃度的含細胞懸浮液遞 送到一個破裂裝置中。在另一個實施方案中，細胞分離器將含細胞的懸浮液遞送到一個存儲罐中。
一旦製成收集物，所述收集物可被進一步處理以將所述含厭氧細菌細胞的發酵液分離成不含細胞的滲透液和一個有第二濃度的含細胞的懸浮液。所述含細胞懸浮液的第二濃度高於所述含厭氧細菌細胞發酵液的第一濃度。不含細胞的滲透液被送回處理室，該室蒸餾乙醇以供乙醇生產。這提供了一種有效的系統，該系統不會棄去仍有用的含乙醇的不含細胞的滲透液。
所述方法還包括使所述含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞的細胞膜破裂以生成一個勻漿。在一個方面，這發生在一個破裂裝置中。所述含厭氧細菌細胞的含細胞的懸浮液進入所述破裂裝置中，其中所述含細胞的懸浮液經受強力(例如，機械的、聲音的、或壓力的)。細胞膜在高剪切力的作用下破裂，使得細胞被打開而細胞內的物質自由流入所述含細胞懸浮液中。所述破裂裝置生產出的勻漿還可被進一步加工成一個第一含蛋白質部分。所述勻漿含有在發酵衍生的細菌細胞中通常能發現的幾個部分，包括蛋白質、金屬(例如，Ca、Cl、Co、K Mg、Ni、P、S、Se、W、Zn、Na、Fe)、脂質、核酸和糖。
為了獲得第一含蛋白質部分，所述方法還包括從勻漿內的細胞碎片部分分離出第一含蛋白質部分。在一個方面，將勻漿離心，然後過濾，以產生第一含蛋白質部分。將第一含蛋白質部分遞送至一個第一分餾器，該分餾器從第一含蛋白質部分分離出第二含蛋白質部分並從第一分餾器收集該第二含蛋白質部分。
在一個方面，所述方法包括將從勻漿中細胞碎片部分分離出的第一含蛋白質部分脫水。在該方面，該系統具有一個連接至第一分餾器的脫水室。第一 分餾器將第一含蛋白質部分遞送到脫水室中，其中脫水室生成一個乾燥的含蛋白質部分，其可作為富含蛋白質的營養補充劑。
在另一個方面，所述方法包括將所述勻漿中的細胞碎片部分脫水。在該方面中，破裂裝置將所述細胞碎片部分遞送到一個脫水室中，以準備用於進行進一步的下游處理。所述細胞碎片部分是含有高蛋白質含量的一個不溶性級分。通常，這包括不可溶解的細胞壁或細胞膜組分。其還可以包含小濃度的核酸或蛋白質聚集體。在大多數方面，大部分的核酸被釋放到第一含蛋白質部分。有時這些蛋白質聚集體難以溶解並且將繼續保留在細胞碎片部分中。第一含蛋白質部分和細胞碎片部分的蛋白質含量的測定是基於所有可溶或不可溶部分的總細胞質量和總蛋白質量質量平衡的假設。作為示例，不溶性蛋白質回收率的計算包括從總細胞質量減去可溶性蛋白質的質量以計算出不溶性質量的近似值。
II.用於處理產乙酸菌生物質以產生發酵衍生的蛋白質的細菌發酵系統
所述細菌發酵系統包括但不限於細菌發酵器、一個或多個破裂裝置、一個或多個細胞分離器、以及一個或多個分餾器。此外，一個或多個脫水室被連接到所述一個或多個破裂裝置和/或一個或多個分餾器，以增加所獲得的含蛋白質部分的蛋白質濃度並降低它們的水分含量。可選地，所述細菌發酵系統還包括一個或多個存儲罐、儲存室、和/或預處理室，用於儲存細菌細胞或含細胞懸浮液。
圖3A-3B、4A-4H、5A-5E和6示出了這樣的示例性細菌發酵系統，其用於從一個使用厭氧細菌培養物的發酵過程中產生含細胞懸浮液和一種或多種含氧烴化合物。圖3A是一個用於生產含細胞懸浮液和一種或多種含氧烴化合物的細菌發酵系統300A的示意圖，其使用了兩個細胞分離器和一個脫水室。
在圖3A中，細菌發酵系統300A包括發酵器310、細胞分離器320、細胞分離器330、處理室350和可選地，脫水室375。該細菌發酵系統300A可以是，在一個實施方案中，連續的細菌發酵系統。或者，細菌發酵系統300A可以是，批處理細菌發酵系統。
兩個或更多個入口管線，例如入口管線302和入口管線304，與發酵器310相連。入口管線302可用於將氣態底物、額外的補充物、和/或其它固體或液體底物輸送到發酵器310中。入口管線304可用於將發酵培養基或其它培養基遞送到發酵器310中。氣態底物和發酵培養基的轉化在發酵器310中發生。本文使用的發酵培養基包括含有充足的維生素、鹽和礦物質的常規細菌生長培養基，以使所選的厭氧細菌生長。維生素以維生素混合液的形式添加到發酵培養基中。維生素包括幾種來自B族的維生素，包括但不限於硫胺素(B1)、泛酸(B5)、生物素(B7)、其它氨基酸及其組合。
在發酵器310內部，氣態底物和發酵培養基被厭氧細菌發酵，進而轉化為含有第一濃度的厭氧細菌細胞的發酵液體肉湯。反應器氣體然後通過出口管線314釋放出細菌發酵系統300A。發酵器310提供了一個用厭氧細菌發酵氣態底物的環境。在一個方面，所述氣態底物是一種或多種由碳源底物、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、氫氣(H2)和合成氣組成的氣體，而所述厭氧細菌是一種或多種選自梭菌屬、醋酸桿菌屬及其變體的厭氧細菌。
發酵器310可以包括三個或更多個出口管線，例如，一個出口管線314、一個出口管線316、以及一個出口管線312。出口管線314可用於輸送氣體、尾氣、多餘氣體等，以將這些額外的氣體排出發酵器310。出口管線312可用於將一部分發酵液體肉湯從細菌發酵系統300A遞送至細胞分離器320中。出口管線316可用於將一部分發酵液體肉湯從細菌發酵系統300A遞送至細胞分離器330中。來自發酵器310的各部分發酵液體肉湯，各自分別通過出口管線312和出口管線316，被 輸送並供應到細胞分離器320和細胞分離器330，。在細胞分離器320和細胞分離器330中，包含的厭氧細菌細胞的發酵液體肉湯(包含第一濃度的細菌細胞)被分離成無細胞的滲透液和一個滲餘溶液(例如，含第二濃度的厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液)。
出口管線322和出口332分別用於將無細胞滲透液從細胞分離器320和細胞分離器330中輸送入處理室350。在處理室350的內部，無細胞滲透物溶液被處理成含氧的烴化合物。處理室350還可以回收蒸餾的含水物，包括水，通過出口管線354送回發酵器310。在一個實例中，餾出物可以主要包含水，並且還可以包含其它組分。例如，一般的含水餾出物包含95%的水，約5%的乙酸，和一些其它的組分。然後，處理室350通過出口管線352遞送出含氧烴化合物的最終產物用於進一步的下游處理。在一個實施方案中，處理室350是一個蒸餾室，其中無細胞滲透液被處理並蒸餾成高質量的含氧烴化合物(例如高濃度和/或無水形式的乙醇、丁醇，如95% w/w或更高濃度的乙醇等)。
從細胞分離器320獲得的含細胞的懸浮液可以經由出口管線324輸送回到發酵器310中用於細胞再循環，使得含細胞的懸浮液內的細胞可以經歷進一步的發酵過程。另一方面，從細胞分離器330獲得的含細胞的懸浮液可以通過細胞分離器330濃縮並經由出口管線336輸送到脫水室375中以破裂成混合物並乾燥。脫水室375可以是烘箱乾燥器、槳葉乾燥器、噴霧乾燥裝置、滾筒乾燥器、凍乾裝置及其組合。一部分從細胞分離器330中獲得的含有厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液可經由出口管線334被輸送回發酵器310用於進一步的發酵過程。
將所述含細胞懸浮液加工成富含蛋白質的補充物的一個實例是將所述含細胞懸浮液在約100攝氏度或更高的高溫下(例如在250攝氏度或更高)在一個高溫處理含細胞懸浮液的另一個實例是將受治療者的含細胞懸浮液在溫度為約0攝氏度或更低的低溫室內部處理。
出口管線376連接到脫水室375以向外遞送經破裂的和脫水的含細胞的懸浮液，所述破裂和脫水形式的含細胞懸浮液可被用於摻混富含蛋白質的補充物中。經脫水室375中的脫水過程處理之後，富含蛋白質的營養補充物可經由出口管線376從細菌發酵系統300A中獲得併收集。
圖3B是一個用於產生含細胞懸浮液和一種或多種含氧烴化合物的細菌發酵系統300B的示意圖，其包括兩個細胞分離器、一個存儲罐和一個脫水室。在圖3B中，細菌發酵系統300B包括與發酵器310連接的入口管線302、入口管線304和數條出口管線，與細胞分離器320連接的出口管線312、出口管線322、和出口管線324，與細胞分離器330相連的出口管線316和出口管線336，和與脫水室相連的出口管線336和出口管線376。
此外，細菌發酵系統300B還包括一個存儲罐或儲存罐，用於保持和儲存部分無細胞滲透液。例如，存儲罐340(例如，一個無細胞滲透液存儲罐)經由出口管線322和出口管線332分別與細胞分離器320和細胞分離器330相連。在由細胞分離器320和細胞分離器330進行細胞分離之後獲得的無細胞滲透液可以在存儲罐340中經歷預處理或大量儲存以準備用於處理成為高品質的含氧烴化合物的最終產物。在一個實施方案中，不含細胞的滲透液被從存儲罐340中經由出口管線342遞送到處理室350中以進行進一步處理並產生乙醇。之後，處理過的含氧烴化合物的最終產物經由出口管線352被輸送出處理室350，並且從處理室350產生的水、乙酸、營養物和其他材料可以經由出口管線354被再循環回發酵器310。
圖4A顯示了一個細菌發酵系統400A的示意圖，其具有一個發酵器、一個細胞分離器、一個處理室、一個破裂裝置、一個分餾器和兩個脫水室，用於使用根據本發明的一個或多個實施方案進行厭氧細菌發酵並獲得富含蛋白質的營養補充劑。細菌發酵系統400A包括入口管線402、入口管線404、發酵器410、出口管線412、出口管線414、細胞分離器420、出口管線422、出口管線424、處 理室450、出口管線452、出口管線454、破裂裝置460、出口管線462、分餾器470、出口管線472、出口管線474、脫水室475A、脫水室475B、出口管線476A、和出口管線476B。
細菌發酵系統400A可以是，在一個實施方案中，連續的細菌發酵系統。首先，一個流動的發酵培養基通過入口管線402被供應到細菌發酵系統400A中。接著，氣態底物通過入口管線404提供到細菌發酵系統400A。氣態底物和發酵培養基進入到培養厭氧細菌的發酵器410中。發酵器410提供了一個用厭氧細菌發酵氣態底物的環境。氣態底物和發酵培養基的轉化在發酵器410中發生。在發酵器410中，氣態底物和發酵培養基通過被厭氧細菌促進發酵成含有第一細胞濃度的發酵液體肉湯。未反應的反應氣體然後通過出口管線414從發酵器410中釋放和排出。
進一步地，發酵液體肉湯通過出口管線412被輸送到細胞分離器420。在細胞分離器420中，含厭氧細菌細胞的發酵液體肉湯被分離成不含細胞的滲透液和含第二濃度的厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液。在細胞分離器420中的無細胞滲透液然後經由出口管線422被輸送到處理室450中。細胞分離器420產生的一部分含有厭氧細菌細胞的含細胞的懸浮液經由出口管線424被輸送回發酵器410以經歷進一步的發酵過程。細胞分離器420產生的另一部分的含有含有厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液經由出口管線426被遞送至破裂裝置460中。
在處理室450中，不含細胞滲透液被處理成含氧的烴化合物。處理室450中的水經由出口管線454循環回到發酵器410中。整體地，處理室450將95%乙醇通過出口管線452送出，以用於進一步的下游處理。
