TW201928064A

TW201928064A - B型肝炎病毒之突變分析方法及其應用

Info

Publication number: TW201928064A
Application number: TW107146397A
Authority: TW
Inventors: 威廉格蘭特哈特利艾伯特
Original assignee: 紐西蘭商紐西蘭健康創新中心管理有限公司
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2019-07-16
Also published as: CN111465703A; WO2019123398A1

Abstract

基於B型肝炎病毒基因體之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以測定個體之肝臟發炎狀態、或鑑定個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的方法，及其相關系統、套組、測量工具、試劑、裝置、電腦可讀取之媒體、寡核苷酸引子對、設備，以及前述之應用，其中該個體係感染B型肝炎病毒基因型A、B或C。

Description

B型肝炎病毒之突變分析方法及其應用

本發明係關於測定一個體之肝臟發炎狀態、測定一個體中B型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的方法，及其相關系統、套組、用途、裝置、電腦可讀取之媒體及設備，其中該個體係感染B型肝炎病毒基因型A、基因型B或基因型C。

慢性B型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）係一種因B型肝炎病毒於一感染B型肝炎病毒之患者的肝細胞中大量複製而導致的慢性肝臟發炎。若未治療，慢性B型肝炎會導致肝臟併發症，包括發炎、硬化、肝衰竭及肝癌。現代抗病毒治療如於活動性肝臟發炎（active liver inflammation）病患中抑制B型肝炎病毒的複製，可降低肝硬化、肝衰竭及肝癌的機率。該些治療亦可逆轉先前存在的肝損傷。

藉由規律的血液檢測以測量血清丙胺酸轉胺酶（alanine amino transferase，ALT；當肝損傷發生時會被釋放至血液中的一種肝臟酵素，表示肝臟發炎），來監測B型肝炎病毒感染之病患。對於血清ALT值提升之病患，抗病毒治療的開始實質上降低了未來肝臟併發症的風險。然而，對於部分病患，肝臟發炎及CHB係於血清ALT值未提高的情況下發展。因此，該些病患存在通常無法治療的晚期疾病。

為了檢測或監測B型肝炎病毒感染之病患的肝臟發炎、鑑定B型肝炎病毒感染之病患對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、檢測B型肝炎病毒感染之病患對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險、及∕或為B型肝炎病毒感染之病患做關於抗病毒治療之臨床決定提供資訊，對於一替代的實驗室檢測係有持續需求。

本發明之一目的在於滿足一或更多個該些需求，或至少提供大眾一有用的選擇。

在一方面，本發明係關於一種測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的方法，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框（S open reading frame，S ORF）的B型肝炎病毒，且該方法係包含：
(a) 基於一相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列，獲得關於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息，以測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
(b) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體的肝臟發炎狀態、或該B型肝炎病毒的基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險。

在另一方面，本發明係關於一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的系統，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該系統係包含：
(a) 一測量工具，其係對於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息進行分析，以測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
(b) 一處理器；
(c) 一電腦可讀取之媒體；以及
(d) 一分析工具，其係儲存在適於被該處理器執行的該電腦可讀取之媒體中，以基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，進而基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險；
該步驟（a）之分析或該步驟（d）之測定係基於一相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列。

於一實施態樣中，該系統係包含一用於測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率的測量工具，其中該測量工具係包含一或更多個標靶至或基於S開放閱讀框參考序列的寡核苷酸引子，且該S開放閱讀框參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型。

於一實施態樣中，該系統包含一用於測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率的測量工具，其中該測量工具係包含一或更多個標靶至S開放閱讀框參考序列的寡核苷酸引子，且該S開放閱讀框參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型。

於一實施態樣中，該系統係包含一用於測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率的測量工具，其中該測量工具係包含一或更多個基於S開放閱讀框參考序列的寡核苷酸引子，且該S開放閱讀框參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型。

於另一實施態樣中，該系統係包含一對於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息的測量工具，以及該分析工具係適於選擇一相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列，且將該測量工具產生之序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率。

在另一方面，本發明係關於一種測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的方法，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該方法係包含，
藉由一種包含如下步驟之方法測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，包含：
(a) 提供關於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息；
(b) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(c) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
(d) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險。

在又一方面，本發明係關於一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的系統，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該系統係包含：
(a) 一測量工具，其對於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息；
(b) 一處理器；
(c) 一電腦可讀取之媒體；以及
(d) 一分析工具，其係儲存在適於被該處理器執行的電腦可讀取之媒體中，藉由執行如下步驟以測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
(i). 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(ii). 將該測量工具所產生之序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
(iii). 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險。

在又一方面，本發明係關於一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的套組，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該套組係包含：
(a) 一寡核苷酸引子對，其係用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物，
該引子對包含：
(i). 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及
(ii). 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且包含核苷酸100至2000；
(b) 增幅試劑（amplication reagents）；
(c) 一分析工具，其係用於在一處理器上執行如下步驟以測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
(i). 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(ii). 將藉由一測量工具產生之關於該擴增引物中至少一部分之該S開放閱讀框區域的序列信息，與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
(iii). 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險；或者
(d) 前述(a)至(c)中任何二或更多者的任何組合。

在又一方面，本發明係關於一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的套組，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該套組係包含：
(a) 一寡核苷酸引子對，其係用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物，
該引子對包含：
(i). 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及
(ii). 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且包含核苷酸100至2000；
(b) 增幅試劑；
(c) 一或更多個核苷酸探針，其係雜交至該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中的特定核苷酸序列，以對於存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息；
(d) 一分析工具，其係用於在一處理器上執行如下步驟以測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
(i). 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(ii). 將藉由一測量工具產生之關於該擴增引物中至少一部分之該S開放閱讀框區域的序列信息、或藉由一或更多個核苷酸探針產生的序列信息，與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
(iii). 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險；或者
(e) 前述(a)至(d)中任何二或更多者的任何組合。

在另一方面，本發明係關於一種對於存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息的測量工具於製備一系統的用途，其中該系統係用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症的發展風險，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，
其中，該測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症的發展風險係藉由如本文所述之方法進行，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒。

在又一方面，本發明係關於一種對於存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息的試劑於製備一套組或系統的用途，其中該套組或系統係用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症的發展風險，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，
其中，該測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症的發展風險係藉由如本文所述之方法進行，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒。

在另一方面，本發明係關於一種用於測定一個體中B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率的裝置，其中該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該裝置係包含：
(a) 一記憶體，其係儲存指令；以及
(b) 一處理器，其係自該記憶體中檢索指令並執行該指令，
(i) 藉由如下步驟來測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
將關於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
基於該每2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率。

在又一方面，本發明係關於一種具有指令儲存於其中的電腦可讀取之媒體，其中，當該電腦可讀取之媒體被一處理器執行時，其會使得該處理器進行實施方法的操作，以測定於一個體中B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，其中該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒的個體，該方法係包含如下步驟：
選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
將關於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息，與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率。

在另一方面，本發明係關於一種使用一寡核苷酸引子對於製備一套組或系統的用途，其中該寡核苷酸引子對係用於放大存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒的S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物，且其中該套組或系統係用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，
該引子對係包含：
(a) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及
(b) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且包含核苷酸100至2000，
其中，該測定該個體之肝臟發炎狀態、或測定該個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定該個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的易感性、或檢測該個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險係藉由如本文所述之方法進行。

在另一方面，本發明係關於一種使用一或更多個核苷酸探針於製備一套組或系統的用途，其中該一或更多個核苷酸探針係雜交至B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中的特定核苷酸序列，以對於存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息，且其中該套組或系統係用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，
其中，該測定該個體之肝臟發炎狀態、或測定該個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定該個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的易感性、或檢測該個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險係藉由如本文所述之方法進行。

在又一方面，本發明係關於一種使用如下述物件於製備一系統之用途：
(a) 一測量工具，其對於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息；
(b) 一處理器；
(c) 一電腦可讀取之媒體；以及
(d) 一分析工具，其係儲存在適於被該處理器執行的電腦可讀取之媒體中，藉由執行如下步驟以測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
將該測量工具所產生之序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，
其中，該系統係用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的易感性、或一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒。

在另一方面，本發明係關於一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險的設備，其中該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該設備係包含：
(a) 用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的元件，以製造一擴增引物；
(b) 用於自該擴增引物產生序列信息的元件；以及
(c) 用於測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率的元件，其係執行下列步驟：
(i) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(ii) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
(iii) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症、或該個體是否具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險。

在另一方面，本發明係關於一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險的設備，其中該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該設備係包含：
(a) 用於產生關於該個體感染之B型肝炎病毒之S開放閱讀框的序列信息的元件；以及
(b) 用於測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率的元件，其係執行下列步驟：
(i) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(ii) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
(iii) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症、或該個體是否具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險。

於一實施態樣中，該用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框以產生一擴增引物的元件係包含如本文所述之一寡核苷酸引子對。

於一實施態樣中，該用於產生序列信息的元件係一核苷酸定序儀。於另一實施態樣中，該用於產生序列信息的元件係包含一或更多個核苷酸探針以對於存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息，其中該核苷酸探針係雜交至該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中特定的核苷酸序列。

在另一方面，本發明係關於一種使用如下述物件於製備一系統之用途：
(a) 一寡核苷酸引子對，其係用於放大存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物，
該引子對包含：
(i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及
(ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且包含核苷酸100至2000；以及
(b) 一核苷酸定序儀，其係用於自該擴增引物產生序列信息；
(c) 一處理器；
(d) 一電腦可讀取之媒體；以及
(e) 一分析工具，其係儲存在適於被該處理器執行的電腦可讀取之媒體中，藉由執行下列步驟以測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
將該測量工具所產生之序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率；
其中，該系統係用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒。

在又一方面，本發明係關於一種使用如下述物件於製備一系統之用途：
(a) 一寡核苷酸引子對，其係用於放大存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒的S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物，
該引子對包含：
(i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及
(ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且包含該B型肝炎病毒基因體之核苷酸100至2000；以及
(b) 一增幅試劑；以及
(c) 一分析工具，其係儲存在適於被該處理器執行的電腦可讀取之媒體中，藉由執行下列步驟以測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
將該測量工具所產生之序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率；
其中，該系統係用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒。

在又一方面，本發明係關於一種使用如下述物件於製備一系統之用途：
(a) 一或更多個核苷酸探針，其係雜交至B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中特定核苷酸序列，以對於存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息；
(d) 一分析工具，其係儲存在適於被該處理器執行的電腦可讀取之媒體中，藉由執行下列步驟以測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
將該測量工具所產生之序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率；
其中，該系統係用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症的發展風險，且該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒。

在另一方面，本發明係關於一種監測一個體之治療反應、預估一個體之治療反應、選擇一個體之治療、測定一個體之治療的最佳時機、持續時間或方案，其中該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該方法係包含：
藉由包含如下步驟之方法測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
(i) 提供關於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息；
(ii) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(iii) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
(iv) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來監測免疫治療的反應、預估免疫治療的反應、選擇一治療、或測定治療的最佳時機、持續時間或方案。

於多個不同的實施態樣中，該治療係化學治療、藥物治療、免疫治療、基因治療、或前述任何二或更多者的組合。於一實施態樣中，該治療係免疫治療。

在另一方面，本發明係關於一種監測一個體之免疫治療反應、預估一個體之免疫治療反應、選擇一個體之治療、測定一個體之治療的最佳時機、持續時間或方案的方法，其中該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該方法係包含：
藉由包含如下步驟之方法測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
(i) 提供關於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息；
(ii) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(iii) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
(iv) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來監測免疫治療的反應、預估免疫治療的反應、選擇一治療、或測定治療的最佳時機、持續時間或方案。

除非另有規定或說明，否則本文所述之任何實施態樣或較佳實施態樣可以是關於本文所述之任一態樣、或本文所述任何態樣與任何一或多個實施態樣或較佳例之組合。

於一實施態樣中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B型肝炎病毒基因型B、B型肝炎病毒基因型C、或前述任何二或更多者之組合的S開放閱讀框的B型肝炎病毒。

於各種不同的實施態樣中，測定該S開放閱讀框區域中2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、35、40、45、50、55或60或更多個密碼子之非同義突變頻率，且各種不同的範圍可以被選自介於任何如下數值，舉例言之，從約2至約60、約2至約50、約2至約40、約2至約35、約2至約31、約2至約30、約2至約25、約2至約20、約2至約15、約2至約10、約2至約5、約3至約60、約3至約50、約3至約40、約3至約30、約3至約20、約3至約10、約4至約40、約4至約30、約4至約20、約4至約10、約5至約60、約5至約50、約5至約40、約5至約30、約5至約20、約5至約10、約7至約40、約7至約30、約7至約20、約7至約10、約10至約60、約10至約50、約10至約40、約10至約30、約10至約20、約10至約15、約20至約60、約20至約50、約20至約40、約25至約60、約25至約50、或約25至約40個B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的密碼子。

