KR102511196B1 - 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 시스템 - Google Patents
박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 시스템 Download PDFInfo
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Abstract
혐기성 박테리아 공정으로부터 유래된 단백질-풍부 영양 보충제 및 동물 사료 보충제가 무수한 세포 파열 및 단백질 분획화/정제 공정을 통해 생성된다. 일산화탄소-함유 기체상 기질을 이용하는 박테리아 발효 시스템 및 발효 공정으로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하는 방법이 제공된다. 본 발명은 다양한, 상이한 동물 및 인간에 의한 섭취에 유용한 적용을 갖는 단백질-풍부 영양 보충제의 조성물을 추가로 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018 년 5 월 21 일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/674,604 및 2019 년 5 월 17 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 16/416,133 호의 혜택을 주장하며, 상기 언급된 모든 출원은 본원에 참조로 포함된다.
미생물 발효는 미생물에 탄소 기질이 제공되어 활용되고 다양한 생성물로 가공되어, 회수, 분리 및 정제가 가능할 때 발생한다. 선택된 탄소 기질은 사용되는 미생물의 유형과 대사 경로에 따라 다르며, 사용되는 미생물의 유형은 원하는 생성물 유형을 가져올 수 있는 능력을 가진 미생물 균주를 식별하고 선택하는데 기반한다. 탄소 기질은 일산화탄소 (CO), 이산화탄소 (CO2), 메탄올, 메틸, 에탄올, n-알칸, 글루코스, 셀룰로스, 사탕수수, 당밀 및 설파이트 폐기물을 포함할 수 있다. 박테리아 발효에 의해 생성되는 유용한 생성물 및 물질은 에탄올, 락트산, 아세테이트 및 기타 바이오연료 및 화학물질을 포함하며, 이것은 에너지 공급원 및 다양한 추가 응용분야로 사용될 수 있다.
예를 들어, 아세트산 생성 (acetogenic) 미생물을 포함하는 혐기성 미생물에 의한 박테리아 발효는 발효 생성물 (예, 에탄올, 부탄올, 아세테이트, 부티레이트, 부티르산, 2,3-부탄디올 및 기타 관련 생성물) 을 일산화탄소 (CO), 수소 가스 (H2), 및/또는 이산화탄소 (CO2) 와 같은 기체상 기질의 발효를 통해 생성할 수 있다. 에탄올 및 부탄올은 운송과 관련된 액체 연료로서 종종 사용되는 반면, 아세테이트 및 2,3-부탄디올은 화학 산업에서 사용된다. 미생물 발효에 사용되는 바이오에탄올-생산 아세토젠 (acetogen) 의 예는 속 클로스트리디움 (Clostridium) 및 아세토박테리움 (Acetobacterium) 의 것들이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,173,429 는 합성 가스에서 에탄올 및 아세테이트를 생성하는 혐기성 미생물인, 클로스트리디움 융달리이 (Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 49587 을 기술한다. 미국 특허 번호 5,807,722 는 클로스트리디움 융달리이 ATCC No. 55380 을 사용하여 폐가스를 유기산 및 알코올로 전환하는 방법 및 장치를 기술한다. 미국 특허 번호 6,136,577 는 클로스트리디움 융달리이 ATCC No. 55988 및 55989 를 사용하여 폐가스를 에탄올로 전환하는 방법 및 장치를 기술한다.
발효 생성물 외에도, 대규모 미생물 발효는 또한 많은 양의 미생물 발효 배양 브로스를 생산하며 죽은 또는 비활성 세포의 많은 부분의 퍼지를 필요로 할 수 있다. 과잉 또는 퍼지된 배양 브로스로부터 미생물 바이오매스로의 과잉 박테리아 세포의 회수는, 동물 사료 및/또는 동물 사료 영양소 또는 보충제를 위한 공급원료로서 유용한 단백질, 아미노산 및 탄수화물 공급원으로서 재사용하기 위한 단일 세포 단백질 (SCP) 및 기타 성분의 생성을 도출할 수 있다. 모든 동물은 최적의 성장, 번식, 수유 및 유지에 필수적인 단백질의 구성 요소인 아미노산을 필요로 한다. 젖소의 소장에서 흡수되는 아미노산은 반추위에서 소화되는 단백질에서 유래되며 일반적으로 소화 시스템은, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린을 포함하여, 젖소가 스스로 생산할 수 없는 10 개의 필수 아미노산을 공급해야 한다. 이상적으로, 흡수된 각각의 필수 아미노산의 상대적인 비율은 젖소의 필수 아미노산 공급량과 정확히 일치할 것인데, 하나의 부족은 다른 것의 이용을 제한할 수 있기 때문이다.
그러나, 단일 세포 단백질을 표적으로 하는 현재의 방법은 종종 동물 사료 또는 수산양식 (aquaculture) 에 사용되는 전체 세포 바이오매스로서 미생물 세포를 직접 통합한다. 미생물 발효 공정에서, 발효 브로스는 박테리아 세포 뿐 아니라 세포 파편을 포함한다. 이들 방법은 두 가지를 구별하지 않으며, 종종 동물이나 수산양식 (aquaculture) (예, 생선 또는 새우, 등) 에 유해할 수 있는 바이오매스 함량을 포함한다. 예를 들어, 미생물 전체 세포 바이오매스는 섭취에 적합하지 않은 높은 핵산 함량 또는 적절하게 소화될 수 없는 기타 함량을 포함할 수 있다. 이들 선행 방법의 대부분은 전체 세포 바이오매스를 동물 사료에 통합하기 전에 추가 세포-파열 또는 세포 파괴 기술에 의해 전체 세포 바이오매스를 가공하지 않는다. 또한, 박테리아 발효로부터 박테리아 단백질을 회수하는 현재의 방법은 영양-관련 목적에 적합한 충분히 높은 단백질 함량을 산출하지 않는다. 박테리아 발효 공정에서 단백질-풍부 보충제를 수득하기 위한 방법 및 시스템, 및 임의의 이러한 영양 보충제 및 동물 사료의 조성물이 필요하다.
발명의 요약
본 발명의 구현예는 무수한 세포 파열 및 단백질 분별 및 정제 기술을 사용하는 혐기성 박테리아 발효 공정 후에 미생물 세포 바이오매스로부터 유래된 단백질-풍부 영양 보충제 및/또는 동물 사료를 생산 및 수득하기 위한 방법, 시스템 및 조성물을 제공한다. 단백질-풍부 영양 보충제는 인간 또는 동물을 위한 보충제로서 직접 또는 다른 영양소와 함께 공급원료로서 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 발효 공정으로부터 단백질-함유 부분을 생성하는 박테리아 발효 시스템이 제공되며, 하나 이상의 발효 용기, 하나 이상의 세포 분리기, 하나 이상의 프로세싱 챔버, 하나 이상의 세포 파열 장치, 및 하나 이상의 분별기를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 여러 다양한 동물 및 인간에 의한 섭취에 유용한 적용을 가진, 혐기성 박테리아를 사용하는 발효 공정으로부터 발생되는 단백질-풍부 영양 보충제의 조성물을 추가로 제공한다.
또다른 구현예에서, 혐기성 박테리아 발효로부터의 미생물 세포 바이오매스로부터 단백질-풍부 부분을 추출하고 단백질-풍부 부분을 영양 보충제로서 사용하는 방법이 제공된다. 하나의 측면에서, 방법은 액체 배양 배지를 포함하는 발효 용기에서 혐기성 박테리아로 고체, 액체 또는 기체상 기질을 발효시키고, 발효 용기로부터 혐기성 박테리아 세포의 제 1 배치를 함유하는 발효 액체 브로스의 양을 제 1 농도에서 수득하고, 발효 액체 브로스로부터 혐기성 박테리아의 세포를 무-세포 투과액 및 제 2 농도에서 혐기성 박테리아 세포의 제 2 배치를 함유하는 세포-함유 현탁액으로 분리하는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 제 2 배치 중의 혐기성 박테리아 세포의 제 2 농도는 제 1 배치 중의 혐기성 박테리아 세포의 제 1 농도보다 더 높다. 세포-함유 현탁액이 수득되면, 방법은 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 파열시켜 균질물을 생성하고, 하나 이상의 분별기를 사용하여 균질물을 제 1 단백질-함유 부분 및 단백질-함유 세포 파편 부분으로 분별하고; 제 1 단백질-함유 부분을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 측면에서, 제 1 단백질-함유 부분 및/또는 단백질-함유 세포 파편 부분은 단백질-풍부 영양 보충제로서 가공 및 생산될 수 있다. 또다른 측면에서, 제 1 단백질-함유 부분은 약 10% 이상, 예컨대 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상, 90% 이상의 단백질 함량, 예컨대 약 10% 내지 약 80% 의 단백질 함량, 또는 약 10% 내지 약 95% 의 단백질 함량, 예, 약 10% 내지 약 98% 의 단백질 함량을 갖는 단백질-풍부 영양 보충제로서 생산된다.
또다른 측면에서, 방법은 또한 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 세포-함유 보유 탱크에 보유하고 세포-함유 보유 탱크로부터의 세포-함유 현탁액을 파열 장치로 전달 속도로 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 세포-함유 보유 탱크는 세포-함유 현탁액을 위한 저장 용기 또는 전처리 챔버로서 역할을 할 수 있다. 하나의 예에서, 세포-함유 보유 탱크는 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 세포-함유 보유 탱크에 연결된 유입 라인을 통해 공급되는 하나 이상의 첨가제로 처리하는 전처리 단계를 수행하는데 사용된다. 첨가제의 예로는 계면활성제, 세제, EDTA, Tween-20, Triton X-100, 나트륨 도데실 설페이트, CHAPS, 효소, 프로테아제, 리소자임, 벤조나아제, 뉴클레아제, pH 조절제, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또다른 측면에서, 방법은 혐기성 박테리아 세포의 세포막이 파열되기 전에 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 하나 이상의 첨가제로 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 방법은 세포-함유 세포 파편 부분으로부터 제 1 단백질-함유 부분을 분리하기 전에 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 하나 이상의 첨가제로 처리하는 단계를 포함한다.
또다른 측면에서, 방법은 혐기성 박테리아의 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 제 2 세포-함유 현탁액으로 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 예에서, 제 2 세포-함유 현탁액은 세포-함유 보유 탱크로 전달되어 그안에서 농축 및/또는 저장된다. 또다른 예에서, 보유 탱크 중의 제 2 세포-함유 현탁액은 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 제 2 세포-함유 현탁액을 세포-함유 보유 탱크에 연결된 유입구를 통해 공급되는 하나 이상의 첨가제로 처리하는 전처리 단계에 적용된다. 그다음, 제 2 세포-함유 현탁액은 보유 탱크에서 파열 장치로 전달된다. 파열 장치는 제 2 세포-함유 현탁액 내에서 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 파열하고 균질물을 생성한다. 추가의 단백질-함유 부분은 이후 균질액 내의 세포-함유 세포 파편 부분으로부터 분리된다.
또다른 측면에서, 방법은 제 1 단백질-함유 부분을 하나 이상의 분별기로 전달하는 단계, 제 1 단백질-함유 부분을 하나 이상의 분별기를 사용하여 제 2 단백질-함유 부분 및/또는 제 3 또는 그 이상의 단백질-함유 부분으로 분별화하는 단계, 및 제 2 및 제 3 또는 그 이상의 단백질-함유 부분을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 분별기의 예는 고체-액체 분별기, 원심분리 장치, 연속 원심분리기, 경사분리 원심분리기, 디스크-스택 원심분리기, 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 장치, 하나 또는 일련의 크기 배제 컬럼, 하나 또는 일련의 이온 교환 컬럼, 하나 또는 일련의 탄소 폴리머 컬럼, 유동식 자기 분별기, 한외여과 장치, 하나 또는 일련의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 하나 또는 일련의 겔 여과 컬럼, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구현예에서, 제 1 단백질-함유 부분은 여과 장치로 전달되어 여과 장치를 통해 여과되고 잔류물 부분 및 여과물 부분으로 분별되어 여과물 부분이 단백질-풍부 영양 보충제로서 생성되도록 할 수 있다. 또다른 구현예에서, 잔류물 부분은 단백질-풍부 영양 보충제로서 생산된다. 또다른 구현예에서, 제 1 단백질-함유 부분은 원심분리기로 전달되고 원심분리에 의해 상청 단백질-함유 부분 및 펠렛 단백질-함유 부분으로 분별되어 상청 단백질-함유 부분 및/또는 펠렛 단백질-함유 부분이 단백질-풍부 영양 보충제로 생성되도록 할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 생성하기 위한 박테리아 발효 시스템을 제공한다. 박테리아 발효 시스템은, 기체상 기질과 배양 배지를 발효 액체 브로스로 발효시키기 위해, 기체상 기질을 발효 용기로 흘려 보내기 위한 가스 유입 라인 및 혐기성 박테리아를 함유하는 발효 용기에 배양 배지를 공급하기 위한 액체 유입 라인에 연결된 발효 용기, 발효 용기로부터 발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 수용하고 발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 제 1 세포-함유 현탁액 및 제 1 무-세포 투과액으로 분리하기 위한 발효 용기의 제 1 배출 라인에 연결된 하나 이상의 세포 분리기, 및 제 1 세포 분리기로부터 제 1 무-세포 투과액을 수용하고 제 1 무-세포 투과액을 산소화된 탄화수소질 화합물로 가공하는 제 1 세포 분리기의 제 2 배출 라인에 연결된 프로세싱 챔버를 포함한다.
박테리아 발효 시스템은 제 1 세포-함유 현탁액을 수용하고, 제 1 세포-함유 현탁액 내에 함유된 세포의 세포막을 파열하고, 균질물을 생성하기 위한 하나 이상의 세포 파열 장치, 및 하나 이상의 세포 파열 장치로부터 균질물을 수용하고 균질물을 제 1 단백질-함유 부분 및 단백질-함유 세포 파편 부분으로 분별하기 위한 하나 이상의 세포 파열 장치의 배출 라인에 연결된 하나 이상의 분별기를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 세포 파열은 미세유동화기에 의해 달성된다. 또다른 구현예에서, 세포 파열은 초음파분쇄기를 사용하여 달성된다. 또다른 구현예에서, 세포 파열은 5,000 내지 25,000 파운드/제곱 인치 (psi) 범위의 프로세싱 압력으로의 미세유동화기를 사용하여 달성된다. 또다른 구현예에서, 세포 파열은 15,000 내지 20,000 파운드/제곱 인치 (psi) 범위의 프로세싱 압력으로의 미세유동화기를 사용하여 달성된다. 또다른 구현예에서, 세포 파열은 15,000 파운드/제곱 인치 (psi) 의 프로세싱 압력으로의 미세유동화기를 사용하여 달성된다.
하나의 측면에서, 박테리아 발효 시스템은 발효 용기에 연결된 제 1 세포 분리기 및 파열 장치를 포함한다. 제 1 세포 분리기는 발효 용기로부터 제 1 세포 농도의 발효 액체를 수용하고 발효 액체를 무-세포 투과액 및 제 2 세포 농도의 세포-함유 현탁액으로 분리한다. 또다른 측면에서, 박테리아 발효 시스템은 일정량의 제 1 세포-함유 현탁액을 수용하기 위한 제 1 세포 분리기에 연결된 세포-함유 보유 탱크를 추가로 포함한다. 또다른 측면에서, 박테리아 발효 시스템은, 발효 용기로부터 발효 액체 브로스의 제 2 흐름을 수용하고 발효 액체 브로스의 제 2 흐름을 제 2 세포-함유 현탁액 및 제 2 무-세포 투과액으로 분리하는 발효 용기의 제 4 배출 라인에 연결된 제 2 세포 분리기를 추가로 포함한다.
하나 이상의 세포-함유 현탁액이 가공되고 균질물로 파열된 후, 균질물은 하나 이상의 분별기에 의해 하나 이상의 단백질-함유 부분 및 하나 이상의 단백질-함유 세포 파편 부분으로 분별된다. 또한, 하나 이상의 세포-함유 현탁액은 하나 이상의 세포 분리기의 하나 이상의 배출구로부터 파열 장치 및/또는 세포-함유 보유 탱크로 전달될 수 있으며, 여기서 세포-함유 보유 탱크는 하나 이상의 세포-함유 현탁액을 보유, 체류 또는 농축하고 하나 이상의 세포-함유 현탁액을 추가 가공을 위해 파열 장치 또는 하나 이상의 분별기에 전달 속도로 전달할 수 있다.
또다른 측면에서, 혐기성 박테리아에 의한 기체상 기질의 발효 후, 제 1 세포 분리기는 박테리아 세포를 함유하는 제 1 발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 수용한다. 발효 용기에 연결된 제 2 세포 분리기는 박테리아 세포를 함유하는 제 2 발효 액체 브로스의 제 2 흐름을 수용한다. 제 2 세포 분리기는 제 2 발효 액체 브로스를 제 2 무-세포 투과액 및 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 제 2 세포-함유 현탁액으로 분리한다. 이 측면에서, 파열 장치는 제 2 세포 분리기로부터 제 2 세포-함유 현탁액을 수용하고, 제 2 세포-함유 현탁액의 세포막을 파열시키고, 균질물을 생성하기 위해 사용된다. 또다른 측면에서, 보유 탱크는 제 2 세포 분리기로부터 제 2 세포-함유 현탁액을 수용하고 제 2 세포-함유 현탁액을 파열 장치로 보낸다.
또다른 측면에서, 박테리아 발효 시스템은 세포-함유 현탁액 내에서 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 파열하기 위한 하나 이상의 파열 장치를 제공한다. 파열 장치의 예는 미세유체 장치, 초음파분쇄 장치, 초음파 장치, 기계적 파괴 장치, 프렌치 프레스, 냉동고, 히터, 열 교환기, 증류 컬럼, 가공 스트림 및 보유 탱크의 온도를 증가시키는 장치, 저온살균 장치, UV 살균 장치, 감마선 살균 장치, 반응기, 균질화기 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 아세트산 생성 박테리아 배양물을 사용하는 발효 공정으로부터 생성된 단백질-풍부 영양 보충제의 조성물이다. 하나의 측면에서, 조성물은 균질물로부터 분별된 단백질-함유 부분을 포함하며, 여기서 균질물은 혐기성 박테리아의 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액의 파열로부터 수득되고, 세포-함유 현탁액은 혐기성 박테리아에 의한 기체상 기질의 발효 동안 발효 용기에서 전달되는 발효 액체 브로스에서 수득되며, 발효 액체 브로스로부터의 혐기성 박테리아의 세포는 세포-함유 현탁액 및 무-세포 투과액으로 분리된다. 또다른 측면에서, 조성물은 균질물로부터 분별된 단백질-함유 세포 파편 부분을 포함한다.
또다른 측면에서, 조성물은 발효-유래 단백질을 포함하고, 여기서 발효-유래 단백질은 속 클로스트리디움 (Clostridium), 아세토박테리움 (Acetobacterium), 부티리박테리움 (Butyribacterium), 유박테리움 (Eubacterium), 및 이들의 유사한 변이체의 자연 발생 또는 유전적으로 변형된 아세트산 생성 박테리아와 함께 액체 배양 배지에서 고체, 액체 또는 기체상 기질의 발효로부터 유래된다. 기질은, 탄수화물, 카르복실산, 메탄올, 메탄, 일산화탄소 (CO), 이산화탄소 (CO2), 수소 (H2) 가스, 질소 가스 (N2), 합성가스, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 액체, 고체 또는 기체로 구성된다. 하나의 구현예에서, 발효는 자연 발생 또는 비-자연 발생 메탄영양 (methanotrophic) 박테리아를 사용하여 달성된다.
또다른 구현예로서, 조성물은 균질물의 단백질-함유 부분의 제 1 양 및 균질물의 단백질-함유 세포 파편 부분의 제 2 양으로부터 분별된 정제된 단백질 생성물을 포함하며, 여기서 균질물은 아세트산 생성 박테리아 배양물의 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액의 파열로부터 수득되고, 세포-함유 현탁액은 아세트산 생성 박테리아 배양물을 사용하는 기체상 기질의 발효 동안 발효 용기로부터 전달되는 발효 액체로부터 수득된다.
본 발명의 상기 기재된 특징들이 상세히 이해될 수 있도록, 상기 간략히 요약된 본 발명의 더 상세한 설명이 실시예들을 참조하여 행해질 수도 있으며, 이 실시예들 중 일부는 첨부 도면들에 도시된다. 하지만, 첨부 도면들은 본 발명의 오직 통상적인 실시예들을 예시할 뿐이고, 따라서, 그 범위를 한정하는 것으로서 간주되지 않아야 하며, 본 발명은 다른 동일하게 유효한 실시예들을 인정할 수도 있음을 유의해야 한다.
도 1A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 갖는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하고 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 1 단백질-함유 부분 및/또는 단백질-함유 세포 파편 부분을 수득하는 방법의 흐름도를 도시한다.
도 1B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 갖는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하고 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 1 단백질-함유 부분 및/또는 단백질-함유 세포 파편 부분을 수득하는 또다른 방법의 흐름도를 도시한다.
도 2A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 갖는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하고 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 2 단백질-함유 부분을 수득하는 방법의 흐름도를 도시한다.
도 2B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 갖는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하고 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 3 단백질-함유 부분을 수득하는 또다른 방법의 흐름도를 도시한다.
도 3A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액 및 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 생산하기 위한 박테리아 발효 시스템 (300A) 의 개략도를 도시하며, 여기서 박테리아 발효 시스템 (300A) 은 하나 이상의 세포 분리기, 하나 이상의 프로세싱 챔버, 및 임의로 하나 이상의 탈수 챔버를 포함한다.
도 3B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정으로부터 하나 이상의 세포-함유 현탁액 및 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 생산하기 위한 박테리아 발효 시스템 (300B) 의 개략도를 도시하며, 여기서 박테리아 발효 시스템 (300B) 은 2 개의 세포 분리기, 무-세포 보유 탱크, 프로세싱 챔버, 및 임의로 탈수 챔버를 포함한다.
도 4A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 하나 이상의 세포 분리기, 하나 이상의 프로세싱 챔버, 하나 이상의 파열 장치, 하나 이상의 분별기, 및 하나 이상의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400A) 의 개략도를 보여준다.
도 4B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 2 개의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400B) 의 개략도를 보여준다.
도 4C 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 하나의 분별기, 및 2 개 이상의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400C) 의 개략도를 보여준다.
도 4D 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 부가적인 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400D) 의 개략도를 보여준다.
도 4E 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 2 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400E) 의 개략도를 보여준다.
도 4F 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400F) 의 개략도를 보여준다.
도 4G 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 2 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400G) 의 개략도를 보여준다.
도 4H 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 2 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400H) 의 개략도를 보여준다.
도 5A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 예시적인 박테리아 발효 시스템의 개략도이다.
도 5B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 또다른 예시적인 박테리아 발효 시스템의 개략도이다.
도 5C 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 박테리아 발효 시스템의 또다른 예의 개략도이다.
도 5D 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 박테리아 발효 시스템의 또다른 예의 개략도이다.
도 5E 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 또다른 예시적인 박테리아 발효 시스템의 개략도이다.
도 6 은 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 박테리아 발효 시스템의 또다른 예의 개략도이다.
도 7A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포를 균질물로 파열시키기 전에 세포-함유 현탁액의 하나의 예의 전자 현미경사진을 보여준다.
도 7B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 박테리아 발효 액체 브로스의 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포를 파열시킨 후에 파열 장치로부터 수득된 균질물의 하나의 예의 전자 현미경사진을 보여준다.
도 7C 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 파열 장치 내부에서 파열된 후 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포를 보여주는 전자 현미경사진의 또다른 예이다.
도 7D 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 고압에서 파열 장치에 의해 파열된 후 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포의 파열된 세포막을 보여주는 균질물의 전자 현미경사진의 또다른 예이다.
도 7E 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 매우 고압에서 파열 장치에 의해 파열된 후 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포의 파열된 세포막을 보여주는 균질물의 전자 현미경사진의 또다른 예이다.
