TW201902928A - 人類化抗原-結合域及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VI)區及重鏈可變(VH)區，其中該人類化VL及VL區源自小鼠抗CD19純系FMC63抗體；該人類化VL及/或人類化VH區在構架區中包含一或多個胺基酸取代。該人類化抗CD19抗體或抗原結合片段可為單鏈可變片段(scFv)、嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之一部分。本發明之其他態樣係關於包含該CAR或該TCR之細胞及該等細胞在T細胞療法中之用途。

Description

人類化抗原-結合域及使用方法
人類癌症就其本質而言包含經歷遺傳或表觀遺傳轉化變為異常癌細胞之正常細胞。藉此，癌細胞開始表現蛋白質，且不同於由正常細胞及/或蛋白質表現之抗原的其他抗原以比由正常細胞表現顯著更大的量表現。
包含能夠與癌細胞表現蛋白質相互作用之結合域的嵌合抗原受體(CAR)及工程改造T細胞受體(TCR)使T細胞靶向且殺死表現特定蛋白質之癌細胞。類似地，結合治療劑之抗體能夠選擇性地為表現特定蛋白質之癌細胞提供治療劑且殺死此等癌細胞。
需要靶向及殺死癌細胞之包含人類化抗原結合域之CAR、TCR及抗體。
本發明藉由提供組合物及方法來解決此需要，該等組合物及方法包括表現具有人類化抗原結合域之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)的經工程改造之免疫細胞；此等CAR及TCR特異性靶向且殺死癌細胞。本發明亦藉由提供包括特異性靶向且殺死癌細胞之抗體之組合物及方法來解決此需要。
本發明之一態樣為人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段。抗體包含輕鏈可變(VI)區及重鏈可變(VH)區，其中該VL區包含VL互補決定區(CDR) 1 (VL CDR1)、VL CDR2及VL CDR3，且該VH區包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。VL區可源自SEQ ID NO: 36且VH區源自SEQ ID NO: 37，且VL及/或VH區在構架區中包含一或多個胺基酸取代。
在一些實施例中，技術方案1之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中與SEQ ID NO: 36相比，VL區包含至多5、10、15、20、25或30個胺基酸取代。
在一些實施例中，VL區中之一或多個胺基酸取代位於與SEQ ID NO: 36之7、8、10、15、22、41、42、43、44、49、71、72、77、79、80、83、87、100及/或107對應之位置。
在一些實施例中，VL區中之一或多個胺基酸取代係選自SEQ ID NO: 36之位置7之Ser、位置8之Pro、位置15之Val、位置22之Thr、位置41之Gln、位置42之Lys、位置43之Ala、位置72之Thr、位置77之Ser、位置79之Gln、位置80之Pro及/或位置107之Lys。
在一些實施例中，與SEQ ID NO: 37相比，VH區包含至多5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸取代。
在一些實施例中，VH區中之一或多個胺基酸取代位於與SEQ ID NO: 37之1、3、5、9、13、15、16、17、19、20、21、23、24、37、42、48、67、69、70、71、73、76、77、78、79、81、83、86、87、88、92及/或115對應之位置。
在一些實施例中，VH區中之一或多個胺基酸取代係選自SEQ ID NO: 37之位置1之Gln、位置3之Gln、位置5之Val、位置9之Gly、位置13之Lys、位置13之Gln、位置15之Gly、位置16之Arg、位置16之Thr、位置17之Thr、位置19之Arg、位置20之Leu、位置21之Ser、位置24之Ala、位置42之Gly、位置48之Ile、位置67之Phe、位置70之Ser、位置71之Arg、位置73之Thr、位置76之Asn、位置77之Thr、位置78之Leu、位置79之Tyr、位置81之Gln、位置83之Ser、位置86之Thr、位置86之Arg、位置87之Ala、位置88之Glu、位置88之Ala、位置92之Val及/或位置115之Leu。
本發明之另一態樣為人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VI)區及重鏈可變(VH)區。VL區包含VL互補決定區(CDR) 1 (VL CDR1)、VL CDR2及VL CDR3且VH區包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。VL區具有與SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 17至少85%一致之胺基酸序列；及/或VH區具有與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 18至少85%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：IgG、Fab、Fab′、F(ab′)2 、Fv、scFv及單域抗體(dAB)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為scFv。
在一些實施例中，VL CDR1與SEQ ID NO: 27至少80%一致，VL CDR2與SEQ ID NO: 28至少80%一致，且VL CDR3與SEQ ID NO: 29至少80%一致。
在一些實施例中，VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，且VL CDR3包含SEQ ID NO: 29。
在一些實施例中，VH CDR1與SEQ ID NO: 30或33至少80%一致，VH CDR2與SEQ ID NO: 31或34至少80%一致，VH CDR3與SEQ ID NO: 32至少80%一致。
在一些實施例中，VH CDR1包含SEQ ID NO: 30或33，VH CDR2包含SEQ ID NO: 31或34，且VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
在一些實施例中，VL CDR1與SEQ ID NO: 27至少80%一致，VL CDR2與SEQ ID NO: 28至少80%一致，VL CDR3與SEQ ID NO: 29至少80%一致，VH CDR1與SEQ ID NO: 30或33至少80%一致，VH CDR2與SEQ ID NO: 31或34至少80%一致，且VH CDR3與SEQ ID NO: 32至少80%一致。
在一些實施例中，VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，VL CDR3包含SEQ ID NO: 29，VH CDR1包含SEQ ID NO: 30或33，VH CDR2包含SEQ ID NO: 31或34，且VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
在一些實施例中，VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，VL CDR3包含SEQ ID NO: 29，VH CDR1包含SEQ ID NO: 30，VH CDR2包含SEQ ID NO: 31，且VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
在一些實施例中，VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，VL CDR3包含SEQ ID NO: 29，VH CDR1包含SEQ ID NO: 33，VH CDR2包含SEQ ID NO: 34，且VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
在一些實施例中，VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，VL CDR3包含SEQ ID NO: 29，VH CDR1包含SEQ ID NO: 30，VH CDR2包含SEQ ID NO: 34，且VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 14至少85%一致。
在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 15至少85%一致。
在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 14至少85%一致，且VH與SEQ ID NO: 15至少85%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 14至少90%一致，且VH與SEQ ID NO: 15至少90%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 14至少95%一致，且VH與SEQ ID NO: 15至少95%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 14至少99%一致，且VH與SEQ ID NO: 15至少99%一致。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 14且VH包含SEQ ID NO: 15。
在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO: 24。
在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 20至少85%一致。
在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 21至少85%一致。
在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 20至少85%一致，且VH與SEQ ID NO: 21至少85%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 20至少90%一致，且VH與SEQ ID NO: 21至少90%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 20至少95%一致，且VH與SEQ ID NO: 21至少95%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 20至少99%一致，且VH與SEQ ID NO: 21至少99%一致。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 20且VH包含SEQ ID NO: 21。
在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO: 26。
在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 11至少85%一致。
在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 12至少85%一致。
在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 11至少85%一致，且VH與SEQ ID NO: 12至少85%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 11至少90%一致，且VH與SEQ ID NO: 12至少90%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 11至少95%一致，且VH與SEQ ID NO: 12至少95%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 11至少99%一致，且VH與SEQ ID NO: 12至少99%一致。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 11且VH包含SEQ ID NO: 12。
在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO: 23。
在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 17至少85%一致。
在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 18至少85%一致。
在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 17至少85%一致，且VH與SEQ ID NO: 18至少85%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 17至少90%一致，且VH與SEQ ID NO: 18至少90%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 17至少95%一致，且VH與SEQ ID NO: 18至少95%一致。在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 17至少99%一致，且VH與SEQ ID NO: 18至少99%一致。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 17且VH包含SEQ ID NO: 18。
在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO: 25。
本發明之另一態樣為一多肽，其包含以上態樣或實施例之人類化抗CD19抗體。
在一些實施例中，多肽包含包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之His Tag。
在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19至少85%一致。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19至少90%一致。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19至少95%一致。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19至少99%一致。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19。
在一些實施例中，多肽連接至治療劑。在一些實施例中，治療劑為化學治療劑、細胞介素、放射性原子、siRNA或毒素。在一些實施例中，治療劑為化學治療劑。
在一些實施例中，藥劑為放射性原子。
本發明之另一態樣為嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。CAR或TCR包含(i)抗原結合結構域、(ii)協同刺激域及(iii)活化域。協同刺激域包含細胞外域、跨膜域及細胞內域，且抗原結合域至少包含技術方案52之多肽。
在一些實施例中，協同刺激域來自或源自CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、 IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位受體(Toll ligand receptor)及其片段或組合。
在一些實施例中，跨膜域來自或源自4-1BB/CD137、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、 IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位受體及其組合。
在一些實施例中，細胞內域來自或源自4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CDl la、CDl lb、CDl lc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、免疫球蛋白樣蛋白質、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、特異性結合CD83之配位體、LIGHT、LIGHT (腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴細胞作用相關之抗原-1 (LFA-1 (CDl la/CD18)、MHC I類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、計劃性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、鐸配位受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其組合。
在一些實施例中，細胞外域來自或源自CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、 IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位受體及其片段或組合。
在一些實施例中，活化域來自或源自CD3-ζ或CD3-ε。
本發明之一態樣為人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其進一步包含以上態樣或實施例之CAR或TCR。
本發明之另一態樣為編碼以上態樣或實施例之人類化抗CD19抗體或抗原結合片段之載體。
在一些實施例中，載體為腺病毒載體、腺病毒相關之載體、DNA載體、豆狀病毒載體、質體、反轉錄病毒載體或RNA載體。在一些實施例中，載體為反轉錄病毒載體。在一些實施例中，反轉錄病毒載體為豆狀病毒載體。
本發明之另一態樣為由以上態樣或實施例之載體編碼之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
本發明之另一態樣為細胞，其包含以上態樣或實施例之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段、以上態樣或實施例之載體或以上態樣或實施例之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
在一些實施例中，細胞為T細胞。
在一些實施例中，T細胞為同種異體T細胞、自體T細胞、經工程改造之自體T細胞(eACT)或腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
在一些實施例中，T細胞為CD4+ T細胞。
在一些實施例中，T細胞為CD8+ T細胞。
在一些實施例中，細胞為活體外細胞。
在一些實施例中，T細胞為自體T細胞。
在一些實施例中，細胞在結合至人類CD19時至少產生干擾素γ (IFNγ)。
本發明之一態樣為包含複數個以上態樣或實施例之細胞之組合物。
在一些實施例中，組合物包含CD4+或CD8+細胞。在一些實施例中，組合物包含CD4+及CD8+細胞。在一些實施例中，約20%與80%之間的T細胞為CD4+細胞，且其餘T細胞為CD8+細胞。在一些實施例中，約30%與70%之間的T細胞為CD4+細胞，且其餘T細胞為CD8+細胞。在一些實施例中，約40%與60%之間的T細胞為CD4+細胞，且其餘T細胞為CD8+細胞。在一些實施例中，約50%之T細胞為CD4+細胞，且約50%之T細胞為CD8+細胞。
在一些實施例中，複數個細胞中之各細胞為自體T細胞。
在一些實施例中，組合物包含至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
本發明之另一態樣為一種組合物，其包含以上態樣或實施例之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段、以上態樣或實施例之載體或以上態樣或實施例之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
本發明之另一態樣為製造表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞之方法。該方法包含用以上態樣或實施例之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段或以上態樣或實施例之載體轉導細胞之步驟。
在一些實施例中，細胞為自需要治療之患者分離之淋巴細胞。
在一些實施例中，淋巴細胞為自然殺手細胞、T細胞或B細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含在促進細胞增殖及/或T細胞活化之條件下培養細胞之步驟。
在一些實施例中，該方法進一步包含分離所需T細胞之步驟。