在所述破裂裝置460中，破裂述含細胞的懸浮液內所含的厭氧細菌細胞的細胞膜以生成勻漿。勻漿通過出口管線462被送至分餾器470。在一個方面，出口管線474連接到分餾器470，並遞送出第一含蛋白質部分以作為待生產的富 含蛋白質的營養補充物。出口管線472也連接到分餾器470，並將細胞碎片部分遞送到另外的裝置中以用於進一步的下游處理。在另一個方面，一個或多個含蛋白質的級分在一個或多個分餾器中除去多餘的污染物和碎片之後被一起收集在一起，並被生產為富含蛋白質的營養補充物。
可用於本文的示例性破裂裝置包括但不限於微流體裝置、聲波處理裝置、超聲波裝置、機械破裂裝置、法式破碎機、冷凍機、加熱器、均質器、高溫反應器、熱交換器、蒸餾柱、增加工藝流和存儲罐溫度的設備、巴氏滅菌裝置、UV滅菌裝置、伽馬射線滅菌裝置、反應器及其組合
在一個實例中，破裂裝置460是一個可引起細菌微生物的細胞膜和細胞壁的結構的不可逆變化的裝置，從而允許進一步對細菌細胞的內容物進行處理。細菌細胞的內容物包括核酸、蛋白質、糖原、色素、脂滴、晶體和其它營養物，例如不同形式的碳、氮、硫、鈣等。
在一個方面中，破裂裝置460通過使用高力打破厭氧細菌細胞的細胞膜來破裂細胞。高剪切力被施加到含細胞懸浮液內的厭氧細菌細胞上，如通過聲音、壓力或機械手段。在本發明中，該方法包括向破裂裝置460中遞送一個具有第二濃度厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液。破裂裝置460通過用強作用力(例如，機械力、聲力、壓力)破裂細胞的細胞膜並產生勻漿，其中在細菌細胞的破裂狀態下，細菌細胞內的有用部分(例如蛋白質)有更好的可接近性。或者，該方法包括在將勻漿輸送到第一分餾器之前將勻漿輸送到一個第二破裂裝置。第二個破裂裝置進一步破裂勻漿的細胞，之後產生富含蛋白質的營養補充劑。
作為一個示例，破裂裝置460是一個微流體裝置。微流體裝置包括，但不限於，反應室，管，泵，法蘭管，環，墊圈，高壓止回閥。該微流體裝置的反應室可以是陶瓷反應室、耐磨室、閥芯反應室，即單槽、多槽和有微槽的反應室。
作為另一個實例，破裂裝置460是一個酶處理裝置。作為又一個實例，所述破裂裝置是一個超聲波裝置。所述超聲波裝置為一個超聲波探頭或超聲波槽。該超聲波裝置通過使用高頻聲波來攪動細胞並使細胞破裂。作為又一個實例，所述破裂裝置是一個冷凍裝置。所述冷凍裝置具有冷凍和解凍循環，其中細菌細胞進入所述冷凍和解凍循環的多個輪次，其中所述細胞在緩衝液中被冷凍和解凍。作為又一個實例，所述破裂裝置是一個機械破裂裝置。所述機械破裂裝置包括機械葉片或珠子，以破壞細菌細胞的細胞壁和/或細胞膜。
在分餾器470內部，勻漿然後被分餾成第一含蛋白質部分和含蛋白質細胞碎片部分。接著，第一含有蛋白質的細胞碎片部分經由出口管線472被輸送到脫水室475A。然後，第一含蛋白質部分經由出口管線474被輸送到脫水室475B。示例性分餾器包括但不限於各種類型的固液分餾器、離心裝置、連續離心裝置、沉降式離心機、盤堆式離心機、過濾裝置、中空纖維過濾裝置、螺旋纏繞過濾裝置、陶瓷過濾裝置、錯流過濾裝置、體積排阻裝置、一個或一系列體積排阻柱、一個或一系列離子交換柱、一個或多個碳聚合物柱、流通式磁力分餾器，超濾裝置，一個或一系列親和層析柱、一個或一系列凝膠過濾柱、以及它們的組合。
經脫水室475A和脫水室475B的脫水過程處理之後，富含蛋白質的補充營養物可經由出口管線476A和476B分別獲得和收集。
圖4B顯示了一個細菌發酵系統400B的示意圖，其具有一個發酵器、兩個細胞分離器、一個處理室、一個破裂裝置、兩個分餾器和三個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。該細菌發酵系統400B包括入口管線402、入口管線404、發酵器410、出口管線412、出口管線414、出口管線416、細胞分離器420、出口管線422、出口管線424、出口管線426、細胞分離器430、出口管線432、出口管線434、出口管線436、處理室450、出口管線452、出口管線454、破裂裝置460、出口管線462、分餾器470、出口管線472、出口管線474、 脫水室475、出口管線476、分餾器480，出口管線482、出口管線484、脫水室485A、出口管線486A、脫水室485B、和出口管線486B。
在一個方面，細胞分離器430是一個細胞濃縮器。對於本發明，該方法包括從發酵器中收集一定量的含有第一濃度的厭氧細菌細胞的發酵液體肉湯。該發酵液體肉湯通過連接發酵器410的出口管線416被遞送至細胞分離器430中。在細胞分離器430中，發酵液體培養液被分離成不含細胞的滲透液和含厭氧細菌細胞的含細胞的懸浮液，其中含細胞懸浮液中的厭氧細菌的細胞以第一濃度濃縮至第二濃度(例如，具有高細胞濃度，高於所述發酵液體肉湯中的第一濃度)。無細胞滲透液通過連接處理室450和細胞分離器430的出口管線432被輸送到處理室450中。含有第二濃度的細胞的含細胞懸浮液通過連接破裂裝置460和細胞分離器430的出口管線436被輸送到破裂裝置460中。
在一個方面，在通過破裂裝置460的處理之後，勻漿被遞送到分餾器470中以分離成一個含蛋白質部分和一個細胞碎片部分。分餾器470經由出口管線462連接到破裂裝置460。該分餾器470具有至少兩個出口管線，其中出口管線472用於遞送細胞碎片部分，而第二出口管線474用於遞送含蛋白質部分。
在一個方面，第一含蛋白質部分被遞送至分餾器480中以進一步從所述第一含蛋白質部分分離出第二含蛋白質部分。分餾器480經由出口管線474連接到分餾器470。分餾器480具有至少兩個出口管線，其中第一出口管線482向外輸出細胞碎片而第二出口管線484向外輸出第二含蛋白質部分。該方法還包括從第二分餾器收集第二含蛋白質部分。在再另一個方面，存在兩個或更多個分餾器。在本發明的又一個方面，在細菌發酵系統內僅存在一個分餾器用於從其中收集第一含蛋白質部分。示例性的精餾器包括但不限於各種類型的固液分餾器、離心裝置、連續離心裝置、沉降式離心機、盤堆式離心機、過濾裝置、中空纖維過濾裝置、螺旋纏繞過濾裝置、陶瓷過濾裝置、錯流過濾裝置、體積排阻裝置、一 個或一系列體積排阻柱、一個或一系列離子交換柱、一個或多個碳聚合物柱、流通式磁力分餾器，超濾裝置，一個或一系列親和層析柱、一個或一系列凝膠過濾柱、以及它們的組合。
圖4C顯示了一個細菌發酵系統400C的示意圖，其具有一個發酵器、一個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個破裂裝置、一個分餾器和兩個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。所述細菌發酵系統400C包括入口管線402、入口管線404、發酵器410、出口管線412、出口管線414、細胞分離器420、出口管線422、出口管線424、出口管線426、無細胞存儲罐440、出口管線442、出口管線444、處理室450、出口管線452、出口管線454、破裂裝置460、出口管線462、分餾器470、出口管線472、出口管線474、脫水室475A、出口管線476A、脫水室475B、以及出口管線476B。
圖4D顯示了一個細菌發酵系統400D的示意圖，其具有一個發酵器、一個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個破裂裝置、兩個分餾器和三個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。所述細菌發酵系統400D包括入口管線402、入口管線404、發酵器410、出口管線412、出口管線414、細胞分離器420、出口管線422、出口管線424、出口管線426、無細胞存儲罐440、出口管線442、出口管線444、處理室450、出口管線452、出口管線454、破裂裝置460、出口管線462、分餾器470、出口管線472、出口管線474、脫水室475、出口管線476、分餾器480、出口管線482，出口管線484、脫水室485A、出口管線486A、脫水室485B、和出口管線486B。
圖4E顯示了一個細菌發酵系統400E的示意圖，具有一個發酵器、兩個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個破裂裝置、兩個分餾器、和三個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。該細菌發酵系 統400E包括入口管線402、入口管線404、發酵器410、出口管線412、出口管線414、出口管線416、細胞分離器420、出口管線422、出口管線424、細胞分離器430、出口管線432、出口管線436、無細胞存儲罐440、出口管線442、出口管線444、處理室450、出口管線452、出口管線454、破裂裝置460、出口管線462、分餾器470、出口管線472、出口管線474、脫水室475，出口管線476、分餾器480、出口管線482、出口管線484、脫水室485A、出口管線486A、脫水室485B、和出口管線486B。
圖4F顯示了一個細菌發酵系統400F的示意圖，具有一個發酵器、一個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個含細胞存儲罐、一個破裂裝置、兩個分餾器、和三個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。所述細菌發酵系統400F包括入口管線402、入口管線404、入口管線406、發酵器410、出口管線412、出口管線414、細胞分離器420、出口管線422、出口管線424、出口管線426、無細胞存儲罐440、出口管線442、出口管線444、含細胞存儲罐445、出口管線446、處理室450、出口管線452、出口管線454、破裂裝置460、出口管線462、分餾器470、出口管線472、出口管線474，脫水室475、出口管線476、分餾器480、出口管線482、出口管線484、脫水室485A、出口管線486A、脫水室485B、和出口管線486B。
在一個方面，細菌發酵系統400F包括一個存儲罐(例如，含細胞存儲罐445)以儲存從發酵器送出的細菌細胞。在一個實施方案中，所述存儲罐是一個儲存容器用以儲存從所述發酵器中收集的微生物生物質中的厭氧細菌細胞。當細菌細胞連續地從細菌發酵器410中收集並輸送到破裂裝置460中時，可能會使會使破裂裝置460過載，存儲罐的加入減輕了對這個問題的擔憂。將濃縮的細菌細胞送入破裂裝置460的速率可以比將發酵液體肉湯送出細胞分離器/濃縮器的速率更低。
在另一個實施方案中，將存儲罐(例如，含有細胞的存儲罐445)用作一個預處理裝置，其中細菌細胞經一種或多種添加劑的預處理以增加破裂效率。用添加劑處理細胞可以使細胞膜更具延展性以適合對細菌細胞的機械破碎。這種預處理可以在含細胞的懸浮液進入到破裂裝置460之前發生。或者，預處理可以在含有細胞的懸浮液通過破裂裝置460進行破裂之後進行，並且將含有厭氧細菌細胞的勻漿用一種或多種添加劑進行處理。含細胞存儲罐445的實例包括，但不限於，工藝室、儲罐、不銹鋼儲罐、塑料儲罐等。
在細菌發酵系統400F中，含細胞的懸浮液可以在含細胞存儲罐445內用一種或多種添加劑進行預處理。所述一種或多種添加劑可以經由入口管線406加入到含細胞的存儲罐445中，例如，表面活性劑、洗滌劑、EDTA、Triton X-100、Tween-20、十二烷基硫酸鈉、CHAPS、酶、蛋白酶、溶菌酶、benzonase、核酸酶、核糖核酸酶(RNases)、脫氧核糖核酸酶(DNases)、水解誘導劑、pH調節劑、以及它們的組合。在一個實例中，作為pH調節劑的添加劑是氫氧化鈉。在另一個實例中，作為pH調節劑的添加劑是氯化氫。