도 8A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 세포-함유 현탁액의 예시 내의 혐기성 박테리아 세포를 파열시킨 후에 파열 장치로부터 수득된 균질물 내 가용성 단백질 농도의 예의 그래프를 보여준다.
도 8B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 세포-함유 현탁액의 또다른 예시 내의 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 파열시킨 후에 파열 장치로부터 수득된 가용성 단백질 농도의 또다른 예의 또다른 그래프를 보여준다.
도 1A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 갖는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하고 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 1 단백질-함유 부분 및/또는 단백질-함유 세포 파편 부분을 수득하는 방법의 흐름도를 도시한다.
도 1B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 갖는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하고 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 1 단백질-함유 부분 및/또는 단백질-함유 세포 파편 부분을 수득하는 또다른 방법의 흐름도를 도시한다.
도 2A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 갖는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하고 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 2 단백질-함유 부분을 수득하는 방법의 흐름도를 도시한다.
도 2B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 갖는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하고 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 3 단백질-함유 부분을 수득하는 또다른 방법의 흐름도를 도시한다.
도 3A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액 및 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 생산하기 위한 박테리아 발효 시스템 (300A) 의 개략도를 도시하며, 여기서 박테리아 발효 시스템 (300A) 은 하나 이상의 세포 분리기, 하나 이상의 프로세싱 챔버, 및 임의로 하나 이상의 탈수 챔버를 포함한다.
도 3B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정으로부터 하나 이상의 세포-함유 현탁액 및 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 생산하기 위한 박테리아 발효 시스템 (300B) 의 개략도를 도시하며, 여기서 박테리아 발효 시스템 (300B) 은 2 개의 세포 분리기, 무-세포 보유 탱크, 프로세싱 챔버, 및 임의로 탈수 챔버를 포함한다.
도 4A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 하나 이상의 세포 분리기, 하나 이상의 프로세싱 챔버, 하나 이상의 파열 장치, 하나 이상의 분별기, 및 하나 이상의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400A) 의 개략도를 보여준다.
도 4B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 2 개의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400B) 의 개략도를 보여준다.
도 4C 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 하나의 분별기, 및 2 개 이상의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400C) 의 개략도를 보여준다.
도 4D 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 부가적인 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400D) 의 개략도를 보여준다.
도 4E 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 2 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400E) 의 개략도를 보여준다.
도 4F 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400F) 의 개략도를 보여준다.
도 4G 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 2 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400G) 의 개략도를 보여준다.
도 4H 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정을 위한 2 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 2 개의 분별기, 및 임의로 3 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400H) 의 개략도를 보여준다.
도 5A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 예시적인 박테리아 발효 시스템의 개략도이다.
도 5B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 또다른 예시적인 박테리아 발효 시스템의 개략도이다.
도 5C 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 박테리아 발효 시스템의 또다른 예의 개략도이다.
도 5D 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 박테리아 발효 시스템의 또다른 예의 개략도이다.
도 5E 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 또다른 예시적인 박테리아 발효 시스템의 개략도이다.
도 6 은 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 혐기성 박테리아 발효 공정으로부터 수집된 세포를 파열시키고 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수득하기 위한 박테리아 발효 시스템의 또다른 예의 개략도이다.
도 7A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포를 균질물로 파열시키기 전에 세포-함유 현탁액의 하나의 예의 전자 현미경사진을 보여준다.
도 7B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 박테리아 발효 액체 브로스의 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포를 파열시킨 후에 파열 장치로부터 수득된 균질물의 하나의 예의 전자 현미경사진을 보여준다.
도 7C 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 파열 장치 내부에서 파열된 후 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포를 보여주는 전자 현미경사진의 또다른 예이다.
도 7D 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 고압에서 파열 장치에 의해 파열된 후 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포의 파열된 세포막을 보여주는 균질물의 전자 현미경사진의 또다른 예이다.
도 7E 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 매우 고압에서 파열 장치에 의해 파열된 후 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포의 파열된 세포막을 보여주는 균질물의 전자 현미경사진의 또다른 예이다.
도 8A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 세포-함유 현탁액의 예시 내의 혐기성 박테리아 세포를 파열시킨 후에 파열 장치로부터 수득된 균질물 내 가용성 단백질 농도의 예의 그래프를 보여준다.
도 8B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라 세포-함유 현탁액의 또다른 예시 내의 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 파열시킨 후에 파열 장치로부터 수득된 가용성 단백질 농도의 또다른 예의 또다른 그래프를 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 구현예는 무수한 세포 파열 및 단백질 분별 및 정제 기술을 사용하는 혐기성 박테리아 발효 공정 후에 미생물 세포 바이오매스로부터 유래된 단백질-풍부 영양 보충제 및/또는 동물 사료를 생산 및 수득하기 위한 방법, 시스템 및 조성물을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 발효 공정에서 미생물 바이오매스를 분리하고, 미생물 바이오매스의 세포를 균질물로 파열시키고, 균질물로부터 하나 이상의 단백질-함유 부분을 분별 및 정제하여 하나 이상의 단백질-함유 부분은 동물 및 인간 모두가 섭취할 수 있는 영양 보충제로 조성물로 추가 가공될 수 있도록 하는 방법에 관한 것이다. 단백질-풍부 영양 보충제는 인간 또는 동물을 위한 보충제로서 직접 또는 다른 영양소와 함께 공급원료로서 사용될 수 있다.
단백질-풍부 영양 보충제 및 동물 사료 보충제는 합성가스, 탄소원 기질, 일산화탄소 (CO)-함유 가스, 이산화탄소 (CO2), 수소 가스 (H2), 합성가스 및 이들의 조합과 같은 하나 이상의 기체상 기질을 사용하는 박테리아 발효 시스템에서 발효 공정 후 하나 이상의 단백질-함유 부분으로부터 가공 및 수득될 수 있다. 본 발명은 동물 및 인간에 의한 섭취에 유용한 적용을 갖는 단백질-풍부 영양 보충제의 조성물을 추가로 제공한다.
I. 발효-유래 단백질을 생성하기 위한 미생물 바이오매스의 가공
박테리아 발효 공정은 일반적으로 혐기성 박테리아 또는 아세트산 생성 박테리아와 같은 박테리아에 의해 합성가스 또는 일산화탄소 (CO)-함유 기체상 기질과 같은 기체상 기질을 발효시키는 것, 그중에서도 이산화탄소 (CO2), 에탄올, 부탄올, 부티르산, 아세트산 등을 포함하는 발효 생성물을 생성하는 것을 포함한다. 좀더 중요하게는, 혐기성 박테리아 발효 공정 후에, 다량의 미생물 바이오매스가 수득된다. 다량의 미생물 바이오매스는 박테리아 발효 공정 중에 또는 후에 퍼지될 수 있다. 세포 퍼지의 완료시 또는 박테리아 발효 공정 중에, 이러한 다량의 미생물 바이오매스는 다른 적용에 유용할 수 있다. 그러나, 예를 들어, 영양 보충제 또는 동물 사료로서 유용하도록 하기 위해 다량의 발효-유래 단백질을 고품질로 (즉, 유해 물질이나 오염물 없이) 추출하려면 추가의 복잡한 가공이 필요하다. 구체적으로, 본 발명은 박테리아 발효 공정으로부터 세포 바이오매스에서 이러한 발효-유래 단백질을 추출하는 공정을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 영양 보충제 및 동물 사료로 가공하기 위해 세포 덩어리 또는 미생물 바이오매스로부터 하나 이상의 발효-유래 단백질-함유 부분을 추출하기 위한 박테리아 발효 공정용 시스템을 포함한다.
도 1A 는 박테리아 발효 시스템으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 생산하는 방법 (100) 의 하나의 예의 흐름도이다. 기체상 기질의 박테리아 발효 방법 (100) 은 알코올 생산성 수준과 같은 원하는 발효 생성물 수준을 유지하면서, 탄화수소질 화합물, 탄수화물, 특정 단백질, 특정 아미노산 및/또는 기타 원하는 성분의 형성을 선호하는 조건 하에서 작동할 수 있다.
단계 (110) 에서, 발효 배지를 발효 용기에 첨가하여 박테리아 발효 공정을 수행한다. 또한, 하나 이상의 기체상 기질이 발효 용기로 전달되고 혐기성 박테리아를 포함하는 배양물과 같은 박테리아 배양물에 의해 발효된다. 초기에, 발효 용기에 함유된 액체 발효 배지는 다양한 유형의 적합한 박테리아 배양 배지, 발효 배지 또는 액체 영양 배지를 포함할 수 있다. 영양 배지는 사용되는 미생물의 성장을 허용하고/하거나 생성되는 특정 생성물을 선호하는 유효량의 하나 이상의 비타민 및 여러 미네랄을 포함한다.
다양한 유형의 에탄올, 부탄올, 아세트산 등과 같은 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 생산하는 발효 공정에 적합한 혐기성 박테리아 성장에 적합한 배양 배지, 그 중에서도 일산화탄소 및 수소 가스와 같은 합성가스 또는 또다른 다른 적절한 기질을 사용하는 배양 배지가 사용될 수 있다. 적합한 발효 배지의 하나의 예는 미국 특허 번호 7,285,402 에 기재되어 있고, 이것은 본원에 참조로서 인용된다. 적합한 배지의 다른 예는 미국 일련 번호 61/650,098 및 61/650,093 에 설명되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로서 인용된다.
또한, 방법 (100) 의 박테리아 발효 공정에 사용되는 하나 이상의 기체상 기질은 다양한 합성 가스 (즉, 합성가스 (syngas)), 철강 생산 공정의 배출 가스, 철 생산 공정의 배출 가스, 석탄 생산 공정의 배출 가스, 또는 산업 생산 공장의 임의의 기타 적절한 가스 공급원을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 박테리아 발효 공정에 사용되는 기체상 기질은 일산화탄소 (CO)-함유 기체상 기질 및/또는 부가 가스, 예컨대 수소 가스, 이산화탄소 (CO2), 질소 가스 (N2) 및 이들의 조합을 포함한다.
하나의 예에서, 일산화탄소-함유 기체상 기질은 대용량 일산화탄소-함유 산업용 연도 (flue) 가스일 수 있다. 일부 측면에서, 일산화탄소를 포함하는 가스는 탄소-함유 폐가스로부터 유래된다. 탄소-함유 폐가스는 산업용 폐가스 또는 기타 도시용 고체 또는 액체 폐기물의 가스화를 포함한다. 따라서, 그러한 산업 공정은 그렇지 않으면 주변 환경으로 배출될 탄소를 포집하는 효과적인 공정을 나타낸다. 산업용 연도 가스의 예는 철 금속 제품 제조, 비-철 제품 제조, 석유 정제 공정, 석탄 가스화, 바이오매스 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조 중에 생성되는 가스를 포함한다.
하나의 예에서, 일산화탄소-함유 합성가스는 사용되는 발효 용기의 크기 및 유형에 따라 다양한 속도로 발효 용기에 도입된다. 하나의 측면에서, 합성가스는 약 10 내지 약 50 ft3/초의 속도로 가스 유입구에 도입된다. 또다른 측면에서, 합성가스는 약 25 내지 약 35 ft3/초의 속도로 도입된다. 용어 "합성가스 (syngas)" 또는 "합성 가스 (synthesis gas)" 는 일산화탄소 (CO) 와 수소 (H2) 가 풍부한 가스 혼합물 중의 합성 가스, 예컨대 수소를 생산하기 위한 천연 가스 또는 탄화수소의 증기 개질에서 생산된 가스 혼합물, 석탄 가스화 또는 일부 유형의 폐기물에서-에너지로의 가스화 시설에서 생산되는 기타 가스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 합성가스는 가연성이며 종종 연료 공급원 또는 다른 화학물질 생산의 중간체로서 사용된다. 합성가스는 임의의 공지된 공급원으로부터 제공될 수 있다.
예를 들어, 합성가스는 탄소질 물질의 가스화로부터 공급될 수 있다. 가스화는 산소 공급이 제한된 환경에서 바이오매스의 부분 연소를 포함한다. 생성된 가스는 주로 일산화탄소 가스와 수소 가스를 포함한다. 합성가스는 적어도 약 10 몰% 일산화탄소, 또는 적어도 약 20 몰%, 또는 10 내지 약 100 몰%, 또는 20 내지 약 100 몰%, 30 내지 약 90 몰% 일산화탄소, 또는 약 40 내지 약 80 몰% 일산화탄소, 또는 약 50 내지 약 70 몰% 일산화탄소를 함유한다. 합성가스는 적어도 약 0.75, 또는 적어도 1.0, 또는 적어도 약 1.5 의 일산화탄소/이산화탄소 몰비를 가질 것이다. 적절한 가스화 방법 및 이의 장치는 미국 특허 출원 번호 13/427,144, 13/427,193, 및 13/427,247 뿐 아니라, 미국 특허 출원 번호 61/516,667, 61/516,704, 및 61/516,646 에 제공되며, 이들 모두는 본원에 참조로 인용된다.
또한, 단계 (110) 에서, 박테리아 배양물이 발효 용기에 접종된다. 발효 배지는 바람직하지 않은 미생물을 제거하기 위해 멸균되고, 박테리아 발효 용기 또는 발효 생물반응기는 선택된 미생물 또는 혼합 박테리아 배양물로 접종된다. 하나의 측면에서, 박테리아 배양물에 사용되는 박테리아는 혐기성 박테리아이다. 사용되는 혐기성 박테리아의 예는 아세트산 생성 박테리아, 예컨대 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 예를 들어, 클로스트리디움 융달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, WO 2000/68407, EP 117309, 미국 특허 번호 5,173,429, 5,593,886 및 6,368,819, WO 1998/00558 및 WO 2002/08438 에 기재된 것들을 포함, 클로스트리디움 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주 (DSMZ 의 DSM 10061 및 DSM 19630, Germany), WO 2007/117157 및 WO 2009/151342 에 기재된 것들을 포함, 및 클로스트리디움 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) (P11, ATCC BAA-622) 및 알칼리바쿨럼 바키 (Alkalibaculum bacchi) (CP11, ATCC BAA-1772), 미국 특허 번호 7,704,723 및 Oklahoma EPSCoR Annual State Conference, 2010년 4월 29일에 발표된 "Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas" (Hasan Atiyeh) 에 기재된 것들을 포함, 및 클로스트리디움 카르복시디보란스 (ATCC PTA-7827), 미국 특허 출원 번호 2007/0276447 에 기재됨 - 을 포함한다. 이들 참고문헌은 각각 본원에 참조로 인용된다. 다른 적합한 박테리아는 무렐라 (Moorella) 종 HUC22-1 을 포함하는 무렐라 (Moorella) 속, 및 카르복시도테르무스 (Carboxydothermus) 속의 것들의 박테리아를 포함한다. 하나의 구현예에서, 혼합된 박테리아 배양물이 사용되며, 여기서 혼합된 박테리아 배양물은 2 개 이상의 박테리아 미생물을 포함한다.
방법 (100) 의 이러한 발효 과정에서 배양하는 데 유용한 박테리아는 아세토게니움 키부이 (Acetogenium kivui), 아세토아나에로비움 노테라에 (Acetoanaerobium noterae), 아세토박테리움 우디이 (Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨럼 바키 CP11 (ATCC BAA-1772), 블라우티아 프로덕카 (Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum), 칼다나에로박테르 서브테라네오우스 (Caldanaerobacter subterraneous), 칼다나에로박테르 서브테라네오우스 파시피쿠스 (Caldanaerobacter subterraneous pacificus), 카르복시도테르무스 히드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 클로스티리디움 아세티쿰 (Clostridium aceticum), 클로스티리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스티리디움 아세토부틸리쿰 P262 (DSMZ 의 DSM 19630, Germany), 클로스티리디움 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (DSMZ 의 DSM 19630, Germany), 클로스티리디움 오토에타노게눔 (DSMZ 의 DSM 10061, Germany), 클로스티리디움 오토에타노게눔 (DSMZ 의 DSM 23693, Germany), 클로스티리디움 오토에타노게눔 (DSMZ 의 DSM 24138, Germany), 클로스트리디움 카르복시디보란스 P7 (ATCC PTA-7827), 클로스트리디움 코스카티 (Clostridium coskatii) (ATCC PTA-10522), 클로스트리디움 드라케이 (Clostridium drakei), 클로스트리디움 융달리이 (Clostridium ljungdahlii) PETC (ATCC 49587), 클로스트리디움 융달리이 ERI2 (ATCC 55380), 클로스트리디움 융달리이 C-01 (ATCC 55988), 클로스트리디움 융달리이 O-52 (ATCC 55889), 클로스트리디움 매그넘 (Clostridium magnum), 클로스트리디움 파스퇴리아눔 (Clostridium pasteurianum) (DSMZ 의 DSM 525, Germany), 클로스트리디움 라그스달리 (Clostridium ragsdali) P11 (ATCC BAA-622), 클로스트리디움 스카톨로게네스 (Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 터모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum), 클로스트리디움 울투넨세 (Clostridium ultunense), 데설포토마쿨룸 쿠즈네트소비 (Desulfotomaculum kuznetsovii), 유박테리움 리모숨 (Eubacterium limosum), 지오박테르 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 메타노사르시나 아세티보란스 (Methanosarcina acetivorans), 메타노사르시나 바케리 (Methanosarcina barkeri), 모렐라 터모아세티카 (Morrella thermoacetica), 모렐라 터모오토트로피카 (Morrella thermoautotrophica), 옥소박테르 페니기이 (Oxobacter pfennigii), 펩토스트렙토코쿠스 프로덕투스 (Peptostreptococcus productus), 루미노코쿠스 프로덕투스 (Ruminococcus productus), 터모아나에로박테르 키부이 (Thermoanaerobacter kivui), 및 이들의 조합을 포함한다. 다른 아세트산 생성 또는 혐기성 박테리아가 또한 본원에 기재된 방법 (100) 에서 사용하기 위해 선택될 수 있다.
하나의 예에서, 사용된 박테리아는 게놈 DNA G+C 함량이 약 50% 이하인 아세트산 생성 박테리아 세포를 포함한다. 아세트산 생성 박테리아는 활성, 비활성 또는 이 둘의 조합일 수 있다. 이 측면에서, G+C 함량은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 게놈은 문헌 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) (또한 "Maniatis" 로서 알려짐, 이는 본원에 참조로서 인용됨) 에 설명된 것들과 같은 방법을 사용하여 서열분석될 수 있다. G+C 함량은 그후 수동으로 결정되거나 임의의 수의 프로그램 예를 들어, Bohlin et al. "Analysis of Intragenomic GC Content Homogenicity within Prokaryotes", BMC Genomics 2010, 11:464 (이는 본원에 참조로서 인용됨) 의 것들을 사용하여 결정될 수 있다. G+C 함량을 결정하기 위한 다른 방법은 미국 특허 번호 8,143,037, Mesbah et al. (1989) "Measurement of Deoxyguanosine/Thymidine Ratios in Complex Mixtures by High-Performance Liquid Chromatorgraphy for Determination of the Mole Percentage Guanine + Cytosine of DNA. J. Chromatogr. 479: 297-306, 및 Tanner et al., "Costridium ljungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I", International Journal of Systematic Bacteriology, Apr. 1993, p. 232-236 (이들 모두는 본원에 참조로 인용됨) 을 포함된다.
단계 (110) 에서, 발효 용기에 박테리아 배양물의 접종시, 초기 공급물 가스 공급 속도는 초기 미생물 집단 (예, 혐기성 박테리아) 의 효과적인 성장 및 후속 발효를 위해 달성된다. 발효 용기는 혐기성 박테리아를 배양하기 위한 환경을 제공한다. 적합한 발효 용기는 연속 교반 탱크 반응기 (CSTR), 고정 세포 반응기 (ICR), 세류층 반응기 (TBR), 이동층 바이오필름 반응기 (MBBR), 버블 컬럼, 가스 부양 발효기, 멤브레인 반응기 (예, 중공 섬유 멤브레인 생물반응기 (HFMBR)), 정적 혼합기, 용기, 배관 배열, 타워, 루프 반응기 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 방법 (100) 에서, 임의의 공지된 발효 용기 또는 발효 생물반응기가 사용될 수 있다. 생물반응기의 일부 예는 2011 년 6 월 30 일에 출원된 미국 일련 번호 61/571,654 및 61/571,565, 2011 년 9 월 13 일에 출원된 미국 일련 번호 61/573,845, 2012 년 5 월 15 일에 출원된 미국 일련 번호 13/471,827 및 13/471,858, 2012 년 5 월 16 일에 출원된 미국 일련 번호 13/473,167 (이들 모두는 본원에 참조로 인용됨) 에 기재된다.
하나의 구현예에서, 발효 용기는 제 2 생물반응기에 연결된 제 1 생물반응기를 포함하고, 여기서 제 1 생물반응기는 발효 액체를 제 2 생물반응기에 공급하고, 여기서 에탄올 생산은 제 2 생물반응기에서 일어난다. 예를 들어, 발효 용기는 개선된 배양 안정성을 위한 2-단계 CSTR 시스템일 수 있다. 예를 들어, 발효 용기는 임의로 제 1 CSTR 챔버가 있는 제 1 성장 단계 및 제 2 CSTR 챔버가 있는 제 2 생산 단계를 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 성장 단계 CSTR 에는 액체 배양 배지가 공급되고 생산 단계 CSTR 의 미전환된 기질 가스는 성장 단계 CSTR 로 공급된다. 일반적으로, 생산 단계 CSTR 에는 성장 단계 CSTR 의 박테리아 배양 공급물 뿐만 아니라 신선한 가스 공급물, 및 신선한 배지 공급물이 공급된다. 임의로, 세포 재순환은 분리된 형태의 발효 생성물로, 박테리아 세포를 생산 단계 CSTR 에서 꺼내고, 생산 단계 CSTR 로 다시 보내 높은 박테리아 발효 효율을 얻기 위해 사용된다. 일반적으로, 박테리아 세포는 성장 단계 CSTR 로 재순환되지 않는다. 미국 특허 번호 10/311,655 는 연속 발효 공정을 기술하며 본원에 참조로서 인용된다. 용어 "발효", "발효 공정", "박테리아 발효 공정", "발효 반응", "박테리아 발효 반응" 등은 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 하나의 측면에서, 발효는 일산화탄소의 알코올로의 전환을 말한다. 하나의 측면에서, 박테리아 발효 공정은 적절한 발효 배지 및 하나 이상의 기체상 기질을 박테리아를 함유하는 발효 용기에 첨가하는 것으로 시작된다.
일반적으로, 박테리아 발효 공정이 시작되면 발효 용기 내부에서 발효 액체 브로스가 생성된다. 발효 액체 브로스는 발효 용기 내부에 함유된, 배양 배지, 하나 이상의 기체상 기질 및 박테리아에 더해, 하나 이상의 발효 생성물을 포함할 수 있다. 발효 액체 브로스 내에 함유되고 발효 용기 내부의 박테리아 발효 공정에 의해 생성된 발효 생성물은 에탄올, 2-부탄올, 2-부타논, 2,3-부탄디올, 아세톤, 부타디엔, 부탄, 부탄올, 부티레이트, 부티르산, 에틸렌 및 지방산, 아세트산 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 알코올 등과 같은 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 포함할 수 있다.
하나의 측면에서, 에탄올과 아세트산의 혼합물이 생성될 수 있다. 또다른 측면에서, 에탄올과 부탄올의 혼합물이 생성된다. 하나의 예에서, 에탄올은 발효 용기에서 1 일 당 10 g/L 초과의 특정 생산성으로 생산되는 반면, 유리 아세트산 농도는 5 g/L 미만의 자유 아세트산으로 유지된다. 발효 액체 브로스에서 발견되는 에탄올 및 아세테이트는 1:1 내지 20:1 범위의 에탄올 대 아세테이트의 비율일 수 있다.
발효 용기 내부에 함유된 발효 액체 브로스는 희석된 농도의 에탄올을 함유할 수 있으며 품질 및/또는 농도 면에서 추가 가공이 필요할 수 있다. 예를 들어, 발효 액체 브로스에 함유된 발효 생성물은 발효 용기에서 나와 증류 챔버 또는 기타 유형의 반응기로 전달되어 더 높은 농도의 최종 증류 생성으로 증류되고, 추가 가공 및 회수될 수 있다.