於各種不同的實施態樣中，測定0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32個密碼子之非同義突變頻率，且該密碼子係相應於SEQ ID NO：1至14任一者之S開放閱讀框參考序列的位置4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387及391的密碼子，以及各種不同的範圍可以被選自介於任何如下數值，舉例言之，從約0至約32、約0至約25、約0至約20、約2至約32、2至約25、約2至約20、約3至約32、約3至約25、約3至約20、約5至約32、約5至約25、約5至約20、約8至約31、約8至約25、約8至約20、約10至約32、約10至約25、約10至約20、約12至約32、約12至約25、約12至約20、約15至約32、約15至約25、或約15至約20的密碼子，且該密碼子係相應於SEQ ID NO：1至14任一者之S開放閱讀框參考序列的位置4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387及391的密碼子。

於各種不同的實施態樣中，測定2或更多個密碼子之非同義突變頻率，且該密碼子係相應於SEQ ID NO：1至14任一者、或任何二或更多之組合的S開放閱讀框參考序列的位置4、35、51、54、56、120、132、135、141、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、334、358、363、377、378、382及387的密碼子。於一實施態樣中，測定2或更多個密碼子之非同義突變頻率，且該密碼子係相應於SEQ ID NO：1至14任一者之S開放閱讀框參考序列的位置4、120、132、135及378的密碼子。

於一實施態樣中，測定在正向選擇壓力情況下2或更多個密碼子之非同義突變頻率。

在各種不同的實施態樣中，測定在一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域之中的2或更多個密碼子的非同義突變，且該一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域係相應於SEQ ID NO：1至14任一者之S開放閱讀框參考序列的密碼子1至400、1至350、1至300、1至250、1至200、1至150、1至100、1至50、50至400、50至350、50至300、50至250、50至200、50至150、50至100、100至400、100至350、100至300、100至250、100至200、100至150、150至400、150至350、150至300、150至250、150至200、200至400、200至350、200至300、200至250、250至400、250至350、250至300、300至400、300至350、或350至400。

於一實施態樣中，選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列係包含：
(a) 將該序列信息與一或更多個S開放閱讀框基因亞型參考序列進行比較，以測定該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型；以及
(b) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列。

於另一實施態樣中，選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列係包含：
(a) 提供關於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的信息；以及
(b) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列。

於各種不同的實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係
(a) SEQ ID NO: 1，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型A1時；
(b) SEQ ID NO: 2，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型A2時；
(c) SEQ ID NO: 3，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B1時；
(d) SEQ ID NO: 4，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B2時；
(e) SEQ ID NO: 5，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B3時；
(f) SEQ ID NO: 6，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B4時；
(g) SEQ ID NO: 7，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B5時；
(h) SEQ ID NO: 8，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C1時；
(i) SEQ ID NO: 9，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C2時；
(j) SEQ ID NO: 10，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C3a時；
(k) SEQ ID NO: 11，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C3b時；
(l) SEQ ID NO: 12，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C4時；
(m) SEQ ID NO: 13，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C5時；以及
(n) SEQ ID NO: 14，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C6時。

於一實施態樣中，該方法係包含選擇一段S開放閱讀框參考序列，且其中該S開放閱讀框參考序列包含相應於B型肝炎病毒基因型A、B或C之2、3、4、5、6、7、8、9、或10、或更多個基因亞型的序列；或者，該S開放閱讀框參考序列係包含相應於B型肝炎病毒基因型A、B或C之2、3、4、5、6、7、8、9、或10、或更多個基因亞型的序列。於一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係相應於所有B型肝炎病毒基因型A、B或C已知的基因亞型。

於各種不同的實施態樣中，對於一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息、或者一寡核苷酸引子對係放大一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，其中該一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域係包含該B型肝炎病毒之S開放閱讀框的至少約10、20、50、100、200、250、300、400、500、750、1000或1200個連續核苷酸，以及各種不同的範圍可以被選自介於任何如下數值，舉例言之，從約10至約1200、約200至約1200、約500至約1200、約750至約1200、或約1000至約1200個連續核苷酸。

於一實施態樣中，該方法係包含使用一寡核苷酸引子對來放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物，以及包含對於該擴增引物產生序列信息。

於一實施態樣中，該方法係包含添加該樣品或該擴增引物於一或更多個核苷酸探針，以產生該序列信息，其中該核苷酸探針係雜交至該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中特定核苷酸。

於一實施態樣中，該測量工具係包含一用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的寡核苷酸引子對，以製造一擴增引物。於一實施態樣中，該測量工具係包含一用於自該擴增引物或自該樣品中產生序列信息的核苷酸定序儀。於一實施態樣中，該測量工具係包含一用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的寡核苷酸引子對，以製造一擴增引物，以及包含一用於自該擴增引物產生序列信息的核苷酸定序儀。

於一實施態樣中，該測量工具係包含一或更多個雜交至B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中特定核苷酸的核苷酸探針，以自該樣品或該擴增引物產生序列信息。

於多個不同的實施態樣中，該寡核苷酸引子對係包含：
(a) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及
(b) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且包含該B型肝炎病毒基因體之核苷酸100至2000。

於各種不同的實施態樣中，
(a) 該寡核苷酸引子對係包含：
(i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，該參考序列係包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，該參考序列係包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及
(ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸100至2000；或者
(b) 該寡核苷酸引子對係包含：
(i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，該參考序列係包含核苷酸1800至3215，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，該參考序列係包含核苷酸1800至3221；以及
(ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸700至1800；或者
(c) 該寡核苷酸引子對係包含：
(i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸1500至2848；以及
(ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸700至1800；或者
(d) 該寡核苷酸引子對係包含：
(i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸1800至3215；以及
(ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸832至1800；或者
(e) 該寡核苷酸引子對係包含：
(i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸1800至2848；以及
(ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸832至1800；或者
(f) 該寡核苷酸引子對係包含：
(i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸2000至2848；以及
(ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係包含核苷酸832至1500；
其中，該B型肝炎病毒基因體參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒基因亞型的SEQ ID Nos：15至28任一者的序列。

於各種不同的實施態樣中，該正向引子係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5、6、7、8、9、10、12、15、17、18、20、25、30、35、40、45或50個連續核苷酸的序列，以及各種不同的範圍可以被選自介於任何如下數值，舉例言之，從約5至約50、約5至約30、約7至約30、約10至約30、約15至約30、約20至約30、約25至約30、約5至約25、約7至約25、約10至約25、約15至約25、約20至約25、約5至約20、約7至約20、約10至約20、約15至約20、約5至約15、約7至約15、約10至約15個一部分該B型肝炎病毒基因體的連續核苷酸。

於各種不同的實施態樣中，該反向引子係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、25、30、35、40、45或50個連續核苷酸的序列，以及各種不同的範圍可以被選自介於任何如下數值，舉例言之，從約5至約50、約5至約30、約7至約30、約10至約30、約15至約30、約20至約30、約25至約30、約5至約25、約7至約25、約10至約25、約15至約25、約20至約25、約5至約20、約7至約20、約10至約20、約15至約20、約5至約15、約7至約15、約10至約15個一部分該B型肝炎病毒基因體的連續核苷酸。

於各種不同的實施態樣中，該B型肝炎病毒參考序列係：
(a) SEQ ID NO: 15，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型A1時；
(b) SEQ ID NO: 16，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型A2時；
(c) SEQ ID NO: 17，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B1時；
(d) SEQ ID NO: 18，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B2時；
(e) SEQ ID NO: 19，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B3時；
(f) SEQ ID NO: 20，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B4時；
(g) SEQ ID NO: 21，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B5時；
(h) SEQ ID NO: 22，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C1時；
(i) SEQ ID NO: 23，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C2時；
(j) SEQ ID NO: 24，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C3A時；
(k) SEQ ID NO: 25，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C3B時；
(l) SEQ ID NO: 26，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C4時；
(m) SEQ ID NO: 27，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C5時；以及
(n) SEQ ID NO: 28，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C6時。

於一實施態樣中，該方法係包含使用2或更多個引子以放大至少一部分該包含2或更多個密碼子之S開放閱讀框區域，其中該2或更多個引子係分別包含或係互補於SEQ ID Nos：1至14任一者之S開放閱讀框參考序列的5或更多個連續核苷酸。於一實施態樣中，一或更多個引子係經設計以特異性地黏著（anneal）至該欲測定其非同義突變頻率之S開放閱讀框參考序列的野生型密碼子。於一實施態樣中，一或更多個引子係經設計以特異性地黏著至一包含非同義突變之S開放閱讀框參考序列的密碼子。

於一實施態樣中，基於一相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列，對於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息係使用擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）進行測定，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率。

於各種不同的實施態樣中，該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中的該非同義突變頻率係指：
(a) 該個體具有一陽性肝臟發炎狀態；
(b) 該B型肝炎病毒係進行一正向選擇壓力（positive selection pressure）；
(c) 該個體係易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症、或者具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險；或者
(d) 前述(a)至(c)中任何二或更多者的任何組合。

於各種不同的實施態樣中，該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中的該非同義突變頻率係藉由下述步驟定義：
(a) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；
(b) 基於該密碼子之非同義突變頻率以分派給各密碼子一數值得分；
(c) 結合各密碼子的數值得分以提供一表示該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率的結合數值得分。

於各種不同的實施態樣中，一正向數值得分係被分派給各具有至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%或至少約50%之非同義突變頻率的密碼子。於各種不同實施態樣中，該各密碼子之正向得分獨立地為0.5、1、1.5、2或2.5。

於各種不同的實施態樣中，該代表B型肝炎病毒之S開放閱讀框中非同義突變頻率的結合數值得分大於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10係指：
(a) 該個體具有一陽性肝臟發炎狀態；
(b) 該B型肝炎病毒係進行一正向選擇壓力；
(c) 該個體係易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或者具有提高的前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險；或者
(d) 前述(a)至(c)中任何二或更多者的組合。

於各種不同的實施態樣中，該個體係：
(a) HBeAg陰性；
(b) 具有正常血清ALT值；
(c) 具有一高於約2,000 IU∕毫升的血清HBV-DNA效價；或者
(d) 具有前述(a)至(c)中任何二或更多者的組合。

於另一實施態樣中，該個體係HBeAg陽性、或具有提高的血清ALT值、或係HBeAg陽性且同時具有提高的血清ALT值。

於各種不同的實施態樣中，該慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症係包含肝硬化、肝癌、肝衰竭、肝臟發炎、肝損害、肝功能異常、或前述二或更多者的組合。

本說明書中所用術語「包含（comprising）」意指「至少部分由……組成（consisting at least in part of）」。當解釋本說明書中包括術語「包含（comprising）」之每一陳述時，亦可能存在除由該術語修飾之彼或彼等特徵之外的特徵。例如「包含（comprise及comprised）」等相關術語應以相同的方式理解。

廣義而言，本發明亦係在於單獨地或共同地在本申請案之說明書中引用或指出的部分、元件及特徵、以及任何二或更多個所述部分、元件或特徵之任何或所有組合，並且當在本文中提及特定整數（specific integers）情形中，該特定整數於本發明所屬領域中所具有之習知等同物被視為如同單獨闡述一樣併入本文中。

本文中引用之數字範圍（例如，1至10）亦意欲包括對該範圍內之所有有理數之引用（例如，1、1.1、2、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9及10）以及該範圍內之任何有理數範圍（例如，2至8、1.5至5.5及3.1至4.7），因此，本文明確揭露之所有範圍的所有子範圍皆特此明確揭露。該些僅係為具體提出的數字範圍之實例，並且所列舉的最低值與最高值之間數值的所有可能組合應被視為在此申請案中以類似的方式明確說明。

於本說明書中提及其他專利說明書、外部文獻或資訊來源係為了討論本發明特徵之背景。除非另有明確說明，否則文中提及的此等外部文獻或資訊來源不應被視為先前技術，或構成本發明所屬領域通常知識的一部分。

自以下僅藉由舉例說明及參考附圖給出之描述可明瞭本發明之其他方面。

本案發明人已鑑定出在正向選擇壓力下B型肝炎病毒之S開放閱讀框中的密碼子。本案發明人意外地證實基於該在正向選擇壓力下的密碼子之非同義突變頻率來測定整個B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率係有助於在感染B型肝炎病毒之病人中檢測或預估早期肝臟發炎及∕或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的提高的發展風險。於此，本發明係關於一種測定一個體之肝臟發炎狀態、測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的方法，其中該個體係感染基因型A、B或C之B型肝炎病毒，且該方法係藉由測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中2或更多個密碼子之非同義突變頻率。本發明亦提供相關系統、套組、測量工具、試劑、裝置、電腦可讀取之媒體、寡核苷酸引子對及設備，以及前述之用途。
1. 定義

