TW201940686A - 細胞培養方法及裝置 - Google Patents

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Abstract

本發明所提供的細胞培養裝置，其係在使用形成有複數個凹部之細胞培養袋來進行細胞培養時，既可防止細胞在凹部之間移動，又可將附著於凹部的內面的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離，而可提昇細胞或細胞的凝聚塊之增殖暨分化誘導效率。
本發明的細胞培養方法，是使用具有：由將周邊部密封起來的上面膜片(21)及下面膜片(22)所構成的袋本體(2)、安裝在袋本體(2)的袋口構件(3)，且在下面膜片(22)形成有複數個凹部(4)之細胞培養袋(1)的細胞培養方法，其是具有：將收容在袋本體(2)內的培養基(S)從袋口構件(3)排出之後，以上面膜片(21)將複數個凹部(4)予以封閉之封閉工序；針對於被封閉後的複數個凹部(4)的其中一部分或全部的凹部(4)，將附著在該凹部(4)的內面的細胞凝聚球狀體予以剝離之剝離工序。

Description

細胞培養方法及裝置
本發明是關於細胞培養方法及裝置，更詳細地說，是關於使用設置有複數個凹部的細胞培養袋之細胞培養方法及裝置。
近年來在醫藥品的生產、基因治療、再生醫療、免疫療法之類的領域中，很需要能夠在人為化的環境下，將細胞(包括：組織、微生物、病毒等)很有效率地大量進行培養暨分化誘導。
在這種細胞培養時，為了要避免污染的風險，有時候是使用封閉式的細胞培養袋。細胞培養袋，例如是由將周邊部密封起來的塑膠膜片所構成的袋本體、以及安裝在袋本體的袋口構件所構成的。專利文獻1所揭示的細胞培養袋，係藉由在袋本體的底面設置了複數個凹部，而可減少細胞培養袋內的細胞的移動。
然而，在細胞培養時，一般而言，隨著細胞的增殖而導致培養基中的細胞濃度太高的話，將會導致增殖所需的培養基成分的枯竭，還有因為細胞本身的代謝產物的累積等等的因素，使得細胞的成長受到阻礙，因而降低了細胞的增殖效率。另外，培養基中的細胞濃度太低的話，也會使得細胞的增殖暨分化誘導的效率降低。因此，為了提高細胞的培養暨分化誘導效率，必須將細胞濃度維持在合宜的範圍。
即使是在使用設有複數個凹部的細胞培養袋來進行培養細胞凝聚球狀體的情況下，也是必須將各凹部內的細胞濃度維持在合宜的範圍，因此，是以可使得各凹部的細胞數都趨於一致的方式，將細胞播種到各凹部內。
此外，在這種細胞凝聚球狀體的培養中，為了在各凹部內形成均一且適度的大小的細胞凝聚球狀體(細胞的凝聚塊)，必須使各凹部內各形成一個細胞凝聚球狀體，並且維持一個凹部內只有一個細胞凝聚球狀體的狀態，直到培養結束為止。
想要在一個凹部內只形成一個細胞凝聚球狀體的話，係在細胞培養袋的內面，實施可讓細胞難以附著上去的細胞低附著處理，以將細胞聚集在細胞培養袋的半球狀凹部的底部中央為宜。所謂的：細胞低附著處理，例如是可舉出：塗敷了磷脂質聚合物、聚乙烯醇衍生物、界面活性劑或白蛋白之類的蛋白質等，以謀求阻礙細胞附著性蛋白吸附到塑膠膜片的表面的處理等等。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2009-11260號公報
[發明所欲解決的技術課題]
然而，即使對於細胞培養袋實施了細胞低附著處理，有時候也會因為例如：處理時的塗佈不一致、或者培養細胞之附著力的差異等等的各種因素，而導致細胞、細胞凝聚球狀體附著到凹部的內面。有時候係如第10圖所示般地，被播種在已收容有培養基S的細胞培養袋1的各凹部4內的細胞C，因為有細胞附著性蛋白的存在，而附著在凹部4的內面的複數個地方。這種情況下，各細胞C將會以其所附著的位置作為起點，分別地形成細胞凝聚球狀體，而變成在一個凹部4內形成有複數個小的細胞凝聚球狀體。並且因為附著在凹部4的內面的細胞凝聚球狀體並不會移動，所以細胞凝聚球狀體彼此之間無法互相附著來形成單一個細胞凝聚球狀體。
因此，為了在各凹部內各只形成一個細胞凝聚球狀體，必須將附著在凹部內面的複數個地方的細胞予以剝離而且聚集到凹部內的一個地方(例如：底部中央)。
