TW201841651A - Alt-803組合抗cd38抗體用於癌症療法 - Google Patents
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Abstract
本發明的特徵在於使用IL-15為基礎的超級促效劑複合物和抗體的組合療法,以有效治療患有癌症和感染性疾病的個體。
Description
本申請案主張2017年3月31日申請之美國臨時申請案第62/480,339號之優先權,其全文經引用併入本文。
本發明大體上係關於治療癌症和自體免疫和炎症疾病療法之領域。
在如本文描述的本發明之前,迫切需要開發增強及/或導向免疫力對抗癌症並改善自體免疫和炎症疾病的新策略。
本發明至少部分係基於令人驚訝的發現,即抗CD38抗體組合ALT-803,一種介白素-15(IL-15)超級促效劑(superagonist)突變體和IL-15受體α/Fc二聚體融合蛋白之複合物可用於增強免疫反應對抗腫瘤形成(例如血液癌症,B細胞瘤,多發性骨髓瘤(MM),慢性淋巴細胞白血病(CLL),B和T急性淋巴細胞白血 病,急性骨髓性白血病,慢性骨髓性白血病,毛細胞白血病,華氏巨球蛋白血症,原發性系統性澱粉沈積症,被套細胞淋巴癌,NK細胞白血病,NK或T細胞淋巴瘤,漿細胞白血病,B細胞淋巴瘤,非何杰金氏淋巴瘤,柏基特氏淋巴瘤,何杰金氏淋巴瘤及實質固態瘤),或用於抑制與抗體相關的自體免疫和炎性疾病(例如全身性紅斑狼瘡(SLE),血管炎,自體免疫性血細胞減少症,類風濕性關節炎,發炎性腸道疾病,潰瘍性結腸炎,移植物抗宿主疾病和過敏反應)。
治療個體中的腫瘤或自體免疫或炎症疾病的方法係經由投予該個體有效量的抗CD38抗體(或類抗體分子)和有效量的醫藥組成物來進行,該醫藥組成物包含IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合物(ALT-803),其中ALT-803包含IL-15RαSu/Fc二聚體和兩個IL-15N72D分子。在一態樣,IL-15N72D分子包含SEQ ID NO:3。一個例示性IL-15RαSu/Fc包含SEQ ID NO:6。
該個體較佳為需要此種治療的哺乳動物,例如已被診斷患有腫瘤或自體免疫或炎症疾病或具有該傾向者。哺乳動物係為任何哺乳動物,例如人類,靈長類動物,小鼠,大鼠,狗,貓,馬,以及供食用的牲畜或動物,例如牛,綿羊,豬,雞,和山羊。在一個較佳的具體實施例中,該哺乳動物為人。
適合以本文中描述的方法治療的腫瘤包括 血液癌症,B細胞瘤,多發性骨髓瘤(MM),慢性淋巴細胞白血病(CLL),B和T急性淋巴細胞白血病,急性骨髓性白血病,慢性骨髓性白血病,毛細胞白血病,華氏巨球蛋白血症,原發性系統性澱粉沈積症,被套細胞淋巴癌,NK細胞白血病,NK或T細胞淋巴瘤,漿細胞白血病,B細胞淋巴瘤,非何杰金氏淋巴瘤,柏基特氏淋巴瘤,何杰金氏淋巴瘤及實質固態瘤。以本文中描述的方法治療的例示性自體免疫或炎症疾病包括全身性紅斑狼瘡(SLE),血管炎,自體免疫性血細胞減少症,類風濕性關節炎,發炎性腸道疾病,潰瘍性結腸炎,移植物抗宿主疾病,嚴重過敏反應和氣喘(van de Donk,et al.2016.Immunol Rev.270:95-112)。
較佳地,本文中所述組成物的投予也預防疾病治療後,未來腫瘤或自體免疫/炎性疾病的復發。本文中所述的治療方法還可以與其他已顯示有效治療MM的藥劑組合,包括但不限於地塞米松(dexamethasone),硼替佐米(lenalidomide),來那度胺(lenalidomide),沙利度胺(thalidomide),硼替佐米/脂質多柔比星(bortezomib/doxil),卡非佐米(carfilzomib),泊馬度胺(pomalidomide),帕比司他(panobinostat),埃羅妥珠單抗(elotuzumab),愛莎佐米(ixazomib)和醣基化美法崙(glycosylated melphalan)。本發明的治療方法還可以與任何以下療法組合:放療,化療,手術,治療性抗體,免疫調節劑,蛋白酶體抑製劑,pan-DAC抑 製劑,H-DAC抑製劑,檢查點抑製劑,過繼性細胞療法包括CAR T和NK細胞療法和疫苗。此外,這些療法可用於初治患者,或復發或難治性疾病患者。
另外,治療前和治療後使用類固醇(即,皮質類固醇,退熱劑和抗組織胺)的策略通常與ALT-803加抗CD38抗體療法合併使用。抗CD38抗體的投予通常導致顯著的輸注反應,其可能延遲或終止治療並導致患者的疼痛和不適。類固醇用於減少這些影響,但也可能抑制為達治療效益所必需的免疫反應。令人驚訝的是,在使用和不使用類固醇預處理的情況下,發現ALT-803加抗CD38抗體治療在動物腫瘤模型中同樣有效。
ALT-803的例示性有效劑量包括0.1μg/kg體重和100mg/kg體重之間,例如:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800或900μg/kg體重,或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg體重。
在某些情況下,ALT-803係每天例如每24小時投予。或者,每天連續或數次投予ALT-803,例如每1小時,每2小時,每3小時,每4小時,每5小時,每6小時,每7小時,每8小時,每9小時,每10小時,每11小時或每12小時。
ALT-803的例示性有效每日劑量包括0.1μg/kg與100μg/kg之間,例如0.1、0.3、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99μg/kg體重。
或者,ALT-803每週投予約一次,例如約每7天一次。或者,ALT-803每週投予兩次,每週三次,每週四次,每週五次,每週六次或每週七次。ALT-803的例示性有效每週劑量包括0.0001mg/kg和4mg/kg體重之間,例如0.001、0.003、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3或4mg/kg體重。例如,有效的ALT-803每週劑量0.1μg/kg體重和400μg/kg體重之間。或者,ALT-803以固定劑量或基於體表面積(即每m2)投予。
在一些情況下,個體接受兩個6週的周期,每周期由4週的每週ALT-803靜脈內劑量,接著為2週的休息期組成。最終,由主治醫師或獸醫決定合適的量和劑量方案。
本文中該的組成物於全身,靜脈內,皮下,肌內,腹膜內,膀胱內或經由滴注投予。抗體和ALT-803可以同時或先後投予。
較佳地,本發明的抗體(Ab)特異性結合於CD38蛋白上的一個或複數個表位(環狀ADP核糖水解酶)。較佳的抗體由重鏈和輕鏈免疫球蛋白(Ig)蛋白 組成,其可以包括囓齒動物,人,嵌合形式和人源化形式。此外,本文描述的方法可以利用類抗體分子,例如包含抗原結合域(例如,單鏈抗體,Fab,Fv,T細胞受體結合域,配體結合域或受體結合域)的分子。在一些情況下,較佳地這些結構域與Fc結構域連結。Ig可以是任何已知的同型(例如,IgA,IgD,IgE,IgG,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgG2a,IgG2b和IgM)。在本文描述的使用抗CD38抗體(或類抗體分子)的一些應用中,Ab(或類抗體分子)含有能夠與Fc受體相互作用以介導抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)的重鏈及/或Fc結構域。在其他情況下,可以使用與效應分子接合的抗體。在其他應用中,較佳的Ab(或類抗體分子)含有不能有效介導ADCC或ADCP的重鏈或Fc結構域(例如IgG4Fc)。抗CD38抗體包括但不限於達雷木單抗(daratumumab,DARZALEX®),伊沙妥昔單抗(isatuximab,SARA650984),MOR202,Ab79,AB19和MT-4019。
於一態樣,在體外或體內的抗CD38抗體治療添加ALT-803增加了免疫細胞對病變或疾病相關細胞的細胞毒性。在一些情況下,ALT-803能夠刺激免疫細胞以增強由CD38特異性抗體(或類抗體分子)所介導的對腫瘤或自體免疫疾病相關細胞的ADCC或ADCP活性。在一具體實施例中,以ALT-803處理免疫細胞提高 了由抗CD38抗體所介導的對病變或疾病相關細胞的ADCC或ADCP活性至少5%,例如至少10%,至少15%,至少20%,至少25%,至少30%,至少35%,至少40%,至少45%,至少50%,至少55%,至少60%%,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%或至少100%。在一較佳具體實施例中,免疫細胞以ALT-803處理並用以經由抗-CD38抗體介導的ADCC或ADCP殺傷腫瘤細胞,其中腫瘤細胞死亡數較未以ALT-803處理的免疫細胞高至少5%,例如至少10%,至少15%,至少20%,至少25%,至少30%,至少35%,至少40%,至少45%,至少50%,至少55%,至少60%%,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%或至少100%。較佳的具體實施例中,在投予ALT-803和抗體之後個體中腫瘤特異性ADCC或ADCP增加至少5%,例如至少10%,至少15%,至少20%,至少25%,至少30%,至少35%,至少40%,至少45%,至少50%,至少55%,至少60%,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%或至少100%。在特定的具體實施例中,以NK細胞為基礎的ADCC活性為ALT-803處理所增強。
在其他情況下,ALT-803刺激CD4+和CD8+ T細胞,以殺傷病變或疾病相關細胞,例如腫瘤細 胞或受感染細胞。較佳地,ALT-803治療刺激免疫細胞的細胞溶解活性,抗CD38抗體靶向疾病細胞,使得這些治療組合提供了針對腫瘤或自體免疫相關免疫細胞的高度有效和/或持久的活性。在一些具體實施例中,ALT-803增加血清中干擾素γ(IFN-γ)和/或IL-6的數量,刺激NK和T細胞增殖,並調高NK和T細胞包括CD25,CD69,穿孔素和顆粒酶等活化標誌物的表現量。這些標誌物的誘導可增強免疫細胞對病變細胞的反應性或細胞溶解活性。例如,本文所述方法刺激NK細胞以殺傷腫瘤或自體免疫相關的免疫細胞。
在其他具體實施例中,ALT-803直接或間接誘導其他先天性免疫細胞,包括嗜中性白血球或單核球細胞的活性和/或數量。已知該等細胞介導對病變細胞例如腫瘤細胞的治療性抗體的ADCC和ADCP(Golay等,Blood.2013122:3482-91,Richards等,Mol Cancer Ther 2008 7:2517-27)。較佳地,ALT-803和抗CD38抗體的組合療法至少部分經由先天性免疫細胞介導的機制,提供患有癌症或自體免疫性/炎性疾病的患者改善的臨床反應。例如,本文所述方法刺激嗜中性白血球或單核球細胞以殺傷腫瘤或自體免疫/炎症相關的免疫細胞。在一具體實施例中,ALT-803能夠刺激NK細胞產生細胞介素或其他能活化巨噬細胞反應(包括ADCP)的因子,藉此提供由抗CD38 Ab所介導的更有效的腫瘤細胞殺傷。
較佳地,相較於投予本文該組成物之前的腫瘤或自體免疫/炎性相關免疫細胞的數量,本文所述方法造成腫瘤或自身免疫/炎性相關免疫細胞的數量降低/減少。或者,本文所述方法導致腫瘤或自體免疫/炎性疾病的疾病進展減少。較佳地,相較於未治療的受試者,本文所述方法使受試者的存活延長。
本發明還提供了用於治療腫瘤的套組,該套組包含有效量的ALT-803,抗體以及使用該套組治療腫瘤的使用說明。
用於治療自體免疫性或炎症性疾病的套組包括有效量的ALT-803,抗體,以及該套組用於治療自體免疫或炎症疾病的使用說明。
本發明的可溶性融合蛋白複合物的某些態樣,該IL-15多肽是具有與天然IL-15多肽不同的胺基酸序列的IL-15變體。本文中,該人類IL-15多肽稱為huIL-15,hIL-15,huIL15,hIL15,IL-15野生型(wt),其變體以天然胺基酸在成熟序列中的位置及變異胺基酸表示。例如,huIL15N72D是指在位置72中包含N取代為D的人類IL-15。於一態樣,IL-15變體作用為IL-15促效劑,如與天然IL-15多肽相比,其具有所示增加的IL-15RβγC受體的結合活性。或者,IL-15變體作用為IL-15拮抗劑,如與天然IL-15多肽相比,其具有降低的IL-15RβγC受體的結合活性所示。
殺傷目標細胞的方法係將抗體和 ALT-803與複數個細胞接觸來進行,其中該複數個細胞進一步包含帶有被IL-15結構域識別的IL-15R鏈的免疫細胞,或帶有被Fc結構域識別的Fc受體鏈的免疫細胞,以及帶有被抗CD38抗體識別的CD38抗原的目標細胞。例如,該目標細胞是與自體免疫或炎性疾病相關的腫瘤細胞或免疫細胞。
殺傷表現CD38抗原的病變細胞的方法係經由以有效量的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合物(ALT-803)處理免疫細胞,將ALT-803處理的免疫細胞與抗CD38抗體和表現CD38抗原的病變細胞混合,並經由ALT-803處理的免疫細胞和CD38特異性抗體介導的ADCC或ADCP殺傷病變細胞。於該方法的一態樣,經ALT-803處理的免疫細胞(即NK細胞)能夠經由抗CD38抗體活化巨噬細胞,以介導針對腫瘤細胞的ADCP。於一態樣,相較於未經ALT-803處理的免疫細胞,經處理的免疫細胞所介導的病變細胞殺傷量增加至少5%,例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。
本發明另提供患者預防或治療疾病的方法,其中該病變細胞表現CD38抗原,該方法包括以下步驟:使抗CD38抗體和ALT-803與複數個細胞接觸,並且破 壞或殺傷該病變細胞足以預防或治療患者的疾病。在較佳的具體實施例中,用ALT-803和抗CD38抗體的組合療法可以減少疾病進展及/或延長患者存活。
本發明提供了經由投予哺乳動物有效量的抗CD38抗體和有效量的ALT-803來刺激該哺乳動物免疫反應的方法。
具體而言,治療個體中的腫瘤或自體免疫或炎性疾病的方法係經由投予個體有效量的抗CD38抗體(或類抗體分子)和有效量的醫藥組成物進行,該醫藥組成物包含IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合物(ALT-803),其中ALT-803包含IL-15RαSu/Fc二聚體和兩個IL-15N72D分子,進而治療腫瘤或自體免疫或炎性疾病。於某些情況中,該方法還包括於投予該抗體或該ALT-803之前,期間或之後以類固醇治療,其中該類固醇選自皮質類固醇,退熱劑和抗組織胺。於一態樣,IL-15N72D分子包含SEQ ID NO:3。於另一態樣,IL-15RαSu/Fc包含SEQ ID NO:6。例如,腫瘤係選自由以下各者所組成的群組:血液癌症,B細胞瘤,多發性骨髓瘤(MM),慢性淋巴細胞白血病(CLL),B和T急性淋巴細胞白血病,急性骨髓性白血病,慢性骨髓性白血病,毛細胞白血病,華氏巨球蛋白血症,原發性系統性澱粉沈積症,被套細胞淋巴癌,NK細胞白血病,NK或T細胞淋巴瘤,漿細胞白血病,B細胞淋巴瘤,非何杰金氏淋巴瘤,柏基特氏淋巴瘤,何杰金氏淋巴瘤及實質固 態瘤。
較佳地,ALT-803的有效量為每日投予或每週投予一次或兩次。該ALT-803的有效量依需要在0.1μg/kg和100mg/kg之間。例如,該醫藥組成物係經全身、靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、膀胱內或經由滴注投予。例示性的抗CD38抗體包括達雷木單抗(DARZALEX®),伊沙妥昔單抗(SARA50984)和MOR202。
於投予後,於個體中經該抗體介導的對腫瘤或自體免疫/炎症相關免疫細胞的抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)增加至少5%,例如至少5%,至少10%,至少15%,至少20%,至少25%,至少30%,至少35%,至少40%,至少50%,至少60%至少70%,至少80%,至少90%或至少100%。
較佳地,抗體和ALT-803增加血液中NK細胞,T細胞,嗜中性白血球,巨噬細胞,樹突細胞或單核白血球的數量或活性。在某些情況下,抗體和ALT-803刺激CD4+或CD8+ T細胞,進而殺傷腫瘤或自體免疫/炎症相關的免疫細胞。在另一情況下,抗體和ALT 803刺激NK細胞,以殺傷腫瘤或自身免疫/炎症相關的免疫細胞。抗體和ALT-803刺激嗜中性白血球或單核球細胞,以殺傷腫瘤或自體免疫/炎症相關的免疫細胞。投予抗體和ALT-803造成腫瘤或自體免疫/炎症相關免疫細胞數 量的減少。或者或另外,投予抗體和ALT-803導致腫瘤或自身免疫性或炎性疾病的疾病進展減少。相較於未治療的個體,投予抗體和ALT-803使個體存活延長。較佳地,該個體是人。
於一態樣,抗體和ALT-803同時投予。另一態樣,抗體和ALT-803先後投予。較佳地,該投予預防未來腫瘤或自體免疫性或炎性疾病的復發。
另提供用於治療腫瘤的套組,該套組包含有效量的ALT-803,抗CD38抗體以及該套組用於治療腫瘤的使用說明。相同地,提供用於治療自體免疫或炎性疾病的套組,該套組包含有效量的ALT-803,抗CD38抗體以及該套組用於治療自體免疫或炎性疾病的使用說明。
