BR112020023163A2 - sistema e processo para aumentar o rendimento de produtos proteicos a partir de células de bactérias - Google Patents

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Abstract

“sistema e processo para aumentar o rendimento deprodutos proteicos a partirde células de bactérias”. suplementos nutricionais ricos em proteínas e suplementos alimentares para animais derivados de um processo com bactérias anaeróbias são gerados através de um grande número de processos de ruptura de células e de fracionamento/purificação de proteínas. são fornecidos sistemas de fermentação bacteriana e métodos de obtenção de uma ou mais partes que contêm proteínas provenientes de um processo de fermentação que utiliza substratos gasosos que contêm monóxido de carbono aumentando o rendimento das células de bactérias. a invenção fornece ainda composições de suplementos nutricionais ricos em proteínas com aplicações úteis para ingestão por uma variedade de animais diferentes e seres humanos.

Description

“SISTEMA E PROCESSO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PRODUTOS PROTEICOS A PARTIR DE CÉLULAS DE BACTÉRIAS” RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOS
[0001] Este Pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente U.S. provisório número de série 62/674,604, depositado em 21 de maio de 2018 e do Pedido de Patente U.S. número de série 16/416,127, depositado em 17 de maio de 2019, todos os pedidos de patentes referidos acima são incorporados aqui como referência.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
[0002] A fermentação microbiana ocorre quando é fornecido para um micro-organismo um substrato de carbono que este pode utilizar e processar em vários produtos, que podem ser recuperados, separados e purificados. Os substratos de carbono escolhidos dependem do tipo de micro-organismos utilizado e de suas vias metabólicas e o tipo de micro- organismos utilizados se baseia na identificação e na seleção de uma cepa microbiana que tem as capacidades de produzir o tipo de produtos desejados. Os substratos de carbono podem incluir monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2), metanol, metil, etanol, n-alcanos, glicose, celulose, bagaço, melaço e resíduo de sulfito. Os produtos e as substâncias úteis gerados pela fermentação bacteriana incluem include etanol, ácido lático, acetato e outros biocombustíveis e reagentes químicos, que podem ser utilizados como uma fonte de energia e uma variedade de aplicações adicionais.
[0003] Como um exemplo, a fermentação bacteriana por micro- organismos anaeróbios, que incluem micro-organismos acetogênicos, pode produzir produtos da fermentação (por exemplo, etanol, butanol, acetato, butirato, ácido butírico, 2,3-butanodiol e outros produtos relacionados) através da fermentação de substratos gasosos tais como monóxido de carbono (CO), gás hidrogênio (H2) e/ou dióxido de carbono (CO2). O etanol e o butanol são frequentemente utilizados como combustíveis líquidos relacionados ao transporte, enquanto que o acetato e o 2,3-butanodiol são utilizados na indústria química. Exemplos de agentes acetogênicos produtores de bioetanol utilizados para a fermentação microbiana incluem aqueles dos gêneros Clostridium e Acetobacterium. Por exemplo, a Patente U.S. No. 5.173.429 descreve Clostridium ljungdahlii ATCC No. 49587, um micro-organismo anaeróbio que produz etanol e acetato partindo do gás de síntese. A Patente U.S. No. 5.807.722 descreve um método e um equipamento para converter gases residuais em ácidos orgânicos e álcoois utilizando Clostridium ljungdahlii ATCC No. 55380. A Patente U.S. No. 6.136,577 descreve um método e um equipamento para converter gases residuais em etanol utilizando Clostridium ljungdahlii ATCC No. 55988 e 55989.
[0004] Em adição aos produtos de fermentação, a fermentação microbiana em grande escala também produz uma grande quantidade de caldo de cultura de fermentação microbiana e pode requerer a purga de uma grande parte das células mortas ou inativas. A recuperação das células bacterianas em excesso provenientes do caldo de cultura em excesso ou purgado na biomassa microbiana pode levar à produção de proteínas unicelulares (SCP) e outros componentes para reuso como fonte de proteínas, aminoácidos e carboidratos que são úteis como uma matéria-prima para uma ração para animais e/ou nutrientes ou suplementos para alimentação de animais. Todos os animais precisam de aminoácidos, os blocos de construção das proteínas necessárias para o crescimento ótimo, a reprodução, a lactação e a manutenção. Os aminoácidos absorvidos no intestino delgado dos bovinos são derivados das proteínas que são digeridas no rúmen e geralmente seu sistema digestivo tem que fornecer 10 aminoácidos essenciais, que não podem ser produzidos pelo próprio bovino, que incluem arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina. De forma ideal, as proporções relativas de cada um dos aminoácidos essenciais absorvidos se comparam exatamente ao suprimento de aminoácidos necessários pelo bovino, porque uma deficiência de um pode limitar a utilização dos outros.
[0005] Entretanto, os métodos atuais que se direcionam para as proteínas unicelulares frequentemente incorporam diretamente células microbianas como a biomassa de células total que será utilizada para alimentação dos animais ou aquacultura. Nos processos de fermentação microbiana, o caldo de fermentação inclui células de bactérias bem como restos celulares. Estes métodos não diferenciam as duas coisas e frequentemente contêm teor de biomassa que pode ser prejudicial para o animal ou a aquacultura (por exemplo, peixes ou camarões etc.). Por exemplo, a biomassa de células microbianas inteiras pode conter alto de teor de ácidos nucleicos que não é adequado para ingestão ou outro conteúdo que não pode ser digerido apropriadamente. A maioria destes métodos anteriores não processa a biomassa de células inteiras através de técnicas de ruptura de células ou rompimento de células adicionais antes da incorporação da biomassa de células inteiras nas rações para animais. Em adição, métodos atuais de recuperação de proteínas bacterianas da fermentação bacteriana não produzem teor de proteína alto o suficiente adequado para as finalidades relacionadas à nutrição. Há uma necessidade de um método e um sistema para obtenção de suplementos ricos em proteínas provenientes de um processo de fermentação bacteriana e composição de quaisquer tais suplementos nutricionais e rações para animais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0006] As modalidades da invenção fornecem métodos, sistemas e composições para produção e obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas e/ou rações para animais que são derivadas de biomassa de células microbianas após um processo de fermentação bacteriana anaeróbia utilizando um grande número de técnicas de ruptura de células e de fracionamento e purificação de proteínas. Os suplementos nutricionais ricos em proteínas podem ser utilizados como ração diretamente ou junto com outros nutrientes como suplementos para seres humanos ou animais.
[0007] Em uma modalidade, é fornecido um sistema de fermentação bacteriana que produz uma parte que contém proteínas proveniente de um processo de fermentação e inclui um ou mais recipientes de fermentação, um ou mais separadores de células, uma ou mais câmaras de processamento, um ou mais dispositivos de ruptura de células e um ou mais fracionadores. Em outra modalidade, a invenção fornece ainda uma composição de suplemento nutricional rico em proteínas gerado partindo de um processo de fermentação que utiliza bactérias anaeróbias com aplicações úteis para ingestão por uma variedade de animais diferentes e seres humanos.
[0008] Ainda em outra modalidade, é fornecido um método para obtenção de uma taxa de recuperação alta de um produto contendo proteínas purificado de células de bactérias anaeróbias. Em um aspecto, o método inclui a fermentação de um substrato gasoso com células de bactérias anaeróbias em um caldo líquido de fermentação dentro de um recipiente de fermentação, em que o caldo líquido de fermentação está em um primeiro valor de pH, a separação de uma quantidade para o caldo líquido de fermentação que será fornecido partindo do recipiente de fermentação em uma concentração de células inicial em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias e o fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH para ajustar o pH da suspensão contendo células, em que o pH da suspensão contendo células é ajustado em um segundo valor de pH maior que o primeiro valor de pH.
[0009] O método inclui ainda a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias contidas dentro da suspensão contendo células em um homogenato que tem o produto contendo proteínas a uma primeira taxa de recuperação de proteínas, em que a primeira taxa de recuperação de proteínas é uma porcentagem de uma concentração de proteínas (gramas por litro) do produto contendo proteínas dividida pela concentração de células inicial (gramas por litro) e o fracionamento do homogenato em uma primeira parte contendo proteínas a uma segunda taxa de recuperação de proteínas e uma parte de restos celulares contendo proteínas a uma terceira taxa de recuperação de proteínas.
[0010] Outra modalidade da invenção fornece um sistema para aumentar uma taxa de recuperação de um produto contendo proteínas purificado de células de bactérias anaeróbias. O sistema inclui um recipiente de fermentação conectado a uma tubulação de entrada de gás para o escoamento de um substrato gasoso dentro do recipiente de fermentação contendo as células de bactérias anaeróbias para fermentar o substrato gasoso pelas células de bactérias anaeróbias em um caldo líquido de fermentação a um primeiro valor de pH e um separador de células conectado ao recipiente de fermentação para receber o caldo líquido de fermentação proveniente do recipiente de fermentação e separar o caldo líquido de fermentação em uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias.
[0011] O sistema inclui ainda um ou mais dispositivos de ruptura que são conectados a uma ou mais primeiras saídas do primeiro separador para romper as membranas celulares das células de bactérias anaeróbias contidas dentro da suspensão contendo células em um homogenato em um segundo valor de pH, em que o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH e um ou mais fracionadores conectados ao um ou mais dispositivos de ruptura para receber o homogenato proveniente do um ou mais dispositivos de ruptura e fracionar o homogenato em uma ou mais partes contendo proteínas que têm o produto contendo proteínas e uma ou mais partes de restos celulares contendo proteínas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0012] Assim, de maneira em que as características citadas anteriormente da presente invenção possam ser entendidas em detalhes, uma descrição mais particular da invenção, resumida sucintamente acima, pode ser tida como referência às modalidades, das quais algumas são ilustradas nos desenhos em anexo. Deve ser observado, entretanto, que os desenhos em anexo ilustram apenas modalidades típicas desta invenção e, portanto, não devem ser considerados limitantes de seu âmbito, uma vez que a invenção pode admitir outras modalidades igualmente eficientes.
[0013] A FIG. 1A ilustra um fluxograma de um método de processamento de uma suspensão contendo células proveniente de um processo de fermentação que tem uma cultura de bactérias anaeróbias contidas ali e de obtenção de uma primeira parte que contém proteínas e/ou uma parte de restos celulares contendo proteínas como um suplemento nutricional rico em proteínas de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0014] A FIG. 1B ilustra um fluxograma de outro método de processamento de uma suspensão contendo células proveniente de um processo de fermentação que tem uma cultura de bactérias anaeróbias contidas ali e de obtenção de uma primeira parte que contém proteínas e/ou uma parte de restos celulares contendo proteínas como um suplemento nutricional rico em proteínas de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0015] A FIG. 2A ilustra um fluxograma de um método de processamento de uma suspensão contendo células proveniente de um processo de fermentação que tem uma cultura de bactérias anaeróbias contidas ali e de obtenção de uma segunda parte que contém proteínas como um suplemento nutricional rico em proteínas de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0016] A FIG. 2B ilustra um fluxograma de outro método de processamento de uma suspensão contendo células proveniente de um processo de fermentação que tem uma cultura de bactérias anaeróbias contidas ali e de obtenção de uma terceira parte que contém proteínas como um suplemento nutricional rico em proteínas de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0017] A FIG. 3A ilustra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 300A para produção de uma suspensão contendo células e um ou mais compostos hidrocarbonetos oxigenados provenientes de um processo de fermentação utilizando uma cultura de bactérias anaeróbias, em que o sistema de fermentação bacteriana 300A inclui um ou mais separadores de células, uma ou mais câmaras de processamento e opcionalmente, uma ou mais câmaras de desidratação, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0018] A FIG. 3B ilustra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 300B para produção de uma ou mais suspensões contendo células e um ou mais compostos hidrocarbonetos oxigenados provenientes de um processo de fermentação utilizando uma cultura de bactérias anaeróbias, em que o sistema de fermentação bacteriana 300B inclui dois separadores de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento e opcionalmente, uma câmara de desidratação, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0019] A FIG. 4A mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400A com um ou mais separadores de células, uma ou mais câmaras de processamento, um ou mais dispositivos de ruptura, um ou mais fracionadores, uma ou mais câmaras de desidratação e uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao sistema para um processo de fermentação utilizando uma cultura de uma bactéria anaeróbia de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0020] A FIG. 4B mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400B com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao sistema, dois separadores de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para um processo de fermentação utilizando uma cultura de uma bactéria anaeróbia de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0021] A FIG. 4C mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400C com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao sistema, um separador de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, um fracionador e duas ou mais câmaras de desidratação para um processo de fermentação utilizando uma cultura de uma bactéria anaeróbia de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0022] A FIG. 4D mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400D com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao sistema, um separador de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e opcionalmente, câmaras de desidratação adicionais para um processo de fermentação utilizando uma cultura de uma bactéria anaeróbia de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0023] A FIG. 4E mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400E com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao sistema, dois separadores de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e opcionalmente, três câmaras de desidratação para um processo de fermentação utilizando uma cultura de uma bactéria anaeróbia de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0024] A FIG. 4F mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400F com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao sistema, um separador de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção contendo células, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e opcionalmente, três câmaras de desidratação para um processo de fermentação utilizando uma cultura de uma bactéria anaeróbia de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0025] A FIG. 4G mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400G com dois separadores de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção que contém células, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e opcionalmente, três câmaras de desidratação para um processo de fermentação utilizando uma cultura de bactérias anaeróbias de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0026] A FIG. 4H mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400H com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao sistema, dois separadores de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e opcionalmente, três câmaras de desidratação para um processo de fermentação utilizando uma cultura de uma bactéria anaeróbia de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0027] A FIG. 5A é um esquema de um exemplo de sistema de fermentação bacteriana para a ruptura de células coletadas de um processo de fermentação bacteriana anaeróbia e a obtenção de uma ou mais partes que contêm proteínas provenientes dos homogenatos de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0028] A FIG. 5B é um esquema de outro exemplo de sistema de fermentação bacteriana para a ruptura de células coletadas de um processo de fermentação bacteriana anaeróbia e a obtenção de uma ou mais partes que contêm proteínas provenientes dos homogenatos de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0029] A FIG. 5C é um esquema de outro exemplo de um sistema de fermentação bacteriana para a ruptura de células coletadas de um processo de fermentação bacteriana anaeróbia e a obtenção de uma ou mais partes que contêm proteínas provenientes dos homogenatos de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0030] A FIG. 5D é um esquema de ainda outro exemplo de um sistema de fermentação bacteriana para a ruptura de células coletadas de um processo de fermentação bacteriana anaeróbia e a obtenção de uma ou mais partes que contêm proteínas provenientes dos homogenatos de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0031] A FIG. 5E é um esquema de outro exemplo de sistema de fermentação bacteriana para a ruptura de células coletadas de um processo de fermentação bacteriana anaeróbia e a obtenção de uma ou mais partes que contêm proteínas provenientes dos homogenatos de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0032] A FIG. 6 é um esquema de ainda outro exemplo de um sistema de fermentação bacteriana para a ruptura de células coletadas de um processo de fermentação bacteriana anaeróbia e a obtenção de uma ou mais partes que contêm proteínas provenientes dos homogenatos de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0033] A FIG. 7A mostra uma micrografia eletrônica de um exemplo de uma suspensão contendo células antes da ruptura de células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células em um homogenato, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0034] A FIG. 7B mostra uma micrografia eletrônica de um exemplo de um homogenato obtido de um dispositivo de ruptura após a ruptura de células de bactérias anaeróbias dentro de uma suspensão contendo células de um caldo líquido de fermentação bacteriana, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0035] A FIG. 7C é ainda outro exemplo de uma micrografia eletrônica, que mostra as células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células após estas serem rompidas dentro dos dispositivos de ruptura, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0036] A FIG. 7D é outro exemplo de uma micrografia eletrônica de um homogenato, que mostra as membranas celulares rompidas das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células após a ruptura pelo dispositivo de ruptura à alta pressão, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0037] A FIG. 7E é ainda outro exemplo de uma micrografia eletrônica de um homogenato, que mostra as membranas celulares rompidas das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células após a ruptura pelo dispositivo de ruptura à pressão muito alta, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0038] A FIG. 8A mostra um gráfico de um exemplo de concentrações de proteínas solúveis no homogenato obtido de um dispositivo de ruptura após a ruptura de células de bactérias anaeróbias dentro de um exemplo de uma suspensão contendo células, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[0039] A FIG. 8B mostra outro gráfico de outro exemplo de concentrações de proteínas solúveis obtidas de um dispositivo de ruptura após a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro de outro exemplo de uma suspensão contendo células, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0040] As modalidades da invenção fornecem métodos, sistemas e composições para produção e obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas e/ou rações para animais que são derivadas de biomassa de células microbianas após um processo de fermentação bacteriana anaeróbia utilizando um grande número de técnicas de ruptura de células e de fracionamento e purificação de proteínas. Mais especificamente, a invenção refere-se a um método de separação de uma biomassa microbiana de um processo de fermentação, de ruptura das células da biomassa microbiana em um homogenato e de fracionamento e purificação de uma ou mais partes que contêm proteínas do homogenato de forma que a uma ou mais partes que contêm proteínas possam ser adicionalmente processadas em uma composição como um suplemento nutricional que pode ser ingerido tanto por animais quanto por seres humanos. Os suplementos nutricionais ricos em proteínas podem ser utilizados como ração diretamente ou junto com outros nutrientes como suplementos para seres humanos ou animais.
[0041] Os suplementos nutricionais ricos em proteínas e os suplementos alimentares para animais podem ser processados e obtidos partindo de uma ou mais partes que contêm proteínas após um processo de fermentação em um sistema de fermentação bacteriana utilizando um ou mais substratos gasosos, tais como gás de síntese, substratos de fonte de carbono, gás contendo monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2), gás hidrogênio (H2), gás de síntese e combinações dos mesmos. A invenção fornece ainda composições de suplementos nutricionais ricos em proteínas com aplicações úteis para ingestão por animais e seres humanos.
[0042] Em um aspecto, é fornecido um processo para aumentar uma taxa de recuperação de um produto contendo proteínas purificado de células de bactérias anaeróbias. O processo inclui a fermentação de um substrato gasoso com células de bactérias anaeróbias em um caldo líquido de fermentação dentro de um recipiente de fermentação, em que o caldo líquido de fermentação está em um primeiro valor de pH e a separação do caldo líquido de fermentação que será fornecido partindo do recipiente de fermentação em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias. O processo inclui ainda o fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH para ajustar o pH da suspensão contendo células, em que o pH da suspensão contendo células é ajustado em um segundo valor de pH maior que o primeiro valor de pH e a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias contidas dentro da suspensão contendo células em um homogenato que tem o produto contendo proteínas a uma primeira taxa de recuperação de proteínas, em que a primeira taxa de recuperação de proteínas é uma porcentagem de uma concentração de proteínas (gramas por litro) do produto contendo proteínas dividida pela concentração de células inicial (gramas por litro).
[0043] Em outro aspecto, o homogenato é fracionado em uma primeira parte contendo proteínas a uma segunda taxa de recuperação de proteínas e uma parte de restos celulares contendo proteínas a uma terceira taxa de recuperação de proteínas utilizando um primeiro fracionador antes do fornecimento da primeira parte contendo proteínas para um segundo fracionador. Ainda em outro aspecto, a primeira parte contendo proteínas é fracionada em uma segunda parte contendo proteínas utilizando um segundo fracionador antes da coleta da segunda parte contendo proteínas.
[0044] Em uma modalidade, a primeira taxa de recuperação de proteínas fica entre 10% e 95%, tal como entre 30% e 85% ou entre 50% e 80%. Em um aspecto, a segunda taxa de recuperação de proteínas fica entre 10% e 85%, tal como entre 30% e 80%. Em outro aspecto, a terceira taxa de recuperação de proteínas fica entre 10% e 75%, tal como entre 45% e 65%. Em outra modalidade, a primeira parte contendo proteínas e/ou a parte de restos celulares contendo proteínas pode ser processada e produzida na forma de suplementos nutricionais ricos em proteínas. Em outro aspecto, a primeira parte contendo proteínas é produzida na forma de um suplemento nutricional rico em proteínas que tem um teor de proteína de aproximadamente 10% ou maior, tal como 40% ou maior, 50% ou maior, 60% ou maior, 70% ou maior ou 80% ou maior, 90% ou maior, tal como entre aproximadamente 10% a aproximadamente 80% de teor de proteína ou entre aproximadamente 10% a aproximadamente 95% de teor de proteína, por exemplo, entre aproximadamente 10% a aproximadamente 98% de teor de proteína.
[0045] Em um aspecto, o segundo valor de pH está em uma faixa de
5 a 12. Em outro aspecto, o segundo valor de pH está em uma faixa de 7 a 12. Em uma modalidade, o um ou mais agentes de ajuste do pH são selecionados do grupo que consiste de hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e quaisquer agentes que possam ser utilizados para aumentar ou reduzir o valor de pH de uma solução e uma combinação dos mesmos.
[0046] Em um aspecto, um ou mais agentes de ajuste do pH são adicionados à suspensão contendo células antes de ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias. Em outro aspecto, o um ou mais agentes de ajuste do pH são adicionados à suspensão contendo células após a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias.
[0047] Ainda em outro aspecto, o método também pode incluir a manutenção da suspensão contendo células contendo as células bacterianas anaeróbias em um tanque de retenção contendo células e o fornecimento da suspensão contendo células proveniente do tanque de retenção contendo células a uma taxa de fornecimento para um dispositivo de ruptura. O tanque de retenção contendo células pode servir como um recipiente de armazenamento ou uma câmara de pré- tratamento para a suspensão contendo células. Em um exemplo, o tanque de retenção contendo células é utilizado para conduzir uma etapa de pré-tratamento de tratamento da suspensão contendo células contendo as células bacterianas anaeróbias com um ou mais aditivos, incluindo agentes de ajuste do pH no segundo valor de pH, fornecidos através de uma tubulação de entrada que é conectada ao tanque de retenção contendo células. Exemplos dos aditivos incluem, mas sem limitação um tensoativo, um detergente, EDTA, Tween-20, Triton X-100, dodecil sulfato de sódio, CHAPS, uma enzima, protease, lisozima, benzonase, nuclease, um agente de ajuste do pH e uma combinação dos mesmos.
[0048] Em outro aspecto, o método inclui ainda o tratamento da suspensão contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias com um ou mais aditivos antes da ruptura das membranas celulares das células bacterianas anaeróbias. Alternativamente, o método inclui o tratamento da suspensão contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias com um ou mais aditivos após o processo de ruptura e antes da separação da primeira parte contendo proteínas da parte de restos celulares contendo células.
[0049] Ainda em outro aspecto, os sistemas e os métodos da invenção podem fornecer ainda a concentração da suspensão contendo células que contém as células das bactérias anaeróbias em uma segunda suspensão contendo células. Em um exemplo, a segunda suspensão contendo células é fornecida para um tanque de retenção contendo células que serão concentradas e/ou armazenadas ali. Em outro exemplo, a segunda suspensão contendo células no tanque de retenção é submetida a uma etapa de pré-tratamento de tratamento da segunda suspensão contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias com um ou mais aditivos fornecidos através de uma entrada conectada ao tanque de retenção contendo células. Então, a segunda suspensão contendo células é fornecida para fora do tanque de retenção em um dispositivo de ruptura. O dispositivo de ruptura rompe as membranas celulares das células bacterianas anaeróbias dentro da segunda suspensão contendo células e gera um homogenato. Partes adicionais contendo proteínas são então separadas de uma parte de restos celulares contendo células dentro do homogenato.
[0050] Ainda em outro aspecto, o método pode incluir ainda o fornecimento da primeira parte contendo proteínas a um ou mais fracionadores, o fracionamento da primeira parte contendo proteínas em uma segunda parte contendo proteínas e/ou uma terceira ou mais partes contendo proteínas utilizando o um ou mais fracionadores e coletando a segunda e a terceira ou mais partes contendo proteínas. Exemplos de fracionadores incluem, mas sem limitação, um fracionador sólido-líquido, um dispositivo de filtração, uma centrífuga contínua, uma centrífuga decantadora, uma centrífuga de placas cônicas, um dispositivo de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo de filtração de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de troca iônica, uma ou séries de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo, um dispositivo de ultrafiltração, uma ou séries de colunas de cromatografia por afinidade, uma ou séries de colunas de filtração em gel e combinações dos mesmos.
[0051] Em uma modalidade, a primeira parte contendo proteínas pode ser fornecida para um dispositivo de filtração para ser filtrada através do dispositivo de filtração e fracionada em uma parte de retentato e uma parte de filtrado de forma que a parte de filtrado seja produzida como o suplemento nutricional rico em proteínas. Em outra modalidade, a parte de retentato é produzida como o suplemento nutricional rico em proteínas. Ainda em outra modalidade, a primeira parte contendo proteínas pode ser fornecida a uma centrífuga e fracionada em uma parte do sobrenadante contendo proteínas e uma parte da pelota contendo proteínas através da centrifugação de forma que a parte do sobrenadante contendo proteínas e/ou a parte da pelota contendo proteínas seja produzida como o suplemento nutricional rico em proteínas.
[0052] Outra modalidade da invenção fornece um sistema para aumentar uma taxa de recuperação de um produto contendo proteínas purificado de células de bactérias anaeróbias. O sistema inclui um recipiente de fermentação conectado a uma tubulação de entrada de gás para o escoamento de um substrato gasoso dentro do recipiente de fermentação contendo as células de bactérias anaeróbias para fermentar o substrato gasoso pelas células de bactérias anaeróbias em um caldo líquido de fermentação a um primeiro valor de pH e um separador de células conectado ao recipiente de fermentação para receber o caldo líquido de fermentação proveniente do recipiente de fermentação e separar o caldo líquido de fermentação em uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias.
[0053] O sistema inclui ainda um ou mais dispositivos de ruptura que são conectados a uma ou mais primeiras saídas do primeiro separador para romper as membranas celulares das células de bactérias anaeróbias contidas dentro da suspensão contendo células em um homogenato em um segundo valor de pH, em que o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH e um ou mais fracionadores conectados ao um ou mais dispositivos de ruptura para receber o homogenato proveniente do um ou mais dispositivos de ruptura e fracionar o homogenato em uma ou mais partes contendo proteínas que têm o produto contendo proteínas e uma ou mais partes de restos celulares contendo proteínas.
