TWI564561B - Detection of KRAS oncogene for circulating cancer cells - Google Patents

Description

循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法

本發明係有關於一種循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，尤指涉及一種利用加權型酵素晶片操作平台（Weighted Enzymatic Chip Array, WEnCA），並合併加權因素之概念算法所成之方法，特別係指可用以評估標靶藥物-cetuximab療效者。

對基因過渡表現（Overexpression）之分析已經導致疾病診斷之基本進步與臨床進展。而研究基因過渡表現之技術係包含有北方墨點法（Northern Blot）、反轉錄聚合酶鏈鎖反應（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）及即時定量聚合酶鏈鎖反應（Real-Time PCR）。其中Northern Blot由於操作步驟十分敏瑣，所需檢體量又過多，因此僅限於研究操作上，無法實際應用於臨床診斷。至於RT-PCR及Real-Time PCR由於操作步驟簡便，因此在單一基因檢測之應用上，使用相當廣泛，例如肝炎病毒之檢測及感染症病原菌之鑑定。然而，雖然PCR序列之創作係作為整體最偉大之實驗，但多數PCR技術仍保有特定之共同問題，其主要問題包含有：其一係汙染，過渡靈敏偵察之偽陽性，例如霧式之DNA或先前之樣品殘餘；其二係RT-PCR僅被認為半定量，因為當比較不同之樣品時，難以控制序列放大之效率；以及其三係由於所需引子（Primer）間黏合（Annearling）之干擾，無論RT-PCR或Real-Time PCR都僅廣泛應用於單一基因標的之檢測，當檢測標的為基因群時，則PCR相關之技術則有操作耗時、費事及高成本等缺點。

隨著近幾年來生物科技之快速發展，生物晶片於臨床醫學診斷或藥效評估上之應用逐漸被重視，本發明之先前研究已開發並且評估一尼龍膜晶片（Membrane Array）方法，能使用於癌症診斷，在血液檢體（Peripheral Blood）中同時查出一多種mRNA標記引物之表達水準。其分子標誌之表達水準由RT-PCR與尼龍膜晶片評估，數據從RT-PCR與尼龍膜晶片取得，且受制於線性迴歸分析，顯示在這兩個方法結果之間之高度相互關係（r=0.979，P<0.0001）。另外，以相關衍生技術之加權化學冷光型基因晶片（Weighted Chemiluminescent Membrane Array, WCHMA）用於肺癌（Lung Cancer）患者之血液檢體分析標的治療藥物（Target Therapeutic Drug）之作用標的K-ras之異常情形，也已被接受刊登於肺癌期刊中。

雖然尼龍膜晶片於分子診斷及藥效評估上之應用已有許多報告提出，然而，由於原始尼龍膜晶片所使用判讀方法上，對於每一基因在特定疾病之重要性皆等值之概念下，造成檢測特異性在達到一定程度之後便不易提升。另外，由於呈色型晶片（Colorimetric Biochip）操作平台所需使用之洋地黃毒（Digoxigenin）系統成本十分昂貴，導致檢測成本過高，再加上晶片操作之高技術門檻，使得即使目前已經發展及評估成熟之診斷晶片仍不易普及於臨床醫學應用。故，ㄧ般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。

本發明之主要目的係在於，克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種利用加權型酵素晶片操作平台（Weighted Enzymatic Chip Array, WEnCA），並合併加權因素之概念算法所成之檢測方法，可用以評估標靶藥物-cetuximab療效者。