此外，即使在各凹部內只形成有一個細胞凝聚球狀體的情況下，也是會發生細胞凝聚球狀體附著在凹部的內面的情事。細胞凝聚球狀體身上之附著於凹部內面的部分，培養基成分很容易枯竭，而且很容易累積代謝產物，因此會導致降低細胞凝聚球狀體之整體的細胞的增殖暨分化誘導效率。
因此，在細胞凝聚球狀體的培養時，為了要提高細胞的增殖暨分化誘導效率，必須定期地(例如：每次更換培養基時)將附著於凹部內面的細胞凝聚球狀體予以剝離，並改變細胞凝聚球狀體的附著位置。
傳統之使用凹坑型細胞培養盤的細胞培養方法，使利用移液器使得凹坑(凹部)內的培養基產生噴流，而可將附著在凹坑的內面的細胞(例如：剛剛播種後的細胞或已經形成了細胞凝聚球狀體的細胞)予以剝離。具體而言，將移液器前端插入凹坑內，平穩地吸取培養基但不要吸到細胞，然後再將所吸取上來的培養基迅速地注入凹坑內而使得培養基中產生噴流，而可利用噴流將細胞予以剝離。
然而，在使用細胞培養袋來培養細胞的方法中，是很難在維持著封閉的狀態下，將移液器插入到細胞培養袋內的凹部。
此外，如第11圖(a)所示，在使用了細胞培養袋的細胞培養法中，可以考慮的方法，是從袋口構件3強力地注入培養基S來使得細胞培養袋1內產生培養基S的水流，來使附著於凹部4的內壁的細胞C剝離。
但是，這種方法，係如第11圖(b)所示，原本沉澱於凹部4內的細胞C和已經剝離後的細胞C將會移動到達其他的凹部4，而導致各凹部4內的細胞濃度變得不均勻。尤其是如果一個凹部4內進入了太多的細胞C的話，很快就會形成太大的細胞塊C’而使得細胞的增殖暨分化誘導效率降低。
本發明是有鑒於上述的情事而開發完成的，其目的是要提供：在使用形成有複數個凹部的細胞培養袋來進行細胞培養時，既可防止細胞在凹部之間移動，又可將附著於凹部的內面的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離，而可提高細胞或細胞的凝聚塊的增殖暨分化誘導效率之細胞培養方法及裝置。

[用以解決課題的技術方案]
本發明的細胞培養方法，係使用具有：由將周邊部密封起來的上面膜片及下面膜片所構成的袋本體、安裝在前述袋本體的袋口構件，且在前述下面膜片形成有複數個凹部之細胞培養袋的細胞培養方法，其特徵為：
係具有：將收容在前述袋本體內的培養基從前述袋口構件排出之後，以前述上面膜片將前述複數個凹部予以封閉之封閉工序；針對於被封閉後的前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，從前述細胞培養袋的外部對於前述凹部施加物理性的刺激，而將附著在該凹部的內面的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離之剝離工序。
又，本發明的細胞培養裝置，係使用具有：由將周邊部密封起來的上面膜片及下面膜片所構成的袋本體、安裝在前述袋本體的袋口構件，且在前述下面膜片形成有複數個凹部之細胞培養袋的細胞培養裝置，其特徵為，係具備：
具有供載置前述細胞培養袋的載置面之台架；
在利用前述上面膜片將前述複數個凹部密封之前，用來將收容在前述袋本體內的培養基從前述袋口構件予以排出的輸液機構；
針對於封閉後的前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，為了將附著於該凹部的內面的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離，乃從前述細胞培養袋的外部對於該凹部施加物理性的刺激的剝離機構。

[發明之效果]
根據本發明的細胞培養方法及裝置，在使用形成有複數個凹部之細胞培養袋來進行細胞培養時，既可防止細胞在凹部之間移動，又可將附著在凹部的內面之細胞或細胞的凝聚塊予以剝離，而可提高細胞或細胞的凝聚塊的增殖暨分化誘導效率。
例如：當細胞附著於細胞培養袋的凹部的內面的複數個地方的情況下，先將凹部封閉起來，再對於凹部施加物理性的刺激，藉此，既可防止細胞在凹部之間移動，又可將細胞予以剝離而使其聚集到一個地方，可很有效率地在一個凹部內只形成一個細胞凝聚塊(細胞凝聚球狀體)，而可提高細胞的增殖暨分化誘導效率。
此外，例如：當細胞凝聚塊附著於細胞培養袋的凹部的內面的情況下，先將凹部封閉起來，再對於凹部施加物理性的刺激，藉此，既可防止細胞凝聚塊在凹部之間移動，又可將細胞凝聚塊予以剝離，而改變細胞凝聚塊的附著部位，因而可提高細胞凝聚塊的增殖暨分化誘導效率。
