JP2021527444A - 細菌発酵プロセスからタンパク質富化栄養素サプリメントを得るためのプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年5月21日に出願された米国特許仮出願第62/674,604号および2019年5月17日に出願された米国特許出願第16/416,140号の利益を主張するものであり、上記の出願はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
例として、嫌気性微生物(酢酸生成微生物など)による細菌発酵は、一酸化炭素(CO)、水素ガス(H2)、および/または二酸化炭素(CO2)などのガス状基質の発酵を通して、発酵産物(例えば、エタノール、ブタノール、アセテート、ブチレート、酪酸、2,3−ブタンジオール、および他の関連産物)を生成することができる。エタノールおよびブタノールは、多くの場合、輸送に関連する液体燃料として使用され、一方、アセテートおよび2,3−ブタンジオールは、化学産業において使用される。微生物発酵に使用されるバイオエタノール生産アセトゲンの例としては、クロストリジウム属およびアセトバクテリウム属に由来するものが挙げられる。例えば、米国特許第5,173,429号は、合成ガスからエタノールおよびアセテートを生成するClostridium Ijungdahlii ATCC番号49587の嫌気性微生物を記載する。米国特許第5,807,722号は、Clostridium Ijungdahlii ATCC番号55380を使用して、廃ガスを有機酸およびアルコールに変換するための方法および装置を記載する。米国特許第6,136,577号は、Clostridium Ijungdahlii ATCC番号55988および55989を使用して、廃ガスをエタノールに変換するための方法および装置を記載する。
しかしながら、単細胞タンパク質を標的とする本方法は、動物用飼料または水産養殖に使用するための全細胞バイオマスとして微生物細胞を直接取り入れることが多い。微生物発酵プロセスにおいて、発酵ブロスは、細菌細胞および細胞残屑を含む。これらの方法は、2つを区別せず、動物または水産養殖生物(例えば、魚またはエビなど)に有害であり得るバイオマス内容物を含有することが多い。例えば、微生物全細胞バイオマスは、消化に適さない高含有量の核酸または適切に消化することができない他の内容物を含有し得る。これらの従来の方法のほとんどは、動物用飼料に全細胞バイオマスを取り入れる前に、追加の細胞破壊または細胞分裂技法による全細胞バイオマスの加工を行わない。加えて、細菌発酵から細菌タンパク質を回収する本方法は、栄養に関連した目的に適した十分に高いタンパク質含有量を達成しない。細菌発酵プロセスからタンパク質富化サプリメントを得るための方法およびシステム、ならびにそのような任意の栄養素サプリメントおよび動物用飼料の組成物が必要とされている。
一実施形態において、発酵プロセスからタンパク質含有部分を製造する細菌発酵システムが提供され、これは、1つまたは複数の発酵容器、1つまたは複数の細胞セパレータ、1つまたは複数の加工チャンバー、1つまたは複数の細胞破壊装置、および1つまたは複数の分画装置を含む。別の実施形態では、本発明は、様々な動物およびヒトが摂取するために有用な用途を有する嫌気性細菌を使用した発酵プロセスから生成されるタンパク質富化栄養素サプリメントの組成物をさらに提供する。
一態様において、第1のタンパク質含有画分および/またはタンパク質含有細胞残屑画分を加工して、タンパク質富化栄養素サプリメントとして製造することができる。別の態様において、第1のタンパク質含有画分を、タンパク質含有量が約10%以上、例えば40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、または80%以上、90%以上、例えば約10%〜約80%、または約10%〜約95%、例えば約10%〜約98%のタンパク質富化栄養素サプリメントとして製造する。
さらに別の態様において、本発明の方法は、嫌気性細菌の細胞を含有する細胞含有懸濁液を濃縮して、第2の細胞含有懸濁液にすることをさらに含んでもよい。一例では、第2の細胞含有懸濁液を細胞含有保持タンクへ送達し、その中で濃縮および/または貯蔵される。別の例では、保持タンク中の第2の細胞含有懸濁液は、嫌気性細菌細胞を含有する第2の細胞含有懸濁液を、細胞含有保持タンクに接続された入口を通して供給される1種または複数の添加剤で処理する前処理工程を経る。次いで、第2の細胞含有懸濁液を保持タンクから破壊装置へ送達する。破壊装置は、第2の細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞の細胞膜を破壊し、ホモジネートを生成する。次いで追加のタンパク質含有画分を、ホモジネート中の細胞含有細胞残屑画分から分離する。
一実施形態において、第1のタンパク質含有画分を濾過装置へ送達して、濾過装置を通して濾過し、保持液画分と濾過液画分とに分画することによって濾過液画分をタンパク質富化栄養素サプリメントとして製造することができる。別の実施形態では、保持液画分をタンパク質富化栄養素サプリメントとして製造する。さらに別の実施形態において、第1のタンパク質含有画分を遠心分離機へ送達し、遠心分離によって上清タンパク質含有画分とペレットタンパク質含有画分とに分画することで、上清タンパク質含有画分および/またはペレットタンパク質含有画分をタンパク質富化栄養素サプリメントとして製造することができる。
細菌発酵システムは、第1の細胞含有懸濁液を受け取り、第1の細胞含有懸濁液中に含まれる細胞の細胞膜を破壊し、ホモジネートを生成するための、1つまたは複数の細胞破壊装置と、1つまたは複数の細胞破壊装置からホモジネートを受け取り、ホモジネートを第1のタンパク質含有画分とタンパク質含有細胞残屑画分とに分画するための、1つまたは複数の細胞破壊装置の出口ラインに接続された1つまたは複数の分画装置と、をさらに含む。
一態様において、細菌発酵システムは、発酵容器および破壊装置に接続された第1の細胞セパレータを含む。第1の細胞セパレータは、第1の細胞濃度の発酵液を発酵容器から受け取り、発酵液を細胞非含有浸透液と第2の細胞濃度の細胞含有懸濁液とに分離する。別の態様において、細菌発酵システムは、ある量の第1の細胞含有懸濁液を受け取るために第1の細胞セパレータに接続された細胞含有保持タンクをさらに含む。さらに別の態様において、細菌発酵システムは、第2の発酵液体ブロス流を発酵容器から受け取り、第2の発酵液体ブロス流を第2の細胞含有懸濁液と第2の細胞非含有浸透液とに分離するための、発酵容器の第4の出口ラインに接続された第2の細胞セパレータをさらに含む。
別の態様において、嫌気性細菌によるガス状基質の発酵の後、第1の細胞セパレータは、細菌細胞を含有する第1の発酵液体ブロスの第1の流れを受け取る。発酵容器に接続された第2の細胞セパレータは、細菌細胞を含有する第2の発酵液体ブロスの第2の流れを受け取る。第2の細胞セパレータは、第2の発酵液体ブロスを、第2の細胞非含有浸透液と、嫌気性細菌細胞を含有する第2の細胞含有懸濁液とに分離する。この態様において、破壊装置を使用して、第2の細胞含有懸濁液を第2の細胞セパレータから受け取り、第2の細胞含有懸濁液の細胞膜を破壊し、ホモジネートを生成する。別の態様において、保持タンクは、第2の細胞含有懸濁液を第2の細胞セパレータから受け取り、第2の細胞含有懸濁液を破壊装置へ送達する。
別の実施形態において、本発明は、酢酸生成菌培養物を使用する発酵プロセスから生成されるタンパク質富化栄養素サプリメントの組成物である。一態様において、組成物は、ホモジネートから分画されるタンパク質含有画分を含み、該ホモジネートは、嫌気性細菌の細胞を含有する細胞含有懸濁液を破壊して得られ、該細胞含有懸濁液は、嫌気性細菌によるガス状基質の発酵中に発酵容器から送り出された発酵液体ブロスから得られ、発酵液体ブロスから得られた嫌気性細菌の細胞は、細胞含有懸濁液と細胞非含有浸透液とに分離される。別の態様において、本発明の組成物は、ホモジネートから分画されたタンパク質含有細胞残屑画分を含む。
したがって、上述の本発明の特徴、より具体的には上記で簡潔にまとめた本発明の説明を詳細に理解することができるように、実施形態を参照してよく、そのいくつかは、添付の図面に例示されている。しかしながら、添付の図面は、本発明の典型的な実施形態のみを例示するものであり、したがって、その範囲を限定するものとはみなさず、他の同等に有効な実施形態が認められ得ることに留意されたい。
細菌発酵プロセスは、一般的に、合成ガスまたは一酸化炭素(CO)含有ガス状基質などのガス状基質を、特に嫌気性細菌または酢酸生成細菌などの細菌によって発酵することと、二酸化炭素(CO2)、エタノール、ブタノール、酪酸、酢酸などを含む発酵製品を生成することと、を含む。さらに重要なことには、嫌気性細菌発酵プロセス後、大量の微生物バイオマスが得られる。大量の微生物バイオマスは、細菌発酵プロセスの間またはその後に除去することができる。細胞除去が完了した際、または細菌発酵プロセスの間、このような大量の微生物バイオマスは、他の用途に有用であり得る。しかしながら、例えば栄養素サプリメントまたは動物用供給原料として有用になるような高品質(すなわち、有害物質または汚染物質がない状態)になるまで発酵由来タンパク質を大量に抽出するには、さらに複雑な加工が必要となる。具体的には、本発明は、このような発酵由来タンパク質を細菌発酵プロセス由来の細胞バイオマスから抽出するプロセスを含む。より具体的には、本発明は、栄養素サプリメントまたは動物用飼料に加工するための、1つまたは複数の発酵由来タンパク質含有画分を細胞集団または微生物バイオマスから抽出する細菌発酵プロセスのためのシステムを含む。
