TW201827455A

TW201827455A - 用於治療癌症之表現膜錨定il-12之t細胞

Info

Publication number: TW201827455A
Application number: TW106134775A
Authority: TW
Inventors: 書林李; 胡潔淼; 雪清夏
Original assignee: 美國德州系統大學評議委員會
Priority date: 2016-10-07
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2018-08-01
Also published as: US11421010B2; US20200048322A1; JP2019532648A; US20220380429A1; EP3523323A1; WO2018068008A8; CN110267978A; EP3523323A4; WO2018068008A1

Abstract

本文提供包含膜錨定IL-12之多肽。本文亦提供表現該膜錨定IL-12之T細胞。另外，本文提供治療癌症之方法，其包含投與表現膜錨定IL-12之T細胞。本文亦提供組合治療，其包含表現膜錨定IL-12之T細胞及誘導T細胞化學吸引劑之趨化介素。另外，本文提供活化T細胞以表現NKG2D之方法及將其用於治療癌症之方法。

Description

用於治療癌症之表現膜錨定IL-12之T細胞

本發明概言之係關於免疫學及醫學領域。更具體而言，其係關於例如使用膜錨定IL-12之T細胞療法，及其用於治療癌症之用途。

自體腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)輸注係患有難治性黑色素瘤之患者的治療中之重大突破，且反應率高於BRAF靶向療法或CTLA-4阻斷療法。大多數患者應經歷對TIL轉移之反應，此乃因TIL可自其腫瘤分離。然而，在實踐中，反應率僅為約50%，包括10%-15%完全反應率(Besser等人，2010；Radvanyi等人，2012；Dudley等人，2005)。 TIL療法之主要挑戰在於，TIL在再輸注後之腫瘤歸巢能力下降，以及腫瘤微環境之變化。在近期臨床試驗中，輸注1.5-2×10¹¹ 個TIL以確保足夠腫瘤靶向TIL及腫瘤成功消退(Radvanyi等人，2012；Dudley等人，2005)。然而，將如此大量之TIL轉移至癌症患者體內可引起目標以外之不良效應。需要使得能將TIL更有效地遞送至腫瘤位點，且因此需要輸注顯著更少數目之T細胞之方法。 TIL無法到達腫瘤位點之一個關鍵原因在於，在離體培養期間腫瘤歸巢特徵之損失；因此，新療法使用已經識別腫瘤抗原(例如，CD19)之受體工程化之T細胞，稱為嵌合抗原受體(CAR)-T細胞療法。CAR-T細胞療法更特異性地靶向腫瘤細胞且已在血液惡性病治療中取得巨大成功，其中CAR-T細胞靶向血液及骨髓中之腫瘤細胞。然而，CAR-T細胞療法之效率在實體腫瘤中有限。實體腫瘤細胞上由於其異質性而缺少常見抗原。另外，宿主條件化通常避免T細胞進入腫瘤基質。使用T細胞療法(包括CAR-T、TIL及TCR-T (CTL)細胞)治療實體腫瘤存在很多困難，包括逃避抗原或靶特異性T細胞攻擊之腫瘤異質性，T細胞滲透至實體腫瘤中，經浸潤T細胞被免疫抑制環境不活化，及效應T細胞之耗竭。因此，業內需要能深入滲透至實體腫瘤中之T細胞療法。

在第一實施例中，本發明提供膜錨定介白素12 (IL-12)異二聚體蛋白質，其包含包含IL-12 α亞單元p35 (例如，SEQ ID NO:2)或與其至少90%相似之多肽之第一多肽、包含IL-12 β亞單元p40 (例如，SEQ ID NO:4)或與其至少90%相似之多肽之第二多肽、及融合至第一多肽及/或第二多肽之末端之跨膜結構域(TMD)。在一些態樣中，第一多肽融合至跨膜結構域。在特定態樣中，跨膜結構域位於第一多肽之C-末端。在一些態樣中，跨膜結構域包含與SEQ ID NO:3至少90%一致之序列。在某些態樣中，跨膜結構域包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列。在某些態樣中，第一多肽位於第二多肽之N-末端。在其他態樣中，第一多肽位於第二多肽之C-末端。在一個特定態樣中，該蛋白質自N-末端至C-末端包含第一多肽、跨膜結構域及第二多肽。在其他態樣中，該蛋白質自N-末端至C-末端包含第二多肽、跨膜結構域及第一多肽。第一多肽、第二多肽、TMD及視情況連接體可以多種構形融合。舉例而言，該蛋白質可包含一構形，例如但不限於p35-TMD-p40、p40-TMD-p35、p35-連接體-TMD-p40、p40-連接體-TMD-p35、p35-TMD-連接體-p40、p40-TMD-連接體-p35、TMD-p35-p40、TMD-p40-p35、p35-p40-TMD或p40-p35-TMD。在一些態樣中，第一多肽係IL-12 α亞單元p35或與其至少90%一致之多肽，且第二多肽係IL-12 β亞單元p40或與其至少90%一致之多肽。在某些態樣中，該蛋白質進一步包含連接體。在一些態樣中，連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGSS (SEQ ID NO:5)。在其他一些態樣中，連接體包含胺基酸序列SGGGGSGGGGSS (SEQ ID NO:6)。在其他態樣中，連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:7)。在特定態樣中，連接體位於IL-12 α亞單元p35與跨膜結構域之間。在一些態樣中，第一多肽包含與SEQ ID NO:1至少90%相似之胺基酸序列。在某些態樣中，第一多肽包含與SEQ ID NO:1至少90%一致之胺基酸序列。在一些態樣中，第一多肽與SEQ ID NO:1至少91%、92%、93%、94%、95%或96%相似。在特定態樣中，第一多肽與SEQ ID NO:1至少91%、92%、93%、94%、95%或96%一致。在某些態樣中，第二多肽包含與SEQ ID NO:4至少90%相似之胺基酸序列。在一些態樣中，第二多肽包含與SEQ ID NO:4至少90%一致之胺基酸序列。在一些態樣中，第二多肽與SEQ ID NO:4至少91%、92%、93%、94%、95%或96%相似。在特定態樣中，第二多肽與SEQ ID NO:4至少91%、92%、93%、94%、95%或96%一致。本文進一步提供編碼實施例之膜錨定IL-12蛋白之多核苷酸。本文亦提供包含編碼膜錨定IL-12之多核苷酸之表現載體。表現載體可為病毒載體，例如慢病毒載體、反轉錄病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。在另一實施例中，提供經工程化以表現實施例之膜錨定IL-12之T細胞群體。在某些態樣中，T細胞可表現編碼膜錨定IL-12之實施例之表現載體，例如病毒載體。在一些態樣中，T細胞係腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、CD8⁺ T細胞及/或CD4⁺ T細胞。在特定態樣中，T細胞係CD8⁺ T細胞。在一些態樣中，T細胞係腫瘤特異性T細胞。在一些態樣中，T細胞經進一步工程化以表現對腫瘤相關抗原具有抗原特異性之T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)。在某些態樣中，(CAR)包含細胞內信號傳導結構域、跨膜結構域及包含腫瘤相關抗原結合區之細胞外結構域。在一些態樣中，抗原結合區係F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。在特定態樣中，細胞內信號傳導結構域係T-淋巴球活化結構域。在一些態樣中，細胞內信號傳導結構域包含CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、細胞介素受體、CD40、類鐸(Toll-like)受體9或其組合。在某些態樣中，跨膜結構域包含CD28跨膜結構域、IgG4Fc鉸鏈、Fc區、CD4跨膜結構域、CD3ξ跨膜結構域、半胱胺酸突變人類CD3ξ結構域、CD16跨膜結構域、CD8跨膜結構域或紅血球生成素受體跨膜結構域。另一實施例提供產生經工程化以表現膜錨定IL-12之T細胞群體之方法，其包含獲得起始T細胞群體及引入表現膜錨定IL-12之載體，由此生成表現膜錨定IL-12之T細胞群體。在某些態樣中，表現載體係病毒載體，例如慢病毒載體。在一些態樣中，膜錨定IL-12係在兩個組成型啟動子控制下，例如巨細胞病毒(CMV)。在一些態樣中，引入包含實施電穿孔。在其他態樣中，T細胞可經抗CD3及CD80-FC重組蛋白活化。T細胞可在CD80-Fc (例如，約1-5天，例如4天)之前經抗CD3處理(例如，約1天)。在另一實施例中，提供治療個體之癌症之方法，其包含將有效量之經工程化以表現實施例之膜錨定IL-12之T細胞投與該個體。在一些態樣中，個體係人類。在某些態樣中，T細胞係自體T細胞。在某些態樣中，該方法進一步包含在投與T細胞之前對個體進行淋巴清除。在特定態樣中，癌症係結腸癌或肺癌。在一些態樣中，將T細胞及/或至少一種額外療法投與多於一次。在特定態樣中，T細胞滲透至該個體體內腫瘤中心或附近。在一些態樣中，T細胞藉由慢病毒轉導經工程化以表現膜錨定IL-12。在特定態樣中，在投與經工程化以表現膜錨定IL-12之T細胞後，在個體肺中存在低或基本上無T細胞累積。在某些態樣中，慢病毒轉導導致細胞介素反應症候群(CRS)之風險下降、全身性毒性減小及/或治療有效性增加。在一些態樣中，淋巴清除包含投與環磷醯胺及/或氟達拉濱(氟達拉濱)。在某些態樣中，該方法進一步包含投與至少一種額外治療劑。在某些態樣中，至少一種額外治療劑係化學療法、免疫療法、手術、放射療法或生物療法。在一些態樣中，化學療法選自由以下組成之群：環磷醯胺、胺甲喋呤(胺甲喋呤)、氟尿嘧啶、多柔比星(多柔比星)、長春新鹼(長春新鹼)、異環磷醯胺、順鉑(順鉑)、吉西他濱(gemcytabine)、白消安(白消安)、ara-C及其組合。在特定態樣中，化學療法係多柔比星或環磷醯胺。在一些態樣中，化學療法係在T細胞之前投與。在某些態樣中，化學療法係在T細胞療法之前15至25小時投與。在某些態樣中，T細胞及/或至少一種額外治療劑係靜脈內、腹膜內、氣管內、腫瘤內、肌內、內視鏡下、病灶內、經皮、皮下、區域性、或藉由直接注射或灌注投與。