MX2015000450A

MX2015000450A - Anticuerpos monoclonales para el uso en la diagnosis y la terapia de canceres y de enfermedades autoinmunes.

Info

Publication number: MX2015000450A
Application number: MX2015000450A
Authority: MX
Inventors: Jeffrey Molldrem; Anna Sergeeva
Original assignee: Univ Texas
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2015-07-14
Also published as: HUE043443T2; KR102049222B1; CA2883056C; WO2014011489A2; AU2013288982B2; PH12015500074B1; EP3088421B1; US20150191546A1; MX360984B; US11192958B2; CN104540522A; CN104540522B; PH12015500074A1; CY1121743T1; EA034033B1; KR20150039774A; IL236664A0; EA201590187A1; ES2720291T3; AU2013288982A1

Abstract

La especificación describe las secuencias para los anticuerpos que reconocen el péptido PR-1 restringido a HLA-A2 en el contexto de la presencia de HLA en la superficie de las células cancerosas. También se proporciona el uso de estos anticuerpos en la diagnosis y el tratamiento del cáncer y de las enfermedades relacionadas con la inmunidad.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA EL USO EN LA ENFERMEDADES AUTOINMUNES Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada La presente solicitud reclama el beneficio de la prioridad al Número de Serie de Solicitud Provisional Americana 61 /669,967, presentado el 10 de julio de 2012 y 61 /702,916, presentado el 19 de septiembre de 2012, el contenido completo de ambas solicitudes se incorpora por este medio por referencia.

Se realizó esta invención con el apoyo gubernamental bajo P50 CA 100632 concedido por el Instituto Nacional de Cáncer/lnstitutos Nacionales de la Salud . El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a los campos de cáncer y de inmunoterapia. Más particularmente, se refiere a anticuerpos inmunodiagnósticos e inmunoterapeuticos para el tratamiento y la prevención del cáncer y de la enfermedad autommune.

Antecedentes de la Invención El sistema inmune se ha implicado durante mucho tiempo en el control del cáncer; sin embargo, la evidencia de inmunorespuestas específicas y eficaces en cáncer humano han sido carentes. En leucemia mieloide crónica (CM L, por sus siglas en ingles), ya sea trasplante alogénico de médula (BMT, por sus siglas en inglés) o terapia de interferón-a2b (IFN-a2b) ha dado lugar a la remisión completa, pero el mecanismo para el control de enfermedades es desconocido y puede implicar respuestas antileucémicas inmunes.

Basado en la evidencia en la téenica, se propone que los linfocitos desempeñan un papel en la intervención de un efecto antileucemia. Los estudios han demostrado que las infusiones del donante de I i nfocito alogénico se han usado para tratar la recaída de la leucemia mieloide después del BMT alogénico (Giralt and Kolb, 1996; Kolb and Holler, 1997; Kolb et al., 1995; Kolb et al., 1996; Antin, 1993). La transfusión de linfocitos del donante de médula original (BM , por sus siglas en inglés) induce las respuestas hematológicas y citogenéticas en aproximadamente 70% a 80% de pacientes con leucemia mielocítica crónica (CM L, por sus siglas en inglés) en fase crónica (CP, por sus siglas en inglés) (Kolb et al., 1996, Kolb and Holler, 1997). Las remisiones después de DLI para AM L no son generalmente tan durables como las obtenidas en la CM L de fase crónica, que puede reflejar la cinética rápida del crecimiento tumoral que supera la cinética de la inmunorespuesta en desarrollo. Adicionalmente, la mayoría de los pacientes con formas mieloides de leucemia morirán de la enfermedad a menos que puedan ser tratados con trasplante alogénico de médula, donde el injerto asociado contra el efecto de leucemia (GVL, por sus siglas en inglés) cura a los pacientes. Sin embargo, la enfermedad de injerto-contra-huésped (GVHD, por sus siglas en inglés) y la toxicidad relacionada con trasplante limitan este tratamiento. Se cree que GVL puede ser separable de GHVD, y que dirigiendo la inmunorespuesta hacia los antígenos asociados con leucemia permitirá la transferencia de GVL a los pacientes sin GVHD.

Así, si más antígenos (es decir, los antígenos de leucemia o los antígenos contra otros cánceres) podrían determinarse, y si una gran número de los linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno más potentes (CTL, por sus siglas en inglés) podrían obtenerse, que permitiría el desarrollo de terapias específicas a leucemias, terapias específicas al cáncer de mama , etc. al usar los antígenos como objetivos para vacunas o para generar los células T específicas para el uso en inmunoterapia adoptiva.

PR1 , un nonámero restringido por HLAA2.1 derivado de la proteinasa 3 (P3) y la elastasa, se identificó como un antígeno asociado con leucemia (Molldrem et al., 2000; Molldrem et al., 1996; Molldrem et al. , 1997; Molldrem et al., 1999; Molldrem et al., 2003 cada uno incorporado en la presente por referencia en su totalidad). El hallazgo que PRI es un antígeno asociado con leucemia ha sido confirmado independiente por Burchert et al. (2002) y Scheibenbogen et al. (2002). Los CTL que son específicas para PR1 que suprime las células AML, CML y M DS, pero no células de médula no normales. En un reciente estudio de vacuna de fase l/l l , el peptido de PR1 se ha administrado a pacientes con AML, CML y M DS, y la inmunidad de CTL específico a PR 1 se ha suscitado en 47% de pacientes, y las respuestas clínicas se han observado en 26% . Así, este antígeno proporciona una plataforma interesante para investigación adicional en inmunorespuestas anticáncer así como para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos.

Breve Descripción de la Invención Así, de acuerdo con la presente invención , se proporciona un anticuerpo aislado y purificado que une a VLQELNVTV (SEC ID NO: 45) cuando se une por un receptor H LA-A2, dicho anticuerpo que tiene las CDR de cadena pesada incluyendo las SEC ID NOS: 3, 4 y 5, y las CDR de cadena ligera incluyendo las SEC I D NOS: 8, 9 y 10. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de ratón, un solo anticuerpo de cadena, un anticuerpo biespecífico, fusionado a un segmento de péptido o de polipéptido de no anticuerpo, ligado a un reactivo de diagnosis (como un fluoróforo, un cromóforo, un tinte, un radioisótopo, una molécula quimioluminiscente, un ion paramagnético, o un reactivo interceptador de órbita), ligado a un reactivo terapéutico (como una citocina, un quimioterapéutico, un radioterapéutico, una hormona, un fragmento de Fe de anticuerpo, un agonista de TLR, una molécula qüe contiene CpG , o una molécula co-estimulante inmune), un anticuerpo humanizado, o combinaciones de los anteriores. El anticuerpo biespecífico puede tener, además de la afinidad de unión para la SEC ID NO: 45, afinidad de unión para las celulas B (CD19, CD20) , células NK, fagocitos (CD16) , o monocitos (CD14). Un anticuerpo humanizado particular puede tener secuencias de cadena ligera/cadena pesada de las SEC ID 5 NOS: 38 y 36 o SEC I D NOS: 40 y 36 y SEC ID NOS: 40 y 42.

En otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico que codifica las CDR de cadena ligera codificada por las SEC I D NOS: 8, 9 y 10. El ácido nucleico puede codificar la SEC ID NO: 7 o la SEC ID NO: 12, o puede codificar la SEC ID NO: 23 o la SEC ID ío NO: 25. El ácido nucleico puede comprender además una secuencia promotora colocada en 5' para el ácido nucleico que codifica las CDR de cadena ligera, como un activo en células eucarióticas o células procarióticas. El ácido nucleico puede localizarse en un vector replicable, como un vector no viral o un 15 vector viral. El ácido nucleico además puede comprender segmentos que codifican los enlazadores, donde dichos segmentos que codifican enlazadores localizados entre dichos segmentos que codifican la CDR, como uno que codifique un motivo de hélice-giro-hélice. 20 En aún otra modalidad, se proporciona un anticuerpo artificial que comprende un segmento que codifica la cadena pesada que comprende las CDR que comprenden las secuencias de las SEC ID NOS: 3, 4 y 5; y que comprenden un segmento que codifica la cadena ligera que comprende las CDR que comprenden 25 las secuencias de las SEC I D NOS: 8, 9 y 10. Las CDR pueden unirse mediante enlazadores sinteticos. La cadena pesada puede fusionarse a un segmento de péptido o de polipéptido de no anticuerpo. El anticuerpo puede ligarse a un reactivo de diagnosis, como un fluoróforo, un cromóforo, un tinte, un radioisótopo, una molécula quimioluminiscente, un ion paramagnético, o un reactivo interceptador de órbita. El anticuerpo puede ligarse a un reactivo terapéutico, como una citocina, una toxina, un quimioterapéutico, un radioterapéutico, una hormona, un fragmento de Fe de anticuerpo, elastasa de neutrófilos, proteinasa 3, un agonista de TLR, una molécula que contiene CpG , o una molécula co-estimulante inmune. La cadena ligera puede comprender la SEC I D NO: 7, la SEC I D NO: 12, la SEC I D NO: 23 o la SEC I D NO: 25, y/o la cadena pesada comprende la SEC ID NO: 36 o la SEC ID NO: 42.

En todavía aún otra modalidad, se proporciona un método para hacer un anticuerpo que comprende (a) introducir en una célula hospedadora (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende las CDR mostradas en las SEC ID NOS: 3, 4 y 5, y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera que comprende las CDR mostradas en las SEC I D NOS: 8, 9 y 10; y (b) cultivar dicha célula hospedadora bajo condiciones que soportan la expresión de dichas cadenas ligeras y pesadas. El método puede además comprender el aislamiento de dicho anticuerpo. El método puede además comprende la etapa de ligar dicho anticuerpo a un agente de diagnosis o terapeutico.

En una modalidad adicional, se proporciona un método para detectar células anormales en una muestra sospechosa de contener las células anormales que comprenden poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo o un anticuerpo artificial como se describe antes. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede conjugarse a un agente de diagnosis (como un fluoróforo, un cromóforo, un tinte, un radioisótopo, una molécula quimioluminiscente, un ion paramagnético, o un reactivo interceptador de órbita). El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede detectarse al usar un agente de unión secundario, como un anticuerpo anti-receptor de Fe. La muestra puede ser (a) un tejido tumoral de tejido de la cabeza y cuello, de cerebro, de esófago, de mama, de pulmón , de hígado, de bazo, de estómago, de intestino delgado, de intestino grueso, de recto, de ovario, de útero, de cerviz, de próstata, de testículo o de piel, o (b) un fluido como sangre, linfa, orina, aspirado medular o aspirado de pezón . La muestra puede ser de un lecho de tumor resecado. El método puede además comprender tomar una decisión de tratamiento basada en la presencia, ausencia o grado de detección, como una decisión para tratar dicho sujeto con una vacuna banda de péptido basada en PR-1 . El método puede detectar células cancerosas primarias, células cancerosas metastáticas o células displásicas mieloides.

En aún una modalidad adicional, se proporciona un método para tratar un sujeto con cáncer que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o un anticuerpo artificial como se describe antes. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede conjugarse a un agente terapeutico. El cáncer puede ser un tumor sólido, como un tumor de cabeza y de cuello, un tumor cerebral, un tumor de esófago, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de hígado, un tumor de bazo, y tumor de estómago, un tumor de intestino delgado, un tumor de intestino grueso, un tumor rectal, un tumor ovárico, un tumor uterino, un tumor cervical, un tumor de próstata, un tumor testicular o un tumor de piel. El cáncer puede ser un cáncer de sangre, como una leucemia o un linfoma. El agente terapéutico puede ser una citocina, una toxina, un quimioterapéutico, un radioterapéutico, una hormona, un fragmento de Fe de anticuerpo, un agonista de TLR, una molécula que contiene CpG, o una molécula co estimulante inmune. El método puede además comprende proporcionar dicho sujeto con una segunda terapia anticáncer, como una terapia de gen , una quimioterapia, una radioterapia, una terapia de hormona, una terapia de toxina o cirugía. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede administrarse a dicho sujeto más de una vez. El cáncer puede ser cáncer recurrente o metastático. El anticuerpo puede administrarse a dicho sujeto más de una vez.

En todavía aún una modalidad adicional, se proporciona un método para tratar un sujeto con una enfermedad autommune que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o un anticuerpo artificial como se describe antes. La enfermedad autommune puede ser granulomatosis de Wegener, síndrome de Churg-Strauss, o vasculitis sistemica de pequeño vaso. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede conjugarse a un agente terapéutico, como una toxina o agente inductor de apoptosis. El método puede comprender además proporcionar dicho sujeto con una segunda terapia anti-autoinmune. La segunda terapia anti-autoinmune puede ser un agente antiinflamatorio. El anticuerpo puede administrarse a dicho sujeto más de una vez.

También se proporciona un método para inducir citotoxicidad mediada por complemento de una célula cancerosa HLA-A2 que comprende poner en contacto dicha célula cancerosa con un anticuerpo o un anticuerpo artificial como se describe antes.

Otra modalidad de la presente invención proporciona un método para detectar células anormales en una muestra sospechosa de contener células anormales que comprenden poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo o un anticuerpo artificial como se describe antes. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede conjugarse a un agente de diagnosis, como un fluoróforo, un cromóforo, un tinte, un radioisótopo, una molécula quimioluminiscente, un ion paramagnético, o un reactivo interceptador de órbita. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede detectarse al usar un agente de unión secundario, como un anticuerpo anti-receptor de Fe. La muestra puede ser (a) un tejido tumoral del tejido de cabeza y de cuello, de cerebro, de esófago, de mama, de pulmón , de hígado, de bazo, de estómago, de intestino delgado, de intestino grueso, de recto, de ovario, de útero, de cerviz, de próstata, de testículo o de piel, o (b) un fluido como sangre, linfa, orina, aspirado medular o aspirado de pezón . La muestra puede ser de un lecho de tumor resecado. El metodo puede además comprender tomar una decisión de tratamiento basada en la presencia, ausencia o grado de detección, como decidir a tratar dicho sujeto con una vacuna de péptido basado en PR-1 . El método puede detectar células cancerosas primarias, células cancerosas metastáticas o se detectan células displásicas mieloides.

En aún otra modalidad , se proporciona un método para tratar un sujeto con cáncer que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o anticuerpo artificial como se describe antes. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede conjugarse a un agente terapéutico, una tal citocina, una toxina, un quimioterapéutico, un radioterapéutico, una hormona, un fragmento de Fe de anticuerpo, un agonista de TLR, una molécula que contiene CpG , o una molécula co-estimulante inmune. El cáncer puede ser un tumor sólido, como un tumor de cabeza y de cuello, un tumor cerebral, un tumor de esófago, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de h ígado, un tumor de bazo, y tumor de estómago, un tumor de intestino delgado, un tumor de intestino grueso, un tumor rectal , un tumor ovárico, un tumor uterino, un tumor cervical, un tumor de próstata, un tumor testicular o un tumor de piel . Alternativamente, el cáncer puede ser un cáncer de sangre, como una leucemia o un linfoma. El cáncer puede ser cáncer recurrente o metastático. El metodo puede comprender además proporcionar dicho sujeto con una segunda terapia anticáncer, como una terapia de gen, una quimioterapia, una radioterapia, una terapia de hormona, una terapia de toxina o cirugía. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede administrarse a dicho sujeto más de una vez.

En aún otra modalidad , se proporciona un método para tratar un sujeto con una enfermedad autommune que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo o anticuerpo artificial como se describe antes. La enfermedad autoinmune puede ser granulomatosis de Wegener, síndrome de Churg-Strauss, o vasculitis sistémica de pequeño vaso. El anticuerpo o el anticuerpo artificial puede conjugarse a un agente terapéutico, como una toxina o agente inductor de apoptosis. El método puede además comprender proporcionar dicho sujeto con una segunda terapia anti-autoinmune, como un agente antiinflamatorio. El anticuerpo puede administrarse a dicho sujeto más de una vez.

Los métodos adicionales incluyen (i) tratar un sujeto con una enfermedad displásica mieloide que comprende administrar a dicho sujeto el anticuerpo o el anticuerpo artificial descrito antes; y (ii) inducir la citotoxicidad mediada por complemento de una celula cancerosa HLA-A2 que comprende poner en contacto dicha célula cancerosa con el anticuerpo o el anticuerpo artificial descrito antes.

Hu 1 -8F4 y Hu2-8F4 se refieren a Hu8F4-1 y Hu8F4-2, respectivamente. Además, el término "Hu8F4" en este documento se refiere generalmente a ambas formas humanizadas de 8F4 (Hu8F4-1 y Hu8F4-2).

Como se usa en la presente la especificación , "un" o " uno" puede significar uno o más. Como se usa en la presente en las reivindicaciones, cuando se usan conjuntamente con la palabra "que comprende", las palabras "un" o " uno" pueden significar uno o más que uno. Como se usa en la presente "otro" puede significar por lo menos un segundo o más.

Otros objetos y características de la presente invención llegarán a ser evidentes de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción y los ejemplos específicos, mientras que indica las modalidades preferidas de la invención, se dan por ilustración solamente, puesto que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención llegarán a ser evidentes a los expertos en la téenica de esta descripción detallada.

Breve Descripción de los Dibujos Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente.

FIG. 1 - Especificidad de 8F4 para PR1/HLA-A2. ELISA con monómeros de peptido recombinante/HLA-A2, cargado con PR1 o análogos PR1 modificados con aminoácido simples. Para determinar las posiciones del aminoácido dentro de la secuencia PR1 son esenciales para la unión de 8F4 óptima, los monómeros H LA-A2 cargados con péptidos que contienen sustituciones de alanina en PR1 (ALA1 -ALA9) cubiertos sobre pozos de microtítulo a concentraciones incrementadas. Los pozos entonces se incubaron con una concentración fija de 8F4 o el anticuerpo control bb7.2 (un anticuerpo monoclonal lgG2a de ratón específico del alelo HLA-A*0201 ). La unión se midió mediante ELISA al usar el anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado por peroxidasa. El 8F4 unido a H LA-A2 cargado con PR1 y la mayor parte de los análogos PR1 , con significantemente menos unión al análogo ALAI (alanina sustituida para valina en la posición 1 del péptido), y ninguna unión para el péptido de control pp65/HLA-A2. El anticuerpo control bb7.2 unido igualmente bien a PR1 - y a HLA-A2 cargado con pp65.

FIG. 2 - Afinidad del anticuerpo monoclonal 8F4 a PR1 /HLA-A2. Las mediciones de afinidad del péptido/HLA-A2 que unen a los anticuerpos 8F4 y bb7.2 se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial al usar el BIAcore 3000. Los anticuerpos de prueba se capturaron sobre superficies recubiertas con anticuerpo anti-ratón. El analito, peptido/HLA-A2, se diluyó a 100 nM y se probó dos veces para unión a las superficies recubiertas con anticuerpo. El análisis se realizó a 25C al usar PBS, 0.005% 5 de Tween-20, 0.1 mg/ml de BSA, pH 7.4 como el amortiguador de corrida. Para obtener la afinidad de unión los datos experimentales se ajustaron a un modelo cinético de primer orden (mostrado como líneas anaranjadas en las figuras) y KD para 8F4 y bb7.2 se determinó posteriormente ío FIG. 3 - Especificidad de 8F4 para HLA-A2+ AML.

Citometría de flujo de multiparámetro de leucemia y PBMC normal con 8F4 y anticuerpos de superficie celular. PBMC de pacientes con AM L y donantes normales se sincronizaron en células vivas al usar color aguamarina y después de tiñeron con 8F4 (conjugado 15 con el Fluor 647 de ALEXA), bb7.2 (conjugado con FITC), y anticuerpos de fenotipo superficial para CD13 y CD33, y analizado mediante citometría de flujo. La siguiente estrategia de sincronización se usó: primero, se analizaron las células vivas en color aguamarina para la expresión CD13 y CD33, y las células 20 positivas dobles se analizaron para la expresión de PR1 /HLA-A2 (8F4) y la expresión HLA-A2 total (bb7.2). La sincronización de cuadrante negativo se estableció al usar células de control de AML negativas a HLA-A2.

FIGS. 4A-B - Anticuerpo 8F4 induce la citotoxicidad 25 dependiente de complemento de AML. Las células objetivo se lavaron y se resuspendieron en 10-RPM l/HEPES a una concentración de 5 x 105 celulas/ml. Veinte microlitros (pl) de anticuerpo y 100 ml de células se mezclaron y se calentaron a 37°C en placas de 96 pozos, después se agregaron 20 mI de complemento de conejo estándar helado (Cedarlane, Ontario, Canadá) e incubaron a 37°C durante 90 min . Se determinó la citotoxicidad al usar el Ensayo de Citotoxicidad de Cyto-Tox Glo (Promega). Se calculó la CDC específica de anticuerpo (AB-CDC, por sus siglas en inglés) como: AB-CDC = ((Lc+AB-LC-AB)/(Lmax-Ls)) x 100%, donde LC +AB es la lisis celular objetivo en presencia de complemento más anticuerpo; LT+C es la lisis en presencia de complemento solamente; se midieron Lspont y Lmax antes y después de agregar el agente citotóxico digitonina a las células, por las instrucciones de los fabricantes. (FIG . 4A) La incubación con 20 pg de 8F4 indujo la citotoxicidad dependiente de complemento de células PBMC y de leucaféresis (LP, por sus siglas en inglés) tomadas de pacientes con HLA-A2+ AML, pero no las muestras de control de lisis de PBMC de AML o PBMC con H LA-A2-negativo del donante normal de HLA-A2 + . (FIG. 4B) la lisis mediada con 8F4 de HLA-A2+ AM L fue dependiente de dosis de anticuerpo, mientras que el anticuerpo control de isotipo (anti-KLH de ratón de lgG2a) e inmunoglobulina intravenosa humana (IVIG comercial) no muestran ninguna lisis de AML.

FIG. 5 - Especificidad de 8F4 para AML Pero No PBMC Normal. Tinción superficial de AM L, PBMC, y célula T2 para PR1 y HLA-A2. Las celulas se tiñeron con anticuerpo anti-PRI/H LA-A2 (8F4)-alexa-647 (rojo) y conjugado anti-H LA-A2-FITC (verde), se fijaron con 1 % de paraformaldehido, y después se estudiaron al usar microscopía confocal. Las células T2 se pulsaron con el 5 péptido PR1 (20 mg/ml) como un control positivo y con el péptido pp65 de CMV (20 pg/ml) como un péptido de control negativo. La expresión PR1 /HLA-A2 es evidente en la superficie celular de AML y células T2 pulsadas con PR 1 , pero no en H LA-A2+ PBMC o en las células T2 pulsadas con pp65. Dapi-azul fue usado para la ío tinción nuclear.

FIG. 6 - el anticuerpo 8F4 previene el prendimiento del injerto de AM L en modelo in vivo. Se lavaron las células primarias de leucemia HLA-A2+ ( 106 ) , se resuspendieron en PBS (mI 100), se mezclaron con 8F4 o anticuerpo control de isotipo (20 i5 pg) y se inyectaron intravenosamente en 200 ratones NOD/SCID transgénicos HLA-A2+ irradiados con cGy. Después de dos semanas los ratones se sacrificaron, se disecaron , y los tejidos se homogeneizaron y se analizaron para la presencia de células de leucemia mediante citometría de flujo con marcadores de 20 superficie celular humanos y de ratón . Se muestran los resultados de la citometría de flujo de las células aisladas a partir de médula de ratón (MB, por sus siglas en inglés). El control (tratado con PBS) y los animales experimentales que recibieron células AM L más 8F4 (anticuerpo AML+ 8F4) no mostraron 25 ninguna célula de leucemia humana en la BM. En cambio, los animales que recibieron celulas AML más el anticuerpo control (control de isotipo AM L+) mostraron las células CD33 + CD45+ humanas en médula, con el mismo fenotipo como el AML infundido.

FIG. 7 - Estrategia de Inmunización para Obtener el Anticuerpo Anti-PR 1 /H LA-A2. Representación esquemática de la molécula de clase I de MHC. La clase de MHC consiste en la cadena pesada y una cadena de microglobulina b2. El antígeno de péptido unido en el surco de la MHC-I , flanqueado por los dominios helicoidales a1 y a2 de la cadena.

FIGS. 8A-B - El Anticuerpo 8F4 Previene el Prendimiento del Injerto de AML Humano en el Modelo de Xenomierto H LA-A2 Tg. Se lavaron las células primarias HLA-A2+ AML ( 106) , se resuspendieron en PBS (250 mI), mezclaron con 20 mg de 8F4 o el anticuerpo control de isotipo se inyectaron intravenosamente en ratones NOD/SC I D de HLA-A2 Tg irradiados subletalmente (200 cGy). En los tiempos indicados, se analizaron la sangre periférica, la médula y los tejidos para la presencia de leucemia mediante histoquímica (FIG. 8A) y citometría de flujo (FIG . 8B). Los ratones irradiados sin células AML de transferencia y AML de pretransferencia usados como controles negativos y positivos, respectivamente. (FIG . 8A) La infiltración de AML en los tejidos de ratones experimentales después de la inyección con células AML más 8F4 (paneles izquierdos), de la inyección con células AML más anticuerpo control de isotipo (iso, paneles centrales), y de ningunos ratones control de transferencia de AML (paneles derechos). (FIG. 8B) Las celulas AML (mostradas pretransferencia, paneles izquierdos) no se detectaron en la médula (dos paneles superiores) y la sangre periférica (dos paneles inferiores) de ninguno de los ratones control de transferencia y tratados con 8F4 experimental . Los ratones que recibieron células AML mezcladas con el anticuerpo igualan el isotipo control (ISO, por sus siglas en inglés) muestran el prendimiento del injerto de AML1 y de AM L5 dos o cuatro semanas después de la transferencia de AML. Un panel extendido, incluyendo un marcador específico de célula de ratón (mCD45), 3-6 marcadores humanos (CD45, CD13, CD33, CD34, CD38, HLA-DR) , y Color Aguamarina Fijable LIVE/DEAD (Invitrogen) se usó para el análisis citométrico de flujo del prendimiento del injerto de AML. Todos los diagramas muestran células viables mCD45.

FIGS. 9A-C - 8F4 Induce la Neutropenia Transitoria (21 -días) en NOD/SCI D Transgénico de H LA-A2 debido a la Expresión de la Secuencia PRI Conservada en Células Hematopoyéticas Murinas que Expresan HLA-A2. Los ratones NOD/SCID de HLA-A2 Tg se inyectaron con 200 mg (10 mg/kg) de 8F4 o Ab de control de isotipo. Estos animales se han mostrado al PRI endógeno presente. Nueve d ías más adelante, las células de médula se cosecharon y tiñeron con mAb dirigido a antígenos de ratón (B220-PE, GR-1 -PB, CDI Ib-APC, F4/80-PE-Cy7, CD3-FITC y Color Aguamarina Fijable LIVE/DEAD) y se examinaron mediante citometría de flujo. (FIG . 9A) Los granulocitos reducidos fueron evidentes en perfiles del dispersor de medula (paneles izquierdos). Los neutrófilos inmaduros GR-1 lo están presentes, pero los neutrófilos maduros GR-1 h¡ fueron menos numerosos en la médula de los ratones tratados con 8F4 (paneles centrales). Adicionalmente, los monocitos (SSCIo CD1 1 b + ; puerta derecha inferior de los paneles derechos) se redujeron en los animales tratados con 8F4. (FIG . 9B) La inyección intravenosa de 8F4 (5 mg/kg) indujo la reducción transitoria en números absolutos de granulocitos, macrófagos y monocitos maduros circulantes en ratones NOD/SCID con HLA-A2 Tg . Tres semanas después del tratamiento, todas las poblaciones permanecen . Las puertas mostradas en la FIG. 9A se usan para determinar la frecuencia de cada tipo de la célula como un porcentaje de células vivas. Las barras de error son desviaciones estándar de n = 2 animales por grupo. Se muestra un experimento representativo fuera de tres. (FIG . 9C) Ninguno de los cambios patológicos significativos fueron evidentes en hígado, pulmón , bazo, riñón, corazón o cerebros de los ratones NOD/SCI D con HLA-A2 Tg 7 días después de la inyección de 200 mg (10 mg/kg) de 8F4. Se muestran las secciones de H&E de tejidos representativos a partir de 2 ratones.

FIGS. 10A-B - 8F4 Induce la Leucopenia Transitoria de Células Hematopovéticas humanas Establecidas después de la Transferencia de Sanare de Cordón Umbilical Enriquecida con celula CD34+ humana en ratones NOD/SCI D. Las unidades sangre de cordón umbilical HLA-A2+ reciente (50-150 mi) se somete a ficoll al usar Histopaquel 077, se lavaron con PBS, 5 después con amortiguador CliniMACS (0.5% de HSA en PBS pH 7.2/1 mM de EDTA, Miltenyi). Se resuspendieron 108 células en 300 mi de amortiguador MAC, se mezclaron con 100 mi de microgránulos CD34 (Miltenyi) y se incubaron a 4°C durante 30 minutos y se lavaron. Las células CD34 + , etiquetadas con ío gránulos magnéticos, se purificaron usando 2 columnas LS (Miltenyi). Se eluyeron las células CD34+ a partir de la columna, se contaron y se inyectaron intravenosamente en el ratón NOD/SCID irradiado (400 rad) (1 -2.5 x 106 células por ratón). El ratón control CB1 -5 no recibió células CB. (FIG. 10A) A partir de 15 4 semanas después del trasplante, la sangre periférica de ratones se tomó semanalmente o cada dos semanas para monitorear el prendimiento del injerto de sangre de cordón umbilical usando FACS con marcadores CD45 de ratón, CD45 de humano, y H LA. 9-12 semanas después de que los ratones de transferencia se 20 inyectaron i.v. con 20 mg (1 mg/kg) de 8F4 dos veces con una semana de intervalo entre la inyección (flechas punteadas). (FIG. 10B) Cuatro semanas después de la 2a de inyección de 8F4 los ratones se sacrificaron. La sangre, el bazo y la médula se analizaron para el prendimiento del injerto de células humanas 25 como antes.