工程110で、発酵培地を発酵容器に加えて細菌発酵プロセスを実施する。加えて、1種または複数のガス状基質を発酵容器に送達し、細菌培養物(嫌気性細菌を含有する培養物など)によって発酵する。最初に、発酵容器に含まれる液体発酵培地は、様々なタイプの好適な細菌培地、発酵培地または液体栄養培地を含んでもよい。栄養培地は、使用する微生物の増殖を可能にする、かつ/または特定の生成物の生成に有利な有効量の1種または複数のビタミンおよびいくつかのミネラルを含む。
加えて、方法100の細菌発酵プロセスで使用する1種または複数のガス状基質としては、様々な合成用ガス(synthesis gas)(すなわち、合成ガス(syngas))、鋼生産プロセス由来の排ガス、鉄生産プロセス由来の排ガス、石炭生産プロセス由来の排ガス、または任意の他の好適な工業生産プラント由来のガス源を挙げることができる。一実施形態において、細菌発酵プロセスで使用されるガス状基質としては、一酸化炭素(CO)含有ガス状基質および/または追加のガス、例えば水素ガス、二酸化炭素(CO2)、窒素ガス(N2)、およびこれらの組合せが挙げられる。
一例において、一酸化炭素含有合成ガスを、使用する発酵容器のサイズおよびタイプに応じて様々な速度で、発酵容器中に導入する。一態様において、合成ガスを、約10〜約50フィート3/秒の速度でガス入口に導入する。別の態様において、合成ガスを、約25〜約35フィート3/秒の速度で導入する。用語「合成ガス(syngas)」または「合成用ガス(synthesis gas)」は、これらに限定されないが、一酸化炭素(CO)および水素(H2)を多く含むガス混合物、例えば水素を生成する天然ガスまたは炭化水素の蒸気改質から生成されるガス混合物、石炭のガス化、またはいくつかのタイプの廃棄物熱源転換ガス化設備で生成される他のガスにおける合成ガスが挙げられる。合成ガスは、可燃性であり、燃料源としてまたは他の化学物質の生成のための中間体として使用されることが多い。合成ガスは、任意の既知の源から得ることができる。
一態様において、エタノールと酢酸との混合物を生成することができる。別の態様では、エタノールとブタノールとの混合物が生成される。一例において、発酵容器中にて、1日当たり10g/L超の比産出力でエタノールを生成し、一方、5g/L未満の遊離酢酸で遊離酢酸濃縮液が維持される。発酵液体ブロス中に存在するエタノールおよびアセテートのエタノール:アセテート比は、1:1〜20:1の範囲であってもよい。
発酵容器内に含まれる発酵液体ブロスは、希釈濃度のエタノールを含有してよく、品質および/または濃度の面でさらに加工する必要があり得る。例えば、発酵液体ブロス中に含まれる発酵生成物を発酵容器から蒸留室または他のタイプの反応器へ送達して、高濃度の最終蒸留生成物を得、それをさらに加工し、回収することができる。
図1Aに示すように、方法100の工程120で、ある程度の量の第1の濃度の嫌気性細菌の細胞を含有する発酵液体ブロスおよび発酵生成物が、細菌発酵容器から送達される。一般に、細胞が発酵容器内で恒常的増殖に達したとき、細菌細胞を含有する発酵液体ブロスは、発酵容器から送達され得る。恒常的増殖段階の後の発酵プロセスでは、発酵液体ブロス中に含まれる細菌細胞の第1のバッチの第1の濃度は、0.5g/L(乾燥細胞集団)、例えば1.0g/L以上、または2.0g/L以上、または5.0g/L以上、または15.0g/L以上、または30.0g/L以上であってもよい。
発酵容器中の微生物培養物の所望の細胞濃度を維持するために、細菌発酵プロセスは、一部の発酵液体ブロスを除去することを含む。細胞濃度の増加に伴い、発酵中の操作に関連する問題、例えば不要な遊離酢酸の濃度の増加が多くなり、アセテート製造がエタノール製造より優先されるようになる。したがって、細胞密度を監視し、発酵液体ブロスの定期的または連続的な細胞除去を行うことが重要となる。用語「細胞密度」は、発酵培地の単位体積当たりの微生物の質量、例えばグラム/リットルを意味する。
発酵液体ブロス中の細胞含有懸濁液から細胞非含有浸透液を分離するために使用することができる好適な細胞セパレータとしては、これらに限定されないが、任意の濾過装置、中空糸濾過装置、螺旋巻き濾過装置、限外濾過装置、セラミックフィルター装置、クロスフロー濾過装置、サイズ排除カラム濾過装置、またはこれらの組合せが挙げられる。本発明の濾過式細胞セパレータで使用することができる好適なフィルターとしては、これらに限定されないが、螺旋巻き膜/フィルター、クロスフローフィルターが挙げられる。加えて、細胞非含有浸透液からの細胞分離の別の好適な手段は、1つまたは複数の遠心分離装置の使用によるものである。
好ましい実施形態において、細胞分離の後、細胞含有懸濁液中の細胞濃度(または細胞密度)は、発酵液体ブロスの細胞濃度より高い。本発明の一態様において、螺旋巻きフィルターを有する1つまたは複数の濾過装置を使用して、発酵液体ブロスを螺旋巻きフィルターに数回通過させて細胞を濃縮する。
別の態様において、細胞のリサイクルを実施し、これは一般に、細胞非含有浸透液から細菌細胞含有懸濁液を分離して、この分離した細菌細胞の全部または一部を発酵容器に戻すことを指す。一実施形態において、濾過装置などの細胞セパレータによる限外濾過を用いて、細胞の分離および/または細胞のリサイクルを達成する。
一態様において、細胞除去は、連続細菌発酵中に行われる。別の態様において、細胞除去は、細菌発酵の後に行われ、ここで、細菌発酵プロセスを中断または停止して、発酵容器からの微生物バイオマスの除去を可能にする。
図1Aに示すように、細胞含有懸濁液中の細菌細胞が壊れて開いた、および/または破壊した後、得られる破壊細胞混合物、例えばホモジネートを、工程150で、微生物バイオマスのホモジネート中の細胞残屑画分からタンパク質含有画分を分離して取り出し、追加のタンパク質含有画分をさらに精製および抽出してタンパク質富化栄養素サプリメントを製造することによってさらに加工することができる。このような分離は、1つまたは複数の分画装置を使用して実施されることが企図される。一態様において、1つまたは複数のタンパク質含有画分が得られ、1つまたは複数のタンパク質は、遊離アミノ酸、全アミノ酸、およびペプチドも含み得る。
一実施形態において、工程150で、1つまたは複数の破壊装置によって細菌細胞を破壊した後に得られるホモジネートを第1の分画装置に送達し、第1のタンパク質含有画分と第1のタンパク質含有細胞残屑画分とが得られる。一態様において、第1のタンパク質含有画分は、少なくとも1%以上、3%以上、5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、または95%以上のタンパク質含有量を有する。
方法100の工程130は、発酵液由来の嫌気性細菌の細胞を、細胞非含有浸透液と、第2の細胞濃度の嫌気性細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液とに分離することを含む。方法100の工程135は、第1の保持タンク中に細胞含有懸濁液を保持することを含んでもよい。一態様において、高いタンパク質含有量および適切な摂取のタンパク質富化サプリメントの生成に備えて、細菌細胞に前処理を施してもよい。さらに別の態様において、工程130の前処理プロセスで添加される1種または複数の添加剤は、細菌細胞を破壊するための条件を最適化し、高品質のホモジネートを生成するのを助けることもできる。
工程130で使用される好適な添加剤としては、これらに限定されないが、洗剤、pH調整剤、酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、加水分解酵素、アルカリ性緩衝液、産生緩衝液、またはこれらの組合せが挙げられる。一実施形態において、方法100の工程130は、発酵由来細菌細胞の細胞含有懸濁液の核酸含有量を減少させることを含む。このような前処理プロセスは、細菌細胞をヌクレアーゼで処理することによって達成される。使用するヌクレアーゼの例としては、これらに限定されないが、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ベンゾナーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる。細胞含有懸濁液のヌクレアーゼ処理は、アルカリ加水分解および化学的抽出、例えば硫安沈殿法、エタノール沈殿法、ポリエチレンイミン沈殿法などによってさらに助長され得る。