在一個方面，一個預處理設備連接到一個與發酵器410相連的細胞分離器/濃縮器(例如，細胞分離器420和/或細胞分離器430)上。在另一個方面，所述預處理設備直接連接到發酵器410上，其中預處理設備的一個組件是細胞分離器和濃縮器。所述預處理裝置包括一個預處理室和一個入口(例如，入口管線406)以加入特定的添加劑以使細菌細胞的細胞膜更具延展性以適合其他的破裂技術。使用的添加劑的類型和使用的破裂裝置的類型可以是任何數量可增加細胞破裂效率的組合。
圖4G顯示了一個細菌發酵系統400G的示意圖，其具有一個發酵器、兩個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個含細胞存儲罐、一個破裂裝置、兩個分餾器、和三個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營 養補充物。該細菌發酵系統400G包括入口管線402、入口管線404、入口管線406、發酵器410、出口管線412、出口管線414、出口管線416、細胞分離器420、出口管線422、細胞分離器430、出口管線432、出口管線436、無細胞存儲罐440、出口管線442、出口管線444、含細胞存儲罐445、出口管線446、處理室450、出口管線452、出口管線454、破裂裝置460、出口管線462、分餾器470，出口管線472、出口管線474、脫水室475、出口管線476、精餾塔480、出口管線482、出口管線484、脫水室485A、出口管線486A、脫水室485B、和出口管線486B。
圖4H顯示了細菌發酵系統400H的示意圖，具有一個發酵器、兩個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個含細胞存儲罐、一個破裂裝置、兩個分餾器、和三個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。該細菌發酵系統400H包括入口管線402、入口管線404、發酵器410、出口管線412、出口管線414、細胞分離器420、出口管線422、細胞分離器430、出口管線432、出口管線436、無細胞存儲罐440、出口管線442、出口管線444、處理室450、出口管線452、出口管線454、破裂裝置460、出口管線462、出口管線464、精餾塔470、出口管線472、出口管線474、脫水室475、出口管線476，分餾器480、出口管線482、出口管線484、脫水室485A、出口管線486A、脫水室485B、和出口管線486B。
在某些實施方案中，細菌發酵系統400H還包括一個或多個再循環管線。在一個實施例中，再循環管線為一個連接到破裂裝置460的上的返回管線464。返回管線464將一部分產品混合物從破裂裝置中遞送出然後使其再循環進入到破裂裝置460中。這使得含細胞懸浮液多次通過破裂裝置460，進而增加了含蛋白質的勻漿中厭氧細菌細胞的破裂量和蛋白質濃度，從而確保了細菌細胞內蛋白質化合物充分的可及性以供進一步的處理。
圖5A顯示了一個細菌發酵系統500A的示意圖，其具有一個發酵器、一個細胞分離器、一個處理室、一個含細胞存儲罐、一個破裂裝置、一個分餾器和兩個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。細菌發酵系統500A包括入口管線502、入口管線504、發酵器510、出口管線512、出口管線514、細胞分離器520、出口管線522、出口管線524、出口管線526、處理室550、出口管線552、出口管線554、含細胞存儲罐545、入口管線506、出口管線542、混合器548、破裂裝置560、出口管線562、出口管線564、分餾器570、出口管線572、出口管線574、脫水室575A、出口管線576A、脫水室575B，和出口管線576B。
在細胞分離器520中，來自發酵器510的發酵液體培養液被分離成不含細胞的滲透溶液和含有第二濃度的厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液。無細胞滲透溶液通過連接處理室550和細胞分離器520的出口管線522被送到處理室550。含有第二濃度的厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液通過將含細胞分離器520連接到含細胞分離器520的出口526被送到含細胞存儲罐545。
所述破裂裝置560連接到分餾器570並遞送一個勻漿。在分餾器570中，方法500A包括將含細胞懸浮液分離成含一個第一含蛋白質部分和一個細胞碎片部分。分餾器570經由出口管線562連接到破裂裝置560。分餾器570具有至少兩個出口，其中第一出口574輸送出細胞碎片而第二出口572輸送出第一含蛋白質部分。所使用的精餾器的類型包括但不限於各種類型的固液分餾器、離心裝置、連續離心裝置、沉降式離心機、盤堆式離心機、過濾裝置、中空纖維過濾裝置、螺旋纏繞過濾裝置、陶瓷過濾裝置、錯流過濾裝置、體積排阻裝置、一個或一系列體積排阻柱、一個或一系列離子交換柱、一個或多個碳聚合物柱、流通式磁力分餾器，超濾裝置，一個或一系列親和層析柱、一個或一系列凝膠過濾柱、以及它們的組合。
在一個示例中，細菌發酵系統500A還包括可作為預處理室的含細胞存儲罐545。將含有厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液可用一種或多種含細胞添加劑在存儲罐545中處理。連接到含細胞存儲罐545上的入口管線506可向其提供一種或多種添加劑(例如，去污劑、酶、緩沖劑、pH調節劑等)。該入口506通常在關閉狀態並且可以在需要時被開啟。含細胞存儲罐545儲存含有厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液，直到細胞達到高細胞密度(高濃度)，並且可以以特定量的含細胞懸浮液在特定時間遞送到破裂裝置中560。
含細胞存儲罐545中的混合器548是一個攪動裝置，例如帶有內部螺槳的攪動裝置。破裂裝置560經由出口管線542連接到含細胞的存儲罐545。所述破裂裝置560產生一個含厭氧細菌細胞的勻漿。在含細胞存儲罐545內儲存特定的持續時間之後，含細胞懸浮液被遞送至破裂裝置560中。
在一個方面，將分餾器570連接到一個或多個脫水室(例如，脫水室575A、575B)，脫水室接收一個或多個含蛋白質部分並乾燥它們。所使用的干燥技術包括乾燥、噴霧乾燥、凍乾等。然後將含蛋白質的部分進一步加工和摻混成富含蛋白質的營養補充劑。所述含蛋白質部分可以生成具有蛋白質含量為10%或更高(例如在10%和80%之間或在50%和95%之間)的富含蛋白質的營養補充劑。
圖5B顯示了一個細菌發酵系統500B的示意圖，其具有一個發酵器、一個細胞分離器、一個處理室、一個破裂裝置、一個含細胞存儲罐、一個分餾器和兩個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。所述細菌發酵系統500B包括入口管線502、入口管線504、發酵器510、出口管線512、出口管線514、細胞分離器520、出口管線522、出口管線524、出口管線526、處理室550、出口管線552、出口管線554、含細胞存儲罐545、入口管線506、出口管線542、混合器548、破裂裝置560、出口管線562、出口管線564、分餾器580、出口管線582、出口管線584、脫水室585A、出口管線586A，一個脫水室585B，和一個出口 管線586B。在該示例中，含細胞存儲罐545經由出口管線562連接在破裂裝置560的下游。
圖5C顯示了一個細菌發酵系統500C的示意圖，其具有一個發酵器、一個細胞分離器、一個處理室、一個含細胞存儲罐、一個破裂裝置、兩個分餾器和三個脫水室，以從一個細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。細菌發酵系統500C包括入口管線502、入口管線504、發酵器510、出口管線512、出口管線514、細胞分離器520、出口管線522、出口管線524、出口管線526、處理室550、出口管線552、出口管線554、含細胞存儲罐545、入口管線506、混合器548、出口管線542、破裂裝置560、出口管線562、出口管線564、分餾器570、出口管線572、出口管線574、脫水室575、出口管線576、分餾器590，出口管線592、出口管線594、脫水室595A、出口管線596A、脫水室595B和出口管線596B。
圖5D顯示了一個細菌發酵系統500D的示意圖，具有一個發酵器、一個細胞分離器、一個處理室、一個破裂裝置、兩個分餾器器和四個脫水室，以從細菌發酵過程獲得富含蛋白質的營養補充物。細菌發酵系統500D包括入口管線502、入口管線504、發酵器510、出口管線512、出口管線514、細胞分離器520、出口管線522、出口管線524、出口管線526、處理室550、出口管線552、出口管線554、破裂裝置560、出口管線562、出口管線564、分餾器570、出口管線572、出口管線574、分餾器570、出口管線592A、出口管線594A、分餾器590、出口管線592B、出口管線594B、脫水室595A，出口管線596A、脫水室595B、出口管線596B、脫水室595C、出口管線596C、脫水室595D和出口管線596D。在一個方面，破裂裝置560具有一個再循環管線(例如，出口管線564)，其允許含細胞懸浮液多次通過破裂裝置560。
圖5E顯示了一個細菌發酵系統500E的示意圖，具有一個發酵器、兩個細胞分離器、一個處理室、一個含細胞的存儲罐、一個破裂裝置、兩個分餾器和 三個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。細菌發酵系統500E包括入口管線502、入口管線504、發酵器510、出口管線512、出口管線514、出口管線516、細胞分離器520、出口管線522、出口管線524、處理室550、出口管線552、出口管線544、細胞分離器530、出口管線532、出口管線534、出口管線536、含細胞存儲罐545、入口管線506、出口管線542、混合器548、破裂裝置560、出口管線562、分餾器570、出口管線572，出口管線574、脫水室575、出口管線576、分餾器580、出口管線582、出口管線584、脫水室585A、出口管線586A、脫水室585B、和出口管線586B。
圖6顯示了細菌發酵系統600的示意圖，具有一個發酵器、兩個細胞分離器、一個無細胞存儲罐、一個處理室、一個含細胞存儲罐、一個破裂裝置、兩個分餾器和兩個脫水室，以從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充物。細菌發酵系統600包括入口管線602、入口管線604、發酵器610、出口管線612、出口管線614、出口管線616、細胞分離器620、出口管線622、出口管線624、無細胞存儲罐640、出口管線642、出口管線644、處理室650、出口管線652、出口管線654、細胞分離器630、出口管線632、出口管線636、含細胞存儲罐645、入口管線606、出口管線646、破裂裝置660、出口管線662、分餾器670、出口管線672、出口管線674、脫水室675、出口管線676、分餾器690、入口管線692、出口管線694、脫水室695、和出口管線696。
