KR102049222B1 - 암 및 자가면역 질환의 진단 및 치료요법에서 사용하기 위한 모노클로날 항체 - Google Patents

암 및 자가면역 질환의 진단 및 치료요법에서 사용하기 위한 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본 명세서는, 암 세포의 표면 상의 HLA 제시와 관련하여 HLA-A2-제한된 펩타이드 PR-1을 인식하는 항체에 대한 서열을 기술한다. 또한, 암 및 면역-관련 질환의 진단 및 치료에 있어서 이들 항체의 용도도 제공된다.

Description

암 및 자가면역 질환의 진단 및 치료요법에서 사용하기 위한 모노클로날 항체{MONOCLONAL ANTIBODIES FOR USE IN DIAGNOSIS AND THERAPY OF CANCERS AND AUTOIMMUNE DISEASE}
본 출원은, 2012년 7월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 제61/669,967호, 및 2012년 9월 19일에 출원된 제61/702,916호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 상기 출원 둘 다의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다.
본 발명의 배경
본 발명은, 미국 국립 암 연구소/국립 보건원에 의해 수여된 P50 CA100632 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 있어 소정 권한을 갖는다.
1. 본 발명의 분야
본 발명은, 일반적으로, 암 및 면역 치료요법의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 암 및 자가면역 질환의 치료 및 예방을 위한 면역 진단학적 및 면역 치료학적 항체에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
면역 시스템은 오랫동안 암의 제어에 연루되어 왔지만; 사람 암에서의 특이적이고 효과적인 면역 반응에 대한 증거는 없었다. 만성 골수성 백혈병(CML)에서, 동종이계 골수 이식(BMT) 또는 인터페론-α2b(IFN-α2b) 치료요법 중 어느 하나는 완전 관해(complete remission)를 초래하였지만, 질환 제어를 위한 메커니즘은 알려져 있지 않고, 면역 항백혈병 반응에 관여할 수 있다.
당해 분야의 증거에 근거하여, 림프구가 항백혈병 효과를 매개하는 역할을 하는 것으로 생각된다. 연구들은, 동종이계 공여자 림프구 주입(DLI)을 이용하여 동종이계 BMT 후 골수성 백혈병의 재발을 치료해 왔음을 입증하였다(Giralt and Kolb, 1996; Kolb and Holler, 1997; Kolb et al., 1995; Kolb et al., 1996; Antin, 1993). 본래의 골수(BM) 공여자로부터의 림프구 수혈은, 만성기(CP: chronic phase)의 만성 골수성 백혈병(CML)을 지닌 환자의 대략 70% 내지 80%에서 혈액학적 반응 및 세포 유전학적 반응 둘 다를 유도한다(Kolb et al., 1996, Kolb and Holler, 1997). AML에 대한 DLI 후의 관해는, 일반적으로, 만성기 CML에서 얻어지는 관해 만큼 오래가지 않고, 이는 면역 반응을 발달시키는 운동역학을 앞서는 종양 성장의 빠른 운동역학을 반영할 수 있다. 추가로, 골수형의 백혈병을 지닌 대부분의 환자들이, 관련된 이식편 대 백혈병(GVL) 효과가 환자를 치유하는 동종이계 골수 이식으로 치료될 수 없는 경우에, 상기 환자들은 상기 질환으로 사망할 것이다. 그러나, 이식편-대-숙주 질환(GVHD) 및 이식-관련된 독성은 이러한 치료를 제한한다. GVL은 GVHD로부터 분리될 수 있고, 백혈병-관련 항원에 대한 면역 반응의 표적화는, GVHD를 지니지 않은 환자에게 GVL의 전이를 가능하게 할 것으로 생각된다.
따라서, 보다 많은 항원(즉, 백혈병 항원 또는 다른 암에 대항하는 항원)이 측정될 수 있는 경우, 및 다수의 가장 강력한 항원-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)가 얻어질 수 있는 경우, 백신에 대한 표적으로서, 또는 양자 면역 치료요법(adoptive immunotherapy)에서 사용하기 위한 특이적 T-세포를 생성하기 위한 표적으로서 항원을 이용하는 백혈병-특이적 치료요법, 유방암 특이적 치료요법 등의 발전이 가능해질 것이다.
프로테이나제 3(P3) 및 엘라스타제로부터 유도된 HLAA2.1-제한된 노나머인 PR1은, 백혈병-관련 항원으로서 동정되었다(Molldrem et al., 2000; Molldrem et al., 1996; Molldrem et al., 1997; Molldrem et al., 1999; Molldrem et al., 2003; 상기 문헌들은 각각 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다). PR1이 백혈병-관련 항원이라는 발견은 문헌[Burchert et al. (2002) 및 Scheibenbogen et al. (2002)]에 의해 독립적으로 확인되어 있다. PR1에 대해 특이적인 CTL은 AML, CML, 및 MDS 세포를 사멸시키지만, 정상 골수 세포는 사멸시키지 않는다. 최근 I/II기 백신 연구에서, AML, CML 및 MDS를 지닌 환자들에게 PR1 펩타이드를 투여하였고, 환자들의 47%에서 PR1-특이적 CTL 면역성이 유발되었으며, 26%에서 임상 반응이 관찰되었다. 따라서, 이러한 항원은, 새로운 치료학적 제제의 발전에 관해서뿐만 아니라 항암 면역 반응에 대한 추가의 조사에 관한 흥미로운 발판을 제공한다.
본 발명의 요약
따라서, 본 발명에 따르면, HLA-A2 수용체에 의해 결합되는 경우에 VLQELNVTV(서열번호 45)에 결합하는, 단리되고 정제된 항체로서, 상기 항체는, 서열번호 3, 서열번호 60, 및 서열번호 5를 포함하는 중쇄 CDR들, 및 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10을 포함하는 경쇄 CDR들을 갖는, HLA-A2 수용체에 의해 결합되는 경우에 VLQELNVTV(서열번호 45)에 결합하는 단리되고 정제된 항체가 제공된다. 상기 항체는, 마우스 항체, 단일쇄 항체, 이특이적 항체, 비-항체 펩타이드 또는 폴리펩타이드 절편에 융합되는 항체, 진단 시약(예를 들면, 형광단, 발색단, 염료, 방사선 치료제, 화학발광성 분자, 상자성(paramagnetic) 이온, 또는 스핀-트랩핑(spin-trapping) 시약)에 링크되어 있는(linked) 항체, 치료학적 시약(예를 들면, 사이토카인, 화학 치료제, 방사성 동위원소, 호르몬, 항체 Fc 단편, TLR 효능제(agonist), CpG-함유 분자, 또는 면역 공동-자극성 분자)에 링크되어 있는 항체, 사람화된 항체, 또는 상기의 조합일 수 있다. 이특이적 항체는, 서열번호 45에 대한 결합 친화성에 추가하여, B 세포(CD19, CD20), NK 세포, 식세포(CD16), 또는 단핵구(CD14)에 대한 결합 친화성을 가질 수 있다. 특정 사람화된 항체는 서열번호 40과 서열번호 38, 서열번호 42와 서열번호 38, 및 서열번호 42와 서열번호 44의 경쇄/중쇄 서열을 가질 수 있다.
다른 실시형태에서, 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10에 의해 암호화되는 경쇄 CDR들을 암호화하는 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 서열번호 7, 서열번호 25 또는 서열번호 27을 암호화할 수 있다. 상기 핵산은, 경쇄 CDR들을 암호화하는 핵산에 5' 위치되는 프로모터 서열, 예를 들면, 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포에서 활성인 프로모터 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 핵산은 복제가능한 벡터, 예를 들면, 비-바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터 내에 위치할 수 있다. 추가로, 상기 핵산은, 링커-암호화(linker-encoding) 절편들을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 링커-암호화 절편들은, 상기 CDR-암호화 절편들 사이에 위치되고, 예를 들면, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프를 암호화하는 링커-암호화 절편이 있다.
또 다른 실시형태에서, 서열번호 3, 서열번호 60, 및 서열번호 5의 서열을 포함하는 CDR들을 포함하는 중쇄-암호화 절편을 포함하고; 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10의 서열을 포함하는 CDR들을 포함하는 경쇄-암호화 절편을 포함하는, 인공 항체가 제공된다. 상기 CDR들은 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 중쇄는 비-항체 펩타이드 또는 폴리펩타이드 절편에 융합될 수 있다. 상기 항체는 진단 시약, 예를 들면, 형광단, 발색단, 염료, 방사성 동위원소, 화학발광성 분자, 상자성 이온, 또는 스핀-트랩핑 시약에 링크될 수 있다. 상기 항체는 치료학적 시약, 예를 들면, 사이토카인, 독소, 화학 치료제, 방사선 치료제, 호르몬, 항체 Fc 단편, 호중구 엘라스타제, 프로테이나제 3, TLR 효능제, CpG-함유 분자, 또는 면역 공동-자극성 분자에 링크될 수 있다. 상기 경쇄는 서열번호 40 또는 42를 포함하고/하거나, 상기 중쇄는 서열번호 38 또는 서열번호 44를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, (a) 숙주 세포에, (i) 서열번호 3, 서열번호 60, 및 서열번호 5에 나타낸 CDR들을 포함하는 중쇄를 암호화하는 핵산 서열, 및 (ii) 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10에 나타낸 CDR들을 포함하는 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 단계; 및 (b) 상기 경쇄 및 중쇄의 발현을 지지하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은, 상기 항체를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은, 진단학적 제제 또는 치료학적 제제에 상기 항체를 링크시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 비정상 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 상기 기술되어 있는 바와 같은 항체 또는 인공 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 비정상 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 중의 비정상 세포를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 항체 또는 인공 항체는 진단학적 제제(예를 들면, 형광단, 발색단, 염료, 방사성 동위원소, 화학발광성 분자, 상자성 이온, 또는 스핀-트랩핑 시약)에 접합될 수 있다. 상기 항체 또는 인공 항체는, 2차 결합제, 예를 들면, 항-Fc 수용체 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 상기 샘플은, (a) 두경부, 뇌, 식도, 유방, 폐, 간, 비장, 위, 소장, 대장, 직장, 난소, 자궁, 자궁 경부, 전립선, 고환, 또는 피부 조직 유래의 종양 조직, 또는 (b) 혈액, 림프액, 뇨, 골수 흡인물, 또는 유두 흡인물과 같은 유체일 수 있다. 상기 샘플은, 절제된 종양층(resected tumor bed) 유래일 수 있다. 상기 방법은, 검출의 존재, 부재, 또는 정도에 근거하여 치료 결정, 예를 들면, 상기 대상체를 PR-1-기반 펩타이드 백신으로 치료하는 결정을 내리는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은, 원발성 암 세포, 전이성 암 세포, 또는 골수 이형성 세포를 검출할 수 있다.
다른 추가의 실시형태에서, 암을 지닌 대상체에게, 상기 기술된 바와 같은 항체 또는 인공 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 지닌 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 항체 또는 인공 항체는 치료학적 제제에 접합될 수 있다. 상기 암은 고형 종양, 예를 들면, 두경부 종양, 뇌 종양, 식도 종양, 유방 종양, 폐 종양, 간 종양, 비장 종양, 및 위 종양, 소장 종양, 대장 종양, 직장 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 자궁 경부 종양, 전립선 종양, 고환 종양, 또는 피부 종양일 수 있다. 상기 암은 혈액암, 예를 들면, 백혈병 또는 림프종일 수 있다. 상기 치료학적 제제는 사이토카인, 독소, 화학 치료제, 방사선 치료제, 호르몬, 항체 Fc 단편, TLR 효능제, CpG-함유 분자, 또는 면역 공동-자극성 분자일 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체에게 제2 항암 치료요법, 예를 들면, 유전자 치료요법, 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법, 독소 치료요법, 또는 외과술을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 인공 항체는 상기 대상체에게 1회 초과로 투여될 수 있다. 상기 암은 재발성 또는 전이성 암일 수 있다. 상기 항체는 상기 대상체에게 1회 초과로 투여될 수 있다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 자가면역 질환을 지닌 대상체에게 상기 기술된 바와 같은 항체 또는 인공 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환을 지닌 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 자가면역 질환은 베게너(Wegener) 육아종증, 처르그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 또는 전신성 소혈관 혈관염일 수 있다. 상기 항체 또는 인공 항체는 치료학적 제제, 예를 들면, 독소 또는 아폽토시스(apoptosis)-유도제에 접합될 수 있다. 상기 방법은, 상기 대상체에게 제2 항-자가면역 치료요법을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2 항-자가면역 치료요법은 소염제일 수 있다. 상기 항체는, 상기 대상체에게 1회 초과로 투여될 수 있다.
또한, HLA-A2 암 세포를 상기 기술된 바와 같은 항체 또는 인공 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, HLA-A2 암 세포의 보체-매개된 세포독성을 유도하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 실시형태는, 비정상 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 상기 기술되어 있는 바와 같은 항체 또는 인공 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 비정상 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 중의 비정상 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 항체 또는 인공 항체는 진단학적 제제, 예를 들면, 형광단, 발색단, 염료, 방사성 동위원소, 화학발광성 분자, 상자성 이온, 또는 스핀-트랩핑 시약에 접합될 수 있다. 상기 항체 또는 인공 항체는, 2차 결합제, 예를 들면, 항-Fc 수용체 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 상기 샘플은 (a) 두경부, 뇌, 식도, 유방, 폐, 간, 비장, 위, 소장, 대장, 직장, 난소, 자궁, 자궁 경부, 전립선, 고환, 또는 피부 조직 유래의 종양 조직, 또는 (b) 혈액, 림프액, 뇨, 골수 흡인물, 또는 유두 흡인물과 같은 유체일 수 있다. 상기 샘플은, 절제된 종양층 유래일 수 있다. 상기 방법은, 검출의 존재, 부재, 또는 정도에 근거하여 치료 결정, 예를 들면, 상기 대상체를 PR-1-기반 펩타이드 백신으로 치료하는 결정을 내리는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은, 원발성 암 세포, 전이성 암 세포, 또는 골수 이형성 세포를 검출할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 암을 지닌 대상체에게 상기에 기술되어 있는 바와 같은 항체 또는 인공 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 지닌 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 항체 또는 인공 항체는 치료학적 제제, 예를 들면, 사이토카인, 독소, 화학 치료제, 방사선 치료제, 호르몬, 항체 Fc 단편, TLR 효능제, CpG-함유 분자, 또는 면역 공동-자극성 분자에 접합될 수 있다. 상기 암은 고형 종양, 예를 들면, 두경부 종양, 뇌 종양, 식도 종양, 유방 종양, 폐 종양, 간 종양, 비장 종양, 및 위 종양, 소장 종양, 대장 종양, 직장 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 자궁 경부 종양, 전립선 종양, 고환 종양, 또는 피부 종양일 수 있다. 대안으로, 상기 암은 혈액암, 예를 들면, 백혈병 또는 림프종일 수 있다. 상기 암은 재발성 또는 전이성 암일 수 있다. 상기 방법은, 상기 대상체에게 제2 항암 치료요법, 예를 들면, 유전자 치료요법, 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법, 독소 치료요법, 또는 외과술을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 인공 항체는 상기 대상체에게 1회 초과로 투여될 수 있다.
다른 추가의 실시형태에서, 자가면역 질환을 지닌 대상체에게 상기 기술되어 있는 바와 같은 항체 또는 인공 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환을 지닌 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 자가면역 질환은 베게너 육아종증, 처르그-스트라우스 증후군, 또는 전신성 소혈관 혈관염일 수 있다. 상기 항체 또는 인공 항체는 치료학적 제제, 예를 들면, 독소, 또는 아폽토시스-유도제에 접합될 수 있다. 상기 방법은, 상기 대상체에게 제2 항-자가면역 치료요법, 예를 들면, 소염제를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체는 상기 대상체에게 1회 초과로 투여될 수 있다.
추가의 방법으로는, (i) 골수 이형성 질환을 지닌 대상체에게 상기 기술되어 있는 항체 또는 인공 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 골수 이형성 질환을 지닌 대상체를 치료하는 방법; 및 (ii) HLA-A2 암 세포를 상기 기술되어 있는 항체 또는 인공 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, HLA-A2 암 세포의 보체-매개된 세포독성을 유도하는 방법이 포함된다.
Hu1-8F4 및 Hu2-8F4는 각각 Hu8F4-1 및 Hu8F4-2를 말한다. 또한, 본 문서에서 용어 "Hu8F4"는, 일반적으로 8F4의 사람화된 형태 둘 다(Hu8F4-1 및 Hu8F4-2)를 나타낸다.
본원 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "한" 또는 "하나"는 1개 이상을 의미할 수 있다. 본원 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우에 단어 "한" 또는 "하나"는 1개 또는 1개 초과를 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 발명의 다른 목적 및 특징은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내의 각종 변화 및 변형은 이러한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 당해 분야 숙련가에게 명백해질 것이므로, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 특정 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내면서 단지 설명의 방식으로서만 제공된다는 것이 이해되어야만 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고, 본 발명의 소정 양상들을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은, 본원에 나타낸 특정 실시형태들의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써, 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1 - PR1/HLA-A2에 대한 8F4의 특이성. PR1 또는 단일 아미노산-변형된 PR1 유사체가 로딩된, 재조합 펩타이드/HLA-A2 단량체를 이용한 ELISA. 최적의 8F4 결합에 필수적인 PR1 서열 내에서의 아미노산 위치를 결정하기 위해, HLA-A2 단량체에, 증가하는 농도로 미세 적정 웰 상에 코팅된 PR1 내에 알라닌 치환(ALA1-ALA9)을 함유하는 펩타이드를 로딩하였다. 이어서, 웰을 고정된 농도의 8F4 또는 대조군 항체 bb7.2(HLA-A*0201 대립 유전자-특이적 마우스 IgG2a 모노클로날 항체)와 함께 항온배양하였다. 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 항체를 이용한 ELISA에 의해 결합을 측정하였다. 8F4는, PR1이 로딩된 HLA-A2에, 그리고, PR1 유사체의 대부분에 결합하였고, ALA1 유사체(펩타이드의 위치 1에서 발린에 대해 치환된 알라닌)에는 덜 유의하게 결합하였고, 대조군 펩타이드 pp65/HLA-A2에는 결합하지 않았다. 대조군 항체 bb7.2는, PR1- 및 pp65-로딩된 HLA-A2에 동등하게 잘 결합하였다.
도 2 - PR1/HLA-A2에 대한 8F4 모노클로날 항체의 친화도. 8F4 및 bb7.2 항체에 대한 펩타이드/HLA-A2 결합의 친화도 측정은, BIAcore 3000을 이용한 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다. 시험 항체는, 항-마우스 항체-코팅된 표면 상에 포획하였다. 분석물인 펩타이드/HLA-A2를 100nM로 희석하였고, 항체-코팅된 표면에의 결합에 대해 이중으로 시험하였다. 분석은 러닝 완충액으로서 PBS, 0.005% Tween-20, 0.1mg/ml BSA, pH 7.4를 이용하여 25℃에서 수행하였다. 결합 친화도를 수득하기 위해서, 실험적 데이터를 1-차 운동역학 모델(도면에서 오렌지색으로 나타냄)에 피팅하였고, 후속적으로, 8F4 및 bb7.2에 대한 KD를 결정하였다.
도 3 - HLA-A2+ AML에 대한 8F4의 특이성. 8F4 및 세포 표면 항체를 이용한 백혈병 및 정상 PBMC의 다중 매개변수 유세포 측정법. AML 환자 및 정상 공여자 유래의 PBMC를 물을 이용하여 생 세포 상에 게이팅하였고, 이어서, 8F4(ALEXA Fluor 647과 접합됨), bb7.2(FITC와 접합됨), 및 CD13 및 CD33에 대한 표면 표현형 항체로 염색하였고, 유세포 측정법에 의해 분석하였다. 하기 게이팅 전략을 사용하였다: 제1 물- 생 세포를 CD13 및 CD33 발현에 대해 분석하였고, 이중 양성 세포를 PR1/HLA-A2(8F4)의 발현 및 총 HLA-A2 발현(bb7.2)에 대해 분석하였다. HLA-A2-음성 AML 대조군 세포를 이용하여 음성 사분면 게이팅을 확립하였다.
도 4a 및 도 4b - 8F4 항체는 AML 의 보체 -의존적 세포독성( CDC )을 유도한다. 표적 세포를 세척하였고, 10-RPMI/HEPES 중에 5x105개의 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 20마이크로리터(㎕)의 항체 및 100㎕의 세포를 혼합하였고, 96-웰 플레이트에서 37℃로 가온하였고, 이어서, 20㎕의 빙냉 표준 토끼 보체(Cedarlane, 캐나다, 온타리오)를 첨가하였고, 37℃에서 90분 동안 항온배양하였다. Cyto-Tox Glo 세포독성 검정(Promega)을 이용하여 세포독성을 측정하였다. 항체-특이적 CDC(AB-CDC)를 하기와 같이 계산하였다: AB-CDC = ((LC+AB-LC-AB)/(Lmax-LS)) x 100%(여기서, LC+AB는 보체 + 항체의 존재시의 표적 세포 용해이고; LT +C는 보체 단독의 존재시의 용해이다); 제조업자의 지침에 따라 세포에 대한 세포독성제 디기토닌을 첨가하기 전에, 그리고, 디기토닌을 첨가한 후에 Lspont 및 Lmax를 측정하였다. (도 4a) 20㎍의 8F4와의 항온배양은, HLA-A2+ AML 환자로부터 채취된 PBMC 및 백혈구 분리 반출(leukapheresis: LP) 세포의 보체-의존적 세포독성을 유도하였지만, HLA-A2-음성 AML 유래의 PBMC, 또는 HLA-A2+ 정상 공여자 유래의 PBMC의 대조군 샘플은 용해시키지 않았다. (도 4b) HLA-A2+ AML의 8F4-매개된 용해는 항체 용량-의존적이었고, 반면, 이소형 대조군 항체(IgG2a 마우스 항-KLH) 및 사람 정맥내 면역글로불린(시판 IVIG)은 AML의 용해를 나타내지 않았다.
도 5 - 정상 PBMC 가 아닌 AML 에 대한 8F4의 특이성. PR1 및 HLA-A2에 대한 AML, PBMC, 및 T2 세포의 표면 염색. 세포를 항-PR1/HLA-A2 항체(8F4)-alexa-647(적색) 및 항-HLA-A2-FITC 접합된 항체(녹색)로 염색하였고, 1% 파라포름알데하이드로 고정하였고, 이어서, 공초점 현미경을 이용하여 연구하였다. T2 세포는, 양성 대조군으로서의 PR1 펩타이드(20㎍/ml)로, 그리고, 음성 대조군 펩타이드로서의 CMV 펩타이드 pp65(20㎍/ml)로 펄싱하였다. PR1/HLA-A2 발현은, AML 및 PR1-펄싱된 T2 세포의 세포 표면 상에서 뚜렷하지만, HLA-A2+ PBMC 상에 또는 pp65-펄싱된 T2 세포 상에서는 그렇지 않았다. Dapi-blue를 핵 염색에 이용하였다.
도 6 - 8F4 항체는 생체내 모델에서의 AML의 생착을 방지한다. 1차 HLA-A2+ 백혈병 세포(106)를 세척하였고, PBS(100㎕) 중에 재현탁시켰고, 8F4 또는 이소형 대조군 항체(20㎍)와 혼합하였고, 200cGy-방사선 조사된 HLA-A2+ 형질전환 NOD/SCID 마우스에 정맥내 주사하였다. 2주 후, 마우스를 희생시키고, 해부하였고, 조직을 균질화시키고, 사람 및 마우스 세포 표면 마커를 이용하여 유세포 측정법에 의해 백혈병 세포의 존재에 대해 분석하였다. 마우스 골수(BM)로부터 단리된 세포의 유세포 측정 결과를 나타낸다. 대조군(PBS-치료됨) 및 AML 세포 + 8F4(AML + 8F4 항체)를 투여받은 실험 동물은, BM에서 사람 백혈병 세포를 나타내지 않았다. 대조적으로, AML 세포 + 대조군 항체(AML + 이소형 대조군)를 투여받은 동물은, 골수에서, 주입된 AML과 동일한 표현형으로 사람 CD33+CD45+ 세포를 나타냈다.
도 7 - 항- PR1 / HLA -A2 항체를 수득하기 위한 면역화 전략. MHC 클래스 I 분자의 도식적 표시. MHC 클래스는 중쇄 및 β2 미세 글로불린 쇄로 이루어진다. 펩타이드 항원은, 쇄의 α1 및 α2 헬릭스 도메인에 의해 플랭킹된 MHC-I의 홈(groove)에 결합한다.
도 8a 및 도 8b - 8F4 항체는 HLA -A2 Tg 이종이식체 모델에서의 사람 AML 의 생착을 방지한다. 1차 HLA-A2+ AML 세포(106)를 세척하였고, PBS(250㎕) 중에 재현탁시켰고, 20㎍의 8F4 또는 이소형 대조군 항체와 혼합하였고, 아치사성으로(sub-lethally) 방사선 조사된(200cGy) HLA-A2 Tg NOD/SCID 마우스에게 정맥내 주사하였다. 명시된 시점에서, 말초 혈액, 골수, 및 조직을 조직화학(도 8a) 및 유세포 측정법(도 8b)에 의해 백혈병의 존재에 대해 분석하였다. AML 전이를 갖지 않는 방사선 조사된 마우스 및 전-전이(pre-transfer) AML 세포를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. (도 8a) AML 세포 + 8F4의 주사(좌측 패널), AML 세포 + 이소형 대조군 항체의 주사(iso, 중앙 패널)에 따른 실험 마우스의 조직에서의 AML 침윤, 및 AML 전이되지 않은 대조군 마우스(우측 패널). (도 8b) AML 세포(전-전이를 나타냄, 좌측 패널)는, 전이되지 않은 대조군 및 실험 8F4-치료된 마우스의 골수(상단 2개의 패널) 및 말초 혈액(하단 2개의 패널)에서 검출되지 않았다. 이소형 매칭된 대조군 항체(iso)와 혼합된 AML 세포를 투여받은 마우스는, AML의 전이 후 2주 또는 4주에 AML1 및 AML5의 생착을 나타냈다. 마우스 세포 특이적 마커(mCD45), 3-6 사람 마커(CD45, CD13, CD33, CD34, CD38, HLA-DR), 및 Live/Dead Fixable Aqua(Invitrogen)를 포함하는 연장된 패널은, AML 생착의 유세포 측정 분석에 사용하였다. 모든 플롯은 생존가능한 mCD45- 세포를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c - 8F4는, HLA -A2-발현 뮤린 조혈 세포에 대한 보존된 PR1 서열의 발현으로 인한 HLA -A2 형질전환 NOD/ SCID 에서의 일시적(21-일) 호중구 감소증을 유도한다. HLA-A2 Tg NOD/SCID 마우스에 200㎍(10mg/kg)의 8F4 또는 이소형 대조군 Ab를 주사하였다. 이들 동물은 내인성 PR1을 제시하는 것으로 밝혀졌다. 9일 후, 골수 세포를 수거하였고, 마우스 항원(B220-PE, Gr-1-PB, CO11b-APC, F4/80-PE-Cy7, CD3-FITC, 및 LIVE/DEAD Fixable Aqua)에 대해 지정된 mAb로 염색하였고, 유세포 측정법에 의해 실험하였다. (도 9a) 골수의 산포(scatter) 프로파일에서는 감소된 과립구가 뚜렷하였다(좌측 패널). Gr-1lo 미성숙 호중구가 나타났지만, Gr-1hi 성숙 호중구는 8F4-치료된 마우스의 골수에서 덜 많았다(중앙 패널). 추가로, 단핵구(SSClo CD11b+; 우측 패널의 아래 우측 게이트)는 8F4-치료된 동물에서 감소하였다. (도 9b) 8F4의 정맥내 주사(5mg/kg)는, HLA-A2 Tg NOD/SCID 마우스에서 순환성 성숙 과립구, 대식세포, 및 단핵구의 무명수의 일시적 감소를 유도하였다. 치료 3주 후, 모든 집단이 남아 있다. 도 9a에 나타낸 게이트를 이용하여 생 세포의 백분율로서 각각의 세포 유형의 출현빈도를 측정하였다. 에러 바는 그룹당 n = 2 동물의 표준 편차이다. 3회 중 1회의 대표적 실험을 나타낸다. (도 9c) 200㎍(10mg/kg)의 8F4의 주사 7일 후, HLA-A2 Tg NOD/SCID 마우스에서 간, 폐, 비장, 신장, 심장, 또는 뇌에서의 유의한 병리학적 변화는 뚜렷하지 않았다. 2마리의 마우스 유래의 대표적인 조직의 H&E 섹션을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b - 8F4는, NOD/ SCID 마우스에의 사람 CD34 + 세포 강화된(enriched) 제대혈의 전이 후 확립된 사람 조혈 세포의 일시적 백혈구 감소증을 유도한다. 신선한 HLA-A2+ 제대혈(CB) 단위(50 내지 150ml)을 Histopaque1077을 이용하여 피콜처리하였고(ficolled), PBS로 세척하였고, 이어서, CliniMACS 완충액(PBS 중의 0.5% HSA, pH 7.2/1mM EDTA, Miltenyi)으로 세척하였다. 108개의 세포를 300ml의 MACS 완충액에 재현탁시켰고, 100ml의 CD34 마이크로비드(Mitenyi)와 혼합하였고, 4℃에서 30분 동안 항온배양하였고, 세척하였다. 마그네틱 비드로 표지된 CD34+ 세포를 2 LS 컬럼(Miltenyi)을 이용함으로써 정제하였다. CD34+ 세포를 컬럼으로부터 용출시켰고, 계수하였고, 방사선 조사된(400rad) NOD/SCID 마우스에게 iv 주사하였다(1 내지 2.5 x 106개의 세포/마우스). 대조군 마우스 CB1-5는 CB 세포를 투여받지 않았다. (도 10a) 이식 4주 후에 시작하여, 마우스로부터 말초 혈액을 매주 또는 2주마다 채혈하여, 마우스 CD45, 사람 CD45, 및 HLA 마커로의 FACS를 이용함으로써 제대혈 생착을 모니터링하였다. 전이 9 내지 12주 후, 마우스에게 20㎍(1mg/kg)의 8F4를 주사간 1주 간격으로 2회 i.v. 주사하였다(점선). (도 10b) 2nd 8F4 주사 4주 후, 마우스를 희생시켰다. 상기와 같이 사람 세포의 생착에 대해 혈액, 비장, 및 골수를 분석하였다.
도 11. pCh8F4 , pHu8F4 -1, pHu8F4 -2, 및 pHu8F4 -2-AA(공통적 발현 벡터)의 도식적 구조. 상단에서 SalI 부위로부터 시계방향으로 진행하면서, 플라스미드는, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 주요 즉시 조기 프로모터 및 인핸서(CMV 프로모터)로 시작하는 중쇄 전사 단위를 함유하여 항체 중쇄 유전자의 전사를 개시한다. CMV 프로모터는, 개재 인트론을 갖는, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 엑손을 포함하는 사람 감마-1 중쇄 불변 영역을 함유하는 게놈 서열인 VH 엑손으로 이어지고, 폴리아데닐화 부위, 이어서, CH3 엑손으로 이어진다. 중쇄 유전자 서열 후, 경쇄 전사 단위는 CMV 프로모터로 시작하고, VL 엑손으로 이어지고, 선행하는 인트론의 부분, 및 폴리아데닐화 부위, 이어서, CL 엑손을 갖는 사람 카파 쇄 불변 영역 엑손(CL)을 함유하는 게놈 서열이 이어진다. 이어서, 경쇄 유전자는, SV40 조기 프로모터(SV40 프로모터), 이. 콜라이(E. coli) 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(gpt), 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 함유하는 절편(SV40 폴리(A) 부위)으로 이어진다. 마지막으로, 플라스미드는, 복제의 박테리아 기원(pUC ori) 및 베타-락타마제 유전자(β-락타마제)를 포함하는, 플라스미드 pUC19의 일부를 함유한다.