FIG. 11 Estructura Esquemática de pCh8F4 P H U8 F4- 1 . pHu8F4-2 y pHu8F4-2-AA (colectivamente Vector de Expresión).

Procediendo a la derecha del sitio de Sa l í en la parte superior, el plásmido contiene la unidad de transcripción de cadena pesada que inicia con el promotor temprano inmediato mayor de citomegalovirus humano (CMV, por sus siglas en ingles) y el potenciador (promotor CMV) para iniciar la transcripción del gen de cadena pesada del anticuerpo. El promotor CMV es seguido por el exón VH , una secuencia genómica que contiene la región constante de cadena pesada gamma-1 humana incluyendo los exones CH 1 , bisagra, CH2 y CH3 con los intrones de intervención, y el sitio de poliadenilación que sigue el exón CH3. Después la secuencia de gen de cadena pesada, la unidad de transcripción de cadena ligera comienza con el promotor CMV, seguido por el exón VL y una secuencia genómica que contiene el exón de región constante de cadena kappa humana (CL, por sus siglas en inglés) con parte del intrón que la precede, y el sitio de poliadenilación que sigue el exón de CL. El gen de cadena ligera entonces es seguido por el promotor temprano SV40 (promotor SV40), el gen de xantina guanina-fosforribosil transferasa de E.

Coli (gpt, por sus siglas en inglés), y un segmento que contiene el sitio de poliadenilación SV40 (sitio SV40 poli(A)). Finalmente, el plásmido contiene una parte del plásmido p(JC 19, que comprende el origen bacteriano de la réplica (pUC ori) y el gen beta-lactamasa (b-lactamasa) .

FIG. 12. Alineación de las secuencias de aminoácido de 8F4 VH. 8F4 humanizado (Hu8F4) VH v aceptor humano U96282 VH. Los residuos de aminoácido se muestran en código de un asóla letra. Los números sobre las secuencias indican las posiciones de acuerdo con Kabat et al. (1991 ). Las secuencias de CDR definidas por Kabat et al. (1991 ) está subrayadon. Los residuos de CDR en U96282 VH se omiten en la figura.

FIG. 13. Alineación de las secuencias de aminoácido de 8F4 VL dos versiones de 8F4 VL humanizado (Hu8F4 VL1 v VL21 v aceptor humano AY043146 VL. Los residuos de aminoácido se muestran en código de una sola letra. Los números sobre las secuencias indican las posiciones de acuerdo con Kabat et al. (1991 ). Las secuencias de CDR definidas por Kabat et al. (1991 ) está subrayadon. Un residuo subrayado en Hu8F4 VL1 se predijo para entrar en contacto con las CDR y el residuo de ratón correspondiente se mantuvo en esta localización en Hu8F4 VL1 . Los residuos de CDR en AY043146 VL se omiten en la figura.

FIG. 14. Análisis de SDS PAGE de anticuerpos 8F4 purificados. Los anticuerpos (5 mg cada uno) se producen en un gel de SDS PAGE al 4-20% bajo condiciones de reducción . El SeeBluePlus2 Prestained Standard de Invitrogen (Cat # LC5925) se usó como estándares de peso molecular (carriles 1 , 7 y 8) . Muestras: 8F4.3.3 (carril 2) , 8F4-4 (carril 3), Ch8F4 (carril 4), Hu8F4-1 (carril 5), Hu8F4-2 porción 9/9/10 (carril 6), Hu8F4-2 porción 1 /23/1 1 (carril 9) y Hu8F4-2-AA (carril 10).

FIG. 15. Análisis de ELISA de la unión de Ch8F4 Hu8F4-1 Hu8F4-2 y Hu8F4-2-AA a PR-1 /HLA-A2. Se probaron Ch8F4, Hu8F-l, Hu8F4-2 y Hu8F-2-AA a varias concentraciones, iniciando en 1 mg/ml y diluciones de tres veces en serie, para la unión a PR-1 /HLA-A2.

FIGS. 16A-C. Especificidad de unión a Hu8F4 y mecanismo de acción . (FIG. 16A) Ensayo de especificidad. (FIG. 16B) Ensayo de afinidad. Ensayo de CDC (FIG. 16C).

FIG. 17. El tratamiento con H u8F4 elimina AML establecido. El ensayo mide el prendimiento del injerto por ciento del injerto de AML dado 3 semanas antes del tratamiento del anticuerpo.

FIG. 18. 8F4 causa pancitopenia reversible: efectos sobre celulas progenitores hematopovéticas normales en ratones SCI D.

FIG. 19. 8F4 causa pancitopenia reversible: efectos sobre células sanguíneas normales en ratones competentes inmunes.

FIGS. 20A-C . 8F4 retrasa el crecimiento tumoral del cáncer de mama v prolonga la supervivencia. (FIG. 20A) neutrófilos asociados a tumores en tumores del xenomjerto 231 BrCA. (FIG . 20B) Modelo de tumor primario. (FIG . 20C) Modelo de tumor metastático.

FIGS. 21 A-B. Las líneas celulares de tumor sólido tomadas de NE y P3. Las líneas celulares que representaban tumores sólidos se incubaron con (FIG . 21 A) NE (10 mg/ml) o (FIG . 21 B) P3 (10 mg/ml), y después permeabilizaron y tiñeron con Abs a n ti - NE o anti-P3. Los datos representan el aumento de 6 veces de la media de SEM en la absorción de NE o P3 contra las celulas no pulsadas de pozos triplicados a partir de dos experimentos independientes. MDA-MB-231 , Carcinoma de mama; M IA PaCa-2, 5 carcinoma pancreático; Mel 624 y Mel 526, melanoma; OVCAR3, adenocarcinoma ovárico; SW-620, adenocarcinoma de colon .

FIGS. 22A-D. El cáncer de mama no expresa endógenamente P3. Se extrajo el ARNm (FIG. 22A) de líneas celulares de cáncer de mama y (FIG. 22B) tejido cáncer de mama ío primario. Se realizó RT-PCR al usar los cebadores P3, que muestra la carencia de expresión de P3 ARNm en líneas celulares de cáncer de mama y cáncer de mama primario. Jurkat y las líneas celulares de leucemia HL-60 se usaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Las células de cáncer de 15 mama primarias a partir de tejidos de pacientes, 1 -3 mamas de muestra, se obtuvieron mediante LCM realizado en el tumor obtenido de pacientes al momento de la resección quirúrgica. Se usó mamaglobina-1 (MGB-1 , por sus siglas en inglés) para confirmar el análisis de células de cáncer de mama, b-actina y 20 GAPDH se usaron como controles de carga. (FIG. 22C) las inmunotransferencias demuestran la carencia de la proteína P3 en WCL a partir de cinco diferentes líneas celulares de cáncer de mama. Los geles se cargados con 20 mg de proteína. P3 purificado (5 mg) se usó como control positivo, y GAPDH se usó 25 como de carga. (FIG . 22D) La inmunohistoquímica muestra la ausencia de P3 en tejido de cáncer de mama en el paciente (mama 3). El panel izquierdo, sección de H&E (ampliación original 3200) muestra el carcinoma poco diferenciado con los neutrófilos mezclados. El panel derecho, la tinción 5 inmunohistoquímica para P3 muestra la tinción positiva de P3 (marrón) en los neutrófilos mezclados, pero no en las celulas cancerosas de mama. La inserción (ampliación original 3400) muestra una rara célula tumoral que envuelve un neutrófilo. Ambas imágenes se toman del mismo paciente y son ío representativas de cinco tejidos. Las puntas de flecha indican neutrófilos.

FIGS. 23A-C . P3 es tomado por líneas celulares de cáncer de mama v localiza a los compartimientos lisosomales. ( F I G . 23A) Las líneas celulares M DA-MB-231 , MCF-7, y MCF-7-HER18 15 se incubaron con P3 soluble (10 mg/ml) durante 1 , 4, y 24 h y después se tiñeron intracelularmente con anti-P3 Ab. Se midió MFI para los grupos experimentales por triplicado y se normalizaron al MFI de células no pulsadas. Las veces de aumento en MFI contra las células no pulsadas se trazan en el eje 20 y. Los datos son 6 SEM medios y representan dos experimentos independientes. (FIG. 23B) Las células M DA-MB-231 se incubaron con dosis aumentadas de P3 u OVA soluble (ova) y se analizaron mediante citometría de flujo para la absorción intracelular de P3 u OVA al usar anti-P3 o Abs anti-OVA, 25 respectivamente. Los datos son 6 SEM medios de experimentos duplicados. (FIG. 23C) Las celulas M DA-MB-231 se cultivaron con P3 soluble (10 mg/ml) y después se tiñeron intracelularmente para P3 (rojo) y LAM P-2 (verde). Las imágenes de microscopía confocal demuestran la localización de P3 en los compartimientos lisosomales 4 h después de la absorción , como se muestra por las imágenes de superposición (amarillo). Los núcleos aparecen azules al usar DAPI . Barras de escala, 5 mm.

FIGS. 24A-F. La absorción de P3 v presentación cruzada de P3 v de NE aumenta la susceptibilidad del cáncer de mama para supresión mediante PRI-CTLs v anti-PR1 /HLA-A2. (FIG. 24A) Se incubaron células cancerosas de mama M DA-MB-231 con P3 soluble, PMNs irradiado, o PBMC durante 4 h . Se permeabilizaron las células, se tiñeron con anti-P3 Ab, y se analizaron mediante citometría de flujo. Para la absorción relacionada con células, la dispersión de luz vista en la citometría de flujo proporcionó una distinción clara entre PBMC, PM Ns, y células M DA-M B-231 . PBMC y PM Ns solamente se usaron como controles negativos y positivos, respectivamente. ANOVA seguido por la prueba de Tukey se realizó usar el software Prism 5.0 (*p, 0.05). Los datos son media 6 SEM a partir de experimentos duplicados. (FIG. 24B) Se cultivaron células cancerosas de mama MDA-MB-231 con P3 o NE soluble (10 mg/ml) al aumentar los puntos de tiempo y después se analizaron para la expresión de PR1 /HLA-A2. El aumento de 6 veces de la media de SEM del MFI de PR1 /HLA-A2 contra células no pulsadas se muestra de experimentos duplicados. ANOVA seguido por la prueba de Tukey se realizó al usar el software Prism 5.0 (*p = 0.01 , **p , 0.0001 ). (FIGS. 24C-D) Las celulas MDA-MB-231 se cultivaron durante 24 h en medios que contienen NE o P3 (10 mg/ml) y la brefeldina A o lactacistina de inhibidores de presentación de Ag. Las células entonces se analizaron para la expresión de PR1 /HLA-A2. Aumento en veces de la media 6 SEM del MFI de PR1 /HLA-A2 se muestra de los pozos duplicados de un experimento representativo. ANOVA seguidos por la prueba de Tukey se realizado al usar el software Prism 5.0 (*p, 0.01 , **p, 0.0001 ). (FIG. 24E) Se cultivaron células M DA-MB-231 durante la noche en medios que contienen P3 o NE (10 mg/ml) , se cargaron con calceína-AM , y entonces se cocultivaron con PRI-CTLs durante 4 h . Se determinó la citotoxicidad midiendo la calceína-AM liberada. Las células pulsadas con NE o P3 muestran mayor supresión contra células MDA-M B-231 no pulsadas. Las células pulsadas con PR1 y T2 no pulsadas se usan como controles positivos y negativos, respectivamente. Los datos son la media 6 SEM de pozos duplicados a partir de un experimento representativo. (FIG . 24F) Se cultivaron las células MDAM B-231 con NE (10 mg/ml) o P3 (10 mg/ml) durante 24 h . Entonces se incubaron las células con Ab anti-PR1 /HLA-A2 (8F4) durante 60 min , y después se agregó el complemento. Se medió la citotoxicidad dependiente de complemento al usar liberación de calceína-AM y muestra supresión específica de células MDA-MB- 231 pulsadas con NE o P3 mediante Ab de 8F4. Los datos de citotoxicidad son media 6 SEM de pozos duplicados a partir de un experimento representativo. La prueba t no pareada se realizó al usar el software Prism 5.0 (*p, 0.05).

FIGS. 25A-D. PR1 /HLA-A2 y PR1 -CTL se detectan en pacientes con cáncer de mama v melanoma. (FIG . 25A) Tejidos de cáncer de mama de pacientes con HLA-A2+ resecados (mamas 1 y 4) se tiñeron con anti-PR1 /HLA-A2 (8F4)-647 (rojo) y anti-CK7)-FITC (verde), y entonces representaron al usar microscopía de láser confocal. PR1 /H LA-A2 parece estar expresado por las celulas cancerosas de mama, como se muestra por cotinción de 8F4 con CK7. DAPI-azul se usó para teñir los núcleos celulares. (FIG . 25B) Las secciones consecutivas del tejido de cáncer de mama HLA-A2+ resecado se tiñeron con anti-CD45-647 (rojo) (panel izquierdo) o anti-CK7-FITC (verde) y 8F4-647 (rojo) (panel derecho), y entonces se representaron al usar microscopía de láser confocal. PR1 /H LA-A2 es expresado por células cancerosas de mama (8F4+/CK7 + ) en áreas que tienen leucocitos mínimos (CD452), de tal modo confirmando la expresión PR1 /HLA-A2 mediante células cancerosas de mama. DAPI-azul se usó para teñir núcleos celulares. (FIG . 25C) El diagrama de cajas y bigotes muestra PRI-CTLs en sangre periférica de pacientes HLA-A2+ con cáncer de mama (n = 1 1 ), melanoma (n = 7), y donantes H LA-A2+ sanos (n = 9). La prueba de Mann-Whitncy U se realizó al usar el software Prism 5.0 (*p, 0.05). (FIG . 25D) Tejidos del paciente HLA-A2+ resecado (melanoma 1 ) y HLA-A22 (melanoma 2) se tiñeron con 8F4-647 (rojo) y anti-MITF-FITC (verde), y entonces se representaron al usar microscopía de láser confocal. PR1 /H LA-A2 parece ser expresado en la muestra del melanoma HLA-A2+ (melanoma 1 ), como se muestra mediante cotinción de 8F4 con MITF. Se usó DAPI-azul para teñir los núcleos celulares. Barras de escala, 20 mm.

FIGS. 26A-F. Presentación cruzada de P3 v NE mediante susceptibilidad aumentada de celulas de melanoma a PR1 -CTL. (FIG. 26A) La tinción doble de NE (marrón) y MITF (rosa) , o (FIG . 26B) P3 (marrón) y MITF (rosa) en muestras de paciente de melanoma primario muestra la carencia de NE y P3 en el melanoma. Las imágenes se tomaron a ampliación original 3100. La inserción, ampliación original 3400, mostraron las células NE disperso o P3 positivo, que son muy probablemente células inflamatorias. (F IG . 26C) La transferencia de tipo Western muestra la ausencia de NE y de P3 en líneas celulares de melanoma. Se usó la línea celular de leucemia U-937 como un control positivo para N E y P3. Se usó tubulina como control de carga. M = marcador de m.w. (FIGS. 26D-E) Se cultivó la línea celular de melanoma 526 HLA-A2+ con NE (10 mg/ml) o P3 soluble (10 mg/ml) en los puntos de tiempo crecientes y después se analizó para absorción (FIG. 26D) de N E y P3 y presentación cruzada (FIG. 26E) (es decir, expresión PR1 /H LA-A2). El aumento de veces del MFI de NE o P3 (FIG. 26D) o PR1 /HLA-A2 (FIG . 26E) contra celulas no pulsadas se muestra en el eje y. ANOVA seguido por la prueba de Tukey se realizó al usar el software Prism 5.0 (**p = 0.0001 , *p, 0.05). Los datos representan media 6 SEM a partir de experimentos duplicados. El 5 ensayo de citotoxicidad de calceína (F)-AM muestra la supresión de la línea celular de melanoma 526 HLA-A2+ pulsado 24 h de NE (10 mg/ml) y P3 (10 mg/ml) mediante PRI-CTLs contra Mel 526 no pulsado (Unp). Las células T2 no pulsadas (T2 Unp) y pulsadas con PRI (T2 PR1 ) se usan como controles negativos y positivos, ío respectivamente. Los datos son media 6 SEM de pozos duplicados de un experimento representativo. La prueba t no pareada se realizó al usar el software Prism 5.0 (*p, 0.05).

Descripción Detallada de la Invención El péptido propio PR-1 (VLQELNVTV; SEC I D NO:45) se ha 15 mostrado para ser reconocido en HLA-A*0201 expresado en membrana celular de leucemia por los linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) CD8 + , y CTL específico del PR1 - específicamente lisa leucemia mieloide pero no células de médula normales. La vacunación de pacientes H LA-A2+ con AML, CM L, y 20 M DS con inmunidad de PR-1 -CTL inducida por el péptido PR1 en el 58% de pacientes y respuestas clínicas objetivas en 13 de 66 pacientes (20%) . Mientras que estos resultados son alentadores, alta carga tumoral sigue siendo una barrera a la vacunación acertada. 25 Debido a que el péptido PR1 se expresa en suficiente cantidad solamente en la superficie de las celulas de leucemia mieloide y no en células de médula normales, los inventores intentaron desarrollar un anticuerpo dirigido a PR1/HLA-A*0201 que podría usarse terapéuticamente para tratar pacientes con leucemia mieloide o que podría usarse para identificar qué pacientes pudieron ser susceptibles a inmunoterapia basada en PR1 , como vacunas o transferencia de células T adoptivas. Puesto que HLA-A2+ es el alelo HLA más comúnmente posible expresado (40% de la población Caucásica general) , la terapia basada en anticuerpo para un epítopo de células T por lo tanto sería nuevo y puede ser que sea aplicado ampliamente. Al Inmunizar ratones BALB/c competentes inmunes con monómeros PR1 /HLA-A*0201 recombinantes, obtuvieron un anticuerpo monoclonal de lgG2a-kappa (8F4) con especificidad para el epítopo PR1 /HLA-A*0201 combinado. El anticuerpo 8F4 se muestra por tener alta afinidad para PR1/HLA-A*0201 (KD = 9.9 nanomolar) y se muestra para reconocer solamente células objetivo T2 pulsadas por PR1 pero no controlar células pulsadas por péptido. 8F4 unido a HLA-A2+ AML al usar FACS y microscopía confocal para etiquetar las células, pero no a células de sangre periférica H LA-A2+ normal.

Además, la citotoxicidad mediada por complemento dependiente de dosis inducida por 8F4 (CDC, por sus siglas en inglés) de leucemia humana primaria HLA-A2+ pero no células de médula normales. Significantemente, el anticuerpo 8F4 previno específicamente el prendimiento del injerto de AML humano en un modelo animal NOD/SCI D transgenico HLA-A2 con solamente una sola exposición al anticuerpo al momento de la transferencia adoptiva en el animal. Además, 8F4 retrasó el crecimiento tumoral del cáncer de mama y prolongó la supervivencia a pesar de que P3 y el NE no se expresan en células cancerosas de mama. Tomados juntos, estos resultados muestran que la creación de un anticuerpo con la especificidad para el epítopo PR1 /HLA-A*0201 unido a la membrana celular, un importante antígeno objetivo de células T, que específicamente dirige y eliminan leucemias humanas y tumores sólidos.

I. Definiciones Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren al material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que acompañan normalmente el material mientras que se encuentra en su estado nativo. Así, los péptidos aislados de acuerdo con la invención no contienen preferiblemente los materiales asociados normalmente con los péptidos en su ambiente in situ.

El "complejo mayor de histocompatibilidad" o "MHC" es un racimo de genes que desempeña un papel en el control de las interacciones celulares responsables de inmunorespuestas fisiológicas. En humanos, el complejo de MHC también se conoce como el complejo de HLA. Para una descripción detallada de los complejos de M HC y de HLA, ver Paul (1993).

El "antígeno del leucocito humano" o "HLA" es una clase humana I o proteína del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (ver, por ejemplo, Stites, 1994) .

Un "supertipo o familia de HLA", como se usa en la presente, describe conjuntos de moleculas de HLA agrupadas en la base de especificidades de unión al péptido compartidas. Las moléculas de clase I de H LA que comparten parte de afinidad de unión similar para péptidos que llevan ciertos motivos del aminoácido se agrupan en los supertipos de HLA. El término superfamilia de HLA, familia del supertipo de HLA, familia de HLA, y moléculas de supertipo similar a xx de HLA (donde xx indica un tipo particular de HLA) , son sinónimos.

El término "motivo" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, generalmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo de clase I de HLA y de aproximadamente 6 a de aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo de clase II de H LA, que es reconocido por una molécula HLA particular. Los motivos del péptido son comúnmente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo de HLA humano y difiere en el patrón de los residuos de ancla primarios y secundarios.

"Célula anormal" es cualquier célula que se considere tener una característica un común para este tipo de célula, incluyendo crecimiento anormal , crecimiento común en una localización anormal o acción común contra un objetivo anormal. Tales celulas incluyen células cancerosas, células hiperplásicas o displásicas benignas, células inflamatorias o células autommunes.

II. Restricción de PR-1 y de HLA A. PR-1 El mismo péptido PR-1 (VLQELNVTV; SEC I D NO :45) se deriva de la proteinasa 3 (P3, por sus siglas en inglés) y de la elastasa de neutrófilos (NE, por sus siglas en inglés), ambas aberrantemente expresadas en leucemia. Se ha mostrado para ser reconocido en HLA-A*0201 expresado en membrana celular de leucemia por linfocitos T citotóxicos CD8 + . CTL específico para PR-1 lisa específicamente la leucemia mieloide, incluyendo leucemia mieloide aguda (AM L, por sus siglas en inglés), leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés), y síndrome de mielodisplasia (MDS, por sus siglas en inglés) perno no células de médula normales. Previamente, los inventores muestran que la vacunación de PR-1 de pacientes HLA-A2+ con AML, CML, y MDS con el péptido PR1 en inmunidad de PR-1 -CTL inducido por Montanida ISA-51 y GM-CSF en 58% de pacientes y respuestas clínicas objetivas en 13 de 66 pacientes (20%).

B. HLA-A2 El sistema del antígeno de leucocito humano (HLA, por sus siglas en inglés) es el nombre del complejo mayor de histocompatibilidad en humanos. El superlugar contiene un gran número de genes relacionados con la función del sistema inmune en humanos. Este grupo de genes reside en el cromosoma 6, y codifica proteínas presentadoras de antígeno de superficie celular y muchos otros genes. Las proteínas codificadas por ciertos genes tambien se conocen como antígenos, como resultado de su descubrimiento histórico como factores en trasplantes de órganos. Los antígenos mayores de HLA son elementos esenciales en la función inmune. Diferentes clases tienen diferentes funciones.

Los antígenos de clase I de H LA (A, B y C) presentan péptidos por dentro de la célula (incluyendo péptidos virales si están presentes). Estos péptidos se producen a partir de proteínas digeridas que se descomponen en lisosomas. Los péptidos son generalmente pequeños polímeros, de aproximadamente 9 aminoácidos en longitud. Los antígenos extranjeros atraen células T supresoras (también llamadas células CD8 + ) que destruyen las células. Los antígenos de clase II de H LA (DR, DP y DQ) presentan antígenos fuera de la célula a linfocitos T. Estos antígenos particulares estimulan las células T auxiliares para reproducirse y estas células T auxiliares entonces estimulan el anticuerpo que producen células B, los mismos antígenos son suprimidas por células T supresoras.

HLA-A2 (A2) es un serotipo del antígeno de leucocito humano dentro del grupo del serotipo H LA-A "A". El serotipo identifica los productos de gen de muchos alelos H LA-A*02, incluyendo los productos del gen HLA-A*0201 , *0202 , *0203, *0206, y *0207. A*02 es globalmente común, pero A*0201 está a alta frecuencia en el Norte de Asia y Norteamerica. A2 es el serotipo más diverso, que muestra diversidad en el Este de África y el Suroeste de Asia. Mientras que la frecuencia de A*0201 en 5 el Norte de Asia es alta, su diversidad se limita a A*0201 las variantes Asiáticas menos comunes A*0203, A*0206.

El serotipo es determinado por el reconocimiento del anticuerpo del subconjunto a2 de cadenas a de H LA-A. Para A2, la cadena a "A" es codificada por el grupo del alelo HLA-A*02 y la ío cadena b es codificada por el lugar B2M . A2 y A*02 son casi sinónimos en el significado. A2 es más común en el Norte de Asia y Norteamérica que en otra parte, y es parte de varios haplotipos largos.

III. Anticuerpos 15 La presente invención se refiere a la producción y al uso de anticuerpos que se unen a PR1 en el contexto de la presentación de HLA-A2. Los anticuerpos son capaces de "unión específica" a un objetivo o una serie particular de objetivos antigénicamente relacionadas. Como se usa en la presente, un anticuerpo se dice 20 que es capaz de "unión específica" a un antígeno si discrimina de las moléculas antigénicamente distintas basadas en unión a la región variable del anticuerpo. Tales interacciones están en contraste con la unión no específica que implican clases de compuestos, con independencia de su estructura química (como 25 al unión de proteínas a la nitrocelulosa, etc.) en particular, un anticuerpo de la presente invención puede exhibir "unión altamente específica" de tal manera que serán incapaces o sustancialmente incapaces de unión incluso a moleculas estrechamente relacionadas.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse fácilmente a través del uso de las téenicas bien conocidas como las ejemplificadas en la Patente de Estados Unidos 4, 196,265, en la presente incorporada por referencia. Comúnmente, una técnica implica primero inmunizar un animal adecuado con un antígeno seleccionado (por ejemplo, un polipéptido o un polinucleótido de la presente invención) de una forma suficiente para proporcionar una inmunorespuesta. Los roedores como ratones y ratas son animales preferidos. Las células de bazo del animal inmunizado entonces se fusionan con células de una célula de mieloma inmortal. Las fusiones acertadas entonces se evalúan para la producción de anticuerpos apropiados.

En una modalidad , las moléculas del anticuerpo comprenderán fragmentos (como (F(ab') , F(ab')2) que son producidos, por ejemplo, mediante la división proteolítica de los mAbs, o inmunoglobulinas de cadena simple producibles, por ejemplo, a través de medios recombinantes. Tales derivados del anticuerpo son monovalentes. En una modalidad , tales fragmentos pueden combinarse uno con otro, o con otros fragmentos del anticuerpo o ligandos del receptor para formar moléculas de unión "quimérica". Significantemente, tales moleculas quiméricas pueden contener sustituyentes capaces de unirse a diferentes epítopos de la misma molécula , o pueden ser capaces de unirse a un epítopo de proteína C activado y un "epítopo de proteína C no activado".

Donde los anticuerpos o sus fragmentos se proponen para propósitos terapéuticos, pueden ser deseables "humanizarlos" con el fin de atenuar cualquier reacción inmune. Tales anticuerpos humanizados pueden estudiarse en un contexto in vitro o in vivo. Los anticuerpos humanizados pueden producirse, por ejemplo, sustituyendo una porción inmunogenética de un anticuerpo con una porción correspondiente, pero no inmunogenética (es decir, anticuerpos quiméricos). La Solicitud PCT PCT/U.S.86/02269; Solicitud EP 184, 187; Solicitud EP 171 .496; Solicitud EP 173,494; Solicitud PCT WO 86/01533; Solicitud EP 125,023; Sun et al. (1987); Wood et al. (1985); y Shaw et al. (1988); todas las cuales referencias se incorporan en la presente por referencia. Las revisiones generales de anticuerpos quiméricos "humanizados" son proporcionadas por Morrison (1985; también incorporado en la presente por referencia. Los anticuerpos "humanizados" pueden producirse alternativamente por sustitución de CDR o CEA. Jones et al. (1986); Verhocyan et al. (1988); Beidler et al. (1988); todas las cuales referencias se incorporan en la presente por referencia .

A. Variantes Lo siguiente es una discusión basada sobre el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear una proteína modificada. Al hacer tales cambios, el índice hidropático de aminoácidos puede considerarse. La importancia del índice de aminoácido hidropático en conferir la función biológica interactiva en una proteína se entiende generalmente en la teenica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN , anticuerpos, antígenos, y similares.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse eficazmente en base de la hidrofilicidad. La patente de Estados Unidos 4,554, 101 , incorporada en la presente por referencia, indica que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, que se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedades biológica de la proteína. Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos 4,554, 101 , los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a residuos de aminoácidos: aminoácidos básicos: arginina (+3.0), lisina (+3.0), e histidina (-0.5); aminoácidos ácidos: aspartato ( + 3.0 ± 1 ), glutamato ( + 3.0 ± 1 ), asparagina ( + 0.2), y glutamina (+0.2); aminoácidos h id rof í I icos , no iónicos: serina ( + 0.3) , asparagina ( + 0.2), glutamina (+0.2) , y treonina (-0.4) , aminoácidos que contienen azufre: cisteína (-1 .0) y metionina (-1 .3); aminoácidos hidrofóbicos, no aromáticos: valina (-1 .5), leucina (-1 .8), isoleucina (-1 .8), prolina (-0.5 ± 1 ), alanina (-0.5), y glicina (0); aminoácidos hidrofóbicos, aromáticos: triptófano (-3.4), fenilalanina (-2.5), y tirosina (-2.3).

Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido para otro que tiene una hidrofilicidad similar y produce una proteína biológica o inmunológicamente modificada. En tales cambios, la sustitución de los aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad está dentro de ± 2 es preferida, los que están dentro de ± 1 son particularmente preferidos, y los que están dentro de ± 0.5 son aún más particularmente preferidos.

Como se señaló antes, las sustituciones del aminoácido se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad , hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones ejemplares que toman en la consideración las varias características anteriores son bien conocidas por los expertos en la teenica e incluyen: arginina y Usina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

La presente invención puede también emplear el uso de miméticos de péptido para la preparación de polipéptidos (ver, por ejemplo, Johnson , 1993) que tienen muchas de las características naturales de un anticuerpo, pero con características alteradas y/o mejoradas. La lógica subyacente detrás del uso de miméticos es que la cadena principal del péptido de proteínas existe principalmente para orientar cadenas laterales de aminoácidos a fin de facilitar las interacciones moleculares, como las del anticuerpo y del antígeno. Estos principios pueden usarse, en combinación con los principios descritos antes, para dirigir moléculas de segunda generación que tienen muchas de las propiedades naturales de un anticuerpo pero con características alteradas e incluso mejoradas.

Se contempla que la presente invención puede emplear además variantes de secuencia como variantes de inserción o de supresión . Las variantes de supresión carecen de uno o más residuos de la proteína nativa. Los mutantes de inserción implican comúnmente la adición del material en un punto no terminal en el polipéptido. También se entenderá que las variantes de la secuencia de inserción pueden incluir aminoácidos N o C terminal, y aún todavía será esencialmente como se indica en una de las secuencias descritas en la presente, siempre y cuando la secuencia cumpla con los criterios indicados antes, incluyendo el mantenimiento de la actividad biológica.

La presente invención también contempla la modificación del isotipo. Como se discute más adelante, el anticuerpo 8F4 se determinó para ser un lgG2a-K. Al modificar la región de Fe para tener un diferente isotipo, diferentes funcionalidades pueden lograrse. Por ejemplo, el cambio a lgG 1 puede aumentar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, conmutar a la clase A puede mejorar la distribución del tejido, y conmutar a la clase M puede mejorar la valencia.

Los anticuerpos modificados pueden hacerse mediante cualquier teenica conocida por los expertos en la técnica, incluyendo la expresión a través de técnicas biológicas moleculares estándar, o la síntesis química de polipéptidos. Los métodos para la expresión recombinante se tratan en otra parte de este documento.

B. Anticuerpo de Cadena Sencilla Un Fragmento Variable de Cadena Sencilla (scFv, por sus siglas en inglés) es una fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, ligadas junto con un enlazador corto (generalmente serina, glicina). Esta molécula quimérica mantiene la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar del retiro de las regiones constantes y la introducción de un péptido enlazador. La imagen a la derecha muestra cómo esta modificación generalmente sale de la especificidad inalterada. Estas moléculas se creadas históricamente para facilitar la expresión en bacteriófagos donde está altamente adecuado para expresar el dominio de unión al antígeno como un solo péptido. Alternativamente, scFv puede crearse directamente a partir de las cadenas pesadas y ligeras subclonadas derivadas de un hibridoma. Los fragmentos variables de cadena simples carecen de la región de Fe constante encontrada en moléculas de anticuerpo completas, y así, los puntos de enlace comunes ( por ejemplo, proteína A/G) usados para purificar los anticuerpos. Estos fragmentos pueden a menudo purificarse/inmovilizarse al usar la Proteína L puesto que la Proteína L interactúa con la región variable de cadenas ligeras de kappa.

Los enlazadores flexibles se comprenden generalmente de residuos de aminoácido promotores de helice y de giro como alanina, serina y glicina. Sin embargo, otros residuos pueden funcionar también. Tang et al. (1996) usó la expresión en bacteriófagos como medio para seleccionar rápidamente enlazadores adaptados para anticuerpos de cadena simple (scFvs, por sus siglas en inglés) a partir de bibliotecas de proteína. Una biblioteca de enlazadores aleatoria se construyó en la cual los genes para los dominios variables de cadena pesada y ligera se ligaron mediante un segmento que codifica un polipéptido de 18 aminoácidos de la composición variable. El repertorio de scFv (aproximadamente 5 x 106 diferentes miembros) se exhibió en el bacteriófago filamentoso y se sometió a selección de afinidad con hapteno. La población de variantes seleccionadas exhibió aumentos significativos en actividad de unión pero conservó la diversidad de secuencia considerable. La evaluación de 1054 variantes individuales produjo posteriormente un scFv activo catalítico que se produjo eficientemente en forma soluble. El análisis de secuencia reveló una prolina conservada en los residuos de dos enlazadores después del término C de VH y una abundancia de argininas y de prolinas en otras posiciones como las únicas características comunes de los enlaces seleccionados.

Los anticuerpos recombinantes de la presente invención pueden tambien implicar secuencias o fracciones que permiten la dimerización o multimerización de los receptores. Tales secuencias incluyen los derivados de IgA, que permiten la formación de multímeros en combinación con la cadena J. Otro dominio de multimerización es el dominio de dimerización Gal4. En otras modalidades, las cadenas pueden modificarse con agentes como biotina/avidina, que permiten la combinación de dos anticuerpos.

En una modalidad separada, un anticuerpo de cadena simple puede ser creado uniendo las cadenas ligeras y pesadas del receptor usar un enlazador diferente de péptido o unidad qu ímica. Generalmente, las cadenas ligeras y pesadas se produjeron en distintas células, purificaron, y ligaron posteriormente juntas de una manera apropiada (es decir, el extremo N de la cadena pesada que está unida al extremo C de la cadena ligera a través de un puente químico apropiado).

Los reactivos de reticulación se usaron para formar puentes moleculares que unen grupos funcionales de dos diferentes moléculas, por ejemplo, un agente de estabilización y de coagulación. Sin embargo, se contempla que los dímeros o los multímeros de los mismos complejos análogos o heteroméricos comprendidos de diferentes análogos pueden crearse. Para ligar dos diferentes compuestos de una manera de manera paso a paso, los reticulantees hetero-bifuncionales pueden usarse que eliminen la formación del homopolímero indeseada. La Tabla 3 ilustra varios reticulantees.

TABLA 3 - RETICULANTEES HETERO-BI FU NCIONALES Un reticulante hetero-bifuncional ejemplar contiene dos grupos reactivos: uno que reacciona con el grupo amina primario (por ejemplo, succinimida de N-hidroxi) y el otro que reacciona con un grupo tiol (por ejemplo, disulfuro de piridilo, maleimidas, halógeno, etc.). A traves del grupo reactivo de amina primaria, el reticulante puede reaccionar con los residuos de Usina de una proteína (por ejemplo, el anticuerpo o el fragmento seleccionado) y a través del grupo reactivo de tiol, el reticulante, ya unido a la primera proteína, reacciona con el residuo de cisteína (grupo sulfhidrilo libre) de la otra proteína (por ejemplo, el agente selectivo).

Es preferido que un reticulante que tiene estabilidad razonable en sangre sea empleado. Numerosos tipos de enlazadores que contienen enlace a disulfuro se conocen que pueden emplearse exitosamente para conjugar agentes dirigidos y terapéuticos/preventivos. Los enlazadores que contienen un enlace de disulfuro que son obstaculizados estéricamente pueden proporcionarse para dar mayor estabilidad in vivo, previniendo la liberación del péptido dirigido antes de alcanzar el sitio de acción. Estos enlazadores son así un grupo de agentes de unión.

Otro reactivo reticulante es SMPT, que es un reticulante bifuncional que contiene un enlace de disulfuro que es "obstaculizado estéricamente" por un anillo de benceno adyacente y grupos metilo. Se cree que el obstáculo estérico del enlace de disulfuro sirve como una función de proteger el enlace contra ataque por los aniones de tiolato como glutationa que puede estar presente en tejidos y sangre, y de tal modo ayuda en la prevención del desacoplamiento del conjugado antes del suministro del agente unido al sitio objetivo.

El reactivo del reticulante de SMPT, como con muchos otros reactivos del reticulante conocidos, proporciona la capacidad a los grupos funcionales de reticulación como el SH de cisteína o de aminas primarias ( por ejemplo, el grupo amino de épsilon de lisina). Otro tipo posible de reticulante incluye las fenilazidas fotoreactivas hetero-bifuncionales que contienen un enlace de disulfuro divisible como sulfosuccinimidil-2-(p-azidosalicilamido)etil-1 ,3’-ditiopropionato. El grupo N-hidroxi-succinimidilo reacciona con los grupos amino primarios y la fenilazida (sobre la fotolisis) reacciona no selectivamente con cualquier residuo de aminoácido.

Además de reticulantes obstaculizados, los enlazadores no obstaculizados también pueden emplearse de acuerdo en la presente. Otros reticulantes útiles, no considerados para contener o generar un disulfuro protegido, incluyen SATA, SPDP y 2-iminotiolano (Wawrzynczak & Thorpe, 1987) . El uso de tales reticulantes se entiende bien en la téenica. Otra modalidad implica el uso de enlazadores flexibles.

La Patente de Estados U nidos 4,680,338, describe enlazadores bifuncionales útiles para producir conjugados de ligandos con polímeros que contienen amina y/o proteínas, especialmente para formar conjugados de anticuerpos con queladores, fármacos, enzimas, etiquetas detectables y similares. Las Patentes de Estados Unidos 5, 141 ,648 y 5,563,250 describen conjugados divisibles que contienen un enlace lábil que es divisible bajo una variedad de condiciones leves. Este enlazador es particularmente útil en que el agente de interés puede enlazarse directamente al enlazador, con división que da lugar a la liberación del agente activo. Los usos particulares incluyen agregar un grupo amino libre o sulfhidrilo libre a una proteína, como un anticuerpo, o un fármaco.

La Patente de Estados Unidos 5,856,456 proporciona enlazadores de péptido para el uso en la conexión de componentes polipeptídicos para hacer proteínas de fusión, por ejemplo, anticuerpos de cadena simple. El enlazador es de hasta aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, contiene por lo menos una ocurrencia de un aminoácido cargado (preferiblemente arginina o lisina) seguido por una prolina, y está caracterizado por mayor estabilidad y agregación reducida. La Patente de Estados Unidos 5,880,270 describe enlazadores que contienen aminooxi útiles en una variedad de téenicas inmunodiagnosis y separativas.

C. Purificación En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden ser purificados. El término "purificado", como se usa en la presente, se propone para referirse a una composición, aislable de otros componentes, donde la proteína se purifica a cualquier grado con relación a su estado obtenible natural. Una proteína purificada por lo tanto tambien se refiere a una proteína, libere del ambiente en el cual puede ocurrir 5 naturalmente. Donde se usa el término "purificado sustancialmente", esta designación se referirá a una composición en la cual la proteína o el péptido forma el componente principal de la composición, como que constituye aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% , aproximadamente ío 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o más de las proteínas en la composición .

Las téenicas de purificación de proteína son bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas técnicas implican , en un nivel, el fraccionamiento crudo del entorno celular a las 15 fracciones de polipéptido y no polipéptido. Que tiene separando el polipéptido de otras proteínas, el polipéptido de interés puede purificarse además al usar técnicas cromatográficas y electroforéticas para alcanzar la purificación parcial o completa (o purificación a homogeneidad). Los métodos analíticos adecuados 20 particularmente a la preparación de un péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión; electroforesis de gel de poliacrilamida; enfoque isoeléctrico. Otros métodos para la purificación de proteína incluyen , precipitación con sulfato de amonio, PEG , anticuerpos y similares 25 o mediante desnaturalización de calor, seguida por centrifugación; filtración de gel, fase inversa, hidroxilapatita y cromatografía de afinidad ; y combinaciones de tales y otras teenicas.

En la purificación de un anticuerpo de la presente invención, puede ser deseable expresar el polipéptido en un sistema de expresión procariótica o eucariótica y extraer la proteína al usar las condiciones de desnaturalización . El polipéptido puede purificarse a partir de otros componentes celulares al usar una columna de afinidad, que une a una porción etiquetada del polipéptido. Como se conoce generalmente en la técnica, se cree que el orden de conducir las varias etapas de purificación puede cambiarse, o que ciertas etapas pueden omitirse, y todavía dar lugar a un método adecuado para la preparación de una proteína o de un péptido sustancialmente purificado.

Comúnmente, los anticuerpos completos se fraccionan al usar agentes (es decir, proteína A) que unen la porción de Fe del anticuerpo. Alternativamente, los antígenos pueden usarse para purificar y seleccionar simultáneamente anticuerpos apropiados. Tales métodos a menudo usan el agente de selección unido a un soporte, como una columna, un filtro o un granulo. Los anticuerpos están unidos a un soporte, contaminantes eliminados ( por ejemplo, lavado), y los anticuerpos liberados aplicando las condiciones (sal, calor, etc.).

Varios métodos para cuantificar el grado de purificación de la proteína o del péptido serán conocidos por los expertos en la teenica a la claridad de la presente descripción . Éstos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción mediante análisis de SDS/PAGE. Otro método para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, para compararla con la actividad especifica del extracto inicial, y para así calcular el grado de pureza. Las unidades actuales usadas para representar la cantidad de actividad, por supuesto, serán dependientes sobre la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación e independientemente de si la proteína o el péptido expresado exhibe una actividad detectable.

Se conoce que la migración de un polipéptido puede variar, a veces significantemente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi et al. , 1977). Por lo tanto será apreciado que bajo diferentes condiciones de electroforesis, los pesos moleculares evidentes de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados pueden variar.

D. Conjugación de Anticuerpos a Agentes Terapéuticos o de Diagnosis En una modalidad , los anticuerpos de la presente invención pueden ligarse a varios reactivos para el uso en diagnosis y terapia de enfermedad. El enlazado puede realizarse al usar una variedad de reacciones químicas y agentes bien conocidos, algunos de los cuales se describen en otra parte de este documento. 1. Reactivos de Diagnosis Mucho agentes de diagnosis/imagenología se conocen en la teenica, al igual que los métodos para su unión a proteínas, 5 incluyendo anticuerpos (ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos 5,021,236; 4,938,948; y 4,472,50, cada una incorporada en la presente por referencia). Las fracciones de imagenología usadas pueden ser iones paramagnéticos, isótopos radiactivos, fluorocromos, sustancias detectables por RMN, y agentes de ío imagenología de rayos X.

En el caso de iones paramagnéticos, uno puede mencionar a modo de ejemplo iones como cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), 15 disprosio (III), holmio (III) y/o erbio (III), con gadolinio que es particularmente preferido. Los iones útiles en otros contextos, como imagenología de rayos X, incluyen pero sin limitarse a lantano (III), oro (III), plomo (II), y especialmente bismuto (III).

En el caso de isótopos radiactivos para aplicación 20 terapéutica y/o de diagnosis, uno puede mencionar astatina211, 14carbono, 51cromio, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, galio67, 3hidrógeno, yodo123, yodo125, yodo131, indio111, 59hierro, 32fósforo, renio186, renio188, 75selenio, 35azufre, tecnicio99m y/o itrio90. 125l a menudo es preferido para el uso en ciertas 25 modalidades, y tecnicio99m e indio111 son también a menudo preferidos debido a su baja energía y adecuadamente para la detección de largo alcance. Los receptores radiactivamente etiquetados de la presente invención pueden producirse de acuerdo con metodos bien conocidos en la téenica. Por ejemplo, los receptores pueden ser yodados por el contacto con yoduro de sodio y/o de potasio y un agente oxidante qu ímico como hipoclorito de sodio, o un oxidante enzimático, como lactoperoxidasa. TcRs de acuerdo con la invención pueden etiquetarse con tecnetio99m mediante proceso de intercambio de ligando, por ejemplo, reduciendo el pertecnato con solución estañosa, quelatando el tecnetio reducido sobre una columna de Sephadex y aplicando el anticuerpo a esta columna.

Alternativamente, las técnicas de etiquetado directo pueden usarse, por ejemplo, incubando el pertecnato, un agente reductor como SNCI2, una solución amortiguadora como solución de ftalato de sodio-potasio, y el anticuerpo. Los grupos funcionales intermediarios que son de uso frecuente para unir los radioisótopos, que existen como iones metálicos al anticuerpo son ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA, por sus siglas en inglés) o ácido etilendiaminotetracético (EDTA, por sus siglas en inglés).

Entre las etiquetas fluorescentes contempladas para el uso como conjugados son Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODI PY 630/650, BODI PY 650/665, BODI PY-FL, BODI PY-R6G, BODI PY-TMR, BODIPY-TRX, Cascada Azul, Cy3, Cy5,6-FAM , Isotiocianato de Fluoresceína, HEX, 6-JOE, Verde Oregón 488, Verde Oregón 500, Verde Oregón 514, Azul Pacífico, REG, Verde Rodamina, Rojo Rodamina, Renografina, ROX, TAMRA, TET, Tetrametilrodamina, y/o Rojo Texas s 2. Reactivos Terapeuticos Una gran variedad de agentes terapéuticos hizo unirse a anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, los radioisótopos discutidos antes, aunque útiles en contextos de diagnosis, pueden también usarse como agentes terapéuticos ío Los quimioterapéuticos también pueden conjugarse a anticuerpos, e incluyen cisplatino (CDDP, por sus siglas en inglés), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán , clorambucilo, busulfán, nitrosurea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, 15 bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor de estrógeno, taxol, gemcitabieno, navelbina, inhibidores de farnesilo-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato. 20 Otra clase de agente terapéutico es las toxinas. Se contemplan toxina del cólera, toxina del botulismo, la toxina de la tosferina, cadenas A y B ricina, así como otras toxinas naturales o sintéticas.

Las citocinas y linfocinas son aún otra clase de agentes 25 terapéuticos que puede combinarse al TcR de la presente invención , e incluyen I L-1 , I L-2, I L-3, I L-4, IL-5, I L-6, I L-7, I L-8, I L-9, I L-10, I L-1 1 , IL-12, I L-13, IL-14, I L-15, I L-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 , I L-22, IL-23, TN Fa, GM-CSF, IN Fa, INFp, e I FNy.

En otras modalidades, los agentes antiinflamatorios se contemplan como agentes terapeuticos que pueden conjugarse a anticuerpos. Los antiinflamatorios incluyen NSAIDs, esteroides, rapamicina, infliximab, y ontak. Los agentes inmunosupresivos incluyen FK-506 y ciclosporina A.

El agonista de TLR puede ligarse al anticuerpo, por ejemplo, a través de la porción de Fe de la molécula. Los agonistas de TLRs son los compuestos que estimulan, o "activan", el sistema inmune. Los agonistas naturales para TLR9 son componentes de ADN que son comunes a bacterias y a virus. Los agonistas naturales para TLRs 7 y 8 son patrones del ARN encontrados en virus. Después del reconocimiento de sus agonistas de ADN y de ARN naturales, los TLRs 7, 8, y 9 cada uno inicia una diferente cascada de inmunorespuestas protectoras. Los agonistas de TLR incluyen oligodesoxinucleótidos, fragmentos del ácido hialurónico, imiquimod, lavendustina C, lípido A, loroxibina, LPS, lipda A de monofosforilo, miristicina, resiquimod, flagelina de S. typhimurum, H KLM, PAM3CSK4, y polyl :C .

IV. Ácidos Nucleicos y Expresión A. Anticuerpo que Codifica Ácidos Nucleicos Un aspecto de la invención, se proporciona ácido nucleico que codifica varias porciones de cadena pesada y ligera del anticuerpo, dominios variables y constantes. Un segmento del ácido nucleico puede derivarse del ADN genómico, ADN complementario (cADN, por sus siglas en ingles) o ADN sintético. Donde la incorporación en un vector de expresión se desea, el ácido nucleico puede también comprender un intrón natural o un intrón derivado de otro gen, así como otras regiones no codificantes ( por ejemplo, regulador) y codificantes ( or ejemplo, enlazadores). Como se usa en la presente, el término "ADNc" se propone para referirse al ADN preparado al usar el ARN mensajero (ARNm, por sus siglas en inglés) como modelo. La ventaja de usar un ADNc, en comparación con el ADN genómico o el ADN polimerizado a partir de un modelo de ARN genómico, no o parcialmente procesado, es que el ADNc contiene principalmente secuencias codificantes de la protefna correspondiente.

El término "recombinante" puede usarse en combinación con un polipéptido o el nombre de un polipéptido específico, y se refiere generalmente a un polipéptido producido a partir de una molécula de ácido nucleico que se ha manipulado in vitro o que es el producto replicado de tal molécula. Los vectores recombinantes y los segmentos de ácido nucleico aislados pueden incluir variadamente las propias regiones codificadoras de anticuerpo, las regiones de codificación que llevan alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región de codificación básica, o pueden codificar polipeptidos más grandes que incluyan regiones diferentes de anticuerpos.

Un "ácido nucleico" como se usa en la presente incluye moléculas de una sola hebra y doble hebra, así como ADN, ARN, ácidos nucleicos químicamente modificados y análogos de ácido nucleico. Se contempla que un ácido nucleico dentro del alcance de la presente invención puede ser de aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 1 10, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 1 70, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375, aproximadamente 400, aproximadamente 425, aproximadamente 450, aproximadamente 475, aproximadamente 500, aproximadamente 525, aproximadamente 550, aproximadamente 575, aproximadamente 600, aproximadamente 625, aproximadamente 650, aproximadamente 675, aproximadamente 700, aproximadamente 725, aproximadamente 750, aproximadamente 775, aproximadamente 800, aproximadamente 825, aproximadamente 850, aproximadamente 875, aproximadamente 900, aproximadamente 925, aproximadamente 950, aproximadamente 975, aproximadamente 1000, aproximadamente 1 100, aproximadamente 1200, aproximadamente 1300, aproximadamente 1400, aproximadamente 1500, aproximadamente 1750, aproximadamente 2000, aproximadamente 2250, aproximadamente 2500 o mayores residuos de nucleótido en longitud .

Se contempla que el anticuerpo puede codificarse por cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique la secuencia de aminoácido apropiada, como aquellos en las SEC ID NOS: 3, 5, 7, 15, 19, 23 (CDR pesadas 1 , 2 y 3; CDR ligeras 1 y 2, 3/J K), y SEC ID NOS: 9 o 25, que incluyen las regiones de CDR pesadas y estructurales 1 , 2 y 3, que flanquean corriente arriba las CDR pesadas 1 , 2 y 3, respectivamente, y la SEC I D NO: 24, que incluye las regiones de CDR pesadas y estructurales 1 , 2 y 3, que flanquean corriente arriba las CDR ligeras 1 , 2 y 3, respectivamente. El diseño y la producción de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácido deseada son bien conocidos por los expertos en la téenica, al usar las tablas de codones estandarizados (Tabla 4). En modalidades particulares, los codones seleccionados para codificar cada aminoácido pueden modificarse para optimizar la expresión del ácido nucleico en la célula hospedadora de interés. El término "codón funcionalmente equivalente" se usa en la presente para referirse a los codones que codifican el mismo aminoácido, como los seis codones para arginina o serina, y tambien se refiere a los codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes. 5 Las preferencias de codón por varias especies de célula hospedadora son bien conocidas en la téenica. Los codones preferidos para el uso en humanos, son bien conocidos por los expertos en la técnica (Wada et al. , 1990). Las preferencias del codón por otros organismos también son bien conocidas por los 10 expertos en la técnica (Wada et al. , 1990, incluido en la presente en su totalidad por referencia).

Tabla 4 - Tabla de Codones Aminoácidos Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU l5 Cisteína Cys C UGC UGU Ácido aspártico Asp D GAC GAU Ácido glutámico Gilí E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Cielina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina lie I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG 20 Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU 25 Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Aminoácidos Codones Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptófano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU B. Expresión de Ácido Nucleico Los sistemas basados en procariotas y/o eucariotas pueden usarse para producir secuencias de ácido nucleico, o sus polipeptidos, proteínas y péptidos cognados. La presente invención contempla el uso de tal sistema de expresión para producir los anticuerpos que unen PR-1 /HLA-A2. Una teenolog ía de potente expresión emplea el sistema de célula de insecto/baculovirus. El sistema de célula de insecto/baculovirus puede producir un de alto nivel de expresión de proteína de un segmento heterólogo de ácido nucleico, como se describe en las Patentes de Estados Unidos 5,871 ,986, 4,879,236, ambas incorporadas en la presente por referencia, y que puede adquirirse, por ejemplo, bajo el nombre MAXBAC® 2.0 de Invitrogen® y BacPack™ Baculovirus Expression System de Clontech®.

Además, numeroso otros sistemas de expresión existen que están comercial y ampliamente disponibles. Un ejemplo de tal sistema es el Sistema de Expresión de Mamífero I nducible de CONTROL COMPLETO de STRATAGENE®, que implica un receptor inducible por ecdisona sintético, o su Sistema de Expresión pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible de I NVITROGEN®, que lleva el Sistema de T-REX™ (expresión regulada por tetracielina), un sistema de expresión de mamífero inducible que usa el promotor CMV de longitud completa. I NVITROGEN® tambien proporciona un sistema de expresión de levadura llamado el Sistema de Expresión de Pichia methanolica, que se diseña para producción de alto nivel de proteínas recombinantes en el Pichia methanolica de levadura metilotrófica. Un experto en la téenica sabría expresar un vector, como un constructo de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína, o péptido cognado. 1. Vectores y Virales Suministro Hay un número de maneras en las cuales los vectores de expresión pueden introducirse en las células. Los virus proporcionan herramientas potentes para la expresión de productos de proteína codificados por ácidos nucleicos. Así, en ciertas modalidades de la invención, el vector de expresión comprende un virus o un vector modificado derivado de un genoma viral. La capacidad de ciertos virus para entrar en las células a través de endocitosis mediada por receptor, para integrar en el genoma de célula hospedadora y expresar genes virales estable y eficientemente han hecho candidatos atractivos para la transferencia de genes extranjeros en células mamíferas (Ridgeway, 1988; Nicolás and Rubenstein , 1988; Baichwal and Sugden , 1986; Temin , 1986). Los primeros virus usados como vectores de gen fueron virus de ADN incluyendo los papovavirus (virus de simio 40, virus de papiloma bovino, y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986).

Vectores Adenovirales. Un metodo particular para s suministrar el ácido nucleico implica el uso de un vector de expresión de adenovirus. Aunque los vectores de adenovirus se conocen para tener una baja capacidad para la integración en el ADN genómico, esta característica es contrarrestada por la alta eficacia de la transferencia de gen producida por estos vectores ío "Vector de expresión de adenovirus" se entiende para incluir estos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) empaquetar el soporte del constructo y (b) para expresar en última instancia un tejido o un constructo específico a la célula que se ha clonado en el mismo. El 15 conocimiento de la organización genética o adenovirus, un virus 36 kb, lineal, ADN de doble hebra, permite la sustitución de piezas grandes de ADN adenoviral con secuencias extranjeras de hasta 7 kb (Grunhaus and Horwitz, 1992).

Vectores de AAV. El ácido nucleico puede introducirse en 20 la célula al usar transfección asistida por adenovirus. Las eficacias de transfección aumentantes se han reportado en sistemas celulares al usar sistemas de adenovirus combinadas (Kelleher and Vos, 1994; Cotten et al. , 1992 ; Curiel, 1994) . El virus adeno-asociado (AAV, por sus siglas en inglés) es un 25 sistema de vector atractivo para el uso en las vacunas de la presente invención (Muzyczka, 1992). El AAV tiene un intervalo de huesped amplio para la infectividad (Tratschin et al. , 1984; Laughlin et al. , 1986; Lebkowski et al. , 1988; McLaughlin et al. , 1988). Los detalles con referencia a la generación y al uso de vectores de rAAV se describen en las Patentes de Estados Unidos 5, 139,941 y 4,797,368, cada una se incorpora en la presente por referencia.

Vectores Retrovirales. Los retrovirus son prometedores como vectores de suministro de genes en vacunas debido a su capacidad de integrar sus genes en el genoma hospedador, transfiriendo un gran número de material genético extranjero, infectando un amplio espectro de tipos de especies y células y de empaquetarse en líneas celulares especiales (Miller, 1992) .

Con el fin de construir un vector retroviral , un ácido nucleico ( por ejemplo, uno que codifica un antígeno de interés) se inserta en el genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es defectuoso en replicación. Para producir viriones, se construye una línea celular de empaquetado que contiene genes gag, pol, y env pero sin LTR y componentes de empaquetando (Mann et al. , 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con el LTR retroviral y las secuencias de empaquetando se introduce en una línea celular especial ( or ejemplo, mediante precipitación de calcio y fosfato por ejemplo), la secuencia de empaquetado permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante sea empaquetado en partículas virales, que entonces se secretan en los medios de cultivo (Nicolás and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al. , 1983). Los medios que contienen los retrovirus recombinantes despues se recolectaron, se concentraron opcionalmente, y se usaron para la transferencia de genes. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de las células hospedadoras (Paskind et al. , 1975).

Los lentivirus son retrovirus complejos, que, además del gen retroviral común gag, pol, y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. Los vectores lentivirales son bien conocidos en la téenica (ver, por ejemplo, Naldini et al. , 1996; Zuffercy et al. , 1997; Blomer et al. , 1997; las Patentes de Estados Unidos 6,013,516 y 5,994, 136). Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los Virus de I nmunodeficiencia Humana: H IV-1 , HIV-2 y el Virus de Inmunodeficiencia se Simio: SIV. Los vectores lentivirales se han generado multiplicando la atenuación de genes de virulencia del VI H , por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef se suprimen haciendo el vector biológico seguro.