[0054] Ainda em outra modalidade da invenção, o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH através do fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH em uma ou mais primeiras saídas do primeiro separador para ajustar o pH da suspensão contendo células. Em outra modalidade, o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH através do fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH dentro de um ou mais dispositivos de ruptura para ajustar o pH da suspensão contendo células.
[0055] Em uma modalidade da invenção, o sistema inclui ainda um tanque de retenção conectado ao um ou mais dispositivos de ruptura e ao separador de células para receber a suspensão contendo células que é escoada para fora do separador de células antes da ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias. Em uma modalidade, o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH através do fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH no tanque de retenção e do ajuste do pH da suspensão contendo células dentro do tanque de retenção. Em uma modalidade alternativa, o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH através do fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH em uma ou mais segundas saídas do tanque de retenção que está conectado ao um ou mais dispositivos de ruptura para ajustar o pH da suspensão contendo células dentro do um ou mais dispositivos de ruptura. Em uma modalidade da invenção, o segundo valor de pH está em uma faixa de 5 a 12.
[0056] Em uma modalidade da invenção, o separador de células do sistema é selecionado do grupo que consiste de dispositivos de filtração, dispositivos de filtração de fibra oca, dispositivos de filtração enrolados em espiral, dispositivos de ultrafiltração, dispositivos de filtração de cerâmica, dispositivos de filtração de fluxo cruzado, dispositivos de filtração com coluna de exclusão de tamanho, dispositivos de filtração com filtros de fluxo cruzado, dispositivos de centrifugação e combinações dos mesmos.
[0057] Em uma modalidade da invenção, o um ou mais fracionadores do sistema são selecionados do grupo que consiste de um fracionador sólido-líquido, um dispositivo de filtração, uma centrífuga contínua, uma centrífuga decantadora, uma centrífuga de placas cônicas, um dispositivo de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo de filtração de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de troca iônica, uma ou séries de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo e combinações dos mesmos.
[0058] Em uma modalidade da invenção, o sistema inclui ainda uma ou mais câmaras de desidratação para receber uma ou mais partes obtidas do um ou mais fracionadores e desidratar a uma ou mais partes para produzir o suplemento nutricional rico em proteínas, em que a uma ou mais partes são selecionadas do grupo que consiste da primeira parte contendo proteínas, da parte de restos celulares contendo proteínas e combinações das mesmas, em que a uma ou mais câmaras de desidratação são selecionadas do grupo que consiste de um dispositivo de secagem por spray, um secador de tambor e um secador por congelamento, um dispositivo de liofilização e combinações dos mesmos.
[0059] Em uma modalidade, a ruptura das células é realizada por um microfluidizador. Em outra modalidade, a ruptura das células é realizada utilizando um sonicador. Ainda em outra modalidade, a ruptura das células é realizada utilizando um microfluidizador com uma pressão de processamento na faixa de 5.000 a 25.000 libras por polegada quadrada (psi). Ainda em outra modalidade, a ruptura das células é realizada utilizando um microfluidizador com uma pressão de processamento na faixa de 15.000 a 20.000 libras por polegada quadrada (psi). Ainda em outra modalidade, a ruptura das células é realizada utilizando um microfluidizador com uma pressão de processamento de
15.000 libras por polegada quadrada (psi).
[0060] Em um aspecto, o sistema de fermentação bacteriana inclui um primeiro separador de células conectado ao recipiente de fermentação e um dispositivo de ruptura. O primeiro separador de células recebe um líquido de fermentação em uma primeira concentração de células proveniente do recipiente de fermentação e separa o líquido de fermentação em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células em uma segunda concentração de células. Em outro aspecto, o sistema de fermentação bacteriana inclui ainda um tanque de retenção contendo células conectado ao primeiro separador de células para receber uma quantidade da primeira suspensão contendo células. Ainda em outro aspecto, o sistema de fermentação bacteriana inclui ainda um segundo separador de células conectado a uma quarta tubulação de saída do recipiente de fermentação para receber um segundo fluxo do caldo líquido de fermentação proveniente do recipiente de fermentação e separar o segundo fluxo do caldo líquido de fermentação em uma segunda suspensão contendo células e uma segunda solução de permeado livre de células.
[0061] I. Processamento de Biomassa Microbiana para Gerar Proteínas Derivadas da Fermentação
[0062] Um processo de fermentação bacteriana geralmente inclui a fermentação de um substrato gasoso, tal como gás de síntese ou substrato gasoso contendo monóxido de carbono (CO) por uma bactéria, tal como bactérias anaeróbias ou bactérias acetogênicas, dentre outras e a obtenção de produtos de fermentação que incluem dióxido de carbono (CO2), etanol, butanol, ácido butírico, ácido acético etc. De maneira mais importante, após um processo de fermentação bacteriana anaeróbia, são obtidas grandes quantidades de biomassa microbiana. As grandes quantidades de biomassa microbiana podem ser purgadas durante ou após o processo de fermentação bacteriana. Após a conclusão da purga das células ou durante o processo de fermentação bacteriana, esta grande quantidade de biomassa microbiana pode ser útil para outras aplicações. Entretanto, o processamento complexo adicional é necessário para extrair altas quantidades de proteínas derivadas da fermentação em alta qualidade (isto é, sem substâncias ou contaminantes prejudiciais) para que sejam úteis, por exemplo, como suplementos nutricionais ou ração para animais. Especificamente, a presente invenção inclui um processo de extração de tais proteínas derivadas da fermentação de uma biomassa de células de um processo de fermentação bacteriana. Mais especificamente, a presente invenção inclui sistemas para um processo de fermentação bacteriana para extrair uma ou mais partes derivadas da fermentação que contêm proteínas da massa de células ou da biomassa microbiana para o processamento em suplementos nutricionais e rações para animais.
[0063] A Figura 1A é um fluxograma de um exemplo de um método 100 de produção de suplemento nutricional rico em proteínas partindo de um sistema de fermentação bacteriana. O método 100 de fermentação bacteriana de substratos gasosos pode ser operado sob condições que favorecem a formação de compostos hidrocarbonetos, carboidratos, proteínas específicas, aminoácidos específicos e/ou outros componentes desejados, enquanto são mantidos os níveis desejados de produtos de fermentação, tais como os níveis de produtividade de álcool.
[0064] A etapa 110 inclui a fermentação de um substrato gasoso com bactérias anaeróbias em um recipiente de fermentação contendo um meio de cultura em um primeiro valor de pH. Na etapa 110, um meio de fermentação é adicionado a um recipiente de fermentação para a realização de um processo de fermentação bacteriana. Em adição, um ou mais substratos gasosos são fornecidos dentro do recipiente de fermentação e são fermentados por uma cultura de bactérias, tal como uma cultura contendo bactérias anaeróbias. Inicialmente, o meio de fermentação líquido contido no recipiente de fermentação pode incluir vários tipos de meio de cultura de bactérias, meio de fermentação ou meio nutricional líquido adequados. O meio nutricional inclui uma ou mais vitaminas e vários minerais em uma quantidade eficiente para permitir o crescimento do micro-organismo utilizado e/ou para favorecer que produtos específicos sejam gerados.
[0065] Pode ser utilizado um meio de cultura adequado para o crescimento de bactérias anaeróbias adequado para um processo de fermentação na produção de um ou mais compostos hidrocarbonetos oxigenados tais como vários tipos de etanol, butanol, ácido acético etc., dentre outros utilizando gás de síntese tal como monóxido de carbono e gás hidrogênio ou outro substrato adequado. Um exemplo de um meio de fermentação adequado é descrito na Pat. U.S. No. 7.285.402, que é incorporada aqui como referência. Outros exemplos de meio adequado são descritos nas U.S. Nos. de Série 61/650.098 e 61/650.093, das quais ambas são incorporadas aqui como referência.
[0066] Em adição, o um ou mais substratos gasosos utilizados no processo de fermentação bacteriana do método 100 podem incluir vários gases de síntese (isto é, syngas), gases de exaustão provenientes de um processo de produção de aço, gases de exaustão provenientes de um processo de produção de ferro, gases de exaustão provenientes de um processo de produção de carvão ou quaisquer outras fontes de gás adequadas provenientes de plantas de produção industriais. Em uma modalidade, os substratos gasosos utilizados no processo de fermentação bacteriana incluem um substrato gasoso contendo monóxido de carbono (CO) e/ou gases adicionais tais como gases de hidrogênio, dióxido de carbono (CO2), gás nitrogênio (N2) e combinações dos mesmos.
[0067] Em um exemplo, os substratos gasosos que contêm monóxido de carbono podem ser gases de combustão industrial contendo um volume alto de monóxido de carbono. Em alguns aspectos, um gás que inclui monóxido de carbono é derivado de gases residuais contendo carbono. Gases residuais contendo carbono incluem gases industriais residuais ou a gasificação de outros resíduos sólidos ou líquidos municipais. Dessa maneira, tais processos industriais representam processos eficientes para a captura de carbono que de outra maneira seria eliminado por exaustão no ambiente ao redor. Exemplos de gases de combustão industrial incluem gases produzidos durante a manufatura de produtos metálicos ferrosos, a manufatura de produtos não ferrosos, processos de refino de petróleo, gasificação de carvão, gasificação de biomassa, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de metanol e manufatura de coque.
[0068] Em um exemplo, o gás de síntese contendo monóxido de carbono é introduzido no recipiente de fermentação a taxas variáveis dependentes do tamanho e do tipo de recipiente de fermentação utilizado. Em um aspecto, o gás de síntese é introduzido na entrada de gás a uma taxa de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ft3/s. Em outro aspecto, o gás de síntese é introduzido a uma taxa de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 ft3/s. O termo “gás de síntese” ou “gás de síntese” inclui, mas sem limitação, gás de síntese em uma mistura gasosa que é rica em monóxido de carbono (CO) e hidrogênio (H2), tal como uma mistura gasosa produzida do vapor de transformação de gás natural ou hidrocarbonetos para produzir hidrogênio, da gasificação de carvão ou outros gases produzidos em alguns tipos de plantas de gasificação de resíduo em energia. O gás de síntese é combustível e é frequentemente utilizado como uma fonte de combustível ou como um intermediário para a produção de outros reagentes químicos. O gás de síntese pode ser fornecido partindo de qualquer fonte conhecida.
[0069] Por exemplo, o gás de síntese pode ser originado da gasificação de materiais de carbono. A gasificação envolve a combustão parcial da biomassa em um ambiente em que o suprimento de oxigênio é restrito. O gás resultante inclui principalmente gás de monóxido de carbono e gás hidrogênio. O gás de síntese contém pelo menos aproximadamente 10 mol % de monóxido de carbono ou pelo menos aproximadamente 20 mol % ou 10 a aproximadamente 100 mol % ou 20 a aproximadamente 100 mol %, 30 a aproximadamente 90 mol % de monóxido de carbono ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 mol % de monóxido de carbono ou aproximadamente 50 a aproximadamente 70 mol % de monóxido de carbono. O gás de síntese terá uma proporção molar de monóxido de carbono/dióxido de carbono de pelo menos aproximadamente 0,75 ou pelo menos 1,0 ou pelo menos aproximadamente 1,5. Os métodos de gasificação adequados e seus equipamentos são fornecidos nos Pedidos de Patentes U.S. Nos. 13/427.144, 13/427.193 e 13/427.247, bem como nos Pedidos de Patentes U.S. Nos. 61/516.667, 61/516.704 e 61/516.646, dos quais todos são incorporados aqui como referência.
[0070] Ainda, na etapa 110, uma cultura de bactérias é inoculada no recipiente de fermentação. O meio de fermentação é esterilizado para remover micro-organismos indesejáveis e o recipiente de fermentação bacteriana ou o biorreator de fermentação é inoculado com um micro- organismo escolhido ou uma cultura de bactérias mistas. Em um aspecto, as bactérias utilizadas na cultura de bactérias são bactérias anaeróbias. Exemplos das bactérias anaeróbias utilizadas incluem bactérias acetogênicas, tais como aquelas do gênero Clostridium, por exemplo, cepas de Clostridium ljungdahlii, incluindo aquelas descritas em WO 2000/68407, EP 117309, Patentes U.S. Nos. 5.173.429, 5.593.886 e
6.368.819, WO 1998/00558 e WO 2002/08438, cepas de Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 e DSM 19630 da DSMZ, Alemanha)
incluindo aquelas descritas na WO 2007/117157 e na WO 2009/151342 e Clostridium ragsdalei (P11, ATCC BAA-622) e Alkalibaculum bacchi (CP11, ATCC BAA-1772) incluindo aquelas descritas respectivamente na Patente U.S. No. 7.704.723 e “Biofuels and Bioproducts from Biomass- Generated Synthesis Gas”, Hasan Atiyeh, presented in Oklahoma EPSCoR Annual State Conference, April 29, 2010 e Clostridium carboxidivorans (ATCC PTA-7827) descrita no Pedido de Patente U.S. No. 2007/0276447. Cada uma destas referências é incorporada aqui como referência. Outras bactérias adequadas incluem aquelas do gênero Moorella, incluindo Moorella sp. HUC22-1 e aquelas do gênero Carboxydothermus. Em uma modalidade, é utilizada uma cultura de bactérias mistas, na qual a cultura de bactérias mistas inclui dois ou mais micro-organismos bacterianos.
[0071] As bactérias úteis para cultura neste processo de fermentação do método 100 incluem Acetogenium kivui, Acetoanaerobium noterae, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi CP11 (ATCC BAA- 1772), Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum P262 (DSM 19630 da DSMZ Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 da DSMZ Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 da DSMZ Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 23693 da DSMZ Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 24138 da DSMZ Alemanha), Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Clostridium coskatii (ATCC PTA-10522), Clostridium drakei, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55889), Clostridium magnum, Clostridium pasteurianum (DSM 525 da DSMZ Alemanha), Clostridium ragsdali P11 (ATCC BAA-622), Clostridium scatologenes, Clostridium thermoaceticum, Clostridium ultunense, Desulfotomaculum kuznetsovii, Eubacterium limosum,
Geobacter sulfurreducens, Metanosarcina acetivorans, Metanosarcina barkeri, Morrella thermoacetica, Morrella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Ruminococcus productus, Thermoanaerobacter kivui e combinações das mesmas. Outras bactérias acetogênicas ou anaeróbias também podem ser selecionadas para uso no método 100 descrito aqui.
[0072] Em um exemplo, as bactérias utilizadas incluem células de bactérias acetogênicas que tem um teor de G+C no DNA genômico de aproximadamente 50% ou menos. As bactérias acetogênicas podem ser ativas, inativas ou uma combinação das duas coisas. Neste aspecto, o teor de G+C pode ser determinado através de quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o genoma pode ser sequenciado utilizando métodos tais como os descritos em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) (também conhecido como “Maniatis”, que é incorporado aqui como referência). O teor de G+C pode então ser determinado manualmente ou através da utilização de qualquer número de programas, tal como por exemplo, Bohlin et al. “Analysis of Intragenomic GC Content Homogenicity within Prokaryotes”, BMC Genomics 2010, 11:464, que é incorporado aqui como referência. Outros métodos para a determinação do teor de G+C incluem a Patente U.S. No.
8.143.037, Mesbah et al. (1989) “Measurement of Deoxyguanosine/Thymidina Ratios in Complex Mixtures by High- Performance Liquid Chromatorgraphy for Determination of the Mole Percentage Guanine + Cytosine of DNA. J. Chromatogr. 479: 297-306 e Tanner et al., “Costridium ljungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I”, International Journal of Systematic Bacteriology, Apr. 1993, p. 232-236, dos quais todos são incorporados aqui como referência.
[0073] Na etapa 110, após a inoculação da cultura de bactérias dentro do recipiente de fermentação, uma taxa de suprimento de gás de alimentação inicial é estabelecida para o crescimento eficiente da população inicial dos micro-organismos (por exemplo, as bactérias anaeróbias) e a fermentação subsequente. O recipiente de fermentação fornece um ambiente para a cultura de bactérias anaeróbias. Um recipiente de fermentação adequado pode incluir, mas sem limitação, um ou mais dos seguintes: um reator de tanque agitado contínuo (CSTR), um reator de células imobilizadas (ICR), um reator de leito de gotejamento (TBR), um reator de biofilme com leito móvel (MBBR), uma coluna de bolhas, um fermentador de elevação de gás, um reator de membrana (por exemplo, um biorreator de membrana de fibra oca (HFMBR)), um misturador estático, um recipiente, um sistema de tubulação, uma torre, um reator do tipo circuito e combinações dos mesmos. No método 100, quaisquer recipientes de fermentação ou biorreatores de fermentação podem ser utilizados. Alguns exemplos de biorreatores são descritos nas U.S. Nos. de Série 61/571.654 e 61/571.565, depositadas em 30 de junho de 2011, na U.S. No. de Série 61/573.845, depositada em 13 de setembro de 2011, nas U.S. Nos. de Série 13/471.827 e 13/471.858, depositadas em 15 de maio de 2012 e na U.S. No. de Série 13/473.167, depositada em 16 de maio de 2012, das quais todas são incorporadas aqui como referência.
[0074] Em uma modalidade, o recipiente de fermentação inclui um primeiro biorreator conectado a um segundo biorreator, em que o primeiro biorreator alimenta um líquido de fermentação no segundo biorreator, em que a produção de etanol ocorre no segundo biorreator. Por exemplo, o recipiente de fermentação pode ser um sistema de CSTR de dois estágios para melhor estabilidade da cultura. Como um exemplo, o recipiente de fermentação pode incluir opcionalmente um primeiro Growth Stage com uma primeira câmara de CSTR e um segundo Production Stage com uma segunda câmara de CSTR.
[0075] Em um exemplo, o Growth Stage CSTR é alimentado com um meio de cultura líquido e o gás de substrato não convertido proveniente do Production Stage CSTR é alimentado no Growth Stage CSTR. Em geral, o Production Stage CSTR é alimentado com um abastecimento de gás novo e um abastecimento de meio novo bem como um abastecimento de cultura de bactérias proveniente do Growth Stage CSTR. Opcionalmente, o reciclo de células é utilizado para tirar as células de bactérias do Production Stage CSTR, separadas dos produtos de fermentação e enviá- las de volta para o Production Stage CSTR para a obtenção de alta eficiência de fermentação bacteriana. Em geral, as células de bactérias não são recicladas para o Growth Stage CSTR. A U.S. Pat. No. 10/311.655 descreve um processo de fermentação contínua e é incorporada aqui como referência. É pretendido que os termos “fermentação”, “processo de fermentação”, “processo de fermentação bacteriana”, “reação de fermentação”, “reação de fermentação bacteriana” e similares abranjam tanto a fase de crescimento quanto a fase de biossíntese do produto do processo. Em um aspecto, a fermentação refere-se à conversão de monóxido de carbono em álcool. Em um aspecto, o processo de fermentação bacteriana começa com a adição de um meio de fermentação adequado e um ou mais substratos gasosos ao recipiente de fermentação contendo bactérias dentro do mesmo.
[0076] Em geral, um caldo líquido de fermentação é gerado dentro do recipiente de fermentação assim que um processo de fermentação bacteriana foi iniciado. O caldo líquido de fermentação pode incluir um ou mais produtos de fermentação, em adição ao meio de cultura, o um ou mais substratos gasosos e as bactérias, contidos no recipiente de fermentação. Os produtos de fermentação contidos no caldo líquido de fermentação e obtidos através do processo de fermentação bacteriana dentro do recipiente de fermentação podem incluir um ou mais compostos hidrocarbonetos oxigenados, tal como álcoois etc., que incluem, mas sem limitação, etanol, 2-butanol, 2-butanona, 2,3- butanodiol, acetona, butadieno, butano, butanol, butirato, ácido butírico, etileno e ácidos graxos, ácido acéticos e combinações dos mesmos.
[0077] Em um aspecto, pode ser produzida uma mistura de etanol e ácido acético. em outro aspecto, a mistura de etanol e butanol é produzida. Em um exemplo, o etanol é produzido no recipiente de fermentação a uma produtividade específica maior que 10 g/L por dia, enquanto que a concentração de ácido acético livre é mantida em menos de 5 g/L de ácido acético livre. O etanol e o acetato encontrados no caldo líquido de fermentação podem estar em uma proporção de etanol para acetato que varia de 1:1 a 20:1.
[0078] O caldo líquido de fermentação contido no recipiente de fermentação pode conter etanol em concentração diluída e pode precisar ser processado adicionalmente em relação à qualidade e/ou sua concentração. Por exemplo, os produtos de fermentação contidos no caldo líquido de fermentação podem ser retirados do recipiente de fermentação e fornecidos para uma câmara de destilação ou outros tipos de reatores para serem destilados em uma produção de destilação final à concentração mais alta e adicionalmente processados e recuperados.
[0079] O caldo líquido de fermentação também pode incluir células de bactérias mortas ou inativas. Estas células de bactérias são de outra maneira conhecidas como células de bactérias ou células de bactérias anaeróbias. Um acúmulo de células provenientes do processo de fermentação bacteriana em grande quantidade é conhecido como massa de células ou biomassa exaurida. O termo “bactérias acetogênicas inativas” ou “células de bactérias inativas” refere-se a células mortas que perderam sua capacidade de se replicar após terem passado pelo processo de fermentação bacteriana. O termo “massa de células” refere- se a células de bactérias que formam uma biomassa microbiana como um todo. A biomassa microbiana pode se acumular durante a fermentação bacteriana e é útil que seja processada pelos métodos e sistemas descritos aqui em proteínas derivadas da fermentação. O caldo líquido de fermentação também pode incluir várias proteínas, aminoácidos, carboidratos, ácidos nucleicos e outros grupamentos. Exemplos de ácidos nucleicos incluem nucleotídeos, tais como DNA, RNA e quaisquer derivados e análogos dos mesmos. Devido ao acúmulo da massa de células ou da biomassa microbiana no caldo de fermentação, o próprio caldo de fermentação pode fornecer um valor calórico significativo.
O caldo líquido de fermentação pode ter um teor de matéria seca que fica em torno de 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% e em torno de 50%.
[0080] Como mostrado na Figura 1A, na etapa 120 do método 100, uma quantidade de um caldo líquido de fermentação contendo células das bactérias anaeróbias em uma primeira concentração e os produtos de fermentação são retirados do recipiente de fermentação bacteriana. Em geral, quando as células atingiram o crescimento em estado estacionário dentro dos recipientes de fermentação, o caldo líquido de fermentação contendo células de bactérias pode ser retirado do recipiente de fermentação. Para um processo de fermentação após um estágio de crescimento em estado estacionário, a primeira concentração da primeira batelada de células de bactérias contidas no caldo líquido de fermentação pode ser de 0,5 g/L (massa seca de células) ou superior, tal como 1,0 g/L ou superior ou 2,0 g/L ou superior ou 5,0 g/L ou superior ou 15,0 g/L ou superior ou 30,0 g/L ou superior.
[0081] A seguir, na etapa 130, as células das bactérias anaeróbias do caldo líquido de fermentação são separadas em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células, utilizando por exemplo, um ou mais separadores de células. Nesta etapa, o objetivo é separar e remover as células de bactérias do caldo líquido de fermentação e obter a solução de permeado livre de células e a suspensão contendo células separadamente. A solução de permeado livre de células contém principalmente os produtos de fermentação gerados pelo processo de fermentação e está pronta para o processamento adicional por destilação e outros processos. A suspensão contendo células é compreendida principalmente de células de bactérias após o processo de fermentação. As células de bactérias dentro da suspensão contendo células podem ser medidas em uma segunda concentração (ou segunda densidade de células) e em uma modalidade, a segunda concentração das células de bactérias dentro da suspensão contendo células é igual ou superior à primeira concentração das células de bactérias contidas no caldo líquido de fermentação.
[0082] Para manter uma concentração de células desejada da cultura microbiana no recipiente de fermentação, o processo de fermentação bacteriana inclui purgar uma parte do caldo líquido de fermentação. A maior concentração de células gera problemas relacionados à operação durante a fermentação, por exemplo, um aumento indesejado na concentração de ácido acético livre, de forma que a produção de acetato fica favorecida em relação à produção de etanol. Assim, é importante monitorar a densidade de células e conduzir purgas de células contínuas do caldo líquido de fermentação. O termo “densidade de células” significa massa de células de micro-organismos por volume unitário de meio de fermentação, por exemplo, gramas/litro.
[0083] A estabilização da concentração de células no recipiente de fermentação bacteriana é realizada através da purga das células de bactérias provenientes do recipiente de fermentação até uma concentração de células menor que a concentração no estado estacionário estável que utiliza todo o gás redutor ou os substratos nutricionais no biorreator e aumenta a taxa de alimentação aquosa quando a parte de ácido acético do acetato presente no biorreator de caldo de fermentação excede uma alta concentração (por exemplo, uma concentração de ácido acético livre de 1 g/L ou superior ou 2 g/L ou superior). A fermentação bacteriana contínua em grande escala pode ser mantida durante um período de tempo longo (por exemplo, durante muitos meses) através da manutenção de uma concentração de células constante dentro do recipiente de fermentação sem suplementação de cultura adicional. À cultura de bactérias dentro do recipiente de fermentação é alimentado um ou mais gases (por exemplo, CO, CO2, H2 e outros substratos de fonte de carbono) junto com um meio nutricional líquido contendo vitaminas e outros nutrientes essenciais durante este período.
[0084] Os separadores de células adequados que podem ser utilizados para separar a solução de permeado livre de células da suspensão contendo células dentro do caldo líquido de fermentação incluem, mas sem limitação, quaisquer dispositivos de filtração, dispositivos de filtração de fibra oca, dispositivos de filtração enrolados em espiral, dispositivos de ultrafiltração, dispositivos de filtração de cerâmica, dispositivos de filtração de fluxo cruzado, dispositivos de filtração com coluna de exclusão de tamanho ou combinações dos mesmos. Os filtros adequados que podem ser utilizados nos separadores de células do tipo filtro da invenção incluem, mas sem limitação, membranas/filtros enrolados em espiral, filtros de fluxo cruzado. Em adição, outro meio adequado de separação das células do permeado livre de células é através do uso de um ou mais dispositivos de centrifugação.