도 12. 8F4 VH , 사람화된 8F4( Hu8F4 ) VH , 및 사람 억셉터 U96282 VH 의 아미노산 서열의 정렬. 아미노산 잔기는 단일 문자 암호로 나타낸다. 서열 위의 숫자는 캐뱃 등(Kabat et al.)(1991)에 따른 위치를 나타낸다. 캐뱃 등(Kabat et al.)(1991)에 의해 정의된 CDR 서열은 밑줄 그어져 있다. U96282 VH의 CDR 잔기는 도면에서 생략되어 있다.
도 13. 8F4 VL , 2개의 버젼의 사람화된 8F4 VL ( Hu8F4 VL1 및 VL2 ), 및 사람 억셉터 AY043146 VL 의 아미노산 서열의 정렬. 아미노산 잔기는 단일 문자 암호로 나타낸다. 서열 위의 숫자는 캐뱃 등(Kabat et al.)(1991)에 따른 위치를 나타낸다. 캐뱃 등(Kabat et al.)(1991)에 의해 정의된 CDR 서열은 밑줄 그어져 있다. Hu8F4 VL1의 밑줄 그어진 잔기는 CDR과 접촉하는 것으로 예측되었고, 상응하는 마우스 잔기는 Hu8F4 VL1의 이 위치에 유지되었다. AY043146 VL의 CDR 잔기는 도면에서 생략되어 있다.
도 14. 정제된 8F4 항체의 SDS PAGE 분석. 항체(각각 5㎍)를 환원 조건 하에 4 내지 20% SDS PAGE 겔 상에 흘렸다. Invitrogen의 SeeBluePlus2 Prestained Standard(Cat # LC5925)를 분자량 표준(레인 1, 7, 및 8)으로서 사용하였다. 샘플: 8F4.3.3(레인 2), 8F4-4(레인 3), Ch8F4(레인 4), Hu8F4-1(레인 5), Hu8F4-2 lot 9/9/10(레인 6), Hu8F4-2 lot 1/23/11(레인 9), 및 Hu8F4-2-AA(레인 10).
도 15. PR-1/ HLA -A2에 대한 Ch8F4 , Hu8F4 -1, Hu8F4 -2, 및 Hu8F4 -2-AA의 결합의 ELISA 분석. Ch8F4, Hu8F-1, Hu8F4-2, 및 Hu8F-2-AA는, 1㎍/ml에서 출발하여 일련의 3-배 희석으로 다양한 농도로 PR-1/HLA-A2에 대한 결합에 관해 시험하였다.
도 16a 내지 도 16c. Hu8F4 결합 특이성 및 작용 메커니즘. (도 16a) 특이성 검정. (도 16b) 친화도 검정. (도 16c) CDC 검정.
도 17. Hu8F4 로의 치료는 확립된 AML 을 제거한다. 검정은, 항체 치료 3주전에 제공된 AML 이식편(graft)의 생착률(%)을 측정한다.
도 18. 8F4는 가역적 범혈구 감소증을 야기한다: SCID 마우스에서의 정상 조혈 전구체 세포에 대한 효과.
도 19. 8F4는 가역적 범혈구 감소증을 야기한다: 면역 적격 마우스에서의 정상 혈액 세포에 대한 효과.
도 20a 내지 도 20c. 8F4는 유방암 종양 성장을 지연시키고 생존을 연장시 킨다. (도 20a) 231 BrCA 이종이식체 종양에서의 종양-관련 호중구. (도 20b) 원발성 종양 모델. (도 20c) 전이성 종양 모델.
도 21a 및 도 21b. 고형 종양 세포주는 NE 및 P3 을 흡수한다. 고형 종양을 제시하는 세포주를 (도 21a) NE(10mg/ml) 또는 (도 21b) P3(10mg/ml)과 함께 항온배양하였고, 이어서, 투과성화하였고, 항-NE 또는 항-P3 Ab로 염색하였다. 데이터는, 2개의 독립적인 실험으로부터의 3중 웰로부터 펄싱되지 않은 세포에 비해 NE 또는 P3 흡수에서 평균 6 SEM 배 증가를 나타낸다. MDA-MB-231, 유방 암종; MIA PaCa-2, 췌장 암종; Mel 624 및 Mel 526, 흑색종; OVCAR3, 난소 선암종; SW-620, 결장 선암종.
도 22a 내지 도 22d. 유방암은 P3 을 내인적으로 발현하지 않는다. (도 22a) 유방암 세포주, 및 (도 22b) 원발성 유방암 조직으로부터 mRNA를 추출하였다. P3 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였고, 이는, 유방암 세포주 및 원발성 유방암에서의 P3 mRNA 발현의 결여를 나타낸다. Jurkat 및 HL-60 백혈병 세포주를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 환자 조직 유래의 원발성 유방암 세포인 샘플 유방 1 내지 3은, 외과적 절제술의 시점에서 환자로부터 수득된 종양에 대해 수행된 LCM에 의해 수득되었다. 맘마글로빈-1(MGB-1)을 사용하여 유방암 세포의 분석을 확인하였다. β-액틴 및 GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. (도 22c) 면역 블롯은, 5개의 상이한 유방암 세포주 유래의 WCL에서의 P3 단백질의 결여를 입증한다. 겔에 20mg의 단백질을 로딩하였다. 정제된 P3(5mg)을 양성 대조군으로서 사용하였고, GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. (도 22d) 환자 유방암 조직(유방 3)에서의 P3의 부재를 나타내는 면역 조직 화학. 좌측 패널, 혼합된 호중구들을 갖는 좋지 못하게 분화된 암종을 나타내는 H&E 섹션(본래 배율 3200). 우측 패널, P3에 대한 면역 조직 화학적 염색은, 혼합된 호중구에서 P3의 양성 염색(갈색)을 나타내지만, 유방암 세포에서는 그렇지 않다. 삽도(본래 배율 3400)는, 호중구를 둘러싸는 드문 종양 세포를 나타낸다. 두 화상 모두는 동일한 환자로부터 촬상된 것이고, 5개 조직의 대표도이다. 화살촉은 호중구를 나타낸다.
도 23a 내지 도 23c. P3 은, 유방암 세포주에 의해 흡수되고, 리소좀 구획에 국재화된다. (도 23a) MDA-MB-231, MCF-7, 및 MCF-7-HER18 세포주는 가용성 P3(10mg/ml)과 함께 1, 4, 및 24h 동안 항온배양하였고, 이어서, 항-P3 Ab로 세포내 염색하였다. MFI는 3중 실험 그룹에 대해 측정하였고, 펄싱되지 않은 세포의 MFI에 대해 표준화하였다. 펄싱되지 않은 세포에 비한 MFI의 배수 증가를 y-축에 플롯팅하였다. 데이터는 평균 6 SEM이고, 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. (도 23b) MDA-MB-231 세포를, 증가하는 용량의 가용성 P3 또는 OVA(ova)와 함께 항온배양하였고, 각각 항-P3 또는 항-OVA Ab를 이용하여 P3 또는 OVA의 세포내 흡수에 대해 유세포 측정법에 의해 분석하였다. 데이터는 이중 실험으로부터 평균 6 SEM이다. (도 23c) MDA-MB-231 세포를 가용성 P3(10mg/ml)과 함께 배양하였고, 이어서, P3(적색) 및 LAMP-2(녹색)에 대해 세포내 염색하였다. 공초점 현미경 화상은, 중첩 화상(황색)으로 나타낸 바와 같이, 흡수 후 4h에 리소좀 구획에서의 P3의 국재화를 입증한다. DAPI를 이용하여 핵은 청색으로 나타난다. 스케일 바, 5mm.
도 24a 내지 도 24f. P3 의 흡수 및 P3 및 NE의 교차-제시는, PR1 - CTL 및 항-PR1/HLA-A2에 의한 사멸에 대한 유방암 민감성을 증가시킨다. (도 24a) MDA-MB-231 유방암 세포를 가용성 P3, 방사선 조사된 PMN, 또는 PBMC와 함께 4h 동안 항온배양하였다. 세포를 투과성화하였고, 항-P3 Ab로 염색하였고, 유세포 측정법에 의해 분석하였다. 세포-관련 흡수에 관해, 유세포 측정에서 보여진 광 산란은, PBMC, PMN, 및 MDA-MB-231 세포 사이의 분명한 차이를 제공하였다. PBMC 및 PMN 단독을 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. Tukey 시험에 이어서 Prism 5.0 소프트웨어(*p, 0.05)를 이용하여 ANOVA를 수행하였다. 데이터는 이중 실험으로부터 평균 6 SEM이다. (도 24b) MDA-MB-231 유방암 세포를 증가하는 시점에서 가용성 P3 또는 NE(10mg/ml)와 배양하였고, 이어서, PR1/HLA-A2의 발현에 대해 분석하였다. 펄싱되지 않은 세포에 비한 PR1/HLA-A2의 MFI의 평균 6 SEM 배수 증가는 이중 실험으로부터 밝혀진다. Tukey 시험에 이어서 Prism 5.0 소프트웨어(*p = 0.01, **p, 0.0001)를 이용하여 ANOVA를 수행하였다. (도 24c 및 도 24d) MDA-MB-231 세포를 NE 또는 P3(10mg/ml), 및 Ag 제시 저해제 브레펠딘 A 또는 락타시스틴을 함유하는 배지 중에서 24h 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 PR1/HLA-A2의 발현에 대해 분석하였다. PR1/HLA-A2의 MFI의 평균 6 SEM은 대표 실험의 이중 웰로부터 밝혀진다. Tukey 시험에 이어서 Prism 5.0 소프트웨어(*p, 0.01, **p, 0.0001)를 이용하여 ANOVA를 수행하였다. (도 24e) MDA-MB-231 세포를, 칼세인-AM이 로딩된 P3 또는 NE(10mg/ml)를 함유하는 배지 중에서 밤새 배양하였고, 이어서, PR1-CTL과 함께 4h 동안 공동 배양하였다. 세포독성은, 방출된 칼세인-AM을 측정함으로써 결정하였다. NE- 또는 P3-펄싱된 세포는, 펄싱되지 않은 MDA-MB-231 세포에 비해 더 높은 사멸을 나타낸다. PR1-펄싱된 세포 및 펄싱되지 않은 T2 세포를 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 데이터는 대표 실험으로부터의 이중 웰로부터 평균 6 SEM이다. (도 24f) MDAMB-231 세포를 NE(10mg/ml) 또는 P3(10mg/ml)과 함께 24h 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 항-PR1/HLA-A2 (8F4) Ab와 함께 60분 동안 항온배양하였고, 이어서, 보체를 첨가하였다. 칼세인-AM 방출을 이용하여 보체-의존적 세포독성을 측정하였고, 이는 8F4 Ab에 의한 NE- 또는 P3-펄싱된 MDA-MB-231 세포의 특이적 사멸을 나타낸다. 세포독성 데이터는 대표 실험으로부터의 이중 웰로부터 평균 6 SEM이다. Prism 5.0 소프트웨어(*p, 0.05)를 이용하여 비대응 표본 t 시험(unpaired t test)을 수행하였다.
도 25a 내지 도 25d. PR1 / HLA -A2 및 PR1 - CTL 은 유방암 및 흑색종 환자에서 검출된다. (도 25a) 절제된 HLA-A2+ 환자 유방암 조직(유방 1 및 4)을 항-PR1/HLA-A2(8F4)-647(적색) 및 항-CK7-FITC(녹색)로 염색하였고, 이어서, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 화상화하였다. PR1/HLA-A2는, CK7과의 8F4의 공동 염색에 의해 나타내어지는 바와 같이, 유방암 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀진다. DAPI-blue를 사용하여 세포 핵을 염색하였다. (도 25b) 절제된 HLA-A2+ 유방암 조직으로부터의 연이은 섹션을 항-CD45-647(적색)(좌측 패널) 또는 항-CK7-FITC(녹색) 및 8F4-647(적색)(우측 패널)로 염색하였고, 이어서, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 화상화하였다. PR1/HLA-A2는, 최소 백혈구를 갖는 부위(CD452)에서 유방암 세포(8F4+/CK7+)에 의해 발현되고, 이에 의해, 유방암 세포에 의한 PR1/HLA-A2 발현을 확인한다. DAPI-blue를 사용하여 세포 핵을 염색하였다. (도 25c) 박스 및 위스커(whisker) 플롯은, 유방암(n = 11), 흑색종(n = 7)을 지닌 HLA-A2+ 환자, 및 건강한(n = 9) HLA-A2+ 공여자 유래의 말초 혈액에서의 PR1-CTL을 나타낸다. Prism 5.0 소프트웨어(*p, 0.05)를 이용하여 만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험을 수행하였다. (도 25d) 절제된 HLA-A2+(흑색종 1) 및 HLA-A22(흑색종 2) 환자 조직을 8F4-647(적색) 및 항-MITF-FITC(녹색)로 염색하였고, 이어서, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 촬상하였다. PR1/HLA-A2는, MITF와의 8F4의 공동 염색에 의해 나타내어지는 바와 같이, HLA-A2+ 흑색종 샘플(흑색종 1)에서 발현되는 것으로 밝혀진다. DAPI-blue를 사용하여 세포 핵을 염색하였다. 스케일 바, 20mm.
도 26a 내지 도 26f. 흑색종 세포에 의한 P3 및 NE의 교차-제시는 PR1 - CTL 에 대한 민감성을 증가시킨다. 원발성 흑색종 환자 샘플에서의 (도 26a) NE(갈색) 및 MITF(분홍색), 또는 (도 26b) P3(갈색) 및 MITF(분홍색)의 이중 염색은, 흑색종에서의 NE 및 P3의 결여를 나타낸다. 화상은 본래 배율 3100으로 촬상하였다. 삽도(본래 배율 3400)는, 아마도 염증성 세포인, 산재된 NE- 또는 P3-양성 세포를 나타낸다. (도 26c) 흑색종 세포주에서 NE 및 P3의 부재를 나타내는 웨스턴 블롯. U-937 백혈병 세포주를 NE 및 P3에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 튜불린을 로딩 대조군으로서 사용하였다. M = m.w. 마커. (도 26d 및 도 26e) 526 HLA-A2+ 흑색종 세포주를 증가하는 시점에서 가용성 NE(10mg/ml) 또는 P3(10mg/ml)과 함께 배양하였고, 이어서, (도 26d) NE 및 P3의 흡수, 및 (도 26e) 교차-제시(즉, PR1/HLA-A2 발현)에 대해 분석하였다. 펄싱되지 않은 세포에 비한 NE 또는 P3(도 26d) 또는 PR1/HLA-A2(도 26e)의 MFI의 배수 증가는 y-축 상에 나타낸다. Tukey 시험에 이어서 Prism 5.0 소프트웨어(**p = 0.0001, *p, 0.05)를 이용하여 ANOVA를 수행하였다. 데이터는 이중 실험으로부터 평균 6 SEM을 나타낸다. (f) 칼세인-AM 세포독성 검정은, 펄싱되지 않은(Unp) Mel 526에 비해 PR1-CTL에 의한 NE(10mg/ml) 및 P3(10mg/ml) 24h 펄싱된 526 HLA-A2+ 흑색종 세포주의 사멸을 나타낸다. 펄싱되지 않은 T2 세포(T2 Unp) 및 PR1-펄싱된 T2 세포(T2 PR1)를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 데이터는 대표 실험으로부터의 이중 웰로부터 평균 6 SEM이다. Prism 5.0 소프트웨어(*p, 0.05)를 이용하여 비대응 표본 t-시험을 수행하였다.
PR-1 자기-펩타이드(VLQELNVTV; 서열번호 45)는, CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)에 의해 백혈병 세포막-발현된 HLA-A*0201에 대해 인식되는 것으로 밝혀졌고, PR1-특이적 CTL은 골수성 백혈병을 특이적으로 용해시키지만, 정상 골수 세포는 용해시키지 않는다. PR1 펩타이드를 이용한 AML, CML, 및 MDS를 지닌 HLA-A2+ 환자의 백신접종은, 환자의 58%에서 PR-1-CTL 면역성을, 그리고, 66명의 환자 중 13명(20%)에서 목적하는 임상 반응을 유도하였다. 이들 결과는 유망하지만, 높은 종양 부담이 성공적인 백신접종에 대한 장벽으로 남아 있다.
PR1 펩타이드는 골수종 백혈병 세포의 표면 상에서만 충분한 양으로 발현되고, 정상 골수 세포 상에서는 그렇지 않기 때문에, 본 발명자들은, 골수성 백혈병을 지닌 환자를 치료하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있거나, 환자가 PR1-기반 면역 치료요법, 예를 들면, 백신 또는 양자 T-세포 전이에 민감성일 수 있는지를 확인하는데 사용될 수 있는, PR1/HLA-A*0201에 대해 표적화된 항체를 발전시키는 것을 시도하였다. HLA-A2+는 가장 일반적으로 발현되는 HLA 대립 유전자(일반적인 백인 집단의 40%)이므로, 따라서, T-세포 에피토프에 대한 항체-기반 치료요법은 신규한 것일 수 있고, 광범위하게 적용될 수 있다. 면역 적격 BALB/c 마우스를 재조합체 PR1/HLA-A*0201 단량체로 면역화함으로써, 이들은, 조합된 PR1/HLA-A*0201 에피토프에 대한 특이성을 갖는 IgG2a-카파 모노클로날 항체(8F4)를 수득하였다. 8F4 항체는, PR1/HLA-A*0201에 대해 높은 친화도(KD = 9.9나노몰)를 갖는 것으로 밝혀졌고, 이는, PR1-펄싱된 T2 표적 세포만을 인식하지만 대조군 펩타이드-펄싱된 세포는 인식하지 않는 것으로 밝혀졌다. 8F4는, FACS 및 공초점 현미경 둘 다를 이용하여, HLA-A2+ AML에 결합하여 세포를 표지화하지만, 정상 HLA-A2+ 말초 혈액 세포에는 그렇지 않다.
또한, 8F4는, HLA-A2+ 원발성 사람 백혈병의 용량-의존적 보체-매개된 세포독성(CDC)을 유도하였지만, 정상 골수 세포에서는 그렇지 않았다. 유의하게, 8F4 항체는, 동물에의 양자 전이 시점에서 항체의 단일 노출만을 이용하는 HLA-A2 형질전환 NOD/SCID 동물 모델에서 사람 AML의 생착을 특이적으로 방지하였다. 또한, 8F4는, P3 및 NE가 유방암 세포에서 발현되지 않는다는 사실에도 불구하고, 유방암 종양 성장을 지연시켰고, 생존을 연장시켰다. 종합하여 생각하면, 이들 결과는, 사람 백혈병 및 고형 종양을 특이적으로 표적화하여 제거하는 중요한 T-세포 표적 항원인 세포막-결합된 PR1/HLA-A*0201 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항체의 생성을 나타낸다.
I. 정의
어구 "단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은, 일반적으로 천연 상태로 발견되는 그대로의 물질을 수반하는 구성성분을 실질적으로 또는 필수적으로 포함하지 않는 물질을 말한다. 따라서, 본 발명에 따른 단리된 펩타이드는, 바람직하게는 동일 반응계(in situ) 환경에서 일반적으로 펩타이드와 회합되는 물질을 함유하지 않는다.
"주요 조직 적합성 복합체" 또는 "MHC"는, 생리학적 면역 반응에 관여하는 세포 상호작용의 제어 역할을 하는 유전자의 클러스터이다. 사람에서, MHC 복합체는, 또한, HLA 복합체로서도 공지되어 있다. MHC 및 HLA 복합체의 상세한 설명에 관해서는 문헌[Paul (1993)]을 참조한다.
"사람 백혈구 항원" 또는 "HLA"는 사람 클래스 I 또는 클래스 II 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 단백질이다(예를 들면, 문헌[Stites, 1994]을 참조한다).
본원에 사용된 바와 같은 "HLA 수퍼타입(supertype) 또는 패밀리(family)"는, 공유된 펩타이드-결합 특이성에 기초하여 그룹핑된(grouped) HLA 분자들의 세트를 말한다. 소정 아미노산 모티프를 지닌 펩타이드에 대한 유사한 결합 친화도를 다소 공유하는 HLA 클래스 I 분자는 HLA 수퍼타입으로 그룹핑된다. 용어 HLA 수퍼패밀리, HLA 수퍼타입 패밀리, HLA 패밀리, 및 HLA xx-유사 수퍼타입 분자(여기서, xx는 특정 HLA 유형을 나타낸다)는 동의어이다.
용어 "모티프"는, 정의된 길이의 펩타이드, 일반적으로 클래스 I HLA 모티프에 대해서는 약 8 내지 약 13개 아미노산, 및 클래스 II HLA 모티프에 대해서는 약 6 내지 약 25개 아미노산의 펩타이드에서, 특정 HLA 분자에 의해 인식되는, 잔기의 패턴을 말한다. 펩타이드 모티프는, 전형적으로, 각각의 사람 HLA 대립 유전자에 의해 암호화되는 각각의 단백질에 대해 상이하고, 1차 및 2차 앵커(anchor) 잔기의 패턴에서 상이하다.
"비정상 세포"는, 비전형적 성장, 비전형적 위치에서의 전형적 성장, 또는 비전형적 표적에 대항하는 전형적 작용을 포함하는 세포 유형에 대해 전형적인 특성을 갖는 것으로 여겨지는 임의의 세포이다. 이러한 세포로는 암 세포, 양성 과형성 또는 이형성 세포, 염증성 세포, 또는 자가면역 세포가 포함된다.
II. PR-1 및 HLA 제한
A. PR1
PR-1 자기-펩타이드(VLQELNVTV; 서열번호 45)는, 백혈병에서 둘 다 비정상적으로 발현되는 프로테이나제 3(P3) 및 호중구 엘라스타제(NE)로부터 유도된다. CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)에 의해 백혈병 세포막-발현된 HLA-A*0201에서 인식되는 것으로 밝혀졌다. PR-1-특이적 CTL은, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 및 골수 이형성 증후군(MDS)을 포함하는 골수성 백혈병을 특이적으로 용해시키지만, 정상 골수 세포는 용해시키지 않는다. 이전에, 본 발명자들은, Montanide ISA-51 및 GM-CSF 중의 PR1 펩타이드를 이용한 AML, CML, 및 MDS를 지닌 HLA-A2+ 환자의 PR-1 백신접종이, 환자의 58%에서 PR-1-CTL 면역성을, 그리고, 66명의 환자 중 13명(20%)에서 목적 임상 반응을 유도하였음을 밝혔다.
B. HLA -A2
사람 백혈구 항원 시스템(HLA)은, 사람에서의 주요 조직 적합성 복합체(MHC)의 명칭이다. 수퍼 유전자좌(superlocus)는, 사람에서의 면역계 기능과 관련된 다수의 유전자를 함유한다. 이러한 그룹의 유전자는 염색체 6에 존재하고, 세포-표면 항원-제시 단백질 및 다수의 다른 유전자들을 암호화한다. 소정 유전자에 의해 암호화된 단백질은, 또한, 기관 이식에서 인자로서 이들의 역사적 발견의 결과로서 항원으로서 공지되어 있다. 주요 HLA 항원은 면역 기능에 있어 필수적 요소이다. 상이한 클래스는 상이한 기능을 갖는다.
HLA 클래스 I 항원(A, B, & C)은 세포 내부로부터 펩타이드(존재하는 경우 바이러스성 펩타이드 포함)를 제시한다. 이들 펩타이드는, 리소좀에서 붕괴된 소화된 단백질로부터 생산된다. 펩타이드는, 일반적으로, 약 9개의 아미노산 길이의 작은 중합체이다. 외래 항원은, 세포를 파괴하는 킬러(killer) T-세포(CD8+ 세포라고도 칭함)를 유인한다. HLA 클래스 II 항원(DR, DP & DQ)은, 세포의 외부로부터 T-림프구까지 항원을 제시한다. 이들 특정 항원은 T-헬퍼 세포를 자극하여 재생되고, 이들 T-헬퍼 세포는, 이어서, B-세포를 생산하는 항체를 자극하고, 자기-항원은 억제제 T-세포에 의해 억제된다.
HLA-A2(A2)는, HLA-A "A" 혈청형 그룹 내의 사람 백혈구 항원 혈청형이다. 혈청형은, HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206, 및 *0207 유전자 생성물을 포함하는, 다수의 HLA-A*02 대립 유전자의 유전자 생성물을 동정한다. A*02가 전세계적으로 일반적이지만, A*0201는 북 아시아 및 북 아메리카에서 높은 출현빈도로 존재한다. A2는 가장 다양한 혈청형이고, 동 아프리카 및 남서 아시아에서 다양성을 나타낸다. 북 아시아에서의 A*0201의 출현빈도는 높지만, 이의 다양성은 A*0201, 덜 일반적인 아시아 변이체 A*0203, A*0206에 한정된다.
혈청형은, HLA-A α-쇄의 α2 서브세트의 항체 인식에 의해 측정된다. A2에 관해서, α "A" 쇄는 HLA-A*02 대립 유전자 그룹에 의해 암호화되고, β-쇄는 B2M 유전자좌에 의해 암호화된다. A2 및 A*02는 의미상 거의 동의어이다. A2는 다른 곳에서보다 북 아시아 및 북 아메리카에서 더 일반적이고, 이는 몇몇의 긴 단상형(haplotype)의 부분이다.
III. 항체
본 발명은, HLA-A2 제시와 관련하여 PR1에 결합하는 항체의 생산 및 용도에 관한 것이다. 항체는, 특정 표적 또는 일련의 항원적으로 관련된 표적들에 "특이적으로 결합"할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 항체는, 항체의 가변 영역에 대한 결합에 기초하여 항원적으로 별개인 분자로부터 구별되는 경우, 항원에 "특이적으로 결합"할 수 있다고 한다. 이러한 상호작용은, 이들의 화학적 구조와 관계없이 화합물의 클래스에 관여하는 비-특이적 결합(예를 들면, 니트로셀룰로스에 대한 단백질의 결합 등)과는 대조적이다. 특히, 본 발명의 항체는, "고도로 특이적인 결합"을 나타낼 수 있으므로, 이들은, 심지어 밀접하게 관련된 분자에 결합할 수 없거나 실질적으로 결합할 수 없을 것이다.
모노클로날 항체는, 익히 공지되어 있는 기술, 예를 들면, 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[미국 특허 제4,196,265호]에 예시되어 있는 기술의 사용을 통해 쉽게 제조될 수 있다. 전형적으로, 기술은, 면역 반응을 제공하기에 충분한 방식으로, 적합한 동물을 선택된 항원(예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)으로 처음으로 면역화하는 것을 포함한다. 설치류, 예를 들면, 마우스 및 래트가 바람직한 동물이다. 이어서, 면역화된 동물 유래의 비장 세포는 불멸 골수종 세포의 세포와 융합된다. 이어서, 적절한 항체의 생산을 위해 성공적인 융합을 스크리닝한다.
한 실시형태에서, 항체 분자는, 예를 들면, mAb의 단백질 분해성 개열에 의해 생산되는 단편(예를 들면, F(ab'), F(ab')2), 또는, 예를 들면, 재조합 수단을 통해 생산가능한 단일쇄 면역글로불린을 포함할 것이다. 이러한 항체 유도체는 1가이다. 한 실시형태에서, 이러한 단편은, 서로 조합되거나, 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 조합되어 "키메라" 결합 분자를 형성할 수 있다. 유의하게, 이러한 키메라 분자는, 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환체를 함유할 수 있거나, 이들은 활성화된 단백질 C 에피토프 및 "비-활성화된 단백질 C" 에피토프에 결합할 수 있다.
항체 또는 이들의 단편이 치료학적 목적으로 의도되는 경우, 임의의 면역 반응을 약화시키기 위해 이들을 "사람화"하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 사람화된 항체는 시험관내 또는 생체내 상황에서 연구될 수 있다. 사람화된 항체는, 예를 들면, 면역원성 부분을, 상응하지만 비-면역원성인 부분(즉, 키메라 항체)으로 대체함으로써 생산될 수 있다. PCT 출원 PCT/U.S.86/02269; EP 출원 184,187; EP 출원 171,496; EP 출원 173,494; PCT 출원 WO 86/01533; EP 출원 125,023; Sun et al. (1987); Wood et al . (1985); 및 Shaw et al . (1988); 이들 참조문헌은 모두 본원에 인용에 의해 포함된다. "사람화된" 키메라 항체의 일반적 검토는 모리슨(Morrison)(1985)에 의해 제공되고; 상기 문헌도 본원에 인용에 의해 포함된다. 대안으로, "사람화된" 항체는 CDR 또는 CEA 치환에 의해 생산될 수 있다. Jones et al . (1986); Verhoeyan et al . (1988); Beidler et al . (1988); 이들 참조 문헌은 모두 본원에 인용에 의해 포함된다.
A. 변이체
이하는, 변형된 단백질을 생성하기 위한 단백질의 아미노산 변화에 근거한 논의이다. 이러한 변화의 제조에 있어서, 아미노산의 수치적(hydropathic) 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수치적 아미노산 지수의 중요성은 당해 분야에서 일반적으로 이해된다(Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적인 수치적 특징이 최종 단백질의 2차 구조에 기여하고, 이는, 결과적으로, 다른 분자, 예를 들면, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 및 항원 등과 단백질의 상호작용을 정의한다는 것이 받아들여진다.
또한, 당해 분야에서, 친수성에 기초하여 유사 아미노산의 치환이 효과적으로 이루어질 수 있다는 것도 이해된다. 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제4,554,101호는, 단백질의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 최대 국부 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상호관련되어 있음을 언급한다. 미국 특허 제4,554,101호에 상세하게 설명되는 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기들에 부여되었다: 염기성 아미노산: 아르기닌(+3.0), 라이신(+3.0), 및 히스티딘(-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트(+3.0 ± 1), 글루타메이트(+3.0 ± 1), 아스파라긴(+0.2), 및 글루타민(+0.2); 치수성 비이온성 아미노산: 세린(+0.3), 아스파라긴(+0.2), 글루타민(+0.2), 및 트레오닌(-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인(-1.0) 및 메티오닌(-1.3); 소수성 비방향족 아미노산: 발린(-1.5), 류신(-1.8), 이소류신(-1.8), 프롤린(-0.5 ± 1), 알라닌(-0.5), 및 글리신(0); 소수성 방향족 아미노산: 트립토판(-3.4), 페닐알라닌(-2.5), 및 티로신(-2.3).
아미노산은, 유사한 친수성을 갖는 다른 아미노산에 대해 치환되어 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생산할 수 있음이 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하며, ±0.5 이내인 아미노산 치환이 더욱 특히 바람직하다.