工程145で使用される好適な添加剤としては、これらに限定されないが、洗剤、pH調整剤、酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、加水分解酵素、アルカリ性緩衝液、酸性緩衝液、またはこれらの組合せが挙げられる。一実施形態において、方法100の工程145は、発酵由来細菌細胞のホモジネートの核酸含有量を減少させることを含む。このような前処理プロセスは、細菌細胞をヌクレアーゼで処理することによって達成される。使用するヌクレアーゼの例としては、これらに限定されないが、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ベンゾナーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる。細胞含有懸濁液のヌクレアーゼ処理は、アルカリ加水分解および化学的抽出、例えば硫安沈殿法、エタノール沈殿法、ポリエチレンイミン沈殿法などによってさらに助長され得る。
図2Aは、発酵プロセス由来の嫌気性細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液(例えば、方法100の工程130由来の第2の濃度の細胞含有懸濁液)を加工して、タンパク質富化栄養素サプリメントとして第2のタンパク質含有画分を得る方法200Aの一例である。この方法には、細胞含有懸濁液中の好気性細胞の細胞膜を破壊する前に、工程202で、細胞含有懸濁液を1種または複数の添加剤で処理し、ホモジネートを生成する任意の加工工程がある。
工程202で使用する好適な添加剤としては、これらに限定されないが、洗剤、pH調整剤、酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、加水分解酵素、アルカリ性緩衝液、酸性緩衝液、またはこれらの組合せが挙げられる。一実施形態において、方法200Aの工程202は、発酵由来細菌細胞の細胞含有懸濁液の核酸含有量を減少させることを含む。このような前処理プロセスは、細菌細胞をヌクレアーゼで処理することによって達成される。使用するヌクレアーゼの例としては、これらに限定されないが、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ベンゾナーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる。細胞含有懸濁液のヌクレアーゼ処理は、アルカリ加水分解および化学的抽出、例えば硫安沈殿法、エタノール沈殿法、ポリエチレンイミン沈殿法によってさらに助長させることができる。一態様において、細胞含有懸濁液の核酸含有量を、約1.5%〜5%、または約2%〜18%に減少させる。
あるいは、工程204で、濃縮細菌細胞の細胞含有懸濁液は、破壊装置に直接移行してもよく、次いで工程202に関して記述したように前処理プロセスを経て、工程206においてホモジネートを分離および分画する条件の最適化を助ける。別の態様において、方法200Aから回収されたタンパク質は、さらなる下流加工を経て、次いで第1のタンパク質含有画分と合わせ、タンパク質富化栄養素サプリメントとして製造することができる。
工程212で、得られた第2のタンパク質含有画分を、タンパク質富化栄養素サプリメント、医薬組成物、細胞増殖培地/組成物、および/または動物用飼料(例えば、魚飼料、エビ飼料、鶏用飼料など)に製剤化することができる。このような混入には、第2のタンパク質含有画分を乾燥して低水分(例えば、ペーストまたは粉末形態)にし、第2のタンパク質含有画分を他の成分(例えば、追加の動物用飼料栄養素、医薬用充填剤、混合剤、可塑剤など)と直接ブレンドして1つまたは複数のタイプの栄養素サプリメントを作製することを要し得る。
別の例として、工程204で得たホモジネートを遠心分離にかけてもよく、その後、上清タンパク質含有画分を収集する。上清タンパク質含有画分は分画装置に入り、第2の濾過液のタンパク質含有画分が収集される。さらに別の例として、第1のタンパク質含有画分のみが濾過装置に入り、その後、濾過液のタンパク質含有画分が収集され、タンパク質富化サプリメントとして使用される。さらに別の例として、第1のタンパク質含有画分のみを遠心分離にかけ、その後、分画されたタンパク質または上清タンパク質含有画分を収集する。1つまたは複数のタンパク質含有画分と細胞残屑タンパク質の分離は、1つまたは複数の分画装置によって達成される。
一態様において、2つの分画装置を有する発酵システムが使用される。別の実施形態において、3つの分画装置を有する発酵システムが使用される。図2Bは、3つの分画装置を使用して、本発明の1つまたは複数の実施形態によるタンパク質富化栄養素サプリメントとして第3のタンパク質含有画分を得る発酵プロセスの細胞含有懸濁液を加工する方法200Bの一例である。
例として、工程210から第2のタンパク質含有画分を送達して第3の分画装置(例えば、濾過装置)に入れ、濾過液として収集されたタンパク質含有画分を得、タンパク質富化サプリメントとして使用することができる。別の例としては、第2のタンパク質含有画分を遠心分離にかけ、その後、上清タンパク質含有画分およびペレット状細胞残屑画分を収集する。濾過液のタンパク質含有画分を濾過装置から収集し、タンパク質含有量が約1%〜3%、3%〜7%、7%〜10%、約10%〜14%、約11%〜20%、約21%〜35%、および約35%以上のタンパク質富化栄養素サプリメントとして製造する。
一実施形態において、本発明は、嫌気性細菌を使用する発酵プロセスからタンパク質富化栄養素サプリメントを製造する方法である。方法は、発酵容器中で嫌気性細菌によってガス状基質を発酵させることと、発酵容器から、第1の濃度の嫌気性細菌の細胞を含有する発酵液のある程度の量を得、発酵液からの嫌気性細菌の細胞を、細胞非含有浸透液と第2の濃度の嫌気性細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液とに分離することと、細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞の細胞膜を破壊してホモジネートを得ることと、ホモジネート中の細胞残屑画分から第1のタンパク質含有画分を分離することと、を含む。
方法は、発酵容器から、第1の細胞濃度の嫌気性細菌の細胞を含有する発酵液のある程度の量を得ることをさらに含む。発酵液の集合体を、細菌発酵システム中の1つまたは複数の装置へ送達することができる。一態様において、後続して操作された量の発酵液は、第2、第3、および第4の細胞濃度である。大部分の態様において、第2の細胞濃度の操作発酵液は、第1の細胞濃度の第1の発酵液より高濃度である。
別の態様において、エタノール製造のためのさらなる加工のために、第1の発酵液の第1の流れを第1の細胞セパレータへ送達する。タンパク質富化栄養素サプリメントとして使用可能なタンパク質含有生成物を製造するためのさらなる加工のために、第2の発酵液の第2の流れを第2の細胞セパレータへ送達する。
収集したら、集合体をさらに加工して、発酵液の嫌気性細菌の細胞を、細胞非含有浸透液と、第2の濃度の嫌気性細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液とに分離することができる。第2の濃度の細胞含有懸濁液は、第1の濃度の嫌気性細菌細胞を含有する発酵液より高濃度である。細胞非含有浸透液を加工チャンバーへ送り戻し、そこでエタノール製造のためにエタノールを蒸留する。これは、依然として有用なエタノール含有の細胞非含有浸透液を廃棄しない効率的なシステムを提供する。
第1のタンパク質含有画分を得るために、方法は、ホモジネート中の細胞残屑画分から第1のタンパク質含有画分を分離することをさらに含む。一態様において、ホモジネートを遠心分離し、次いで濾過して、第1のタンパク質含有画分を得る。第1のタンパク質含有画分を第1の分画装置へ送達し、第1のタンパク質含有画分から第2のタンパク質含有画分を分離し、第2のタンパク質含有画分を第1の分画装置から収集させる。
一態様において、方法は、ホモジネートの細胞残屑画分から分離した第1のタンパク質含有画分を脱水することを含む。この態様において、システムは、第1の分画装置に接続された脱水チャンバーを有する。第1の分画装置は、第1のタンパク質含有画分を脱水チャンバーへ送達し、脱水チャンバーが、タンパク質富化栄養素サプリメントとして製造される乾燥タンパク質含有画分を生成する。
細菌発酵システムは、これらに限定されないが、細菌発酵容器、1つまたは複数の破壊装置、1つまたは複数の細胞セパレータ、および1つまたは複数の分画装置を含む。加えて、得られたタンパク質含有画分のタンパク質濃度を増加し、その水分を減少させるために、1つまたは複数の脱水チャンバーが1つまたは複数の破壊装置および/または1つまたは複数の分画装置に接続されている。細菌発酵システムは、細菌細胞または細胞含有懸濁液を保持するための1つまたは複数の保持タンク、貯蔵室、および/または前処理チャンバーをさらに含んでもよい。
図3A〜3B、4A〜4H、5A〜5E、および6は、嫌気性細菌の培養物を使用した発酵プロセスから細胞含有懸濁液および1種または複数の含酸素炭化水素質化合物を製造するための例示的な細菌発酵システムを示している。図3Aは、2つの細胞セパレータおよび1つの脱水チャンバーを使用した、細胞含有懸濁液および1種または複数の含酸素炭化水素質化合物を製造するための細菌発酵システム300Aの概略図である。