[0085] Em uma modalidade, o separador de células utilizado na etapa 130 funciona para separar células de bactérias dentro da suspensão contendo células e a solução de permeado livre de células e/ou concentrar a suspensão contendo células até ficar em uma concentração maior que a concentração de células dentro do caldo líquido de fermentação antes da separação das células pelo separador de células. Em uma modalidade alternativa, as células dentro do caldo líquido de fermentação podem ser separadas e concentradas através de várias passagens das mesmas pelo separador de células (por exemplo, através de várias passagens por um ou mais dispositivos de filtração do tipo filtro ou centrifugações por uma ou mais centrífugas várias vezes na mesma ou em velocidades de centrifugação diferentes).
[0086] Em uma modalidade preferida, após a separação das células, a concentração de células (ou densidade de células) dentro da suspensão contendo células é maior que a concentração de células do caldo líquido de fermentação. Em um aspecto da invenção, um ou mais dispositivos de filtração com filtros enrolados em espiral são utilizados para concentrar as células enviando o caldo líquido de fermentação através das várias passagens nos filtros enrolados em espiral.
[0087] Em outro aspecto, o reciclo de células é realizado e é geralmente referido como a separação de uma suspensão que contém células de bactéria de uma solução de permeado líquido livre de células e o retorno de todas ou de partes destas células de bactérias separadas para o recipiente de fermentação. Em uma modalidade, a ultrafiltração através de um separador de células, tal como um dispositivo de filtração, é utilizada para realizar a separação das células e/ou o reciclo das células.
[0088] Ainda em outro aspecto, durante o crescimento bacteriano no estado estacionário para as bactérias cultivadas dentro do recipiente de fermentação, uma purga de células proveniente do recipiente de fermentação é realizada para coletar células de bactérias em concentrações mais altas da suspensão contendo células ou biomassa microbiana semisseca. Em uma modalidade, uma purga de células requer uma quantidade de caldo líquido de fermentação contendo células de bactérias e outras substâncias encontradas em um meio de fermentação. Por exemplo, a purga de células pode ser uma fermentação ou um caldo líquido de fermentação removido do recipiente de fermentação durante a fermentação bacteriana. Em outra modalidade, a purga de células pode requerer a obtenção de uma suspensão concentrada contendo células através da remoção do líquido de fermentação em uma primeira concentração de células proveniente do recipiente de fermentação e a concentração adicional para se obter uma suspensão contendo células em uma segunda concentração de células. A suspensão contendo células tem uma densidade de células maior que a densidade de células do líquido de fermentação removido do recipiente de fermentação. Estas etapas possibilitam a remoção eficiente de certos particulados e permitem um alto rendimento do teor de proteínas no suplemento nutricional rico em proteínas final que é produzido partindo do método 100.
[0089] Em um aspecto, a purga de células ocorre durante uma fermentação bacteriana contínua. Em outro aspecto, a purga de células ocorre após a fermentação bacteriana, em que o processo de fermentação bacteriana é pausado ou interrompido para permitir a remoção da biomassa microbiana do recipiente de fermentação.
[0090] A seguir, a etapa 140 do método 100 inclui o fornecimento de um agente de ajuste do pH e a ruptura das membranas celulares das células bacterianas anaeróbias dentro da suspensão contendo células para gerar um homogenato a uma primeira taxa de recuperação de proteínas. O agente de ajuste do pH pode ser selecionado de um grupo que consiste de hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico, quaisquer agentes que possam ser utilizados para aumentar ou reduzir o valor de pH de uma solução e uma combinação dos mesmos.
[0091] Na etapa 140 do método 100, as células de bactérias contidas na suspensão contendo células são rompidas em um homogenato. Um dispositivo de ruptura pode ser utilizado para romper e/ou lisar as membranas celulares de células de bactérias dentro da suspensão contendo células. Exemplos do dispositivo de ruptura para a ruptura de células de bactérias incluem, mas sem limitação, vários tipos de dispositivos microfluídicos, dispositivos de sonicação, dispositivos ultrassônicos, dispositivos de rompimento mecânico, prensa francesa, freezers, aquecedores, trocadores de calor, colunas de destilação, qualquer dispositivo que aplica calor para causar uma alteração da temperatura, reatores à alta temperatura, homogeneizadores e combinações dos mesmos, dentre outros.
[0092] Como mostrado na Figura 1A, após as células de bactérias dentro da suspensão contendo células serem abertas e/ou rompidas, a mistura de células rompidas resultante, por exemplo, um homogenato, pode ser adicionalmente processada na etapa 150 através da separação de uma parte que contém proteínas de uma parte de restos celulares dentro do homogenato da biomassa microbiana e da purificação e da extração adicionais de partes que contêm proteínas adicionais para gerar um suplemento nutricional rico em proteínas. É considerado que esta separação é realizada através do uso de um ou mais fracionadores. Em um aspecto, uma ou mais partes que contêm proteínas são obtidas e a uma ou mais proteínas também podem incluir aminoácidos livres,
aminoácidos totais e peptídeos.
[0093] Na etapa 150, exemplos adequados do um ou mais fracionadores para o fracionamento do homogenato incluem, mas sem limitação, vários tipos de fracionadores sólido-líquido, dispositivos de centrifugação, centrífugas contínuas, centrífugas decantadoras, centrífugas de placas cônicas, dispositivos de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo de filtração de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de troca iônica, uma ou séries de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo, um dispositivo de ultrafiltração, uma ou séries de colunas de cromatografia por afinidade, uma ou séries de colunas de filtração em gel e combinações dos mesmos, dentre outros.
[0094] Em uma modalidade, na etapa 150, o homogenato obtido após a ruptura de células de bactérias por um ou mais dispositivos de ruptura é fornecido a um primeiro fracionador e uma primeira parte que contém proteínas e uma primeira parte de restos celulares contendo proteínas são obtidas. Em um aspecto, a primeira parte que contém proteínas tem um teor de proteínas de pelo menos 1% ou mais, 3% ou mais, 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais ou 95% ou mais.
[0095] Em uma modalidade, na etapa 160, a primeira parte que contém proteínas derivada do homogenato pode ser diretamente incorporada em composições de suplementos nutricionais ricos em proteínas, suplemento/composição de meio de crescimento celular, composições farmacêuticas e/ou uma ração para animais (por exemplo, ração para peixes, ração para camarão, ração para frango etc.). Esta incorporação pode requerer a secagem da primeira parte que contém proteínas em um teor de umidade baixo (por exemplo, formas de pasta ou pó) e a mistura direta da primeira parte que contém proteínas com outros ingredientes (por exemplo, nutrientes alimentícios para animais adicionais, recheios farmacêuticos, agente de mistura, plastificantes etc.) para a produção de um ou mais tipos de suplementos nutricionais. A etapa 160 descrita aqui pode incluir etapas de processamento adicionais de ajuste do pH da primeira parte que contém proteína, adição de um ou mais melhoradores de solubilidade, remoção de proteínas prejudiciais da primeira parte que contém proteínas e/ou combinações dos mesmos para aumentar e aprimorar a qualidade e a concentração da primeira parte que contém proteínas. Em adição, a primeira parte que contém proteínas pode sofrer ainda um processamento a jusante através da realização da extração e da purificação de proteína derivada da fermentação bacteriana e do reaproveitamento da mesma para uso como um suplemento nutricional rico em proteínas. Tais exemplos são mostrados nas Figuras 2A e 2B.
[0096] Alternativamente, na etapa 165, a primeira parte de restos celulares contendo proteínas derivada do homogenato pode ser diretamente incorporada nas composições de suplementos nutricionais ricos em proteínas, nas composições farmacêuticas, no suplemento/composição de meio de crescimento celular e/ou uma ração para animais (por exemplo, ração para peixes, ração para camarão, ração para frango etc.). Similarmente, as etapas de processamento adicionais de ajuste do pH da primeira parte de restos celulares contendo proteínas, adição de um ou mais melhoradores de solubilidade à parte de restos celulares contendo proteínas, remoção de proteínas prejudiciais da primeira parte de restos celulares contendo proteínas e/ou combinações das mesmas podem ser necessárias para aumentar e aprimorar a qualidade e a concentração da primeira parte de restos celulares contendo proteínas. Em um aspecto, se as proteínas solúveis da primeira parte de restos celulares contendo proteínas individualmente forem recuperadas, então as proteínas recuperadas podem ser obtidas e incorporadas diretamente como um suplemento rico em nutrientes para ingestão por animais ou para ingestão por seres humanos. Entretanto,
para que a primeira parte de restos celulares contendo proteínas seja incorporada em suplementos ricos em nutrientes de alta qualidade para ingestão por seres humanos, pode ser requerido um processamento a jusante adicional para purificar e recuperar nutrientes e o conteúdo de proteínas. Em outro aspecto, as proteínas insolúveis recuperadas neste método podem sofrer um processamento a jusante adicional e então ser combinadas com a primeira parte que contém proteínas e processadas na forma de um suplemento nutricional rico em proteínas.
[0097] A Figura 1B é um fluxograma de outro exemplo de um método 100 de produção de suplemento nutricional rico em proteínas partindo de um sistema de fermentação bacteriana. O método 100 de fermentação bacteriana de um substrato gasoso pode ser operado sob condições que favorecem a formação de compostos hidrocarbonetos, carboidratos, proteínas específicas, aminoácidos específicos e/ou outros componentes desejados, enquanto são mantidos os níveis dos produtos de fermentação desejados, tais como os níveis de produtividade de álcool.
[0098] A etapa 130 do método 100 inclui a separação das células das bactérias anaeróbias do líquido de fermentação em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células que contém células de bactérias anaeróbias em uma segunda concentração de células. Opcionalmente, a etapa 135 do método 100 inclui manter a suspensão contendo células em um segundo valor de pH em um primeiro tanque de retenção.
[0099] A etapa 140 do método 100 inclui a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células em um segundo valor de pH para gerar um homogenato por um dispositivo de ruptura. Opcionalmente, a etapa 145 do método 100 manter a suspensão contendo células após ser rompida em um segundo valor de pH em um primeiro tanque de retenção.
[00100] A etapa 150 do método 100 inclui o fracionamento do homogenato em uma primeira parte que contém proteínas e uma parte de restos celulares contendo proteínas utilizando um primeiro fracionador. A etapa 160 do método 100 inclui a obtenção da primeira parte que contém proteínas como um suplemento nutricional rico em proteínas. A etapa 165 do método 100 inclui a obtenção da parte de restos celulares contendo proteínas como um suplemento nutricional rico em proteínas.
[00101] A Figura 2A é um exemplo de um método 200A de processamento de uma suspensão contendo células que contém células de bactérias anaeróbias proveniente de um processo de fermentação (por exemplo, uma suspensão contendo células em uma segunda concentração proveniente da etapa 130 do método 100) para a obtenção de uma segunda parte que contém proteínas como um suplemento nutricional rico em proteínas. No método, há uma etapa de processamento opcional de tratamento da suspensão contendo células com um ou mais aditivos na etapa 202 antes da ruptura das membranas celulares das células aeróbias dentro da suspensão contendo células e da produção do homogenato.
[00102] No processo de pré-tratamento de células de etapa 202, a suspensão contendo células pode ser processada em uma câmara de pré- tratamento ou um tanque de retenção para o pré-tratamento e tratada com um ou mais aditivos para auxiliar e aumentar a eficiência de ruptura das células para romper as paredes celulares e as membranas celulares das células de bactérias anaeróbias na etapa 204. Em um aspecto, as células de bactérias concentradas entram em um tanque de retenção onde são mantidas até que o dispositivo de ruptura esteja pronto para que um volume de células maior seja processado junto. Em outro aspecto, durante o armazenamento no tanque de retenção, as células de bactérias podem sofrer um pré-tratamento na preparação para gerar um suplemento rico em proteínas com alto teor de proteínas e apropriado para consumo. Ainda em outro aspecto, um ou mais aditivos adicionados no processo de pré-tratamento na etapa 202 também podem ajudar a otimizar as condições para ruptura das células de bactérias na etapa 204 e gerar o homogenato em alta qualidade.
[00103] Os aditivos adequados para serem utilizados na etapa 202 incluem, mas sem limitação, detergentes, agentes de ajuste de pH, enzimas, nuclease, protease, hidrolases, tampão alcalino, tampão ácido ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, a etapa 202 do método 200A inclui a redução do teor de ácidos nucleicos da suspensão contendo células de células de bactérias derivadas da fermentação. Esse processo de pré-tratamento é realizado através do tratamento das células de bactérias com nucleases. Os exemplos de nucleases utilizadas incluem, mas sem limitação, desoxirribonucleases, ribonucleases, benzonases e nuclease. O tratamento com nuclease da suspensão contendo células pode ser adicionalmente auxiliado por hidrólise alcalina e extração química, tal como precipitação com sulfato de amônio, precipitação com etanol, precipitação com polietilenoimina. Em um aspecto, o teor de ácido nucleico da suspensão contendo células é reduzido para aproximadamente 1,5% a 5% ou aproximadamente 2% para 18%.
[00104] Na etapa 206, após a ruptura das células, o homogenato pode ser submetido a processos de extração e purificação adicionais, de forma que seja fracionado na primeira parte que contém proteínas e uma parte de restos celulares contendo proteínas utilizando um primeiro fracionador. Exemplo do primeiro fracionador para o fracionamento do homogenato inclui, mas sem limitação, vários tipos de fracionadores sólido-líquido, dispositivos de centrifugação, centrífugas contínuas, centrífugas decantadoras, centrífugas de placas cônicas, dispositivos de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo de filtração de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de troca iônica, uma ou séries de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo, um dispositivo de ultrafiltração, uma ou séries de colunas de cromatografia por afinidade, uma ou séries de colunas de filtração em gel e combinações dos mesmos, dentre outros.
[00105] Alternativamente, a suspensão contendo células de células de bactérias concentradas pode seguir diretamente para um dispositivo de ruptura na etapa 204 e estas são submetidas ao processo de pré- tratamento que é mencionado na etapa 202 para ajudar a otimizar as condições para a separação e o fracionamento do homogenato na etapa
206. Em outro aspecto, as proteínas recuperadas do método 200A podem sofrer um processamento a jusante adicional e então ser combinadas com a primeira parte que contém proteínas e processadas na forma de um suplemento nutricional rico em proteínas.
[00106] Na etapa 208, a primeira parte que contém proteínas é fornecida a um segundo fracionador e fracionada em uma segunda parte que contém proteínas utilizando o segundo fracionador na etapa 210. Exemplos do segundo fracionador para o fracionamento da parte que contém proteínas incluem, mas sem limitação, vários tipos de fracionadores sólido-líquido, dispositivos de centrifugação, centrífugas contínuas, centrífugas decantadoras, centrífugas de placas cônicas, dispositivos de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo de filtração de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de troca iônica, uma ou séries de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo, um dispositivo de ultrafiltração, uma ou séries de colunas de cromatografia por afinidade, uma ou séries de colunas de filtração em gel e combinações dos mesmos, dentre outros.
[00107] Na etapa 212, a segunda parte que contém proteínas obtida pode ser formulada em suplemento nutricional rico em proteínas, composições farmacêuticas, meio/composição para crescimento celular e/ou uma ração para animais (por exemplo, ração para peixes, ração para camarão, ração para frango etc.). Tal incorporação pode requerer a secagem da segunda parte que contém proteínas em um teor de umidade baixo (por exemplo, formas de pasta ou pó) e a mistura direta da segunda parte que contém proteínas com outros ingredientes (por exemplo, nutrientes alimentícios para animais adicionais, recheios farmacêuticos, agente de mistura, plastificantes etc.) para a produção de um ou mais tipos de suplementos nutricionais.
[00108] Como um exemplo, o homogenato da etapa 204 pode entrar em um dispositivo de filtração para produzir uma primeira parte que contém proteínas (por exemplo, a parte de filtrado que contém proteínas após a filtração pelo dispositivo de filtração). A parte que contém proteínas filtrada é um produto proteico parcialmente purificado. Em uma modalidade, a parte que contém proteínas filtrada é então centrifugada (por exemplo, por um segundo fracionador/centrífuga) para produzir frações de proteínas solúveis adicionais e partes sólidas de células. Estas segundas partes que contêm proteínas podem ser utilizadas individualmente ou em combinação como os suplementos nutricionais ricos em proteína.
[00109] Como outro exemplo, o homogenato da etapa 204 pode sofrer centrifugação, após a qual a parte de sobrenadante que contém proteína é coletada. A parte de sobrenadante que contém proteína entra em um dispositivo de filtração, em que uma segunda parte que contém proteínas filtrada é coletada. Ainda como outro exemplo, a primeira parte que contém proteínas entra apenas em um dispositivo de filtração, após o qual uma parte que contém proteínas filtrada é coletada e utilizada como um suplemento rico em proteínas. Ainda como outro exemplo, a primeira parte que contém proteínas apenas sofre centrifugação, após a qual um fracionado de proteínas ou uma parte de sobrenadante que contém proteína é coletada. A separação de uma ou mais partes que contêm proteínas e proteínas de restos celulares é realizada por um ou mais fracionadores.
[00110] Em um aspecto, é utilizado um sistema de fermentação que tem dois fracionadores. Em outra modalidade, é utilizado um sistema de fermentação que tem três fracionadores. A Figura 2B é um exemplo de um método 200B de processamento de uma suspensão contendo células proveniente de um processo de fermentação em que três fracionadores são utilizados para a obtenção de uma terceira parte que contém proteínas como um suplemento nutricional rico em proteínas de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00111] Como mostrado na Figura 2B, o método 200B inclui o fornecimento da segunda parte que contém proteínas para um terceiro fracionador na etapa 214 e uma terceira parte que contém proteínas é fracionada e extraída da segunda parte que contém proteínas na etapa
216. A terceira parte que contém proteínas é coletada na etapa 218 e a terceira parte que contém proteínas é coletada e obtida como um suplemento rico em proteínas na etapa 220.
[00112] Como um exemplo, a segunda parte que contém proteínas da etapa 210 pode ser fornecida para um terceiro fracionador (por exemplo, um dispositivo de filtração) para produzir uma parte que contém proteínas filtrada coletada e utilizada como um suplemento rico em proteínas. Como outro exemplo, a segunda parte que contém proteínas sofre centrifugação, após a qual a parte de sobrenadante que contém proteína e uma pelota da parte de restos celulares são coletadas. A parte de filtrado que contém proteínas é coletada do dispositivo de filtração e processada como o suplemento nutricional rico em proteínas com um teor de proteínas de em torno de 1% a 3%, 3% a 7%, 7% a 10%, em torno de 10% a 14%, em torno de 11% a 20%, em torno de 21% a 35% e em torno de 35% ou mais.
[00113] Em uma modalidade, uma ou mais partes que contêm proteínas obtidas de etapas 160, 165, 212, 220 são fornecidas para uma câmara de desidratação, após a qual uma parte que contém proteínas desidratada é coletada e processadas como um suplemento nutricional rico em proteínas. Alternativamente, há duas ou mais câmaras de desidratação, em que cada parte que contém proteínas proveniente de cada etapa é fornecida para uma câmara de desidratação individual separada. A câmara de desidratação recebe as partes que contêm proteínas e as seca em formas de pastas com baixo teor de umidade ou formas de pó seco, prontas para serem misturadas nos suplementos nutricionais ricos em proteínas para ingestão por seres humanos e/ou rações para animais. Exemplos adequados das câmaras de desidratação incluem, mas sem limitação, um secador de forno, uma câmara de secagem por spray, um secador de tambor e um secador por congelamento, um dispositivo de liofilização, um secador a vácuo e combinações dos mesmos.
[00114] Em uma modalidade, a presente invenção é um método de produção de suplemento nutricional rico em proteínas proveniente de um processo de fermentação utilizando bactérias anaeróbias. O método inclui a fermentação de um substrato gasoso com bactérias anaeróbias em um recipiente de fermentação, a obtenção partindo do recipiente de fermentação de uma quantidade de um líquido de fermentação contendo células das bactérias anaeróbias em uma primeira concentração, a separação das células das bactérias anaeróbias do líquido de fermentação em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células que contém células de bactérias anaeróbias em uma segunda concentração, a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células em um homogenato e a separação de uma primeira parte que contém proteínas de uma parte de restos celulares dentro do homogenato.
[00115] Em um aspecto, o método inclui a fermentação de um substrato gasoso com bactérias anaeróbias em um recipiente de fermentação. O substrato gasoso é um substrato gasoso que contém CO de um ou mais gases que escoam para o recipiente de fermentação. O um ou mais gases utilizados são selecionados do grupo que consiste de substratos de fonte de carbono, monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2), gás hidrogênio (H2), gás de síntese e combinações dos mesmos. As bactérias anaeróbias incluem, mas sem limitação, uma ou mais cepas de bactérias acetogênicas, tais como dos gêneros Clostridium, Acetobacterium e variantes similares das mesmas. O recipiente de fermentação fornece um ambiente que é favorável para a cultura de bactérias Clostridium, em que há um meio de fermentação que escoa para o recipiente de fermentação para fornecer nutrientes, vitaminas e outros minerais essenciais para as bactérias.
[00116] O método inclui ainda a obtenção partindo do recipiente de fermentação de uma quantidade de um líquido de fermentação contendo células das bactérias anaeróbias em uma primeira concentração de células. As coletas do líquido de fermentação podem ser enviadas para um ou mais dispositivos dentro do sistema de fermentação bacteriana. Em um aspecto, quantidades manipuladas subsequentes de líquido de fermentação estão em uma segunda, uma terceira e uma quarta concentrações de células. Na maioria dos aspectos, a segunda concentração de células de um líquido de fermentação manipulado é maior que a primeira concentração de células de um primeiro líquido de fermentação.
[00117] O método inclui ainda um primeiro separador de células que recebe uma quantidade de líquido de fermentação que contém células de bactérias anaeróbias. O primeiro separador de células separa o líquido de fermentação em uma primeira suspensão contendo células que contém células de bactérias anaeróbias e uma primeira solução de permeado livre de células. O líquido de fermentação fornecido para o primeiro separador de células tem uma primeira concentração de células. A primeira suspensão contendo células gerada pelo primeiro separador de células tem uma segunda concentração de células. A segunda concentração de células da primeira suspensão contendo células é maior que a primeira concentração de células do líquido de fermentação. A primeira solução de permeado livre de células é enviada para uma câmara de processamento conectada ao primeiro separador de células. Em alguns aspectos, parte da primeira suspensão contendo células é enviada de volta para o recipiente de fermentação.
[00118] Em outro aspecto, um primeiro fluxo do primeiro líquido de fermentação é enviado para um primeiro separador de células para processamento adicional para produção de etanol. Um segundo fluxo do segundo líquido de fermentação é enviado para um segundo separador de células para processamento adicional para a produção de um produto que contém proteínas que pode ser utilizado como um suplemento nutricional rico em proteínas.
[00119] O método da presente invenção fornece uma abordagem simultânea de geração de uma alta produtividade de produção de etanol, enquanto reaproveita grupamentos úteis encontrados dentro das células de bactérias utilizadas no processo de fermentação. O líquido de fermentação coletado está em uma primeira concentração de células de bactérias anaeróbias. O separador de células gera uma suspensão contendo células em uma segunda concentração de células anaeróbias. Em uma modalidade, o separador de células envia a suspensão contendo células em uma segunda concentração para um dispositivo de ruptura. Em outra modalidade, o separador de células envia a suspensão contendo células para um tanque de retenção.
[00120] Assim que é feita uma coleta, a coleta pode ser adicionalmente processada para separar as células das bactérias anaeróbias do líquido de fermentação em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias em uma segunda concentração. A segunda concentração da suspensão contendo células é maior que a primeira concentração de líquido de fermentação contendo células de bactérias anaeróbias. A solução de permeado livre de células é enviada de volta para uma câmara de processamento que destila o etanol para produção de etanol. Isto fornece um sistema eficiente que não descarta solução de permeado livre de células ainda útil contendo etanol.
[00121] O método inclui ainda a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células em um homogenato. Em um aspecto, esta ocorre em um dispositivo de ruptura. A suspensão contendo células que contém células de bactérias anaeróbias entra no dispositivo de ruptura, no qual a suspensão contendo células é submetida a altas forças (por exemplo,
mecânicas, sonoras ou de pressão). A alta força de cisalhamento rompe as membranas celulares das células, fazendo com que as células se abram e que o conteúdo das células flutue livremente à medida que entram na suspensão contendo células. O dispositivo de ruptura gera um homogenato que pode ser adicionalmente processado para a obtenção de uma primeira parte que contém proteína. O homogenato contém vários grupamentos geralmente encontrados nas células de bactérias derivadas da fermentação, incluindo proteínas, metais (por exemplo, Ca, Cl, Co, K Mg, Ni, P, S, Se, W, Zn, Na, Fe), lipídeos, ácidos nucleicos e açúcares.
[00122] Para a obtenção de uma primeira parte que contém proteína, o método inclui ainda a separação de uma primeira parte que contém proteínas de uma parte de restos celulares dentro do homogenato. Em um aspecto, o homogenato é centrifugado e então filtrado, para produzir uma primeira parte que contém proteína. A primeira parte que contém proteínas é fornecida para um primeiro fracionador, que separa uma segunda parte que contém proteínas da primeira parte que contém proteínas e permite a coleta de uma segunda parte que contém proteínas proveniente do primeiro fracionador.
[00123] Em um aspecto, o método inclui a desidratação da primeira parte que contém proteínas separada da parte de restos celulares do homogenato. Neste aspecto, o sistema tem uma câmara de desidratação conectada a um primeiro fracionador. O primeiro fracionador fornece a primeira parte que contém proteínas para a câmara de desidratação, em que a câmara de desidratação gera uma parte que contém proteínas secas produzida na forma de um suplemento nutricional rico em proteínas.