Los vectores lentivirales recombinantes son capaces de infectar células no divisibles y pueden usarse para la transferencia de gen in vivo y ex vivo y la expresión de las secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, el lentivirus recombinante capaz de infectar una célula no divisible donde una célula hospedadora adecuada es transfectada con dos o más vectores que llevan las funciones de empaquetado, a conocer gag , pol y env, así como rev y tat se describe en la Patente de Estados Unidos 5,994, 136, incorporada en la presente por referencia. Uno puede dirigir el virus recombinante mediante enlace de la proteína de envolvente con un anticuerpo o un ligando particular para dirigir a un receptor de un tipo de celula particular. Insertando una secuencia (incluyendo una región reguladora) de interés en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula objetivo específica, por ejemplo, el vector es ahora el objetivo específico.

Otros Vectores Virales. Otros vectores virales pueden emplearse como constructos de vacunas en la presente invención. Los vectores derivados de virus como virus de vacuna (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al. , 1988) , virus Sindbis, citomegalovirus y virus del herpes simple pueden emplearse. Ofrecen varias características atractivas para varias células mamíferas (Friedmann , 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden , 1986; Coupar et al. , 1988; Horwich et al. , 1990). Los lentivirus también se han explorado como vectores de vacuna (VandenDriessche et al. , 2002).

Suministro al Usar Virus Modificados. Un ácido nucleico a suministrarse puede alojarse dentro de un virus infeccioso que se ha modificado para expresar un ligando de unión específico. La partícula de virus así se unió específicamente a los receptores cognados de la célula objetivo y suministró el contenido a la celula. Un nuevo proceso diseñado para permitir el direccionamiento específico de los vectores de retrovirus se desarrolló basada en la modificación química de un retrovirus por la adición química de residuos de lactosa al envolvente viral. Esta modificación puede permitir la infección específica de hepatocitos a través de los receptores de sialoglicoproteína.

Otro proceso para el direccionamiento de los retrovirus recombinantes se diseñó en los cuales los anticuerpos biotinilados contra una proteína de envolvente retroviral y contra un receptor de célula específico se usaron. Los anticuerpos se combinaron a través de los componentes de biotina al usar estreptavidina (Roux et al. , 1989). Al usar anticuerpos contra antígenos de clase I y clase II complejos de histocompatibilidad mayor, mostraron la infección de una variedad de células humanas que tienen estos antígenos superficiales con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al. , 1989). 2. Suministro de Ácido Nucleico No-Viral Los métodos no virales adecuados para suministrar ácido nucleico para afectar la expresión de composiciones de la presente invención se creen para incluir virtualmente cualquier método mediante el cual un ácido nucleico ( por ejemplo, ADN) pueda introducirse en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en la presente o como se conocerá por un experto en la téenica. Tales métodos incluyen , pero no se limitan a, suministro directo de ADN como mediante inyección (Patentes de Estados Unidos 5,994,624, 5,981 ,274, 5,945, 100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702 ,932, 5,656,610, 5,589,466 and 30 5,580,859, cada una incorporada en la presente por referencia), incluyendo micromyección (Harland and Weintraub, 1985; Patente de Estados Unidos 5,789,215, incorporada en la presente por referencia); mediante electroporación (Patente de Estados Unidos 5,384,253, incorporada en la presente por referencia) ; mediante precipitación de fosfato de calcio (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et a/. , 1990); al usar DEAE-dextrano seguido por polietilenglicol (Gopal, 1985); mediante carga sónica directa (Fechheimer et a/. , 1987) ; mediante transfección mediada por liposoma (Nicolau and Sene, 1982; Fralcy et al. , 1979; Nicolau et al. , 1987; Wong et al. , 1980; Kaneda et al. , 1989; Kato et al. , 1991 ); mediante bombardeo de microproyectil (Números de Solicitud PCT WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de Estados Unidos 5,610,042; 5,322,783 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 y 5,538,880, y cada una incorporada en la presente por referencia); mediante agitación con las fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al. , 1990; Patentes de Estados U nidos 5,302,523 y 5,464,765, cada una incorporada en la presente por referencia); o mediante transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al. , 1993; Patentes de Estados Unidos 4,684,61 1 y 4,952,500, cada una incorporada en la presente por referencia) ; mediante absorción de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al. , 1985). A traves de la aplicación de téenicas como éstas, orgánulos, células, tejidos u organismos pueden ser estables o transformados transitoriamente.

V. Anticuerpos para la diagnosis del Cáncer o Trastornos Hiperplásicos o Displásticos En una modalidad de la presente invención, se proporcionan métodos de diagnosis de cánceres como leucemia (por ejemplo, AML, CML, MDS), así como trastornos mielodisplásticos. La mielodisplasia (MDS, por sus siglas en inglés) se refiere a un grupo de trastornos en los cuales la médula no funciona normalmente y no produce el número insuficiente de células sanguíneas normales. El M DS afectan la producción de cualquiera, y ocasionalmente todos, los tipos de células sanguíneas incluyendo células rojas sanguíneas, plaquetas, y células blancas sanguíneas (citopenias) . Aproximadamente 50% de mielodisplasia pediátrica puede clasificarse en cinco tipos de MDS: anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos en anillo, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación, y leucemia mielomonocítica crónica. El 50% restante comúnmente presente con citopenias aisladas o combinadas como anemia, leucopenia y/o trombocitopenia (conteo bajo de plaquetas). Aunque sea crónico, el M DS progresa para convertirse en leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés) en aproximadamente 30 por ciento de pacientes.

Tambien contemplados para la diagnosis de acuerdo con la presente invención son cánceres de tumor sólido. Tal cáncer, cáncer de pulmón, cáncer cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de hueso, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, cáncer gastromtestinal, linfomas, lesiones preneoplásicas en el pulmón , cáncer de colon, melanoma, y cáncer de vejiga. Otras enfermedades hiperplásicas, neoplásicas y displásicas, incluyendo están enfermedades hiperproliferativas benignas también con el alcance de los procedimientos de diagnosis descritos en la presente.

A. Administración de Reactivos de Diagnosis La administración de reactivos de diagnosis es bien conocida en la téenica y variará dependiendo día diagnosis a alcanzarse. Por ejemplo, donde una masa o masas discreta de tumor es/son imaginadas, puede usarse la administración local o regional ( por ejemplo, en la vasculatura tumoral, el sistema linfático local o arterias o venas locales). Alternativamente, uno puede proporcionar los reactivos de diagnosis regionalmente o sistémicamente. Ésta puede ser la ruta de opción donde la imagenología de un miembro o de un organismo entero se desea, donde se ha identificado la masa de tumor específica conocida, o cuando se sospecha la metástasis.

B. Composiciones y Formulaciones Inyectables Un método para el suministro de un producto farmacéutico de acuerdo con la presente invención es sistémico. Sin embargo, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden alternativamente administrarse parenteral, intravenosa, intradérmica, intramuscular, transdérmica o aún 5 intraperitonealmente como se describe en la Patente de Estados Unidos 5,543, 158; Patente de Estados Unidos 5,641 ,515 y Patente de Estados Unidos 5,399,363 (cada una incorporada específicamente en la presente por referencia en su totalidad).

La inyección de productos farmacéuticos puede se mediante ío jeringa o cualquier otro método usado para la inyección de una solución , siempre y cuando el agente pueda pasar a través del calibre particular de la aguja requerido para la inyección . Se ha descrito un nuevo sistema de inyección sin aguja (Patente de Estados Unidos 5,846,233) que tiene una boquilla que define una ís cámara de ampolla para retener la solución y un dispositivo de energ ía para empujar la solución fuera de la boquilla al sitio de suministro. Un sistema de jeringa también se ha descrito para el uso en terapia de gen que permite múltiples inyecciones de cantidades predeterminadas de una solución exacta a cualquier 20 profundidad (Patente de Estados Unidos 5,846,225) .

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden también 25 prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmaceuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (Patente de Estados Unidos 5,466,468, incorporada específicamente en la presente por referencia en su totalidad) . En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista la fácil inyectabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservada contra la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol ( por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante varios agentes antibacterianos y antihongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcar o cloruro sódico.

La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en las composiciones de los agentes que retrasan la absorción , por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución se debe amortiguar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa , intramuscular, subcutánea, ¡ntratumoral e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos esteriles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la téenica en claridad de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 mi de solución isotónica de NaCI y agregarse a 1000 mi de fluido de hipodermolisis o inyectada en el sitio propuesto de infusión , (ver, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición , páginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variación en la dosificación ocurrirá necesariamente dependiendo de la condición del sujeto que está siendo tratado. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Por otra parte, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir esterilidad , pirogenicidad, seguridad general y estándares de pureza como los requeridos por los Estándares de la FDA Office of Biologies.

Las soluciones inyectables esteriles son preparadas incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados antes, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando los varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los mismos enumerados antes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son téenicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

Las composiciones descritas en la presente pueden formularse en una forma neutral o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden también derivarse de bases inorgánicas como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, se administrarán soluciones de una manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad como sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Como se usa en la presente, "portador" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción , amortiguadores, soluciones portadoras, suspensiones, coloides, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la téenica. Excepto en cuanto a cualquier medio o agente convencional es incompatible con el ingrediente activo, su uso en composiciones terapéuticas se contempla. Los ingredientes activos suplementarios pueden también incorporarse en las composiciones.

La frase "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción inadecuado alérgica o similar cuando se administran a un humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un ingrediente activo se entiende bien en la técnica. Comúnmente, tales composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección pueden tambien prepararse.

VI. Métodos Terapéuticos A. Cáncer y Enfermedad Hiperplásica/Displásica/Neoplásica Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en los métodos para tratar enfermedades/condiciones hiperplásicas/displásicas/neoplásicas incluyendo el cáncer. Los tipos de enfermedades/condiciones contempladas para ser tratados con los péptidos de la presente invención incluyen , pero no se limitan a leucemias, por ejemplo, AML, MDS y CML, así como mielodisplasias. Otros tipos de cánceres pueden incluir cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y de cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de hueso, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, cáncer gastromtestinal, linfomas, lesiones preneoplásicas en el pulmón, cáncer de colon , melanoma, cáncer de vejiga y cualquier otra enfermedad neoplásica.

Para suprimir células, inhibir el crecimiento de células, inhibir la metástasis, disminuir el tamaño de tumor/tejido, carga de células tumorales o de otra manera invertir o reducir el fenotipo maligno de células tumorales, al usar los métodos y las composiciones de la presente invención, uno generalmente en contacto con una célula hiperplásica/neoplásica/cancerosa con el compuesto terapéutico como un polipéptido o un constructo de expresión que codifica un anticuerpo de la presente invención, dispersado normalmente en un amortiguador o portador farmaceuticamente aceptable (ver antes en la discusión de agentes de diagnosis) . Las rutas de administración variarán, naturalmente, con la localización y la naturaleza de la lesión, e incluirán, por ejemplo, inyección intradérmica, transdérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal , intratumoral, perfusión, de lavado, directa, y la administración oral y formulación. Cualquiera de las formulaciones y rutas de administración discutidas con respecto al tratamiento o al diagnosis del cáncer se pueden también emplear con respecto a enfermedades y a condiciones neoplásicas. Se contemplan las modalidades ex vivo, donde las células tumorales se tratan/transducen fuera del cuerpo de un paciente (ya sea específicamente o como parte de una población celular más grande).

La inyección intratumoral, o la inyección en la vasculatura tumoral se contempla específicamente para tumores discretos, sólidos, accesibles. La administración local, regional o sistémica también puede ser apropiada. Para tumores de >4 cm, el volumen que se administrará será de aproximadamente 4-10 mi), mientras que para los tumores de <4 cm, un volumen de aproximadamente 1 -3 mi será usado. Múltiples inyecciones suministradas como una simple dosis comprenden de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 mi de volúmenes. Las partículas virales pueden ventajosamente ponerse en contacto administrando múltiples inyecciones al tumor, separadas a intervalos de aproximadamente 1 cm.

En el caso de la intervención quirúrgica, la presente invención puede usarse a la hora de cirugía, y/o despues de esta, para tratar la enfermedad residual o metastática. Por ejemplo, un lecho de tumor resecado puede inyectarse o someterse a perfusión con una formulación que comprende anticuerpos. La perfusión puede ser después de la resección continua, por ejemplo, dejando un catéter implantado en el sitio de la cirugía. El tratamiento después de la cirugía quirúrgica periódica también se prevé.

La administración continua también puede ser aplicada en su caso, por ejemplo, donde se extirpa un tumor y el lecho tumoral se trata para eliminar la enfermedad residual , microscópica. El suministro a través de la jeringa o la cateterización es preferida. Tal perfusión continua puede ocurrir durante un período de aproximadamente 1 -2 hora, a aproximadamente 2-6 hora, a aproximadamente 6-12 hora, a aproximadamente 12-24 hora, a aproximadamente 1 -2 días, a aproximadamente 1 -2 semanas o más después de la iniciación del tratamiento. Generalmente, la dosis de la composición terapéutica a través de la perfusión continua será equivalente a la dada mediante una sola o múltiples inyecciones, ajustada durante un periodo de tiempo durante el cual ocurre la perfusión . Se contempla además que la perfusión de miembro puede usarse para administrar las composiciones terapeuticas de la presente invención, particularmente en el tratamiento de melanomas y de sarcomas.

Los regímenes de tratamiento pueden variar también , y dependen a menudo del tipo de tumor, localización del tumor, progresión de la enfermedad, y salud y edad del paciente. Obviamente, ciertos tipos de tumor requerirán un tratamiento más agresivo, mientras que al mismo tiempo, ciertos pacientes no pueden tolerar más protocolos agotadores. El médico será el más adecuado para tomar tales decisiones en base a la eficacia y toxicidad conocidas (eventualmente) de las formulaciones terapéuticas.

En ciertas modalidades, el tumor que es tratado no puede, por lo menos inicialmente, ser resecable. Los tratamientos pueden aumentar la resecabilidad del tumor debido a la contracción en los márgenes o mediante eliminación de ciertas porciones invasores particularmente. Después de los tratamientos, la resección puede ser posible. Los tratamientos adicionales subsecuentes a la resección servirán para eliminar la enfermedad residual microscópica en el sitio del tumor.

Un curso común de tratamiento, para un tumor primario o un lecho tumoral después de la extirpación, implicará múltiples dosis. El tratamiento del tumor primario común implica una aplicación de 6 dosis durante un período de dos semanas. El regimen de dos semanas puede repetirse una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más veces. Durante un curso de tratamiento, la necesidad de terminar las dosificaciones previstas puede ser evaluada de nuevo.

B. Terapias de Combinación También puede probar ventajosamente usar terapias de combinación, donde está incluido un segundo agente anticáncer. Un agente "anticáncer" es capaz negativamente afectar al cáncer en un sujeto, por ejemplo, suprimiendo células cancerosas, induciendo la apoptosis en células cancerosas, reduciendo la velocidad de crecimiento de células cancerosas, reduciendo la incidencia o el número de metástasis, reduciendo el tamaño de tumor, inhibiendo el crecimiento del tumor, reduciendo el suministro de sangre a un tumor o células cancerosas, promoviendo una inmunorespuesta contra células cancerosas o un tumor, previniendo o inhibiendo la progresión del cáncer, o aumentando la vida útil de un sujeto con cáncer. Los agentes anticáncer incluyen agentes biológicos (bioterapia), agentes de quimioterapia, y agentes de radioterapia . Más generalmente, estas otras composiciones se proporcionaran con una terapia de acuerdo con la presente invención en una cantidad combinada eficaz para suprimir o inhibir la proliferación de la célula. Este proceso puede implicar poner en contacto las células con ambos agentes al mismo tiempo. Esto puede conseguirse poniendo en contacto la célula con una sola composición o una formulación farmacológica que incluya ambos agentes, o poniendo en contacto la celula con dos composiciones o formulaciones distintas al mismo tiempo.

Alternativamente, la terapia de anticuerpo puede preceder o seguir el otro tratamiento de agente por intervalos que oscilan de minutos a semanas. En las modalidades donde el otro agente y anticuerpos se aplican por separado a la célula, una generalmente asegurará que un periodo de tiempo significativo no expire entre el tiempo de cada suministro, de tal manera que el agente y el constructo de expresión todavía será capaz de ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula. En tales casos, se contempla que uno puede poner en contacto la célula con ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 h entre sí y, más preferiblemente, dentro de aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el período de tiempo para el tratamiento significantemente, sin embargo, donde varios d ías (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1 , 2 , 3, 4, 5, 6, 7 o 8) transcurre entre las administraciones respectivas.

Varias combinaciones pueden emplearse; por ejemplo, la terapia de anticuerpo (con o sin un agente terapéutico conjugado) es "A" y la terapia anticáncer secundaria es "B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A La administración de los agentes terapeuticos de la presente invención a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de esta terapia secundaria particular, teniendo en cuenta la toxicidad, eventualmente, del tratamiento de anticuerpo. Se espera que los ciclos de tratamiento sean repetidos como sea necesario. También se contempla que varias terapias estándar, así como intervención quirúrgica, pueden aplicarse en combinación con las terapias contra el cáncer descritas. 1. Quimioterapia Las terapias contra el cáncer también incluyen una variedad de terapias de combinación con el producto químico y tratamientos basados en radiación . Las quimioterapias de combinación incluyen , por ejemplo, cisplatino (CDDP, por sus siglas en inglés), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán , clorambucilo, busulfán, nitrosurea, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor de estrógeno, taxol, gemcitabina, navelbina, inhibidores de farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato, Temazolomida (una forma acuosa de DTIC), o cualquier variante análoga o derivada de los anteriores. La combinación de quimioterapia con terapia biológica se conoce como bioquimioterapia. La presente invención contempla cualquier agente quimioterapéutico que pueda emplearse o conocerse en la teenica para tratar o prevenir cánceres. 2. Radioterapia Otros factores que causan daño al ADN y se han usado incluyen ampliamente qué se conocen comúnmente como rayos y, rayos X, y/o suministro dirigido de radioisótopos a células tumorales. Otras formas de factores que dañan el ADN también se contemplan por ejemplo microondas y radiación UV. Es más probable que todos estos factores efectúen un intervalo amplio de daño en el ADN , en los precursores de ADN , en la replicación y la reparación del ADN , y en el montaje y el mantenimiento de cromosomas. Los intervalos de dosificación para rayos X oscila de dosis diarias de 50 a 200 roentgenios por periodos de tiempo prolongados (3 a 4 semanas) , a dosis simples de 2000 a 6000 roentgenios. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente, y dependen de la vida promedio del isótopo, la fuerza y el tipo de radiación emitidos, y la absorción por las células neoplásicas.

Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplica a una célula, se usan en la presente para describir el proceso mediante el cual un constructo terapéutico y un agente quimioterapéutico o radioterapéutico son suministrados a una célula objetivo o colocados en yuxtaposición directa con la célula objetivo. Para alcanzar la supresión o estasis de la célula, ambos agentes se suministraron a una célula en una cantidad combinada eficaz para suprimir la célula o evitar que se divida. 3. Inmunoterapia Los inmunoterapeuticos, generalmente, se basan en el uso de células y moléculas efectoras inmunes para dirigir y destruir a células cancerosas. El efector inmune puede ser, por ejemplo, un específico del anticuerpo para algún marcador en la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo solamente puede servir como un efector de terapia o puede seleccionar otras células para efectuar realmente la supresión celular. El anticuerpo también puede conjugarse a una fármaco o una toxina (quimioterapéutico, radionúclido, cadena de ricina A, toxina del cólera, toxina de la tosferina, etc.) y sirve simplemente como un agente dirigido. Alternativamente, el efector puede ser un linfocito que lleva una molécula superficial que interactúa, directa o indirectamente, con un objetivo de célula tumoral. Varias células efectoras incluyen células T citotóxicas y células NK. La combinación de modalidades terapéuticas, es decir, actividad e inhibición o reducción citotóxica directa de Fortilin proporcionaría la ventaja terapéutica en el tratamiento del cáncer.

La inmunoterapia podrá también usarse como parte de una terapia combinada. El proceso general para la terapia combinada se discute a continuación. En un aspecto de la inmunoterapia, la célula tumoral debe llevar algún marcador que sea favorable para direccionamiento, es decir, no está presente en la mayoría de otras células. Muchos marcadores tumorales existen y cualquiera de estos puede ser adecuado para direccionamiento en el contexto de la presente invención. Los marcadores tumorales comunes incluyen antígeno carcinoembrionario, antígeno específico de la próstata, antígeno asociado a tumor urinario, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG , antígeno de Sialyl Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógeno, receptor de laminina, erb B y p155. Un aspecto alternativo de inmunoterapia es para efectos anticáncer con efectos estimulantes inmunes. Las moleculas inmunoestimulantes también existen incluyendo: citocinas como IL-2, IL-4, I L-12 , GM-CSF, gamma-I FN , quimiocinas como M I P-1 , MCP-1 , I L-8 y factores de crecimiento como ligando FLT3. Al combinar las moléculas inmunoestimulantes, ya sea como proteínas o al usar suministro de gen en combinación con un supresor tumoral como mda-7 se ha mostrado para mejorar los efectos antitumorales (Ju et al. , 2000) .

Como se discute antes, los ejemplos de inmunoterapias actualmente bajo investigación o en uso son adyuvantes inmunes ( por ejemplo, Mycobacterio bovis, Plasmodio falciparum , dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos) (Patente de Estados Unidos 5,801 ,005; Patente de Estados Unidos 5,739, 169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al. , 1998), terapia de citocína ( por ejemplo, interferones, e; I L-1 , GM-CSF y TNF) (Bukowski et al. , 1998; Davidson et al. , 1998; Hellstrand et al. , 1998) terapia génica ( por ejemplo, TNF, I L-1 , I L-2, p53) (Qin et al. , 1998; Austin-Sala and Villaseca, 1998; Patente de Estados Unidos 5,830,880 y Patente de Estados Unidos 5,846,945) y anticuerpos monoclonales ( por ejemplo, anti-gangliósido GM2, anti-HER-2, anti-p185) (Pietras et al. , 1998; Hanibuchi et al. , 1998; Patente de Estados Unidos 5,824,31 1 ) . La herceptina (trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal quimerico (ratón-humano) que bloquea el receptor H ER2-neu. Posee actividad antitumoral y se ha aprobado para el uso en el tratamiento de tumores malignos (Dillman, 1999). La terapia de combinación del cáncer con herceptina y quimioterapia se ha mostrado para ser más eficaz que las terapias individuales. Así, se contempla que una o más terapias anticáncer pueden emplearse con las terapias de péptido restringidas por H LA asociadas a tumor descritas en la presente.

Inmunoterapia Adoptiva. En inmunoterapia adoptiva, los linfocitos circulantes del paciente, o linfocitos infiltrados en tumor, se aísla in vitro, activados por linfocinas como I L-2 o transducidas con genes para la necrosis tumoral, y readministrados (Rosenberg et al. , 1988; 1989). Para alcanzar esto, uno administraría a un animal, o paciente humano, una cantidad inmunológicamente eficaz de linfocitos activados en combinación con una composición de péptido antigénica incorporada por adyuvante como se describe en la presente. Los linfocitos activados serán más preferiblemente células propias del paciente que se aislaron antes de una muestra de sangre o de tumor y se activaron (o "expandieron") in vitro. Esta forma de inmunoterapia ha producido varios casos de regresión del melanoma y del carcinoma renal , pero el porcentaje de respondedores fue poco comparado a los que no respondieron.

Inmunoterapia Pasiva. Existe un número de diferentes procesos para inmunoterapia pasiva del cáncer. Pueden ser categorizados ampliamente en lo siguiente: inyección de anticuerpos solamente; inyección de anticuerpos acoplados a toxinas o a agentes quimioterapeuticos; inyección de anticuerpos acoplados a isótopos radiactivos; inyección de anticuerpos anti-idiotipo; y finalmente, purgado de células tumorales en médula.

Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales humanos se emplean en inmunoterapia pasiva, ya que producen pocos o ningún efecto secundario en el paciente. Sin embargo, su aplicación es un poco limitada por su escasez y se ha administrado hasta ahora solamente intralesionalmente. Los anticuerpos monoclonales humanos a antígenos de gangliósido se han administrado intralesionalmente a pacientes que sufren de melanoma recurrente cutáneo (I rie and Morton, 1986). La regresión se observó en seis de cada diez pacientes, seguido, diaria o semanalmente, inyecciones intralesionales. En otro estudio, se logró un éxito moderado a partir de inyecciones intralesionales de dos anticuerpos monoclonales humanos (Irie et al. , 1989). Los anticuerpos terapéuticos posibles incluyen anti-TNF, anti-CD25, anti-CD3, anti-CD20, CTLA-4-IG , y anti-CD28.

Puede ser favorable administrar más de un anticuerpo monoclonal dirigido contra dos diferentes antígenos o aún anticuerpos con especificidad múltiple de antígeno. Los protocolos de tratamiento también pueden incluir la administración de linfocinas u otros potenciadores inmunes como se describe por Bajorin et al. (1988) . El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos se describe con más detalle en otra parte en la especificación. 4. Terapia de Gen En aún otra modalidad , el tratamiento secundario es una terapia de gen en la cual un polinucleótido terapéutico se administra al mismo, después, o al mismo tiempo se administra como el péptido restringido por HLA asociado al tumor. El suministro de un vector que codifica el péptido restringido por H LA asociado al tumor en combinación con un segundo vector que codifica uno de los siguientes productos de gen tendrá un efecto anti-hiperproliferativo combinado en tejidos objetivo. Alternativamente, un simple vector que codifica ambos genes puede usarse. Una variedad de proteínas se comprenden dentro de la invención, algunos de los cuales se describen más adelante. Varios genes que pueden dirigirse para terapia de gen de una cierta forma en combinación con la presente invención son conocidos por un experto en la téenica y pueden comprender cualquier gen implicado en cánceres.

Inductores de Proliferación Celular. Las proteínas que inducen proliferación celular además caen en varias categorías dependientes en la función. Los aspectos en común de todas estas proteínas es su capacidad para regular la proliferación celular. Por ejemplo, una forma de PDGF, el oncogen sis, es un factor de crecimiento secretado. Los oncógenos rara vez se derivan de los genes que codifican factores de crecimiento, y en la presente, sis es el único factor de crecimiento oncogénico que ocurre naturalmente conocido. En una modalidad de la presente invención , se contempla que el ARNm antisentido dirigido a un inductor particular de proliferación celular es usado para prevenir la expresión del inductor de la proliferación celular.

Las proteínas FMS, ErbA, ErbB y neu son receptores del factor de crecimiento. Las mutaciones a estos receptores dan lugar a la pérdida de función regulable. Por ejemplo, una mutación de punto que afecta al dominio de transmembrana de la proteína de receptor Neu da lugar al oncogén neu. El oncogén erbA se deriva del receptor intracelular para la hormona tiroidea. El receptor ErbA oncogénico modificado se cree para competir con el receptor de hormona tiroidea endógena, causando crecimiento incontrolado.

La clase más grande de oncógenos incluye las proteínas transducción de señal ( por ejemplo, Src, Abl y Ras). La proteína Src es una proteína-tirosina cinasa citoplásmica, y su transformación del proto-oncogén al oncogén en algunos casos, resulta a través de mutaciones en el residuo de tirosina 527. En cambio, la transformación de la proteína ras GTPasa del proto- oncogen al oncogén, en un ejemplo, resulta de una valina a la mutación de glicina en el aminoácido 12 en la secuencia, reduciendo la actividad de ras GTPasa. Las proteínas Jun, Fos y Myc son proteínas que ejercen directamente sus efectos sobre funciones nucleares como factores de transcripción .

Inhibidores de Proliferación Celular. Los oncógenos del supresor tumoral funcionan para inhibir la proliferación celular excesiva. La inactivación de estos genes destruye su actividad inhibidora, dando por resultado la proliferación no regulada. Los supresores tumorales más comunes son Rb, p53, p21 y p16.

Otros genes que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención incluyen las fusiones APC, DCC, NF-1 , NF-2 , WT-1 , MEN-I, EN-II, zacl, p73, VHL, C-CAM , MMAC 1 /PTEN, DBCCR-1 , FCC, rsk-3, p27, p27/pl6, y las fusiones p21 /p27.

Reguladores de Muerte Celular Programada. Apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso esencial para el desarrollo embrionario normal, manteniendo la homeostasis en tejidos adultos, y suprimiendo la carcinogénesis (Kerr et al. , 1972). La familia Bcl-2 de proteínas y proteasas similares a ICE han demostrado ser importantes reguladores y efectores de apoptosis en otros sistemas. La proteína Bcl-2 , descubierta en asociación con linfoma folicular, desempeña un papel destacado en controlar la apoptosis y mejora la supervivencia celular en respuesta a diversos estímulos apoptóticos (Bakhshi et al. , 1985; Cleary and Sklar, 1985; Cleary et al. , 1986; Tsujimoto et al. , 1985; Tsujimoto and Croce, 1986). La proteína Bcl-2 evolucionariamente conservada ahora se reconoce para ser un miembro de una familia de proteínas relacionadas, que pueden categorizarse como agonistas de muerte o antagonistas de 5 muerte.