図3A中、細菌発酵システム300Aは、発酵容器310、細胞セパレータ320、細胞セパレータ330、加工チャンバー350、および任意の脱水チャンバー375を含む。一実施形態において、細菌発酵システム300Aは、連続細菌発酵システムであってもよい。あるいは、細菌発酵システム300Aは、回分細菌発酵システムであってもよい。
タンパク質富化サプリメントを得るための細胞含有懸濁液の加工の一例としては、高温加工チャンバー内、例えば噴霧乾燥脱水チャンバー内で摂氏約100℃以上(例えば、摂氏250℃以上)の高温に細胞懸濁液をさらし、細胞を破壊して、細胞含有懸濁液の水分を減少させてペーストまたは粉末の形態にするものがある。細胞含有懸濁液の加工の別の例としては、低温加工チャンバー内で摂氏約0℃以下の温度に細胞懸濁液をさらすものがある。
図3Bは、2つの細胞セパレータ、1つの保持タンクおよび1つの脱水チャンバーを使用した、細胞含有懸濁液および1種または複数の含酸素炭化水素質化合物を製造するための細菌発酵システム300Bの概略図である。図3B中、上で考察されるように、細菌発酵システム300Bは、入口ライン302に接続された発酵容器310、入口ライン304およびいくつかの出口ライン、出口ライン312、出口ライン322、および出口ライン324に接続された細胞セパレータ320、出口ライン316および出口ライン336に接続された細胞セパレータ330、ならびに出口ライン336および出口ライン376に接続された脱水チャンバー375を含む。
細菌発酵システム400Aは、一実施形態において、連続細菌発酵システムであってもよい。まず、発酵培地の流れを、入口ライン402によって細菌発酵システム400Aに供給する。次に、ガス状基質の流れを、入口ライン404によって細菌発酵システム400Aに供給する。次いでガス状基質および発酵培地の流れが、嫌気性細菌を培養する発酵容器410に入る。発酵容器410は、嫌気性細菌によってガス状基質を発酵させる環境を提供する。ガス状基質および発酵培地の変換は、発酵容器410内で生じる。発酵容器410内で、ガス状基質および発酵培地の発酵が、発酵容器中に含まれる嫌気性細菌によって促進されて、第1の濃度の嫌気性細菌の細胞を含有する発酵液体ブロスが生成される。次いで未反応の反応性ガスが放出され、細菌容器410から出口ライン414によって排出される。
加工チャンバー450内で、細胞非含有浸透液を加工して含酸素炭化水素質化合物を得る。加工チャンバー450はまた、出口ライン454を介して発酵容器410に水を戻して再利用する。加工チャンバー450は、出口ライン452を通じて合計で95%のエタノールをさらなる下流加工のために送り出す。
本明細書で使用できる例示的な破壊装置としては、これらに限定されないが、マイクロ流体装置、超音波処理装置、超音波装置、機械的破砕装置、フレンチプレス、冷凍器、加熱器、ホモジナイザー、高温反応器、熱交換器、高温反応器、蒸留塔、プロセスの流れおよび保持タンクの温度を上昇させる装置、低温殺菌装置、紫外線殺菌装置、ガンマ線殺菌装置、反応器、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
破壊装置460の一例としては、細菌性微生物の細胞膜および細胞壁の構造に不可逆変化をもたらし、細菌細胞の内容物のさらなる操作を可能にする装置がある。細菌細胞の内容物は、核酸、タンパク質、グリコーゲン、顔料、脂肪滴、結晶、および他の栄養素(種々の形態の炭素、窒素、硫黄、カルシウムなど)を含む。
例として、破壊装置460は、マイクロ流体装置である。マイクロ流体装置は、これらに限定されないが、反応室、管、ポンプ、フランジ管、リング、ガスケット、高圧逆止め弁を含む。マイクロ流体装置の反応室は、セラミック反応室、耐摩耗室、スプール反応室であってもよく、シングルスロット付き、マルチスロット付きであり、マイクロチャネリングを有する。
次いで分画装置470内で、ホモジネートを、第1のタンパク質含有画分と、タンパク質含有細胞残屑画分とに分画する。次に、第1のタンパク質含有細胞残屑画分を、出口ライン472を介して脱水チャンバー475Aへ送達する。次いで、第1のタンパク質含有画分を、出口ライン474を介して脱水チャンバー475Bへ送達する。例示的な分画装置には、これらに限定されないが、様々なタイプの固液分画装置、遠心分離装置、連続遠心分離装置、デカンター遠心分離装置、ディスクスタック遠心分離装置、濾過装置、中空糸濾過装置、螺旋巻き濾過装置、セラミックフィルター装置、クロスフロー濾過装置、サイズ排除装置、1本または一連のサイズ排除カラム、1本または一連のイオン交換カラム、1本または一連の炭素重合体カラム、流入式磁気分別装置、限外濾過装置、1本または一連のアフィニティクロマトグラフィーカラム、1本または一連のゲル濾過カラム、およびこれらの組合せが挙げられる。
脱水チャンバー475Aおよび脱水チャンバー475B中で行われる脱水プロセスの後、タンパク質富化栄養素サプリメントを得ることができ、脱水チャンバー475Aおよび脱水チャンバー475Bそれぞれから、出口ライン476Aおよび476Bの両方を介して収集することができる。
一態様において、破壊装置460によって加工した後、ホモジネートを分画装置470へ送達して、タンパク質含有画分と細胞残屑画分とに分離する。分画装置470は、出口ライン462を介して破壊装置460に接続されている。分画装置470は、少なくとも2つの出口ラインを有し、出口ライン472は、細胞残屑画分を送達するために使用され、第2の出口ライン474は、タンパク質含有画分を送達するために使用される。
図4Dは、細菌発酵プロセスからタンパク質富化栄養素サプリメントを得るための、1つの発酵容器、1つの細胞セパレータ、1つの細胞非含有保持タンク、1つの加工チャンバー、1つの破壊装置、2つの分画装置、および3つの脱水チャンバーを有する細菌発酵システム400Dの概略図を示す。細菌発酵システム400Dは、入口ライン402、入口ライン404、発酵容器410、出口ライン412、出口ライン414、細胞セパレータ420、出口ライン422、出口ライン424、出口ライン426、細胞非含有保持タンク440、出口ライン442、出口ライン444、加工チャンバー450、出口ライン452、出口ライン454、破壊装置460、出口ライン462、分画装置470、出口ライン472、出口ライン474、脱水チャンバー475、出口ライン476、分画装置480、出口ライン482、出口ライン484、脱水チャンバー485A、出口ライン486A、脱水チャンバー485B、および出口ライン486Bを含む。
細菌発酵システム400Fにおいて、細胞を含有する細胞含有懸濁液を、細胞含有保持タンク445内で、1種または複数の添加剤で前処理することができる。1種または複数の添加剤、例えば、界面活性剤、洗剤、EDTA、Triton X−100、Tween−20、ドデシル硫酸ナトリウム、CHAPS、酵素、プロテアーゼ、リゾチーム、ベンゾナーゼ、ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ(RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、加水分解誘発剤、pH調整剤、およびこれらの組合せは、入口ライン406を介して細胞含有保持タンク445に添加することができる。pH調整剤としての添加剤の別の例には、塩化水素がある。
特定の実施形態において、細菌発酵システム400Hは、1つまたは複数の再循環ラインをさらに含む。一実施形態において、再循環ラインは、破壊装置460に接続された戻りライン464である。戻りライン464は、破壊装置から一部の生成物混合物を取り、破壊装置460に再度入る。これによって、複数回の破壊装置460を経る通過が可能になり、その結果、破壊量および嫌気性細菌細胞のタンパク質含有ホモジネートのタンパク質濃度が増加し、さらなる加工のために細菌細胞中のタンパク質化合物への十分な到達が確保される。
細胞セパレータ520中で、発酵容器510からの発酵液体ブロスを、細胞非含有浸透液と、第2の濃度の嫌気性細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液とに分離する。細胞非含有浸透液を、加工チャンバー550と細胞セパレータ520とを接続する出口ライン522に通して加工チャンバー550へ送達する。第2の濃度の嫌気性細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液を、細胞含有保持タンク545と細胞セパレータ520とを接続する出口ライン526に通して細胞含有保持タンク545へ送達する。
細胞含有保持タンク545内のミキサー548は、撹拌装置、例えば内部にプロペラを備えた撹拌装置である。破壊装置560は、出口ライン542を介して細胞含有保持タンク545に接続されている。破壊装置560は、嫌気性細菌細胞のホモジネートを生成する。細胞含有保持タンク545中で特定の期間を経た後、細胞含有懸濁液を破壊装置560へ送達する。