在一些實施例中，分離所需T細胞之步驟發生在培養約六天之後。
在一些實施例中，所需T細胞表現CD4+及/或CD8+。
本發明之另一態樣為治療B細胞淋巴瘤之方法，其包含向有需要之個體投與以上態樣或實施例之細胞或以上態樣或實施例之組合物。
在一些實施例中，B細胞淋巴瘤係選自由以下組成之群：急性淋巴母細胞白血病(ALL)、AIDS相關之淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、經典霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin lymphoma)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、產生HHV8相關多中心卡斯爾曼氏病(HHV8-associated multicentric Castleman's disease)之大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、淋巴漿細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤(MALT)、結邊緣區B細胞淋巴瘤(NMZL)、節狀淋巴細胞為主型霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenström's macroglobulinemia)。在一些實施例中，B細胞淋巴瘤係選自由以下組成之群：急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤(MALT)及非霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，B細胞惡性病為非霍奇金氏淋巴瘤。
一般而言，本發明係關於縮寫為「eACT™」之經工程改造之自體細胞療法，亦稱為授受細胞轉移eACT™，為一種方法，藉由該方法收集患者自身T細胞且隨後經遺傳工程改造以識別且靶向一或多種特異性癌症適應症之細胞表面上表現之一或多個抗原。T細胞可經工程改造以表現例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。參見圖1A、圖1B及圖2。CAR陽性(CAR+)T細胞經工程改造以表現CAR。CAR可包含例如對例如人類CD19之特定腫瘤抗原具有特異性之人類化單鏈可變片段(scFv)。scFV可直接或間接連接至包含至少一個協同刺激域之細胞內信號傳導部分，其又直接或間接連接至至少一個活化域。CAR之組分可以任何次序排列。CART細胞療法及構築體之實例描述於美國專利公開案第2013/0287748號、第2014/0227237號、第2014/0099309號及第2014/0050708號；美國臨時申請案第62/470,703號及第62/317,258號；國際專利公開案第WO2012033885號、第WO2012079000號、第WO2014127261號、第WO2014186469號、第WO2015080981號、第WO2015142675號、第WO2016044745號及第WO2016090369號；及Rosenberg及Restifo,Cancer Immunology and Immunotherapy , 348: 62-68 (2015)中，其各以全文引用的方式併入本文中。
另外，本發明大體上係關於對人類CD19具有特異性之人類化單鏈可變片段(scFv)。人類化scFV抗人類CD19 scFV可結合至(例如連接至)用於結合至癌細胞、將治療劑遞送至癌細胞且殺死表現人類CD19之癌細胞的治療劑(例如化學治療劑及放射性原子)。
本文所述之任何態樣或實施例可與如本文所揭示之任何其他態樣或實施例組合。儘管本發明已結合其實施方式加以描述，但前述描述意欲說明且不限制由隨附申請專利範圍之範疇定義的本發明之範疇。其他態樣、優點及修改屬於以下申請專利範圍之範疇內。
本文所提及之專利及科學文獻確立熟習此項技術者可獲得之知識。本文中所引用之所有美國專利及公開或未公開之美國專利申請案均以引用的方式併入。本文中所引用之所有公開之外國專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中。本文中所引用之所有其他公開之參考文獻、詞典、文獻、稿圖及科學文獻均以引用的方式併入本文中。
本發明之其他特徵及優勢將自圖式及包括實施例及申請專利範圍之以下詳細描述顯而易見。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2017年4月24日申請之美國臨時申請案第62/489,258號之優先權，其以全文引用的方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。2017年4月24產生之該ASCII複本命名為K-1046_01SL_ST25.txt且大小為43,305位元組。
本發明係關於新穎多肽，其包含識別且結合人類CD19及編碼其之聚核苷酸的人類化抗原結合域。本發明之一些態樣係關於編碼包含人類化抗人類CD19抗原結合域之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之聚核苷酸。本發明亦提供包含此類聚核苷酸之載體(例如病毒載體)及包含此類載體之組合物。本發明進一步提供編碼此類CAR或TCR之聚核苷酸及包含此類聚核苷酸之組合物。本發明另外提供包含此類聚核苷酸及/或經此類病毒載體轉導之經工程改造之細胞(例如T細胞)及包含此類經工程改造之細胞之組合物。本發明提供包括複數個經工程改造之T細胞之組合物(例如醫藥組合物)。本發明提供製造此類經工程改造之T細胞及組合物之方法及此類經工程改造之T細胞及組合物之用途(例如用於治療B細胞淋巴瘤中)。並且本發明提供誘導對抗腫瘤之免疫性之方法，其包含向個體投與有效量之包含本發明之聚核苷酸、載體或多肽之細胞。本發明之其他態樣係關於包含CAR或TCR之細胞及其在例如自體細胞療法(eACT™)之T細胞療法中之用途，其係用於治療罹患癌症之患者。定義
為了使本發明可更易於理解，以下首先對某些術語進行定義。以下術語及其他術語之額外定義貫穿本說明書闡述。
除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一（a/an）」及「該（the）」包括複數個指示物。
除非明確陳述或自上下文顯而易見，否則如本文所用之術語「或」應理解為包括性的且涵蓋「或」與「及」。
本文所用之術語「及/或」應視為兩種指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之特定揭示內容。因此，諸如本文「A及/或B」之短語中所用之術語「及/或」意欲包括A及B；A或B；A(單獨)；及B(單獨)。同樣，諸如「A、B及/或C」之短語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
如本文所用，術語「例如」及「亦即」僅作為舉例使用，但不意欲限制，且不應視為僅提及說明書中明確列舉之彼等條目。
術語「或更多個」、「至少」、「大於」及例如「至少一個」之其類似術語應理解為，包括(但不限於)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149 or 150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或大於陳述值。亦包括任何更大的數目或之間的分數。
相反，術語「不超過」包括小於陳述值之各值。舉例而言，「不超過100個核苷酸」包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1及0個核苷酸。亦包括任何更小的數目或之間的分數。
術語「複數個」、「至少兩個」、「兩種或更多個」、「至少第二個」及其類似物應理解為包括(但不限於)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149 or 150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多個。亦包括任何更大的數目或之間的分數。
在本說明書通篇中，詞語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所陳述之要素、整數或步驟、或要素、整數或步驟之群組，但不排除任何其他要素、整數或步驟、或要素、整數或步驟之群組。應瞭解每當本文中用語言「包含」描述態樣時，則亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」所描述之類似態樣。除非特定陳述或自上下文顯而易見，否則如本文所用，術語「約」係指如藉由一般熟習此項技術者所測定之特定值或組成之可接受誤差範圍內之值或組成，其將部分取決於值或組成之量測或測定方式，亦即測量系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含」可意謂根據此項技術中之實踐在一個或一個以上標準差內。「約」或「基本上包含」可意謂至多10% (亦即±10%)之範圍。因此，「約」可應理解為在大於或小於陳述值10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或0.001%之內。舉例而言，約5 mg可包括4.5 mg與5.5 mg之間的任何量。此外，尤其在生物系統或方法方面，該等術語可意謂值之至多一個數量級或至多5倍。當特定值或組成提供於本發明中時，除非另外說明，否則「約」或「基本上由……構成」之含義應假設為在特定值或組成之可接受之誤差範圍內。
如本文所述，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所述範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。
本文所用之單元、前綴及符號使用其國際單位系統(SI)可接受之形式來提供。數值範圍包括界定該範圍之數字。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，Juo, 「The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology」, 第2版, (2001), CRC Press；「The Dictionary of Cell & Molecular Biology」第5版, (2013), Academic Press；及「The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology」, Cammack等人編, 第2版, (2006), Oxford University Press為熟習此項技術者提供本發明中所用之許多術語之通用辭典。
「投與」係指使用熟習此項技術者已知之各種方法及遞送系統中之任一者將藥劑物理引入至個體中。本文所揭示之調配物的例示性投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、脊柱或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，片語「非經腸投與」意謂通常藉由注射實現之除經腸及局部投與外之投與模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注，以及活體內電穿孔。在一些實施例中，調配物經由非腸胃外途徑，較佳經口投與。其他非腸胃外途徑包括局部、表皮或黏膜投與途徑，例如鼻內、經陰道、經直腸、舌下或局部。投與亦可執行例如一次、複數次及/或經一或多個延長之週期。
術語「抗體」(Ab)包括(但不限於)特異性結合至抗原之糖蛋白免疫球蛋白。一般而言，抗體可包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈，或其抗原結合分子。各H鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域CL。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，其自胺基端至羧基端以如下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。Ab之恆定區可調節免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)的結合。
抗體可包括例如單株抗體、以重組方式產生之抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、經工程改造之抗體、人類化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體、抗體融合物(在本文中有時稱為「抗體結合物」)、異結合抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fvs (scFv)、駱駝化抗體、親和抗體、Fab片段、F(ab')2 片段、二硫鍵連接之Fvs (sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如抗抗Id抗體)、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(在本文中有時稱為「抗體模擬物」)及以上任一者之抗原結合片段。在某些實施例中，本文所述之抗體係指多株抗體群體。
免疫球蛋白可源自任一通常已知同型，包括(但不限於) IgA、分泌性IgA、IgG、IgE及IgM。IgG子類亦為熟習此項技術者所熟知，且包括(但不限於)人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之Ab類別或子類(例如IgM或IgG1)。術語「抗體」包括例如天然產生與非天然產生之Ab；單株與多株Ab；嵌合與人類化Ab；人類或非人類Ab；完全合成Ab；及單鏈Ab。非人類Ab可藉由重組方法人類化以降低其在人中之免疫原性。若未明確陳述且除非上下文指示，否則術語「抗體」亦包括前述免疫球蛋白中任一者之抗原結合片段或抗原結合部分，且包括單價及二價片段或部分、及單鏈Ab。
「源自抗體之胺基酸序列」可以物理方式得到，例如自編碼抗體之聚核苷酸之片段表現，或可以電腦模擬得到，例如確定編碼抗體(或其片段)之核苷酸序列用以合成人工聚核苷酸序列(或片段)且人工聚核苷酸序列表現為抗體或其片段。
「抗原結合分子」、「抗原結合部分」或「抗體片段」係指包含分子來源之抗體之抗原結合部分(例如CDR)之任何分子。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括(但不限於)由抗原結合分子形成之Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體及多特異性抗體。肽體(亦即包含肽結合域之Fc融合分子)為適合抗原結合分子之另一實例。在一些實施例中，抗原結合分子結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中，抗原結合分子結合至與過度增生性疾病有關之細胞上之抗原或病毒性或細菌性抗原。在某些實施例中，抗原結合分子結合至CD19。在其他具體實例中，抗原結合分子為特異性結合至抗原之抗體片段，包括其互補決定區(CDR)中之一或多者。
在其他實施例中，抗原結合分子為單鏈可變片段(scFv)。scFv多肽分子為共價連接之VH ::VL 雜二聚體，其可自包括由編碼肽之連接子連接的VH 及VL 編碼基因之基因融合物表現。(參見Huston等人 (1988)Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883)。連接肽(例如具有約十至約25個胺基酸)通常富含甘胺酸以提供可撓性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以提供溶解性。連接子可使VH之N端與VL之C端連接或使VH之C端與VL之N端連接。此蛋白保留原始免疫球蛋白之特異性，但去除恆定區且引入連接子。scFv亦可包括N端肽序列，其有時稱為「信號肽」或「前導序列」。已描述多種方法來辨別化學結構以用於使來自抗體V區之天然聚集(但經化學分離)之輕多肽鏈及重多肽鏈轉化成為scFv分子，該scFv分子將摺疊以形成大體上與抗原結合位點之結構類似之三維結構。參見例如美國專利第5,091,513號、第5,132,405號及第4,946,778號。
已經且可產生極大初始人類scFv文庫以提供針對靶向分子之多血症的大重排抗體基因來源。可自患有傳染病之個體構築較小文庫以分離疾病特異性抗體(參見Barbas等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43 (1992)；Zebedee等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992))。
如本文所用，術語「可變區」或「可變域」可互換地使用且在此項技術中具有共性。可變區通常係指抗體之一部分，一般係指輕鏈或重鏈之一部分，通常係指成熟重鏈中胺基端約110至120個胺基酸及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸以，其序列在抗體間廣泛不同且用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列中之可變性集中於稱為互補決定區(CDR)之彼等區中，而可變域中更高度保守之區稱為構架區(FR)。在不希望受任何特定機制或理論束縛之情況下，咸信輕鏈及重鏈之CDR為引起抗體與抗原之相互作用及特異性的主要原因。在某些實施例中，可變區為人類可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒類或鼠類CDR及人類構架區(FR)。在特定實施例中，可變區為靈長類(例如非人類靈長類)可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒類或鼠類CDR及靈長類(例如非人類靈長類)構架區(FR)。
術語「VL」、「VL區」及「VL域」可互換使用以指示諸如抗體或其抗原結合片段之抗原結合域之輕鏈可變區，且包含一、二或所有三個CDR。
術語「VH」、「VH區」及「VH域」可互換使用以指示諸如抗體或其抗原結合片段之抗原結合域之重鏈可變區，且包含一、二或所有三個CDR。
通常使用多種CDR定義：Kabat編號、Chothia編號、AbM編號或contact編號。AbM定義為由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用之兩種之間的折衷。Contact定義係基於可用複合晶體結構之分析。 表1. CDR編號
術語「Kabat編號」及類似術語在此項技術中公認且係指編號抗體或其抗原結合分子之重鏈及輕鏈可變區中之胺基酸殘基之系統。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統確定(參見例如Kabat EA及Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391，及Kabat EA等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, 美國健康與人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH公開案第91-3242號)。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置31至35處，其視情況在35之後可包括一或兩個額外胺基酸(在Kabat編號方案中稱為35A及35B)(CDR1)；胺基酸位置50至65處(CDR2)；及胺基酸位置95至102處(CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置24至34處(CDR1)、胺基酸位置50至56處(CDR2)及胺基酸位置89至97處(CDR3)。在一特定實施例中，本文所述抗體之CDR根據Kabat編號方案確定。
在某些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案確定，其係指免疫球蛋白結構環之位置(參見例如Chothia C及Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917；Al-Lazikani B等人, (1997) J Mol Biol 273: 927-948；Chothia C等人, (1992) J Mol Biol 227: 799-817；Tramontano A等人, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82；及美國專利第7,709,226號)。通常，當使用Kabat編號規約時，Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34處，Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56處，且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。在使用Kabat編號規約進行編號時，Chothia CDR-HI環末端在H32與H34之間變化，此視環的長度而定(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B；若既不存在35A，亦不存在35B，則環末端位於32處；若僅存在35A，則環末端位於33處；若35A與35B皆存在，則環末端位於34處)。在一特定實施例中，本文所述抗體之CDR根據Chothia編號方案確定。