殺傷表現CD38抗原的病變細胞或疾病相關細胞的方法係經由以有效量的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合物(ALT-803)處理免疫細胞,將經ALT-803處理的免疫細胞與抗CD38抗體和表現CD38抗原的病變細胞或疾病相關細胞混合,並殺傷病變細胞或疾病相關細胞。例如,相較於未經ALT-803處理的免疫細胞,經處理的免疫細胞所介導的病變細胞殺傷量增加至少5%,例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。經ALT-803處理 的免疫細胞直接殺傷病變細胞或疾病相關細胞。於一態樣,經ALT-803處理的免疫細胞刺激其他免疫細胞,進而殺傷病變細胞或疾病相關細胞。例如,經ALT-803處理的免疫細胞和抗CD38抗體經由ADCC或ADCP介導殺傷病變細胞或疾病相關細胞。例示性疾病相關細胞包括腫瘤細胞。在某些情況下,疾病相關細胞與自體免疫或炎性疾病有關。
除非另外定義,否則本文中所使用的所有技術和科學術語具有發明所屬技術領域的技術人員通常理解的含義。以下參考文獻為技術人員提供了本發明中使用的許多術語的一般定義:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);and Hale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另有說明,本文中所使用的下列術語具有以下所述含義。
術語「藥劑」是指肽,核酸分子或小分子化合物。例示性的治療藥劑是ALT-803。
術語「ALT-803」是指包含與IL-15RαSu/Fc二聚體融合蛋白非共價結合且具有免疫刺激活性的IL-15N72D的複合物。在一具體實施例中, IL-15N72D及/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白相對於參考序列包含1,2,3,4或更多個胺基酸變異。以下提供例示性IL-15N72D胺基酸序列。
術語「改善」是指降低,抑制,減弱,減少,阻止或穩定疾病的發展或進展。
術語「類似物」是指不相同,但具有類似功能或結構特徵的分子。例如,多肽類似物保留相對應的天然存在的多肽的生物活性,同時具有增強類似物相對於天然存在的多肽的功能的生物化學性修飾。該生物化學修飾可以提高類似物的蛋白酶抗性,膜滲透性或半衰期,而不會改變例如配體的結合。類似物可以包含非天然胺基酸。
本發明包括抗體或此等抗體的片段,只要它們表現出期望的生物活性即可。本發明還包括嵌合抗體,如人源化抗體。通常,人源化抗體具有從非人源引入的一個或複數個胺基酸殘基。人源化可以使用發明所屬技術領域中描述的方法進行,例如經由使用至少一部分囓齒動物互補決定區取代相對應的人類抗體區。
如本文中所述,術語「抗體」(Ab)包括單株抗體,多株抗體,多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段,只要它們表現出期望的生物活性即可。術語「免疫球蛋白」(Ig)與本文中的「抗體」可互換使用。
術語「類抗體」分子是指與抗體相比具有相似結構和/或相似功能的分子。例示性類抗體分子包括 包含抗原結合域(例如,單鏈抗體,Fab,Fv,T細胞受體結合域,配體結合域或受體結合域)的分子。
術語「經單離的抗體」是從其天然環境的組分中分離及/或回收的。其天然環境的污染成分是會干擾抗體診斷或治療用途的物質,可能包括酶,激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳的具體實施例中,抗體的純化係達到:(1)通過Lowry方法測定的大於95%重量的抗體,最佳為大於99%重量;(2)使用旋杯式序列分析儀足以獲得至少N端或內部胺基酸序列15個殘基的程度;或(3)在還原或非還原條件下使用考馬斯藍,或較佳地銀染色經SDS-PAGE的均一性。經單離的抗體包括重組細胞內的原位抗體,因為抗體天然環境的至少一種組分不會存在。然而,經單離的抗體通常經由至少一個純化步驟製備。
基本的四鏈抗體單位是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的異四聚體醣蛋白。IgM抗體由5個基本的異四聚體單元和稱為J鏈的一個額外多肽組成,因此含有10個抗原結合位點,而分泌的IgA抗體可以聚合形成包含2至5個基本4鏈單元與J鏈的多價集合體。至於IgG,該4鏈單元通常約為150,000道耳頓。每條L鏈由一個共價二硫鍵與H鏈連結,而兩條H鏈根據H鏈型別由一個或多個二硫鍵相互連結。每個H和L鏈也具有規則間隔的鏈間二硫鍵。每條H鏈在N端有一個可變結構域(VH),其後在α和γ鏈有三個恆定結 構域(CH),而在同型μ和ε中有四個CH結構域。每條L鏈在N端具有可變結構域(VL),在其另一端具有恆定結構域(CL)。VL與VH對齊,且CL與重鏈的第一恆定域(CH1)對齊。據信特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結構域之間形成界面。VH和VL的配對一起形成單個抗原結合位點。對於不同類別的抗體的結構和特性,參見例如:Basic and Clinical Immunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994,page 71,and Chapter 6.
根據其恆定區(CL)的胺基酸序列,來自任何脊椎物種的L鏈可以被分配為兩種明顯不同的類型中的一種,稱為kappa(κ)和lambda(λ)。根據其重鏈恆定結構域(CH)的胺基酸序列,可將免疫球蛋白歸為不同的類別或同型別。計有五類免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,其重鏈分別命名為alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。基於CH序列和功能的相對小的差異,γ和α類別進一步分為亞類,例如,人類表現以下亞類:IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。
術語「可變」係指V結構域的某些區段在抗體間的序列中廣泛不同的事實。V結構域介導抗原結合並定義特定抗體對其特定抗原的特異性。然而,該可變性在橫跨可變結構域的110個胺基酸中分佈並不均勻,反而 該V區的組成為相對不變的15至30個胺基酸的構架區(FR),被稱為「高變區」的每個長9至12個胺基酸的較短的極度變異區域所分隔。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR,大部分採用β折疊構型,由三個高變區連結,這三個高變區形成環,連結β折疊結構,並且在一些情況下形成β折疊結構的一部分。每條鏈中的高變區經由FR緊密連結在一起,並與來自另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定結構域不直接參與抗體與抗原間的結合,但表現出各種作用功能,例如參與抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)。
如於本文中使用,術語「高變區」是指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區通常包含來自「互補決定區」或「CDR」中的胺基酸殘基(例如,根據Kabat編號系統編號時(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991),大約為VL中的殘基24至34(L1),50至56(L2)和89至97(L3),以及大約為VH中的殘基31至35(H1),50至65(H2)和95至102(H3);及/或來自「高變環」的殘基(例如,根據Chothia編號系統編號時(Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987),VL中的殘基24至34(L1),50至56(L2)和89至97(L3),和VH中的殘基26至32(H1),52至56(H2)和95至101(H3));及/或彼等來自「高變環」/CDR的殘基(例如,根據IMGT編號系統編號時(Lefranc,M.P.et al.Nucl.Acids Res.27:209-212(1999),Ruiz,M.e al.Nucl.Acids Res.28:219-221(2000),VL中的殘基27至38(L1),56至65(L2)和105至120(L3),和VH中的殘基27至38(H1),56-65(H2)和105至120(H3)。視需要,抗體根據AHo編號系統編號時(Honneger,A.and Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001)),在一個或多個下述位點具有對稱插入:VL中的28,36(L1),63,74至75(L2)和123(L3)處,和VH中的28,36(H1),63,74至75(H2)和123(H3)。
如本文中所述,術語「單株抗體」係指從實質上同質的抗體群中獲得的抗體,即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突變之外,組成該群的各個抗體是相同的。單株抗體僅導向單個抗原位點,為高度特異性。此外,相對於包含導向不同決定位(表位)的不同抗體的多株抗體製劑,每個單株抗體導向抗原上的單一個決定位。除了它們的特異性之外,單株抗體的優點在於它們被合成時可以不被其他抗體污染。修飾語「單株」不應被解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。例如,用於本發明的單 株抗體可以經由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)首先描述的融合瘤方法來製備,或者可以使用重組DNA方法在細菌,真核動物或植物細胞中製備(參見,例如,美國專利號4,816,567)。「單株抗體」也可以使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技術,自噬菌體抗體庫單離。
單株抗體包括「嵌合」抗體以及這些抗體的片段,其中該抗體重鏈及/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的對應序列相同或同源的,而鏈(群)的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一種抗體類別或亞類的抗體中的對應序列相同或同源的,只要它們表現出期望的生物活性(參見美國專利號4,816,567;and Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。還提供了源自人類抗體的可變區抗原結合序列。因此,本文中主要感興趣的嵌合抗體包括具有一個或多個人抗原結合序列(例如CDR)並含有一個或多個衍生自非人類抗體的序列(例如FR或C區序列)的抗體。另外,本文中主要感興趣的嵌合抗體,包括彼等包含一種抗體類別或亞類的人可變結構域抗原結合序列,和另一種序列(例如來自另一種抗體類別或亞類的FR或C區序列)的抗體。本文中感興趣的嵌合抗體還包括含有與本文所述相關或衍生自不同物種(例如非人靈長類動物,如,舊大陸猴,猿等)的 可變結構域抗原結合序列的抗體。嵌合抗體還包括靈長類化和人源化抗體。
此外,嵌合抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。此些修改進一步改進抗體性能。更詳細的資訊參見Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
「人源化抗體」通常被認為是從非人源引入一個或多個胺基酸殘基的人類抗體。這些非人類胺基酸殘基通常被稱為「輸入」殘基,其通常取自「輸入」可變域。經由輸入高變區序列取代人類抗體的對應序列,人源化傳統上係遵循Winter與其同事的方法進行(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Reichmann et al.,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))。據此,這種「人源化」抗體係為嵌合抗體(美國專利號4,816,567),其中實質上少於一個完整的人可變結構域被來自非人物種的對應序列取代。
「人類抗體」是僅含有存在於人自然產生的抗體中的序列的抗體。然而,如本文中所述,人類抗體可包含天然存在的人類抗體中沒有的殘基或修飾,包括本文所述修飾和變體序列,以進一步改善或增強抗體性能。
「完整」抗體為包含抗原結合位點,以及 CL和至少重鏈恆定結構域CH 1,CH 2和CH 3的抗體。恆定結構域可以是天然序列恆定結構域(例如,人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變體。較佳地,完整抗體具有一種或多種作用功能。「抗體片段」包含完整抗體的一部分,較佳為完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab,Fab',F(ab')2和Fv片段;雙功能抗體;線性抗體(參見美國專利號5,641,870;Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995]);單鏈抗體分子;和由抗體片段形成的多重特異性抗體。
抗體的術語「功能性片段或類似物」是具有與全長抗體相同的生物活性性質的化合物。例如,抗IgE抗體的功能性片段或類似物是可結合至IgE免疫球蛋白的抗體,以防止或實質上降低此類分子與高親和力受體如FcεRI結合的能力。
抗體經木瓜蛋白酶分解產生兩個相同的抗原結合片段,稱為「Fab」片段,和殘餘的「Fc」片段,此命名反映其易於結晶的能力。Fab片段由連同H鏈的整個L鏈可變區結構域(VH)和一個重鏈(CH 1)的第一恆定結構域組成。每個Fab片段相對於抗原結合為單價,即其具有單個抗原結合位點。抗體經胃蛋白酶處理產生單個大F(ab')2片段,其大致對應於由二硫化物鏈接的兩個Fab片段,其具有二價抗原結合活性,且仍能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於CH1結構域的 羧基末端具有額外的少量殘基,包括來自抗體鉸鏈區的一個或複數個半胱胺酸。Fab'-SH是本文對Fab'的命名,其中恆定結構域的半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基。F(ab')2抗體片段最初產生的方式為成對的Fab'片段,其間以半胱胺酸作為鉸鏈連結。其他抗體片段的化學偶合皆為已知。
「Fc」片段包含以二硫化物結合在一起的兩條H鏈的羧基末端部分。抗體的作用功能由Fc區中的序列決定,該區也是某些類型細胞上的Fc受體(FcR)用以識別的部分。
「Fv」是含有完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段,該片段以緊密的非共價結合一個重鏈和一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。自該兩個結構域的折疊中延伸出六個高變環(H和L鏈各三個環),其貢獻用於抗原結合的胺基酸殘基,並賦予抗體結合抗原的特異性。然而,即使單個可變結構域(或半個Fv,其僅包含三個特異於抗原的CDR)仍具有識別和結合抗原的能力,儘管其親和力低於整個結合位點。
「單鏈Fv」也縮寫為「sFv」或「scFv」,是包含連結成單個多肽鏈的VH和VL抗體結構域的抗體片段。較佳地,sFv多肽還包含VH和VL結構域之間的多肽連結基,使sFv能夠形成抗原結合所需的結構。有關sFv的評論,參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Borrebaeck 1995,infra。
術語「雙功能抗體」是指在VH和VL結構域之間經由短連結基(約5至10個殘基)構建的sFv片段(參見前面的段落)而製備的小抗體片段,因而形成V結構域的鏈間配對而非鏈內配對,進而產生二價片段,即具有兩個抗原結合位點的片段。特異性雙功能抗體是兩個「交叉」sFv片段的異二聚體,其中兩種抗體的VH和VL結構域存在於不同的多肽鏈上。雙功能抗體更完整的描述參見例如EP 404,097;WO 93/11161;以及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所述,「內化」的抗體是在與哺乳動物細胞上的抗原(例如細胞表面的多肽或受體)結合後被細胞吸收(即進入)的抗體,內化抗體當然包括抗體片段,人類或嵌合抗體和抗體接合物;對於某些治療應用,預期有體內的內化。內化的抗體分子的數量將能夠或足以殺傷細胞或抑制其生長,特別是受感染的細胞。取決於抗體或抗體接合物的效力,在一些情況下,被細胞吸收的單個抗體分子足以殺傷抗體結合的目標細胞。例如,某些毒素在細胞殺傷中非常有效,因此一個與抗體共軛結合的毒素的分子的內化足以殺傷受感染的細胞。
如本文中所述,如果抗體與抗原的反應為可被檢測,較佳地具有親和力常數Ka大於或等於約 104M-1,或者大於或等於約105M-1,大於或等於約106M-1,大於或等於約107M-1,或者大於或等於108M-1,則該抗體與抗原則被認為是「免疫特異性的」,「特異性的」或「特異性地結合」。抗體對其同源抗原的親和力通常也以離解常數KD表示,並且在某些具體實施例中,如果HuM2e抗體與M2e結合的KD為小於或等於10-4M,小於或等於大約10-5M,小於或等於大約10-6M,小於或等於10-7M,或小於或等於10-8M,則為特異性結合。抗體的親和力可以使用常規技術輕易地決定,例如,經由彼等Scatchard等人所描述者(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949).