在一個實施方案中，破裂裝置是微流體裝置，其中厭氧細菌細胞進入該破裂裝置並且在反應室中經受高剪切力以使其細胞壁和細胞膜破裂。對破裂的細菌細胞進行進一步的處理，其處理方法包括離心，過濾，各種方法的脫水(例如，乾燥，冷凍乾燥，凍乾等)，混合，去除重金屬離子，作為營養補充物摻入到可攝取物質中，或其組合。
在另一個實施方案中，細菌發酵系統具有兩個或更多個破裂裝置。其中第一破裂裝置可以是一個存儲罐或儲存容器，並將從發酵液中分離出的含細菌細胞的含細胞懸浮液儲存在其中。在一個實例中第一破裂裝置為預處理裝置，其中在含細胞的懸浮液進入所述第一破裂裝置後對其用添加劑處理以提高破裂效率。使用的添加劑包括但不限於一種或多種洗滌劑、酶、化學品或其組合。第二破裂裝置可以是一個微流體裝置，其中細胞進入所述第二破裂裝置並且在其反應室中經受高剪切力的處理。所述含細胞的懸浮液受迫通過微流體裝置的微通道，所述微通道使細菌細胞的細胞壁和細胞膜破裂並所述細菌細胞的內容物自由流入發酵液中。通過上述方法可對第一蛋白質進行回收，並對其進行離心、過濾、脫水等進一步處理。
III.包含發酵衍生的蛋白質的營養補充劑的組合物
從本文所述的從細菌發酵系統中回收的一種或多種含蛋白質部分可以進行進一步的處理以獲得純化的蛋白質和更高的蛋白質含量，處理方法包括：與原料組合物直接共混、乾燥、沉降、過濾、超濾、微過濾、真空過濾、離心、順序離心、冷凍乾燥、乾燥、水解，及其組合。在微生物生物質被水解的方面，水解可以經由熱處理、酸水解、酶水解、鹼水解及其組合來進行。
在所述方法的一個實施方案中，所述第一含蛋白質部分被生產為富含蛋白質的營養補充物。第一含蛋白質部分的蛋白質含量在60%到80%之間。在另一個方面，第一含蛋白質部分具有在40%到60%之間的蛋白質含量。在又一個方面，第一含蛋白質部分具有在10%到40%之間的蛋白質含量。
在一個實施方案中，本發明提供一種為富含蛋白質營養補充劑的組合物。該組合物是從使用產乙酸細菌培養物的發酵過程中產生的。該組合物包括一個從勻漿的細胞碎片部分分離的含蛋白質部分，其中勻漿從將含細胞懸浮液中包含的產乙酸細菌培養物的細胞破裂以獲得，並且其中含細胞懸浮液從一份發 酵液體中獲得，所述發酵液體在使用產乙酸細菌培養物發酵氣體底物的過程期間被輸送出發酵器。
在一個方面，所述產乙酸細菌培養物選自由梭菌屬細菌、醋酸桿菌屬細菌及其組合組成的組。所述發酵氣態底物包含一種或多種氣體，選自由碳源底物、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、氫(H2)氣、合成氣及其組合組成的組。
在另一個方面，組合物的含蛋白質部分包括的蛋白質含量在約10%至約80%之間，碳水化合物含量在約5%至約35%之間，並且核酸含量在約5%至約15%之間。所述含蛋白質部分中的蛋白質含量大於所述含蛋白質部分中的碳水化合物含量。在又一個方面，其中核酸含量不超過組合物的2%。這是一種可用於人類和動物攝入的組合物。
在另一個實施方案中，所述富含蛋白質的營養補充物的組合物包含一個經提純的蛋白質部分，所述經提純蛋白質部分為含第一部分的含蛋白質部分和第二部分的細胞碎片部分的勻漿中分離出來，所述勻漿為對一個含產乙酸菌培養基的含細胞懸浮液進行破裂而獲得，所述含細胞懸浮液為從一個進行產醋酸菌培養基發酵氣體底物的發酵器輸送出的發酵液中獲得。所述細胞碎片部分包括細胞壁顆粒、細胞膜顆粒、蛋白質聚集體、包涵體、核酸、和厭氧細菌細胞的其它組分。將輸送出發酵器的發酵液體肉湯分離成不含細胞的滲透液和含細胞的懸浮液，所述含細胞的懸浮液含有所述產乙酸菌培養物中的細胞。在一個方面，所述部分純化的蛋白質產物具有不超過2%的核酸含量。在另一個方面，核酸含量不超過8%到12%。
在一個方面，所述組合物包括的蛋白質含量在約10%至約80%之間，碳水化合物含量在約5%至約35%之間，以及核酸含量在約5%至約15%之間。所述含蛋白質部分中的蛋白質含量大於所述含蛋白質部分中的碳水化合物含量。
在另一方面，所述組合物包括的蛋白質含量在約10%至約80%之間，碳水化合物含量在約5%至約35%之間，以及核酸含量不超過2%。
在又一個實施方案中，從細菌發酵器中移出的原料組合物可提供約220千卡或更多每100克產乙酸菌生物質，並且可以提供約15克或更多碳水化合物每100克產乙酸生物質，以乾重計。在該方面，所述原料具有的碳水化合物與蛋白質的重量比為約1.0或更小。在另一個方面，所述原料包括約18mg或更多的鈣每100克產乙酸菌生物質、約150mg或更多鐵每100克細胞質量、約25mg或更多鈉每100克產乙酸菌生物質、約1200mg或更多鉀每100克生物質、或其組合，以乾重計。原料組合物包括必需氨基酸和非必需氨基酸。所述原料組合物還可以包括核苷酸。
在一個方面，原料組合物提供的蛋白質含量為約60克或更多每100克產乙酸菌生物質，在另一個方面，約60至約90克每100克產乙酸菌生物質，在另一個方面，約65至約85克每100克產乙酸菌生物質，在另一個方面，約70至約80克每100克產乙酸菌生物質，以乾重計。
在另一方面，所述原料組合物提供約220千卡或更多每100克乾產乙酸菌生物質，在另一個方面，約220千卡至約400千卡，在另一個方面，約250千卡至約350千卡，在另一個方面，約300千卡至約325千卡，和在另一個方面，約220千卡至約300千卡。
在另一方面，原料組合物提供約15克或更多的碳水化合物每100克乾產乙酸菌生物質，在另一方面，約15克至約60克，在另一方面，約20至約40克，在另一個方面，約25至約35克，和在另一個方面，約30至約35克。在該方面，所述原料包括碳水化合物與蛋白質的重量比為約1.0或更小，在另一個方面，約0.75或更小，在另一個方面，0.5或更小，在另一個方面，約0.25或更小，和在另一個 方面，0.1或更小。在一個方面，所述原料不具有可檢測出的碳水化合物並且僅具有蛋白質。在另一方面，碳水化合物可包括乙醇和/或水溶性糖。
所述原料組合物還可以包括纖維。纖維可包括酸性洗滌劑纖維、中性洗滌劑纖維、可消化纖維、和/或難消化纖維。所述原料組合物還可以包括澱粉。在又一個方面，所述原料組合物包括以下數量的鈣、鐵、鈉和鉀(全部表示為以每100克產乙酸菌生物質乾重計)：鈣：約18毫克或更多，在另一個方面，約20毫克或更多，在另一個方面，約25毫克或更多，和在另一個方面，約30毫克或更多；鐵：約150mg或更多，在另一個方面中，約175mg或更多，在另一個方面中，約200mg或更多，在另一個方面中，約225mg或更多；鈉：約25mg或更多，在另一個方面中，約30mg或更多，在另一個方面中，約35mg或更多，在另一個方面中，約40mg或更多；鉀：約1200mg或更多，在另一個方面中，約1300mg或更多，在另一個方面，約1400mg或更多，並且在另一個方面，約1500mg或更多。
在一個方面，原料組合物可包括微量的金屬。在另一個方面，原料可以包括特定的合適的金屬。可存在於原料中的金屬的實例包括鋅、鉬、鎘、鈧、鈦、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鎢和硒。
在另一方面，產乙酸生物質可包括以下氨基酸中的任一種，單獨或以任何組合(以每100克產乙酸菌生物質的克乾重計)：必需氨基酸含量：精氨酸：在一個方面，約2.5克或更多，在另一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約4.5克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多，和在另一個方面，約7.0克或更多；組氨酸：在一個方面，約1.5克或更多，在另一個方面，約2.0克或更多，在另一個方面，約2.5克或更多，在另一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，和在另一個方面，約6.0克或更多；異亮氨酸：在一個方面，約4.0 克或更多，在另一個方面，約4.5克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約5.5克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多，在另一個方面，約7.0克或更多，在另一個方面，約8.0克或更多，和在另一個方面，約9.0克或更多；亮氨酸：在一個方面，約4.5克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約5.5克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多，在另一個方面，約6.5克或更多，在另一個方面，約7.0克或更多，在另一個方面，約8.0克或更多，在另一個方面，約9.0克或更多；賴氨酸：在一個方面，約6.0克或更多，在另一個方面，約6.5克或更多，在另一個方面，約7.0克或更多，在另一個方面，約7.5克或更多，在另一個方面，約8.0克或更多，在另一個方面，約9.0克或更多，在另一個方面，約10.0克或更多，和在另一個方面，約12.0克或更多；蛋氨酸：在一個方面，約1.5克或更多，在另一個方面，約2.0或更多，在另一個方面，約2.5克或更多，在另一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，和在另一個方面，約6.0克或更多；苯基丙氨酸：在一個方面，約2.5克或更多，在另一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約4.5克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約5.5克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多；蘇氨酸：在一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約4.5克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多，在另一個方面，約7.0克或更多，在另一個方面，約8.0克或更多；色氨酸：在一個方面，約0.4克或更多，在另一個方面，約0.5克或更多，在另一個方面，約0.6克或更多，在另一個方面，約0.7克或更多，在另一個方面，約0.8克或更多，在另一個方面，約0.9克或更多，在另一個方面，約1.0克或更多，和在另一個方面，約1.5克或更多；纈氨酸：在一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約4.5 克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約5.5克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多，在另一個方面，約7.0克或更多，在另一個方面，約8.0克或更多，和在另一個方面，約9.0克或更多。