在某些態樣中，與投與具有野生型IL-12之T細胞相比，投與表現膜錨定IL-12之T細胞不誘導IFNγ或誘導較低含量之IFNγ。在一些態樣中，IFNγ係在血清樣品中或在培養基中量測。在一些態樣中，T細胞誘導CXCL9、CXCL10及/或CCL17之表現。在一些態樣中，投與T細胞誘導NKG2D及/或NKG2D配體之表現。在某些態樣中，T細胞誘導共刺激受體CD28之表現。在一些態樣中，T細胞降低免疫檢查點抑制劑之表現。在特定態樣中，免疫檢查點抑制劑係PD-1或PD-L1。在另一實施例中，提供生成NKG2D陽性CD8⁺ T細胞之活體外方法，其包含獲得起始T細胞群體及將起始T細胞群體在抗CD3 (例如，抗CD3微珠)及CD80 (例如，CD80-Fc重組蛋白)存在下培養足以誘導NKG2D表現之時間段，由此生成NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞。在一些態樣中，培養進一步定義為預處理起始T細胞群體至抗CD3，隨後用CD80處理T細胞。在一些態樣中，起始T細胞群體為CD28陽性。在某些態樣中，起始T細胞群體係TIL、CD8⁺ T細胞及/或CD4⁺ T細胞。在一些態樣中，起始T細胞群體係CD8⁺ T細胞。在某些態樣中，用抗CD3預處理12-48小時，例如約24小時。在一些態樣中，在CD80存在下培養1-5天，例如1、2、3、4或5天。在一些態樣中，用CD80處理導致STAT3磷酸化。在一些態樣中，T細胞經進一步工程化以表現對腫瘤相關抗原具有抗原特異性之TCR或CAR。在某些態樣中，CAR包含細胞內信號傳導結構域、跨膜結構域及包含腫瘤相關抗原結合區之細胞外結構域。在某些態樣中，抗原結合區係F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。在一些態樣中，細胞內信號傳導結構域係T-淋巴球活化結構域。在某些態樣中，細胞內信號傳導結構域包含CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、細胞介素受體、CD40、類鐸受體9或其組合。在某些態樣中，跨膜結構域包含CD28跨膜結構域、IgG4Fc鉸鏈、Fc區、CD4跨膜結構域、CD3ξ跨膜結構域、半胱胺酸突變人類CD3ξ結構域、CD16跨膜結構域、CD8跨膜結構域或紅血球生成素受體跨膜結構域。本文進一步提供治療個體之癌症之方法，其包含將有效量之實施例之NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞投與個體。在其他態樣中，T細胞例如藉由慢病毒載體之慢病毒轉導表現實施例之膜錨定IL-12。在一些態樣中，個體係人類。在某些態樣中，T細胞係自體T細胞。在特定態樣中，癌症係結腸癌或肺癌。在其他態樣中，該方法進一步包含投與至少一種額外治療劑。在一些態樣中，至少一種額外治療劑係化學療法、免疫療法、手術、放射療法或生物療法。在某些態樣中，化學療法選自由以下組成之群：環磷醯胺、胺甲喋呤、氟尿嘧啶、多柔比星、長春新鹼、異環磷醯胺、順鉑、吉西他濱、白消安、ara-C及其組合。在一些態樣中，化學療法係多柔比星或環磷醯胺。在特定態樣中，化學療法係在T細胞之前投與。在特定態樣中，化學療法係在T細胞療法之前15至25小時投與。在一些態樣中，T細胞及/或至少一種額外治療劑係靜脈內、腹膜內、氣管內、腫瘤內、肌內、內視鏡下、病灶內、經皮、皮下、區域性、或藉由直接注射或灌注投與。本發明之其他目標、特徵及優點將自以下詳細說明來表現。然而，應理解，儘管詳細說明及具體實例指示本發明之較佳實施例，但其僅以闡釋方式給出，此乃因熟習此項技術者自此詳細說明將明瞭在本發明之精神及範疇內之各種改變及修改。

本申請案主張2016年10月7日申請之美國臨時專利申請案第62/405,796號之權益，其全文以引用方式併入本文中。申請案中所含序列表命名為「UTFCP1302WO_ST25.txt」，其為9 KB (如在Microsoft Windows中所量測)且係於2017年10月6日創建，與本文一起藉由電子提交來提出申請且以引用方式併入本文中。 TIL或經修飾T細胞(例如，CAR-T細胞)在實體腫瘤中缺乏抗腫瘤活性主要係由於以下所致：腫瘤細胞之異質性；及儘管存在腫瘤靶向抗原，但缺乏浸潤至腫瘤中；以及經浸潤T細胞之不活化。因此，在一些實施例中，本發明提供迫使所輸注T細胞滲透至具有異質性之實體腫瘤中之方法。具體而言，本文中提供膜錨定腫瘤靶向之IL-12 (attIL-12)，其可促進所輸注T細胞滲透至實體腫瘤中。本文中亦提供包含attIL-12之T細胞(例如，具有CAR或TCR之T細胞，或腫瘤浸潤性淋巴球(TIL))之群體，以及藉由投與該經修飾T細胞群體來治療癌症之方法。亦提供用於自個體血液分離T細胞、用attIL-12修飾、擴增及投與個體之方法。另外，可用多柔比星或其他T細胞招募誘導物對個體進行預處理。本發明之研究顯示，藉由提高共刺激/共抑制性受體之比率，用attIL-12 T細胞治療不僅加強T細胞浸潤至實體腫瘤中，且亦上調吸引T細胞之趨化介素之含量，將T細胞吸引至腫瘤微環境且增強經浸潤T細胞之持久性。特定而言，修飾T細胞滲透至腫瘤中心(即，自腫瘤邊緣5-10 mm)。有趣地，在活體外培養基中或在活體內血清中，attIL-12修飾之T細胞加多柔比星治療不誘導任何可檢測之毒性IFNγ表現。此係重要的，此乃因野生型IL12對IFNγ之誘導由於毒性而限制IL12之臨床效用。事實上，觀察到attIL-12抑制IFNγ誘導且促進CD8⁺ T細胞滲透至腫瘤中，從而導致腫瘤根除。在其他態樣中，T細胞可藉由attIL-12慢病毒之慢病毒轉導經工程化以表現attIL-12。在本發明研究中，顯示在多柔比星治療後之該等慢病毒attIL-12 T細胞有效抑制腫瘤生長。與對照慢病毒T細胞相比，慢病毒attIL-12 T細胞在器官、例如肺中亦具有減少之T細胞累積。因此，由於正常組織中之此減少之T細胞累積，與接受對照慢病毒T細胞療法之個體相比，細胞介素反應症候群(CRS)之風險下降。在一些態樣中，此方法亦減小全身性毒性且增加治療有效性。另外，本發明方法可在腫瘤細胞中增加T細胞存活，增加非耗竭性信號基因CD28表現，且增加CD80表現。此CD28及CD80相互作用可進一步促進由NKG2D配體起始之抗腫瘤免疫反應。因此，本文提供之經修飾T細胞可用於藉由在其輸注後滲透至腫瘤中來治療實體癌症。在其他實施例中，提供藉由在CD80存在下培養T細胞來生成NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞之方法。T細胞可用抗CD3微珠預處理，之後用CD80、例如CD80-Fc重組蛋白處理足以誘導T細胞中NKG2D表現之時間段(例如，1-5天)。本發明研究發現，表現CD28之T細胞藉由用CD80處理經由STAT3磷酸化依賴性機制而活化。因此，CD80可用於誘導CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現。I. 定義如本文所用「基本上不含」在指定組分方面在本文中用於意指，無該指定組分被故意調配至組合物中及/或僅作為污染物或以痕量存在。因此，源自組合物之無意污染之該指定組分之總量遠低於0.05%，較佳低於0.01%。最佳者係其中用標準分析方法檢測不到該指定組分之量之組合物。如本文說明書中所用，「一(a)」或「一(an)」可意指一或多個。如本文申請專利範圍中所用，在結合詞語「包含」使用時，詞語「一(a)」或「一(an)」可意指一個或多於一個。除非明確指示僅指替代項或替代項相互排斥，否則申請專利範圍中所用術語「或」用於意指「及/或」，但本發明支持僅指替代項及「及/或」之定義。如本文所用「另一」可意指至少第二者或更多。在本申請通篇中，術語「約」用於指示，一值包括用於測定該值之裝置、方法之固有誤差變化，或在研究個體之間存在之差異。如本文所用術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」、「治療(treating)」或「改善」在關於疾病、病症或醫學病況使用時，係指對病況之治療性治療，其中目標係逆轉、緩和、改善、抑制、減慢或停止症狀或病況之進展或嚴重程度。術語「治療」包括減少或緩和病況之至少一種不良效應或症狀。若一或多個症狀或臨床標記物減少，則治療通常係「有效的」。或者，若病況之進展減小或停止，則治療係「有效的」。亦即，「治療」不僅包括症狀或標記物之改良，且亦包括停止或至少減慢在無治療時會預期之症狀之進展或惡化。有益或期望臨床結果包括但不限於與無治療時之預期相比，緩和一或多種症狀、降低缺陷程度、穩定化(即，不惡化)腫瘤或惡性病之狀態、延遲或減慢腫瘤生長及/或轉移及延長壽命。「個體」及「患者」係指人類或非人類，例如靈長類動物、哺乳動物及脊椎動物。在特定實施例中，個體係人類。如本申請通篇所用術語「治療益處」或「治療有效」係指關於此病況之醫學治療，促進或增強個體健康之任何事物。此包括但不限於疾病徵象或症狀之頻率或嚴重程度之下降。舉例而言，癌症治療可涉及例如腫瘤大小之減小、腫瘤侵襲力之下降、癌症生長速率之減小或轉移之預防。癌症治療亦可係指延長患有癌症之個體之存活。「抗癌」劑能例如藉由以下方式對個體中之癌細胞/腫瘤產生負面影響：促進對癌細胞之殺死、誘導癌細胞之細胞凋亡、降低癌細胞之生長速率、降低轉移發生率或數量、減小腫瘤大小、抑制腫瘤生長、減少腫瘤或癌細胞之血液供應、促進針對癌細胞或腫瘤之免疫反應、預防或抑制癌症進展或延長患有癌症之個體之壽命。「表現構築體」或「表現盒」意指能引導轉錄之核酸分子。表現構築體至少包括一或多個在一或多種期望細胞類型、組織或器官中引導基因表現之轉錄控制元件(例如啟動子、增強子或其功能等效結構)。亦可包括其他元件，例如轉錄終止信號。「載體」或「構築體」(有時稱為基因遞送系統或基因轉移「媒介」)係指包含欲在活體外或活體內遞送至宿主細胞之多核苷酸之巨分子或分子複合物。「質體」係常見類型之載體，係與染色體DNA分離之染色體外DNA分子，其能獨立於染色體DNA複製。在某些情形中，其係環狀且為雙鏈。「編碼」特定蛋白質之「基因」、「多核苷酸」、「編碼區」、「序列」、「區段」、「片段」或「轉基因」係在活體外或活體內置於適當調節序列控制下時經轉錄且視情況亦轉譯為基因產物(例如多肽)之核酸分子。編碼區可以cDNA、基因體DNA或RNA形式存在。在以DNA形式存在時，核酸分子可為單鏈(即，有義鏈)或雙鏈。編碼區之邊界係由5' (胺基)末端之起始密碼子及3' (羧基)末端之轉譯終止密碼子來確定。基因可包括但不限於來自原核或真核mRNA之cDNA、來自原核或真核DNA之基因體DNA序列及合成DNA序列。