本文中用語「包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒（an HBV comprising an S ORF of HBV genotype A, B or C）」係指一B型肝炎病毒，其係包含一實質上相應於B型肝炎病毒基因型A、B或C任一者之基因亞型S開放閱讀框區域的S開放閱讀框。其中，包括包含一B型肝炎病毒，其係包含一具有與本文所述B型肝炎病毒基因亞型A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3A、C3B、C4、C5及C6任一者之S開放閱讀框參考序列一致的基本序列（substantial sequence）的S開放閱讀框。且其中，亦包括一B型肝炎病毒，其係包含一具有任何B型肝炎病毒基因型A、B或C尚未分類或尚未鑑定之基因亞型的S開放閱讀框共有序列（consensus sequence）一致的基本序列的S開放閱讀框區域。於各種不同的實施態樣中，該B型肝炎病毒所具有的S開放閱讀框係具有至少約70%、75%、80%、90%、95%、或至少99%序列與本文所述S開放閱讀框參考序列一致。於一實施態樣中，該S開放閱讀框之核苷酸序列係實質上與本文所述之S開放閱讀框參考序列一致，但有一或更多個同義取代（synonymous substitutions）。

本文所使用之術語「插入∕缺失（indel）」係指於該野生型B型肝炎病毒基因體中一或更多個核苷酸的插入（insertion）或刪除（deletion）。

本文所使用之術語「非同義突變（non-synonymous mutation）」係指一B型肝炎病毒S開放閱讀框序列之單一核苷酸突變導致該密碼子編碼出與一野生型、共有的、或參考的B型肝炎病毒S開放閱讀框序列中相同位置密碼子編碼之胺基酸不同的胺基酸。

本文所使用之術語「同義突變（synonymous mutation）」或「同義取代（synonymous substitution）」係指於一B型肝炎病毒S開放閱讀框序列中單一核苷酸的突變或取代，且其係導致密碼子編碼出與一野生型、共有的、或參考的B型肝炎病毒S開放閱讀框序列中相同位置密碼子編碼之胺基酸相同的胺基酸。

本文所使用之術語「引子（primer）」係指一股短鏈核苷酸，其係包含雜交於模板DNA序列且作為聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）起始點的10或更多個核苷酸的序列。為用於本文所述之PCR反應中，一合適的正向引子係包含該B型肝炎病毒基因體之非模板股（non-template strand，亦稱為正股（plus strand）或有義股（sense strand））序列的至少約5個連續核苷酸的序列。該正向引子係與該B型肝炎病毒基因體之模板股（template strand，亦稱為負股（minus strand）或反義股（antisense strand））結合。為用於本文所述之PCR反應中，一合適的反向引子係包含該B型肝炎病毒基因體之模板股（亦稱為負股或反義股）序列的至少約5個連續核苷酸。該反向引子係與該B型肝炎病毒基因體之非模板股（亦稱為正股或有義股）結合。

本文中用語「正向選擇壓力下（under positive selection pressure）」係指B型肝炎病毒之S開放閱讀框中的密碼子處於非同義取代的機率超過預期藉由隨機進行的機率。密碼子演化之取代機率可使用本領域習知方法測定，包括如本文實施例中所述之方法。舉例言之，取代機率可藉由如下方法而推知：建構自一或更多個受試者獲得之B型肝炎病毒的S開放閱讀框序列的親緣關係（phylogenies），並使用如最大似然親緣分析（Phylogenetic Analysis of Maximum Likelihood，PAML）等方法估計親緣關係樹（phylogenetic tree）中在正向選擇壓力下密碼子之總體比例。

所謂術語「基因型（genotype）」、「基因亞型（subgenotype）」及「基因亞亞型（sub-subgenotype）」（以及相關分類）係指在病毒演化時發生之B型肝炎病毒於基因上不同的組別。本領域目前公認之該些組別的共有的、野生型核苷酸序列係如本文所描述。該等術語將包括任何未來公認之新基因型、新基因亞型、新基因亞亞型。

「個體」係指為哺乳類的脊椎動物，例如：人類。

本文中用語「慢性B型肝炎病毒（CHB）感染之肝臟併發症」及相關術語係廣義地關於任何由慢性B型肝炎病毒感染造成之肝臟病變或病情，包括但不限於，肝臟發炎、肝損害、肝功能異常、肝硬化、肝癌（例如：肝細胞癌（hepatocellular carcinoma））、及肝衰竭。

本文所使用之術語「及∕或（and/or）」意指「及（and）」、或「或（or）」、或二者。

本文所使用之跟隨一名詞的複數形式「等」意指該名詞之複數形式及／或單數形式。

本文所使用有關於基因體序列、S開放閱讀框序列及其密碼子、特定B型肝炎病毒基因型、基因亞型或基因亞亞型之胺基酸序列的術語「野生型（wild-type）」係指該B型肝炎病毒基因型、基因亞型或基因亞亞型之公認的共有序列或密碼子。
2. B 型肝炎病毒基因體

B型肝炎病毒係一屬於肝病毒（Hepadnaviridae ）科的DNA病毒。

B型肝炎病毒之環狀基因體係被包覆於一蛋白質核心中，且為部分雙股。該基因體係由一非編碼負（模板）股組成，且聚合酶蛋白係附於其5’端。該負股之3’終端核苷酸係重疊於該5’序列。該正編碼股長度通常為1700至2800個核苷酸，以及該正股之5’序列係橋接負股之3’及5’端間的空隙。進入肝細胞之細胞核時，此二股皆會完全形成一環狀、雙股基因體，稱為共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）。該基因型B或基因型C之cccDNA長度為3,215個核苷酸。該基因型A之cccDNA長度為3,221個核苷酸。cccDNA係含有4個重疊的開放閱讀框（open reading frames，ORF）。該C開放閱讀框係編碼該核心蛋白（core protein）及該HBeAg之P25前驅蛋白。該X開放閱讀框係被預期為編碼一轉錄反式激活蛋白（transcriptional transactivator）。該S開放閱讀框係編碼成熟病毒體之3個外殼蛋白（envelope protein），以及該P開放閱讀框係編碼與B型肝炎病毒基因體複製相關些許功能的蛋白。

B型肝炎病毒之序列於各長期感染個體中具有實質上的變異。這些序列變異的保留模式允許大部分B型肝炎病毒可被分類為廣義的組別，稱為基因型、基因亞型及基因亞亞型。截至今日，有9種B型肝炎病毒之基因型被定義於人類群組中，稱為基因型A、B、C、D、E、F、G、H及I，且其係藉由核苷酸取代之單倍體基因型（haplotypes）於至少8%之核苷酸序列中進行區分。該些基因型因地域分布不同且遍及全球，及亦具有致病的能力。舉例言之，基因型C之B型肝炎病毒主要發生於東亞及太平洋地區，以及有極高的機率演變為肝硬化及肝癌。

各基因型內第二級的變異稱為基因亞型。該些基因亞型亦因其地域分布而不同。常見的B型肝炎病毒之基因型A、B及C的基因亞型為A1及A2；B1、B2、B3、B4及B5；以及，C1、C2、C3、C4、C5及C6。此外，基因亞型C3的二種基因亞亞型曾於東加（Tonga）被描述，稱為基因亞亞型C3A及C3B。鑒於B型肝炎病毒序列仍持續被鑑定出含有無法與習知基因亞型或基因亞亞型相匹配之固定核苷酸取代的單倍體基因型，未來很可能會鑑定出更多的基因亞型或更多的基因亞亞型。

定義B型肝炎病毒之基因型、基因亞型及基因亞亞型的部分序列變異發生於S開放閱讀框。故，為測定S開放閱讀框中非同義突變頻率，必須選擇如下所述相應於一個體之病毒的基因亞型的S開放閱讀框參考序列，以使用本發明之方法進行分析。

於B型肝炎病毒序列中變異的其他來源為來自感染同一位病患之不同基因型的二種病毒的基因材料重組。該些狀況最常被鑑定為基因型B∕C、基因型C∕D、或基因型A∕D。最後，B型肝炎病毒之優勢序列將隨著時間於病患內改變，隨之產生選擇壓力及基因漂移（genetic drift）。個體間的變異可包括於定義基因型、基因亞型及基因亞亞型之單倍體基因型中核苷酸的突變。

B型肝炎病毒基因亞型A1及A2之基因體的共有核苷酸序列分別係如SEQ ID NOs: 15及16所說明。

B型肝炎病毒基因亞型B1、B2、B3、B4及B5之基因體的共有核苷酸序列分別係如SEQ ID NOs: 17至21所說明。

B型肝炎病毒基因亞型C1、C2、C3A、C3B、C4、C5及C6之基因體的共有核苷酸序列分別係如SEQ ID NOs: 22至28所說明。於特定B型肝炎病毒基因亞型之B型肝炎病毒基因體測定共有核苷酸序列的方法係如下所述。
3. 本發明之方法

本發明之方法係包含以下步驟：
(a) 基於一相應於該個體感染之B型肝炎病毒S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列來獲得關於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變的率；
(b) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險。
獲得樣品及萃取病毒 DNA

任何自包含B型肝炎病毒DNA之個體獲取的樣品係合宜的。於部分實施態樣中，該自個體獲取之樣品係經處理以用於本發明之方法。舉例言之，於一實施態樣中，該樣品包含自該個體抽取之全血樣品分離所得的血清或血漿。於另一實施態樣中，該樣品包含新鮮冷凍組織或經福馬林固定組織。於各種不同的實施態樣中，該樣品包含全血、血清、血漿、或肝臟組織。於各種不同的實施態樣中，該組織樣品係於切片檢查（biopsy）或手術中獲取。

B型肝炎病毒DNA可使用任何本領域習知合適方法自樣品中萃取而得，前述方法包括但不限於，本案實施例所描述之方法。用於萃取病毒DNA之合適的市售套組係廣泛地容易獲取且於本領域所熟知。
選擇 S 開放閱讀框參考序列

由於B型肝炎病毒基因亞型間的核苷酸序列變異（包括在S開放閱讀框區域內），於各種不同的實施態樣中，該方法包含選擇或設計一適當的S開放閱讀框參考序列。B型肝炎病毒基因型間的重組現象會造成混合的B型肝炎病毒基因型及基因亞型，於此，特異性地測定該S開放閱讀框區域之基因亞型可能有其必要性。

於一實施態樣中，該方法包含提供關於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的信息，舉例言之，自一前測試（earlier test）得到信息且選擇一相應於該基因亞型的S開放閱讀框參考序列。

於另一實施態樣中，該方法係包含將如本文所述關於自該個體獲取之樣品中B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的信息，與一或更多個基因亞型S開放閱讀框共有序列進行比較，以測定該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型並選擇一相應的S開放閱讀框參考序列。

於一實施態樣中，該方法係包含對一或更多個B型肝炎病毒基因型、基因亞型、或基因亞亞型S開放閱讀框共有序列進行關於至少一部分S開放閱讀框的序列信息的一或更多個序列比對。

於一實施態樣中，該方法係包含對一或更多個B型肝炎病毒基因型、基因亞型、或基因亞亞型S開放閱讀框共有序列進行關於至少一部分S開放閱讀框的序列信息的一或更多個雙序列比對（pairwise sequence alignments）。測定S開放閱讀框基因亞型之方法的一實例係如實施例1所描述。於各種不同的實施態樣中，該序列比對係使用一至多個雙序列比對（使用但不限於，BLAST、Smith-Waterman、或Needleman-Wunsch based algorithms）。軟體可選擇自一包括但不限於以下程序的群組：Burrows-Wheeler aligner program、novoalign、bowtie、mrsFAST、Partek、SOAP、MAQ、Segemehl、SSHA及Stampy。本領域熟悉此項技藝者可測定用於測量序列比對之合適參數，包括任何可完成之最大序列比對超過被比較序列之全長的演算法。

於一實施態樣中，該方法包含對一或更多個B型肝炎病毒基因型、基因亞型、或基因亞亞型S開放閱讀框共有序列進行關於至少一部分S開放閱讀框的序列信息的一或更多個多重序列比對（multiple sequence alignments）。用於進行多重比對的技術包括但不限於，漸進式比對建構（progressive alignment construction）、迭代法（iterative methods）、共同法（consensus methods）、隱藏式馬可夫模型（hidden Markov models）、phylogeny-aware模型、尋找模體（motif finding）、或非編碼多重序列比對（non-coding multiple sequence alignment）。可使用之軟體包括但不限於，Clustal、MAFFT、T-Coffee、PRRN∕PRRP、CHAOS∕DIALIGN、M-Coffee、MergeAlign、POA、SAM、HMMER、PRANK、PAGAN、MEME∕MAST及EDNA。

於一實施態樣中，該方法係包含確定優先比對序列信息的基因亞型S開放閱讀框共有序列，以及選擇該優先比對之S開放閱讀框序列作為S開放閱讀框參考序列。

於部分實施態樣中，於感染重組病毒之病患中區分來自不同基因型、基因亞型、或基因亞亞型之S開放閱讀框區域為必須的。於一實施態樣中，該方法係包含藉由鑑定該個體感染之B型肝炎病毒的2或更多個S開放閱讀框區域的基因型、基因亞型、或基因亞亞型，選擇本文揭露之相應於不同基因亞型或基因亞亞型之各區域的S開放閱讀框參考序列區域，以及結合該些區域以形成一針對該個體定制的全長S開放閱讀框參考序列，來建構一S開放閱讀框參考序列。