為達以上之目的，本發明係一種循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，其至少包含下列步驟：（Ａ）檢體前處理步驟：收集一待檢測之檢體，磁珠純化萃取得該檢體中之訊息核醣核酸（mRNA），將此mRNA經由反轉錄為互補去氧核醣核酸（cDNA）後，再以酵素標定成探針（Probe） ；（Ｂ）製備活化型KRAS檢測晶片步驟：將包含22個目標基因（target gene）、一組空白對照組（Blank Control與Negative control）及一組內部對照組（Internal Control）三重複點陣於一基材上，在該基材上形成被覆有標定特定核苷酸探針序列之活化型KRAS檢測晶片（Activating KRAS Chip），其中該22個目標基因係為ATP2A2、ATP6V0B、BCL2、CALM2、CEBPB、CLSTN1、COL4A1、CXCL11、CXCR4、CYR61、DVL3、E2F4、ETS1、H2AFZ、L1CAM、LRP1、RAP1B、RPL30、SLC25A5、SPP1、TAF12及TBX19；（Ｃ）雜合反應步驟：將該探針與該活化型KRAS檢測晶片進行雜合（Hybridization）反應，使該活化型KRAS檢測晶片表面之標定特定核苷酸探針序列與該探針上之酵素進行雜合處理，並將未反應之探針由晶片上洗淨；（Ｄ）晶片呈色步驟：將該活化型KRAS檢測晶片上雜合後之探針加上呈色劑進行呈色反應（Color Development）；以及（Ｅ）分析判讀步驟：擷取該活化型KRAS檢測晶片呈色反應後之影像，並對呈色反應後之影像結果進行自動化分析，將分析後所得之偵測值以基因加權計算方式，依據每個基因對於疾病形成或抗藥性發生之重要性給予個別加權分數（Weighted score），再經由陽性反應（Positive reaction）基因點乘上基因點之加權值而得到晶片之總分（Total Score）。

於本發明上述實施例中，該活化型KRAS檢測晶片上所有之基因位點係呈陣列排列狀。

於本發明上述實施例中，該活化型KRAS檢測晶片之內部對照組係為β-肌動蛋白（β-actin）。

於本發明上述實施例中，該檢體係可為血液、體液、細胞培養或組織細胞。

於本發明上述實施例中，該循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法係可評估標靶藥物- cetuximab之療效。

於本發明上述實施例中，該步驟（Ｆ）係給予該22個目標基因總加權分數為58，當中ATP2A2、CXCR4、RAP1B、ATP6V0B、CYR61與RPL30加權分數為4分；BCL2、DVL3、SLC25A5、CALM2、E2F4與SPP1加權分數為3分；CEBPB、ETS1、TAF12、CLSTN1、H2AFZ與TBX19加權分數為2分；以及COL4A1、L1CAM、CXCL11與LRP1加權分數為1分。

於本發明上述實施例中，該步驟（Ｆ）係以接受者操作特性曲線（Receiver Operating Characteristic Curve, ROC Curve）方式算出該活化型KRAS檢測晶片之陽性反應之邊界值（cutoff value）。

於本發明上述實施例中，該陽性反應之邊界值係為20。

於本發明上述實施例中，該基材係可為 玻璃（g lass） 、聚碳酸酯（ polycarbonate，PC） 、或 尼龍膜（ Nylon Membrane）。

１‧‧‧活化型KRAS檢測晶片
１０‧‧‧基材
１１‧‧‧目標基因
１１１‧‧‧核苷酸探針序列
１２‧‧‧空白對照組
１３‧‧‧內部對照組
S111～S115‧‧‧步驟

第１圖，係本發明之流程方塊示意圖。
第２圖，係本創作之活化型KRAS檢測晶片示意圖。
第３圖，係本發明活化型KRAS檢測晶片之基因位置排列示意圖。
第４圖，係本發明之基因加權示意圖。
第５圖，係本發明癌症組織反應後之晶片影像示意圖。

請參閱『第１圖～第４圖』所示，係分別為本發明之流程方塊示意圖、本創作之活化型KRAS檢測晶片示意圖、本發明活化型KRAS檢測晶片之基因位置排列示意圖、及本發明之基因加權示意圖。如圖所示：本發明係一種循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，可用以評估標靶藥物-cetuximab療效，利用加權型酵素晶片操作平台（Weighted Enzymatic Chip Array, WEnCA），並合併加權因素之概念算法所成之方法，其 至少包括下列步驟：