발효 액체 브로스는 또한 죽은 또는 비활성 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 이들 박테리아 세포는 다르게는 박테리아 세포 또는 혐기성 박테리아 세포로 알려져 있다. 박테리아 발효 공정으로부터의 대량으로의 세포 축적은 세포 덩어리 또는 소비된 바이오매스라고 알려져 있다. 용어 "비활성 아세트산 생성 박테리아" 또는 "비활성 박테리아 세포" 는 박테리아 발효 공정을 거친 후 복제 능력을 상실한 죽은 세포를 말한다. 용어 "세포 덩어리" 는 전체적으로 미생물 바이오매스를 형성하는 박테리아 세포를 말한다. 미생물 바이오매스는 박테리아 발효 동안 축적될 수 있으며, 본원에 기술된 방법 및 시스템에 의해 발효-유래 단백질로 가공되는 데 유용하다. 발효 액체 브로스는 또한 다양한 단백질, 아미노산, 탄수화물, 핵산 및 기타 모이어티를 포함할 수 있다. 핵산의 예는 뉴클레오티드, 예컨대 DNA, RNA 및 이의 유도체 및 유사체를 포함한다. 발효 브로스 내에 세포 덩어리 또는 미생물 바이오매스의 축적으로 인해, 발효 브로스 자체가 상당한 칼로리 값을 제공할 수 있다. 발효 액체 브로스는 약 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 및 약 50% 인 건조 물질 함량을 가질 수 있다.
도 1A 에 도시된 바와 같이, 방법 (100) 의 단계 (120) 에서, 제 1 농도의 혐기성 박테리아의 세포 및 발효 생성물을 함유하는 발효 액체 브로스의 양이 박테리아 발효 용기로부터 전달된다. 일반적으로, 세포가 발효 용기 내부에서 정상 성장 상태에 도달하면, 박테리아 세포를 함유하는 발효 액체 브로스가 발효 용기로부터 배출될 수 있다. 정상 상태 박테리아 성장 단계 후 발효 방법의 경우, 발효 액체 브로스에 함유된 박테리아 세포의 제 1 배치의 제 1 농도는 0.5 g/L (건조 세포 질량) 이상, 예컨대 1.0 g/L 이상, 또는 2.0 g/L 이상, 또는 5.0 g/L 이상, 또는 15.0 g/L 이상, 또는 30.0 g/L 이상일 수 있다.
다음으로, 단계 (130) 에서, 발효 액체 브로스로부터의 혐기성 박테리아의 세포는 예를 들어 하나 이상의 세포 분리기를 사용하여 무-세포 투과액 및 세포-함유 현탁액으로 분리된다. 이 단계에서, 목표는 발효 액체 브로스로부터 박테리아 세포를 분리 및 제거하고 무-세포 투과액 및 세포-함유 현탁액을 별도로 수득하는 것이다. 무-세포 투과액은 주로 발효 공정에 의해 생성된 발효 생성물을 포함하며 증류 및 기타 공정을 통해 추가 가공할 준비가 된다. 세포-함유 현탁액은 발효 공정 후 주로 박테리아 세포로 구성된다. 세포-함유 현탁액 내의 박테리아 세포는 제 2 농도 (또는 제 2 세포 밀도) 에서 측정될 수 있으며, 하나의 구현예에서, 세포-함유 현탁액 내의 박테리아 세포의 제 2 농도는 발효 액체 브로스에 함유된 박테리아 세포의 제 1 농도와 같거나 더 높다.
발효 용기에서 미생물 배양물의 원하는 세포 농도를 유지하기 위해, 박테리아 발효 공정은 발효 액체 브로스의 일부를 퍼지하는 것을 포함한다. 증가된 세포 농도는 발효 동안, 예를 들어, 유리 아세트산 농도의 원치 않는 증가로 인해 아세테이트 생산이 에탄올 생산보다 선호되도록 하는 등의 작동-관련 문제를 일으킨다. 따라서, 세포 밀도를 모니터링하고 발효 액체 브로스의 주기적인 또는 연속적인 세포 퍼지를 수행하는 것이 중요하다. 용어 "세포 밀도" 는 발효 배지의 단위 부피 당 미생물 세포의 질량, 예를 들어, 그램/리터를 의미한다.
박테리아 발효 용기 중의 세포 농도의 안정화는 발효 용기에서 박테리아 세포를 생물반응기의 모든 환원성 가스 또는 영양소 기질을 이용하는 안정된 정상 상태 농도 미만의 세포 농도로 퍼징하고 발효 생물반응기 브로스에 존재하는 아세테이트의 유리 아세트산 부분이 고농도 (예, 1 g/L 이상, 또는 2 g/L 이상의 유리 아세트산 농도) 를 초과할 때 수성 공급물 속도를 증가시킴으로써 달성된다. 추가적인 배양물 보충 없이 발효 용기 내에서 일정한 세포 농도를 유지함으로써 장기간 (예, 수개월 동안) 대규모의, 연속 박테리아 발효를 유지할 수 있다. 발효 용기 내의 박테리아 배양물에는 하나 이상의 가스 (예, CO, CO2, H2, 및 기타 탄소원 기질) 과 함께 이 기간 동안 비타민 및 기타 필수 영양소를 포함하는 액체 영양 배지가 공급된다.
발효 액체 브로스 내의 세포-함유 현탁액으로부터 무-세포 투과액을 분리하는 데 사용될 수 있는 적합한 세포 분리기는 임의의 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 한외여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 컬럼 여과 장치 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 여과-유형 세포 분리기에 사용될 수 있는 적합한 필터는 나권형 멤브레인/필터, 교차 흐름 필터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 무-세포 투과액으로부터의 세포 분리의 또다른 적절한 수단은 하나 이상의 원심분리 장치를 사용하는 것이다.
하나의 구현예에서, 단계 (130) 에서 사용되는 세포 분리기는 박테리아 세포를 세포-함유 현탁액 및 무-세포 투과액으로 분리 및/또는 세포-함유 현탁액을 세포 분리기에 의한 세포 분리 전에 발효 액체 브로스 내의 세포 농도보다 더 높은 농도로 농축하는 기능을 한다. 대안적인 구현예에서, 발효 액체 브로스 내의 세포는 세포 분리기를 통해 여러 번 통과시켜 (예, 하나 이상의 필터-유형 여과 장치를 여러 번 통과시키거나 하나 이상의 원심 분리기에 의해 동일한 또는 상이한 원심분리 속도로 여러 번 원심분리함으로써) 분리 및 농축될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세포 분리 후, 세포-함유 현탁액 내의 세포 농도 (또는 세포 밀도) 는 발효 액체 브로스의 세포 농도보다 높다. 본 발명의 하나의 측면에서, 나권형 필터를 갖는 하나 이상의 여과 장치는 발효 액체 브로스를 나권형 필터를 통해 여러 번 통과시켜 세포를 농축하는데 사용된다.
또다른 측면에서, 세포 재순환이 수행되고, 일반적으로 무-세포 액체 투과액으로부터 박테리아 세포 함유 현탁액을 분리하고 분리된 박테리아 세포의 전부 또는 일부를 발효 용기로 되돌리는 것을 지칭한다. 하나의 구현예에서, 여과 장치와 같은 세포 분리기에 의한 한외여과는 세포 분리 및/또는 세포 재순환을 달성하기 위해 사용된다.
또다른 측면에서, 발효 용기 내에서 배양된 박테리아에 대한 정상 상태 박테리아 성장 동안, 발효 용기로부터의 세포 퍼지가 수행되어 박테리아 세포를 더 높은 농도의 세포-함유 현탁액 또는 반-건조 미생물 바이오매스로 수집한다. 하나의 구현예에서, 세포 퍼지는 발효 배지에서 발견되는 박테리아 세포 및 기타 물질을 함유하는 발효 액체 브로스의 양을 필요로 한다. 예를 들어, 세포 퍼지는 박테리아 발효 동안 발효 용기로부터 제거된 발효 또는 발효 액체 브로스일 수 있다. 또다른 구현예에서, 세포 퍼지는 발효 용기로부터 제 1 세포 농도의 발효 액체를 제거하고 세포를 제 2 세포 농도의 세포-함유 현탁액을 갖도록 추가로 농축함으로써 농축된 세포-함유 현탁액을 수득하는 것을 필요로 할 수 있다. 세포-함유 현탁액은 발효 용기로부터 제거된 발효 액체의 세포 밀도보다 높은 세포 밀도를 갖는다. 이러한 단계는 특정 미립자의 효율적인 제거를 제공하고 방법 (100) 에서 생산되는 최종 단백질-풍부 영양 보충제에서 단백질 함량의 높은 수율을 허용한다.
하나의 측면에서, 세포 퍼지는 연속적인 박테리아 발효 동안 발생한다. 또다른 측면에서, 세포 퍼지는 박테리아 발효 후에 발생하며, 여기서 박테리아 발효 공정은 발효 용기로부터 미생물 바이오매스의 제거를 허용하기 위해 일시 중지되거나 중단된다.
방법 (100) 의 단계 (140) 에서, 세포-함유 현탁액 내에 함유된 박테리아 세포는 균질물로 파열된다. 파열 장치는 세포-함유 현탁액 내에서 박테리아 세포의 세포막을 파열 및/또는 용해하는 데 사용될 수 있다. 박테리아 세포의 파열을 위한 파열 장치의 예는 미세유체 장치, 초음파분쇄 장치, 초음파 장치, 기계적 파괴 장치, 프렌치 프레스, 냉동고, 히터, 열 교환기, 증류 컬럼, 가공 스트림 및 보유 탱크의 온도를 증가시키는 장치, 저온살균 장치, UV 살균 장치, 감마선 살균 장치, 반응기, 균질화기 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
도 1A 에 나타난 바와 같이, 세포-함유 현탁액 내의 박테리아 세포가 파괴 및/또는 파열된 후, 산출되는 파열된 세포 혼합물, 예, 균질물은 미생물 바이오매스의 균질물 내의 세포 파편 부분에서 단백질-함유 부분을 분리하고 단백질-풍부 영양 보충제를 생성하도록 추가 단백질-함유 부분을 추가로 정제 및 추출하여 단계 (150) 에서 추가로 가공될 수 있다. 이러한 분리는 하나 이상의 분별기를 사용하여 수행되는 것으로 고려된다. 하나의 측면에서, 하나 이상의 단백질-함유 부분이 수득되고 하나 이상의 단백질은 또한 유리 아미노산, 총 아미노산 및 펩티드를 포함할 수 있다.
단계 (150) 에서, 균질물을 분별하기 위한 하나 이상의 분별기의 적합한 예는 그 중에서도 다양한 유형의 고체-액체 분별기, 원심분리 장치, 연속 원심분리기, 경사분리 원심분리기, 디스크-스택 원심분리기, 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 장치, 하나 또는 일련의 크기 배제 컬럼, 하나 또는 일련의 이온 교환 컬럼, 하나 또는 일련의 탄소 폴리머 컬럼, 유동식 자기 분별기, 한외여과 장치, 하나 또는 일련의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 하나 또는 일련의 겔 여과 컬럼, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구현예에서, 단계 (150) 에서, 하나 이상의 파열 장치에 의해 박테리아 세포의 파열 후 수득된 균질물이 제 1 분별기로 전달되고, 제 1 단백질-함유 부분 및 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분이 수득된다. 하나의 측면에서, 제 1 단백질-함유 부분은 적어도 1% 이상, 3% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 95% 이상의 단백질 함량을 갖는다.
하나의 구현예에서, 단계 (160) 에서, 균질물로부터 유래된 제 1 단백질-함유 부분은 단백질-풍부 영양 보충제 조성물, 세포 성장 배지 보충제/조성물, 약학 조성물, 및/또는 동물 사료 (예, 물고기 사료, 새우 사료, 닭 사료, 등) 에 직접 혼입될 수 있다. 이러한 혼입은 하나 이상의 유형의 영양 보충제를 만들기 위해 제 1 단백질-함유 부분을 저수분 함량 (예, 페이스트 또는 분말 형태) 으로 건조 및 제 1 단백질-함유 부분을 다른 성분 (예, 추가 동물 사료 영양소, 약학 충전제, 혼합제, 가소제 등) 과 직접 혼합을 필요로 할 수 있다. 본원에 기술된 단계 (160) 은 제 1 단백질-함유 부분의 품질과 농도를 증가 및 향상시키기 위해, 제 1 단백질-함유 부분의 pH 를 조정하는 추가 가공 단계, 하나 이상의 용해도 향상제의 첨가, 제 1 단백질-함유 부분으로부터 유해한 단백질 제거, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 제 1 단백질-함유 부분은 박테리아 발효-유래 단백질의 추출 및 정제를 수행하고 이를 단백질-풍부 영양 보충제로 사용하기 위해 용도변경함으로써 추가 하류 가공을 거칠 수 있다. 이러한 예는 도 2A 및 2B 에 나타낸다.
대안적으로, 단계 (165) 에서, 균질물로부터 유래된 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분은 단백질-풍부 영양 보충제 조성물, 약학 조성물, 세포 성장 배지 보충제/조성물, 및/또는 동물 사료 (예, 물고기 사료, 새우 사료, 닭 사료, 등) 에 직접 혼입될 수 있다. 유사하게는, 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분의 pH 를 조정하는 추가 가공 단계, 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분에 대한 하나 이상의 용해도 향상제의 첨가, 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분으로부터 유해한 단백질 제거, 및/또는 이들의 조합의 부가적인 가공 단계는 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분의 품질과 농도를 증가 및 향상시키는데 필요할 수 있다. 하나의 측면에서, 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분의 가용성 단백질이 단독으로 회수된다면, 회수된 단백질이 수득될 수 있고, 동물 섭취 또는 인간 섭취를 위한 영양-풍부 보충제로서 직접 혼입될 수 있다. 그러나, 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분이 인간 섭취를 위해 고품질의 영양-풍부 보충제에 혼입되기 위해서는, 영양소 및 단백질 함량을 정제하고 회수하기 위한 추가 하류 가공이 필요할 수 있다. 또다른 측면에서, 이 방법에서 회수된 불용성 단백질은 추가 하류 가공을 거친 다음, 제 1 단백질-함유 부분과 조합되어 단백질-풍부 영양 보충제로 생산될 수 있다.
도 1B 는 박테리아 발효 시스템으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 생산하는 방법 (100) 의 또다른 예의 흐름도이다. 기체상 기질의 박테리아 발효 방법 (100) 은 알코올 생산성 수준과 같은 원하는 발효 생성물 수준을 유지하면서, 탄화수소질 화합물, 탄수화물, 특정 단백질, 특정 아미노산 및/또는 기타 원하는 성분의 형성을 선호하는 조건 하에서 작동할 수 있다.
방법 (100) 의 단계 (130) 는 발효 액체로부터 혐기성 박테리아의 세포를 무-세포 투과액 및 제 2 세포 농도에서 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액으로 분리하는 것을 포함한다. 임의로, 방법 (100) 의 단계 (135) 는 세포-함유 현탁액을 제 1 보유 탱크에 보유하는 것을 포함한다. 하나의 측면에서, 박테리아 세포는 단백질 함량이 높고 소비에 적합한 단백질-풍부 보충제를 생성하는 준비에서 전처리될 수 있다. 또다른 측면에서, 단계 (130) 에서 전처리 공정에 첨가된 하나 이상의 첨가제는 또한 박테리아 세포를 파열시키기 위한 조건을 최적화하고 균질물을 고품질로 생성하는데 도움이 될 수 있다.
단계 (130) 에서 사용되는 적합한 첨가제는 세제, pH 조절제, 효소, 뉴클레아제, 프로테아제, 히드롤라아제, 알칼리성 완충액, 산성 완충액 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 방법 (100) 의 단계 (130) 는 발효-유래 박테리아 세포의 세포-함유 현탁액의 핵산 함량을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 전처리 공정은 박테리아 세포를 뉴클레아제로 처리하여 달성된다. 사용된 뉴클레아제의 예는 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 벤조나아제 및 뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포-함유 현탁액의 뉴클레아제 처리는 알칼리 가수분해 및 화학적 추출, 예컨대 황산암모늄 침전, 에탄올 침전, 폴리에틸렌이민 침전에 의해 추가로 보조될 수 있다.
방법 (100) 의 단계 (140) 은 파열 장치에 의해 균질물을 생성하기 위해 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 파열하는 것을 포함한다. 임의로, 방법 (100) 의 단계 (145) 는 제 1 보유 탱크에서 파열된 후 세포-함유 현탁액을 보유하는 것을 포함한다. 하나의 측면에서, 박테리아 세포는 단백질 함량이 높고 소비에 적합한 단백질-풍부 보충제를 생성하는 준비에서 가공될 수 있다. 또다른 측면에서, 단계 (145) 에서 공정에 첨가된 하나 이상의 첨가제는 또한 박테리아 세포의 파열 후 조건을 최적화하는데 도움이 될 수 있다.
단계 (145) 에서 사용되는 적합한 첨가제는 세제, pH 조절제, 효소, 뉴클레아제, 프로테아제, 히드롤라아제, 알칼리성 완충액, 산성 완충액 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 방법 (100) 의 단계 (145) 는 발효-유래 박테리아 세포의 균질물의 핵산 함량을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 전처리 공정은 박테리아 세포를 뉴클레아제로 처리하여 달성된다. 사용된 뉴클레아제의 예는 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 벤조나아제 및 뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포-함유 현탁액의 뉴클레아제 처리는 알칼리 가수분해 및 화학적 추출, 예컨대 황산암모늄 침전, 에탄올 침전, 폴리에틸렌이민 침전에 의해 추가로 보조될 수 있다.
방법 (100) 의 단계 (150) 는 제 1 분별기를 사용하여 균질물을 제 1 단백질-함유 부분 및 단백질-함유 세포 파편 부분으로 분별하는 것을 포함한다. 방법 (100) 의 단계 (160) 는 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 1 단백질-함유 부분을 수득하는 것을 포함한다. 방법 (100) 의 단계 (165) 는 단백질-풍부 영양 보충제로서 단백질-함유 세포 파편 부분을 수득하는 것을 포함한다.
도 2A 는 제 2 단백질-함유 부분을 단백질-풍부 영양 보충제로서 수득하기 위한 발효 공정으로부터 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액 (예, 방법 (100) 의 단계 (130) 으로부터 제 2 농도의 세포-함유 현탁액) 의 가공 방법 (200A) 의 하나의 예이다. 방법에서, 세포-함유 현탁액 내에서 호기성 세포의 세포막을 파열시키고 균질물을 생성하기 전에 단계 (202) 에서 세포-함유 현탁액을 하나 이상의 첨가제로 처리하는 임의의 가공 단계가 있다.
단계 (202) 의 세포 전처리 공정에서, 세포-함유 현탁액은 전처리를 위해 전처리 챔버 또는 보유 탱크에서 가공될 수 있으며, 단계 (204) 에서 혐기성 박테리아 세포의 세포벽 및 세포막의 파괴를 위한 세포 파열 효율을 보조 및 증가시키기 위해 하나 이상의 첨가제로 처리될 수 있다. 하나의 측면에서, 농축된 박테리아 세포는 파열 장치가 더 많은 부피의 세포를 함께 가공할 준비될 때까지 체류할 보유 탱크에 유입된다. 또다른 측면에서, 보유 탱크에 체류하는 동안, 박테리아 세포는 단백질 함량이 높고 소비에 적합한 단백질-풍부 보충제를 생성하는 준비에서 전처리될 수 있다. 또다른 측면에서, 단계 (202) 에서 전처리 공정에 첨가된 하나 이상의 첨가제는 또한 단계 (204) 에서 박테리아 세포를 파열시키기 위한 조건을 최적화하고 균질물을 고품질로 생성하는데 도움이 될 수 있다.
단계 (202) 에서 사용되는 적합한 첨가제는 세제, pH 조절제, 효소, 뉴클레아제, 프로테아제, 히드롤라아제, 알칼리성 완충액, 산성 완충액 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 방법 (200A) 의 단계 (202) 는 발효-유래 박테리아 세포의 세포-함유 현탁액의 핵산 함량을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 전처리 공정은 박테리아 세포를 뉴클레아제로 처리하여 달성된다. 사용된 뉴클레아제의 예는 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 벤조나아제 및 뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포-함유 현탁액의 뉴클레아제 처리는 알칼리 가수분해 및 화학적 추출, 예컨대 황산암모늄 침전, 에탄올 침전, 폴리에틸렌이민 침전에 의해 추가로 보조될 수 있다. 하나의 측면에서, 세포-함유 현탁액의 핵산 함량은 약 1.5% 내지 5%, 또는 약 2% 내지 18% 로 감소된다.
단계 (206) 에서, 세포 파열 후에, 균질물은 제 1 분별기를 사용하여 제 1 단백질-함유 부분 및 단백질-함유 세포 파편 부분으로 분별화되는 것과 같은 추가 추출 및 정제 공정을 거칠 수 있다. 균질물을 분별하기 위한 제 1 분별기의 예는 그 중에서도 다양한 유형의 고체-액체 분별기, 원심분리 장치, 연속 원심분리기, 경사분리 원심분리기, 디스크-스택 원심분리기, 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 장치, 하나 또는 일련의 크기 배제 컬럼, 하나 또는 일련의 이온 교환 컬럼, 하나 또는 일련의 탄소 폴리머 컬럼, 유동식 자기 분별기, 한외여과 장치, 하나 또는 일련의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 하나 또는 일련의 겔 여과 컬럼, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 농축된 박테리아 세포의 세포-함유 현탁액은 단계 (204) 에서 파열 장치로 직접 이동할 수 있고, 이후 단계 (206) 에서 균질물을 분리하고 분별하기 위한 조건을 최적화하는 것을 돕기 위해 단계 (202) 에서 언급한 바와 같이 전처리 과정을 거친다. 또다른 측면에서, 방법 (200A) 에서 회수된 단백질은 추가 하류 가공을 거친 다음, 제 1 단백질-함유 부분과 조합되어 단백질-풍부 영양 보충제로 생산될 수 있다.
단계 (208) 에서, 제 1 단백질-함유 부분은 제 2 분별기로 전달되고 단계 (210) 에서 제 2 분별기를 사용하여 제 2 단백질-함유 부분으로 분별된다. 단백질-함유 부분을 분별하기 위한 제 2 분별기의 예는 그 중에서도 다양한 유형의 고체-액체 분별기, 원심분리 장치, 연속 원심분리기, 경사분리 원심분리기, 디스크-스택 원심분리기, 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 장치, 하나 또는 일련의 크기 배제 컬럼, 하나 또는 일련의 이온 교환 컬럼, 하나 또는 일련의 탄소 폴리머 컬럼, 유동식 자기 분별기, 한외여과 장치, 하나 또는 일련의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 하나 또는 일련의 겔 여과 컬럼, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
단계 (212) 에서, 수득된 제 2 단백질-함유 부분은 단백질-풍부 영양 보충제, 약학 조성물, 세포 성장 배지/조성물, 및/또는 동물 사료 (예, 물고기 사료, 새우 사료, 닭 사료, 등) 로 제형화될 수 있다. 이러한 혼입은 하나 이상의 유형의 영양 보충제를 만들기 위해 제 2 단백질-함유 부분을 저수분 함량 (예, 페이스트 또는 분말 형태) 으로 건조 및 제 2 단백질-함유 부분을 다른 성분 (예, 추가 동물 사료 영양소, 약학 충전제, 혼합제, 가소제 등) 과 직접 혼합을 필요로 할 수 있다.