Subsecuente a su descubrimiento, se mostró que Bcl-2 actúa para suprimir la muerte celular accionada por una variedad de estímulos. Tambien, ahora es evidente que hay una familia de proteínas reguladoras de muerte celular Bcl-2 que comparten en ío común homologías estructurales y secuenciales. Estos diferentes miembros de la familia han mostrado ya sea poseer funciones similares a Bcl-2 (por ejemplo, BCIXL, Bclw, Bcls, Mcl-1 , Al, Bfl-1 ) o contrarrestar la función Bcl-2 y promueven la muerte celular (por ejemplo, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad , Harakiri) . is 5. Cirugía Aproximadamente 60% de personas con cáncer experimentarán cirug ía de un cierto tipo, que incluye cirugía preventiva, de diagnosis o de estadificación , curativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento contra el cáncer que puede 20 usarse en combinación con otras terapias, como el tratamiento de la presente invención, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia de gen, inmunoterapia y/o terapias alternativas.

La cirugía curativa incluye la resección en la cual todo o parte del tejido canceroso se elimina, extirpa, y/o destruye 25 físicamente. La resección del tumor se refiere al retiro físico de por lo menos parte de un tumor. Además de la resección del tumor, el tratamiento mediante cirugía incluye cirugía láser, criocirugía, electrocirugía, y cirugía microscópicamente controlada (cirugía de Mohs). Se contempla además que la presente invención puede usarse en combinación con el retiro de cánceres superficiales, precánceres, o cantidades fortuitas de tejido normal.

Tras la escisión de parte o de todas las células cancerosas, tejido, o tumor, una cavidad puede formarse en el cuerpo. El tratamiento puede llevarse a cabo mediante perfusión , inyección directa o aplicación local del área con una terapia anticáncer adicional. Tal tratamiento puede repetirse, por ejemplo, cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, o 7 d ías, o cada 1 , 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12 meses. Estos tratamientos pueden ser de dosificaciones variables también.

C. Enfermedades Autommunes La presente invención también contempla el tratamiento de enfermedad autoinmune al usar los anticuerpos de la presente invención . PR1 se deriva de las mismas proteínas mieloides. La proteinasa 3 (Pr3), que contiene PR1 , es el objetivo de ataque autoinmune en la granulomatosis de Wegener. La mieloperoxidasa (MPO, por sus siglas en inglés) es el antígeno objetivo en vasculitis de pequeños vasos (Franssen et al. , 1996; Brouwer et al. , 1994; Molldrem et al. , 1996), con evidencia para ya sea células T e inmunidad de anticuerpo en pacientes con estas enfermedades. La granulomatosis de Wegener se asocia con la producción de anticuerpos citoplásmicos anti-neutrófilos citoplasmáticos (cANCA, por sus siglas en ingles) con especificidad para Pr3 (Molldrem et al. , 1997), mientras que poliangeítis microscópicas y síndrome de Churg-Strauss se asocian con ANCA perinuclear (pANCA, por sus siglas en inglés) con especificidad para MPO (Molldrem et al. , 1999; Savage et al. , 1999). Como tal, la inhibición de reconocimiento celular inmune de PR1 puede se terapéutica para la enfermedad autommune.

Así, los anticuerpos de la presente invención serán administrados a los sujetos que sufren de enfermedad autoinmune para neutralizar efectos de otros autoanticuerpos ( por ejemplo, pANCA contra proteinasa 3). Alternativamente, un anticuerpo será modificado para ser "bi-específico", es decir, para tener especificidad inmunológica para dos antígenos, donde uno es PR1 /HLA-A2, y el otro es DEC-205 similar a antígenos de superficie de célula dendrítica, LOX-1 , RAGE, de tal modo bloqueando la función de célula dendrítica en la presentadoras de antígeno. 1. Vasculitis La vasculitis es un proceso causado por la inflamación de las paredes del vaso sanguíneo y da lugar en una variedad de trastornos. Un sistema de clasificación aceptado para la vasculitis no ha surgido, aunque pueda ser categorizado por el tamaño o el tipo del vaso sanguíneo implicado como vasculitis grandes, medios, o pequeños vasos. La vasculitis de pequeños vasos se define como vasculitis que afecta vasos más pequeños que las arterias (es decir, arteriolas, venulas y capilares) ; sin embargo, la vasculitis de pequeños vasos puede también implicar arterias de tamaño mediano. La vasculitis asociada a anticuerpo citoplásmico anti-neutrófilos (ANCA, por sus siglas en inglés) es la causa más común de vasculitis de pequeños vasos e incluye poliangeítis microscópica, granulomatosis de Wegener, síndrome de Churg-Strauss, y ciertos tipos de vasculitis inducida por fármaco.

Granulomatosis de Wegener. La granulomatosis de Wegener es un trastorno raro que causa la inflamación de los vasos sanguíneos en el tracto respiratorio superior (nariz, senos paranasales, oídos), pulmones, y riñones. Muchas otras áreas del cuerpo pueden también ser afectadas, con artritis (inflamación de articulaciones) que ocurre en casi la mitad de todos los casos. Los ojos y la piel pueden también ser afectados. La causa es desconocida, pero la Granulomatosis de Wegener se piensa que es una enfermedad autommune y se clasifica a menudo como una de las enfermedades reumáticas. Las lesiones destructivas lesiones se desarrollan en el tracto respiratorio superior e inferior y el riñón . En el riñón, estas lesiones causan glomerulonefritis que puede dar lugar a la hematuria (sangre en la orina) e insuficiencia renal. Se presenta con mayor frecuencia entre las edades de 30 y 50, y afectan a los hombres dos veces más a menudo que las mujeres. Es rara en niños, pero se ha visto en los bebes de tan sólo 3 meses de edad. La enfermedad de riñón puede progresar rápidamente, con insuficiencia renal que ocurre dentro de meses de la diagnosis inicial. Si no es tratada, la insuficiencia renal y la muerte ocurren en más del 90% de todos los pacientes con granulomatosis de Wegener.

Los síntomas tempranos pueden incluir fatiga, malestar, fiebre, y un sentido del malestar alrededor de la nariz y de los senos paranasales. Las infecciones respiratorias superiores como sinusitis o infecciones del oído preceden frecuentemente la diagnosis de la Granulomatosis de Wegener. Otros síntomas respiratorios superiores incluyen sangrado nasal, dolor y llagas alrededor de la abertura de la nariz. La fiebre persistente sin una causa obvia (fiebre del origen indeterminado -- FUO) puede ser un síntoma inicial. Sudores nocturnos pueden acompañar la fiebre. La pérdida de apetito y de pérdida de peso es común. Las lesiones de piel son comunes, pero no hay una lesión característica asociada con la enfermedad . La enfermedad de riñón es necesaria hacer la diagnosis definitivo de la Granulomatosis de Wegener. La orina puede ser sangrienta, que a menudo primero aparece como orina roja o turbia. Puede que no haya síntomas, pero se diagnostica fácilmente con estudios de laboratorio. Problemas en los ojos se desarrollan en un número significativo de pacientes y pueden ir desde una conjuntivitis leve a inflamación severa del globo de ojo y los tejidos alrededor del globo de ojo. Los síntomas adicionales incluyen debilidad , perdida de apetito, pérdida de peso, secreción sangumolenta por la nariz, dolor en los senos paranasales, sinusitis, lesiones en y alrededor de la abertura de la nariz, tos, tos con sangre, esputo con sangre, dificultad para respirar, sibilancias, dolor de pecho, sangre en la orina, erupciones, y dolor en las articulaciones.

La diagnosis se hizo tomando una biopsia del tejido anormal, que puede incluir biopsia de pulmón abierto, biopsia de vías respiratorias superiores, biopsia de mucosa nasal, broncoscopia con biopsia transtraqueal, biopsia de riñón, urinálisis, rayos X de mama, aspiración de médula, prueba de sangre (para autoanticuerpos). El tratamiento incluye corticoesteroides, ciclofosfamida, metotrexato, o azatioprina, que puede producir la remisión a largo plazo en más del 90% de gente afectada.

Síndrome de Churg-Strauss. El síndrome de Churg-Strauss (CSS, por sus siglas en inglés) , también conocido como granulomatosis alérgica, es una forma de vasculitis sistémica. El CSS es similar a la poliarteritis nodosa, pero la abundancia de eosinófilos distingue esta enfermedad . La mayoría de los pacientes con CSS son de mediana edad , con una historia de nueva o aumentada severidad del asma - asma que es una de las características cardinales del CSS. Los síntomas del asma pueden comenzar mucho antes del inicio de la vasculitis. Otros síntomas tempranos incluyen pólipos nasales y rinitis alérgica.

La enfermedad a menudo se convierte en eosinofilia , con conteos alcanzando hasta del 60%. La siguiente fase de enfermedad es la vasculitis abierta, que puede implicar la piel, pulmones, nervios, riñones, y otros órganos. La afectación del nervio periferico puede ser particularmente debilitante e incluye dolor, entumecimiento, o hormigueo en las extremidades (neuropatía/mononeuritis múltiple). Antes de la llegada de las terapias, el CSS fue a menudo una enfermedad fatal. La mayoría de pacientes murió de enfermedad creciente, incontrolada.

La causa del CSS no se conoce, pero es como multifactorial.

Aunque un factor genético puede existir, el CSS se considera solo raramente en dos miembros de la misma familia. Así, los factores ambientales y las infecciones son más probables ser la causa, pero no hay evidencia definitiva de esto. La diagnosis se realiza mediante una combinación específica de síntomas y signos, el patrón de afectación de órgano, y la presencia de ciertas pruebas de sangre anormales (eosinofilia, en particular). Además de una historia paciente detallada y un examen físico, pruebas de sangre, rayos X de mama y otros tipos de estudios de imagenología, pruebas de conducción de nervio, y biopsias de tejido (pulmón, piel, o nervio) pueden realizarse para ayudar en la diagnosis. Para ser clasificado como un paciente con CSS, un paciente debe tener por lo menos 4 de los siguientes 6 criterios: 1 ) asma; 2) eosinofilia [> 10% en conteo de WBC diferencial]; 3) mononeuropatía; 4) infiltrados pulmonares transitorios en rayos X de mama; 5) anomalías de los senos paranasales; y 6) biopsia que contiene un vaso sangu íneo con eosinófilos extravasculares.

El CSS responde generalmente a la prednisona. Inicialmente, altas dosis de prednisona oral se usaron, pero despues del primer mes o así, esta alta dosis de prednisona se reduce gradualmente durante los siguientes meses. Otros fármacos inmunosupresivos, como azatioprina, cellcept, metotrexato, o ciclofosfamida pueden usarse además de la prednisona. Altas dosis de esteroides intravenosos tal vez son útiles para aquellos pacientes con enfermedad severa, o para aquellos que son insensibles a otros tratamientos. Con terapia apropiada, los síntomas comienzan a resolverse rápidamente, con mejora gradual en la función cardiaca y renal , así como la mejora en el dolor que resultada de la afectación del nervio periférico La terapia puede durar de 1 a 2 años, dependiendo de la respuesta del paciente y continuación de la enfermedad . 2. Enfermedad de Crohn Los síntomas de la enfermedad de Crohn incluyen inflamación intestinal y el desarrollo de la estenosis intestinal y las fístulas; neuropatía acompañada a menudo de estos síntomas. Los fármacos antiinflamatorios, como 5-aminosalicilatos ( or ejemplo, mesalamina) o corticoesteroides, son comúnmente prescritos, pero no son siempre eficaces (repasado en V.A. Botoman et al. , 1998). La inmunosupresión con ciclosporina es a veces beneficiosa para pacientes resistentes a o intolerantes a los corticoesteroides (Brynskov et al. , 1989).

Sin embargo, la corrección quirúrgica se requiere eventual en 90% de pacientes; 50% experimentan resección colónica (Leiper et al. , 1998; Makowiec et al. , 1998). El índice de 5 recurrencia despues de la cirug ía es alto, con un 50% requieren cirugía adicional dentro de 5 años (Leiper et al. , 1998; Besnard et al. , 1998).

Una hipótesis para la etiología de la enfermedad de Crohn es que una falta de la barrera de mucosa intestinal , posiblemente ío que resulta de las susceptibilidades genéticas y de los factores ambientales ( por ejemplo, fumar), expone el sistema inmune a antígenos del lumen intestinal incluyendo antígenos bacterianos y de alimentos ( or ejemplo, Soderholm et al. , 1999; Holandés et al. , 1986; Hollander, 1992). Otra hipótesis es que la infección 15 intestinal persistente por parte de patógenos como Mycobacterio paratuberculosis, Listeria monocytogenes, Escherichia coli anormal, o paramixovirus, estimulan la inmunorespuesta; o alternativamente, los síntomas resultan de una inmunorespuesta desregulada a antígenos ubicuos, como microflora intestinal 20 normal y los metabilitos y toxinas que producen (Sartor, 1997) .

La presencia de anti -Sacccharomyces cerevisiae de IgA y de IgG (ASCA, por sus siglas en inglés) en el suero se encontró que fue altamente diagnóstica de la enfermedad de Crohn pediátrica (Ruemmele et al. , 1998; Hoffenberg et al. , 1999). 25 En la enfermedad de Crohn, una inmunorespuesta desregulada que tiene tendencia hacia la inmunopatología mediada por celulas (Murch, 1998). Pero los fármacos inmunosupresivos, como ciclosporina, tacrolimus, y mesalamina se han usado para tratar casos resistentes a corticoesteroides de la enfermedad de Crohn con éxito mixto (Brynskov et al. , 1989; Fellerman et al. , 1998).

Esfuerzos recientes para desarrollar herramientas de diagnosis y de tratamiento contra la enfermedad de Crohn se han centrado en el papel central de las citoqumas (Schreiber, 1998; van Hogezand & Verspaget, 1998). Las citocinas son proteínas pequeñas, secretadas o factores (5 a 20 kD) que tienen efectos específicos en interacciones célula-a-célula, comunicación intercelular, o comportamiento de otras células. Las citocinas son producidas por linfocitos, especialmente linfocitos TH1 y TH2, monocitos, macrófagos intestinales, granulocitos, células epiteliales, y fibroblastos (repasados en Rogler & Andus, 1998; Gallcy & Webster, 1996). Algunas citocinas son pro-inflamatorias ( por ejemplo, TNF-a, IL-1 (a y b), IL-6, IL-8, I L-12, o factor inhibidor de leucemia); otros son antiinflamatorias (por ejemplo, antagonista del receptor I L-1 , I L-4, I L-10, IL-1 1 , y TGF-b) . Sin embargo, puede haber traslape y redundancia funcional en sus efectos bajo ciertas condiciones inflamatorias.

En casos activos de enfermedad de Crohn, elevadas concentraciones de TNF-a e IL-6 se secretan en la circulación sanguínea, y TNF-a, IL-1 , IL-6, e I L-8 son producido en exceso localmente por las celulas de mucosa (Funakoshi et al. , 1998). Estas citocinas pueden tener efectos de de largo alcance en sistemas fisiológicos incluyendo desarrollo óseo, hematopoyesis, y hígado, tiroides, y función neuropsiquiátrica. También , un 5 desequilibrio de la relación de I L-1 p/I L-1 ra, a favor de I L- 1 b proinflamatorio, se ha observado en pacientes con enfermedad de Crohn (Rogler & Andus, 1998; Saiki et al. , 1998; Dionne et al. , 1998; pero ver S. Kuboyama, 1998). Un estudio sugirió que los perfiles de citocina en muestras de heces podrían ser una ío herramienta de diagnosis útil para la enfermedad de Crohn (Saiki et al. , 1998).

Los tratamientos que se han propuesto para la enfermedad de Crohn incluyen el uso de varios antagonistas de citocina (por ejemplo, I L- 1 ra), inhibidores (por ejemplo, de enzima convertidora 15 de I L- 1 b y antioxidantes) y anticuerpos anti-citocina (Rogler and Andus, 1998; van Hogezand & Verspaget, 1998; Reimund et al. , 1998; N . Lugering et al. , 1998; McAlindon et al. , 1998) . En particular, los anticuerpos monoclonales contra TN F-a se han ensayado con un cierto éxito en el tratamiento de la enfermedad 20 de Crohn (Targan et al. , 1997; Apilado et al. , 1997; van Dullemen et al. , 1995) . Estos compuestos pueden usarse en terapia de combinación con compuestos de la presente invención .

Otro proceso para el tratamiento de la enfermedad de Crohn se ha centrado en por lo menos erradicar parcialmente la 25 comunidad bacteriana que puede accionar la respuesta inflamatoria y sustituirla con una comunidad no patógena. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5,599,795 describe un metodo para la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Crohn en pacientes humanos. Su método se dirigió a esterilizar la zona intestinal con por lo menos un antibiótico y por lo menos un agente antihongos para suprimir la flora existente y sustituirlo por bacterias diferentes, selectas, bien caracterizadas tomadas de humanos normales. Borody enseñó un método para tratar la enfermedad de Crohn por lo menos el retiro parcial de la microflora intestinal existente por lavado y reemplazo con una nueva comunidad bacteriana introducida por el inoculo fecal de un donante humano evaluado como enfermo o por una composición que comprende las especies Bacteroides y Escherichia coli (Patente de Estados Unidos 5,443,826). Sin embargo, no ha habido causa conocida de la enfermedad de Crohn a la cual la diagnosis y/o el tratamiento podrían ser dirigida. 3. Artritis Reumatoide La etiología exacta de RA sigue siendo desconocida, pero está claro que tiene aspectos autommunes. Los primeros signos de la enfermedad de las articulaciones aparecen en la capa de revestimiento sinovial, con proliferación de fibroblastos sinoviales y su unión a la superficie articular en el margen articular (Lipsky, 1998). Posteriormente, los macrófagos, las células T y otras células inflamatorias se seleccionan en la articulación , donde producen un número de mediadores, incluyendo las citocinas interleucinas-1 (I L-1 , por sus siglas en inglés), que contribuye a las secuelas crónicas que llevan a la destrucción ósea y del cartílago, y el factor de necrosis tumoral (TNF-a), que desempeña un papel en la inflamación (Dinarello, 1998; Burger & Dayer, 5 1995; van den Berg, 2001 ) . La concentración de I L-1 en plasma es significantemente más alta en pacientes con RA que en individuos sanos y, notablemente, niveles de plasma de I L-1 correlacionados con actividad de enfermedad de RA (Eastgate et al. , 1988). Por otra parte, los niveles fluidos sinoviales de I L 1 se ío correlacionan con varias características radiográficas e histológicas de RA (Kahle et al. , 1992; Rooncy et al. , 1990).

En articulaciones normales, los efectos de éstas y otras citocinas promflamatorias son balanceados por una variedad de citocinas antiinflamatorias y de factores reguladores (Burger & i5 Dayer, 1995). La significación de este equilibrio de citocina se ilustra en pacientes juveniles con RA, que tienen aumentos cíclicos en fiebre a través del día (Prieur et al. , 1987). Después de cada pico en fiebre, un factor que bloquea los efectos de I L-1 se encuentra en suero y orina. Este factor se ha aislado, clonado 20 e identificado como el antagonista del receptor de I L-1 (I L-1 ra , por sus siglas en inglés), un miembro de la familia del gen de I L-1 (Hannum et al. , 1990). La l L- 1 ra , como su nombre indica, es un antagonista del receptor natural que compite con I L-1 para unir a los receptores de I L-1 tipo I y, como resultado, bloquea los 25 efectos de IL-1 (Arend et al. , 1998). Un exceso de 10 a 100 veces de I L-1 ra puede ser necesario para bloquear I L-1 eficazmente; sin embargo, las celulas sinoviales aisladas de pacientes con RA no parecen producir bastante I L- 1 ra para contrarrestar los efectos de IL-1 (Firestein et al. , 1994; Fujikawa et al. , 1995). 4. Lupus Eritematoso Sistémico El lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés) es una enfermedad reumática autommune caracterizada por la deposición en tejidos de autoanticuerpos y complejos inmunes que llevan a lesión de tejido (Kotzin , 1996). En contraste con enfermedades autoinmunes como MS y diabetes mellitus tipo 1 , SLE potencialmente implica sistemas de múltiples órganos directamente, y sus manifestaciones clínicas son diferentes y variables (repasado por Kotzin & O'Dell, 1995) . Por ejemplo, algunos pacientes pueden demostrar principalmente erupciones en la piel y dolor en las articulaciones, muestran remisiones espontáneas, y requieren poca medicación. En el otro extremo del espectro están los pacientes que demuestran afectación renal severa y progresiva que requiere terapia con altas dosis de esteroides y fármacos citotóxicos como ciclofosfamida (Kotzin, 1996).

El sello serológico de SLE, y la prueba de diagnosis primaria disponible, son niveles de suero elevados de anticuerpos de IgG a constituyentes del núcleo celular, como ADN de doble hebra (dsDNA, por sus siglas en inglés), ADN de una sola hebra (ss-DNA, por sus siglas en ingles), y cromatina. Entre estos autoanticuerpos, los anticuerpos anti-dsADN de IgG desempeñan un papel principal en el desarrollo de la glomerulonefritis lúpica (GN , por sus siglas en inglés) (Hahn & Tsao, 1993; Ohnishi et al. , 1994). La glomerulonefritis es una condición seria en la cual las paredes capilares de los glomérulos que purifican la sangre del riñón es espesa por acreciones en el lado epitelial de las membranas básales glomerulares. La enfermedad es a menudo crónica y progresista y puede llevar a falta renal eventual Los mecanismos por los cuales los autoanticuerpos son inducidos en estas enfermedades autommunes siguen siendo confusos. Pues no ha habido causa conocida de SLE, al cual la diagnosis y/o el tratamiento podría ser dirigido, el tratamiento se ha dirigido para suprimir ínmunorespuestas, por ejemplo, con antibióticos macrólidos, más que una causa subyacente, ( por ejemplo, Patente de Estados Unidos 4,843,092) . 5. Artritis Reumatoide Juvenil La artritis reumatoide juvenil (JRA, por sus siglas en inglés), un término para la forma más frecuente de artritis en niños, se aplica a una familia de enfermedades caracterizadas por inflamación crónica e hipertrofia de las membranas sinoviales. El término se superpone, pero no es completamente sinónimo, con la familia de enfermedades referidas como artritis crónica juvenil y/o artritis idiopática juvenil en Europa.

Jarvis (1998) y ortos (Arend , 2001 ) han propuesto que la patogenesis de la enfermedad reumatoide en adultos y niños implica interacciones complejas entre la inmunidad natural y adaptiva. Esta complejidad se encuentra en el núcleo de la dificultad de desenlazar la patogénesis de la enfermedad.

Los sistemas inmunes naturales y adaptativos usaron múltiples tipos de células, un arreglo extenso de superficie celular y proteínas secretadas, y red^s interconectadas de la retroalimentación positiva y negativa (Lo et al. , 1999). Además, mientras que es separable en pensamiento, alcances innatos y adaptativos del sistema inmune se intersecan funcionalmente (Fearon & Lockslcy, 1996), y los eventos patológicos que ocurren en estos puntos de intersección son probables que sean muy relevantes para la comprensión de los inventores de la patogénesis de formas adultas e infantiles de la artritis crónica (Warrington, et al. , 2001 ).

La JRA poliarticular es un subtipo clínico distinto caracterizado por inflamación y proliferación sinovial en múltiples articulaciones (cuatro o más), incluyendo pequeñas articulaciones de las manos (Jarvis, 2002). Este subtipo de J RA puede ser severo, debido a su afectación de múltiples articulaciones y su capacidad de progresar rápidamente con el tiempo. Aunque clínicamente es distinto, la J RA poliarticular no es homogénea, y los pacientes varían en manifestaciones de la enfermedad , edad del inicio, pronóstico, y respuesta terapéutica. Estas diferencias reflejan muy probablemente un espectro de variación en la en la naturaleza del ataque inmune e inflamatorio que puede ocurrir en esta enfermedad (Jarvis, 1998). 6. Síndrome de Sjogren El síndrome de Sjogren primario (SS, por sus siglas en ingles) es una enfermedad crónica, lentamente progresiva, autommune sistémica, que afecta predominante a mujeres de mediana edad (relación mujer-a-hombre 9: 1 ), aunque puede ser visto en todas las edades incluyendo la infancia (Jonsson et al. , 2002). Es caracterizado por infiltración linfocítica y destrucción de las glándulas exocrinas, que son infiltradas por células mononucleares incluyendo linfocitos CD4 + , CD8+ y células B (Jonsson et al. , 2002). Además, las manifestaciones extraglandulares (sistémicas) se consideran en un tercio de los pacientes (Jonsson et al. , 2001 ).

La infiltración linfocítica glandular es una característica progresiva (Jonsson et al. , 1993) , que, cuando es extensiva, puede sustituir grandes porciones de los órganos.

Interesantemente, los infiltrados glandulares en algunos pacientes se asemeja mucho a las microestructuras linfoides ectópicas en las glándulas salivales (indicadas como centros germinales ectópicos) (Salomonsson et al. , 2002; Xantou y Polihronis, 2001 ). En SS, los GCs ectópicos se definen como los agregados de células T y B de las células proliferantes con una red de células dendríticas foliculares y células endoteliales activadas. Éstas estructuras similares a CG formadas dentro del tejido objetivo tambien representan las propiedades funcionales con producción de autoanticuerpos (anti-Ro/SSA y anti-La/SSB) (Salomonsson & Jonsson, 2003).

En otras enfermedades autommunes sistémicas, como RA, los factores críticos para GCs ectópicos se han identificado. Los tejidos sinoviales reumatoides con GCs se muestran para producir quimiocinas CXCL13, CCL21 y linfotoxina (LT, por sus siglas en inglés)^ (detectados en centro folicular y células B de zona de epitelio). El análisis de regresión multivariante de estos analitos identificados CXCL13 y LT-b como las citocinas solitarias que predicen los GCs en sinovitis reumatoide (Wcyand & Goronzy, 2003). Recientemente CXCL13 y CXCR5 en glándulas salivales se han mostrado para desempeñar un papel esencial en el proceso inflamatorio mediante la selección de células B y T, por lo tanto contribuyendo a la neogénesis linfoide y a la formación de GC ectópica en SS (Salomonsson & Larsson , 2002) . 7. Psoriasis La psoriasis es una enfermedad de piel crónica de descamación y de la inflamación que afecta al 2 a 2.6 por ciento de la población de Estados Unidos, o entre 5.8 y 7.5 millones de personas. Aunque la enfermedad ocurre en todos los grupos de todas las edades, afecta principalmente a adultos. Aparece alrededor igualmente en hombres y mujeres. La psoriasis ocurre cuando las células epiteliales se levantan rápidamente de su origen debajo de la superficie de la piel y se acumulan en la superficie antes de que tengan la oportunidad de madurar. Por lo general, este movimiento (tambien llamado recambio) tarda generalmente alrededor de un mes, pero en psoriasis puede ocurrir en solamente algunos días. En su forma común, la psoriasis da lugar parches de piel gruesa, roja (inflamada) cubierta con escamas plateadas. Estos parches, que se refieren a veces como placas, generalmente pican o son dolorosas. Tienden a ocurrir en los codos, rodillas, otras partes de las piernas, cuero cabelludo, espalda baja, cara, palmas, y plantas del pie, pero pueden ocurrir en la piel en cualquier parte del cuerpo. La enfermedad puede también afectar a las uñas, los uñas de los pies, y tejidos blandos de los genitales y en el interior de la boca. Si no es inusual para la piel alrededor de las articulaciones afectadas se agriete, aproximadamente 1 millón de personas con psoriasis experimentan inflamación de articulaciones que produce síntomas de la artritis. Esta condición se llama artritis psoriática.

La psoriasis es un trastorno de la piel impulsado por el sistema inmune, implicando especialmente células T. En la psoriasis, las células T son colocadas en acción por error y llegan a ser tan activas que accionan otras inmunorespuestas, que llevan a la inflamación y al recambio rápido de células epiteliales. En aproximadamente un tercio de los casos, hay historia familiar de psoriasis. Los investigadores han estudiado un gran número de familias afectadas por la psoriasis y los genes identificados ligados a la enfermedad. La gente con psoriasis puede notar que hay momentos cuando su piel empeora, despues de mejorar. Las condiciones que pueden causar ulceras incluyen infecciones, estrés, y cambios en el clima que secan la piel. También , ciertas medicinas, incluyendo litio y betabloqueadores, que son prescritos para la presión arterial alta, pueden accionar un brote o empeorar la enfermedad . 8. Esclerosis Múltiple La esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés) continúa siendo un serio problema de salud que aflige centenares de millares cada año en los Estados Unidos solamente, y millones por todo el mundo. Es una de las enfermedades más comunes del sistema nervioso central (cerebro y médula espinal). La MS es una condición inflamatoria asociada con desmielinización , o pérdida de la vaina de mielina. La mielina, un material graso que aísla los nervios, actúa como aislador en permitir que los nervios transmitan impulsos a partir de un punto a otro. En la MS, la pérdida de mielina es acompañada por una alteración en la capacidad de los nervios para conducir impulsos eléctricos desde y hacia el cerebro y esto produce los varios síntomas de la MS, como deficiencias en la visión, coordinación muscular, fuerza, sensación , habla y deglución , control de la vejiga, sexualidad y función cognoscitiva. Las placas o lesiones donde se pierde la mielina aparecen como áreas similares a cicatrices endurecidas. Estas cicatrices aparecen en diferentes momentos y en diferentes áreas del cerebro y la medula espinal, por lo tanto el término "esclerosis múltiple", literalmente significando muchas cicatrices.