如本文所用，術語「恆定區」及「恆定域」可互換且具有此項技術中之常見含義。恆定區為抗體部分，例如不與抗體與抗原之結合直接有關但可展現各種效應功能(諸如與Fc受體之相互作用)之輕及/或重鏈之羧基端部分。免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列一般比免疫球蛋白可變域更保守。
如本文所用，術語「重鏈」當提及抗體使用時基於恆定域之胺基酸序列可指任何獨特類型，例如α、δ、ε、γ及µ，其產生抗體之IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類，分別包括IgG子類，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 及IgG4 。
如本文所用，術語「輕鏈」當提及抗體使用時基於恆定域之胺基酸序列可指任何獨特類型，例如κ或λ。輕鏈胺基酸序列在此項技術中已熟知。在特定實施例中，輕鏈為人類輕鏈。
「結合親和力」一般係指在分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用總和之強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD )表示。親和力可以此項技術中已知之多種方式加以量測及/或表現，包括(但不限於)平衡解離常數(KD )及平衡締合常數(KA )。KD 由koff /kon 之商計算，而KA 由kon /koff 之商計算。kon 係指例如抗體與抗原之結合速率常數，且koff 係指例如抗體與抗原之解離。kon 及koff 可藉由一般熟習此項技術者已知之技術，諸如BIACORE® 或KinExA加以測定。
CD19 (亦稱為分化簇19、 B-淋巴細胞抗原CD19、B淋巴細胞表面抗原B4、B4、CVID3、分化抗原CD19)為在人體內由CD19 基因編碼之蛋白質。其見於B細胞之表面上。因為CD19為B細胞之標誌，所以其可為適用於識別之抗原及由此類型B細胞而產生之癌細胞，亦即B細胞淋巴瘤。
如本文所用，「保守性胺基酸取代」為一個胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已限定具有側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。在某些實施例中，抗體或其抗原結合分子之CDR內或構架區內之一或多個胺基酸殘基可經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。
如本文所用，術語「異源」」意謂來自除天然產生之序列外之任何來源。舉例而言，作為具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之協同刺激蛋白質(例如對應人類協同刺激蛋白質)之一部分包括之異源序列為並非天然產生，亦即並不與野生型人類協同刺激蛋白質對準之胺基酸。舉例而言，異源核苷酸序列係指除野生型人類協同刺激蛋白質編碼序列之核苷酸序列外之核苷酸序列。
如本文所用，「抗原決定基」為此項技術中之術語且係指抗原中抗體可特異性結合之局部區。抗原決定基可為例如多肽之連續胺基酸(線性或連續抗原決定基)，或抗原決定基可例如由一或多個多肽之兩個或更多個非連續區聚集在一起得到(構形、非線性、不連續或非連續抗原決定基)。在某些實施例中，結合抗體之抗原決定基可藉由例如NMR光譜分析、X射線繞射結晶學研究、ELISA分析、耦接質譜分析之氫/氘交換(例如液相層析電噴霧質譜分析)、基於陣列之寡肽掃描分析及/或突變誘發定位(例如定點突變誘發定位)測定。對於X射線結晶學，結晶可使用此項技術中已知之方法中之任一者實現(例如Giegé R等人, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350；McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23；Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274；McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303)。抗體:抗原晶體可使用熟知X射線繞射技術研究，且可使用此項技術中已知之電腦軟體Refmac及Phenix改進。突變誘發定位研究可使用熟習此項技術者已知之任何方法來實現。關於突變誘發技術，包括丙胺酸掃描突變誘發技術之描述，參見例如Champe M等人, (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394，及Cunningham BC及Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085。
如本文所用，若抗原與第一結合分子、抗體或其抗原結合分子之間的相互作用阻斷、限制、抑制或以其他方式降低參比結合分子、參比抗體或其抗原結合分子與抗原相互作用之能力，則抗原結合分子、抗體或其抗原結合分子與參比抗體或其抗原結合分子「交叉競爭」。交叉競爭可為完全的，例如結合分子與抗原之結合完全阻斷參比結合分子結合抗原之能力，或其可為部分的，例如結合分子與抗原之結合降低參比結合分子結合抗原之能力。在某些實施例中，與參比抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參比抗原結合分子相同或重疊的抗原決定基。在其他實施例中，與參比抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參比抗原結合分子不同的抗原決定基。可使用許多類型之競爭性結合分析以判定一個抗原結合分子是否與另一者競爭，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)；固相直接或間接酶免疫分析(EIA)；夾心競爭分析(Stahli等人, 1983, Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生素蛋白EIA (Kirkland等人, 1986, J. Immunol. 137:3614-3619)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(Harlow及Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記物之固相直接標記RIA(Morel等人, 1988, Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素-抗生素蛋白EIA(Cheung等人, 1990, Virology 176:546-552)；及直接標記RIA (Moldenhauer等人, 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)。
如本文所用，術語「免疫特異性結合」、「免疫特異性識別」、「特異性結合」及「特異性識別」在抗體之情況下為類似術語，且係指結合至抗原(例如抗原決定基或免疫複合體)之分子，因為此類結合係熟習此項技術者所瞭解。舉例而言，如藉由例如免疫分析、BIACORE® 、KinExA 3000儀器（Sapidyne Instruments，Boise，ID）或此項技術中已知之其他分析所測定，特異性結合至抗原之分子一般係以較低親和力結合至其他肽或多肽。在一特定實施例中，特異性結合至抗原之分子與該抗原結合之KA 為該分子結合至另一種抗原時之KA 的至少2對數級、2.5對數級、3對數級、4對數級或更大。
在一特定實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合分子，其與例如人類CD19之標靶人類抗原之結合的親和力高於例如非人類CD19之另一標靶抗原物種。在某些實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合分子t，與另一標靶抗原物種相比，其與例如人類CD19之標靶人類抗原之結合親和力為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更高，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿子共振或動力學排除分析所量測。在一特定實施例中，結合至標靶人類抗原之本文所述抗體或其抗原結合分子與另一標靶抗原物種之結合將為該抗體或其抗原結合分子與人類抗原之結合的小於10%、15%或20%，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿子共振或動力學排除分析所量測。
「抗原」係指引起免疫反應或能夠與抗體或抗原結合分子結合之任何分子。該免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術者將容易瞭解，任何大分子，包括實際上所有蛋白質或肽均可充當抗原。抗原可內源性表現，亦即由基因組DNA表現，或可以重組方式表現。抗原可對某一組織，諸如癌細胞具有特異性，或其可廣泛表現。另外，較大分子之片段可充當抗原。在一個實施例中，抗原為腫瘤抗原。在一個特定實施例中，抗原為所有人類CD19或其片段。
術語「中和」係指結合至配位體且防止或降低該配位體之生物學影響的抗原結合分子、scFv、抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體或其片段直接阻斷配位體上之結合位點，或以其他方式改變配位體經由間接手段結合之能力(諸如配位體中之結構性或高能變化)。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體或其片段防止其所結合之蛋白質執行生物功能。
如本文所用，術語「自體」意謂源自個體之任何物質，該個體與物質隨後重新引入至之個體相同。舉例而言，經工程改造之自體細胞療法(eACT™)，亦稱為授受細胞轉移，為一種方法，藉由該方法收集患者之自身T細胞且隨後經遺傳工程改造以表現聚核苷酸，例如編碼CAR之聚核苷酸，該聚核苷酸識別且標靶一或多種特異性腫瘤細胞或惡性疾病之細胞表面上所表現之一或多種抗原，且接著投與回相同患者。
術語「同種異體」係指源自一個個體之任何物質，接著將其引入至相同物種之另一個體中，例如同種異體T細胞移植。
術語「轉導」及「經轉導」係指經由病毒載體將外源DNA引入至細胞中之方法(參見Jones等人, 「Genetics: principles and analysis」, Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998))。在一些實施例中，載體為反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦巴爾病毒載體(Epstein Barr viral vector)、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關之載體、豆狀病毒載體或其任何組合。
如本文所用，術語「遺傳工程改造」或「工程改造」可互換使用且意謂修飾細胞基因組之方法，包括(但不限於)刪除編碼或非編碼區或其一部分或插入編碼區或其一部分。在一些實施例中，修飾之細胞為淋巴細胞，例如T細胞，其可獲自患者或供者。細胞可經修飾以表現外源性構築體，諸如例如嵌合抗原受體(CAR)，將其併入至細胞之基因組中。
「癌症」係指特徵為異常細胞在體內不受控生長之廣泛之多種疾病群。不受調控細胞分裂及生長導致形成形成侵入鄰近組織且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分的惡性腫瘤。「癌症」或「癌症組織」可包括腫瘤。可藉由本發明方法處理之癌症之實例包括(但不限於)免疫系統之癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及其他白血球惡性疾病。
可處理之癌症包括B細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、AIDS相關之淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、經典霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、產生HHV8相關多中心卡斯爾曼氏病之大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、淋巴漿細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤(MALT)、結邊緣區B細胞淋巴瘤(NMZL)、節狀淋巴細胞為主型霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症或其組合。在一個實施例中，B細胞淋巴瘤為急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤(MALT)及非霍奇金氏淋巴瘤。在一個實施例中，B細胞淋巴瘤為非霍奇金氏淋巴瘤。
特定癌症可對化學或輻射療法有反應，或癌症可為難治癒的。難治癒之癌症係指手術干預不可改善之癌症，且癌症起初對化學或輻射療法無反應或癌症隨時間推移變得無反應。
如本文所用，「抗腫瘤效應」係指可以腫瘤體積降低、腫瘤細胞數目降低、腫瘤細胞增生降低、轉移灶數目降低、總體或無進展存活期增加、預期壽命增加或與腫瘤相關之各種生理性症狀改善存在之生物學效應。抗腫瘤效應亦可指預防腫瘤出現，例如疫苗。
如本文所用，「細胞介素」係指藉由一個細胞回應於與特異性抗原接觸而釋放之非抗體蛋白質，其中細胞介素與第二細胞相互作用以介導第二細胞中之反應。細胞介素可由細胞內源性表現或向個體投與。細胞介素可藉由免疫細胞釋放，包括傳播免疫反應之巨噬細胞、B細胞、T細胞及肥大細胞。細胞介素可在接受者細胞中誘導各種反應。細胞介素可包括體內恆定細胞介素、趨化介素、促炎性細胞介素、效應子及急性期蛋白質。舉例而言，體內恆定細胞介素，包括介白素(IL)7及IL-15，促進免疫細胞存活及增殖，且促炎性細胞介素可促進發炎反應。體內恆定細胞介素之實例包括(但不限於)IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15及干擾素(IFN) γ。促炎性細胞介素之實例包括(但不限於)IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF)2、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、可溶性細胞間黏附分子1 (sICAM -1)、可溶性血管黏附分子1 (sVCAM -1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PLGF)。效應子之實例包括(但不限於)顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配位體(sFasL)及穿孔蛋白。急性期蛋白質之實例包括(但不限於)C反應蛋白(CRP)及血清澱粉樣蛋白A (SAA)。
「趨化介素」為一種類型之細胞介素，其介導細胞趨化性或方向性移動。趨化介素之實例包括(但不限於)IL-8、IL-16、伊紅趨素、伊紅趨素-3、巨噬細胞源趨化介素(MDC或CCL22)、單核球趨化性蛋白質1 (MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬細胞發炎性蛋白質1α (MIP-1α、MIP-1a)、MIP-1β (MIP-1b)、γ誘導性蛋白質10 (IP-10)及胸腺及活化調節之趨化介素(TARC或CCL17)。
治療劑，例如經工程改造之CAR T細胞之「治療有效量」、「有效劑量」，「有效量」或「治療有效劑量」為單獨或與另一治療劑組合使用保護個體免於疾病發作或由疾病症狀之嚴重強度降低，無疾病症狀週期之頻率及持續時間增長證明之促進疾病消退，或預防歸因於疾病病痛之損傷或殘疾之任何量。治療劑促進疾病消退之能力可使用熟習此項技術者已知的多種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類個體中評估、在預測人體內之功效的動物模型系統中評估或藉由在活體外分析中分析藥劑活性評估。
如本文所用，術語「淋巴細胞」包括自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。NK細胞為表示固有免疫系統之主要組分的一種類型的細胞毒性(細胞毒性)淋巴細胞。NK細胞抑制腫瘤及感染病毒之細胞。其經由細胞凋亡或計劃性細胞死亡之過程起作用。其稱為「天然殺手」，因為其並不需要活化以殺死細胞。T細胞在細胞介導之免疫性中起主要作用(無抗體參與)。其T細胞受體(TCR)將其與其他淋巴細胞類型分化。胸腺(一種免疫系統之特定器官)主要造成T細胞之成熟。存在六個已知類型之T細胞，亦即：輔助T細胞(例如CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(亦稱為TC、細胞毒性T淋巴球、CTL、T殺手細胞、溶胞T細胞、CD8+ T細胞或殺手T細胞)、記憶T細胞((i)幹細胞記憶TSCM 細胞，如初始細胞，為CD45RO−、CCR7+、CD45RA+、CD62L+ (L-選擇素)、CD27+、CD28+及 IL-7Rα+，但其亦表現大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1，且展示記憶細胞特有之許多功能特質)；(ii)中樞記憶TCM 細胞表現L-選擇素及CCR7，其分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，及(iii)然而，效應子記憶TEM 細胞並不表現L-選擇素或CCR7，但產生效應子細胞介素，如IFNγ及IL-4)、調節性T細胞(Tregs、抑制因子T細胞或CD4+CD25+調節性T細胞)、自然殺手T細胞(NKT)及γ δ T細胞。另一方面，B細胞在體液免疫中起主要作用(有抗體參與)。B細胞製造抗體，處理抗原以實施抗原呈遞細胞(APC)之作用且在藉由抗原相互作用活化之後發育成記憶B細胞。在哺乳動物中，未成熟B細胞在其名稱來源之骨髓中發育。
術語「經遺傳工程改造」或「經工程改造」係指修飾細胞基因組之方法，包括(但不限於)刪除編碼或非編碼區或其一部分或插入編碼區或其一部分。在一些實施例中，修飾之細胞為淋巴細胞，例如T細胞，其可獲自患者或供者。細胞可經修飾以表現外源性構築體，諸如例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，將其併入至細胞之基因組中。
「免疫反應」係指免疫系統細胞(例如T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞及嗜中性白血球)及藉由此等細胞中之任一者或肝臟(包括Ab、細胞介素及補體)產生之可溶性大分子之作用，其導致選擇性靶向感染病原體、癌性或其他異常細胞之細胞或組織，或在自體免疫或病理性發炎情況下之正常人類細胞或組織、結合至其、損壞其、破壞其及/或自侵入病原體之脊椎動物主體消除其。
術語「免疫療法」係指藉由包含誘導、提高、抑制或以其他方式改良免疫反應之方法治療罹患疾病或處於感染或遭受疾病復發之風險中的個體。免疫療法之實例包括(但不限於)T細胞療法。T細胞療法可包括授受T細胞療法、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)免疫療法、自體細胞療法、經工程改造之自體細胞療法(eACT™)及同種異體T細胞移植。然而，熟習此項技術者將認識到，本文所揭示之調節方法將提高任何移植T細胞療法之效用。T細胞療法之實例描述於美國專利公開案第2014/0154228號及第2002/0006409號、美國專利第5,728,388號及國際公開案第WO 2008/081035號中。
免疫療法之T細胞可來自此項技術中已知之任何來源。舉例而言，T細胞可在活體外自造血幹細胞群體分化，或T細胞可獲自個體。T細胞可獲自例如周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積液、脾臟組織及腫瘤。另外，T細胞可源自一或多種此項技術中可獲得之T細胞株。T細胞亦可使用諸如FICOLL™分離及/或血球分離術之熟習此項技術者已知之許多技術獲自自個體收集之血液單元。用於T細胞療法之分離T細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號中，其以全文引用的方式併入本文中。