[00124] Em outro aspecto, o método inclui a desidratação da parte de restos celulares do homogenato. Neste aspecto, o dispositivo de ruptura fornece a parte de restos celulares para uma câmara de desidratação, que será preparada para um processamento a jusante adicional. A parte de restos celulares é uma fração insolúvel que contém um alto nível do teor de proteínas. Tipicamente, esta inclui componentes da parede celular ou da membrana celular que são insolúveis. Pode conter ainda pequenas concentrações de agregados de ácido nucleico ou de proteínas. Na maioria dos aspectos, a maioria do ácido nucleico é liberada dentro da primeira parte que contém proteína. Algumas vezes é difícil solubilizar estes agregados de proteínas e permanecerão na parte de restos celulares. As determinações do teor de proteínas na primeira parte que contém proteínas e na parte de restos celulares se baseiam em uma suposição de equilíbrio de massa em torno da massa total de células e das quantidades de proteínas, solúveis e insolúveis. Com a finalidade de exemplo, um cálculo de recuperação das proteínas insolúveis inclui a subtração da massa da proteína solúvel da massa total de células para produzir uma aproximação da massa insolúvel.
[00125] II. Sistemas de Fermentação Bacteriana para o Processamento de uma Biomassa Acetogênica para Produzir uma Proteína Derivada da Fermentação
[00126] O sistema de fermentação bacteriana inclui, mas sem limitação, uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao sistema, um recipiente de fermentação bacteriana, um ou mais dispositivos de ruptura, um ou mais separadores de células e um ou mais fracionadores. Em adição, uma ou mais câmaras de desidratação são conectadas ao um ou mais dispositivos de ruptura e/ou o um ou mais fracionadores para aumentar a concentração de proteínas das partes que contêm as proteínas obtidas e reduzir seu teor de umidade. Opcionalmente, o sistema de fermentação bacteriana inclui ainda um ou mais tanques de retenção, câmaras de armazenamento e/ou câmaras de pré-tratamento para armazenar células de bactérias ou suspensões contendo células.
[00127] As Figuras 3A-3B, 4A-4H, 5A-5E e 6 ilustram estes exemplos de sistemas de fermentação bacteriana para produção de uma suspensão contendo células e um ou mais compostos hidrocarbonetos oxigenados provenientes de um processo de fermentação utilizando uma cultura de bactérias anaeróbias. A Figura 3A é um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 300A para produção de uma suspensão contendo células e um ou mais compostos hidrocarbonetos oxigenados, no qual são utilizados dois separadores de células e uma câmara de desidratação.
[00128] Na Figura 3A, o sistema de fermentação bacteriana 300A inclui um recipiente de fermentação 310, um separador de células 320, um separador de células 330, uma câmara de processamento 350 e opcionalmente, uma câmara de desidratação 375. O sistema de fermentação bacteriana 300A pode ser, em uma modalidade, um sistema de fermentação bacteriana contínua. Alternativamente, o sistema de fermentação bacteriana 300A pode ser, um sistema de fermentação bacteriana em batelada.
[00129] Duas ou mais tubulações de entrada, por exemplo, uma tubulação de entrada 302 e uma tubulação de entrada 304, são conectadas ao recipiente de fermentação 310. A tubulação de entrada 302 pode ser utilizada para o fornecimento de substratos gasosos, suplementos adicionais e/ou outros substratos sólidos ou líquidos para o recipiente de fermentação 310. A tubulação de entrada 304 pode ser utilizada para o fornecimento de um meio de fermentação ou outro meio de cultura para o recipiente de fermentação 310. A conversão dos substratos gasosos e do meio de fermentação ocorre no recipiente de fermentação 310. O meio de fermentação utilizado aqui inclui meios de crescimento de bactérias convencionais contendo vitaminas, sais e minerais suficientes para permitir o crescimento de bactérias anaeróbias selecionadas. As vitaminas na forma de um coquetel de vitaminas são adicionadas ao meio de fermentação. As vitaminas incluem várias da família da vitamina B, incluindo, mas sem limitação, tiamina (B1), ácido pantotênico (B5), biotina (B7), outros aminoácidos e combinações dos mesmos.
[00130] Dentro do recipiente de fermentação 310, os substratos gasosos e o meio de fermentação são fermentados pelas bactérias anaeróbias contidas dentro do recipiente de fermentação 310 em um caldo líquido de fermentação, contendo células das bactérias anaeróbias em uma primeira concentração. O gás do reator é então liberado do sistema de fermentação bacteriana 300A pela tubulação de saída 314. O recipiente de fermentação 310 fornece um ambiente para fermentar o substrato gasoso com bactérias anaeróbias. Em um aspecto, o substrato gasoso é um ou mais gases que consistem de substratos de fonte de carbono, monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2), gás hidrogênio (H2) e gás de síntese, enquanto que as bactérias anaeróbias são uma ou mais bactérias anaeróbias selecionadas dos gêneros Clostridium, Acetobacterium e variantes das mesmas.
[00131] O recipiente de fermentação 310 pode incluir três ou mais tubulações de saída, por exemplo, uma tubulação de saída 314, uma tubulação de saída 316 e uma tubulação de saída 312. A tubulação de saída 314 pode ser utilizada para o fornecimento de gases, gases de ventilação, gases extras que serão eliminados por exaustão do recipiente de fermentação 310. A tubulação de saída 312 pode ser utilizada para o fornecimento de uma parte do caldo líquido de fermentação para fora do sistema de fermentação bacteriana 300A para o separador de células 320. A tubulação de saída 316 pode ser utilizada para o fornecimento de uma parte do caldo líquido de fermentação para fora do sistema de fermentação bacteriana 300A para o separador de células 330. Partes do caldo líquido de fermentação proveniente do recipiente de fermentação 310 são fornecidas e abastecidas no separador de células 320 e no separador de células 330, cada uma pela tubulação de saída 312 e pela tubulação de saída 316, respectivamente. Dentro de cada um do separador de células 320 e do separador de células 330, as células das bactérias anaeróbias contidas no caldo líquido de fermentação (contendo células de bactérias em uma primeira concentração) são separadas em uma solução de permeado livre de células e uma solução de retentato (por exemplo, uma suspensão contendo células que contém bactérias anaeróbias células em uma segunda concentração).
[00132] Uma tubulação de saída 322 e uma saída 332 são utilizadas para fornecer soluções de permeado livre de células para fora separador de células 320 e um separador de células 330, respectivamente e para dentro da câmara de processamento 350. Dentro da câmara de processamento 350, a solução de permeado livre de células é processada em um composto hidrocarboneto oxigenado. A câmara de processamento 350 também pode reciclar o conteúdo aquoso de destilação, incluindo água, de volta para o recipiente de fermentação 310 através de uma tubulação de saída 354. Em um exemplo, o destilado pode incluir principalmente água e também pode conter outro conteúdo. Por exemplo, um fluxo aquoso de destilação geral contém 95% de água, aproximadamente 5% de ácido acético e algum outro conteúdo. Então, a câmara de processamento 350 envia para fora um produto final de um composto hidrocarboneto oxigenado através de uma tubulação de saída 352 para um processamento a jusante adicional. Em uma modalidade, a câmara de processamento 350 é uma câmara de destilação na qual a solução de permeado livre de células é processada e destilada no composto hidrocarboneto oxigenado de alta qualidade (por exemplo, alta concentração e/ou forma anidra de etanol, butanol, tal como 95% p/p ou concentração superior de etanol etc.).
[00133] A suspensão contendo células obtida após a passagem através do separador de células 320 pode ser fornecida através de uma tubulação de saída 324 de volta para o recipiente de fermentação 310 para o reciclo de células de forma que as células dentro da suspensão contendo células possam sofrer ainda um processo de fermentação. Por outro lado, a suspensão contendo células obtida após a passagem através do separador de células 330 pode ser concentrada pelo separador de células 330 e fornecida através de uma tubulação de saída 336 para a câmara de desidratação 375 para ser rompida em uma mistura e seca. A câmara de desidratação 375 pode ser um secador de forno, um secador com pá, um dispositivo de secagem por spray, um secador de tambor, um dispositivo de liofilização e combinações dos mesmos. Uma parte da suspensão contendo células, que contém células de bactérias anaeróbias,
no separador de células 330 é então fornecida de volta para o recipiente de fermentação 310 através de uma tubulação de saída 334 para processo de fermentação adicional.
[00134] Um exemplo de processamento da suspensão contendo células em um suplemento rico em proteínas é submeter a suspensão contendo células a uma temperatura alta de aproximadamente 100 graus Celsius ou mais (por exemplo, a 250 graus Celsius ou mais) dentro de uma câmara de processamento de alta temperatura, por exemplo, a câmara de desidratação de secagem por spray, para romper as células e reduzir o teor de umidade da suspensão contendo células em formas de pasta ou pó. Outro exemplo de processamento da suspensão contendo células é submeter a suspensão contendo células a uma temperatura de aproximadamente 0 grau Celsius ou menor dentro de uma câmara de processamento de baixa temperatura.
[00135] Uma tubulação de saída 376 é conectada à câmara de desidratação 375 para fornecer a forma rompida e desidratada da suspensão contendo células para fora da câmara de desidratação 375 para ficar pronta para mistura nas composições de suplementos ricos em proteínas. Após o processo de desidratação ser realizado na câmara de desidratação 375, o suplemento nutricional rico em proteínas é obtido e coletado do sistema de fermentação bacteriana 300A através da tubulação de saída 376.
[00136] A Figura 3B é um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 300B para produção de uma suspensão contendo células e um ou mais compostos hidrocarbonetos oxigenados, em que dois separadores de células, um tanque de retenção e uma câmara de desidratação são utilizados. Na Figura 3B, o sistema de fermentação bacteriana 300B inclui o recipiente de fermentação 310 conectado à tubulação de entrada 302, à tubulação de entrada 304 e várias tubulações de saída, o separador de células 320 conectado à tubulação de saída 312, à tubulação de saída 322 e à tubulação de saída 324, o separador de células 330 conectado à tubulação de saída 316 e à tubulação de saída 336 e a câmara de desidratação 375 conectada às tubulações de saída 336 e à tubulação de saída 376, como discutido anteriormente.
[00137] Em adição, o sistema de fermentação bacteriana 300B inclui ainda um tanque de retenção ou um tanque de armazenamento para manter e armazenar as partes das soluções de permeado livre de células. Por exemplo, um tanque de retenção 340 (por exemplo, um tanque de retenção do permeado livre de células) é conectado ao separador de células 320 e ao separador de células 330 através da tubulação de saída 322 e uma tubulação de saída 332, respectivamente. As soluções de permeado livre de células obtidas após a separação das células pelo separador de células 320 e o separador de células 330 podem sofrer um pré-tratamento ou armazenamento em grande quantidade na preparação para o processamento das soluções de permeado livre de células que são mantidas no tanque de retenção 340 em um produto final na forma de alta qualidade de um composto hidrocarboneto oxigenado. Em uma modalidade, a solução de permeado livre de células é adicionalmente processada para produção de etanol dentro de uma câmara de processamento 350 que é fornecida do tanque de retenção 340 através de uma tubulação de saída 342. Depois disso, os produtos finais processados de compostos hidrocarbonetos oxigenados são fornecidos para fora da câmara de processamento 350 através da tubulação de saída 352 e água, ácido acético, nutrientes e outros materiais produzidos partindo da câmara de processamento 350 podem ser reciclados de volta para o recipiente de fermentação 310 através de uma tubulação de saída
354.
[00138] A Figura 4A mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400A com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste de pH ao processo de fermentação, um recipiente de fermentação, um separador de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, um fracionador e duas câmaras de desidratação para um processo de fermentação utilizando uma cultura de bactérias anaeróbias de acordo com uma ou mais modalidades da invenção e de obtenção de um suplemento nutricional rico em proteínas partindo da fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 400A inclui uma tubulação de entrada 402, uma tubulação de entrada 404, uma tubulação de entrada 406A, uma tubulação de entrada 406B, uma tubulação de entrada 406C, um recipiente de fermentação 410, uma tubulação de saída 412, uma tubulação de saída 414, um separador de células 420, uma tubulação de saída 422, uma tubulação de saída 424, uma câmara de processamento 450, uma tubulação de saída 452, uma tubulação de saída 454, um dispositivo de ruptura 460, uma tubulação de saída 462, um fracionador 470 uma tubulação de saída 472, uma tubulação de saída 474, uma câmara de desidratação 475A, uma câmara de desidratação 475B, uma tubulação de saída 476A e uma tubulação de saída 476B.
[00139] O sistema de fermentação bacteriana 400A pode ser, em uma modalidade, um sistema de fermentação bacteriana contínua. Em primeiro lugar, um fluxo de meio de fermentação é fornecido para o sistema de fermentação bacteriana 400A pela tubulação de entrada 402. A seguir, um fluxo de substratos gasosos é fornecido para o sistema de fermentação bacteriana 400A pela tubulação de entrada 404. O fluxo de substratos gasosos e o meio de fermentação então entram no recipiente de fermentação 410 que cultiva as bactérias anaeróbias. O recipiente de fermentação 410 fornece um ambiente para fermentar o substrato gasoso com bactérias anaeróbias. A conversão dos substratos gasosos e do meio de fermentação ocorre no recipiente de fermentação 410. Dentro do recipiente de fermentação 410, os substratos gasosos e o meio de fermentação são fermentados facilitados pelas bactérias anaeróbias contidas dentro do recipiente de fermentação em um caldo líquido de fermentação, contendo células das bactérias anaeróbias em uma primeira concentração. Os gases reagentes não reagidos são então liberados e eliminados por exaustão do recipiente de bactérias 410 pela tubulação de saída 414.
[00140] Ainda, o caldo líquido de fermentação é fornecido e abastecido no separador de células 420 através da tubulação de saída
412. Dentro do separador de células 420, as células das bactérias anaeróbias contidas no caldo líquido de fermentação são separadas em uma solução de permeado livre de células e células de bactérias anaeróbias contendo células em uma segunda concentração. A solução de permeado livre de células no separador de células 420 é então fornecida para a câmara de processamento 450 através da tubulação de saída 422. Uma quantidade da suspensão contendo células, contendo células de bactérias anaeróbias, no separador de células 420 é então fornecida de volta para o recipiente de fermentação 410 através da tubulação de saída 424 para sofrer processo de fermentação adicional. Outra quantidade da suspensão contendo células, contendo células de bactérias anaeróbias, no separador de células 420 é fornecida através da tubulação de saída 426 para o dispositivo de ruptura 460.
[00141] Em uma modalidade, o sistema de fermentação 400A inclui ainda uma tubulação de entrada 406A conectada à tubulação de saída 426 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH da suspensão contendo células, que contém células de bactérias anaeróbias fornecidas para fora do separador de células 420. O tratamento das células com agentes de ajuste do pH torna a membrana celular mais maleável para o rompimento mecânico das células de bactérias. Este ajuste do pH pode ocorrer antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Alternativamente, o ajuste do pH pode ocorrer quando a suspensão contendo células entra no dispositivo de ruptura 460. Alternativamente, o ajuste do pH pode ocorrer após a suspensão contendo células ser rompida pelo dispositivo de ruptura 460 e um homogenato contendo as células bacterianas anaeróbias é tratado com um ou mais agentes de ajuste do pH.
[00142] Em uma modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor maior que o valor de pH do líquido do caldo de fermentação antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em uma modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para 5 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para 6 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para 7 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para 8 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para 9 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para 10 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para 11 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para 12 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para qualquer valor entre 5 e 12 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460.
[00143] Dentro da câmara de processamento 450, a solução de permeado livre de células é processada em um composto hidrocarboneto oxigenado. A câmara de processamento 450 também recicla a água de volta para o recipiente de fermentação 410 através da tubulação de saída
454. No total, a câmara de processamento 450 envia para fora 95% de etanol através da tubulação de saída 452 para um processamento a jusante adicional.
[00144] Dentro do dispositivo de ruptura 460, as membranas celulares das células de bactérias anaeróbias contidas dentro da suspensão contendo células são rompidas para gerar um homogenato. O homogenato é enviado para o fracionador 470 através da tubulação de saída 462. Em um aspecto, a tubulação de saída 474 é conectada ao fracionador 470 que fornece uma primeira parte que contém proteínas que será processada como o suplemento nutricional rico em proteínas. A tubulação de saída 472 é conectada ao fracionador 470 que permite que uma parte de restos celulares escoe para dentro de outro equipamento para um processamento a jusante adicional. Em outro aspecto, uma ou mais das frações que contêm proteínas após um ou mais fracionadores para remover contaminantes indesejados e restos celulares são adicionadas de volta juntas e processadas na forma de um suplemento nutricional rico em proteínas.
[00145] Um exemplo de dispositivo de ruptura que pode ser utilizado aqui inclui, mas sem limitação, um dispositivo microfluídico, um dispositivo de sonicação, um dispositivo ultrassônico, um dispositivo de rompimento mecânico, uma prensa francesa, um freezer, um aquecedor, um dispositivo de pasteurização, um trocador de calor, uma coluna de destilação, um dispositivo que aumenta a temperatura dos fluxos do processo e tanques de retenção, um dispositivo de esterilização com UV, um dispositivo de esterilização com raios gama, um reator, um homogeneizador e combinações dos mesmos.
[00146] Um exemplo do dispositivo de ruptura 460 é um dispositivo que causa uma alteração irreversível na estrutura das membranas celulares e paredes celulares de micro-organismos bacterianos para permitir a manipulação adicional do conteúdo das células de bactérias. O conteúdo das células de bactérias inclui ácidos nucleicos, proteínas, glicogênio, pigmentos, gotículas lipídicas, cristais e outros nutrientes, tais como formas diferentes de carbono, nitrogênio, enxofre, cálcio etc.
[00147] Em um aspecto, o dispositivo de ruptura 460 abre as células através do rompimento das membranas celulares de células de bactérias anaeróbias pelo uso de alta força. Forças de cisalhamento altas são aplicadas às células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células, tal como através de meios sonoros, de pressão ou mecânicos. Na presente invenção, o método inclui enviar para um dispositivo de ruptura 460 uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias em uma segunda concentração. O dispositivo de ruptura 460 abre as células através do rompimento das membranas celulares das células com um força alta (por exemplo, mecânica, sonora, de pressão) e gerando um homogenato, onde há melhor acessibilidade aos grupamentos úteis dentro das células de bactérias, por exemplo, proteína, devido ao estado rompido das células de bactérias. Alternativamente, o método inclui o fornecimento do homogenato para um segundo dispositivo de ruptura antes do homogenato ser fornecido para um primeiro fracionador. O segundo dispositivo de ruptura rompe adicionalmente as células do homogenato, após o que o suplemento nutricional rico em proteínas é produzido.
[00148] Como um exemplo, o dispositivo de ruptura 460 é um dispositivo microfluídico. O dispositivo microfluídico inclui, mas sem limitação, câmaras de reação, tubos, bombas, canos com flanges, anéis, gaxetas, válvulas de verificação de alta pressão. A câmara de reação do dispositivo microfluídico pode ser uma câmara de reação de cerâmica, uma câmara resistente à abrasão, uma câmara de reação com bobina, que tem uma fenda, várias fendas e tem microcanais.
[00149] Como outro exemplo, o dispositivo de ruptura 460 é um dispositivo de tratamento enzimático. Ainda como outro exemplo, o dispositivo de ruptura é um dispositivo ultrassônico. O dispositivo ultrassônico é uma sonda ultrassônica ou um banho ultrassônico. O dispositivo ultrassônico cisalha as células através do uso de ondas sonoras de alta frequência para agitar e romper as células. Ainda como outro exemplo, o dispositivo de ruptura é um dispositivo de congelamento. O dispositivo de congelamento tem um ciclo de congelamento e descongelamento, em que as células de bactérias passam por várias rodadas do ciclo de congelamento e descongelamento, em que as células são congeladas e então descongeladas em um tampão. Ainda como outro exemplo, o dispositivo de ruptura é um dispositivo de ruptura mecânica. O dispositivo de ruptura mecânica inclui lâminas ou esferas mecânicas para romper as paredes celulares e/ou as membranas celulares das células de bactérias.
[00150] Em outra modalidade alternativa, o sistema de fermentação 400A inclui ainda uma tubulação de entrada 406B conectada ao dispositivo de ruptura 460 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH das células de bactérias anaeróbias dentro do dispositivo de ruptura 460. Em uma modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor maior que o valor de pH do líquido do caldo de fermentação antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para qualquer valor entre 5 e 12 dentro do dispositivo de ruptura 460.
[00151] Em outra modalidade alternativa, o sistema de fermentação 400A inclui ainda uma tubulação de entrada 406C conectada à tubulação de saída 462 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH do homogenato rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para um valor maior que o valor de pH do líquido do caldo de fermentação antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para 5 antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para 6 antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para 7 antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para 8 antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para 9 antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para 10 antes do homogenato entrar no fracionador
470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para 11 antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para 12 antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para qualquer valor entre 5 e 12 antes do homogenato entrar no fracionador 470.
[00152] Os agentes de ajuste do pH que podem ser fornecidos ao sistema através das tubulações de entrada 406A, 406B e 406C incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e quaisquer agentes que possam ser utilizados para aumentar ou reduzir o valor de pH de uma solução.
[00153] Dentro do fracionador 470, o homogenato é então fracionado em uma primeira parte que contém proteínas e uma parte de restos celulares contendo proteínas. A seguir, a primeira parte de restos celulares contendo proteínas é fornecida para a câmara de desidratação 475A através da tubulação de saída 472. Então, a primeira parte que contém proteínas é fornecida para a câmara de desidratação 475B através da tubulação de saída 474. Exemplos de fracionadores incluem, mas sem limitação, vários tipos de fracionadores sólido-líquido, dispositivos de centrifugação, centrífugas contínuas, centrífugas decantadoras, centrífugas de placas cônicas, dispositivos de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo de filtração de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de troca iônica, uma ou séries de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo, um dispositivo de ultrafiltração, uma ou séries de colunas de cromatografia por afinidade, uma ou séries de colunas de filtração em gel e combinações dos mesmos.
[00154] Após o processo de desidratação ocorrer na câmara de desidratação 475A e na câmara de desidratação 475B, o suplemento nutricional rico em proteínas pode ser obtido e coletado através de ambas as tubulações de saída 476A e 476B, cada uma da câmara de desidratação 475A e da câmara de desidratação 475B, respectivamente.
[00155] A Figura 4B mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400B com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, dois separadores de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 400B inclui a tubulação de entrada 402, a tubulação de entrada 404, uma tubulação de entrada 406A, uma tubulação de entrada 406B, uma tubulação de entrada 406C, o recipiente de fermentação 410, a tubulação de saída 412, a tubulação de saída 414, uma tubulação de saída 416, um separador de células 420, a tubulação de saída 422, a tubulação de saída 424, a tubulação de saída 426, um separador de células 430, uma tubulação de saída 432, uma tubulação de saída 434, uma tubulação de saída 436, a câmara de processamento 450, a tubulação de saída 452, a tubulação de saída 454, o dispositivo de ruptura 460, a tubulação de saída 462, um fracionador 470, a tubulação de saída 472, a tubulação de saída 474, a câmara de desidratação 475, a tubulação de saída 476, um fracionador 480, uma tubulação de saída 482, uma tubulação de saída 484, uma câmara de desidratação 485A, uma tubulação de saída 486A, uma câmara de desidratação 485B e uma tubulação de saída 486B.
[00156] Em um aspecto, o separador de células 430 é um concentrador de células. Para a presente invenção, o método inclui a coleta do recipiente de fermentação de uma quantidade de um caldo líquido de fermentação contendo as células das bactérias anaeróbias em uma primeira concentração. Esta coleta é fornecida através da tubulação de saída 416 que conecta o recipiente de fermentação 410 ao separador de células 430. No separador de células 430, o caldo líquido de fermentação é separado em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias em uma primeira concentração e concentrado em uma segunda concentração (por exemplo, com uma alta concentração de células, maior que a primeira concentração do caldo líquido de fermentação). A solução de permeado livre de células é enviada para a câmara de processamento 450 através da tubulação de saída 432 que conecta a câmara de processamento 450 e o separador de células 430. A suspensão contendo células que contém as células na segunda concentração é enviada para o dispositivo de ruptura 460 através da tubulação de saída 436 que conecta o dispositivo de ruptura 460 ao separador de células 430.
[00157] Em uma modalidade, o sistema de fermentação 400B inclui ainda uma tubulação de entrada 406A conectada à tubulação de saída 436 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH da suspensão contendo células, que contém células de bactérias anaeróbias fornecidas para fora do separador de células 430. O tratamento das células com agentes de ajuste do pH torna a membrana celular mais maleável para o rompimento mecânico das células de bactérias. Este ajuste do pH pode ocorrer antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Alternativamente, o ajuste do pH pode ocorrer enquanto a suspensão contendo células entra no dispositivo de ruptura 460. Alternativamente, o ajuste do pH pode ocorrer após a suspensão contendo células ser rompida pelo dispositivo de ruptura 460 e um homogenato contendo as células bacterianas anaeróbias é tratado com um ou mais agentes de ajuste do pH.
[00158] Em uma modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor maior que o valor de pH do líquido do caldo de fermentação antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para qualquer valor entre 5 e 12 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460.
[00159] Em outra modalidade alternativa, o sistema de fermentação 400B inclui ainda uma tubulação de entrada 406B conectada ao dispositivo de ruptura 460 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH das células de bactérias anaeróbias dentro do dispositivo de ruptura 460. Em uma modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor maior que o valor de pH do líquido do caldo de fermentação antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, dentro do dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para qualquer valor entre 5 e 12 dentro do dispositivo de ruptura 460.
[00160] Em um aspecto, após ser processado pelo dispositivo de ruptura 460, o homogenato é fornecido para o fracionador 470 para separar em uma parte que contém proteínas e uma parte de restos celulares. O fracionador 470 é conectado ao dispositivo de ruptura 460 através da tubulação de saída 462. O fracionador 470 tem pelo menos duas tubulações de saída, em que a tubulação de saída 472 é utilizada para fornecer a parte de restos celulares e a segunda tubulação de saída 474 é utilizada para fornecer a parte que contém proteína.
[00161] Em outra modalidade alternativa, o sistema de fermentação 400B inclui ainda uma tubulação de entrada 406C conectada à tubulação de saída 462 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH do homogenato rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias. Em uma modalidade, o valor de pH do homogenato pode ser ajustado para um valor maior que o valor de pH do líquido do caldo de fermentação antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato pode ser ajustado para um valor, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, antes do homogenato entrar no fracionador 470. Em outra modalidade, o valor de pH do homogenato após ser rompido partindo da solução contendo células que contém as células bacterianas anaeróbias pode ser ajustado para qualquer valor entre 5 e 12 antes do homogenato entrar no fracionador 470.