Actualmente, no hay una sola prueba de laboratorio, síntoma, o hallazgo físico que proporcione un diagnosis concluyente de la MS. Para complicar las cosas, los síntomas de la EM pueden confundirse fácilmente con una amplia variedad de otras enfermedades, como la encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Lyme, mielopatía asociada a VI H, mielopatía asociada a HTLV-I , neurosífilis, leucoencefalopatía multifocal progresiva, lupus eritematoso sistémico, poliarteritis nodosa, síndrome de Sjógren , enfermedad de Behcet, sarcoidosis, síndromes paraneoplásicos, degeneración combinada subaguda medular, neuropatía mielo-óptica subaguda, adrenomieloneuropatía, síndromes espinocerebelares, paraparesia espástica hereditaria/esclerosis lateral primaria, accidentes cerebrovasculares, tumores, malformaciones arteriovenosas, quistes araenoides, malformaciones de Arnold-Chiari, y espondilosis cervical. Por lo tanto, la diagnosis de la EM debe hacerse por un proceso que demuestre resultados consistentes con la EM , y también descarta otras causas.

Generalmente, la diagnosis de la MS se basa en dos criterios. Primero, debe haber habido dos ataques al menos un mes de diferencia. Un ataque, también conocido como una exacerbación, reagudización, o recaída, es una aparición repentina de o empeoramiento de un síntoma de MS o síntomas que duran al menos 24 horas. Segundo, debe haber más de un área de daño a la vaina de mielina del sistema nervioso central. El daño a la vaina debe haber ocurrido en más de un punto en tiempo y no haber sido causado por cualquier otra enfermedad que pueda causar desmielinización o síntomas neurológicos similares. La MRI (imagenolog ía de resonancia magnetica) actualmente es el método preferido de representar el cerebro para detectar la presencia de placas o cicatrices causadas por la MS.

La diagnosis de la MS no pudo hacerse, sin embargo, solamente en base de MRI . Otras enfermedades pueden causar lesiones comparables en el cerebro que se asemejan a las causadas por la MS. Además, la aparición de lesiones cerebrales mediante MRI puede ser absolutamente heterogéneo en diferentes pacientes, incluso se asemeja a tumores cerebrales o de médula espinal en algunos. Además, una exploración de M RI normal no descarta un diagnosis de la MS, como un pequeña número de pacientes con MS confirmada no muestra ninguna lesión en el cerebro en MRI . Estos individuos tienen a menudo lesiones de médula espinal o lesiones que no pueden detectarse mediante MRI . Como resultado, es crítico que un examen clínico cuidadoso también incluye una historia del paciente y pruebas funcionales. Esto debe cubrir funciones mentales, emocionales, y de lenguaje, movimiento y coordinación , visión, balance, y las funciones de los cinco sentidos. El sexo, lugar de nacimiento, antecedentes familiares y edad de la persona cuando los síntomas primero comenzaron son tambien consideraciones importantes. Otras pruebas, incluyendo potenciales evocados (estudios de diagnosis eléctricos que pueden revelar los retrasos en los tiempos de conducción del sistema nervioso central) , fluido cerebroespinal (que busca la presencia de genes de ¡nmunoglobulina expandida clonalmente, referida como bandas oligoclonales), y sangre (para descartar otras causas), pueden requerirse en ciertos casos.

D. Terapia de Combinación Las terapias de combinación para los trastornos inmunes enumerados antes también se contemplan . Tales terapias incluirían terapias estándar como agentes antiinflamatorios y inmunosupresivos, usados en combinación con los métodos terapéuticos de la presente invención . Tales terapias estándar serán capaces de negativamente afectar una célula inmune que causa enfermedad en un sujeto o aliviar los síntomas de tal enfermedad. Este proceso puede implicar poner en contacto las células o el sujeto con los ambos agentes al mismo tiempo. Esto puede alcanzarse con una sola composición o una formulación farmacológica que incluya ambos agentes, o con dos composiciones o formulaciones distintas al mismo tiempo. Alternativamente, la terapia de anticuerpo puede preceder o seguir el otro tratamiento de agente por intervalos que oscilan de minutos a semanas.

Varias combinaciones pueden emplearse; por ejemplo, la terapia de anticuerpo (con o sin un agente terapeutico conjugado) es "A" y la terapia de inmune enfermedad secundaria es "B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A La administración de los agentes terapéuticos de la presente invención a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de esta terapia secundaria particular, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hay, de la terapia con anticuerpos. Se espera que los ciclos de tratamiento sean repetidos como sea necesario. También se contempla que varias terapias estándar, así como la intervención quirúrgica, pueden ser aplicadas en combinación con las terapias descritas.

Vil. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Debe apreciarse por los expertos en la téenica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la invención , y así pueden considerarse para constituir los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben, a la luz de la presente descripción , aprecian que muchos cambios pueden hacerse en las modalidades específicas se describen que y todavía obtiene un resultado semejante o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 : MÉTODOS Producción del anticuerpo. Para obtener un anticuerpo contra el epítopo PR1 /HLA-A*0201 combinado, los inventores inmunizaron ratones BALB/c con monómeros PR1 /HLA-A*0201 recombinantes a traves de rutas subcutáneas (SQ, por sus siglas en inglés) e intraperitoneales (I P, por sus siglas en inglés), tres veces separadas dos semanas aparte. Se aislaron esplenocitos a partir del animal inmunizado y se fusionaron las células B con HGPRT negativo, las células de mieloma inmortalizadas usaron polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés) . Las células de hibridoma después se seleccionaron con los monómeros pp65/HLA-A*0201 y PR1 /HLA-A*0201 y se colocaron en placas de 96 pozos para clonación unicelular.

Evaluación y Caracterización del anticuerpo. Las líneas celulares monoclonales (~20.000) se evaluaron con monómeros PR1 /H LA-A*0201 mediante ELISA para identificar un hibridoma de secreción de anticuerpo positivo. El hibridoma 8F4 se identificó mediante ELISA con especificidad para PR1 /HLA-A*0201 y se caracterizó al usar anticuerpos específicos de isotipos y anticuerpos de cadena ligera de inmunoglobulina.

Clonación del Anticuerpo, Análisis de Secuencia y Estudios de Unión. La cadena pesada 8F4 se clonó a partir de ADNc de hibridoma y se obtuvo la secuencia primaria. Se realizó la cartografía epitópica al plegar péptidos PR1 alterados, que contienen una sustitución de Ala en cada posición P1 a P9, con la cadena pesada HLA-A*0201 más microglobulina b-2. Se determinó la afinidad de unión de 8F4 a PR1 /HLA-A*0201 mediante resonancia de plasmón superficial en un instrumento de Biacore con 8F4 inmovilizado y el aumento de concentración de PR1 /HLA-A*0201 soluble. El análisis de FACS y la imagenología confocal se usaron para estudiar la unión de 8F4 a celulas normales y anormales.

Actividad de Anticuerpo. Para determinar si la unión de 8F4 a AML desencadena la lisis celular, se realizaron citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC , por sus siglas en inglés) y ensayos de citotoxicidad dependiente de complementos (CDC, por sus siglas en inglés). Las células AML del material de paciente que se mostró para ser sensible a lisis mediada con CDC de 8F4 se incubaron en presencia o ausencia de 8F4 o control de isotipo y después se transfirieron en ratones NOD/SCID transgénicos de HLA-A2 inmunodeficientes irradiados (200 cGy). A dos semanas, los animales se sacrificaron y se analizaron los esplenocitos y la médula mediante FACS.

Aislamiento Total de ARN . Se usó el kit Qiagen RNA Easy con columnas minelut. El amortiguador de carga de ARN se hizo como sigue: agregar 1 mI de bromuro de etidio (EtBr, por sus siglas en inglés) (10 mg/ml) a 100 mI, 10x de tinte de carga de ADN , 1 % de agarosa en 1 X TAE, ARNasa libre de H2O (en kit). Las instrucciones son "frasco congelado de células de hibridoma o 1 -5 x 106 células vivas. Si los cultivos activos están disponibles, granular 1 -5 x 1 O6 celulas vivas en un tubo cónico de 15 mi como en la etapa 4 y proceder a la etapa 5. Si solamente las células congeladas están disponibles, descongelar células de hibridoma de 1 frasco a 37C, retirar del baño de agua puntualmente después de descongelar, mezclar suavemente. Limpiar el frasco con 70% de etanol y desenroscar la tapa teniendo cuidado de evitar tocar las roscas. Transferir el contenido del frasco al tubo cónico de 15 mi que contiene 15 mi de medio completo. Centrifugar 100 x g (~1 .000 rpm para la centrífuga de poca velocidad Sorvall) durante 5 min . Durante la centrifugación, agregar b-mercaptoetanol a la pequeña alícuota del amortiguador de RLT. Retirar cuidadosamente todo el medio de células con la pipeta de 10 mi. Se lisa la pelotilla celular en amortiguador RLT al usar Qiashredder y seguir el protocolo de Qiagen para el aislamiento del ARN . Eluir el ARN de la columna minelut con 2X de 15 ml de ARNasa libre de dH2O dependiendo de la cantidad de célula inicial (si a partir de 6 pozos, se eluye con 1 x 13 pl). El ARN debe permanecer en hielo a través de los siguientes procedimientos. Verter 1 % de minigel de agarosa que contiene 1 mg/ml de EtBr y durante 15 minutos de tiempo de solidificación cuantificar el ARN . Cuantificar 2 mI de ARN usando un espectrofotómetro, usar el mismo H20 libre de ARNasa anterior como un blanco. Calcular la concentración de ARN : (A26O)(40) - pg/ml. La relación A260/280 debe ser > 1 .6.

Comprobar la calidad del ARN al secuenciar 1 ug en 1 % de minigel de agarosa en 1 % mI de volumen total de 1 X de amortiguador de carga de ARN . Secuenciar -2.54 cm (-1 pulgada) en el gel. Analizar el gel en el sistema de documentación de foto. El patrón de bandas del ARN de alta calidad está caracterizado por distintas bandas 28s y 18s del ARN ribosomal a una relación ideal de 2: 1 en intensidad . Una relación 1 : 1 puede ser aceptable; sin embargo no hay bandas o una mancha en la parte inferior del gel indicativo de degradación del ARN e indica que este ARN no debe usarse.

Aislamiento y análisis de secuencia de genes de región variable (V) de Ig reorganizados del hibridoma. Para obtener secuencias de ADN a partir de genes de cadena pesada de V (VH) y cadena ligera de V (VL), la amplificación rápida de los extremos de ADNc se realizó con el kit de amplificación de ADNc BD Smart TM RACE (BD Bioscience) y siguiendo las instrucciones proporcionadas con el mismo. Se usaron PFU ultra (Stratagene), mezcla del cebador A de Universla (U PM) y cebadores específicas de gen (GSP) para la región constante H&L de IgG humana.

La clonación y el secuenciado de ADN de productos 5' RACE PCR usaron el kit de clonación TOPO (I nvitrogen) y el kit de extracción de gel (Qiagen) . Para IgG L, 8 colonias se aislaron para minipreparación y evaluación mediante digerir EcoRI . Seis clones positivos se secuenciaron con cebadores M 13 rev y T7. Para IgG, 8 colonias se aislaron para minipreparación y evaluación mediante digerir EcoRI . Seis clones positivos se secuenciaron con cebadores M 13 rev y T7.

EJEMPLO 2: RESULTADOS Producción de anticuerpo. Para obtener un anticuerpo contra el epítopo PR1 /HLA-A*0201 combinado, los inventores inmunizaron ratones BALB/c con monómeros PR1 /HLA-A*0201 recombinantes a traves de rutas subcutáneas (SQ, por sus siglas en inglés) e intraperitoneales ( I P , por sus siglas en inglés), tres veces se espaciaron dos semanas aparte. Se aislaron los esplenocitos del animal inmunizado y se fusionaron las células B con HGPRT negativo, las células de mieloma inmortalizadas usaron polietilenglicol (PEG , por sus siglas en inglés). Las células de hibridoma después se seleccionaron con los monómeros pp65/HLA-A*0201 y PR1 /HLA-A*0201 y se colocaron en placas de 96 pozos para clonación unicelular.

Evaluación y Caracterización de Anticuerpo. Se evaluaron las líneas celulares monoclonales con monómeros PR1 /HLA-A*0201 mediante ELISA para identificar un hibridoma de secreción de anticuerpo positivo. Casi 2,000 hibridomas se evaluaron y uno, 8F4 doblado, se identificó mediante ELISA con especificidad para PR 1 /HLA-A 0201 . Se caracterizó el hibridoma 8F4 al usar anticuerpos específicos del isotipo y los anticuerpos de cadena ligera de inmunoglobulina y mostró secretar un anticuerpo específico del PRI/HLA-A*0201 de lgG2a-K simple.

Evaluación de Unión ai Anticuerpo. Se realizó la cartografía epitópica doblando los péptidos PR1 alterados, que contienen una sustitución de Ala en cada posición P 1 a P9, con la microglobulina de cadena pesada H LA-A*0201 más b2. P1 resulta ser el más crítico para la unión a 8F4, aunque la alteración de todas las posiciones del aminoácido interrumpe la unión (FIG. 1 ). 5 La afinidad de unión de 8F4 a PR1 /HLA-A*0201 se determinó mediante resonancia de plasmón superficial en un instrumento de Biacore con 8F4 inmovilizado y concentración aumentada de PR1 /HLA-A*0201 soluble, como se muestra en la FIG . 2. 8F4 KD es 9.9 nM , comparado al KD de 162 nM para un anticuerpo ío monoclonal murino BB7.2 comercialmente disponible que reconoce un distinto sitio específico del alelo en H LA-A*0201 . Al usar microscopía confocal, los conjugados de fluorescencia directa de 8F4 solamente se unen a celulas PR1 T2 pulsadas por péptido (que expresan HLA-A*0201 ), pero no a células T2 15 pulsadas por pp65 o no pulsadas irrelevantes. Tomando juntas, se confirmó la especificidad de 8F4 para, y alta afinidad de unión a 8F4 al PR1 /HLA-A*0201 combinado. Usando el análisis de FACS e imagenolog ía confocal (de nuevo con 8F4, anticuerpo anti-HLA-A*0201 de BB7.2 conjugado con FITC, y DAPI), 8F4 se 20 mostró para unir a los blastos de circulación de pacientes con H LA-A2+ con AML pero no a PBMC de donantes sanos con HLA- A2+ ni a blastos AML negativos a H LA-A2 (FIGS. 3 y 5).

Clonación y secuenciado de genes de región variable de 8F4 de ratón. Las células del hibridoma de 8F4 de ratón se 5 hicieron crecer en medio RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT) que contienen 10% de suero bovino fetal (FBS; HyClone) y 1 mM de piruvato de sodio a 37°C en una incubadora de CO2 al 7.5% . Se extrajo el ARN total de aproximadamente 107 celulas de hibridoma al usar el reactivo de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del proveedor. El ADNc imprimado con oligo dT se sintetizó usando el kit de amplificación de ADNc por SMARTer RACE (Clontech , Mountain View, CA) siguiendo el protocolo del proveedor. Los ADNcs de región variable para las cadenas pesadas y ligeras de 8F4 se amplificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) con la polimerasa de ADN de Phusion (New England Biolabs, Beverly, MA) usar cebadores en 3' que hibridan, respectivamente, a las regiones constantes de cadena y-2a y k de ratón, y una mezcla de Universal Primer A o Nested Universal Primer A proporcionada en el Kit de Amplificación de ADNc por SMARTer RACE como un cebador en 5'. Para la amplificación de la PCR de región variable de cadena pesada (VH , por sus siglas en inglés), el cebador en 3' tiene la secuencia 5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3' (SEC ID NO:46) . Para la amplificación de la PCR de región variable de cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés), el cebador en 3' tiene la secuencia 5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEC I D NO:47). Los ADNc VH y VL amplificados se clonaron en el vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) para la determinación de secuencia. El secuenciado del ADN de las regiones variables se realizó en Tocore (Menlo Park, CA). Se secuenciaron varios clones de cadena pesada y ligera y se identificaron las únicas secuencias homologas a las regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón comunes. Las secuencias de ADNc de consenso junto con secuencias de aminoácidos deducidas VH y VL de 8F4 se muestran en las FIGS. 1 y 2 , respectivamente. No se observaron ningunas de las características inusuales en las secuencias de aminoácidos VH y VL de 8F4 maduras.

Construcción del anticuerpo quimerico de lgGI/k de 8F4. Un gen que codifica VH de 8F4 se generó como un exón que incluye una señal donante del empalme y se apropia de sitios de la enzima de restricción flanqueante por PCR al usar el ADNc VH de 8F4 como un molde, 5'- GCAACTAGTACCACCAT GAACTTCGGGCTCAGC-3' (SEC ID NO:48; el sitio Spel está subrayado) como un cebador 5', y 5'-CGAAAGCTTGAAGTTAGGACTCACCTGCAGAGAGAGTGACCAGAG -3' (SEC I D NO:49; El sitio Hindlll está subrayado) como un cebador 3'. Asimismo, un gen que codifica VL de 8F4 se generó como un exón incluyendo una señal donante del empalme y los sitios de la enzima de restricción flanqueante apropiados por PCR al usar el ADNc VL de 8F4 como un molde, 5'-GCAGCTAGCACCACCATGGAGTCACAGATTCAG-3' (SEC ID NO:50; El sitio Nhel está subrayado) como un cebador 5' , y 5'-CGAGAATTCTTTGGATTCTACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTG-3' (SEC I D NO: 51 ; El sitio EcoRI está subrayado) como un cebador 3'. Las señales donantes del empalme VH de 8F4 y los exones VL se derivadas de la línea germinal de ratón JH3 y secuencias JK1 , respectivamente. Los fragmentos amplificados por PCR se purificaron en gel al usar el kit de Extracción II de NucleoSpin (Machercy-Nagel, Bethlehem, PA) y se clonaron en el vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) para la confirmación de la secuencia. Los fragmentos de V correctos se digeridos con Spel e Hindlll (para VH) o Nhel y EcoRI (para VL), purificaron en gel y clonaron en un vector de expresión mamífero que llevaba las regiones constantes y-1 y k humanas para la producción del anticuerpo quimerico de lgGI/k de 8F4. La estructura esquemática del vector de expresión resultante, pCh8F4, se demuestra en la FIG . 1 1 .

Generación de genes humanizado VH y VL de 8F4. El diseño de las secuencias de aminoácidos humanizados VH y VL de 8F4 se realizó como sigue. Primero, un modelo molecular de VH de 8F4 tridimensional se construyó al usar el algoritmo propietario de JN Biosciences. Después, los residuos de aminoácidos estructurales importantes para la formación de la estructura de CDR se identificaron al usar el modelo molecular. Paralelamente, se seleccionaron secuencias de aminoácidos VH y VL humanas derivadas de ADNc con alta homología a VH y VL de 8F4, respectivamente. Finalmente, las secuencias de CDR junto con residuos de aminoácidos estructurales importantes para mantener la estructura de CDR se injertaron de VH y VL de 8F4 en la correspondencia de las secuencias de marco humanas seleccionadas.

Las secuencias VH humanas homologas a los marcos VH de 8F4 se buscaron dentro de la base de datos de GenBank, y la secuencia VH codificada por el ADNc humano U96282 (U96282 VH) (número de acceso de GenBank; Rassenti and Kipps, J . Exp. ed. 185: 1435, 1997) se eligió como un acepto r para humanización . Las secuencias de CDR de VH de 8F4 primero se transfirieron a las posiciones correspondientes del U96282 VH . Ninguna sustitución de aminoácidos humanos de marco se predijo que sea necesaria para mantener la estructura de CDR. La secuencia de aminoácido de la VH humanizada resultante, VH de Hu8F4, junto con secuencias de 8F4 y de U96282 VH, se muestra en la FIG . 12.

Basándose en la búsqueda de homología con las secuencias estructurales VL de 8F4, la región de VK humana que codificada por el ADNc AY043146 (AY043146 VL) (número de acceso de GenBank; Ghiotto et al. , sometido a GenBank el 29 de junio de 2001 ) se eligió como un aceptor para humanización . Las secuencias de CDR de VL de 8F4 primero se transfirieron a las posiciones correspondientes de AY043146 VL. Despues, en la posición estructural 70, donde el análisis del modelo tridimensional de las regiones variables 8F4 indicó el contacto con las CDR, un residuo de aminoácido de VL de 8F4 de ratón se sustituyó para el residuo humano correspondiente. La secuencia de aminoácido de la VL humanizada resultante, VL1 de Hu8F4, se muestra junto con 8F4 y las secuencias AY043146 VL en la FIG. 13.

Mientras que Val en la posición 70 en la VL de 8F4 de ratón se localiza en una posición de marco importante para la formación de la estructura de CDR, el análisis detallado del modelo molecular de las regiones variables de 8F4 sugirió una posibilidad que un residuo de aminoácido en la posición 70 en VL1 de Hu8F4 podría sustituirse con el residuo correspondiente humano, Asp, en AY043146 VL sin perder la afinidad de unión al antígeno. Para reducir además la inmunogenicidad potencial del anticuerpo 8F4 humanizado, una segunda VL humanizada (VL2 de Hu8F4) se diseñó, en la cual Val en la posición 70 en VL1 de H u8F4 se sustituyó con Asp. La secuencia de aminoácido de VL2 de Hu8F4 se muestra en la FIG . 13.

Un gen que codifica la VH de Hu8F4 se diseñó como exón incluyendo un peptido de señal, una señal donante de empalme, y los sitios de la enzima de restricción apropiados para la clonación subsecuente en un vector de expresión mamífero. La señal donante de empalme del exón de la VH de Hu8F4 se derivó de la secuencia de línea germinal J H3 humana. La secuencia del péptido de señal en el exón de VH de Hu8F4 humanizado se derivó de la secuencia de VH de 8F4 de ratón correspondiente.

Cada uno de los genes que codifican la VL1 y VL2 de Hu8F4 se diseñó como exón que incluye un péptido de señal, una señal donante de empalme, y los sitios de la enzima de restricción apropiados para la clonación subsecuente en un vector de expresión mamífero. La señal donante de empalme de los exones de VL1 y VL2 de Hu8F4 se derivó de la secuencia de línea germinal JK4 humana. La secuencia del peptido de señal en los exones de VL1 y VL2 de Hu8F4 humanizados se derivó de la secuencia de VL de 8F4 de ratón correspondiente.

Los genes VH , VL1 y VL2 de Hu8F4, se construyeron por GenScript USA (Piscataway, NJ) bajo un término de confidencialidad no descrito. Después de la digestión con Spel e Hindlll (para VH) o Nhel y EcoRI (para VL), los genes de VH , VL1 y VL2 de Hu8F4 se subclonaron en sitios correspondientes en un vector de expresión mamífero para la producción en la forma lgGI/k humana. El vector de expresión resultante, pHu8F4-1 , expresa el anticuerpo lgGI/k de 8F4 humanizado que contiene VH y VL1 de Hu8F4 (Hu8F4-1 ). Asimismo, pHu8F4-2 expresa el anticuerpo lgGI/k de 8F4 humanizado que contiene la VH y VL2 de Hu8F4 (Hu8F4-2). La estructura esquemática de pHu8F4-1 y pHu8F4-2 se muestra en la FIG. 1 1 . Las secuencias de nucleótido de los genes VH , VL1 y VL2 de Hu8F4 junto con secuencias de aminoácidos deducidas se muestran como las SEC I D NOS: 20/21 , 22/23 y 24/25, respectivamente.

Los genes VH y VL2 de Hu8F4 también se clonaron en otro vector de expresión mamífero para la producción de una forma lgGI/k humana variante llamada lgG 1 -AA. La forma IgGI-AA lleva dos sustituciones del aminoácido en la cadena pesada g-1 de Leu a Ala en la posición 234 y Leu a Ala en la posición 235 (numeración de Eu; Kabat et al. , 1991 ), dando por resultado una unión seriamente reducida a los receptores Fcy (Patente de Estados Unidos 6,491 ,916). La estructura esquemática del plásmido resultante, pHu8F4-2-AA, se muestra en la FIG. 1 1 .

Generación de transfectantes NSO estables para producir anticuerpos de lgGI/k de 8F4 quiméricos y humanizados. Para obtener las líneas celulares estables que producen los anticuerpos de lgGI/k Ch8F4, Hu8F4-1 , Hu8F4-2 y Hu8F4-2-AA, los vectores de expresión pCh8F4, pHu8F4-1 , pH u8F4-2 y pHu8F4-2-AA, respectivamente, se introducen en el cromosoma de una línea celular de ratón NSO (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Las células NSO se hacer crecer en medio DME que contiene 10% de FBS a 37°C en una incubadora de CO2 al 7.5% . La transfección estable en NSO se realizó mediante electroporación como se describe en Bebbington et al. (Bio/Technology 10: 169-175, 1992) . Antes de la transfección, cada vector de expresión se linearizó al usar Fspl. Aproximadamente 107 células se transfectaron con 20 pg del plásmido linearizado, se suspendieron en el medio DME que contiene 10% de FBS, y se aplicaron sobre la placa en varias placas de 96 pozos. Después de 48 horas, se aplicaron los medios de selección (medio DME que contiene 10% de FBS, suplemento de medios HT (Sigma, St. Louis, MO), 0.25 mg/ml de xantina y 1 mg/ml de ácido micofenólico). Aproximadamente 10 días despues de la iniciación de la selección , los sobrenadantes de cultivo se ensayaron para la producción del anticuerpo.

La expresión de los anticuerpos lgGI/k de 8F4 quiméricos y humanizados se midió mediante ELISA en sándwich. En experimentos comunes, una placa de ELISA se cubrió durante la noche a 4°C con 100 mI/pozo de anticuerpo policlonal específico de cadena Fcy de IgG antihumano de cabra diluido 1 /2,000 (Sigma) en PBS, se lavó con Wash Amortiguador (PBS que contiene 0.05% de Tween 20) , y se bloqueó durante 0.5 horas a temperatura ambiente con 300 mI/rozo de Amortiguador de Bloque (PBS que contiene 2% Leche Descremada y 0.05% de Tween 20). Después de lavarse con Amortiguador de Lavado, 100 mI/rozo de muestras diluidas apropiadamente en Amortiguador de ELISA (PBS que contiene 1 % de leche descremada y 0.025% de Tween 20) se aplicaron a la placa de ELISA. Un anticuerpo de lgGI/k humanizado apropiado se usó como estándar. Después de incubar la placa de ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente y de lavarse con Amortiguador de Lavado, los anticuerpos unidos se detectaron al usar 100 mI/rozo de anticuerpo policlonal de cadena kappa antihumana de cabra conjugado con HRP diluido 1 /2,000 (SouthernBiotech). Después de incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente y lavarse con Amortiguador de Lavado, el desarrollo de color se realizó agregando 100 mI/rozo de sustrato de ABTS (bioWORLD, Dublín, OH). El desarrollo de color se detuvo agregando 100 mI/rozo de ácido oxálico al 2% . La absorbencia se lcyó a 405 nm. Los transfectantes estables de NSO produjeron un alto nivel de anticuerpos Ch8F4, H u8F4-1 , H u8F4-2 y Hu8F4-2-AA (NS0-Ch8F4 1 -G8, NS0-Hu8F4-1 1 -D2, 5 NS0-Hu8F4-2 1 -F5 y NS0-Hu8F4-2-AA 1 D3, respectivamente) se adaptaron al crecimiento en medios libres de suero al usar el Hibridoma-SFM (Invitrogen). Probando con el Set de detección de Micoplasma de PCR (Takara Bio USA, Madison , Wl) indicó que NS0-Ch8F4 1 -G8, NS0-Hu8F4-1 1 -D2 , NS0-Hu8F4-2 1 -F5 y NS0-ío Hu8F4-2-AA 1 D3, fueron negativos para la presencia de micoplasma.

La autenticidad de cadenas pesadas y ligeras producidas en NS0-Ch8F4 1 -G8, NS0-Hu8F4-1 1 -D2, NS0-Hu8F4-2 1 -F5 y NS0- Hu8F4-2-AA 1 D3 se confirmó mediante el secuenciado del ADNc. i5 El ARN total se extrajo a partir de celulas al usar el reactivo de TRIzol (Invitrogen) y el ADNc imprimado con oligo dT se sintetizó al usar el Sistema de Síntesis de potencia de Primera Hebra Superscript I I I para RT-PCR (Invitrogen) siguiendo los protocolos del proveedor. La región de codificación de cadena pesada y-1 20 se amplificó por PCR al usar CMV2 y JNT098 como las cebadores (FIG. 1 1 ) y polimerasa de ADN Phusion . Los fragmentos de PCR se purificaron en gel y se sometieron a la secuencia con CMV2, JNT082, JNT097 y JNT098 como cebadores mostrados como las SEC ID NOS: 26 y 28-30. Similarmente, la región de codificación 25 de cadena ligera k se amplificó al usar CMV2 y JNT026 (SEC ID NOS: 26 y 27). Los fragmentos del ADN purificados en gel se sometieron a secuenciado con CMV2 y J NT026 como cebadores. La secuencia de nucleótido obtenida de la región de codificación para cada una de la cadena pesada Ch8F4, cadena ligera Ch8F4, cadena pesada Hu8F4-1 , cadena ligera Hu8F4-1 , cadena pesada Hu8F4-2, cadena ligera Hu8F4-2, cadena pesada Hu8F4-2-AA, y cadena ligera Hu8F4-2-AA se igualó perfectamente con la secuencia correspondiente en el vector pCh8F4, pHu8F4-1 , pHu8F4-2 o pHu8F4-2-AA (SEC I D NOS: 31 /32, 33/34, 35/36, 37/38, 39/40 y 41 /42).