可縮寫為「eACT™」之術語「經工程改造之自體細胞療法」，亦稱為授受細胞轉移，為一種方法，藉由該方法收集患者之自身T細胞且隨後經遺傳變化以識別且標靶一或多種特異性腫瘤細胞或惡性疾病之細胞表面上所表現之一或多種抗原。T細胞可經工程改造以表現例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)或兩者。CAR陽性(+) T細胞經工程改造以表現一或多個對特定腫瘤抗原具有特異性之連接至包含至少一個協同刺激域及至少一個活化域之細胞內信號傳導部分的細胞外單鏈可變片段(scFv)。協同刺激域可源自天然產生之協同刺激域或其變異體，且活化域可源自例如CD3-ζ及CD3-ε。在某些實施例中，CAR經設計以具有兩個、三個、四個或更多個協同刺激域。CAR scFv可經設計以標靶例如人類CD19，其為由B細胞譜系中之細胞表現之跨膜蛋白，該等細胞包括所有正常B細胞及B細胞惡性疾病，包括(但不限於)NHL、CLL及非T細胞ALL。在一些實施例中，CAR經工程改造以使得協同刺激域表現為各別多肽鏈。實施例CART細胞療法及構築體描述於美國專利公開案第2013/0287748號、第2014/0227237號、第2014/0099309號及第2014/0050708號中及美國臨時申請案第62/470,703號及第62/317,258號；此等參考文獻以全文引用的方式併入。
如本文所用，「患者」包括罹患癌症(例如淋巴瘤或白血病)之任何人類。術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用。
如本文所用，術語「活體外細胞」係指離體培養之任何細胞。特定言之，活體外細胞可包括T細胞。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基之化合物。蛋白質或肽含有至少兩個胺基酸，且對可包含蛋白或肽之序列的胺基酸之最大數目並無限制。多肽包括包含藉由肽鍵彼此接合之兩個或更多個胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所用，該術語係指短鏈(其在此項技術中通常亦稱為例如肽、寡肽及寡聚物)與長鏈(其在此項技術中一般稱為蛋白質，其存在多種類型)。「多肽」包括例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、均二聚體、雜二聚體、多肽變異體、修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白以及其他物質。多肽包括天然肽、重組型肽、合成肽或其組合。
如本文所用，「刺激」係指藉由刺激分子與其同源配位體之結合誘導之主要反應，其中該結合介導信號轉導事件。「刺激分子」為T細胞上之分子，例如T細胞受體(TCR)/CD3複合物，其特異性結合抗原呈現細胞上存在之同源刺激配位體。「刺激配位體」為一種配位體，其若存在於抗原呈現細胞(例如APC、樹突狀細胞、B細胞及其類似物)上則可與T細胞上之刺激分子特異性結合，由此藉由T細胞介導主要反應，包括(但不限於)活化、起始免疫反應、增殖及其類似反應。刺激配位體包括(但不限於)抗CD3抗體(諸如OKT3)、負載有肽之MHC I類分子、超促效劑抗CD2抗體及超促效劑抗CD28抗體。
如本文所用，「協同刺激信號」係指與諸如TCR/CD3接合之主要信號組合之引起T細胞反應之信號，該T細胞反應為諸如(但不限於)關鍵字分子之增殖及/或上調或下調。
如本文所用，「協同刺激配位體」包括特異性結合T細胞上之同源協同刺激分子之抗原呈現細胞(APC)上之分子。或者/另外，抗體(例如抗CD28抗體)當結合至盤、珠粒、APC或溶液中時可為協同刺激配位體。協同刺激配位體之結合提供介導T細胞反應之信號，該T細胞反應包括(但不限於)增殖、活化、分化及其類似反應。協同刺激配位體誘導除主要信號以外藉由刺激分子，例如藉由T細胞受體(TCR)/CD3複合物與負載有肽之主要組織相容複合物(MHC)分子結合提供之信號。協同刺激配位體可包括(但不限於) 3/TR6、4-1BB配位體、結合鐸配位受體之促效劑或抗體、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD30配位體、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒進入介體(HVEM)、人類白血球抗原G (HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白樣轉錄物(ILT) 3、誘導性協同刺激配位體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、特異性結合B7-H3之配位體、淋巴毒素β受體、MHC I類鏈相關之蛋白質A (MICA)、MHC I類鏈相關之蛋白質B (MICB)、OX40配位體、PD-L2或計劃性死亡(PD) L1 A協同刺激配位體，包括(但不限於)特異性結合存在於T細胞上之協同刺激分子之抗體，諸如(但不限於) 4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、特異性結合CD83將配位體、淋巴細胞作用相關之抗原-1 (LFA-1)、自然殺手細胞受體C (NKG2C)、OX40、PD-1或腫瘤壞死因子超家族成員14 (TNFSF14或LIGHT)。
術語「協同刺激分子」為T細胞上之同源結合搭配物，其特異性結合協同刺激配位體，由此藉由T細胞介導協同刺激反應，諸如(但不限於)增殖。協同刺激分子包括(但不限於)：4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD 33、CD 45、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 (α；β；δ；ε；γ；ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配位體、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96 (Tactile)、CDl-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Igα (CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT (腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴細胞作用相關之抗原-1 (LFA-1 (CDl la/CD18)、MHC I類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、鐸配位受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短或組合。
術語「減少」及「減小」在本文中亦可互換使用且指示小於原始之任何變化。「減少」及「減小」為相對術語，需要在量測前及量測後之間比較。「減少」及「減小」包括完全耗盡。
“個體之「治療(treatment/treating)」係指在個體上進行之任何類型之干預或過程，或向個體投與活性劑，目標為逆轉、緩解、改善、抑制、減緩或防止發作、進展、發展、嚴重程度或復發症狀、併發症或病狀或與疾病相關之生物化學標誌。在一個實施例中，「治療(treatment/treating)」包括部分緩解。在另一實施例中，「治療(treatment/treating)」包括完全緩解。
為計算一致性百分比，通常以提供序列之間的最大匹配之方式比對所比較之序列。可用於測定一致性百分比之電腦程式之一個實施例為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)。使用電腦演算法GAP來比對欲測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。比對序列以獲得其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度」，如由演算法所測定)。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)。
在以下子部分中進一步詳細描述本發明之各種態樣。 I. 嵌合抗原受體及 T 細胞 受體
嵌合抗原受體(CAR或CAR-T)及T細胞受體(TCR)為經遺傳工程改造之受體。此等經工程改造之受體可容易插入至免疫細胞中且由其表現，該等免疫細胞包括根據此項技術中已知技術之T細胞。在CAR之情況下，單個受體可經程式化以識別特異性抗原，且當結合至抗原時活化免疫細胞以攻擊及破壞帶有該抗原之細胞。當此等抗原存在於腫瘤細胞上時，表現CAR之免疫細胞可標靶且殺死腫瘤細胞。
表現CAR之細胞之製造中所執行之步驟示於圖1A中，且經由識別腫瘤細胞上之標靶所介導之CAR介導之殺死之機制示於圖1B中。
本發明係關於包含特異性結合至人類CD19之抗原結合域(諸如scFv)的嵌合抗原受體(CAR)及T細胞受體(TCR)，及包含特異性結合至人類CD19之抗原結合域的經工程改造之T細胞。在一些實施例中，本發明之抗原結合域為源自抗體之scFv，例如FMC63抗體。可使用針對人類CD19之其他抗體。
本發明之抗人類CD19 CAR或TCR包含特異性結合至人類CD19之抗原結合域。在一些實施例中，抗人類CD19 CAR或TCR進一步包含協同刺激域及/或細胞外域(亦即「鉸鏈」或「間隔子」區域)、及/或跨膜域、及/或細胞內(信號傳導)域、及/或CD3-ζ或CD3-ε活化域。在一些實施例中，抗人類CD19 CAR或TCR包含特異性結合人類CD19之scFv抗原結合域、協同刺激域、細胞外域、跨膜域及CD3-ζ或CD3-ε活化域。
在一些實施例中，本發明之CAR之定向包含抗原結合域(諸如scFv)串聯有協同刺激域及活化域。協同刺激域可包含細胞外部分、跨膜部分及細胞內部分中之一或多者。在其他實施例中，可以串聯方式利用多個協同刺激域。 I.A. 抗原結合域
CAR可經工程改造以藉由併入與特異性靶向抗原相互作用之抗原結合分子結合至抗原(諸如細胞表面抗原)。在一些實施例中，抗原結合分子為其抗體片段，例如一或多個單鏈抗體片段(「scFv」)。scFv為具有抗體之重鏈及輕鏈之可變區連接於一起之單鏈抗體片段。參見美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Eshhar等人, Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136。scFv保留親本抗體與標靶抗原特異性相互作用之能力。scFv適用於嵌合抗原受體，因為其可經工程改造以連同其他CAR組分一起表現為單鏈之一部分。同上亦參見Krause等人, J. Exp. Med., 第188卷, 第4期, 1998 (619-626)；Finney等人,Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797。應瞭解，抗原結合分子通常包含於CAR之細胞外部分內以使得其能夠識別且結合至相關抗原。對超過一種相關標靶具有特異性之雙特異性及多特異性CAR涵蓋在本發明之範疇內。
本發明係關於具有人類化抗原結合域之抗人類CD19抗體、其片段(例如scFv)、嵌合抗原受體(CAR)及T細胞受體(TCR)。
以下核苷酸序列以「前導序列 -VL-連接子 -VH- His 標籤 -終止密碼子」之形式展示，亦即「前導序列」呈粗體字體，「連接子」呈斜體，「His標籤」呈粗斜體，且VL、VH及「終止密碼子」呈標準字體。
WT-FMC63-scFv 。
SS-scFv 。
JS-scFv 。
AS-scFv 。
NS-scFv 。
在一些實施例中，聚核苷酸序列可與上文所提及之聚核苷酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。野生型 scFv 及七個所選人類化 scFvs 中之四者之 胺基酸序列
以下多肽序列以「前導序列 -VL-連接子 -VH- His 標籤 」之形式示出，亦即「前導序列」呈粗體字體，「連接子」呈斜體且「His標籤」呈粗斜體。
以下scFv中之各者中所用之前導序列具有胺基酸序列MEWTWVFLFLLSVTAGVHS (SEQ ID NO: 6)。以下scFv中之各者中所用之連接子序列具有胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 7)。以下scFv中之各者中所用之His標籤序列具有胺基酸序列 HHHHHH (SEQ ID NO: 8)
WT-FMC63-scFv 。
WT-FMC63-scFV之VL序列具有胺基酸序列DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(SEQ ID NO: 36)
WT-FMC63-scFV之VH序列具有胺基酸序列EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 37)。
SS-scFv。
SS-scFV之VL序列具有胺基酸序列DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 11)。
SS-scFV之VH序列具有胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWVRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12)
JS-scFv .
The VL sequence for the JS-scFV has the amino acid sequence of DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQK PDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 14)。
JS-scFV之VH序列具有胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 15)。
AS-scFv 。
AS-scFV之VL序列具有胺基酸序列DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 17)。
AS-scFV之VH序列具有胺基酸序列QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18)。
NS scFv。
NS-scFV之VL序列具有胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 20)。
NS-scFV之VH序列具有胺基酸序列QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTISKDTSKNQVFLKMSSLTAADTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 21)。
上述WT-FMC63-scFv、SS-scFv、JS-scFv、AS-scFv及NS-scFv胺基酸序列可能缺乏His標籤(SEQ ID NO: 8)。因此，scFv將具有以下胺基酸序列：
WT-FMC63-scFv (無His標籤) 。
SS-scFv (無His標籤)
JS-scFv (無His標籤) 。
AS-scFv (無His標籤) 。
NS scFv (無His標籤) 。
在一些實施例中，多肽序列可與以上提及之多肽序列中之任一者至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。
人類化抗體(例如scFv)之VL區與SEQ ID NO:36之不同之處為至少一個胺基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 21、22、23、24、25或更多個胺基酸。舉例而言，人類化抗體(例如scFv)之VL區與SEQ ID NO:36之不同之處可為具有位置7之Ser、位置8之Pro、位置15之Val、位置22之Thr、位置41之Gln、位置42之Lys、位置42之Gln、位置43之Ala、位置44之Pro、位置49之Lys、位置72之Thr、位置77之Ser、位置79之Gln、位置80之Pro、位置83之Phe、位置87之Tyr、位置100之Gln及/或位置107之Lys。在一些實施例中，人類化抗體(例如scFv)之VL區與SEQ ID NO: 36之不同之處可為具有位置7之Ser、位置8之Pro、位置15之Val、位置22之Thr、位置42之Gln、位置43之Ala、位置44之Pro、位置49之Lys、位置72之Thr、位置77之Ser、位置79之Gln、位置80之Pro、位置83之Phe、位置87之Tyr、位置100之Gln及/或位置107之Lys。在其他實施例中，人類化抗體(例如scFv)之VL區與SEQ ID NO: 36之不同於之處可為具有位置7之Ser、位置8之Pro、位置15之Val、位置22之Thr、位置41之Gln、位置42之Lys、位置43之Ala、位置72之Thr、位置77之Ser、位置79之Gln、位置80之Pro及位置107之Lys。
人類化抗體(例如scFv)之VH區與SEQ ID NO: 37之不同之處為至少一個胺基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 21、22、23、24、25或更多個胺基酸。舉例而言，人類化抗體(scFv)之VH區與SEQ ID NO: 37之不同之處可為具有位置1之Gln、位置3之Gln、位置5之Val、位置9之Gly、位置13之Lys、位置13之Gln、位置15之Gly、位置16之Arg、位置16之Thr、位置17之Thr、位置19之Arg、位置20之Leu、位置21之Ser、位置24之Ala、位置42之Gly、位置48之Ile、位置67之Phe、位置70之Ser、位置71之Arg、位置73之Thr、位置76之Asn、位置77之Thr、位置78之Leu、位置79之Tyr、位置81之Gln、位置83之Ser、位置86之Thr、位置86之Arg、位置87之Ala、位置88之Glu、位置88之Ala、位置92之Val及/或位置115之Leu。在一些實施例中，人類化抗體(例如scFv)之VH區與SEQ ID NO: 37之不同之處可為具有位置3之Gln、位置5之Val、位置9之Gly、位置13之Gln、位置15之Gly、位置16之Arg、位置19之Arg、位置20之Leu、位置21之Ser、位置24之Ala、位置42之Gly、位置48之Ile、位置67之Phe、位置70之Ser、位置71之Arg、位置76之Asn、位置77之Thr、位置78之Leu、位置79之Tyr、位置81之Gln、位置86之Arg、位置87之Ala、位置88之Glu、位置92之Val及/或位置115之Leu。在其他實施例中，人類化抗體(例如scFv)之VH區與SEQ ID NO: 37之不同之處可為具有位置1之Gln、位置3之Gln、位置13之Lys、位置16之Thr、位置17之Thr、位置42之Gly、位置70之Ser、位置73之Thr、位置76之Asn、位置83之Ser、位置86之Thr、位置87之Ala、位置88之Ala及/或位置115之Leu。
在一些實施例中，抗原結合分子結合標靶抗原(例如人類CD19)之KD 為小於1×10- 6 M、小於1×10- 7 M、小於1×10- 8 M或小於1×10- 9 M。在一些實施例中，抗原結合分子結合標靶抗原(例如人類CD19)之KD 為約1×10- 8 M、約2×10- 8 M、約3×10- 8 M、約4×10- 8 M、約5×10- 8 M、約6×10- 8 M、約7×10- 8 M、約8×10- 8 M、約9×10- 8 M、約1×10- 9 M、約2×10- 9 M、約3×10- 9 M、約4×10- 9 M、約5×10- 9 M、約6×10- 9 M、約7×10- 9 M、約8×10- 9 M或約9×10- 9 M。在某些實施例中。KD 計算為koff /kon 之商，且kon 及koff 使用諸如Fab片段之單價抗體測定，如藉由例如BIAcore® 表面電漿子共振技術所量測。在其他實施例中，KD 計算為koff /kon 之商，且kon 及koff 使用諸如Fab片段之二價抗體測定，如藉由例如BIAcore® 表面電漿子共振技術所量測。
在一些實施例中，抗原結合分子結合標靶抗原(例如人類CD19)之締合速率(kon )為小於1×10- 4 M- 1 s- 1 、小於2×10- 4 M- 1 s- 1 、小於3×10- 4 M- 1 s- 1 、小於4×10- 4 M- 1 s- 1 、小於5×10- 4 M- 1 s- 1 、小於6×10- 4 M- 1 s- 1 、小於7×10- 4 M- 1 s- 1 、小於8×10- 4 M- 1 s- 1 、小於9×10- 4 M- 1 s- 1 、小於1×10- 5 M- 1 s- 1 、小於2×10- 5 M- 1 s- 1 、小於3×10- 5 M- 1 s- 1 、小於4×10- 5 M- 1 s- 1 、小於5×10- 5 M- 1 s- 1 、小於6×10- 5 M- 1 s- 1 、小於7×10- 5 M- 1 s- 1 、小於8×10- 5 M- 1 s- 1 、小於9×10- 5 M- 1 s- 1 、小於1×10- 6 M- 1 s- 1 、小於2×10- 6 M- 1 s- 1 、小於3×10- 6 M- 1 s- 1 、小於4×10- 6 M- 1 s- 1 、小於5×10- 6 M- 1 s- 1 、小於6×10- 6 M- 1 s- 1 、小於7×10- 6 M- 1 s- 1 、小於8×10- 6 M- 1 s- 1 、小於9×10- 6 M- 1 s- 1 或小於1×10- 7 M- 1 s- 1 。在某些實施例中，kon 使用諸如Fab片段之單價抗體測定，如藉由例如BIAcore® 表面電漿子共振技術所量測。在其他實施例中，kon 使用二價抗體測定，如藉由例如BIAcore® 表面電漿子共振技術所量測。