茲佐以圖面來說明本發明的較佳實施方式如下。
(細胞培養袋)
首先，在說明本實施方式的細胞培養裝置之前，先佐以第1圖來說明本實施方式中所使用的細胞培養袋。第1圖(a)～第1圖(c)所示的細胞培養袋1，係具備：由重疊在一起並且將周邊部20密封起來的上面膜片21及下面膜片22所構成的袋本體2；以及安裝在這個袋本體2上的袋口構件3。袋本體2的大小，雖然並未特別的限定，例如係可以採用：縱長為50～500mm且橫寬為50～500mm的大小。
此外，在包含第1圖在內的各圖當中，與袋口構件3相連接的軟管等的流路以及用以封閉流路的夾子或閥等的封閉機構的圖示都予以省略。
如第1圖(c)所示，在下面膜片22形成有作為各個細胞培養部之複數個凹部4。凹部4為了抑制袋本體2內的細胞的移動，以將培養中的細胞停留在一個凹部4內，乃將其開口徑(直徑)D設定在0.3～10mm、深度d設定在0.1mm以上為宜。凹部4係可將全部的凹部4都設定為同一種開口徑，也可以是包含不同開口徑之兩種以上的凹部。例如：亦可將下面膜片22分割成複數個領域，就各個領域來將凹部4的開口徑予以設定成不同。
又，細胞培養袋1為了使細胞比較容易聚集到凹部4的底部，乃如第1圖(b)所示，將凹部4設計成具有球面狀的形狀。此外，凹部4的形狀，並不限定於此。例如：凹部4係可設計成下凹成磨缽狀(圓錐狀)的形狀。為了使得細胞比較容易聚集到凹部4的底部，係將凹部4的深度d與直徑D的比值d/D設定在0.05～1為宜。
又，凹部4的排列方式，係可如第1圖(c)所示般地，以交錯狀來進行排列，以使得在下面膜片22中的凹部4所佔據的面積愈大愈好，但是，亦可配合需求而排列成格子狀。
如第1圖(b)所示，上面膜片21的形狀是形成：由可將複數個凹部4整體的上方予以覆蓋之實質上呈平坦的頂面部分21a；以及形成在頂面部分21a的周圍的傾斜部分21b所構成之呈台地狀膨凸之膨凸形狀。如此一來，與只單純地將兩個塑膠膜片重疊在一起並且周邊部密封起來的扁平口袋狀容器進行比較，即使在袋本體2內裝滿了培養基，係可減少下面膜片22的周邊部產生被往上抬舉的變形。
用來形成袋本體2的上面膜片21及下面膜片22，係以具有透氣性的塑膠膜片來形成的。這種塑膠膜片的透氣性，依據日本工業規格JIS K 7126所制定的透氣度試驗方法，在試驗溫度為37℃時所測定到的氧氣透氣度達到5000 mL/(m2 ・day・atm)以上的為宜。
用來形成袋本體2的塑膠膜片所使用的材料，可舉出例如：聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚合體、聚酯、聚矽氧系彈性體、聚苯乙烯系彈性體、四氟合乙烯-六氟丙烯共聚合體(FEP)之類的熱可塑性樹脂。這些材料可以單層來使用，也可以將同一種類或不同種類的材料疊層來使用，但是若考慮到將周邊部進行熱封合時的熱融著性的話，係採用具有可當成密封膠層來發揮作用的層的材料為佳。
此外，為了使得上面膜片21既有可撓性又可保持膨凸形狀，並且使得下面膜片22可以保持住凹部4的形狀，用以形成袋本體2的塑膠膜片的厚度優選為：具有適度的形狀保持性之30～200μm。
袋口構件3係以可讓培養基、細胞等流通過去的管狀構件所製成的，例如：係可以聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚苯乙烯系彈性體、FEP之類的熱可塑性樹脂來成形製作的。
(第1實施方式)
其次，佐以第2圖及第3圖來說明本發明的實施方式的細胞培養方法及裝置。第2圖係第1實施方式的細胞培養裝置100之剖面示意圖，第2圖(a)係顯示：按壓構件往上抬舉的狀態；第2圖(b)係顯示：按壓構件往下按壓的狀態。
本實施方式的細胞培養裝置100，係具備：供載置細胞培養袋1的台架5；具有用來按壓上面膜片21的頂面部分21a的大小的底面6a之按壓構件6；用以支承按壓構件6的支承機構7。
此外，在第2圖中係省略了：作為可從細胞培養袋1的袋口構件3注入和排出培養基之輸液機構用的泵浦；用以從細胞培養袋1的凹部4將細胞凝聚球狀體予以剝離的剝離機構之圖示。此外，此處的泵浦，係可舉出例如：經由軟管來與袋口構件3相連接的蠕動泵浦。此外，輸液機構，並不限定為泵浦，也可以是例如：注射器。