Purificación de anticuerpos 8F4-4, Ch8F4, Hu8F4-1 , Hu8F4-2 y Hu8F4-2-AA. El hibridoma 8F4-4 (proporcionado por el Dr. Molldrem) se cultivó en los medios de RPMI (Hyclone) que contiene 10% de FBS, y se adaptó a crecimiento en el Hibridoma-SFM. Las celulas 8F4-4, NS0-Ch8F4 1 -G8, NS0-Hu8F4-1 1 -D2, NS0-Hu8F4-2 1 -F5 y NS0-Hu8F4-2-AA 1 D3 se hicieron crecer en el Hibridoma-SFM en una botella de centrifugación a la densidad de aproximadamente 106/ml, se alimentó con 1 / 10th volumen de 60 mg/ml de Hidrolizado de Soya Ultrafiltrado (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) se disolvió en los medios de SFM4MAb (HyClone), y se hizo crecer además hasta que la viabilidad celular se convirtió en menos del 50% . Después de la centrifugación y la filtración, el sobrenadante de cultivo se cargó sobre una columna de Sefarosa de Proteína-A (HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se lavó la columna con PBS antes de que el anticuerpo se eluyera con glicina-HCI 0.1 M (pH 3.0). Despues de la neutralización con Tris-HCI 1 M (pH 8), el amortiguador del anticuerpo eluido se cambió a PBS mediante diálisis. La concentración del anticuerpo se determinó midiendo la absorbencia a 280 nm (1 mg/ml = 1 .4 OD). La purificación y el rendimiento de cada 8F4-4, Ch8F4, Hu8F4-1 , Hu8F4-2 y Hu8F4-2-AA se resume en la Tabla 5.

Tabla 5 Varios lotes de purificación y rendimientos de 8F4-4, Ch8F4, Hu8F4-1 , Hu8F4-2 y Hu8F4-2-AA. 8F4-4, Ch8F4, Hu8F4-1 , Hu8F4-2 y Hu8F4-2-AA purificados se caracterizaron por SDS-PAGE de acuerdo con los procedimientos estándar. El análisis bajo condiciones de reducción indicó que cada uno de los anticuerpos está comprendido de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa (FIG. 14). La pureza de cada anticuerpo parece ser mayor del 95%.

Caracterización de anticuerpos Ch8F4 y Hu8F4. La unión al antígeno Ch8F4, Hu8F4-1 , Hu8F4-2 y Hu8F4-2-AA se examinó mediante ELISA al usar el complejo del peptido PR1 (VLQELNVTV (SEC ID NO:45)) con HLA-A2 (PR1 /HLA-A2) . Una placa de ELISA primero se recubrió con 100 mI/rozo de 5 mg/ml de estreptavidina (Jackson ImmunoResearch , West Grove, PA) en PBS. Después de lavar los pozos con Amortiguador de Lavado (PBS que contiene 0.05% de Tween 20) y bloquear con Amortiguador de Bloqueo, se agregaron 50 mI/rozo de 2 pg/ml de PR1 /HLA-A2 biotinilado, que se había proporcionado por el Dr. Molldrem. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se lavó la placa de ELISA con Amortiguador de Lavado. Se agregaron los anticuerpos Ch8F4, Hu8F4-1 , Flu8F4-2 y Hu8F4-2-AA, iniciando a 1 pg/ml y diluciones 3 veces en serie en Amortiguador de ELISA, para unir a PR1 /HLA-A2. Después de incubar la placa de ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavó con Amortiguador de Lavado, se detectaron los anticuerpos unidos al usar 100 mI/rozo de anticuerpo policlonal de cadena kappa anti-humana de cabra conjugado con HRP diluido 1 /2,000. Después de incubar durante 30 min a temperatura ambiente y lavarse con Amortiguador de Lavado, se realizó el desarrollo de color agregando 100 mI/rozo de sustrato de ABTS. El desarrollo de color se detuvo agregando 100 mI/rozo de ácido oxálico al 2%. Se lcyó la absorbencia a 405 nm. Los datos se muestran en la FIG . 15. Se calcularon los valores de CE5o al usar GraphPad Prism (Software GraphPad , San Diego, CA) fue 0.054 pg/rnl para Ch8F4, 0.050 mg/ml para Hu8F4-1 , 0.07 pg/ml para Hu8F4-2, y 0.07 pg/ml para Hu8F4-2-AA. Este resultado indica que Hu8F4-1 , Hu8F4-2 y Hu8F4-2-AA todos conservan la afinidad de unión al antígeno del anticuerpo 8F4 de ratón .

Acción del Anticuerpo Contra Celulas Objetivo. Para determinar si la unión de 8F4 a lisis celular activa AML, se realizó la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) y los ensayos de citotoxicidad dependiente de complementos (CDC, por sus siglas en inglés). La lisis mediada por CDC de H LA-A2+ AML por 8F4, pero no AML negativo HLA-A2 o PBMC control de donante sano HLA-A2 + , se muestran para ser el anticuerpo dependiente de dosis (FIG. 4). Las células AML del material de paciente que se muestra para ser sensible a la lisis mediada por CDC de 8F4 se incubaron en presencia o ausencia de 8F4 o control de isotipo y después se transfirieron a ratones NOD/SCID transgénicos de H LA-A2 inmunodeficientes irradiados (200 cGy). A dos semanas los animales se sacrificaron y los esplenocitos y la médula se analizaron mediante FACS. En la autopsia, AM L se identificó solamente en el animal tratado con control de isotipo lgG2a pero no en el animal tratado con 8F4 (FIG . 6). No hubo toxicidad evidente en los ratones que recibieron 8F4 solamente comparados con los ratones tratados con isotipo. En total, estos datos soportan la conclusión que el anticuerpo monoclonal 8F4: (1 ) unido específicamente con alta afinidad al epítopo PR1 /HLA- A*0201 combinado; (2) unido específicamente a, y puede usarse para identificar las moleculas PR1 HLA-A*0201 ocupadas por el péptido en la superficie de células humanas, incluyendo leucemia mieloide; (3) causa lisis específica de HLA-A2+ AML en presencia del complemento; (4) puede prevenir el precambio del injerto de AML en un modelo de ratón inmunodeficiente.

Prevención del Precambio del Injerto Tumoral . La infiltración de AM L en tejidos de ratones experimentales después de la inyección con células AML más 8F4 se midió y se muestra en las FIGS. 8A-B. Las células AML no se detectaron en la médula y la sangre periférica de ningún control de transferencia y los ratones experimentales tratados con 8F4. Los ratones que recibieron células AML se mezclaron con el anticuerpo de control igualado de isotipo (iso) muestra el precambio del injerto de AML1 y AML5 dos o cuatro semanas después de la transferencia de AML. Un panel extendido, incluyendo un marcador específico de célula de ratón (mCD45), 3-6 marcadores humanos (CD45, CD13, CD33, CD34, CD38, HLA-DR), y Color Aguamarina Fijable LIVE/DEAD (Invitrogen) se usó para el análisis citométrico de flujo del precambio del injerto de AML. Todos los diagramas muestran células mCD45 viables. 8F4 Induce Neutropenia Transitoria en NOD/SCID transgénico HLA-A2. NOD/SCI D de Tg H LA-A2, muestra a PR1 endógeno presente, se inyectó con 8F4 o Ab de control . Las células de médula se cosechadas y tiñeron con mAb dirigido a antígenos de ratón. Los granulocitos reducidos fueron evidentes en perfiles de dispersión de medula (FIG. 9A; paneles izquierdos). Los neutrófilos inmaduros GR-1 lo estuvieron presentes, pero los neutrófilos maduros GR-1 h¡ fueron menos numerosos en la médula de los ratones tratados con 8F4 (FIG . 9A; paneles centrales) . Adicionalmente, los monocitos (SSC1 o CD1 lb+; FIG. 9A; puerta derecha inferior de los paneles derechos) se redujeron en los animales tratados con 8F4. La inyección intravenosa de 8F4 indujo la reducción transitoria en números absolutos de granulocitos, macrófagos y monocitos maduros circulantes en ratones NOD/SCI D de Tg HLA-A2 (FIG. 9B). Tres semanas después del tratamiento, todas las poblaciones se mantienen . No hay cambios patológicos significativos evidentes en h ígado, pulmón , bazo, riñón, corazón o cerebros de los ratones NOD/SCID de Tg HLA-A2 7 días después de la inyección de 200 mg (10 mg/kg) de 8F4 (FIG. 9C). 8F4 Induce la Leucopenia Transitoria de Células Hematopoyéticas Humanas Establecidas. Se tomó sangre periférica de ratones para monitorear el precambio del injerto de la sangre de cordón umbilical, y 9-12 semanas después se inyectaron los ratones de transferencia con 8F4. Se sacrificaron posteriormente los ratones y se analizaron la sangre, el bazo y la médula para el precambio del injerto de células humanas (FIG . 10B). Como se puede ver, la inyección de anticuerpo reduce transitoriamente el % del precambio del injerto de las células transferidas (FIG. 10A).

Especificidad, afinidad, y actividad de unión de anticuerpos 8F4 humanizados contra AML humano. Para caracterizar la especificidad de unión de Hu8F4, los inventores condujeron un ensayo basado en FACS para mostrar que Hu8F4 une solamente a celulas T2 pulsadas por PR1 (FIG . 16A), pero no a células T2 pulsadas por pp65. Para caracterizar la afinidad de unión de Hu8F4, los inventores usaron un ELISA que compara la unión de dos formas de los anticuerpos humanizados, Hu8F4-1 (Hu1 ) y Hu8F4-2 (Hu2) con 8F4 de ratón y control de isotipo ( rh I g G 1 ) . Los inventores usaron placas recubiertas con monómero PR1 /HLA-A2 recombinantes para capturar el anticuerpo, y se usaron anticuerpos antihumanos en un ensayo colorimétrico para determinar la fracción de unión por densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés). Como se muestra en la FIG. 16B, Hu 1 y Hu2 mostraron KD de 7.7 y 7.8 nM , respectivamente, que fue similar a 8F4 de ratón (KD=9.9 nM) . Por lo tanto, los dos anticuerpos humanizados tienen especificidad de ligando idéntica y afinidad de unión comparadas al anticuerpo de ratón original. Estos datos establecen la justificación bioquímica para usar los anticuerpos Hu8F4 en experimentos adicionales para determinar el espectro de actividad en los moldes animales preclínicos.

Para dirigir un mecanismo potencial de acción de Hu8F4, los inventores trataron células objetivo T2 pulsadas por PR1 con Hu8F4 o anticuerpo de control de isotipo (lgG 1 ) en presencia del complemento de conejo y determinaron la lisis mediada por complemento al usar un ensayo estándar. Como se muestra en la FIG . 16C, ni Hu8F4 ni Ch8F4 quimerico (Fe humano de lgG 1 y F(ab)2 de ratón de 8F4) citotoxicidad dependiente de complemento mediada (CDC, por sus siglas en inglés). Por lo tanto, a diferencia del 8F4 de ratón (lgG2), Hu8F4 no se Usaron las células objetivo mediante fijación de complemento. Los inventores condujeron además estudios para determinar si Hu8F4 media el ADCC , la apoptosis directa, o la supresión de la mitosis y la proliferación en experimentos en curso.

Después, los inventores usaron Hu8F4 para tratar xenomjertos de AM L humanos primarios establecidos en ratones NSG . Los ratones primero se injertaron con AM L por dos semanas y en seguida se tratados con Hu8F4, Ch8F4, o el isotipo lgG 1 3x/semanas durante 2 semanas con 10 mg/kg de anticuerpo. Se analizaron BM y el quimerismo de sangre periférica después del tratamiento. Como se muestra en la FIG . 17, tres experimentos por separado con 3 diferentes especímenes de AML o se eliminaron o su crecimiento fue inhibido significantemente por Hu8F4 y Ch8F4 comparado al control de isotipo. Por lo tanto, estos datos establecen que Hu8F4 es alto biológicamente activo contra AML humano primario de pacientes con recaída de la enfermedad secuandaria al tratamiento, y que el mecanismo de acción de Hu8F4 es independiente al complemento debido a que los ratones NSG carecen de expresión de proteínas de complemento clave.

Datos seguridad biológica de 8F4 en ratones inmunocompetentes (B6) e inmunodeficientes (NOD/scid) transgenicos HLA-A2. Los inventores han establecido tres modelos de ratón para los estudios preclínicos de Hu8F4: ratones inmunocompetentes B6 transgénicos HLA-A2 , ratones NOD/scid transgénicos HLA-A2 , y ratones NSG (que carece de cadena g común de IL-2). Para determinar la toxicidad potencial, los inventores primero mostraron que PR1 está expresado en H LA-A2 en 5 y 6% de células madre hematopoyéticas y granulocitos, respectivamente, de los animales transgénicos HLA-A2. Después, los inventores mostraron que una simple administración IV de 8F4 de alta dosis (10 mg/kg) induce citopenia temporal o completamente reversible en ambos de los ratones transgénicos HLA-A2 (FIGS. 18-19). Los ratones NSG se han injertado con sangre de cordón umbilical humana seleccionada de CD34 para establecer el quimerismo humano estable a largo plazo, que será tratado con las simples y múltiples de Hu8F4 para determinar los efectos del mAb contra células madre hematopoyéticas humanas PR1 /H LA-A2 + .

H8F4, un mAb anti-PRI/HLA-A2, retrasa el crecimiento tumoral de xenomjertos de cáncer de mama triple negativo y prolonga la supervivencia. Además del trabajo mencionado antes en leucemias, los inventores han mostrado que el péptido 9-mer de PR1 , derivado de la elastasa neutrófila de serina-proteasas restringida hematopoyetica (NE, por sus siglas en inglés) y proteinasa 3 (P3), puede también presentarse transversal en HLA-A2 en muchos tumores no-hematopoyéticos que no expresen P3 endógeno o NE, incluyendo melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y cáncer de mama (Alatrash et al. , 2012). La línea celular de cáncer de mama triple negativa MB-MDA-231 (referida como 231 células) no expresa P3 y NE pero no expresa HLA-A2. Sin embargo, estas células toman P3 y NE soluble y PR1 presente transversal, que posteriormente hace las 231 células susceptibles a la lisis mediada por 8F4. Importantemente, PR1 /HLA-A2 se expresa en células de cáncer de mama de biopsias de pacientes (Alatrash et al. , 2012), incluyendo pacientes con cáncer de mama triple negativo. Por lo tanto, PR1 /H LA-A2 podría ser un antígeno objetivo en cáncer de mama y los inventores razonaron que 8F4 podría tener actividad biológica contra cáncer de mama HLA-A2 + .

Para probar esta hipótesis, los inventores estudiaron los efectos de h8F4 en (a) un tumor primario y (b) un modelo de xenomjerto de tumor metastático en ratones NSG . En el modelo de tumor primario, 231 células TNBC se inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NSG , seguido por inyección de un una dosis simple de h8F4, el anticuerpo de control de isotipo, o PBS. Las 231 células se transfectaron con el gen ffluc de modo que el crecimiento tumoral podría monitorearse a traves del tiempo con imagenología de bioluminiscencia (BLI , por sus siglas en inglés). Las manchas de H&E de biopsias de sitio de tumor 1 -2 días después de la implantación mostraron infiltración tumoral por neutrófilos y macrófagos, que son células que expresan naturalmente P3 y NE (FIG. 20A). Como se muestra en la FIG. 20B, el crecimiento tumoral se retrasó en los ratones que recibieron h8F4 comparado con ratones que recibieron ya sea control de isotipo o PBS. Además, h8F4 prolongó la supervivencia comparada con ratones de control (p < 0.01 ).

En el segundo modelo, el gen ffluc modificó 231 células (2 x 105) se inyectó en la vena de la cola de los ratones NSG y el día 7 los ratones recibieron 10 mg/kg de h8F4 o anticuerpo de control de isotipo 3x/semanas. En ratones NSG no tratados, 231 células inyectadas IV rápidamente se matastatizaron a los pulmones (confirmados con BLI) y posteriormente a otros tejidos, incluyendo el bazo, el tracto G l , y el hígado. Como se muestra en la FIG . 20C, h8F4 retrasó significantemente el crecimiento tumoral metastático de 231 células y aumentó significantemente la supervivencia comparada con los ratones con isotipo (p = 0.0006). Este resultado sugieren que P3 y NE de neutrófilos y de macrófagos asociados a tumores son tomados por 231 células in vivo y PR1 están presentados transversal en H LA-A2, que causa el crecimiento de células TNBC a ser inhibidas por el tratamiento con h8F4. Por lo tanto, h8F4 es biológicamente activo contra TNBC y nuestros resultados sugieren fuertemente que mAb de h8F4 tiene potencial como un mAb terapeutico para tratar tumores H LA-A2+ no hematopoyéticos incluyendo cáncer de mama.

EJEMPLO 3: MÉTODOS Tejidos, células, y cultivo celular de pacientes. Los bloques de tejido de cáncer de mama congelados de pacientes se adquirieron de Origene. Las muestras donantes de pacientes y sanas se recolectaron después de que el consentimiento informado fuera obtenido para participar en un estudio aprobado por el comité examinador institucional en MD Anderson Cáncer Center (Houston, TX). Se obtuvieron líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 , MCF-7, MDAMB-453, y T47D, y las líneas celulares SW-620 (adenocarcinoma colorrectal), OVCAR-3 (adenocarcinoma ovárico) , MIA PaCa-2 (carcinoma pancreático), Jurkat (leucemia de células T aguda), T2 (hibridoma de células B/células T), HL-60 (leucemia promielocítica aguda), y U-937 (leucemia histiocítica) se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Se proporcionó la línea celular MCF-H ER-18 por M.-C . Hung (MD Anderson Cáncer Center). Se proporcionaron líneas celulares de melanoma Mel 526, Mel 624, MT 2019, y MT 2333 por L. Radvanyi (M D Anderson Cáncer Center). Las líneas celulares se autenticaron mediante la huella dactilar genética de ADN en el MD Anderson Cáncer Center dentro de los 6 meses de uso en experimentos.

Se hicieron crecer células cancerosas de mama en DM EM con 2.5 mM de 1 -glutamina (HyClone) complementadas con 10% de FBS (Gemini Bio-Products) y 100 U/ml de penicilina/100 mg/ml de estreptomicina (Cellgro) . Se agregó G418 (Lonza) (0.5 mg/ml) a los cultivos celulares MCF-7-HER18 como agente selectivo. Se usó RPMI 1640 con 25 mM de HEPES más 1 -glutamina (HyClone) en lugar de DM EM para los cultivos de línea celular de leucemia. Se cultivaron todas las líneas celulares en CO2 al 5% a 37°C. Los PBMC de donante sano y paciente y neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) se enriquecieron al usar centrifugación de gradiente Histopaque 1077 y 1 1 19 estándar (Sigma-Aldrích), respectivamente.

RT-PCR. Se extrajo el ARNm de líneas celulares y de muestras de microdisección por captura láser (LCM , por sus siglas en inglés) al usar el kit RNA Stat 60 (TelTest). Se realizó la síntesis del ADNc al usar el kit de Gene Amp RNA (PerkinElmer). Se usaron los siguientes cebadores: P3, cebador delantero, 59-GACCCCACCATGGCTCAC-39 [SEC I D NO : 52] y cebador inverso, 59-ATGGGAAGGACAGACAGGAG-39 [SEC ID NO: 53]; mamaglobina-1 , cebador delantero, 59- AGCACTGCTACGCAGGCTCT-39 [SEC I D NO: 54] y cebador inverso, 59-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-39 [SEC ID NO: 55]; actinia, cebador delantero, 59-CCAGAGCAAGAGAGCTATCC-39 [SEC ID NO: 56] y cebador inverso, 59- CTGTGGTGGTGAAGCTGTAG-39 [SEC I D NO: 57]; y GAPDH, cebador delantero, 59-TAGACGGGAAGCTCACTGGC-39 [SEC ID NO: 58] y cebador inverso, 59-AGGTCCACCACCCTGTTGCT-39 [SEC I D NO: 59] Despues de la desnaturalización durante 5 min 5 a 95°C , se amplificaron las muestras durante 35 ciclos al usar un iCycler (Bio-Rad). Las muestras se secuenciaron en 1 .5% de gel de agarosa. Las bandas se sometieron a imagenología al usar GelDoc2000 (Bio-Rad) y se analizaron mediante el software QuantityOne (Bio-Rad).

Transferencia de Tipo Western. Se generaron lisados de células enteras (WCL, por sus siglas en inglés) suspendiendo las pelotillas celulares en amortiguador de lisis (10 mM/l de HEPES [pH 7.9], 10 mM/l de KC 1 , 0.1 mM/l de EGTA, 0.1 mM/l de EDTA, y 1 mM/l de DTT) que contiene inhibidores de proteasa y ciclos de congelado-descongelado subsecuentes durante 15 min. Se separaron los WCL mediante electroforesis en 10% de geles de SDS bajo condiciones de reducción, se transfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinilideno, se bloquearon con 5% de leche, y se tiñeron con anti-NE (Santa Cruz Biotechnology), anti-P3 (NeoMarkers) , antitubulina (Sigma-Aldrich), o Abs anti-GAPDH (Sigma-Aldrich) . Se capturó la quimioluminiscencia en la película de Kodak.

Presentación transversal de Ag. Para determinar la absorción de proteína, se pulsaron las células en medio de suero reducido (0.5% de FBS) que contiene 10 mg/ml de P3, NE (ambos de Athens Research & Technology), EndoGrade OVA (Hyglos) , o se irradiaron (7500 cGy) PMNs o PBMCs en una relación de 1 : 1 (cáncer de mama: celula irradiada). Las células después se permeabilizaron (BD Biosciences) y se tiñeron con Alexa-488 o 647, anti-P3 directamente conjugado (clon MCPR3-2; Thermo Scientific) o anti-NE (Santa Cruz Biotechnology) y se analizaron mediante citometría de flujo. Para determinar las células de presentación transversal, se tiñeron las células superficialmente con 8F4 fluorescentemente conjugado, como se describe previamente (Sergeeva et al. , 201 1 ). Se usados los kits Alexa-488 o 647 (Invitrogen) para conjugar directamente Abs anti-P3, anti-NE, y anti-PR1 /HLA-A2 (8F4). Se usó tinción de color aguamarina live/dead (I nvitrogen) para evaluar la viabilidad. Para todos los experimentos de citometría de flujo, se usó dispersión de luz para establecer la compuerta inicial, seguida por tinción de color aguamarina live/dead . Para inhibir la presentación cruzada, se comcubaron las células con el retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés) para la brefeldina A del inhibidor de anterógrado Golgi (Sigma-Aldrich) o la lactacistina del inhibidor de proteasoma (Sigma-Aldrich) (Francois et al. , 2009, Kovacsovics-Bankowski y Rock 1995 y Mukai et al., 2009) .

La imagenología confocal para mostrar la localización intracelular P3 se realizó al usar el microscopio confocal de Leica Microsystems SP2 SE (Leica) con 310/25 aire, 363/1 .4 objetivos de aceite y se analizó al usar el software de Leica LCS (versión 2.61 ). Se usó La protein-2 de membrana asociada a lisosoma conjugada por FITC (LAMP-2; eBioscience) para teñir los lisosomas y los últimos endosomas (Kuronita et al. , 2002) . Se realizó la citometría de flujo al usar el citómetro de flujo de Cytomation CyAn (Dako). Se analizaron los datos al usar el software de Flow Jo (Tree Star).

Inmunohistoquímica. Tejidos de tumor de mama y de melanoma criopreservados (Origene) se fijó la formalina y despues se incrustó en parafina para inmunohistoquímica. Antes del teñido, las secciones de tejido se desparafinaron en xileno, se rehidrataron, y se templaron para actividad de peroxidasa endógena. Se bloquearon las secciones con 10% de suero de caballo normal y después se incubaron con el clon WGM2 anti-P3 mAb primario (1 : 10) (Abeam) o anti-NE (Santa Cruz Biotechnology) durante 30 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos de melanoma se cotiñeron con el factor de transcripción asociado con anti-microftalmia (M ITF) Ab (Thermo Scientific). Los portaobjetos después se lavaron y se incubaron con IgG-biotina Ab anti-ratón secundaria (1 :200) (Vector Laboratories), seguido por la avidina-biotina peroxidasa (1 : 100) (Vector Laboratories). Se usó la 3,39-diaminobencidina de Chromagen (Dako) para visualización de tinción. Todos los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina. Se usó la tinción de PMN del tejido de amígdala normal como un control positivo. Se tiñeron los controles negativos como antes después de la supresión del Abs primario.

Líneas de CTL Específicas del Péptido. Los CTL específicos al PR1 se ampliaron estimulando los PBMC de los donantes HLA-A2 sanos con el peptido PR1 in vitro, como se describe previamente (Molldrem et al. , 2000 and Molldrem et al. , 1999). Brevemente, las células T2 se lavaron en un medio RPM I 1640 libre de suero y se incubaron con el péptido PR1 a 20 mg/ml durante 90 min a 37°C. Se irradiaron las células 12 cargadas con péptido con 7500 cGy, se lavaron, y se cultivaron con PBMC recientemente aislados a una relación 1 : 1 en un medio RPM I 1640 complementado con en 10% de suero AB humano. Se reestimularon los cultivos con células T2 pulsadas con péptido los días 7, 14, y 21 , y, en el día siguiente, se agregaron 20 l U/ml de rl L-2 humano (BioSource I nternational).

Ensayo de citotoxicidad mediada por células. Se usó un ensayo de citotoxicidad estándar para determinar la lisis específica, como se describe previamente (Molldrem et al. , 1996 and Molldrem et al. , 1997). Brevemente, se tiñeron 1000 células objetivo en 10 mi (1 .03 x 105 células/ml) con calceína-AM (Invitrogen) durante 90 min a 37°C, se lavaron tres veces con RPM I 1640, y después se comcubaron con 10 mi de CTL específicos al péptido a relaciones E:T variantes. Después de un período de incubación de 4 h a 37°C en 5% de CO2, se agregaron 5 mi de azul tripano a cada pozo y se midió la fluorescencia al usar un lector de placa CytoFluor I I automatizado (PerSeptive Biosystems) . Se calculó el porcentaje de citotoxicidad específica como sigue: ([fluorescenciaobjet¡vo efectorfluorescenciamed¡o] /[fluorescencia0bjetivo Soiofluorescenciamedio]) x 100.

Ensayo de citotoxicidad mediada por complemento. Para determinar si la presentación cruzada aumenta la susceptibilidad del cáncer de mama a 8F4, realizamos ensayos de citotoxicidad 5 mediada por complemento, como se describe previamente (Sergeeva et al. , 201 1 and Prang et al. , 2005). Se cultivaron celulas MDA-M B-231 en N E (10 mg/ml) o P3 (10 mg/ml) que contienen los medios durante 24 h. Se incubaron células con calceína-AM (Invitrogen), se lavaron tres veces, y se ío resuspendieron en RPM I 1640 libre de suero. Se mezcló un millón de células con dosis aumentadas de 8F4 Ab (0.624, 1 .25, 2.5, 5, y 10 mg/ml) o el isotipo Ab (control negativo) en una concentración final de 10 mg/ml e se incubaron durante 10 min a 37°C. El complemento de conejo estándar (5 mi; Cedarlane 15 Laboratories) entonces se agregó, y se incubaron las células durante 60 min a 37°C . Se usó el sobrenadante del hibridoma BB7.2 (fuente para anti-HLA-A2) y digitonina (Promega) como controles positivos. Se midió la fluorescencia, y se calculó la supresión específica, como se describe antes. 20 Extracción de LCM y de ARN del tejido de tumor de mama. Se realizó LCM para aislar células de cáncer de mama del tejido de biopsia de tumor de mama con un microscopio de captura láser Arcturus PixCell con un láser de diodo de IR (Life Technologies, Applied Biosystems) . Se seccionó el tejido (5 mM 25 de espesor), se colocó en portaobjetos de vidrio no cargados, y se fijó en 75% de etanol y agua con pirocarbonato dietílico. Se usó hematoxilina para teñir los núcleos despues de la hidratación de tejido. Se almacenaron las muestras en xileno después de la deshidratación de alcohol graduada hasta el momento de LCM . Las áreas usadas para microdisección se identificaron al usar la tinción de H&E. Se pulsado el tejido con un rayo láser con energía ajustada entre 30 y 70 mW para mantener un diámetro de 10 mm.

Se capturaron aproximadamente 5000 células de cáncer de mama en las tapas de Arcturus Capsure HS LCM (Life Technologies, Applied Biosystems). Se extrajo el ARN total y se purificó al usar el kit de Aislamiento de ARN Arcturus PicoPure (Life Technologies, Applied Biosystems). Se determinaron la integridad y cantidad de ARN con un Espectrofotómetro Nano Drop ND-1000 (Thermo Scientific). Se usó el kit de Amplificación de ARN Arcturus RiboAmp para amplificar el ARN al usar dos rondas de amplificación basada en T7. Esto dio 2.5 mg de ARN amplificado. Se sintetizó el ADNc a partir de 1 mg de ARN amplificado al usar kit de Síntesis de ADNc de Primera Hebra del Transcriptor de Roche (Roche Applied Science), por instrucciones del fabricante.

Tinción para PR1 -CTLs en pacientes con cáncer de mama.