一態様において、分画装置570は、1つまたは複数のタンパク質含有画分を受け取って乾燥させる、1つまたは複数の脱水チャンバー(例えば、脱水チャンバー575Aおよび575B)に接続されている。使用される乾燥技法には、乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。次いで、タンパク質含有画分をさらに加工し、ブレンドして、タンパク質富化栄養素サプリメントにする。タンパク質含有画分は、タンパク質富化栄養素サプリメントの10%以上(例えば、10%〜80%または50%〜95%)のタンパク質含有量を占め得る。
別の実施形態において、細菌発酵システムは、2つ以上の破壊装置を有する。第1の破壊装置はまた、発酵液から分離した細胞含有懸濁液中の細菌細胞を保持する保持タンクまたは貯蔵容器にもなり得る。前処理装置である第1の破壊装置が存在し、細胞含有懸濁液が、第1の破壊装置に入り、添加剤で処理されて破壊効率が増強される。使用する添加剤としては、これらに限定されないが、1種または複数の洗剤、酵素、化学物質、またはこれらの組合せが挙げられる。マイクロ流体装置である第2の破壊装置が存在し、細胞が第2の破壊装置に入り、反応室内で高剪断力を受ける。細胞含有懸濁液は、マイクロチャネリングを通して押し出され、それによって細菌細胞の細胞壁および細胞膜が破壊して開かれ、細菌細胞の中身が、発酵液中を浮遊するようになる。これは、第1のタンパク質集合体の回収を可能にし、遠心分離、濾過、脱水などによってさらに操作することができる。
本明細書に記載の細菌発酵システムから回収された1つまたは複数のタンパク質含有画分に、供給原料組成物との直接のブレンド、乾燥、沈降、濾過、限外濾過、精密濾過、真空濾過、遠心分離、連続遠心分離、冷凍乾燥、凍結、加水分解、およびこれらの組合せを行い、非常に純粋な形態のタンパク質をより高いタンパク質濃度で生成して得ることができる。微生物バイオマスが加水分解される態様において、加水分解は、熱処理、酸加水分解、酵素加水分解、アルカリ加水分解、およびこれらの組合せによって実施することができる。
方法の一実施形態において、第1のタンパク質含有画分を、タンパク質富化栄養素サプリメントとして製造する。第1のタンパク質含有画分は、60%〜80%のタンパク質含有量を占める。別の態様では、第1のタンパク質含有画分は、40%〜60%のタンパク質含有量を占める。さらに別の態様では、第1のタンパク質含有画分は、10%〜40%のタンパク質含有量を占める。
一態様において、酢酸生成細菌培養物は、クロストリジウム菌、アセトバクテリウム菌、およびこれらの組合せからなる群から選択される。発酵されたガス状基質は、炭素源基質、一酸化炭素(CO)、二酸化炭素(CO2)、水素(H2)ガス、合成ガス、およびこれらの組合せからなる群から選択される1種または複数のガスを含む。
別の態様において、組成物のタンパク質含有画分は、組成物の約10%〜約80%の含有量のタンパク質、組成物の約5%〜約35%の含有量の炭水化物、および組成物の約5%〜約15%の含有量の核酸を含む。タンパク質含有画中のタンパク質含有量は、タンパク質含有画分中の炭水化物含有量より多い。さらに別の態様では、核酸含有量は、組成物の2%を超えない。これは、ヒトおよび動物などが摂取可能な組成物である。
一態様において、組成物は、組成物の約10%〜約80%のタンパク質含有量、組成物の約5%〜約35%の炭水化物含有量、および組成物の約5%〜約15%の核酸含有量を含む。タンパク質含有画分中のタンパク質含有量は、タンパク質含有画分中の炭水化物含有量より多い。
別の態様において、組成物は、組成物の約10%〜約80%のタンパク質含有量、組成物の約5%〜約35%の炭水化物含有量、および組成物の2%を超えない核酸含有量を含む。
別の態様において、供給原料組成物は、乾燥酢酸生成バイオマス100グラム当たり約220kcal以上、別の態様では、約220kcal〜約400kcal、別の態様では、約250kcal〜約350kcal、別の態様では、約300kcal〜約325kcal、および別の態様では、約220kcal〜約300kcalをもたらす。
別の態様において、供給原料組成物は、乾燥酢酸生成バイオマス100グラム当たり約15グラム以上、別の態様では、約15グラム〜約60グラム、別の態様では、約20〜約40グラム、別の態様では、約25〜約35グラム、および別の態様では、約30〜約35グラムの炭水化物をもたらす。この態様において、供給原料の炭水化物とタンパク質の質量比は、約1.0以下、別の態様では、約0.75以下、別の態様では、0.5以下、別の態様では、約0.25以下、および別の態様では、0.1以下である。一態様において、供給原料は、検出可能な炭水化物がなく、タンパク質のみを含む。別の態様では、炭水化物は、エタノールおよび/または水溶性糖類を含み得る。
一態様において、供給原料組成物は、僅少な量の金属を含み得る。代替の態様において、供給原料は、特定の所望レベルの金属を含み得る。供給原料中に存在し得るまたは存在し得ない金属の例としては、亜鉛、モリブデン、カドミウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、タングステンおよびセレンが挙げられる。
一態様において、本組成物は、細菌発酵プロセスに有効な量の栄養素をもたらす。この態様において、「有効な量」は、全アルコール約1g以上/(L・日)のSTYの全アルコールの生産のうちの少なくとも1つを含み得る健康的な発酵プロセスを促進し、約2.0グラム/リットル以上の細胞密度をもたらし、培養物を定常状態で維持する上での使用を説明する。細菌発酵プロセスは、CO含有ガス状基質の発酵であってよく、供給原料を本来誘導した細菌発酵プロセスと同じであってもよい。
別の態様において、本組成物は、有効な量の栄養素を動物にもたらす。「有効な量」は、動物の健康的な成長を促進する使用が、以下、すなわち、動物における細菌負荷の阻害、家禽における壊死性腸炎の予防または軽減、動物における免疫応答の刺激、給餌または別法で動物に投与された抗生物質およびワクチンの効力の強化、給餌量当たりの成長率の増加、乳汁産生の増加、死亡率の低下、などのうちの少なくとも1つを促進させるのに十分な量であることを説明する。動物に適合される有効な量を決定する上で、限定されないが、動物の年齢、活動のレベル、ホルモンバランス、および総体的な健康状態を含めた、いくつかの要因が考慮され得、例えば低用量で開始し、用量を漸増して有効な量を決定する。
連続細菌発酵プロセス
COおよび/またはCO2/H2を含有する合成物ならびに廃ガスを、クロストリジウム・リュングダーリイ(Clostridium ljungdahlii)の株が入っている撹拌タンクバイオリアクター内に、ビタミン、微量の金属、および塩を含有する発酵培地と共に連続して導入する。使用される適切な発酵培地を、以下の表1に報告する。
撹拌速度を名目上増大させながらCO2生成(またはH2変換)をモニターする手順は、目標撹拌速度に到達するまで比較的迅速に行われる。New Brunswick Scientific Bioflo(登録商標)発酵バイオリアクターにおける典型的な目標撹拌速度は、900rpmである。バッチ式液体培養で撹拌速度が増大する期間中、細胞生成のモニタリングを、生成物発酵を促すよりも優先して行う。したがって約1.5g/Lの細胞濃度が得られ、一方、典型的な生成物濃度は、バッチ式培養から10g/Lエタノールおよび2g/Lアセテートである。
気体流量が増大するにつれ、目標の生産性で、H2変換の小さな降下によって明らかなように、反応器が最終的には液相栄養素(例えば、パントテン酸カルシウム、コバルト)に限定されるまで、細胞生成が増大する。New Brunswick Scientific Bioflo(登録商標)CSTRでは、これは20g/L・日の目標生産性でのH2変換率の10%降下によって理解される。
発酵生成物比を制御するための、発酵容器からの細菌細胞の除去
ガス状基質(30%CO、15%H2、10%CO2、45%N2)発酵は、C.リュングダーリイ株C−01を利用するCSTR(pH=5.0、温度=38℃、圧力=20psig)で、細胞リサイクル(細胞保持時間=40時間、および液体保持時間=6時間)と共に行われ、培養は、コバルト、パントテン酸カルシウム、または任意の他の栄養素による成長に限定されない。培養物が成長するにつれ、細胞密度は、特異的な取込み(分当たりの乾燥細胞のグラム当たりのCOのmmol)が0.5よりも低くなるように、かつ酢酸がエタノールよりも優先して生成されるように、実現される。この結果を防止するために、細胞除去速度を増大させて細胞密度の増大を防止し、それによって細胞の定常濃度が、分当たりの乾燥細胞のグラム当たり0.5mmol COよりも高い特異的取込みを維持するのに十分低く保持されるようにする。そのようにすることで、細胞保持時間は6〜25時間に短縮される。C.リュングダーリイの株の細菌発酵プロセス中の細胞濃度のモニタリングに関する、表2を参照されたい。
酢酸生成細菌細胞の細胞バイオマスの分析
クロストリジウム・リュングダーリイC−01を、合成ガスを用いてバイオリアクター内で成長させた。バイオリアクターからの発酵物の試料、および細胞バイオマスの濃縮乾燥質量を、以下の表3の手順に従い分析した。