台架5係具有：可供細胞培養袋1以水平狀態進行載置的載置面5a。在這個載置面5a的形狀係形成具有開口部5b，以便於置入形成在細胞培養袋1的下面膜片22的複數個凹部4的各個凹部。如此一來，載置面5a是以並未接觸於凹部4的狀態來支承下面膜片22，因此，可避免凹部4的崩潰變形而可防止凹部4內的細胞流出，亦可提高來自下面膜片22的透氣性。
此外，用來置入複數個凹部4的各個凹部的形狀，並不限定為開口部，例如：亦可以是凹部形狀或者是網眼狀。
按壓構件6是與細胞培養袋1的頂面部分21a相對應的略長方形的平面形狀之板狀構件，且具有平坦的底面6a。
支承機構7是由：設在台架5上的框架71；從按壓構件6的上表面的四個角落朝上方延伸且可朝上下移動地貫通過框架71的導引銷72；可將按壓構件6朝下方彈推的彈推機構73所構成的。彈推機構73係由：配置在按壓構件6的上表面與配置在框架71，並且將相同的磁極端相對向的永久磁鐵73所構成的。利用作用在永久磁鐵73彼此之間的排斥力，按壓構件6係可隨著上面膜片21的高度而往上下進行移動。
此外，彈推機構73並不限定為永久磁鐵。又，亦可將彈推機構73予以省略，而是利用按壓構件6的本身重量，讓按壓構件6隨著上面膜片21的高度而往上下進行移動。
其次，佐以第3圖及第4圖來說明本實施方式的細胞培養方法。此外，在第3圖及第4圖中，係將第2圖所示的細胞培養裝置中的支承機構7的圖示予以省略。
如第3圖(a)所示，在各凹部4內是以均勻一致的細胞濃度收容著正在進行細胞培養中所形成的細胞凝聚球狀體C。
如第3圖(b)所示，在封閉工序時，係利用泵浦(未圖示)將收容在袋本體2內的培養基S從袋口構件3排出，而利用上面膜片21將複數個凹部4全數都予以封閉起來。因為是以按壓構件6的平坦的底面6a按壓著上面膜片21，因此上面膜片21也變得平坦而可以這個上面膜片21將複數個凹部4的各個凹部都確實地封閉起來。如此一來，各個細胞凝聚球狀體C就被封閉在各凹部4內，在進行接下來的剝離工序時，可防止細胞凝聚球狀體C從各凹部4流出。
此外，在利用上面膜片21將複數個凹部4予以封閉時，係可以將各凹部4密閉起來，但也可以不要密閉起來。如果不要將複數個凹部4密閉起來的話，只要是以能夠阻止細胞從凹部4流出來的程度，來將複數個凹部4予以堵住即可。
其次，如第4圖所示，在剝離工序中，係針對於被封閉後的複數個凹部4的其中一部分或全部，將細胞凝聚球狀體C從該凹部4的內面進行剝離。
剝離工序，係只要針對於複數個凹部4的其中一部分或全部的凹部4，施加振動或搖動即可。這個時候，係可針對於細胞培養裝置100整體施加振動或搖動，也可以是針對於形成有凹部4的下面膜片22施加振動或搖動之類的物理性的力量。被施加於凹部4的振動或搖動也會傳遞到達附著在凹部4的內面的細胞凝聚球狀體C，使得細胞凝聚球狀體C從凹部4的內面剝離開來。
此外，用來施加振動或搖動的機構，既可採用如第4圖所示的安裝在細胞培養裝置的台架5上的振動組件(振動機)8，也可以採用搖動裝置。再者，亦可將振動組件8直接接觸於凹部4，而直接對於凹部4施加振動。或者，亦可只針對於其中一部分的凹部4選擇性地施加振動或搖動。
又，振動及搖動亦可以是往復運動，也可以是例如：試管混合機所施加的旋轉運動。
第5圖的照片係顯示本實施方式中的已經將細胞播種後的一個凹部4內。此處，係使用「味之素株式會社」製的培養基(商標名稱為：Stem Fit)，將尚未分化的iPS細胞(細胞株1231 A3)在每一個凹部(凹坑)內，播種了3×104 個。
第5圖(a)是顯示：從播種起算48個小時後的凹部。如第5圖(a)所示，播種後的細胞是形成細胞凝聚球狀體，不僅是凹部的底部中央也附著在凹部的內面的所有的地方。此外，在第5圖(a)中，附著在凹部的周圍內面的細胞凝聚球狀體，因為已經脫離了照片的焦點面，因此並未清楚地呈現出來。
第5圖(b)係顯示封閉工序後的凹部。如果只是單純地將凹部4封閉起來的話，細胞凝聚球狀體還是維持著附著在內面的每一個地方的狀態。
封閉工序，係使用蠕動泵浦當作輸液機構，以1.0ml/分鐘的輸液速度，將培養基從袋口構件3排出，直到上面膜片21將各凹部4封閉起來為止。
第5圖(c)係顯示在剝離工序隨後的凹部。是利用振動組件8對於台架5施加振動。如第5圖(c)所示，從凹部4的周圍內面剝離後的多數個小細胞凝聚球狀體都聚集到凹部的底部中央。