其它氨基酸含量：丙氨酸：在一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約5.5克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多，在另一個方面，約7.0克或更多，在另一個方面，約8.0克或更多，在另一個方面，約9.0克或更多，在另一個方面，約10.0克或更多，在另一個方面，約11.0克或更多；冬氨酸：在一個方面，約7.0克或更多，在另一個方面，約7.5克或更多，在另一個方面，約8.0克或更多，在另一個方面，約9.0克或更多，在另一個方面，約10.0克或更多，在另一個方面，約11.0克或更多，在另一個方面，約12.0克或更多，在另一個方面，約14.0克或更多；半胱氨酸：在一個方面，約1.0克或更多，在另一個方面，約1.5克或更多，在另一個方面，約2.0克或更多，在另一個方面，約2.5克或更多，在另一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方，約4.0克或更多，和在另一個方面，約5.0克或更多；谷氨酸：在一個方面，約9.0克或更多，在另一個方面，約9.5克或更多，在另一個方面，約10.0克或更多，在另一個方面，約12.0克或更多，在另一個方面，約14.0克或更多，在另一個方面，約16.0克或更多，在另一個方面，約18.0克或更多，在另一個方面，約20.0克或更多；甘氨酸：在一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約4.5克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約5.5克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多，在另一個方面，約7.0克或更多；蛋氨酸：在一個方面，約1.5克或更多，在另一個方面，約2.0克或更多，在另一個方面，約2.5克或更多，在另一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，和在另一個方面，約6.0克或更多；脯氨酸：在一個方面，約2.0克或更 多，在另一個方面，約2.5克或更多，在另一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約4.5克或更多，在另一個方面，約6.0克或更多，在另一個方面，約7.0克或更多；絲氨酸：在一個方面，約2.5克或更多，在另一個方面，約3.0克或更多，在另一個方面，約3.5克或更多，在另一個方面，約4.0克或更多，在另一個方面，約4.5克或更多，在另一個方面，約5.0克或更多，在另一個方面，約5.5克或更多，和在另一個方面，約6.0克或更多；酪氨酸：在一個方面中，約2.5克或更多，在另一個方面中，約3.0克或更多，在另一個方面中，約3.5克或更多，在另一個方面中，約4.0克或更多，在另一個方中，約4.5克或更多，在另一個方面中，約5.0克或更多，在另一個方面中，約5.5克或更多，和在另一個方面中，約6.0克或更多。
在一個實施方案中，所述原料組合物可以用作動物飼料中的原料。在又一個實施方案中，所述原料組合物可以在水產養殖中用作飼料。在又一個實施方案中，所述原料組合物可被進一步加工和利用為動物和人類均可攝入的營養補充劑。
在一個方面，本發明組合物向細菌發酵過程提供了有效量的營養物。在該方面，"有效量"是指促進健康的發酵過程，其可包括以下中的至少一種：總醇的生產率STY約為1克或更多的總醇/(升．天)；提供細胞密度約2.0克/升；和將培養基保持在一個穩定狀態。所述細菌發酵過程可以是含一氧化碳氣體底物的發酵過程，並且可以是與原料最初產生時相同的細菌發酵過程。
在另一個方面，本發明提供了向動物提供有效量營養的組合物。"有效量"是指促進動物的健康生長，其可包括以下中的至少一種：抑制動物中的細菌負荷；預防或降低家禽中壞死性腸炎的發生率；刺激動物的免疫反應；增加動物飼料中疫苗和抗生素的有效性；增加單位數量飼料的成長率；增加產奶量；降低死亡率，等等。在確定有效量時，可以考慮若干與動物相關的特定因素，這些 因素包括但不限於動物的年齡、活性水平、激素平衡水平、和健康水平，，例如可以通過在開始時選用低劑量和滴定的方法來確定有效量。
可以從本組合物的攝入中受益的動物包括，例如，家禽如雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、野母雞，等等；肉牛和乳牛、豬、山羊，等等；家養動物如狗和貓；水生動物如鮭魚、大馬哈魚、鱒魚、羅非魚、蝦、龍蝦，等等；以及人。該富含蛋白質的營養補充劑的用途包括將牛、豬、家禽和魚育肥。本組合物的其它用途包括用作乳化助劑，以提高包括焙烤食品、湯、預先包裝的膳食、智能食品和飲食食品的多種消耗品的營養價值。其還有其他用途包括紙張加工，皮革加工和泡沫穩定。
例子：
實施例1：一種連續發酵制菌工藝
將含有CO和/或CO2/H2的合成氣或廢氣連續輸入到含有俊達氏梭菌菌株的攪拌生物反應器中，並同時輸入含有維生素、微量金屬和鹽的發酵培養基。所用的合適的發酵培養基如表1中所述。
Figure 108117391-A0202-12-0055-1
Figure 108117391-A0202-12-0056-2
在啟動期間，使用反應器中10%或更低的接種量的培養物來操作分批液相，其中發酵培養基不被連續地進料到反應器中。反應器中的液相因此由一批具有標稱濃度的一種或多種限制性營養物的發酵培養基組成，例如泛酸鈣、鈷。或者，也可以採用富含酵母提取物、胰酶或其它複合營養物的培養基。
理想地，啟動時的氣相中不包含CO2的並且包含過量的H2。將氣體速率和攪動速率保持在低水平(在New Brunswik Scientific Bioflo®發酵生物反應器中低於500rpm)以產生略微過量的CO和H2，但同時，避免了CO底物抑制。作為一個例子，在一個一升的實驗室New Brunswick Scientific Bioflo®發酵生物反應器中，其中進料氣體組成為63%H2、32%CO和5%CH4，啟動時的攪拌速率為400rpm，氣體速率為20ml/min。提供過量的H2和液體營養成分以在啟動過程中實現乙醇生產。在稍後的階段再進行發酵培養基內的某些營養素含量的限制。因此，啟動過程中存在著過量的液體營養物(例如，泛酸鈣、鈷)，以避免培養物不必要的適應低營養物環境。
隨著細菌發酵在接種後數小時的期間內進行，CO2從CO的轉化中產生，並且H2與CO2一起被消耗，這是增加攪動速率的信號，以避免氣體質量傳遞的限制。在New BrunswickScientific Bioflo®CSTR中，出口氣體組成為25%CO、67%H2、2%CO2和6%CH4。如果攪動速率增加得太快，則發生CO底物抑制，可通過在攪動增加後甲烷濃度降低以證明。因此，攪動速率通常可能在24小時內增加200rpm。
以相對快速的加速增加的攪動速率以達到目標攪動速率的同時，監測過程中CO2產生(或H2轉化)。在New Brunswick Scientific Bioflo®發酵生物反應器中典型的目標攪拌速率是900rpm。在間歇式液體培養中增加攪拌速率的這段時間內，監測細胞生產優先於誘使產物形成。因此，在此間歇式培養中，細胞濃度可達到約1.5g/L，同時典型的產品濃度是10g/L乙醇和2g/L乙酸鹽。
在達到目標攪動速率時，系統允許的h2攝入達到到最大值。此系統中期望具有非常高的H2出口濃度(通常>60%)，以確保乙醇生產，同時限制乙酸生產。然後開啟液體發酵培養基進料(對於從儲備培養物的分批接種的系統)以開始連續進行的液體進料並且使氣體進料速率朝向目標流速增加。在實驗室New Brunswick Scientifc Bioflo®發酵生物反應器中，液體進料速率通常為0.5毫升/分鐘，而氣體流速每24小時增加10%至15%的速率增加，而目標速率為125毫升/分鐘。
隨著氣體流速增加，反應器的細胞產量增加直至最終受限於液相營養物的含量(例如，泛酸鈣、鈷)，其通過h2轉化率的微量下降所證明，在達到目標生產率時。在NewBrunswick Scientific Bioflo®CSTR中，在目標生產率為20g/L．day時的H2轉化率下降了10%。
該生產方法和細菌發酵反應器系統隨後都保持在穩定狀態下，所述穩定狀態生產15至35克/升乙醇和0至5克/升乙酸鹽作為產品，並且僅偶爾對營養物、液體速率和氣體速率進行微小的調整。實驗室中Brunswick Scientific Bioflo®發酵生物反應器的不含細胞再循環的穩態條件為氣體保留時間(氣體流速/反應器液體體積)為20分鐘，液體保留時間(液體流速/反應器液體體積)為30小時，攪拌速率為900rpm，在對泛酸鹽進行限制的情況下產生92%的CO轉化率和60%的h2轉化率。
在一個實施方案中，細胞再循環被加入到反應器系統中，伴隨著調節氣體速率(增加)和第一營養物濃度(降低)。在New Brunswick Scientific Bioflo®CSTR中，氣體保留時間通常為8分鐘，液體保留時間為12小時，細胞保留時間為40小時，攪拌速率為900rpm。此時，在對泛酸鹽進行限制的情況下，通常產生92%的CO轉化率和50%的h2轉化率。這種連續發酵的方法允許在穩定的操作條件下進行連續生產和維持高的乙醇濃度與低的副產物乙酸鹽的濃度，以提高工業規模上使用所選細菌進行的乙醇生產。
實施例2：從發酵器中排出細菌細胞以控制發酵產物比率
一個氣態底物(30%CO、15%H2、10%CO2、45%N2)的發酵發生在CSTR反應器(pH=5.0，溫度=38℃，壓力=20psig)中，此發酵使用俊達氏梭菌C-01和細 胞在循環(細胞保留時間為40小時並且液體保留時間為6小時)，並且培養物的生長並不受鈷、泛酸鈣、或其他營養物的限制。隨著培養物的生長，細胞密度達到低於0.5的特定攝入量(毫摩爾CO每克乾細胞每分鐘)，並且與乙醇相比優先產生乙酸。為了防止這種發生，增加細胞排出速率以防止細胞密度的增加，使得穩態細胞濃度保持在足夠低以保持高於0.5毫摩爾CO每克乾細胞每分鐘的特定攝入。此時，細胞保留時間被減少到6和25小時之間。參見表2，在細菌發酵過程中監測俊達氏梭菌菌株的細胞濃度。
Figure 108117391-A0202-12-0059-3
 a以乾細胞重量為基礎
實施例3：產乙酸細菌細胞的細胞生物質的分析
生物反應器中加入合成氣以使得俊達氏梭菌C-01生長。來自生物反應器的發酵物的樣品和濃縮的細胞生物質的干質量按照下表3中的程序進行分析。
Figure 108117391-A0202-12-0060-4
濃縮的細胞生物質的乾質量的分析結果示於表4中。
Figure 108117391-A0202-12-0060-5
Figure 108117391-A0202-12-0061-6
濃縮的細胞生物質的干質量中氨基酸含量的分析結果如表5所示。
實施例4：分析產乙酸細菌細胞中的蛋白質、碳水化合物和核酸含量
生物反應器中加入合成氣以使得俊達氏梭菌C-01生長。細胞培養物以4,000rpm離心以除去培養基。收集團粒並使其在100c烘箱中進行通宵乾燥。
Figure 108117391-A0202-12-0061-7
Figure 108117391-A0202-12-0062-8
使用與實施例3中描述的碳水化合物和蛋白質的分析方法相同的方法對100克粉碎的、乾燥的團粒進行測試。表6所示高達80%的細胞質量為蛋白質。
Figure 108117391-A0202-12-0062-9
Figure 108117391-A0202-12-0063-54
實施例5：通過一個或多個微流體破裂裝置破裂細菌細胞和通過微流體破裂裝置破裂細菌細胞的蛋白質回收
所述使用微流體技術的微流體裝置也被認定為一個破裂裝置，以破裂來自發酵過程中的厭氧細菌細胞並產生含有蛋白質的部分。從發酵器中獲得一定體積的發酵液。樣品通過離心濃縮1.5倍或至細胞濃度為例如約20g/L或更高。例如，從發酵器中獲得細胞濃度約為15g/L的發酵液體樣品，並通過離心濃縮以獲得22.4g/L或更高的細胞密度。
將所得細胞重新懸浮在溶液中(例如，放入2L溶液中，該溶液可含有約44g細胞)並送至微流體裝置。微流體工藝涉及通過迫使細胞通過微流體反應室中的微通道以使用在高壓力下生成的高剪切力來破裂細胞。