抗體與抗原,細胞或其組織的結合特性大致上可使用免疫檢測方法來決定和評估,例如以免疫螢光為基礎的分析,如免疫組織化學(IHC)及/或螢光活化細胞分選(FACS)。
具有指定抗體的「生物特徵」的抗體,是具有一種或多種可區別自其他抗體的生物特徵的抗體。例如,在某些具體實施例中,具有指定抗體的生物特徵的抗體,會與指定抗體結合的相同表位結合,及/或具有與指定抗體相同的作用功能。術語「拮抗劑」抗體以最廣義使用,包含的抗體經其特異性結合至表位、多肽或細胞,可部分或完全阻斷,抑製或中和其生物活性。用於辨識拮抗劑抗體的方法可包括以特異性結合候選拮抗劑抗體的多肽或細胞與候選拮抗劑抗體接觸,並測量通常與多肽或細 胞相關的一種或多種生物活性的可檢測變化。
抗體「作用功能」是指彼等歸因於抗體的Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)的生物活性,並且隨著同型抗體而變化。抗體作用功能的實例包括:C1q結合和補體依賴性細胞毒性作用;Fc受體結合;抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC);吞噬;細胞表面受體(例如B細胞受體)的下調;和B細胞活化。
「結合」至分子意指對該分子具有物理化學親和力。
「對照組」或「參考組」是指用以比較的標準。在一態樣,如本文中所述,樣本或個體「相較於對照組的改變」被理解為與來自正常,未處理或對照組的樣本具有統計上的不同。對照組樣本包括例如培養的細胞,一個或多個實驗室測試動物或一個或多個人類個體。選擇和測試對照組樣本的方法在發明所屬技術領域的技術人員的能力範圍內。分析物可以是由細胞或生物體特徵式表現或產生的天然存在的物質(例如抗體,蛋白質),或由報導子構建體(reporter construct)(例如β-半乳糖苷酶或螢光素酶)產生的物質。取決於檢測的方法,改變的量和測量可能會有所不同,統計顯著性的決定在發明所屬技術領域的技術人員的能力範圍內,例如構成陽性結果的平均值的標準偏差的數目。
「檢測」係指識別待檢測分析物的存在,不存在或量。
「疾病」是指損害或干擾細胞、組織或器官正常功能的任何狀況或病症。疾病的例子包括腫瘤和自體免疫和炎性疾病。
製劑或製劑組分的術語「有效量」和「治療有效量」是指以單獨或組合形式提供期望的效果的製劑或組分的足夠量。例如,「有效量」是指相對於未治療患者,以單獨或組合型式改善疾病症狀所需的化合物的量。本發明用於治療疾病的活性化合物的有效量取決於投予方式,個體的年齡,體重和一般健康狀況而不同。最終,主治醫師或獸醫將決定適當的劑量和劑量方案,該劑量被稱為「有效」量。
「片段」是指多肽或核酸分子的一部分。該部分較佳地含有參考核酸分子或多肽整個長度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。例如,一個片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個核苷酸或胺基酸。然而,本發明亦包含多肽和核酸片段,只要它們分別呈現需要的全長多肽和核酸的生物活性即可。可使用幾乎任何長度的核酸片段,例如,長度為約10,000,約5000,約3000,約2,000,約1,000,約500,約200,約100,約50個鹼基對(包括所有中間長度)的示範性多核苷酸片段包括在本發明許多的具體實施例中。同樣地,可使用幾乎任何長度的多肽片段,例如,長度為約10,000、約 5000、約3000、約2,000、約1,000、約5,000、約1,000、約500、約200個、約100、約50個胺基酸(包括所有中間長度)的示範性多肽片段包括在本發明許多的具體實施例中。
術語「單離的」,「純化的」或「生物學上純的」指的是自通常伴隨其於天然狀態的組分以不同程度分離的物質。「單離」表示與原始來源或周圍環境的分離程度,「純化的」表示的分離程度高於單離的。
「純化的」或「生物學上純的」蛋白質為充分地不含其他材料,因此任何雜質不會實質上影響蛋白質的生物特性或引起其他不良後果。意即,本發明的核酸或肽經由DNA重組技術、或化學合成時由化學前體或其他化學物質產生時,如果實質上不含細胞物質,病毒物質或培養基,則該核酸或肽為純化的。純度和同質性通常使用分析化學技術來確定,例如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析法。術語「純化的」可以表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中實質上產生一個條帶(band)。對於可以進行修飾(例如磷酸化或醣基化)的蛋白質,不同的修飾可以產生不同的分離的蛋白質,其可以分別純化。
相同地,「實質上純的」是指已經自其天然伴隨的組分分離的核苷酸或多肽。典型地,核苷酸和多肽為至少60重量%,70重量%,80重量%,90重量%,95重量%或甚至99重量%時實質上是純的,不含與其天然伴隨的蛋白質和天然存在的有機分子。
「單離的核酸」所指的核酸,為沒有該核酸取自的生物天然存在的基因組中的側接基因的核酸,該術語涵蓋,例如:(a)作為天然存在的基因組DNA分子的一部分DNA,但並未側接於其於天然存在生物體基因組中該分子部分兩側的核酸序列;(b)合併至載體或原核生物或真核生物的基因組DNA中的核酸,使得所得分子與任何天然存在的載體或基因組DNA不同;(c)單獨的分子,例如cDNA,基因組片段,通過聚合酶連鎖反應(PCR)產生的片段或限制性片段;和(d)作為雜合基因(hybrid gene)(即編碼融合蛋白的基因)的一部分的重組核苷酸序列。依據本發明的分離的核酸分子還包括合成產生的分子,以及任何經化學改變及/或具有修飾的骨架的核酸。例如,單離的核酸係為純化的cDNA或RNA多核苷酸,單離的核酸分子亦包括傳訊核糖核酸(mRNA)分子。
「單離的多肽」是指本發明的多肽已經自其天然伴隨的組分中分離。通常,當多肽為至少60重量%時,多肽是單離的,不含與其天然伴隨的蛋白質和天然存在的有機分子。較佳地,本發明多肽製備物為至少75重量%,更佳的為至少90重量%,最佳的為至少99重量%。本發明的單離的多肽可以經由例如天然來源中提取,經由表現編碼此多肽的重組核酸來獲得;或以化學合成方式獲得該蛋白質。可使用任何合適的方法測量純度,例如管柱層析法,聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析法。
「標誌物」是指任何具有與疾病或病症相關的表現量改變或活性改變的蛋白質或多核苷酸。
「腫瘤」是指以過度增殖或凋亡減少為特徵的疾病或病症。本發明可適用的例示性腫瘤包括但不限於白血病(例如急性白血病,急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性骨髓母細胞性白血病、急性前髓細胞白血病、急性骨髓單核球白血病、急性單核球白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、真性红血球增多症、淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏病)、華氏巨球蛋白血症、重鏈蛋白質病、及和實質固態瘤如肉瘤和癌(例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、軟骨樣脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃和食管癌、頭頸癌、直腸癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣上皮癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突膠質細胞瘤、神經鞘瘤、腦脊髓膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤)。於特定具體實施例中, 腫瘤為多發性骨髓瘤、β-細胞淋巴瘤、泌尿上皮/膀胱癌或黑色素瘤。如本文中所述,如「獲得藥劑」中的「獲得」包括合成,購買或以其他方式獲取該藥劑。
「降低」是指至少5%、10%、25%、50%、75%或100%的負變化。
「參考序列」係作為序列比較基礎的限定序列。參考序列可以是指定序列的子集或全部;例如,全長cDNA或基因序列的片段,或完整的cDNA或基因序列。對於多肽而言,參考多肽序列的長度通常為至少約16個胺基酸,較佳至少約20個胺基酸,更佳至少約25個胺基酸,甚至更佳約35個胺基酸,約50個胺基酸,或約100個胺基酸。對於核酸而言,參考核酸序列的長度一般為至少約50個核苷酸,較佳至少約60個核苷酸,更佳至少約75個核苷酸,甚至更佳約100個核苷酸或約300個核苷酸或其上下,或其間任何整數。
「特異性結合」是指識別並結合本發明多肽的化合物或抗體,但實質上不識別並結合樣本中其他分子,例如天然含有本發明多肽的生物樣本。
可用於本發明方法中的核酸分子包括編碼本發明多肽或其片段的任何核酸分子。此類核酸分子不需要與內源的核酸序列100%相同,但通常會表現出實質上的一致性。與內源序列具有「實質一致性」的多核苷酸通常能夠與雙鏈核酸分子的至少一條鏈雜交。可用於本發明方法中的核酸分子包括編碼本發明多肽或其片段的任何 核酸分子。此類核酸分子不需要與內源的核酸序列100%相同,但通常會表現出實質上的一致性。與內源序列具有「實質一致性」的多核苷酸通常能夠與雙鏈核酸分子的至少一條鏈雜交。「雜交」意指在各種嚴謹性的條件下與互補的多核苷酸序列(例如,本文所述基因)或其部分配對,形成雙鏈分子。(參見例如Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399;Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
例如,嚴謹的鹽濃度通常小於約750mM NaCl和75mM檸檬酸三鈉,較佳地小於約500mM NaCl和50mM檸檬酸三鈉,並且更佳地小於約250mM NaCl和25mM檸檬酸三鈉。可以在沒有例如甲醯胺的有機溶劑情況下獲得低嚴謹性雜交,而高嚴謹性雜交可以在至少約35%甲醯胺,更佳地至少約50%甲醯胺的存在下獲得。嚴謹的溫度條件通常包括至少約30℃,更佳的至少約37℃,最佳至少約42℃的溫度。其他參數的改變,例如雜交時間,清潔劑(例如十二基硫酸鈉(SDS))的濃度,以及載體DNA的包含或排除,是發明所屬技術領域的技術人員熟知的。可根據需要組合各種不同的條件來實現各種嚴謹性。在較佳的具體實施例中,雜交發生於30℃,750mM NaCl,75mM檸檬酸三鈉和1%SDS。在更佳的實施方案中,雜交發生於37℃,500mM NaCl,50mM檸檬酸三鈉,1%SDS,35%甲醯胺和100μg/ml變性鮭魚精子DNA(ssDNA)。在最佳的具體實施例中,雜交 發生於42℃,250mM NaCl,25mM檸檬酸三鈉,1%SDS,50%甲醯胺和200μg/ml ssDNA。這些條件有用的變化對於發明所屬技術領域的技術人員而言為顯而易見的。
對於大多數應用,雜交後的洗滌步驟在嚴謹性上也會有所不同。洗滌條件的嚴謹性可以經由鹽濃度和溫度來定義。如上所述,可通過降低鹽濃度或通過增加溫度來增加洗滌嚴謹性。例如,洗滌步驟嚴謹的鹽濃度較佳小於約30mM NaCl和3mM檸檬酸三鈉,並且最佳小於約15mM NaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴謹的溫度條件通常包括至少約25℃,更佳至少約42℃,甚至更佳至少約68℃的溫度。在較佳的具體實施例中,洗滌步驟於25℃,30mM NaCl,3mM檸檬酸三鈉和0.1%SDS中進行。在更佳的具體實施例中,洗滌步驟於42℃,15mM NaCl,1.5mM檸檬酸三鈉和0.1%SDS中進行。在更佳的具體實施例中,洗滌步驟於68℃,15mM NaCl,1.5mM檸檬酸三鈉和0.1%SDS中進行。這些條件的其他改變對於發明所屬技術領域的技術人員來說是顯而易見的。雜交技術對於發明所屬技術領域的技術人員來說是熟知的,並且於以下說明,例如:Benton and Davis(Science 196:180,1977);Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975);Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001);Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York);and Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York。
「實質上相同」是指與參考胺基酸序列(例如,本文中所描述的任何一種胺基酸序列)或核酸序列(例如,本文中該的任何一種核酸序列)具有至少50%一致性的多肽或核酸分子。較佳地,該序列與用於比較的序列相比,其胺基酸或核酸具有至少60%,更佳的80%或85%,且更佳的90%,95%或甚至99%一致性。
通常使用序列分析軟體測量序列一致性(例如,Genetics Computer Group的Sequence Analysis Software Package,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705,BLAST,BESTFIT,GAP,或PILEUP/PRETTYBOX等軟體)。此類軟體經由指定取代,刪除及/或其他修飾等的同源性程度以配對相同或相似的序列。保留性取代通常包括於下述組合內的取代:甘胺酸、丙胺酸;纈胺酸、異白胺酸、白胺酸;天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸;絲胺酸、蘇胺酸;離胺酸、精胺酸;和苯丙胺酸、酪胺酸。在決定一致性程度的例示性方法中,可以使用BLAST軟體,其中e-3與e-100之間的機率評分表示密切相關的序 列。
「個體」是指哺乳動物,包括但不限於人類或非人類哺乳動物,例如牛,馬,犬,綿羊或貓科動物,該個體較佳為需要此治療的哺乳動物,例如已被診斷患有B細胞淋巴瘤或其傾向性的個體。該哺乳動物為任何哺乳動物,例如人類,靈長類動物,小鼠,大鼠,狗,貓,馬,以及供食用的牲畜或動物,例如牛,綿羊,豬,雞,和山羊。在較佳的具體實施例中,該哺乳動物為人類。
於本文中提供的範圍被理解為範圍內的所有值的簡寫,例如,1至50的範圍應理解為包括1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50。
如本文中所用的術語「治療(treating)」和「治療(treatment)」是指將藥劑或製劑投予患有不良症狀、病症或疾病等具臨床症狀的個體,因而降低其症狀嚴重性及/或頻率,消除症狀及/或其根本原因,及/或促進改善或損害的補救。應該理解,雖然不排除,但治療疾病或病症並不需要與其相關的疾病,病症或症狀完全消除。
腫瘤患者的治療可以包括以下任何一種:輔助療法(adjuvant therapy)(也稱為附屬治療 (adjunct therapy)或附屬性治療(adjunct therapy)),在初始治療(例如手術)移除已知的腫瘤後,用以消除可能存在的殘餘腫瘤細胞,防止可能的癌症復發;在手術前投予先導性輔助治療以縮小癌症;誘導性治療促使緩解,通常用於急性白血病;鞏固性治療(也稱為強化治療)在一旦獲得緩解後投予,以維持緩解;維持性療法投予較低或較低頻率的劑量以協助延長緩解;一線治療(也稱為標準治療);如果疾病在一線治療後沒有反應或再發生,則投予第二(或第三、第四等)線治療(也稱為救援性療法);和緩和性療法(也稱為支持療法)在不期望顯著減少癌症的情況下針對症狀進行處置。
術語「預防(preventing)」和「預防(prevention)」是指對臨床上無症狀的個體施用藥劑或組成物,該個體對特定的不良症狀,病症或疾病為易感的或具該傾向,因此涉及預防症狀及/或其根本原因的發生。
除非特別說明或從上下文中可明顯看出,否則如本文中所述的術語「或」應理解為包含性的。除非特別聲明或從上下文可明顯看出,否則如本文中所描述的術語「一(a)」、「一(an)」和「該」被理解為單數或複數。
除非特別說明或從上下文中可明顯看出,如本文中所描述的術語「約」應理解為在發明所屬技術領域的正常容忍範圍內,例如在平均值的2個標準差內。「約」 可以理解為所述數值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%。除非上下文另有明確說明,否則本文中所述所有數值均由術語「約」修飾。
本文中在定義任何變數時所列出之化學基團列表,該變數的定義包括任何單個基團或所列基團組合。本文中針對變數或態樣的具體實施例的敘述,包括任何作為單個的具體實施例,或與任何其它具體實施例或其部分的組合。
本文中所提供的任何組成物或方法可以與本文中所提供的任何一種或多種其他組成物和方法的組合。
與「包括」,「含有」或「其特徵為」同義的連結詞術語「包含」是包含性的或開放性的,且不排除另外、未列舉的元素或方法步驟。相反地,連結詞術語「由...組成」排除任何未於請求項中界定的要素,步驟或成分。連結詞術語「基本上由...組成」將請求項的範圍限定為指定的材料或步驟,「以及彼等不會實質上影響要求保護的發明的基本和新穎特徵者」。
本發明的其它特徵和優點將於以下對其較佳具體實施例的描述以及從請求項中顯示。除非另外定義,否則本文使用的所有技術和科學術語與發明所屬技術領域的一般技術人員通常理解的具有相同的含義。儘管在本發明的實施或測試中可以使用與本文描述的方法和材料 類似或相等的方法和材料,以下描述合適的方法和材料。本文引用的所有公開的國外專利和專利申請經引用併入本文。本文引用的登錄號所代表的Genbank和NCBI提交經由引用納入本文。本文引用的所有其他公開參考文獻,文獻,手稿和科學文獻均經引用併入本文。在衝突的情況下,本說明書(包括定義)將具控制。此外,材料,方法和實例僅為說明性質,而非限制性的。
第1圖為顯示ALT-803對於人類周邊血單核細胞(PBMC)的抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)引導的抗CD38抗體針對血液腫瘤細胞的作用的柱狀圖。人類PBMC係用作作用細胞(effector cell),而經CellTrace Violet標記的Daudi細胞係作為沒有刺激(未處理),ALT-803(10nM),抗CD38 Ab(10nM)或ALT-803(10nM)加抗CD38 Ab(10nM)的目標(E:T比例為5:1)。兩天後,以流式細胞術測定Daudi細胞死亡數(以碘化丙啶染色陽性者)。每個柱表示來自4個獨立捐贈者的PMBC的平均值±SEM。
第2A圖為顯示ALT-803對於人類PBMC的ADCC引導的抗CD38抗體針對血液腫瘤細胞的濃度依賴效應的柱狀圖。將新鮮分離的PBMC與不同濃度的ALT-803在有或沒有10nM抗CD38抗體的條件下進行培養。兩天後,以第1圖所述方法測定針對Daudi目標腫瘤細胞的ADCC活性。每個柱表示來自4個獨立 捐贈者的PMBC的平均值±SEM。第2B圖顯示使用第2A圖所述方法時,顯示有或沒有10nM ALT-803的抗CD38抗體對於人類PBMC的ADCC經引導針對Daudi細胞的濃度依賴效應的線圖。顯示為來自2個不同捐贈者的結果。第2C圖為顯示ALT-803對於人類自然殺手細胞(NK cell)的ADCC引導的抗CD38抗體針對血液腫瘤細胞的濃度依賴效應的柱狀圖。將新鮮分離的NK細胞(>90% CD56+CD3-)與不同濃度的ALT-803在有或沒有10nM抗CD38抗體的條件下進行培養。兩天後,以第1圖所述方法測定針對Daudi目標腫瘤細胞(E:T ratio 2:1)的ADCC活性。每個柱表示來自4個獨立捐贈者的NK細胞的平均值±SEM。
第3圖為顯示ALT-803加抗CD38抗體處理在帶有Daudi細胞腫瘤的小鼠的骨髓中,減少其腫瘤負荷的功效的柱狀圖。在第0天,將嚴重合併性免疫缺失(SCID)小鼠注射(i.v.)1×107個Daudi細胞。腫瘤小鼠(每組6隻小鼠)注射(i.v.)PBS(載體,i.v.),抗CD38抗體(10mg/kg,i.v.),ALT-803(0.2mg/kg,皮下)或抗CD38抗體(10mg/kg)加上ALT803(0.2mg/kg,皮下)。在腫瘤細胞接種後第5天投予抗CD38抗體(Dara),在腫瘤細胞接種後第17天投予ALT-803。如指示,某些小鼠在第15天也施以類固醇(每劑0.2μg氫化皮質酮,i.p.)。以流式細胞儀對注射後第22天的骨髓(BM)中的Daudi細胞(人類HLA-DR+) 的百分比進行定量。*,P<0.05;**** P<0.0001.