（Ａ）檢體前處理步驟S111：收集一待檢測之檢體，將檢體加入裂解緩衝液打破細胞，萃取得訊息核醣核酸（mRNA），經由加入磁珠（Magnetic Particles）與細胞內之RNA結合，將磁珠上之核酸與裂解緩衝液沖洗分離，繼而洗提（Elute）出磁珠上之mRNA，並將此純化而得之mRNA經由反轉錄為互補去氧核醣核酸（cDNA）後，再以酵素標定成探針（Probe），其中，該檢體係可為血液、體液、細胞培養或組織細胞等；

（Ｂ）製備活化型KRAS檢測晶片步驟S112：如第２圖所示，將包含數個目標基因（target gene）１１、一組空白對照組（Blank Control與Negative control）１２及一組內部對照組（Internal Control）１３三重複點陣於一基材１０上，在該基材１０上形成被覆有標定特定核苷酸探針序列１１１之活化型KRAS檢測晶片（Activating KRAS Chip）１，其中，該基材係可為 玻璃（g lass） 、聚碳酸酯（ polycarbonate，PC） 、或 尼龍膜（ Nylon Membrane）；

（Ｃ） 雜合反應步驟S113：將上述探針與該活化型KRAS檢測晶片進行雜合（Hybridization）反應，使該活化型KRAS檢測晶片表面之標定特定核苷酸探針序列與該探針上之酵素進行雜合處理，並將未反應之探針由晶片上洗淨；

（Ｄ） 晶片呈色步驟S114：將該活化型KRAS檢測晶片上雜合後之探針加上二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine, DAB）呈色劑進行呈色反應（Color Development）；以及

（Ｅ） 分析判讀步驟S115：擷取該活化型KRAS檢測晶片呈色反應後之影像，並對呈色反應後之影像結果進行自動化分析，將分析後所得之偵測值以基因加權計算方式，依據每個基因對於疾病形成或抗藥性發生之重要性給予個別加權分數（Weighted score），再經由陽性反應（Positive reaction）基因點乘上基因點之加權值而得到晶片之總分（Total Score）。如是，藉由上述揭露之流程構成一全新之循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法。

本發明在判讀時，係可對晶片上每一目標基因不同之重要性給予不同程度之加權 （Lung Cancer Ref），另以生物素-抗生物素蛋白（Biotin-Avidin）呈色系統取代原洋地黃毒（Digoxigenin）系統，建立全新之WEnCA操作平台，另由於此方法易於結合流體控制平台，以自動化操作系統進行，使得檢測時間大幅度降低，並減少人為操作差異所產生之誤差，進而突破晶片檢測技術在商品化過程所面臨之瓶頸。

為進一步瞭解循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法於臨床醫學檢測上之可作為檢測循環癌細胞之KRAS致癌基因之實用性，本發明於一用以檢測KRAS突變（KRAS mutation）之較佳實施例中，係取得210個臨床病理科確認為非小細胞肺癌（Non-small-cell lung carcinoma）及180個大腸直腸癌（Colorectal Cancer, CRC）患者之末梢血液檢體，以上述建構之活化型KRAS檢測晶片１利用本方法（配合WEnCA操作平台）之靈敏度（Sensitivity）、特異性（Specificity）及準確性作為檢體中KRAS突變之檢測。

上述建構之活化型KRAS檢測晶片１如第２圖所示，係選定與非小細胞肺癌及大腸直腸癌相關之目標基因，將包含22個目標基因１１、該空白對照組１２及該內部對照組１３三重複點陣於該基材１０（如：尼龍膜）上，基因位點排列順序如第３圖所示之陣列排列狀，其中該22個目標基因１１係為ATP2A2、ATP6V0B、BCL2、CALM2、CEBPB、CLSTN1、COL4A1、CXCL11、CXCR4、CYR61、DVL3、E2F4、ETS1、H2AFZ、L1CAM、LRP1、RAP1B、RPL30、SLC25A5、SPP1、TAF12及TBX19，且該內部對照組１３係為β-肌動蛋白（β-actin）。上述22個目標基因及 內部對照組β-肌動蛋白之核苷酸探針序列，其序列內容如後顯示之基因序表。