於感染2或更多個B型肝炎病毒基因型、基因亞型、或基因亞亞型的個體，在各種不同的實施態樣中，對於各個不同的基因型分別鑑定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率為必須的。

本發明之方法係適合用於測定對於S開放閱讀框區域基因亞型序列為可獲得的B型肝炎病毒基因型A、B或C之任何基因亞型的S開放閱讀框中非同義突變頻率。

對於B型肝炎病毒基因亞型合適的S開放閱讀框參考序列可藉由以下方式產生：比對2或更多個自基因亞型經鑑定之B型肝炎病毒獲得的S開放閱讀框核苷酸序列、並產生一共有序列。適合用於產生共有序列的比對軟體係本領域所熟知，包括如本所所述之軟體程序。

於各種不同的實施態樣中，該一或更多個B型肝炎病毒S開放閱讀框參考序列係包含一或更多個SEQ ID Nos：1至14序列。

用於B型肝炎病毒基因亞型A1及A2之S開放閱讀框參考序列分別如SEQ ID Nos：1及2所提供。用於B型肝炎病毒基因亞型B1、B2、B3、B4及B5之S開放閱讀框參考序列分別如SEQ ID NOs：3至7所提供。用於B型肝炎病毒基因亞型C1、C2、C3A、, C3B、C4、C5及C6之S開放閱讀框參考序列分別如SEQ ID NOs：8至14所提供。於各種不同的實施態樣中，相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框區域基因亞型的S開放閱讀框參考序列係包含具有至少約90%、95%、97%、98%、或至少約99%序列相同於該相應於如本文所述之基因亞型的S開放閱讀框參考序列的核苷酸序列。

於一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係包含關於至少一部分S開放閱讀框區域的序列信息。於一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列僅包含關於對該病患感染之B型肝炎病毒之基因型或基因亞型測定非同義突變頻率的2或更多個密碼子的序列信息。舉例言之，於一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係包含2或更多個離散的序列（discrete sequences），其中，各序列相應於待測定非同義突變頻率的密碼子。於另一實施態樣中，該參考序列係包含該S開放閱讀框區域或其一部分的序列，其中非相應於該待測定非同義突變頻率的2或更多個密碼子的一或更多個核苷酸係被指定為「n」。

於一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係包含一經設計相應於2或更多個B型肝炎病毒基因亞型的序列。舉例言之，於一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係包含一B型肝炎病毒之2或更多個基因亞型的共有序列。例如：若該S開放閱讀框參考序列係經設計相應於B型肝炎病毒特定基因型的所有習知基因亞型，則為進行本發明之方法而測定該個體感染之B型肝炎病毒基因亞型可能為非必須的。於一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係包含一相應於基因型C之2或更多、3或更多、4或更多、或者5或更多個基因亞型的序列。於另一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係包含一相應於B型肝炎病毒基因型C之所有習知基因亞型的序列。於另一實施態樣中，該S開放閱讀框參考序列係包含一經設計相應於B型肝炎病毒所有習知基因型及基因亞型的序列。

B型肝炎病毒之其他基因亞型可能於未來會被鑑定出。相應於該些新基因亞型的S開放閱讀框參考序列可如上述產生。當用於新基因亞型的核苷酸序列變得可取得，該些序列可以被包括在如上述的方法中，以鑑定該些基因亞型是否存在於自個體獲得之樣品中。
提供序列信息

於一實施態樣中，該方法係包含：
(a) 藉由包含如下步驟之方法測定該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框區域中非同義突變頻率：
(i) 提供對於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒的S開放閱讀框區域的序列信息；
(ii) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列；
(iii) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以定義該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及
(iv) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率；以及
(b) 基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒的基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險。
產生序列信息

該B型肝炎病毒基因型A之S開放閱讀框區域係包含1,200個核苷酸，其中該核苷酸包含環狀B型肝炎病毒基因體之核苷酸2854至3221及1至832。用於該B型肝炎病毒基因型A1及A2之S開放閱讀框的共有核苷酸序列係分別如SEQ ID Nos：1及2所說明。

該B型肝炎病毒基因型B及C之S開放閱讀框區域係包含1,200個核苷酸，其中該核苷酸包含環狀B型肝炎病毒基因體之核苷酸2848至3215及1至832。用於該B型肝炎病毒基因型B1、B2、B3、B4及B5之S開放閱讀框的共有核苷酸序列係分別如SEQ ID Nos：3至7所說明。用於該B型肝炎病毒基因型C1、C2、C3a、C3b、C4、C5及C6之S開放閱讀框的共有核苷酸序列係分別如SEQ ID Nos：8至14所說明。

該S開放閱讀框區域的1,200個核苷酸係包含400個密碼子。為了鑑定本文之S開放閱讀框區域的特定密碼子，該密碼子係自如上經鑑定之相關基因亞型的S開放閱讀框共有序列的5’端進行連續編號。舉例言之，密碼子1係包含該S開放閱讀框的核苷酸1至3、密碼子2係包含該S開放閱讀框的核苷酸4至6、以此類推至密碼子400係包含該S開放閱讀框的核苷酸1,198至1,200。用於包含一或更多個插入∕缺失（indel）的S開放閱讀框序列，於該插入∕缺失位置之後的特定密碼子係藉由參考該相關基因亞型S開放閱讀框參考序列而鑑定。

於一實施態樣中，該方法包含對於存在於自該個體獲取之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息。於一實施態樣中，該方法係包含對於該S開放閱讀框區域全部1,200個核苷酸產生序列信息。於另一實施態樣中，該方法係包含對於一部分包含待測定非同義突變頻率之2或更多個密碼子的S開放閱讀框區域產生序列信息。

於一實施態樣中，該方法係包含放大該S開放閱讀框區域、或其一部分，以製造一擴增引物。於一實施態樣中，該S開放閱讀框、或其一部分係使用連續巢式PCR反應（sequential nested PCR reactions）或其他本領域習知擴增策略進行放大，以減少錯誤引導（mispriming）、非特異性擴增（non-specific amplification），或者以增加所欲擴增引物的特異性擴增。

於一實施態樣中，該方法係包含使用寡核苷酸引子進行二個DNA合成的起始回合，其中，該3’部分係包含一隨機核苷酸序列，以及該5’部分係一經定義的序列。此策略之一實例係如Bohlander et al., 2002, Genomics 13:1322-1324所描述。於一實施態樣中，一寡核苷酸引子係黏著至B型肝炎病毒DNA，且使用一聚合酶（例如：T7 DNA聚合酶）進行延長，使得第一股DNA合成，其中該寡核苷酸引子係包含一5’「經定義」序列及一3’「隨機」序列，且其中，該5’「經定義」序列係包含不存在於B型肝炎病毒及人類基因體的序列並經優化用於根據本領域熟悉此項技藝者習知標準的PCR反應，該3’「隨機」序列係包含3或更多個隨機選擇的核苷酸。隨著變性（denaturation）及再黏著（re-annealing），第二股合成係使用相同或相似設計的引子進行，以製造一互補的第二股。接著，於PCR反應中使用黏著於5’經定義序列的引子放大此雙股DNA，以放大該S開放閱讀框區域、或其一部分。

於一實施態樣中，該方法係包含使用可同時定序多個空間分離的DNA模板的大量平行定序技術（massive parallel sequencing technology，亦稱為第二代定序（massive parallel sequencing technology）或次世代定序（next generation sequencing））對於該擴增引物產生序列信息。可使用任何本領域習知的合適大量平行定序技術。於各種不同的實施態樣中，該方法係包含焦磷酸定序（pyrosequencing）、可逆終止子化學（reversible terminator chemistry）、藉由接合（ligation）或磷酸聯結螢光核苷酸（phospholinked fluorescent nucleotides）定序。合適的系統平台技術係本領域所熟知，包括但不限於，Illumina、Ion Torrent、羅氏（Roche）、萊富生命科技（Life Technologies）、Complete Genomics、螺旋生物科學（Helicos Biosciences）、GS FLX Titanium或太平洋生物科學（Pacific Biosciences）等系統平台。

例示性方法係如實施例所描述。簡言之，擴增引物係藉由超音波進行片段化。於片段化後，終端修復、3’端終端腺苷酸化、銜接蛋白（adaptor）接合及接合基因庫之銜接蛋白（adaptor ligated libraries）的擴增係使用NEBNext Ultra library preparation reagents於Illumina系統平台（NEB）進行。個別的條碼係使用NEBNext Multiplex Oligos Set-I於基因庫形成時加入。該Illumina基因庫係經定序於NextSeq500 instrument（Illumina Inc. ），以自各樣品獲得關於一千萬雙端（paired-end，PE）讀長（reads）（150bp x 2）。

於一實施態樣中，該方法係包含使用大量平行定序技術對於直接來自萃取於自該個體獲取之合適樣品的B型肝炎病毒DNA的S開放閱讀框產生序列信息。可使用任何本領域習知萃取方法製造適合用於定序的部分或完整的B型肝炎病毒DNA。可使用任何本領域習知大量平行定序技術，包括如上所描述之方法。

於一實施態樣中，該方法係包含使用DNA雜交以獲得關於來自樣品的B型肝炎病毒的核苷酸或胺基酸序列信息。合適的DNA雜交技術包括但不限於，DNA、RNA或cDNA與附著於一固相（例如：玻璃、塑膠或矽生物晶片）或者聚苯乙烯微珠（microscopic polystyrene beads）的DNA、cDNA或RNA探針的雜交。該些技術係用於對萃取自該樣品或自一擴增引物的部分或完整B型肝炎病毒DNA產生序列信息。

於一實施態樣中，該方法係包含使用單一分子定序技術（single molecule-based sequencing technology）對於S開放閱讀框產生序列信息。可使用任何本領域習知合適的定序技術。於各種不同的實施態樣中，該方法係包含藉由雜交定序或藉由合成定序。合適的技術平台係為本領域所熟知，以及包括但不限於，Ion Torrent、Life Technologies或 Pacific Biosciences等平台。

其他適合用於產生關於S開放閱讀框區域的序列信息的定序方法係為本領域所熟知，例如包括Sanger定序法。
寡核苷酸引子設計

合適的寡核苷酸引子可以使用本領域所熟知的策略及方法來進行設計。第一步為鑑定包含所欲放大之S開放閱讀框的一部分B型肝炎病毒基因體。該部分包含所欲評估之S開放閱讀框中所有密碼子。下一步為鑑定合適的引子以完成所欲擴增引物：一包含在所欲放大部分之5’端具有5或更多個連續核苷酸的正向引子；以及，一包含互補於在所欲放大之基因體部分的3’端具有5或更多個連續核苷酸之序列的反向引子。正向及反向引子的選擇係基於以下參數之考量，該參數包括但不限於引子長度、引子熔點（melting temperature）、引子黏著溫度（annealing temperature）、GC含量以及引子二級結構。多種引子設計工具係可獲得以協助引子設計，包括但不限於，Primer Premier、Primer-BLAST、DNASTAR、Primer3以及Oligo Primer Analysis Software。本領域熟悉此項技藝者可清楚瞭解特定B型肝炎病毒基因亞型可能需要獨特的引子對，以及該些引子對可使用如上概述之方法設計而得。

於一實施態樣中，該正向引子係來自包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60（當B型肝炎病毒係基因型B或C時）或核苷酸1500至3221及核苷酸1至60（當B型肝炎病毒係基因型A時）之B型肝炎病毒基因體的區域，以及該反向引子係來自包含核苷酸1至2000之B型肝炎病毒基因體的區域。

於一實施態樣中，引子皆黏著於B型肝炎病毒基因體之S開放閱讀框區域以外的區域，於此該PCR反應可放大完整的S開放閱讀框。於一實施態樣中，該正向引子經設計黏著至部分重疊或完全落入B型肝炎病毒基因體之S開放閱讀框區域的位置，以及該反向引子黏著至B型肝炎病毒基因體之S開放閱讀框區域以外的區域，或者，反之亦然。

於一實施態樣中，引子皆經設計黏著至部分重疊或完全落入B型肝炎病毒基因體之S開放閱讀框區域的位置。舉例言之，該正向引子係來自包含B型肝炎病毒基因體之核苷酸1500至2848的B型肝炎病毒基因體區域，以及該反向引子係來自包含核苷酸832至2000之S開放閱讀框的區域。