[00162] Os agentes de ajuste do pH que podem ser fornecidos ao sistema através das tubulações de entrada 406A, 406B e 406C incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio,
bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e quaisquer agentes que poderiam ser ajustados para aumentar ou reduzir o valor de pH de uma solução.
[00163] Em um aspecto, a primeira parte que contém proteínas é fornecida para um fracionador 480 para separar adicionalmente uma segunda parte que contém proteínas da primeira parte que contém proteína. O fracionador 480 é conectado ao fracionador 470 através de uma saída 474. O fracionador 480 tem pelo menos duas saídas, em que partindo de uma primeira saída 482 escoam os restos celulares e de uma segunda saída 484 escoa uma segunda parte que contém proteína. O método inclui ainda a coleta da segunda parte que contém proteínas do segundo fracionador. Ainda em outro aspecto, há dois ou mais fracionadores. Ainda em outro aspecto, há apenas um fracionador dentro do sistema de fermentação bacteriana utilizado para a presente invenção, do qual uma primeira parte que contém proteínas é coletada. Exemplos de fracionadores incluem, mas sem limitação, vários tipos de fracionadores sólido-líquido, dispositivos de centrifugação, centrífugas contínuas, centrífugas decantadoras, centrífugas de placas cônicas, dispositivos de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo de filtração de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de troca iônica, uma ou séries de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo, um dispositivo de ultrafiltração, uma ou séries de colunas de cromatografia por afinidade, uma ou séries de colunas de filtração em gel e combinações dos mesmos.
[00164] A Figura 4C mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400C com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, um separador de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, um fracionador e duas câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 400C inclui uma tubulação de entrada 402, uma tubulação de entrada 404, uma tubulação de entrada 406A, uma tubulação de entrada 406B, uma tubulação de entrada 406C, um recipiente de fermentação 410, uma tubulação de saída 412, uma tubulação de saída 414, um separador de células 420, uma tubulação de saída 422, uma tubulação de saída 424, uma tubulação de saída 426, um tanque de retenção livre de células 440, uma tubulação de saída 442, uma tubulação de saída 444, uma câmara de processamento 450, uma tubulação de saída 452, uma tubulação de saída 454, um dispositivo de ruptura 460, um tubulação de saída 462, um fracionador 470, uma tubulação de saída 472, uma tubulação de saída 474, uma câmara de desidratação 475A, uma tubulação de saída 476A, uma câmara de desidratação 475B e uma tubulação de saída 476B.
[00165] A Figura 4D mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400D com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, um separador de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 400D inclui uma tubulação de entrada 402, uma tubulação de entrada 404 uma tubulação de entrada 406A, uma tubulação de entrada 406B, uma tubulação de entrada 406C, um recipiente de fermentação 410, uma tubulação de saída 412, uma tubulação de saída 414, o separador de células 420, uma tubulação de saída 422, uma tubulação de saída 424, uma tubulação de saída 426, o tanque de retenção livre de células 440, uma tubulação de saída 442, uma tubulação de saída 444, a câmara de processamento 450, uma tubulação de saída 452, uma tubulação de saída 454, um dispositivo de ruptura 460, uma tubulação de saída 462, um fracionador 470, uma tubulação de saída 472, uma tubulação de saída 474, uma câmara de desidratação 475, uma tubulação de saída 476, um fracionador 480, uma tubulação de saída 482, uma tubulação de saída 484, uma câmara de desidratação 485A, uma tubulação de saída 486A, um câmara de desidratação 485B e uma tubulação de saída 486B.
[00166] A Figura 4E mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400E com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, dois separadores de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 400E inclui uma tubulação de entrada 402, uma tubulação de entrada 404, uma tubulação de entrada 406A, uma tubulação de entrada 406B, uma tubulação de entrada 406C, um recipiente de fermentação 410, uma tubulação de saída 412, uma tubulação de saída 414, um separador de células 420, uma tubulação de saída 422, uma tubulação de saída 424, um separador de células 430, uma tubulação de saída 432, uma tubulação de saída 436, um tanque de retenção livre de células 440, uma tubulação de saída 442, uma tubulação de saída 444, a câmara de processamento 450, uma tubulação de saída 452, uma tubulação de saída 454, um dispositivo de ruptura 460, uma tubulação de saída 462, um fracionador 470, uma tubulação de saída 472, uma tubulação de saída 474, a câmara de desidratação 475, uma tubulação de saída 476, um fracionador 480, uma tubulação de saída 482, uma tubulação de saída 484, uma câmara de desidratação 485A, uma tubulação de saída 486A, uma câmara de desidratação 485B e uma tubulação de saída 486B.
[00167] Figura 4F mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400F com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, um separador de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção contendo células, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 400F inclui uma tubulação de entrada 402, uma tubulação de entrada 404, uma tubulação de entrada 406A, uma tubulação de entrada 406B, uma tubulação de entrada 406C, uma tubulação de entrada 406D, uma tubulação de entrada 406E, um recipiente de fermentação 410, uma tubulação de saída 412, uma tubulação de saída 414, um separador de células 420, uma tubulação de saída 422, uma tubulação de saída 424, uma tubulação de saída 426, um tanque de retenção livre de células 440, uma tubulação de saída 442, uma tubulação de saída 444, um tanque de retenção contendo células 445, uma tubulação de saída 446, a câmara de processamento 450, uma tubulação de saída 452, uma tubulação de saída 454, um dispositivo de ruptura 460, uma tubulação de saída 462, um fracionador 470, uma tubulação de saída 472, uma tubulação de saída 474, uma câmara de desidratação 475, uma tubulação de saída 476, um fracionador 480, uma tubulação de saída 482, uma tubulação de saída 484, uma câmara de desidratação 485A, uma tubulação de saída 486A, uma câmara de desidratação 485B e uma tubulação de saída 486B.
[00168] Em uma modalidade, o sistema de fermentação 400F inclui uma tubulação de entrada 406D conectada à tubulação de saída 426 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH da suspensão contendo células, que contém células de bactérias anaeróbias fornecidas para fora do separador de células 420. O tratamento das células com agentes de ajuste do pH torna a membrana celular mais maleável para o rompimento mecânico das células de bactérias. Este ajuste do pH pode ocorrer antes da suspensão contendo células entrar no tanque de retenção contendo células 445. Alternativamente, o ajuste do pH pode ocorrer enquanto a suspensão contendo células entra no tanque de retenção contendo células 445. Alternativamente, este ajuste do pH pode ocorrer antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460, enquanto a suspensão contendo células entra no dispositivo de ruptura 460 ou após a suspensão contendo células ser rompida pelo dispositivo de ruptura 460 e um homogenato contendo as células bacterianas anaeróbias é tratado com um ou mais agentes de ajuste do pH.
[00169] Em uma modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor maior que o valor de pH do líquido do caldo de fermentação antes da suspensão contendo células entrar no tanque de retenção contendo células 445. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para qualquer valor entre 5 e 12 antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 460.
[00170] Em um aspecto, o sistema de fermentação bacteriana 400F inclui um tanque de retenção (por exemplo, o tanque de retenção que contém células 445) para armazenar as células de bactérias enviadas do recipiente de fermentação bacteriana. Em uma modalidade, o tanque de retenção é um recipiente de armazenamento que estoca as células de bactérias anaeróbias da biomassa microbiana coletada proveniente do recipiente de fermentação. Isto reduz as preocupações em relação às questões de limitações quando as células de bactérias estão percorrendo desde o recipiente de fermentação 410 para dentro do dispositivo de ruptura 460, com as células de bactérias que são continuamente coletadas do recipiente de fermentação bacteriana 410 e fornecidas para o dispositivo de ruptura 460 sem sobrecarregar o dispositivo de ruptura
460. A taxa de fornecimento das células de bactérias concentradas para o dispositivo de ruptura 460 pode ser uma taxa menor que a taxa de fornecimento do caldo líquido de fermentação para fora do separador/concentrador de células.
[00171] Em outra modalidade, o tanque de retenção (por exemplo, o tanque de retenção que contém células 445) serve como um dispositivo de pré-tratamento, no qual as células de bactérias são submetidas a um ou mais aditivos para aumentar a eficiência de ruptura. O tratamento das células com aditivos torna a membrana celular mais maleável para rompimento mecânico das células de bactérias. Este pré-tratamento pode ocorrer antes que a suspensão contendo células entre no dispositivo de ruptura 460. Alternativamente, o pré-tratamento pode ocorrer após a suspensão contendo células ser rompida pelo dispositivo de ruptura 460 e um homogenato contendo as células de bactérias anaeróbias é tratado com um ou mais aditivos. Exemplos do tanque de retenção que contém células 445 incluem, mas sem limitação, câmaras de processo, tanques, tanques de aço inoxidável, tanques de plástico etc.
[00172] No sistema de fermentação bacteriana 400F, a suspensão contendo células que contém as células pode ser pré-tratada com um ou mais aditivos dentro do tanque de retenção que contém células 445. O um ou mais aditivos podem ser adicionados ao tanque de retenção que contém células 445 através da tubulação de entrada 406E, por exemplo, tensoativos, detergentes, EDTA, Triton X-100, Tween-20, dodecil sulfato de sódio, CHAPS, enzimas, proteases, lisozima, benzonase, nuclease, ribonucleases (RNases), desoxirribonucleases (DNases), agentes indutores de hidrólise, agentes de ajuste de pH e uma combinação dos mesmos. Um exemplo de um aditivo como um agente de ajuste de pH é hidróxido de sódio. Outro exemplo de um aditivo como um agente de ajuste de pH é ácido clorídrico.
[00173] Em uma modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor maior que o valor de pH do líquido do caldo de fermentação antes da suspensão contendo células entrar no tanque de retenção contendo células 445. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para um valor, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, dentro do tanque de retenção contendo células 445. Em outra modalidade, o valor de pH da suspensão contendo células pode ser ajustado para qualquer valor entre 5 e 12 dentro do tanque de retenção contendo células 445.
[00174] Os agentes de ajuste do pH que podem ser fornecidos ao sistema através das tubulações de entrada 406A, 406B, 406C, 406D e 406E incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e quaisquer agentes que possam ser utilizados para aumentar ou reduzir o valor de pH de uma solução.
[00175] Em um aspecto, o dispositivo de pré-tratamento é conectado ao separador/concentrador de células (por exemplo, o separador de células 420 e/ou o separador de células 430), que está conectado ao recipiente de fermentação 410. Em outro aspecto, o dispositivo de pré- tratamento é conectado ao recipiente de fermentação 410 diretamente, em que um componente do dispositivo de pré-tratamento é um separador e concentrador de células. O dispositivo de pré-tratamento inclui uma câmara de pré-tratamento e entradas (por exemplo, a tubulação de entrada 406) para introduzir aditivos específicos para tornar as membranas celulares das células de bactérias mais maleáveis para outras técnicas de ruptura. O(s) tipo(s) de aditivo(s) utilizado(s) e o tipo de dispositivo de ruptura utilizado podem ser qualquer número de combinações para aumentar a eficiência de ruptura das células.
[00176] Figura 4G mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400G com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, dois separadores de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção contendo células, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 400G inclui uma tubulação de entrada 402, uma tubulação de entrada 404, uma tubulação de entrada 406A, uma tubulação de entrada 406B, uma tubulação de entrada 406C, uma tubulação de entrada 406D, uma tubulação de entrada 406E, um recipiente de fermentação 410, uma tubulação de saída 412, uma tubulação de saída 414, uma tubulação de saída 416, um separador de células 420, uma tubulação de saída 422, uma tubulação de saída 424, um separador de células 430, uma tubulação de saída 432, uma tubulação de saída 436, um tanque de retenção livre de células 440, uma tubulação de saída 442, uma tubulação de saída 444, um tanque de retenção contendo células 445, uma tubulação de saída 446, uma câmara de processamento 450, uma tubulação de saída 452, uma tubulação de saída 454, um dispositivo de ruptura 460, uma tubulação de saída 462, um fracionador 470, uma tubulação de saída 472, uma tubulação de saída 474, uma câmara de desidratação 475, uma tubulação de saída 476, um fracionador 480, uma tubulação de saída 482, uma tubulação de saída 484, uma câmara de desidratação 485A, uma tubulação de saída 486A, uma câmara de desidratação 485B e uma tubulação de saída 486B.
[00177] Figura 4H mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 400H com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, dois separadores de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção contendo células, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 400H inclui uma tubulação de entrada 402, uma tubulação de entrada 404, uma tubulação de entrada 406A, uma tubulação de entrada 406B, uma tubulação de entrada 406C, uma tubulação de entrada 406D, uma tubulação de entrada 406E, um recipiente de fermentação 410, uma tubulação de saída 412, uma tubulação de saída 414, uma tubulação de saída 416, um separador de células 420, uma tubulação de saída 422, uma tubulação de saída 424, um separador de células 430, uma tubulação de saída 432, uma tubulação de saída 436, um tanque de retenção livre de células 440, uma tubulação de saída 442, uma tubulação de saída 444, um tanque de retenção contendo células 445, uma tubulação de saída 446, uma câmara de processamento 450, uma tubulação de saída 452, uma tubulação de saída 454, um dispositivo de ruptura 460, uma tubulação de saída 462, uma tubulação de retorno 464, um fracionador 470, uma tubulação de saída 472, uma tubulação de saída 474, uma câmara de desidratação 475, uma tubulação de saída 476, um fracionador 480, uma tubulação de saída 482, uma tubulação de saída 484, uma câmara de desidratação 485A, uma tubulação de saída 486A, uma câmara de desidratação 485B e uma tubulação de saída 486B.
[00178] Em certas modalidades, o sistema de fermentação bacteriana 400H inclui ainda uma ou mais tubulações de reciclo. Em uma modalidade, a tubulação de reciclo é uma tubulação de retorno 464 conectada ao dispositivo de ruptura 460. A tubulação de retorno 464 retira uma parte das misturas do produto do dispositivo de ruptura e reinsere no dispositivo de ruptura 460. Isto permite inúmeras passagens através do dispositivo de ruptura 460, que, por sua vez, aumenta as quantidades rompidas e as concentrações de proteínas do homogenato contendo proteínas de células de bactérias anaeróbias e garante a acessibilidade adequada aos compostos proteicos dentro das células de bactérias para processamento adicional.
[00179] Figura 5A mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 500A com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, um separador de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção contendo células,
um dispositivo de ruptura, um fracionador e duas câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 500A inclui uma tubulação de entrada 502, uma tubulação de entrada 504, uma tubulação de entrada 506A, uma tubulação de entrada 506B, uma tubulação de entrada 506C, uma tubulação de entrada 506D, uma tubulação de entrada 506E, um recipiente de fermentação 510, uma tubulação de saída 512, uma tubulação de saída 514, um separador de células 520, uma tubulação de saída 522, uma tubulação de saída 524, uma tubulação de saída 526, a câmara de processamento 550, uma tubulação de saída 552, uma tubulação de saída 554, um tanque de retenção contendo células 545, uma tubulação de entrada 506, uma tubulação de saída 542, um misturador 548, um dispositivo de ruptura 560, uma tubulação de saída 562, uma tubulação de saída 564, um fracionador 570, uma tubulação de saída 572, uma tubulação de saída 574, uma câmara de desidratação 575A, uma tubulação de saída 576A, a câmara de desidratação 575B e uma tubulação de saída 576B.
[00180] No separador de células 520, o caldo líquido de fermentação proveniente do recipiente de fermentação 510 é separado na solução de permeado livre de células e na suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias em uma segunda concentração. A solução de permeado livre de células é enviada para a câmara de processamento 550 através da tubulação de saída 522 que conecta a câmara de processamento 550 e o separador de células 520. A suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias em uma segunda concentração é enviada para um tanque de retenção que contém células 545 através de uma saída 526 que conecta o tanque de retenção que contém células 545 ao separador de células 520.
[00181] O dispositivo de ruptura 560 que fornece um homogenato é conectado a um fracionador 570. No fracionador 570, o método 500A inclui a separação da suspensão contendo células em uma primeira parte que contém proteínas e uma parte de restos celulares. O fracionador 570 é conectado ao dispositivo de ruptura 560 através de uma saída 562. O fracionador 570 tem pelo menos duas saídas, em que partindo da uma primeira saída 574 escoam os restos celulares e partindo de uma segunda saída 572 escoa uma primeira parte que contém proteína. Os tipos de fracionadores utilizados incluem, mas sem limitação, vários tipos de fracionadores sólido-líquido, dispositivos de centrifugação, centrífugas contínuas, centrífugas decantadoras, centrífugas de placas cônicas, dispositivos de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo de filtração de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de exclusão de tamanho, uma ou séries de colunas de troca iônica, uma ou séries de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo, um dispositivo de ultrafiltração, uma ou séries de colunas de cromatografia por afinidade, uma ou séries de colunas de filtração em gel, e combinações dos mesmos.
[00182] Em um exemplo, o sistema de fermentação bacteriana 500A inclui ainda o tanque de retenção que contém células 545 que serve como uma câmara de pré-tratamento. A suspensão contendo células que contém células de bactérias anaeróbias é tratada com um ou mais aditivos no tanque de retenção que contém células 545. O tanque de retenção que contém células 545 é conectado à tubulação de entrada 506E que fornece um ou mais aditivos (por exemplo, detergentes, enzimas, tampões, agentes de ajuste de pH etc.). A entrada 506E é geralmente desligada e pode ser ligada quando necessário. O tanque de retenção que contém células 545 armazena a suspensão contendo células que contém células de bactérias anaeróbias até que as células atinjam alta densidade de células (altas concentrações) e possam servir para fornecimento com tempo determinado de quantidades específicas da suspensão contendo células para o dispositivo de ruptura 560.
[00183] O misturador 548 dentro do tanque de retenção que contém células 545 é um dispositivo de agitação, tal como um dispositivo de agitação com propulsor interno. O dispositivo de ruptura 560 é conectado ao tanque de retenção que contém células 545 através da tubulação de saída 542. O dispositivo de ruptura 560 gera um homogenato das células de bactérias anaeróbias. Após um período de tempo específico dentro do tanque de retenção que contém células 545, a suspensão contendo células é fornecida ao dispositivo de ruptura 560.
[00184] Em um aspecto, o fracionador 570 é conectado a uma ou mais câmaras de desidratação (por exemplo, as câmaras de desidratação 575A, 575B), que recebem uma ou mais partes que contêm proteínas e as secam. As técnicas de secagem utilizadas incluem secagem, secagem por spray, liofilização etc. A parte que contém proteínas é então processada e misturada adicionalmente em suplementos nutricionais ricos em proteína. As partes que contêm proteínas podem ter um teor de proteínas de 10% ou mais (tal como entre 10% e 80% ou entre 50% e 95%) dos suplementos nutricionais ricos em proteína.
[00185] Em uma modalidade, o sistema de fermentação 500A inclui uma tubulação de entrada 506D conectado à tubulação de saída 526 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH da suspensão contendo células, que contém células de bactérias anaeróbias fornecidas para fora do separador de células 520. O tratamento das células com agentes de ajuste do pH torna a membrana celular mais maleável para o rompimento mecânico das células de bactérias. Este ajuste do pH pode ocorrer antes da suspensão contendo células entrar no tanque de retenção contendo células 545. Alternativamente, o ajuste do pH pode ocorrer enquanto a suspensão contendo células entra no tanque de retenção contendo células 545 através de tubulação de entrada 506E. Alternativamente, este ajuste do pH pode ocorrer antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 560 através de tubulação de entrada 506A, enquanto a suspensão contendo células entra no dispositivo de ruptura 560 através de tubulação de entrada 506B ou após a suspensão contendo células ser rompida pelo dispositivo de ruptura 560 através de tubulação de entrada 506C e um homogenato contendo as células bacterianas anaeróbias é tratado com um ou mais agentes de ajuste do pH.
[00186] Os agentes de ajuste do pH que podem ser fornecidos ao sistema através das tubulações de entrada 506A, 506B, 506C, 506D e 506E incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e quaisquer agentes que possam ser utilizados para aumentar ou reduzir o valor de pH de uma solução.
[00187] Figura 5B mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 500B com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, um separador de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, um tanque de retenção contendo células, um fracionador e duas câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 500B inclui uma tubulação de entrada 502, uma tubulação de entrada 504, uma tubulação de entrada 506A, uma tubulação de entrada 506B, uma tubulação de entrada 506C, uma tubulação de entrada 506D, uma tubulação de entrada 506E, um recipiente de fermentação 510, uma tubulação de saída 512, uma tubulação de saída 514, um separador de células 520, uma tubulação de saída 522, uma tubulação de saída 524, uma tubulação de saída 526, uma câmara de processamento 550, uma tubulação de saída 552, uma tubulação de saída 554, um tanque de retenção contendo células 545, uma tubulação de entrada 506, uma tubulação de saída 542, um misturador 548, um dispositivo de ruptura 560, uma tubulação de saída 562, uma tubulação de saída 564, um fracionador 580, uma tubulação de saída 582, uma tubulação de saída 584, uma câmara de desidratação 585A, uma tubulação de saída 586A, a câmara de desidratação 585B e uma tubulação de saída 586B.
[00188] A Figura 5C mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 500C com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, um separador de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção contendo células, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 500C inclui uma tubulação de entrada 502, uma tubulação de entrada 504, uma tubulação de entrada 506A, uma tubulação de entrada 506B, uma tubulação de entrada 506C, uma tubulação de entrada 506D, uma tubulação de entrada 506E, um recipiente de fermentação 510, uma tubulação de saída 512, uma tubulação de saída 514, um separador de células 520, uma tubulação de saída 522, uma tubulação de saída 524, uma tubulação de saída 526, a câmara de processamento 550, uma tubulação de saída 552, uma tubulação de saída 554, um tanque de retenção contendo células 545, uma tubulação de entrada 506, um misturador 548, uma tubulação de saída 542, um dispositivo de ruptura 560, uma tubulação de saída 562, uma tubulação de saída 564, um fracionador 570, a tubulação de saída 572, a tubulação de saída 574, a câmara de desidratação 575, a tubulação de saída 576, um fracionador 590, uma tubulação de saída 592, uma tubulação de saída 594, uma câmara de desidratação 595A, uma tubulação de saída 596A, uma câmara de desidratação 595B e uma tubulação de saída 596B.
[00189] A Figura 5D mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 500D com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, um separador de células, uma câmara de processamento, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e quatro câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 500D inclui a tubulação de entrada 502, a tubulação de entrada 504, uma tubulação de entrada 506A, uma tubulação de entrada 506B, uma tubulação de entrada 506C, um recipiente de fermentação 510, uma tubulação de saída 512, uma tubulação de saída 514, um separador de células 520, uma tubulação de saída 522, uma tubulação de saída 524, uma tubulação de saída 526, uma câmara de processamento 550, uma tubulação de saída 552, uma tubulação de saída 554, um dispositivo de ruptura 560, a tubulação de saída 562, uma tubulação de saída 564, um fracionador 570, uma tubulação de saída 572, uma tubulação de saída 574, um fracionador 570, uma tubulação de saída 592A, uma tubulação de saída 594A, um fracionador 590, uma tubulação de saída 592B, uma tubulação de saída 594B, uma câmara de desidratação 595A, uma tubulação de saída 596A, uma câmara de desidratação 595B, uma tubulação de saída 596B, uma câmara de desidratação 595C, uma tubulação de saída 596C, uma câmara de desidratação 595D e uma tubulação de saída 596D. Em um aspecto, o dispositivo de ruptura 560 tem uma tubulação de fluxo de reciclo (por exemplo, a tubulação de saída 564) que permite várias passagens através do dispositivo de ruptura 560.
[00190] A Figura 5E mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 500E com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, dois separadores de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção contendo células, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e três câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 500E inclui uma tubulação de entrada 502, uma tubulação de entrada 504, uma tubulação de entrada 506A, uma tubulação de entrada 506B, uma tubulação de entrada 506C, uma tubulação de entrada 506D, uma tubulação de entrada 506E, um recipiente de fermentação 510, uma tubulação de saída 512, uma tubulação de saída 514, uma tubulação de saída 516, um separador de células 520, uma tubulação de saída 522, uma tubulação de saída 524, uma câmara de processamento 550, uma tubulação de saída 552, uma tubulação de saída 544, um separador de células 530, uma tubulação de saída 532, uma tubulação de saída 534, uma tubulação de saída 536, um tanque de retenção contendo células 545, uma tubulação de entrada 506, uma tubulação de saída 542, um misturador 548, um dispositivo de ruptura 560, uma tubulação de saída 562, um fracionador 570, uma tubulação de saída 572, uma tubulação de saída 574, uma câmara de desidratação 575, a tubulação de saída 576, um fracionador 580, uma tubulação de saída 582, uma tubulação de saída 584, uma câmara de desidratação 585A, uma tubulação de saída 586A, a câmara de desidratação 585B e uma tubulação de saída 586B.
[00191] A Figura 6 mostra um esquema de um sistema de fermentação bacteriana 600 com uma ou mais tubulações de entrada para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação, um recipiente de fermentação, dois separadores de células, um tanque de retenção livre de células, uma câmara de processamento, um tanque de retenção contendo células, um dispositivo de ruptura, dois fracionadores e duas câmaras de desidratação para a obtenção de suplementos nutricionais ricos em proteínas partindo de um processo de fermentação bacteriana. O sistema de fermentação bacteriana 600 inclui uma tubulação de entrada 602, uma tubulação de entrada 604, uma tubulação de entrada 606A, uma tubulação de entrada 606B, uma tubulação de entrada 606C, uma tubulação de entrada 606D, uma tubulação de entrada 606E, um recipiente de fermentação 610, uma tubulação de saída 612, uma tubulação de saída 614, uma tubulação de saída 616, um separador de células 620, uma tubulação de saída 622, uma tubulação de saída 624, um tanque de retenção livre de células 640, uma tubulação de saída 642, uma tubulação de saída 644, uma câmara de processamento 650, uma tubulação de saída 652, uma tubulação de saída 654, um separador de células 630, uma tubulação de saída 632, uma tubulação de saída 636, um tanque de retenção contendo células 645, uma tubulação de entrada 606, uma tubulação de saída 646, um dispositivo de ruptura 660, uma tubulação de saída 662, um fracionador 670, uma tubulação de saída 672, uma tubulação de saída 674, uma câmara de desidratação 675, uma tubulação de saída 676, um fracionador 690, uma tubulação de entrada 692, uma tubulação de saída 694, uma câmara de desidratação 695 e uma tubulação de saída 696.