實驗數據N=210非小細胞肺癌+180大腸直腸癌：如表一所示，本發明以直接定序法檢測腫瘤組織中KRAS突變，在加權冷光晶片反應之分析上，本發明首先整理晶片上22個目標基因點在具活化型K-ras突變之癌症組織（cancer tissue）中過渡表現之比例，並將之分為四個等級，基因點在80個以上之癌組織中呈現過渡表現者，加權分數為4；在70～80個癌組織中呈現過渡表現者，加權分數為3；過渡表現僅在60～70個癌組織中存在之基因點，加權分數為2；若僅能50～60個癌組織中測得過渡表現之基因點，加權分數為1。如第４圖所示，該22個目標基因總加權分數為58；其中ATP2A2、CXCR4、RAP1B、ATP6V0B、CYR61與RPL30加權分數為4分；BCL2、DVL3、SLC25A5、CALM2、E2F4與SPP1加權分數為3分；CEBPB、ETS1、TAF12、CLSTN1、H2AFZ與TBX19加權分數為2分；以及COL4A1、L1CAM、CXCL11與LRP1加權分數為1分。經由反應後晶片上陽性反應之基因數，乘上加權值之後，先計算出每一反應後之晶片之總分，而後同樣以組織是否實際具有可測得之突變點作為標準參考值。並利用接受者操作特性曲線（Receiver Operating Characteristic Curve, ROC Curve）方式算出該活化型KRAS檢測晶片之陽性反應之邊界值（cutoff value）為20，此晶片在組織中之檢測結果，其靈敏度與準確性可達96%，特異性亦可達97%。

 

 

表一

表一中95%CI代表95%信賴區間。

請參閱『第５圖』所示，係本發明癌症組織反應後之晶片影像示意圖。如圖所示：為上述癌症組織反應後之晶片影像圖，包含圖中左側之帶有K-ras基因突變之癌症組織（cancer tissue with K-ras mutation），以及右側之帶有原生型K-ras基因之癌症組織（cancer tissue with wild type K-ras）。經結果顯示可知，帶有K-ras基因突變之癌症組織於晶片反應結果為陽性（Positive），而帶有原生型K-ras基因之癌症組織於晶片反應結果為陰性（Negative）。

本發明於另一用以檢測治療FOLFOX-4 plus Cetuximab後是否會復發（Relapse）之較佳實施例中，係取210大腸直腸癌病人（colorectal cancer patients）為實驗數據n，其結果如下表二～四所示，當活化型KRAS檢測晶片結果為陰性，則表示病人復發之機率較低。

 

 

 

 

表二

表三

表四

據此，本發明係揭露可提供一快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易於結合自動化之WEnCA操作平台之方法，可進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統生醫檢測上所無法達成之目標。由於本發明不需大型離心機，因此易於在各個實驗操作，並易於自動化，且採用包含Poly-T引子之磁珠以利萃取之mRNA純度更高，使反應後之晶片背景值降低，準確度高。此外，本發明以Biotin-Avidin取代Digoxigenin，不僅使用之酵素成本低，且以DAB作為呈色劑之穩定度亦高，顏色容易保存；再者，本發明亦在最後之結果判讀上以基因加權計算值之決定方式，配合ROC Curve決定陽性判讀標準，經上述臨床測試結果顯示本方法之準確度係能更準確地輔助疾病之診斷。因此本發明係可於臨床上提高診斷靈敏性、特異性及準確性之同時，加上若結合自動化操作系統更可使檢測時間大幅降低，並減少人為操作誤差，以達突破晶片檢測技術在商品化過程所面臨之瓶頸。