예를 들어, 단계 (204) 의 균질물은 여과 장치에 유입되어 제 1 단백질-함유 부분 (예, 여과 장치에 의한 여과 후 여과물 단백질-함유 부분) 을 산출할 수 있다. 여과된 단백질-함유 부분은 부분적으로 정제된 단백질 생성물이다. 하나의 구현예에서, 여과된 단백질-함유 부분은 이후 원심분리하여 (예, 제 2 분별기/원심분리기에 의해) 추가 가용성 단백질 분별물 및 세포 고체 부분을 산출한다. 이러한 제 2 단백질-함유 부분은 단백질-풍부 영양 보충제로서 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
또다른 예로서, 단계 (204) 로부터의 균질물은 원심분리를 겪을 수 있고, 그 후 상청 단백질-함유 부분이 수집된다. 상청 단백질-함유 부분은 여과 장치로 유입되고, 여기서 제 2 여과물 단백질-함유 부분이 수집된다. 또다른 예로서, 오직 제 1 단백질-함유 부분이 여과 장치로 유입되고, 그 후에 여과물 단백질-함유 부분이 수집되어 단백질-풍부 보충제로 사용된다. 또다른 예로서, 오직 제 1 단백질-함유 부분이 원심분리를 겪고, 그 후 단백질 분별물 또는 상청 단백질-함유 부분이 수집된다. 하나 이상의 단백질-함유 부분과 세포-파편 단백질의 분리는 하나 이상의 분별기에 의해 수행된다.
하나의 측면에서, 2 개의 분별기를 갖는 발효 시스템이 사용된다. 또다른 구현예에서, 3 개의 분별기를 갖는 발효 시스템이 사용된다. 도 2B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 단백질-풍부 영양 보충제로서 제 3 단백질-함유 부분을 수득하기 위해 3 개의 분별기가 사용되는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액을 가공하는 방법 (200B) 의 하나의 예이다.
도 2B 에 제시된 바와 같이, 방법 (200B) 는 단계 (214) 에서 제 2 단백질-함유 부분을 제 3 분별기로 전달하고 제 3 단백질 함유-부분은 단계 (216) 에서 제 2 단백질-함유 부분으로부터 분별되고 추출된다. 제 3 단백질-함유 부분은 단계 (218) 에서 수집되고 제 3 단백질-함유 부분은 단계 (220) 에서 단백질-풍부 보충제로서 수집 및 수득된다.
예를 들어, 단계 (210) 로부터의 제 2 단백질-함유 부분은 제 3 분별기 (예, 여과 장치) 로 유입되도록 전달되어 단백질-풍부 보충제로서 수집 및 사용되는 여과물 단백질-함유 부분을 산출한다. 또다른 예로서, 제 2 단백질-함유 부분은 원심분리를 거치고, 그 후 상청 단백질-함유 부분 및 펠렛 세포 파편 부분이 수집된다. 여과물 단백질-함유 부분은 여과 장치로부터 수집되어 단백질 함량이 약 1% 내지 3%, 3% 내지 7%, 7% 내지 10%, 약 10% 내지 14%, 약 11% 내지 20%, 약 21% 내지 35%, 약 35% 이상인 단백질-풍부 영양 보충제로 생산된다.
하나의 구현예에서, 단계 (160), (165), (212), (220) 에서 수득된 하나 이상의 단백질-함유 부분은 탈수 챔버로 전달되고, 그 후 탈수된 단백질-함유 부분이 수집되어 단백질-풍부 영양 보충제로서 생산된다. 대안적으로, 2 개 이상의 탈수 챔버가 있으며, 여기서 각 단계의 각 단백질-함유 부분은 별도의, 개별 탈수 챔버로 전달된다. 탈수 챔버는 단백질-함유 부분을 수용하여 저 수분 페이스트 형태 또는 건조 분말 형태로 건조하여, 인간 섭취 및/또는 동물 사료를 위한 단백질-풍부 영양 보충제에 혼합할 준비가 된다. 탈수 챔버의 적합한 예는 오븐 건조기, 분무 건조 챔버, 드럼 건조기 및 냉동 건조기, 동결건조 장치 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 아세트산 생성 박테리아를 사용하는 발효 공정으로부터의 단백질-풍부 영양 보충제의 제조 방법이다. 상기 방법은 발효 용기에서 혐기성 박테리아로 기체상 기질을 발효시키는 단계, 발효 용기로부터 혐기성 박테리아의 세포를 함유하는 발효 액체의 양을 제 1 농도에서 수득하는 단계, 발효 액체로부터 혐기성 박테리아의 세포를 무-세포 투과액 및 제 2 농도에서 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액으로 분리하는 단계, 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 균질물로 파열시키는 단계, 및 균질물 내의 세포 파편 부분에서 제 1 단백질-함유 부분을 분리하는 단계를 포함한다.
하나의 측면에서, 방법은 발효 용기에서 혐기성 박테리아로 기체상 기질을 발효시키는 단계를 포함한다. 기체상 기질은 발효 용기로 흐르는 하나 이상의 가스의 CO-함유 기체상 기질이다. 사용되는 하나 이상의 가스는 탄소원 기질, 일산화탄소 (CO), 이산화탄소 (CO2), 수소 (H2) 가스, 합성가스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 혐기성 박테리아에는 속 클로스트리디움, 아세토박테리움, 및 이들의 유사한 변이체와 같은 아세트산 생성 박테리아의 하나 이상의 균주가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 발효 용기는 클로스트리디움 박테리아의 배양에 적합한 환경을 제공하며, 영양분, 비타민 및 기타 필수 미네랄을 박테리아에 제공하기 위해 발효 용기로 유입되는 발효 배지가 있다.
방법은 발효 용기로부터 제 1 세포 농도에서 혐기성 박테리아의 세포를 함유하는 발효 액체의 양을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 발효 액체의 수집물은 박테리아 발효 시스템 내의 하나 이상의 장치로 보내질 수 있다. 하나의 측면에서, 발효 액체의 후속 조작량은 제 2, 제 3 및 제 4 세포 농도이다. 대부분의 측면에서, 조작된 발효 액체의 제 2 세포 농도는 제 1 발효 액체의 제 1 세포 농도보다 더 크다.
방법은 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 발효 액체의 양을 수용하는 제 1 세포 분리기를 추가로 포함한다. 제 1 세포 분리기는 발효 액체를 혐기성 박테리아 세포 및 제 1 무-세포 투과액을 함유하는 제 1 세포-함유 현탁액으로 분리한다.
제 1 세포 분리기로 전달되는 발효 액체는 제 1 세포 농도를 갖는다. 제 1 세포 분리기에 의해 생성된 제 1 세포-함유 현탁액은 제 2 세포 농도를 갖는다. 제 1 세포-함유 현탁액의 제 2 세포 농도는 발효 액체의 제 1 세포 농도보다 높다. 제 1 무-세포 투과액은 제 1 세포 분리기에 연결된 프로세싱 챔버로 보내진다. 일부 측면에서, 제 1 세포-함유 현탁액의 일부는 발효 용기로 다시 보내진다.
또다른 측면에서, 제 1 발효 액체의 제 1 흐름은 에탄올 생산을 위한 추가 공정을 위해 제 1 세포 분리기로 보내진다. 제 2 발효 액체의 제 2 흐름은, 단백질-풍부 영양 보충제로 사용될 수 있는 단백질-함유 생성물의 생산을 위한 추가 공정을 위해 제 2 세포 분리기로 보내진다.
본 발명의 방법은 에탄올 생산의 높은 생산성을 생성하는 동시에 발효 공정에 사용되는 박테리아 세포 내에서 발견되는 유용한 모이어티를 재활용하는, 동시 접근방식을 제공한다. 수집된 발효 액체는 혐기성 박테리아 세포의 제 1 농도에 있다. 세포 분리기는 혐기성 세포의 제 2 농도에서 세포-함유 현탁액을 생성한다. 하나의 구현예에서, 세포 분리기는 제 2 농도의 세포-함유 현탁액을 파열 장치로 보낸다. 또다른 구현예에서, 세포 분리기는 세포-함유 현탁액을 보유 탱크로 보낸다.
일단 수집되면, 수집은 발효 액체로부터 혐기성 박테리아의 세포를 무-세포 투과액 및 제 2 세포 농도에서 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액으로 분리하기 위해 추가 가공될 수 있다. 세포-함유 현탁액의 제 2 농도는 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 발효 액체의 제 1 농도보다 높다. 무-세포 투과액은 에탄올 생산을 위해 에탄올을 증류하는 프로세싱 챔버로 다시 보내진다. 이것은 에탄올을 함유하는 여전히 유용한 무-세포 투과액을 버리지 않는 효율적인 시스템을 제공한다.
방법은 세포-함유 현탁액 내에서 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 균질물로 파열하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 측면에서, 이것은 파열 장치에서 발생한다. 혐기성 박테리아의 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액은 파열 장치로 유입되며, 여기서 세포-함유 현탁액은 높은 힘 (예, 기계적, 소리 또는 압력) 을 받는다. 높은 전단력은 세포의 세포막을 파열시켜, 세포를 파괴시키고, 세포가 세포-함유 현탁액에 유입될 때 세포의 내용물이 자유-부유하도록 한다. 파열 장치는 제 1 단백질-함유 부분을 얻기 위해 추가로 가공될 수 있는 균질물을 생성한다. 균질물은 일반적으로 단백질, 금속 (예, Ca, Cl, Co, K, Mg, Ni, P, S, Se, W, Zn, Na, Fe), 지질, 핵산 및 당을 포함하여, 발효-유래 박테리아 세포에서 일반적으로 발견되는 여러 모이어티를 함유한다.
제 1 단백질-함유 부분을 수득하기 위해, 방법은 균질물 내의 세포 파편 부분으로부터 제 1 단백질-함유 부분을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 측면에서, 균질물은 원심분리된 다음 여과되어, 제 1 단백질-함유 부분을 산출한다. 제 1 단백질-함유 부분은 제 1 분별기로 전달되고, 이는 제 2 단백질-함유 부분을 제 1 단백질-함유 부분으로부터 분리하고, 제 1 분별기로부터 제 2 단백질-함유 부분의 수집을 허용한다.
하나의 측면에서, 방법은 균질물의 세포 파편 부분으로부터 분리된 제 1 단백질-함유 부분을 탈수시키는 단계를 포함한다. 이 측면에서, 시스템은 제 1 분별기에 연결된 탈수 챔버를 갖는다. 제 1 분별기는 제 1 단백질-함유 부분을 탈수 챔버로 전달하고, 탈수 챔버는 단백질-풍부 영양 보충제로서 생산된 건조된 단백질-함유 부분을 생성한다.
또다른 측면에서, 방법은 균질물의 세포 파편 부분을 탈수시키는 단계를 포함한다. 이 측면에서, 파열 장치는 세포 파편 부분을 탈수 챔버로 전달하여, 추가 하류 가공을 위해 준비한다. 세포 파편 부분은 높은 수준의 단백질 함량을 함유하는 불용성 분획이다. 전형적으로, 이것은 불용성인 세포벽 또는 세포막 성분을 포함한다. 이것은 또한 적은 농도의 핵산 또는 단백질 응집체를 함유할 수 있다. 대부분의 측면에서, 핵산의 대부분은 제 1 단백질-함유 부분으로 방출된다. 때때로 이들 단백질 응집체는 용해하기 어렵고 세포 파편 부분에 남을 것이다. 제 1 단백질-함유 부분 및 세포 파편 부분 중의 단백질 함량의 결정은 총 세포 질량 및 단백질 양, 가용성 및 불용성에 대한 질량 균형의 가정을 기반으로 한다. 예를 들어, 불용성 단백질 회수율 계산에는 전체 세포 질량에서 가용성 단백질의 질량을 빼서 불용성 질량의 근사치를 산출하는 것이 포함된다.
II. 아세트산 생성 바이오매스를 가공하여 발효-유래 단백질을 산출하기 위한 박테리아 발효 시스템
박테리아 발효 시스템은 박테리아 발효 용기, 하나 이상의 파열 장치, 하나 이상의 세포 분리기 및 하나 이상의 분별기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 하나 이상의 탈수 챔버가 하나 이상의 파열 장치 및/또는 하나 이상의 분별기에 연결되어 수득된 단백질-함유 부분의 단백질-농도를 증가시키고 수분 함량을 감소시킨다. 임의로, 박테리아 발효 시스템은 박테리아 세포 또는 세포-함유 현탁액을 보유하기 위한 하나 이상의 보유 탱크, 저장 챔버 및/또는 전처리 챔버를 추가로 포함한다.
도 3A-3B, 4A-4H, 5A-5E 및 6 은 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하는 발효 공정으로부터 세포-함유 현탁액 및 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 생산하기 위한 이러한 예시적인 박테리아 발효 시스템을 예시한다. 도 3A 는 세포-함유 현탁액 및 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 생성하기 위한 박테리아 발효 시스템 (300A) 의 개략도이며, 여기서 2 개의 세포 분리기 및 1 개의 탈수 챔버가 사용된다.
도 3A 에서, 박테리아 발효 시스템 (300A) 은 발효 용기 (310), 세포 분리기 (320), 세포 분리기 (330), 프로세싱 챔버 (350), 및 임의로 탈수 챔버 (375) 를 포함한다. 박테리아 발효 시스템 (300A) 은 하나의 구현예에서 연속 박테리아 발효 시스템일 수 있다. 대안적으로, 박테리아 발효 시스템 (300A) 은 배치 박테리아 발효 시스템일 수 있다.
2 개 이상의 유입 라인, 예, 유입 라인 (302) 및 유입 라인 (304) 은 발효 용기 (310) 에 연결된다. 유입 라인 (302) 은 기체상 기질, 추가 보충제 및/또는 기타 고체 또는 액체 기질을 발효 용기 (310) 로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 유입 라인 (304) 은 발효 배지 또는 기타 배양 배지를 발효 용기 (310) 로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 기체상 기질 및 발효 배지의 전환은 발효 용기 (310) 에서 일어난다. 본원에서 사용되는 발효 배지는 선택된 혐기성 박테리아의 성장을 허용하기에 충분한 비타민, 염 및 미네랄을 함유하는 통상의 박테리아 성장 배지를 포함한다. 비타민 칵테일 형태의 비타민이 발효 배지에 첨가된다. 비타민은 티아민 (B1), 판토텐산 (B5), 비오틴 (B7), 기타 아미노산 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 B 비타민 계열에서 여러 가지를 포함한다.
발효 용기 (310) 내부에서, 기체상 기질 및 발효 배지는 발효 용기 (310) 내에 함유된 혐기성 박테리아에 의해 제 1 농도의 혐기성 박테리아의 세포를 함유하는 발효 액체 브로스로 발효된다. 이어서 반응기 가스는 배출 라인 (314) 에 의해 박테리아 발효 시스템 (300A) 으로부터 방출된다. 발효 용기 (310) 는 혐기성 박테리아로 기체상 기질을 발효시키기 위한 환경을 제공한다. 하나의 측면에서, 기체상 기질은 탄소원 기질, 일산화탄소 (CO), 이산화탄소 (CO2), 수소 가스 (H2) 및 합성가스로 이루어진 하나 이상의 가스인 반면, 혐기성 박테리아는 속 클로스트리디움, 아세토박테리움 및 그의 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 혐기성 박테리아이다.
발효 용기 (310) 는 3 개 이상의 배출 라인, 예, 배출 라인 (314), 배출 라인 (316) 및 배출 라인 (312) 을 포함할 수 있다. 배출 라인 (314) 은 발효 용기 (310) 로부터 배출될 가스, 배출 가스, 추가 가스의 전달을 위해 사용될 수 있다. 배출 라인 (312) 은 박테리아 발효 시스템 (300A) 으로부터 세포 분리기 (320) 로 발효 액체 브로스의 일부를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 배출 라인 (316) 은 박테리아 발효 시스템 (300A) 으로부터 세포 분리기 (330) 로 발효 액체 브로스의 일부를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 발효 용기 (310) 로부터의 발효 액체 브로스의 일부는 각각 배출 라인 (312) 및 배출 라인 (316) 에 의해, 세포 분리기 (320) 및 세포 분리기 (330) 로 전달되고 공급된다. 각각의 세포 분리기 (320) 및 세포 분리기 (330) 내부에서, 발효 액체 브로스 (1 차 농도의 박테리아 세포를 함유함) 에 함유된 혐기성 박테리아의 세포는 무-세포 투과액과 잔류액 (예, 제 2 농도의 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액) 으로 분리된다.
배출 라인 (322) 및 배출 라인 (332) 는 무-세포 투과액을 각각 세포 분리기 (320) 및 세포 분리기 (330) 로부터, 그리고 프로세싱 챔버 (350) 로 전달하는데 사용된다. 프로세싱 챔버 (350) 내부에서, 무-세포 투과액은 산소화 탄화수소질 화합물로 가공된다. 프로세싱 챔버 (350) 는 또한 배출 라인 (354) 을 통해 발효 용기 (310) 로 다시, 물을 포함하는 증류 수성 내용물을 재순환시킬 수 있다. 하나의 예에서, 증류액은 주로 물을 포함할 수 있고, 다른 내용물도 포함할 수 있다. 예를 들어, 일반 증류 수성 스트림은 95% 의 물, 약 5% 의 아세트산, 및 일부 기타 내용물을 함유한다. 그 후, 프로세싱 챔버 (350) 는 추가의 하류 가공을 위해 배출 라인 (352) 을 통해 산소화 탄화수소질 화합물의 최종 생성물을 보낸다. 하나의 구현예에서, 프로세싱 챔버 (350) 는 무-세포 투과액이 가공되고 고 품질의 산소화 탄화수소질 화합물 (예, 고농도 및/또는 무수 형태의 에탄올, 부탄올, 예컨대 95% w/w 이상 농도의 에탄올 등) 로 증류되는 증류 챔버이다.
세포 분리기 (320) 를 통과한 후 수득된 세포-함유 현탁액은 배출 라인 (324) 을 통해 세포 재순환을 위한 발효 용기 (310) 로 다시 전달될 수 있어서 세포-함유 현탁액 내의 세포가 추가 발효 공정을 거칠 수 있다. 한편, 세포 분리기 (330) 통과 후 수득된 세포-함유 현탁액은 세포 분리기 (330) 에 의해 농축되고 배출 라인 (336) 을 통해 탈수 챔버 (375) 로 전달되어 혼합물로 파열되고 건조될 수 있다. 탈수 챔버 (375) 는 오븐 건조기, 패들 건조기, 분무 건조 장치, 드럼 건조기, 동결건조 장치 및 이들의 조합일 수 있다. 이어서, 세포 분리기 (330) 에서, 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액의 일부는 추가 발효 공정을 위해 배출 라인 (334) 을 통해 발효 용기 (310) 로 다시 전달된다.
세포-함유 현탁액을 단백질-풍부 보충제로 가공하는 하나의 예는 세포-함유 현탁액을 고온 프로세싱 챔버 내부, 예, 분무 건조 탈수 챔버 내부의 약 100°C 이상의 고온 (예, 섭씨 250 도 이상) 에 적용하여, 세포를 파열시키고 세포-함유 현탁액의 수분 함량을 페이스트 또는 분말 형태로 감소시킨다. 세포-함유 현탁액을 가공하는 또다른 예는 세포-함유 현탁액을 저온 프로세싱 챔버 내부의 약 섭씨 0 도 이하의 온도에 적용하는 것이다.
배출 라인 (376) 은 탈수 챔버 (375) 에 연결되어 단백질-풍부 보충제의 조성물로 혼합할 준비가 되도록 탈수 챔버 (375) 로부터 세포-함유 현탁액의 파열 및 탈수 형태를 전달한다. 탈수 챔버 (375) 에서 탈수 공정이 수행된 후, 단백질-풍부 영양 보충제가 배출 라인 (376) 을 통해 박테리아 발효 시스템 (300A) 으로부터 수득 및 수집된다.
도 3B 는 세포-함유 현탁액 및 하나 이상의 산소화 탄화수소질 화합물을 생성하기 위한 박테리아 발효 시스템 (300B) 의 개략도이며, 여기서 2 개의 세포 분리기, 1 개의 보유 탱크 및 1 개의 탈수 챔버가 사용된다. 도 3B 에서, 박테리아 발효 시스템 (300B) 은, 상기 논의된 바와 같이, 유입 라인 (302), 유입 라인 (304) 및 여러 배출 라인에 연결된 발효 용기 (310), 배출 라인 (312), 배출 라인 (322) 및 배출 라인 (324) 에 연결된 세포 분리기 (320), 배출 라인 (316) 및 배출 라인 (336) 에 연결된 세포 분리기 (330), 및 배출 라인 (336) 및 배출 라인 (376) 에 연결된 탈수 챔버 (375) 를 포함한다.
또한, 박테리아 발효 시스템 (300B) 은 무-세포 투과액의 일부를 보유하고 저장하기 위한 보유 탱크 또는 저장 탱크를 추가로 포함한다. 예를 들어, 보유 탱크 (340) (예, 무-세포 투과액 보유 탱크) 는 배출 라인 (322) 및 배출 라인 (332) 을 통해 각각 세포 분리기 (320) 및 세포 분리기 (330) 에 연결된다. 세포 분리기 (320) 및 세포 분리기 (330) 에 의한 세포 분리 후 수득된 무-세포 투과액은 보유 탱크 (340) 에 담겨 있는 무-세포 투과액을 산소화 탄화수소질 화합물의 고품질 형태의 최종 생성물로 가공하기 위한 준비시 전처리 또는 다량으로 저장될 수 있다. 하나의 구현예에서, 무-세포 투과액은 배출 라인 (342) 을 통해 보유 탱크 (340) 로부터 전달되는 프로세싱 챔버 (350) 내에서 에탄올 생산을 위해 추가로 가공된다. 그 후, 산소화 탄화수소질 화합물의 가공된 최종 생성물은 배출 라인 (352) 을 통해 프로세싱 챔버 (350) 밖으로 전달되고, 프로세싱 챔버 (350) 로부터 생성된 물, 아세트산, 영양소 및 기타 물질은 배출 라인 (354) 을 통해 발효 용기 (310) 로 다시 재순환될 수 있다.
도 4A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 혐기성 박테리아의 배양물을 사용하고 박테리아 발효로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하는 발효 공정을 위한 하나의 발효 용기, 하나의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 하나의 분별기, 및 2 개의 탈수 챔버를 갖는 박테리아 발효 시스템 (400A) 의 개략도를 보여준다. 박테리아 발효 시스템 (400A) 은 유입 라인 (402), 유입 라인 (404), 발효 용기 (410), 배출 라인 (412), 배출 라인 (414), 세포 분리기 (420), 배출 라인 (422), 배출 라인 (424), 프로세싱 챔버 (450), 배출 라인 (452), 배출 라인 (454), 파열 장치 (460), 배출 라인 (462), 분별기 (470), 배출 라인 (472), 배출 라인 (474), 탈수 챔버 (475A), 탈수 챔버 (475B), 배출 라인 (476A), 및 배출 라인 (476B) 을 포함한다.
박테리아 발효 시스템 (400A) 은 하나의 구현예에서 연속 박테리아 발효 시스템일 수 있다. 먼저, 발효 배지의 흐름이 유입 라인 (402) 에 의해 박테리아 발효 시스템 (400A) 으로 공급된다. 그 다음, 기체상 기질의 흐름이 유입 라인 (404) 에 의해 박테리아 발효 시스템 (400A) 으로 공급된다. 기체상 기질 및 발효 배지의 흐름은 이후 혐기성 박테리아를 배양하는 발효 용기 (410) 로 유입된다. 발효 용기 (410) 는 혐기성 박테리아로 기체상 기질을 발효시키기 위한 환경을 제공한다. 기체상 기질 및 발효 배지의 전환은 발효 용기 (410) 에서 일어난다. 발효 용기 (410) 내부에서, 기체상 기질 및 발효 배지는 발효 용기 내에 함유된 혐기성 박테리아에 의해 제 1 농도의 혐기성 박테리아의 세포를 함유하는 발효 액체 브로스로 용이하게 발효된다. 미반응 반응 가스는 배출 라인 (414) 에 의해 박테리아 용기 (410) 로부터 방출되고 배기된다.