於一較佳實施態樣中，該些引子係經設計為可連接及放大任何基因型或基因亞型之任何B型肝炎病毒的B型肝炎病毒基因體部分的廣用引子（universal primers）。該等廣用引子可藉由標靶足夠作為引子之長度的B型肝炎病毒基因體的高度保留區域而設計獲得。該等引子之實例係如下實施例所提供。由於B型肝炎病毒頻繁且快速的突變，可能需要設計一套經設計用於特定基因型或基因亞型、或者用於作為一個備案（若第一個引子對無法製造出所欲擴增引物）的一或更多個正向引子及一或更多個反向引子。
測定 S 開放閱讀框區域中非同義突變頻率

於一實施態樣中，本發明之方法係包含將關於自該個體獲得之樣品中一部分B型肝炎病毒的S開放閱讀框區域的序列信息（例如：藉由次世代定序獲得之讀長（reads）），與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率。接著，基於每一密碼子之非同義突變頻率測定S開放閱讀框區域中非同義突變頻率。

於一實施態樣中，該序列信息係經集合至單倍體基因型，而後將集合的序列（通常稱為重疊群（contig））與S開放閱讀框參考序列比對，以及進行各個重疊群間的基因變異分析。

於一實施態樣中，該方法係包含進行一生物資訊分析，舉例言之，如上所敘述及於實施例中的序列信息與S開放閱讀框參考序列間的序列相似度分析，以鑑定S開放閱讀框中每2或更多個密碼子的非同義突變的存在或不存在。適於突變鑑定的軟體程序係如本領域所熟知，包括但不限於SAMtools、GATK Haplotypecaller、Freebayes、GATK UnifiedGenotyper、SOAPSnp、VarScan、及Platypus。

於一實施態樣中，該方法係包含測定每個經檢測之突變是否為同義或非同義突變。此將參考遺傳密碼（genetic code）進行，且該遺傳密碼係本領域專業知識所熟知。

於一實施態樣中，該方法係包含測定S開放閱讀框中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率。各序列係分別與S開放閱讀框參考序列進行比對，而後計數自比對S開放閱讀框內各密碼子的個體所得的所有序列讀長。此將提供用於計算非同義突變頻率的分母。S開放閱讀框中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率係經計算為各密碼子的非同義突變的總數除以該些密碼子序列讀長的總數。

於一實施態樣中，該方法係包含測定表示S開放閱讀框中非同義突變頻率的數值得分。於一實施態樣中，該方法係包含基於該S開放閱讀框中非同義突變頻率來分派一類別（category）或等級（grade）。

於一實施態樣中，該方法係包含基於密碼子的非同義突變頻率來分派各密碼子一數值得分。於一實施態樣中，該數值得分係基於各密碼子的非同義突變頻率的閾值（threshold）而分派。舉例言之，該方法係包含：若該密碼子的非同義突變頻率係小於該閾值頻率，則分派一為0的得分；以及，若該密碼子的非同義突變頻率係等於或大於該閾值頻率，則分派一正向得分。於一實施態樣中，該方法係包含分派一類別或等級，其中該類別或等級係藉由各密碼子的非同義突變的閾值頻率而定義。

該分派給各密碼子的正向數值得分可以被加權，舉例言之，一較高得分可以被分派給在最強正向選擇壓力下的密碼子。

於一實施態樣中，該分派給各密碼子的數值得分係經結合以提供一表示B型肝炎病毒S開放閱讀框區域中非同義突變頻率的結合數值得分。於一實施態樣中，該分派給各密碼子的類別或等級係經結合以提供表示B型肝炎病毒S開放閱讀框區域中非同義突變頻率的結合等級。
ARMS 試驗及其他方法

於一替代實施態樣中，該方法係包含藉由擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）試驗檢測各密碼子的非同義突變頻率。於一ARMS試驗中，藉由PCR的擴增係使用包含3’終端序列的引子，其中該包含3’終端序列的引子係經設計來區分存在於S開放閱讀框參考序列各密碼子中的鹼基，以及存在於自該個體獲得之樣品的B型肝炎病毒S開放閱讀框中該密碼子的非同義突變。

用於ARMS的PCR引子係基於相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框區域基因亞型的S開放閱讀框參考序列而設計。為測定S開放閱讀框中2或更多個密碼子的非同義突變頻率，PCR引子係經設計用於PCR反應，以於野生型密碼子存在時，特異性地放大至少一部分僅包含各密碼子的S開放閱讀框，即，該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列中密碼子的核苷酸序列。其他引子係經設計用於PCR反應，以於該密碼子中各個可能的非同義突變存在時，特異性地放大至少一部分僅包含各密碼子的S開放閱讀框。該各反應的擴增引物係進行瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis）以及該相應於各擴增引物的亮帶（bands）係經檢測及定量，以使用本領域熟知方法進行非同義突變頻率測定。

於其他實施態樣中，該方法係包含使用質譜儀、經標記抗體、螢光標記探針、金屬標記探針、或任何其他區分野生型及經突變胺基酸的分子，而檢測S開放閱讀框之蛋白序列中胺基酸取代的存在或不存在。該各個位置的野生型胺基酸為編碼於S開放閱讀框參考序列相應位置之密碼子的胺基酸。

於部分實施態樣中，該經標記抗體、探針或其他分子係藉由流式細胞儀或藉由cytometry by time of flight（CyTOF）分析而檢測。

於其他實施態樣中，S開放閱讀框之核苷酸或蛋白序列中非同義突變的存在將藉由體外培養中經轉染（transfected）、經轉導（transduced）、或經感染之細胞分析，或藉由任何來自體外培養的上清液分析而檢測。

於該些實施態樣中，基於各密碼子的非同義突變頻率可使用本文所描述之任何方法測定S開放閱讀框區域中非同義突變頻率。
使用該頻率以預估 B 型肝炎病毒之基因狀態及臨床疾病

慢性B型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）係與肝臟併發症相關，包括肝臟發炎、硬化及肝癌。CHB病患可能許多年無症狀且出現臨床症狀時已於疾病中晚期（advanced stage）。

本發明之方法係適合用於篩檢任何感染於B型肝炎病毒基因型A、B或C之個體。該方法尤其是被考慮用於篩檢未顯現臨床症狀、或未曾被檢測出罹患慢性B型肝炎病毒的個體，例如：被認為是B型肝炎病毒非活動性健康帶原者（inactive healthy carriers，IHC）的個體。

於其他實施態樣中，該個體係B型肝炎e抗原（HBeAg）測試陰性、具有正常血清ALT值、具有大於約2,000 IU∕毫升之HBV-DNA效價、或前述之任何組合。HBeAg陰性通常係指病患具有肝臟發炎及硬化的低發展風險，以及大多數病患被認為是非活動性健康帶原者（IHC）。然而，一小群具有正常基線ALT值及HBV-DNA值大於2,000 IU∕毫升的HBeAg陰性病患可能發展形成一種慢性肝臟發炎，稱為HBeAg陰性慢性B型肝炎（e-CHB），其與肝硬化的快速進程相關。

於各種不同的實施態樣中，B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率係用於基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險。

於一實施態樣中，該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中發現非同義突變的頻率係指該個體係罹患肝臟發炎，例如：無臨床症狀的早期肝臟發炎。

於一實施態樣中，該方法係用於測定病患感染之B型肝炎病毒的基因狀態。於一實施態樣中，該非同義突變的頻率係指該B型肝炎病毒係於正向選擇壓力下。

於一實施態樣中，B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中發現非同義突變的頻率係指該個體係易感於肝臟發炎、或者一或更多個慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症，或該個體係具有前述肝臟發炎、或者一或更多個慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險。於各種不同的實施態樣中，該慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症係包含肝硬化、肝癌、肝衰竭、肝臟發炎、肝損傷、肝功能異常、或前述任何二或更多個的組合。

於其他實施態樣中，該個體係HBeAg陽性、或具有提升的血清ALT值、或係HBeAg陽性且具有提升的血清ALT值。於部分實施態樣中，該方法係用於確認該個體係罹患肝臟發炎，例如：早期肝臟發炎。

於一實施態樣中，S開放閱讀框區域中發現非同義突變的頻率係指該個體係於1年內，或2、3、4、5、6、7、8、9或10年內，易感於肝臟發炎或肝臟併發症、或具有前述肝臟發炎或肝臟併發症的發展風險。

於一實施態樣中，一表示S開放閱讀框區域中非同義突變頻率的數值得分係用於測定臨床結果（clinical outcome）。舉例言之，一大於或等於測定前閾值得分的數值得分係指B型肝炎病毒係於正向選擇壓力下、或該個體係易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體係具有前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險。

於各種不同的實施態樣中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的數值得分係指B型肝炎病毒係於正向選擇壓力下、或該個體係易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體係具有前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險。

於各種不同的實施態樣中，S開放閱讀框中非同義突變頻率係用於確定一個體需進一步進行臨床測試（例如：肝臟掃描或切片檢查），以鑑定B型肝炎病毒之肝臟併發症。於其他實施態樣中，非同義突變頻率係用於確定對於病患的臨床篩檢計畫，例如：確定對於血清ALT、HBeAg、HBV DNA值的試驗頻率。於其他實施態樣中，非同義突變頻率係用於建議本發明之方法需於一確定的時間範圍內重複進行。

於各種不同的實施態樣中，S開放閱讀框區域中非同義突變頻率係用於監測個體之治療反應、預估個體之治療反應、選擇個體之治療、確定個體之治療的最佳時機、持續時間或方案。

免疫治療係包括改變或增強個體對於病原（尤其是如B型肝炎病毒的病毒）之免疫反應的任何治療。免疫治療一詞尤其指給予一罹患慢性B型肝炎病毒感染之個體的處理或治療。

於各種不同的實施態樣中，S開放閱讀框區域中非同義突變頻率係於個體以規律間隔被測定。於一實施態樣中， S開放閱讀框區中提高的非同義突變頻率係指對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒之肝臟併發症提高的發展風險、或該個體需開始一特定的免疫治療或其他治療方案。
實施例
實施例 1

本實施例描述來自第一批次感染B型肝炎病毒之病患的B型肝炎病毒S開放閱讀框的選殖（cloning）及分析。
1. 方法

紐西蘭B型肝炎篩檢計畫監測1,439位慢性B型肝炎病毒感染6至12個月的東加成年受試者。其中345位受試者於常規血液檢查時被招募至此次研究。使用額外的3毫升血清進行HBV-DNA分析，並自周邊血白血球中萃取基因體DNA以用於HLA第一類基因分型。所有受試者皆簽署書面同意書，且本研究係於紐西蘭衛生部北方X區域倫理委員會（the Northern X Regional Ethics Committee of the New Zealand Ministry of Health）批准下進行。

首先，來自該345位受試者之47個血清的完整B型肝炎病毒基因體係經定序以用於測定在東加B型肝炎病毒的野生型序列，以及鑑定用於定序及PCR的保守引子（conserved primer）位置。接著，選擇所有具有正常血清ALT值且PCR檢測HBV DNA為基因型C的HBeAg陰性受試者進行S開放閱讀框突變的橫斷面分析（cross-sectional analysis）。該些受試者皆不曾接受慢性B型肝炎治療。
B 型肝炎病毒基因體的選殖與定序

使用高純度病毒核酸套組（High Pure Viral Nucleic Acid kit ，購自美國印地安納波利斯的Roche Diagnostics）自300微升血清中萃取出HBV-DNA。於東加族群中，B型肝炎病毒之序列具有個體間及個體內差異。因此，設計特定的PCR引子以用於放大及定序來自部分獨立個體之B型肝炎病毒係有其必要性；尤其是HBeAg陰性的個體。

第一個步驟為獲得鹼基對1700至2411的共有序列。用於放大此段序列的引子係藉由在自NCBI核苷酸資料庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）獲得之54個基因型C及基因型D的Multalin（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）比對中尋找保守序列（conserved sequences）。透過比對，三個正向引子被確定且皆能與二個反向引子配對（皆如表1所示）。Tm值係使用寡引子分析軟體（Oligo Primer Analysis Software，版本 7.58，購自Molecular Biology Insights Inc, CO）進行計算。
表 1 ：用於放大 B 型肝炎病毒基因體區域 1700 至 2411 的引子
相應於基因型C3序列的鹼基編號（基因銀行編號：X75656）。

B型肝炎病毒基因體係於二片段中進行選殖。一包括S開放閱讀框、P開放閱讀框之終端2455 bp、及X開放閱讀框之起始端403 bp的2.6 kb選殖株係使用互補於如上所述1700至2411 bp序列中的保守序列且經設計以放大B型肝炎病毒之負股的引子進行放大。藉由於Multalin序列比對程序（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）中該47個1700至2411 bp序列的外觀檢查（visual inspection）來鑑定保守序列。作為引子以選殖該2.6 kb片段的保守序列係如表2及表3所描述。
表 2 ：用以選殖該 2.6kb 片段的外部引子對
表 3 ：用於巢式 PCR 反應的引子
表 4 ：內部定序引子