每個樣品以不同的時間量和不同的壓力條件下運行。測試的壓力範圍在10,000和30,000磅每平方英寸(psi)之間的一次或多次通過。每通過一次微流體裝置為一次通過。破裂裝置以恆定速率提供壓力。微流體裝置產生六個勻化樣品。所述含細胞的懸浮液可以用一種或多種添加劑(例如，洗滌劑、酶等)進行處理，並使其通過所述微流體裝置(例如，在3,000psi或更高的高剪切力或壓力下)。
進行了幾個實驗。每個樣品在不同的時間量和不同的壓力條件下運行。其中，用於6個示例性樣品處理實驗的條件為：(1)在18,000psi壓力下單次 通過；(2)在18,000psi壓力下兩次通過；(3)在23,000psi壓力下單次通過；(4)在23,000psi壓力下兩次通過；(5)在28,000psi壓力下單次通過；(6)在28,000psi壓力下兩次通過。每通過一次微流體裝置的實驗都構成一次通過。破裂裝置以恆定速率提供壓力。經微流體裝置處理後產生六份含蛋白質勻化樣品。使用Bradford測定法對每份含蛋白質樣品進行蛋白質含量分析。
在一個實驗中，一些樣品僅通過微流體裝置一次以進行處理。在一次通過後，將一個第一含蛋白質部分從勻漿中分離出來。然後，可以對所述第一含蛋白質部分進行噴霧乾燥，從而獲得含蛋白質粉末。
在第二個實驗中，樣品兩次通過微流體裝置以進行處理，其中一個經預處理的含細胞的懸浮液並流入一個再循環流以第二次進入微流體裝置。經過兩次通過後，得到含有蛋白質的部分。然後，可以獲得含蛋白質部分的粉末形式。例如，在獲得含蛋白質部分後，可對三種不同的干燥技術(在高溫乾燥、噴霧乾燥和凍乾)進行測試。
實施例6：通過一個或多個過濾型分餾器裝置對勻漿中破裂的細菌細胞進行分餾
將經過實施例5的步驟處理後的含有含蛋白質部分的勻漿通過尼龍過濾器過濾。過濾的勻漿可使5-15%的最初的微生物生物質被回收作為可溶性蛋白質，如表7中所示。
Figure 108117391-A0202-12-0064-11
Figure 108117391-A0202-12-0065-12
實施例7：通過一個或多個離心式分餾器裝置對勻漿中破裂的細菌細胞進行分餾
將實施例4中產生的勻漿在2,000和10,000RPM之間的速度下進行離心6分鐘，並使用Bradford蛋白質測定法分析蛋白質含量。使用起始生物質濃度作為基礎計算可溶性蛋白質回收率百分比。
結果表明，高達25%的蛋白質在微流化之後被回收，這表明微流化之後再離心以溶解細胞和回收可溶性蛋白為一個可行方法，如表7中所示。
作為另一個實例，將具有22.4g/L的細胞密度的細胞懸浮液(發酵肉湯中的細胞)送至微流體裝置。其中一個樣品在18,000psi壓力下下通過微流體裝置，而另一個樣品在28,000psi的壓力下通過相同類型的微流體裝置兩次。進行比較而得到的結果如表8所示。
Figure 108117391-A0202-12-0065-13
Figure 108117391-A0202-12-0066-14
對於在18，000psi壓力下通過一次的樣品，在勻漿中的蛋白質濃度為9.5mg/mL。然後將樣品過濾或離心並進一步分析。在通過0.45微米過濾器過濾之後，富含蛋白質的級分含有2.4mg/mL的蛋白質。在2,000rpm離心8分鐘後，富含蛋白質的級分的蛋白質濃度為約3.2mg/mL。較高的離心速度可導致較少的蛋白質(在5，000rpm下，回收的級分中的蛋白質濃度為約1.0mg/mL或更高，或約1.9mg/mL或更高。在更高的10，000rpm的離心速度下，所得上清液級分中離心後的蛋白質濃度為約1.4mg/mL)。
另一組樣品在28，000psi壓力下兩次通過微流體裝置進行處理，一個經預先裂解的含細胞的懸浮液並流入一個再循環流以第二次進入微流體裝置。所得的勻漿中含蛋白質部分的蛋白質濃度經測量約為8.5mg/ml。然後將樣品過濾和/或離心。通過0.45微米過濾器過濾後，所得蛋白質濃度為約1.8mg/ml。在2000RPM離心8分鐘後，所得蛋白質濃度為約3.0mg/ml。更高的離心速度可導致較少蛋白質(在5000轉每分鐘，濃度是2.0mg/ml；在10000轉每分鐘濃度是1.3mg/ml)。
實施例8：通過一個或多個微流體破裂裝置進行破裂對細菌細胞進行裂解
所選擇的進行破裂處理的破裂裝置可以是微流體裝置和其它商品儀器。在圖7B-7E中，用於進行破裂過程的破裂裝置是微流體裝置。破裂裝置中的破裂過程可以在不同的條件下進行，包括不同的壓力和通過次數。
圖7A示出了一張尚未進行裂解的含細胞懸浮液的電子顯微照片。此電子顯微照片為在顯微鏡中以100X的放大倍數對準勻漿所拍攝。
所選擇的用於在破裂裝置中進行破裂的含細胞懸浮液可以具有不同的密度。在圖7A中，未經破裂的含細胞懸浮液的密度為約10克/升或更高，如約16克/升或更高。
圖7B示出了一張根據本發明的一個或多個實施方案中的在破裂裝置460、560、或660的內部獲得的勻漿的另一個電子顯微照片，所述勻漿是來自破裂裝置460、560、或660的內部的將含細胞懸浮液中厭氧細菌細胞的細胞膜破裂後的產物。
所述電子顯微照片為在顯微鏡中以100X的放大倍數對準所述勻漿所拍攝。在圖7B中，所選擇的進行破裂處理的破裂裝置是微流體裝置。在圖7B中，破裂過程是在1,000psi或更高的壓力下(例如，在1,000磅每平方英寸(psi)至9,000psi或更高的壓力之間)使含細胞懸浮液通過一次而進行的。同樣，在圖7B中，選擇的用於此種破裂裝置中破裂過程的含細胞懸浮液的細胞濃度為約10克/升或更高，如約16克/升或更高。從視覺效果上看，微流化工藝對破壞細胞膜有顯著效果。
圖7C圖示了一張根據本發明的一個或多個實施方式的在細胞膜在破裂裝置460、560或660內被破裂之前的含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞的細胞膜的電子顯微照片。
所述電子顯微照片為在顯微鏡中以100X的放大倍數對準所述勻漿所拍攝。在圖7C中，選擇的用於此種破裂裝置中破裂過程的含細胞懸浮液的細胞濃度為約10克/升或更高，如在約16克/升或更高。所述破裂過程是在約1,000psi或更高的壓力(例如，在1,000磅每平方英寸(psi)至20,000psi或更高)下使所述含 細胞的懸浮液通過一次而進行的。與圖7A中的結果相比，圖7C中所示的結果顯示在該處理壓力下細胞膜發生了顯著的破裂。
圖7D示出了一張根據本發明的一個或多個實施方案中的在破裂裝置460、560、或660的內部獲得的勻漿的另一個電子顯微照片，所述勻漿是來自破裂裝置460、560、或660的內部的將含細胞懸浮液中厭氧細菌細胞的細胞膜破裂後的產物。
所述電子顯微照片為在顯微鏡中以800X的放大倍數對準所述勻漿所拍攝。在圖7D中，所選擇的進行破裂處理的破裂裝置是微流體裝置。在圖7D中，破裂過程是在1,000psi的壓力下(例如，在1,000磅每平方英寸(psi)至22,000psi或更高)使含細胞的懸浮液通過一次而進行的。同樣，在圖7D中，選擇的用於此種破裂裝置中破裂過程的含細胞懸浮液的濃度為約15克/升或更高，如在約20克/升或更高，或約22.4克/升或更高。
圖7E示出了一張根據本發明的一個或多個實施方案中的在破裂裝置460、560、或660的內部獲得的勻漿的另一個電子顯微照片，所述勻漿是來自破裂裝置460、560、或660的內部的將含細胞懸浮液中厭氧細菌細胞的細胞膜破裂後的產物。
所述電子顯微照片為在顯微鏡中以800X的放大倍數對準所述勻漿所拍攝。在圖7E中，所選擇的進行破裂處理的破裂裝置是微流體裝置。在圖7E中，破裂過程是在1，000psi的壓力(例如，在每平方英寸25,000磅(psi)至30,000psi或更高的壓力之間)下使含細胞的懸浮液通過兩次而進行的。同樣，在圖7E中，選擇的用於此種破裂裝置中破裂過程的含細胞懸浮液的細胞濃度為約15克/升或更高，如在約20克/升或更高，或約23克/升或更高。
實施例9：通過一個或多個微流體裝置破裂在一個細胞存儲罐中經過預處理的細菌細胞
微流體破裂裝置(例如，微流體裝置)被用於對發酵過程中產生的厭氧細菌細胞進行破裂並產生含有蛋白質的部分。從實驗室反應器的一個高細胞濃度的發酵器中獲得發酵液體肉湯(例如，在15g/L的細胞密度)。離心濃縮樣品以得到為45g/L的細胞濃度。將所得細胞懸浮液(2L含90g細胞)送至細胞存儲罐中進行預處理。
微流化過程涉及通過在迫使細胞通過一個1微米反應室以使用在高壓力下生成的高剪切力來破裂細胞。將含有細菌細胞的含細胞懸浮液分成6個樣品。將含細胞懸浮液用一種或多種添加劑(例如洗滌劑、酶等)進行處理，並在15，000psi的壓力下通過微流體裝置。只進行一次所述通過。在一次通過後，將所述第一含蛋白質部分從勻漿中分離出來並進行噴霧乾燥。
實施例10：通過一個或多個聲波處理裝置對細菌細胞進行破裂
一個聲波處理裝置被認定為一個破裂裝置，以破裂來自發酵過程中的厭氧細菌細胞並產生含有蛋白質的部分。從實驗室反應器的一個發酵器中獲得15g/L的高細胞濃度發酵液。離心濃縮樣品以得到22.4g/L的細胞濃度。對所得細胞再懸浮液(2L含有44g細胞)進行聲波處理。聲波處理過程涉及通過超聲頻率下以聲能為作用力攪動細胞並破壞細胞膜。將含有細菌細胞的含細胞懸浮液分成6個樣品。對各樣品進行聲波處理。
實施例11：通過一個或多個聲波處理裝置破裂在一個含細胞存儲罐中經過預處理的細菌細胞
一個聲波處理裝置被認定為一個破裂裝置，以破裂來自發酵過程中的厭氧細菌細胞並產生含有蛋白質的部分。從三個含高細胞濃度發酵器中獲得發酵液體肉湯。樣品通過離心濃縮以獲得4至10mg/ml之間的細胞濃度。
例如，將從發酵器(在該實例中是示例性容器A)獲得的含有約4.2mg/ml的細菌細胞的發酵液體肉湯，在各種緩衝液中進行聲波處理。將來自另 一個發酵器(示例性容器B)的含含有約9.2mg/ml的厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液再各種緩衝液中進行聲波處理。將來自另一個發酵器(示例性容器C)的含有約7.1mg/ml的細胞濃度的含細胞懸浮液，也在各種緩衝液中進行聲波處理。
在從發酵器中收集發酵肉湯後，將來自發酵肉湯的細菌細胞經由離心(例如，在4,000rpm或更高的離心速度下將細菌細胞向下旋轉)而使其重新懸浮在其各自的緩衝液中。
將細胞重新懸浮於含洗滌劑的緩衝液(TrisHCl pH8含有十二烷基硫酸鈉(SDS)、CHAPS、Triton X-100或Tween20)或含酶的緩衝液(TrisHCl pH8含有溶菌酶)中。TrisHCl pH8用作對照緩衝液。對所得細胞懸浮液進行聲波處理。
細胞在5秒脈衝中進行聲波處理，並在其中進行冷卻。該循環重複三次。聲波處理後，將細胞在20K RPM速度下向下旋轉10分鐘並去除上清液。使用Lowry-based protein assay對可溶性蛋白質部分的蛋白質含量進行分析。根據超聲處理後細胞的濃度可計算可溶性蛋白質的回收率。
將幾個樣品經過冷凍/解凍循環，其中細胞在Tris HCl緩衝液中完全冷凍。在-80攝氏度下冷凍後，細胞完全解凍後再重新冷凍。完成此循環5次。完成後，含細胞的懸浮液在20,000rpm下旋轉10分鐘並去除上清液。表9顯示了通過各種類型的緩衝液的含細胞懸浮液樣品的蛋白質回收量。基於初始原料可計算可溶性蛋白質的回收率百分比。起始材料包括發酵液，其包含液體營養培養基、其它必需礦物質、以及蓄積的產乙酸菌生物質。