또한, 발효 액체 브로스는 배출 라인 (412) 에 의해 세포 분리기 (420) 로 전달되고 공급된다. 세포 분리기 (420) 내부에서, 발효 액체 브로스에 함유된 혐기성 박테리아의 세포는 무-세포 투과액 및 제 2 농도의 세포-함유 혐기성 박테리아 세포로 분리된다. 세포 분리기 (420) 내의 무-세포 투과액은 그 후 배출 라인 (422) 을 통해 프로세싱 챔버 (450) 로 전달된다. 이어서, 세포 분리기 (420) 에서, 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액의 양은 추가 발효 공정을 겪도록 배출 라인 (424) 을 통해 발효 용기 (410) 로 다시 전달된다. 세포 분리기 (420) 에서, 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액의 또다른 양은 배출 라인 (426) 을 통해 파열 장치 (460) 로 전달된다.
프로세싱 챔버 (450) 내부에서, 무-세포 투과액은 산소화 탄화수소질 화합물로 가공된다. 프로세싱 챔버 (450) 는 또한 배출 라인 (454) 을 통해 발효 용기 (410) 로 다시 물을 재순환시킨다. 전체적으로, 프로세싱 챔버 (450) 는 추가의 하류 가공을 위해 배출 라인 (452) 을 통해 95% 에탄올을 보낸다.
파열 장치 (460) 의 내부에서, 세포-함유 현탁액 내에 함유된 혐기성 박테리아 세포의 세포막이 파열되어 균질물을 생성한다. 균질물은 배출 라인 (462) 을 통해 분별기 (470) 로 보내진다. 하나의 측면에서, 배출 라인 (474) 은 단백질-풍부 영양 보충제로서 생산될 제 1 단백질-함유 부분을 전달하는 분별기 (470) 에 연결된다. 배출 라인 (472) 은 세포 파편 부분이 추가 하류 가공을 위해 또다른 장치로 흐르도록 하는 분별기 (470) 에 연결된다. 또다른 측면에서, 원치않는 오염물 및 파편을 제거하기 위한 하나 이상의 분별기 이후에 하나 이상의 단백질-함유 분획이 다시 함께 첨가되고 단백질-풍부 영양 보충제로서 생산된다.
본원에서 사용될 수 있는 예시적인 파열 장치는 미세유체 장치, 초음파분쇄 장치, 초음파 장치, 기계적 파괴 장치, 프렌치 프레스, 냉동고, 히터, 열 교환기, 증류 컬럼, 가공 스트림 및 보유 탱크의 온도를 증가시키는 장치, 저온살균 장치, UV 살균 장치, 감마선 살균 장치, 반응기, 균질화기 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
파열 장치 (460) 의 하나의 예는 박테리아 세포의 내용물을 추가로 조작할 수 있도록 박테리아 미생물의 세포막 및 세포벽의 구조에 대한 비가역적 변경을 유발하는 장치이다. 박테리아 세포의 내용물은 핵산, 단백질, 글리코겐, 안료, 지질 방울, 결정 및 기타 영양소, 예컨대 상이한 형태의 탄소, 질소, 황, 칼슘, 등을 포함한다.
하나의 측면에서, 파열 장치 (460) 는 높은 힘을 사용하여 혐기성 박테리아 세포의 세포막을 파열시킴으로써 세포를 파괴한다. 높은 전단력은 예컨대 소리, 압력 또는 기계적 수단에 의해 세포-함유 현탁액 내의 혐기성 박테리아 세포에 적용된다. 본 발명에서, 방법은 제 2 농도의 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 파열 장치 (460) 에 보내는 단계를 포함한다. 파열 장치 (460) 는 강한 힘 (예, 기계적, 소리, 압력) 으로 세포의 세포막을 파열시키고 균질물을 생성함으로써 세포를 파괴하며, 여기서 박테리아 세포의 파열된 상태가 제공된 박테리아 세포 내 유용한 모이어티, 예를 들어, 단백질에 대한 접근성이 더 양호하다. 대안적으로, 방법은 균질물은 제 1 분별기로 전달하기 전, 균질물을 제 2 파열 장치에 전달하는 것을 포함한다. 제 2 파열 장치는 균질물의 세포를 추가로 파열하고, 그 후 단백질-풍부 영양 보충제를 생산한다.
예를 들어, 파열 장치 (460) 는 미세유체 장치이다. 미세유체 장치는 반응 챔버, 튜브, 펌프, 플랜지 파이프, 링, 개스킷, 고압 체크 밸브를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 미세유체 장치의 반응 챔버는 세라믹 반응 챔버, 내마모성 챔버, 스풀 반응 챔버 (단일-슬롯, 다중-슬롯이고 마이크로-채널링이 있음) 일 수 있다.
또다른 예로서, 파열 장치 (460) 는 효소 처리 장치이다. 또다른 예로서, 파열 장치는 초음파 장치이다. 초음파 장치는 초음파 프로브 또는 초음파 배쓰이다. 초음파 장치는 세포를 교반하고 파열하도록 고주파 음파를 사용하여 세포를 전단한다. 또다른 예로서, 파열 장치는 냉동 장치이다. 냉동 장치는 동결 및 해동 주기를 가지며, 여기서 박테리아 세포는 동결 및 해동 주기의 여러 라운드에 들어가고, 여기서 세포는 동결된 다음 완충액에서 해동된다. 또다른 예로서, 파열 장치는 기계적 파열 장치이다. 기계적 파열 장치는 박테리아 세포의 세포벽 및/또는 세포막을 파괴하기 위한 기계적 블레이드 또는 비드를 포함한다.
분별기 (470) 내부에서, 이어서 균질물이 제 1 단백질-함유 부분 및 단백질-함유 세포 파편 부분으로 분획화된다. 다음으로, 제 1 단백질-함유 세포 파편 부분이 배출 라인 (472) 를 통해 탈수 챔버 (475A) 에 전달된다. 이어서, 제 1 단백질-함유 부분이 배출 라인 (474) 를 통해 탈수 챔버 (475B) 에 전달된다. 예시적인 분별기는 다음을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다: 다양한 유형의 고체-액체 분별기, 원심분리 장치, 연속 원심분리기, 경사분리 원심분리기, 디스크-스택 원심분리기, 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 장치, 하나 또는 일련의 크기 배제 컬럼, 하나 또는 일련의 이온 교환 컬럼, 하나 또는 일련의 탄소 폴리머 컬럼, 유동식 자기 분별기, 한외여과 장치, 하나 또는 일련의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 하나 또는 일련의 겔 여과 컬럼, 및 이들의 조합.
탈수 챔버 (475A) 및 탈수 챔버 (475B) 에서 탈수 공정을 거친 후, 단백질-풍부 영양 보충제가 배출 라인 (476A 및 476B) 둘 모두를 통해 각각 탈수 챔버 (475A) 및 탈수 챔버 (475B) 로부터 각각 수득 및 수집될 수 있다.
도 4B 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 두 개의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 세 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (400B) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (400B) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (402), 유입 라인 (404), 발효 용기 (410), 배출 라인 (412), 배출 라인 (414), 배출 라인 (416), 세포 분리기 (420), 배출 라인 (422), 배출 라인 (424), 배출 라인 (426), 세포 분리기 (430), 배출 라인 (432), 배출 라인 (434), 배출 라인 (436), 프로세싱 챔버 (450), 배출 라인 (452), 배출 라인 (454), 파열 장치 (460), 배출 라인 (462), 분별기 (470), 배출 라인 (472), 배출 라인 (474), 탈수 챔버 (475), 배출 라인 (476), 분별기 (480), 배출 라인 (482), 배출 라인 (484), 탈수 챔버 (485A), 배출 라인 (486A), 탈수 챔버 (485B), 및 배출 라인 (486B).
한 측면에서, 세포 분리기 (430) 는 세포 농축기이다. 본 발명의 경우, 방법은 제 1 농도의 혐기성 박테리아의 세포를 함유하는 상당한 양의 발효 액체 브로스를 발효 용기로부터 수집하는 것을 포함한다. 이 수집물은 발효 용기 (410) 를 세포 분리기 (430) 에 연결하는 배출 라인 (416) 을 통해 전달된다. 세포 분리기 (430) 에서, 발효 액체 브로스가 무-세포 투과액 및 제 1 농도의 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액으로 분리되고 제 2 농도로 농축된다 (예를 들어, 발효 액체 브로스의 제 1 농도 보다 더 높은, 고농도의 세포를 지님). 무-세포 투과액은 프로세싱 챔버 (450) 및 세포 분리기 (430) 를 연결하는 배출 라인 (432) 을 통해 프로세싱 챔버 (450) 로 보내진다. 제 2 농도의 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액은 파열 장치 (460) 를 세포 분리기 (430) 에 연결하는 배출 라인 (436) 을 통해 파열 장치 (460) 에 보내진다.
한 측면에서, 파열 장치 (460) 에 의해 가공된 후, 균질물은 분별기 (470) 에 전달되어 단백질-함유 부분 및 세포 파편 부분으로 분리된다. 분별기 (470) 는 배출 라인 (462) 을 통해 파열 장치 (460) 에 연결된다. 분별기 (470) 는 적어도 둘의 배출 라인을 가지는데, 여기서 배출 라인 (472) 은 세포 파편 부분을 전달하는 데 이용되고, 제 2 배출 라인 (474) 은 단백질-함유 부분을 전달하는 데 이용된다.
한 측면에서, 제 1 단백질-함유 부분은 제 1 단백질-함유 부분으로부터 제 2 단백질-함유 부분을 추가로 분리해내기 위해 분별기 (480) 에 전달된다. 분별기 (480) 는 배출구 (474) 를 통해 분별기 (470) 에 연결된다. 분별기 (480) 는 적어도 둘의 배출구를 가지는데, 여기서 제 1 배출구 (482) 로부터 세포 파편이 흐르고, 제 2 배출구 (484) 로부터 제 2 단백질-함유 부분이 흐른다. 방법은 제 2 분별기로부터 제 2 단백질-함유 부분을 수집하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 둘 이상의 분별기가 존재한다. 또 다른 측면에서, 본 발명에 이용되는 박테리아 발효 시스템 내에 단 하나의 분별기가 존재하며, 이로부터 제 1 단백질-함유 부분이 수집된다. 예시적인 분별기는 다음을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다: 다양한 유형의 고체-액체 분별기, 원심분리 장치, 연속 원심분리기, 경사분리 원심분리기, 디스크-스택 원심분리기, 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 장치, 하나 또는 일련의 크기 배제 컬럼, 하나 또는 일련의 이온 교환 컬럼, 하나 또는 일련의 탄소 폴리머 컬럼, 유동식 자기 분별기, 한외여과 장치, 하나 또는 일련의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 하나 또는 일련의 겔 여과 컬럼, 및 이들의 조합.
도 4C 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 하나의 분별기, 및 두 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (400C) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (400C) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (402), 유입 라인 (404), 발효 용기 (410), 배출 라인 (412), 배출 라인 (414), 세포 분리기 (420), 배출 라인 (422), 배출 라인 (424), 배출 라인 (426), 무-세포 보유 탱크 (440), 배출 라인 (442), 배출 라인 (444), 프로세싱 챔버 (450), 배출 라인 (452), 배출 라인 (454), 파열 장치 (460), 배출 라인 (462), 분별기 (470), 배출 라인 (472), 배출 라인 (474), 탈수 챔버 (475A), 배출 라인 (476A), 탈수 챔버 (475B), 및 배출 라인 (476B).
도 4D 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 세 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (400D) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (400D) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (402), 유입 라인 (404), 발효 용기 (410), 배출 라인 (412), 배출 라인 (414), 세포 분리기 (420), 배출 라인 (422), 배출 라인 (424), 배출 라인 (426), 무-세포 보유 탱크 (440), 배출 라인 (442), 배출 라인 (444), 프로세싱 챔버 (450), 배출 라인 (452), 배출 라인 (454), 파열 장치 (460), 배출 라인 (462), 분별기 (470), 배출 라인 (472), 배출 라인 (474), 탈수 챔버 (475), 배출 라인 (476), 분별기 (480), 배출 라인 (482), 배출 라인 (484), 탈수 챔버 (485A), 배출 라인 (486A), 탈수 챔버 (485B), 및 배출 라인 (486B).
도 4E 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 두 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 세 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (400E) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (400E) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (402), 유입 라인 (404), 발효 용기 (410), 배출 라인 (412), 배출 라인 (414), 배출 라인 (416), 세포 분리기 (420), 배출 라인 (422), 배출 라인 (424), 세포 분리기 (430), 배출 라인 (432), 배출 라인 (436), 무-세포 보유 탱크 (440), 배출 라인 (442), 배출 라인 (444), 프로세싱 챔버 (450), 배출 라인 (452), 배출 라인 (454), 파열 장치 (460), 배출 라인 (462), 분별기 (470), 배출 라인 (472), 배출 라인 (474), 탈수 챔버 (475), 배출 라인 (476), 분별기 (480), 배출 라인 (482), 배출 라인 (484), 탈수 챔버 (485A), 배출 라인 (486A), 탈수 챔버 (485B), 및 배출 라인 (486B).
도 4F 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 하나의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 세 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (400F) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (400F) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (402), 유입 라인 (404), 유입 라인 (406), 발효 용기 (410), 배출 라인 (412), 배출 라인 (414), 세포 분리기 (420), 배출 라인 (422), 배출 라인 (424), 배출 라인 (426), 무-세포 보유 탱크 (440), 배출 라인 (442), 배출 라인 (444), 세포-함유 보유 탱크 (445), 배출 라인 (446), 프로세싱 챔버 (450), 배출 라인 (452), 배출 라인 (454), 파열 장치 (460), 배출 라인 (462), 분별기 (470), 배출 라인 (472), 배출 라인 (474), 탈수 챔버 (475), 배출 라인 (476), 분별기 (480), 배출 라인 (482), 배출 라인 (484), 탈수 챔버 (485A), 배출 라인 (486A), 탈수 챔버 (485B), 및 배출 라인 (486B).
한 측면에서, 박테리아 발효 시스템 (400F) 은 박테리아 발효 용기로부터 보내진 박테리아 세포를 체류시키기 위해 보유 탱크 (예, 세포-함유 보유 탱크 (445)) 를 포함한다. 한 구현예에서, 보유 탱크는 발효 용기로부터 수집된 미생물 바이오매스의 혐기성 박테리아 세포를 저장하는 저장 용기이다. 이는 박테리아 세포가 발효 용기 (410) 로부터 파열 장치 (460) 로 이동하는 경우, 병목 현상 문제점에 대한 우려를 완화한다 (박테리아 세포가 박테리아 발효 용기 (410) 로부터 지속적으로 수집되어 파열 장치 (460) 를 과부하시키지 않고 파열 장치 (460) 에 전달됨). 파열 장치 (460) 로의 농축된 박테리아 세포의 전달 속도는 세포 분리기/농축기 밖의 발효 액체 브로스의 전달 속도보다 더 낮을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 보유 탱크 (예, 세포-함유 보유 탱크 (445)) 는 파열 효율을 증가시키기 위해 박테리아 세포에 하나 이상의 첨가제가 적용되는 전처리 장치로서 역할 한다. 첨가제로 세포를 처리하는 것은 세포막이 박테리아 세포의 기계적 파괴에 보다 가단성 (malleable) 이 되도록 한다. 이러한 전처리는 세포-함유 현탁액이 파열 장치 (460) 에 진입하기 전에 일어날 수 있다. 대안적으로는, 전처리는 세포-함유 현탁액이 파열 장치 (460) 에 의해 파열되고 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 균질물이 하나 이상의 첨가제로 처리된 후에 일어날 수 있다. 세포-함유 보유 탱크 (445) 의 예시는 프로세싱 챔버, 탱크, 스테인리스 스틸 탱크, 플라스틱 탱크 등을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
박테리아 발효 시스템 (400F) 에서, 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액은 세포-함유 보유 탱크 (445) 내부에서 하나 이상의 첨가제로 전-처리될 수 있다. 하나 이상의 첨가제, 예를 들어, 계면활성제, 세제, EDTA, Triton X-100, Tween-20, 나트륨 도데실 설페이트, CHAPS, 효소, 프로테아제, 리소자임, 벤조나아제, 뉴클레아제, 리보뉴클레아제 (RNase), 데옥리보뉴클레아제 (DNase), 가수분해-유도제, pH 조절제, 및 이들의 조합물이 유입 라인 (406) 을 통해 세포-함유 보유 탱크 (445) 에 첨가될 수 있다. pH 조절제로서 첨가제의 한 예시는 나트륨 하이드록사이드이다. pH 조절제로서 첨가제의 또 다른 예시는 하이드로젠 클로라이드이다.
한 측면에서, 전처리 장치는 발효 용기 (410) 에 연결되는 세포 분리기/농축기 (예, 세포 분리기 (420) 및/또는 세포 분리기 (430)) 에 연결된다. 또 다른 측면에서, 전처리 장치는 발효 용기 (410) 에 직접적으로 연결되며, 여기서 전처리 장치의 구성 요소는 세포 분리기 및 농축기이다. 특정한 첨가제를 도입하여 박테리아 세포의 세포막이 기타 파열 기법에 대해서 보다 가단성이 되도록 하기 위해, 전처리 장치는 전처리 챔버 및 유입구 (예, 유입 라인 (406)) 을 포함한다. 이용된 첨가제(들) 의 유형 및 이용된 파열 장치의 유형은 세포의 파열 효율을 증가시키기 위해 임의의 수의 조합일 수 있다.
도 4G 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 두 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 세 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (400G) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (400G) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (402), 유입 라인 (404), 유입 라인 (406), 발효 용기 (410), 배출 라인 (412), 배출 라인 (414), 배출 라인 (416), 세포 분리기 (420), 배출 라인 (422), 세포 분리기 (430), 배출 라인 (432), 배출 라인 (436), 무-세포 보유 탱크 (440), 배출 라인 (442), 배출 라인 (444), 세포-함유 보유 탱크 (445), 배출 라인 (446), 프로세싱 챔버 (450), 배출 라인 (452), 배출 라인 (454), 파열 장치 (460), 배출 라인 (462), 분별기 (470), 배출 라인 (472), 배출 라인 (474), 탈수 챔버 (475), 배출 라인 (476), 분별기 (480), 배출 라인 (482), 배출 라인 (484), 탈수 챔버 (485A), 배출 라인 (486A), 탈수 챔버 (485B), 및 배출 라인 (486B).
도 4H 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 두 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 세 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (400H) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (400H) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (402), 유입 라인 (404), 발효 용기 (410), 배출 라인 (412), 배출 라인 (414), 세포 분리기 (420), 배출 라인 (422), 세포 분리기 (430), 배출 라인 (432), 배출 라인 (436), 무-세포 보유 탱크 (440), 배출 라인 (442), 배출 라인 (444), 프로세싱 챔버 (450), 배출 라인 (452), 배출 라인 (454), 파열 장치 (460), 배출 라인 (462), 배출 라인 (464), 분별기 (470), 배출 라인 (472), 배출 라인 (474), 탈수 챔버 (475), 배출 라인 (476), 분별기 (480), 배출 라인 (482), 배출 라인 (484), 탈수 챔버 (485A), 배출 라인 (486A), 탈수 챔버 (485B), 및 배출 라인 (486B).
특정 구현예에서, 박테리아 발효 시스템 (400H) 은 하나 이상의 재순환 라인을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 재순환 라인은 파열 장치 (460) 에 연결된 복귀 라인 (464) 이다. 복귀 라인 (464) 은 파열 장치로부터 생성물 혼합물의 부분을 취하고 파열 장치 (460) 에 재진입한다. 이는 파열 장치 (460) 를 다회 통과하는 것을 허용하는데, 이는 결국 혐기성 박테리아 세포의 단백질-함유 균질물의 파열된 양 및 단백질 농도를 증가시켜 추가의 가공을 위한 박테리아 세포 내 단백질 화합물에의 충분한 접근성을 보장한다.
도 5A 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 하나의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 하나의 분별기, 및 두 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (500A) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (500A) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (502), 유입 라인 (504), 발효 용기 (510), 배출 라인 (512), 배출 라인 (514), 세포 분리기 (520), 배출 라인 (522), 배출 라인 (524), 배출 라인 (526), 프로세싱 챔버 (550), 배출 라인 (552), 배출 라인 (554), 세포-함유 보유 탱크 (545), 유입 라인 (506), 배출 라인 (542), 혼합기 (548), 파열 장치 (560), 배출 라인 (562), 배출 라인 (564), 분별기 (570), 배출 라인 (572), 배출 라인 (574), 탈수 챔버 (575A), 배출 라인 (576A), 탈수 챔버 (575B), 및 배출 라인 (576B).
세포 분리기 (520) 에서, 발효 용기 (510) 로부터의 발효 액체 브로스가 무-세포 투과액 및 제 2 농도의 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액으로 분리된다. 무-세포 투과액은 프로세싱 챔버 (550) 및 세포 분리기 (520) 를 연결하는 배출 라인 (522) 을 통해 프로세싱 챔버 (550) 로 보내진다. 제 2 농도의 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액은 세포-함유 보유 탱크 (545) 를 세포 분리기 (520) 에 연결하는 배출구 (526) 를 통해 세포-함유 보유 탱크 (545) 에 보내진다.
균질물을 전달하는 파열 장치 (560) 는 분별기 (570) 에 연결된다. 분별기 (570) 에서, 방법 (500A) 은 세포-함유 현탁액을 제 1 단백질-함유 부분 및 세포 파편 부분으로 분리하는 것을 포함한다. 분별기 (570) 는 배출구 (562) 를 통해 파열 장치 (560) 에 연결된다. 분별기 (570) 는 적어도 둘의 배출구를 가지는데, 여기서 제 1 배출구 (574) 로부터 세포 파편이 흐르고, 제 2 배출구 (572) 로부터 제 1 단백질-함유 부분이 흐른다. 이용된 분별기의 유형은 다음을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다: 다양한 유형의 고체-액체 분별기, 원심분리 장치, 연속 원심분리기, 경사분리 원심분리기, 디스크-스택 원심분리기, 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 장치, 하나 또는 일련의 크기 배제 컬럼, 하나 또는 일련의 이온 교환 컬럼, 하나 또는 일련의 탄소 폴리머 컬럼, 유동식 자기 분별기, 한외여과 장치, 하나 또는 일련의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 하나 또는 일련의 겔 여과 컬럼, 및 이들의 조합.
한 예시에서, 박테리아 발효 시스템 (500A) 은 전처리 챔버로서 역할 하는 세포-함유 보유 탱크 (545) 를 추가로 포함한다. 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액은 세포-함유 보유 탱크 (545) 에서 하나 이상의 첨가제로 처리된다. 세포-함유 보유 탱크 (545) 는 하나 이상의 첨가제 (예, 세제, 효소, 완충액, pH 조절제 등) 를 공급하는 유입 라인 (506) 에 연결된다. 유입구 (506) 는 일반적으로는 꺼져 있고 필요할 때 켜질 수 있다. 세포-함유 보유 탱크 (545) 는 세포가 높은 세포 밀도 (고농도) 에 도달하기까지 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 보유하고, 파열 장치 (560) 로의 특정량의 세포-함유 현탁액의 적시 전달을 제공하는 역할을 할 수 있다.
세포-함유 보유 탱크 (545) 내부의 혼합기 (548) 는 교반 장치, 예컨대 내부에 프로펠러가 있는 교반 장치이다. 파열 장치 (560) 는 배출 라인 (542) 을 통해 세포-함유 보유 탱크 (545) 에 연결된다. 파열 장치 (560) 는 혐기성 박테리아 세포의 균질물을 생성한다. 세포-함유 보유 탱크 (545) 내에서 특정 기간 후에, 세포-함유 현탁액은 파열 장치 (560) 에 전달된다.
한 측면에서, 분별기 (570) 는 하나 이상의 단백질-함유 부분을 수용하고 이들을 건조시키는, 하나 이상의 탈수 챔버 (예, 탈수 챔버 (575A, 575B)) 에 연결된다. 이용되는 건조 기법은 건조, 분무 건조, 동결건조 등을 포함한다. 이어서, 단백질-함유 부분이 추가로 가공되어 단백질-풍부 영양 보충제에 배합된다. 단백질-함유 부분은 단백질-풍부 영양 보충제의 10 % 이상 (예컨대, 10 % 내지 80 % 또는 50 % 내지 95 %) 의 단백질 함량을 가질 수 있다.