用於第一次PCR反應的上游引子（upper primer）係正向4或正向5，以及下游引子（lower primer）係反向3或反向4（表2）。來自該第一次反應的PCR產物係使用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG；分子量= 8000；購自密蘇里州聖路易的Sigma Aldrich，產品編號：P5413）進行純化與濃縮，其後再次懸浮於5微升水中，其中0.1至5.0微升係作為模板並使用包含上游6或上游7作為上游引子及反向4作為下游引子以用於第二次巢式PCR反應（表3）。

用於各反應的PCR循環條件係使用寡引子分析軟體（Oligo Primer Analysis Software，版本6；購自Molecular Biology Insights，www.oligo.net）確定。如上所描述之用於所有PCR反應的PCR策略為三階段的遞減規程（touchdown protocol）。該變性溫度係96^o C於第一階段中歷時10秒，且係高於該產物之Tm值2^o C於後二階段歷時10秒。該第一及第二階段之黏著溫度係設於引子之Tm值（最大值72^o C）歷時15秒，分別於第一階段以每循環減少0.2^o C（共8個循環）及於第二階段以每循環減少0.5^o C（共4個循環）。第三階段黏著溫度係設於藉由寡引子分析軟體所計算之最佳值，共30個循環。延長溫度為72^o C，且延長時間為產物的每千鹼基（kilobase）50至60秒。所有的HBV-DNA擴增係使用Accuprime Taq DNA Polymerase High Fidelity（購自加州卡爾斯巴德的Invitrogen Life Technologies）進行。

來自巢式PCR之經PEG清潔的擴增引物係添加A尾（A-tailed；30至300奈克之擴增引物、0.88微升之10倍磷酸銨緩衝液（ammonium sulphate buffer，pH=8.4）、0.8微升之2毫莫耳濃度的dATP、0.33微升之25毫莫耳濃度的MgCl₂ 、3單位（U）之Taq聚合酶、加水至8.8微升，於72^o C歷時30分鐘），以及連結至pGEM-T（購自威斯康辛州麥迪遜的Promega），進而使用於轉型大腸桿菌（transform E.coli，DH5α）。自各個PCR反應定序一全長選殖株。

Sanger定序反應係含有20至40奈克之經選殖DNA以及1微升之ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing mix（購自加州福斯特城的Applied Biosystems）。該定序反應係依該定序引子之Tm值使用56^o C或50.5^o C之黏著溫度進行。該定序反應產物係藉由磁珠（購自麻州貝弗利的Agencourt Biosciences Corp.，CleanSEQ）純化，並使用POP7聚合物於適於50公分毛細管陣列（capillary array）之ABI Prism基因分析儀3130XL進行分析。序列分析及重疊群集合係使用Chromas 1.61（購自澳洲昆士蘭的Technelysium Pty Ltd）進行。

為將樣品之間的汙染風險最小化，所有的PCR混合製劑（PCR cocktails）係於一PCR操作台（購自英國漢普郡的Bigneat Ltd）中準備，且轉移至一不同的房間以添加模板。熱循環及PCR產物之瓊脂膠分析係於第三個房間進行。PCR產物的轉型及選殖係於外部排氣之通風櫃（externally-vented fume cabinet）中進行，其中該通風櫃係具有一直接比鄰的專用4至8^o C冰箱、37^o C培養箱及水浴槽。來自所有受試者的B型肝炎病毒族群中具有獨特的突變庫（repertoire of mutations），以及受試者間的交叉汙染可自突變輪廓（mutation profiles）鑑定。
確定 B 型肝炎病毒基因型

各個B型肝炎序列之基因型係藉由比對擴增引物之序列而確定，其中該擴增引物係藉由任何一個與一小組自NCBI核苷酸資料庫（Genbank Accession and Version in parentheses）獲取之序列比對的引子對而產生：基因型A（AF297623.1、AY128092.1、AB126580.1）、基因型B（AY167100.1、AY206391.1、AY206390.1）、基因型C（AY167090.1、AY167096.1、AY167092.1、X75656.1）、基因型D（AB126581.1、AB104711.1、AB104712.1）、基因型E（AB091256.1、AB091255.1）、基因型F（AB036920.1、AY179734.1、AY179735.1）、基因型G（AB064315.1、AF405706.1）、以及基因型H（AY090460.1、AY090457.1）。該經定序之第一擴增引物（含有鹼基1700至2411，如上述）係含有於東加族群中自基因型D區分基因型C的52個鹼基的單倍體基因型，以及此序列係用於排除基因型D受試者。任何具有混合基因型病毒之受試者的可能性係藉由2.6 kb選殖株之序列與上述該組序列進行比對來排除。無鑑定出具有包含混合基因型C及基因型D的東加受試者。

142個選殖株係獲得於來自19個受試者的B型肝炎病毒基因型C的全長S開放閱讀框序列，自每位受試者獲取5至12個選殖株。包含插入∕缺失（indels）及∕或無義突變的選殖株係經由進一步的分析進行排除。
實施例 2

本實施例將描述自感染B型肝炎病毒之第二批次病患獲取之B型肝炎病毒基因體的選殖及分析。
1. 方法

紐西蘭B型肝炎篩檢計畫監測超過10,000位慢性B型肝炎病毒感染6至12個月的成人。其中250位於進入篩檢計畫時係HBeAg陰性且具有正常ALT值的受試者於常規血液檢查時獨立於年齡、種族或性別地被招募至此次研究。所有的受試者皆為其欲使用至此研究的初始篩檢血清樣品簽署書面同意書，其中本研究係於紐西蘭衛生部北方X區域倫理委員會批准下進行。HBV-DNA值係使用COBAS Ampliprep/COBAS Taqman HBV Test（版本2.0；具有1.30至8.23 log₁₀ IU∕毫升之線性範圍）進行測量。本研究包括12位HBV DNA大於2,000IU∕毫升的受試者、以及5位HBV-DNA小於2,000IU∕毫升的受試者，其中所有的受試者皆為基因型C。
選殖及定序 B 型肝炎病毒基因體

HBV DNA係使用QiAamp Ultrasens病毒套組（購自德國希爾登的QIAGEN GmbH）自500微升之血清中萃取。B型肝炎病毒之S開放閱讀框係於連續巢式PCR反應中放大。所有PCR反應係使用5微升之模板及Phusion High fidelity DNA聚合酶（購自芬蘭埃斯波的Finnzymes）。最佳黏著溫度係確認至購入商的網站（www.finnzymes.com）。

起始PCR反應係使用列於上述表2中的正向引子4或正向引子5搭配反向引子4。使用三階段遞減規程。變性溫度係98^o C，歷時10秒。第一及第二階段黏著溫度係起始於引子之Tm值（最大值72^o C）歷時10秒，分別於第一階段每循環減少0.2^o C（共8循環）以及於第二階段每循環減少0.5^o C（共4循環）。第三階段黏著溫度係設於由購入商網站計算出的最佳值，共25循環。延長溫度係72^o C，且延長時間係產物之每千鹼基30秒。

巢式PCR係於起始PCR之產物上進行。該巢式PCR係使用HF緩衝液及一包含正向引子及下述表5所列之一反向引子的引子對。三階段遞減規程係如上所敘述以用於初始PCR。
表 5 ：用於巢式 PCR 之引子對

經PEG清潔的擴增引物係如實施例1所敘述經添加A尾及經轉型至大腸桿菌。

Sanger定序係如實施例1所敘述進行。

採取如實施例1所敘述之措施以將汙染風險最小化。
確定 B 型肝炎病毒基因型

各B型肝炎病毒序列的基因型係藉由與任何一個與一小組如上實施例1所敘述的B型肝炎病毒序列比對之引子對製造的序列進行比對而確認。

156個含有全長S開放閱讀框序列的選殖株係獲取自17位受試者。包含插入∕缺失（indels）及∕或無義突變的選殖株係自進一步分析中排除。
實施例 3

本實施例係描述B型肝炎病毒之PAML分析以鑑定正向選擇壓力下的S開放閱讀框密碼子。
1. 方法

PAML分析係於如上實施例1及2所描述般獲取之S開放閱讀框選殖株上進行。

作用於B型肝炎病毒的自然選擇壓力係使用Yang等人之文獻（Mol. Biol. Evol.，2005，22：1107–1118）的方法探討。於該些方法中，在密碼子序列發生非同義取代的機率（dN ）係與同義取代的機率（dS ）進行比較。該些機率通常係藉由計算其比率（經常以ω表示）比較。當演化藉由突變隨機進行及核苷酸飄移而發生，可預期的是該非同義取代的機率係與同義取代的機率相同（ω=1），以及稱為中立的選擇。當胺基酸改變之取代為不利的且經刪除，則該比率ω將會降至0至1範圍中。此表示為負向選擇。當選擇傾向胺基酸多樣性時，該非同義取代的機率將超過藉由隨機進行預期之機率（ω大於1），以提供一正向選擇。該些密碼子演化的取代機率必須於親緣關係樹上推斷。

如實施例1及2中所描述獲得之病毒的親緣關係係於PhyML（Guindon等人之文獻，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 2004，101：12957–12962）中使用最大似然法進行建構。最大似然親緣分析（PAML；模型2a；Yang等人之文獻，Mol. Biol. Evol.，2005，22：1107–1118）程序則係用於估計在整個親緣關係樹在正向、中立或負向選擇壓力下的所有比對中密碼子的總體比例。各密碼子則係被分派至具有如使用Bayes Empirical Bayes（BEB）標準計算的最大後驗機率（greatest posterior probability）所屬選擇類別（負向、中立或正向）。
2. 結果

表6係統整298個於實施例1及2中獲取自36位受試者之S開放閱讀框選殖株的PAML分析。列出所有ω大於2.0之密碼子，其中該密碼子係經最強正向選擇壓力鑑定。於星號（*或**）標記的密碼子中正向選擇壓力已達到雙尾統計顯著性常規水平（Pr大於0.95）。
表 6 ： B 型肝炎病毒基因型 C 選殖株之 PAML 分析結果
實施例 4

本實施例係探討在正向選擇壓力下S開放閱讀框密碼子的非同義突變頻率與慢性B型肝炎發展之間的關係。
1. 方法

16位來自實施例1（n=4）及實施例2（n=12）的受試者經鑑定為具有HBeAg陰性、血清HBV-DNA大於2,000IU∕毫升之基因型C慢性肝炎病毒感染、以及正常血清ALT值。通過當地實驗室資料庫及醫院紀錄收集所有該些受試者可用的經分析血清樣品至少需要十年。此使得每位受試者被分類為發展嚴重B型肝炎相關肝臟疾病（肝臟發炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌）或在此期間發展為非活動性肝臟疾病。每組共8位受試者。每位受試者具有6個可用於分析之經選殖的全長S開放閱讀框序列。於獲取超過6個選殖株的受試者僅分析初始獲得的6個選殖株。於每位受試者中計數含有非同義突變的6個選殖株中的2、3、4、5或6個選殖株的上述32個正向選擇密碼子（Pr大於0.90）的數目。此可能導致0至32中的任何數字。此數字即為受試者的得分。發現16位受試者之得分範圍於0至11間。
2. 結果

接受者操作特徵（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲線（第1圖）係自此數據產生，以顯示於每個可能得分該測試得靈敏度及特異性。

該靈敏度（或真陽性率（true positive rate））係以具有大於或等於發展肝臟疾病之得分的受試者數目除以發展肝臟疾病之受試者總數來計算。該特異性係以具有大於或等於未發展肝臟疾病之得分的受試者數目除以未發展肝臟疾病之受試者總數來計算。此表示於ROC曲線中作為偽陽性率（false positive rate）的1-特異性。因為所有的受試者皆具有大於或等於0之得分，該得分為100%靈敏且具有100%偽陽性率。大於或等於2之得分係100%靈敏且具有38%偽陽性率。大於或等於5之得分係75%靈敏及0%偽陽性率。

第2圖顯示之存活曲線係將9位具有大於或等於3之得分的受試者（第1組）的十年追蹤結果與7位具有小於或等於2之得分的受試者（第0組）的結果進行比較。

該X軸係顯示於7位第1組受試者及1位第0組受試者的肝臟發炎發展時間；以及，於8位持續具有非活動性疾病超過十年以上之受試者的追蹤持續期間亦顯示（+）作為受限觀察值（censored observations）。第2圖係顯示二組別間的統計顯著差異（Wilcoxon Chi-square=7.2，p=0.007）。第0組單一受試者之肝臟疾病發展的時間係長於任何一位第1組受試者。未發展肝臟疾病的所有第1組受試者都具有3的得分。此外，該些受試者中的一位具有不符合任何目前已知基因亞型的C基因亞型，且該位受試者的得分可能不是免疫介導的正向選擇反映。