發酵液得自三個含高細胞濃度的發酵器。通過在4,000RPM離心濃縮以獲得細胞濃度在4至10mg/ml之間的樣品。將細胞重新懸浮於含洗滌劑的緩衝液(TrisHCl pH8含有十二烷基硫酸鈉(SDS)、CHAPS、Triton X-100或Tween20)或含酶的緩衝液(TrisHCl pH8含有溶菌酶)中。TrisHCl pH8用作對照緩衝液。對所 得細胞懸浮液進行聲波處理。聲波處理過程涉及通過超聲頻率下以聲能為作用力攪動細胞並破壞細胞膜。
細胞在5秒脈衝中進行聲波處理，並在其中進行冷卻。該循環重複三次。聲波處理後，將細胞在20，000rpm下旋轉10分鐘並去除上清液。使用Lowry-based protein assay對可溶性蛋白質部分的蛋白質含量進行分析。根據聲波處理後細胞的濃度可計算可溶性蛋白質的回收率。
結果，如表9所示，表明了將洗滌劑作為添加劑能夠在細胞進行聲波處理時增加蛋白質的溶解度。具體而言，SDS或溶菌酶的添加大大增強了膜蛋白的溶解性。
Figure 108117391-A0202-12-0071-16
實施例12：通過一個或多個過濾型分餾器裝置對含已破裂的細菌細胞的勻漿進行分餾
將實施例4中的勻漿通過尼龍過濾器過濾。過濾的勻漿使10.7%的初始微生物生物質被回收為可溶性蛋白質。
實施例13：通過一個或多個離心式分餾器裝置對含已破裂的細菌細胞的勻漿進行分餾
將實施例4中的勻漿液在2000rpm下進行離心，將3.2mg的蛋白質分餾進上清液。對所述勻漿的離心允許以14.3%的回收率從發酵器中收集的從初始微生物生物質中分離出的可溶性蛋白。
實施例14：測定pH值對通過一個或多個破裂裝置進行破裂後回收含細胞懸浮液中的蛋白質的影響
從含高細胞濃度的發酵器中收集樣品。收集時的細胞濃度約為22g/L。一定量的細胞培養物在4,000RPM的速率下向下旋轉10分鐘。將細胞團粒重新懸浮在與從離心裝置中移除的培養基相同體積的TrisHCl中(使得樣品不被濃縮或稀釋)。通過加入0.5m NaOH以改變多個體積的細胞培養物的pH值，使培養肉湯的最終pH值介於3.5和10之間。樣品被在10,000和20,000psi之間和為一次或多次通過的條件下進行處理。每個樣品在13,300rpm速度中向下旋轉6分鐘。收集上清液並且使用Lowry-based protein assay對可溶性級分中的蛋白質濃度進行測定。
數據，如表10所示，表明在微流化之前增加細胞勻漿的pH值增強了蛋白質的溶解度。具體地，當pH高時(高於7.6)，可溶性蛋白質的回收率增強了。
Figure 108117391-A0202-12-0073-17
實施例15.測定溶菌酶對可溶性蛋白質回收的影響
從含高細胞濃度的發酵器中收集樣品。將一定體積的細胞培養液向下旋轉並重新懸浮於TrisHCl緩衝液中，方法與前文所述相同。使用0.5m氫氧化鈉將培養液的pH值升高至8。為了確定酶預處理的效果，使用0.5mg/ml溶菌酶。對於培養肉湯樣品，用溶菌酶在室溫下孵育持續約30分鐘。對於TrisHCl樣品，用溶菌酶在室溫下孵育持續約45分鐘(差異產生於使用微流體裝置時作為瓶頸的延遲)。樣品被在10,000和20,000psi壓力之間和一次或多次通過的條件下進行處理。對照物也在未通過微流體裝置處理的樣品中運行。每個樣品在13,300rpm的速度下向下旋轉6分鐘。收集上清液並使用Lowry-based和Bradford-based蛋白質測定法測定可溶性級分中的蛋白質濃度，結果列於表11中。
實施例16.測定降低溶菌酶濃度和延長孵育時間的效果。
從含高細胞濃度的發酵器中收集樣品並經由在4,000RPM下離心10分鐘進行濃縮。調節培養液的pH值至7-10。一些樣品在37攝氏度與100ng/ml溶菌酶孵育一小時。每10分鐘取出樣品以監測溶菌酶活性。
Figure 108117391-A0202-12-0074-18
在30分鐘和1小時時取出較大的樣品，並將其通過微流體裝置在10,000至20,000psi壓力下通過一次或多次以進行處理。每個樣品在13,300rpm速度下向下旋轉6分鐘。收集上清液並使用Lowry-based蛋白測定法測定可溶級分中的蛋白質濃度，結果見表12。
Figure 108117391-A0202-12-0074-19
Figure 108117391-A0202-12-0075-20
實施例17.PH值和細胞濃度對蛋白質提取的影響。
來自含高細胞濃度的發酵器中的樣品經由離心被稀釋至1和10g/L之間的濃度並且使其再懸浮於培養基中。使用0.5m氫氧化鈉將培養肉湯的pH值調節至6和10之間。樣品(包括在發酵pH值下的未受調節的培養液)通過微流體裝置在10,000和20,000psi的壓力和通過一次或多次的條件下進行處理。類似地，從含高細胞密度發酵器中排出的未稀釋的培養物在一種酸性pH值和一種鹼性pH值下進行處理。每個樣品在13,300rpm下向下旋轉6分鐘。
收集上清液並使用Lowry-based蛋白質測定法來測定可溶性級分中的蛋白質濃度。表13表明隨著培養液的pH值在微流化之前增加，在可溶級分中回收的蛋白質的量一併增加。
圖8A示出了一個根據本發明的一個或多個實施方案從破裂裝置460、560或660和含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞的細胞膜中所獲得的可溶性蛋白質的曲線圖。
Figure 108117391-A0202-12-0076-21
所選擇的進行破裂處理的破裂裝置可以是微流體裝置和其它商品儀器。在該圖8A中，所選擇的進行破裂處理的破裂裝置是微流體裝置。
破裂裝置460、560或660內的破裂過程可以在不同的條件下進行，所述條件包括壓力和通過的次數。在圖8A中，破裂過程的條件為15,000磅每平方英寸(psi)的壓力僅使含細胞懸浮液通過一次。
所選擇的經過破裂裝置460、560或660中破裂過程的含細胞懸浮液可以具有不同的濃度。在圖8A中，有四份含細胞懸浮液流被選擇用於破裂裝置460、 560或660內的破裂過程。這四份含細胞懸浮液的濃度分別為1g/L、5g/L、10g/L和18.5g/L。
線802的y軸表示了，根據本發明的一個或多個實施方案，使用破裂裝置460、560或660對不同pH值條件下(X軸)的濃度為18.5g/L的含細胞懸浮液進行破裂而獲得的細胞勻漿中獲得的蛋白質產率。
線804的y軸表示了，根據本發明的一個或多個實施方案，使用破裂裝置460、560或660對不同pH值條件下(X軸)的濃度為10g/L的含細胞懸浮液進行破裂而獲得的細胞勻漿中獲得的蛋白質產率。
線806的y軸表示了，根據本發明的一個或多個實施方案，使用破裂裝置460、560或660對不同pH值條件下(X軸)的濃度為5g/L並抑制不同pH條件的含細胞懸浮液進行破裂而獲得的細胞勻漿中獲得的蛋白質產率。
線808的y軸表示了，根據本發明的一個或多個實施方案，使用破裂裝置460、560或660對不同pH值條件下(X軸)的濃度為18.5g/L的含細胞懸浮液進行破裂而獲得的細胞勻漿中獲得的蛋白質產率。
所選擇的用於在破裂裝置460、560或660內進行破裂過程的含細胞懸浮液可擁有在1至14的範圍內的任何pH值。含細胞懸浮液的pH值可以通過各種方法來調節，包括酸、鹼、或鹽添加劑、或其組合。在圖8A中，含細胞懸浮液的pH值用0.5m氫氧化鈉調節到大約6或8。含細胞懸浮液的pH值可以在含細胞懸浮液在破裂裝置460、560或660內進行破裂之前進行調節。例如，含細胞懸浮液的pH值可以在含細胞存儲罐445、545、或645內進行調節。
實施例18.PH對高濃度含蛋白質懸浮液的影響。
從高細胞濃度的發酵器中收集樣品並使其通過在4,000rpm下離心10分鐘將其細胞濃縮至3倍。細胞團粒被重新懸浮在培養基中。使用濃氫氧化鈉將培養基的pH值調節至5和10之間。例如，通過在4,000RPM下離心10分鐘將樣品中 的細胞濃縮至45g/L。細胞團粒被重新懸浮於培養基中。使用0.5m氫氧化鈉將所得的細胞混合物的pH值調節至5、6、7或8。樣品在15,000PSI的壓力下通過微流體裝置一次以進行處理。每個樣品在13,300rpm下旋轉6分鐘。收集上清液並使用Lowry-based protein assay測定可溶性級分中的蛋白質濃度。
圖8B圖示了一個根據本發明的一個或多個實施方案從破裂裝置460、560或660和含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞的細胞膜中所獲得的可溶性蛋白質的曲線圖。
在圖8B中，選擇微流體裝置為破裂設備進行破裂處理。在圖8B中，破裂過程以10,000和20,000psi之間的壓力對含細胞的懸浮液進行通過一次或多次的處理。經由13,300RPM離心後收集上清液，並使用Lowry-based protein assay法分析蛋白質。表14表明將培養液的pH值從4-5增加到6-10顯著增加了在可溶級分中回收的蛋白質的百分比。
Figure 108117391-A0202-12-0078-22
線812的y軸表示，根據本發明的一個或多個實施方案，pH值對來自細胞勻漿的蛋白質產率的影響，所述細胞勻漿由破裂裝置460,560或660中根據不 同pH值條件製備的具有45g/L和不同pH值的含細胞懸浮液中的厭氧細菌細胞的破裂而獲得。
雖然本文揭示了本發明的實施例，本發明的其它和進一步的實施例可以在不脫離本發明基本範圍的情況下被設計出，並且本發明的範圍由隨後的申請專利範圍確定。
100‧‧‧方法
110‧‧‧步驟
120‧‧‧步驟
130‧‧‧步驟
140‧‧‧步驟
150‧‧‧步驟
160‧‧‧步驟
165‧‧‧步驟

Claims (20)

  1. 一種使用厭氧細菌發酵產生的富含蛋白質的營養補充物的組合物，其包括：
    從一份勻漿中分餾出一份含蛋白質部分，
    其中，所述勻漿包含所述含蛋白質部分和一個含蛋白質細胞碎片部分，並且勻漿是從將一份含所述厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液中的細胞破碎以獲取的，
    其中，所述含厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液由分離從發酵器輸送出的由厭氧細菌發酵氣態底物產生的發酵液體肉湯而產生，和
    其中所述發酵液體肉湯被分離成含厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液和一份不含細胞的滲透液。
  2. 如請求項1所述的組合物，其中所述厭氧細菌選自由梭菌屬細菌、醋桿菌屬細菌及其組合。