剝離工序中作為剝離機構所使用的振動組件8是試管混合機8。如第4圖所示，將試管混合機8抵接在細胞培養裝置100的台架5的下面1分鐘，藉此，對於細胞培養袋1的各凹部4施加來自外部的物理性的刺激。試管混合機8是採用：振動速度為約2800轉/分；水平振動式之TAITEC株式會社製之型號6076881的試管混合機。
第5圖(d)係顯示從剝離工序起算15小時後的凹部。在剝離工序之後，將培養基注入袋本體2內，再度開始進行培養。如第5圖(d)所示，係在凹部4的底部中央形成一個細胞凝聚球狀體。
是以，根據本實施方式，既可防止細胞凝聚球狀體在凹部4之間移動，又可將細胞凝聚球狀體從內面剝離而聚集到一個地方。如此一來，可很有效率地在一個凹部4內只形成一個細胞凝聚球狀體，而可提高細胞凝聚球狀體的增殖暨分化誘導效率。
此外，即使一個凹部4內只形成一個細胞凝聚球狀體，而細胞凝聚球狀體又附著在凹部4的內面的情況下，只要再度將凹部4予以封閉，對於凹部4施加物理性的刺激，藉此，既可防止細胞凝聚球狀體在凹部4之間移動，又可將細胞凝聚球狀體從內面剝離而改變細胞凝聚球狀體所附著的部位，還是可以提高細胞凝聚球狀體的增殖暨分化誘導效率。
(第2實施方式)
其次，佐以第6圖來說明本發明的第2實施方式。第6圖中，係省略了一部分與第1實施方式相同的構成部分的圖示。
本實施方式，是第1實施方式所說明過的在封閉工序之後，所實施的剝離工序中，如第6圖(a)所示般地，將各凹部4保持在封閉的狀態下，針對於第1圖所示的每一個細胞培養裝置100都將細胞培養袋1進行上下反轉，來取代對於細胞培養袋的凹部4施加來自外部的物理性的刺激。
此外，在剝離工序中，亦可如第6圖(b)所示般地，將各凹部4保持在封閉的狀態下，針對於第1圖所示的每一個細胞培養裝置100都將細胞培養袋1進行傾斜，來取代對於細胞培養袋的凹部4施加來自外部的物理性的刺激。此外，細胞培養袋1之相對於水平面的傾斜角度，並未特別地限定，亦可傾斜到達例如：90度。
此外，在剝離工序中，亦可如第6圖(c)所示般地，將各凹部4保持在封閉的狀態下，針對於第1圖所示的每一個細胞培養裝置100都將細胞培養袋1進行上下反轉並且進行傾斜，來取代對於細胞培養袋的凹部4施加來自外部的物理性的刺激。
是以，本實施方式係利用：將培養袋1予以上下反轉及傾斜的其中至少一種簡單的操作，使得原本附著在凹部4的內面的細胞凝聚球狀體C，藉由重力而剝離，而且各凹部4是受到上面膜片21的封閉，因此，可以避免剝離後的細胞或細胞凝聚球狀體C移動到其他的凹部4。
又，本實施方式是很適合使用在：只要將細胞培養袋1予以上下反轉及傾斜的其中至少一種操作即可使得原本附著在細胞培養袋1的凹部4的內側的細胞及凝聚塊發生剝離的情況。
此外，細胞培養袋1係可藉由人手來進行上下反轉及傾斜的其中至少一種操作，亦可藉由機器手臂之類的機構來進行上下反轉及傾斜的其中至少一種操作。
又，在上述第1實施方式的剝離工序中，亦可進一步地實施本實施方式的這種將細胞培養袋1進行上下反轉及傾斜的其中至少一種操作。又，在後述的第3及4實施方式的剝離工序中，亦可進一步地實施本實施方式的這種將細胞培養袋1進行上下反轉及傾斜的其中至少一種操作。
(第3實施方式)
其次，佐以第7圖來說明本發明的第3實施方式。第7圖中係省略了一部分與第1實施方式相同構成部分的圖示。
本實施方式，係在第1實施方式所說明過的封閉工序之後的剝離工序中，利用分別配置在複數個凹部4的下方之上頂構件9，從下方將各凹部往上頂，以對於各凹部4施加物理性的刺激，來取代對於細胞培養袋的凹部4施加振動或搖動。
上頂構件9是利用致動器(未圖示)而可在形成於台架5的載置面5a的開口部5b內進行上下移動。朝下側呈凸狀彎曲的球面狀的凹部4的底部，受到上頂構件9往上頂時，將會使其膨凸面反轉成朝上側彎曲成凸狀。藉由將凹部4往上頂，來使得原本附著在凹部4的內面的細胞凝聚球狀體C發生剝離。
如果凹部4還是保持在往上側反轉的狀態的話，例如：在下一次將培養基注入袋本體2內之後，利用按壓構件6等對於袋本體2進行按壓而使得袋本體2的內壓上昇，就可使其恢復成原本之朝下側彎曲成凸狀之球面狀的形狀。此外，例如：將往上側反轉後的凹部4從下側進行吸引，也可以使其恢復凹部4原本的形狀。
此外，第7圖所示的例子，上頂構件9是將全數的凹部4同時往上頂，但上頂構件亦可選擇性地只將其中一部的凹部4往上頂。