該結果係顯示於B型肝炎病毒中非同義突變頻率的測定係可用於在B型肝炎病毒感染的病患中靈敏地及特異地預估肝臟疾病的發展。
實施例 5

本實施例中所描述之研究目的為
(i) 測定藉由66個混合選殖株（pooled clone）之次世代定序（Next Generation Sequencing，NGS）的定序與藉由66個個別選殖株之Sanger定序是否可檢測出相同的正向選擇突變庫（repertoire of positively-selected mutations）。以此確認NGS可以於32個正向選擇密碼子中鑑定出與AT選殖相同突變範圍。
(ii) 測定是否36個自6位具有肝臟發炎或非活動性疾病的受試者製造之Sanger定序選殖株中發現的完整突變庫可以被發現於含有混合自（pooled from）各受試者之一PCR反應的一NGS定序回合。以此確認是否PCR反應中的擴增偏差（amplification bias）導致部分突變鑑定失敗。
(iii) 評估於NGS定序前模板DNA劃分的最佳方法。
1. 第一個研究

於第一個研究中，66個來自實施例2中11個受試者的已知序列S開放閱讀框選殖株經混合（10奈克 DNA∕選殖株）用於Illumina NGS定序。該選殖株首先藉由Epishear超音波震盪器（購自Activemotif）進行機械性剪切（歷時15分鐘，65%振幅，溫度4°C，30秒開及30秒關為一循環）。片段化後，終端修復、3’端腺苷酸化、銜接蛋白接合及接合基因庫之銜接蛋白的擴增係使用NEBNext Ultra library preparation reagents用於Illumina platform（NEB）進行。該Illumina基因庫則係於NextSeq500 instrument（Illumina Inc.）上進行定序，以自各樣品獲得關於約一千萬雙端（paired-end，PE）讀長（150bp x 2）。

於生物資訊分析，NGS序列係使用Burrows-Wheeler Aligner對於基因亞型C1、C2、C3a、C3b以及C4（SEQ ID Nos：22至26）與一小組參考基因型C基因亞型序列進行比對。比對結果係以SAMtools程序及一自定過濾器進行分析，以鑑定實施例3中所示正向選擇密碼子（即，密碼子4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387或391）何者含有大於0.01讀長之非同義突變的頻率。所有經鑑定於來自66個Sanger定序選殖株之32個正向選擇密碼子的31個中的突變係於NGS中鑑定出。環繞密碼子84的DNA序列係自NGS定序中遺失，其中遺失的原因我們尚未確定。於此，無法評估此密碼子的突變庫。我們認為NGS係足夠準確於檢測在正向選擇下S開放閱讀框密碼子中所有突變。
2. 第二個研究

將來自實施例2的各個6位肝臟發炎受試者、用於AT選殖之90奈克的PCR反應產物結合，以及將另外來自實施例2的各個6位肝臟發炎受試者之90奈克的PCR反應產物亦結合於不同試管中。此二PCR產物的複合混合物係藉由超音波震盪（該6位肝臟發炎受試者）或限制酶切割（restriction enzyme digestion）（該6位非活性疾病受試者）進行片段化。該限制酶切割係依照購入商的指示使用Sau96I（購自New England Biolabs，產品編號：#R0165）進行。

終端修復、3’端腺苷酸化、銜接蛋白接合及接合基因庫之銜接蛋白的擴增係使用NEBNext Ultra library preparation reagents用於Illumina platform（NEB）進行。基因庫係於Illumina次世代定序系統平台上進行定序。超音波震盪係片段化的最佳方法，其導致32個密碼子的各個密碼子在介於850,000及一百一十萬個讀長之間。相反地，限制酶切割的片段化導致該32個密碼子中的5個密碼子於低讀長數目（每個密碼子介於9,000至813,000個讀長範圍中）。該結果顯示超音波震盪為PCR產物片段化的最佳方法。

於來自經超音波震盪之擴增引物的Sanger定序選殖株中檢測出43個非同義突變。NGS檢測出其中41個。於來自經限制酶切割之擴增引物的Sanger定序選殖株中檢測出20個非同義突變。NGS亦檢測出其中15個。

本實施例證實次世代定序在本發明方法中於檢測B型肝炎病毒S開放閱讀框之非同義突變的可用性。
實施例 6

本實施例之目的為
(a) 測定正向選擇密碼子4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387或391中非同義突變的存在是否於基因型C、HBeAg陰性慢性B型肝炎病毒個體中增加，其中該個體於活動型B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病（定義如需治療的肝臟發炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌）確診時具有正常血清ALT值；以及
(b) 鑑定於具有正常血清ALT值、基因型C、HBeAg陰性慢性B型肝炎病毒個體中活動型B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病（定義如需治療的肝臟發炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌）發展的最強預測性的正向選擇密碼子。
1. 方法

150位具有基因型C之HBeAg陰性慢性B型肝炎病毒感染、正常血清ALT值、以及血清HBV-DNA大於2,000 IU∕毫升的連續受試者係招募自中國廣州南方醫科大學南方醫院的門診部。病患係藉由其主治醫師根據目前的亞洲準則（Asian-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatitis B: a 2015 update，Hepatology International 2015，DOI：10.1007/s12072-015-9675-4）針對需要治療之活動型肝臟發炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌的存在進行評估。47位病患經評估用於本實施例。

對於本探討之目的，活動型B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病的定義係指具有慢性B型肝炎病毒感染、曾被他或她的主治醫師視為已發展需治療之肝臟發炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌之至少一者的個體。

HBV DNA係使用Qiagen Ultrasens病毒萃取套組自具有HBV-DNA大於2,000 IU∕毫升的血清中萃取。

一放大來自各受試者之B型肝炎病毒S開放閱讀框的PCR反應係如上實施例2所描述進行。使用NEBNext Multiplex Oligos Set-I於基因庫形成時個別對其進行條碼編碼。來自各受試者的基因庫次世代定序及隨後的超音波震盪片段化係使用如上實施例5中所描述的方法進行。

來自各受試者的病毒基因型及基因亞型係藉由將來自於次世代定序的S開放閱讀框共有序列與如本文所描述之B型肝炎病毒基因型A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3A、C3B、C4、C5及C6的參考序列進行比對而確定。

生物資訊分析係如上實施例中所描述進行。計算每位受試者發生於各個S開放閱讀框密碼子4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387或391中大於0.10讀長之非同義突變頻率。

每位受試者的得分係如具有大於0.10之非同義突變頻率的正向選擇密碼子的數目進行計算。

測定於參與本研究時曾被其主治醫師基於臨床評估視為需要治療之慢行B型肝炎病毒感染、且具有大於或等於4之得分的病患百分比。

亦進行一為期五年的分析。於此分析中，對於正向選擇密碼子的不同組合創建ROC曲線，以確定哪一個正向選擇密碼子的組合於曲線下提供最高面積，且提供在過去五年中曾進行活動性肝臟疾病治療的受試者與持續具有非活動性疾病的病患之間的最高判別值。
2. 結果

所有藉由肝纖維化掃描（fibroscan）具有肝纖維化或硬化證據的受試者獲得高於或大於4的得分。此表示本發明之方法係可用於在具有基因型C之慢性B型肝炎病毒感染、且具有正常ALT值及HBV-DNA值大於2,000 IU∕毫升的HBeAg陰性患者中鑑定嚴重慢性肝臟疾病。

ROC分析係鑑定具有活動性B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病發展的最強預測性的正向選擇密碼子。
實施例 7

本實施例之目的在於評估本發明方法在一具有正常血清ALT值之基因型C、HBeAg陰性慢性B型肝炎病毒受試者的新群組中，使用實施例6所定義之正向選擇密碼子的最佳組合，對於預估活動性B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病發展的實用性。
1. 方法

來自100位慢性B型肝炎病毒感染、HBeAg陰性、且於其初始血液檢查時具有正常ALT值之受試者的儲存血清樣品係自中國廣州南方醫科大學南方醫院的門診部獲得。該些病患係正經由其主治醫師根據如上實施例6所描述之目前的亞洲準則對於需要治療之活動性肝臟發炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌進行評估。該些樣品係經測試以鑑定所有受試者皆具有HBV-DNA值大於2,000 IU∕毫升。

來自所有具有基因型C感染之病患的B型肝炎病毒S開放閱讀框係使用如上實施例6所描述之次世代定序進行放大、條型編碼及定序。

受試者係如上實施例6所描述之判別基因型、基因亞型。

當追蹤五年後對於各個病患臨床信息係有用的，生物資訊及ROC分析係如上實施例6所描述般進行。對於各受試者的得分將如實施例6中鑑定之具有非同義突變頻率大於0.10的正向選擇密碼子數目進行計算。
2. 結果

該結果係確定鑑定偽陽性率為0%、具有活動型B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病的受試者的最低受試者得分。此係用於建議任何具有大於或等於此數目之得分的受試者開始進行用於預防或逆轉活動性B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病的抗病毒治療。

該結果係用於確定在任何持續發展活動性肝臟疾病的受試者中的最低得分。此係用於建議任何持續參與該篩檢計畫、具有低於此數目的受試者，主要用於可能在肝硬化不存在之狀況下發生的肝癌早期鑑定。該些受試者不需要進行抗病毒治療。

對於具有發生在所有發展活動性肝臟疾病之受試者中的得分的受試者，以及發展非活動性肝臟疾病超過十年的受試者，建議進行進一步的探討，例如：肝纖維化掃描、肝臟超音波、肝臟切片檢查。建議該些病患於5至10年時間重複進行本試驗。
實施例 8

本實施例之目的在於鑑定在HBeAg陰性且具有正常血清ALT值的受試者中於正向選擇壓力下基因型B之B型肝炎病毒中S開放閱讀框的密碼子。評估藉由在該些密碼子的非同義突變頻率以預估活動性B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病的實用性。
1. 方法
階段 1

來自100位慢性B型肝炎病毒感染、HBeAg陰性、且於其初始血液檢查時具有正常ALT值之受試者的儲存血清樣品係自中國廣州南方醫科大學南方醫院的門診部獲得。該些病患係正經由其主治醫師根據如上實施例6所描述之目前的亞洲準則對於需要治療之活動性肝臟發炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌的存在進行評估。HBV DNA係使用Qiagen Ultrasens病毒萃取套組自該100個血清中進行萃取。

對於50個血清進行如上實施例2之B型肝炎病毒之S開放閱讀框的選殖及定序。300個選殖株係自該50個血清進行定序。

該300個B型肝炎病毒選殖株的親緣關係分析係如上實施例3所描述進行，以鑑定正向選擇壓力下的密碼子。
階段 2

S開放閱讀框係放大自該些血清的第二部分50個血清，以進行如上所描述之次世代定序。使用如上實施例7所描述之方法進行ROC分析，以確認階段1鑑定之正向選擇密碼子的非同義突變的技術係預測活動性、B型肝炎病毒誘導之肝臟疾病的發展。
2. 結果

階段1係鑑定在正向選擇壓力下的基因型B之B型肝炎病毒S開放閱讀框中的密碼子。

階段2係確定階段1鑑定之密碼子的非同義突變頻率是否預估病患是否於將於之後五年發展成活動性或非活動性肝臟疾病。

ROC分析係確定在如上實施例4之偽陽性率為0%時，預估活動性肝臟疾病發展的病患得分。
產業應用

本發明提供一種測定感染B型肝炎病毒基因型A、B或C之病患的肝臟發炎狀態、或感染B型肝炎病毒基因型A、B或C之病患對於慢性B型肝炎之肝臟併發症的易感性、或感染B型肝炎病毒基因型A、B或C之病患對於前述慢性B型肝炎之肝臟併發症的提高風險。本發明於醫藥、臨床及實驗室研究上應用具有可用性。

於前文敘述中，已經參考具有習知等同物的元件或整體，且該些等同物係如單獨闡述般地包括於本文中。

雖然本發明已透過實施例及參考特定實施態樣進行描述，熟習此項技術者將理解，在不背離本發明之精神的情形下可進行調整及∕或改善。

現僅透過實施例並參考附圖對本發明進行描述，其中：

第1圖係一接受者操作特徵（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲線，其顯示於B型肝炎病毒之S開放閱讀框中非同義突變頻率之靈敏度與特異性的關係，以預估肝臟疾病。在獲得血清樣品後，16位為HBeAg陰性、以大於2,000 IU∕毫升之HBV-DNA效價感染基因型C慢性B型肝炎病毒、且血清ALT值正常的受試者，被分為已發展嚴重B型肝炎相關肝臟疾病（肝臟發炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌—第A組）、或已發展非活動性肝臟疾病（inactive liver disease）十年（第B組）（每組8位受試者）。分析來自每位受試者的6個選殖株（clone）。計數每位受試者中含有非同義突變的6個選殖株中之2或更多個選殖株的32個正向選擇密碼子（Pr＞0.90）的數目，其中該32個正向選擇密碼子之鑑定如表6所示。該ROC曲線描繪出對於每個可能得分（於小方塊中），該測試的靈敏度（大於或等於該得分之第A組受試者的數量除以第A組受試者總數）與特異性（大於或等於該得分之第B組受試者的數量除以第B組受試者總數）之間的關係。