第4圖為顯示ALT-803及抗CD38抗體的組合能夠延長帶有Daudi細胞腫瘤的存活的線圖。SCID小鼠在第0天注射(i.v.)1×107個Daudi細胞。腫瘤小鼠(每組6隻小鼠)以磷酸鹽緩衝液(PBS)(載體,i.v.),抗CD38抗體(10mg/kg,i.v.),ALT-803(0.2mg/kg,皮下)或抗CD38抗體(10mg/kg)加上ALT803(0.2mg/kg,皮下)處理(i.v.)。除了PBS組別的小鼠,所有的小鼠組別接受類固醇(0.2mg/小鼠,腹膜內)以減少輸注前反應。在腫瘤細胞接種後第5天投予抗CD38抗體(DARA),在腫瘤細胞接種後第17天投予ALT-803。於第22天,各組別接受第二次的各種處理(磷酸鹽緩衝液(PBS)(載體,i.v.),抗CD38抗體(10mg/kg,i.v.),ALT-803(0.2mg/kg,皮下)或抗CD38抗體(10mg/kg)加上ALT803(0.2mg/kg,皮下))。小鼠於第22天未以類固醇處理。監控小鼠的存活,顯示為Kaplan-Meier分析法。**** P<0.0001.
第5圖顯示一系列之流式細胞儀的結果圖,其顯示ALT-803及抗CD38抗體的組合於體內對巨噬細胞介導細胞吞噬作用於Daudi腫瘤細胞的影響。以PKH67標記的人類THP-1巨噬細胞和CellTrace Violet標記的Daudi細胞(E:T比例為1:1)與PBS(US),10nM抗CD38抗體及/或10nM ALT-803在有或沒有NK-92細胞(aNK細胞)的情況下共同培養。 24小時後,以流式細胞儀測定被吞噬的Daudi腫瘤細胞的百分比(顯示為右上象限中的PKH67+ CellTrace Violet+ THP-1細胞)。
本發明至少部分係基於令人驚訝的發現,即抗CD38抗體組合ALT-803,一種介白素-15(IL-15)超級促效劑突變體和IL-15受體α/Fc二聚體融合蛋白之複合物可用於增強免疫反應對抗腫瘤形成(例如神經膠質母細胞瘤,前列腺癌,血液癌症,B細胞瘤,多發性骨髓瘤,B細胞淋巴瘤,何杰金氏淋巴瘤,急性骨髓性白血病,慢性淋巴細胞白血病,皮膚T細胞淋巴瘤,T細胞淋巴瘤,實質固態瘤,泌尿上皮/膀胱癌,黑素瘤,肺癌,腎細胞癌,乳癌,頭頸癌,結腸直腸癌和卵巢癌)或自體免疫和炎性疾病。
ALT-803包含IL-15突變體,其對IL-2Rβγ具有增加的結合能力和增強的生物活性(美國專利號8,507,222,以參照方式併入本文)。此IL-15超級促效劑突變體已描述於刊物中(J Immunol 2009 183:3598),且該超級促效劑已獲美國專利和商標局核發專利,且有數個專利申請正在申請中(例如,美國專利申請第12/151,980號和第13/238,925號)。此IL-15超級促效劑與可溶性IL-15α受體融合蛋白 (IL-15RαSu/Fc)的組合在體外和體內形成具有高度有效IL-15活性的蛋白質複合物(Han et al.,2011,Cytokine,56:804-810;Xu,et al.,2013 Cancer Res.73:3075-86,Wong,et al.,2013,OncoImmunology 2:e26442)。該IL-15超級促效劑複合物(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc)稱為ALT-803。藥物動力學分析指出該複合物在靜脈注射小鼠後具有25小時的半衰期。ALT-803在抵抗免疫健全小鼠中的侵襲性固態瘤和血液腫瘤模型中,表現出令人印象深刻的抗腫瘤活性,可以作為單一療法以每週兩次或每週一次的劑量方案投予,或抗體組合治療。ALT-803抗腫瘤反應也能持久,以ALT-803治療而治癒的腫瘤小鼠,對相同腫瘤細胞的再次攻擊(re-challenge)具高度抵抗力,代表ALT-803對再次引入的腫瘤細胞誘導有效的免疫記憶反應。
介白素-15(IL-15)是發展,增殖和活化NK作用細胞和CD8+記憶T細胞的重要細胞因子。IL-15結合至IL-15受體α(IL-15Rα),以反式呈遞給作用細胞上的IL-2/IL-15受體β-共同γ鏈(IL-15Rβγc)複合物。IL-15和IL-2共享與IL-15Rβγc的結合,並通過STAT3和STAT5途徑傳遞信號。然而,IL-2也支持CD4+ CD25+ FoxP3+調節T細胞(Treg)的維持並誘導經活化CD8+ T細胞的細胞死亡,這些影響可能會限制 IL-2對腫瘤的治療活性。IL-15不與IL-2共享這些免疫抑制活性,另外,IL-15是唯一已知為CD8+作用T細胞提供抗凋亡信號的細胞因子,IL-15以單獨形式或作為與IL-15Rα的複合物投予,在動物實驗模式中對已確立的實質固態瘤顯示出有效的抗腫瘤活性,因此已被視為最有希望能治癒癌症的免疫治療藥物之一。
為了促進以IL-15為基礎的癌症治療劑的臨床開發,已發現與IL-15相比具有增加的生物學活性的IL-15突變體(IL-15N72D)(Zhu et al.,J Immunol,183:3598-3607,2009)。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合複合物(ALT-803)的產生進一步改善了該IL-15超級促效劑(IL-15N72D)的藥物動力學和生物活性,使得該超級促效劑複合物於活體內的活性為天然細胞激素的至少25倍(Han et al.,Cytokine,56:804-810,2011)。
如上所述,IL-15:IL-15Rα融合蛋白複合物可以指具有與天然IL-15Rα的可溶性IL-15Rα結構域非共價結合的IL-15的複合物,在一些情況下,可溶性IL-15Rα共價連結至生物活性多肽與/或IgG Fc結構域。該IL-15可以是IL-15或與第二生物活性多肽共價連結的IL-15。IL15:IL15Rα蛋白質複合物的結晶結構示於Chirifu et al.,2007 Nat Immunol 8,1001-1007中,以參 照方式併入本文。
於本文所描述的此發明上述態樣或任何其它態樣的各種具體實施例中,IL-15Rα融合蛋白包含可溶性IL-15Rα,例如與生物活性多肽共價連結的IL-15Rα(例如:IgG的重鏈恆定結構域,IgG的重鏈恆定結構域的Fc結構域,或細胞激素)。在本發明上述態樣的其他具體實施例中,IL-15包含IL-15,例如與第二生物活性多肽(例如細胞因子)共價連結的IL-15。在其他具體實施例中,從宿主細胞或培養基純化IL-15:IL-15Rα融合蛋白複合物涉及在特異性結合IL-15:IL-15Rα的親和試劑上捕獲IL-15:IL-15Rα融合蛋白複合物。在其他具體實施例中,IL-15Rα融合蛋白含有IL-15Rα/Fc融合蛋白,並且特異性結合Fc結構域的親和試劑。在其他具體實施例中,該親和試劑為蛋白A或蛋白G。在其他具體實施例中,該親和試劑為抗體。在其他具體實施例中,從宿主細胞或培養基純化IL-15:IL-15Rα融合蛋白複合物包含離子交換層析。在其他具體實施例中,從宿主細胞或培養基純化IL-15:IL-15Rα融合蛋白複合物包含粒徑篩析層析法。
在其他具體實施例中,IL-15Rα包含IL-15RαSushi(IL-15RαSu)。在其他具體實施例中,IL-15是IL-15變體(例如IL-15N72D)。在其他具體實施例中,IL-15:IL-15Rα融合蛋白複合物的IL-15結合位點被完全佔據。在其他具體實施例中,IL-15: IL-15RαSu/Fc融合蛋白複合物的IL-15結合位點都被完全佔據。在其他具體實施例中,基於融合蛋白複合物電荷或粒徑大小純化IL-15:IL-15Rα融合蛋白複合物。在其他具體實施例中,基於融合蛋白複合物電荷特性,通過陰離子交換層析法純化被完全佔據的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白複合物。在其他具體實施例中,以四級胺基樹脂純化完全佔據的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白複合物,其結合條件採用低離子強度的中性pH緩衝液,沖提條件為遞增離子強度的緩衝液。
在本發明的可溶性融合蛋白複合物的某些具體實施例中,IL15多肽是具有與天然IL-15多肽不同胺基酸序列的IL-15變體。人類IL-15多肽在本文中被稱為huIL-15,hIL-15,huIL15,hIL15,IL-15野生型(wt),而其變體以天然胺基酸,其在成熟序列中的位置和變體胺基酸稱之。例如,huIL15N72D是指在位置72包含N取代為D的人類IL-15。在某些具體實施例中,IL15變體作用為IL-15促效劑,例如相較於天然IL-15多肽,其對IL-15RβγC受體的結合活性增加。在某些具體實施例中,IL-15變體作用為IL-15拮抗劑,例如相較於與天然IL-15多肽,該IL-15變體對IL-15RβγC受體的結合活性降低。在某些具體實施例中,相較於天然IL-15多肽,IL-15變體對IL-15RβγC受體具有增加的結合親和力或降低的結合活性。在某些具體 實施例中,相較於天然IL-15序列,IL-15變體的序列具有至少一個(即,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)胺基酸變化。該胺基酸變化可以包括與IL-15Rβ及/或IL-15RγC交互作用的IL-15結構域中的一個或多個胺基酸取代或刪除。在某些具體實施例中,胺基酸改變是人類IL-15成熟序列中位置8、61、65、72、92、101、108或111處的一個或多個胺基酸取代或刪除。例如,胺基酸改變是將人類IL15成熟序列中位置8的D取代為N或A,位置61的D取代為A,位置65的N取代為A,位置72的N取代為R,或位置108的Q取代為A,或這些取代的任何組合。在某些具體實施例中,胺基酸改變是人類IL15成熟序列中位置72的N取代為D。
ALT-803包含IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合複合物。組合IgG的Fc區與另一蛋白質(如各種細胞因子和可溶性受體)的結構域的融合蛋白已有報導(參見例如Capon et al.,Nature,337:525-531,1989;Chamow et al.,Trends Biotechnol.,14:52-60,1996;美國專利號5,116,964 and 5,541,087)。該融合蛋白的原型是IgG Fc的鉸鏈區中經由半胱胺酸殘基連結的同二聚體蛋白,形成類似於不含重鏈可變區和CH1結構域和輕鏈的IgG分子。包含Fc結構域的融合蛋白的 二聚特性可能有利於提供與其他分子更高等的相互作用(即二價或雙特異性結合)。由於結構同源性,Fc融合蛋白表現出與具有相似同型的人類IgG相當的體內藥物動力學特徵。IgG類免疫球蛋白是人體血液中含量最豐富的蛋白質之一,其循環半衰期可達21天。為了延長IL-15或IL-15融合蛋白的循環半衰期及/或增加其生物活性,製造出含有與IL-15RαSu非共價結合的IL-15結構域的融合蛋白複合物,其共價連結至人類重鏈IgG蛋白質的Fc部分(例如ALT-803)。
術語「Fc」是指抗體的非抗原結合片段,此「Fc」可以是單體或多聚體形式。天然Fc的原始免疫球蛋白來源較佳為人類,並且可以是任何免疫球蛋白,儘管IgG 1和IgG 2為較佳的。天然Fc係由單體多肽組成,其可經共價(即二硫鍵)和非共價結合連結成二聚體或多聚體形式。取決於其類別(例如,IgG,IgA,IgE)或亞類(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgA1,IgGA2),於天然Fc分子單體單元之間的分子間二硫鍵的數目為1至4。天然Fc的一個實例是由木瓜蛋白酶消化IgG所產生,由二硫鍵結合的二聚體(參見,Ellison et al.(1982),Nucleic Acids Res.10:4071-9)。本文中所述術語「天然Fc」是單體,二聚體和多聚體形式的通用術語,Fc結構域包含可結合至蛋白A,蛋白G,各種Fc受體和補體蛋白的結合位點。
在一些具體實施例中,術語「Fc變體」是 指從天然Fc修飾,但仍包含補救受體FcRn的結合位點的分子或序列。國際專利申請WO 97/34631(1997年9月25日公開)和WO 96/32478描述了例示性的Fc變體及其與補救受體的相互作用,並且藉由參照而併入本文中。因此,術語「Fc變體」包含從非人類天然Fc人源化的分子或序列,此外,天然Fc包含可被去除的位點,因為它們提供了本發明融合分子不需要的結構特徵或生物活性。因此,在某些具體實施例中,術語「Fc變體」包含缺少一個或多個影響或參與下述反應的天然Fc位點:(1)二硫鍵形成,(2)與選擇的宿主細胞的不相容性,(3)在選擇的宿主細胞中表現後的N端異質性,(4)醣基化,(5)與補體的相互作用,(6)與補救受體以外的Fc受體的結合,(7)抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC),或(8)抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。下文將進一步詳細描述Fc變體。
術語「Fc結構域」涵蓋如上所定義的天然Fc和Fc變體分子和序列。如同Fc變體和天然Fc一樣,術語「Fc結構域」包括單體形式或多聚體形式的分子,無論是從完整抗體消化還是通過重組基因表現,或通過其他方式產生。
在一些情況下,本發明的融合蛋白複合物還包括介於IL-15或IL-15Rα結構域之間的柔性連結基序列,連結 基序列應容許多肽相對於IL-15或IL-15Rα結構域的有效定位,以容許兩個結構域的功能活性。
在某些情況下,可溶性融合蛋白複合物具有連結基,其中第一多肽經多肽連結基序列與IL-15(或其功能片段)共價連結。於其它態樣中,如本文所述可溶性融合蛋白複合物具有連結基,其中第二多肽經多肽連結基序列與IL-15Rα多肽(或其功能片段)共價連結。
連結基序列較佳為核苷酸序列,其所編碼的肽可有效定位TCR分子的結合溝以辨識呈現抗原,或可有效定位抗體分子的結合結構域以辨識抗原。如本文中該,短語「生物活性多肽相對於IL-15或IL-15Rα結構域的有效定位」或其它類似短語,旨在表示與IL-15或IL-15Rα連結的生物活性多肽結構域的定位,使IL-15或IL-15Rα結構域能夠彼此相互作用以形成蛋白質複合物。例如,IL-15或IL-15Rα結構域被有效定位而容許與免疫細胞的相互作用,以啟動或抑制免疫反應,或抑製或刺激細胞發育。
本發明的融合蛋白複合物較佳地還包括插入在IL-15或IL-15Rα結構域和免疫球蛋白Fc結構域之間的柔性連結基序列。該連結基序列應容許Fc結構域,生物活性多肽和IL-15或IL-15Rα結構域的有效定位,以容許每個結構域的功能活性。例如,Fc結構域被有效定位,以容許適當的融合蛋白複合物形成及/或與補體系統的免疫細胞或蛋白上的Fc受體的相互作用,進而刺激 Fc介導的作用,其包括調理作用,細胞裂解,肥大細胞脫顆粒作用,嗜鹼性球細胞、嗜伊紅細胞和其他Fc受體依賴性反應;補體途徑的活化;以及增強融合蛋白複合物的體內半衰期。
連結基序列也可用於連結兩個或更多個生物活性多肽,以產生具有所需功能活性的單鏈分子。
較佳地,連結基序列包含約7至20個胺基酸,更佳地約10至20個胺基酸。連結基序列較佳是柔性的,生物活性多肽或效應分子因而不會以不理想的單構形接合。連結基序列可用於例如間隔辨識位點與融合分子,具體而言,肽連結基序列可位於生物活性多肽和作用分子之間,例如用於化學交聯和提供分子靈活性。較佳地,連結基主要包含具有小側鏈的胺基酸,例如甘胺酸,丙胺酸和絲胺酸,以提供靈活性。較佳地,連結基序列約80或90%或更多包含甘胺酸,丙胺酸和絲胺酸殘基,特別是甘胺酸和絲胺酸殘基。
可使用不同的連結基序列,包括已成功用於將抗體可變區連結在一起的多種柔性連結基設計中的任何一種(參見Whitlow,M.et al.,(1991)Methods:A Companion to Methods in Enzymology,2:97-105)。