도 5B 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 하나의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 분별기, 및 두 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (500B) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (500B) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (502), 유입 라인 (504), 발효 용기 (510), 배출 라인 (512), 배출 라인 (514), 세포 분리기 (520), 배출 라인 (522), 배출 라인 (524), 배출 라인 (526), 프로세싱 챔버 (550), 배출 라인 (552), 배출 라인 (554), 세포-함유 보유 탱크 (545), 유입 라인 (506), 배출 라인 (542), 혼합기 (548), 파열 장치 (560), 배출 라인 (562), 배출 라인 (564), 분별기 (580), 배출 라인 (582), 배출 라인 (584), 탈수 챔버 (585A), 배출 라인 (586A), 탈수 챔버 (585B), 및 배출 라인 (586B). 이 예시에서, 세포-함유 보유 탱크 (545) 는 배출 라인 (562) 을 통해서 파열 장치 (560) 의 하류에 연결된다.
도 5C 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 하나의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 세 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (500C) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (500C) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (502), 유입 라인 (504), 발효 용기 (510), 배출 라인 (512), 배출 라인 (514), 세포 분리기 (520), 배출 라인 (522), 배출 라인 (524), 배출 라인 (526), 프로세싱 챔버 (550), 배출 라인 (552), 배출 라인 (554), 세포-함유 보유 탱크 (545), 유입 라인 (506), 혼합기 (548), 배출 라인 (542), 파열 장치 (560), 배출 라인 (562), 배출 라인 (564), 분별기 (570), 배출 라인 (572), 배출 라인 (574), 탈수 챔버 (575), 배출 라인 (576), 분별기 (590), 배출 라인 (592), 배출 라인 (594), 탈수 챔버 (595A), 배출 라인 (596A), 탈수 챔버 (595B), 및 배출 라인 (596B).
도 5D 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 하나의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 네 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (500D) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (500D) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (502), 유입 라인 (504), 발효 용기 (510), 배출 라인 (512), 배출 라인 (514), 세포 분리기 (520), 배출 라인 (522), 배출 라인 (524), 배출 라인 (526), 프로세싱 챔버 (550), 배출 라인 (552), 배출 라인 (554), 파열 장치 (560), 배출 라인 (562), 배출 라인 (564), 분별기 (570), 배출 라인 (572), 배출 라인 (574), 분별기 (570), 배출 라인 (592A), 배출 라인 (594A), 분별기 (590), 배출 라인 (592B), 배출 라인 (594B), 탈수 챔버 (595A), 배출 라인 (596A), 탈수 챔버 (595B), 배출 라인 (596B), 탈수 챔버 (595C), 배출 라인 (596C), 탈수 챔버 (595D), 및 배출 라인 (596D). 한 측면에서, 파열 장치 (560) 는 파열 장치 (560) 를 다회 통과하는 것을 허용하는 재순환 스트림 라인 (예, 배출 라인 (564)) 을 갖는다.
도 5E 는 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 두 개의 세포 분리기, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 세 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (500E) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (500E) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (502), 유입 라인 (504), 발효 용기 (510), 배출 라인 (512), 배출 라인 (514), 배출 라인 (516), 세포 분리기 (520), 배출 라인 (522), 배출 라인 (524), 프로세싱 챔버 (550), 배출 라인 (552), 배출 라인 (544), 세포 분리기 (530), 배출 라인 (532), 배출 라인 (534), 배출 라인 (536), 세포-함유 보유 탱크 (545), 배출 라인 (506), 배출 라인 (542), 혼합기 (548), 파열 장치 (560), 배출 라인 (562), 분별기 (570), 배출 라인 (572), 배출 라인 (574), 탈수 챔버 (575), 배출 라인 (576), 분별기 (580), 배출 라인 (582), 배출 라인 (584), 탈수 챔버 (585A), 배출 라인 (586A), 탈수 챔버 (585B), 및 배출 라인 (586B).
도 6 은 박테리아 발효 공정으로부터 단백질-풍부 영양 보충제를 수득하기 위한 하나의 발효 용기, 두 개의 세포 분리기, 하나의 무-세포 보유 탱크, 하나의 프로세싱 챔버, 하나의 세포-함유 보유 탱크, 하나의 파열 장치, 두 개의 분별기, 및 두 개의 탈수 챔버가 있는 박테리아 발효 시스템 (600) 의 개략도를 나타낸다. 박테리아 발효 시스템 (600) 은 다음을 포함한다: 유입 라인 (602), 유입 라인 (604), 발효 용기 (610), 배출 라인 (612), 배출 라인 (614), 배출 라인 (616), 세포 분리기 (620), 배출 라인 (622), 배출 라인 (624), 무-세포 보유 탱크 (640), 배출 라인 (642), 배출 라인 (644), 프로세싱 챔버 (650), 배출 라인 (652), 배출 라인 (654), 세포 분리기 (630), 배출 라인 (632), 배출 라인 (636), 세포-함유 보유 탱크 (645), 유입 라인 (606), 배출 라인 (646), 파열 장치 (660), 배출 라인 (662), 분별기 (670), 배출 라인 (672), 배출 라인 (674), 탈수 챔버 (675), 배출 라인 (676), 분별기 (690), 유입 라인 (692), 배출 라인 (694), 탈수 챔버 (695), 및 배출 라인 (696).
한 구현예에서, 미세유체 장치인 하나의 파열 장치가 존재하는데, 여기서 세포는 파열 장치에 진입하고 반응 챔버에서 높은 전단력을 받아 혐기성 박테리아의 세포벽 및 세포막이 파괴된다. 이어서, 파열된 박테리아 세포는 원심분리, 여과, 혐기성 박테리아 세포를 탈수하는 다양한 방법 (예, 건조, 냉동 건조, 동결건조 등), 배합, 중금속 이온의 제거, 섭취 가능한 물질에 영양 보충제로서의 통합, 또는 이들의 조합을 통해 추가로 가공된다.
또 다른 구현예에서, 박테리아 발효 시스템은 2 개 이상의 파열 장치를 갖는다. 또한, 제 1 파열 장치는 발효 액체로부터 분리된 세포-함유 현탁액 내 박테리아 세포를 보유하는 보유 탱크 또는 저장 용기일 수 있다. 전처리 장치인 제 1 파열 장치가 존재하는데, 여기서 세포-함유 현탁액이 제 1 파열 장치에 진입하고 첨가제로 처리되어 파열 효율을 증가시킨다. 이용되는 첨가제는 하나 이상의 세제, 효소, 화학 물질 또는 이들의 조합물을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 미세유체 장치인 제 2 파열 장치가 존재하는데, 여기서 세포는 제 2 파열 장치에 진입하고 반응 챔버에서 높은 전단력을 받는다. 세포-함유 현탁액은 박테리아 세포의 세포벽 및 세포막이 파열 및 파괴되도록 야기하는 미세-채널링 (micro-channeling) 을 통해 강제되는데, 여기서 박테리아 세포의 내용물이 발효 액체 전체에 걸쳐 자유롭게 부유하게 된다. 이는 원심분리, 여과, 탈수 등에 의해 추가로 조작될 수 있는 제 1 단백질 회수의 수집을 허용한다.
III. 발효-유래 단백질을 포함하는 영양 보충제의 조성물
본원에 기재되어 있는 박테리아 발효 시스템으로부터 회수된 하나 이상의 단백질-함유 부분은 공급 원료 조성물과의 직접 블렌딩, 건조, 침강, 여과, 한외여과, 미세여과, 진공 여과, 원심분리, 순차 원심분리, 냉동 건조, 동결, 가수분해, 및 이들의 조합을 겪어, 훨씬 순수한 형태의 단백질을 보다 높은 단백질 농도로 생성 및 수득할 수 있다. 미생물 바이오매스가 가수분해되는 측면에서, 가수분해는 열처리, 산 가수분해, 효소 가수분해, 알칼리 가수분해 및 이들의 조합을 통해 수행될 수 있다.
방법의 한 구현예에서, 제 1 단백질-함유 부분은 단백질-풍부 영양 보충제로서 생산된다. 제 1 단백질-함유 부분은 60 % 내지 80 % 인 단백질 함량을 갖는다. 또 다른 측면에서, 제 1 단백질-함유 부분은 40 % 내지 60 % 인 단백질 함량을 갖는다. 또 다른 측면에서, 제 1 단백질-함유 부분은 10 % 내지 40 % 인 단백질 함량을 갖는다.
한 구현예에서, 본 발명은 단백질-풍부 영양 보충제인 조성물을 제공한다. 이 조성물은 아세트산 생성 박테리아 배양을 이용하는 발효 공정으로부터 생성된다. 이러한 조성물은 균질물의 세포 파편 부분으로부터 분리된 단백질-함유 부분을 포함하는데, 여기서 균질물은 아세트산 생성 박테리아 배양물의 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 파열하는 것으로부터 수득되고, 세포-함유 현탁액은 아세트산 생성 박테리아 배양물을 이용하는 기체상 기질의 발효 동안 발효 용기 밖에서 전달되는 발효 액체로부터 수득된다.
한 측면에서, 아세트산 생성 박테리아 배양물은 클로스트리듐 박테리아, 아세토박테리움 박테리아 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 발효된 기체상 기질은 탄소원 기질, 일산화탄소 (CO), 이산화탄소 (CO2), 수소 (H2) 기체, 합성기체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 조성물의 단백질-함유 부분은 조성물의 약 10 % 내지 약 80 % 의 단백질 함량, 조성물의 약 5 % 내지 약 35 % 의 탄수화물 함량, 및 조성물의 약 5 % 내지 약 15 % 의 핵산 함량을 포함한다. 단백질-함유 부분 중 단백질 함량은 단백질-함유 부분 중 탄수화물 함량보다 더 크다. 또 다른 측면에서, 핵산 함량은 조성물의 2 % 이하이다. 이는 인간 및 동물에 동등하게 섭취 가능한 조성물이다.
또 다른 구현예에서, 단백질-풍부 영양 보충제의 조성물은 균질물의 단백질-함유 부분으로부터의 제 1 양 및 세포 파편 부분으로부터의 제 2 양으로부터 분리된 정제된 단백질 생성물을 포함하는데, 여기서 균질물은 아세트산 생성 박테리아 배양물의 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 파열하는 것으로부터 수득되고, 세포-함유 현탁액은 아세트산 생성 박테리아 배양물을 이용하는 기체상 기질의 발효 동안 발효 용기 밖에서 전달되는 발효 액체로부터 수득된다. 세포 파편 부분은 혐기성 박테리아 세포의 세포벽 미립자, 세포막 미립자, 단백질 응집체, 봉입체, 핵산 및 기타 구성 요소를 포함한다. 발효 용기 밖에서 전달된 발효 액체 브로스는 무-세포 투과액 및 아세트산 생성 박테리아 배양물의 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액으로 분리된다. 한 측면에서, 부분적으로 정제된 단백질 생성물은 2 % 이하인 핵산 함량을 갖는다. 또 다른 측면에서, 핵산 함량은 8 % 내지 12 % 이하이다.
한 측면에서, 조성물은 조성물의 약 10 % 내지 약 80 % 의 단백질 함량, 조성물의 약 5 % 내지 약 35 % 의 탄수화물 함량, 및 조성물의 약 5 % 내지 약 15 % 의 핵산 함량을 포함한다. 단백질-함유 부분 중 단백질 함량은 단백질-함유 부분 중 탄수화물 함량보다 더 크다.
또 다른 측면에서, 조성물은 조성물의 약 10 % 내지 약 80 % 의 단백질 함량, 조성물의 약 5 % 내지 약 35 % 의 탄수화물 함량, 및 조성물의 2 % 이하의 핵산 함량을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 박테리아 발효 용기로부터 제거되는 경우에 공급 원료 조성물은 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 약 220 kcal 이상을 제공하고 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 약 15 그람 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다 (건조 중량 기준). 이러한 측면에서, 공급 원료는 약 1.0 이하의 탄수화물 대 단백질의 중량비를 갖는다. 또 다른 측면에서, 공급 원료는 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 칼슘 약 18 mg 이상, 세포 질량 100 그람 당 철 약 150 mg 이상, 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 나트륨 약 25 mg 이상, 바이오매스 100 그람 당 칼륨 약 1200 mg 이상, 또는 이들의 조합을 포함한다 (건조 중량 기준). 공급 원료 조성물은 필수 및 비-필수 아미노산 둘 모두를 포함한다. 또한, 공급 원료 조성물은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 공급 원료 조성물은 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 약 60 그람 이상, 또 다른 측면에서, 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 약 60 내지 약 90 그람, 또 다른 측면에서, 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 약 65 내지 약 85 그람, 및 또 다른 측면에서, 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 약 70 내지 약 80 그람의 단백질 함량을 제공한다 (모두 건조 중량 기준).
또 다른 측면에서, 공급 원료 조성물은 건조 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 약 220 kcal 이상, 또 다른 측면에서, 약 220 kcal 내지 약 400 kcal, 또 다른 측면에서 약 250 kcal 내지 약 350 kcal, 또 다른 측면에서, 약 300 kcal 내지 약 325 kcal, 및 또 다른 측면에서, 약 220 kcal 내지 약 300 kcal 를 제공한다.
또 다른 측면에서, 공급 원료 조성물은 건조 아세트산 생성 바이오매스 100 그람 당 약 15 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 15 그람 내지 약 60 그람, 또 다른 측면에서, 약 20 내지 약 40 그람, 또 다른 측면에서, 약 25 내지 약 35 그람, 및 또 다른 측면에서, 약 30 내지 약 35 그람의 탄수화물을 제공한다. 이러한 측면에서, 공급 원료는 약 1.0 이하, 또 다른 측면에서, 약 0.75 이하, 또 다른 측면에서, 0.5 이하, 또 다른 측면에서, 약 0.25 이하, 및 또 다른 측면에서 0.1 이하의 탄수화물 대 단백질의 중량비를 포함한다. 한 측면에서, 공급 원료는 검출 가능한 탄수화물이 없고 단백질만 포함한다. 또 다른 측면에서, 탄수화물은 에탄올 및/또는 수용성 당을 포함할 수 있다.
또한, 공급 원료 조성물은 섬유를 포함할 수 있다. 섬유는 산성 세제 섬유, 중성 세제 섬유, 가소화성 섬유 및/또는 난소화성 섬유를 포함할 수 있다. 또한, 공급 원료 조성물은 전분을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 공급 원료 조성물은 칼슘, 철, 나트륨 및 칼륨을 하기의 양으로 포함한다 (모두 건조 중량 기준으로 아세트산 생성 바이오매스 100 g 당 mg 으로서 표현됨): 칼슘: 약 18 mg 이상, 또 다른 측면에서, 약 20 mg 이상, 또 다른 측면에서, 약 25 mg 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 30 mg 이상; 철: 약 150 mg 이상, 또 다른 측면에서, 약 175 mg 이상, 또 다른 측면에서, 약 200 mg 이상, 및 또 다른 측면에서 약 225 mg 이상; 나트륨: 약 25 mg 이상, 또 다른 측면에서, 약 30 mg 이상, 또 다른 측면에서, 약 35 mg 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 40 mg 이상; 칼륨: 약 1200 mg 이상, 또 다른 측면에서, 약 1300 mg 이상, 또 다른 측면에서, 약 1400 mg 이상, 및 또 다른 측면에서 약 1500 mg 이상.
한 측면에서, 공급 원료 조성물은 미소량의 금속을 포함할 수 있다. 대안적인 측면에서, 공급 원료는 특정한 바람직한 금속의 수준을 포함할 수 있다. 공급 원료 중에 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있는 금속의 예시는 징크, 몰리브데넘, 카드뮴, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크로뮴, 망가니즈, 철, 코발트, 니켈, 구리, 텅스텐 및 셀레늄을 포함한다.
또 다른 측면에서, 아세트산 생성 바이오매스는 단독으로 또는 임의의 조합으로 다음 아미노산 중 어느 하나를 포함할 수 있다 (건조 중량 기준으로 아세트산 생성 바이오매스 100 g 당 그람으로서 표현됨): 필수 아미노산 함량: 아르기닌: 한 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상; 히스티딘: 한 측면에서, 약 1.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 또는 그 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상; 이소류신: 한 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 8.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 9.0 그람 이상; 류신: 한 측면에서, 약 4.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 8.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 9.0 그람 이상; 리신: 한 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 7.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 8.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 9.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 10.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 12.0 그람 이상; 메티오닌: 한 측면에서, 약 1.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상; 페닐알라닌: 한 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상; 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.5 그람 이상, 및 또 다른 측면에서 약 6.0 그람 이상; 트레오닌: 한 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상; 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서 약 8.0 그람 이상; 트립토판: 한 측면에서, 약 0.4 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 0.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 0.6 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 0.7 그람 이상; 또 다른 측면에서, 약 0.8 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 0.9 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 1.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 1.5 그람 이상; 발린: 한 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.5 그람 이상; 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 8.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서 약 9.0 그람 이상.
기타 아미노산 함량: 알라닌: 한 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 8.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 9.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 10.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서 약 11.0 그람 이상; 아스파르트산: 한 측면에서, 약 7.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 7.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 8.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 9.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 10.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 11.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 12.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 14.0 그람 이상; 시스테인: 한 측면에서, 약 1.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 1.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상; 글루탐산: 한 측면에서, 약 9.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 9.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 10.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 12.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 14.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 16.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 18.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 20.0 그람 이상; 글리신: 한 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상; 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상; 메티오닌: 한 측면에서, 약 1.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상; 프롤린: 한 측면에서, 약 2.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 7.0 그람 이상; 세린: 한 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.5 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상; 티로신: 한 측면에서, 약 2.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 3.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 4.5 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.0 그람 이상, 또 다른 측면에서, 약 5.5 그람 이상, 및 또 다른 측면에서, 약 6.0 그람 이상.
한 구현예에서, 공급 원료 조성물은 동물 사료에서 공급 원료로서 활용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 공급 원료 조성물은 수산양식 (aquaculture) 에서 공급 원료로서 활용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 공급 원료 조성물은 인간 및 동물이 동등하게 섭취 가능한 영양 보충제로서 추가로 가공 및 활용될 수 있다.
한 측면에서, 본 조성물은 박테리아 발효 공정에 유효량의 영양소를 제공한다. 이러한 측면에서, "유효량" 은 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있는 건강한 발효 공정을 촉진시키는 것에서의 이용을 설명한다: 약 1 g 이상의 전체 알코올/(L·일) 의 STY 에서의 전체 알코올의 생산; 약 2.0 그람/리터 이상의 세포 밀도의 제공; 및 배양물을 정상 상태로 유지하는 것. 박테리아 발효 공정은 CO-함유 기체상 기질의 발효일 수 있고, 공급 원료가 본래 유래된 동일한 박테리아 발효 공정일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 조성물은 동물에게 유효량의 영양소를 제공한다. "유효량" 은 동물에서의 건강한 성장을 촉진시키는 것에서의 이용 및 다음 중 적어도 하나를 촉진하는 데 충분한 양을 설명한다: 동물에서 박테리아 부하 (bacterial load) 의 억제; 가금류에서의 괴사성 장염 (necrotic enteritis) 의 발병 예방 또는 감소; 동물에서의 면역 반응의 자극; 사료 또는 다른 방식으로 동물에게 투여되는 항생제 및 백신의 유효성의 향상; 투여된 사료의 양 당 증가된 성장률; 증가된 우유 생산; 사망률의 감소; 등. 예를 들어, 유효량을 결정하기 위해 낮은 투여량으로 시작하여 투여량을 적정함으로써, 동물에 맞춰지는 유효량의 결정에 있어서, 동물의 연령, 활동 수준, 호르몬 균형 및 일반 건강과 같은 요인을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 몇 가지 요인이 고려될 수 있다.
본 조성물을 복용하는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 동물은, 예를 들어, 가금류, 예컨대, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 영계 (game hen) 등; 육우 및 젖소, 돼지, 염소 등; 가축, 예컨대, 개 및 고양이; 수생 동물, 예컨대 연어, 연어과 어류 (salmonids), 송어, 틸라피아, 새우, 랍스터 등; 및 인간을 포함한다. 단백질-풍부 영양 보충제의 용도는 소, 돼지, 가금류 및 어류를 비대하게 하는 것을 포함한다. 본 조성물의 다른 용도는 구운 제품, 수프, 사전 포장된 식사, 스마트 식품 및 다이어트 식품을 포함하는 다수의 소비재 제품의 영양가를 개선하기 위한 유화 보조제로서 역할 하는 것을 포함한다. 또 다른 용도는 종이 가공, 가죽 가공, 및 거품 안정화를 포함한다.
실시예:
실시예 1: 연속 박테리아 발효 공정
비타민, 미량 금속 및 염을 함유하는 발효 배지와 함께, 클로스트리듐 융달리이 (Clostridium ljungdahlii) 의 균주를 함유하는 교반 탱크 생물 반응기에 CO 및/또는 CO2/H2 를 함유하는 합성 또는 폐기체가 연속적으로 도입된다. 이용된 적합한 발효 배지는 하기 표 1 에 보고되어 있다.
10 % 이하의 배양 접종물을 이용하여 방법을 시작하는 동안에, 반응기는 발효 배지가 반응기에 연속적으로 공급되지 않는 배치 액상으로 작동된다. 따라서, 반응기 중 액상은 명목 농도의 하나 이상의 제한 영양소, 예를 들어, 칼슘 판토테네이트, 코발트가 있는 발효 배지의 배치로 이루어진다. 대안적으로는, 효모 추출물, 트립티카제, 또는 기타 복합 영양소를 함유하는 풍부 배지가 또한 사용될 수 있다.
이상적으로, 시작에서의 기체상은 CO2-프리이고, 과량의 H2 를 함유한다. 기체 속도 및 교반 속도를 낮은 수준 (New Brunswick Scientific Bioflo® 발효 생물 반응기에서 500 rpm 미만) 으로 유지하여 약간 과량으로 H2 및 CO 를 수득하나, 동시에 CO 기질 억제를 방지한다. 1 리터의 실험실 New Brunswick Scientific Bioflo® 발효 생물 반응기에서, 공급 기체 조성이 63 % 의 H2, 32 % 의 CO 및 5 % 의 CH4 인 예시로서, 시작을 개시하기 위한 교반 속도는 400 rpm 이고, 기체 속도는 20 ml/분 이다. 시작하는 동안 에탄올 생산을 유발하기 위해, 과량으로 H2 및 액체 영양소가 모두 존재한다. 발효 배지 내 특정 영양소에 대한 제한은 나중에 일어난다. 따라서, 과량의 액체 영양소 (예, 칼슘 판토테네이트, 코발트) 는 시작하는 동안 실제로 존재하여 원치 않는 낮은 영양소에 대한 배양 순응 (culture acclimation) 을 방지한다.
a Na+ 농도는 NaCl 로부터만 기인한다. 이는 Na2WO4·2H2O 와 같은 다른 성분으로부터의 Na+ 를 포함하지 않는다.
b Ca+2 농도는 판토텐산으로부터의 칼슘 또는 칼슘 염을 포함하지 않는다.
c 비타민 용액은 d-비오틴, 티아민 HCl, 및 d-판토텐산, 칼슘 염을 함유한다.
d 접종시 0.3-0.5 ml 으로부터 높은 기체 속도에서 0.7-0.8 ml 만큼으로 상당히 달라진다.
접종 후 수 시간의 기간에 걸쳐 박테리아 발효가 진행됨에 따라, CO2 가 CO 의 전환으로부터 생산되고, H2 가 CO2 와 함께 소비되는데, 이는 교반 속도를 명목적으로 증가시켜 기체 물질 이동 제한을 방지하는 신호이다. New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR 에서, 배출 기체는 25 % 의 CO, 67 % 의 H2, 2 % 의 CO2, 및 6 % 의 CH4 이다. 교반 속도가 너무 빠르게 증가하는 경우, 교반의 증가 후의 메탄 농도의 감소에 의해 입증되는 것처럼 CO 기질 억제가 발생한다. 따라서, 교반 속도는 전형적으로 24 시간 내에 200 rpm 이 증가될 수도 있다.