轉錄終止序列通常將位於基因序列之3'。術語「控制元件」共同地指啟動子區、多聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調節結構域、複製起點、內部核糖體進入位點(IRES)、增強子、剪接點及諸如此類，其共同提供接受細胞中編碼序列之複製、轉錄、轉錄後處理及轉譯。並非所有該等控制元件皆需要存在，只要所選編碼序列能在適當宿主細胞中複製、轉錄及轉譯即可。術語「啟動子」在本文中以其普通含義用於指包含DNA調節序列之核苷酸區，其中調節序列源自能結合RNA聚合酶且起始下游(3'方向)編碼序列之轉錄之基因。其可含有遺傳元件，調節蛋白及分子(例如RNA聚合酶及其他轉錄因子)可在該等遺傳元件處結合以起始核酸序列之特異性轉錄。片語「可操作定位」、「可操作連接」、「在控制下」及「在轉錄控制下」意指，啟動子相對於核酸序列位於正確功能位置及/或取向，以控制該序列之轉錄起始及/或表現。「增強子」意指在靠近啟動子定位時，相對於在增強子結構域不存在時源自啟動子之轉錄活性，賦予增強之轉錄活性之核酸序列。關於核酸分子之「可操作連接」或「共表現」意指，兩個或更多個核酸分子(例如，欲轉錄核酸分子、啟動子及增強子元件)以例如允許核酸分子轉錄之方式連接。關於肽及/或多肽分子之「可操作連接」或「共表現」意指，兩個或更多個肽及/或多肽分子以例如產生單一多肽鏈(即融合多肽，其具有融合物中每一肽及/或多肽組分之至少一種性質)之方式連接。融合多肽較佳係嵌合的，即由異源分子組成。本文中之術語「抗體」以最廣泛含義使用且明確涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望生物活性即可。如本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體之群體獲得之抗體，即，除可以少量存在之可能突變(例如天然突變)外，構成該群體之個別抗體相同。因此，修飾語「單株」指示抗體特徵並非離散抗體之混合物。在某些實施例中，此一單株抗體通常包括包含結合靶之多肽序列之抗體，其中靶結合多肽序列係藉由包括自複數個多肽序列選擇單一靶結合多肽序列之方法獲得。舉例而言，選擇方法可為自複數個純系(例如一組雜交瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系)選擇獨特純系。應理解，可進一步改變所選靶結合序列以(例如)改良對靶之親和性，使靶結合序列人類化，改良其在細胞培養物中之產生，降低其在活體內之免疫原性，產生多特異性抗體等，且包含經改變靶結合序列之抗體亦係本發明之單株抗體。與通常包括針對不同決定子(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除了其特異性以外，單株抗體製劑之優點在於其通常未經其他免疫球蛋白污染。片語「醫藥或藥理上可接受的」係指在適當時投與動物(例如人類)時不產生不良、過敏或其他不利反應之分子實體及組合物。包含抗體或其他活性成分之醫藥組合物之製備將為熟習此項技術者根據本發明已知。此外，對於動物(例如人類)投與，應理解，製劑應符合如FDA生物標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)所需之無菌性、致熱原性、一般安全性及純度標準。如本文所用「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如，水、醇/水溶液、鹽水溶液、非經腸媒劑，例如氯化鈉及林格氏(Ringer's)右旋糖)、非水性溶劑(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯，例如油酸乙酯)、分散介質、塗料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料、體液及營養補充劑、該等類似材料及其組合，如熟習此項技術者已知。醫藥組合物中各種組分之pH及確切濃度係根據熟知參數來調節。術語「單位劑量」或「劑量」係指適用於個體之物理離散單位，各單位含有結合其投與(即適當途徑及治療方案)經計算產生上述期望反應之預定量之治療組合物。根據治療次數及單位劑量二者欲投與之量取決於期望效應。投與患者或個體之本發明實施例之組合物之實際劑量可依據物理及生理因素來確定，例如個體之體重、年齡、健康及性別、所治療疾病之類型、疾病侵入之程度、先前或並行治療介入、患者之特發病、投與途徑以及特定治療物質之功效、穩定性及毒性。舉例而言，劑量亦可包含每次投與約1 µg/kg/體重至約1000 mg/kg/體重(此所述範圍包括中間劑量)或更多，以及其中可推導之任何範圍。在來自此處所列示數值之可推導範圍之非限制性實例中，可投與約5 µg/kg/體重至約100 mg/kg/體重、約5 µg/kg/體重至約500 mg/kg/體重等之範圍。在任一事件中，負責投與之執業醫師將決定組合物中活性成份之濃度及個別個體之適當劑量。如本文所用術語「抗原」係能被抗體或T細胞受體結合之分子。抗原通常可用於誘導體液性免疫反應及/或細胞免疫反應，導致產生B及/或T淋巴球。術語「免疫檢查點」係指免疫系統中之分子(例如蛋白質)，其向免疫系統組分提供抑制性信號以平衡免疫反應。已知免疫檢查點蛋白包含CTLA-4、PD1及其配體PD-L1及PD-L2及另外LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3及KIR之路徑為業內公認可構成類似於CTLA-4及PD-1依賴性路徑之免疫檢查點路徑(例如，參見Pardoll, 2012.Nature Rev Cancer 12:252-264；Mellman等人，2011.Nature 480:480-489)。「免疫檢查點抑制劑」係指抑制免疫檢查點蛋白功能之任何化合物。抑制包括降低功能及完全阻斷。特定而言，免疫檢查點蛋白係人類免疫檢查點蛋白。因此，特定而言，免疫檢查點蛋白抑制劑係人類免疫檢查點蛋白抑制劑。術語「腫瘤相關抗原」、「腫瘤抗原」及「癌細胞抗原」在本文中可互換使用。在每一情形中，該等術語係指癌細胞特異性或優先表現之蛋白質、醣蛋白或碳水化合物。術語「膜錨定IL-12」或「膜錨定腫瘤靶向IL-12 (attIL-12)」係指已經修飾以包含跨膜結構域之IL-12蛋白。多核苷酸或多核苷酸區(或多肽或多肽區)具有某一百分比(例如80%、85%、90%或95%)之「相似性百分比」或「序列相似性」，其係指一種胺基酸可取代另一胺基酸而不喪失功能之程度。此相似性百分比可經由使用諸如PAM250或BLOSUM62矩陣等矩陣來測定。多核苷酸或多核苷酸區(或多肽或多肽區)與另一序列具有某一百分比(例如，80%、85%、90%或95%)之「序列一致性」或「同源性」意指，在比對時，在比較兩個序列中該百分比之鹼基(或胺基酸)相同。此比對及同源性或序列一致性百分比可使用業內已知之軟體程式來測定，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編輯，1987) 增刊30，第7.7.18節，表7.7.1中所述之彼等。較佳地，使用默認參數進行比對。較佳比對程式係BLAST，使用默認參數。特定而言，較佳程式係BLASTN及BLASTP，使用以下默認參數：遺傳密碼=標準；過濾器=無；鏈=兩條鏈；截止值=60；預期=10；矩陣=BLOSUM62；說明=50個序列；分選依據=高分；資料庫=非冗餘，基因庫+EMBL+DDBJ+PDB+基因庫CDS轉譯+SwissProtein+SPupdate+PIR。II. 過繼性 T 細胞療法 本發明之某些實施例係關於獲得起始T細胞群體，修飾T細胞，及將經修飾T細胞作為免疫療法投與個體以靶向癌細胞。特定而言，該等T細胞表現膜錨定介白素12 (IL-12)。過去二十年中已闡述若干種用於衍生、活化及擴增功能性抗腫瘤效應T細胞之基本方法。該等方法包括：自體細胞，例如腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)；使用自體DC、淋巴球、人工抗原呈遞細胞(APC)或經T細胞配體及活化抗體塗佈之珠粒離體活化之T細胞，或藉助捕獲靶細胞膜分離之細胞；天然表現抗宿主腫瘤T細胞受體(TCR)之同種異體細胞；及非腫瘤特異性自體或同種異體細胞，其經遺傳重程式化或「重引導」以表現展示抗體樣腫瘤識別能力之腫瘤反應性TCR或嵌合TCR分子，稱為「T-體」。該等方法已產生多種可用於本文所述方法中之T細胞製備及免疫方案。A. T 細胞製備 在一些實施例中，起始T細胞群體源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些態樣中，細胞係人類細胞。細胞通常係初代細胞，例如直接自個體分離及/或自個體分離並冷凍之彼等細胞。在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型之一或多個亞組，例如全T細胞群體、CD4⁺ 細胞、CD8⁺ 細胞及其亞群體，例如彼等藉由以下界定者：功能、活化狀態、成熟度、分化潛力、擴增、再循環、定位及/或持久能力、抗原特異性、抗原受體類型、在特定器官或區室中之存在、標記物或細胞介素分泌概況及/或分化程度。關於欲治療個體，細胞可為同種異體及/或自體的。在一些態樣中，例如對於現有技術，細胞係多潛能及/或多能的，例如幹細胞，例如經誘導多潛能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，該方法包括自個體分離細胞、製備、處理、培養及/或將其工程化，如本文所述，及在冷凍保存之前或之後將其再引入同一患者。 T細胞(例如，CD4⁺ 及/或CD8⁺ T細胞)之亞型及亞群體尤其係幼稚T (T_N )細胞、效應T細胞(T_EFF )、記憶T細胞及其亞型(例如幹細胞記憶T (TSC_M )、中樞記憶T (TC_M )、效應記憶T (T_EM )或最終分化之效應記憶T細胞)、腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、不成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T (MAIT)細胞、天然及適應性調節T (Treg)細胞、輔助T細胞(例如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助T細胞、α/β T細胞及δ/γ T細胞)。在一些實施例中，一或多個T細胞群體係針對對特定標記物(例如表面標記物)呈陽性之細胞或對特定標記物呈陰性之細胞加以富集或清除該等細胞。