此外，亦可利用一個上頂構件9依序地將凹部4一個一個地往上頂。這種情況下，致動器(未圖示)不僅要具有：可將上頂構件9予以上下移動的功能，還必須具有：可將上頂構件朝水平方向移動，並且依序地定位在所期望的凹部4的下方的功能。
此外，亦可在利用上頂構件9將凹部4往上頂的同時，也對於細胞培養袋1施加振動或搖動來對於凹部4施加物理性的刺激，來使得原本附著在凹部4的內面的細胞凝聚球狀體C發生剝離。
是以，即使是使用細胞培養袋1來進行細胞的培養，亦可既防止細胞凝聚球狀體C在凹部4之間移動，又可改變細胞凝聚球狀體C在凹部4內的附著位置。如此一來，係可提高細胞的培養暨分化誘導效率。
(第4實施方式)
其次，佐以第8圖來說明本發明的第4實施方式的細胞培養方法及裝置。
本實施方式的細胞培養裝置的構造，係可採用與第2實施方式的細胞培養裝置相同的構造。本實施方式，係在第1實施方式所說明過的封閉工序之後，選擇性地將不要的細胞凝聚球狀體C1予以排除。
如第8圖(a)所示，剝離工序，係將封閉後的複數個凹部4的其中一部分的凹部內的細胞凝聚球狀體C1選擇性地予以剝離。本實施方式中也是採用與第1實施方式相同的剝離機構。
其次，如第8圖(b)所示，解除工序，係利用泵浦從袋口構件3將培養基注入袋本體2內，藉此，來解除上面膜片21對於凹部4的封閉。凹部4的封閉被解除後的結果，剝離後的細胞凝聚球狀體C1就成為可流出到該凹部4的外部的狀態。
其次，如第8圖(c)所示，排出工序，是利用泵浦從袋口構件3排出袋本體2內的培養基，藉此，可將選擇性地剝離後的細胞凝聚球狀體C1與培養基S一起排出到外部。如此一來，即可將不要的細胞凝聚球狀體C1選擇性地剝離之後予以除去。
除了將不要的細胞凝聚球狀體C1選擇性地剝離和除去之外，沒有被選擇到的其他的凹部4內的細胞凝聚球狀體C，還是分別附著在各凹部4的內面，因此並未被從袋口構件3排出。
此外，本實施方式雖然是選擇了不要的細胞凝聚球狀體C1，但所選擇的細胞凝聚球狀體並不限定於不要的細胞凝聚球狀體C1，例如：亦可當作抽出取樣來進行選擇。又，亦可將兩個以上的凹部4內的細胞凝聚球狀體選擇性地予以剝離。
(第5實施方式)
其次，佐以第9圖來說明本發明的第5實施方式。
本實施方式的細胞培養裝置的構造，係可採用與第4實施方式的細胞培養裝置相同的構造。
本實施方式，是在第4實施方式所說明過的排出工序中，係在將細胞培養袋1予以上下反轉，且將細胞培養袋1予以傾斜成使得袋口構件3位於較之複數個凹部4更下方的狀態下，選擇性地將剝離後的細胞凝聚球狀體C1與培養基S一起從袋口構件3排出到袋本體2的外部。
此外，也可以是不要將細胞培養袋1傾斜，而是在只將細胞培養袋1予以上下反轉的狀態下，將剝離後的細胞凝聚球狀體C1與培養基S一起從袋口構件3排出到袋本體2的外部。
又，本實施方式是很適合使用在：只是將細胞培養袋1予以上下反轉並不會使得原本附著在細胞培養袋1的凹部4的內側的細胞及凝聚塊發生剝離的情況。
又，將細胞培養袋1予以上下反轉及傾斜的其中至少一種的操作，係可在排出工序中實施，也可以在排出工序之前的階段中實施。
是以，藉由將細胞培養袋1予以上下反轉，在剝離工序中可將選擇性地剝離後的細胞凝聚球狀體C1往凹部4的外部移動，而可很容易從袋口構件3排出。此外，只要將細胞培養袋1傾斜而使袋口構件3位於較之複數個凹部4更下方的位置的話，即可很容易讓剝離後的細胞凝聚球狀體C1從袋口構件3排出。
以上，是就本發明說明了其較佳的實施方式，但是本發明並不限定於前述的實施方式，只要是在本發明的範圍內亦可進行各種變更實施。在前述的實施方式中，係使用了棒狀的上頂構件，但是上頂構件的形狀並不限定於此。又，在上述的實施方式中，雖然是說明了以按壓構件來按壓上面膜片的例子，但本發明亦可將按壓構件予以省略。
又，在上述的實施方式中，雖然是說明了將附著在細胞培養袋的凹部的內面的細胞凝聚球狀體予以剝離的例子，但是本發明也可以適用在將尚未形成細胞凝聚球狀體的細胞，從細胞培養袋的凹部的內面予以剝離的情況。

[產業上的可利用性]
本發明係適合作為可有效率地培養各種細胞的技術來利用。
本說明書中所記載的文獻以及作為本申請案的優先權基礎的日本申請案的說明書的內容，全部都予以援用到本說明書。
1‧‧‧細胞培養袋
2‧‧‧袋本體
20‧‧‧周邊部
21‧‧‧上面膜片
21a‧‧‧頂面部分
21b‧‧‧傾斜部分
22‧‧‧下面膜片
3‧‧‧袋口構件
4‧‧‧凹部(凹坑)