상기 개요된 바와 같이, 아미노산 치환은, 일반적으로, 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 및 크기 등에 근거한다. 각종 상기 특징을 고려한 예시적 치환은 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있고, 이들로는 아르기닌과 라이신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신, 및 이소류신이 포함된다.
본 발명은, 또한, 항체의 다수의 천연 특성을 갖지만 특징이 변경되고/개선된 폴리펩타이드의 제조를 위한 펩타이드 모사체의 사용(예를 들면, Johnson, 1993을 참조한다)을 이용할 수 있다. 모사체의 사용을 지지하는 근본적인 이유는, 단백질의 펩타이드 백본(backbone)이, 주로, 아미노산 측쇄를, 분자 상호작용, 예를 들면, 항체와 항원의 상호작용을 가능하게 하는 방식으로 배향시키도록 존재한다는 것이다. 이들 원칙은 상기 원칙의 개요와 함께 사용하여, 항체의 다수의 천연 특성을 갖지만 특징이 변경되고 심지어 개선된 제2 세대 분자를 조작할 수 있다.
본 발명은, 서열 변이체, 예를 들면, 삽입 또는 결실 변이체를 추가로 사용할 수 있음이 고려된다. 결실 변이체에는 본래 단백질의 1개 이상의 잔기가 결여되어 있다. 삽입 돌연변이체는 전형적으로 폴리펩타이드의 비-말단점에서 물질의 첨가를 포함한다. 또한, 삽입 서열 변이체는 N- 또는 C-말단 아미노산을 포함할 수 있고, 서열이, 생물학적 활성의 유지를 포함하는 상기 제시된 기준을 충족시키는 한, 본원에 개시되어 있는 서열 중 하나에 제시되는 바와 같이 여전히 필수적으로 존재할 수 있음도 이해된다.
본 발명은, 또한, 이소형 변형을 고려한다. 하기 논의되는 바와 같이, 항체 8F4는 IgG2a-κ인 것으로 측정되었다. 상이한 이소형을 갖도록 Fc 영역을 변형시킴으로써, 상이한 기능성이 달성될 수 있다. 예를 들면, IgG1로의 변화는 항체 의존적 세포 세포독성을 증가시킬 수 있고, 클래스 A로의 스위칭은 조직 분포를 개선할 수 있으며, 클래스 M으로의 스위칭은 원자가(valency)를 개선할 수 있다.
변형된 항체는, 표준 분자 생물학적 기술을 통한 발현, 또는 폴리펩타이드의 화학적 합성을 포함하는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현 방법은 본 문서 다른 곳에서 다루어진다.
B. 단일쇄 항체
단일쇄 가변 단편(scFv)은, 짧은(일반적으로 세린, 글리신) 링커에 의해 함께 링크된, 면역글로불린들의 중쇄 및 경쇄들의 가변 영역들의 융합이다. 이러한 키메라 분자는, 불변 영역의 제거 및 링커 펩타이드의 도입에도 불구하고 본래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 우측 화상은, 이러한 변형이 일반적으로 어떻게 특이성을 변경되지 않게 두는지를 나타낸다. 역사적으로, 이들 분자는 파지 디스플레이를 가능하게 하기 위해 생성되었고, 여기서, 항원 결합 도메인을 단일 펩타이드로서 발현하는 것은 매우 간편하다. 대안으로, scFv는, 하이브리도마로부터 유도된 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접적으로 생성될 수 있다. 단일쇄 가변 단편에는, 온전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 결여되어 있고, 따라서, 보통 결합 부위(예를 들면, 단백질 A/G)를 사용하여 항체를 정제하였다. 단백질 L은 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하므로, 이들 단편은, 종종 단백질 L을 이용하여 정제/고정화될 수 있다.
가요성 링커는, 일반적으로, 헬릭스- 및 턴-촉진성 아미노산 잔기, 예를 들면, 알라닌, 세린, 및 글리신으로 이루어진다. 그러나, 다른 잔기들도 기능할 수 있다. Tang et al. (1996)은, 단백질 링커 라이브러리로부터, 단일쇄 항체(scFv)에 대해 조정된(tailored) 링커를 신속하게 선택하는 수단으로서 파지 디스플레이를 사용하였다. 무작위 링커 라이브러리를 작제하였고, 여기서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자는, 가변 조성물의 18-아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 절편에 의해 링크되었다. scFv 레퍼토리(대략 5 x 106의 상이한 구성원)를 사상 파지 상에 디스플레이하고, 합텐을 이용하여 친화성 선택하였다. 선택된 변이체의 집단은, 결합 활성의 유의한 증가를 나타냈지만, 상당한 서열 다양성을 유지하였다. 후속적으로, 스크리닝 1054 개별 변이체는, 가용성 형태로 유효하게 생산된 촉매적 활성 scFv를 얻었다. 서열 분석은, VH C 말단 후 2개의 잔기가 링커 내의 보존된 프롤린이고, 선택된 테더(tether)만의 일반적 특징으로서 다른 위치에서의 아르기닌 및 프롤린의 풍부함을 밝혔다.
본 발명의 재조합 항체는, 또한, 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 허용하는 서열 또는 모이어티(moiety)를 포함할 수 있다. 이러한 서열로는, IgA로부터 유도된 서열이 포함되고, 이는, J-쇄와 함께 다량체의 형성을 허용한다. 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 실시형태에서, 쇄는, 제제, 예를 들면, 비오틴/아비딘을 이용하여 변형시킬 수 있고, 이는 2개의 항체의 조합을 허용한다.
별도의 실시형태에서, 단일쇄 항체는, 비-펩타이드 링커 또는 화학적 단위를 이용하여 수용체 경쇄 및 중쇄를 연결함으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생산되고, 정제되어, 후속적으로, 적절한 방식으로 함께 링크될 것이다(즉, 적절한 화학적 가교를 통해 중쇄의 N-말단이 경쇄의 C-말단에 부착됨).
가교-연결 시약, 예를 들면, 안정화제 및 응고제를 이용하여, 2개의 상이한 분자의 기능성 그룹들을 묶는 분자 가교를 형성한다. 그러나, 동일한 유사체들의 이량체 또는 다량체, 또는 상이한 유사체들로 이루어진 헤테로머 복합체가 생성될 수 있음이 고려된다. 2개의 상이한 화합물을 단계적 방식으로 연결하기 위해, 원하지 않는 동종 중합체 형성을 제거하는 이종-이기능성 가교-연결제를 사용할 수 있다. 표 3은 몇몇의 가교-연결제를 보여준다.
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예시적 이종-이기능성 가교-연결제는, 2개의 반응성 그룹: 1차 아민 그룹(예를 들면, N-하이드록시 석신이미드)와 반응하는 하나의 그룹, 및 티올 그룹(예를 들면, 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)과 반응하는 다른 하나의 그룹을 함유한다. 1차 아민 반응성 그룹을 통해, 가교-연결제는 하나의 단백질(예를 들면, 선택된 항체 또는 단편)의 라이신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응성 그룹을 통해, 이미 제1 단백질에 묶여 있는 가교-연결제는 다른 단백질(예를 들면, 선택적 제제)의 시스테인 잔기(유리 설프하이드릴 그룹)와 반응한다.
혈액에서 타당한 안정성을 갖는 가교-연결제를 사용할 것임이 바람직하다. 표적화제 및 치료학적/예방학적 제제를 접합하는데 성공적으로 사용될 수 있는, 링커를 함유하는 많은 유형의 디설파이드-결합이 공지되어 있다. 입체적으로 방해되는 디설파이드 결합을 함유하는 링커는, 생체내에서 보다 큰 안정성을 제공하여, 작용 부위에 도달하기 전에 표적 펩타이드를 방출하는 것을 방지함을 입증할 수 있다. 따라서, 이들 링커는 한 그룹의 연결제이다.
다른 가교-연결 시약은 SMPT이고, 이는, 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 입체적으로 방해되는 디설파이드 결합을 함유하는 이기능성 가교-연결제이다. 디설파이드 결합의 입체적 방해는, 조직 및 혈액 내에 존재할 수 있는 티올레이트 음이온, 예를 들면, 글루타티온에 의한 공격으로부터 결합을 보호하는 기능을 하고, 이에 의해, 부착된 제제를 표적 부위에 전달하기 전의 접합체의 디커플링(decoupling)을 방지하는 것을 돕는 것으로 생각된다.
다른 많은 공지의 가교-연결 시약 중에서, SMPT 가교-연결 시약은, 기능성 그룹, 예를 들면, 시스테인 또는 1차 아민의 SH(예를 들면, 라이신의 엡실론 아미노 그룹)에 가교-연결하는 능력을 부여한다. 다른 가능한 유형의 가교-연결제로는, 개열가능한 디설파이드 결합, 예를 들면, 설포석신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트를 함유하는 이종-이기능성 광반응성 페닐아지드가 포함된다. N-하이드록시-석신이미딜 그룹은 1차 아미노 그룹과 반응하고, 페닐아지드(광분해시)는 비-선택적으로 임의의 아미노산 잔기와 반응한다.
방해된 가교-연결제에 추가하여, 비-방해된 링커도, 또한, 이와 함께 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 생각되지 않는 다른 유용한 가교-연결제로는, SATA, SPDP, 및 2-이미노티올란이 포함된다(Wawrzynczak & Thorpe, 1987). 이러한 가교-연결제의 사용은 당해 분야에 잘 이해되어 있다. 다른 실시형태는 가요성 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 제4,680,338호는, 아민-함유 중합체 및/또는 단백질과 리간드의 접합체를 생산하는데, 특히, 킬레이터, 약물, 효소, 및 검출가능한 표지 등과의 항체 접합체를 형성하는데 유용한 이기능성 링커를 기술한다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는, 각종 온화한 조건 하에 개열가능한 불안정한(labile) 결합을 함유하는 개열가능한 접합체를 개시한다. 이러한 링커는, 목적하는 제제가, 활성제의 방출을 초래하는 개열을 이용하여 링커에 직접 결합될 수 있다는 점에서 특히 유용하다. 특정 용도로는, 유리 아미노 또는 유리 설프하이드릴 그룹을 단백질, 예를 들면, 항체, 또는 약물에 첨가하는 것을 포함한다.
미국 특허 제5,856,456호는, 폴리펩타이드 구성체를 연결하여 융합 단백질, 예를 들면, 단일쇄 항체를 제조하는데 사용하기 위한 펩타이드 링커를 제공한다. 링커는 약 50개 아미노산 길이 이하이고, 1회 이상의 하전된 아미노산(바람직하게는 아르기닌 또는 라이신), 이어서, 프롤린의 발생을 함유하고, 보다 큰 안정성 및 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는, 각종 면역진단학적 기술 및 분리 기술에 유용한 아미노옥시-함유 링커를 개시한다.
C. 정제
소정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 정제될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된"은, 다른 구성성분으로부터 분리가능한 조성물을 나타내는 것으로 의도되고, 여기서, 단백질은, 단백질의 천연으로 수득가능한 상태에 비해 임의의 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 단백질은, 또한, 단백질이 천연으로 발생할 수 있는 환경으로부터 유리된 단백질을 말한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 명칭은, 단백질 또는 펩타이드가, 예를 들면, 조성물 중의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 그 이상의 단백질을 구성하는 조성물의 주요 구성성분을 형성하는 조성물을 나타낼 것이다.
단백질 정제 기술은 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 이들 기술은 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획에 대한 세포 환경의 조 분획화를 한 수준으로 포함한다. 다른 단백질로부터 폴리펩타이드를 분리하면, 목적하는 폴리펩타이드는, 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 이용하여 추가로 정제되어, 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질함에 이르는 정제)를 달성할 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점 전기영동이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법으로는 암모늄 설페이트, PEG, 및 항체를 이용하거나 가열 변성에 의한 침전, 이어서, 원심 분리에 의한 침전; 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 이러한 기술 및 다른 기술의 조합이 포함된다.
본 발명의 항체의 정제에 있어서, 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 폴리펩타이드를 발현하고 변성 조건을 이용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩타이드는, 폴리펩타이드의 태그된 부분에 결합하는 친화성 컬럼을 이용하여 다른 세포 구성성분으로부터 정제될 수 있다. 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 각종 정제 단계를 수행하는 순서를 변화시킬 수 있거나, 소정 단계는 생략할 수 있고, 여전히, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 제조에 적합한 방법을 얻을 수 있는 것으로 생각된다.
보통, 완전한 항체는, 항체 Fc 부분에 결합하는 제제(즉, 단백질 A)를 이용하여 분획화된다. 대안으로, 항원을 이용하여 적절한 항체를 동시에 정제하고 선택할 수 있다. 이러한 방법은 종종 지지체, 예를 들면, 컬럼, 필터, 또는 비드에 결합된 선택 제제를 이용한다. 항체는 지지체, 제거된(예를 들면, 세척되어 제거된) 오염물질, 및 적용 조건(염, 가열 등)에 의해 방출된 항체에 결합된다.
단백질 또는 펩타이드의 정제의 정도를 정량하기 위한 각종 방법은 본 개시를 고려하여 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다. 이들은, 예를 들면, 활성 분획의 특이적 활성을 측정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩타이드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 다른 방법은, 분획의 특이적 활성을 계산하여 이것을 처음 추출물의 특이적 활성에 대해 비교하고, 이로써 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용된 실제 단위는, 물론, 정제에 따라 선택된 특정 검정 기술, 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출가능한 활성을 나타내는지에 의존할 것이다.
폴리펩타이드의 이동은, 때때로, 상이한 조건의 SDS/PAGE를 이용하여 유의하게 변할 수 있는 것으로 공지되어 있다(Capaldi et al., 1977). 따라서, 상이한 전기영동 조건 하에, 정제되거나 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량이 변할 수 있음이 이해될 것이다.
D. 치료학적 제제 또는 진단학적 제제에 대한 항체의 접합
한 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 질환의 진단 및 치료요법에 사용하기 위해 각종 시약에 링크될 수 있다. 링킹(linking)은, 익히 공지되어 있는 각종 화학적 반응 및 제제를 이용하여 수행할 수 있고, 이들 중 몇몇은 본 문서의 어딘가에 기술되어 있다.
1. 진단 시약
다수의 진단학적/화상화 제제(imaging agent)는, 항체를 포함하는 단백질에의 이들 제제의 부착 방법이 존재하는 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,021,236호; 제4,938,948호; 및 제4,472,509호를 참조하고, 이들 문헌 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다). 사용된 화상화 모이어티는 상자성 이온, 방사성 동위원소, 형광 색소, NMR-검출가능한 물질, 및 X-선 화상화 제제일 수 있다.
상자성 이온의 경우, 당업자는 한 예로서 이온, 예를 들면, 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III), 및/또는 에르븀(III)을 언급할 수 있고, 가돌리늄이 특히 바람직하다. 다른 상황, p를 들면, X-선 화상화에 유용한 이온으로는 란타늄(III), 금(III), 납(II), 및 특히 비스무트(III)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
치료학적 및/또는 진단학적 적용을 위한 방사성 동위원소의 경우, 당업자는 아스타틴2 11, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99 m 및/또는 이트륨90을 언급할 수 있다. 125I는 종종 소정 실시형태에서 사용하기에 바람직하고, 테크니슘99 m 및/또는 인듐111도, 또한, 이들의 낮은 에너지 및 긴 범위 검출에의 적합성으로 인하여 바람직하다. 본 발명의 방사성 표지된 수용체는, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 방법에 따라 생산될 수 있다. 예를 들면, 수용체는, 나트륨 및/또는 칼륨 요오드화물 및 화학적 산화제, 예를 들면, 차아염소산 나트륨, 또는 효소적 산화제, 예를 들면, 락토퍼옥시다제와의 접촉에 의해 요오드화될 수 있다. 본 발명에 따른 TcR은, 리간드 교환 프로세스에 의해, 예를 들면, 퍼테크네이트(pertechnate)를 주석 함유 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스(Sephadex) 컬럼 상에 킬레이트화하고, 이 컬럼에 항체를 가함으로써, 테크니튬99 m으로 표지화될 수 있다. 대안으로, 직접적인 표지화 기술은, 예를 들면, 퍼테크네이트, 환원제, 예를 들면, SNCl2, 완충액, 예를 들면, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액, 및 항체를 항온배양함으로써 사용될 수 있다. 항체에 대한 금속 이온으로서 존재하는 방사성 동위원소를 결합시키는데 종종 사용되는 중재적 기능성 그룹은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
형광성 표지들 중에서, 알렉사(Alexa) 350, 알렉사 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 케스케이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5, 6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그라핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드(Texas Red)는, 접합체로서 사용하기 위해 고려된다.
2. 치료학적 시약
다양한 치료학적 제제가 본 발명의 항체에 링크되게 하였다. 예를 들면, 상기 논의된 방사성 동위원소는 진단학적 상황에서 유용하지만, 또한, 치료학적 제제로서도 사용될 수 있다. 또한, 화학 치료제도 항체에 접합될 수 있으며, 이들로는 시스플라틴(CDDP), 카르보플라틴, 프로카르바진, 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드(VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 겜시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 저해제, 트랜스플래티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 메토트렉세이트가 포함된다.
다른 클래스의 치료학적 제제는 독소이다. 콜레라 독소, 보툴리즘 독소, 백일해 독소, 리신 A 및 B 쇄뿐만 아니라 다른 천연 또는 합성 독소도 고려된다.
사이토카인 및 림포카인은, 본 발명의 TcR에 커플링될 수 있는 또 다른 클래스의 치료학적 제제이고, 이들로는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, TNFα, GM-CSF, INFα, IFNβ, 및 IFNγ가 포함된다.
다른 실시형태에서, 소염제는, 항체에 접합될 수 있는 치료학적 제제로서 고려된다. 소염제로는 NSAID, 스테로이드, 라파마이신, 인플릭시마브, 및 온타크(ontak)가 포함된다. 면역 억제제로는 FK-506 및 사이클로스포린 A가 포함된다.
TLR 효능제는, 예를 들면, 분자의 Fc 부분을 통해 항체에 링크될 수 있다. TLR의 효능제는, 면역 시스템을 자극하거나 "공격하는(turn on)" 화합물이다. TLR9에 대한 천연 효능제는, 박테리아 및 바이러스에 공통된 DNA의 구성성분이다. TLR 7 및 TLR 8에 대한 천연 효능제는, 바이러스에서 발견되는 RNA의 패턴이다. 이들의 천연 DNA 및 RNA 효능제의 인식 후, TLR 7, 8, 및 9는 각각 상이한 캐스케이드의 보호 면역 반응을 개시한다. TLR 효능제로는 올리고데옥시뉴클레오타이드, 히알루론산 단편, 이미퀴모드, 라벤두스틴 C, 지질 A, 로록시빈(loroxibine), LPS, 모노포스포릴 리프다(lipda) A, 미리스티신, 레시퀴모드, 에스 . 티피무리움(S. typhimurium) 플라겔린, HKLM, PAM3CSK4, 및 폴리I:C가 포함된다.
IV. 핵산 및 발현
A. 항체 암호화 핵산
본 발명의 한 양상에서, 항체 중쇄 및 경쇄, 가변 및 불변 도메인의 각종 부분을 암호화하는 핵산이 제공된다. 핵산 절편은 게놈 DNA, 상보성 DNA(cDNA), 또는 합성 DNA로부터 유도될 수 있다. 발현 벡터로의 포함이 바람직한 경우, 핵산은, 또한, 천연 인트론, 또는 다른 유전자로부터 유도된 인트론 뿐만 아니라 다른 비-암호화(예를 들면, 조절성) 및 암호화 영역(예를 들면, 링커)도 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "DNA"는, 주형으로서 메신저 RNA(mRNA)를 사용하여 제조된 DNA를 나타내는 것으로 의도된다. 게놈 DNA, 또는 게놈, 비- 또는 부분적으로-프로세싱된 RNA 주형으로부터 중합된 DNA와는 대조적으로, cDNA를 이용하는 것의 이점은, cDNA가, 주로, 상응하는 단백질의 암호화 서열을 함유한다는 점이다.
용어 "재조합체"는 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드의 명칭과 함께 사용될 수 있고, 일반적으로, 시험관내에서 조작되거나 핵산 분자로부터 생산되는 폴리펩타이드, 또는 이러한 분자의 복제된 생성물인 폴리펩타이드를 말한다. 재조합체 벡터 및 단리된 핵산 절편은 항체-암호화 영역 자체, 염기 암호화 영역에 선택된 변경 또는 변형을 지니는 암호화 영역을 다양하게 포함할 수 있거나, 이들은, 비-항체 영역을 포함하는 보다 큰 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "핵산"으로는 단일-가닥 및 이중-가닥 분자뿐만 아니라 DNA, RNA, 화학적으로 변형된 핵산 및 핵산 유사체도 포함된다. 본 발명의 범위 내의 핵산은, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 275, 약 300, 약 325, 약 350, 약 375, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 525, 약 550, 약 575, 약 600, 약 625, 약 650, 약 675, 약 700, 약 725, 약 750, 약 775, 약 800, 약 825, 약 850, 약 875, 약 900, 약 925, 약 950, 약 975, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1750, 약 2000, 약 2250, 약 2500, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 잔기 길이로 이루어질 수 있는 것으로 생각된다.
항체는, 적절한 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호 3, 60, 5, 8, 9, 10 (중쇄 CDR 1, 2, 및 3; 경쇄 CDR 1 및 2, 3/JK), 및 중쇄 CDR들 및 각각 중쇄 CDR 1, 2, 및 3의 업스트림을 플랭킹하는 프레임워크 영역 1, 2, 및 3을 포함하는, 서열번호 16, 및 경쇄 CDR들 및 각각 경쇄 CDR 1, 2, 및 3의 업스트림을 플랭킹하는 프레임워크 영역 1, 2, 및 3을 포함하는, 서열번호 19 또는 20 내의 적절한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는 것으로 생각된다. 바람직한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산의 고안 및 생산은, 표준화된 코돈 표(표 4)를 이용하여 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, 각각의 아미노산을 암호화하기 위해 선택된 코돈은, 목적하는 숙주 세포에서의 핵산의 발현을 최적화하도록 변형될 수 있다. 용어 "기능적으로 등가인 코돈"은, 본원에서, 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈, 예를 들면, 아르기닌 또는 세린에 대한 6개의 코돈을 나타내고, 또한, 생물학적으로 등가인 아미노산을 암호화하는 코돈을 나타내는 것으로 사용된다. 다양한 종의 숙주 세포에 대한 코돈 선호도는 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 사람에서 사용하기에 바람직한 코돈은 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다(Wada et al., 1990). 또한, 다른 유기체에 대한 코돈 선호도도 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다(Wada et al., 1990, 이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다).
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B. 핵산 발현
원핵생물- 및/또는 진핵생물-기반 시스템을 이용하여 핵산 서열, 또는 이들의 동족 폴리펩타이드, 단백질, 및 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 본 발명은, PR-1/HLA-A2에 결합하는 항체를 생산하기 위해 이러한 발현 시스템을 사용하는 것을 고려한다. 하나의 강력한 발현 기술은 곤충-세포/배큘로바이러스 시스템을 사용한다. 곤충-세포/배큘로바이러스 시스템은, 예를 들면, 둘 다 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,871,986호, 및 제4,879,236호에 기술되어 있는 이종 핵산 절편의 높은 수준의 단백질 발현을 생산할 수 있고, 곤충-세포/배큘로바이러스 시스템은, 예를 들면, INVITROGEN®으로부터의 상표명 MAXBAC® 및 CLONTECH®로부터의 BACPACKTM 배큘로바이러스 발현 시스템 하에 구입할 수 있다.
또한, 상업적으로 그리고 광범위하게 이용가능한 다수의 다른 발현 시스템이 존재한다. 이러한 시스템의 한 예는, 합성 에크디손-유도가능한 수용체, 또는 이의 pET 발현 시스템, 이. 콜라이 발현 시스템을 포함하는, STRATAGENE®의 완전 제어 유도가능한 포유동물 발현 시스템이다. 유도가능한 발현 시스템의 다른 예는, 전장 CMV 프로모터를 사용하는 유도가능한 포유동물 발현 시스템인 T-REXTM(테트라사이클린-조절된 발현) 시스템을 갖는 INVITROGEN®으로부터 입수가능하다. INVITROGEN®은, 또한, 메탄올 자화 효모 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica)에서의 높은 수준의 재조합체 단백질의 생산을 위해 고안되는 피키아 메탄올리카 발현 시스템이라고 칭하는 효모 발현 시스템을 제공한다. 당해 분야 숙련가는, 벡터, 예를 들면, 발현 작제물을 발현시켜 핵산 서열, 또는 이의 동족 폴리펩타이드, 단백질, 또는 펩타이드를 생산하는 방법을 알 것이다.
1. 바이러스 벡터 및 전달
발현 벡터가 세포에 도입될 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 바이러스는, 핵산에 의해 암호화되는 단백질 생성물의 발현을 위한 강력한 도구를 제공한다. 따라서, 본 발명의 소정 실시형태에서, 발현 벡터는, 바이러스, 또는 바이러스 게놈으로부터 유도되는 조작된 벡터를 포함한다. 숙주 세포 게놈을 통합하고 바이러스 유전자를 안정하게 그리고 유효하게 발현하게 하기 위한, 수용체-매개된 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포에 들어가는 소정 바이러스의 능력은, 이들이 포유동물 세포에의 외래 유전자의 전이를 위한 매력적인 후보자가 되게 하였다(Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986). 유전자 벡터로서 사용된 제1 바이러스는, 파포바바이러스(유인원 바이러스 40, 소 유두종 바이러스, 및 폴리오마)(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) 및 아데노바이러스(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986)를 포함하는 DNA 바이러스였다.
아데노바이러스 벡터. 핵산의 전달을 위한 특정 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. 아데노바이러스 벡터는 게놈 DNA에의 통합에 대해 낮은 수용력을 갖는 것으로 공지되어 있지만, 이러한 특징은, 이들 벡터에 의해 제공되는 유전자 전이의 높은 효율에 의해 상쇄된다. "아데노바이러스 발현 벡터"는,
(a) 작제물의 패키징을 지지하는데, 그리고, (b) 궁극적으로, 조직, 또는 조직 내에 클로닝된 세포-특이적 작제물을 발현하는데 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 36kb의 직선상 이중-가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 유전적 구성(genetic organization)을 아는 것은, 7kb 이하의 외래 서열과의 아데노바이러스 DNA의 큰 조각의 치환을 가능하게 한다(Grunhaus and Horwitz, 1992).
AAV 벡터. 아데노바이러스 보조된 형질감염을 이용하여 핵산을 세포에 도입할 수 있다. 아데노바이러스 커플링된 시스템을 이용한 세포 시스템에서 증가된 형질감염 효율이 보고되어 왔다(Kelleher and Vos, 1994; Cotten　et al.,　1992; Curiel, 1994). 아데노-관련 바이러스(AAV)는 본 발명의 백신에 사용하기에 매력적인 벡터 시스템이다(Muzyczka, 1992). AAV는 감염성에 대해 넓은 숙주 범위를 갖는다(Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 1986; Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al., 1988). rAAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 상세한 설명은 미국 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호에 기술되어 있고, 이들은 각각 본원에 인용에 의해 포함된다.
레트로바이러스 벡터. 레트로바이러스는, 숙주 게놈에 이들의 유전자를 통합시켜, 대량의 외래 유전자 물질을 전이시키고, 넓은 범위의 종 및 세포 유형을 감염시키고, 특정 세포주에 패키징되는 레트로바이러스의 능력으로 인하여 백신에서의 유전자 전달 벡터로서의 장래성을 갖는다(Miller, 1992).
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해서, 핵산(예를 들면, 목적하는 항원을 암호화하는 핵산)을 소정 바이러스 서열의 위치의 바이러스 게놈에 삽입하여 복제-결함인 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위해, gag, pol, 및 env 유전자를 함유하지만 LTR이 없고 구성성분을 패키징하는 패키징 세포주를 작제한다(Mann et al., 1983). cDNA를 레트로바이러스 LTR과 함께 함유하고 서열을 패키징하는 재조합 플라스미드를 (예를 들면, 칼슘 포스페이트 침전에 의해) 특정 세포주에 도입하는 경우, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체를 바이러스 입자에 패킹징되게 하고, 이는, 이어서, 배양 배지로 분비된다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann　et al.,　1983). 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전이에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는, 매우 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 요구한다(Paskind et al., 1975).
렌티바이러스는, 보통의 레트로바이러스 유전자 gag, pol, 및 env 이외에 조절성 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호]을 참조한다). 렌티바이러스의 몇몇의 예로는 사람 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2, 및 유인원 면역결핍 바이러스: SIV가 포함된다. 렌티바이러스 벡터는, HIV 독성 유전자를 복합적으로 약화시킴으로써 생성되었고, 예를 들면, 유전자 env , vif , vpr , vpu, 및 nef를 결실시켜 벡터를 생물학적으로 안전하게 하였다.
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 생체내 및 생체외 유전자 전이 및 핵산 서열의 발현 둘 다에 사용할 수 있다. 예를 들면, 패키징 기능, 즉, gag, pol, 및 env뿐만 아니라 rev 및 tat도 지니는 2개 이상의 벡터를 이용하여 적합한 숙주 세포를 형질감염시키는, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는, 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,994,136호에 기술되어 있다. 당업자는, 특정 세포-유형의 수용체에 대해 표적화하기 위해 항체 또는 특정 리간드와의 외피 단백질의 연결에 의해 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 특정 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 다른 유전자와 함께, 목적하는 서열(조절 영역)을 바이러스 벡터에 삽입함으로써, 예를 들면, 벡터가 이제 표적-특이적이다.
다른 바이러스 벡터. 본 발명에서 백신 작제물로서 다른 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 바이러스로, 예를 들면, 백시니아 바이러스(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar　et al.,　1988), 신드비스 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터 유도된 벡터를 사용할 수 있다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 몇몇의 매력적인 특징을 제공한다(Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar　et al.,　1988; Horwich　et al.,　1990). 렌티바이러스는, 또한, 백신 벡터로서 탐구되었다(VandenDriessche et al., 2002).
변형된 바이러스를 이용한 전달. 전달되는 핵산은, 특정 결합 리간드를 발현하도록 조작된 감염성 바이러스 내에 하우징될 수 있다. 따라서, 바이러스 입자는 표적 세포의 동족 수용체에 특이적으로 결합하고, 내용물을 세포에 전달할 것이다. 레트로바이러스 벡터의 특이적 표적화를 가능하게 하도록 고안된 신규한 접근법은, 바이러스 외피에의 락토스 잔기의 화학적 첨가에 의한 레트로바이러스의 화학적 변형에 근거하여 개발되었다. 이러한 변형은, 시알로당단백질 수용체를 통한 간세포의 특이적 감염을 허용할 수 있다.
레트로바이러스 외피 단백질에 대한, 그리고, 특정 세포 수용체에 대한 비오티닐화된 항체를 사용한, 재조합 레트로바이러스의 표적화의 다른 접근법이 고안되었다. 항체는, 스트렙트아비딘을 이용함으로써 비오틴 구성성분을 통해 커플링시켰다(Roux　et al.,　1989). 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I 및 클래스 II 항원에 대한 항체를 이용하여, 이들은, 시험관내에서 동종 지향성 바이러스로 이들 표면 항원을 뚫는 다양한 사람 세포의 감염을 입증하였다(Roux　et al.,　1989).