在一些情形中，該等標記物係在某些T細胞群體(例如，非記憶細胞)上不存在或以相對低程度表現，但在其他某些T細胞群體(例如，記憶細胞)上存在或以相對較高程度表現之彼等標記物。在一些實施例中，T細胞係藉由負向選擇非T細胞(例如B細胞、單核球或其他白血球)上表現之標記物(例如CD14)自PBMC樣品分離。在一些態樣中，CD4⁺ 或CD8⁺ 選擇步驟用於分離CD4⁺ 輔助細胞及CD8⁺ 細胞毒性T細胞。該等CD4⁺ 及CD8⁺ 群體可藉由正向或負向選擇在一或多個幼稚、記憶及/或效應T細胞亞群體上表現或以相對較高程度表現之標記物進一步分選為多個亞群體。在一些實施例中，CD8⁺ T細胞係例如藉由基於與各別亞群體相關之表面抗原進行正向或負向選擇，針對幼稚、中樞記憶、效應記憶及/或中樞記憶幹細胞加以富集或清除該等細胞。在一些實施例中，針對中樞記憶T (T_CM )細胞加以富集以提高效能，以例如改良投與後之長期存活、擴增及/或植入，其在一些態樣中在該等亞群體中尤其穩健。Terakura等人(2012)Blood .1:72- 82；Wang等人(2012)J Immunother . 35(9):689-701。在一些實施例中，T細胞係自體T細胞。在此方法中，腫瘤樣品係自患者獲得且獲得單細胞懸浮液。單細胞懸浮液可以任何適宜方式獲得，例如機械方式(使用例如gentleMACS™解離器(Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.)使腫瘤解聚)或酶方式(例如，膠原酶或DNA酶)。在介白素-2 (IL-2)中培養腫瘤酶消化物之單細胞懸浮液。培養細胞直至鋪滿(例如，約2×10⁶ 個淋巴球)，例如約5至約21天，較佳約10至約14天。舉例而言，可將細胞培養5天、5.5天或5.8天至21天、21.5天或21.8天，例如10天、10.5天或10.8天至14天、14.5天或14.8天。所培養T細胞可經彙集及快速擴增。快速擴增使抗原特異性T細胞數經約10至約14天時間段增加至少約50倍(例如，50、60、70、80、90或100倍或更多)。更佳地，快速擴增使其經約10至約14天時間段增加至少約200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900倍或更多)。擴增可藉由如業內已知之多種方法中之任一方法來完成。舉例而言，T細胞可使用非特異性T細胞受體刺激在飼養淋巴球及介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15) (IL-2較佳)存在下快速擴增。非特異性T細胞受體刺激物可包括約30 ng/ml之OKT3，其係一種小鼠單株抗CD3抗體(可自Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.獲得)。或者，T細胞可藉由活體外外周血單核細胞(PBMC)及一或多種可視情況自載體(例如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽)表現之癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位或細胞)之刺激在T細胞生長因子(例如300 IU/ml IL-2或IL-15，IL-2較佳)存在下快速擴增。活體外誘導之T細胞係藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈遞細胞上之相同癌症抗原再刺激來快速擴增。或者，例如，T細胞可用經輻照自體淋巴球或用經輻照HLA-A2⁺ 同種異體淋巴球及IL-2再刺激。自體T細胞可經修飾以表現促進自體T細胞生長及活化之T細胞生長因子。適宜T細胞生長因子包括例如介白素(IL)-2、IL-7、IL-15及IL-12。適宜修飾方法為業內已知。例如，參見Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第3版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology , Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994。在特定態樣中，經修飾自體T細胞高度表現T細胞生長因子。T細胞生長因子編碼序列(例如IL-12之編碼序列)如啟動子一般在業內易於獲得，啟動子與T細胞生長因子編碼序列之可操作連接促進高度表現。B. T 細胞活化 在一些實施例中，本發明提供活化T細胞以增加T細胞(例如CD8⁺ T細胞)上之NKG2D受體表現之方法。起始T細胞群體可經抗CD3 (例如抗CD3珠粒)預處理。該預處理可進行約12小時至3天，例如約24小時。隨後可將經擴增T細胞與CD80蛋白(例如CD80-Fc重組蛋白)一起培養以誘導CD28活化，且由此誘導NKG2D表現。與CD80一起培養可進行約1-6天，例如約1、2、3、4、5或6天，尤其約4天。在一些態樣中，T細胞可同時經抗CD3及CD80處理。C. 具有膜錨定 IL-12 之 T 細胞在特定實施例中，本文提供表現膜錨定IL-12之T細胞。本發明膜錨定IL-12可包含SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:4，其包含IL-12 α亞單元p35 (NCBI參照序列：NP_000873.2；SEQ ID NO:2)、連接體、跨膜結構域(例如，SEQ ID NO:3)及IL-12 β亞單元p40 (NCBI參照序列：NP_002178.2；SEQ ID NO:4)。本文亦提供包含膜錨定IL-12之組合物，其可包括編碼膜錨定IL-12之蛋白質及/或核酸。在一些態樣中，本文提供之膜錨定IL-12異二聚體蛋白質與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:4具有至少約90%序列一致性，例如與SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO:4具有至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，IL-12 p35亞單元之C-末端融合至跨膜結構域。跨膜結構域可包含SEQ ID NO:3。在其他實施例中，跨膜結構域可包含業內已知之其他跨膜序列，例如Kozma等人，Nucleic Acids Research 41資料庫專刊，D524-D529, 2013中所揭示。在其他實施例中，IL-12 p40包含跨膜結構域。具有一或多個跨膜多肽結構域之跨膜蛋白之熟知實例包括整聯蛋白家族成員、CD44、血型醣蛋白、MHC I類及II類醣蛋白、EGF受體、G蛋白偶合受體(GPCR)家族、受體酪胺酸激酶(例如胰島素樣生長因子1受體(IGFR)及血小板源生長因子受體(PDGFR))、孔蛋白家族及其他跨膜蛋白。本發明之某些實施例涵蓋使用跨膜多肽結構域之一部分，例如具有膜插入特徵之截短多肽，如根據標準及熟知方法可測定。在實施例之膜錨定IL-12中可使用多種連接體。在一些態樣中，連接體可為一串串聯之一或多個胺基酸(例如，2、3、4、5、10、15、20或更多個胺基酸)。根據實施例使用之一些特定連接體包括218 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG)、HL (EAAAK)及G₄ S (GGGGS)連接體。可用於多個實施例中之膜錨定IL-12蛋白序列包括本文所述胺基酸序列以及類似物及其衍生物。類似物及衍生物可包括但不限於由核苷酸序列編碼之胺基酸序列內胺基酸殘基之加成或取代，但此導致沉默變化，由此產生功能等效基因產物。胺基酸取代可基於所涉及殘基在以下方面中之相似性來進行：極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。胺基酸取代可替代地基於胺基酸之親水指數來進行。每一胺基酸係基於其疏水性及電荷特徵分配親水指數。其係：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸鹽(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸鹽(-3.5)；天冬醯胺 (-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。業內理解在蛋白質上賦予相互作用生物功能中使用親水胺基酸指數(Kyte及Doolittle,J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982)。已知在某些情況下，某些胺基酸可取代其他具有相似親水指數或評分之胺基酸且仍保留相似生物活性。在基於親水指數進行變化時，在某些實施例中，包括親水指數在± 2內之胺基酸取代，而在其他實施例中，包括在± 1內之胺基酸取代，且在其他實施例中，包括在± 0.5內之胺基酸取代。胺基酸取代可替代地基於親水性來進行，特定而言其中由此產生之生物功能蛋白質或肽意欲用於免疫實施例中。在某些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性(如受其毗鄰胺基酸之親水性所支配)與其免疫原性及抗原性、即與蛋白質之生物性質相關聯。以下親水性值已分配給該等胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸鹽(+3.0 ± 1)；麩胺酸鹽(+3.0 ± 1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺 (+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5 ± 1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於相似親水性值進行變化時，在某些實施例中，包括親水性值在± 2內之胺基酸之取代，在某些實施例中，包括在± 1內之胺基酸取代，且在某些實施例中，包括在± 0.5內之胺基酸取代。亦可基於親水性鑑別來自一級胺基酸序列之表位。取代型變體通常含有在蛋白質內之一或多個位點用一個胺基酸交換另一個胺基酸，且可經設計以在損失或不損失其他功能或性質之情況下調節多肽之一或多種性質。取代可為保守取代，亦即一個胺基酸經具有相似形狀及電荷之胺基酸替代。