在一些實施例中，抗原結合分子結合標靶抗原(例如人類CD19)之解離速率(koff )為小於1×10- 2 s- 1 、小於2×10- 2 s- 1 、小於3×10- 2 s- 1 、小於4×10- 2 s- 1 、小於5×10- 2 s- 1 、小於6×10- 2 s- 1 、小於7×10- 2 s- 1 、小於8×10- 2 s- 1 、小於9×10- 2 s- 1 、小於1×10- 3 s- 1 、小於2×10- 3 s- 1 、小於3×10- 3 s- 1 、小於4×10- 3 s- 1 、小於5×10- 3 s- 1 、小於6×10- 3 s- 1 、小於7×10- 3 s- 1 、小於8×10- 3 s- 1 、小於9×10- 3 s- 1 、小於1×10- 4 s- 1 、小於2×10- 4 s- 1 、小於3×10- 4 s- 1 、小於4×10- 4 s- 1 、小於5×10- 4 s- 1 、小於6×10- 4 s- 1 、小於7×10- 4 s- 1 、小於8×10- 4 s- 1 、小於9×10- 4 s- 1 、小於1×10- 4 s- 1 或小於5×10- 4 s- 1 。在某些實施例中，koff 使用諸如Fab片段之單價抗體測定，如藉由例如BIAcore® 表面電漿子共振技術所量測。在其他實施例中，koff 使用二價抗體測定，如藉由例如BIAcore® 表面電漿子共振技術所量測。
在一些實施例中，聚核苷酸編碼TCR，其中TCR進一步包含第四互補決定區(CDR4)。在某些實施例中，聚核苷酸編碼TCR，其中TCR進一步包含恆定區。在一些實施例中，恆定區係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE及IgM之恆定區。 I.B. 協同刺激域
嵌合抗原受體併入有協同刺激(信號傳導)域以增加其效力。參見美國專利第7,741,465號及第6,319,494號，以及Krause等人及Finney等人(同上)，Song等人, Blood 119:696-706 (2012)；Kalos等人, Sci Transl. Med. 3:95 (2011)；Porter等人, N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011)及Gross等人, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)。例示性協同刺激蛋白質具有天然見於T細胞上之協同刺激蛋白質之胺基酸序列。此協同刺激蛋白質之完整天然胺基酸序列以NCBI參考序列：NP_006130.1描述。
其他協同刺激域之聚核苷酸及多肽序列在此項技術中已知。在一些實施例中，編碼協同刺激域之聚核苷酸包含與此項技術中已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，協同刺激域之多肽序列包含與此項技術中已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之多肽序列。 I.B.1 細胞外或「鉸鏈」域
在一個實施例中，本發明之CAR或TCR包含「細胞外」或「鉸鏈」或「間隔子」域或區，該等術語在本文中可互換使用。在另一實施例中，細胞外域來自或源自(例如包含其所有或片段) CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位體受體及其片段或組合。「細胞外」或「鉸鏈」或「間隔子」域或區可源自天然或合成來源。此等鉸鏈域之聚核苷酸及多肽序列在此項技術中已知。
在一些實施例中，編碼鉸鏈域之聚核苷酸包含與此項技術中已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，鉸鏈域之多肽序列包含與此項技術中已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之多肽序列。
在一些實施例中，鉸鏈域位於抗原結合域(例如scFv)與跨膜域之間。在此定向中，鉸鏈域在抗原結合域與表現CAR之細胞膜表面之間提供距離。在一些實施例中，鉸鏈域來自或源自免疫球蛋白。在一些實施例中，鉸鏈域係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE及IgM之鉸鏈區或其片段。在其他實施例中，鉸鏈域包含、來自或源自CD8α之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈域包含、來自或源自CD28之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈域包含CD8α之鉸鏈區之片段或CD28之鉸鏈區之片段，其中該片段為小於整個鉸鏈區之任何片段。在一些實施例中，CD8α鉸鏈區之片段或CD28鉸鏈區之片段包含在CD8α鉸鏈區或CD28鉸鏈區之N端或C端或兩處排除至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個胺基酸之胺基酸序列。 I.B.2 跨膜域
本發明之CAR或TCR之協同刺激域可進一步包含跨膜域及/或細胞內信號傳導域。跨膜域可經設計以融合至CAR之細胞外域。其可類似地融合至CAR之細胞內域。在一個實施例中，使用與CAR中之一個結構域天然相關之跨膜域。在一些情況下，跨膜域可經選擇或藉由胺基酸取代修飾以避免此類結構域結合至相同或不同表面膜蛋白質之跨膜域，以使與受體複合物之其他成員的相互作用降至最低。跨膜域可來源於天然來源或合成來源。在來源為天然來源時，該結構域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。特定用於本發明之跨膜區可源自(亦即包含)4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CDl la、CDl lb、CDl lc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、特異性結合CD83之配位體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴細胞作用相關之抗原-1 (LFA-1；CDl la/CD18)、MHC 1類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、計劃性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、TNFSF14、鐸配位受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短或組合。此等跨膜域之聚核苷酸及多肽序列在此項技術中已知。
在一些實施例中，編碼跨膜域之聚核苷酸包含與此項技術中已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，跨膜域之多肽序列包含與此項技術中已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之多肽序列。
視情況，短連接子可在CAR之任何或一些細胞外、跨膜及細胞內域之間的形成鍵聯。 I.B.3. 細胞內 ( 信號傳導 ) 域
本發明之經工程改造之T細胞之細胞內(信號傳導)域可為活化域提供信號傳導，其接著活化免疫細胞之正常效應功能中之至少一者。T細胞之效應功能例如可為溶胞活性或輔助活性，包括分泌細胞介素。
在某些實施例中，適合的細胞內信號傳導域包括(亦即包含)(但不限於)4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CDl la、CDl lb、CDl lc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、特異性結合CD83之配位體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、Lyl08)、淋巴細胞作用相關之抗原-1 (LFA-1；CDl la/CD18)、MHC 1類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、計劃性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、TNFSF14、鐸配位受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短或組合。此等細胞內信號傳導域之聚核苷酸及多肽序列在此項技術中已知。
在一些實施例中，編碼細胞內信號傳導域之聚核苷酸包含與此項技術中已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞內信號傳導域之多肽序列包含與此項技術中已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之多肽序列。 I.C 活化域
CD3為天然T細胞上之T細胞受體之要素，且已證明為CAR中之重要細胞內活化要素。在一些實施例中，CD3為CD3-ζ或CD3-ε，其各者之聚核苷酸及多肽序列在此項技術中係已知。
在一些實施例中，編碼活化域之聚核苷酸包含與此項技術中已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，活化域之多肽序列包含與此項技術中已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之多肽序列。 I.D. 開關域
應瞭解，不良事件可藉由用自殺基因轉導免疫細胞(含有一或多個CAR或TCR)降至最低。亦可能需要將誘導性「打開」或「加速器」開關併入至免疫細胞中。適合的技術包括在細胞經本發明之CAR構築體轉導之前、之後或同時使用誘導性卡斯蛋白酶-9 (美國申請案2011/0286980)或胸苷激酶。引入自殺基因及/或「打開」開關之額外方法包括TALENS、鋅指、RNAi、siRNA、shRNA、反義技術及此項技術中已知之其他技術。
根據本發明，本文中可併入額外開-關或其他類型之控制開關技術。此等技術可使用二聚域及視情況存在之此類域二聚作用之活化劑。此等技術包括例如Wu等人, Science 2014 350 (6258)所述在某些細胞中利用FKBP/Rapalog二聚系統之彼等技術，其內容以全文引用之方式併入本文中。額外二聚技術描述於例如Fegan等人, Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336以及美國專利第5,830,462號；第5,834,266號；第5,869,337號；及第6,165,787號中，其內容亦以全文引用的方式併入本文中。額外二聚對可包括環孢靈-A/親環蛋白受體、雌激素/雌激素受體(視情況使用他莫昔芬(tamoxifen))、糖皮質激素/糖皮質激素受體、四環素/四環素受體、維生素D/維生素D受體。二聚技術之其他實例可見於例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US 2015/0266973、US 2016/0046700、美國專利第8,486,693號、US 2014/0171649及US 2012/0130076中，其內容進一步以全文引用的方式併入本文中。 I.E. 前導肽或前導序列
在一些實施例中，本發明之聚核苷酸編碼CAR或TCR，其可進一步包含前導肽(在本文中亦稱為「信號肽」或「前導序列」)。在某些實施例中，前導肽包含與胺基酸序列MEWTWVFLFLLSVTAGVHS (SEQ ID NO: 6)或MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO:35)至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，前導肽包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 35之胺基酸序列。
其他前導肽之聚核苷酸及多肽序列在此項技術中已知。
在一些實施例中，編碼前導肽之聚核苷酸包含與此項技術中已知之核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，前導肽之多肽序列包含與此項技術中已知之多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之多肽序列。
在一些實施例中，本發明之聚核苷酸編碼CAR或TCR，其中CAR或TCR包含前導肽(P)、抗原結合分子(B)、協同刺激蛋白質之細胞外域(E)、跨膜域(T)、協同刺激區(C)及活化域(A)，其中CAR根據以下組態：P-B-E-T-C-A。在一些實施例中，抗原結合分子包含VH及VL，其中CAR根據以下組態：P-VH-VL-E-T-C-A或P-VL-VH-E-T-C-A。在一些實施例中，VH及VL藉由連接子(L)連接，其中CAR根據以下組態，由N端至C端：P-VH-L-VL-E-T-C-A或P-VH-L-VL-E-T-C-A。
在一些實施例中，本發明之聚核苷酸編碼CAR或TCR，其中CAR或TCR包含與此項技術中已知之用於CAR或TCR之胺基酸序列至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%一致之胺基酸序列。參見例如US 62/470,703及US 62/317,258。 II. 載體、細胞及醫藥組合物
在某些態樣中，本發明提供包含本發明聚核苷酸之載體。在一些實施例中，本發明係針對一種載體或一組載體，其包含編碼包含如本文所述抗原結合域之CAR或TCR的聚核苷酸。
此項技術中已知之任何載體均可適用於本發明。在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，載體為反轉錄病毒載體、DNA載體、鼠類白血病病毒載體、SFG載體、質體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦巴爾病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關之載體(AAV)、豆狀病毒載體或其任何組合。
在其他態樣中，本發明提供包含本發明之聚核苷酸或載體之細胞。在一些實施例中，本發明係針對一種細胞，例如活體外細胞，其包含編碼包含如本文所述抗原結合域之CAR或TCR的聚核苷酸。在其他實施例中，本發明係針對一種細胞，例如活體外細胞，其包含由包含如本文所述抗原結合域之CAR或TCR編碼的多肽。
可使用任何細胞作為本發明之聚核苷酸、載體或多肽之宿主細胞。在一些實施例中，細胞可為原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或高級真核細胞，諸如哺乳動物細胞。適合的原核細胞包括(但不限於)真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科(Enterobacteriaceae )，諸如埃希氏桿菌屬(Escherichia )，例如大腸桿菌；腸桿菌屬(Enterobacter )；歐文菌屬(Erwinia )；克雷伯氏菌屬(Klebsiella )；變形桿菌屬(Proteus )；沙門氏菌屬(Salmonella )，例如鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium )；沙雷菌屬(Serratia )，例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans )，及志賀桿菌屬(Shigella )；桿菌(Bacilli )，諸如枯草芽孢桿菌(B . subtilis )及地衣芽孢桿菌(B . licheniformis )；假單胞菌屬(Pseudomonas )，諸如綠膿桿菌(P . aeruginosa )；及鏈黴菌(Streptomyces )。在一些實施例中，細胞為人類細胞。在一些實施例中，細胞為免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係選自由以下組成之群：T細胞、B細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、TCR表現細胞、自然殺手(NK)細胞、樹突狀細胞、粒細胞、先天性淋巴樣細胞、巨核細胞、單核球、巨噬細胞、血小板、胸腺細胞及骨髓細胞。在一個實施例中，免疫細胞為T細胞。在另一實施例中，免疫細胞為NK細胞。在某些實施例中，T細胞為腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、自體T細胞、經工程改造之自體T細胞(eACT™)、同種異體T細胞、異源T細胞或其任何組合。
本發明之細胞可經由此項技術中已知之任何來源獲得。舉例而言，T細胞可在活體外自造血幹細胞群體分化，或T細胞可獲自個體。T細胞可獲自例如周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積液、脾臟組織及腫瘤。另外，T細胞可源自一或多個此項技術中可獲得之T細胞株。T細胞亦可使用熟習此項技術者已知之許多技術，諸如FICOLL™分離及/或血球分離術獲自自個體收集之血液單元。在某些實施例中，藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理。在一些實施例中，細胞用PBS洗滌。如應瞭解，可使用洗滌步驟，諸如藉由使用半自動流過式離心機，例如CobeTM 2991細胞處理器、Baxter CytoMateTM 或其類似物。在一些實施例中，使經洗滌細胞再懸浮於一或多種生物相容緩衝液或有或無緩衝液之其他生理食鹽水溶液中。在某些實施例中，移除血球分離術樣品之不合需要之組分。用於T細胞療法之分離T細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號中，其以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，T細胞自PBMC藉由裂解紅細胞及消耗單核細胞，例如藉由使用經由PERCOLLTM 梯度之離心而分離。在一些實施例中，特定T細胞子群，諸如CD4+ 、CD8+ 、CD28+ 、CD45RA+ 及CD45RO+ T細胞，藉由此項技術中已知之陽性或陰性選擇技術進一步分離。舉例而言，藉由陰性選擇增濃T細胞群體可使用針對陰性選擇之細胞所特有之表面標記物的抗體之組合來實現。在一些實施例中，可使用經由陰性磁性免疫黏附或流式細胞術進行的細胞分選及/或選擇，其使用針對存在於經陰性選擇之細胞上之細胞表面標記物的單株抗體混合液。舉例而言，為藉由陰性選擇增濃CD4+ 細胞，單株抗體混合液通常包括CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20及HLA-DR之抗體。在某些實施例中，使用流式細胞測量術及細胞分選分離用於本發明之所關注之細胞群。
在一些實施例中，PBMC直接用於使用如本文所述之方法用免疫細胞(諸如CAR或TCR)遺傳修飾。在某些實施例中，在分離PBMC之後，進一步分離T淋巴球，且在遺傳修飾及/或擴增之前或之後，將細胞毒性與輔助T淋巴球分選為初始、記憶及效應T細胞亞群。
在一些實施例中，CD8+ 細胞藉由鑑別與此等類型之CD8+ 細胞中之各者相關之細胞表面抗原而進一步分選為初始、中樞記憶及效應細胞。在一些實施例中，中樞記憶T細胞之表型標記物之表現包括CCR7、CD3、CD28、CD45RO、CD62L及CD127，且對於顆粒酶B為陰性的。在一些實施例中，中樞記憶T細胞為CD8+ 、CD45RO+ 及CD62L+ T細胞。在一些實施例中，效應T細胞對於CCR7、CD28、CD62L及CD127為陰性的且對於顆粒酶B及穿孔蛋白為陽性的。在某些實施例中，CD4+ T細胞進一步分選成亞群。舉例而言，CD4+ T輔助細胞可藉由鑑別具有細胞表面抗原之細胞群而分選成初始、中樞記憶及效應細胞。
在一些實施例中，免疫細胞(例如T細胞)在使用已知方法分離之後遺傳修飾，或免疫細胞在遺傳修飾之前活體外活化及擴增(或在先驅細胞之情況下分化)。在另一實施例中，免疫細胞(例如T細胞)經本文所述之嵌合抗原受體遺傳修飾(例如經包含一或多種編碼CAR之核苷酸序列之病毒載體轉導)且接著活體外活化及/或擴增。用於活化及擴增T細胞之方法在此項技術中已知且描述於例如美國專利第6,905,874號；第6,867,041號；及第6,797,514號；及PCT公開案第WO 2012/079000號中，其內容以全文引用的方式併入本文中。一般而言，此類方法包括在具有諸如IL-2之適當細胞介素之培養基中使PBMC或分離之T細胞與一般連接於珠粒或其他表面之諸如抗CD3及抗CD28抗體之刺激劑及協同刺激劑接觸。連接於相同珠粒之抗CD3及抗CD28抗體充當「替代」抗原呈現細胞(APC)。一個實施例為Dynabeads® 系統，一種用於人類T細胞之生理性活化CD3/CD28活化劑/刺激物系統。在其他實施例中，使用諸如美國專利第6,040,177號及第5,827,642號及PCT公開案第2012/129514號中所述之彼等方法之方法用飼養細胞及適當抗體及細胞介素將T細胞活化且刺激以增殖，其內容以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，T細胞獲自供者個體。在一些實施例中，供者個體為罹患癌症或腫瘤之人類患者。在其他實施例中，供者個體為不罹患癌症或腫瘤之人類患者。