2. 비-바이러스성 핵산 전달
본 발명의 조성물의 발현을 유효화하기 위한 핵산 전달에 적합한 비-바이러스성 방법은, 사실상, 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 또는 당해 분야 숙련가 중 하나에게 공지되어 있는 바와 같이, 핵산(예를 들면, DNA)이 세포 소기관, 세포, 조직, 또는 유기체에 도입될 수 있는 임의의 방법을 포함하는 것으로 생각된다. 이러한 방법으로는, 예를 들면, 마이크로인젝션(Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 제5,789,215호, 본원에 인용에 의해 포함됨)을 포함하는 주사에 의한(미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호, 및 제5,580,859호, 각각 본원에 인용에 의해 포함됨); 전기천공에 의한(미국 특허 제5,384,253호, 본원에 인용에 의해 포함됨); 칼슘 포스페이트 침전에 의한(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe　et al.,　1990); DEAE-덱스트란, 이어서, 폴리에틸렌 글리콜의 이용에 의한(Gopal, 1985); 직접적인 음파 부하에 의한(Fechheimer et al., 1987); 리포솜 매개된 형질감염에 의한(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); 미세발사체 충격(microprojectile bombardment)에 의한(PCT 출원 제WO 94/09699호 및 제95/06128호; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호, 및 제5,538,880호, 각각 본원에 인용에 의해 포함됨); 실리콘 카바이드 섬유와의 교반에 의한(Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 제5,302,523호, 및 제5,464,765호, 각각 본원에 인용에 의해 포함됨); 또는 원형질체의 PEG-매개된 형질전환에 의한(Omirulleh et al., 1993; 미국 특허 제4,684,611호, 및 제4,952,500, 각각 본원에 인용에 의해 포함됨); 건조(desiccation)/저해-매개된 DNA 흡수에 의한(Potrykus et al., 1985) DNA의 직접적 전달이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 기술의 적용을 통해 이들 세포 소기관(들), 세포(들), 조직(들), 또는 유기체(들)를 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시킬 수 있다.
V. 암, 또는 과형성 또는 이형성 장애의 진단을 위한 항체
본 발명의 실시형태에서, 암, 예를 들면, 백혈병(예를 들면, AML, CML, MDS)뿐만 아니라 골수 이형성 장애를 진단하는 방법이 제공된다. 골수 이형성증(MDS)은, 골수가 정상적으로 기능하지 않고 불충분한 수의 정상 혈액 세포를 생산하는 장애의 그룹을 나타낸다. MDS는, 적혈구 세포, 혈소판, 및 백혈구 세포를 포함하는, 임의의, 그리고, 가끔 모든 혈액 세포의 생산에 영향을 미친다(혈구 감소증). 소아 골수 이형성증의 약 50%는, 5개 유형의 MDS로 분류될 수 있다: 불응성 빈혈, 환상 철적혈모구(ring sideroblast)를 갖는 불응성 빈혈, 과량의 모구(blast)를 갖는 불응성 빈혈, 형질전환시 과량의 모구를 갖는 불응성 빈혈, 및 만성 골수 단구성 백혈병. 나머지 50%는, 전형적으로, 단리되거나 조합된 혈구 감소증, 예를 들면, 빈혈, 백혈구 감소증, 및/또는 혈소판 감소증(낮은 혈소판 수)을 나타낸다. MDS는, 비록 만성이지만, 진행하여 환자의 약 30%에서 급성 골수성 백혈병(AML)이 된다.
또한, 고형 종양 암도 본 발명에 따른 진단에 고려된다. 이러한 암은 폐암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 폐에서의 전-신생물성 병변, 결장암, 흑색종, 및 방광암이다. 양성 과증식성 질환을 포함하는 다른 과형성, 신생물성, 및 이형성 질환은, 또한, 본원에 기술되어 있는 진단 절차의 범위 내이다.
A. 진단 시약의 투여
진단 시약의 투여는 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 달성되는 진단에 따라 다를 것이다. 예를 들면, 별개의 종양 덩어리(mass) 또는 덩어리들이 화상화되는 경우, 국소적 또는 부위적 투여(예를 들면, 종양 혈관구조에서, 국소적 림프 시스템 또는 국소적 동맥 또는 정맥)를 이용할 수 있다. 대안으로, 당업자는 진단 시약을 부위적으로 또는 전신적으로 제공할 수 있다. 이는, 전체 사지(limb) 또는 유기체의 화상화를 원하는 경우, 공지의 특정 종양 덩어리가 확인된 경우, 또는 전이가 의심되는 경우의 선택 경로일 수 있다.
B. 주사가능한 조성물 및 제형
본 발명에 따른 약제의 전달을 위한 한 방법은 전신적이다. 그러나, 본원에 개시되어 있는 약제학적 조성물은, 대안으로, 비경구, 정맥내, 피부내, 근육내, 경피, 또는 심지어 미국 특허 제5,543,158호; 미국 특허 제5,641,515호, 및 미국 특허 제5,399,363호(이들 문헌은 각각 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 구체적으로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같이 복강내 투여될 수 있다.
약제의 주사는, 제제가 주사에 필요한 특정 게이지(gauge)의 바늘(needle)을 통과할 수 있는 한, 시린지 또는 용액의 주사에 사용되는 임의의 다른 방법에 의해 이루어질 수 있다. 용액을 수용하기 위한 앰플 챔버(ampule chamber)를 정의하는 노즐, 및 전달 부위에 상기 노즐로부터 용액을 밀어내기 위한 에너지 장치를 갖는, 신규한 무바늘(needleless) 주사 시스템이 기술되어 있다(미국 특허 제5,846,233호). 또한, 임의의 깊이로 정확하게 소정량의 용액을 다중 주사하는 것을 허용하는, 유전자 치료요법에 사용하기 위한 시린지 시스템도 기술되어 있다(미국 특허 제5,846,225호).
유리 염기로서의 활성 화합물 또는 약리학적으로 허용되는 염의 용액은, 계면활성제, 예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조할 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 중에서, 그리고, 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상의 보관 및 사용 조건 하에, 이들 제제는, 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 주사가능한 용도에 적합한 약제학적 형태로는, 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다(미국 특허 제5,466,468호, 이 문헌은 이의 전문이 본원에 인용에 의해 구체적으로 포함된다). 모든 경우에 있어서, 상기 형태는 멸균이어야만 하고, 용이한 주사능력(syringability)이 존재하는 정도로 유동성이어야만 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야만 하고, 미생물, 예를 들면, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야만 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균성 및 항진균성 제제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 및 티메로살 등에 의해 유발될 수 있다. 다수의 경우에 있어서, 등장성 제제, 예를 들면, 당 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는, 조성물 중의 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유발될 수 있다.
수용액으로의 비경구 투여를 위해, 예를 들면, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야만 하고, 액체 희석제는, 우선 충분한 염수 또는 글루코스를 이용하여 등장성이 되게 하여야만 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하, 종양내, 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시를 고려하여 당해 분야 숙련가에게 공지될 것이다. 예를 들면, 한 용량은, 1ml의 등장성 NaCl 용액 중에 용해되어, 1000ml의 피하주입(hypodermolysis) 유체에 첨가되거나 주입이 제안된 부위에 주사될 수 있다(예를 들면, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580]을 참조한다). 치료되는 대상체의 상태에 따라 용량 중의 몇몇의 변동이 필연적으로 발생할 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은, 어떠한 경우에도, 개별 대상체에 대해 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 사람 투여에 관해서, 제제는, 생물학적 표준의 FDA국에 의해 요구되는 바와 같은, 무균성, 발열원성, 일반적 안전성, 및 순도 표준을 충족시켜야만 한다.
멸균 주사가능한 용액은, 적절한 용매 중에 활성 화합물을 요구량으로, 필요에 따라, 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 포함시키고, 이어서, 여과 멸균시킴으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은, 염기성 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클에, 각종 멸균된 활성 성분들, 및 상기 열거된 성분들 유래의 요구되는 다른 성분들을 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 조제를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 조제 방법은, 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 수득하는, 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
본원에 개시되어 있는 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염으로는 산성 부가염(단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성됨)이 포함되고, 이는 무기산, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 및 만델산 등으로 형성된다. 유리 카르복실 그룹으로 형성된 염은, 또한, 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2 철, 및 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 및 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은, 용량 제형화와 적합한 방식으로, 그리고, 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 각종 용량형, 예를 들면, 주사가능한 용액, 및 약물 방출 캡슐 등으로 쉽게 투여된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "담체"로는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 및 콜로이드 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 성분과 부적합한 한에 있어서를 제외하고, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 또한, 보충 활성 성분도 조성물에 포함될 수 있다.
어구 "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은, 사람에게 투여되는 경우에 알레르기성 반응 또는 유사한 부반응(untoward reaction)을 생산하지 않는, 분자 실체(molecular entities) 및 조성물을 나타낸다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 조제는 당해 분야에 잘 이해되어 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조되고; 주사하기 전에 액체의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다.
VI. 치료학적 방법
A. 암 및 과형성/이형성/신생물 질환
본 발명의 항체는, 암을 포함하는 과형성/이형성/신생물 질환/병태를 치료하는 방법에서 사용할 수 있다. 본 발명의 펩타이드로 치료될 것으로 고려되는 질환병태의 유형으로는 백혈병, 예를 들면, AML, MDS, 및 CML뿐만 아니라 골수 이형성증도 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 암의 다른 유형으로는 폐암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 자궁 경부암, 위장암, 림프종, 폐에서의 전-신생물성 병변, 결장암, 흑색종, 방광암, 및 임의의 다른 신생물성 질환이 포함될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 사용하여, 세포를 사멸시키거나, 세포 성장을 저해하거나, 전이를 저해하거나, 종양/조직 크기, 종양 세포 부담을 감소시키거나, 그렇지 않으면 종양 세포의 악성 표현형을 역전시키거나 감소시키기 위해서, 당업자는, 일반적으로, 과형성/신생물성/암 세포를 치료학적 화합물, 예를 들면, 보통 약제학적으로 허용되는 완충액 또는 담체(상기 진단학적 제제의 논의를 참조한다)에 분산된, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리펩타이드 또는 발현 작제물과 접촉시킬 것이다. 투여의 경로는 자연히 병변의 위치 및 특성에 따라 다를 것이고, 이로는 예를 들면, 피부내, 경피, 비경구, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 피부경유(percutaneous), 척수강내, 복강내, 종양내, 관류, 세척(lavage), 직접 주사, 및 경구 투여 및 제형화가 포함된다. 암의 치료 또는 진단과 관련하여 논의되는 임의의 제형 및 투여 경로는, 또한, 신생물성 질환 및 신생물성 병태와 관련하여 사용될 수 있다. 환자의 신체(특정하게 또는 보다 큰 세포 집단의 일부로서) 외부에서 종양 세포가 치료/되는 생체외 실시형태가 고려된다.
종양내 주사 또는 종양 혈관구조에의 주사는, 별개의 고형의 접근가능한 종양에 대해 특정하게 고려된다. 또한, 국소적, 부위적, 또는 전신적 투여가 적절할 수 있다. 4cm 초과의 종양에 대해서, 투여되는 체적은 약 4 내지 10ml일 것이고, 한편, 4cm 미만의 종양에 대해서는 약 1 내지 3ml의 체적이 사용될 것이다. 단일 용량으로서 전달되는 다중 주사는 약 0.1 내지 약 0.5ml의 체적을 포함한다. 바이러스 입자는 대략 1cm 간격으로의 공간을 둔 종양에의 다중 주사를 투여함으로써 유리하게 접촉될 수 있다.
외과적 중재의 경우에 있어서, 본 발명은, 수술시에 그리고/또는 그 후에 잔류 질환 또는 전이성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 절제된 종양층에는, 항체를 포함하는 제형이 주사되거나 관류될 수 있다. 관류는, 예를 들면, 수술 부위에 이식삽입된(implanted) 카테터를 남겨둠으로써 절제-후 계속될 수 있다. 또한, 수술-후 주기성 치료도 계획된다.
연속적 투여는, 적절한 경우에, 예를 들면, 종양을 잘라내고, 종양층을 치료하여 잔류 현미경적 질환을 제거하는 경우에 적용될 수 있다. 시린지 또는 카테터법을 통한 전달이 바람직하다. 이러한 연속적 관류는 약 1 내지 2hr로부터 약 2 내지 6hr, 약 6 내지 12hr, 약 12 내지 24hr, 약 1 내지 2일, 약 1 내지 2wk, 또는 그 이상까지의 기간 동안 발생할 수 있고, 이어서, 치료를 개시한다. 일반적으로, 연속적 관류를 통한 치료학적 조성물의 용량은, 관류가 발생하는 동안의 기간에 걸쳐 조정되는, 단일 또는 다중 주사에 의해 제공되는 것과 등가일 것이다. 특히, 흑색종 및 육종의 치료에 있어서 사지 관류를 이용하여 본 발명의 치료학적 조성물을 투여하는 것이 추가로 고려된다.
치료 용법도 다를 수 있고, 치료 용법은 종종 종양 유형, 종양 위치, 질환 진행, 및 환자의 건강 및 연령에 의존한다. 분명하게, 어떠한 유형의 종양은 보다 공격적인 치료를 요구할 것이고, 한편, 동시에 어떠한 환자는 보다 힘든 프로토콜을 견딜 수 없다. 임상의는, 치료학적 제형의 공지의 효능 및 독성(존재하는 경우)에 근거하여 이러한 결정을 내리는 것이 가장 적합할 것이다.
소정 실시형태에서, 치료되는 종양은 적어도 처음으로 절제되는 것이 아닐 수 있다. 치료는, 가장자리의 수축으로 인하여, 또는 소정 부분, 특히, 침습 부분의 제거에 의해 종양의 절제성(resectability)을 증가시킬 수 있다. 치료에 따라, 절제가 가능해질 수 있다. 절제에 후속하는 추가의 치료는, 종양 부위에서의 현미경적 잔류 질환을 제거하도록 작용할 것이다.
원발성 종양 또는 절개-후 종양층에 대한 치료의 전형적인 과정은 다중 용량을 포함할 것이다. 전형적인 원발성 종양 치료는 2-주 기간에 걸친 6-용량의 적용을 포함한다. 2-주 용법을 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 그 이상 반복할 수 있다. 치료의 과정 동안, 계획된 투약을 완료할 필요성은 재-평가될 수 있다.
B. 병용 치료요법
또한, 제2 항암제가 포함되는 경우, 병용 치료요법을 사용하는 것이 유리함을 입증할 수 있다. 항암제는, 예를 들면, 암 세포를 사멸시키거나, 암 세포의 아폽토시스를 유도하거나, 암 세포의 성장률을 감소시키거나, 전이의 발생률 또는 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 저해하거나, 종양 또는 암 세포에의 혈액 공급을 감소시키거나, 암 세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키거나, 암의 진행을 예방 또는 저해하거나, 암을 지닌 대상체의 수명을 증가시킴으로써 대상체의 암에 부정적 영향을 미칠 수 있다. 항암제로는 생물학적 제제(생물 치료요법), 화학 치료요법제, 및 방사선 치료요법제가 포함된다. 보다 일반적으로, 이들 기타 조성물은, 세포를 사멸시키거나 세포의 증식을 저해하는데 유효한 조합량으로 본 발명에 따른 치료요법과 함께 제공될 수 있다. 이러한 프로세스는, 세포를 동시에 두 제제(들)와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는, 두 제제를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형과 세포를 접촉시킴으로써, 또는 2개의 별개의 조성물 또는 제형을 동시에 세포와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.
대안으로, 치료요법은, 분 내지 주의 범위의 간격으로, 다른 제제 치료에 선행하거나 이에 후속할 수 있다. 다른 제제가 세포에 별도로 적용되는 실시형태에서, 당업자는, 일반적으로, 제제 및 발현 작제물이 세포에 대한 병용 효과를 여전히 유리하게 발휘할 수 있도록, 각각의 전달 시점 사이에 상당한 기간이 만료되지 않았음을 확실히 할 것이다. 이러한 예에서, 당업자는, 세포를 두 모달리티(modality)와 서로 약 12 내지 24h 내에, 보다 바람직하게는 서로 6 내지 12h 내에 접촉시킬 수 있음이 고려된다. 몇몇의 상황에서, 치료 기간을 유의하게 연장시키는 것이 바람직할 수 있지만, 여기서, 각각의 투여 사이에는 수일(2, 3 4, 5, 6, 또는 7일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주) 기간이 걸린다.
각종 조합을 사용할 수 있고; 예를 들면, 항체 치료요법(접합된 치료학적 제제의 존재 또는 부재)은 "A"이고, 2차 항암 치료요법은 "B"이다:
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환자에의 본 발명의 치료학적 제제의 투여는, 항체 치료의 독성이 존재하는 경우 항체 치료의 독성을 고려하여, 특정 2차 치료요법의 투여를 위한 일반적 프로토콜에 따를 것이다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것으로 예상된다. 또한, 각종 표준 치료요법뿐만 아니라 외과적 중재도, 기술되어 있는 암 치료요법과 병용하여 적용될 수 있는 것으로 생각된다.
1. 화학 치료요법
암 치료요법은, 또한, 화학 및 방사선 기반 치료 둘 다와의 다양한 병용 치료요법을 포함한다. 병용 화학 치료요법으로는, 예를 들면, 시스플라틴(CDDP), 카르보플라틴, 프로카르바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로소우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드(VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 겜시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스페라제 저해제, 트랜스플래티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 메토트렉세이트, 테모졸로미드(수성 형태의 DTIC), 또는 상기의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체가 포함된다. 생물학적 치료요법과 화학 치료요법의 병용은 생화학 치료요법으로서 공지되어 있다. 본 발명은, 암을 치료하거나 예방하기 위한 당해 분야에서 사용될 수 있거나 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 화학 치료제를 고려한다.
2. 방사선 치료요법
DNA 손상을 야기하고 광범위하게 사용되어 온 다른 인자로는, γ-선, X-선으로서 알려져 있는 것, 및/또는 종양 세포에의 방사성 동위원소의 직접적인 전달이 포함된다. 또한, 다른 형태의 DNA 손상 인자로는, 예를 들면, 마이크로파 및 UV-방사선이 고려된다. 이들 인자의 전부는, DNA에 대한, DNA의 전구체에 대한, DNA의 복제 및 수복(repair)에 대한, 그리고, 염색체의 어셈블리(assembly) 및 유지에 대한 넓은 범위의 손상에 영향을 미칠 가능성이 크다. X-선에 대한 용량 범위는, 연장된 기간(3 내지 4wk) 동안 50 내지 200뢴트겐의 1일 용량으로부터 2000 내지 6000뢴트겐의 단일 용량까지의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 광범위하게, 그리고, 방사성 동위원소의 반감기, 방사되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 흡수에 의존하여 변한다.
용어 "접촉된" 및 "노출된"은, 세포에 적용되는 경우, 본원에서, 프로세스에 의해 치료학적 작제물 및 화학 치료제 또는 방사선 치료제가 표적 세포에 전달되거나, 표적 세포와 직렬 배치(direct juxtaposition)로 위치되는, 프로세스를 기술하는 것으로 사용된다. 세포 사멸 또는 정체(stasis)를 달성하기 위해, 두 제제를, 세포를 사멸시키거나 세포가 분열하는 것을 방지하는데 유효한 조합량으로 세포에 전달한다.
3. 면역 치료요법
면역 치료제는, 일반적으로, 암 세포를 표적화하여 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 면역 이펙터는, 예를 들면, 종양 세포의 표면 상의 몇몇의 마커에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독이 치료요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나, 또는 항체 단독은, 다른 세포를 동원하여 세포 사멸에 실제로 영향을 미칠 수 있다. 또한, 항체는 약물 또는 독소(화학 치료제, 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어 단지 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안으로, 이펙터는, 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 지니는 림프구일 수 있다. 각종 이펙터 세포로는 세포독성 T-세포 및 NK 세포가 포함된다. 치료학적 모달리티의 조합, 즉, 직접적인 세포독성 활성 및 포르틸린의 저해 또는 감소는 암의 치료시 치료학적 이점을 제공할 것이다.
또한, 면역 치료요법은 병용 치료요법의 부분으로서 사용할 수 있다. 병용 치료요법에 대한 일반적인 접근법은 하기에 논의된다. 면역 치료요법의 한 양상에서, 종양 세포는, 표적화할 수 있는, 즉, 대다수의 다른 세포 상에 존재하지 않는 몇몇의 마커를 가져야만 한다. 다수의 종양 마커가 존재하고, 이들 중 어느 하나는 본 발명의 맥락에서의 표적화에 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커로는 암배아성 항원, 전립선 특이적 항원, 요도 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B, 및 p155가 포함된다. 면역 치료요법의 대안의 양상은, 면역 자극 효과를 갖는 항암 효과이다. 사이토카인, 예를 들면, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예를 들면, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들면, FLT3 리간드를 포함하는 면역 자극 분자도 존재한다. 단백질로서, 또는 mda-7과 같은 종양 억제제와 병용하여 유전자 전달을 이용하여, 면역 자극 분자를 병용하는 것은, 항-종양 효과를 향상시키는 것으로 밝혀졌다(Ju et al., 2000).
앞서 논의된 바와 같이, 현재 조사되고 있거나 사용되고 있는 면역 치료요법의 예로는 면역 보강제(예를 들면, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물)(미국 특허 제5,801,005호; 미국 특허 제5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), 사이토카인 치료요법(예를 들면, 인터페론, 및; IL-1, GM-CSF, 및 TNF)(Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998, Hellstrand et al., 1998), 유전자 치료요법(예를 들면, TNF, IL-1, IL-2, p53)(Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국 특허 제5,830,880호, 및 미국 특허 제5,846,945호), 및 모노클로날 항체(예를 들면, 항-강글리오시드 GM2, 항-HER-2, 항-p185)(Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; 미국 특허 제5,824,311호)가 있다. 헤르셉틴(트라스투주맙)은, HER2-neu 수용체를 차단하는 키메라 (마우스-사람) 모노클로날 항체이다. 이는 항-종양 활성을 갖고, 악성 종양의 치료에의 사용에 대해 승인되었다(Dillman, 1999). 헤르셉틴 및 화학 치료요법과의 암의 병용 치료요법은 개별 치료요법보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 하나 이상의 항암 치료요법은, 본원에 기술되어 있는 종양-관련 HLA-제한된 펩타이드 치료요법과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.
양자 면역 치료요법. 양자 면역 치료요법에서, 환자의 순환성 림프구, 또는 종양 침윤된 림프구는 시험관내에서 단리되고, 림포카인, 예를 들면, IL-2에 의해 활성화되거나, 종양 괴사를 위한 유전자로 형질도입되고, 재투여된다(Rosenberg et al., 1988; 1989). 이를 달성하기 위해, 당업자는 동물, 또는 사람 환자에게 활성화된 림프구의 면역학적 유효량을, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 보강제-포함된 항원성 펩타이드 조성물과 병용하여 투여할 것이다. 활성화된 림프구는, 가장 바람직하게는 혈액 또는 종양 샘플로부터 미리 단리되고 시험관내에서 활성화된(또는 "확장된") 환자 자신의 세포일 수 있다. 이러한 형태의 면역 치료요법은 몇몇 사례의 흑색종 및 신장 암종의 퇴행(regression)을 초래하였지만, 반응자의 백분율은, 반응하지 않은 환자에 비하여 적었다.
수동적 면역 치료요법. 암의 수동적 면역 치료요법을 위한 다수의 상이한 접근법들이 존재한다. 이들은 광범위하게 하기로 분류될 수 있다: 항체 단독의 주사; 독소 또는 화학 치료제에 커플링된 항체의 주사; 방사성 동위원소에 커플링된 항체의 주사; 항-이디오타입 항체의 주사; 그리고, 마지막으로, 골수에서의 종양 세포의 축출(purging).
바람직하게, 사람 모노클로날 항체는 환자에서 적은 부작용을 생산하거나 부작용을 생산하지 않으므로, 사람 모노클로날 항체를 수동적 면역 치료요법에 사용한다. 그러나, 이들의 적용은 이들의 부족함에 의해 다소 한정되고, 지금까지 병변내로만 투여되어 왔다. 강글리오시드 항원에 대한 사람 모노클로날 항체는, 피부 재발성 흑색종을 앓고 있는 환자에게 병변내 투여되어 왔다(Irie & Morton, 1986). 매일 또는 매주의 병변내 주사에 따라 10명의 환자 중 6명에서 퇴행이 관찰되었다. 다른 연구에서, 2개의 사람 모노클로날 항체의 병변내 주사로부터 중간 정도의 성공이 달성되었다(Irie et al., 1989). 가능한 치료학적 항체로는 항-TNF, 항-CD25, 항-CD3, 항-CD20, CTLA-4-IG, 및 항-CD28이 포함된다.
2개의 상이한 항원에 대해 지정된 1개 초과의 모노클로날 항체, 또는 다중 항원 특이성을 갖는 항체를 투여하는 것이 선호될 수 있다. 또한, 치료 프로토콜은, 문헌[Bajorin et al. (1988)]에 기술되어 있는 바와 같이 림포카인 또는 다른 면역 증진제의 투여를 포함할 수 있다. 사람 모노클로날 항체의 발달은 본 명세서의 다른 곳에서 추가로 상세하게 기술된다.
4. 유전자 치료요법
또 다른 실시형태에서, 2차 치료는, 종양-관련 HLA-제한된 펩타이드가 투여되기 전에, 종양-관련 HLA-제한된 펩타이드가 투여된 후에, 또는 종양-관련 HLA-제한된 펩타이드가 투여됨과 동시에, 치료학적 폴리뉴클레오타이드가 투여되는, 유전자 치료요법이다. 종양-관련 HLA-제한된 펩타이드를 암호화하는 벡터를, 하기 유전자 생성물 중 하나를 암호화하는 제2 벡터와 함께 전달하는 것은, 표적 조직에 대해 병용 항-과증식성 효과를 가질 것이다. 대안으로, 두 유전자를 암호화하는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 다양한 단백질이 본 발명에 포함되고, 이들 중 몇몇은 하기에 기술된다. 본 발명과 병용하여 몇몇 형태의 유전자 치료요법에 대해 표적화될 수 있는 각종 유전자는, 당해 분야 숙련가에게 공지될 것이고, 암에 관련된 임의의 유전자를 포함할 수 있다.
세포 증식의 유도물질. 세포 증식을 유도하는 단백질은, 추가로, 기능에 따라 각종 카테고리로 나뉜다. 이들 단백질 모두의 공통점은, 세포 증식을 조절하는 이들 단백질의 능력이다. 예를 들면, PDGF 형태인 sis 종양 유전자는, 분비된 성장 인자이다. 종양 유전자는, 성장 인자를 암호화하는 유전자에서 드물게 발생하고, 현재, sis는 유일한 공지의 천연-발생 종양 유전자 성장 인자이다. 본 발명의 한 실시형태에서, 세포 증식의 유도물질의 발현을 방지하기 위해, 세포 증식의 특정 유도물질에 대해 지정된 안티-센스 mRNA를 사용하는 것이 고려된다.
단백질 FMS, ErbA, ErbB, 및 neu는 성장 인자 수용체이다. 이들 수용체에 대한 돌연변이는, 조절가능한 기능의 손실을 초래한다. 예를 들면, Neu 수용체 단백질의 막관통(transmembrane) 도메인에 영향을 미치는 점 돌연변이는 neu 종양 유전자를 초래한다. erbA 종양 유전자는, 갑상선 호르몬에 대한 세포내 수용체로부터 유도된다. 변형된 종양 유전자 ErbA 수용체는, 내인성 갑상선 호르몬 수용체와 경쟁하여 제어되지 않은 성장을 야기하는 것으로 생각된다.
최대 클래스의 종양 유전자는 신호 전달 단백질(예를 들면, Src, Abl, 및 Ras)을 포함한다. 단백질 Src는 세포질 단백질-티로신 키나제이고, 몇몇의 경우, 이의 원발성-종양 유전자로부터의 종양 유전자로의 형질전환은 티로신 잔기 527에서의 돌연변이를 통해 초래된다. 대조적으로, 한 예에서, 원발성 종양 유전자로부터 종양 유전자로의 Pase 단백질 ras의 형질전환은, 서열 내의 아미노산 12에서의 발린으로부터 글리신으로의 돌연변이로부터 초래되어 ras GTPase 활성을 감소시킨다. 단백질 Jun, Fos, 및 Myc는, 전사 인자로서의 핵 기능에 대한 이들의 효과를 직접적으로 발휘하는 단백질이다.
세포 증식의 저해물질. 종양 억제제 종양 유전자는, 과도한 세포 증식을 저해하도록 기능한다. 이들 유전자의 불활성화는 이들의 저해 활성을 파괴하여, 조절되지 않은 증식을 초래한다. 가장 흔한 종양 억제제는 Rb, p53, p21, 및 p16이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 유전자로는 APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, C-CAM, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16 융합, 및 p21/p27 융합이 포함된다.
프로그래밍된 세포 사멸의 조절물질. 아폽토시스, 또는 프로그래밍된 세포 사멸은, 성인 조직에서 생체 항상성(homeostasis)을 유지하고 발암(carcinogenesis)을 억제하는 정상 배아 발달에 필수적인 프로세스이다(Kerr et al., 1972). Bcl-2 패밀리의 단백질 및 ICE-유사 프로테아제는, 다른 시스템에서의 아폽토시스의 중요한 조절물질 및 이펙터인 것으로 입증되었다. 여포성 림프종과 관련하여 발견된 Bcl-2 단백질은, 아폽토시스를 제어하고 다양한 아폽토시스성 자극에 반응하여 세포 생존을 향상시키는데 있어서 중요한 역할을 한다(Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986). 현재, 진화적으로 보존된 Bcl-2 단백질은, 사멸 효능제 또는 사멸 길항제로서 분류될 수 있는 관련 단백질의 패밀리의 구성원인 것으로 인식된다.
이의 발견에 후속하여, Bcl-2는, 각종 자극에 의해 유발되는 세포 사멸을 억제하도록 작용한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 현재, 공통 구조 및 서열 상동성을 공유하는, Bcl-2 세포 사멸 조절 단백질의 패밀리가 존재한다는 것이 명백하다. 이들 다양한 패밀리 구성원은, Bcl-2(예를 들면, BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1)와 유사한 기능을 갖거나, 또는 Bcl-2 기능을 상쇄시키고 세포 사멸을 촉진하는 것(예를 들면, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri)으로 밝혀졌다.
5. 외과술
암을 지닌 환자의 대략 60%는, 예방성, 진단성, 병기 확인성(staging), 치유성 및 증상 완화성(palliative) 외과술을 포함하는 소정 유형의 외과술을 경험할 것이다. 치유성 외과술은, 다른 치료요법, 예를 들면, 본 발명의 암 치료, 화학 치료요법, 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법, 면역 치료요법, 및/또는 대안의 치료요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.
치유성 외과술은, 암의 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되고/제거되거나, 절개되고/절개되거나, 파괴되는 절제를 포함한다. 종양 절제는, 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 말한다. 종양 절제에 추가하여, 외과술에 의한 치료는 레이저 외과술, 냉동 외과술, 전기 외과술, 및 현미경적으로 제어된 외과술(Mohs' surgery: 모스 수술)을 포함한다. 본 발명은 표재성 암, 전암, 또는 부수적인 양의 정상 세포의 제거와 함께 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
암의 세포, 조직, 또는 종양 모두의 부분의 절개시, 신체에 공동(cavity)이 형성될 수 있다. 치료는, 추가의 항암 치료요법과 함께, 관류, 직접적인 주사 또는 환부의 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이들 치료는, 또한, 변하는 용량으로도 이루어질 수 있다.