5‧‧‧台架
5a‧‧‧載置面
5b‧‧‧開口部
6‧‧‧按壓構件
6a‧‧‧底面
7‧‧‧支承機構
71‧‧‧框架
72‧‧‧導引銷
73‧‧‧彈推機構(磁鐵)
8‧‧‧振動組件(試管混合機)
9‧‧‧上頂構件
100‧‧‧細胞培養裝置
C、C’、C1‧‧‧細胞或細胞的凝聚塊(細胞凝聚球狀體)
S‧‧‧培養基
第1圖(a)是顯示本發明的實施方式所使用的細胞培養袋的概略之俯視圖；第1圖(b)是顯示本發明的實施方式所使用的細胞培養袋的概略之側面圖；第1圖(c)是顯示本發明的實施方式所使用的細胞培養袋的概略之仰視圖。
第2圖(a)是本發明的第1實施方式的細胞培養裝置之剖面示意圖，係顯示按壓構件往上升起的狀態；第2圖(b)是本發明的第1實施方式的細胞培養裝置之剖面示意圖，係顯示按壓構件往下降低的狀態。
第3圖(a)是顯示本發明的第1實施方式的細胞培養中的狀態之剖面示意圖；第3圖(b)是顯示本發明的第1實施方式中的封閉工序的細胞培養袋之剖面示意圖。
第4圖係用來說明本發明的第1實施方式的剝離工序的細胞培養袋之剖面示意圖。
第5圖(a)係顯示細胞播種後的一個凹部內的照片，係顯示出從播種起算48個小時後的凹部內；第5圖(b)係顯示細胞播種後的一個凹部內的照片，係顯示封閉工序後的凹部內；第5圖(c)係顯示細胞播種後的一個凹部內的照片，係顯示剝離工序隨後的凹部內；第5圖(d)係顯示細胞播種後的一個凹部內的照片，係顯示從剝離工序起算15個小時後的凹部內。
第6圖(a)係用來說明本發明的第2實施方式的細胞培養袋之剖面示意圖，係顯示將其上下反轉後的細胞培養袋；第6圖(b)係用來說明本發明的第2實施方式的細胞培養袋之剖面示意圖，係顯示將其傾斜後的細胞培養袋；第6圖(c)係用來說明本發明的第2實施方式的細胞培養袋之剖面示意圖，係顯示將其上下反轉且傾斜後的細胞培養袋。
第7圖係用來說明本發明的第3實施方式的剝離工序的細胞培養袋之剖面示意圖。
第8圖(a)係用來說明本發明的第4實施方式的細胞培養方法的細胞培養袋之剖面示意圖，係顯示剝離工序；第8圖(b)係用來說明本發明的第4實施方式的細胞培養方法的細胞培養袋之剖面示意圖，係顯示解除工序；第8圖(c)係用來說明本發明的第4實施方式的細胞培養方法的細胞培養袋之剖面示意圖，係顯示排出工序。
第9圖係用來說明本發明的第5實施方式的細胞培養方法的細胞培養袋之剖面示意圖。
第10圖係顯示細胞附著於細胞培養袋的凹部的內面的複數個地方的狀態時的細胞培養袋之剖面示意圖。
第11圖(a)係顯示細胞凝聚球狀體被從細胞培養袋內的凹部剝離後的狀態時的細胞培養袋之剖面示意圖；第11圖(b)係顯示在細胞培養袋內剝離後的細胞凝聚球狀體在凹部之間移動後的狀態時的細胞培養袋之剖面示意圖。

Claims (15)

  1. 一種細胞培養方法，係使用具有：由將周邊部密封起來的上面膜片及下面膜片所構成的袋本體、安裝在前述袋本體的袋口構件，且在前述下面膜片形成有複數個凹部之細胞培養袋的細胞培養方法，其特徵為，係具有： 將收容在前述袋本體內的培養基從前述袋口構件排出之後，以前述上面膜片將前述複數個凹部予以封閉之封閉工序； 針對於被封閉後的前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，將附著在該凹部的內面的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離之剝離工序。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的細胞培養方法，其係在前述剝離工序中，針對於被封閉後的前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，從前述細胞培養袋的外部對於前述凹部施加物理性的刺激，而將附著在該凹部的內面的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的細胞培養方法，其係在前述剝離工序中，針對於前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，施加振動或搖動。
  4. 如申請專利範圍第2項或第3項所述的細胞培養方法，其係在前述剝離工序中，針對於前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，從外側進行頂撞。