本發明之其他態樣係針對一種組合物，其包含本文所述之聚核苷酸、本文所述之載體、本文所述之多肽或本文所述之活體外細胞。在一些實施例中，組合物包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。在一些實施例中，組合物包含賦形劑。在一個實施例中，組合物包含編碼包含如本文所述之抗原結合域之CAR或TCR之聚核苷酸。在另一實施例中，組合物包含由本發明聚核苷酸編碼之包含如本文所述之抗原結合域之CAR或TCR。在另一實施例中，組合物包含T細胞，其包含有包含如本文所述之抗原結合域之CAR或TCR。 III. 本發明之方法
本發明之另一態樣係針對一種在適合條件下製造表現CAR或TCR之細胞之方法，該細胞包含具有本文所揭示之聚核苷酸之經轉導細胞。在一些實施例中，該方法包含用如本文所揭示之編碼CAR或TCR之聚核苷酸轉導細胞。在一些實施例中，該方法包含用包含編碼CAR或TCR之聚核苷酸之載體轉導細胞。
本發明之另一態樣係針對一種誘導對腫瘤之免疫性之方法，其包含向個體投與有效量之包含本文所述之聚核苷酸、本文所述之載體或本文所述之CAR或TCR之細胞。在一個實施例中，該方法包含向個體投與有效量之包含編碼本文所揭示之CAR或TCR之聚核苷酸的細胞。在另一實施例中，該方法包含向個體投與有效量之包含有包含編碼本文所揭示之CAR或TCR之聚核苷酸的載體之細胞。在另一實施例中，該方法包含向個體投與有效量之包含由本文所揭示之聚核苷酸編碼之CAR或TCR之細胞。
本發明之另一態樣係針對一種誘導個體之免疫反應之方法，其包含投與有效量之本申請案之經工程改造之免疫細胞。在一些實施例中，免疫反應為T細胞介導之免疫反應。在一些實施例中，T細胞介導之免疫反應係針對一或多種標靶細胞。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞包含CAR或TCR，其中CAR或TCR包含如本文所述之抗原結合域。在一些實施例中，標靶細胞為腫瘤細胞。
本發明之另一態樣係針對一種用於治療或預防惡性病之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之至少一種免疫細胞，其中該免疫細胞包含至少一種CAR或TCR，且其中CAR或TCR包含如本文所述之抗原結合域。
本發明之另一態樣係針對一種治療有需要個體之癌症之方法，其包含向個體投與本文所揭示之聚核苷酸、載體、CAR或TCR、細胞或組合物。在一個實施例中，該方法包含投與編碼CAR或TCR之聚核苷酸。在另一實施例中，該方法包含投與包含編碼CAR或TCR之聚核苷酸的載體。在另一實施例中，該方法包含投與由本文所揭示之聚核苷酸編碼之CAR或TCR。在另一實施例中，該方法包含投與包含聚核苷酸之細，或包含聚核苷酸之載體，該聚核苷酸編碼CAR或TCR。
在一些實施例中，治療有需要個體之癌症之方法包含T細胞療法。在一個實施例中，本發明之T細胞療法為經工程改造之自體細胞療法(eACT™)。根據此實施例，該方法可包括自患者收集血球。分離之血球(例如T細胞)接著可經工程改造以表現本發明之CAR或TCR。在一特定實施例中，向該患者投與CAR T細胞或TCR T細胞。在一些實施例中，CAR T細胞或TCR T細胞治療患者之腫瘤或癌症。在一個實施例中，CAR T細胞或TCR T細胞降低腫瘤之尺寸或減輕癌症。
在一些實施例中，用於T細胞療法中之供者T細胞獲自患者(例如對於自體T細胞療法)。在其他實施例中，用於T細胞療法中之供者T細胞獲自並非患者之個體。
T細胞可以治療有效量投與。舉例而言。T細胞之治療有效量可為至少約104 個細胞、至少約105 個細胞、至少約106 個細胞、至少約107 個細胞、至少約108 個細胞、至少約109 個細胞或至少約1010 個細胞。在另一實施例中，T細胞之治療有效量為約104 個細胞、約105 個細胞、約106 個細胞、約107 個細胞或約108 個細胞。在一個特定實施例中，CAR T細胞或TCR T細胞之治療有效量為約2×106 個細胞/kg、約3×106 個細胞/kg、約4×106 個細胞/kg、約5×106 個細胞/kg、約6×106 個細胞/kg、約7×106 個細胞/kg、約8×106 個細胞/kg、約9×106 個細胞/kg、約1×107 個細胞/kg、約2×107 個細胞/kg、約3×107 個細胞/kg、約4×107 個細胞/kg、約5×107 個細胞/kg、約6×107 個細胞/kg、約7×107 個細胞/kg、約8×107 個細胞/kg或約9×107 個細胞/kg。 IV. 癌症治療
本發明之方法可用以治療個體之癌症，降低腫瘤之尺寸，殺死腫瘤細胞，預防腫瘤細胞增生，預防腫瘤生長，自患者消除腫瘤，預防腫瘤復發，預防腫瘤癌轉移，誘導患者緩解或其任何組合。在某些實施例中，該等方法誘導完全反應。在其他實施例中，該等方法誘導部分反應。
可治療之癌症包括B細胞淋巴瘤。在某些實施例中，B細胞淋巴瘤為急性淋巴母細胞白血病(ALL)、AIDS相關之淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、經典霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、產生HHV8相關多中心卡斯爾曼氏病之大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、淋巴漿細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤(MALT)、結邊緣區B細胞淋巴瘤(NMZL)、節狀淋巴細胞為主型霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症或其組合。在一個實施例中，B細胞淋巴瘤為急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤(MALT)及非霍奇金氏淋巴瘤。在一個實施例中，B細胞淋巴瘤為非霍奇金氏淋巴瘤。
在一些實施例中，該等方法進一步包含投與化學治療劑。
在其他實施例中，投與各有效治療個體中之疾病或病狀之量的抗原結合分子、經轉導之(或以其他方式工程改造之)細胞(諸如CAR或TCR)及化學治療劑。
在某些實施例中，本文所揭示之包含表現CAR及/或TCR之免疫效應細胞之組合物可在許多化學治療劑之前、結合其及/或在其之後投與。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN™)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺恢復；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、氧氮芥鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物,諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺藥，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲(hydroxyurea)；磨菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；PSK® ；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside，「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷類(taxoid), 例如太平洋紫杉醇(TAXOLTM ，Bristol-Myers Squibb)及多西他賽(doxetaxel) (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C(mitomycin C)；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞賓(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷；道諾黴素；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylomithine，DMFO)；視黃酸衍生物，諸如Targretin™ (貝瑟羅汀)、Panretin™ (阿利維甲酸(alitretinoin))；ONTAK™ (迪夫托斯地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯波黴素(esperamicin)；卡培他濱；及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，本文所揭示之包含表現CAR及/或TCR之免疫效應細胞組合物可結合用以調節或抑制腫瘤上之激素作用之抗激素劑投與，該抗激素劑為諸如抗雌激素劑，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4 (5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(法樂通(Fareston))；及抗雄激素劑，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。適當時亦投與化學治療劑之組合，包括(但不限於) CHOP，亦即環磷醯胺(Cytoxan® )、小紅莓(羥基小紅莓)、長春新鹼(Oncovin® )及潑尼松(Prednisone)。
在某些實施例中，本文所揭示之包含表現CAR及/或TCR之免疫效應細胞之組合物可在CHOP之前、結合其及/或在其之後投與。CHOP由以下組成：(C)環磷醯胺，一種藉由與其結合及使得形成交聯而損害DNA之烷基化劑；(H)羥基小紅莓(亦稱為小紅莓或阿德力黴素(adriamycin))，一種藉由將其插入DNA鹼基之間而損害DNA之嵌入劑；(O)ncovin(長春新鹼)，其藉由結合至微管蛋白而防止細胞複製；及(P)潑尼松或(P)潑尼龍，其為皮質類固醇。
在一些實施例中，化學治療劑在投與經工程改造之細胞或核酸的同時或之後一週內投與。在其他實施例中，化學治療劑在投與經工程改造之細胞或核酸之後1至4週或1週至1個月、1週至2個月、1週至3個月、1週至6個月、1週至9個月或1週至12個月投與。在一些實施例中，化學治療劑在投與細胞或核酸之前至少1個月投與。在一些實施例中，該方法進一步包含投與兩種或更多種化學治療劑。
適用於與本發明組合之額外治療劑包括(但不限於)依魯替尼(ibrutinib，Imbruvica®)、奧伐木單抗(ofatumumab，Arzerra®)、利妥昔單抗(rituximab，Rituxan®)、貝伐單抗(bevacizumab，Avastin®)、曲妥珠單抗(trastuzumab，Herceptin®)、曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine，KADCYLA®)、伊馬替尼(imatinib，Gleevec®)、西妥昔單抗(cetuximab，Erbitux®)、帕尼單抗(panitumumab，Vectibix®)、卡托莫西單抗(catumaxomab)、異貝莫單抗(ibritumomab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、托西莫單抗(tositumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、來那替尼(neratinib)、阿西替尼(axitinib)、馬賽替尼(masitinib)、帕佐泮尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、妥賽蘭尼(toceranib)、來他替尼(lestaurtinib)、阿西替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、樂伐替尼(lenvatinib)、尼達尼布(nintedanib)、帕佐泮尼(pazopanib)、瑞戈非尼(regorafenib)、司馬沙尼(semaxanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替沃紮尼(tivozanib)、妥賽蘭尼(toceranib)、凡德他尼(vandetanib)、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊馬替尼(imatinib)、達沙替尼(dasatinib)、尼羅替尼(nilotinib)、普納替尼(ponatinib)、拉多替尼(radotinib)、伯舒替尼(bosutinib)、來他替尼(lestaurtinib)、盧佐替尼(ruxolitinib)、帕瑞替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、畢尼替尼(binimetinib)、艾樂替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克卓替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、脂肪肽(adipotide)、地尼白介素迪夫托斯(denileukin diftitox)、mTOR抑制劑(諸如依維莫司(Everolimus)及坦羅莫司(Temsirolimus))、豪豬抑制劑(諸如索尼蒂吉伯(sonidegib)及維莫德吉(vismodegib))、CDK抑制劑(諸如CDK抑制劑(帕泊昔布(帕泊昔布)))。
適用於本發明之額外治療劑包括放射性原子。此類放射性原子之實例包括131 I、90 Y、212 Bi、186 Re、221 At、99m Tc及其混合物。然而，其他放射性原子亦可如此項技術中所已知來使用。
在額外實施例中，投與包含表現CAR及/或TCR之T細胞之組合物、包含scFV之結合物或scFV本身與消炎劑。消炎劑或藥物可包括(但不限於)類固醇及糖皮質激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氫皮質酮(hydrocortisone acetate)、氫皮質酮、氫皮質酮、甲基潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、曲安西龍(triamcinolone))；非類固醇消炎藥(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲胺喋呤(methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺(cyclophosphamide)及黴酚酸酯(mycophenolate)。例示性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑及唾液酸化物。例示性鎮痛劑包括乙醯胺苯酚、氧可酮(oxycodone)、曲馬多(tramadol)或鹽酸丙氧芬(proporxyphene hydrochloride)。例示性糖皮質激素包括可的松(cortisone)、地塞米松、氫皮質酮、甲基潑尼龍、潑尼龍或潑尼松。例示性生物反應修飾劑包括針對細胞表面標記物之分子(例如CD4、CD5等)、細胞介素抑制劑，諸如TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept，ENBREL® )、阿達木單抗(adalimumab，HUMIRA® )及英利昔單抗(infliximab，REMICADE® )、趨化介素抑制劑及黏附分子抑制劑。生物反應修飾劑包括單株抗體以及分子之重組形式。例示性DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環孢靈、甲胺喋呤、青黴胺(penicillamine)、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥基氯奎(hydroxychloroquine)、Gold(經口(金諾芬(auranofin))及肌肉內)及二甲胺四環素(minocycline)。
在某些實施例中，本文中所述之組合物與細胞介素結合投與。如本文所用，「細胞介素」意謂由一種細胞群體釋放而作用於另一細胞之蛋白質，如細胞間介體。細胞介素之實例為淋巴介質、單核球激素及傳統多肽激素。細胞介素中包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛類生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如濾泡刺激激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體激素(LH)；肝生長因子(HGF)；纖維母細胞生長因子(FGF)；促乳素；胎盤催乳激素；苗勒氏管抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子(NGF)，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II；紅血球生成素(EPO)；骨性誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF (M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF (GM-CSF)；及粒細胞-CSF (G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體(KL)。如本文所用，術語細胞介素包括來自天然來源或來自重組細胞培養基之蛋白質及天然序列細胞介素之生物活性同等物。 V. 結合物
本發明之抗原結合域(例如抗人類CD19 scFv)可結合(例如連接至)至如本文所述之治療劑(例如化學治療劑及放射性原子)。
使此類治療部分與例如scFv之抗體結合的技術已熟知；參見例如Arnon等人, 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy ，Reisfeld等人 (編), 1985, 第243-56頁, Alan R. Liss, Inc.)；Hellstrom等人, 「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery (第2版)，Robinson等人 (編), 1987, 第623-53頁, Marcel Dekker, Inc.)；Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」,Monoclonal Antibodies ' 84: Biological And Clinical Applications ，Pinchera等人 (編), 1985, 第475-506頁)；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy ，Baldwin等人(編), 1985, 第303-16頁, Academic Press；及Thorpe等人,Immunol. Rev., 62:119-58, 1982，前述參考文獻各以全文引用的方式併入本文中。 VI. 抗體人類化
抗體人類化為用人類抗體替換非人類抗體(例如scFv)構架之方法。成功抗體人類化視替換殘基之後維持親和力而定。在一些實施例中，人類化抗體為輕鏈與重鏈之序列中之至少一部分由人類基因產生之抗體分子。此類抗體本文中稱為「人類化抗體」、「人類抗體」或「全人類抗體」。人類單株抗體可藉由使用以下來製備：三源融合瘤技術；人類B細胞融合瘤技術(參見Kozbor等人, 1983 Immunol Today 4: 72)；及產生人類單株抗體之EBV融合瘤技術(參見Cole等人, 1985 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁)。人類單株抗體可使用人類融合瘤(參見Cote等人, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030)或藉由用埃-巴二氏病毒活體外轉變人類B細胞(參見Cole等人, 1985 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁)產生。
另外，例如scFv之人類抗體可使用額外技術產生，包括噬菌體呈現文庫(參見Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。類似地，藉由將人類免疫球蛋白基因座引入至轉殖基因動物(例如內源免疫球蛋白基因已部分或完全不活化之小鼠)中來製備人類抗體。激發時，觀察到人類抗體產生，其在所有方面與在人類中所見極其類似，包括基因重組、組裝及抗體譜系。此方法描述於美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號及第5,661,016號及Marks等人, Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等人, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild等人, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；及Lonberg及Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)中。