C. 자가면역 질환
본 발명은, 또한, 본 발명의 항체를 이용한 자가면역 질환의 치료를 고려한다. PR1은 골수성 자기-단백질로부터 유도된다. PR1을 함유하는 프로테이나제(Pr3)는 베게너 육아종증의 자가면역 공격의 표적이다. 미엘로퍼옥시다제(MPO)는, 이들 질환을 지닌 환자에서의 T-세포 및 항체 면역성 둘 다에 대한 증거인 소혈관 혈관염에서의 표적 항원이다(Franssen et al., 1996; Brouwer et al., 1994; Molldrem et al., 1996). 베게너 육아종증은, Pr3에 대한 특이성을 갖는 세포질 항-호중구 세포질 항체(cANCA)의 생산과 관련되어 있고(Molldrem et al., 1997), 한편, 현미경적 다발성 혈관염 및 처르그-스트라우스 증후군은, MPO에 대한 특이성을 갖는 핵주위 ANCA(pANCA)와 관련되어 있다(Molldrem et al., 1999; Savage et al., 1999). 이와 같이, PR1의 면역 세포 인지를 저해하는 것은 자가 면역 질환에 대해 치료학적일 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는, 자가면역 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여되어 다른 자가항체(예를 들면, 프로테이나제 3에 대한 pANCA)의 효과를 중화시킬 것이다. 대안으로, 항체는, "이-특이적"이 되도록, 즉, 하나의 항원은 PR1/HLA-A2이고, 다른 하나의 항원은 DEC-205, LOX-1, RAGE와 같은 수지상 세포 표면 항원인 2개의 항원에 대한 면역학적 특이성을 갖도록 조작되고, 이에 의해 항원 제시에 있어서 수지상 세포의 기능을 차단할 것이다.
1. 혈관염
혈관염은, 혈관 벽의 염증에 의해 야기되는 프로세스이고, 각종 장애를 초래한다. 관여하는 혈관의 크기 또는 유형에 따라 대-, 중-, 또는 소-혈관 혈관염으로서 분류될 수 있지만, 혈관염에 허용되는 분류 시스템은 알려져 있지 않다. 소혈관 혈관염은, 동맥보다 더 작은 혈관(즉, 세동맥, 세정맥, 및 모세혈관)에 영향을 미치는 혈관염으로서 정의되지만; 소-혈관 혈관염은, 또한, 중간-크기의 동맥에 관여할 수 있다. 항-호중구 세포질 항체(ANVA)-관련된 혈관염은 소혈관 혈관염의 가장 흔한 원인이고, 현미경적 다발성 혈관염, 베게너 육아종증, 처르그-스트라우스 증후군, 및 소정 유형의 약물-유도된 혈관염을 포함한다.
베게너 육아종증. 베게너 육아종증은, 상기도(upper respiratory tract)(코, 부비동, 귀), 폐, 및 신장에서 혈관의 염증을 야기하는 드문 장애이다. 신체의 다수의 다른 부위에는, 또한, 모든 사례의 거의 절반에서 발생하는 관절염(관절 염증)이 영향을 미칠 수 있다. 또한, 눈 및 피부에도 영향을 미칠 수 있다. 원인은 알려져 있지 않지만, 베게너 육아종증은 자가면역 장애인 것으로 생각되고, 이는 종종 류마티스 질환 중 하나로서 분류된다. 파괴적 병변은 상기도 및 하기도, 및 신장에서 발병한다. 신장에서, 이들 병변은, 혈뇨(뇨 내의 혈액) 및 신부전을 초래할 수 있는 사구체신염을 야기한다. 이는 대부분 30세 내지 50세 연령에서 종종 발생하고, 남성이 여성의 2배만큼 자주 영향을 받는다. 소아에서는 드물지만, 3개월령만큼 어린 영아에서 나타났다. 신장 질환은, 초기 진단 달 내에 신부전이 발생하여 신속하게 진행할 수 있다. 치료되지 않는 경우, 신부전 및 사멸은, 베게너 육아종증을 지닌 모든 환자의 90% 초과에서 발생한다.
조기 증상으로는 피로, 권태, 열, 및 코 및 부비동 주위의 불편감이 포함될 수 있다. 부비동 또는 귀 감염과 같은 상부 호흡기 감염은 자주 베게너 육아종증의 진단에 선행한다. 다른 상부 호흡기 증상으로는 코피, 통증, 및 코의 입구 주위의 욕창이 포함된다. 명백한 원인이 없는 지속적인 열(측정되지 않은 기원의 열 -- FUO)은 초기 증상일 수 있다. 도한은 열을 수반할 수 있다. 식욕 감퇴 및 체중 손실은 일반적이다. 피부 병변은 일반적이지만, 질환과 관련된 하나의 특징적인 병변은 존재하지 않는다. 신장 질환은, 베게너 육아종증의 확정적인 진단을 하는데 필요하다. 뇨는 혈액이 있을 수 있고, 이는 종종 처음으로 적색 또는 흐린 뇨로 나타난다. 증상이 없을 수 있지만, 실험실 연구로 쉽게 진단된다. 눈 문제는, 상당한 수의 환자에서 발병하고, 안구 및 안구 주위의 조직의 경미한 결막염 내지 중증의 염증의 범위일 수 있다. 추가의 증상으로는 쇠약, 식욕 감퇴, 체중 손실, 비출혈, 부비동의 통증, 부비동염, 코의 입구에서의 그리고 코의 입구 주위에서의 병변, 기침, 객혈, 혈담, 호흡 곤란, 천명, 흉통, 혈뇨, 발진, 및 관절 통증이 포함된다.
정상 조직의 생검 채취에 의해 이루어지는 진단은, 개흉 폐 생검, 상기도 생검, 비점막 생검, 기관지경 생검으로의 기관지 내시경, 신장 생검, 뇨검사, 흉부 x-선, 골수 천자, (자가항체에 대한) 혈액 검사를 포함할 수 있다. 치료제로는 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 또는 아자티오프린이 포함되고, 이는 영향을 받은 사람의 90% 초과에서 장기 관해를 생산할 수 있다.
처르그 -스트라우스 증후군. 알레르기성 육아종증으로서도 알려져 있는 처르그-스트라우스 증후군(CSS)은, 전신성 혈관염의 한 형태이다. CSS는 결절성 다발성 동맥염과 유사하지만, 호산구의 풍부함이 이러한 질병을 구별하였다. 대부분의 CSS 환자는 신규한 또는 증가된 중증도의 천식(천식은 CSS의 기본적인 특징 중 하나이다) 병력을 갖는 중년이다. 천식의 증상은 혈관염의 개시의 훨씬 전에 시작될 수 있다. 다른 조기 증상으로는 비용종 및 알레르기성 비염이 포함된다. 당해 질환은, 종종 60% 정도까지 높게 도달하는 수로 호산구 증가증으로 이행된다. 질환의 다음 상(phase)은, 피부, 폐, 신경, 신장, 및 다른 기관에 관여할 수 있는 명시적인 혈관염이다. 말초 신경 관여는 특히 쇠약성일 수 있고, 이로는 통증, 저림(nnumbness), 사지의 아린감(tingling in extremities)(신경병증/다발성 단신경염)이 포함된다. 치료요법의 출현 이전에, CSS는 종종 치명적 질환이었다. 대다수의 환자들이 만연하는 제어되지 않은 질환으로 사망하였다.
CSS의 원인은 알려져 있지 않지만, 다인성인 것으로 보인다. 유전적 인자가 존재할 수 있지만, CSS는 동일한 가족의 2명의 구성원에서 나타나는 것은 매우 드물다. 따라서, 환경적 인자 및 감염이 당해 원인일 가능성이 더 많지만, 이의 확정적인 증거는 없다. 진단은 특정 조합의 증상 및 증후, 기관 관여의 패턴, 및 소정의 비정상적 혈액 검사(특히, 호산구 증가증)의 존재에 의해 수행된다. 상세한 환자 병력 및 신체 검사 이외에, 혈액 검사, 흉부 X-선 및 다른 유형의 화상 연구, 신경 전도 검사, 및 조직 생검(폐, 피부, 또는 신경)을 수행하여 진단을 보조할 수 있다. CSS 환자로서 분류되기 위해서는, 환자는 하기 6개의 기준 중 적어도 4개를 가져야만 한다: 1) 천식; 2) 호산구 증가증[>10%의 감별 WBC 수]; 3) 단발성 신경병증; 4) 흉부 X-선 상의 일시적 폐의 침윤물; 5) 부비강 이상; 및 6) 혈관외 호산구를 갖는 혈관을 함유하는 생검.
CSS는 일반적으로 프레드니손에 반응한다. 처음으로, 높은 용랴의 경구 프레드니손을 사용하지만, 첫 달 정도 후, 이러한 높은 용량의 프레드니손은 다음 달에 걸쳐 점차 감소된다. 다른 면역 억제성 약물, 예를 들면, 아자티오프린, 셀셉트, 메토트렉세이트, 또는 사이클로포스파미드를 프로드니손 이외에 사용할 수 있다. 높은 용량의 정맥내 스테로이드는, 중증의 질환을 지닌 환자들에게, 또는 다른 치료에 대해 비반응성인 환자들에게 유용할 수 있다. 적절한 치료요법을 이용하면, 증상은 신속하게 해결되기 시작하고, 심장 및 신장 기능의 점진적 개선될 뿐만 아니라 말초 신경 관여를 초래하는 통증이 개선된다. 치료요법은, 환자 반응 및 질환의 지속에 의존하여 1 내지 2년 동안 지속할 수 있다.
2. 크론 질환
크론 질환 증상으로는 장내 감염 및 장 협착과 누공의 발병이 포함되고; 신경병증은 종종 이들 증상을 수반한다. 소염성 약물, 예를 들면, 5-아미노살리실레이트(예를 들면, 메살라민) 또는 코르티코스테로이드가 전형적으로 처방되지만, 항상 효과적인 것은 아니다(V. A. Botoman et al., 1998에서 검토됨). 사이클로스포린을 이용한 면역 억제는 때때로 코르티코스테로이드에 내성이거나(resistant) 코르티코스테로이트 불내증인(tolerant) 환자에게 이롭다(Brynskov et al., 1989).
그럼에도 불구하고, 외과적 교정이 결국 환자의 90%에서 요구되고; 50%는 결장 절제를 경험한다(Leiper et al., 1998; Makowiec et al., 1998). 수술 후 재발률은 높고, 50%는 5년 이내에 추가의 외과술을 필요로 한다(Leiper et al., 1998; Besnard et al., 1998).
크론 질환의 병인에 대한 한 가설은, 유전적 민감성 및 환경적 인자(예를 들면, 흡연)로부터 초래될 가능성이 있는 장내 점막 장벽의 기능부전(failure)이, 면역 시스템을 박테리아 항원 및 식품 항원을 포함하는 장내 강(lumen) 유래의 항원에 노출시킨다는 것이다(예를 들면, Soderholm et al., 1999; Hollander et al., 1986; Hollander, 1992). 다른 가설은, 병원체, 예를 들면, 마이코박테리움 파라투베르큘로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 비정상적 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 또는 파라믹소바이러스에 의한 지속적 장내 감염이 면역 반응을 자극하거나; 대안으로, 증상이, 편재성(ubiquitous) 항원, 예를 들면, 정상 장내 미생물총(microflora), 및 이들이 생산하는 대사물 및 독소에 대한 이상조절된 면역 반응으로부터 초래한다는 것이다(Sartor, 1997). 혈청 중의 IgA 및 IgG 항-사카로마이 세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 항체의 존재는, 소아 크론 질환의 진단에서 높은 것으로 밝혀졌다(Ruemmele et al., 1998; Hoffenberg et al., 1999).
크론 질환에서, 이상조절된 면역 반응은, 세포-매개된 면역 병리학에 편향되어 있다(Murch, 1998). 그러나, 면역 억제성 약물, 예를 들면, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 및 메살라민을 이용하여 크론 질환의 코르티코스테로이드-내성 사례를 치료하여 복합적 성공을 거두었다(Brynskov et al., 1989; Fellerman et al., 1998).
크론 질환에 대한 진단 및 치료 도구를 개발하기 위한 최근의 노력은 사이토카인의 중심 역할에 중점을 두었다(Schreiber, 1998; van Hogezand & Verspaget, 1998). 사이토카인은, 세포-대-세포 상호작용, 세포간 교신(communication), 또는 다른 세포의 거동에 대한 특이적 효과를 갖는, 작은 분비된 단백질 또는 인자(5 내지 20kD)이다. 사이토카인은 림프구, 특히, TH1 및 TH2 림프구, 단핵구, 장내 대식세포, 과립구, 상피 세포, 및 섬유모세포에 의해 생산된다(Rogler & Andus, 1998; Galley & Webster, 1996에서 검토됨). 몇몇의 사이토카인은 전-염증성(예를 들면, TNF-α, IL-1(α 및 β), IL-6, IL-8, IL-12, 또는 백혈병 저해성 인자(LIF))이고; 다른 것들은 소염성(예를 들면, IL-1 수용체 길항제, IL-4, IL-10, IL-11, 및 TGF-β)이다. 그러나, 소정 염증 조건 하에 이들의 효과에 있어서 중첩 및 기능적 가외성(redundancy)이 존재할 수 있다.
크론 질환의 활성 사례에서, 상승된 농도의 TNF-α 및 IL-6이 혈액 순환에 분비되고, TNF-α, IL-1, IL-6, 및 IL-8은 점막 세포에 의해 국소적으로 과량으로 생산된다(Funakoshi et al., 1998). 이들 사이토카인은, 골 발달, 조혈, 및 간, 갑상선, 및 신경 정신병학적 기능을 포함하는 생리학적 시스템에 대한 광범위한 효과를 가질 수 있다. 또한, 크론 질환을 지닌 환자에서 전-염증성 IL-1β에 지지되는 IL-1β/IL-1ra 비의 불균형이 관찰되었다(Rogler & Andus, 1998; Saiki et al., 1998; Dionne et al., 1998; 그러나 S. Kuboyama, 1998을 참조한다). 한 연구는, 대변 샘플에서의 사이토카인 프로파일은 크론 질환에 유용한 진단학적 도구일 수 있음을 시사하였다(Saiki et al., 1998).
크론 질환에 제안된 치료로는 각종 사이토카인 길항제(예를 들면, IL-1ra), 저해제(예를 들면, IL-1β 전환 효소 및 항산화제) 및 항-사이토카인 항체의 사용이 포함된다(Rogler and Andus 1998; van Hogezand & Verspaget, 1998; Reimund et al., 1998; N. Lugering et al., 1998; McAlindon et al., 1998). 특히, TNF-α에 대한 모노클로날 항체는 크론 질환의 치료에 시도되어 소정 성공을 거두었다(Targan et al., 1997; Stack et al., 1997; van Dullemen et al., 1995). 이들 화합물은, 본 발명의 화합물을 이용한 병용 치료요법에 사용할 수 있다.
크론 질환의 치료에 대한 다른 접근법은, 염증 반응을 유발할 수 있는 박테리아 군집(community)을 적어도 부분적으로 근절시키고, 이 박테리아 군집을 비-병원성 군집으로 대체하는 것에 중점을 두었다. 예를 들면, 미국 특허 제5,599,795호는 사람 환자에서의 크론 질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 개시한다. 이들의 방법은, 장관을 하나 이상의 항생제 및 하나 이상의 항진균제로 멸균하여 존재하는 미생물총(flora)을 사멸시키고, 상기 미생물총을, 정상의 사람으로부터 채취한 다양한 엄선된 잘-특징확인된 박테리아로 대체하도록 하였다. 보로디(Borody)는, 존재하는 장내 미생물총을 세척에 의해 적어도 부부적으로 제거하고
질환-스크리닝된 사람 공여자로부터의 분변 접종물(fecal inoculum)에 의해, 또는 박테로이데스(Bacteroides) 및 에스케리키아 콜라이 종을 포함하는 조성물에 의해 도입된 새로운 박테리아 군집으로 대체함으로써 크론 질환을 치료하는 방법을 교시하였다(미국 특허 제5,443,826호). 그러나, 진단 및/또는 치료가 지시될 수 있는 크론 질환의 공지의 원인은 없었다.
3. 류마티스 관절염
RA의 정확한 병인은 미지로 남아 있지만, RA가 자가면역 양상을 갖는 것은 명확하다. 관절 질환의 제1 증후는, 활막 라이닝층에서 활막 섬유모세포의 증식 및 관절 가장자리의 관절면에의 이들의 부착으로 나타난다(Lipsky, 1998). 후속적으로, 대식 세포, T- 세포 및 다른 염증성 세포가 관절에 동원되고, 여기서, 이들은, 사이토카인 인터류킨-1(IL-1)을 포함하는 다수의 매개체를 생산하며, 이는, 골 및 연골 파괴, 및 종양 괴사 인자(TNF-α)를 유도하는 만성 후유증에 기여하고, 이는 염증에서 역할을 행한다(Dinarello, 1998; Burger & Dayer, 1995; van den Berg, 2001). 혈장 중의 IL-1의 농도는 건강한 개체에서보다 RA를 지닌 환자에서 유의하게 더 높고, 현저한 혈장 IL-1 수준은 RA 질환 활성과 상호 관련이 있다(Eastgate et al., 1988). 또한, IL-1의 활막액 수준은 RA의 각종 방사선 사진 및 조직학적 특징과 상호 관련이 있다(Kahle et al., 1992; Rooney et al., 1990).
정상 관절에서, 이들 및 기타 전염증성 사이토카인의 효과는, 각종 소염성 사이토카인 및 조절성 인자에 의해 평형을 이룬다(Burger & Dayer, 1995). 이러한 사이토카인 평형의 유의성은, 온종일 열이 주기적으로 증가하는 소아 RA 환자에서 실증된다(Prieur et al., 1987). 열의 각각의 피크 후, IL-1의 효과를 차단하는 인자가 혈청 및 뇨에서 발견된다. 이러한 인자를 단리하고, 클로닝하여, IL-1 유전자 패밀리의 구성원인 IL-1 수용체 길항제(IL-1ra)로서 동정하였다(Hannum et al., 1990). IL-1ra는, 이의 명칭과 같이, 유형 I IL-1 수용체에 결합하기 위해 IL-1과 경쟁하고, 그 결과, IL-1의 효과를 차단하는 천연 수용체 길항제이다(Arend et al., 1998). IL-1을 효율적으로 차단하기 위해 10-배 내지 100-배 과량의 IL-1ra가 필요할 수 있지만; RA를 지닌 환자로부터 단리된 활막 세포는 IL-1의 효과를 상쇄시키는데 충분한 IL-1ra를 생산하는 것으로 밝혀지지 않는다(Firestein et al., 1994; Fujikawa et al., 1995).
4. 전신성 홍반성 낭창
전신성 홍반성 낭창(SLE)은, 조직 손상을 유도하는 자가항체 및 면역 복합체의 조직에서의 침착을 특징으로 하는 자가면역 류마티스성 질환이다(Kotzin, 1996). 자가면역 질환, 예를 들면, MS 및 1형 진성 당뇨병과 대조적으로, SLE는, 잠재적으로 다중 기관 시스템에 직접적으로 관여하고, 이의 임상학적 징후는 다양하고 가변적이다(Kotzin & O'Dell, 1995에 의해 검토됨). 예를 들면, 몇몇의 환자들은 처음에 피부 발진 및 관절 통증을 보이고, 자발적 관해를 나타내고, 의약을 거의 요구하지 않을 수 있다. 범위의 다른 말단에, 높은 용량의 스테로이드 및 세포독성 약물, 예를 들면, 사이클로포스파미드를 이용한 치료요법을 필요로 하는 중증 및 진행성 신장 관여를 보이는 환자가 존재한다(Kotzin, 1996).
SLE, 및 입수가능한 1차 진단 시험의 혈청학적 특징은, 세포 핵의 구성 요소, 예를 들면, 이중-가닥 DNA(dsDNA), 단일-가닥 DNA(ss-DNA), 및 크로마틴에 비해 상승된 IgG 항체의 혈청 수준이다. 이들 자가 항체들 중에서, IgG 항-dsDNA 항체는 낭창 사구체신염(G N)의 발병에서 주요 역할을 행한다(Hahn & Tsao, 1993; Ohnishi et al., 1994). 사구체신염은, 신장의 혈액을 정제하는 사구체의 모세혈관벽이 사구체 기저막의 상피 면 상의 부착에 의해 두꺼워지는 심각한 병태이다. 질환은 종종 만성 및 진행성이고, 결국 신부전을 유도할 수 있다.
메커니즘에 의해 이들 자가면역 질환에서 자가 항체가 유도되는 메커니즘은 불명확하게 남아 있다. 진단 및/또는 치료가 지시될 수 있는 SLE의 공지의 원인은 없지만, 치료는, 근본적인 원인보다는 예를 들면, 매크롤라이드 항생제를 이용하여 면역 반응을 억제하도록 지시되었다. (예를 들면, 미국 특허 제4,843,092호).
5. 소아 류마티스 관절염
어린이에서의 관절염의 가장 일반적인 형태의 용어인 소아 류마티스 관절염(JRA)은, 활막 멤브레인의 만성 염증 및 비대증을 특징으로 하는 질병의 패밀이에 적용된다. 당해 용어는, 유럽에서 소아 만성 관절염 및/또는 소아 특발성 관절염으로서 언급되는 질병의 패밀리와 중복되지만, 완전하게 동의어는 아니다.
Jarvis(1998) 등(Arend, 2001)은, 성인 및 어린이에서의 류마티스 질환의 발병이 선천성 및 후천성 면역 사이의 복합 상호작용을 포함한다는 것을 제안하였다. 이러한 복합성은, 질환 발병을 밝히는 것의 곤란함의 중심에 있다. 선천성 및 후천성 면역 시스템 둘 다는, 세포 표면 및 분비된 단백질의 광대한 어레이인 다중 세포 유형, 및 양성 및 음성 피드백의 상호 연결된 네트워크를 사용한다(Lo et al., 1999). 또한, 생각으로 분리가능하지만, 면역 시스템의 선천성 및 후천성 윙(wing)은 기능적으로 교차하고(Fearon & Locksley, 1996), 이들 교차점에서 발생하는 병리 사건은 성인 및 아동기 형태의 만성 관절염의 발병의 발명자들의 이해와 고도로 관련되는 경향이 있다(Warrington, et al., 2001).
다발 관절성 JRA는, 손의 소관절을 포함하는 다중 관절(4개 이상)에서의 염증 및 활막 증식을 특징으로 하는 별개의 임상학적 서브타입이다(Jarvis, 2002). JRA의 이러한 서브타입은, 이의 다중 관절 관여 및 시간에 따라 신속하게 진행하는 이의 능력 둘 다로 인하여 작용될 수 있다. 임상학적으로 별개인 다발 관절성 JRA는 동종은 아니지만, 환자는, 질환 징후, 개시 연령, 예후, 및 치료학적 반응이 다르다. 이들 차이는, 이러한 질환에서 발생할 수 있는 면역 및 염증성 공격의 특성의 변화의 스펙트럽을 반영하는 것으로 보인다.
6. 쇼그렌 증후군
원발성 쇼그렌 증후군(SS)은 만성의 서행 전신성 자가면역 질환이고, 원발성 쇼그렌 증후군은 아동기를 포함한 모든 연령에서 나타날 수 있지만, 이는 대개 중년 여성에게 영향을 미친다(여성 대 남성 비 9:1)(Jonsson et al., 2002). 이는, 림프구 침윤 및 외분비선의 파괴를 특징으로 하고, CD4+, CD8+ 림프구 및 B-세포를 포함하는 단핵구 세포에 의해 침윤된다(Jonsson et al., 2002). 또한, 환자의 1/3에서 선외(전신성) 징후가 나타난다(Jonsson et al., 2001).
선상(glandular) 림프구 침윤은 진행성 특징이고(Jonsson et al., 1993), 선상 림프구 침윤은, 광범위한 경우, 기관의 대부분을 대체할 수 있다. 흥미롭게도, 몇몇 환자에서의 선상 침윤물은 타액선에서의 이소성 림프구 미세구조(이소성 배중심으로 나타냄)와 매우 비슷하다(Salomonsson et al., 2002; Xanthou & Polihronis, 2001). SS에서, 이소성 GC는, 여포성 수지상 세포 및 활성화된 내피 세포의 네트워크를 이용하여 증식하는 세포의 T 세포 및 B 세포 응집물로서 정의된다. 표적 조직 내에 형성된 이들 GC-유사 구조는, 또한, 자가 항체(항-Ro/SSA 및 항-La/SSB)의 생산으로 기능적 특성을 나타낸다(Salomonsson &, Jonsson, 2003).
다른 전신성 자가면역 질환, 예를 들면, RA에서, 이소성 GC에 중요한 인자는 동정되어 있다. GC를 갖는 류마티스성 활막 조직은 케모카인 CXCL13, CCL21 및 림프독소(LT)-β(여포성 중심 및 맨틀(mantle) 존 B 세포 상에서 검출됨)를 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이들 분석물의 다변량 회귀 분석은, CXCL13 및 LT-β를, 류마티스성 활막염에서의 GC를 예측하는 단 하나의 사이토카인으로서 동정하였다(Weyand & Goronzy, 2003). 최근, 타액선에서의 CXCL13 및 CXCR5는, B-세포 및 T-세포를 동원함으로써 염증 프로세스에서 필수적인 역할을 하고, 따라서, SS에서의 림프구 신생 및 이소성 GC 형성에 기여하는 것으로 밝혀졌다(Salomonsson & Larsson, 2002).
7. 건선
건선은, 미국 인구의 2 내지 2.6%, 또는 5.8 내지 7.5백만명에게 영향을 미치는 스케일링(scaling) 및 염증의 만성 피부 질환이다. 당해 질환은 모든 연령 그룹에서 발생하지만, 이는 주로 성인에게 영향을 미친다. 이는 남성 및 여성에서 대략 동등하게 나타난다. 건선은, 피부 세포가 성숙될 기회를 갖기 전에 피부의 표면 아래의 이들의 기원으로부터 빠르게 발생하여 표면 상에 쌓이는 경우에 발생한다. 일반적으로, 이러한 동작(전환(turnover)이라고도 칭함)은 대략 1개월이 걸리지만, 건선에서는 수일 내에 발생할 수 있다. 건선의 전형적인 형태에서, 건선은, 은색의 각질로 덮힌 두꺼운 적색(염증이 생긴) 피부의 패치를 초래한다. 때때로 플라크(plaque)로서도 나타내는 이들 패치는, 일반적으로 가렵고 아픈 느낌이 난다. 이들 대부분은 종종 팔꿈치, 무릎, 다리의 다른 부분, 두피, 등 아래부분, 얼굴, 손바닥, 및 발바닥에서 발생하지만, 이들은 신체의 어디에서나 피부 상에서 발생할 수 있다. 당해 질환은, 또한, 손톱, 발톱, 및 생식기 및 입 내부의 연조직에도 영향을 미칠 수 있다. 건선은, 갈라지는 환부 관절 주위의 피부에 대해 드문 것은 아니지만, 건선을 지닌 대략 1백만명의 사람들은, 관절염의 증상을 생성시키는 관절 염증을 경험한다. 이러한 병태는 건선성 관절염이라고 칭한다.
건선은, 특히, T-세포에 관여하는 면역 시스템에 의해 유도되는 피부 장애이다. 건선에서, T-세포는 실수에 의한 작용으로 표현되고, 매우 활성이 되어 이들이 다른 면역 반응을 유발하며, 이는 피부 세포 상의 염증 및 신속한 전환을 초래한다. 약 1/3의 사례에서, 건선의 가족 병력이 존재한다. 연구자들은 건선에 의해 영향을 받은 다수의 가족을 연구하였고, 질환과 관련된 유전자를 동정하였다. 건선을 지닌 사람들은, 이들의 피부가 더 나빠지고, 이어서, 개선되는 시간이 존재함에 주목할 수 있다. 플레어 업(flareup)을 야기할 수 있는 병태로는, 감염, 스트레스, 및 피부를 건조하게 하는 기후 변화가 포함된다. 또한, 고혈압에 대해 처방되는, 리튬 및 베타 차단제를 포함하는 소정 의약은, 질환의 발생을 유발하거나 질환을 악화시킬 수 있다.
8. 다발성 경화증
다발성 경화증(MS)은, 계속해서 미국에서만 매해 수십만명이, 그리고, 전세계적으로 백만명이 걸리는 심각한 건강 문제이다. 다발성 경화증은, 중추 신경계(뇌 및 척수)의 가장 흔한 질환 중 하나이다. MS는 탈수초, 또는 수초(myelin sheath)의 손실과 관련된 염증성 병태이다. 신경을 절연시키는 지방성 물질인 미엘린은, 신경이 한 포인트(point)에서 다른 포인트로 충격을 전송하도록 하는데 있어서 절연체로서 작용한다. MS에서, 미엘린의 손실은, 뇌에 그리고 뇌로부터 전기적 충격을 전도하는 신경의 능력의 파괴를 수반하고, 이는 각종 MS의 증상, 예를 들면, 시각, 근육 조화능력(muscle coordination), 강도, 감각, 언어 능력 및 연하(swallowing), 방광 제어, 성적 및 인지 기능의 손상을 생성시킨다. 미엘린이 손실되는 플라크 또는 병변은, 경화된 흉터-유사 부위로서 나타난다. 이들 흉터는 상이한 시점에, 그리고, 뇌 및 척수의 상이한 부위에 나타나므로, 용어 "다발성" 경화증은 문자 그대로 많은 흉터를 의미한다.
현재, MS의 결정적인 진단을 제공하는 단일 실험실 시험, 증상, 또는 신체적 발견은 존재하지 않는다. 상황을 복잡하게 하는 MS의 증상은, 광범위한 다른 질환, 예를 들면, 급성 파종성 뇌척수염, 라임 질환, HIV-관련된 척수병증, HTLV-I-관련 척수병증, 신경매독, 진행성 다소성 백질 뇌병증, 전신성 홍반성 낭창, 결절성 다발 동맥염, 쇼그렌 증후군, 베체트 질환, 유육종증, 부신생물성 증후군, 척수의 아급성 연합 변성, 아급성 척수-시신경병증, 부신 척수 신경병증, 척수 소뇌 증후군, 유전성 경직성 하반신 마비/원발성 측삭 경화증, 뇌졸중, 종양, 동정맥 기형, 지주막 낭종, 아놀드-키아리(Arnold-Chiari) 기형, 및 경부 척추증과 쉽게 혼동될 수 있다. 결과적으로, MS의 진단은, MS와 일치하는 발견을 입증하고, 또한, 따른 사례들을 배제하는 프로세스에 의해 이루어져야만 한다.