本發明提供了ALT-803,其為一種IL-15N72D和 IL-15RαSu/Fc之間的蛋白質複合物。在某些具體實施例中,ALT-803多肽可作為與其他蛋白結構域融合的支架,在此類融合蛋白複合物中,第一融合蛋白包含與介白素-15(IL-15)或其功能片段共價連結的第一生物活性多肽;且第二融合蛋白包含與可溶性介白素-15受體α(IL-15Rα)多肽或其功能片段共價連結的第二生物活性多肽,其中該第一融合蛋白的IL-15結構域與該第二融合蛋白的可溶性IL-15Rα結構域結合,形成可溶性融合蛋白複合物。本發明的融合蛋白複合物還包含與第一和第二融合蛋白之一或兩者連結的免疫球蛋白Fc結構域或其功能片段。較佳地,與第一和第二融合蛋白連結的Fc結構域相互作用,形成融合蛋白複合物。此複合物藉由免疫球蛋白Fc結構域之間形成的二硫鍵而穩定化。在某些具體實施例中,本發明的可溶性融合蛋白複合物包括IL-15多肽,IL-15變體或其功能片段,和可溶性IL-15Rα多肽或其功能片段,其中IL-15和IL-15Rα多肽中的一者或兩者還包括免疫球蛋白Fc結構域或其功能片段。
在更進一步的具體實施例中,第一和第二生物活性多肽中的一者或兩者包含抗體或其功能片段。
在另一具體實施例中,抗體結構域的抗原包含細胞表面受體或配體。
在另一具體實施例中,該抗原包含CD抗原,細胞激素或趨化介素受體或配體,生長因子受體或配體,組織因子,細胞粘附分子,MHC/類MHC分子, Fc受體,類鐸受體(Toll-like receptor),NK受體,TCR,BCR,陽性/陰性共刺激受體或配體,死亡受體或配體,腫瘤相關抗原,或病毒編碼抗原。
如本文中所述,術語「生物活性多肽」或「作用分子」是指例如蛋白質,多肽或肽的胺基酸序列;糖或多醣;脂質或醣脂質,醣蛋白或脂蛋白,其可產生如本文所討論的所需效果。作用分子還包括化學試劑,亦考慮編碼生物活性或作用蛋白,多肽或肽的作用分子核酸。因此,合適的分子包括調控因子,酶,抗體或藥物以及DNA,RNA和寡核苷酸。生物活性多肽或作用分子可以是天然存在的,或者可以由已知組分合成,例如經由重組或化學合成,並且可以包括異源組分。根據通用的分子大小測量技術如離心或SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳判斷,生物活性多肽或作用分子通常介於約0.1至100KD或更高至約1000KD,較佳地介於約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30和50KD之間。本發明期望的效果包括但不限於,例如形成具有增加的結合活性的本發明融合蛋白複合物,藉由例如誘導細胞增殖或細胞死亡殺傷目標細胞,啟動免疫反應預防或治療疾病,或作為用於診斷目的之檢測分子。對於此種檢測,可以使用例如包含以連續步驟培養細胞以增殖細胞的測定法。
根據本發明將作用分子與本發明的融合蛋白複合物共價連結提供了許多顯著的優點。可產生包含單一作用分子的本發明融合蛋白複合物,包括已知結構的肽。 另外,可以在相似的DNA載體中產生各種作用分子,意即,各種不同的作用分子可以與融合蛋白複合物連結以辨識受感染或患病細胞。此外,對於治療應用,相對於將本發明的融合蛋白複合物投予個體,另可投予編碼融合蛋白複合物的DNA表現載體,於體內表現融合蛋白複合物。這種方法避免了通常與製備重組蛋白相關的昂貴純化步驟,也避免了與一般方法相關的抗原攝入和處理的複雜性。
如所指出的,本文中揭露的融合蛋白和抗體的組分,例如作用分子接合物(如細胞激素,趨化介素,生長因子,蛋白毒素,免疫球蛋白結構域或其他生物活性分子和任何肽連結基,可以以幾乎任何方式組織,條件是融合蛋白或抗體具有其預期的功能。具體而言,如果需要,融合蛋白的每種組分可以與另一種組分隔開至少一個合適的肽連結基序列。另外,融合蛋白可包含標誌,例如以便於融合蛋白的修飾,識別及/或純化。
本發明提供了包含ALT-803作為治療劑的醫藥組成物。於一態樣,系統性投予ALT-803,例如配製在藥學上可接受的如生理食鹽水的緩衝液中。較佳的投予途徑包括例如滴注入膀胱,皮下,靜脈內,腹膜內,肌肉內或皮內注射,其在患者體內提供連續的且持續的組成物的量。人類患者或其他動物的治療係使用本文中所述的治療劑, 於生理學上可接受的載體中以治療有效量進行,合適的載體及其製劑描述於如E.W.Martin所著的Remington's Pharmaceutical Sciences中。依投予方式、患者的年齡和體重、以及腫瘤或自體免疫或炎性疾病的臨床症狀,治療劑所投予的用量也不同。通常,用量將在用於治療與腫瘤或自體免疫或炎性疾病相關的其他疾病的其他藥劑的範圍內,儘管在某些情況下由於化合物增加的特異性,需要的量較低。如發明所屬技術領域的技術人員已知的方法能測定的,化合物以能增強個體的免疫反應或降低癌細胞的增殖、存活或侵襲性的劑量投予。或者,化合物以能減少由疾病相關免疫反應所引起的自體免疫或炎性疾病的劑量施用。
投予ALT-803以治療腫瘤或自體免疫或炎性疾病可以經由任何合適的方法來實現,該方法使用與其他組分結合時可有效改善,減輕或穩定腫瘤或自體免疫或炎性疾病的治療劑濃度。ALT 803可以以任何合適的量包含在任何合適的載體物質中,並且通常以重量計為組成物總重量的1至95%的量存在。該組成物可以以適合腸胃外(例如皮下,靜脈內,肌肉內,膀胱內或腹膜內)投予途徑的劑型提供。該醫藥組成物可根據常規藥物製造方式來配製(參照例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams & Wilkins,2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)。
如發明所屬技術領域的技術人員所習知,以動物模型為基礎改變人的劑量是發明所屬技術領域常規,所以可以通過從小鼠或非人靈長類動物中使用的化合物量推斷來確定人類的劑量。在某些具體實施例中,設想劑量可以在約0.1μg化合物/kg體重至約5000μg化合物/kg體重之間變化;或約1μg/kg體重至約4000μg/kg體重,或約10μg/kg體重至約3000μg/kg體重。在其它具體實施例中,該劑量可以是約0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、或5000μg/kg體重。在其他具體實施例中,設想劑量可以在約0.5μg化合物/kg體重至約20μg化合物/kg體重的範圍內。在其他具體實施例中,劑量可以是約0.5、1、3、6、10或20mg/kg體重。當然,如於此類治療方案中常規進行的,該劑量可以根據初始臨床試驗的結果和特定患者的需要向上或向下調整。
在特別的具體實施例中,將ALT-803配 製於適用於腸胃外投予的賦形劑。在具體的具體實施例中,以0.5μg/kg至約15μg/kg(例如0.5、1、3、5、10或15μg/kg)投予ALT-803。
ALT-803經由膀胱低注進行投予治療膀胱癌,滴注方法為已知的,參照例如Lawrencia,et al.,Gene Ther 8,760-8(2001);Nogawa,et al.,J Clin Invest 115,978-85(2005);Ng,et al.,Methods Enzymol 391,304-13 2005;Tyagi,et al.,J Urol 171,483-9(2004);Trevisani,et al.,J Pharmacol Exp Ther 309,1167-73(2004);Trevisani,et al.,Nat Neurosci 5,546-51(2002));(Segal,et al.,1975).(Dyson,et al.,2005).(Batista,et al.,2005;Dyson,et al.,2005)。在某些具體實施例中,可以設想用於滴注的ALT-803劑量在約5和1000μg/劑量之間變化。
醫藥組成物與合適的賦形劑一起配製成醫藥組成物,其在投予後在控制下釋放治療劑。實例包括單個或多單位錠劑或膠囊組成物、油溶液、懸浮液、乳劑、微膠囊、微球體、分子複合物、奈米顆粒、貼片和脂質體。
包含ALT-803的醫藥組成物以劑型,製劑或通過合適的遞送裝置或植入物經由注射,輸注或植入(皮下,靜脈內,肌內,囊內,腹膜內等)採腸胃外投予,該遞送裝 置或植入物含有常規的及無毒的藥學上可接受的載體和佐劑。這種組成物的配製和製備為藥物製劑領域的技術人員所熟知,製劑可見於Remington:The Science and Practice of Pharmacy,同上。
於腸胃外使用的包含ALT-803的組成物可以以單位劑量形式(例如,在單劑量安瓿,注射器或袋中)或者在含有幾個劑量並且其中可以加入合適防腐劑的小瓶中提供(見下文)。該組成物可以是用於植入的溶液,懸浮液,乳劑,輸注裝置或輸送裝置的形式,或者其可以呈現為乾粉,在使用之前以水或另一合適的載體重構。除了減少或改善腫瘤或自體免疫或炎性疾病的活性劑之外,該組成物可包含合適的腸胃外可接受的載體及/或賦形劑。該活性治療劑可摻入用於控制釋放的微球體,微膠囊,奈米顆粒,脂質體或類似物中,此外,組成物可以包括懸浮劑、增溶劑、穩定劑、pH調節劑、張力調節劑及/或分散劑。
如上所述,包含ALT-803的醫藥組成物可以是適於無菌注射的形式。為了製備這種組成物,將合適的活性抗腫瘤/抗感染治療劑溶解或懸浮於腸胃外可接受的液體載體中,可以使用的可接受載體和溶劑為水,經加入適量的鹽酸、氫氧化鈉或合適的緩衝劑調節至合適的pH值得水,1,3-丁二醇,林格氏溶液和等張的氯化鈉溶液和葡萄糖溶液。含水製劑還可以含有一種或多種防腐劑(例如對羥苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在其中一種化 合物僅在水中略溶或微溶的情況下,可以加入溶解促進劑或增溶劑,或者溶劑可以包含10至60%重量/重量的丙二醇等。
本發明提供了治療腫瘤或感染性疾病及/或病症或其症狀的方法,其包括向個體(例如,哺乳動物如人)投予包含本文中所述配方之化合物的醫藥組成物的治療有效量。因此,一個具體實施例是治療患有或易患腫瘤或感染性疾病或其病症或症狀的個體的方法,該方法包括在治療疾病或病症的條件下,投予哺乳動物本文所述化合物治療量的量的步驟,該量足以治療疾病或其病症或症狀。
本文中所述方法包括投予個體(包括被鑑定為需要此種治療的個體)本文所述化合物,或本文所述組成物的有效量以產生此效果。鑑定需要此種治療的個體可以經由個體或醫療保健專業人員判斷,並且可以是主觀的(例如意見)或客觀的(例如可經由測試或診斷方法測量)。
本發明的治療方法(其包括預防性治療)通常包括將本文中所述化合物,例如本文中所述配方之化合物的治療有效量,投予有需要的個體(例如動物、人),包括哺乳動物,特別是人類。此種治療將適合投予患病的、患有、易患、或有風險患得腫瘤或感染性疾病,病症或其症狀的個體,尤其是人。可經由個體或健康護理提供者的診斷測試或意見(例如,基因測試,酶或蛋白質標誌物, 標誌物(如本文所定義),家族史等)的任何客觀或主觀決定,判定「有風險患得」的個體。ALT-803可用於治療任何需要增加免疫反應的其他疾病。
在一個具體實施例中,本發明提供了一種監測治療進展的方法,該方法包括以下步驟:測定患有或易患與腫瘤或自體免疫或炎性疾病相關的病症或其症狀個體中的診斷標誌物(標誌物)的量(例如,由本文所描述的化合物所調控的任何本文所述目標物,蛋白質或其指示物等)或診斷測量結果(例如篩檢,化驗),其中已投予該個體本文中足以治療疾病或其症狀的化合物的治療量。在該方法中測定的標誌物的量可以與健康的正常人對照組或其他患病的患者中已知的標誌物的量進行比較,以確定該個體的疾病狀態。在較佳的具體實施例中,在第一次測定標誌物的量後,進行第二次的測定,並且比較兩次測定的量以監測疾病的過程或治療的功效。在某些較佳的具體實施例中,根據本發明在開始治療之前測定個體中標誌物的治療前的量,然後可以將該標誌物的治療前的量與治療開始後個體中的標誌物的量進行比較,以決定治療的功效。
較佳地,ALT-803與例如抗體(如腫瘤特異性抗體或免疫檢查點抑製劑)的抗腫瘤或抗炎治療劑合併投予,抗體和ALT-803可以同時或先後投予。在某些具體實施例 中,抗體治療是用於疾病適應症的既有治療,而在抗體治療方案外增加ALT-803治療增進了對患者的治療益處,這種治療益處的增進可以被測量為以每個患者為基礎所增加的反應,或於患者群體中增加的反應。合併治療還可以在更少或更低頻率的抗體劑量下提供改善的反應,作為耐受性更好的治療方案。如所示,ALT-803與抗體的合併治療可通過各種機制提供增強的臨床活性,包括增強的ADCC、ADCP及/或NK細胞、T細胞、嗜中性白血球或單核球細胞的數量或免疫反應。
若期望,ALT-803與任何常規療法合併投予,包括但不限於手術,放射療法,化學療法,蛋白質療法或生物療法。化療藥物包括烷化劑(例如含鉑藥物,四,氮環丙烷,亞硝基尿素,氮芥子氣),抗代謝劑(例如葉酸拮抗劑,氟嘧啶,去氧核苷類似物,硫醇嘌呤類),微管抑制劑(例如長春花生物鹼,紫杉醇類),拓撲異構酶抑制劑(例如拓撲異構酶I和II抑製劑),細胞毒素抗生素(例如蒽環抗生素)和免疫調節藥物(例如沙利度胺和類似物)。
包含ALT-803的醫藥組成物可以裝配成套組或藥物系統,用於治療腫瘤或自體免疫或炎性疾病。根據本發明此態樣的套組或藥物系統包含載體裝置,例如盒子,紙盒,管子,在其密封中有一個或複數個容器裝置,例如小瓶, 管子,安瓿瓶,瓶子,注射器或袋子。本發明的套組或藥物系統還可以包含ALT-803的使用相關說明。
通常,本發明的融合蛋白複合物(例如ALT-803的組分)的製備可以藉由本文中所公開的方法和被認可的重組DNA技術來完成。
通常,經用合適的表現載體中的全部或部分編碼多肽的核酸分子或其片段來轉殖合適的宿主細胞,產生重組多肽。彼等分子生物學所屬領域中的技術人員將會理解,可以使用各種表現系統中的任何一種提供重組蛋白。確切的宿主細胞對本發明不具關鍵性,實際上重組多肽可以在任何真核宿主(例如釀酒酵母,昆蟲細胞,例如Sf21細胞或哺乳動物細胞,例如NIH 3T3,HeLa,COS或較佳的CHO細胞)中產生,此種細胞可以從廣泛的來源獲得(例如American Type Culture Collection,Rockland,Md.;另外也可參照,Ausubel et al.,Current Protocol in Molecular Biology,New York:John Wiley and Sons,1997).轉染方法和表現載體的選擇取決於所選的宿主系統,轉殖方法描述於例如Ausubel等人(同上);表現載體可選自例如Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels等,1985,Supp.1987)中所提供者。
有多種表現系統可用於產生重組多肽,用 於產生此類多肽的表現載體包括但不限於染色體形,附加型和病毒衍生載體,例如來自細菌質體、噬菌體、轉位子、酵母附加體、插入片段、酵母染色體片段、病毒如桿狀病毒、乳突多瘤空泡病毒如SV40、痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假性狂犬病病毒和反轉錄病毒之載體,以及由其組合衍生的載體。
表現重組多肽後進行單離,例如使用親和力層析法。在一個實例中,針對多肽產生的抗體(例如,如本文中所述而產生的)可連結至管柱並用於分離重組多肽。親和力層析法之前,含多肽細胞的溶解和粗分離(fractionation)可使用標準方法進行(參見例如Ausubel等,同上)。一旦單離,若期望,重組蛋白可以進一步純化,例如透過高效液相層析法(參見例如Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology,eds。,Work and Burdon,Elsevier,1980)。
如本文中所述,本發明的生物活性多肽或作用分子可包括諸如細胞介素,趨化介素,生長因子,蛋白毒素,免疫球蛋白結構域或其他生物活性蛋白例如酶。生物活性多肽也可以包括與其他化合物如非蛋白毒素、細胞毒性劑、化療劑、可檢測標記、放射性物質等的接合物。
本發明的細胞介素定義為由細胞產生並影響其他細胞的的任何因子,並且負責細胞免疫的多種作用中任何數量的作用。細胞介素的實例包括但不限於IL-2 家族,干擾素(IFN),IL-10,IL-1,IL-17,TGF和TNF細胞介素家族,以及IL-1至IL-35,IFN-α,IFN-β,IFNγ,TGF-β,TNF-α和TNFβ。