GenScript®提供一種人類化抗體之方法。該方法遵循組合CDR接枝、基於結構之回復突變方法及產生具有親和力及最佳特性之人類化抗體(例如scFv)之表現量、生物物理學特性及親和力技術之快速篩檢(FASEBA)。使用FASEBA技術使人類化抗體之特性(諸如表現量及熱穩定性)最佳化，該等特性對於最佳製造及活體內性能十分重要。GenScript®之方法之額外詳述見於全球資訊網(www)之genscript.com/Antibody-Humanization.html。其在本發明之揭示內容處可獲得之內容以全文引用的方式併入本文中。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如各單獨的公開案、專利或專利申請案經特定及單獨地指示以引用的方式併入一般。然而，本文中參考文獻之引用不應視為承認此類參考文獻為本發明之先前技術。若以引用的方式併入之參考文獻中提供之定義或術語中之任一者與本文提供之術語及論述有一定程度不同，則以本發明術語及定義為準。
本發明進一步藉由以下實例說明，該等實例不應理解為進一步限制。所有本申請案中所引用之參考文獻之內容均明確以引用的方式併入本文中。 實例實例 1 ： FMC63 抗體之 scFV 之人類化
此實例之目標為使用CDR接枝加回復突變在不犧牲親本(野生型)抗體結合親和力之情況下使抗CD19小鼠單株抗體(mAb)純系FMC63人類化。抗原細胞及參比抗體之結合驗證
培養Raji (智人伯基特氏淋巴瘤)細胞且藉由離心收集。每孔約3×105 個細胞用PBS洗滌兩次且在4℃下在200 μl參比抗體之連續稀釋液(FMC63：小鼠抗人類B細胞(CD19) IgG抗體)中培育30分鐘。在用PBS洗滌之後，將二級抗體(5 μg/ml山羊抗小鼠IgG [FITC])添加至細胞中且在4℃下培育30分鐘。在用PBS洗滌之後，藉由使用FACSCalibur™ (BD Bioscience, San Jose, CA)及FlowJo軟體(Ashland, OR)分析細胞之結合EC50。
參比抗體(FMC63)結合至Raji細胞，但不結合至Eol-1細胞(智人急性骨髓(嗜酸性)白血病)(資料未示出)。產生人類化 FMC63 文庫
設計用於FMC63之重鏈及輕鏈之組合人類化回復突變(BM)篩檢文庫。文庫之構築遵循GenScript之標準運作程序來實施。自噬菌體呈現文庫分離人類化 FMC63 scFv
針對Raji (智人伯基特氏淋巴瘤)細胞淘選獲自以上提及之人類化文庫之人類化scFv噬菌體呈現文庫。將輸入噬菌體粒子在有或無Eol-1 (智人急性骨髓(嗜酸性)白血病)細胞下預培育，且結合之噬菌體在藉由野生型抗體先前競爭溶離下藉由TEA溶離，得到多樣化及高親和力結合子。
個別輸出噬菌體純系在96深孔盤中擴增且藉由基於細胞之ELISA及流式細胞測量術驗證來分析擴增之噬菌體。結合之噬菌體藉由HRP/抗M13單株抗體探測。
當發現良好百分比之噬菌體純系與Raji細胞結合，但不結合至Ecol-1細胞時，淘選結束。遵循GenScript之標準運作程序實施淘選及噬菌體ELISA。表現、生物物理學特性及親和力之快速篩檢 ( FASEBA )
使用所選輸出噬菌體感染以指數方式生長之TG1 (噬菌體呈現勝任型)細胞。使萃取出dsDNA之經轉染細胞生長。人類化scFv片段自雙股噬菌粒消化且插入於pFASEBA載體中以篩檢最佳人類化抗體純系。
個別純系表現於96深孔盤中，且藉由大腸桿菌分泌至培養基中之粗蛋白質藉由ELISA針對BSA及藉由FACS驗證針對Raji細胞進行分析以分別評估表現及結合活性。構築及產生人類化 FMC63 scFv
合成編碼FMC63 (小鼠抗人類B細胞(CD19)IgG抗體)之人類化重鏈及輕鏈之DNA序列，且插入至pTT5表現載體中以構築scFv-(單鏈片段可變)表現質體。人類化抗體之表現在100 ml HEK293細胞培養基中進行，且用Ni螯合劑親和管柱純化上清液。純化抗體使用PD-10去鹽管柱緩衝液交換至PBS中。純化蛋白質之濃度及純度分別藉由OD280及SDS-PAGE測定。人類化 FMC63 scFv 之流式細胞測量術滴定
對於人類化FMC63抗體與Raji細胞之親和力分級，使純化抗體經受流式細胞測量術滴定。簡言之，培養Raji細胞且藉由離心收集。每孔約3×105 個細胞用PBS洗滌兩次且在4℃下在200 μl scFVs之連續稀釋液中培育30分鐘。在用PBS洗滌之後，將二級抗體(5 μg/ml His標籤抗體[FITC])添加至細胞中且在4℃下培育30分鐘。在用PBS洗滌之後，藉由使用FACSCalibur™及FlowJo軟體分析細胞之結合EC50。自噬菌體呈現文庫分離人類化 FMC63 scFv 純系
執行在有或無Ecol-1細胞下預培育之人類化scFv噬菌體文庫之淘選(表4)。 表4：細胞淘選及噬菌體ELISA驗證之詳述
第二輪之陽性速率(抗原特異性人類化純系之數目相比於隨機拾取之純系之總數目)為約40%。在用流式細胞測量術驗證之後持續觀察到針對Raji及Ecol-1細胞之基於細胞之ELISA之結果。FASEBA 篩檢
使編碼第二輸出噬菌體之scFv片段之DNA擴增且插入至pFASEBA載體中以篩檢前導抗體。將個別FASEBA文庫純系接種且在96深孔盤中誘導表現。執行FACS篩檢以分離特異性識別Raji細胞之scFv。
根據結果，選擇七個純系(命名為RS、CS、BS、SS、JS、AS及NS)以用於表現、純化及親和力量度。表現及純化人類化 FMC63 scFv
以上提及之七個人類化scFv及野生型scFv表現於100 mlHEK293細胞中且藉由NTA-Ni樹脂純化。各scFv之純度高於90%，如藉由SDS-PAGE所評估。人類化 FMC63 scFv 之流式細胞測量術滴定
首先藉由FACS使用時以3 μM純化之抗體為起始物質研究人類化scFv與Raji細胞之結合。在兩輪流式細胞測量術期間持續觀察到七個上文所提及之人類化scFv純系之陽性結合信號。
最終，選擇此等七個人類化scFv藉由流式細胞測量術進行分析。七個所選人類化抗體之幾何平均值及EC50示於圖3A及圖3B及表5中。值得注意的是，相比於野生型抗體之27.11 nM，scFv純系SS、JS、AS/AS-R及NS之EC50分別為72.76 nM、65.98 nM、53.06/61.97 nM及34.02 nM。 表5：藉由FACS滴定得到之七個所選人類化scFvs之幾何平均值 表徵七個所選 scFV 中之 四者
編碼野生型scFv及七個所選人類化scFV中之四者之核苷酸序列在上文描述於實施方式中。同樣地，用於野生型scFv及七個所選人類化scFV中之四者之胺基酸序列在上文描述於實施方式中。
選擇與野生型scFv之結合EC50相當之四個人類化scFv(純系，命名為SS、JS、AS及NS)用於進一步表徵。
執行對四個純系之尺寸排阻層析(SEC)分析以部分鑑別scFv形成可溶性聚集體之傾向。如圖4A及圖4B中所示，NS及JS純系經SEC呈現單峰；因此，在分析條件下NS及JS scFv並不形成聚集體。另一方面，如圖4C及圖4D中所示，SS及AS純系經SEC呈現雙峰；參見，各圖式中之插圖。因此，在測試條件下，SS及AS scFv形成明顯量之可溶性聚集體。結論
在此實例中，將抗CD19小鼠單株抗體(mAb)純系FMC63成功人類化。七個人類化scFv獲自FASEBA高產出率篩檢及噬菌體呈現技術。四個人類化scFv (純系，命名為SS、JS、AS及NS)展示與野生型FMC63 scFv相當的結合(EC50值)。實例 2 ：表徵包含各所選 scFV 之嵌合抗原受體 ( CAR )
設計將四個所選scFV (SS、JS、AS及NS)中之一者表現為其抗原結合分子之嵌合抗原受體(CAR)。執行熱升溫分析以確定四個包含 CAR 結合域之 scFv 之熱穩定性
增強之穩定性為蛋白質之所需特性。此特性通常藉由在各種條件下確定蛋白質之熔融溫度評定。具有更高熔融溫度之蛋白質一般穩定更長時間。當CAR更為熱穩定時，其在細胞之表面上可具功能活性更長時段。
包含本發明之CAR之結合域的scFv之熱穩定性使用Bio-Rad C1000熱循環器、CFx96即時系統量測。使用螢光染料SYPRO®橙(Invitrogen)監測蛋白質之去摺疊，當蛋白質去摺疊時，其結合至暴露之疏水性胺基酸。將溫度梯度設置為在1℃/分鐘逐步增加下由25℃至95℃。各樣品含有10 µM CAR scFv及5X SYPRO®橙蛋白質凝膠染色劑(Molecular Probes™；5,000倍於DMSO中之濃度)。在圖5A中所示之樣品中包括50 mM NaCl。
在此分析中，可接受之CAR熔融溫度理想地大於60℃。
如圖5A中所示，在50 mM NaCl存在下，包含人類化scFv之CAR展示不同熱穩定性，當省略NaCl時，差異極小(如圖5B中所示)。此外，相對於其他CAR中所用之其他經研究之scFv，本發明之CAR之scFv相當穩定。當(「□」)scFv具有約58℃之最低熔融溫度時；可見SS純系(「∆」；65℃)、JS純系(「◊」；67℃)及NS純系(「Χ」；73℃)之scFV的遞增之熔融溫度。兩個細胞株中之 CAR 表現
包含SS-scFv、JS-scFv、AS-scFv及NS-scFv之CAR表現於兩個T細胞供者細胞中：5244 (圖6A)及5273 (圖6B)。亦製備模擬-CAR表現供者細胞樣品及表現包含FMC63 (親本) scFV之CAR的供者細胞。
藉由用結合PE之抗CAR抗體培育細胞在供者細胞之表面上偵測CAR。CAR陽性及螢光強度百分比藉由流式細胞測量術來量測。
圖6A及圖6B展示無CAR表現於經模擬轉導之T細胞中。在任一供者之細胞中，與其他三個所選人類化scFv純系相比，表現更多SS CAR；AS CAR具有最小表現量。實例 3 ：包含所選 scFV 中之各者的 CAR 選擇性殺死腫瘤細胞
將來自供者5244 (圖7A至7D)或5273 (圖8A至8D)之經CAR或模擬轉導之T細胞以1:1或4:1之效應子與標靶之比率添加至標靶細胞株中。使用四個標靶細胞類型：Raji (CD19+智人伯基特氏淋巴瘤細胞；圖7A及圖8A)、Namalawa (CD19+智人伯基特氏淋巴瘤細胞；圖7B及圖8B)、Eol-1 (CD19- 智人急性骨髓(嗜酸性)白血病細胞；圖7C及圖8C)及Mv411 (CD19- 智人雙表型B骨髓單核細胞性白血病細胞；圖7D及圖8D)。使用星形孢菌素(「Stauro」)作為腫瘤細胞殺死之陽性對照。
在37℃下同培養18小時之後，將50 µL於R10培養基中之穩定-Glo螢光素試劑添加至各孔中且在37℃下培育盤10分鐘。使用螢光素酶活性作為細胞存活力之量度。在Varioskan Flash盤讀取器中讀取發光。
圖7A至圖7D及圖8A至圖8D展示經CAR轉導且與標靶細胞一起培育之供者細胞之量測之發光。本發明之CAR中之各者能夠殺死CD19+標靶細胞。
在用OKT3初始刺激之後十天量測來自額外供體之經CAR或模擬轉導之T細胞之生長動力學。觀察到之各CAR之生長曲線示於圖9A中。接著第二次刺激經CAR或模擬轉導之T細胞，且如圖9B中所示，觀察到生長動力學差異。在第10天，用抗CAR抗體及CD3表徵T細胞群體(圖10A)。亦執行CD4/CD8染色以在圖10B中所示之CART細胞生產期間監測CD8細胞之富集。在1:1之效應子與標靶之比率下，對CD19+NAMALWA (圖11A)或CD19-EOL-1 (圖11B)進行細胞毒性分析。
當結合附圖時，以上及其他特徵將根據以下實施方式而更清楚地理解。然而，圖式僅出於說明的目的；而非限制的。
圖1A及圖1B為描繪嵌合抗原受體(CAR)製造及用途之特徵的草圖。圖1A展示編碼CAR之例示性聚核苷酸、包含編碼CAR之聚核苷酸之病毒載體、將病毒載體轉導至患者之T細胞中、整合至宿主基因組中及在經轉導(「經CAR工程改造之」)T細胞之表面上表現CAR。圖1B展示已識別位於癌細胞表面上之標靶抗原之經CAR工程改造之T細胞。標靶抗原之識別及結合激活T細胞中之機制，包括溶胞活性、細胞介素釋放及T細胞增殖；此等機制促進癌細胞殺死。
圖2為展示在經工程改造之自體細胞療法(eACT™)期間執行之主要步驟之草圖。
圖3A及圖3B為展示七個結合至Raji (CD19+智人伯基特氏淋巴瘤)細胞之所選人類化scFvs之流式細胞測量術資料之圖表。RS、CS、BS、SS、JS、AS、AS-R及NS表示發明人關於人類化抗體之內部命名規約；WT表示野生型。
圖4A至圖4D為展示NS、SS、JS及AS人類化scFVs之尺寸排阻層析(SEC)分析之圖表。此分析反映此等抗體之可溶性聚集傾向。
圖5A及圖5B為展示確定包含NS、SS、JS及AS人類化scFVs之CAR之多肽穩定性的熱升溫之圖表。在圖5A中，在存在50 mM NaCl下確定熱穩定性，且在圖5B中，省略NaCl。展示源自scFVs AS (「□」)、SS (「∆」)、JS (「◊」)及NS (「Χ」)之CAR。
圖6A及圖6B包括展示表現於T細胞表面上之本發明之包含SS、JS、AS及NS之CAR之偵測的一系列曲線圖，其獲自兩種供者個體5244 (圖6A)及5273 (圖6B)。亦製備表現模擬-CAR之供者細胞及表現包含親本抗體(「FMC63」) scFV之CAR之供者細胞。
圖7A至圖7D包括表明來自供者5244之具有經CAR或模擬轉導之供者細胞之本發明之CAR之溶胞活性之一系列條形圖。在效應子添加經CAR或模擬轉導之供者細胞達1:1或4:1之標靶比率。使用四個標靶細胞類型：Raji (CD19+智人伯基特氏淋巴瘤細胞；圖7A)、Namalawa (CD19+智人伯基特氏淋巴瘤細胞；圖7B)、Eol-1 (CD19- 智人急性骨髓(嗜酸性)白血病細胞；圖7C)及Mv411 (CD19- 智人雙表型B骨髓單核細胞性白血病細胞；圖7D)。使用星形孢菌素(「Stauro」)作為腫瘤細胞殺死之陽性對照。
圖8A至圖8D包括表明來自供者5273之具有經CAR或模擬轉導之供者細胞之本發明之CAR之溶胞活性之一系列條形圖。在效應子添加經CAR或模擬轉導之供者細胞達1:1或4:1之標靶比率。使用四個標靶細胞類型：使用Raji細胞(圖8A)、Namalawa細胞(圖8B)、Eol-1細胞(圖8C)及Mv411細胞(圖8D)。使用Stauro作為腫瘤細胞殺死之陽性對照。
圖9A及9B展示在用OKT3初始刺激之後十天量測之來自額外供者之經CAR或模擬轉導之T細胞之生長動力學。觀察到之各CAR之生長曲線示於圖9A中。接著第二次刺激經CAR或模擬轉導之T細胞，且如圖9B中所示，觀察到生長動力學差異。
圖10A展示使用抗CAR抗體及CD3之第10天之T細胞群體之特徵。圖10B展示CAR T細胞產生期間之CD4/CD8染色。
圖11展示對CD19+ NAMALWA 圖11A)或CD19- EOL-1 (圖11B)細胞進行之細胞毒性分析。

Claims (106)

  1. 一種人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區，其中該VL區包含VL互補決定區(CDR) 1 (VL CDR1)、VL CDR2及VL CDR3，且該VH區包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3， 其中該VL區源自SEQ ID NO: 36且VH區源自SEQ ID NO: 37，且其中該VL及/或VH區在構架區中包含一或多個胺基酸取代。
  2. 如請求項1之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中與SEQ ID NO: 36相比，該VL區包含至多5、10、15、20、25或30個胺基酸取代。
  3. 如請求項1或2之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL區中之一或多個胺基酸取代位於與SEQ ID NO: 36之7、8、10、15、22、41、42、43、44、49、71、72、77、79、80、83、87、100及/或107對應之位置。
  4. 如請求項1至3中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL區中之一或多個胺基酸取代係選自SEQ ID NO: 36之位置7之Ser、位置8之Pro、位置15之Val、位置22之Thr、位置41之Gln、位置42之Lys、位置43之Ala、位置72之Thr、位置77之Ser、位置79之Gln、位置80之Pro及/或位置107之Lys。
  5. 如請求項1至4中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中與SEQ ID NO: 37相比，該VH區包含至多5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸取代。
  6. 如請求項1至5中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VH區中之一或多個胺基酸取代位於與SEQ ID NO: 37之1、3、5、9、13、15、16、17、19、20、21、23、24、37、42、48、67、69、70、71、73、76、77、78、79、81、83、86、87、88、92及/或115對應之位置。
  7. 如請求項1至6中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VH區中之一或多個胺基酸取代係選自SEQ ID NO: 37之位置1之Gln、位置3之Gln、位置5之Val、位置9之Gly、位置13之Lys、位置13之Gln、位置15之Gly、位置16之Arg、位置16之Thr、位置17之Thr、位置19之Arg、位置20之Leu、位置21之Ser、位置24之Ala、位置42之Gly、位置48之Ile、位置67之Phe、位置70之Ser、位置71之Arg、位置73之Thr、位置76之Asn、位置77之Thr、位置78之Leu、位置79之Tyr、位置81之Gln、位置83之Ser、位置86之Thr、位置86之Arg、位置87之Ala、位置88之Glu、位置88之Ala、位置92之Val及/或位置115之Leu。
  8. 一種人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區，其中該VL區包含VL互補決定區(CDR) 1 (VL CDR1)、VL CDR2及VL CDR3，且該VH區包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3， 其中該VL區具有與SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 17至少85%一致之胺基酸序列；及/或 其中該VH區具有與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 18至少85%一致之胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：IgG、Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv、scFv及單域抗體(dAB)。
  10. 如請求項9之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為scFv。
  11. 如請求項10之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL CDR1與SEQ ID NO: 27至少80%一致，該VL CDR2與SEQ ID NO: 28至少80%一致，且該VL CDR3與SEQ ID NO: 29至少80%一致。
  12. 如請求項10或11之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，該VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，且該VL CDR3包含SEQ ID NO: 29。
  13. 如請求項10至12中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VH CDR1與SEQ ID NO: 30或33至少80%一致，該VH CDR2與SEQ ID NO: 31或34至少80%一致，且該VH CDR3與SEQ ID NO: 32至少80%一致。
  14. 如請求項13之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VH CDR1包含SEQ ID NO: 30或33，該VH CDR2包含SEQ ID NO: 31或34，且該VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
  15. 如請求項10之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL CDR1與SEQ ID NO: 27至少80%一致，該VL CDR2與SEQ ID NO: 28至少80%一致，該VL CDR3與SEQ ID NO: 29至少80%一致，該VH CDR1與SEQ ID NO: 30或33至少80%一致，該VH CDR2與SEQ ID NO: 31或34至少80%一致，且該VH CDR3與SEQ ID NO: 32至少80%一致。