일반적으로, MS의 진단은 2개의 기준에 의존한다. 첫째로, 적어도 1개월 간격으로 2회의 공격이 있어야만 한다. 악화, 플레어(flare), 또는 재발로서도 공지되어 있는 공격은, 24시간 이상 지속하는 MS 증상 또는 증상들의 갑작스러운 출현 또는 악화이다. 둘째로, 중추 신경계 수초에 1개 초과의 손상 부위가 존재해야만 한다. 수초에의 손상은 1회 초과의 시점에서 발생해야만 하고, 탈수초 또는 유사한 신경학적 증상을 야기할 수 있는 임의의 다른 질환에 의해 야기되어야만 한다. MRI(자기 공명 영상화)는 현재 MS에 의해 야기되는 플라크 또는 흉터의 존재를 검출하기 위한 뇌를 영상화하는 바람직한 방법이다.
그러나, MS의 진단은 MRI에만 기초하여 이루어질 수 없다. 다른 질환들은, MS에 의해 야기되는 병변과 유사한 뇌에서의 비교할만한 병변을 야기할 수 있다. 또한, MRI에 의한 뇌 병변의 외형은 때때로 유사한 뇌 또는 척수 종양에서도 상이한 환자에서 상당이 이종성일 수 있다. 또한, 정상 MRI 스캔은, 확인된 MS를 지닌 소수의 환자들이 MRI 상에서 뇌의 임의의 병변을 나타내지 않으므로, MS의 진단을 배제하지 않는다. 이들 개체는, 종종 척수 병변 또는 MRI에 의해 검출될 수 없는 병변을 갖는다. 그 결과, 철저한 임상 실험은 또한 환자 병력 및 기능적 시험을 포함한다는 것이 중요하다. 이는 정신적, 감정적, 및 언어 기능, 동작 및 조화능력, 시력, 균형, 및 오감의 기능을 포함해야만 한다. 성별, 출생지, 가족 병력, 및 증상이 처음 시작되었을 때 사람의 연령도, 또한, 중요한 고려사항이다. 떠오르는 잠재력(중추 신경계 실행 시간의 지연을 드러낼 수 있는 전기적 진단 연구), 뇌척수액(클로날-확장된 면역글로불린 유전자 탐색), 및 혈액(다른 원인들을 배제하기 위함)을 포함하는 다른 시험이 소정 사례에서 요구될 수 있다.
D. 병용 치료요법
상기 열거된 면역 장애에 대한 병용 치료요법도 고려된다. 이러한 치료요법은, 표준 치료요법, 예를 들면, 본 발명의 치료학적 방법과 함께 사용되는 소염제 및 면역 억제제를 포함할 것이다. 이러한 표준 치료요법은, 대상체에서 질환을 야기하는 면역 세포에 부정적 영향을 미치거나 이러한 질환의 증상을 완화시킬 수 있을 것이다. 이러한 프로세스는, 동시에 제제(들) 둘 다를 갖는 세포 또는 대상체를 접촉시킴을 포함할 수 있다. 이는, 제제 둘 다를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형으로, 또는 동시에 2개의 별개의 조성물들 또는 제형들로 달성될 수 있다. 대안으로, 항체 치료요법은, 분 내지 주 범위의 간격으로, 다른 제제 치료에 선행하거나 다른 제제 치료에 후속할 수 있다.
각종 조합을 사용할 수 있고; 예를 들면, 항체 치료요법(접합된 치료제의 존재 또는 부재)은 "A"이고, 2차 면역 질환 치료요법은 "B"이다:
Figure 112015014195088-pct00004
환자에게의 본 발명의 치료제의 투여는, 항체 치료요법의 독성이 존재하는 경우 독성을 고려하여 특정 2차 치료요법의 투여를 위한 일반적인 프로토콜에 따를 것이다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것임이 예측된다. 또한, 각종 표준 치료요법뿐만 아니라 외과적 중재도, 기술되어 있는 치료요법과 병용하여 적용할 수 있음이 고려된다.
VII. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태들을 입증하기 위해 포함된다. 이어지는 실시예에 개시되어 있는 기술은, 본 발명의 실행시 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서, 이의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하도록 고려될 수 있음이 당해 분야 숙련가에 의해 이해되어야만 한다. 그러나, 당해 분야 숙련가는, 본 개시를 고려하여, 개시되어 있는 특정 실시형태에서 다수의 변화가 이루어질 수 있음을 이해하고, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 여전히 동일하거나 유사한 결과를 수득한다.
실시예 1: 방법들
항체 생산. 조합된 PR1/HLA-A*0201 에피토프에 대항하는 항체를 수득하기 위해서, 본 발명자들은, BALB/c 마우스를 재조합 PR1/HLA-A*0201 단량체를 이용하여 피하(SQ) 및 복강내(IP) 경로를 통해 2주 간격으로 3회 면역화시켰다. 면역화된 동물로부터 비장 세포를 단리하였고, B 세포는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 이용하여 HGPRT 음성의 불멸화된 골수종 세포와 융합시켰다. 이어서, pp65/HLA-A*0201 및 PR1/HLA-A*0201 단량체를 이용하여 하이브리도마 세포를 선택하였고, 단일 세포 클로닝을 위해 96-웰 플레이트에 위치시켰다.
항체 스크리닝 및 특성 확인. ELISA에 의해 PR1/HLA-A*0201 단량체를 이용하여 모노클로날 세포주(약 20,000)를 스크리닝하여 양성 항체-분비 하이브리도마를 동정하였다. 8F4 하이브리도마는, PR1/HLA-A*0201에 대한 특이성을 이용하여 ELISA에 의해 동정하였고, 이소형-특이적 항체 및 면역글로불린 경쇄 항체를 이용하여 특성 확인하였다.
항체 클로닝, 서열 분석 및 결합 연구. 8F4 중쇄를 하이브리도마 cDNA로부터 클로닝하였고, 1차 서열을 수득하였다. HLA-A*0201 중쇄 + β-2 마이크로글로불린을 이용한, 각각의 P1 내지 P9 위치에서의 Ala 치환을 함유하는, 변경된 PR1 펩타이드를 폴딩함으로써, 에피토프 맵핑을 수행하였다. PR1/HLA-A*0201에 대한 8F4의 결합 친화도는, 불멸화된 8F4 및 증가하는 농도의 가용성 PR1/HLA-A*0201을 이용한 Biacore 기기에 대한 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다. FACS 분석 및 공초점 영상화를 이용하여 정상 및 비정상 세포에 대한 8F4의 결합을 연구하였다.
항체 활성. AML에 대한 8F4의 결합이 세포 용해를 유발하는지를 측정하기 위해, 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 및 보체-의존적 세포독성(CDC) 검정을 수행하였다. 8F4 CDC-매개된 용해에 민감성인 것으로 밝혀진 환자 물질 유래의 AML 세포를 8F4 또는 이소형 대조군의 존재 또는 부재시 항온배양하였고, 이어서, 방사선 조사된(200cGy) 면역 결핍 HLA-A2 형질전환 NOD/SCID 마우스에 전이시켰다. 2주째에 동물을 희생시켰고, 비장 세포 및 골수를 FACS에 의해 분석하였다.
총 RNA 단리. minelut 컬럼과 Qiagen RNA easy 키트를 사용하였다. RNA 로딩 완충액은 하기와 같이 제조하였다: (키트 내) 1X TAE, RNAse 불포함 H2O 중의 100㎕의 10x DNA 로딩 염료, 1% 아가로스에 1㎕의 에티듐 브로마이드(EtBr)(10mg/ml)를 첨가한다. 지침은 하이브리도마 세포의 "동결된 바이알 또는 1 내지 5 x 106의 생세포이다. 활성 배양물이 입수가능한 경우, 단계 4에서와 같은 15ml 코니칼 튜브 중의 펠렛 1 내지 5 x 106 생세포를 단계 5로 진행시킨다. 동결된 세포만이 입수가능한 경우, 1 바이알의 하이브리도마 세포를 37℃에서 해동시키고, 해동 후 즉시 수욕으로부터 제거하고, 약하게 혼합한다. 바이알을 70% 에탄올로 닦고, 스레드(thread)에 닿지 않도록 주의하여 캡을 연다. 15ml의 완전 배지를 함유하는 15ml의 코니칼 튜브에 바이알의 내용물을 이동시킨다. 5분 동안 100xg(저속 Sorvall 원심분리에 대해 약 1,000rpm) 원심분리한다. 회전 동안에, RLT 완충액의 소 분취량에 b-메르캅토에탄올을 첨가한다. 10ml 피펫을 이용하여 세포로부터 모든 배지를 주의 깊게 제거한다. Qiashredder를 이용하여 완충액 RLT 중에 세포 펠렛을 용해시키고, RNA 단리를 위한 Qiagen 프로토콜에 따른다. 출발 세포량(6-웰 유래인 경우, 1 x 13㎕로 용출시킨다)에 따라 2X의 15㎕ RNAse 불포함 dH2O를 이용하여 minelut 컬럼으로부터 RNA를 용출시킨다. RNA는 하기 절차들에 걸쳐 빙상에서 유지해야만 한다. 1㎍/ml의 EtBr을 함유하는 1% 아가로스 미니겔(minigel)을 붓고, 15분의 고화 시간 동안 RNA를 정량한다. 블랭크로서 상기 동일한 RNAse 불포함 H2O를 이용하여, 분광 광도계를 이용하여 2㎕ RNA를 정량한다. RNA 농도를 계산한다: (A260)(40) - ㎍/ml. A260/280 비는 1.6 초과여야만 한다. 1X RNA 로딩 완충액의 총 체적 10㎕ 중의 1% 아가로스 미니겔 상에 1ug을 흘림으로써 RNA의 품질을 확인한다. 약 1 인치를 겔에 흘린다. 겔을 광 기록문서 시스템(photo documentation system) 상에서 분석한다. 고품질 RNA의 밴딩 패턴은, 강도에 있어서 2:1의 이상적 비율로의 별도의 28s 및 18s 리보솜 RNA 밴드로 특성 확인한다. 1:1의 비는 허용될 수 있지만; 밴드 부재 또는 겔의 저면의 스미어(smear)는 RNA 분해의 지표이고, 이러한 RNA는 사용되지 않아야만 함"을 나타낸다.
하이브리도마 유래의 재배열된 Ig 가변 영역(V) 유전자의 단리 및 서열 분석. V 중쇄(VH) 및 V 경쇄(VL) 유전자로부터 DNA 서열을 수득하기 위해, cDNA 말단(RACE) PCR의 신속한 증폭을, 중쇄 불변 영역 프라이머 또는 경쇄 불변 영역 프라이머와 함께 병용하여 사용하였다. BD Smart TM RACE cDNA 증폭 키트(BD Bioscience)를 이용하여 5'RACE cDNA 증폭을 수행하였고, 이와 함게 제공된 지침서에 따랐다. PFU ultra(Stratagene), Universla 프라이머 A 믹스(UPM), 및 사람 IgG H&L 불변 영역에 대한 유전자 특이적 프라이머(GSP)를 이용하였다.
5' RACE PCR 생성물의 클로닝 및 DNA 서열분석은 TOPO 클로닝 키트(Invitrogen) 및 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하였다. IgG L에 관해, 미니프렙 및 EcoRI 소화에 의한 스크린을 위해 8개의 콜로니를 단리하였다. M13 rev 및 T7 프라이머를 이용하여 6개의 양성 클론을 서열분석하였다. IgG에 관해, 미니프렙 및 EcoRI 소화에 의한 스크린을 위해 8개의 콜로니를 단리하였다. M13 rev 및 T7 프라이머를 이용하여 6개의 양성 클론을 서열분석하였다.
실시예 2: 결과
항체 생산. 조합된 PR1/HLA-A*0201 에피토프에 대항하는 항체를 수득하기 위해서, 본 발명자들은, BALB/c 마우스를 재조합 PR1/HLA-A*0201 단량체를 이용하여 피하(SQ) 및 복강내(IP) 경로를 통해 2주 간격으로 3회 면역화시켰다. 면역화된 동물로부터 비장 세포를 단리하였고, B 세포는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 이용하여 HGPRT 음성의 불멸화된 골수종 세포와 융합시켰다. 이어서, pp65/HLA-A*0201 및 PR1/HLA-A*0201 단량체를 이용하여 하이브리도마 세포를 선택하였고, 단일 세포 클로닝을 위해 96-웰 플레이트에 위치시켰다.
항체 스크리닝 및 특성 확인. ELISA에 의해 PR1/HLA-A*0201 단량체로 모노클로날 세포주를 스크리닝하여 양성 항체-분비 하이브리도마를 동정하였다. 거의 2,000개의 하이브리도마를 스크리닝하였고, 하나의 더빙된(dubbed) 8F4를, PR1/HLA-A*0201에 대한 특이성을 이용하여 ELISA에 의해 동정하였다. 8F4 하이브리도마는, 이소형-특이적 항체 및 면역글로불린 경쇄 항체를 이용하여 특성 확인하였고, 단일 IgG2a-κ PR1/HLA-A*0201-특이적 항체를 분비하는 것으로 나타났다.
항체 결합 평가. HLA-A*0201 중쇄 + β2 마이크로글로불린을 이용한, 각각의 P1 내지 P9 위치에서의 Ala 치환을 함유하는, 변경된 PR1 펩타이드를 폴딩함으로써, 에피토프 맵핑을 수행하였다. 모든 아미노산 위치의 변경이 결합을 파괴하였지만, P1이 8F4 결합에 가장 중요한 것으로 밝혀졌다(도 1). PR1/HLA-A*0201에 대한 8F4의 결합 친화도는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 불멸화된 8F4 및 증가하는 농도의 가용성 PR1/HLA-A*0201을 이용한 Biacore 기기에 대한 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다. 8F4 KD는, HLA-A*0201 상의 별도의 대립 유전자-특이적 부위를 인식하는 상업적으로 입수가능한 BB7.2 뮤린 모로클로날 항체에 대한 162nM의 KD와 비교하여 9.9nM이다. 공초점 현미경을 이용하여, 8F4의 직접적 형광성 접합체만이, (HLA-A*0201을 발현하는) PR1 펩타이드-펄싱된 T2 세포에 결합하였지만, 상관없는 pp65-펄싱된 T2 세포 또는 비-펄싱된 T2 세포에는 결합하지 않았다. 이를 종합하여 고려하면, 조합된 PR1/HLA-A*0201에 대한 8F4 특이성, 및 조합된 PR1/HLA-A*0201에 대한 높은 8F4 결합 친화도가 확인되었다. (재차 8F4, FITC-접합된 BB7.2 항-HLA-A*0201 항체, 및 DAPI로의) FACS 분석 및 공초점 영상화 둘 다를 이용하여, 8F4는 AML을 지닌 HLA-A2+ 환자 유래의 순환성 모구에 결합하지만 HLA-A2+ 건강한 공여자 유래의 PBMC 또는 HLA-A2 음성 AML 모구에는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다(도 3 및 도 5).
마우스 8F4 가변 영역 유전자의 클로닝 및 서열 분석. 마우스 8F4 하이브리도마 세포를, 7.5% CO2 항온배양기 내의 37℃에서, 10% 소 태아 혈청(FBS; HyClone) 및 1mM 피루브산 나트륨을 함유하는 RPMI-1640 배지(HyClone, Logan, UT)에서 성장시켰다. 공급자의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 대략 107 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 올리고 dT-프라이밍된 cDNA는, 공급업자의 프로토콜에 따라 SMARTer RACE cDNA 증폭 키트(Clontech, Mountain View, CA)를 이용하여 합성하였다. 8F4 중쇄 및 경쇄에 대한 가변 영역 cDNA를, 마우스 γ-2a 및 κ 쇄 불변 영역에 각각 어닐링하는 3' 프라이머 및 SMARTer RACE cDNA 증폭 키트에서 5' 프라이머로서 제공되는 Universal 프라이머 A 믹스 또는 Nested Universal 프라이머 A를 이용하여, Phusion DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA)로의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 중쇄 가변 영역(VH)의 PCR 증폭을 위해, 3' 프라이머는 서열 5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3'(서열번호 46)을 갖는다. 경쇄 가변 영역(VL)의 PCR 증폭을 위해, 3' 프라이머는 서열 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(서열번호 47)을 갖는다. 증폭된 VH 및 VL cDNA는, 서열 측정을 위해 pCR4Blunt-TOPO 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. Tocore(Menlo Park, CA)에서 가변 영역의 DNA 서열분석을 수행하였다. 몇몇의 중쇄 및 경쇄 클론을 서열분석하였고, 전형적인 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 상동성인 고유의 서열을 동정하였다. 8F4 VH 및 VL의 추론된 아미노산 서열과 마찬가지로, 컨센서스 cDNA 서열은 각각 도 1 및 도 2에 나타낸다. 성숙 8F4 VH 및 VL 아미노산 서열에서 비정상적인 특징은 주목되지 않았다.
키메라 8F4 IgG1/κ 항체의 작제. 8F4 VH를 암호화하는 유전자는, 주형으로서 8F4 VH cDNA를, 5' 프라이머로서 5'-GCAACTAGTACCACCATGAACTTCGGGCTCAGC-3'(서열번호 48; SpeI 부위는 밑줄 그어짐)을, 그리고, 3' 프라이머로서 5'-CGAAAGCTTGAAGTTAGGACTCACCTGCAGAGAGAGTGACCAGAG-3'(서열번호 49; HindIII 부위는 밑줄 그어짐)을 이용한 PCR에 의해, 스플라이스 공여자 신호 및 적절한 플랭킹 제한 효소 부위를 포함하는 엑손으로서 생성되었다. 유사하게, 8F4 VL을 암호화하는 유전자는, 주형으로서 8F4 VL cDNA를, 5' 프라이머로서 5'-GCAGCTAGCACCACCATGGAGTCACAGATTCAG-3'(서열번호 50; NheI 부위는 밑줄 그어짐)을, 그리고, 3' 프라이머로서 5'-CGAGAATTCTTTGGATTCTACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTG-3'(서열번호 51; EcoRI 부위는 밑줄 그어짐)을 이용한 PCR에 의해, 스플라이스 공여자 신호 및 적절한 플랭킹 제한 효소 부위를 포함하는 엑손으로서 생성되었다. 8F4 VH 및 VL 엑손의 스플라이스 공여자 신호는 각각 마우스 생식선 JH3 및 Jκ1 서열로부터 유도되었다. PCR-증폭된 단편을, NucleoSpin 추출 II 키트(Macherey-Nagel, Bethelehem, PA)를 이용하여 겔-정제하였고, 서열 확인을 위해 pCR4Blunt-TOPO 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. 정확한 V 단편을 SpeI 및 HindIII(VH의 경우) 또는 NheI 및 EcoRI(VL의 경우)로 소화시켰고, 겔-정제하였고, 키메라 8F4 IgG1/κ 항체의 생산을 위한 사람 γ-1 및 κ 불변 영역을 지닌 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다. 획득된 발현 벡터인 pCh8F4의 도식적 구조는 도 11에 나타낸다.
사람화된 8F4 VH 및 VL 유전자의 생성. 사람화된 8F4 VH 및 VL 아미노산 서열의 고안은 하기와 같이 수행하였다. 첫째로, JN Biosciences의 등록상표인 알고리듬을 이용하여 8F4 가변 영역의 3-차원 분자 모델을 작제하였다. 이어서, 상기 분자 모델을 이용하여, CDR 구조의 형성에 중요한 프레임워크 아미노산 잔기를 동정하였다. 동시에, 8F4 VH 및 VL에 대해 높은 상동성을 갖는 cDNA-유도된 사람 VH 및 VL 아미노산 서열을 각각 선택하였다. 마지막으로, CDR 서열을, CDR 구조를 유지하는데 중요한 프레임워크 아미노산 잔기와 함께, 8F4 VH 및 VL로부터, 상응하는 선택된 사람 프레임워크 서열에 절편이식하였다.
8F4 VH 프레임워크에 상동성인 사람 VH 서열을 GenBank 데이터베이스 내에서 탐색하였고, 사람 U96282 cDNA(U96282 VH)(GenBank 수탁 번호; Rassenti and Kipps, J. Exp. Med. 185: 1435, 1997)에 의해 암호화된 VH 서열을 사람화를 위한 억셉터로서 선택하였다. 8F4 VH의 CDR 서열을, 우선, U96282 VH의 상응하는 위치에 이동시켰다. 사람 프레임워크 아미노산의 치환은 CDR 구조를 유지하는데 필요한 것으로 예측되지 않았다. 획득된 사람화된 VH인 Hu8F4 VH의 아미노산 서열은 도 12에서 8F4와 U96282 VH 서열 사이에 끼워 나타낸다.
8F4 VL 프레임워크 서열과의 상동성 탐색에 기초하여, AY043146 cDNA에 의해 암호화된 사람 Vκ 영역(AY043146 VL)(GenBank 수탁 번호; Ghiotto et al., 2001년6월 29일에 GenBank에 제출됨)을 사람화를 위한 억셉터로서 선택하였다. 8F4 VL의 CDR 서열을, 우선, AY043146 VL의 상응하는 위치에 이동시켰다. 이어서, 프레임워크 위치 70에서, 8F4 가변 영역의 3-차원 모델의 분석이 CDR과의 접촉을 나타내는 경우, 마우스 8F4 VL 유래의 아미노산 잔기는 상응하는 사람 잔기에 대해 치환되었다. 얻어진 사람화된 VL인 Hu8F4 VL1의 아미노산 서열은 도 13에서 8F4와 AY043146 VL 서열 사이에 끼워 나타낸다.
마우스 8F4 VL에서 위치 70에서의 Val은, CDR 구조의 형성에 중요한 프레임워크 위치에 위치하지만, 8F4 가변 영역의 분자 모델의 상세한 분석은, Hu8F4 VL1에서 위치 70의 아미노산 잔기가, 항원-결합 친화성을 잃지 않으면서 AY043146 VL에서 사람의 상응하는 잔기 Asp로 대체될 수 있는 가능성을 시사하였다. 사람화된 8F4 항체의 잠재적 면역원성을 추가로 감소시키기 위해, 제2 사람화된 VL(Hu8F4 VL2)을 고안하였고, 여기서, Hu8F4 VL1에서의 위치 70의 Val은 Asp로 대체되었다. Hu8F4 VL2의 아미노산 서열은 도 13에 나타낸다.
Hu8F4를 암호화하는 유전자는, 신호 펩타이드, 스플라이스 공여자 신호, 및 후속적인 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 적절한 제한 효소 부위를 포함하는 엑손으로서 고안되었다. Hu8F4 VH 엑손의 스플라이스 공여자 신호는 사람 생식선 JH3 서열로부터 유도되었다. 사람화된 Hu8F4 VH 엑손에서의 신호 펩타이드 서열은, 상응하는 마우스 8F4 VH 서열로부터 유도되었다.
Hu8F4 VL1 및 VL2를 암호화하는 유전자들의 각각은, 신호 펩타이드, 스플라이스 공여자 신호, 및 후속적인 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 적절한 제한 효소 부위를 포함하는 엑손으로서 고안되었다. Hu8F4 VL1 및 VL2 엑손의 스플라이스 공여자 신호는 사람 생식선 Jκ4 서열로부터 유도되었다. 사람화된 Hu8F4 VL1 및 VL2 엑손에서의 신호 펩타이드 서열은 상응하는 마우스 8F4 VL 서열로부터 유도되었다.
Hu8F4 VH, VL1, 및 VL2 유전자는, 비밀 유지 비-공개 계약 하에 GenScript USA(Piscataway, NJ)에 의해 작제되었다. SpeI 및 HindIII(VH의 경우) 또는 NheI 및 EcoRI(VL의 경우)로의 소화 후, Hu8F4 VH, VL1, 및 VL2 유전자를, 사람 IgG1/κ 형태로의 생산을 위한 포유동물 발현 벡터에서 상응하는 부위에 서브클로닝하였다. 획득된 발현 벡터인 pHu8F4-1은, Hu8F4 VH 및 VL1을 함유하는 사람화된 8F4 IgG1/κ 항체(Hu8F4-1)를 발현한다. 유사하게, pHu8F4-2는, Hu8F4 VH 및 VL2를 함유하는 사람화된 8F4 IgG1/κ 항체(Hu8F4-2)를 발현한다. pHu8F4-1 및 pHu8F4-2의 도식적 구조는 도 11에 나타낸다. Hu8F4 VH, VL1 및 VL2 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 추론된 아미노산 서열과 함께, 각각 서열번호 22/23, 24/25 및 26/27로서 나타낸다.
또한, Hu8F4 VH 및 VL2 유전자는, IgG1-AA라고 칭하는 변이체 사람 IgG1/κ 형태의 생산을 위한 다른 포유동물 발현 벡터에 클로닝시켰다. IgG1-AA 형태는, γ-1 중쇄에서 위치 234에서의 Leu으로부터 Ala으로의, 그리고 235 위치에서 Leu으로부터 Ala으로의 2개의 아미노산 치환을 지니고 (Eu 넘버링, Kabat et al, 1991), 이는 Fc γ 수용체에 대한 결합의 극심한 감소를 초래한다(미국 특허 제6,491,916호). 획득된 플라스미드인 pHu8F4-2-AA의 도식적 구조는 도 11에 나타낸다.
키메라 및 사람화된 8F4 IgG1/κ 항체를 생산하는 NS0 안정한 형질감염체의 생성. Ch8F4, Hu8F4-1, Hu8F4-2, 및 Hu8F4-2-AA IgG1/κ 항체를 안정하게 생산하는 세포주를 수득하기 위해, 발현 벡터 pCh8F4, pHu8F4-1, pHu8F4-2, 및 pHu8F4-2-AA는 각각 마우스 골수종 세포주 NS0의 염색체(European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK)에 도입하였다. NS0 세포는, 7.5% CO2 항온배양기 내의 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DME 배지에서 성장시켰다. NS0으로의 안정한 형질감염은, 문헌[Bebbington et al. (Bio/Technology 10: 169-175, 1992)]에 기술되어 있는 바와 같이 전기 천공에 의해 수행하였다. 형질감염 전에, 각각의 발현 벡터를 FspI를 이용하여 선형화하였다. 대략 107 세포를, 10% FBS를 함유하는 DME 배지 중에 현탁된 20㎍의 선형화된 플라스미드로 형질감염시켰고, 몇몇의 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 48hr 후, 선택 배지(10% FBS, HT 배지 보충제(Sigma, St. Louis, MO), 0.25mg/ml의 크산틴, 및 1㎍/ml의 마이코페놀산을 함유하는 DME 배지)를 적용하였다. 선택의 개시 대략 10일 후, 항체 생산에 대해 배양 상청을 검정하였다.
키메라 및 사람화된 8F4 IgG1/κ 항체의 발현은 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 전형적인 실험에서, ELISA 플레이트는, 100㎕/웰의 PBS 중의 1/2,000-희석된 염소 항-사람 IgG Fcγ-쇄-특이적 폴리클로날 항체(Sigma)로 4℃에서 밤새 코팅하였고, 세척 완충액(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)으로 세척하였고, 300㎕/웰의 차단 완충액(2% 스킴 밀크 및 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)으로 실온에서 0.5hr 동안 차단시켰다. 세척 완충액으로 세척 후, ELISA 완충액(1% 스킴 밀크 및 0.025% Tween 20을 함유하는 PBS) 중에 적절하게 희석된 100㎕/웰의 샘플을 ELISA 플레이트에 적용하였다. 적절한 사람화된 IgG1/κ 항체를 표준물로서 사용하였다. 실온에서 1hr 동안 ELISA 플레이트를 항온배양하고 세척 완충액으로 세척한 후, 100㎕/웰의 1/2,000-희석된 HRP-접합된 염소 항-사람 카파 쇄 폴리클로날 항체(SouthernBiotech)를 이용하여, 결합된 항체를 검출하였다. 실온에서 0.5hr 동안 항온배양하고 세척 완충액으로 세척한 후, 100㎕/웰의 ABTS 기질(bioWORLD, Dublin, OH)을 첨가함으로써 색 발현(color development)을 수행하였다. 100㎕/웰의 2% 옥살산을 첨가함으로써 색 발현을 중지하였다. 405nm에서 흡광도를 판독하였다. 높은 수준의 Ch8F4, Hu8F4-1, Hu8F4-2, 및 Hu8F4-2-AA 항체를 생산하는 NS0 안정한 형질감염체(각각 NS0-Ch8F4 1-G8, NS0-Hu8F4-1 1-D2, NS0-Hu8F4-2 1-F5 및 NS0-Hu8F4-2-AA 1D3)는 하이브리도마-SFM(Invitrogen)을 이용한 혈청-불포함 배지에서의 성장에 적용시켰다. PCR 마이코플라스마 검출 세트(Takara Bio USA, Madison, WI)를 이용한 시험은, NS0-Ch8F4 1-G8, NS0-Hu8F4-1 1-D2, NS0-Hu8F4-2 1-F5 및 NS0-Hu8F4-2-AA 1D3이 마이코플라스마의 존재에 대해 음성이었음을 나타냈다.
NS0-Ch8F4 1-G8, NS0-Hu8F4-1 1-D2, NS0-Hu8F4-2 1-F5 및 NS0-Hu8F4-2-AA 1D3에서 생산된 중쇄 및 경쇄의 진정성은 cDNA 서열분석에 의해 확인되었다. 총 RNA는, TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 세포로부터 추출되었고, 올리고 dT-프라이밍된 cDNA는, 공급업자의 프로토콜에 따른 RT-PCR(Invitrogen)을 위한 SuperScript III 첫번째-가닥 합성 시스템을 이용하여 합성하였다. γ-1 중쇄의 암호화 영역은, 프라이머로서 CMV2 및 JNT098을(도 11), 그리고, Phusion DNA 폴리머라제를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 단편은, 겔-정제하였고, 서열번호 28 및 30 내지 32로 나타낸 프라이머로서 CMV2, JNT082, JNT097, 및 JNT098을 이용하여 서열분석하였다. 유사하게, κ 경쇄의 암호화 영역은 CMV2 및 JNT026(서열번호 28 및 29)을 이용하여 증폭시켰다. 겔-정제된 DNA 단편은, 프라이머로서 CMV2 및 JNT026을 이용하여 서열분석하였다. Ch8F4 중쇄, Ch8F4 경쇄, Hu8F4-1 중쇄, Hu8F4-1 경쇄, Hu8F4-2 중쇄, Hu8F4-2 경쇄, Hu8F4-2-AA 중쇄, 및 Hu8F4-2-AA 경쇄의 각각에 대한 암호화 영역의 얻어진 뉴클레오타이드 서열은, pCh8F4, pHu8F4-1, pHu8F4-2 또는 pHu8F4-2-AA 벡터에서 상응하는 서열(서열번호 33/34, 35/36, 37/38, 39/40, 37/38, 41/42, 43/44, 및 41/42)과 완벽하게 일치하였다.