酢酸生成細菌細胞のタンパク質、炭水化物、および核酸含有量の分析
クロストリジウム・リュングダーリイC−01を、合成ガスを用いてバイオリアクター内で成長させた。細胞培養物を4,000RPMで遠心分離して、培地を除去した。ペレットを収集し、100Cの炉内で一晩乾燥した。
1つまたは複数のマイクロ流体化破壊装置による細菌細胞の破壊、およびマイクロ流体化破壊装置による細菌細胞の破壊のためのタンパク質の回収
マイクロ流体工学によるマイクロ流体化装置は、発酵プロセスからの嫌気性細菌細胞を破壊し、かつタンパク質含有部分を生成する、破壊装置と確認された。ある体積の発酵液体は、発酵容器から得た。試料を、遠心分離によって1.5倍にまたは例えば約20g/L以上の細胞濃度に濃縮した。例えば、発酵液体約15g/Lは発酵容器から得られ、試料は、遠心分離により濃縮して22.4g/L以上の細胞密度を得た。
得られる細胞を、溶液に再懸濁し(例えば、細胞を約44g含有し得る2L溶液に)、マイクロ流体装置に送った。マイクロ流体化プロセスでは、高圧でマイクロ流体反応室内のマイクロチャネルに細胞を強制的に通すことによって創出された高剪断力で、細胞を破壊する。
いくつかの実験を行った。各試料を、異なる長さの時間でかつ異なる圧力で流した。それらの中で、6つの、例示的な試料の処理実験に関する条件を示す:(1)1回の通過を18,000psiで;(2)2回の通過を18,000psiで;(3)1回の通過を23,000psiで;(4)2回の通過を23,000psiで;(5)1回の通過を28,000psiで;(6)2回の通過を28,000psiで。各通過は、マイクロ流体化装置を通過する実験を構成する。圧力は、破壊装置を介して一定速度で加えた。結果的に得られるタンパク質含有画分の6種の均質化試料は、マイクロ流体化装置による処理の後に発生した。タンパク質含有画分の各試料を、Bfadfordアッセイを使用して、タンパク質含有量に関して分析した。
1つの実験では、いくつかの試料を、マイクロ流体化装置に1回だけ通過させて処理した。1回の通過後、第1のタンパク質含有部分を、ホモジネートから分離した。次いで第1のタンパク質含有部分を噴霧乾燥して、タンパク質含有粉末を得ることができる。
第2の実験では、試料を、マイクロ流体化装置を2回通過させることにより処理し、前処理された細胞含有懸濁液はリサイクル流中を流動して2回目にマイクロ流体化装置に再度進入した。2回通過後、タンパク質含有部分が得られた。次いでタンパク質含有部分の粉末形態を得ることができる。例えば、3つの異なる乾燥技法(高温での乾燥、噴霧乾燥、および凍結乾燥)を、タンパク質含有部分が得られた後に試験した。
1つまたは複数の濾過型分画装置による、破壊された細菌細胞のホモジネートの分画
実施例5の処理プロセス後のタンパク質含有部分のホモジネートを、ナイロンフィルターに通して濾過した。ホモジネートの濾過により、当初の微生物バイオマスの5〜15%を、表7に示されるように可溶性タンパク質として回収することが可能になった。
1つまたは複数の遠心分離型分画装置による破壊細菌細胞のホモジネートの分画
実施例4のホモジネートに、2,000〜10,000RPMの速度で6分間、遠心分離を行い、タンパク質含有量を、Bradfordタンパク質アッセイを使用して分析した。可溶性タンパク質の回収率パーセントを、基本的に出発時のバイオマス濃度を使用して計算した。
結果は、タンパク質の最大25%がマイクロ流体化後に回収されたことを示し、このことは、表7にも示されるように、マイクロ流体化およびその後の遠心分離が、細胞を溶解しかつ可溶性タンパク質を回収するのに実現可能な方法であることを示している。
1つまたは複数のマイクロ流体化破壊装置による細菌細胞の破壊からの細胞溶解
破壊プロセスを実行するのに選択される破壊装置は、マイクロ流体化装置およびその他の市販の装置とすることができる。図7B〜図7Eにおいて、破壊プロセスを実行するのに選択された破壊装置は、マイクロ流体化装置である。破壊装置内の破壊プロセスは、圧力および通過回数を含む種々の変数の下で実行することができる。
図7Aは、溶解に供されなかった細胞含有懸濁液の電子顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡写真は、顕微鏡により100×の倍率でホモジネートを標的として撮影された。
破壊装置内の破壊プロセスを受けるために選択された細胞含有懸濁液は、種々の密度のものとすることができる。図7Aにおいて、破壊プロセスを受けなかった細胞含有懸濁液の密度は、約10g/L以上、例えば約16g/L以上である。
図7Bは、本発明の1つまたは複数の実施形態による、破壊装置460、560、または660内で得られる、かつ破壊装置460、560、または660内の細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞の破壊細胞膜からの生成物である、ホモジネートの別の電子顕微鏡写真を示す。
図7Cは、本発明の1つまたは複数の実施形態による、破壊装置460、560、または660内で破壊される前の、細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞の細胞膜の電子顕微鏡写真を示す。
図7Dは、本発明の1つまたは複数の実施形態による、破壊装置460、560、または660内で得られたかつ破壊装置460、560、または660内で細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞の破壊細胞膜からの生成物であるホモジネートの、別の電子顕微鏡写真を示す。
図7Eは、本発明の1つまたは複数の実施形態による、破壊装置460、560、または660内で得られる、かつ破壊装置460、560、または660内の細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞の破壊細胞膜からの生成物である、ホモジネートの、別の電子顕微鏡写真を示す。
細胞含有保持タンクにおける細菌細胞の前処理での1つまたは複数のマイクロ流体化破壊装置による細菌細胞の破壊
マイクロ流体化破壊装置(例えば、マイクロ流体装置)を使用して、発酵プロセスからの嫌気性細菌細胞を破壊し、タンパク質含有部分を生成した。発酵液体ブロス(例えば、細胞密度が15g/L)を、発酵容器の高細胞密度実験室反応器から得た。試料を遠心分離によって濃縮して、細胞密度45g/Lを得た。得られる細胞懸濁液(細胞90gを含有する2L)を、前処理のために細胞含有保持タンクに送った。
マイクロ流体化プロセスでは、高圧で1μm反応室に細胞を強制的に通すことにより創出された高剪断力で、細胞を破壊する。細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液を、6つの試料に分割した。細胞含有懸濁液を、1種または複数の添加剤(例えば、洗剤、酵素など)で処理し、15,000psiでマイクロ流体化装置内に通した。マイクロ流体化破壊装置内へのたった1回の通過が実行された。1回の通過後、第1のタンパク質含有部分をホモジネートから分離し、噴霧乾燥した。
1つまたは複数の超音波処理破壊装置による細菌細胞の破壊
超音波処理装置は、発酵プロセスからの嫌気性細菌細胞を破壊しかつタンパク室含有部分を生成する破壊装置として特定された。15g/Lの発酵液体が、発酵容器の高細胞密度実験室反応器から得られた。試料を遠心分離によって濃縮して、細胞密度22.4g/Lを得た。得られた細胞再懸濁液(細胞44gを含有する2L)を、超音波処理に供した。超音波処理プロセスでは、細胞を撹拌し細胞膜を破る超音波周波数での音響エネルギーを介した、高い力で細胞を破壊する。細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液を、6つの試料に分割した。各試料を超音波処理に供した。
細胞含有保持タンクにおける細菌細胞の前処理での1つまたは複数の超音波処理破壊装置による細菌細胞の破壊
超音波処理装置は、発酵プロセスからの嫌気性細菌細胞を破壊しかつタンパク質含有部分を生成する、破壊装置として特定された。発酵液体ブロスを、3つの高細胞密度発酵容器から得た。試料を、遠心分離を介して濃縮して、4〜10mg/mlの細胞密度を得た。
例えば、細菌細胞を約4.2mg/ml含有する発酵容器(この実施例では、例示的な容器A)から得られた発酵液体ブロスを、様々な緩衝剤中での超音波処理に供した。嫌気性細菌細胞約9.2mg/mlを含有する別の発酵容器(例示的な容器B)からの細胞含有懸濁液を、様々な緩衝剤中での超音波処理に供した。細胞約7.1mg/mlを含有する別の発酵容器(例示的な容器C)からの細胞含有懸濁液も、様々な緩衝剤中での超音波処理に供した。
発酵容器から発酵ブロスを収集した後、発酵ブロスからの細菌細胞を、遠心分離を介してスピンダウンし(例えば、4,000RPM以上の遠心分離速度で細菌細胞をスピンダウンする)、そのそれぞれの緩衝剤中に再懸濁した。