Se tiñó PBMC de pacientes con el siguiente Abs fluorescente: aloficocianina-H7 CD8 (BD Biosciences), CD3 PE Cy7 (BD Biosciences), anaranjado pacífico CD4 (Invitrogen), PR1 /HLA-A2- dextramer conjugado con PE (Immudex), y el siguiente linaje Abs conjugado con azul pacífico: CD14 (BD Biosciences), CD16 (BD Biosciences), y CD19 (BioLegend). Se usó teñido de color aguamarina live/dead (Invitrogen) para excluir células muertas. Se fijaron las muestras con 4% de paraformaldehido. Se adquirieron los datos en el citómetro de flujo Canto (BD Biosciences) y se analizaron al usar el software Flow Jo (Tree Star). Se determinó la frecuencia PR1 -CTLs como el porcentaje de células vivas que fue el linaje , CD4 , CD3 + , CD8 + , y PR1 -dextramer+.

Imagenología confocal de tejidos de pacientes. Se fijaron secciones de tejido Criopreservado con acetona fría. Se tiñeron tejidos de cáncer de mama con el Ab (Abeam) anti-citoqueratina-7 (CK7) de ratón conjugado con Alexa-647 del marcador de cáncer de mama y Ab de 8F4 conjugado con Alexa-488 (Sergeeva et al. , 201 1 ). Para confirmar que la expresión PR1 /H LA-A2 es por las células de cáncer de mama y no por los leucocitos de infiltración, las secciones de tejido de cáncer de mama consecutivo también se tiñeron con Ab anti-CD45 de ratón conjugado con Alexa-647 (Invitrogen) como un marcador leucocito. Las secciones de tejido de amígdala humano (Origene) se usaron como el control de tinción positivo para CD45. Para el melanoma, se fijaron las secciones de tejido con acetona fría, se permeabilizaron con 0.5% de Tritón X-100 (Sigma-Aldrich) durante 15 min , y se bloquearon con 5% de suero de cabra normal (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Las secciones después se incubaron con anti- M ITF de ratón del marcador de melanoma (Thermo Scientific) durante 1 h, se lavaron con PBS, y despues se incubaron con IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa-488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Los portaobjetos después se lavaron , se bloquearon con 5% de suero de ratón normal (Jackson ImmunoResearch Laboratories), e incubaron con Ab de 8F4 conjugado con Alexa-647. Se agregó el reactivo de ProLong Gold antifade con DAPI (Invitrogen). Se realizó la imagenología confocal al usar el microscopio confocal Leica Microsystems SP2 SE con 310/25 aire, 363/1 .4 objetivos de aceite. Se usó el software Leica LCS (versión 2.61 ) para el análisis de imagen .

EJEMPLO 4: RESULTADOS Tumores sólidos captan NE y P3. Para determinar si la absorción de NE y P3 es un fenómeno ubicuo, los inventores cocultivaron múltiples líneas celulares de tumores sólidos con 10 mg/ml de NE o P3 y después usaron citometría de flujo para evaluar la absorción intracelular. Los inventores mostraron que no todos los tipos de tumor captan NE y P3, y, además, el grado de absorción varía entre diferentes tipos de tumores (FIG. 21 ). Además, la absorción de N E parece nivelarse con el tiempo y es mucho menor que la absorción de P3, indicando diferentes mecanismos de absorción y sugiriendo un proceso mediado con receptor que puede implicarse en la absorción de NE.

P3 está ausente en cáncer de mama. Debido a que los inventores han mostrado previamente que N E está ausente en cáncer de mama y es captado por células de cáncer de mama (Mittendorf et al. , 2012) y a diferencia de la absorción de P3 de la expresión endógena, se analizaron líneas celulares de cáncer de mama y tejidos tumorales primarios para la expresión de P3 a 5 niveles de ARNm y de proteína. PCR muestra que las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 , MCF-7, MCF-7- HER18 (HER18) , y MDAMB-453 todas carecen de ARNm P3 (FIG . 22A). Similarmente, células de cáncer de mama extraídas a partir de tres diferentes tumores de mama (FIG. 22B, Tabla 6) también ío carece de ARNm P3. La inmunotransferencias de WCL a partir de líneas celulares confirmó la ausencia de la proteína P3 en células de cáncer de mama (FIG. 22C). La tinción de inmunohistoquímica del P3 detectado de cáncer de mama primario en tejido de cáncer de mama, pero el P3 se limitó al componente inflamatorio dentro 15 del tumor de mama, y no en células de tumor de mama (FIG . 22D). Estos datos son constantes con reportes anteriores que muestran P3 en cáncer de mama (Desmedt et al. , 2006), aunque nuestros datos sugieren que la fuente de P3 es células inflamatorias dentro del tumor, y no células de cáncer de mama. 20 Tabla 6 - Características patológicas de tejidos de tumor de mama y de melanoma usadas para LCM y microscopía confocal Paciente Histología Estado ER/PR/HER2 Teñido de TNM Estado HLA-A2 Mama 1 IDC ER2-/PR2-/HER22- TIcNXMX Positivo 25 Paciente Histología Estado ER/PR/HER2 Teñido de TNM Estado HLA-A2 Mama 2 IDC ER2-/PR2-/HER2+ T2NlbMX N/D Mama 3 IDC/ILC ER+/HER2+ T2N1bMX Negativo Mama 4 IDC ER2-/HER22- T3N0MX Positivo Melanoma 1 Nodular N/A T3N2M1C Positivo Melanoma 2 N/D N/A T3N2M1b Negativo ER, Receptor de estrógeno; HER2, HER2/neu; I DC, carcinoma ductal invasivo; ILC, carcinoma lobular invasivo; N/D, no determinado; PR, receptor de progesterona; TNM , clasificación de tumor/nodo/metástasis de tumores maligno.

P3 es tomado por celulas de cáncer de mama. Debido a que mostramos que P3 no es expresado endógenamente por células de cáncer de mama, los inventores plantearon que P3 puede captarse por las células de cáncer de mama, como se han mostrado previamente para NE (Mittendorf et al. , 2012). Las líneas celulares MDA-MB-231 , MCF-7, y HER18 positivas a HLA-A2a se cocultivaron con 10 mg de P3 a 1 , 4, y 24 h y después se analizaron al usar citometría de flujo para absorción intracelular de P3 (FIG. 23A). Los inventores detectaron un aumento dependiente del tiempo en la absorción P3 en toldas las tres líneas celulares. También demostraron una absorción dependiente de dosis de P3 que no parece estabilizarse, sugiriendo un proceso mediado por ningún receptor para la absorción de P3 (FIG. 23B). Para caracterizar además la absorción de P3 como se relaciona con la presentación cruzada de AG, que ocurre en distintos compartimientos celulares (Cresswell et al. , 2005), los inventores realizaron la microscopía de láser confocal y mostró que, despues de la absorción , P3 se localiza dentro de lisosomas, como se muestra por P3 coteñido con LAMP-2 (FIG . 23C). La absorción en los compartimientos lisosomales ocurrió en puntos de tiempo tempranos (1 -4 h) y puede ser la etapa inicial en la degradación de Ag mientras que se está procesando para la presentadoras cruzada en las moléculas de clase I de HLA (Basha et al. , 2008).

Debido a que diferentes trayectorias celulares están implicadas en la absorción y el proceso de proteínas solubles y asociadas a células, que pueden determinar si están presentes cruzadas (Burgdorf et al. , 2006), y debido a que los neutrófilos se reportaron en tejidos tumorales incluyendo cáncer de mama (Queen et al., , 2005 and Jensen et al. , , 2009), los inventores evaluaron si había diferencia en la absorción de P3 asociado a células por células de cáncer de mama. Para examinar esto, las células MDA-MB-231 se cocultivaron durante 4 h con P3 soluble (10 mg/ml) o con PM N o PBMC irradiados en una relación 1 : 1 (FIG . 24A; datos no mostrados). Los datos demostraron que las células de cáncer de mama pueden tomar P3 soluble así como P3 asociado a células. De hecho, la absorción de P3 asociado a células parece ser más eficiente comparada con la absorción de la proteína soluble (intensidad de fluorescencia mediana [M FI] = 12,292 contra 1 ,356; p, 0.05), que puede ser debido a la asociación de P3 con otras proteínas que podrían facilitar la absorción .

P3 y NE están presentados cruzados por celulas de cáncer de mama. Debido a que los inventores han mostrado que N E también es captado por el cáncer de mama (Mittendorf et al. , 2012) y debido a que PR1 se deriva de ambos de NE y P3 de proteasas granulares azurófilas de neutrófilos, investigaron si el N E y P3 están presentes cruzados por células de cáncer de mama después de la absorción. Las células HLA-A2 + MDA-MB-231 se cocultivaron con P3 o NE soluble en puntos de tiempo aumentados y se analizaron posteriormente para la expresión PR1 /HLA-A2 al usar 8F4 de Ab anti-PR1 /H LA-A2 de ratón (Sergeeva et al. , 201 1 ). Estos datos muestran que las células de cáncer de mama pueden ser PR1 presente cruzado por NE y de P3. La presentación cruzada PR1 significante se vio principalmente a 24 h (FIG. 24B) con un aumento de 2.5 y 3.0 veces en PR1 /HLA-A2 en la superficie de células de cáncer de mama después del cultivo con NE y P3, respectivamente, comparado con células no pulsadas. No hubo aumento significante en la expresión HLA-A2 en la superficie celular (datos no mostrados).

Además, para investigar los mecanismos intracelulares que están implicados en la presentación cruzada de NE y P3, los inventores estudiaron si el proteasoma y el ER/Golgi están implicados en la presentación cruzada de NE y P3, como se muestra previamente para el otro Ags (Francois et al. , 2009, Kovacsovics-Bankowski et al. , 1995 y Mukai et al. , 2009). Nuestros datos muestran que el ER/Golgi y proteasoma están 5 implicados en la presentadoras cruzada de NE y P3, debido a que la incubación de celulas con brefeldina A, que inhibe ER al transporte anterógrado de Golgi, y con lactacistina, un inhibidor de proteasoma, la expresión PR1/HLA-A2 disminuida por células de cáncer de mama MDA-MB-231 después de cocultivar con NE o ío P3 (FIGS. 24C, 24D). Esto es similar a los resultados previos de de los inventores que demuestran el proteasoma y la participación de ER/Golgi en la presentadoras cruzada de NE y P3 por APCs (Alatrash et al. , 2012).

La presentación cruzada de PR1 hace al cáncer de mama 15 susceptible a terapias dirigidas a PR1 . Debido a que PR1 se ha dirigido eficazmente en leucemia al usar una vacuna del péptido PR1 (Rezvani et al., 2008), PRI-CTLs (Rezvani et al., 2007 y Ma et al., 2010), y Ab anti-PR1 /HLA-A2 (8F4) (Sergeeva et al. , 201 1 ), los inventores investigaron si la expresión PR 1 /H LA-A2 en células 0 de cáncer de mama después de la presentación cruzada haría estas células susceptibles a la supresión por PR1 -CTLs y Ab de 8F4. Se cultivaron células HLA-A2+ MDA-M B-231 en medios que contienen 10 mg/ml de N E o P3 durante 24 h y después se incubaron con PR1 -CTL expandidos del donante sano durante 4 h 5 en un ensayo de citotoxicidad de calceína-AM estándar (Molldrem et al. , 1996; Jiang et al. , 1996) (FIG . 24E). Los datos demuestran que la presentación cruzada de NE y P3 aumentó la susceptibilidad de las células MDA-MB-231 a la supresión por PR1 -CTLs después de que NE o P3 se pulsaron, en comparación con células MDA-M B-231 no pulsadas. Similarmente, al usar Ab de 8F4 en un ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (FIG. 24F) (Sergeeva et al. , 201 1 ), los inventores observaron una supresión dependiente de dosis de las células M DA-MB-231 después de la presentación cruzada de NE o P3 en comparación con células no pulsadas. La supresión mayor se observó en la dosis mayor de Ab de 8F4 (10 mg/ml) .

PR1 /HLA-A2 y PR1 -CTL se detectan en pacientes con cáncer de mama. Debido a que los inventores mostraron que las líneas de célula de cáncer de mama cultivadas y tejidos tumorales carecen de NE y P3 endógeno, y debido a que observaron la evidencia in vitro de la presentación cruzada de NE y P3 por células de cáncer de mama y susceptibilidad subsecuente a terapias dirigidas por PR1 , los inventores investigaron si PR1 podría detectarse en tejidos de pacientes con cáncer de mapa primarios y si los PR1 -CTL podrían detectarse en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama. La microscopía confocal láser de dos tejidos de cáncer de mama positivos a HLA-A2 demostró 8F4 en ambos tejidos tumorales (FIG . 25A). La tinción de 8F4 estuvo ausente en el tejido negativo a HLA-A2 (datos no mostrados). Por otra parte, para verificar que la expresión de PR1 /HLA-A2 sea por las celulas de cáncer de mama y no por infiltración de leucocitos, los inventores tiñeron secciones de tejido del cáncer de mama consecutivo con el marcador de leucocito CD45. Los inventores mostraron la ausencia de tinción en CD45 en las áreas del tejido de cáncer de mama que se cotiñeron con 8F4 y CK7, además de confirmar que la expresión PR1 /H LA-A2 fue para células de cáncer de mama, no para células inflamatorias adyacentes (FIG. 25B).

Para determinar si PR1 -CTL podría detectarse en pacientes con cáncer de mama, usamos tinción de dextramer PR1 /H LA-A2 de 1 1 muestras de sangre periférica de enfermos con cáncer de mama de etapa temprano (FIG. 25C). La frecuencia mediana de PR1 -CTLs en estos pacientes de H LA-A2+ fue 0.05% de células T CD8+ (intervalo, 0.02-0.2%), ligeramente mayor que la frecuencia de PR1 -CTLs en donadores sanos (1 /15,000 a 1 /350,000 células CD8 + ) (Molldrem et al. , 1997). Tomados juntos, estos datos in vivo sugieren que NE y P3 de serina proteasas presentes en el microambiente de tumor pueden captarse y presentarse cruzados por las células de cáncer de mama, que pueden contribuir a una inmunorespuesta adaptativa contra el epítopo PR 1 derivado de NE y P3.

PR1/HLA-A2 y PR1 -CTL en pacientes con melanoma. Debido a que los tejidos de melanoma también se muestran para tener células inflamatorias que pueden ser una fuente para NE y P3 (Jensen et al. , 2012), y debido a que el melanoma se conoce para ser susceptible a inmunoterapia (Dudlcy et al. , 2002 y Schwartzentruber et al. , 201 1 ), los inventores despues investigaron si la presentación cruzada de NE y P3 podría también detectarse en melanoma. Para determinar si PR1 -CTL también es detectado en melanoma , los inventores tiñeron PBMC de pacientes con melanoma con dextramer PR1 /HLA-A2 y detectaron PR 1 -CTLs en todos los siete pacientes a una frecuencia mediana de 0.014% de células T CD8+ (intervalo, 0.0053-0.019%) (FIG. 25C), similar a la que se vio en sangre de donantes normales. Los inventores también detectaron la expresión PR1 /HLA-A2 en un tejido de melanoma HLA-A2 + (melanoma 1 ), pero no H LA-A22 (melanoma 2) (FIG. 25D).

Presentación cruzada de NE y P3 mediante susceptibilidad aumentada de melanoma a PR1 -CTL. Para determinar si el melanoma expresa NE y P3, los inventores tiñeron el tejido de melanoma obtenido de pacientes para N E y P3 y mostraron la ausencia de N E y de P3 (FIGS. 26A, 26B). Los inventores también analizaron la expresión de N E y P3 en cuatro líneas celulares de melanoma, MEL526, MEL624, NT2019, y NT2333 . El análisis de transferencia de tipo Western muestra la ausencia de NE y P3 en las líneas celulares de melanoma (FIGS. 26C). Similar al cáncer de mama, los inventores demuestran la absorción y la presentación cruzada de NE y P3 por la línea celular HLA-A2+ Mel 526 (FIGS. 26D, 26E). Debido a que Ab de 8F4 unido a la molécula HLA-A2 (Sergeeva et al. , 201 1 y Porgador et al. , 1997), que compone una porción significante del epítopo PR1 /H LA-A2 conformacional, las celulas Mel 526 muestra la tinción con 8F4 antes del co cultivo con NE o P3 (datos no mostrados). Sin embargo, la tinción con 8F4 aumenta después del cocultivo con NE o P3, sin un aumento en la tinción superficial de H LA-A2 (datos no mostrados), indicando un aumento en la expresión de PR1 /HLA-A2 en la superficie celular. Además, la presentación cruzada de NE y P3 aumentó la susceptibilidad de la línea celular de HLA-A2 + Mel 526 para la supresión por PR1 -CTL, con la supresión más alta conocida en la relación E:T más alta (FIG . 26F).

Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados en la presente pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida a claridad de la presente descripción. Mientras que las composiciones y los métodos de esta invención se han descrito en términos de las modalidades preferidas, será evidente por los expertos en la téenica que las variaciones se pueden aplicar a las composiciones y/o a los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en la presente sin apartarse del concepto, el espíritu y alcance de la invención . Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están química y fisiológicamente relacionados pueden sustituirse para los agentes descritos en la presente mientras que se lograrían los mismos o similares resultados.

Todos tales sustituyentes y modificaciones similares evidentes a los expertos en la teenica se consideran estar dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

VIII. REFERENCIAS Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles suplementarios a los indicados en la presente, se ncorporan específicamente en la presente por referencia.

Patente de Estados Unidos 4, 196,265 Patente de Estados Unidos 4,472,509 Patente de Estados Unidos 4,554,101 Patente de Estados Unidos 4,680,338 Patente de Estados Unidos 4,684,61 1 Patente de Estados Unidos 4,797,368 Patente de Estados Unidos 4,843,092 Patente de Estados Unidos 4,879,236 Patente de Estados Unidos 4,938,948 Patente de Estados Unidos 4,952,500 Patente de Estados Unidos 5,021 ,236 Patente de Estados Unidos 5,302,523 Patente de Estados Unidos 5,322,783 Patente de Estados Unidos 5,384,253 Patente de Estados Unidos 5,399,363 Patente de Estados Unidos 5,443,826 Patente de Estados Unidos 5,464,765 Patente de Estados Unidos 5,466,468 Patente de Estados Unidos 5,538,877 Patente de Estados Unidos 5.538.880 Patente de Estados Unidos 5,543, 158 Patente de Estados Unidos 5,550,318 Patente de Estados Unidos 5,563,055 Patente de Estados Unidos 5,563,250 Patente de Estados Unidos 5,580,859 Patente de Estados Unidos 5,589,466 Patente de Estados Unidos 5,599,795 Patente de Estados Unidos 5,610,042 Patente de Estados Unidos 5,641 ,515 Patente de Estados Unidos 5,656,610 Patente de Estados Unidos 5,702,932 Patente de Estados Unidos 5,736,524 Patente de Estados Unidos 5,739, 169 Patente de Estados Unidos 5,780,448 Patente de Estados Unidos 5,789,215 Patente de Estados Unidos 5,801 ,005 Patente de Estados Unidos 5,824,31 1 Patente de Estados Unidos 5.830.880 Patente de Estados Unidos 5,846,233 Patente de Estados Unidos 5,846,945 Patente de Estados Unidos 5,856,456 Patente de Estados Unidos 5,871 ,986 Patente de Estados Unidos 5,880,270 Patente de Estados Unidos 5,945, 100 Patente de Estados Unidos 5,981 ,274 Patente de Estados Unidos 5,994, 136 Patente de Estados Unidos 5,994,624 Patente de Estados Unidos 6,013,516 Alatrash et al., J. Immunol, 35: 309-320, 2012 Antm, Blood, 82:2273-2277 , 1993.

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Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un anticuerpo aislado y purificado que une a VLQELNVTV (SEC ID NO:45) cuando se une por un receptor H LA- 5 A2, dicho anticuerpo que tiene CDR de cadena pesada incluyendo las SEC ID NOS: 3, 4 y 5, y CDR de cadena ligera incluyendo las SEC ID NOS: 8, 9 y 10. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo es un anticuerpo de ratón. ío 3. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple o anticuerpo biespecífico. 4. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo está fusionado a un peptido no anticuerpo o segmento 15 de polipéptido. 5. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo se une a un reactivo de diagnosis. 6. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde dicho reactivo de diagnosis es un fluoróforo, un cromóforo, un tinte, un 20 radioisótopo, una molécula quimioluminíscente, un ion paramagnético, o un reactivo de captura de espín . 7. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo se une a un reactivo terapéutico. 8. El anticuerpo de la reivindicación 7, donde el reactivo 25 terapéutico es una citocina, un quimioterapéutico, un radioterapeutico, una hormona, un fragmento de Fe de anticuerpo, un agonista de TLR, una molécula que contiene CpG, o una molécula co-estimulante inmune. 9. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde dicho 5 anticuerpo es un anticuerpo humanizado. 10. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde dicho anticuerpo humanizado tiene secuencias de cadena ligera/cadena pesada de las SEC I D NOS: 38 y 36 o SEC I D NOS: 40 y 36 e SEC ID NOS: 40 y 42. ío 1 1 . Un ácido nucleico que codifica las CDR de cadena ligera codificadas por las SEC I D NOS: 8, 9 y 10. 12. El ácido nucleico de la reivindicación 1 1 , donde el ácido nucleico codifica la SEC I D NO: 7 o SEC ID NO: 12. 13 El ácido nucleico de la reivindicación 1 1 , donde el 15 ácido nucleico codifica la SEC I D NO: 23 o SEC I D NO: 25. 14. El ácido nucleico de la reivindicación 1 1 , adicionalmente comprende una secuencia promotora colocada en 5' al ácido nucleico que codificaba las CDR de cadena ligera. 15. El ácido nucleico de la reivindicación 14 , donde dicho 20 promotor es activo en células eucarióticas. 16. El ácido nucleico de la reivindicación 14, donde dicho promotor es activo en células procarióticas. 17. El ácido nucleico de la reivindicación 1 1 , donde dicho ácido nucleico está localizado en un vector replicable. 25 18. El ácido nucleico de la reivindicación 17, donde dicho vector replicable es un vector no-viral. 19. El ácido nucleico de la reivindicación 17, donde dicho vector replicable es un vector viral. 20. El ácido nucleico de la reivindicación 1 1 , 5 adicionalmente comprende segmentos que codifican enlazadores, donde dichos segmentos que codifican enlazadores localizados entre dichos segmentos que codifican la CDR. 21 . El ácido nucleico de la reivindicación 20, donde uno o más dichos segmentos que codifican enlazadores codifican un ío motivo de helice-giro-hélice. 22. Un anticuerpo artificial que comprende un segmento que codifica la cadena pesada que comprende las CDR que comprenden las secuencias de las SEC I D NOS: 3, 4 y 5; y que comprenden un segmento que codifica la cadena ligera que 15 comprende las CDR que comprenden las secuencias de las SEC ID NOS: 8, 9 y 10. 23. El anticuerpo artificial de la reivindicación 22, donde dichas CDR se unen mediante enlazadores sintéticos. 24. El anticuerpo artificial de la reivindicación 22, donde 20 dicha cadena pesada se fusiona a un péptido de no-anticuerpo o segmento de polipéptido. 25. El anticuerpo artificial de la reivindicación 22, donde dicho anticuerpo se une a un reactivo de diagnosis. 26. El anticuerpo artificial de la reivindicación 25, donde 5 dicho reactivo de diagnosis es un fluoróforo, un cromóforo, un tinte, un radioisótopo, una molecula quimioluminiscente, un ion paramagnético, o un reactivo interceptador de órbita. 27. El anticuerpo artificial de la reivindicación 22 , donde dicho anticuerpo se une a un reactivo terapéutico. 5 28. El anticuerpo artificial de la reivindicación 27, donde el reactivo terapéutico es una citocina, una toxina, un quimioterapéutico, un radioterapéutico, una hormona, un fragmento de Fe de anticuerpo, elastasa de neutrófilo, proteinasa 3, un agonista de TLR, una molécula que contiene CpG , o una ío molécula co-estimulante inmune. 29. El anticuerpo artificial de la reivindicación 22, donde la cadena ligera comprende la SEC I D NO: 7, SEC ID NO: 12 , SEO ID NO: 23 o SEC I D NO: 25, y/o la cadena pesada comprende la SEC ID NO : 36 o SEC I D NO: 42. 15 30. Un método para hacer un anticuerpo que comprende (a) introducir en una célula hospedadora (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende las CDR mostradas en las SEC I D NOS: 3, 4 y 5, y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera que 20 comprende las CDR demostradas en las SEC I D NOS: 8, 9 y 10; y (b) cultivar dicha célula hospedadora bajo condiciones que soporten la expresión de dichas cadenas ligeras y pesadas. 31 . El método de la reivindicación 30, adicionalmente comprende aislar dicho anticuerpo. 25 32. El método de la reivindicación 31 , adicionalmente comprende la etapa de unir dicho anticuerpo a un agente de diagnosis o terapeutico. 33. Un método para detectar células anormales en una muestra sospechosa de contener células anormales que comprenden poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo de la reivindicación 1 o un anticuerpo artificial de la reivindicación 22. 34. El método de la reivindicación 33, donde dicho anticuerpo o anticuerpo artificial se conjuga a un agente de diagnosis. 35. El método de la reivindicación 34, donde dicho agente de diagnosis es un fluoróforo, un cromóforo, un tinte, un radioisótopo, una molécula quimioluminiscente, un ion paramagnético, o un reactivo interceptador de órbita. 36. El método de la reivindicación 33, donde dicho anticuerpo o anticuerpo artificial se detecta al usar un agente de unión secundario. 37. El método de la reivindicación 36, donde dicho agente de unión secundario es un anticuerpo anti-receptor de Fe. 38 El método de la reivindicación 33, donde dicha muestra es (a) un tejido tumoral del tejido de cabeza y de cuello, de cerebro, de esófago, de mama, de pulmón, de hígado, de bazo, de estómago, de intestino delgado, de intestino grueso, de recto, de ovario, de útero, de cerviz, de próstata, de testículo o de piel, o (b) un fluido como sangre, linfa, orina, aspirado medular o aspirado de pezón. 39. El metodo de la reivindicación 33, donde dicha muestra es un lecho de tumor resecado. 40. El método de la reivindicación 33, adicionalmente 5 comprende tomar una decisión de tratamiento basada en la presencia, ausencia o grado de detección. 41 . El método de la reivindicación 40, donde la decisión de tratamiento comprende tratar dicho sujeto con una vacuna de péptido basado en PR1 . ío 42. El método de la reivindicación 33, donde se detectan células cancerosas primarias, células cancerosas metastáticas o células displásicas mieloides. 43. Un método para tratar un sujeto con cáncer que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo de la 15 reivindicación 1 o un anticuerpo artificial de la reivindicación 22. 44. El método de la reivindicación 43, donde dicho anticuerpo o anticuerpo artificial se conjuga a un agente terapéutico. 45. El método de la reivindicación 43, donde dicho cáncer 20 es un tumor sólido. 46. El método de la reivindicación 45, donde dicho tumor sólido es un tumor de cabeza y de cuello, un tumor cerebral, un tumor de esófago, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de hígado, un tumor de bazo, y tumor de estómago, un 25 tumor de intestino delgado, un tumor de intestino grueso, un tumor rectal, un tumor ovárico, un tumor uterino, un tumor cervical, un tumor de próstata, un tumor testicular o un tumor de piel. 47. El metodo de la reivindicación 43, donde dicho cáncer 5 es un cáncer de sangre. 48. El método de la reivindicación 47, donde dicho tumor de sangre es una leucemia o un linfoma. 49. El método de la reivindicación 44, donde dicho agente terapéutico es una citocina, una toxina, un quimioterapéutico, un ío radioterapéutico, una hormona, un fragmento de Fe de anticuerpo, un agonista de TLR, una molécula que contiene CpG, o una molécula co-estimulante inmune. 50. El método de la reivindicación 43, adicionalmente comprende proporcionar dicho sujeto con una segunda terapia 15 anticáncer. 51 . El método de la reivindicación 50, donde dicha segunda terapia anticáncer es una terapia de gen , una quimioterapia, una radioterapia, una terapia de hormona, una terapia de toxina o cirugía. 20 52. El método de la reivindicación 43, donde dicho anticuerpo o anticuerpo artificial se administra a dicho sujeto más de una vez. 53. El método de la reivindicación 43, donde dicho cáncer es cáncer recurrente o metastático. 25 54. Un método para tratar un sujeto con una enfermedad autommune que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo de la reivindicación 1 o un anticuerpo artificial de la reivindicación 22. 55. El metodo de la reivindicación 54, donde dicha 5 enfermedad autoinmune es granulomatosis de Wegener, síndrome de Churg-Strauss, o vasculitis sistémica de pequeño vaso. 56. El método de la reivindicación 54, donde dicho anticuerpo o anticuerpo artificial se conjuga a un agente terapéutico. ío 57. El método de la reivindicación 56, donde dicho agente terapéutico es una toxina o un agente que induce apoptosis. 58. El método de la reivindicación 54, adicionalmente comprende proporcionar a dicho sujeto una segunda terapia a n ti - autoinmune. 15 59. El método de la reivindicación 58, donde dicha segunda terapia anti-autoinmune es un agente antiinflamatorio. 60. El método de la reivindicación 54, donde dicho anticuerpo se administra a dicho sujeto más de una vez. 61 . Un método para inducir citotoxicidad mediada por 20 complemento de una célula cancerosa H LA-A2 que comprende poner en contacto dicha célula cancerosa con un anticuerpo de la reivindicación 1 o un anticuerpo artificial de la reivindicación 22.