8F4-4, Ch8F4, Hu8F4-1, Hu8F4-2 및 Hu8F4-2-AA 항체의 정제. 하이브리도마 8F4-4(Dr. Molldrem에 의해 제공됨)는, 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지(Hyclone)에서 배양하였고, 하이브리도마-SFM에서의 성장에 적응되었다. 8F4-4, NS0-Ch8F4 1-G8, NS0-Hu8F4-1 1-D2, NS0-Hu8F4-2 1-F5 및 NS0-Hu8F4-2-AA 1D3 세포는, SFM4MAb 배지(HyClone)에 용해된 60mg/ml의 한외여과된 대두 가수분해물(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)의 1/10th 체적이 공급된 롤러 보틀 내의 하이브리도마-SFM에서 약 106/ml의 밀도로 성장시켰고, 세포의 생존가능성이 50% 미만이 될 때까지 추가로 성장시켰다. 원심분리 및 여과 후, 배양 상청을 단백질-A 세파로스 컬럼(HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, NJ) 상에 로딩하였다. 항체를 0.1M의 글리신-HCl(pH 3.0)으로 용출시키기 전에 컬럼을 PBS로 세척하였다. 1M Tris-HCl(pH 8)로 중화시킨 후, 용출된 항체의 완충액을 투석에 의해 PBS로 변화시켰다. 항체 농도는, 280nm에서 흡광도(1mg/ml = 1.4 OD)를 측정함으로써 결정하였다. 8F4-4, Ch8F4, Hu8F4-1, Hu8F4-2 및 Hu8F4-2-AA의 각각의 배치의 정제 및 수율은 표 5에 요약한다.
Figure 112015014195088-pct00005
정제된 8F4-4, Ch8F4, Hu8F4-1, Hu8F4-2, 및 Hu8F4-2-AA는, 표준 절차에 따른 SDS-PAGE에 의해 특성 확인되었다. 환원 조건 하의 분석은, 각각의 항체가, 약 50kDa의 분자량을 갖는 중쇄 및 약 25kDa의 분자량을 갖는 경쇄로 구성된다는 것을 나타냈다(도 14). 각각의 항체의 순도는 95% 초과인 것으로 나타났다.
Ch8F4 및 Hu8F4 항체의 특성 확인. Ch8F4, Hu8F4-1, Hu8F4-2, 및 Hu8F4-2-AA의 항원 결합은, HLA-A2와의 PR1 펩타이드(VLQELNVTV(서열번호 45))의 복합체(PR1/HLA-A2)를 이용하여 ELISA에 의해 실험하였다. 우선, ELISA 플레이트를, PBS 중의 5㎍/ml의 스트렙트아비딘(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)의 100㎕/웰로 코팅하였다. 웰을 세척 완충액(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)으로 세척하고 차단 완충액으로 차단한 후, Dr. Molldrem에 의해 제공된 2㎍/ml의 비오티닐화된 PR1/HLA-A2의 50㎕/웰을 첨가하였다. 실온에서 30분의 항온배양 후, ELISA 플레이트를 세척 완충액으로 세척하였다. PR1/HLA-A2에의 결합을 위해, 1㎍/ml에서 시작하여 ELISA 완충액 중의 일련의 3-배 희석으로 Ch8F4, Hu8F4-1, Hu8F4-2 및 Hu8F4-2-AA 항체를 첨가하였다. ELISA 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온배양하고 세척 완충액으로 세척한 후, 100㎕/웰의 1/2,000-희석된 HRP-접합된 염소 항-사람 카파 쇄 폴리클로날 항체를 이용하여, 결합된 항체를 검출하였다. 실온에서 30분 동안 항온배양하고 세척 완충액으로 세척한 후, 100㎕/웰의 ABTS 기질을 첨가함으로써 색 발현을 수행하였다. 100㎕/웰의 2% 옥살산을 첨가함으로써 색 발현을 중지하였다. 405nm에서 흡광도를 판독하였다. 데이터는 도 15에 나타낸다. GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 계산한 EC50 값은, Ch8F4의 경우 0.054㎍/ml, Hu8F4-1의 경우 0.050㎍/ml, Hu8F4-2의 경우 0.07㎍/ml, 그리고, Hu8F4-2-AA의 경우 0.07㎍/ml였다. 이러한 결과는, Hu8F4-1, Hu8F4-2, 및 Hu8F4-2-AA 모두가 마우스 8F4 항체의 항원 결합 친화성을 보유한다는 것을 나타낸다.
표적 세포에 대항하는 항체 작용. AML에의 8F4의 결합이 세포 용해를 유발하는지를 결정하기 위해서, 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 및 보체-의존적 세포독성(CDC) 검정을 수행하였다. HLA-A2 음성 AML 또는 HLA-A2+ 건강한 공여자 대조군 PBMC가 아닌 8F4에 의한 HLA-A2+ AML의 CDC-매개된 용해는 항체 용량-의존적인 것으로 밝혀졌다(도 4). 8F4 CDC-매개된 용해에 민감성인 것으로 밝혀진 환자 물질 유래의 AML 세포는, 8F4 또는 이소형 대조군의 존재 또는 부재 하에 항온배양하였고, 이어서, 방사선 조사된(200cGy) 면역결핍성 HLA-A2 형질전환 NOD/SCID 마우스에게 전이시켰다. 2주째에, 동물을 희생시켰고, 비장 세포 및 골수를 FACS에 의해 분석하였다. 검시시, AML은, IgG2a 이소형 대조군-치료된 동물에서만 동정되었고, 8F4-치료된 동물에서는 동정되지 않았다(도 6). 이소형-치료된 마우스에 비교하여, 8F4 단독을 투여받은 마우스에서 명백한 독성은 존재하지 않았다. 전체로서, 이들 데이터는, 8F4 모노클로날 항체가: (1) 조합된 PR1/HLA-A*0201 에피토프에 높은 친화도로 특이적으로 결합하고; (2) 골수성 백혈병을 포함하는 사람 세포의 표면 상의 PR1 펩타이드-점유된 HLA-A*0201 분자에 특이적으로 결합하여, 이를 동정하는데 사용될 수 있고; (3) 보체의 존재 하에 HLA-A2+ AML의 특이적 용해를 야기하고; (4) 면역결핍 마우스 모델에서 AML의 생착을 예방할 수 있다는 결론을 지지한다.
종양 생착의 예방. AML 세포 + 8F4를 이용한 주사에 따른 실험 마우스의 조직에서의 AML 침윤이 측정되었고, 이는 도 8a 및 도 8b에 나타낸다. AML 세포는, 전이되지 않은 대조군 및 실험적 8F4-치료된 마우스의 골수 및 말초 혈액에서 검출되지 않았다. 이소형 매칭된 대조군 항체(iso)와 혼합된 AML 세포를 투여받은 마우스는, AML 전이 2주 또는 4주 후에 AML1 및 AML5의 생착을 나타냈다. 마우스 세포 특이적 마커(mCD45), 3-6 사람 마커(CD45, CD13, CD33, CD34, CD38, HLA-DR), 및 Live/Dead Fixable Aqua(Invitrogen)을 포함하는 연장된 패널은, AML 생착의 유세포 측정 분석에 사용하였다. 모든 플롯은 살아있는 mCD45-세포를 나타낸다.
8F4는 HLA-A2 형질전환 NOD/SCID에서 일시적 호중구 감소증을 유도한다. 내인성 PR1을 나타내는 것으로 밝혀진 HLA-A2 Tg NOD/SCID에, 8F4 또는 대조군 Ab를 주사하였다. 골수 세포를 수거하였고, 마우스 항원에 대해 지정된 mAb로 염색하였다. 감소된 과립구는 골수의 분산 프로파일에서 명백하였다(도 9a; 좌측 패널). Gr-1lo 미성숙 호중구가 존재하였지만, Gr-1hi 성숙 호중구는 8F4-치료된 마우스의 골수에서 더 적었다(도 9a; 중앙 패널). 추가로, 단핵구(SSClo CD11b+; 도 9a; 우측 패널의 아래 오른쪽 게이트)는 8F4-치료된 동물에서 감소하였다. 8F4의 정맥내 주사는, HLA-A2 Tg NOD/SCID 마우스에서 순환성 성숙 과립구, 대식세포, 및 단핵구의 무명수(absolute number)의 일시적 감소를 유도하였다(도 9b). 치료 3주 후, 모든 집단이 유지된다. 200㎍의 8F4의 주사(10mg/ml) 7일 후, HLA-A2 Tg NOD/SCID 마우스의 간, 폐, 비장, 신장, 심장 또는 뇌에서의 유의한 병리학적 변화는 명백하지 않았다(도 9c).
8F4는, 확립된 사람 조혈 세포의 일시적 백혈구 감소증을 유도한다. 마우스로부터 말초 혈액을 채혈하여 제대혈 생착을 모니터링하였고, 전이 9 내지 12주 후, 마우스에게 8F4를 주사하였다. 후속적으로, 마우스를 희생시켰고, 사람 세포의 생착에 대해 혈액, 비장, 및 골수를 분석하였다(도 10b). 나타내어질 수 있는 바와 같이, 항체 주사는, 전이된 세포의 생착률(%)을 일시적으로 감소시킨다(도 10a).
사람 AML에 대항하는 사람화된 8F4 항체의 결합 특이성, 친화도, 및 활성. Hu8F4의 결합 특이성을 특성 확인하기 위해, 본 발명자들은 FACS-기반 검정을 수행하여, Hu8F4가 PR1-펄싱된 T2 세포에만 결합하고(도 16a) pp65-펄싱된 T2 세포에는 결합하지 않음을 밝혔다. Hu8F4의 결합 친화도를 특성 확인하기 위해서, 본 발명자들은, 마우스 8F4 및 이소형 대조군(rhIgG1)과 2개의 형태의 사람화된 항체들인 Hu8F4-1(Hu1) 및 Hu8F4-2(Hu2)의 결합을 비교하는 ELISA를 사용하였다. 본 발명자들은, 재조합 PR1/HLA-A2 단량체-코팅된 플레이트를 사용하여 항체를 포획하였고, 항-사람 항체를 비색 검정에서 사용하여 광학 밀도(OD)에 의해 결합된 분획을 결정하였다. 도 16b에 나타낸 바와 같이, Hu1 및 Hu2는 각각 7.7 및 7.8nM의 KD를 나타냈고, 이는 마우스 8F4와 유사하였다(KD = 9.9nM). 따라서, 2개의 사람화된 항체는, 모 마우스 항체와 비교하여 동일한 리간드 특이성 및 결합 친화도를 갖는다. 이러한 데이터는, 추가의 실험에서 Hu8F4 항체를 이용하기 위한 생화학적 타당성을 확립하여 전-임상 동물 모델에서의 활성 스펙트럼을 결정한다.
Hu8F4의 작용의 잠재적 메커니즘을 다루기 위해, 본 발명자들은, 토끼 보체의 존재 하에, PR1-펄싱된 T2 표적 세포를 Hu8F4 또는 이소형 대조군 항체(IgG1)로 치료하였고, 표준 검정을 이용하여 보체-매개된 용해를 측정하였다. 도 16c에 나타낸 바와 같이, Hu8F4도, 또는 키메라 Ch8F4(IgG1 유래의 사람 Fc 및 8F4 유래의 마우스 F(ab)2)도 보체-의존적 세포독성(CDC)을 매개하지 않았다. 따라서, 마우스 8F4(IgG2)와는 달리, Hu8F4는 보체 고정화에 의해 표적 세포를 용해시키지 않는다. 본 발명자들은, Hu8F4가, 상기 실험에서 ADCC, 직접적 아폽토시스, 또는 유사분열 및 증식의 억제를 매개하는지를 결정하기 위해 추가의 연구를 수행하고 있다.
이어서, 본 발명자들은 Hu8F4를 사용하여, NSG 마우스에서의 확립된 1차 사람 AML 이종이식체를 치료하였다. 우선, 마우스를 AML로 2주 동안 생착시켰고, 이어서, Hu8F4, Ch8F4, 또는 이소형 IgG1로 3x/주로 2주 동안 10mg/kg의 항체와 함께 치료하였다. BM 및 말초 혈액 키메라화를 치료 후에 분석하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 3개의 상이한 AML 표본을 이용한 3회의 별도의 실험이 제거되었거나, 이들의 성장이 이소형 대조군에 비교하여 Hu8F4 및 Ch8F4에 의해 유의하게 저해되었다. 따라서, 이들 데이터는, Hu8F4가, 치료-난치성 재발 질환을 지닌 환자 유래의 1차 사람 AML에 대항하여 고도로 생물학적 활성임을 확립하고, NSG 마우스에 주요 보체 단백질의 발현이 결여되어 있으므로 Hu8F4의 작용의 메커니즘이 보체-독립적임을 확립한다.
HLA-A2 형질전환 면역-적격(B6) 및 면역-결핍(NOD/scid) 마우스에서의 8F4의 생물학적 안전성 데이터. 본 발명자들은 Hu8F4의 전-임상 연구를 위해 3마리의 마우스 모델: HLA-A2 형질전환 B6 면역-적격 마우스, HLA-A2 형질전환 NOD/scid 마우스, 및 NSG(IL-2 공통 γ 쇄가 결여되어 있음) 마우스를 확립하였다. 잠재적 독성을 결정하기 위해서, 본 발명자들은, 우선, PR1이, HLA-A2 형질전환 동물의 조혈 줄기 세포 및 과립구 각각의 5 및 6%에 대해 HLA-A2 상에 발현됨을 밝혔다. 이어서, 본 발명자들은, 고용량의 8F4(10mg/kg)의 단일 IV 투여가 HLA-A2 형질전환 마우스의 둘 다에서 일시적이고 완전한 가역적 혈구 감소증을 유도한다는 것을 밝혔다(도 18 내지 도 19). NSG 마우스에는, CD34-선택된 사람 제대혈이 생착되어 장기 안정성 사람 키메라화가 확립되었고, 이는, 단일 및 다중 용량의 Hu8F4로 치료하여 PR1/HLA-A2+ 사람 조혈 줄기 세포에 대항하는 mAb의 효과가 결정될 것이다.
H8F4 , 항- PR1 / HLA -A2 mAb 는, 삼중-음성 유방암 이종이식체의 종양 성장을 지연시키고 생존을 연장시킨다 . 백혈병에 대해 상기 언급된 작용에 추가하여, 본 발명자들은, 조혈성-제한된 세린 프로테아제 호중구 엘라스타제(NE) 및 프로테이나제 3(P3)으로부터 유도된 PR1 9량체 펩타이드가, 또한, 흑색종, 비-소세포 폐암, 및 유방암을 포함하는, 내인성 P3 또는 NE를 발현하지 않는 다수의 비-조혈성 종양 상에 HLA-A2에 대해 교차-제시될 수 있음을 밝혔다(Alatrash et al., 2012). 삼중-음성 유방암 세포주 MB-MDA-231(231 세포로서 나타냄)은 P3 및 NE를 발현하지 않지만, HLA-A2를 발현한다. 그러나, 이들 세포는 가용성 P3 및 NE를 흡수하고, PR1을 교차-제시하며, 이는, 후속적으로 231 세포를 8F4-매개된 용해에 민감성이 되게 한다. 중요하게도, PR1/HLA-A2는, 삼중-음성 유방암(TNBC)을 지닌 환자를 포함하는 환자 생검 유래의 유방암 세포 상에 발현된다(Alatrash et al., 2012). 따라서, PR1/HLA-A2는, 유방암에 대한 표적 항원일 수도 있고, 본 발명자들은, 8F4가 HLA-A2+ 유방암에 대항하여 생물학적 활성을 가질 수도 있음을 추론하였다.
이러한 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은, NSG 마우스에서 (a) 원발성 종양, 및 (b) 전이성 종양 이종이식체 모델에서의 h8F4의 효과를 연구하였다. 원발성 종양 모델에서, 231 TNBC 세포를 NSG 마우스의 포유동물 지방 패드에 주사하였고, 이어서, h8F4, 이소형 대조군 항체, 또는 PBS의 단일 용량을 주사하였다. 231 세포를 ffluc 유전자로 형질감염시켜, 생물발광 영상화(BLI)를 이용하여 시간에 따른 종양 성장을 모니터링할 수 있었다. 이식 1 내지 2일 후 종양 부위 생검의 H&E 염색은, 천연으로 P3 및 NE를 발현하는 세포들인 호중구 및 대식 세포에 의한 종양 침윤을 나타냈다(도 20a). 도 20b에 나타낸 바와 같이, 종양 성장은, 이소형 대조군 또는 PBS를 투여받은 마우스와 비교하여 h8F4를 투여받은 마우스에서 지연되었다. 또한, h8F4는 대조군 마우스와 비교하여 생존을 연장시켰다(p < 0.01).
제2 모델에서, ffluc 유전자 변형된 231 세포(2 x 105)를 NSG 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였고, 7일째에 마우스는 10mg/kg의 h8F4 또는 이소형 대조군 항체를 3x/주로 투여받았다. 치료되지 않은 NSG 마우스에서, IV 주사된 231 세포는 신속하게 폐(BLI로 확인됨)에, 후속적으로, 비장, GI 관, 및 간을 포함하는 다른 조직에 전이된다. 도 20c에 나타낸 바와 같이, h8F4는, 231 세포의 전이성 종양 성장을 유의하게 지연시켰고, 이소형-치료된 마우스에 비교하여 생존을 유의하게 증가시켰다(p = 0.0006). 이들 결과는, 종양-관련 호중구 및 대식세포 유래의 P3 및 NE가 생체내에서 231 세포에 의해 흡수되고, PR1은 HLA-A2 상에 교차-제시되며, 이는, h8F4 치료에 의해 저해되는 TNBC 세포의 성장을 야기함을 시사한다. 따라서, h8F4는, TNBC에 대항하여 생물학적으로 활성이고, 본 발명자들의 결과는, h8F4 mAb가, 유방암을 포함하는 비조혈 HLA-A2+ 종양을 치료하는 치료학적 mAb로서의 잠재력을 가짐을 시사한다.
실시예 3: 방법들
환자 조직, 세포, 및 세포 배양물. 환자 유방암 동결된 조직 블록은 Origene으로부터 구매하였다. MD Anderson Cancer Center(Houston, TX)에서 기관 감사 위원회에 의해 승인된 연구에 있어서 참여자에게 사전 동의를 수득한 후에 환자 및 건강한 공여자 샘플을 수집하였다. MDA-MB-231, MCF-7, MDAMB-453, 및 T47D 유방암 세포주, 및 SW-620(결장직장 선암종), OVCAR-3(난소 선암종), MIA PaCa-2(췌장 암종), Jurkat(급성 T 세포 백혈병), T2(B-세포/T-세포 하이브리도마), HL-60(급성 전골수성 백혈병), 및 U-937(조직구성 백혈병) 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 수득하였다. MCF-HER-18 세포주는 M.-C. Hung(MD Anderson Cancer Center)에 의해 제공되었다. Mel 526, Mel 624, MT 2019, 및 MT 2333 흑색종 세포주는 L. Radvanyi(MD Anderson Cancer Center)에 의해 제공되었다. 세포주는, 실험에서의 사용의 6mo 내에 MD Anderson Cancer Center에서 DNA 핑거프린팅(fingerprinting)에 의해 증명되었다.
유방암 세포는, 10% FBS(Gemini Bio-Products) 및 100U/ml의 페니실린/100mg/ml의 스트렙토마이신(Cellgro)이 보충된 2.5mM l-글루타민(HyClone)을 갖는 DMEM에서 성장되었다. G418(Lonza)(0.5mg/ml)을 선택성 제제(selective agent)로서 MCF-7-HER18 세포 배양물에 첨가하였다. 25mM HEPES + l-글루타민(HyClone)을 갖는 RPMI 1640을, 백혈병 세포주 배양물에 대한 DMEM 대신에 사용하였다. 모든 세포주를 37℃에서 5% CO2에서 배양하였다. 건강한 공여자 및 환자 PBMC 및 다형핵 호중구(PMN)를 각각 표준 Histopaque 1077 및 1119(Sigma-Aldrich) 구배 원심분리를 이용하여 농축시켰다.
RT-PCR. 세포주 및 RNA Stat 60 키트(TelTest)를 이용한 레이저 포획 현미경 해부(LCM) 샘플로부터 mRNA를 추출하였다. Gene Amp RNA 키트(PerkinElmer)를 이용하여 cDNA의 합성을 수행하였다. 하기 프라이머를 사용하였다: P3, 전방 프라이머, 59-GACCCCACCATGGCTCAC-39[서열번호 52] 및 역방 프라이머, 59-ATGGGAAGGACAGACAGGAG-39[서열번호 53]; 맘마글로빈-1, 역방 프라이머, 59-AGCACTGCTACGCAGGCTCT-39[서열번호 54] 및 역방 프라이머, 59-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-39[서열번호 55]; 액틴, 전방 프라이머, 59-CCAGAGCAAGAGAGCTATCC-39[서열번호 56] 및 역방 프라이머, 59-CTGTGGTGGTGAAGCTGTAG-39[서열번호 57]; 및 GAPDH, 전방 프라이머, 59-TAGACGGGAAGCTCACTGGC-39[서열번호 58] 및 역방 프라이머, 59-AGGTCCACCACCCTGTTGCT-39[서열번호 59]. 95℃에서 5분 동안의 변성에 따라, 샘플은 iCycler(Bio-Rad)를 이용하여 35 주기 동안 증폭되었다. 샘플을 1.5% 아가로스 겔 상에 흘렸다. 밴드를 GelDoc2000(Bio-Rad)을 이용하여 화상화하였고, QuantityOne 소프트웨어(Bio-Rad)에 의해 분석하였다.
웨스턴 블롯팅. 세포 펠렛을, 프로테아제 저해제를 함유하는 용해 완충액(10mM/L HEPES[pH 7.9], 10mM/L KCl, 0.1mM/L EGTA, 0.1mM/L EDTA, 및 1mM/L DTT)에 현탁시킴으로써 전체-세포 용해물(WCL)을 생성하였고, 후속적으로 15분 동안 냉동-해동 주기를 행하였다. 환원 조건 하에서 10% SDS 겔 상의 전기 영동에 의해 WCL을 분리하였고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 상에 이동시켰고, 5% 밀크로 차단하였고, 항-NE(Santa Cruz Biotechnology), 및 항-P3(NeoMarkers), 항튜불린(Sigma-Aldrich), 또는 항-GAPDH(Sigma-Aldrich) Ab로 염색하였다. 화학 발광성은 Kodak 필름 상에 포획하였다.
Ag 교차-제시. 단백질 흡수를 측정하기 위해, 세포를, 10mg/ml P3, NE(둘 다 Athens Research & Technology), EndoGrade OVA(Hyglos), 또는 방사선 조사된(7500cGy) PMN 또는 PBMC를 1:1의 비로(유방암:방사선 조사된 세포) 함유하는 환원된 혈청 배지(0.5% FBS)에서 펄싱하였다. 이어서, 세포를 투과성화하였고(BD Biosciences), 항-P3(클론 MCPR3-2; Thermo Scientific) 또는 항-NE(Santa Cruz Biotechnology)에 직접적으로 접합된 Alexa-488 또는 647로 염색하였고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 교차-제시를 측정하기 위해, 이전에 기술된 바와 같이(Sergeeva et al., 2011) 형광성 접합된 8F4로 세포를 표면 염색하였다. Alexa-488 또는 647 키트(Invitrogen)를 사용하여 항-P3, 항-NE, 및 항-PR1/HLA-A2(8F4) Ab에 직접적으로 접합시켰다. Aqua Live/Dead 염색(Invitrogen)을 사용하여 생존가능성을 평가하였다. 모든 유세포 측정 실험에 관해서, 광 분산을 사용하여 초기 게이팅을 확립하였고, 이어서, aqua Live/Dead 염색하였다. 교차-제시를 저해하기 위해, 세포를, 골지 전방성 저해제 브레펠딘 A(Sigma-Aldrich) 또는 프로테아솜 저해제 락타시스틴(Sigma-Aldrich)에 대한 소포체(endoplasmic reticulum: ER)와 공동 항온배양하였다(Francois et al., 2009, Kovacsovics-Bankowski 및 Rock 1995 and Mukai et al., 2009).
세포내 P3 국재화를 나타내기 위한 공초점 영상화는 Leica Microsystems SP2 SE 공초점 현미경(Leica)을 이용하여 310/25 air, 363/1.4 오일 대물렌즈로 수행하였고, Leica LCS 소프트웨어(버젼 2.61)를 이용하여 분석하였다. FITC-접합된 리소솜-관련 막 단백질-2(LAMP-2; eBioscience)를 이용하여 리소솜 및 후기 엔도솜을 염색하였다(Kuronita et al., 2002). Cytomation CyAn 유세포 측정기(Dako)를 이용하여 유세포 측정법을 수행하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
면역 조직 화학. 동결보존된 유방 및 흑색종 종양 조직(Origene)을 포르말린 고정하였고, 이어서, 면역 조직 화학을 위해 파라핀 포매하였다(embedded). 염색하기 전에, 조직 표본을 크실렌 중에서 탈파라핀화하고, 재수화시키고, 내인성 퍼옥시다제 활성을 켄칭하였다(quenched). 절편을 10% 정상 말 혈청으로 차단하였고, 이어서, 1차 WGM2 항-P3 mAb 클론(1:10)(Abcam) 또는 항-NE(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 실온에서 30분 동안 항온배양하였다. 흑색종 슬라이드를 항-소안구증-관련된 전사 인자(MITF) Ab(Thermo Scientific)와 공동 염색하였다. 이어서, 슬라이드를 세척하였고, 2차 항-마우스 IgG-비오틴 Ab(1:200)(Vector Laboratories)와 함께 항온배양하였고, 이어서, 아비딘-비오틴 퍼옥시다제(1:100)(Vector Laboratories)와 함께 항온배양하였다. 크로마젠(Chromagen) 3,39-디아미노벤지딘(Dako)을 염색 가시화에 사용하였다. 모든 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비 염색하였다. 정상 편도 조직의 PMN 염색을 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군은, 1차 Ab의 결실 후 상기와 같이 염색하였다.
펩타이드 -특이적 CTL 주. PR1-특이적 CTL은, 이전에 기술된 바와 같이(Molldrem et al., 2000 및 Molldrem et al., 1999), 건강한 HLA-A2 공여자 유래의 PBMC를 PR1 펩타이드로 시험관내 자극함으로써 확장되었다. 간략하게, T2 세포를 혈청-불포함 RPMI 1640 배지 중에서 세척하였고, 20mg/ml로의 PR1 펩타이드와 함께 37℃에서 90분 동안 항온배양하였다. 펩타이드-로딩된 T2 세포를 7500cGy로 방사선 조사하였고, 세척하였고, 10% 사람 AB 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중에서, 신선하게 단리된 PBMC와 1:1의 비로 배양하였다. 7일, 14일, 및 21일째에 배양물을 펩타이드-펄싱된 T2 세포로 재자극하였고, 다음 날에 20IU/ml의 사람 rIL-2(BioSource International)를 첨가하였다.
세포- 매개된 세포독성 검정. 이전에 기술된 바와 같이(Molldrem et al., 1996 및 Molldrem et al., 1997), 표준 세포독성 검정을 이용하여 특이적 용해를 측정하였다. 간략하게, 10ml 중의 1000개의 표적 세포(1.0 3 105 세포/ml)를 칼세인-AM(Invitrogen)으로 37℃에서 90분 동안 염색하였고, RPMI 1640으로 3회 세척하였고, 이어서, 10ml의 펩타이드-특이적 CTL과 변하는 E:T 비로 공동 항온배양하였다. 5% CO2 중의 37℃에서의 4-h 항온배양 기간 후, 5ml의 트립판 블루를 각각의 웰에 첨가하였고, 자동화된 CytoFluor II 플레이트 판독기(PerSeptive Biosystems)를 이용하여 형광성을 측정하였다. 특이적 세포독성 백분율을 하기와 같이 계산하였다: ([형광성표적 + 이펙터 형광성배지]/[형광성표적 단독 형광성배지]) x 100.
보체 - 매개된 세포독성 검정. 교차-제시가 8F4에 대한 유방암 민감성을 증가시키는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 이전에 기술된 바와 같이(Sergeeva et al., 2011 및 Prang et al., 2005) 보체-매개된 세포독성 검정을 수행하였다. MDA-MB-231 세포를, NE(10mg/ml) 또는 P3(10mg/ml) 함유 배지 중에서 24h 동안 배양하였다. 세포를 칼세인-AM(Invitrogen)과 항온배양하였고, 3회 세척하였고, 혈청-불포함 RPMI 1640 중에 재현탁시켰다. 1백만개의 세포를 증가하는 용량의 8F4 Ab(0.624, 1.25, 2.5, 5, 및 10mg/ml) 또는 이소형 Ab(음성 대조군)와 10mg/ml의 최종 농도로 혼합하였고, 37℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 이어서, 표준 토끼 보체(5ml; Cedarlane Laboratories)를 첨가하였고, 세포를 37℃에서 60분 동안 항온배양하였다. BB7.2 하이브리도마 유래의 상청(항-HLA-A2를 위한 공급원) 및 디기토닌(Promega)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 형광성을 측정하였고, 상기 기술된 바와 같이 특이적 사멸을 계산하였다.
유방 종양 조직으로부터의 LCM 및 RNA 추출. LCM을 수행하여, IR 다이오드 레이저를 이용한 Arcturus PixCell 레이저 포획 현미경(Life Technologies, Applied Biosystems)으로 유방 종양 생검 조직으로부터 유방암 세포를 단리하였다. 조직을 절편화하였고(5mm 두께), 비하전된 유리 슬라이드 상에 두고, 75% 에탄올 및 디에틸 피로카르보네이트 수로 고정시켰다. 헤마톡실린을 사용하여 조직 수화 후에 핵을 염색하였다. LCM을 위해 준비되기까지 등급이 나뉜(graded) 알콜 탈수 후에 샘플을 크실렌 중에 보관하였다. 현미 해부(microdissection)에 사용된 영역은 H&E 염색을 이용하여 동정하였다. 조직을 레이저 빔을 이용하여 30 내지 70mW로 조정된 파워로 펄싱하여 10mm 직경을 유지하였다. 대략 5000개의 유방암 세포를 Arcturus Capsure HS LCM 캡(Life Technologies, Applied Biosystems)에 포획하였다. 총 RNA를 추출하였고, Arcturus PicoPure RNA 단리 키트(Life Technologies, Applied Biosystems)를 이용하여 정제하였다. RNA 통합성 및 정량은 Nano Drop ND-1000 분광 광도계(Thermo Scientific)로 측정하였다. Arcturus RiboAmp RNA 증폭 키트를 사용하여, 2회의 T7-기반 증폭을 이용하여 RNA를 증폭시켰다. 이는 2.5mg의 증폭된 RNA를 수득하였다. 1mg의 증폭된 RNA로부터 제조업자의 지침서에 따라 Roche Transcriptor First Strand cDNA 합성 키트(Roche Applied Science)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
유방암 환자에서의 PR1 - CTL 에 대한 염색. 환자 유래의 PBMC를 하기 형광성 Ab로 염색하였다: CD8 알로피코시아닌-H7(BD Biosciences), CD3 PE Cy7(BD Biosciences), CD4 퍼시픽 오렌지(Invitrogen), PE-접합된 PR1/HLA-A2-덱스트라머(Immudex), 및 하기 퍼시픽 블루-접합된 계통 Ab: CD14(BD Biosciences), CD16(BD Biosciences), 및 CD19(BioLegend). Aqua Live/Dead 염색(Invitrogen)을 이용하여 죽은 세포를 배제시켰다. 샘플을 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 데이터를 Canto flow 세포 측정기(BD Biosciences)에서 획득하였고, FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 이용하여 분석하였다. PR1-CTL의 출현빈도를, 계통-, CD4-, CD3+, CD8+, 및 PR1-덱스트라머+인 생세포의 백분율(%)로서 측정하였다.