  16. 如請求項15之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，該VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，該VL CDR3包含SEQ ID NO: 29，該VH CDR1包含SEQ ID NO: 30或33，該VH CDR2包含SEQ ID NO: 31或34，且該VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
  17. 如請求項16之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，該VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，該VL CDR3包含SEQ ID NO: 29，該VH CDR1包含SEQ ID NO: 30，該VH CDR2包含SEQ ID NO: 31，且該VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
  18. 如請求項16之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，該VL CDR2包含SEQ ID NO:28，該VL CDR3包含SEQ ID NO: 29，該VH CDR1包含SEQ ID NO: 33，該VH CDR2包含SEQ ID NO: 34，且該VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
  19. 如請求項16之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL CDR1包含SEQ ID NO: 27，該VL CDR2包含SEQ ID NO: 28，該VL CDR3包含SEQ ID NO: 29，該VH CDR1包含SEQ ID NO: 30，該VH CDR2包含SEQ ID NO: 34，且該VH CDR3包含SEQ ID NO: 32。
  20. 如請求項1至19中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 14至少85%一致。
  21. 如請求項20之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VH與SEQ ID NO: 15至少85%一致。
  22. 如請求項21之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 14至少85%一致，且該VH與SEQ ID NO: 15至少85%一致。
  23. 如請求項22之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 14至少90%一致，且該VH與SEQ ID NO: 15至少90%一致。
  24. 如請求項23之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 14至少95%一致，且該VH與SEQ ID NO: 15至少95%一致。
  25. 如請求項24之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 14至少99%一致，且該VH與SEQ ID NO: 15至少99%一致。
  26. 如請求項25之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL包含SEQ ID NO: 14，且該VH包含SEQ ID NO: 15。
  27. 如請求項26之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中多肽包含SEQ ID NO: 24。
  28. 如請求項1至19中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 20至少85%一致。
  29. 如請求項28之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VH與SEQ ID NO: 21至少85%一致。
  30. 如請求項29之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 20至少85%一致，且該VH與SEQ ID NO: 21至少85%一致。
  31. 如請求項30之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 20至少90%一致，且該VH與SEQ ID NO: 21至少90%一致。
  32. 如請求項31之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 20至少95%一致，且該VH與SEQ ID NO: 21至少95%一致。
  33. 如請求項32之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 20至少99%一致，且該VH與SEQ ID NO: 21至少99%一致。
  34. 如請求項33之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL包含SEQ ID NO: 20，且該VH包含SEQ ID NO: 21。
  35. 如請求項34之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中多肽包含SEQ ID NO: 26。
  36. 如請求項1至19中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 11至少85%一致。
  37. 如請求項36之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VH與SEQ ID NO: 12至少85%一致。
  38. 如請求項37之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 11至少85%一致，且該VH與SEQ ID NO: 12至少85%一致。
  39. 如請求項38之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 11至少90%一致，且該VH與SEQ ID NO: 12至少90%一致。
  40. 如請求項39之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 11至少95%一致，且該VH與SEQ ID NO: 12至少95%一致。
  41. 如請求項40之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 11至少99%一致，且該VH與SEQ ID NO: 12至少99%一致。
  42. 如請求項41之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL包含SEQ ID NO: 11，且該VH包含SEQ ID NO: 12。
  43. 如請求項42之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中多肽包含SEQ ID NO: 23。
  44. 如請求項1至19中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 17至少85%一致。
  45. 如請求項44之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VH與SEQ ID NO: 18至少85%一致。
  46. 如請求項45之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 17至少85%一致，且該VH與SEQ ID NO: 18至少85%一致。
  47. 如請求項46之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 17至少90%一致，且該VH與SEQ ID NO: 18至少90%一致。
  48. 如請求項47之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 17至少95%一致，且該VH與SEQ ID NO: 18至少95%一致。
  49. 如請求項48之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL與SEQ ID NO: 17至少99%一致，且該VH與SEQ ID NO: 18至少99%一致。
  50. 如請求項49之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中該VL包含SEQ ID NO: 17，且該VH包含SEQ ID NO: 18。
  51. 如請求項50之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其中多肽包含SEQ ID NO: 25。
  52. 一種多肽，其包含如請求項1至51中任一項之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段。
  53. 如請求項52之多肽，其進一步包含有包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的His標籤。
  54. 如請求項53之多肽，其中該多肽與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19至少85%一致。
  55. 如請求項54之多肽，其中該多肽與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19至少90%一致。
  56. 如請求項55之多肽，其中該多肽與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19至少95%一致。
  57. 如請求項56之多肽，其中該多肽與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19至少99%一致。
  58. 如請求項57之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19。
  59. 如請求項52至58中任一項之多肽，其中該多肽連接至治療劑。
  60. 如請求項59之多肽，其中該治療劑為化學治療劑、細胞介素、放射性原子、siRNA或毒素。
  61. 如請求項60之多肽，其中該治療劑係化學治療劑。
  62. 如請求項60之多肽，其中該治療劑為放射性原子。
  63. 一種嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其包含：(i)抗原結合域、(ii)協同刺激域及(iii)活化域， 其中該協同刺激域包含細胞外部分、跨膜域及胞內域，且 其中該抗原結合域至少包含如請求項52之多肽。
  64. 如請求項63之CAR或TCR，其中該共刺激域來自或源自CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、 IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位受體(Toll ligand receptor)及其片段或組合。
  65. 如請求項63或64之CAR或TCR，其中該跨膜域來自或源自4-1BB/CD137、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞共刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、 IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位受體及其組合。
  66. 如請求項63至65中任一項之CAR或TCR，其中該胞內域來自或源自4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CDl la、CDl lb、CDl lc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、免疫球蛋白樣蛋白質、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、特異性結合CD83之配位體、LIGHT、LIGHT (腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴細胞作用相關之抗原-1 (LFA-1 (CDl la/CD18)、MHC I類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、計劃性死亡-1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白質)、SLAM (SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244；2B4)、SLAMF6 (NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白質、TNFR2、鐸配位受體、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其組合。
  67. 如請求項63至66如請求項中任一項之CAR或TCR，其中該細胞外域來自或源自CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關之α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關之β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、誘導性T細胞協同刺激物(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、 IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、鐸配位受體(Toll ligand receptor)及其片段或組合。
  68. 如請求項63至67中任一項之CAR或TCR，其中該活化域來自或源自CD3-ζ或CD3-ε。
  69. 一種人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段，其進一步包含如請求項63至68中任一項之CAR或TCR。
  70. 一種載體，其編碼如請求項69之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段。
  71. 如請求項70之載體，其中載體為腺病毒載體、腺病毒相關之載體、DNA載體、豆狀病毒載體、質體、反轉錄病毒載體或RNA載體。
  72. 如請求項71之載體，其中該載體為反轉錄病毒載體。
  73. 如請求項72之載體，其中該反轉錄病毒載體為豆狀病毒載體。
  74. 一種嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其由如請求項70至73中任一項之載體編碼。
  75. 一種細胞，其包含如請求項69之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段、如請求項70至73中任一項之載體或如請求項63至67中任一項或請求項74之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
  76. 如請求項75之細胞，其中該細胞為T細胞。
  77. 如請求項76之細胞，其中該T細胞為同種異體T細胞、自體T細胞、經工程改造之自體T細胞(eACT)或腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
  78. 如請求項77之細胞，其中該T細胞為CD4+ T細胞。
  79. 如請求項77之細胞，其中該T細胞為CD8+ T細胞。
  80. 如請求項75至79中任一項之細胞，其中該細胞為活體外細胞。
  81. 如請求項中76至80任一項之細胞，其中該細胞為自體T細胞。
  82. 如請求項75至81中任一項之細胞，其中該細胞當結合至人類CD19時至少產生干擾素γ (IFNγ)。
  83. 一種組合物，其包含複數個如請求項75至82中任一項之細胞。
  84. 如請求項83之組合物，其中該組合物包含CD4+或CD8+細胞。
  85. 如請求項84之組合物，其中該組合物包含CD4+及CD8+細胞。
  86. 如請求項85之組合物，其中約20%與80%之間的該等T細胞為CD4+細胞，且其餘部分該等T細胞為CD8+細胞。
  87. 如請求項86之組合物，其中約30%與70%之間的該等T細胞為CD4+細胞，且其餘部分該等T細胞為CD8+細胞。
  88. 如請求項87之組合物，其中約40%與60%之間的該等T細胞為CD4+細胞，且其餘部分該等T細胞為CD8+細胞。
  89. 如請求項88之組合物，其中約50%之該等T細胞為CD4+細胞，且約50%之該等T細胞為CD8+細胞。
  90. 如請求項85之組合物，其中約20%與80%之間的該等T細胞為CD8+細胞，且其餘部分該等T細胞為CD4+細胞。
  91. 如請求項90之組合物，其中約30%與70%之間的該等T細胞為CD8+細胞，且其餘部分該等T細胞為CD4+細胞。
  92. 如請求項91之組合物，其中約40%與60%之間的該等T細胞為CD8+細胞，且其餘部分該等T細胞為CD4+細胞。
  93. 如請求項83至92中任一項之組合物，其中該複數個細胞中之各細胞為自體T細胞。
  94. 如請求項83至92中任一項之組合物，其中該組合物包含至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  95. 一種組合物，其包含如請求項69之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段、如請求項70至73中任一項之載體或如請求項63至67中任一項或請求項74之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
  96. 一種用於製造表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞之方法，其包含用如請求項69之人類化抗CD19抗體或其抗原結合片段或如請求項70至73中任一項之載體轉導細胞之步驟。
  97. 如請求項96之方法，其中該細胞為分離自需要治療之患者之淋巴細胞。
  98. 如請求項97之方法，其中該淋巴細胞為自然殺手細胞、T細胞或B細胞。
  99. 如請求項96至98中任一項之方法，其進一步包含在促進細胞增殖及/或T細胞活化之條件下培養該等細胞之步驟。
  100. 如請求項96至99中任一項之方法，其進一步包含分離所需T細胞之步驟。
  101. 如請求項100之方法，其中該分離所需T細胞之步驟發生在培養約六天之後。
  102. 如請求項101之方法，其中該等所需T細胞表現CD4+及/或CD8+。
  103. 一種如請求項75至82中任一項之細胞或如請求項83至95中任一項之組合物的用途，其係用以製造用於治療B細胞淋巴瘤之藥劑。
  104. 如請求項103之用途，其中該B細胞淋巴瘤係選自由以下組成之群：急性淋巴母細胞白血病(ALL)、AIDS相關之淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、經典霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin lymphoma)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、產生HHV8相關多中心卡斯爾曼氏病(HHV8-associated multicentric Castleman's disease)之大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、淋巴漿細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤(MALT)、結邊緣區B細胞淋巴瘤(NMZL)、節狀淋巴細胞為主型霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenström's macroglobulinemia)。
  105. 如請求項104之用途，其中該B細胞淋巴瘤係選自由以下組成之群：急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤(MALT)及非霍奇金氏淋巴瘤。
  106. 如請求項105之用途，其中該B細胞淋巴瘤為非霍奇金氏淋巴瘤。
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