  5. 如申請專利範圍第1項至第3項之任一項所述的細胞培養方法，其係在前述剝離工序中，維持在將前述複數個凹部封閉的狀態下，執行：將前述細胞培養袋上下反轉及將其傾斜的至少其中一項動作。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項之任一項所述的細胞培養方法，其係在前述剝離工序中，選擇性地將前述複數個凹部的其中一部分的凹部內的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離， 接續在前述剝離工序之後，又具有： 從前述袋口構件將培養基注入前述袋本體內，然後解除以前述上面膜片將前述複數個凹部加以封閉的狀態之解除工序； 將於前述剝離工序中，選擇性地剝離後的細胞或細胞的凝聚塊與培養基一起從前述袋口構件排出到前述袋本體的外部之排出工序。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的細胞培養方法，其係在前述排出工序中，在將前述細胞培養袋上下反轉的狀態下，將前述選擇性地剝離後的細胞或細胞的凝聚塊與培養基一起從前述袋口構件排出到前述袋本體的外部。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的細胞培養方法，其係在前述排出工序中，在以將前述袋口構件位於前述複數個凹部的更下方的方式，使前述細胞培養袋傾斜的狀態下，將前述選擇性地剝離後的細胞或細胞的凝聚塊與培養基一起從前述袋口構件排出到前述袋本體的外部。
  9. 如申請專利範圍第1項至第3項之任一項所述的細胞培養方法，其係在前述封閉工序中，利用按壓構件從上方來按壓前述上面膜片。
  10. 一種細胞培養裝置，係使用具有：由將周邊部密封起來的上面膜片及下面膜片所構成的袋本體、安裝在前述袋本體的袋口構件，且在前述下面膜片形成有複數個凹部之細胞培養袋的細胞培養裝置，其特徵為，係具備： 具有供載置前述細胞培養袋的載置面之台架； 在利用前述上面膜片將前述複數個凹部密封之前，用來將收容在前述袋本體內的培養基從前述袋口構件予以排出的輸液機構； 針對於封閉後的前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，將附著於該凹部的內面的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離的剝離機構。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的細胞培養裝置，其中，前述剝離機構，針對於封閉後的前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，為了將附著於該凹部的內面的細胞或細胞的凝聚塊予以剝離，乃從前述細胞培養袋的外部對於該凹部施加物理性的刺激。
  12. 如申請專利範圍第10項或第11項所述的細胞培養裝置，其中，前述剝離機構，係對於前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，施加振動或搖動。
  13. 如申請專利範圍第10項或第11項所述的細胞培養裝置，其中，前述剝離機構，係具備： 對於前述複數個凹部的其中一部分或全部的凹部，從下方往上頂的上頂構件； 可使前述上頂構件進行上下移動的致動器； 而在前述台架的前述載置面，則形成有可供前述上頂構件進行上下移動的開口部。
  14. 如申請專利範圍第10項或第11項所述的細胞培養裝置，其中，前述剝離機構係將附著在前述複數個凹部的其中一部分的凹部的內面的細胞進行選擇性地剝離， 前述輸液機構，係從前述袋口構件將培養基注入前述袋本體內之後，解除前述上面膜片對於前述複數個凹部的封閉狀態，然後，將被前述剝離機構選擇性地剝離後的細胞或細胞的凝聚塊與培養基一起從前述袋口構件排出到前述袋本體的外部。
  15. 如申請專利範圍第10項或第11項所述的細胞培養裝置，其中，還具備：從上方來按壓前述細胞培養袋的前述上面膜片的按壓構件。
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