本發明的一個態樣中,第一融合蛋白包含與介白素-15(IL-15)結構域或其功能片段共價連結的第一生物活性多肽。IL-15是一種影響T細胞活化和增殖的細胞介素,在影響免疫細胞活化和增殖方面,IL-15活性在某些方面與IL-2類似,儘管其基本差異已廣為描述(Waldmann,T A,2006,Nature Rev.Immunol.6:595-601)。
本發明的另一態樣中,第一融合蛋白包含介白素-15(IL-15)結構域,即IL-15變體(在本文中也稱為IL-15突變體)。IL-15變體較佳地包含與天然(或野生型)IL-15蛋白不同的胺基酸序列。IL-15變體較佳地與IL-15Rα多肽結合,並作用為IL-15促效劑或拮抗劑。較佳地,具有促效劑活性的IL-15變體具有超級促效劑活性。在某些具體實施例中,IL-15變體可作用為與其與IL-15Rα的結合無關之IL-15促效劑或拮抗劑。IL-15促效劑藉由其相較於野生型IL-15增加或相等的生物活性而例證。IL-15拮抗劑藉其相較於野生型IL-15減少的生物活性或抑制IL-15所介導的反應而例證。在某些實例中,IL-15變體與IL-15RβγC受體的結合活性增加或降低。在某些具體實施例中,IL-15變體的序列具有至少一個胺基酸改變,例如,相較於天然IL-15序列之取 代或刪除,這種改變形成IL-15促效劑或拮抗劑活性。較佳地,胺基酸取代/刪除位於與IL-15Rβ及/或γC相互作用的IL-15結構域中,更佳地,胺基酸取代/刪除不影響與IL-15Rα多肽的結合或產生IL-15變體的能力。適用於產生IL-15變體的胺基酸取代/刪除可經由基於推定的或已知的IL-15結構、與IL-15同源分子(如具有已知結構的IL-2)比較,而以本文所提供之合理的或隨機的誘變和功能分析或其他經驗方法辨識。其他合適的胺基酸取代可以是保留性或非保留性的改變和額外胺基酸的插入。較佳地,本發明的IL-15變體在成熟人類IL-15序列位置6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111或112處含有一個或多個胺基酸取代/刪除;特別是D8N(「D8」是指天然成熟人類IL-15序列中的胺基酸和其殘基位置,「N」是指IL-15變體中該位置的取代胺基酸殘基)、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A等胺基酸取代產生具有拮抗劑活性的IL-15變體,而N72D取代產生具有促效劑活性的IL-15變體。
趨化激素,與細胞介素相似,被定義為任何一種任何化學因子或分子,當暴露於其他細胞時負責細胞免疫多種作用中任何數量的作用。合適的趨化激素可包括但不限於CXC、CC、C和CX3C趨化激素家族,以及CCL-1至CCL-28、CXC-1至CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-1b、IL-8、MCP-1,和 Rantes。
生長因子包括任何暴露於特定細胞時,誘導受影響的細胞的增殖及/或分化的分子。生長因子包括蛋白質和化學分子,其中一些包括:GM-CSF,G-CSF,人類生長因子和幹細胞生長因子。其他生長因子也可適用於本文所述用途。
毒素或細胞毒素劑包括任何暴露於細胞時具有致死作用或抑制生長作用的物質。更具體而言,作用分子可以是例如植物或細菌來源的細胞毒素,例如白喉毒素(DT),志賀毒素,相思豆毒素,霍亂毒素,蓖麻毒素,皂草毒素,假單胞菌外毒素(PE),美洲商陸抗病毒蛋白或白樹素。這些毒素的生物活性片段在發明所屬技術領域中是公知的,包括例如DT的A鏈和蓖麻毒素A鏈。另外,毒素可以是在細胞表面有活性的試劑,例如磷脂酶(例如磷脂酶C)。
此外,作用分子可以是化學治療藥物,例如,長春地辛、長春新鹼、長春鹼、甲胺喋呤、阿黴素、博來黴素和順鉑。
此外、作用分子可以是適合於診斷或影像研究的具有可檢測標記的分子,此類標記包括生物素或鏈黴抗生物素蛋白/抗生物素蛋白,可檢測的奈米顆粒或結晶體,酶或其催化活性片段,螢光標記如綠色螢光蛋白、FITC、紅藻素、Cychome、德克薩斯紅或量子點;放射核種如碘-131、釔-90、錸-188或鉍-212;磷光或化學 發光分子或可透過PET、超音波或MRI檢測的標記,如以Gd或順磁性金屬離子為基礎的造影劑,有關製造和使用包含作用物或標記的蛋白質之公開資料,參見例如Moskaug,et al.J.Biol.Chem.264,15709(1989);Pastan,I.et al.Cell 47,641,1986;Pastan et al.,Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents,Ann.Rev.Biochem.61,331,(1992);"Chimeric Toxins" Olsnes and Phil,Pharmac.Ther.,25,355(1982);PCT公告號:WO 94/29350;PCT公告號:WO 94/04689;PCT公告號:WO2005046449及美國專利號5,620,939。
包含共價連結的IL-15和IL-15Rα結構域的蛋白質融合物或接合物複合物具有幾個重要用途,易於被傷害或死亡的細胞或組織可以經由本文中所公開的方法輕易測定。
本發明的IL-15和IL-15Rα多肽與天然存在的IL-15和IL-15Rα分子的胺基酸序列合適地相對應,例如,人類、小鼠或其他囓齒動物或其他哺乳動物的IL-15和IL-15Rα分子。這些多肽和編碼核酸的序列在文獻中是已知的,包括人類介白素15(IL15)mRNA-GenBank:U14407.1、小鼠介白素15(IL15)mRNA-GenBank:U14332.1、人類介白素-15受體α鏈前體(IL15RA)mRNA-GenBank:U31628.1、小鼠介白素15受體、α鏈-GenBank:BC095982.1。
在某些情況下,製造本發明的蛋白質融合物或接合物複合物製成多價是有用的,例如以增加sc-TCR或sc-抗體的價位。具體而言,融合蛋白複合物的IL-15和IL-15Rα結構域之間的相互作用提供了產生多價複合物的方法。另外,多價融合蛋白可以透過使用例如標準生物素-鏈黴抗生物素蛋白標記技術,或通過共軛結合至合適的固體支持物如乳膠珠,以共價或非共價連結1至4種(相同或不同的)蛋白質。化學交聯的蛋白質(例如與奈米顆粒交聯)也是合適的多價物。例如,透過包含可被修飾的編碼標籤序列的序列,蛋白質可以進行修飾,例如生物素化BirA標籤或具有化學反應性側鏈的胺基酸殘基如Cys或His。這種胺基酸標籤或化學反應性胺基酸可以位於融合蛋白或抗體的多個位置,較佳地位於生物活性多肽或作用分子活性位點的遠端。例如,可溶性融合蛋白的C端可以共價連結至包含此類反應性胺基酸的標籤或其他融合蛋白,可包括合適的側鏈,將兩種或更多種融合蛋白化學連結至合適的奈米顆粒以產生多價分子。例示性的奈米粒子包括樹枝狀聚合物、脂質體、核-殼粒子或以PLGA為基礎的粒子。
在本發明的另一具體實施例中,融合蛋白複合物的一個或兩個多肽包含免疫球蛋白結構域。或者,蛋白質結合結構域-IL-15融合蛋白可以進一步連結到免疫球蛋白結構域。如上所述,較佳的免疫球蛋白結構域包含允許與其他免疫球蛋白結構域相互作用形成多鏈蛋白 的區域。例如,免疫球蛋白重鏈區如IgG1CH2-CH3能夠穩定地相互作用以產生Fc區。包括Fc結構域的較佳的免疫球蛋白結構域,還包含具有作用功能的區域,包括Fc受體或補體蛋白結合活性,及/或具有醣基化位點。在某些具體實施例中,融合蛋白複合物的免疫球蛋白結構域含有會降低或增加Fc受體或補體結合活性或醣基化的突變,因而影響所得蛋白質的生物學活性。例如,含有降低與Fc受體結合的突變的免疫球蛋白結構域可用於產生本發明的融合蛋白複合物,其對帶有Fc受體的細胞具有較低的結合活性,這對設計用於識別或檢測特定抗原的試劑可能是有利的。
本發明還提供了編碼本發明蛋白質的核酸序列,特別是DNA序列(例如ALT-803的成分)。較佳地,DNA序列由適合於染色體外複製的載體如噬菌體,病毒,質體,噬質體,黏接質體,YAC或附加體。具體而言,編碼需要的融合蛋白的DNA載體可用於協助本文中所述的製備方法,並獲得顯著量的融合蛋白。可以將DNA序列插入合適的表現載體,即含有轉錄和轉譯插入的蛋白質編碼序列所需元件的載體。多種宿主-載體系統可用於表現蛋白質編碼序列。這些包括經病毒感染的哺乳動物細胞細統(例如牛痘病毒,腺病毒等);經病毒感染的昆蟲細胞細統(例如桿狀病毒);微生物如含酵母載體的酵母,或經 噬菌體DNA,質體DNA或黏接質體DNA轉殖的細菌。取決於所利用的宿主-載體系統,可以使用許多合適的轉錄和轉譯元件中的任何一種。參見Sambrook等人(同上)和Ausubel等人(同上)。
本發明包括製備可溶性融合蛋白複合物的方法,該方法包括將編碼第一和第二融合蛋白的如本文所述DNA載體導入宿主細胞,在細胞或培養基中足以表現融合蛋白的條件下於培養基中培養宿主細胞,並允許第一融合蛋白的IL-15結構域和第二融合蛋白的可溶性IL-15Rα結構域之間結合,形成可溶性融合蛋白複合物,自宿主細胞或培養基純化可溶性融合蛋白複合物。
通常,根據本發明的較佳DNA載體包含經由磷酸二酯鍵連結的核苷酸序列,由5'至3'方向其包含用於引入編碼生物活性多肽的第一核苷酸序列的第一選殖位點,該第一選殖位點經可操控連結至編碼作用分子的序列。
由DNA載體編碼的融合蛋白組分可以卡匣式提供。術語「卡匣式」是指每種組分可以經由標準重組方法輕易地替換成另一種組分。尤其,當編碼的融合複合物係用於抵抗可能具有或具有發展血清型能力的病原體時,特別需要以卡匣式配置的DNA載體。
使用合適的接合酶,將編碼生物活性多肽的序列與編碼作用肽的序列連結,以製備編碼融合蛋白複合物的載體。編碼呈現肽的DNA可以經由從天然來源, 例如合適的細胞株中單離,或經由已知的合成方法,例如磷酸三酯法,參見例如Oligonucleotide Synthesis,IRL Press(M.J.Gait,1984編輯)。合成寡核苷酸也可以使用市售的自動寡核苷酸合成儀來製備。一旦單離後,編碼生物活性多肽的基因可以透過聚合酶連鎖反應(PCR)或發明所屬技術領域已知的其他方法進行擴增,用於擴增生物活性多肽基因的合適PCR引子可以添加限制性位點於PCR產物。PCR產物較佳地包括作用肽和前導序列的剪接位點,其為正確表現和分泌生物活性多肽-效應融合複合物所需。PCR產物還較佳地包含編碼連結基序列的序列,或用於接合該序列的限制性酶位點。
本文中所述的融合蛋白較佳地是經由標準重組DNA技術產生,例如,一旦單離出編碼生物活性多肽的DNA分子,就可以將該序列接合至編碼作用多肽的另一個DNA分子。編碼生物活性多肽的核苷酸序列可以直接接編碼作用肽的DNA序列,或者更典型地,編碼如本文討論的連結基序列的DNA序列,可以插入於編碼生物活性多肽的序列和編碼作用肽的序列之中,並使用合適的接合酶接。所得的混合DNA分子可以在合適的宿主細胞中表現以產生融合蛋白複合物。DNA分子以5'至3'方向彼此接合,使得在接合後,編碼多肽的轉譯框不改變(即DNA分子以符合轉譯框的方式彼此接合)。得到的DNA分子編碼符合轉譯框的融合蛋白。
其他核苷酸序列也可以包含在基因構建體 中。例如,啟動子序列(控制編碼融合至作用肽的生物活性多肽的序列的表現)、或將融合蛋白引導至細胞表面或培養基的前導序列,可包括在構建體中或存在於構建體所插入的表現載體中,免疫球蛋白或CMV啟動子特別較佳。
取得變體生物活性多肽如IL-15,IL-15Rα或Fc結構域編碼序列時,發明所屬技術領域中具有通常技術人員將認知到,可通過某些胺基酸取代、添加、刪除和轉譯後修飾來修飾多肽、但不會損失或減少生物活性。具體而言,眾所皆知保留性胺基酸取代(即一個胺基酸被另一個具有相似大小,電荷,極性和構型的胺基酸取代)不可能顯著改變蛋白質功能。蛋白質成分的20種標準胺基酸可大致分為如下四組保留型胺基酸:非極性(疏水性)組包括丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸和纈胺酸;極性(不帶電的、中性的)基組包括天冬醯胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸;帶正電(鹼性)組含有精胺酸、組胺酸和離胺酸;而帶負電的(酸性)組包含天冬胺酸和麩胺酸。蛋白質中一種胺基酸替換成同一組內的另一種胺基酸不太可能對蛋白質的生物活性產生不利影響。在其他情況下,可以對胺基酸位置進行修飾以降低或增強蛋白質的生物活性。這種變化可以隨機引入,或基於已知或推測的目標殘基的結構或功能特性,經由位點特異性突變引入。在表現變體蛋白之後,經由修飾引起的生物 活性的變化可以使用結合性或功能性的測定輕易評估。
核苷酸序列之間的同源性可以通過DNA雜交分析來決定,其中雙鏈DNA雜交體的穩定性取決於鹼基配對的形成多寡。高溫和/或低鹽含量的條件降低雜交體的穩定性,並且可以變動以防止具有少於選定程度同源性的序列黏合。例如,對於具有約55%GC含量的序列,40至50℃、6×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉緩衝液)和0.1%SDS(十二基硫酸鈉)的雜交和洗滌條件表示約60至70%同源性,50至65℃、xSSC和0.1%SDS的雜交和洗滌條件表明約82至97%的同源性,並52℃,0.1xSSC和0.1%SDS的雜交和洗滌條件表示約99-100%同源性。可用於比較核苷酸和胺基酸序列(以及測量同源性程度)的電腦軟體來源廣泛,並且在Ausubel等人(1999年)提供了市售和免費軟體的來源清單。容易獲得的序列比較和多序列比對演算法分別是基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul等,1997)和ClustalW程序,BLAST可於網站ncbi.nlm.nih.gov上取得,ClustalW可在2.ebi.ac.uk網站上取得。
融合蛋白的組成部分可以依幾乎任何順序組成,只要能夠執行其預期功能,例如,在一個具體實施例中,生物活性多肽位於作用分子的C或N端。
本發明較佳作用分子將具有的大小有助於這些結構域欲執行的功能。本發明的作用分子可以經由包括眾所周知的化學交聯方法在內的多種方法製備並與生 物活性多肽融合。參見例如Means,G.E.and Feeney,R.E.(1974)in Chemical Modification of Proteins,Holden-Day,S.S.Wong(1991)in Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press。然而,使用重組操作方法來製備符合轉譯框的融合蛋白通常是較佳的。
如上所述,根據本發明的融合分子或接合物分子可以以數種方式組成,在一個例示性配置中,生物活性多肽的C端可操控地接合至作用分子的N端。若期望,該連結可以透過重組方法形成。然而,在另一種配置中,生物活性多肽的N端連結到作用分子的C端。
或者,或另外,根據需要可以將一個或多個額外的作用分子插入生物活性多肽或接合物複合物中。
可以採用多種策略來表現ALT-803,例如,編碼ALT-803的構建體可以使用限制酶整合到合適的載體中,以在載體中進行切割以插入構建體。然後接合,再將含有基因構建體的載體導入合適的宿主中以表現融合蛋白(一般資訊參見Sambrook等人,同上)。根據選殖實驗步驟相關的因素,可實驗選擇合適的載體,例如,該載體應該與正在使用的宿主兼容並具有適當的複製子。載體必須能夠容納編碼待表現的融合蛋白複合物的DNA序列,合適 的宿主細胞包括真核細胞和原核細胞,較佳的為那些易於轉殖並在培養基中快速生長的細胞。更具體而言,較佳宿主細胞包括原核生物如大腸桿菌,枯草芽孢桿菌等,和真核生物如動物細胞和酵母菌株,如釀酒酵母。哺乳動物細胞一般較佳,特別是J558,NSO,SP2-O或CHO,其他合適的宿主包括例如昆蟲細胞,例如Sf9。採用常規培養條件,參見Sambrook,同上。接著可以選擇穩定轉殖或轉染的細胞株,表現本發明的融合蛋白複合物的細胞可經由已知方法測定,例如,與免疫球蛋白連結的融合蛋白複合物的表現可以藉由針對連結的免疫球蛋白的ELISA,及/或藉由免疫墨點法確定。用於檢測包含與IL-15或IL-15Rα結構域連結的生物活性多肽的融合蛋白表現的其他方法揭露於具體實施例中。