[00192] Em uma modalidade, o sistema de fermentação 600 inclui uma tubulação de entrada 606D conectada à tubulação de saída 636 para o fornecimento de agentes de ajuste do pH ao sistema de fermentação e o ajuste do valor de pH da suspensão contendo células, que contém células de bactérias anaeróbias fornecidas para fora do separador de células 620. O tratamento das células com agentes de ajuste do pH torna a membrana celular mais maleável para o rompimento mecânico das células de bactérias. Este ajuste do pH pode ocorrer antes da suspensão contendo células entrar no tanque de retenção contendo células 645. Alternativamente, o ajuste do pH pode ocorrer enquanto a suspensão contendo células entra no tanque de retenção contendo células 645 através de tubulação de entrada 606E. Alternativamente, este ajuste do pH pode ocorrer antes da suspensão contendo células entrar no dispositivo de ruptura 660 através de tubulação de entrada 606A, enquanto a suspensão contendo células entra no dispositivo de ruptura 660 através de tubulação de entrada 606B ou após a suspensão contendo células ser rompida pelo dispositivo de ruptura 660 através de tubulação de entrada 606C e um homogenato contendo as células bacterianas anaeróbias é tratado com um ou mais agentes de ajuste do pH.
[00193] Os agentes de ajuste do pH que podem ser fornecidos ao sistema através das tubulações de entrada 606A, 606B, 606C, 606D e 606E incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e quaisquer agentes que possam ser utilizados para aumentar ou reduzir o valor de pH de uma solução.
[00194] Em uma modalidade, há um dispositivo de ruptura que é um dispositivo microfluídico, em que as células entram no dispositivo de ruptura e são submetidas a altas forças de cisalhamento na câmara de reação para separar as paredes celulares e as membranas celulares das bactérias anaeróbias. As células de bactérias rompidas são então adicionalmente processadas através de centrifugação, filtração, vários métodos de desidratação das células de bactérias anaeróbias (por exemplo, secagem, secagem por congelamento, liofilização etc.), mistura, remoção de íons de metais pesados, incorporação com um suplemento nutricional em uma substância que pode ser ingerida ou combinações dos mesmos.
[00195] Em outra modalidade, o sistema de fermentação bacteriana tem dois ou mais dispositivos de ruptura. O primeiro dispositivo de ruptura também pode ser um tanque de retenção ou um recipiente de armazenamento que está mantendo as células de bactérias dentro de uma suspensão contendo células que foi separada do líquido de fermentação. Há um primeiro dispositivo de ruptura que é um dispositivo de pré-tratamento, em que a suspensão contendo células entra no primeiro dispositivo de ruptura e é tratada com aditivos para aumentar a eficiência de ruptura. Os aditivos utilizados incluem, mas sem limitação, um ou mais detergentes, enzimas, reagentes químicos ou combinações dos mesmos. Há um segundo dispositivo de ruptura que é um dispositivo microfluídico, em que as células entram no segundo dispositivo de ruptura e são submetidas a altas forças de cisalhamento na câmara de reação. A suspensão contendo células é forçada através de microcanais que faz com que as paredes celulares e as membranas celulares de células de bactérias sem rompam e abram, em que o conteúdo das células de bactérias se tornam flutuantes livremente por todo o líquido de fermentação. Isto permite a coleta de uma primeira recuperação de proteínas, que pode ser adicionalmente manipulada por centrifugação,
filtração, desidratação etc.
[00196] III. Composição de Suplementos Nutricionais Compreendendo Proteínas Derivadas da Fermentação
[00197] Uma ou mais partes que contêm proteínas recuperadas do sistema de fermentação bacteriana descrito aqui podem ser submetidas à mistura direta com uma composição para ração, secagem, assentamento, filtração, ultrafiltração, microfiltração, filtração a vácuo, centrifugação, centrifugação sequencial, secagem por congelamento, congelamento, hidrólise e combinações dos mesmos para gerar e obter formas mais puras de proteínas e a concentrações de proteínas mais altas. No aspecto em que a biomassa microbiana é hidrolisada, a hidrólise pode ser realizada através de tratamento térmico, hidrólise ácida, hidrólise enzimática, hidrólise alcalina e combinações dos mesmos.
[00198] Em uma modalidade do método, a primeira parte que contém proteínas é produzida como o suplemento nutricional rico em proteínas. A primeira parte que contém proteínas tem um teor de proteína que está entre 60% a 80%. Em outro aspecto, a primeira parte que contém proteínas tem um teor de proteína que está entre 40% a 60%. Ainda em outro aspecto, a primeira parte que contém proteínas tem um teor de proteína que está entre 10% a 40%.
[00199] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição que é um suplemento nutricional rico em proteínas. Esta composição é gerada partindo de um processo de fermentação utilizando cultura de bactérias acetogênicas. Esta composição compreende uma parte que contém proteínas separada de uma parte de restos celulares de um homogenato, em que o homogenato é obtido partindo da ruptura de uma suspensão contendo células que contém células da cultura de bactérias acetogênicas e em que a suspensão contendo células é obtida partindo de um líquido de fermentação que é fornecido para fora de um recipiente de fermentação durante a fermentação de um substrato gasoso utilizando a cultura de bactérias acetogênicas.
[00200] Em um aspecto, a cultura de bactérias acetogênicas é selecionada de um grupo que consiste de bactérias Clostridium, bactérias Acetobacterium e combinações das mesmas. O substrato gasoso fermentado compreende um ou mais gases selecionados do grupo que consiste de substratos de fonte de carbono, monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2), gás hidrogênio (H2), gás de síntese e combinações dos mesmos.
[00201] Em outro aspecto, a parte que contém proteínas da composição compreende um teor de proteínas entre aproximadamente 10% a aproximadamente 80% da composição, um teor de carboidratos entre aproximadamente 5% a aproximadamente 35% da composição e um teor de ácidos nucleicos entre aproximadamente 5% a aproximadamente 15% da composição. O teor de proteína na parte que contém proteínas é maior que um teor de carboidratos na parte que contém proteína. Ainda em outro aspecto, o teor de ácido nucleico não é maior que 2% da composição. Esta é uma composição que pode ser ingerida por seres humanos e animais similares.
[00202] Em outra modalidade, a composição de um suplemento nutricional rico em proteínas compreende um produto proteico purificado separado de uma primeira quantidade de uma parte que contém proteínas e uma segunda quantidade de uma parte de restos celulares de um homogenato, em que o homogenato é obtido através da ruptura de uma suspensão contendo células que contém células da cultura de bactérias acetogênicas e em que a suspensão contendo células é obtida partindo de um líquido de fermentação que será fornecido para fora de um recipiente de fermentação durante a fermentação de um substrato gasoso utilizando a cultura de bactérias acetogênicas. A parte de restos celulares compreende particulados de parede celular, particulados de membrana celular, agregados de proteínas, corpos de inclusão, ácido nucleico e outros componentes de células de bactérias anaeróbias. O caldo líquido de fermentação fornecido para fora do recipiente de fermentação é separado em uma solução de permeado livre de células e na suspensão contendo células que contém as células da cultura de bactérias acetogênicas. Em um aspecto, o produto proteico parcialmente purificado tem um teor de ácidos nucleicos que não é maior que 2%. Em outro aspecto, o teor de ácido nucleico não é maior que 8% a 12%.
[00203] Em um aspecto, a composição inclui um teor de proteínas entre aproximadamente 10% a aproximadamente 80% da composição, um teor de carboidratos entre aproximadamente 5% a aproximadamente 35% da composição e um teor de ácidos nucleicos entre aproximadamente 5% a aproximadamente 15% da composição. O teor de proteína na parte que contém proteínas é maior que um teor de carboidratos na parte que contém proteína.
[00204] Em outro aspecto, a composição inclui um teor de proteínas entre aproximadamente 10% a aproximadamente 80% da composição, um teor de carboidratos entre aproximadamente 5% a aproximadamente 35% da composição e um teor de ácidos nucleicos que não é maior que 2% da composição.
[00205] Ainda em outra modalidade, a composição da matéria-prima quando removida do recipiente de fermentação bacteriana fornece aproximadamente 220 kcal ou mais por 100 gramas de biomassa acetogênica e pode incluir aproximadamente 15 gramas ou mais de carboidrato por 100 gramas de biomassa acetogênica, em uma base em peso seco. Neste aspecto, a matéria-prima tem uma proporção em peso de carboidratos para proteínas de aproximadamente 1,0 ou menos. Em outro aspecto, a matéria-prima inclui aproximadamente 18 mg ou mais cálcio por 100 gramas de biomassa acetogênica, aproximadamente 150 mg ou mais de ferro por 100 gramas de massa de células, aproximadamente 25 mg ou mais de sódio por 100 gramas de biomassa acetogênica, aproximadamente 1200 mg ou mais de potássio por 100 gramas de biomassa ou uma combinação dos mesmos, em uma base em peso seco. A composição da matéria-prima inclui tanto aminoácidos essenciais quanto não essenciais. A composição da matéria-prima também pode incluir nucleotídeos.
[00206] Em um aspecto, a composição da matéria-prima fornece um teor de proteínas de aproximadamente 60 gramas ou mais por 100 gramas de biomassa acetogênica, em outro aspecto, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 gramas por 100 gramas de biomassa acetogênica, em outro aspecto, aproximadamente 65 a aproximadamente 85 gramas por 100 gramas de biomassa acetogênica e em outro aspecto, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 gramas por 100 gramas de biomassa acetogênica, todos em uma base em peso seco.
[00207] Em outro aspecto, a composição da matéria-prima fornece aproximadamente 220 kcal ou mais por 100 gramas de biomassa acetogênica seca, em outro aspecto, aproximadamente 220 kcal a aproximadamente 400 kcal, em outro aspecto, aproximadamente 250 kcal a aproximadamente 350 kcal, em outro aspecto, aproximadamente 300 kcal a aproximadamente 325 kcal e em outro aspecto, aproximadamente 220 kcal a aproximadamente 300 kcal.
[00208] Em outro aspecto, a composição da matéria-prima fornece aproximadamente 15 gramas ou mais de carboidratos por 100 gramas de biomassa acetogênica seca, em outro aspecto, aproximadamente 15 gramas a aproximadamente 60 gramas, em outro aspecto, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 gramas, em outro aspecto, aproximadamente 25 a aproximadamente 35 gramas e em outro aspecto, aproximadamente 30 a aproximadamente 35 gramas. Neste aspecto, a matéria-prima inclui uma proporção em peso de carboidratos para proteínas de aproximadamente 1,0 ou menos, em outro aspecto, aproximadamente 0,75 ou menos, em outro aspecto, 0,5 ou menos, em outro aspecto, aproximadamente 0,25 ou menos e em outro aspecto, 0,1 ou menos. Em um aspecto, a matéria-prima não tem carboidratos detectáveis e inclui somente proteínas. Em outro aspecto, o carboidrato pode incluir etanol e/ou açúcares solúveis em água.
[00209] A composição da matéria-prima também pode incluir fibra. A fibra pode incluir fibra detergente ácida, fibra detergente neutra, fibra que pode ser digerida e/ou fibra que não pode ser digerida. A composição da matéria-prima também pode incluir amido. Ainda em outro aspecto,
a composição da matéria-prima inclui cálcio, ferro, sódio e potássio nas seguintes quantidades (todas expressas na forma de mg por 100 gramas de biomassa acetogênica em uma base em peso seco): Cálcio: aproximadamente 18 mg ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 20 mg ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 25 mg ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 30 mg ou mais; Ferro: aproximadamente 150 mg ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 175 mg ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 200 mg ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 225 mg ou mais; Sódio: aproximadamente 25 mg ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 30 mg ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 35 mg ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 40 mg ou mais; Potássio: aproximadamente 1200 mg ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 1300 mg ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 1400 mg ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 1500 mg ou mais.
[00210] Em um aspecto, a composição da matéria-prima pode incluir de minimis quantidades de metais. Em um aspecto alternativo, a matéria- prima pode incluir níveis de certos metais desejáveis. Exemplos de metais que podem ou não estar presentes na matéria-prima incluem zinco, molibdênio, cádmio, escândio, titânio, vanádio, cromo, manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, tungstênio e selênio.
[00211] Em outro aspecto, a biomassa acetogênica pode incluir qualquer um dos aminoácidos a seguir, individualmente ou em qualquer combinação (expressos na forma de gramas por 100 gramas de biomassa acetogênica em uma base em peso seco): Teor de Aminoácidos Essenciais: Arginina: em um aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto,
aproximadamente 6,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais; Histidina: em um aspecto, aproximadamente 1,5 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais; Isoleucina: em um aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 8,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 9,0 gramas ou mais; Leucina: em um aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 8,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 9,0 gramas ou mais; Lisina: em um aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 7,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 8,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 9,0 gramas ou mais, em outro aspecto,
aproximadamente 10,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 12,0 gramas ou mais; Metionina: em um aspecto, aproximadamente 1,5 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais; Fenilalanina: em um aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,5 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais; Treonina: em um aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 8,0 gramas ou mais; Triptofano: em um aspecto, aproximadamente 0,4 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 0,5 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 0,6 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 0,7 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 0,8 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 0,9 grama ou mais, em outro aspecto,
aproximadamente 1,0 grama ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 1,5 grama ou mais; Valina: em um aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 8,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 9,0 gramas ou mais.
[00212] Teor de Outros Aminoácidos: Alanina: em um aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 8,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 9,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 10,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 11,0 gramas ou mais; Ácido Aspártico: em um aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 7,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 8,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 9,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 10,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 11,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 12,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 14,0 gramas ou mais; Cisteína: em um aspecto, aproximadamente 1,0 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 1,5 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto,
aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais; Ácido Glutâmico: em um aspecto, aproximadamente 9,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 9,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 10,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 12,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 14,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 16,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 18,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 20,0 gramas ou mais; Glicina: em um aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais; Metionina: em um aspecto, aproximadamente 1,5 grama ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais; Prolina: em um aspecto, aproximadamente 2,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto,
aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 7,0 gramas ou mais; Serina: em um aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,5 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais; Tirosina: em um aspecto, aproximadamente 2,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 3,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 4,5 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,0 gramas ou mais, em outro aspecto, aproximadamente 5,5 gramas ou mais e em outro aspecto, aproximadamente 6,0 gramas ou mais.
[00213] Em uma modalidade, a composição da matéria-prima pode ser utilizada como ração na alimentação de animais. Ainda em outra modalidade, a composição da matéria-prima pode ser utilizada como ração na aquacultura. Ainda em outra modalidade, a composição da matéria-prima pode ser adicionalmente processada e utilizada como um suplemento nutricional que pode ser ingerido por animais e seres humanos similares.
[00214] Em um aspecto, a presente composição fornece uma quantidade eficiente de nutrientes para um processo de fermentação bacteriana. Neste aspecto, uma “quantidade eficiente” descreve o uso na promoção de um processo de fermentação saudável que pode incluir pelo menos um dos seguintes: produção de total álcool em um STY de aproximadamente 1 g ou mais de álcool total/(L·dia); fornecimento de uma densidade de células de aproximadamente 2,0 gramas/litro ou mais; e manutenção da cultura em um estado estacionário. O processo de fermentação bacteriana pode ser a fermentação de um substrato gasoso que contém CO e pode ser o mesmo processo de fermentação bacteriana do qual a matéria-prima foi derivado originalmente.
[00215] Em outro aspecto, a presente composição fornece uma quantidade eficiente de nutrição para um animal. Uma “quantidade eficiente” que descreve o uso na promoção de crescimento saudável em um animal é uma quantidade suficiente para promover pelo menos um dos seguintes: inibição da carga bacteriana no animal; prevenção ou redução da incidência de enterite necrótica em aves; estimulação da resposta imunológica no animal; aumento da eficácia de antibióticos e vacinas administrados ao animal na ração ou de outra maneira; maior taxa de crescimento por quantidade de ração administração; maior produção de leite; reduções na taxa de mortalidade; e similares. Podem ser considerados vários fatores que, incluem, mas sem limitação, os fatores tais como idade do animal, nível de atividade, equilíbrio hormonal e saúde geral na determinação da quantidade eficiente, que são específicos para o animal, por exemplo, começando com uma dosagem baixa e titulando a dosagem para determinar a quantidade eficiente.
[00216] Os animais que podem se beneficiar da ingestão da presente composição incluem, por exemplo, aves tais como frangos, patos, gansos, perus, codorna, galetos e similares; gado de corte e de leite, suínos, caprinos e similares; animais domésticos tais como cães e gatos; animais aquáticos tais como salmão, salmonídeos, truta, tilápia, camarão, lagosta e similares; e, seres humanos. Os usos do suplemento nutricional rico em proteínas incluem a engorda de bovinos, suínos, aves e peixes. Outros usos da presente composição incluem servir como auxiliares de emulsificação para aumentar ao valor nutritivo de um grande número de produtos que podem ser consumidos, incluindo produtos de panificação, sopas, refeições pré-empacotadas, alimentos práticos e alimentos dietéticos. Ainda outros usos incluem processamento de papel,
processamento de couro e estabilização de espuma.
Exemplos:
[00217] Exemplo 1: Um Processo de Fermentação Bacteriana Contínua
[00218] Um gás de síntese ou residual contendo CO e/ou CO2/H2 é introduzido continuamente em um biorreator de tanque agitado contendo uma cepa de Clostridium ljungdahlii, junto com um meio de fermentação contendo vitaminas, metais traços e sais. Um meio de fermentação adequado utilizado é relatado na Tabela 1 abaixo.
TABELA 1 MEIO DE FERMENTAÇÃO: COMPONENTES &
CONCENTRAÇÕES Fornecido na Forma 1x EtOH Componente De Conc (ppm) NH4+ NH4Cl(NH4)2HPO4 838 Fe FeCl24H2O 16,8 Ni NiCl26H2O 0,198 Co CoCl26H2O 0,991 Se Na2SeO3 0,0913 Zn ZnSO47H2O 0,455 Mo Na2MoO22H2O 0,238 Mn MnCl22H2O 0,167 B H3BO3 1,05 Cu CuCl22H2O 0,149 W Na2WO42H2O 1,12 K KCl 78,6 Mg MgCl26H2O 59,8
Na NaCl 78,7a Ca CaCl22H2O 54,5b Cisteína HCl Cisteína HCl 250 PO4-2 H3PO4(NH4)2HPO4 816 Coquetel de Vitaminas Variáveld vitaminasc a A concentração de Na+ é apenas de NaCl. Não inclui Na+ dos outros componentes tais como Na2WO4·2H2O, b A concentração de Ca+2 não inclui cálcio proveniente do ácido pantotênico ou do sal de cálcio.
c A solução de vitaminas contém d-biotina, tiamina HCl e ácido d-pantotênico, sal de cálcio.
d Varia consideravelmente de 0,3-0,5 mL na inoculação até 0,7- 0,8 mL a altas taxas de gás.
[00219] Durante a inicialização do método utilizando um inóculo de cultura de 10% ou menos o reator é operado com uma fase líquida em batelada, na qual o meio de fermentação não é alimentado continuamente ao reator. A fase líquida no reator consiste assim de uma batelada de meio de fermentação com uma concentração nominal de um ou mais nutrientes limitantes, por exemplo, pantotenato de cálcio, cobalto. Alternativamente, também pode ser empregado um meio rico contendo extrato de levedura, tripticase ou outros nutrientes complexos.
[00220] De maneira ideal, a fase gasosa na inicialização é livre de CO2 e contém excesso de H2. A taxa de gás e a taxa de agitação são mantidas em níveis baixos (menores que 500 rpm em um biorreator de fermentação New Brunswick Scientific Bioflo®) para produzir CO e H2 em ligeiro excesso, mas ao mesmo tempo, evitando a inibição do substrato de CO.
Em um biorreator de fermentação New Brunswick Scientific Bioflo® de laboratório de um litro, como um exemplo, no qual a composição de gás de alimentação é 63% de H2, 32% de CO e 5% de CH4, a taxa de agitação para começar a inicialização é 400 rpm e a taxa de gás é 20 mL/min. Para causar a produção de etanol durante a inicialização, estão em excesso tanto o H2 quanto nutrientes líquidos. As limitações colocadas sobre certos nutrientes dentro do meio de fermentação ocorrem em um momento mais tarde. Assim, os nutrientes líquidos em excesso (por exemplo, pantotenato de cálcio, cobalto) estão realmente presentes durante a inicialização para evitar a adaptação indesejada da cultura à quantidade baixa de nutrientes.
[00221] À medida que a fermentação bacteriana prossegue ao longo de um período de várias horas após a inoculação, o CO2 é produzido partindo da conversão de CO e H2 é consumido junto com o CO2, que é um sinal para aumentar nominalmente a taxa de agitação para evitar a limitação de transferência da massa de gás. No New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR, o gás que sai é 25% de CO, 67% de H2, 2% de CO2 e 6% de CH4. Se a taxa de agitação for reduzida muito rapidamente, ocorre a inibição do substrato de CO, que é evidenciada por uma redução na concentração de metano após um aumento na agitação. Assim, a taxa de agitação poderia ser tipicamente aumentada em 200 rpm em 24 horas.
[00222] O procedimento de monitoramento da produção de CO2 (ou conversão de H2) enquanto que a agitação é nominalmente aumentada ocorre a uma taxa relativamente alta até que a taxa de agitação de objetivo seja atingida. Uma taxa de agitação de objetivo típica no biorreator de fermentação é 900 rpm. Durante este período de aumento da taxa de agitação na cultura em batelada, o monitoramento da produção de células ocorre antes da instigação da formação de produtos. Assim, concentrações de células de aproximadamente 1,5 g/L são atingidas, enquanto as concentrações de produtos típicas são 10 g/L de etanol e 2 g/L de acetato partindo da batelada.
[00223] Assim que a taxa de agitação de objetivo é atingida, é permitido que o sistema se desenvolva até uma captação máxima de H2. É desejável ter concentrações de H2 de saída muito altas (tipicamente >60%) para garantir a produção de etanol enquanto a produção de ácido acético é limitada. O meio de fermentação líquido alimentado é então desligado (para sistemas que tem inoculação em batelada partindo da coluna de estoque) para iniciar a alimentação contínua do líquido e a taxa de alimentação de gás é aumentada em direção à vazão de objetivo. No biorreator de fermentação New Brunswick Scientific Bioflo® de laboratório, a taxa de alimentação do líquido é tipicamente 0,5 mL/min, enquanto que a vazão do gás é aumentada em 10 a 15% a cada 24 horas em direção da taxa de objetivo de 125 mL/min.
[00224] À medida que a vazão de gás é aumentada, a produção de células aumenta até o reator ser eventualmente limitado em relação aos nutrientes da fase líquida (por exemplo, pantotenato de cálcio, cobalto) como é evidenciado por uma pequena queda na conversão de H2, na produtividade de objetivo. No New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR, isto é reconhecido por uma queda de 10% na H2 conversão em uma produtividade de objetivo de 20 g/L·dia.
[00225] O método de produção e o sistema de reator de fermentação bacteriana são então mantidos em um estado estacionário produzindo 15 a 35 g/L de etanol e 0 a 5 g/L de acetato como produtos, apenas com pequenos ajustes ocasionais nos nutrientes limitantes, nas taxas de líquidos e na taxa de gás. As condições típicas de estado estacionário no biorreator de fermentação New Brunswick Scientific Bioflo® de laboratório sem reciclo de células, são um tempo de retenção de gás (vazão de gás/volume de líquido do reator) de 20 minutos, um tempo de retenção de líquidos (vazão de líquidos/volume de líquido do reator) de 30 horas e uma taxa de agitação de 900 rpm, produzindo conversões de CO de 92% e conversões de H2 de 60% com uma limitação de pantotenato.
[00226] Em uma modalidade, o reciclo de células é adicionado ao sistema de reator ao mesmo tempo que um ajuste na taxa de gás (aumento) e na concentração de um primeiro nutriente (redução). Com o reciclo de células no New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR, o tempo de retenção de gás é tipicamente de 8 minutos, o tempo de retenção de líquidos é de 12 horas, o tempo de retenção de células é de 40 horas e a taxa de agitação é de 900 rpm. Estas condições tipicamente produzem uma conversão de CO de 92% e uma conversão de H2 de 50% com uma limitação de pantotenato. Este método de fermentação contínua permite a produção contínua e a manutenção de altas concentrações de etanol com baixas concentrações do subproduto acetato sob condições de operação estáveis para aumentar o uso da bactéria de objetivo em uma escala industrial para produção de etanol.
[00227] Exemplo 2: Purga das Células de Bactérias Provenientes de um Recipiente de Fermentação para Controlar a Proporção de Produtos da Fermentação
[00228] Uma fermentação em substrato gasoso (30% de CO, 15% de H2, 10% de CO2, 45% de N2) ocorre em um CSTR (pH=5,0, Temperatura=38° C., Pressão=20 psig) utilizando C. ljungdahlii, cepa C- 01, com reciclo de células (tempo de retenção de células=40 horas e o tempo de retenção de líquidos=6 horas) e a cultura não é limitada em relação ao crescimento por cobalto, pantotenato de cálcio ou qualquer outro nutriente. À medida que a cultura cresce, é atingida uma densidade de células de forma que a captação específica (mmol de CO por grama de células secas por minuto) seja menor que 0,5 e o ácido acético é produzido preferencialmente em etanol. Para prevenir que isso ocorra, a taxa de purga de células é aumentada para prevenir um aumento na densidade de células, de forma que a concentração estacionária de células seja mantida baixa o suficiente para manter uma captação específica maior que 0,5 mmol de CO por grama de células secas por minuto. Fazendo isso, o tempo de retenção de células é reduzido para o intervalo de 6 e 25 horas. Ver a Tabela 2 para o monitoramento da concentração de células durante um processo de fermentação bacteriana de uma cepa de C. ljungdahlii.