保守取代為業內所熟知且包括例如以下變化：丙胺酸變為絲胺酸；精胺酸變為離胺酸；天冬醯胺變為麩醯胺酸或組胺酸；天冬胺酸鹽變為麩胺酸鹽；半胱胺酸變為絲胺酸；麩醯胺酸變為天冬醯胺；麩胺酸鹽變為天冬胺酸鹽；甘胺酸變為脯胺酸；組胺酸變為天冬醯胺或麩醯胺酸；異白胺酸變為白胺酸或纈胺酸；白胺酸變為纈胺酸或異白胺酸；離胺酸變為精胺酸；甲硫胺酸變為白胺酸或異白胺酸；苯丙胺酸變為酪胺酸, 白胺酸或甲硫胺酸；絲胺酸變為蘇胺酸；蘇胺酸變為絲胺酸；色胺酸變為酪胺酸；酪胺酸變為色胺酸或苯丙胺酸；及纈胺酸變為異白胺酸或白胺酸。或者，取代可為非保守的，使得多肽之功能或活性受影響。非保守變化通常涉及用一殘基取代化學上不相似之殘基，例如用極性或帶電荷胺基酸取代非極性或不帶電荷胺基酸，且反之亦然。在一些態樣中，將編碼膜錨定IL-12之核酸投與或引入細胞，例如T細胞。核酸通常係以表現載體之形式來投與。在一些態樣中，表現載體係反轉錄病毒表現載體、腺病毒表現載體、DNA質體表現載體或AAV表現載體。在一些態樣中，將一或多種編碼膜錨定IL-12之多核苷酸遞送至細胞。在一些態樣中，遞送係藉由遞送一或多種載體、其一或多種轉錄物及/或一或多種自其轉錄之蛋白質遞送至細胞。在一些實施例中，多肽係由於將編碼該等多肽之多核苷酸引入細胞中而在細胞中原位合成。在一些態樣中，多肽可在細胞外產生且隨後引入該等細胞中。將多核苷酸構築體引入動物細胞中之方法為人所知且作為非限制性實例包括穩定轉變方法，其中將多核苷酸構築體整合至細胞基因體中；瞬時轉變方法，其中不將多核苷酸構築體整合至細胞基因體中；及病毒介導之方法。在一些實施例中，可藉由例如重組體病毒載體(例如反轉錄病毒、腺病毒)、脂質體及諸如此類將多核苷酸引入細胞中。舉例而言，在一些態樣中，瞬時轉變方法包括顯微注射、電穿孔或粒子轟擊。在一些實施例中，慮及在細胞中表現，多核苷酸可包括於載體中，更特定而言質體或病毒中。在一些實施例中，可使用基於病毒及非病毒之基因轉移方法在哺乳動物細胞或靶組織中引入核酸。該等方法可用於將編碼CRISPR、ZFP、ZFN、TALE及/或TALEN系統之組分之核酸投與培養物中或宿主生物體中之細胞。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、RNA (例如本文所述載體之轉錄物)、裸核酸及與諸如脂質體等遞送媒介複合之核酸。病毒載體遞送系統包括DNA及RNA病毒，其在遞送至細胞後具有游離或整合基因體。關於基因治療程序之綜述，參見Anderson, 1992；Nabel及Feigner, 1993；Mitani及Caskey, 1993；Dillon, 1993；Miller, 1992；Van Brunt, 1988；Vigne, 1995；Kremer及Perricaudet, 1995；Haddada等人，1995；及Yu等人，1994。核酸之非病毒遞送方法包括脂轉染、核轉染、顯微注射、生物彈道學、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質:核酸偶聯物、裸DNA、人工病毒粒子及藥劑增強之DNA攝取。脂轉染闡述於(例如，美國專利第5,049,386號、第4,946,787號及第4,897,355號)中，且脂轉染試劑在市場上有售(例如，Transfectam™及Lipofectin™)。適於多核苷酸之有效受體識別脂轉染之陽離子及中性脂質包括Feigner, WO 91117424；WO 91116024之彼等。可遞送至細胞(例如活體外或離體投與)或靶組織(例如活體內投與)。在一些實施例中，遞送係經由使用基於RNA或DNA病毒之系統來遞送核酸。在一些態樣中，病毒載體可直接投與患者(活體內)，或其可用於在活體外或離體處理細胞，隨後投與患者。在一些實施例中，基於病毒之系統包括用於基因轉移之反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒及單純皰疹病毒載體。在一些態樣中，可將包括但不限於麩胱甘肽-5-轉移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT) β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)及自發螢光蛋白(包括藍色螢光蛋白(BFP))之報導基因引入細胞中以編碼基因產物，該基因產物用做標記物，憑該標記物量測基因產物表現之改變或修改。在另一實施例中，可經由載體將編碼基因產物之DNA分子引入細胞中。在一些實施例中，基因產物係螢光素酶。D. 遺傳工程化抗原受體 本發明T細胞可經遺傳工程化以表現抗原受體，例如工程化TCR及/或嵌合抗原受體(CAR)。舉例而言，自體T細胞經修飾以表現對癌症抗原具有抗原特異性之T細胞受體(TCR)。適宜修飾方法為業內已知。例如，參見Sambrook及Ausubel，上文參考文獻。舉例而言，T細胞可使用Heemskerk等人Hum Gene Ther. 19:496-510 (2008)及Johnson等人Blood 114:535-46 (2009)中所述之轉導技術經轉導以表現對癌症抗原具有抗原特異性之T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，T細胞包含一或多個經由遺傳工程化引入之編碼一或多個抗原受體之核酸及該等核酸之遺傳工程化產物。在一些實施例中，核酸係異源的，即通常在細胞或自細胞獲得之樣品中不存在，例如自另一生物體或細胞獲得者，其例如通常在所工程化細胞及/或自其衍生該細胞之生物體中未發現。在一些實施例中，核酸係非天然的，例如在自然界中未發現之核酸(例如，嵌合的)。在一些實施例中，CAR含有特異性結合至抗原之細胞外抗原識別結構域。在一些實施例中，抗原係在細胞表面上表現之蛋白質。在一些實施例中，CAR係TCR樣CAR且抗原係經處理肽抗原，例如細胞內蛋白質之肽抗原，其如同TCR一般在主要組織相容性複合體(MHC)分子情況下在細胞表面上被識別。實例性抗原受體(包括CAR及重組體TCR)以及工程化受體並將該等受體引入細胞中之方法包括闡述於例如以下文獻中之彼等：國際專利申請公開案編號WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、美國專利申請公開案編號US2002131960、US2013287748、US20130149337、美國專利編號6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353及8,479,118，及歐洲專利申請案編號EP2537416，及/或以下闡述之彼等：Sadelain等人，Cancer Discov . 2013年4月；3(4): 388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle等人，Curr. Opin. Immunol., 2012年10月；24(5): 633-39；Wu等人，Cancer , 2012年3月，18(2): 160-75。在一些態樣中，遺傳工程化抗原受體包括如美國專利第7,446,190號中所述之CAR及國際專利申請公開案第WO/2014055668 Al號中所述之彼等。在一些態樣中，腫瘤抗原係人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)、存活素、小鼠雙微體2 同系物(MDM2)、細胞色素P450 1B1 (CYP1B)、HER2/neu、威爾姆氏瘤基因1 (WT1)、生存素(livin)、α胎兒蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、黏蛋白16 (MUC16)、MUC1、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53或週期蛋白(Dl)。舉例而言，靶抗原係hTERT或存活素。在一些態樣中，靶抗原係CD38。在其他態樣中，靶抗原係CD33或TIM-3。在其他態樣中，靶抗原係CD26、CD30、CD53、CD92、CD148、CD150、CD200、CD261、CD262或CD362。在一些實施例中，工程化免疫細胞可含有靶向一或多種其他抗原之抗原。在一些實施例中，一或多種其他抗原係腫瘤抗原或癌症標記物。其他抗原包括孤兒酪胺酸激酶受體ROR1、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、間皮素、CEA及肝炎B表面抗原、抗葉酸鹽受體、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB 3或ErbB 4、FBP、胎兒乙醯膽鹼e受體、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ輕鏈、Lewis Y、Ll-細胞黏著分子、MAGE-A1、間皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配體、NY-ESO-1、MART-1、gplOO、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受體、助孕酮受體、ephrinB2、CD 123、CS-1、c-Met、GD-2及MAGE A3、CE7、威爾姆氏瘤1 (Wilms Tumor 1，WT-1)、週期蛋白(例如週期蛋白Al (CCNA1))及/或生物素化分子、及/或由HIV、HCV、HBV或其他病原體表現之分子。1. 嵌合抗原受體 在一些實施例中，工程化抗原受體包括嵌合抗原受體(CAR)，包括活化或刺激性CAR、共刺激CAR (參見WO2014/055668)及/或抑制性CAR (iCAR，參見Fedorov等人，Sci. Transl. Medicine , 5(215) (2013年12月)。CAR通常包括在一些態樣中經由連接體及/或跨膜結構域連接至一或多個細胞內信號傳導組分之細胞外抗原(或配體)結合結構域。該等分子通常模擬或接近經過天然抗原受體之信號、經過此一受體與共刺激受體之組合之信號及/或僅經過共刺激受體之信號。在一些實施例中，CAR經構築具有對特定抗原(或標記物或配體)之特異性，該特定抗原例如在欲由過繼性療法靶向之特定細胞類型中表現之抗原，例如癌症標記物，及/或意欲誘導衰減反應(dampening response)之抗原，例如在正常或無病細胞類型上表現之抗原。因此，CAR通常在其細胞外部分中包括一或多個抗原結合分子，例如一或多個抗原結合片段、結構域或部分，或一或多個抗體可變結構域及/或抗體分子。