목표 교반 속도가 도달되기까지 교반 속도가 비교적 신속한 속도로 명목적으로 증가하는 동안, CO2 생산 (또는 H2 전환) 을 모니터링하는 절차가 존재한다. New Brunswick Scientific Bioflo® 발효 생물 반응기에서의 전형적인 목표 교반 속도는 900 rpm 이다. 배치 액체 배양에서 교반 속도가 증가하는 이 시간 동안, 세포 생산을 모니터링하는 것은 생성물 형성의 유도보다 우선된다. 따라서, 배치 배양으로부터의 전형적인 생성물 농도가 10 g/L 의 에탄올 및 2 g/L 의 아세테이트인 동안, 약 1.5 g/L 의 세포 농도가 획득된다.
목표 교반 속도가 도달되면, 시스템은 최대 H2 흡수로 성장하도록 허용된다. 아세트산의 생산을 제한하는 동안 에탄올 생산을 보장하기 위해, 매우 높은 H2 파과 농도 (exit concentration) (전형적으로, >60 %) 를 갖는 것이 바람직하다. 이어서, 액체 발효 배지 공급을 켜서 (스톡 배양물로부터의 배치 접종물을 갖는 시스템의 경우) 연속적인 액체 공급을 개시하고, 기체 공급 속도를 목표 유량을 향해 증가시킨다. 실험실 New Brunswick Scientific Bioflo® 발효 생물 반응기에서, 기체 유속이 목표 속도인 125 ml/분을 향해 24 시간마다 10 내지 15 % 씩 증가하는 동안, 액체 공급 속도는 전형적으로 0.5 ml/분이다.
기체 유속이 증가함에 따라, 목표 생산성에서 H2 전환의 소폭 하락에 의해 입증되는 것처럼 반응기가 결국에 액상 영양소 (예, 칼슘 판토테네이트, 코발트) 에 제한되기까지 세포 생산이 증가한다. New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR 에서, 이는 20 g/L·일의 목표 생산성에서 H2 전환의 10 % 하락에 의해 인식된다.
이어서, 생산 방법 및 박테리아 발효 반응기 시스템을 정상 상태에서 유지하여, 15 내지 35 g/L 의 에탄올 및 0 내지 5 g/L 의 아세테이트를 생성물로서 생산하는데, 단지 가끔 제한 영양소, 액체 속도 및 기체 속도가 약간 조절된다. 세포 재순환이 없는 실험실 New Brunswick Scientific Bioflo® 발효 생물 반응기에서의 전형적인 정상 상태 조건은, 20 분의 기체 체류 시간 (기체 유속/반응기 액체 부피), 30 시간의 액체 체류 시간 (액체 유속/반응기 액체 부피) 및 900 rpm 의 교반 속도인데, 이는 판토테네이트 제한과 92 % 의 CO 전환 및 60 % 의 H2 전환을 수득한다.
한 구현예에서, 세포 재순환은 기체 속도 (증가) 및 제 1 영양소 농도 (감소) 의 조절과 함께, 이 때에 반응기 시스템에 첨가된다. New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR 에서 세포 재활용이 있는 기체 체류 시간은 전형적으로 8 분이고, 액체 체류 시간은 12 시간이며, 세포 체류 시간은 40 시간이고, 교반 속도는 900 rpm 이다. 이들 조건은 판토테네이트 제한과 92 % 의 CO 전환 및 50 % 의 H2 전환을 전형적으로 수득한다. 이러한 연속 발효의 방법은 안정적인 작동 조건 하에서 낮은 부산물 아세테이트 농도로 높은 에탄올 농도를 연속적으로 생산하고 유지하는 것을 허용하여, 대상 박테리아의 이용을 에탄올 생산을 위한 산업적 규모로 향상시킨다.
실시예 2: 발효 생성물 비를 제어하기 위한 발효 용기로부터 박테리아 세포의 퍼징 (purging)
CSTR (pH=5.0, 온도=38°C, 압력=20 psig) 에서 C. 융달리이, 균주 C-01 을 활용하여 기체상 기질 (30 % CO, 15 % H2, 10 % CO2, 45 % N2) 발효를 발생시키고 (세포 재순환 있음 (세포 체류 시간=40 시간 및 액체 체류 시간=6 시간)), 배양을 코발트, 칼슘 판토테네이트, 또는 임의의 기타 영양소에 의해 제한하지 않는다. 배양물이 성장함에 따라, 특정한 흡수 (분 당 건조 세포 그람 당 CO mmol) 가 0.5 미만이되도록 하는 세포 밀도가 획득되고, 에탄올에 우선하여 아세트산이 생산된다. 이러한 발생을 막기 위해, 세포의 정상 농도가 분 당 건조 세포 그람 당 0.5 mmol 의 CO 보다 높은 특정한 흡수를 유지하기에 충분히 낮게 유지되도록, 세포 퍼지 속도를 증가시켜 세포 밀도의 증가를 막는다. 이렇게 함으로써, 세포 체류 시간이 6 내지 25 시간으로 감소된다. C. 융달리이의 균주의 박테리아 발효 공정 동안에 세포 농도를 모니터링하기 위해 표 2 를 참고한다.
a 건조 세포 중량 기준
실시예 3: 아세트산 생성 박테리아 세포의 세포 바이오매스의 분석
클로스트리듐 융달리이 C-01 을 합성가스와 생물 반응기에서 성장시켰다. 생물 반응기로부터의 발효물의 샘플 및 세포 바이오매스의 농축 건조 질량을 하기 표 3 의 절차에 따라 분석했다.
세포 바이오매스의 농축 건조 질량의 분석 결과가 표 4 에서 제시된다.
세포 바이오매스의 농축 건조 질량의 아미노산 분석 결과가 표 5 에서 제시된다.
실시예 4: 아세트산 생성 박테리아 세포의 단백질, 탄수화물, 및 핵산 함량 분석
클로스트리듐 융달리이 C-01 을 합성가스와 생물 반응기에서 성장시켰다. 세포 배양물을 4,000 RPM 에서 원심분리하여 배양 배지를 제거하였다. 펠렛을 수집하고 밤새 100°C 의 오븐에서 건조되도록 허용했다.
100 g 의 분쇄된, 건조 펠렛을 실시예 3 에서 기재된 바와 같이, 탄수화물 및 단백질에 대해서 동일한 시험을 이용한 분석을 위해 보냈다. 표 6 은 세포 질량의 최대 80 % 가 단백질이라는 것을 나타낸다.
a 1 % 미만인 비-단백질 질소 함량의 존재로 인한 이론적 근거. 샘플이 3 % 이하의 핵산을 함유하도록, 핵산 중 질소의 비는 약 3 g 의 RNA/DNA 대 1 g 의 질소이다.
실시예 5: 하나 이상의 미세 유동화 파열 장치에 의한 박테리아 세포의 파열 및 미세 유동화 파열 장치에 의한 박테리아 세포의 파열에 대한 단백질 회수
Microfluidics 의 미세유동화기를 발효 공정으로부터 혐기성 박테리아 세포를 파열하고 단백질-함유 부분을 생산하기 위한 파열 장치로서 확인했다. 소정 부피의 발효 액체를 발효 용기로부터 수득했다. 샘플을 원심분리에 의해 1.5 배 또는 예를 들어, 약 20 g/L 이상의 세포 농도로 농축했다. 예를 들어, 약 15 g/L 의 발효 액체를 발효 용기로부터 수득했고, 샘플을 원심분리에 의해 농축하여 22.4 g/L 이상의 세포 밀도를 수득하였다.
생성되는 세포를 용액 중에 (예, 약 44 g 의 세포를 함유할 수 있는 2 L 용액에) 재현탁시켜, Microfluidics 에 보냈다. 미세 유동화 공정은 세포가 고압에서 Microfluidics 반응 챔버 내의 미세-채널을 통과하도록 강제함으로써 생성된 높은 전단력으로 세포를 파열시키는 것을 수반한다.
각 샘플을 상이한 양의 시간(들) 및 상이한 압력에서 러닝시켰다. 시험된 압력은 1 회 또는 다회 통과하는 동안 10,000 내지 30,000 파운드/제곱 인치 (psi) 범위였다. 각 통과는 Microfluidizer 를 통한 러닝을 구성한다. 압력을 파열 장치를 통해 일정한 속도로 가했다. Microfluidizer 는 6 개의 균질화된 샘플을 생성했다. 세포-함유 현탁액을 하나 이상의 첨가제 (예, 세제, 효소 등) 으로 처리하고, Microfluidizer (예, 3,000 psi 이상의 고압 또는 고전단에서) 를 통과시킬 수 있다.
몇몇 실험을 수행했다. 각 샘플을 상이한 양의 시간(들) 및 상이한 압력에서 러닝시켰다. 이 중, 6 개의 예시적 샘플 처리 실험을 위한 조건이 제시된다: (1) 18,000 psi 에서 단일 통과; (2) 18,000 psi 에서 2 회 통과; (3) 23,000 psi 에서 단일 통과; (4) 23,000 psi 에서 2 회 통과; (5) 28,000 psi 에서 단일 통과; (6) 28,000 psi 에서 2 회 통과. 각 통과는 Microfluidizer 를 통과하는 실험을 구성한다. 압력을 파열 장치를 통해 일정한 속도로 가했다. 생성된 단백질-함유 분획의 6 개의 균질화된 샘플이 Microfluidizer 로 처리된 후에 생성되었다. 단백질-함유 분획의 각 샘플을 브래드포드 검정을 이용하여 단백질 함량에 대해서 분석했다.
한 실험에서, 일부 샘플을 Microfluidizer 를 단 1 회 통과시켜 처리했다. 1 회 통과 후, 제 1 단백질-함유 부분을 균질물로부터 분리해냈다. 이어서, 제 1 단백질-함유 부분을 분무 건조하여 단백질 함유 분말을 수득할 수 있다.
제 2 실험에서, 샘플을 Microfluidizer 를 2 회 통과시켜 처리했는데, 여기서 전처리된 세포-함유 현탁액을 재순환 스트림을 통해 흐르게하여, Microfluidizer 에 재차 재-진입시켰다. 2 회의 통과 후, 단백질-함유 부분을 수득했다. 이어서, 단백질-함유 부분의 분말 형태를 수득할 수 있다. 예를 들어, 단백질 함유-부분을 수득한 후, 세 가지 상이한 건조 기법 (고온 건조, 분무 건조, 및 동결건조) 을 시험했다.
실시예 6: 하나 이상의 여과형 분별기 장치에 의한, 파열된 박테리아 세포의 균질물의 분획화
실시예 5 의 처리 공정 후 단백질-함유 부분의 균질물을 나일론 필터를 통해 여과시켰다. 균질물의 여과는 표 7 에 나타낸 바와 같이, 본래의 미생물 바이오매스의 5-15 % 가 가용성 단백질로서 회수되도록 허용했다.
표 7: 여과 후 가용성 단백질의 회수 백분율
실시예 7: 하나 이상의 원심분리형 분별기 장치에 의한, 파열된 박테리아 세포의 균질물의 분획화
실시예 4 의 균질물을 2,000 내지 10,000 RPM 의 속력으로 6 분 동안 원심분리했고, 단백질 함량을 브래드포드 단백질 검정을 이용하여 분석했다. 출발 바이오매스 농도를 기초선으로 이용하여, 가용성 단백질 회수 백분율을 계산했다.
결과는 미세 유동화 후 최대 25 % 의 단백질이 회수되었음을 나타내며, 이는 미세 유동화 후 원심분리가 세포를 용해하고 가용성 단백질을 회수하는 실행 가능한 방법이라는 것을 나타낸다 (또한, 표 7 에도 나타냄).
또 다른 예시로서, 세포 밀도가 22.4 g/L (발효 브로스 중 세포) 인 세포 현탁액을 Microfluidics 에 보냈다. 한 샘플을 18,000 psi 에서 Microfluidizer 를 통과시켰고, 또 다른 샘플은 28,000 psi 의 압력에서 동일한 유형의 Microfluidizer 를 2 회 통과시켰다. 표 8 에 나타낸 바와 같이 결과를 비교하고 수득했다.
a 총 세포 질량의 단백질 함량을 결정하여 계산된 백분율.
b 균질물 및 여과된 샘플을 측정 전에 11X 희석했다.
18,000 psi 에서 1 회 통과한 샘플의 경우, 균질물 중 단백질 농도가 9.5 mg/mL 였다. 이어서, 샘플을 여과하거나, 또는 원심분리하여 추가로 분석했다. 0.45 미크론 필터를 통한 여과 후, 단백질-풍부 분획은 2.4 mg/mL 의 단백질을 함유했다. 2,000 RPM 에서 8 분간 원심분리 후, 단백질-풍부 분획의 단백질 농도는 약 3.2 mg/mL 의 단백질이다. 보다 높은 원심분리 속력은 보다 적은 단백질을 야기했다 (5,000 RPM 에서, 회수된 분획의 단백질 농도는 약 1.0 mg/mL 이상, 또는 약 1.9 mg/mL 이상이었다. 10,000 RPM 의 훨씬 더 높은 원심분리 속력에서, 스핀 후 상청액 분획의 생성된 단백질 농도는 약 1.4 mg/mL 였다).
또 다른 그룹의 샘플을 28,000 psi 에서 Microfluidizer 를 2 회 통과시켜 처리했는데, 여기서 이전에 용해된 세포-함유 현탁액을 재순환 스트림을 통해 흐르게하여, Microfluidizer 에 재차 재-진입시켰다. 균질물 중 단백질-함유 부분의 생성된 단백질 농도는 약 8.5 mg/ml 으로 측정되었다. 이어서, 샘플을 여과 및/또는 원심분리했다. 0.45 미크론 필터를 통한 여과 후, 생성된 단백질 농도는 약 1.8 mg/ml 였다. 2000 RPM 에서 8 분 동안의 원심분리 후, 생성된 단백질 농도는 약 3.0 mg/ml 였다. 보다 높은 원심분리 속력은 보다 낮은 단백질을 야기했다 (5000 RPM 에서, 이는 2.0 mg/ml 였고; 10000 RPM 에서 이는 1.3 mg/ml 였다).
실시예 8: 하나 이상의 미세 유동화 파열 장치에 의한 박테리아 세포 파열로부터의 세포 용해
파열 공정을 수행하기 위해 선택된 파열 장치는 미세유동화기 및 기타 시판중인 장치일 수 있다. 도 7B-7E 에서, 파열 공정을 수행하기 위해 선택된 파열 장치는 미세유동화기이다. 파열 장치 내부의 파열 공정은 통과의 시간 및 압력을 포함한 다양한 변수 하에 수행할 수 있다.
도 7A 는 용해되지 않은 현탁액을 함유하는 세포의 전자 현미경 사진을 도시한다. 전자 현미경 사진은 현미경에 의해 균질물을 대상으로 하여 100X 배율로 촬영했다.
파열 장치 내부에서 파열 공정을 거치기 위해 선택된 세포-함유 현탁액은 밀도가 상이할 수 있다. 도 7A 에서, 파열 공정을 거치지 않은 세포-함유 현탁액의 밀도는 약 10 g/L 이상, 예컨대 약 16 g/L 이상이다.
도 7B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부에서 수득되고, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부의 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포의 세포막의 파열로부터의 생성물인 균질물의 또 다른 전자 현미경 사진을 도시한다.
전자 현미경 사진은 현미경에 의해 균질물을 대상으로 하여 100X 배율로 촬영했다. 도 7B 에서, 파열 공정을 수행하기 위해 선택된 파열 장치는 미세유동화기이다. 이러한 도 7B 에서, 세포-함유 현탁액에 대해서 파열 공정은 1,000 psi 이상의 압력 (예, 1,000 파운드/제곱 인치 (psi) 내지 9,000 psi 이상) 에서 수행된다 (1 회의 통과 있음). 또한, 도 7B 에서, 파열 장치 내부의 이러한 파열 공정을 위해 선택된 세포-함유 현탁액의 세포 밀도는 약 10 g/L 이상, 예컨대 약 16 g/L 이상이다. 시각적으로, 미세 유동화 공정의 결과로서 세포막에 행해진 심각한 손상이 존재한다.
도 7C 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 세포-함유 현탁액이 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부에서 파열되기 전의 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포의 세포막의 전자 현미경 사진을 도시한다.
전자 현미경 사진은 현미경에 의해 균질물을 대상으로 하여 100X 배율로 촬영했다. 이러한 도 7C 에서, 파열 장치 내부의 이러한 파열 공정을 위해 선택된 세포-함유 현탁액의 세포 밀도는 약 10 g/L 이상, 예컨대 약 16 g/L 이상이다. 세포-함유 현탁액에 대해서 파열 공정은 약 1,000 psi 이상의 압력 (예, 1,000 파운드/제곱 인치 (psi) 내지 20,000 psi 이상) 에서 수행된다 (1 회의 통과 있음). 도 7A 에서의 결과에 비해, 도 7C 에서 나타낸 결과는 이 가공 압력에서 발생한 세포막의 상당한 파열을 나타낸다.
도 7D 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부에서 수득되고, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부의 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포의 세포막의 파열로부터의 생성물인 균질물의 또 다른 전자 현미경 사진을 도시한다.
전자 현미경 사진은 현미경에 의해 균질물을 대상으로하여 800X 배율로 촬영했다. 도 7D 에서, 파열 공정을 수행하기 위해 선택된 파열 장치는 미세유동화기이다. 이러한 도 7D 에서, 세포-함유 현탁액에 대해서 파열 공정은 1,000 psi 의 압력 (예, 1,000 파운드/제곱 인치 (psi) 내지 22,000 psi 이상) 에서 수행된다 (1 회의 통과 있음). 또한, 도 7D 에서, 파열 장치 내부의 이러한 파열 공정을 위해 선택된 세포-함유 현탁액의 밀도는 약 15 g/L 이상, 예컨대 약 20 g/L 이상, 또는 약 22.4g/L 이상이다.
도 7E 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부에서 수득되고, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부의 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포의 세포막의 파열로부터의 생성물인 균질물의 또 다른 전자 현미경 사진을 도시한다.
전자 현미경 사진은 현미경에 의해 균질물을 대상으로 하여 800X 배율로 촬영했다. 도 7E 에서, 파열 공정을 수행하기 위해 선택된 파열 장치는 미세유동화기이다. 이러한 도 7E 에서, 세포-함유 현탁액에 대해서 파열 공정은 1,000 psi 의 압력 (예, 25,000 파운드/제곱 인치 (psi) 내지 30,000 psi 이상) 에서 수행된다 (2 회의 통과 있음). 또한, 도 7E 에서, 파열 장치 내부의 이러한 파열 공정을 위해 선택된 세포-함유 현탁액의 세포 밀도는 약 15 g/L 이상, 예컨대 약 20 g/L 이상, 또는 약 23 g/L 이상이다.
실시예 9: 하나 이상의 미세 유동화 파열 장치에 의한 박테리아 세포의 파열과 세포-함유 보유 탱크에서의 박테리아 세포의 전처리
미세유동화기 파열 장치 (예, Microfluidics 장치) 를 발효 공정으로부터 혐기성 박테리아 세포를 파열하고 단백질-함유 부분을 생산하는 데 이용했다. 발효 액체 브로스 (예, 15 g/L 의 세포 밀도) 를 발효 용기의 고세포 밀도 실험실 반응기로부터 수득했다. 샘플을 원심분리에 의해 농축하여 45 g/L 의 세포 밀도를 수득하였다. 생성된 세포 현탁액 (90 g 의 세포를 함유하는 2 L) 을 전처리를 위해 세포-함유 보유 탱크에 보냈다.
미세 유동화 공정은 세포가 고압에서 1 미크론 반응 챔버를 통과하도록 강제함으로써 생성된 높은 전단력으로 세포를 파열시키는 것을 수반한다. 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 6 개의 샘플로 분할했다. 세포-함유 현탁액을 하나 이상의 첨가제 (예, 세제, 효소 등) 으로 처리하고, Microfluidizer 를 15,000 psi 에서 통과시켰다. 미세유동화기 파열 장치를 통과시키는 것을 단 1 회 수행하였다. 1 회 통과 후, 제 1 단백질-함유 부분을 균질물로부터 분리해내고 분무 건조했다.
실시예 10: 하나 이상의 초음파분쇄 파열 장치에 의한 박테리아 세포의 파열
초음파분쇄기를 발효 공정으로부터 혐기성 박테리아 세포를 파열하고 단백질-함유 부분을 생산하기 위한 파열 장치로서 확인했다. 15 g/L 의 발효 액체를 발효 용기의 고세포 밀도 실험실 반응기로부터 수득했다. 샘플을 원심분리에 의해 농축하여 22.4 g/L 의 세포 밀도를 수득하였다. 생성된 세포 재-현탁액 (44 g 의 세포를 함유하는 2 L) 을 초음파분쇄했다. 초음파분쇄 공정은 세포를 교반하고 세포막을 부수어 여는 (beak open) 초음파 주파수에서 소리 에너지를 통한 높은 힘으로 세포를 파열시키는 것을 수반한다. 박테리아 세포를 함유하는 세포-함유 현탁액을 6 개의 샘플로 분할했다. 각 샘플을 초음파분쇄했다.
실시예 11: 하나 이상의 초음파분쇄 파열 장치에 의한 박테리아 세포의 파열과 세포-함유 보유 탱크에서의 박테리아 세포의 전처리
초음파분쇄기를 발효 공정으로부터 혐기성 박테리아 세포를 파열하고 단백질-함유 부분을 생산하기 위한 파열 장치로서 확인했다. 발효 액체 브로스를 3 개의 고세포 밀도 발효 용기로부터 수득하였다. 샘플을 원심분리를 통해 농축하여 4 내지 10 mg/ml 의 세포 밀도를 수득하였다.
예를 들어, 약 4.2 mg/ml 의 박테리아 세포를 함유하는 발효 용기 (이 예시에서, 예시적인 용기 A) 로부터 수득한 발효 액체 브로스를 다양한 완충액 중에서 초음파분쇄하였다. 약 9.2 mg/ml 의 혐기성 박테리아 세포를 함유하는 또 다른 발효 용기 (예시적인 용기 B) 로부터의 세포-함유 현탁액을 다양한 완충액 중에서 초음파분쇄하였다. 또한, 약 7.1 mg/ml 의 세포를 함유하는 또 다른 발효 용기 (예시적인 용기 C) 로부터의 세포-함유 현탁액을 다양한 완충액 중에서 초음파분쇄하였다.
발효 용기로부터 발효 브로스의 수집 후, 발효 브로스로부터의 박테리아 세포를 원심분리를 통해 스핀 다운 (예, 4,000 RPM 이상의 원심분리 속력으로 박테리아 세포를 스핀 다운) 하고 이들의 각각의 완충액 중에서 재-현탁시켰다.
세포를 세제-함유 완충액 (나트륨 도데실 설페이트 (SDS), CHAPS, Triton X-100, 또는 Tween 20 을 함유하는 TrisHCl pH 8) 또는 효소-함유 완충액 (리소자임을 함유하는 TrisHCl pH 8) 중에 재현탁시켰다. TrisHCl pH 8 을 대조군 완충액으로 이용했다. 생성된 세포 현탁액을 초음파분쇄했다.
세포를 5 초의 펄스로 초음파분쇄한 후, 중간에 얼음 상에서 휴지시켰다. 사이클을 3 회 반복했다. 초음파분쇄 후, 세포를 20K RPM 에서 10 분 동안 스핀 다운하고, 상청액을 제거했다. 가용성 단백질 분획을 로우리-기반 단백질 검정을 이용하여 단백질 함량에 대해서 분석했다. 가용성 단백질 회수 백분율을 초음파분쇄된 세포의 농도에 기초하여 계산했다.