TABELA 2 Concentrações de Células de Caldo Líquido de Fermentação Diferente Proveniente de Várias Purgas de Células em Intervalos de Tempo Diferentes Aceta Conc. % de to Tempo de CO H2 Etanol Acetato Produtividade Água Líqui Células a do (h) Reciclo (g/L) (%) (%) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L · dia) 75 25 2,1 95 68 12 4 4 12 193 50 2,1 95 75 15 6 5 15 462 75 2,1 92 60 17 5 4 17 554 50 1,6 85 30 17→13 5 3 12-16 669 75 2,6 92 75 13→19 5 3 12-18 943 100 3,0 92 70 23 6 3 23 1087 100 3,0 92 60 23 6 0 23 1232 100 2,7 92 60 23 6 −0 23 1375 100 3,0 91 60 27 6 −1 27 1534 100 3,5 88 35 23 5 0 23 a Base em peso de células secas
[00229] Exemplo 3: Análise de Biomassa Celular de Células de Bactérias Acetogênicas
[00230] Clostridium ljungdahlii C-01 foi crescido em um biorreator com gás de síntese. Uma amostra do fermentado do biorreator e a massa seca concentrada da biomassa de células foi analisada de acordo com os seguintes procedimentos na Tabela 3.
TABELA 3 Procedimentos para análise de amostras do fermentado AOAC 990.08: Cálcio, Ferro, Sódio Metais pesados: ICP-M, com base em AOAC 993.14 AOAC 994.10: colesterol AOAC 996.06: gordura bruta AOAC 992.16/991.43: fibras dietéticas AOAC 980.13: açúcares AOAC 926.08: umidade AOAC 990.03/992.23: proteína AOCS Ce 1j-07 e Ce 1h-05, AOAC 996.06: gordura 21 CFR 101.9: teor calórico por cálculo
[00231] Os resultados da análise da massa seca concentrada da biomassa de célula são mostrados na Tabela 4.
TABELA 4 Resultados de Peso Seco de Biomassa Os resultados da análise eram os seguintes: Teor por 100 gramas de biomassa acetogênica Analito (base em peso seco)
carboidratos 33,0 g calorias (calorímetro) 224,2 kcal proteína 60,4 g Cálcio 18 mg Ferro 152 mg Sódio 25 mg Potássio 1200 mg
[00232] Os resultados da análise de aminoácidos da massa seca concentrada da biomassa de células são mostrados na Tabela 5 aqui abaixo.
[00233] Exemplo 4: Análise do Teor de Proteínas, Carboidratos e Ácidos Nucleicos de Células de Bactérias Acetogênicas Clostridium ljungdahlii C-01 foi crescido em um biorreator com gás de síntese. A cultura de células foi centrifugada em 4.000 RPM para remover o meio de cultura. As pelotas foram coletadas e foi permitido que secassem em um forno a 100C durante toda a noite. 100 gramas de pelotas secas trituradas foram enviados para análise utilizando os mesmos testes para carboidratos e proteína que são descritos no Exemplo 3. A Tabela 6 indica que até 80% da massa de células são proteínas.
TABELA 5 Resultados da Análise de Aminoácido do Peso Seco de Biomassa Gramas por 100 gramas de biomassa acetogênica
(base em peso seco)
Aminoácidos totais
Ácido aspártico 7,36
Treonina 3,29
Serina 2,83
Ácido glutâmico 9,18
Prolina 2,29
Glicina 3,28
Alanina 5,44
Valina 4,39
Metionina 1,83
Isoleucina 4,44
Leucina 4,95
Tirosina 2,58
Fenilalanina 2,90
Histidina 1,70
Lisina 6,28
Arginina 2,77
Cisteína 1,05
Metionina 1,88 Triptofano 0,48 Aminoácidos Livres Ácido glutâmico 0,07 TABELA 6 Três Componentes de Consideração em um Suplemento Nutricional Rico em Proteínas Ácido Nucleico Número do Teste Carboidrato Proteína a 1 33% ≥ 60,6% ≥ 3% 2 7,06% ≥ 78,1% ≥ 3% 3 -- ≥ 78,9% ≥ 3% a Justificativa pelo fato de que há um teor de nitrogênio que não é de proteínas que é menor que 1%. A proporção de nitrogênio no ácido nucleico é de aproximadamente 3 g de RNA/DNA para 1 g de Nitrogênio, de forma que as amostras contivessem não mais que 3% de ácido nucleico.
[00234] Exemplo 5: Ruptura de Células de Bactérias por Um ou Mais Dispositivos de Ruptura com Microfluidização e a Recuperação da Proteínas para Ruptura de Células de Bactérias pelos Dispositivos de Ruptura com Microfluidização
[00235] O Microfluidizador da Microfluidics foi identificado como um dispositivo de ruptura para romper células de bactérias anaeróbias provenientes do processo de fermentação e produzir uma parte que contém proteínas. Um volume de líquido de fermentação foi obtido de um recipiente de fermentação. As amostras foram concentradas 1,5 vez por centrifugação ou até uma concentração de células de, por exemplo, aproximadamente 20 g/L ou maior. Por exemplo, aproximadamente 15 g/L de um líquido de fermentação foram obtidos de um recipiente de fermentação e as Amostras foram concentradas por centrifugação para a obtenção de uma densidade de células de 22,4 g/L ou maior.
[00236] As células resultantes foram ressuspensas em soluções (por exemplo, em uma solução de 2L que pode conter aproximadamente 44 g de células) e enviadas para Microfluidics. O processo de microfluidização envolve a ruptura das células com altas forças de cisalhamento criadas forçando as células através de microcanais dentro da câmara de reação Microfluidics a altas pressões.
[00237] Cada amostra foi processada em quantidade(s) de tempo diferente(s) e a uma pressão diferente. As pressões testadas variavam entre 10.000 e 30.000 libras por polegada quadrada (psi) para uma ou várias passagens. Cada passagem constitui uma rodada através do Microfluidizador. A pressão foi fornecida a uma taxa constante através do dispositivo de ruptura. O Microfluidizador gerou seis amostras homogeneizadas. As suspensões contendo células podem ser tratadas com um ou mais aditivos (por exemplo, detergentes, enzimas etc.) e passadas através do Microfluidizador (por exemplo, a cisalhamento ou pressões altas a 3.000 psi ou mais altas).
[00238] Vários experimentos foram realizados. Cada amostra foi processada a uma quantidade de tempo diferente e a uma pressão diferente. Dentre estes, são mostradas as condições para seis exemplos de experimentos de tratamento de amostras: (1) uma única passagem a
18.000 psi; (2) duas passagens a 18.000 psi; (3) uma única passagem a
23.000 psi; (4) duas passagens a 23.000 psi; (5) uma única passagem a
28.000 psi; (6) duas passagens a 28.000 psi. Cada passagem constitui um experimento que passa através do Microfluidizador. A pressão foi fornecida a uma taxa constante através do dispositivo de ruptura. As seis amostras homogeneizadas resultantes das frações contendo proteínas foram geradas após o tratamento com o Microfluidizador. Cada amostra da fração contendo proteínas foi analisada em relação ao teor de proteínas utilizando um ensaio de Bradford.
[00239] Em um experimento, algumas amostras foram tratadas apenas com uma passagem através do Microfluidizador. Após uma passagem, uma primeira parte que contém proteínas foi separada do homogenato. Então, a primeira parte que contém proteínas pode ser seca por spray para a obtenção de pó contendo proteínas.
[00240] Em um segundo experimento, as amostras foram tratadas com duas passagens através do Microfluidizador, no qual uma suspensão contendo células pré-tratada foi escoada através de um fluxo de reciclo para reentrar no Microfluidizador uma segunda vez. Após duas passagens, foi obtida uma parte que contém proteínas. Então, pode ser obtida a forma de pó da parte que contém proteínas. Por exemplo, três técnicas de secagem diferentes (secagem a altas temperaturas, secagem por spray e liofilização) foram testadas após a parte contendo proteínas ser obtida.
[00241] Exemplo 6: Fracionamento dos Homogenatos das Células de Bactérias Rompidas por Um ou Mais Dispositivos Fracionadores do Tipo Filtradores
[00242] O homogenato da parte contendo proteínas após o processo de tratamento do Exemplo 5 foi filtrado através de um filtro de nylon. A filtração do homogenato permitiu que 5-15% da biomassa microbiana original fossem recuperados na forma de proteína solúvel, como indicado na Tabela 7.
TABELA 7 Porcentagem de recuperação de proteínas solúveis após a filtração.
Porcentagem de recuperação de proteínas solúveis Amostra Filtradas 2.000 RPM 5.000 RPM 10.000 RPM Rodada 1 5 %-15 % 10 %-25 % 5 %-15 % 5 % -15 % Rodada 2 5 %-15 % 10 %-25 % 5 %-15 % 5 % -15 %
[00243] Exemplo 7: Fracionamento dos Homogenatos das Células de Bactérias Rompidas por Um ou mais Dispositivos Fracionadores do Tipo Centrifugadores
[00244] O homogenato do Exemplo 4 foi submetido à centrifugação em velocidades entre 2.000 e 10.000 RPM durante 6 minutos e o teor de proteína foi analisado utilizando o ensaio de proteínas de Bradford. A porcentagem de recuperação de proteínas solúveis foi calculada utilizando a concentração de biomassa inicial como uma base. Os resultados indicam que até 25% de proteína foram recuperados após a microfluidização, indicando que a microfluidização seguida pela centrifugação é um método viável de lisar as células e recuperar proteínas solúveis.
[00245] Como outro exemplo, uma suspensão celular com uma densidade de células de 22,4g/L (células no caldo de fermentação) foi enviada para o Microfluidics. Uma amostra foi passada através de um microfluidizador a 18.000 psi e outra amostra foi passada através do mesmo tipo de Microfluidizador duas vezes a uma pressão de 28.000 psi. Os resultados foram comparados e obtidos como mostrado na Tabela 8.
[00246] Para as amostras que passam uma vez a 18.000 psi, a concentração de proteínas no homogenato era de 9,5 mg/mL. A amostra foi então filtrada ou centrifugada e adicionalmente analisada. Após a filtração através de um filtro de 0,45 micra, a fração rica em proteínas continha 2,4 mg/mL de proteína. Após a centrifugação durante 8 minutos a 2.000 RPM, a concentração de proteínas da fração rica em proteínas é de aproximadamente 3,2 mg/mL de proteína. Velocidades mais altas de centrifugação resultaram em menos proteína (a 5.000 RPM, a concentração de proteínas da fração recuperada era de aproximadamente 1,0 mg/mL ou mais ou aproximadamente 1,9 mg/mL ou mais. À velocidade de centrifugação mais alta de 10.000 RPM, a concentração de proteína resultante da fração de sobrenadante após a centrifugação era de aproximadamente 1,4 mg/mL).
TABELA 8 Concentração (μg/mL) e Porcentagem (%) de Proteínas Dentro dos Homogenatos (Misturas de Células de Bactérias Rompidas) Filtradas b Centrifugadas (rpm) Homogenato b (filtro de 2.000 5.000 10.000 0,45 micra) rpm rpm rpm 1878, 3178,4 6 1423,3 18k, 1 passagem 9502 μg/mL 2371 μg/mL μg/mL μg/m μg/mL
L Recuperação de 42,4% 10,6% 14,2% 8,4% 6,35% Proteínas a 2007, 3006,9 8 1330,3 28k, 2 passagens 8549 μg/mL 1777 μg/mL μg/mL μg/m μg/mL
L Recuperação de 38,2% 7,9% 13,4% 8,96% 5,94% Proteínas a a Porcentagens calculadas determinando o teor de proteínas de massa de células total.
b O homogenato e as amostras filtradas foram diluídos 11X antes da medida.
[00247] Outro grupo de amostras foi tratado com duas passagens pelo Microfluidizador a 28.000 psi, em que uma suspensão contendo células previamente lisadas foi escoada através de um fluxo de reciclo para reentrar no Microfluidizador uma segunda vez. A concentração de proteína resultante da parte contendo proteínas no homogenato foi medida em torno de 8,5 mg/mL. As amostras foram então filtradas e/ou centrifugadas. Após a filtração através de um filtro de 0,45 micra, a concentração de proteína resultante era de aproximadamente 1,8 mg/ml. Após a centrifugação durante 8 minutos a 2000 RPM, a concentração de proteína resultante era de aproximadamente 3,0 mg/mL. Uma velocidade de centrifugação mais alta resultou em menos proteína (a 5000 RPM, esta era de 2,0 mg/mL; a 10000 RPM esta era de 1,3 mg/mL).
[00248] Exemplo 8: Lise de Células Provenientes da Ruptura de Células de Bactérias por Um ou Mais Dispositivos de Ruptura com Microfluidização
[00249] Os dispositivos de ruptura selecionados para a realização do processo de ruptura podem ser microfluidizadores e outros dispositivos disponíveis comercialmente. Nas Figuras 7B-7E, os dispositivos de ruptura selecionados para a realização do processo de ruptura são um microfluidizador. O processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura pode ser conduzido sob variáveis diferentes, incluindo pressão e tempos de passagens.
[00250] A Figura 7A ilustra uma micrografia eletrônica da suspensão contendo células que não foi submetida à lise. A micrografia eletrônica foi obtida por um microscópio e em um aumento de 100X direcionado para o homogenato.
[00251] A suspensão contendo células selecionada para passar pelo processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura pode ser de densidades diferentes. Na Figura 7A, a densidade da suspensão contendo células que não passou por um processo de ruptura é de aproximadamente 10 g/L ou mais, tal como de aproximadamente 16 g/L ou mais.
[00252] A Figura 7B ilustra outra micrografia eletrônica do homogenato que é obtido dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 e é um produto da ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00253] A micrografia eletrônica foi obtida por microscópio e em um aumento de 100X direcionado para o homogenato. Nesta Figura 7B, os dispositivos de ruptura selecionados para a realização do processo de ruptura são um microfluidizador. Nesta Figura 7B, o processo de ruptura é realizado a uma pressão de 1.000 psi ou mais (por exemplo, entre 1.000 libras por polegada quadrada (psi) a 9.000 psi ou mais) contra a suspensão contendo células e com uma passagem. Ainda, na Figura 7B, a densidade de células de suspensão contendo células selecionada para este processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura é de aproximadamente 10 g/L ou mais, tal como de aproximadamente 16 g/L ou mais. Visualmente, há um dano significativo causado às membranas celulares como um resultado do processo de microfluidização.
[00254] A Figura 7C ilustra uma micrografia eletrônica das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células antes desta ser rompida dentro dos dispositivos de ruptura 460, 560 ou 660, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00255] A micrografia eletrônica foi obtida por microscópio e em um aumento de 100X direcionado para o homogenato. Nesta Figura 7C, a densidade de células da suspensão contendo células selecionada para este processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura é de aproximadamente 10 g/L ou mais, tal como de aproximadamente 16 g/L ou mais. O processo de ruptura é realizado a uma pressão de aproximadamente 1.000 psi ou mais (por exemplo, entre 1.000 libras por polegada quadrada (psi) a 20.000 psi ou mais) contra a suspensão contendo células e com uma passagem. Comparados com os resultados na Figura 7A, os resultados que são mostrados na Figura 7C mostra a ruptura significativa das membranas celulares ocorrida a esta pressão de processamento.
[00256] A Figura 7D ilustra outra micrografia eletrônica do homogenato que é obtido dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 e é um produto da ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00257] A micrografia eletrônica foi obtida por microscópio e em um aumento de 800X direcionado para o homogenato. Nesta Figura 7D, os dispositivos de ruptura selecionados para a realização do processo de ruptura são um microfluidizador. Nesta Figura 7D, o processo de ruptura é realizado a uma pressão de 1.000 psi (por exemplo, entre 1.000 libras por polegada quadrada (psi) a 22.000 psi ou mais) contra a suspensão contendo células e com uma passagem. Ainda, nesta Figura 7D, a densidade de suspensão contendo células selecionada para este processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura é de aproximadamente 15 g/L ou mais, tal como de aproximadamente 20 g/L ou mais ou de aproximadamente 22,4g/L ou mais.
[00258] A Figura 7E ilustra outra micrografia eletrônica do homogenato que é obtido dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 e é um produto da ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00259] A micrografia eletrônica foi obtida por microscópio e em um aumento de 800X direcionado para o homogenato. Nesta Figura 7E, os dispositivos de ruptura selecionados para a realização do processo de ruptura são um microfluidizador. Nesta Figura 7E, o processo de ruptura é realizado a uma pressão de 1.000 psi (por exemplo, entre 25.000 libras por polegada quadrada (psi) a 30.000 psi ou mais) contra a suspensão contendo células e com duas passagens. Ainda, nesta Figura 7E, a densidade de células da suspensão contendo células selecionada para este processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura é de aproximadamente 15 g/L ou mais, tal como de aproximadamente 20 g/L ou mais ou de aproximadamente 23 g/L ou mais.
[00260] Exemplo 9: Ruptura das Células de Bactérias por Um ou Mais
Dispositivos de Ruptura com Microfluidização com Pré-Tratamento das Células de Bactérias em um Tanque de Retenção que Contém Células
[00261] O dispositivo de ruptura Microfluidizador (por exemplo, dispositivo da Microfluidics) foi utilizado para romper as células de bactérias anaeróbias provenientes do processo de fermentação e produzir uma parte que contém proteína. O caldo líquido de fermentação (por exemplo, a 15 g/L de densidade de células) foi obtido do reator de laboratório de alta densidade de células partindo de um recipiente de fermentação. As amostras foram concentradas por centrifugação para a obtenção de uma densidade de células de 45 g/L. A suspensão de células resultante (2L contendo 90 g de células) foi enviada para um tanque de retenção que contém células para pré-tratamento.
[00262] O processo de microfluidização envolve a ruptura de células com altas forças de cisalhamento criadas forçando as células através de uma câmara de reação de 1 mícron a altas pressões. As suspensões contendo células que contêm as células de bactérias foram divididas em seis amostras. As suspensões contendo células foram tratadas com um ou mais aditivos (por exemplo, detergentes, enzimas etc.) e passadas através do Microfluidizador a 15.000 psi. Apenas uma passagem através do dispositivo de ruptura microfluidizador foi realizada. Após uma passagem, uma primeira parte contendo proteínas foi separada do homogenato e seca por spray.
[00263] Exemplo 10: Ruptura de Células de Bactérias por Um ou Mais Dispositivos de Ruptura com Sonicação
[00264] Um sonicador foi identificado como um dispositivo de ruptura para romper células de bactérias anaeróbias provenientes do processo de fermentação e produzir uma parte que contém proteína. 15 g/L de líquido de fermentação foram obtidos partindo do reator de laboratório de alta densidade de células de um recipiente de fermentação. As amostras foram concentradas por centrifugação para a obtenção de uma densidade de células de 22,4 g/L. A ressuspensão de células resultante (2L contendo 44 g de células) foi submetida à sonicação. O processo de sonicação envolve a ruptura de células com alta força através de energia sonora em frequências ultrassônicas que agitam as células e rompem as membranas celulares. A suspensão contendo células que contém as células de bactérias foi dividida em seis amostras. Cada amostra foi submetida à sonicação.
[00265] Exemplo 11: Ruptura de Células de Bactérias por Um ou Mais Dispositivos de Ruptura com Sonicação com Pré-Tratamento das Células de Bactérias em um Tanque de Retenção que Contém Células
[00266] Um sonicador foi identificado como um dispositivo de ruptura para romper células de bactérias anaeróbias provenientes do processo de fermentação e produzir uma parte que contém proteína. O caldo líquido de fermentação foi obtido partindo de três recipientes de fermentação com alta densidade de células. As amostras foram concentradas através de centrifugação para a obtenção de densidades de células entre 4 e 10 mg/mL.
[00267] Por exemplo, um caldo líquido de fermentação obtido de um recipiente de fermentação (neste exemplo, um exemplo de recipiente A) contendo aproximadamente 4,2 mg/mL de células de bactérias foi submetido à sonicação em uma variedade de tampões. Uma suspensão contendo células proveniente de outro recipiente de fermentação (um exemplo de recipiente B) contendo aproximadamente 9,2 mg/mL de células de bactérias anaeróbias foi submetida à sonicação em uma variedade de tampões. Uma suspensão contendo células proveniente de outro recipiente de fermentação (um exemplo de recipiente C) contendo aproximadamente 7,1 mg/mL de células também foi submetida à sonicação em uma variedade de tampões.
[00268] Após a coleta dos caldos de fermentação provenientes do recipiente de fermentação, as células de bactérias provenientes do caldo de fermentação foram baixadas através de centrifugação (por exemplo, centrifugando as células de bactérias a 4.000 RPM ou velocidade de centrifugação maior) e ressuspensas em seus respectivos tampões.
[00269] As células foram ressuspensas em tampão contendo detergente (TrisHCl pH 8 contendo dodecil sulfato de sódio (SDS), CHAPS, Triton X-100 ou Tween 20) ou tampão contendo enzima (TrisHCl pH 8 contendo lisozima). O TrisHCl pH 8 foi utilizado como o tampão de controle. A suspensão de células resultante foi submetida à sonicação.
[00270] As células foram submetidas à sonicação em pulsos de 5 segundos seguidos por repousos em gelo entre eles. O ciclo foi repetido três vezes. Após a sonicação, as células foram centrifugadas durante 10 minutos a 20K RPM e o sobrenadante foi removido. A fração de proteínas solúveis foi analisada em relação ao teor de proteína utilizando um ensaio de proteína com base em Lowry. As porcentagens de recuperação de proteínas solúveis foram calculadas com base na concentração de células submetida à sonicação.
[00271] Várias amostras também foram submetidas a um ciclo de congelamento/descongelamento, em que as células foram completamente congeladas em tampão Tris HCl. Após o congelamento a -80 graus Celsius, as células foram completamente descongeladas antes do recongelamento. Este ciclo foi concluído 5 vezes. Após a conclusão, a suspensão contendo células foi centrifugada a 20.000 RPM durante 10 minutos e o sobrenadante foi removido. A Tabela 9 mostra as quantidades de recuperação de proteínas pelo tipo de tampão ao qual as amostras da suspensão contendo células foram submetidas. As porcentagens de recuperação de proteínas solúveis foram calculadas com base nos materiais de partida iniciais. Os materiais de partida incluem líquido de fermentação que compreende um meio nutricional líquido, outros minerais essenciais e um acúmulo de biomassa acetogênica.
[00272] O líquido de fermentação foi obtido partindo de três recipientes de fermentação com alta densidade de células. As amostras foram concentradas através de centrifugação a 4.000 RPM para a obtenção de densidades de células entre 4 e 10 mg/mL. As células foram ressuspensas em tampão contendo detergente (TrisHCl pH 8 contendo dodecil sulfato de sódio (SDS), CHAPS, Triton X-100 ou Tween 20) ou tampão contendo enzima (TrisHCl pH 8 contendo lisozima). O TrisHCl pH
8 foi utilizado como o tampão de controle. A suspensão de células resultante foi submetida à sonicação. O processo de sonicação envolve a ruptura de células com alta força através de energia sonora em frequências ultrassônicas que agitam as células e rompem as membranas celulares.
[00273] As células foram submetidas à sonicação em pulsos de 5 segundos seguidos por repouso em gelo entre eles. O ciclo foi repetido três vezes. Após a sonicação, as células foram centrifugadas durante 10 minutos a 20.000 RPM e o sobrenadante foi removido. A fração de proteínas solúveis foi analisada em relação ao teor de proteína utilizando um ensaio de proteína baseado em Lowry. As porcentagens de recuperação de proteínas solúveis foram calculadas com base na concentração de células submetida à sonicação.
[00274] Os resultados, mostrados na Tabela 9, indicam que os aditivos de detergente podem aumentar a solubilidade de proteínas quando as células são submetidas à sonicação. Especificamente, a adição de SDS ou lisozima aumenta enormemente a solubilidade das proteínas de membrana.
[00275] Exemplo 12: Fracionamento dos Homogenatos das Células de Bactérias Rompidas por Um ou Mais Dispositivos Fracionadores do Tipo Filtradores
[00276] O homogenato do Exemplo 4 é filtrado através de um filtro de nylon. A filtração do homogenato permitiu que 10,7% da biomassa microbiana original fossem recuperados na forma de proteína solúvel.
TABELA 9 Proteína Rompida Recuperada em Porcentagem (%) Recipiente Recipiente Tipo de Tampão Recipiente Tipo 2 Tipo 1 Tipo 3 0,1-1% de SDS 20-35 13-26 25-35 0,5-2% de CHAPS 7-18 7-12 5-11
TABELA 9 0,1-2% de Triton 10-25 5-10 5-13 X-100 2,5-5% de Tween 10-20 10-20 10-20 20 Controle 15-20 8-13 8-13 Tris HCl 5-10 5-10 5-10 Congelamento/De scongelamento Lisozima 25-30 15-20 15-20
[00277] Exemplo 13: Fracionamento dos Homogenatos das Células de Bactérias Rompidas por Um ou Mais Dispositivos Fracionadores do Tipo Centrifugadores
[00278] O homogenato do Exemplo 4 foi submetido à centrifugação a 2000 rpm, que fracionou 3,2 mg de proteína no sobrenadante. A centrifugação do homogenato permitiu uma recuperação de 14,3% de proteína solúvel separada da massa total de células da biomassa microbiana inicial coletada partindo do recipiente de fermentação.
[00279] Exemplo 14: Determinação do Efeito do pH na Suspensão Contendo Células Sobre a Proteína Recuperada Após a Ruptura Através de Um ou Mais Dispositivos de Ruptura
[00280] As amostras foram coletadas de um recipiente de fermentação com alta densidade de células contendo células de Clostridium ljungdahlii. A concentração de células no momento da coleta era de aproximadamente 22 g/L e tinha um valor de pH de aproximadamente 4.5. Um volume de cultura de células foi centrifugado a 4.000 RPM durante 10 minutos. As pelotas de células foram ressuspensas no mesmo volume de TrisHCl que o volume de meio de cultura que foi removido após a centrifugação (de forma que as amostras não foram concentradas ou diluídas). Vários volumes de cultura de células foram submetidos à modificação do pH através da adição de NaOH a 0,5 M de forma que o pH final do caldo de cultura ficasse entre 3,5 e 10. As amostras foram processadas entre 10.000 e 20.000 psi para uma ou várias passagens. Cada amostra foi centrifugada a 13.300 RPM durante 6 minutos. O sobrenadante foi coletado e um ensaio de proteína baseado em Lowry foi utilizado para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel.