如上所述,宿主細胞可用於製備目的以增殖編碼所需融合蛋白的核酸。因此,宿主細胞可以包括原核或真核細胞,該細胞生產特定的融合蛋白。因此具體宿主細胞包括能夠增殖編碼融合物的核酸的酵母、蠅、蠕蟲、植物、蛙、哺乳動物細胞和器官。可以使用的哺乳動物細胞株的非限制性實例包括CHO dhfr-細胞(Urlaub and Chasm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))、293細胞(Graham et al.,J Gen.Virol.,36:59(1977))或骨髓瘤細胞如SP2或NSO(Galfre and Milstein,Meth.Enzymol.,73(B):3(1981))。
能夠增殖編碼所需融合蛋白複合物的核酸 的宿主細胞也包括非哺乳動物真核細胞,包括昆蟲(例如草地貪夜蛾(Sp.frugiperda))、酵母(例如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、嗜甲醇酵母菌、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、漢遜氏酵母菌(H.polymorpha);如一般由Fleer,R.,Current Opinion in Biotechnology,3(5):486496(1992)所綜述的),真菌和植物細胞,也預期包含某些原核生物如大腸桿菌和芽孢桿菌屬。
可以經由用於轉染細胞的標準技術將編碼所需融合蛋白的核酸引入宿主細胞中。術語“轉染(transfecting)”或“轉染(transfection)”旨於涵蓋用於將核酸引入宿主細胞的所有常規技術,包括磷酸鈣共沉澱,DEAE-葡聚醣介導的轉染,脂質體轉染,電穿孔法,顯微注射,病毒轉導及/或整合,用於轉染宿主細胞的合適方法可見於Sambrook等人,如上文,以及其他實驗教科書。根據本發明可以使用各種啟動子(轉錄起始的調控區),啟動子合適的的選擇取決於欲使用之表現宿主,只要它們在選擇的宿主中有作用,就可以使用來自異源的啟動子。
啟動子選擇還取決於所需的效率和肽或蛋白質的產生量,通常使用誘導型啟動子如tac以顯著提高大腸桿菌中的蛋白質表現量。蛋白質的過度表現可能對宿主細胞有害,故宿主細胞的生長可能受到限制。誘導型啟動子系統的使用允許宿主細胞在誘導基因表現之前培養至可接受的密度,進而有助於更高的產物量。
根據本發明可以使用各種訊號序列,可以使用與生物活性多肽編碼序列同源的訊號序列,或者,也可以使用為了在表現宿主中有效分泌和加工而選擇或設計的訊號序列。例如,合適的訊號序列/宿主細胞組合包括用於在枯草芽孢桿菌中分泌的枯草芽孢桿菌sacB訊號序列,和用於嗜甲醇酵母菌分泌的釀酒酵母α-交配因子或嗜甲醇酵母菌酸性磷酸酶phoI訊號序列。訊號序列可以經由編碼訊號肽酶切割位點的序列直接接到蛋白質編碼序列,或經由通常少於10個密碼子組成的短核苷酸鍵橋接合,該鍵橋確保下游蛋白質序列的正確閱讀框。
已發現真核蛋白質表現系統中用於增強轉錄和轉譯的元件,例如,將花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動子定位在異源啟動子的任一側1000bp可以在植物細胞中將轉錄量提高10至400倍。表現構建體應還包括合適的轉譯起始序列,為了適當地啟動轉譯,表現構建體修飾成包含Kozak共有序列可以將轉譯水平提高10倍。
通常會採用篩選標記,其可以是表現構建體的一部分或與其分開(例如,由表現載體攜帶),使得標記可以整合在與目的基因不同的位點。實例包括賦予對抗生素抗性的標記(例如bla賦予大腸桿菌宿主細胞對胺芐青黴素的抗性,nptII賦予各種原核和真核細胞康黴素抗性),或允許宿主在基本培養基上生長(例如,HIS4使嗜甲醇酵母菌或His-釀酒酵母在不存在組胺酸的情況下生長)。篩選標記具有自己的轉錄和轉譯起始和終止調 控區,以允許標記的獨立表現。如果使用抗生素抗性作為標記物,則用於篩選的抗生素的濃度將根據抗生素不同,通常為10至600μg抗生素/mL培養基。
組裝表現構建體係使用已知的重組DNA技術(Sambrook等,1989;Ausubel等,1999)。限制性酶消化及接合是用於接合兩個DNA片段的基本步驟,DNA片段的末端在接合之前可能需要修飾,可以藉由填充突出端、以核酸酶(例如ExoIII)去除片段末端的部分、定點突變或藉由PCR添加新的鹼基等完成,可採用多位點連接子(polylinker)和銜接基(adaptor)幫助選定片段的接合。表現構建體通常經由於大腸桿菌中多次的限制酶消化、接合和轉殖等階段的輪迴進行組裝。適合構建表現構建體的許多選殖載體在發明所屬技術領域中是已知的(λZAP和pBLUESCRIPT SK-1(Stratagene,La Jolla,CA),pET(Novagen Inc.,Madison,WI)引用於Ausubel等,1999),而特定選擇對於本發明並不重要。選殖載體的選擇受用於將表現構建體引入宿主細胞的基因轉移系統所影響。在每個階段結束時,可使用限制酶,DNA序列,雜交和PCR分析來分析所得構建體。
表現構建體可以作為選殖載體構建體而轉殖到宿主中,可以是線性的或環狀的,或者可以從選殖載體中除去並按原樣使用或引入到遞送載體上,遞送載體有助於在所選宿主細胞類型中引入和維持表現構建體。以許多已知的基因轉移系統中的任何一種將表現構建體引入 宿主細胞中(例如,天然能力(natural competence),化學介導的轉殖,原生質體轉殖,電穿孔,基因槍轉殖,轉染或接合)(Ausubel等,1999;Sambrook等,1989)。選擇的基因轉移系統取決於所用的宿主細胞和載體系統。
例如,可以通過原生質體轉殖或電穿孔將表現構建體引入釀酒酵母細胞中,釀酒酵母的電穿孔容易執行,且轉殖效率與原生質球轉殖相當。
本發明進一步提供了分離目的融合蛋白的生產方法,在該過程中,宿主細胞(例如,酵母,真菌,昆蟲,細菌或動物細胞)以生產規模於培養基中生長,以刺激編碼目的融合蛋白的核苷酸序列的轉錄,該宿主細胞引入有與調節序列可操作地連結的編碼目的蛋白質的核酸,隨後,從收集的宿主細胞或培養基中分離目的融合蛋白。可使用標準蛋白質純化技術從培養基或收集的細胞中分離目的蛋白質,更具體而言,純化技術可用於從各種實施方式中大規模(即至少毫克量)表現和純化所需的融合蛋白,包括滾瓶,旋轉瓶,組織培養板,生物反應器或發酵槽。可經由已知方法分離和純化表現的蛋白質融合複合物,通常將培養基離心或過濾,然後經由親和或免疫親和層析法純化上清液,例如蛋白-A或蛋白-G親和層析或免疫親和法,或包含使用結合表現的融合複合物的單株抗體的免疫親和法,可以藉由已知技術的適當組合,分離和純化本發明的融合蛋白。這些方法包括,例如,利用溶解度 的方法,如鹽沉澱和溶劑沉澱,利用分子量差異的方法,例如透析,超濾,凝膠過濾和SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳,利用電荷差異的方法,例如離子交換管柱層析法,利用特異親和力的方法,如親和層析法,利用疏水性差異的方法,如反相高效液相層析法,和利用等電點差異的方法,如等電聚焦電泳,金屬親和力管柱諸如Ni-NTA等。涉及這些方法的公開內容一般參見Sambrook等人和Ausubel等人,同上。
本發明的融合蛋白較佳地為實質上是純的,也就是說,融合蛋白已經從天然伴隨的細胞取代基中單離出來,因此融合蛋白較佳以至少80%,或90%至95%的同質性(重量/重量)存在。具有至少98%至99%同質性(重量/重量)的融合蛋白對於許多藥物,臨床和研究應用來說是最佳的。一旦實質上純化之後,融合蛋白於治療應用上應實質上不含污染物。一旦部分純化或達到實質純度,可溶性融合蛋白可用於治療,或用於進行本文公開的體外或體內測定。可藉由各種標準技術如層析法和凝膠電泳確定實質純度。
本發明的融合蛋白複合物適用於多種癌細胞,或被感染的細胞或可能被一種或多種疾病感染的細胞的於體外或體內用途。
人類介白素-15(hIL-15)經由在抗原呈現細胞上表現的人類IL-15受體α鏈(hIL-15Rα)轉移至免疫作用細胞,IL-15Rα主要通過細胞外sushi結構 域(IL-15RαSu)以高親和力(38pM)結合hIL-15。如本文所述,IL-15和IL-15RαSu結構域可用於生產可溶性複合物(例如,ALT-803)或作為支架以構建多結構域融合複合物。
IgG結構域,特別是Fc片段,已成功被使用作為許多治療分子的二聚體支架,包括已獲核准的生物藥物。例如,依那西普(etanercept)是與人類IgG1的Fc結構域連結可溶性人類p75腫瘤壞死因子-α(TNF-α)受體(sTNFR)的二聚體。這種二聚化使依那西普在抑制TNF-α活性方面的效力比單體sTNFR高1000倍,並使融合物的血清半衰期比單體形式長5倍。因此,依那西普於體內有效中和TNF-α的促炎活性,並且改善了許多不同自體免疫病症病患的治療成效。
除了其二聚化活性之外,Fc片段還經由補體活化和與自然殺傷(NK)細胞,嗜中性白血球,單核球,吞噬細胞和樹突細胞上展示的Fcγ受體的相互作用提供細胞毒殺作用功能。在抗癌治療性抗體和其他抗體結構域-Fc融合蛋白的背景下,這些活性在動物腫瘤模型和癌症患者中觀察到的功效中可能扮演重要角色。然而,這些細胞毒殺作用反應在許多治療應用中可能不足。因此,人們對改善和擴大Fc結構域的作用活性,以及開發藉由免疫治療分子在疾病部位增加細胞溶解性免疫反應(包括NK細胞和T細胞)的活性或募集的其它方法具有相當大的興趣。
為了發展人源免疫刺激治療劑,使用了人類IL-15(hIL-15)和IL-15受體結構域。hIL-15是細胞介素的四個小α-螺旋束家族的成員之一,其以高結合親和力(平衡解離常數(KD)~10-11M)與hIL-15受體α鏈(hIL-15Rα)結合。然後將得到的複合物反式呈現至T細胞和NK細胞表面上展示的人類IL-2/15受體β/共γ鏈(hIL-15RβγC)複合物上。這種細胞激素/受體相互作用導致作用T細胞和NK細胞的擴增和活化,其在根除病毒感染和惡性細胞中有重要作用。通常,hIL-15和hIL-15Rα在樹突細胞中共同產生以在細胞內形成複合物,隨後被分泌至細胞表面上呈現為異二聚體分子。因此,hIL-15和hIL-15Rα相互作用的特徵表明這些鏈間結合結構域可以做為人源免疫刺激複合物,並且作為支架供製備能夠與目標特異性結合的可溶性二聚體分子。
除非另有說明,本發明的實施採用分子生物學(包括重組技術),微生物學,細胞生物學,生物化學和免疫學的常規技術,這些技術完全在發明所屬技術領域的技術人員的知識範圍內。這些技術在文獻中有充分的解釋,例如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook,1989);“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984);“Animal Cell Culture”(Freshney,1987);“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir,1996);“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos,1987);“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis,1994);“Current Protocols in Immunology”(Coligan,1991)。這些技術適用於本發明中多核苷酸和多肽的產生,因此,可以在製備和實施本發明時考慮這些技術,用於特定具體實施例的特別有用的技術將在以下章節討論。
本文描述了使用ALT 803(一種IL-15超級促效劑)在體外和實驗動物腫瘤模型中,抗CD38抗體的抗腫瘤活性的增強。達雷木單為FDA最近核准用於治療具有復發或難治性多發性骨髓瘤患者的抗CD38抗體。已顯示達雷木單抗通過靶向表現CD38的腫瘤細胞來減少腫瘤負荷。類似地,已經顯示其他抗CD38抗體,例如伊沙妥昔單抗(SAR650984),MOR202,Ab79,AB19和MT-4019,在血液腫瘤患者中對表現CD38的腫瘤細胞和/或臨床活性具有抗腫瘤活性。如以下實例所描述,檢驗了ALT-803(一種新型IL-15超級促效劑複合物)在合併療法中,於體外和體內增強達雷木單抗的抗CD38抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的能力。使用新鮮單離的PBMC,顯示了ALT-803顯著增強達雷木單抗對Daudi細胞(人類B淋巴瘤細胞)的ADCC活性。如以下的實例中描述,由ALT-803活化的經純化人類NK細胞,增強了達雷木單抗介導的針對原代人類B淋巴瘤細 胞的ADCC活性;也在SCID異種移植模型中檢驗了ALT-803對達雷木單抗介導的抗Daudi細胞的抗腫瘤活性的體內作用,觀察到ALT-803和達雷木單抗單獨使用都能減少腫瘤小鼠中的Daudi腫瘤負荷。然而,ALT-803與達雷木單抗的組合增加了抗腫瘤活性,顯著降低了骨髓中的Daudi細胞。這些觀察結果表明,與單獨使用達雷木單抗相比,在達雷木單抗治療中加入ALT-803可增強達雷木單抗的抗腫瘤效力。另外,如本文所述,ALT-803還增強了達雷木單抗對抗腫瘤細胞的抗體依賴性細胞毒殺吞噬作用。在目前的臨床研究中,相關研究還表明ALT-803增強了達雷木單抗對Daudi細胞的ADCC活性,這也證明ALT-803在體內具有與腫瘤特異性抗體的協同抗腫瘤活性。
提出以下實施例以便為發明所屬技術領域具有通常技術人員提供關於如何進行和使用本發明的測定,篩檢和治療方法的完整揭露和描述,並非用於限制發明人所認為的發明的範圍。
在此實施例中,“ALT-803”是指包含與二聚體IL-15RαSu/Fc融合蛋白非共價結合的IL-15N72D的複合物,其中該複合物表現出免疫刺激活性。視需要地,IL-15N72D及/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白相對於參 考序列包含一個、兩個、三個、四個或更多個胺基酸變異。以下提供例示性IL-15N72D胺基酸序列。(參見,例如U.S.S.N.13/769,179,經引用併入本文)。
以下提供例示性IL-15N72D核酸序列(具有前導肽)(SEQ ID NO:1):(前導肽)
(IL-15N72D)
(終止密碼子)taa
以下提供例示性IL-15N72D胺基酸序列(具有前導肽)(SEQ ID NO:2):(前導肽)METDTLLLWVLLLWVPGSTG-
(IL-15N72D)
在某些情況下,前導肽從成熟的IL-15N72D多肽切下(SEQ ID NO:3):(IL-15N72D)
以下提供例示性IL-15RαSu/Fc核酸序列(具有前導肽)(SEQ ID NO:4):(前導肽)
(IL-15RαSu)
(IgG1 CH2-CH3(Fc結構域))
(終止密碼子)taa
以下提供例示性IL-15RαSu/Fc胺基酸序列(具有前導肽)(SEQ ID NO:5):(前導肽)MDRLTSSFLLLIVPAYVLS-
(IL-15RαSu)
(IgG1 CH2-CH3(Fc結構域))
在某些情況下,成熟的IL-15RαSu/Fc蛋白缺乏前導序列(SEQ ID NO:6):(IL-15RαSu)
(IgG1 CH2-CH3(Fc結構域))
為了評估ALT-803與抗CD38抗體的組合是否會影響針對癌細胞的細胞介導的細胞毒性,將來自血液棕黃層經單離的人類PBMC作為作用細胞。使用 Daudi人類B細胞淋巴瘤細胞作為目標細胞,並在RPMI-10中(RPMI-1640,2-巰乙醇,青黴素-鏈黴素-麩醯胺,非必需胺基酸,丙酮酸鈉和10%胎牛血清)如製造商所述在37℃以5μM的CellTraceTM Violet標記20分鐘。將作用細胞與紫色標記的腫瘤目標細胞以5:1的比例混合,並在含有和不含ALT-803,或與抗CD38 Ab(達雷木單抗)組合的RPMI-10中於37℃與5%CO2溫育兩天。然後經由離心收集混合物,並重懸於含有2mg/ml碘化丙錠的RPMI-10中。藉由流式細胞測量術測定碘化丙錠染色後死亡的紫色標記目標細胞的百分比,評估作用細胞對目標細胞的細胞毒性。如第1圖所示,在ALT-803不存在的情況下,新鮮的人類PBMC對Daudi細胞具有弱的細胞毒性。相反地,在10nM的ALT-803存在下,PBMC對Daudi腫瘤目標細胞具有強烈的細胞毒性。Daudi腫瘤細胞表現可被抗CD38 Ab識別(達雷木單抗)的CD38分子。人類PBMC能夠僅由抗CD38 Ab介導的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)裂解Daudi細胞(第1圖)。重要的是,添加ALT-803能夠顯著增強人類PBMC針對Daudi腫瘤細胞由抗CD38 Ab介導的ADCC活性。