在一些實施例中，CAR包括抗體分子之一或多個抗原結合部分，例如源自單株抗體(mAb)之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之單鏈抗體片段(scFv)。在一些態樣中，抗原特異性結合或識別組分連接至一或多個跨膜及細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，CAR包括融合至CAR之細胞外結構域之跨膜結構域。在一個實施例中，使用與CAR中之一個結構域天然締合之跨膜結構域。在一些情況下，跨膜結構域經選擇或藉由胺基酸取代經修飾以避免該等結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域結合，以最小化與受體複合物之其他成員的相互作用。在一些實施例中，跨膜結構域源自天然來源或源自合成來源。在來源為天然時，在一些態樣中，結構域源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。跨膜區包括彼等源自(即至少包含其跨膜區) T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154者。或者，在一些實施例中，跨膜結構域係合成的。在一些態樣中，合成跨膜結構域主要包含疏水殘基，例如白胺酸及纈胺酸。在一些態樣中，將在合成跨膜結構域之每一末端發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。 CAR通常包括至少一個細胞內信號傳導組分。在一些實施例中，CAR包括TCR複合物之細胞內組分，例如介導T細胞活化及細胞毒性之TCR CD3⁺ 鏈，例如CD3 ζ鏈。因此，在一些態樣中，抗原結合分子連接至一或多個細胞信號傳導模組。在一些實施例中，細胞信號傳導模組包括CD3跨膜結構域、CD3細胞內信號傳導結構域及/或其他CD跨膜結構域。在一些實施例中，CAR進一步包括一或多個其他分子(例如Fc受體γ、CD8、CD4、CD25或CD16) 之一部分。舉例而言，在一些態樣中，CAR包括CD3-ζ (CD3-Q)或Fc受體γ與CD8、CD4、CD25或CD16之間之嵌合分子。2. T 細胞受體 (TCR) 在一些實施例中，遺傳工程化抗原受體包括重組體T細胞受體(TCR)及/或自天然T細胞選殖之TCR。「T細胞受體」或「TCR」係指含有可變a及β鏈(亦分別稱為TCRa及TCRp)或可變γ及δ鏈(亦分別稱為TCRy及TCR5)且能特異性結合至與MHC受體結合之抗原肽之分子。在一些實施例中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ及γδ形式存在之TCR通常在結構上相似，但表現其之T細胞可具有不同解剖學位置或功能。TCR可發現於細胞表面上或呈可溶形式。通常，TCR發現於T細胞(或T淋巴球)表面上，其中其通常負責識別與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合之抗原。在一些實施例中，TCR亦可含有恆定結構域、跨膜結構域及/或短胞質尾區(例如，參見Janeway等人，Immunobiology: The Immune System in Health and Disease，第3版，Current Biology Publications, 第4:33頁, 1997)。舉例而言，在一些態樣中，TCR之每一鏈可具有一個N-末端免疫球蛋白可變結構域、一個免疫球蛋白恆定結構域、跨膜區及在C-末端之短胞質尾區。在一些實施例中，TCR與介導信號轉導中所涉及之CD3複合物之不變蛋白質締合。除非另有陳述，否則術語「TCR」應理解為涵蓋其功能性TCR片段。該術語亦涵蓋完整或全長TCR，包括呈αβ形式或γδ形式之TCR。因此，出於本文之目的，所提及之TCR包括任何TCR或功能片段，例如TCR之抗原結合部分，其結合至MHC分子中所結合之特定抗原性肽，即MHC-肽複合物。TCR之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」可互換使用，係指含有TCR之結構結構域之一部分，但結合完整TCR所結合之抗原(例如MHC-肽複合物)之分子。在一些情形中，抗原結合部分含有TCR之可變結構域，例如TCR之可變a鏈及可變β鏈，其足以形成用於結合至特定MHC-肽複合物之結合位點，例如通常其中每一鏈含有三個互補決定區。在一些實施例中，TCR鏈之可變結構域締合形成環或類似於免疫球蛋白之互補決定區(CDR)，其賦予抗原識別且藉由形成TCR分子之結合位點來決定肽特異性。通常，如同免疫球蛋白一般，CDR由框架區(FR)隔開(例如，參見Jores等人，PNAS U.S.A . 87:9138, 1990；Chothia等人，EMBO J . 7:3745, 1988；亦參見Lefranc等人，Dev. Comp. Immunol . 27:55, 2003)。在一些實施例中，CDR3係負責識別經處理抗原之主要CDR，但α鏈之CDR1亦顯示可與抗原性肽之N-末端部分相互作用，而β鏈之CDR1與該肽之C-末端部分相互作用。CDR2被認為可識別MHC分子。在一些實施例中，β鏈之可變區可含有另一超變性(HV4)區。在一些實施例中，TCR鏈含有恆定結構域。舉例而言，如同免疫球蛋白一般，TCR鏈(例如，a鏈、β鏈)之細胞外部分可含有兩個免疫球蛋白結構域，即在N-末端之可變結構域(例如，V_a 或Vp；通常基於Kabat編號之胺基酸1至116，Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991，第5版)，及一個與細胞膜毗鄰之恆定結構域(例如，a鏈恆定結構域或C_a ，通常基於Kabat之胺基酸117至259，β鏈恆定結構域或Cp，通常基於Kabat之胺基酸117至295)。舉例而言，在一些情形中，藉由兩條鏈形成之TCR之細胞外部分含有兩個膜近端恆定結構域，及兩個含有CDR之膜遠端可變結構域。TCR結構域之恆定結構域含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，構成兩條鏈之間之連接。在一些實施例中，TCR可在α及β鏈之每一者中具有另一半胱胺酸殘基，使得TCR在恆定結構域中含有兩個二硫鍵。在一些實施例中，TCR鏈可含有跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域帶正電荷。在一些情形中，TCR鏈含有胞質尾區。在一些情形中，該結構容許TCR與其他分子(如CD3)締合。舉例而言，含有具有跨膜區之恆定結構域之TCR可將蛋白質錨定於細胞膜中並與CD3信號傳導器或複合物之不變亞單元締合。通常，CD3係多蛋白複合物其可具有哺乳動物中之三條不同鏈(γ、δ及ε)及ζ鏈。舉例而言，在哺乳動物中，該複合物可含有CD3y鏈、CD35鏈、兩條CD3s鏈及CD3ζ鏈之同二聚體。CD3y、CD35及CD3s鏈係含有單一免疫球蛋白結構域之免疫球蛋白超家族之高度相關之細胞表面蛋白。CD3y、CD35及CD3s鏈之跨膜區帶負電荷，其係容許該等鏈與帶正電荷之T細胞受體鏈締合之特徵。CD3y、CD35及CD3s鏈之胞內尾各自含有稱為免疫受體酪胺酸基活化基序或ITAM之單一保守基序，而各CD3ζ鏈具有三個。通常，ITAM參與TCR複合物之信號傳導能力。該等附加分子具有帶負電荷之跨膜區且在將信號自TCR傳播至細胞中發揮作用。CD3鏈及ζ鏈與TCR一起形成稱為T細胞受體複合物者。在一些實施例中，TCR可為兩條鏈α及β (或視情況γ及δ)之異二聚體或其可為單鏈TCR構築體。在一些實施例中，TCR係含有兩條例如藉由一或多個二硫鍵連接之單獨鏈(α及β鏈或γ及δ鏈)之異二聚體。在一些實施例中，鑑別靶抗原(例如，癌症抗原)之TCR並將其引入細胞中。在一些實施例中，編碼TCR之核酸可例如藉由可公開獲得之TCR DNA序列之聚合酶鏈式反應(PCR)擴增自多個來源獲得。在一些實施例中，TCR係自生物來源獲得，例如來自細胞，例如T細胞(例如細胞毒性T細胞)、T細胞雜交瘤或其他可公開獲得之來源。在一些實施例中，T細胞可自活體內分離之細胞獲得。在一些實施例中，高親和性T細胞純系可自患者分離，且TCR分離。在一些實施例中，T細胞可為培養T細胞雜交瘤或純系。在一些實施例中，靶抗原之TCR純系係在經人類免疫系統基因(例如，人類白血球抗原系統或HLA)工程化之轉基因小鼠中生成。例如，參見腫瘤抗原(例如，參見Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res . 15: 169-180及Cohen等人(2005)J Immunol. 175:5799-5808。在一些實施例中，使用噬菌體展示來分離針對靶抗原之TCR (例如，參見Varela-Rohena等人(2008)Nat Med . 14: 1390-1395及Li (2005)Nat Biotechnol . 23:349-354。在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分可根據對TCR序列之瞭解以合成方式生成。3. 抗原呈遞細胞 抗原呈遞細胞包括巨噬細胞、B淋巴球及樹突細胞，其係依據其特定MHC分子之表現來區分。APC內化抗原並與其外層細胞膜上之MHC分子一起重表現該抗原之一部分。主要組織相容性複合體(MHC)係具有多個基因座之大型基因複合物。MHC基因座編碼兩個主要類別之MHC膜分子，成為I類及II類MHC。T輔助淋巴球通常識別與MHC II類分子締合之抗原，且T細胞毒性淋巴球識別與MHC I類分子締合之抗原。在人類中，將MHC稱為HLA複合物，且在小鼠中稱為H-2複合物。在一些情形中，aAPC可用於製備實施例之治療組合物及細胞治療產物。關於抗原呈遞系統之製備及使用之通用指南參見例如美國專利第6,225,042號、第6,355,479號、第6,362,001號及第6,790,662號；美國專利申請公開案第2009/0017000號及第2009/0004142號；及國際公開案第WO2007/103009號。 aAPC系統可包含至少一個外源輔助分子。可採用輔助分子之任何適宜數目及組合。輔助分子可選自諸如共刺激分子及黏著分子等輔助分子。實例性共刺激分子包括CD86、CD64 (FcγRI)、41BB配體及IL-21。黏著分子可包括結合碳水化合物之醣蛋白(例如選擇蛋白)、跨膜結合醣蛋白(例如整聯蛋白)、鈣依賴蛋白(例如鈣黏蛋白)及單次跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白(例如細胞間黏著分子(ICAM)，其促進例如細胞間接觸或細胞-基質接觸)。