細胞を、5秒のパルスで超音波処理し、その後、それらの間で氷上に載置した。サイクルを3回繰り返した。超音波処理後、細胞を10分間、20K RPMでスピンダウンし、上澄みを除去した。可溶性タンパク質画分を、Lowryベースのタンパク質アッセイを使用してタンパク質含有量に関して分析した。可溶性タンパク質回収率のパーセンテージを、超音波処理に供される細胞の濃度に基づいて計算した。
発酵液体を、3つの高細胞密度発酵容器から得た。試料を、4,000RPMでの遠心分離を介して濃縮して、4〜10mg/mlの細胞密度を得た。細胞を、洗剤含有緩衝剤(TrisHCl pH8であり、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、CHAPS、Triton X−100、またはTween 20を含有する)または酵素含有緩衝剤(TrisHCl pH8であり、リゾチームを含有する)中に再懸濁した。TrisHCl pH8を、対照緩衝剤として使用した。得られた細胞懸濁液を、超音波処理に供した。超音波処理プロセスでは、細胞を撹拌し細胞膜を破る超音波周波数での音響エネルギーを介した、高い力で細胞を破壊する。
表9に示される結果は、細胞が超音波処理に供されたとき、洗浄添加剤がタンパク質の溶解度を増大させることができることを示す。特に、SDSまたはリゾチームの添加は、膜タンパク質の溶解度を大幅に高める。
1つまたは複数の濾過型分画装置による破壊細菌細胞のホモジネートの分画
実施例4のホモジネートを、ナイロンフィルターに通して濾過する。ホモジネートの濾過は、当初の微生物バイオマスの10.7%を可溶性タンパク質として回収可能にした。
(実施例13)
1つまたは複数の遠心分離型分画装置による破壊細菌細胞のホモジネートの分画
実施例4のホモジネートが2000rpmでの遠心分離を受け、タンパク質3.3mgを上澄み中に分画した。ホモジネートの遠心分離は、発酵容器から収集された初期微生物バイオマスの全細胞集団から分離された可溶性タンパク質の、14.3%の回収率を可能にした。
1つまたは複数の破壊装置を通した破壊の後に回収されたタンパク質に対する、細胞含有懸濁液中のpHの影響の決定
試料を、高細胞密度発酵容器から収集した。収集時の細胞濃度は約22g/Lであった。ある体積の細胞培養物を、4,000RPMで10分間、スピンダウンした。細胞ペレットを、遠心分離後に除去された培地の体積と同じ体積のTrisHCl中に再懸濁した(したがって試料は、濃縮されずまたは希釈されなかった)。多数の体積の細胞培養物を、0.5M NaOHの添加によってpH調整に供し、培養ブロスの最終pHが3.5〜10になるようにした。試料を、10,000〜20,000psiで、1回または多数回の通過に関して処理した。各試料を、13,300RPMで6分間、スピンダウンした。上澄みを収集し、Lowryベースのタンパク質アッセイを使用して可溶性画分中のタンパク質濃度を決定した。
可溶性タンパク質回収率に対するリゾチームの影響の決定
試料を、高細胞密度発酵容器から収集した。ある体積の細胞培養物を、これまで述べてきたものと同じ手法で、スピンダウンしかつTrisHCl緩衝剤中に再懸濁した。培養ブロスのpHを、0.5Mの水酸化ナトリウムを使用してpH8に上昇させた。酵素前処理の影響を決定するために、0.5mg/mlのリゾチームを使用した。培養ブロス試料では、リゾチームとのインキュベーションを約30分、室温で継続した。TrisHCl試料では、リゾチームとのインキュベーションを室温で約45分継続した(相違は、ボトルネックとしてマイクロ流体化装置による処理の遅延に起因する)。試料を、10,000〜20,000psiで、1回または多数回の通過のために処理した。対照も同様に実験操作に供したが、試料はマイクロ流体化装置に通して処理しなかった。各試料を、13,300RPMで6分間、スピンダウンした。上澄みを収集し、LowryベースのおよびBradfordベースのタンパク質アッセイを使用して、可溶性画分中のタンパク質濃度を決定し、その結果を表11に示す。
リゾチーム濃度の減少およびインキュベーション時間の延長の影響の決定
試料を高細胞密度発酵容器から収集し、4,000RPMでの10分間の遠心分離を介して濃縮した。培養ブロスのpHを、7〜10に調節した。いくつかの試料を、100ng/mlのリゾチームと共に1時間、37Cでインキュベートした。試料を10分ごとに採取して、リゾチーム活性をモニターした。
タンパク質の抽出に対するpHおよび細胞濃度の影響
高細胞密度発酵容器からの試料を、遠心分離を介して1〜10g/Lの濃度に希釈し、培地に再懸濁した。培養ブロスpHを、0.5Mの水酸化ナトリウムを使用して6〜10に調節した。試料(発酵pHでの非修飾培養ブロスを含む)を、マイクロ流体化装置に通して10,000〜20,000psiで、1回または複数回の通過で処理した。同様に、高細胞密度発酵容器から除去した非希釈培養物を、1つの酸性pHおよび1つのアルカリ性pHで処理した。各試料を、13,300RPMで6分間、スピンダウンした。
図8Aは、本発明の1つまたは複数の実施形態による、破壊装置460、560、または660からおよび細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞の細胞膜から得られた可溶性タンパク質のグラフを示す。
破壊装置460、560、または660内での破壊プロセスは、圧力および通過回数を含む種々の変数の下で実行することができる。この図8Aにおいて、破壊プロセスは、細胞含有懸濁液に対しておよびただ1回の通過の下で、平方インチ当たり15,000ポンド(psi)の圧力まで実行される。
破壊装置460、560、または660内で破壊プロセスを受けるために選択された細胞含有懸濁液は、種々の密度のものにすることができる。この図8Aにおいて、細胞含有懸濁液の4本の流れを、破壊装置460、560、または660内での破壊プロセス用に選択する。細胞含有懸濁液の密度のそれぞれは、1g/L、5g/L、10g/L、および18.5g/Lである。
線804のy軸は、本発明の1つまたは複数の実施形態による、密度が10g/Lの、細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞から種々のpH条件下(X軸)で調製された、破壊装置460、560、または660から破壊されかつ得られた細胞ホモジネートからのタンパク質の収率を表す。
線808のy軸は、本発明の1つまたは複数の実施形態による、密度が1g/Lの細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞から種々のpH条件下(X軸)で調製された、破壊装置460、560、または660から破壊されかつ得られた細胞ホモジネートからのタンパク質の収率を表す。
破壊装置460、560、または660内での破壊処理を受けるために選択された細胞含有懸濁液は、1〜14の範囲内にある異なるpH値のものとすることができる。細胞含有懸濁液のpH値は、酸、塩基、もしくは塩の添加、またはこれらの組合せを含む様々な方法によって、調節することができる。ここで図8Aにおいて、細胞含有懸濁液のpH値は、0.5Mの水酸化ナトリウムを使用して、約6または8に調節される。細胞含有懸濁液のpH値は、細胞含有懸濁液が破壊装置460、560、または660内で破壊される前に、調節することができる。例えば、細胞含有懸濁液のpH値は、細胞含有保持タンク445、545、または645内で調節することができる。
高濃度のタンパク質含有懸濁液に対するpHの影響
試料を、高細胞密度発酵容器から収集し、4,000RPMで10分間、細胞を遠心分離することによって、3倍に濃縮した。細胞ペレットを、培地に再懸濁した。培地を、濃縮水酸化ナトリウムを使用して5〜10のpHに調節した。例えば、試料は、細胞を4,000RPMで10分間、遠心分離することによって、45g/Lに濃縮した。細胞ペレットを、培地に再懸濁した。得られた細胞混合物のpHを、0.5Mの水酸化ナトリウムを使用して、5、6、7、または8に修正した。試料を、1回の通過のためにマイクロ流体化装置に通して15,000PSIで処理した。各試料を、13,300RPMで6分間スピンダウンした。上澄みを収集し、Lowryベースのタンパク質アッセイを使用して、可溶性画分中のタンパク質濃度を決定した。
図8Bは、本発明の1つまたは複数の実施形態により、破壊装置460、560、または660から、および細胞含有懸濁液中の嫌気性細菌細胞の細胞膜から得られた、可溶性タンパク質の収率のチャートを示す。
前述の内容は本発明の実施形態を対象とするが、本発明のその他およびさらなる実施形態が、その基本的な範囲から逸脱することなく考えられ、その範囲は、以下の特許請求の範囲によって決定される。
Claims (20)
- 細菌発酵プロセスからタンパク質富化栄養素サプリメントを製造する方法であって、
培地を含有する発酵容器中で、ガス状基質を嫌気性細菌によって発酵させることと、
前記発酵容器から、第1の濃度の第1の嫌気性細菌細胞のバッチを含有する発酵液体ブロスのある程度の量を得ることと、
前記第1の嫌気性細菌細胞のバッチを含有する発酵液体ブロスを、細胞非含有浸透液と、第2の濃度の第2の嫌気性細菌細胞のバッチを含有する細胞含有懸濁液とに分離することと、ここで、前記第2の濃度が、前記第1の濃度より高く、