探討ALT-803誘導人類PBMC對Daudi細胞的細胞毒性的濃度依賴性。將新鮮的人類PBMC與CellTrace Violet標記的Daudi細胞在RPMI-10培養基中混合。該培養基具有不同濃度(1nM至25nM)的 ALT-803和固定濃度的抗CD38 Ab(10nM),然後孵育2天。如上所述,藉由流式細胞測量術評估人類PBMC對目標細胞的細胞毒性。與第1圖中的結果一致,ALT-803能夠以低至1nM的濃度增強人類PBMC對Daudi細胞的抗CD38 Ab介導的細胞毒性(第2A圖)。在該ADCC測定中也進行劑量反應研究,其中使用不同濃度的抗CD38 Ab(從0.1nM至50nM)和固定的10mM ALT-803(第2B圖),在低至0.1nM時觀察到Daudi細胞殺傷增加,抗CD38 Ab在每個濃度下藉由添加ALT-803進一步增強腫瘤細胞殺傷。
為了辨識負責觀察到的腫瘤目標細胞殺傷的免疫作用細胞,藉由MACS從人類PBMC單離NK細胞,並將其用作上述ADCC測定中的作用細胞。類似於使用完整人類PBMC的結果,NK細胞能夠經由抗CD38 Ab介導的ADCC活性(其透過添加ALT-803而增強)殺傷Daudi腫瘤細胞(第2C圖)。與完整PBMC相比,觀察到以ALT-803加抗CD38 Ab孵育的NK細胞對腫瘤目標的更大細胞毒性。
在帶有Daudi腫瘤的SCID小鼠中進一步評估ALT-803增強抗CD38 Ab抗腫瘤功效的能力。此外,於類固醇預處理後,在腫瘤小鼠中評估ALT-803與抗 CD38 Ab組合的效果。類固醇通常與抗CD38 Ab療法一起使用,作為抗炎劑以減少輸注反應。然而,亦有這些類固醇的免疫抑制作用也可能限制抗CD38 Ab療法的免疫介導功效的顧慮。於本研究中,以Daudi細胞(每隻小鼠10×106個)(6隻小鼠/組)靜脈內(i.v.)接種Fox Chase SCID雌性小鼠(Harlan,C.B-17/IcrHsd-Prkdc-scid:6週齡)。這些小鼠具有功能性NK細胞,其可能介導針對腫瘤的ADCC反應。在某些組中,在第15天(腫瘤接種後)靜脈注射PBS或抗CD38 Ab(10mg/kg)前1小時,亦以類固醇(氫化皮質酮,0.2mg/小鼠,腹膜內)治療腫瘤小鼠。在第17天,以PBS或抗CD38抗體治療兩天後,依治療組別,以ALT-803(0.2mg/kg,皮下)進一步治療小鼠。抗CD38抗體治療後7天,犧牲小鼠並測定骨髓中Daudi細胞的水平。以PE結合的抗人類HLA-DR抗體(BioLegend)染色後,以流式細胞測量術分析評估股骨骨髓細胞的Daudi細胞百分比。如第3圖所示,ALT-803和抗CD38 Ab單一療法能夠降低腫瘤小鼠骨髓中Daudi細胞的百分比。然而,ALT-803加抗CD38 Ab的組合提供了最多的抗腫瘤活性,將對照小鼠中62%的骨髓Daudi細胞減少至ALT-803+抗CD38 Ab治療小鼠中的10%。在ALT-803加抗CD38Ab療法之前用類固醇治療的腫瘤小鼠中也觀察到這種增強功效。事實上,在使用或不使用類固醇預處理的ALT-803加抗CD38 Ab治療的小鼠中觀察到類似的抗腫瘤活性。
亦評估了ALT-803加抗CD38 Ab延長帶有Daudi細胞腫瘤的小鼠的存活的能力。於此研究中,以Daudi細胞(每隻小鼠10×106個)靜脈內(i.v.)接種Fox Chase SCID雌性小鼠。15天後,以PBS或抗CD38 Ab(10mg/kg,i.v。)治療腫瘤小鼠。除了PBS治療的小鼠外,所有小鼠都用類固醇(氫化皮質酮,0.2mg/小鼠,腹膜內)預處理以減少輸注反應。在第17天,ALT-803和ALT-803組合抗CD38Ab的組別以ALT-803(0.2mg/kg,皮下)治療小鼠。在第22天,ALT-803,抗CD38抗體和ALT-803組合抗CD38組別進行類似第15天和第17天的治療。監控小鼠的存活率(包括基於後腿麻痺的發病率)。如第4圖所示,以PBS,ALT-803和抗CD38 Ab單一療法治療的腫瘤小鼠組別顯示存活中位天數為31至41天,而以抗CD38 Ab治療的所有腫瘤小鼠存活超過45天,表明合併治療顯著延長了帶有B細胞淋巴瘤的小鼠的存活。總之,這些結果證實了ALT-803組合體內抗CD38 Ab的協同抗腫瘤作用,這些結果是在類固醇預處理的存在下觀察到的。
治療性抗體部分可經由巨噬細胞對腫瘤細胞的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)活性介導抗腫瘤活性。細胞介素和其他免疫作用細胞釋放的其他因子接著可以刺激巨噬細胞活性。為了暸解ALT-803影響巨噬細胞抗腫瘤活性的能力,吾等建立了以流式細胞儀為基礎的吞噬作用測定,使用人類巨噬細胞株THP-1作為主要作用細胞,人類NK-92細胞株(NK細胞株)作為次要作用細胞,以及Daudi細胞作為腫瘤目標細胞。在本研究中,使用TranswellTM系統將NK-92細胞(aNK細胞)與THP-1和Daudi細胞分離。將NK-92細胞(1×105個)培養在TranswellTM插入物(Corning)的頂部孔中,而THP-1細胞(1×105個)(根據Sigma使用說明以PKH67標記)和Daudi細胞(1×105個)(根據Molecular Probes使用說明以CellTrace Violet標記)培養在24孔板的底部孔中。在每個孔中以1ml總體積的單獨培養基,或含有10nM ALT-803,10nM抗CD38Ab或10nM ALT-803組合10nM抗CD38Ab的培養基處理細胞。24小時後,以離心收集THP-1和Daudi細胞,並重懸於流式細胞儀緩衝液中,藉由測定經PKH67和CellTrace Violet標記的細胞的百分比來評估吞噬作用(第5圖中顯示代表性的流式細胞測定術結果)。這種雙陽性細胞代表以PKH67標記的THP-1巨噬細胞,其吞噬了以CellTrace Violet標記的Daudi細胞。相較於 單獨使用ALT 803或抗CD38抗體孵育的細胞,ALT-803和抗CD38抗體的組合增加了巨噬細胞介導的腫瘤細胞吞噬作用,如PKH67 + CellTrace Violet +細胞增加的百分比所示(第5圖)。這種增強的活性依賴於NK細胞和ALT-803的存在,表明NK細胞的ALT-803依賴性活化導致對Ab導向病變細胞(例如腫瘤細胞)被巨噬細胞吞噬的刺激。
雖然已經結合詳細說明描述了本發明,前述說明旨在說明而不是限製本發明的範疇,本發明的範疇由所附申請專利範圍的範疇限定。其他的態樣、優點和修改落入以下申請專利範圍的範疇內。
本文中所提及的專利和科學文獻建立了發明所屬技術領域的技術人員可取得的知識。本文引用的所有美國專利和公開或未公開的美國專利申請經引用併入至本文中。本文引用的所有公開的外國專利和專利申請均經引用併入至本文中。由本文引用以登錄號表示的Genbank和NCBI提交的文獻經引用併入此文。本文引用的所有其他公開的參考文獻,文獻,手稿和科學文獻經引用併入此文。
雖然引用較佳具體實施例以特別顯示和描述本發明,但是發明所屬技術領域的技術人員將理解,在不脫離本發明所附申請專利範圍所涵蓋的發明範疇下,可 以在形式和細節上進行各種改變。
Claims (37)
- 一種用於治療個體中的腫瘤或自體免疫或炎性疾病的方法,該方法包括:投予該個體1)有效量的抗CD38抗體(或類抗體分子)和2)有效量的IL-15:IL-15Rα複合物,進而治療該腫瘤或自體免疫或炎症性疾病。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該IL-15:IL-15Rα複合物包含IL-15RαSu/Fc二聚體分子和兩個IL-15N72D分子之間的複合物(ALT-803)。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之方法,其中該抗CD38抗體(或類抗體分子)和IL-15:IL-15Rα複合物合併投予。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法,其中投予包含該IL-15:IL-15Rα複合物的醫藥組成物。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之方法,進一步包括在投予該抗體(或類抗體分子)或該IL-15:IL-15Rα複合物之前,期間或之後投予該個體類固醇。
- 如申請專利範圍第5項所述之方法,其該類固醇係選自由下列各者所組成之群組:皮質類固醇,退熱劑和抗組織胺。
- 如申請專利範圍第2至6項中任一項所述之方法,其 中該IL-15N72D分子包括SEQ ID NO:3。
- 如申請專利範圍第2至7項中任一項所述之方法,其中該IL-15RαSu/Fc包括SEQ ID NO:6。
- 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之方法,其中該腫瘤係選自由下列各者所組成之群組:血液癌症、B細胞瘤、多發性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、B和T急性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、毛細胞白血病、華氏巨球蛋白血症、原發性系統性澱粉沈積症、被套細胞淋巴癌、NK細胞白血病、NK或T細胞淋巴瘤、漿細胞白血病、B細胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、柏基特氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤及實質固態瘤。
- 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之方法,其中該IL-15:IL-15Rα複合物之有效量為每天投予、每週投予一次或兩次,或每月投予一次或兩次。
- 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之方法,其中該IL-15:IL-15Rα複合物之有效量為0.1μg/kg和100mg/kg之間。
- 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之方法,其中該醫藥組成物之有效量為經全身、靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、膀胱內投予或經由滴注投予。
- 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之方法,其中該抗CD38抗體為達雷木單抗、伊沙妥昔單抗(SAR650984),或MOR202。
- 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之方法,其中在該投予後,該個體中的由該抗體針對腫瘤或自體免疫/炎症相關免疫細胞所介導的抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)增加至少5%。
- 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之方法,其中該抗體(或類抗體分子)和該IL-15:IL-15Rα複合物增加血液中之NK細胞,T細胞,嗜中性白血球,巨噬細胞,樹突細胞或單核白血球的數量或活性之水平。
- 如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之方法,其中該抗體(或類抗體分子)和該IL-15:IL-15Rα複合物刺激CD4 +或CD8 + T細胞,以殺傷腫瘤或自體免疫/炎症相關的免疫細胞。
- 如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之方法,其中該抗體(或類抗體分子)和該IL-15:IL-15Rα複合物刺激NK細胞,以殺傷腫瘤或自身免疫/炎症相關的免疫細胞。
- 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述之方法,其中該抗體(或類抗體分子)和該IL-15:IL-15Rα複合物刺激嗜中性白血球或單核球細胞,以殺傷腫瘤或自體免疫/炎症相關的免疫細胞。
- 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之方法,其中投予該抗體(或類抗體分子)和該IL-15: IL-15Rα複合物造成腫瘤或自體免疫/炎症相關免疫細胞數量的減少。
- 如申請專利範圍第1至19項中任一項所述之方法,其中投予該抗體(或類抗體分子)和該ALT-803導致該腫瘤或自身免疫性或炎性疾病的疾病進展減少。
- 如申請專利範圍第1至20項中任一項所述之方法,其中相較於未治療的個體,投予該抗體和該ALT-803使該個體之存活延長。
- 如申請專利範圍第1至20項中任一項所述之方法,其中該個體是人。
- 如申請專利範圍第1至21項中任一項所述之方法,其中該抗體(或類抗體分子)和IL-15:IL-15Rα複合物為同時或先後投予。
- 如申請專利範圍第1至22項中任一項所述之方法,其中該投予預防或減少未來該腫瘤或自體免疫/炎性疾病的復發。
- 一種用於治療腫瘤的套組,該套組包含:1)抗CD38抗體(或類抗體分子);2)IL-15:IL-15Rα複合物,和3)使用套組於治療自體免疫或炎性疾病的使用說明。
- 一種用於治療自體免疫或炎性疾病的套組,該套組包含:1)抗CD38抗體(或類抗體分子); 2)IL-15:IL-15Rα複合物,和3)使用套組於治療自體免疫或炎性疾病的使用說明。
- 一種醫藥組成物,其包含:1)抗CD38抗體(或類抗體分子)和2)IL-15:IL-15Rα複合物。
- 如申請專利範圍第25至27項中任一項所述之套組或醫藥組成物,其中該IL-15:IL-15Rα複合物包含IL-15RαSu/Fc二聚體分子和兩個IL-15N72D分子之間的複合物(ALT-803)。
- 一種用於治療表現CD38抗原的病變細胞或疾病相關細胞的方法,該方法包含:以有效量的IL-15:IL-15Rα複合物處理免疫細胞,和將經IL-15:IL-15Rα複合物處理的免疫細胞與抗CD38抗體和表現CD38抗原的病變細胞或疾病相關細胞混合。
- 如申請專利範圍第29項所述之方法,其中該處理和混合導致該病變細胞或疾病相關細胞的殺傷。
- 如申請專利範圍第29或30項所述之方法,其中該IL-15:IL-15Rα複合物包含IL-15RαSu/Fc二聚體分子和兩個IL-15N72D分子之間的複合物(ALT-803)。
- 如申請專利範圍第29至第31項中任一項所述之方法,其中相較於未經該IL-15:IL-15Rα複合物處理的免 疫細胞,經處理的免疫細胞所介導的病變細胞或疾病相關細胞殺傷之水平增加至少5%。
- 如申請專利範圍第29至32項中任一項所述之方法,其中經IL-15:IL-15Rα複合物處理的免疫細胞直接殺傷該病變細胞或疾病相關細胞。
- 如申請專利範圍第29至33項中任一項所述之方法,其中經IL-15:IL-15Rα複合物處理的免疫細胞刺激其他免疫細胞,以殺傷該病變細胞或疾病相關細胞。
- 如申請專利範圍第29至34項中任一項所述之方法,其中該病變細胞或疾病相關細胞的殺傷係經由該IL-15:IL-15Rα複合物處理的免疫細胞和該抗CD38抗體的ADCC或ADCP所介導。
- 如申請專利範圍第29至35項中任一項所述之方法,其中該病變細胞為腫瘤細胞。
- 如申請專利範圍第29至36項中任一項所述之方法,其中該疾病相關細胞為自體免疫或炎性疾病相關。
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