  3. 如請求項1所述的組合物，其中所述厭氧細菌選自於一下所構成的群組：凱伍產醋菌(Acetogenium kivui)，潮濕厭氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)，伍迪厭氧醋菌(Acetobacterium woodii)，巴奇產鹼菌(Alkalibaculum bacchi)CP11(ATCC BAA-1772)，產生性布洛堤菌(Blautia producta)，嗜甲醇丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)，地下厭氧卡拉菌(Caldanaerobacter subterraneous)，太平洋地下厭氧卡拉菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)，產氫羧基嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)，醋酸梭菌(Clostridium aceticum)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，丙酮丁醇梭菌P262(Clostridium acetobutylicum P262)(德國DSMZ之DSM 19630)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 19630)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 10061)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 23693)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium aut oethanogenum)(德國DSMZ之DSM24138)，羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans P7)(ATCC PTA-7827)，克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)，德可氏梭菌(Clostridium drakei)，俊達氏梭菌(Clostridium ljungdahlii PETC)(ATCC 49587)，俊達氏梭菌ER12(Clostridium ljungdahlii ER12)(ATCC 55380)，俊達氏梭菌C-01(Clostridium ljungdahlii C-01)(ATCC 55988)，俊達氏梭菌O-52(Clostridium ljungdahlii O-52)(ATCC 55889)，美格氏梭菌(Clostridium magnum)，巴斯德氏梭菌(Clostridium pasteurianum)(德國DSMZ之DSM 525)，拉格拉氏梭菌(Clostridium ragsdali P11)(ATCC BAA-622)，煎盤梭菌(Clostridium scatologenes)，熱醋梭菌(Clostridium thermoaceticum)，雅爾氏梭菌(Clostridium ultunense)，庫茲氏脫硫菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)，黏液真桿菌(Eubacterium limosum)，硫還原地桿菌(Geobacter sulfurreducens)，乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)，巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)，熱醋莫雷拉氏菌(Morrella thermoac etica)，自嗜熱莫雷拉氏菌(Morrella thermoautotrophica)，芬尼氧菌(Oxobacter pfennigii)，產生性腖鏈球菌(Peptostreptococcus productus)，產生性魯米諾球菌(Ruminococcus productus)，凱伍厭氧嗜熱菌(Thermoanaerobacter kivui)，及其組合。
  4. 如請求項1所述的組合物，其中所述氣態底物包括一種或多種氣體，包括一氧化碳(CO)、氫氣(H2)、和二氧化碳(CO2)。
  5. 如請求項1所述的組合物，其中所述細胞碎片部分包含細胞壁微粒、細胞膜微粒、蛋白質聚集體、包含體、核酸、和厭氧細菌細胞的其它組分。
  6. 如請求項1所述的組合物，其中從發酵器輸送出的發酵液體肉湯被分離成不含細胞的滲透液和含細胞的懸浮液，其中所述不含細胞的滲透液包含選自乙醇、丁醇、乙酸、丁酸及其組合的烴化合物。
  7. 如請求項1所述的組合物，其中所述含蛋白質部分包含：
    蛋白質含量在所述組合物的約10%至約95%之間；
    碳水化合物含量在所述組合物的約5%至約35%之間；和
    核酸含量小於所述組合物的15%。
  8. 如請求項7所述的組合物，其中所述含蛋白質部分的核酸含量小於所述組合物的2%。
  9. 如請求項1所述的組合物，其中在含蛋白質部分中的蛋白質含量大於在含蛋白質部分中的碳水化合物含量。
  10. 一種使用厭氧細菌發酵產生的富含蛋白質的營養補充物的組合物，其包含：
    從一份勻漿中分餾出一份含蛋白質部分，
    其中，所述勻漿包含所述含蛋白質部分和一個含蛋白質細胞碎片部分，並且勻漿是從將一份含所述厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液中的細胞破碎以獲取的，
    其中所述含厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液由分離從發酵器輸送出的由厭氧細菌發酵氣態底物產生的發酵液體肉湯而產生。
  11. 如請求項10所述的組合物，其中所述厭氧細菌選自由梭菌屬細菌、醋桿菌屬細菌及其組合。
  12. 一種使用厭氧細菌發酵產生的富含蛋白質的營養補充物的組合物，其包含：
    從一份勻漿中獲取一份含蛋白質部分，其中勻漿是從將一份含所述厭氧細菌細胞的含細胞懸浮液中的細胞破碎以獲取的，並且
    其中含細胞的懸浮液是從一份發酵液體肉湯中獲得的，該發酵液體肉湯從進行厭氧細菌發酵氣態底物的一個發酵器中輸出，並將所述發酵液體肉湯分離成不含細胞的滲透液和含細胞懸浮液。
  13. 如請求項12所述的組合物，其中所述厭氧細菌選自由梭菌屬細菌、醋桿菌屬細菌及其組合。
  14. 如請求項12所述的組合物，其中所述厭氧細菌選自於一下所構成的群組：凱伍產醋菌(Acetogenium kivui)，潮濕厭氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)，伍迪厭氧醋菌(Acetobacterium woodii)，巴奇產鹼菌(Alkalibaculum bacchi)CP11 (ATCC BAA-1772)，產生性布洛堤菌(Blautia producta)，嗜甲醇丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)，地下厭氧卡拉菌(Caldanaerobacter subterraneous)，太平洋地下厭氧卡拉菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)，產氫羧基嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)，醋酸梭菌(Clostridium aceticum)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，丙酮丁醇梭菌P262(Clostridium acetobutylicum P262)(德國DSMZ之DSM 19630)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 19630)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 10061)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 23693)，自行乙醇生成梭菌(Clostridium a utoethanogenum)(德國DSMZ之DSM 24138)，羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans P7)(ATCC PTA-7827)，克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)，德可氏梭菌(Clostridium drakei)，俊達氏梭菌(Clostridium ljungdahlii PETC)(ATCC 49587)，俊達氏梭菌ER12(Clostridium ljungdahlii ER12)(ATCC 55380)，俊達氏梭菌C-01(Clostridium ljungdahlii C-01)(ATCC 55988)，俊達氏梭菌O-52(Clostridium ljungdahlii O-52)(ATCC 55889)，美格氏梭菌(Clostridium magnum)，巴斯德氏梭菌(Clostridium pasteurianum)(德國DSMZ之DSM 525)，拉格拉氏梭菌(Clostridium ragsdali P11)(ATCC BAA-622)，煎盤梭菌(Clostridium scatologenes)，熱醋梭菌(Clostridium thermoaceticum)，雅爾氏梭菌(Clostridium ultunense)，庫茲氏脫硫菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)，黏液真桿菌(Eubacterium limosum)，硫還原地桿菌(Geobacter sulfurreducens)，乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)，巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)，熱醋莫雷拉氏菌(Morrella thermo acetica)，自嗜熱莫雷拉氏菌(Morrella thermoautotrophica)，芬尼氧菌(Oxobacter pfernnigii)，產生性腖鏈球菌(Peptostreptococcus productus)，產生性魯米諾球菌(Ruminococcus productus)，凱伍厭氧嗜熱菌(Thermoanaerobacter kivui)，及其組合。
  15. 如請求項12所述的組合物，其中所述氣態底物包含一種或多種選自由碳源底物、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、氫氣(H2)、合成氣及其組合。
  16. 如請求項12所述的組合物，其中所述勻漿還包含一個含蛋白質細胞碎片部分，並且所述含蛋白質細胞碎片部分包含細胞壁微粒、細胞膜微粒、蛋白質聚集體、包含體、核酸、和厭氧細菌細胞的其他組分。
  17. 如請求項12所述的組合物，其中所述含蛋白質部分被分離出一份純化的蛋白質產物，並且所述純化的蛋白質產物包含核酸含量小於所述組合物約12%。
  18. 如請求項12所述的組合物，其中將發酵液肉湯通過超濾進行分離生成所述不含細胞的滲透液和所述含細胞懸浮液。
  19. 如請求項12所述的組合物，其中所述含細胞懸浮液內的厭氧細菌的細胞膜的破裂是通過一個或多個破裂裝置完成的，所述破裂裝置選自微流體裝置、聲波處理裝置、超聲波裝置、機械破裂裝置、法式破碎機、冷凍機、加熱器、巴氏滅菌裝置、UV滅菌裝置、伽馬射線滅菌裝置、反應器、均質器、及其組合。
  20. 如請求項12所述的組合物，其中所述含蛋白質部分由一個分餾器從勻漿中分餾出，所述分餾器選自固液分餾器、離心裝置、連續離心裝置、沉降離心機、盤堆式離心機、過濾裝置、中空纖維過濾系統、螺旋纏繞過濾系統、陶瓷過濾系統、錯流過濾裝置、體積排阻裝置、一個或一系列離子交換柱、一個或一系列碳聚合物柱、流通式磁力分餾器、及其組合。
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