實例性黏著分子包括LFA-3及ICAM (例如ICAM-1)。可用於實例性輔助分子(包括共刺激分子及黏著分子)之選擇、選殖、製備及表現之技術、方法及試劑例示於例如美國專利第6,225,042號、第6,355,479號及第6,362,001號中。III. 治療方法 本文進一步提供用於治療個體之癌症或延遲其進展之方法，其包含向該個體投與有效量之T細胞療法，例如表現膜錨定IL-12之T細胞及/或已經活化以表現NKG2D之T細胞。治療所涵蓋之癌症的實例包括肺癌、頭頸癌、乳癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、子宮頸癌、胃腸癌症、淋巴瘤、肺中之腫瘤發生前病灶、結腸癌、黑色素瘤及膀胱癌。在一些實施例中，個體患有抵抗(已證實可抵抗)一或多種抗癌症療法之癌症。在一些實施例中，對抗癌症療法之抵抗包括癌症復發或難治性癌症。復發可係指在治療後在初始位點或新位點，癌症重新出現。在一些實施例中，對抗癌症療法之抵抗包括癌症在用該抗癌症療法治療期間之進展。在一些實施例中，癌症處於早期或晚期。在一些實施例中，向個體投與化學治療劑與T細胞療法之組合。舉例而言，化學治療劑可為多柔比星(Dox)或環磷醯胺。個體可用化學治療劑(例如多柔比星或其他T細胞招募誘導物)預治療。預治療可在T細胞療法之前16-24小時進行。在一些實施例中，T細胞係自體的。然而，若剔除內源TCR，則細胞可為同種異體。在一些實施例中，T細胞係自患者自身分離，使得細胞係自體的。若T細胞為同種異體，則需要移除內源TCR。將細胞以足以控制、減少或消除所治療疾病之症狀及徵象之量投與目標個體。治療有效性可藉由熟習此項技術者已知之多種方法來量測。在一個實施例中，使用白血球計數(WBC)來測定個體免疫系統之反應性。WBC量測個體之白血球數。使用業內熟知之方法，將個體血樣中之白血球與其他血細胞分離並計數。白血球之正常值為約4,500至約10,000個白血球/μl。白血球數較低可指示個體之免疫抑制狀態。在另一實施例中，個體之免疫抑制可使用T-淋巴球技術來測定。使用業內熟知之方法，將個體血樣中之白血球與其他血細胞分離。使用業內標準方法區分T-淋巴球與其他白血球，例如免疫螢光或FACS。可使用減少之T細胞或特定T細胞群體之數目作為免疫抑制之量測。與治療前T細胞數(或特定群體中之細胞數)相比，T細胞或特定T細胞群體之數目之減少可用於指示，已誘導免疫抑制。在其他實施例中，實施測試以量測T細胞活化、增殖或細胞介素反應，包括針對特定抗原之彼等。在一些實例中，可在來自個體之樣品中量測Treg或Breg細胞數。在其他實例中，在來自個體之樣品中量測細胞介素，例如IL-10。在其他實例中，為評價發炎，可量測發炎位點之嗜中性球浸潤。為評價嗜中性球浸潤，可量測髓過氧化酶活性。髓過氧化酶係存於多型核白血球及單核球之嗜苯胺顆粒中之血紅素蛋白。其催化鹵素離子氧化為其各別次鹵酸，其用於吞噬細胞之微生物殺死。因此，組織中髓過氧化酶活性之下降反映嗜中性球浸潤減少，且可用作發炎抑制之量度。在另一實例中，可藉由量測個體之細胞介素含量來分析個體之有效治療。藉由習用方法來測定體液或細胞樣品中之細胞介素含量。舉例而言，可使用免疫斑點分析，例如酶聯免疫斑點或「ELISPOT」分析。免疫斑點分析係高度靈敏之定量分析，用於檢測單細胞層面之細胞介素分泌。免疫斑點方法及應用為業內所熟知且闡述於例如以下文獻中：Czerkinsky等人，1988；Olsson等人，1990；及EP 957359。標準免疫斑點分析之變化形式為業內所熟知且可在該公開之方法中用於檢測細胞介素產生之變化(例如，參見美國專利第5,939,281號及美國專利第6,218,132號)。在一些實施例中，可在T細胞療法之前向個體投與非清髓性淋巴清除化學療法。非清髓性淋巴清除化學療法可為任何適宜的此類療法，其可藉由任何適宜途徑投與。尤其在癌症係可轉移之黑色素瘤時，非清髓性淋巴清除化學療法可包含例如投與環磷醯胺及氟達拉濱。投與環磷醯胺及氟達拉濱之實例性途徑係靜脈內。同樣，可投與任何適宜劑量之環磷醯胺及氟達拉濱。在特定態樣中，投與約60 mg/kg環磷醯胺2天，之後投與約25 mg/m² 氟達拉濱5天。在某些實施例中，將促進自體T細胞生長及活化之T細胞生長因子與自體T細胞並行投與個體或在自體T細胞之後投與。T細胞生長因子可為促進自體T細胞生長及活化之任何適宜生長因子。適宜T細胞生長因子之實例包括介白素(IL)-2、IL-7、IL-15及IL-12，其可單獨或以各種組合使用，例如IL-2及IL-7、IL-2及IL-15、IL-7及IL-15、IL-2、IL-7及IL-15、IL-12及IL-7、IL-12及IL-15或IL-12及IL2。IL-12係較佳T細胞生長因子。明確涵蓋腫瘤內注射或注射至腫瘤血管系統中用於離散、實體、可及腫瘤。局部、區域性或全身投與亦可係適當的。對於＞4 cm之腫瘤，欲投與體積將為約4-10 ml (特定而言10 ml)，而對於＜4 cm之腫瘤，將使用約1-3 ml之體積(特定而言3 ml)。作為單一劑量遞送之多次注射包含約0.1至約0.5 ml體積。B. 醫藥組合物 本文亦提供包含T細胞療法及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物及調配物。如本文所述之醫藥組合物及調配物可藉由混合具有期望純度之活性成分(例如抗體或多肽)與一或多種醫藥上可接受之可選載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第22版，2012)來製備，其呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶中性-活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶PH-20透明質酸酶醣蛋白，例如rHuPH20 (HYLENEX^® , Baxter International, Inc.)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種其他糖胺聚醣酶(例如軟骨素酶)組合。C. 額外療法 在某些實施例中，本發明實施例之組合物及方法涉及例如表現膜錨定IL-12及/或表現NKG2D之T細胞群體與至少一種額外療法之組合。額外療法可為放射療法、手術(例如，乳房腫瘤切除術及乳房切除術)、化學療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或前述療法之組合。額外療法可呈輔助或前導性療法形式。 T細胞療法可在相對於額外療法(例如多柔比星)之前、期間、之後或以多種組合來投與。投與可具有介於同時至數分鐘至數天至數週範圍內之間隔。在將T細胞療法與額外治療劑分開提供給患者之實施例中，通常可確保每次遞送時間之間不會間隔長時間段，使得兩種化合物仍可發揮對患者有利之組合效應。在該等情況下，預期可向患者提供T細胞療法及抗癌症療法，彼此相隔約12至24或72 h內，且更特定而言彼此相隔約6-12 h內。在一些情況下，可期望顯著延長治療時間段，其中在各別投與之間推移數天(2、3、4、5、6或7)至數週(1、2、3、4、5、6、7或8)。 T細胞療法及額外治療劑可藉由相同投與途徑或藉由不同投與途徑來投與。在一些實施例中，T細胞療法及/或抗血小板劑係靜脈內、肌內、皮下、局部、經口、經皮、腹膜內、眶內、藉由植入、藉由吸入、鞘內、室內或鼻內投與。可投與有效量之T細胞療法及額外治療劑以供預防或治療疾病。T細胞療法及額外治療劑之適當劑量係基於以下來確定：欲治療疾病之類型、疾病之嚴重程度及病程、個體之臨床狀況、個體之病史及對治療之反應以及主治醫師之慎重考慮。在一些實施例中，額外療法係投與小分子酶抑制劑或抗轉移劑。在一些實施例中，額外療法係投與副作用限制劑(例如，意欲減輕治療副作用之出現及/或嚴重程度之藥劑，例如抗噁心劑等)。在一些實施例中，額外療法係放射療法。在一些實施例中，額外療法係手術。在一些實施例中，額外療法係放射療法與手術之組合。在一些實施例中，額外療法係γ輻照。在一些實施例中，額外療法係靶向PBK/AKT/mTOR路徑之療法、HSP90抑制劑、微管蛋白抑制劑、細胞凋亡抑制劑及/或化學預防劑。額外療法可為業內已知一或多種化學治療劑。可採用多種組合。對於下文實例，T細胞療法為「A」且額外治療劑為「B」： A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A 將本發明實施例之任何化合物或療法投與患者將遵循投與該等化合物之一般方案，慮及該等藥劑之毒性(若存在)。因此，在一些實施例中，存在監測可歸因於組合療法之毒性之步驟。1. 化學療法 根據本發明實施例可使用眾多種化學治療劑。術語「化學療法」係指使用藥物治療癌症。「化學治療劑」用於意指在癌症治療中投與之化合物或組合物。該等藥劑或藥物係依據其在細胞內之活性模式來歸類，例如其是否及在哪個階段影響細胞週期。或者，藥劑可基於其直接交聯DNA、嵌入DNA中或藉由影響核酸合成來誘導染色體及有絲分裂畸變之能力來表徵。