前記細胞含有懸濁液中の前記第2の嫌気性細菌細胞のバッチの細胞膜を破壊して、ホモジネートを生成することと、
第1の分画装置を使用して、前記ホモジネートを、第1のタンパク質含有画分とタンパク質含有細胞残屑画分とに分画することと、
前記第1のタンパク質含有画分を得ることと、
を含む、方法。 - 前記第1のタンパク質含有画分が、10%〜95%の間のタンパク質含有量を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質富化栄養素サプリメントが、前記第1のタンパク質含有画分、前記タンパク質含有細胞残屑画分、およびこれらの組合せからなる群から選択される画分から加工され、製造される、請求項1に記載の方法。
- 前記嫌気性細菌細胞を含有する発酵液体ブロスが、限外濾過によって前記細胞非含有浸透液と前記細胞含有懸濁液とに分離される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞非含有浸透液が、エタノール、ブタノール、酢酸、酪酸、およびこれらの組合せからなる群から選択される1種または複数の発酵産物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞膜の破壊が、マイクロ流体装置、超音波処理装置、超音波装置、機械的破砕装置、フレンチプレス、冷凍器、加熱器、熱交換器、蒸留塔、低温殺菌装置、紫外線殺菌装置、ガンマ線殺菌装置、反応器、ホモジナイザー、およびこれらの組合せからなる群から選択される1つまたは複数の破壊装置によって達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の嫌気性細菌細胞のバッチを含有する細胞含有懸濁液を、前記嫌気性細菌細胞の細胞膜を破壊する前に、1種または複数の添加剤で処理することをさらに含み、前記1種または複数の添加剤が、界面活性剤、洗剤、EDTA、Triton X−100、Tween−20、ドデシル硫酸ナトリウム、CHAPS、酵素、プロテアーゼ、リゾチーム、ベンゾナーゼ、ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ(RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、加水分解誘発剤、pH調整剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の嫌気性細菌細胞のバッチを含有する細胞含有懸濁液を、前記細胞残屑画分から前記第1のタンパク質含有画分を分画する前に、1種または複数の添加剤で処理することをさらに含み、前記1種または複数の添加剤が、界面活性剤、洗剤、EDTA、Tween−20、Triton X−100、ドデシル硫酸ナトリウム、CHAPS、酵素、プロテアーゼ、リゾチーム、ベンゾナーゼ、ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ(RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、加水分解誘発剤、pH調整剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の分画装置が、固液分画装置、遠心分離装置、連続遠心分離装置、デカンター遠心分離装置、ディスクスタック遠心分離装置、濾過装置、中空糸濾過装置、螺旋巻き濾過装置、セラミックフィルター装置、クロスフロー濾過装置、サイズ排除装置、1本または一連のサイズ排除カラム、1本または一連のイオン交換カラム、1本または一連の炭素重合体カラム、流入式磁気分別装置、限外濾過装置、1本または一連のアフィニティクロマトグラフィーカラム、1本または一連のゲル濾過カラム、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のタンパク質含有画分を第2の分画装置へ送達することと、
前記第2の分画装置を使用して、前記第1のタンパク質含有画分を第2のタンパク質含有画分に分画することと、
前記第2のタンパク質含有画分を収集することと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第2の分画装置が、固液分画装置、遠心分離装置、連続遠心分離装置、デカンター遠心分離装置、ディスクスタック遠心分離装置、濾過装置、中空糸濾過装置、螺旋巻き濾過装置、セラミックフィルター装置、クロスフロー濾過装置、サイズ排除装置、1本または一連のサイズ排除カラム、1本または一連のイオン交換カラム、1本または一連の炭素重合体カラム、流入式磁気分別装置、限外濾過装置、1本または一連のアフィニティクロマトグラフィーカラム、1本または一連のゲル濾過カラム、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記第2のタンパク質含有画分が、前記タンパク質富化栄養素サプリメントとして製造される、請求項10に記載の方法。
- 前記第2のタンパク質含有画分を第3の分画装置へ送達することと、
前記第3の分画装置を使用して、前記第2のタンパク質含有画分を第3のタンパク質含有画分に分画することと、
前記第3のタンパク質含有画分を収集することと、
をさらに含む、請求項10に記載の方法。 - 前記第3の分画装置が、固液分画装置、遠心分離装置、連続遠心分離装置、デカンター遠心分離装置、ディスクスタック遠心分離装置、濾過装置、中空糸濾過装置、螺旋巻き濾過装置、セラミックフィルター装置、クロスフロー濾過装置、サイズ排除装置、1本または一連のサイズ排除カラム、1本または一連のイオン交換カラム、1本または一連の炭素重合体カラム、流入式磁気分別装置、限外濾過装置、1本または一連のアフィニティクロマトグラフィーカラム、1本または一連のゲル濾過カラム、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記第3のタンパク質含有画分が、前記タンパク質富化栄養素サプリメントとして製造される、請求項13に記載の方法。
- 細菌発酵プロセスからタンパク質富化栄養素サプリメントを製造する方法であって、
発酵容器中で、嫌気性細菌によってガス状基質を発酵させることと、
前記発酵容器から、第1の濃度の嫌気性細菌細胞を含有する発酵液体ブロスのある程度の量を得ることと、
前記嫌気性細菌細胞を含有する発酵液体ブロスを、細胞非含有浸透液と、第2の濃度の嫌気性細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液とに分離することと、
細胞含有保持タンク中に、前記嫌気性細菌細胞を含有する細胞含有懸濁液を保持することと、
ある送達速度で、前記細胞含有懸濁液を、前記細胞含有保持タンクから破壊装置へ送達することと、
前記破壊装置を使用して、前記嫌気性細菌細胞の細胞膜を破壊して、ホモジネートを生成することと、
1つまたは複数の分画装置を使用して、前記ホモジネートを、第1のタンパク質含有画分とタンパク質含有細胞残屑画分とに分画することと、
を含む、方法。 - 前記細胞含有保持タンクが、前記細胞含有懸濁液が前処理プロセスを経るようにする前記細胞含有懸濁液を収容するための前処理チャンバーであり、前記前処理プロセスが、前記嫌気性細菌細胞を1種または複数の添加剤で処理することを含み、前記1種または複数の添加剤が、界面活性剤、洗剤、EDTA、Triton X−100、Tween−20、ドデシル硫酸ナトリウム、CHAPS、酵素、プロテアーゼ、リゾチーム、ベンゾナーゼ、ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ(RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、加水分解誘発剤、pH調整剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 第1の濃度の液体ブロス中の細菌細胞からタンパク質富化栄養素サプリメントを製造する方法であって、
前記細菌細胞を含有する発酵液体ブロスを、細胞非含有浸透液と、第2の濃度の第2の細菌細胞のバッチを含有する細胞含有懸濁液とに分離し、前記第2の濃度が、前記第1の濃度より高いことと、
前記細胞含有懸濁液中の前記第2の細菌細胞のバッチの細胞膜を破壊して、ホモジネートを生成することと、
第1の分画装置を使用して、前記ホモジネートを、第1のタンパク質含有画分とタンパク質含有細胞残屑画分とに分画することと、
前記第1のタンパク質含有画分を得ることと、
を含み、前記第1のタンパク質含有画分が、10%〜95%間のタンパク質含有量を有する、方法。 - 前記細菌細胞が、固体、液体またはガス状基質の液体培地中の発酵によって得られる、請求項18に記載の方法。
- 前記基質が、炭水化物、カルボン酸、メタノール、メタン、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、合成ガス、およびこれらの組合せを含む、請求項19に記載の方法。
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