第2圖係一存活分析，將9位具有大於或等於3之得分的受試者（第1組）十年追蹤的結果，與7位具有大於或等於2之得分的受試者（第0組）十年追蹤之結果進行比較。該得分係以如上第1圖所描述進行計算。

Claims

一種測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒（HBV）之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的方法，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框（S ORF）的B型肝炎病毒，且該方法係包含： (a) 基於一相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列，於自該個體獲得之樣品中獲得關於至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息，以測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及 (b) 基於2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體的肝臟發炎狀態、或該B型肝炎病毒的基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險。
一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的系統，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該系統係包含： (a) 一測量工具，其係分析關於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息，以測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率； (b) 一處理器； (c) 一電腦可讀取之媒體；以及 (d) 一分析工具，其係儲存在適於被該處理器執行的該電腦可讀取之媒體中，以基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，進而基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險；該步驟（a）之分析或該步驟（d）之測定係基於一相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列。
一種測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的方法，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該方法係包含，藉由一種包含如下步驟之方法測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率： (a) 提供存在於自該個體獲得之樣品中關於至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息； (b) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列； (c) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率；以及 (d) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率測定該個體之肝臟發炎狀態、或測定該個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定該個體是否對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症為易感性、或該個體是否對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險。
一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的系統，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該系統係包含： (a) 一測量工具，其對於存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息； (b) 一處理器； (c) 一電腦可讀取之媒體；以及 (d) 一分析工具，其係儲存在適於被該處理器執行的電腦可讀取之媒體中，藉由執行下列步驟以測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率： (i) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列； (ii) 將該測量工具所產生之序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率； (iii) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域中非同義突變頻率測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險。
如請求項1或3之方法，其係包含使用一寡核苷酸引子對（oligonucleotide primer pair）放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物（amplimer）及產生該擴增引物之序列信息。
如請求項2或4之系統，其中該測量工具係包含一寡核苷酸引子對，且該寡核苷酸引子對係用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物。
如請求項2或4或6之系統，其中該測量工具係包含一核苷酸定序儀，且該核苷酸定序儀係用於自該樣品或該擴增引物產生序列信息。
如請求項2或4之系統，其中該測量工具係包含一寡核苷酸引子對及一核苷酸定序儀，且其中該寡核苷酸引子對係用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物，以及該核苷酸定序儀係用於自該擴增引物產生序列信息。
3、或5之方法，其係包含將該樣品或該擴增引物加入一或更多個核苷酸探針，且該核苷酸探針係雜交至該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中的特定核苷酸，以產生該序列信息。
4、或6之系統，其中該測量工具係包含一或更多個核苷酸探針，且該核苷酸探針係雜交至該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中的特定核苷酸，以自該樣品或擴增引物產生該序列信息。
如請求項5至10中任一項之方法或系統，其中該寡核苷酸引子對係包含： (a) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及 (b) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中該序列包含該B型肝炎病毒基因體之核苷酸100至2000。
一種用於測定一個體之肝臟發炎狀態、或測定一個體中B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定一個體對於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的易感性、或檢測一個體對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症的發展風險的套組，其中，該個體係感染包含B型肝炎病毒基因型A、B或C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒，且該套組係包含： (a) 一寡核苷酸引子對，其係用於放大存在於自該個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域，以製造一擴增引物，該引子對包含： (i) 一正向引子，其係包含一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中當該B型肝炎病毒係基因型B或C時，包含核苷酸1500至3215及核苷酸1至60，或者當該B型肝炎病毒係基因型A時，包含核苷酸1500至3221及核苷酸1至60；以及 (ii) 一反向引子，其係包含一互補於一部分B型肝炎病毒基因體參考序列之至少約5個連續核苷酸的序列，其中該參考序列係相應於該個體感染之B型肝炎病毒的基因亞型，且其中該序列包含該B型肝炎病毒基因體之核苷酸100至2000； (b) 增幅試劑（amplication reagents）； (c) 一或更多個核苷酸探針，其係雜交至該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中的特定核苷酸序列，以對於存在於自一個體獲得之樣品中至少一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域產生序列信息； (d) 一分析工具，其係用於在一處理器上執行下列步驟以測定該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率： (i) 選擇一段相應於該個體感染之B型肝炎病毒的S開放閱讀框基因亞型的S開放閱讀框參考序列； (ii) 將藉由一測量工具產生之關於該擴增引物中至少一部分之該S開放閱讀框區域的序列信息、或藉由一或更多個核苷酸探針產生的序列信息，與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率； (iii) 基於該2或更多個密碼子的非同義突變頻率來測定該S開放閱讀框區域之非同義突變頻率，以基於該S開放閱讀框區域之非同義突變頻率來測定該個體之肝臟發炎狀態、或B型肝炎病毒之基因狀態、或鑑定該個體是否易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症、或該個體是否對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險；或者 (e) 前述(a)至(d)中任何二或更多者的任何組合。
如請求項1至12中任一項之方法、系統、或套組，其中該個體係被包含B型肝炎病毒基因型C之S開放閱讀框的B型肝炎病毒感染。
如請求項1至12中任一項之方法、系統、或套組，其中該個體係被包含B型肝炎病毒基因型B之S開放閱讀框的B型肝炎病毒感染。
如請求項1至14中任一項之方法、系統、或套組，其中該S開放閱讀框區域中該2或更多個密碼子係選自一群組，且其中該群組係包含相應於SEQ ID NOs: 1至14中任一者之S開放閱讀框參考序列的位置4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387及391的密碼子。
如請求項3至15中任一項之方法、系統、或套組，其中選擇一相應於該個體感染之B型肝炎病毒之S開放閱讀框的基因亞型的S開放閱讀框參考序列係包含： (a) 將該序列信息與一或更多S開放閱讀框基因亞型參考序列進行比較，以測定該個體感染之B型肝炎病毒之S開放閱讀框的基因亞型；以及 (b) 選擇一相應於該個體感染之B型肝炎病毒之S開放閱讀框的基因亞型的S開放閱讀框參考序列。
如請求項3至15中任一項之方法、系統、或套組，其中選擇一相應於該個體感染之B型肝炎病毒之S開放閱讀框的基因亞型的S開放閱讀框參考序列係包含： (a) 提供關於該個體感染之B型肝炎病毒之S開放閱讀框的基因亞型的信息；以及 (b) 選擇一相應於該個體感染之B型肝炎病毒之S開放閱讀框的基因亞型的S開放閱讀框參考序列。
如請求項1至17中任一項之方法、系統、或套組，其係包含選擇如下序列的S開放閱讀框參考序列，或者其中該S開放閱讀框係包含以下序列： (a) SEQ ID NO: 1，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型A1時； (b) SEQ ID NO: 2，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型A2時； (c) SEQ ID NO: 3，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B1時； (d) SEQ ID NO: 4，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B2時； (e) SEQ ID NO: 5，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B3時； (f) SEQ ID NO: 6，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B4時； (g) SEQ ID NO: 7，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B5時； (h) SEQ ID NO: 8，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C1時； (i) SEQ ID NO: 9，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C2時； (j) SEQ ID NO: 10，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C3a時； (k) SEQ ID NO: 11，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C3b時； (l) SEQ ID NO: 12，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C4時； (m) SEQ ID NO: 13，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C5時；以及 (n) SEQ ID NO: 14，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C6時。
如請求項1至17中任一項之方法、系統、或套組，其係包含選擇一相應於2或更多個B型肝炎病毒基因型A、B或C之基因亞型的S開放閱讀框參考序列，或者其中該S開放閱讀框參考序列係相應於2或更多個前述基因亞型。
如請求項1至19中任一項之方法、系統、或套組，其中該慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症係包含肝硬化、肝癌、肝衰竭、肝臟發炎、肝損害、肝功能異常、或前述二或更多的組合。
如請求項1至20中任一項之方法、系統、或套組，其中，該方法係包含測定於該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的3或更多、4或更多、5或更多、或10或更多個密碼子的非同義突變頻率，或者該系統或套組包含一適於在處理器上執行的分析工具，以測定前述非同義突變頻率。
如請求項1至21中任一項之方法、系統、或套組，其中，該方法係包含測定於至少2、3、5、10、15、20或25個密碼子的非同義突變頻率，或者該系統或套組包含一適於在處理器上執行的分析工具，以測定前述非同義突變頻率，且其中該密碼子係相應於SEQ ID NOs: 1至14中任一者之S開放閱讀框參考序列的位置4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387及391的密碼子。
如請求項1至22中任一項之方法、系統、或套組，其中，該方法係包含測定於一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域內的2或更多個密碼子的非同義突變頻率，或者該系統或套組包含一適於在處理器上執行的分析工具，以測定前述非同義突變頻率，且其中該一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域係包含相應於SEQ ID NOs: 1至14中任一者之S開放閱讀框參考序列的密碼子1至400、密碼子1至300、密碼子1至200、密碼子1至100、密碼子100至400、密碼子100至300、密碼子100至200、密碼子200至400、密碼子200至300、或密碼子300至400。
如請求項1至23中任一項之方法、系統、或套組，其中，該方法係包含提供關於一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息，該系統係包含一產生關於一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息的測量工具，或者該套組係包含一用於放大一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的寡核苷酸引子對，且其中該一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域係包含相對於SEQ ID NOs: 1至14中任一者之S開放閱讀框參考序列的密碼子1至400、密碼子1至300、密碼子1至200、密碼子1至100、密碼子100至400、密碼子100至300、密碼子100至200、密碼子200至400、密碼子200至300、或密碼子300至400。
如請求項1至24中任一項之方法、系統、或套組，其中，該方法係包含提供關於一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息，該系統係包含一產生關於一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的序列信息的測量工具，或者該套組係包含一用於放大一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域的寡核苷酸引子對，且其中該一部分B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域係包含至少約10、20、50、100、200、250、300、400、500、750、1000或1200個該B型肝炎病毒之S開放閱讀框的連續核苷酸。
如請求項11至25中任一項之方法、系統、或套組，其中該B型肝炎病毒基因體參考序列為： (a) SEQ ID NO: 15，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型A1時； (b) SEQ ID NO: 16，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型A2時； (c) SEQ ID NO: 17，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B1時； (d) SEQ ID NO: 18，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B2時； (e) SEQ ID NO: 19，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B3時； (f) SEQ ID NO: 20，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B4時； (g) SEQ ID NO: 21，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型B5時； (h) SEQ ID NO: 22，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C1時； (i) SEQ ID NO: 23，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C2時； (j) SEQ ID NO: 24，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C3a時； (k) SEQ ID NO: 25，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C3b時； (l) SEQ ID NO: 26，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C4時； (m) SEQ ID NO: 27，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C5時；或者 (n) SEQ ID NO: 28，當該B型肝炎病毒之基因亞型為基因型C6時。
如請求項1至26中任一項之方法、系統、或套組，其中該序列信息係藉由次世代定序產生。
如請求項1至27中任一項之方法、系統、或套組，其中於B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中的該非同義突變頻率係指： (e) 該個體具有一陽性肝臟發炎狀態； (f) 該B型肝炎病毒係進行一正向選擇壓力（positive selection pressure）； (g) 該個體係易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症、或者對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險；或者 (h) 前述(a)至(c)中任何二或更多者的任何組合。
如請求項1至28中任一項之方法、系統、或套組，其係包含： (a) 將該序列信息與該S開放閱讀框參考序列進行比較，以測定於該S開放閱讀框區域中每2或更多個密碼子的非同義突變頻率； (b) 基於密碼子之非同義突變頻率以分派給各密碼子一數值得分；以及 (c) 結合各密碼子的數值得分以提供一表示該B型肝炎病毒之S開放閱讀框區域中非同義突變頻率的結合數值得分。
如請求項29之方法、系統、或套組，其係包含分派給各具有至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、或至少約50%之非同義突變頻率的密碼子一正向數值得分。
如請求項30之方法、系統、或套組，其中該各密碼子之正向得分獨立地為0.5、1、1.5、2或2.5。
如請求項29至31中任一項之方法、系統、或套組，其中一代表該B型肝炎病毒之S開放閱讀框中非同義突變頻率的結合數值得分大於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10係指： (a) 該個體具有一陽性肝臟發炎狀態； (b) 該B型肝炎病毒係進行一正向選擇壓力； (c) 該個體係易感於肝臟發炎或慢性B型肝炎感染之肝臟併發症、或者對於前述肝臟發炎或慢性B型肝炎病毒感染之肝臟併發症具有提高的發展風險；或者 (d) 前述(a)至(c)中任何二或更多者的任何組合。
如請求項1至32中任一項之方法、系統、或套組，其中該個體係： (a) HBeAg陰性； (b) 具有正常血清ALT值； (c) 具有一高於約2,000 IU∕毫升的血清HBV-DNA效價；或者 (d) 具有前述(a)至(c)中任何二或更多者的組合。