또한, 몇몇 샘플이 동결/해동 사이클을 겪게 하였는데, 여기서 세포를 Tris HCl 완충액 중에서 완전히 동결시켰다. 섭씨 -80 도에서 동결시킨 후, 세포를 재-동결시키기 전에 완전히 해동시켰다. 이러한 사이클을 5 회 완료했다. 완료 후, 세포-함유 현탁액을 20,000 RPM 에서 10 분 동안 스핀 다운했고, 상청액을 제거했다. 표 9 는 세포-함유 현탁액 샘플이 적용된 완충액 유형에 의한 단백질 회수량을 나타낸다. 가용성 단백질 회수 백분율은 초기 출발 물질에 기초하여 계산했다. 출발 물질은 액체 영양 배지, 기타 필수 미네랄 및 아세트산 생성 바이오매스의 축적물을 포함하는 발효 액체를 포함한다.
발효 액체를 3 개의 고세포 밀도 발효 용기로부터 수득하였다. 샘플을 4,000 RPM 에서의 원심분리를 통해 농축하여 4 내지 10 mg/ml 의 세포 밀도를 수득하였다. 세포를 세제-함유 완충액 (나트륨 도데실 설페이트 (SDS), CHAPS, Triton X-100, 또는 Tween 20 을 함유하는 TrisHCl pH 8) 또는 효소-함유 완충액 (리소자임을 함유하는 TrisHCl pH 8) 중에 재현탁시켰다. TrisHCl pH 8 을 대조군 완충액으로 이용했다. 생성된 세포 현탁액을 초음파분쇄했다. 초음파분쇄 공정은 세포를 교반하고 세포막을 부수어 여는 초음파 주파수에서 소리 에너지를 통한 높은 힘으로 세포를 파열시키는 것을 수반한다.
세포를 5 초의 펄스로 초음파분쇄한 후, 중간에 얼음 상에서 휴지시켰다. 사이클을 3 회 반복했다. 초음파분쇄 후, 세포를 20,000 RPM 에서 10 분 동안 스핀 다운하고, 상청액을 제거했다. 가용성 단백질 분획을 로우리-기반 단백질 검정을 이용하여 단백질 함량에 대해서 분석했다. 가용성 단백질 회수 백분율을 초음파분쇄된 세포의 농도에 기초하여 계산했다.
표 9 에 나타낸 결과는 세제 첨가제가 세포가 초음파분쇄되는 경우에 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 구체적으로, SDS 또는 리소자임의 첨가는 막 단백질의 용해도를 크게 향상시킨다.
실시예 12: 하나 이상의 여과형 분별기 장치에 의한, 파열된 박테리아 세포의 균질물의 분획화
실시예 4 의 균질물을 나일론 필터를 통해 여과시킨다. 균질물의 여과는 본래의 미생물 바이오매스의 10.7 % 가 가용성 단백질로서 회수되도록 허용했다.
실시예 13: 하나 이상의 원심분리형 분별기 장치에 의한, 파열된 박테리아 세포의 균질물의 분획화
실시예 4 의 균질물을 2000 rpm 에서의 원심분리하였는데, 이는 3.2 mg 의 단백질이 상청액으로 분획화되도록 하였다. 균질물의 원심분리는, 발효 용기로부터 수집된 초기 미생물 바이오매스의 전체 세포 질량으로부터 분리되어 나온 가용성 단백질의 14.3 % 의 회수를 허용했다.
실시예 14: 하나 이상의 파열 장치를 통해 파열 후 회수된 단백질에 대한 세포-함유 현탁액에서의 pH 효과의 결정
샘플을 고세포 밀도 발효 용기로부터 수집하였다. 수집 시의 세포 농도는 약 22 g/L 였다. 소정 부피의 세포 배양물을 4,000 RPM 에서 10 분 동안 스핀 다운했다. 세포 펠렛을, 원심분리 후 제거했던 배양 배지의 부피와 동일한 부피의 TrisHCl 중에 재-현탁시켰다 (샘플이 농축 또는 희석되지 않도록). 복수의 소정 부피의 세포 배양물을 0.5 M NaOH 의 첨가를 통해 pH 를 변형하여 배양 브로스의 최종 pH 가 3.5 내지 10 이 되도록 했다. 샘플을 1 회 또는 다회 통과시키는 동안 10,000 내지 20,000 psi 로 가공했다. 각 샘플을 13,300 RPM 에서 6 분 동안 스핀 다운했다. 상청액을 수집했고, 로우리-기반 단백질 검정을 이용하여 가용성 분획 중 단백질 농도를 결정했다.
표 10 에 나타낸 데이터는 미세 유동화 전의 세포 균질물의 pH 증가가 단백질 용해도를 향상시킨다는 것을 나타낸다. 구체적으로, pH 가 높은 (7.6 초과) 경우, 가용성 단백질의 회수가 향상된다.
실시예 15. 가용성 단백질 회수에 대한 리소자임의 효과의 결정
샘플을 고세포 밀도 발효 용기로부터 수집하였다. 소정 부피의 세포 배양물을 스핀 다운했고, 이전에 언급한 것과 동일한 방식으로 TrisHCl 완충액 중에 재-현탁시켰다. 0.5 M 나트륨 하이드록사이드를 이용하여 배양물 브로스의 pH 를 pH 8 로 증가시켰다. 효소 전-처리의 효과를 결정하기 위해, 0.5 mg/ml 의 리소자임을 이용했다. 배양물 브로스 샘플의 경우, 리소자임과의 배양을 실온에서 ~30 분 지속했다. TrisHCl 샘플의 경우, 리소자임과의 배양을 실온에서 ~45 분 지속했다 (병목 현상으로서 미세유동화기를 이용한 가공의 지연으로 인한 차이). 샘플을 1 회 또는 다회 통과시키는 동안 10,000 내지 20,000 psi 로 가공했다. 또한, 샘플이 미세유동화기를 통해 가공되지 않은 대조군을 러닝시켰다. 각 샘플을 13,300 RPM 에서 6 분 동안 스핀 다운했다. 상청액을 수집했고, 로우리-기반 및 브래드포드-기반 단백질 검정을 이용하여 가용성 분획 중 단백질 농도를 결정했는데, 결과가 표 11 에 제시된다.
실시예 16. 리소자임 농도 감소 및 배양 시간 연장의 효과의 결정.
샘플을 고세포 밀도 발효 용기로부터 수집했고, 4,000 RPM 에서 10 분 동안의 원심분리를 통해 농축시켰다. 배양 브로스 pH 를 7 - 10 으로 조절했다. 일부 샘플을 37°C 에서 100 ng/ml 의 리소자임과 1 시간 동안 배양시켰다. 리소자임 활성을 모니터링하기 위해 10 분마다 샘플을 채취했다.
30 분 및 1 시간에서 큰 샘플을 취해 10,000 내지 20,000 psi 에서 미세유동화기를 1 회 또는 다회 통과시키는 동안 가공했다. 각 샘플을 13,300 RPM 에서 6 분 동안 스핀 다운했다. 상청액을 수집했고, 로우리-기반 단백질 검정을 이용하여 가용성 분획 중 단백질 농도를 결정했는데, 결과가 표 12 에 제시된다.
실시예 17. 단백질의 추출에 대한 pH 및 세포 농도의 효과.
고세포 밀도 발효 용기로부터의 샘플을 원심분리를 통해 1 내지 10 g/L 의 농도로 희석시켰고 배양 배지 중에 재현탁시켰다. 배양 브로스 pH 를 0.5 M 나트륨 하이드록사이드를 이용하여 6 내지 10 으로 조절했다. 샘플 (발효 pH 에서 변형되지 않은 배양 브로스 포함) 을 10,000 내지 20,000 psi 에서 미세유동화기를 1 회 또는 다회 통과시키는 동안 가공했다. 마찬가지로, 고세포 밀도 발효 용기로부터의 희석되지 않은 배양 퍼지를, 한 산성 pH 및 한 알칼리성 pH 에서 가공했다. 각 샘플을 13,300 RPM 에서 6 분 동안 스핀 다운했다.
상청액을 수집했고, 로우리-기반 단백질 검정을 이용하여 가용성 분획 중 단백질 농도를 결정했다. 표 13 은 미세 유동화 전에 배양 브로스의 pH 가 증가함에 따라, 가용성 분획 중 회수된 단백질의 양이 증가한다는 것을 나타낸다.
도 8A 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 로부터 및 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포의 세포막으로부터 수득된 가용성 단백질의 그래프를 도시한다.
파열 공정을 수행하기 위해 선택된 파열 장치는 미세유동화기 및 기타 시판중인 장치일 수 있다. 도 8A 에서, 파열 공정을 수행하기 위해 선택된 파열 장치는 미세유동화기이다.
파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부의 파열 공정은 통과의 시간 및 압력을 포함한 다양한 변수 하에 수행될 수 있다. 이러한 도 8A 에서, 세포-함유 현탁액에 대해서 파열 공정은 15,000 파운드/제곱 인치 (psi) 의 압력에서 단 1 회의 통과 하에 수행된다.
파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부에서 파열 공정을 거치기 위해 선택된 세포-함유 현탁액은 밀도가 상이할 수 있다. 이러한 도 8A 에서, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부의 이러한 파열 공정을 위해 세포-함유 현탁액의 4 개의 스트림을 선택한다. 세포-함유 현탁액의 각 밀도는 1 g/L, 5 g/L, 10 g/L 및 18.5 g/L 이다.
라인 (802) 의 y 축은 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 밀도가 18.5 g/L 인 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포로부터의 상이한 pH 조건 (X-축) 하에 제조된 파열 장치 (460, 560 또는 660) 로부터 파열 및 수득된 세포 균질물로부터의 단백질의 수율을 나타낸다.
라인 (804) 의 y 축은 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 밀도가 10 g/L 인 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포로부터의 상이한 pH 조건 (X-축) 하에 제조된 파열 장치 (460, 560 또는 660) 로부터 파열 및 수득된 세포 균질물로부터의 단백질의 수율을 나타낸다.
라인 (806) 의 y 축은 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 상이한 pH 조건에 대해서 플로팅된 밀도가 5 g/L 인 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포로부터의 상이한 pH 조건 (X-축) 하에 제조된 파열 장치 (460, 560 또는 660) 로부터 파열 및 수득된 세포 균질물로부터의 단백질의 수율을 나타낸다.
라인 (808) 의 y 축은 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 밀도가 1 g/L 인 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포로부터의 상이한 pH 조건 (X-축) 하에 제조된 파열 장치 (460, 560 또는 660) 로부터 파열 및 수득된 세포 균질물로부터의 단백질의 수율을 나타낸다.
파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부에서 파열 공정을 거치기 위해 선택된 세포-함유 현탁액은 1 내지 14 의 범위 내에서 pH 값이 상이할 수 있다. 세포-함유 현탁액의 pH 값은 산, 염기, 또는 염 첨가 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 방법에 의해 조절될 수 있다. 여기 도 8A 에서, 세포-함유 현탁액의 pH 값은 0.5 M 나트륨 하이드록사이드를 이용하여 약 6 또는 8 로 조절된다. 세포-함유 현탁액의 pH 값은 세포-함유 현탁액이 파열 장치 (460, 560 또는 660) 내부에서 파열되기 전에 조절될 수 있다. 예를 들어, 세포 함유-현탁액의 pH 값은 세포-함유 보유 탱크 (445, 545 또는 645) 내부에서 조절될 수 있다.
실시예 18. 단백질-함유 현탁액에 대한 고농도에 대한 pH 의 효과.
샘플을 고세포 밀도 발효 용기로부터 수집했고, 4,000 RPM 에서 10 분 동안의 원심분리에 의해 세포를 3 배 농축시켰다. 세포 펠렛을 배양 배지 중에 재-현탁시켰다. 배양 배지를 농축된 나트륨 하이드록사이드를 이용하여 pH 5 내지 10 으로 조절했다. 예를 들어, 4,000 RPM 에서 10 분 동안 세포를 원심분리함으로써, 샘플을 45 g/L 로 농축시켰다. 세포 펠렛을 배양 배지 중에 재-현탁시켰다. 생성되는 세포 혼합물 pH 를 0.5 M 나트륨 하이드록사이드를 이용하여 5, 6, 7, 또는 8 로 변형시켰다. 샘플을 15,000 PSI 에서 미세유동화기를 통해 1 회 통과하는 동안 가공했다. 각 샘플을 13,300 RPM 에서 6 분 동안 스핀 다운했다. 상청액을 수집했고, 로우리-기반 단백질 검정을 이용하여 가용성 분획 중 단백질 농도를 결정했다.
도 8B 는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 파열 장치 (460, 560 또는 660) 로부터 및 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포의 세포막으로부터 수득된 가용성 단백질의 수율의 차트를 도시한다.
도 8B 에서, 파열 공정을 수행하기 위해 선택된 파열 장치는 미세유동화기이다. 도 8B 에서, 세포-함유 현탁액에 대해서 파열 공정은 10,000 내지 20,000 psi 의 압력에서 1 회 또는 다회 통과하는 동안 수행된다. 상청액을 13,300 RPM 에서 원심분리를 통해 수집했고, 단백질을 로우리-기반 단백질 검정을 이용하여 분석했다. 표 14 는 배양 브로스 4-5 내지 6-10 의 pH 를 증가시키는 것이 가용성 분획 중 회수된 단백질의 백분율을 현저히 증가시킨다는 것을 나타낸다.
라인 (812) 의 y 축은 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른, 세포-함유 현탁액의 pH 값의 변화로부터 밀도가 45 g/L 인 세포-함유 현탁액 내 혐기성 박테리아 세포로부터의 상이한 pH 조건 (X-축) 하에 제조된 파열 장치 (460, 560 또는 660) 로부터 파열 및 수득된 세포 균질물로부터의 단백질의 수율에 대한 pH 의 효과를 나타낸다.
전술한 것이 본 발명의 구현예에 관한 것이나, 본 발명의 다른 및 추가의 구현예가 이의 기본적인 범위를 벗어나지 않고 고안될 수 있으며, 이의 범위는 하기 청구범위에 의해 결정된다.
Claims (24)
- 하기를 포함하는, 혐기성 박테리아를 사용하는 발효 공정으로부터 단백질 보충제를 생산하기 위한 시스템:
기체상 기질과 배양 배지를 발효 액체 브로스로 발효시키기 위한, 기체상 기질을 발효 용기로 흘려 보내기 위한 기체 유입 라인 및 혐기성 박테리아를 함유하는 발효 용기에 배양 배지를 공급하기 위한 액체 유입 라인에 연결된 발효 용기;
발효 용기로부터 발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 수용하고 발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 제 1 세포-함유 현탁액 및 제 1 무-세포 투과액으로 분리하기 위한 발효 용기의 하나 이상의 제 1 배출 라인에 연결된 제 1 세포 분리기;
제 1 세포 분리기로부터 제 1 무-세포 투과액을 수용하고 제 1 무-세포 투과액을 산소화 탄화수소질 화합물로 가공하기 위한 제 1 세포 분리기의 하나 이상의 제 2 배출 라인에 연결된 프로세싱 챔버;
제 1 세포-함유 현탁액을 수용하고, 제 1 세포-함유 현탁액의 세포막을 파열하여 균질물을 생성하기 위한 제 1 세포 분리기에 연결된 하나 이상의 세포 파열 장치; 및
하나 이상의 세포 파열 장치로부터 균질물을 수용하고 균질물을 제 1 단백질-함유 부분 및 단백질-함유 세포 파편 부분으로 분별하기 위한 하나 이상의 세포 파열 장치의 하나 이상의 제 3 배출 라인에 연결된 하나 이상의 분별기. - 제 1 항에 있어서, 기체상 기질이 일산화탄소 (CO), 이산화탄소 (CO2), 수소 가스 (H2), 일산화탄소와 수소를 포함하는 합성가스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시스템.
- 제 1 항에 있어서, 발효 용기가 연속 교반 탱크 반응기 (CSTR), 고정 세포 반응기 (ICR), 세류층 반응기 (TBR), 버블 컬럼, 가스 부양 발효기, 정적 혼합기, 루프 반응기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시스템.
- 제 1 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 시스템:
일정량의 제 1 세포-함유 현탁액을 수용하기 위한 제 1 세포 분리기에 연결된 세포-함유 보유 탱크. - 제 1 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 시스템:
발효 용기로부터 발효 액체 브로스의 제 2 흐름을 수용하고 발효 액체 브로스의 제 2 흐름을 제 2 세포-함유 현탁액 및 제 2 무-세포 투과액으로 분리하기 위한 발효 용기의 하나 이상의 제 4 배출 라인에 연결된 제 2 세포 분리기. - 제 5 항에 있어서, 제 2 무-세포 투과액의 제 1 양이 프로세싱 챔버로 전달되는 시스템.
- 제 5 항에 있어서, 제 2 무-세포 투과액의 제 2 양이 무-세포 보유 탱크로 전달되고, 이것이 프로세싱 챔버에 연결되는 시스템.
- 제 5 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 시스템:
제 2 세포-함유 현탁액을 수용하기 위한 제 2 세포 분리기에 연결된 세포-함유 보유 탱크, 여기서 제 2 세포 분리기는 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 한외여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 컬럼 여과 장치, 교차 흐름 필터가 있는 여과 장치, 원심분리 장치, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨. - 제 1 항에 있어서, 제 1 세포 분리기가 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 한외여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 컬럼 여과 장치, 교차 흐름 필터가 있는 여과 장치, 원심분리 장치, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시스템.
- 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 파열 장치가 미세유체 장치, 초음파분쇄 장치, 초음파 장치, 기계적 파괴 장치, 프렌치 프레스, 냉동고, 히터, 열 교환기, 증류 컬럼, 저온살균 장치, UV 살균 장치, 감마선 살균 장치, 반응기, 균질화기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시스템.
- 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 분별기가 고체-액체 분별기, 원심분리 장치, 연속 원심분리기, 경사분리 원심분리기, 디스크-스택 원심분리기, 여과 장치, 중공 섬유 여과 장치, 나권형 여과 장치, 세라믹 필터 장치, 교차-흐름 여과 장치, 크기 배제 장치, 하나 또는 일련의 크기 배제 컬럼, 하나 또는 일련의 이온 교환 컬럼, 하나 또는 일련의 탄소 폴리머 컬럼, 유동식 자기 분별기, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시스템.
- 제 1 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 시스템:
하나 이상의 분별기로부터 수득된 하나 이상의 부분을 수용하고 하나 이상의 부분을 탈수하여 단백질 보충제를 생산하는 하나 이상의 탈수 챔버, 여기서 하나 이상의 부분은 제 1 단백질-함유 부분, 단백질-함유 세포 파편 부분 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기서 하나 이상의 탈수 챔버는 분무 건조 장치, 드럼 건조기 및 냉동 건조기, 동결건조 장치 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨. - 하기를 포함하는, 혐기성 박테리아를 사용하는 발효 공정으로부터 단백질 보충제를 생산하기 위한 시스템:
기체상 기질과 배양 배지를 발효 액체 브로스로 발효시키기 위한, 기체상 기질을 발효 용기로 흘려 보내기 위한 기체 라인 및 혐기성 박테리아를 함유하는 발효 용기에 배양 배지를 공급하기 위한 액체 유입 라인에 연결된 발효 용기;
발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 수용하고 발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 제 1 세포-함유 현탁액 및 제 1 무-세포 투과액으로 분리하기 위한 발효 용기의 하나 이상의 제 1 배출 라인에 연결된 제 1 세포 분리기;
제 1 무-세포 투과액을 수용하기 위한 제 1 세포 분리기의 하나 이상의 제 2 배출 라인에 연결된 무-세포 보유 탱크;
무-세포 보유 탱크로부터 제 1 무-세포 투과액을 수용하고 제 1 무-세포 투과액을 산소화 탄화수소질 화합물로 가공하기 위한 무-세포 보유 탱크의 하나 이상의 제 3 배출 라인에 연결된 프로세싱 챔버;
제 1 세포-함유 현탁액을 수용하고, 제 1 세포-함유 현탁액 내에 함유된 세포의 세포막을 파열하여, 균질물을 생성하기 위한 하나 이상의 세포 파열 장치; 및
하나 이상의 세포 파열 장치로부터 균질물을 수용하고 균질물을 제 1 단백질-함유 부분 및 단백질-함유 세포 파편 부분으로 분별하기 위한 하나 이상의 세포 파열 장치의 하나 이상의 제 4 배출 라인에 연결된 하나 이상의 분별기. - 제 13 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 시스템:
발효 용기로부터 발효 액체 브로스의 제 2 흐름을 수용하고 발효 액체 브로스의 제 2 흐름을 제 2 세포-함유 현탁액 및 제 2 무-세포 투과액으로 분리하기 위한 발효 용기의 하나 이상의 제 5 배출 라인에 연결된 제 2 세포 분리기. - 제 14 항에 있어서, 제 2 무-세포 투과액의 제 1 양이 발효 용기로 전달되는 시스템.
- 제 14 항에 있어서, 제 2 무-세포 투과액의 제 2 양이 무-세포 보유 탱크로 전달되는 시스템.
- 제 14 항에 있어서, 제 2 무-세포 투과액의 제 3 양이 프로세싱 챔버로 전달되는 시스템.
- 제 14 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 시스템:
제 2 세포-함유 현탁액을 수용하기 위한 제 2 세포 분리기에 연결된 세포-함유 보유 탱크. - 하기를 포함하는, 혐기성 박테리아를 사용하는 발효 공정으로부터 단백질 보충제를 생산하기 위한 시스템:
기체상 기질과 배양 배지를 발효 액체 브로스로 발효시키기 위한, 기체상 기질을 발효 용기로 흘려 보내기 위한 기체 유입 라인 및 발효 용기에 배양 배지를 공급하기 위한 액체 유입 라인에 연결된 발효 용기;
발효 용기로부터 발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 수용하고 발효 액체 브로스의 제 1 흐름을 제 1 세포-함유 현탁액 및 제 1 무-세포 투과액으로 분리하기 위한 발효 용기의 하나 이상의 제 1 배출 라인에 연결된 제 1 세포 분리기;
제 1 세포 분리기로부터 제 1 무-세포 투과액을 수용하고 제 1 무-세포 투과액을 산소화 탄화수소질 화합물로 가공하기 위한 제 1 세포 분리기의 하나 이상의 제 2 배출 라인에 연결된 프로세싱 챔버;
발효 용기로부터 제 2 발효 액체의 제 2 흐름을 수용하고 제 2 발효 액체의 제 2 흐름을 제 2 세포-함유 현탁액 및 제 2 무-세포 투과액으로 분리하기 위한 발효 용기에 연결된 제 2 세포 분리기;
제 2 세포-함유 현탁액을 수용하고 제 2 세포-함유 현탁액의 균질물을 생성하기 위한 하나 이상의 세포 파열 장치; 및
균질물을 수용하고 균질물을 제 1 단백질-함유 부분 및 단백질-함유 세포 파편으로 분별하기 위한 하나 이상의 세포 파열 장치에 연결된 하나 이상의 분별기. - 제 19 항에 있어서, 세포-함유 보유 탱크가 제 2 세포-함유 현탁액을 수용하기 위한 제 2 세포 분리기에 연결된 시스템.
- 제 20 항에 있어서, 세포-함유 보유 탱크가 제 2 세포-함유 현탁액을 수용하고 제 2 세포-함유 현탁액을 하나 이상의 첨가제로 처리하여 전처리된 세포 현탁액을 생성하는 전처리 챔버로서 역할을 하는 시스템.
- 제 21 항에 있어서, 하나 이상의 첨가제가 계면활성제, 세제, EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), Tween-20, Triton X-100, 나트륨 도데실 설페이트, CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), 프로테아제, 리소자임, 벤조나아제, 뉴클레아제, pH 조절제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시스템.
- 제 21 항에 있어서, 하나 이상의 파열 장치가 세포-함유 보유 탱크에 연결되고 보유 탱크로부터 전처리된 세포 현탁액을 수용하는 시스템.
- 제 19 항에 있어서, 제 1 세포 분리기의 하나 이상의 제 3 배출구가 제 1 세포 분리기로부터 발효 용기로 제 1 세포-함유 현탁액을 전달하기 위해 발효 용기에 연결되는 시스템.
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