綜上所述，本發明係一種循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，可有效改善習用之種種缺點，其利用加權型酵素晶片操作平台（Weighted Enzymatic Chip Array, WEnCA），並合併加權因素之概念算法，可用以評估標靶藥物-cetuximab療效，提供一快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易於自動化之WEnCA操作平台之方法，以進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統生醫檢測上所無法達成之目標者，進而使本發明之産生能更進步、更實用、更符合使用者之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

S111~S115‧‧‧步驟

Claims (8)

1. 一種循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，其至少包含下列步驟：(A)檢體前處理步驟：收集一待檢測之檢體，磁珠純化萃取得該檢體中之訊息核醣核酸(mRNA)，將此mRNA經由反轉錄為互補去氧核醣核酸(cDNA)後，再以酵素標定成探針(Probe)；(B)製備活化型KRAS檢測晶片步驟：將包含22個目標基因(target gene)、一組空白對照組(Blank Control與Negative control)及一組內部對照組(Internal Control)三重複點陣於一基材上，在該基材上形成被覆有標定特定核苷酸探針序列之活化型KRAS檢測晶片(Activating KRAS Chip)，其中該22個目標基因係為ATP2A2、ATP6V0B、BCL2、CALM2、CEBPB、CLSTN1、COL4A1、CXCL11、CXCR4、CYR61、DVL3、E2F4、ETS1、H2AFZ、L1CAM、LRP1、RAP1B、RPL30、SLC25A5、SPP1、TAF12及TBX19；(C)雜合反應步驟：將該探針與該活化型KRAS檢測晶片進行雜合(Hybridization)反應，使該活化型KRAS檢測晶片表面之標定特定核苷酸探針序列與該探針上之酵素進行雜合處理，並將未反應之探針由晶片上洗淨；(D)晶片呈色步驟：將該活化型KRAS檢測晶片上雜合後之探針加上呈色劑進行呈色反應(Color Development)；以及(E)分析判讀步驟：擷取該活化型KRAS檢測晶片呈色反應後之影像，並對呈色反應後之影像結果進行自動化分析，將分析後所 得之偵測值以基因加權計算方式，依據每個基因對於疾病形成或抗藥性發生之重要性給予個別加權分數(Weighted score)，再經由陽性反應(Positive reaction)基因點乘上基因點之加權值而得到晶片之總分(Total Score)，其中在判讀時，係給予該22個目標基因總加權分數為58，當中ATP2A2、CXCR4、RAP1B、ATP6V0B、CYR61與RPL30加權分數為4分；BCL2、DVL3、SLC25A5、CALM2、E2F4與SPP1加權分數為3分；CEBPB、ETS1、TAF12、CLSTN1、H2AFZ與TBX19加權分數為2分；以及COL4A1、L1CAM、CXCL11與LRP1加權分數為1分，並以抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)呈色系統取代洋地黃毒(Digoxigenin)系統。
2. 依申請專利範圍第1項所述之循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，其中，該活化型KRAS檢測晶片上所有之基因位點係呈陣列排列狀。
3. 依申請專利範圍第1項所述之循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，其中，該活化型KRAS檢測晶片之內部對照組係為β-肌動蛋白(β-actin)。
4. 依申請專利範圍第1項所述之循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，其中，該檢體係可為血液、體液、細胞培養或組織細胞。
5. 依申請專利範圍第1項所述之循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，係可評估標靶藥物-cetuximab之療效。
6. 依申請專利範圍第1項所述之循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，其中，該步驟(E)係以接受者操作特性曲線(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC Curve)方式算出該活化型KRAS檢測晶片之陽性反應之邊界值(cutoff value)。
7. 依申請專利範圍第6項所述之循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方 法，其中，該陽性反應之邊界值係為20。
8. 依申請專利範圍第1項所述之循環癌細胞之KRAS致癌基因檢測方法，其中，該基材係為玻璃(glass)、聚碳酸酯(polycarbonate，PC)、或尼龍膜(NylonMembrane)。