환자 조직의 공초점 영상화. 동결보존된 조직 절편을 냉 아세톤으로 고정화시켰다. 유방암 조직을, 유방암 마커 Alexa-488-접합된 마우스 항-사이토케라틴-7(CK7) Ab(Abcam) 및 Alexa-647-접합된 8F4 Ab로 염색하였다(Sergeeva et al., 2011). PR1/HLA-A2 발현이 유방암 세포에 의한 것이고 침윤성 백혈구에 의한 것이 아님을 확인하기 위해, 연이은 유방암 조직 절편도, 또한, 백혈구 마커로서의 Alexa-647-접합된 마우스 항-CD45 Ab(Invitrogen)로 염색하였다. 사람 편도 조직 절편(Origene)을 CD45에 대한 양성 염색 대조군으로서 사용하였다. 흑색종에 관해, 조직 절편을 냉 아세톤으로 고정시켰고, 0.5% Triton X-100(Sigma-Aldrich)로 15분 동안 투과성화하였고, 5% 정상 염소 혈청(Jackson ImmunoResearch Laboratories)으로 차단하였다. 이어서, 절편을 흑색종 마커 마우스 항-MITF(Thermo Scientific)와 1h 동안 항온배양하였고, PBS로 세척하였고, 이어서, Alexa-488-접합된 염소 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)와 항온배양하였다. 이어서, 슬라이드를 세척하였고, 5% 정상 마우스 혈청(Jackson ImmunoResearch Laboratories)으로 차단하였고, Alexa-647-접합된 8F4 Ab와 항온배양하였다. DAPI을 이용한 ProLong Gold 안티페이드 시약(antifade reagent)(Invitrogen)을 첨가하였다. Leica Microsystems SP2 SE 공초점 현미경을 310/25 air, 363/1.4 오일 대물렌즈로 이용하여 공초점 영상화를 수행하였다. Leica LCS 소프트웨어(버젼 2.61)를 화상 분석에 사용하였다.
실시예 4: 결과
고형 종양은 NE 및 P3 을 흡수한다. NE 및 P3의 흡수가 편재하는 현상인지를 측정하기 위해, 본 발명자들은, 다중 고형 종양 세포주를 10mg/ml NE 또는 P3과 공동배양하였고, 이어서, 유세포 측정법을 이용하여 세포내 흡수를 평가하였다. 본 발명자들은, 모든 종양 유형이 NE 및 P3을 흡수하는 것은 아니고, 또한, 흡수의 정도는 상이한 종양 유형 사이에 다름을 밝혔다(도 21). 또한, NE 흡수는 시간에 따라 안정기(plateau)로 나타나고, P3 흡수보다 훨씬 더 낮으며, 이는 상이한 흡수 메커니즘을 나타내고, NE 흡수에 관여할 수 있는 수용체-매개된 프로세스를 제안한다.
P3 은 유방암에서 부재한다. 본 발명자들은, 이전에, NE가 유방암에서 부재하고 유방암 세포에 의해 흡수됨을 밝혔고(Mittendorf et al., 2012), 내인성 발현으로부터 P3 흡수를 구별하기 위해, 본 발명자들은, mRNA 및 단백질 수준에서 P3 발현에 대한 유방암 세포주 및 원발성 종양 조직을 분석하였다. PCR은, 유방암 세포주 MDA-MB-231, MCF-7, MCF-7-HER18(HER18), 및 MDAMB-453 모두에는 P3 mRNA가 결여되어 있음을 나타낸다(도 22a). 유사하게, 3개의 상이한 유방 종양으로부터 추출된 유방암 세포(도 22b, 표 6)에도 P3 mRNA가 결여되어 있다. 세포주 유래의 WCL의 면역 블롯은, 유방암 세포에서 P3 단백질의 부재를 확인하였다(도 22c). 원발성 유방암의 면역 조직 화학 염색은 유방암 조직에서 P3을 검출하였지만, P3은, 유방 종양 세포 내가 아니라, 유방 종양 내의 염증성 구성성분에 한정되어 있었다(도 22d). 이들 데이터는, 유방암에서 P3을 나타내는 이전의 보고와 일치하지만(Desmedt et al., 2006), 본 발명자들의 데이터는, P3의 공급원이, 유방암 세포가 아니라 종양 내의 염증성 세포임을 시사한다.
Figure 112015014195088-pct00006
P3 은 유방암 세포에 의해 흡수된다. 본 발명자들은, P3이 유방암 세포에 의해 내인적으로 발현되지 않음을 밝혔기 때문에, 본 발명자들은, P3이, 이전에 NE에 대해 밝힌 바와 같이(Mittendorf et al., 2012) 유방암 세포에 의해 흡수될 수 있다고 가정하였다. HLA-A2-양성 세포주 MDA-MB-231, MCF-7, 및 HER18을 10mg P3과 1, 4, 및 24h에 공동배양하였고, 이어서, P3의 세포내 흡수에 대해 유세포 측정법을 이용하여 분석하였다(도 23a). 본 발명자들은, 3개의 세포주 모두에서의 P3 흡수의 시간-의존적 증가를 검출하였다. 본 발명자들은, 또한, 안정기로 나타나지 않는 P3의 용량-의존적 흡수를 입증하였고, P3 흡수에 대해 비수용체-매개된 프로세스를 제안하였다(도 23b). P3 흡수를 추가로 특성 확인하기 위해서, 이는 Ag 교차-제시에 관련되어 있으므로, 이는 별도의 세포 구획에서 발생하고(Cresswell et al., 2005), 본 발명자들은, 레이저 공초점 현미경법을 수행하였고, 흡수에 따라 P3은, LAMP-2로의 P3 공동 염색에 의해 나타낸 바와 같이 리소솜 내에 국재한다는 것을 밝혔다(도 23c). 리소솜 구획에의 흡수는 조기 시점(1 내지 4h)에 발생하였고, HLA 클래스-I 분자 상의 교차-제시를 위해 프로세싱되는 것이므로 Ag 분해에 있어 초기 단계일 수 있다(Basha et al., 2008).
상이한 세포 경로가 가용성 및 세포-관련 단백질의 흡수 및 프로세싱에 관여하므로, 이는, 이들이 교차-제시되는지를 측정할 수 있고(Burgdorf et al., 2006), 유방암을 포함하는 종양 조직 내에서 호중구가 보고되었으므로(Queen et al., 2005 및 Jensen et al., 2009), 본 발명자들은, 유방암 세포에 의해 가용성 및 세포-관련된 P3의 흡수에 차이가 존재했는지를 평가하였다. 이를 실험하기 위해, MDA-MB-231 세포를, 가용성 P3(10mg/ml)과 또는 방사선 조사된 PMN 또는 PBMC와 1:1의 비로 4h 동안 공동 배양하였다(도 24a; 데이터 도시하지 않음). 데이터는, 유방암 세포가 가용성 P3뿐만 아니라 세포-관련된 P3도 둘 다 흡수할 수 있음을 입증하였다. 사실상, 세포-관련된 P3으로부터의 흡수는 가용성 단백질의 흡수와 비교하여 더욱 효과적인 것으로 밝혀지고(중간값(median) 형광성 강도[MFI] = 12,292 대 1,356; p, 0.05), 이는, 흡수를 가능하게 할 수 있는 다른 단백질과 P3의 회합으로 인한 것일 수 있다.
P3 및 NE는 유방암 세포에 의해 교차-제시된다. 본 발명자들은, NE도 유방암에 의해 흡수된다는 것을 밝혔으므로(Mittendorf et al., 2012), 그리고, PR1은 호중구 아주르 과립(azurophil granule) 프로테아제 NE 및 P3 둘 다로부터 유도되므로, 본 발명자들은, NE 및 P3이 흡수에 따라 유방암 세포에 의해 교차-제시되는지를 조사하였다. HLA-A2+ MDA-MB-231 세포를, 증가하는 시점에서 가용성 P3 또는 NE와 함께 공동 배양하였고, 후속적으로, 마우스 항-PR1/HLA-A2 Ab 8F4를 이용하여 PR1/HLA-A2 발현에 대해 분석하였다(Sergeeva et al., 2011). 이들 데이터는, 유방암 세포가 NE 및 P3 둘 다로부터 PR1을 교차-제시할 수 있음을 나타낸다. 유의한 PR1 교차-제시는, 24h에서 처음으로, 펄싱되지 않은 세포와 비교하여, NE 및 P3과의 배양에 따른 유방암 세포 표면 상의 PR1/HLA-A2에서 각각 2.5-배 및 3.0-배 증가로 나타났다(도 24b). 세포 표면 상의 HLA-A2 발현의 유의한 증가는 존재하지 않았다(데이터 도시하지 않음).
또한, NE 및 P3 교차-제시에 관여하는 세포내 메커니즘을 조사하기 위해, 본 발명자들은, 프로테아솜 및 ER/골지가 NE 및 P3 교차 제시에 관여하는지를 연구하였고, 다른 Ag에 대해 이전에 밝혀진 바와 같았다(Francois et al., 2009, Kovacsovics-Bankowski et al., 1995 및 Mukai et al., 2009). 본 발명자들의 데이터는, 골지 전방성 수송체에 대한 ER을 저해하는 브레펠딘 A와의, 그리고, 프로테아솜 저해제인 락타시스틴과의 세포의 항온배양이 둘 다 NE 또는 P3과의 공동 배양 후에 MDA-MB-231 유방암 세포에 의해 PR1/HLA-A2 발현을 감소시켰으므로, ER/골지 및 프로테아솜이 둘 다 NE 및 P3 교차-제시에 관여한다는 것을 나타낸다(도 24c, 도 24d). 이는, APC에 의한 NE 및 P3 교차-제시에서의 프로테아솜 및 ER/골지 관여를 입증하는 본 발명자들의 이전 결과와 유사하다(Alatrash et al., 2012).
PR1 교차-제시는 유방암이 PR1 -표적 치료요법에 민감성이 되게 한다. PR1은 PR1 펩타이드 백신(Rezvani et al., 2008), PR1-CTL(Rezvani et al., 2007 및 Ma et al., 2010), 및 항-PR1/HLA-A2 Ab(8F4)(Sergeeva et al., 2011)을 이용하여 백혈병에서 효율적으로 표적화되었으므로, 본 발명자들은, 교차-제시에 따른 유방암 세포 상의 PR1/HLA-A2 발현이 이들 세포를 PR1-CTL 및 8F4 Ab에 의한 사멸에 대해 민감성이 되게 할 것인지를 조사하였다. 10mg/ml의 NE 또는 P3을 함유하는 배지 중에서 HLA-A2+ MDA-MB-231 세포를 24h 동안 배양하였고 이어서, 표준 칼세인-AM 세포독성 검정에서 건강한 공여자-확장된 PR1-CTL과 4h 동안 항온배양하였다(Molldrem et al., 1996; Jiang et al., 1996)(도 24e). 데이터는, NE 및 P3의 교차-제시가, 펄싱되지 않은 MDA-MB-231 세포와 비교하여, NE 또는 P3 펄싱 후 PR1-CTL에 의한 사멸에 대해 MDA-MB-231 세포의 민감성을 증가시켰음을 입증한다. 유사하게, 보체-의존적 세포독성 검정에서 8F4 Ab를 이용하여(도 24f)(Sergeeva et al., 2011), 본 발명자들은, 펄싱되지 않은 세포와 비교하여, NE 또는 P3 교차-제시에 따른 MDA-MB-231 세포의 용량-의존적 사멸을 관찰하였다. 최고 용량(10mg/ml)의 8F4 Ab에서 최대 사멸이 나타났다.
PR1 / HLA -A2 및 PR1 - CTL 은, 유방암을 지닌 환자에서 검출된다. 본 발명자들은, 배양된 유방암 세포주 및 종양 조직에 내인성 NE 및 P3이 결여되어 있음을 밝혔으므로, 그리고, 본 발명자들은, 유방암 세포에 의한 NE 및 P3 교차-제시, 및 이에 후속하는 PR1-표적 치료요법에 대한 민감성의 시험관내 증거를 관찰하였으므로, 본 발명자들은, 원발성 유방암 환자 조직에서 PR1이 검출될 수 있는지를, 그리고, 유방암을 지닌 환자 유래의 말초 혈액에서 PR1-CTL이 검출될 수 있는지를 조사하였다. 2개의 HLA-A2-양성 유방암 조직의 레이저 공초점 현미경은 종양 조직 둘 다에서 8F4를 입증하였다(도 25a). HLA-A2-음성 조직에서 8F4 염색은 부재하였다(데이터 도시하지 않음). 또한, PR1/HLA-A2의 발현이, 침윤성 백혈구에 의한 것이 아니라 유방암 세포에 의한 것임을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 연이은 유암방 조직 절편을 백혈구 마커 CD45로 염색하였다. 본 발명자들은, 8F4 및 CK7로 공동 염색된 유방암 조직의 영역에서의 CD45 염색의 부재를 밝혔고, 추가로, PR1/HLA-A2 발현이, 인접한 염증성 세포에 의한 것이 아니라 유방암 세포에 의한 것이었음을 확인하였다(도 25b).
PR1-CTL이 유방암 환자에서 검출될 수 있는지를 결정하기 위해서, 본 발명자들은, 조기-단계 유방암 환자 유래의 11개의 말초 혈액 샘플의 PR1/HLA-A2 덱스트라머 염색을 사용하였다(도 25c). 이들 HLA-A2+ 환자에서의 PR1-CTL의 중간값 출현빈도는 CD8+ T 세포의 0.05%였고(범위, 0.02 내지 0.2%), 건강한 공여자에서의 PR1-CTL의 출현빈도보다 약간 더 높았다(1/15,000 내지 1/350,000 CD8+ 세포)(Molldrem et al., 1997). 이를 종합하여 고려하면, 이들 생체내 데이터는, 종양 미세 환경에 존재하는 세린 프로테아제 NE 및 P3이, 유방암 세포에 의해 흡수되어 교차-제시될 수 있고, 이는, NE- 및 P3-유도된 에피토프 PR1에 대항하는 후천성 면역 반응에 기여할 수 있음을 시사한다.
흑색종 환자에서의 PR1 / HLA -A2 및 PR1 - CTL . 흑색종 조직은, NE 및 P3을 위한 공급원일 수 있는 염증성 세포를 갖는 것으로도 밝혀졌으므로(Jensen et al., 2012), 그리고, 흑색종은 면역 치료요법에 민감성인 것으로 알려져 있으므로(Dudley et al., 2002 및 Schwartzentruber et al., 2011), 본 발명자들은, 이어서, NE 및 P3의 교차-제시가 또한 흑색종에서도 검출될 수 있는지를 조사하였다. PR1-CTL이 흑색종에서도 검출되는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은, 흑색종 환자 유래의 PBMC를 PR1/HLA-A2 덱스트라머로 염색하였고, 7명의 환자 모두에서 PR1-CTL을, 정상 공여자 유래의 혈액에서 보여진 것과 유사하게 0.014%의 CD8+ T 세포의 중간값 출현빈도(범위, 0.0053 내지 0.019%)(도 25c)로 검출하였다. 또한, 본 발명자들은, HLA-A22(흑색종 2) 흑색종 조직이 아닌 1개의 HLA-A2+(흑색종 1)에서 PR1/HLA-A2 발현을 검출하였다(도 25d).
흑색종에 의한 NE 및 P3 교차-제시는 PR1 - CTL 에 대한 민감성을 증가시킨다. 흑색종이 NE 및 P3을 발현하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은, 환자로부터 얻어진 흑색종 조직을 NE 및 P3에 대해 염색하였고, NE 및 P3의 부재를 나타냈다(도 26a, 도 26b). 본 발명자들은, 또한, 4개의 흑색종 세포주인 MEL526, MEL624, MT2019, 및 MT2333에서 NE 및 P3 발현을 분석하였다. 웨스턴 블롯 분석은 흑색종 세포주에서 NE 및 P3의 부재를 나타낸다(도 26c). 유방암과 유사하게, 본 발명자들은, HLA-A2+ Mel 526 세포주에 의한 N3 및 P3의 흡수 및 교차-제시를 입증한다(도 26d, 도 26e). 8F4 Ab는, 입체구조적 PR1/HLA-A2 에피토프의 상당한 부분을 구성하는 HLA-A2 분자에 결합하므로(Sergeeva et al., 2011 및 Porgador et al., 1997), Mel 526 세포는, NE 또는 P3과의 공동 배양 전에 8F4로의 염색을 나타낸다(데이터 도시하지 않음). 그러나, 8F4로의 염색은, NE 또는 P3과의 공동 배양 후에 HLA-A2 표면 염색을 증가시키지 않으면서(데이터 도시하지 않음) 증가하고, 이는 세포 표면 상의 PR1/HLA-A2 발현의 증가를 나타낸다. 또한, NE 및 P3의 교차-제시는, PR1-CTL에 의한 사멸에 대해 HLA-A2+ Mel 526 세포주의 민감성을 증가시켰고, 최고 E:T 비에서 최고 사멸이 나타났다(도 26f).
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본원에 개시되고 청구된 조성물 및/또는 방법의 전부는, 본 개시를 고려하여 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시형태의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 개념, 정신, 및 범위를 벗어나지 않으면서, 본원에 기술되어 있는 조성물 및/또는 방법에, 그리고, 본원에 기술되어 있는 방법의 단계에서, 또는 본원에 기술되어 있는 방법의 단계의 순차에 변화가 적용될 수 있음은 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리학적으로 둘 다 관련되는 소정 제제는 본원에 기술되어 있는 제제로 치환될 수 있고, 한편, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 것임은 명백할 것이다. 당해 분야 숙련가에게 명백한 모든 이러한 유사한 치환 및 변형은, 첨부된 특허청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내인 것으로 생각된다.
VIII. 참조문헌
하기 참조 문헌은, 이들이, 본원에 제시된 것에 보충하여 예시적 절차 또는 다른 상세 설명을 제공하는 정도로, 본원에 인용에 의해 구체적으로 포함된다.
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Figure 112015014195088-pct00013
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> MONOCLONAL ANTIBODIES FOR USE IN DIAGNOSIS AND THERAPY OF CANCERS AND AUTOIMMUNE DISEASE <130> UTFC.P1136WO <150> 61/669,967 <151> 2012-07-10 <150> 61/702,916 <151> 2012-09-19 <160> 60 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 429 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atgaacttcg ggctcagctt gattttcctg gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgga tatggcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gacaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240 gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaagacaca gccatgtatt actgtgcaag acatgagggg 360 ggttactacg gtagtagccc tgcctggttt gtttactggg gccaagggac tctggtcact 420 ctctctgca 429 <210> 2 <211> 143 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Leu Ser Ala 130 135 140 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gly Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala Trp Phe Val Tyr 1 5 10 15 <210> 6 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 atggagtcac agattcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180 ggacaatctc ctaaactgct gatttactcg acatcctacc ggtacactgg agtccctgat 240 cgcttcactg gcagtggatc tgggacggtt ttcactttca ccatcaacag tgtccaggct 300 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattttatta ctcctccgac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa a 381 <210> 7 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Phe Thr Ile Asn 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe 100 105 110 Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Gln Gln His Phe Ile Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 11 <211> 463 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 11 actagtacca ccatgaactt cgggctcagc ttgattttcc tggccctcat tttaaaaggt 60 gtccagtgtg aggtgcagct ggtggagtct gggggagact tagtgaagcc tggagggtcc 120 ctgaaactct cctgtgcagc ctctggattc actttcagtg gatatggcat gtcttgggtt 180 cgccagactc cagacaagag gctggagtgg gtcgcaacca ttagtagtgg tggtagttac 240 acctactatc cagacagtgt gaaggggcga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300 accctgtacc tgcaaatgag cagtctgaag tctgaagaca cagccatgta ttactgtgca 360 agacatgagg ggggttacta cggtagtagc cctgcctggt ttgtttactg gggccaaggg 420 actctggtca ctctctctgc aggtgagtcc taacttcaag ctt 463 <210> 12 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Leu Ser Ala 130 135 140 <210> 13 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 13 gctagcacca ccatggagtc acagattcag gtctttgtat tcgtgtttct ctggttgtct 60 ggtgttgacg gagacattgt gatgacccag tctcacaaat tcatgtccac atcagtagga 120 gacagggtca gcatcacctg caaggccagt caggatgtga gtactgctgt agcctggtat 180 caacagaaac caggacaatc tcctaaactg ctgatttact cgacatccta ccggtacact 240 ggagtccctg atcgcttcac tggcagtgga tctgggacgg ttttcacttt caccatcaac 300 agtgtccagg ctgaagacct ggcagtttat tactgtcagc aacattttat tactcctccg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtaagt agaatccaaa gaattc 416 <210> 14 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Phe Thr Ile Asn 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe 100 105 110 Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 15 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala Trp Phe Val 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Leu Ser Ala 115 120 <210> 16 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala Trp Phe Val 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Val 20 25 30 Arg Gln Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Phe Thr Ile Ser 35 40 45 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 50 55 60 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75 80 Met Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Phe Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe Ile Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe Ile Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe Ile Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 50 55 60 Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 65 70 75 80 <210> 22 <211> 463 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 22 actagtacca ccatgaactt cgggctcagc ttgattttcc tggccctcat tttaaaagga 60 gtccagtgtg aagtgcagct ggtggagtct ggcggaggcc tcgtgcagcc tggaggatcc 120 ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc actttcagcg gatatggcat gtcttgggtt 180 cgccaggctc caggcaaggg gctcgaatgg gtcgcaacca ttagtagtgg tggtagttac 240 acctactatc cagacagtgt gaaggggcga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300 tcactgtacc tgcaaatgaa cagtctgaga gccgaagaca cagccgtgta ttactgtgca 360 agacatgagg gaggctacta cggtagtagc cctgcctggt ttgtttactg gggccaaggg 420 actatggtca ctgtctcttc aggtaagatg ggcttccaag ctt 463 <210> 23 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 23 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 24 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 24 gctagcacca ccatggagtc acagattcag gtctttgtat tcgtgtttct ctggttgtct 60 ggtgttgacg gagacattca gatgacccag tctccatcct ccctgtccgc atcagtagga 120 gacagggtca ccatcacctg caaggccagt caggatgtga gtactgctgt ggcctggtac 180 caacagaaac caggaaaagc ccctaaactg ctgatttact ccacatccta ccggtacact 240 ggagtccctt cacgcttcag tggcagtgga tctgggaccg ttttcacttt caccatcagc 300 agtctgcagc ctgaagacat tgcaacatat tactgtcagc aacattttat tactcctccc 360 acattcggtg gaggcaccaa agtggaaatc aaacgtaagt gcactttcct gaattc 416 <210> 25 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 25 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe 100 105 110 Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 26 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 26 gctagcacca ccatggagtc acagattcag gtctttgtat tcgtgtttct ctggttgtct 60 ggtgttgacg gagacattca gatgacccag tctccatcct ccctgtccgc atcagtagga 120 gacagggtca ccatcacctg caaggccagt caggatgtga gtactgctgt ggcctggtac 180 caacagaaac caggaaaagc ccctaaactg ctgatttact ccacatccta ccggtacact 240 ggagtccctt cacgcttcag tggcagtgga tctgggaccg atttcacttt caccatcagc 300 agtctgcagc ctgaagacat tgcaacatat tactgtcagc aacattttat tactcctccc 360 acattcggtg gaggcaccaa agtggaaatc aaacgtaagt gcactttcct gaattc 416 <210> 27 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe 100 105 110 Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 28 gaaccgtcag atcgcctgga gacg 24 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 29 tgaaagatga gctggaggac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 30 ctttcttgtc caccttggtg 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 31 gctgtcctac agtcctcag 19 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 32 acgtgccaag catcctcg 18 <210> 33 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 33 atgaacttcg ggctcagctt gattttcctg gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgga tatggcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gacaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240 gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaagacaca gccatgtatt actgtgcaag acatgagggg 360 ggttactacg gtagtagccc tgcctggttt gtttactggg gccaagggac tctggtcact 420 ctctctgcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422 <210> 34 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Leu Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 145 150 155 160 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 180 185 190 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 195 200 205 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 210 215 220 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 225 230 235 240 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 255 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 325 330 335 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 370 375 380 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 35 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 35 atggagtcac agattcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180 ggacaatctc ctaaactgct gatttactcg acatcctacc ggtacactgg agtccctgat 240 cgcttcactg gcagtggatc tgggacggtt ttcactttca ccatcaacag tgtccaggct 300 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattttatta ctcctccgac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 36 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Phe Thr Ile Asn 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe 100 105 110 Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 37 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 37 atgaacttcg ggctcagctt gattttcctg gccctcattt taaaaggagt ccagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg cggaggcctc gtgcagcctg gaggatccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagcgga tatggcatgt cttgggttcg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tcgaatgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240 gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc actgtacctg 300 caaatgaaca gtctgagagc cgaagacaca gccgtgtatt actgtgcaag acatgaggga 360 ggctactacg gtagtagccc tgcctggttt gtttactggg gccaagggac tatggtcact 420 gtctcttcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422 <210> 38 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 145 150 155 160 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 180 185 190 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 195 200 205 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 210 215 220 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 225 230 235 240 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 255 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 325 330 335 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 370 375 380 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 39 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 39 atggagtcac agattcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60 gacattcaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtccgcat cagtaggaga cagggtcacc 120 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtgg cctggtacca acagaaacca 180 ggaaaagccc ctaaactgct gatttactcc acatcctacc ggtacactgg agtcccttca 240 cgcttcagtg gcagtggatc tgggaccgtt ttcactttca ccatcagcag tctgcagcct 300 gaagacattg caacatatta ctgtcagcaa cattttatta ctcctcccac attcggtgga 360 ggcaccaaag tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 40 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 40 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe 100 105 110 Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 41 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 41 atggagtcac agattcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60 gacattcaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtccgcat cagtaggaga cagggtcacc 120 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtgg cctggtacca acagaaacca 180 ggaaaagccc ctaaactgct gatttactcc acatcctacc ggtacactgg agtcccttca 240 cgcttcagtg gcagtggatc tgggaccgat ttcactttca ccatcagcag tctgcagcct 300 gaagacattg caacatatta ctgtcagcaa cattttatta ctcctcccac attcggtgga 360 ggcaccaaag tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 42 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 42 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe 100 105 110 Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 43 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 43 atgaacttcg ggctcagctt gattttcctg gccctcattt taaaaggagt ccagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg cggaggcctc gtgcagcctg gaggatccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagcgga tatggcatgt cttgggttcg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tcgaatgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240 gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc actgtacctg 300 caaatgaaca gtctgagagc cgaagacaca gccgtgtatt actgtgcaag acatgaggga 360 ggctactacg gtagtagccc tgcctggttt gtttactggg gccaagggac tatggtcact 420 gtctcttcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagct 780 gctggaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422 <210> 44 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 44 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 145 150 155 160 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 180 185 190 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 195 200 205 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 210 215 220 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 225 230 235 240 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 255 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 325 330 335 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 370 375 380 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 45 Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr Val 1 5 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 46 gccagtggat agaccgatgg 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 47 gatggataca gttggtgcag c 21 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 48 gcaactagta ccaccatgaa cttcgggctc agc 33 <210> 49 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 49 cgaaagcttg aagttaggac tcacctgcag agagagtgac cagag 45 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 50 gcagctagca ccaccatgga gtcacagatt cag 33 <210> 51 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 51 cgagaattct ttggattcta cttacgtttg atttccagct tggtg 45 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 52 gaccccacca tggctcac 18 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 53 atgggaagga cagacaggag 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 54 agcactgcta cgcaggctct 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 55 ataagaaaga gaaggtgtgg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 56 ccagagcaag agagctatcc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 57 ctgtggtggt gaagctgtag 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 58 tagacgggaa gctcactggc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 59 aggtccacca ccctgttgct 20 <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly

Claims (61)

  1. 서열번호 3, 서열번호 60, 및 서열번호 5로 각각 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10으로 각각 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    HLA-A2 수용체에 의해 결합되는 경우에 VLQELNVTV(서열번호 45)에 결합하는 사람화된 항체.
  2. 서열번호 16으로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19 또는 20으로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    HLA-A2 수용체에 의해 결합되는 경우에 VLQELNVTV(서열번호 45)에 결합하는 사람화된 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 16으로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 사람 감마-1 중쇄 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 및
    서열번호 19로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 사람 카파 경쇄 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 16으로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 사람 감마-1 중쇄 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 및
    서열번호 20으로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 사람 카파 경쇄 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 사람 감마-1 중쇄 불변 영역이 서열번호 38로 나타낸 아미노산 서열 중의 불변 영역이고, 상기 사람 카파 경쇄 불변 영역이 서열번호 42로 나타낸 아미노산 서열 중의 불변 영역인, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 분리되고 정제된 것인, 항체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 비-항체 펩타이드 또는 폴리펩타이드 절편에 융합된 것인, 항체.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 형광단, 발색단, 염료, 방사성 동위원소, 화학발광성 분자, 상자성(paramagnetic) 이온, 및 스핀-트랩핑(spin-trapping) 시약으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 진단 시약에 연결되거나, 상기 항체가 사이토카인, 화학 치료제, 방사선 치료제, 호르몬, 항체 Fc 단편, TLR 효능제(agonist), CpG-함유 분자, 및 면역 공동-자극성 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치료학적 시약에 연결되는, 항체.
  9. 제2항에 따른 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
  10. 제2항에 따른 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
  11. 제9항에 따른 핵산 및/또는 제10항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제2항에 따른 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 및 제2항에 따른 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 도입된 숙주 세포.
  13. 제4항에 따른 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 및 제4항에 따른 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이 도입된 숙주 세포.
  14. 제12항에 따른 숙주 세포를, HLA-A2 수용체에 의해 결합되는 경우에 VLQELNVTV(서열번호 45)에 결합하는 사람화된 항체의 발현을 지지하는 조건하에서 배양함을 포함하는, 사람화된 항체의 제조 방법.
  15. 제13항에 따른 숙주 세포를, HLA-A2 수용체에 의해 결합되는 경우에 VLQELNVTV(서열번호 45)에 결합하는 사람화된 항체의 발현을 지지하는 조건하에서 배양함을 포함하는, 사람화된 항체의 제조 방법.
  16. 제14항에 따른 방법에 의해 제조되며, HLA-A2 수용체에 의해 결합되는 경우에 VLQELNVTV(서열번호 45)에 결합하는 사람화된 항체.
  17. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되며, HLA-A2 수용체에 의해 결합되는 경우에 VLQELNVTV(서열번호 45)에 결합하는 사람화된 항체.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 항체가 형광단, 발색단, 염료, 방사성 동위원소, 화학발광성 분자, 상자성(paramagnetic) 이온, 및 스핀-트랩핑(spin-trapping) 시약으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 진단 시약에 연결되거나, 상기 항체가 사이토카인, 화학 치료제, 방사선 치료제, 호르몬, 항체 Fc 단편, TLR 효능제(agonist), CpG-함유 분자, 및 면역 공동-자극성 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치료학적 시약에 연결되는, 항체.
  19. 제1항 내지 제5항, 16항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 대상체의 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암이 고형 종양 또는 혈액암인, 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 고형 종양이, 두경부 종양, 뇌 종양, 식도 종양, 유방 종양, 폐 종양, 간 종양, 비장 종양, 위 종양, 소장 종양, 대장 종양, 직장 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 자궁 경부 종양, 전립선 종양, 고환 종양, 또는 피부 종양인, 약제학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 암이 백혈병 및 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 혈액암인, 약제학적 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 암이 재발성 또는 전이성 암인, 약제학적 조성물.
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