[00281] Os dados, mostrados na Tabela 10, indicam que um aumento no pH do homogenato de células antes da microfluidização aumenta a solubilidade de proteína. Especificamente, quando o pH é alto (acima de 7,6), a recuperação de proteína solúvel é maior.
TABELA 10 Proteína Rompida Recuperada em Porcentagem (%) Amostra Passa mg/mL % de gens Recupera ção pH 3,5 – 5 1–4 2,5-3,5 12-15 pH 5 – 7,5 1–4 7-10 40-45 pH 7,6 – 10 1–4 10-15 50-55 TrisHCl pH 8 1–4 9-15 40-60
[00282] Exemplo 15: Determinação do Efeito do pH na Suspensão Contendo Células Sobre a Proteína Recuperada após a Ruptura Através de Um ou Mais Dispositivos de Ruptura
[00283] As amostras foram coletadas de um recipiente de fermentação com alta densidade de células contendo células de Acetobacterium woodii. O peso de células secas da concentração de células no momento da coleta era de aproximadamente 3 g/L e tinha um valor de pH de aproximadamente 6,1. Um volume de cultura de células foi centrifugado a 4.100 RPM durante 10 minutos. As pelotas de células foram ressuspensas no mesmo volume de TrisHCl que o volume de meio de cultura que foi removido após a centrifugação (de forma que as amostras não foram concentradas ou diluídas). Vários volumes de cultura de células foram submetidos à modificação do pH através da adição de NaOH a 0,5 M de forma que o pH final do caldo de cultura ficasse entre 6 e 10. As amostras foram processadas entre 10.000 e
20.000 psi para uma passagem. Cada amostra foi centrifugada a 9.800 RPM durante 30 minutos. O sobrenadante foi coletado e um ensaio de proteína baseado em Lowry foi utilizado para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel.
[00284] Os dados, mostrados na Tabela 11, indicam que um aumento no pH da amostra de células antes da microfluidização aumenta a solubilidade de proteína. Especificamente, quando o pH é aumentado, a recuperação de proteína solúvel é maior.
TABELA 11 Proteína Rompida Recuperada em Porcentagem (%) Amostra Passagens mg/mL % de Recuperação através do microfluidiza dor pH 6-6,5 1 1,5-2,0 60-65 pH 6,5– 7,5 1 2,0-2,2 65-72,5 pH 7,5 – 8,5 1 2,2-2,3 72,5-76 pH 8,5 – 9,5 1 2,3-2,5 76-80
[00285] Exemplo 16. Determinação do Efeito da Lisozima Sobre a Recuperação de Proteínas Solúveis
[00286] As amostras foram coletadas partindo de um recipiente de fermentação com alta densidade de células. Um volume de cultura de células foi centrifugado e ressuspenso em tampão TrisHCl da mesma maneira que a determinada anteriormente. O pH do caldo de cultura foi aumentado para pH 8 utilizando hidróxido de sódio a 0,5 M. Para determinar o efeito do pré-tratamento enzimático, foi utilizado 0,5 mg/mL de lisozima. Para as amostras de caldo de cultura, a incubação com a lisozima durou ~30 minutos à temperatura ambiente. Para as amostras com TrisHCl, a incubação com a lisozima durou ~45 minutos à temperatura ambiente (diferença devido ao atraso no processamento com o microfluidizador como o limitador).
[00287] As amostras foram processadas entre 10.000 e 20.000 psi para uma ou várias passagens. Os controles também foram rodados quando as amostras não foram processadas através do microfluidizador. Cada amostra foi centrifugada a 13.300 RPM durante 6 minutos. O sobrenadante foi coletado e ensaios de proteína com base em Lowry e com base em Bradford foram utilizados para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel e os resultados são mostrados na Tabela
12.
TABELA 12 Proteína Rompida Recuperada em Porcentagem (%) Amostra # de mg/m % de Recuperação passagens L de Proteína Caldo de Cultura 1–4 4-9 25-46 Caldo de cultura com 1–4 4,5-10 25-52 lisozima TrisHCl 1–4 4,5-9 26-46 TrisHCl com lisozima 1–4 5-12 28-64 Sobrenadante do reator 0 0,5-1 0,02-4,5 TrisHCl com lisozima 0 2-5 4-25 Caldo de cultura 0 1-2 0,25-8,5 Caldo de cultura com 0 2-5 3-22 lisozima
[00288] Exemplo 17. Determinação do Efeito da Redução da Concentração de Lisozima e do Prolongamento do Tempo de Incubação.
As amostras foram coletadas partindo de um recipiente de fermentação com alta densidade de células e foram concentradas por centrifugação durante 10 minutos a 4.000 RPM. O pH do caldo de cultura foi ajustado em 7 – 10. Algumas amostras foram incubadas a 37C com 100 ng/mL de lisozima durante uma hora. As amostras foram coletadas a cada 10 minutos para monitorar a atividade da lisozima. Foram coletadas amostras grandes em 30 minutos e 1 hora e processadas através do microfluidizador a 10.000 a 20.000 psi para uma ou várias passagens. Cada amostra foi centrifugada a 13.300 RPM durante 6 minutos. O sobrenadante foi coletado e um ensaio de proteína com base em Lowry foi utilizado para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel e os resultados são mostrados na Tabela 13.
[00289] Exemplo 18. Efeito do pH e da Concentração de Células Sobre a Extração de Proteína.
[00290] As amostras do recipiente de fermentação com alta densidade de células foram diluídas até concentrações entre 1 e 10 g/L através de centrifugação e ressuspensão em meio de cultura. O pH do caldo de cultura foi ajustado entre 6 e 10 utilizando hidróxido de sódio a 0,5 M. As amostras (incluindo o caldo de cultura não modificado no pH de fermentação) foram processadas entre 10.000 e 20.000 psi através do microfluidizador para uma ou várias passagens. Similarmente, a purga de cultura não diluída proveniente do recipiente de fermentação com alta densidade de células foi processada em um valor de pH ácido e um valor de pH alcalino. Cada amostra foi centrifugada a 13.300 RPM durante 6 minutos.
TABELA 13 Proteína Rompida Recuperada em Porcentagem (%)
TABELA 13 % de Recupe Concentraçã Pressão do mg/ ração Enzima Amostra o de Células, microfluidiza mL de g/L dor, psi Proteína Solúvel Nenhu Sobrena -- 0 0,5-1 -- ma dante 0 1-2 7-10 10-15 10,000- 5-10 42-52 Nenhu Caldo de 20,000 ma cultura 0 1,5-3 3,5-4,5 40-50 10,000- 15-20 35-46 20,000 1,5- 0 3,5-5 Caldo de 2,3 Lisozima 40-50 cultura 10,000- 15-20 35-46 20,000
[00291] O sobrenadante foi coletado e um ensaio de proteína baseado em Lowry foi utilizado para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel. A Tabela 14 indica que à medida que o pH do caldo de cultura aumenta antes da microfluidização, a quantidade de proteína recuperada na fração solúvel aumenta.
TABELA 14 Recuperação de Proteínas Rompidas (Concentração de Proteínas indicadas) Amostra Células Coletadas pH do Proteína
TABELA 14 (Concentração: g/L) caldo Rompida de (mg/mL) cultura 1 1 4-5 0,92 2 1 6-7 1,03 3 1 8-9 1,23 4 5 4-5 1,3 5 5 6-7 2,7 6 5 8-9 3 7 10 4-5 1,7 8 10 6-7 4,3 9 10 8-9 5,0 10 18,5 4-5 7,1 10 18,5 8-9 8,9
[00292] A Figura 8A ilustra um gráfico de proteína solúvel obtido do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 e de membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00293] Os dispositivos de ruptura selecionados para a realização do processo de ruptura podem ser microfluidizadores e outros dispositivos disponíveis comercialmente. Nesta Figura 8A, os dispositivos de ruptura selecionados para a realização do processo de ruptura são um microfluidizador.
[00294] O processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 pode ser realizado sob variáveis diferentes, incluindo pressão e tempos de passagens. Nesta Figura 8A, o processo de ruptura é realizado à pressão de 15.000 libras por polegada quadrada (psi) contra a suspensão contendo células e sob apenas uma passagem.
[00295] A suspensão contendo células selecionada para passar pelo processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 pode ser de densidades diferentes. Nesta Figura 8A, quatro fluxos de suspensões contendo células são selecionados para este processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660. Cada uma das densidades das suspensões contendo células é 1g/L, 5g/L, 10g/L e 18,5 g/L.
[00296] O eixo y da linha 802 representa o rendimento da proteína proveniente do homogenato de células rompidas e obtido do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 preparado sob condições de pH diferentes (eixo X) partindo das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células com uma densidade de 18,5 g/L, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00297] O eixo y da linha 804 representa o rendimento da proteína proveniente do homogenato de células rompidas e obtido do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 preparado sob condições de pH diferentes (eixo X) partindo das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células com uma densidade de 10 g/L, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00298] O eixo y da linha 806 representa o rendimento da proteína proveniente do homogenato de células rompidas e obtido do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 preparado sob condições de pH diferentes (eixo X) partindo das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células com uma densidade de 5 g/L representado graficamente contra condições de pH diferentes, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00299] O eixo y da linha 808 representa o rendimento de proteínas provenientes do homogenato de células rompidas e obtido do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 a preparado sob condições de pH diferentes (eixo X) partindo das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células com uma densidade de 1 g/L, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00300] A suspensão contendo células selecionada para passar pelo processo de ruptura dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 pode ter valor de pH diferente, dentro de uma faixa de 1 a 14. O valor do pH da suspensão contendo células pode ser ajustado através de vários métodos, incluindo adição de ácidos, bases ou sais ou combinações dos mesmos. Aqui na Figura 8A, o valor do pH de suspensão contendo células é ajustado em aproximadamente 6 ou 8 utilizando hidróxido de sódio de 0,5M. O valor do pH da suspensão contendo células pode ser ajustado antes da suspensão contendo células que ser rompida dentro do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660. Por exemplo, o valor do pH da suspensão contendo células pode ser ajustado dentro do tanque de retenção que contém células 445, 545 ou 645.
[00301] Exemplo 19. Efeito do pH em Altas Concentrações Sobre Suspensões Contendo Proteína.
[00302] As amostras foram coletadas partindo de um recipiente de fermentação com alta densidade de células e concentradas 3 vezes através da centrifugação das células durante 10 minutos a 4.000 RPM. As pelotas de células foram ressuspensas em meio de cultura. O meio de cultura foi ajustado para pH entre 5 e 10 utilizando hidróxido de sódio concentrado. Por exemplo, as amostras foram concentradas em 45 g/L através da centrifugação das células durante 10 minutos a 4.000 RPM. As pelotas de células foram ressuspensas em meio de cultura. O pH da mistura de células resultante foi modificado para 5, 6, 7 ou 8 utilizando hidróxido de sódio a 0,5 M. As amostras foram processadas a 15.000 PSI através do microfluidizador por uma passagem. Cada amostra foi centrifugada a 13.300 RPM durante 6 minutos. O sobrenadante foi coletado e um ensaio de proteína baseado em Lowry foi utilizado para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel.
[00303] A Figura 8B ilustra um gráfico do rendimento de proteína solúvel obtida partindo do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 e de membranas celulares das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
[00304] Na Figura 8B, os dispositivos de ruptura selecionados para a realização do processo de ruptura são um microfluidizador. Na Figura 8B, o processo de ruptura é realizado à pressão entre 10.000 e 20.000 psi contra a suspensão contendo células para uma ou várias passagens. O sobrenadante foi coletado através de centrifugação a 13.300 RPM e a proteína foi analisada utilizando um ensaio de proteína baseado em Lowry. A Tabela 15 indica que o aumento do pH do caldo de cultura de 4-5 para 6-10 aumenta de forma significativa a porcentagem de proteína que é recuperada na fração solúvel.
[00305] O eixo y da linha 812 representa o efeito do pH sobre o rendimento de proteína partindo do homogenato de células rompidas e obtido partindo do dispositivo de ruptura 460, 560 ou 660 preparado sob condições de pH diferentes (eixo X) partindo das células de bactérias anaeróbias dentro da suspensão contendo células com uma densidade de 45 g/L de uma alteração no valor de pH da suspensão contendo células, de acordo com uma ou mais modalidades da invenção.
TABELA 15 Recuperação de Proteínas Rompidas Purificadas de 45 g/L de Células (concentração de proteínas que é indicada em mg/mL) Concentração Amostra pH do caldo de cultura de proteínas (mg/mL) 1 4-5 7,7 2 6-7 16 3 7,1-8 18,1 4 8,1-10 18,4
[00306] Exemplo 20: Determinação do Efeito do pH no Homogenato Sobre a Proteína Recuperada após a Ruptura Através de Um ou Mais
Dispositivos de Ruptura
[00307] As amostras foram coletadas de um recipiente de fermentação com alta densidade de células contendo células de Clostridium ljungdahlii. A concentração de células no momento da coleta era de aproximadamente 18 g/L e tinha um valor de pH de aproximadamente 4,5. Um volume de cultura de células foi centrifugado a 4.000 RPM durante 10 minutos. As amostras foram processadas entre 15.000 psi para zero ou uma passagem. Então, vários volumes de cultura de células foram submetidos à modificação do pH através da adição de 0,5M de NaOH ou NH4OH de forma que o pH final do caldo de cultura ficasse entre aproximadamente 8. Cada amostra foi centrifugada a 13.300 RPM durante 6 minutos. O sobrenadante foi coletado e um ensaio com base em Lowry foi utilizado para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel.
[00308] Os dados, mostrados na Tabela 16, indicam que um aumento no pH do homogenato de células após a microfluidização aumenta a solubilidade de proteína. Especificamente, quando o pH é aumentando, a recuperação de proteína solúvel é maior.
TABELA 16 Taxa de Recuperação de Proteínas em Porcentagem (%) Valor de pH Agente de Passagen mg/mL % de da Amostra ajuste de pH s Recupera ção 4,5 nenhum 0 0,4 1,5-2 4,5 nenhum 1 3,3 15-20 8 NH4OH 1 6,4 30-35 8 NaOH 1 8,3 40-45
[00309] Exemplo 21: Determinação do Efeito do pH nas Amostras de Células Sobre a Proteína Recuperada sem a Ruptura
[00310] As amostras foram coletadas de um recipiente de fermentação com alta densidade de células contendo células de Clostridium ljungdahlii. A concentração de células no momento da coleta era de aproximadamente 18 g/L e tinha um valor de pH de aproximadamente 4,5. Um volume de cultura de células foi centrifugado a 4.000 RPM durante 10 minutos. Então, vários volumes de cultura de células foram submetidos à modificação do pH através da adição de 0,5M de NaOH ou NH4OH de forma que o pH final do caldo de cultura fosse de aproximadamente 8. A seguir, as amostras foram processadas entre
15.000 psi. Cada amostra foi centrifugada a 13.300 RPM durante 6 minutos. O sobrenadante foi coletado e um ensaio com base em Lowry foi utilizado para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel. Os dados, mostrados na Tabela 17, indicam que um aumento no pH das amostras de células antes da microfluidização aumenta a estabilidade de proteína. Especificamente, quando o pH for alto, a recuperação de proteína solúvel é maior.
TABELA 17 Taxa de Recuperação de Proteínas em Porcentagem (%) Valor de Agente de Passagens mg/mL % de pH da ajuste de Recupera amostra pH ção 4,5 Nenhum 0 0,3-0,5 1,5-2,0 8 NH4OH 0 0,4-0,6 2,1-2,6 8 NaOH 0 0,8-1,0 4,5-5,0
[00311] Exemplo 22: Determinação do Efeito do pH nas Amostras de Células sobre a Proteína Recuperada após a Ruptura Através de Um ou Mais Dispositivos de Ruptura
[00312] As amostras foram coletadas de um recipiente de fermentação com alta densidade de células contendo células de
Clostridium ljungdahlii. A concentração de células no momento da coleta era de aproximadamente 18 g/L e tinha um valor de pH de aproximadamente 4,5. Um volume de cultura de células foi centrifugado a 4.000 RPM durante 10 minutos. Então, vários volumes de cultura de células foram submetidos à modificação do pH através da adição de 0,5M de NaOH ou NH4OH de forma que o pH final do caldo de cultura fosse de aproximadamente 8. A seguir, as amostras foram processadas entre
15.000 psi para uma passagem. Cada amostra foi centrifugada a 13.300 RPM durante 6 minutos. O sobrenadante foi coletado e um ensaio com base em Lowry foi utilizado para determinar a concentração de proteínas na fração solúvel.
[00313] Os dados, mostrados na Tabela 18, indicam que um aumento no pH das amostras de células antes de microfluidização aumenta a solubilidade da proteína. Especificamente, quando o pH for alto, a recuperação de proteína solúvel é maior.
TABELA 18 Taxa de Recuperação de Proteínas em Porcentagem (%) Valor de Agente de Passa mg/mL % de pH da ajuste de pH gens Recupera amostra ção 4,5 Nenhum 1 3,0-3,5 15-20 8 NaOH 1 10,0-10,5 50-55 8 NH4OH 1 11,0-11,5 55-60
[00314] Embora o que foi descrito acima seja direcionado para as modalidades da presente invenção, outras e modalidades adicionais da invenção podem ser planejadas sem se afastar do seu âmbito básico e seu âmbito é determinado pelas Reivindicações a seguir.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, contendo proteínas purificado a partir de células de bactérias anaeróbias, caracterizado por que compreende: a fermentação de um substrato gasoso com células de bactérias anaeróbias em um caldo líquido de fermentação dentro de um recipiente de fermentação, em que o caldo líquido de fermentação está em um primeiro valor de pH; a separação de uma quantidade do caldo líquido de fermentação que será fornecido partindo do recipiente de fermentação em uma concentração de células inicial em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias; o fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH para ajustar o pH da suspensão contendo células, em que o pH da suspensão contendo células é ajustado em um segundo valor de pH maior que o primeiro valor de pH; a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias contidas dentro da suspensão contendo células em um homogenato que tem o produto contendo proteínas a uma primeira taxa de recuperação de proteínas, em que a primeira taxa de recuperação de proteínas é uma porcentagem de uma concentração de proteínas (gramas por litro) do produto contendo proteínas dividida pela concentração de células inicial (gramas por litro); e o fracionamento do homogenato em uma primeira parte contendo proteínas a uma segunda taxa de recuperação de proteínas e uma parte de restos celulares contendo proteínas a uma terceira taxa de recuperação de proteínas.
2. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o segundo valor de pH está em uma faixa de 5 a 12.
3. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o segundo valor de pH está em uma faixa de 7 a 12.
4. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que um ou mais agentes de ajuste do pH são selecionados do grupo que consiste em hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e uma combinação dos mesmos.
5. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que um ou mais agentes de ajuste do pH são adicionados à suspensão contendo células antes de ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias.
6. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que um ou mais agentes de ajuste do pH são adicionados à suspensão contendo células após a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias.
7. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda: manter a suspensão contendo células contendo as células bacterianas anaeróbias no segundo valor de pH em um tanque de retenção contendo células antes da ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias.
8. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda: manter a suspensão contendo células contendo as células bacterianas anaeróbias no segundo pH em um tanque de retenção contendo células após a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias.
9. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a primeira taxa de recuperação de proteínas fica entre 10% e 95%.
10. Processo Para Obter Alta Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a segunda taxa de recuperação de proteínas fica entre 10% e 85% e a terceira taxa de recuperação de proteínas fica entre 10% e 75%.
11. Processo Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, contendo proteínas purificado a partir de células de bactérias anaeróbias, caracterizado por que compreende: a fermentação de um substrato gasoso com células de bactérias anaeróbias em um caldo líquido de fermentação dentro de um recipiente de fermentação, em que o caldo líquido de fermentação está em um primeiro valor de pH; a separação do caldo líquido de fermentação que será fornecido partindo do recipiente de fermentação em uma solução de permeado livre de células e uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias; o fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH para ajustar o pH da suspensão contendo células, em que o pH da suspensão contendo células é ajustado em um segundo valor de pH maior que o primeiro valor de pH; a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias contidas dentro da suspensão contendo células em um homogenato que tem o produto contendo proteínas a uma primeira taxa de recuperação de proteínas, em que a primeira taxa de recuperação de proteínas é uma porcentagem de uma concentração de proteínas (gramas por litro) do produto contendo proteínas dividida pela concentração de células inicial (gramas por litro); o fracionamento do homogenato em uma primeira parte contendo proteínas a uma segunda taxa de recuperação de proteínas e uma parte de restos celulares contendo proteínas a uma terceira taxa de recuperação de proteínas utilizando um primeiro fracionador; o fornecimento da primeira parte contendo proteínas para um segundo fracionador; e o fracionamento da primeira parte contendo proteínas em uma segunda parte contendo proteínas utilizando um segundo fracionador; e a coleta da segunda parte contendo proteínas.
12. Processo Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que o segundo valor de pH está em uma faixa de 7 a 12 e um ou mais agentes de ajuste do pH são selecionados do grupo que consiste em hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, bicarbonato, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorídrico e uma combinação dos mesmos.
13. Processo Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, na Reivindicação 11, caracterizado por que um ou mais agentes de ajuste do pH são adicionados à suspensão contendo células antes de ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias.
14. Processo Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, na Reivindicação 11, caracterizado por que um ou mais agentes de ajuste do pH são adicionados à suspensão contendo células após a ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias.
15. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, contendo proteínas purificado a partir de células de bactérias anaeróbias, caracterizado por que compreende: um recipiente de fermentação conectado a uma tubulação de entrada de gás para o escoamento de um substrato gasoso dentro do recipiente de fermentação contendo as células de bactérias anaeróbias para fermentar o substrato gasoso pelas células de bactérias anaeróbias em um caldo líquido de fermentação em um primeiro valor de pH; um separador de células conectado ao recipiente de fermentação para receber o caldo líquido de fermentação proveniente do recipiente de fermentação e separar o caldo líquido de fermentação em uma suspensão contendo células que contém as células de bactérias anaeróbias; um ou mais dispositivos de ruptura que são conectados a uma ou mais primeiras saídas do primeiro separador para romper as membranas celulares das células de bactérias anaeróbias contidas dentro da suspensão contendo células em um homogenato em um segundo valor de pH, em que o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH; um ou mais fracionadores conectados ao um ou mais dispositivos de ruptura para receber o homogenato proveniente do um ou mais dispositivos de ruptura e fracionar o homogenato em uma ou mais partes contendo proteínas que têm o produto contendo proteínas e uma ou mais partes de restos celulares contendo proteínas.
16. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH através do fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH em uma ou mais primeiras saídas do primeiro separador para ajustar o pH da suspensão contendo células.
17. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH através do fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH dentro de um ou mais dispositivos de ruptura para ajustar o pH da suspensão contendo células.
18. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que compreende ainda: um tanque de retenção conectado a um ou mais dispositivos de ruptura e ao separador de células para receber a suspensão contendo células que é escoada para fora do separador de células antes da ruptura das membranas celulares das células de bactérias anaeróbias.
19. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH através do fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH ao tanque de retenção e do ajuste do pH da suspensão contendo células dentro do tanque de retenção.
20. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que o segundo valor de pH é maior que o primeiro valor de pH através do fornecimento de um ou mais agentes de ajuste do pH a uma ou mais segundas saídas do tanque de retenção que serão conectadas ao um ou mais dispositivos de ruptura para ajustar o pH da suspensão contendo células dentro do um ou mais dispositivos de ruptura.
21. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que o segundo valor de pH está em uma faixa de 5 a 12.
22. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que um ou mais dispositivos de ruptura são selecionados do grupo que consiste num dispositivo microfluídico, um dispositivo de sonicação, um dispositivo ultrassônico, um dispositivo de rompimento mecânico, uma prensa francesa, um freezer, um aquecedor, um trocador de calor, uma coluna de destilação, um dispositivo de pasteurização, um dispositivo de esterilização com UV, um dispositivo de esterilização com raios gama, um reator, um homogeneizador e combinações dos mesmos.
23. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que o separador de células é selecionado do grupo que consiste em dispositivos de filtração, dispositivos de filtração de fibra oca, dispositivos de filtração enrolados em espiral, dispositivos de ultrafiltração, dispositivos com filtro de cerâmica, dispositivos de filtração de fluxo cruzado, dispositivos de filtração com colunas de exclusão de tamanho, dispositivos de filtração com filtros de fluxo cruzado, dispositivos de centrifugação e combinações dos mesmos.
24. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que um ou mais fracionadores são selecionados do grupo que consiste num fracionador sólido-líquido, um dispositivo de centrifugação, uma centrífuga contínua, uma centrífuga decantadora, uma centrífuga de placas cônicas, um dispositivo de filtração, um dispositivo de filtração de fibra oca, um dispositivo de filtração enrolado em espiral, um dispositivo com filtro de cerâmica, um dispositivo de filtração de fluxo cruzado, um dispositivo de exclusão de tamanho, uma ou uma série de colunas de exclusão de tamanho, uma ou uma série de colunas de troca iônica, uma ou uma série de colunas de polímero de carbono, um fracionador magnético de fluxo contínuo e combinações dos mesmos.
25. Sistema Para Aumentar Taxa de Recuperação de Produto, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que o sistema compreende ainda: uma ou mais câmaras de desidratação para receber uma ou mais partes obtidas partindo do um ou mais fracionadores e desidratar uma ou mais partes para produzir o suplemento nutricional rico em proteínas, em que uma ou mais partes são selecionadas do grupo que consiste na primeira parte contendo proteínas, da parte de restos celulares contendo proteínas e combinações das mesmas, em que uma ou mais câmaras de desidratação são selecionadas do grupo que consiste num dispositivo de secagem por spray, um secador de tambor e um secador por congelamento, um dispositivo de liofilização e combinações dos mesmos.
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