化學治療劑之實例包括烷基化劑，例如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)及脲多巴(uredopa)；次乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；番荔枝內酯(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利斯他汀(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻素(cryptophycin，尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin，包括合成類似物、KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，例如氮芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺、甲基二氯乙基胺、鹽酸氧氮芥、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)及尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γlI及卡奇黴素ωI1)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，例如氯膦酸；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authrarnycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素類(chromomycinis)、放線菌素D、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星及去氧多柔比星)、泛艾黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)，例如絲裂黴素C、黴酚酸、諾拉黴素(nogalarnycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如胺甲喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸、蝶羅呤(pteropterin)及三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-阿紮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睪內酯(testolactone)；抗腎上腺藥，例如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺醣苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹單莫(mopidanmol)；硝胺丙吖啶(nitraerine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西左非蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene，尤其T-2毒素、疣皰菌素(verracurin) A、桿孢菌素(roridin) A及蛇形菌素(anguidine))；胺甲酸酯；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西他賽吉西他濱(docetaxel gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；鉑配位錯合物，例如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide，VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan，例如，CPT-11)；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、普卡黴素(plicomycin)、吉西他濱(gemcitabien)、溫諾平(navelbine)、法尼基-蛋白轉移酶抑制劑、反鉑(transplatinum)及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。2. 放射療法 引起DNA損傷且已廣泛使用之其他因素包括一般稱為γ射線、X射線者及/或將放射性同位素直接遞送至腫瘤細胞。亦涵蓋DNA損傷因素之其他形式，例如微波、質子束輻照(美國專利5,760,395及4,870,287)及UV輻照。最可能地，所有該等因素皆影響對DNA、對DNA前體、對DNA複製及修復及對染色體裝配及維持之眾多種損傷。X射線之劑量範圍介於50至200侖琴之日劑量達延長時間段(3至4週)至2000至6000侖琴之單一劑量範圍內。放射性同位素之劑量範圍變化範圍寬，且取決於同位素之半衰期、所發射輻射之強度及類型及腫瘤細胞之攝取。3. 免疫療法 熟習此項技術者將理解，額外免疫療法可與實施例之方法組合或結合使用。在癌症治療情況下，免疫治療劑通常依賴於使用免疫效應物細胞及分子來靶向並破壞癌細胞。利妥昔單抗(Rituximab，RITUXAN®)係此一實例。免疫效應物可為例如對腫瘤細胞表面上之某一標記物具有特異性之抗體。單獨之抗體可用作療法之效應物，或其可招募其他細胞以實際影響細胞殺死。抗體亦可偶聯至藥物或毒素(化學治療劑、放射性核種、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)並用作靶向劑。或者，效應物可為攜載與腫瘤細胞靶直接或間接相互作用之表面分子之淋巴球。各種效應物細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。抗體-藥物偶聯物作為突破性方法出現用於研發癌症治療劑。癌症係世界上之主要死因之一。抗體-藥物偶聯物(ADC)包含共價連接至殺死細胞之藥物之單株抗體(MAb)。此方法組合MAb針對其抗原靶之高特異性與高潛在細胞毒性藥物，得到將酬載(藥物)遞送至具有富集抗原含量之腫瘤細胞之「武裝(armed)」 MAb (Carter等人，2008；Teicher等人，2014；Leal等人，2014)。藥物之靶向遞送亦使其在正常組織中之暴露降至最低，從而降低毒性並提高治療指數。FDA批准兩種ADC藥物，即ADCETRIS® (貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))於2011年及KADCYLA® (曲妥珠單抗艾坦辛(trastuzumab emtansine)或T-DM1)於2013年，驗證了該方法。目前在癌症治療臨床試驗之各個階段中有多於30種候選ADC藥物(Leal等人，2014)。隨著抗體工程化及連接體-酬載最佳化變得愈來愈成熟，新ADC之發現及研發逐漸依賴於適用於此方法之新靶之鑑別及驗證(Teicher等人，2009)及靶向MAb之生成。ADC靶之兩個準則係在腫瘤細胞中之上調/高表現程度及穩健內化。在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須帶有適於靶向，即在大多數其他細胞上不存在之某一標記物。存在多種腫瘤標記物且在本發明實施例之情況下該等標記物中之任一者適於靶向。常見腫瘤標記物包括CD20、癌胚抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、層黏蛋白受體、erb B及p155。免疫療法之替代性態樣係組合抗癌效應與免疫刺激性效應。免疫刺激分子亦存在，包括：細胞介素，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趨化介素，例如MIP-1、MCP-1、IL-8；及生長因子，例如FLT3配體。目前在研究或在使用中之免疫療法之實例係免疫佐劑，例如牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯及芳香族化合物(美國專利5,801,005及5,739,169；Hui及Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；細胞介素療法，例如干擾素α、β及γ、IL-1、GM-CSF及TNF (Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因療法，例如TNF、IL-1、IL-2及p53 (Qin等人，1998；Austin-Ward及Villaseca，1998；美國專利5,830,880及5,846,945)；及單株抗體，例如抗CD20、抗神經節苷酯GM2及抗p185 (Hollander，2012；Hanibuchi等人，1998；美國專利5,824,311)。預期一或多種抗癌症療法可與本文所述抗體療法一起使用。在一些實施例中，免疫療法可為免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點係免疫系統調節劑，其調高信號(例如，共刺激分子)或調低信號。可由免疫檢查點阻斷劑靶向之抑制性檢查點包括腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3 (亦稱為CD276)、B及T淋巴球衰減劑(BTLA)、細胞毒性T-淋巴球相關蛋白4 (CTLA-4，亦稱為CD152)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、殺手細胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴球活化基因-3 (LAG3)、程式化死亡1 (PD-1)、T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (TIM-3)及T細胞活化之V-結構域Ig抑制劑(VISTA)。特定而言，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1軸及/或CTLA-4。免疫檢查點抑制劑可為藥物，例如小分子、配體或受體之重組體形式、或特定而言係抗體，例如人類抗體(例如，國際專利公開案WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012；皆以引用方式併入本文中)。可使用免疫檢查點蛋白或其類似物之已知抑制劑，特定而言可使用抗體之嵌合、人類化或人類形式。如熟習此項技術者將瞭解，本發明中提及之某些抗體可使用替代性及/或等效名稱。該等替代性及/或等效名稱在本發明情況下可互換。舉例而言，已知蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)亦稱為替代性等效名稱MK-3475及派姆單抗(pembrolizumab)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抑制PD-1結合至其配體結合配偶體之分子。在具體態樣中，PD-1配體結合配偶體係PDL1及/或PDL2。在另一實施例中，PDL1結合拮抗劑係抑制PDL1結合至其結合配偶體之分子。在具體態樣中，PDL1結合配偶體係PD-1及/或B7-1。在另一實施例中，PDL2結合拮抗劑係抑制PDL2結合至其結合配偶體之分子。在具體態樣中，PDL2結合配偶體係PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。實例性抗體闡述於美國專利第US8735553號、第US8354509號及第US8008449號，其皆係以引用方式併入本文中。用於本文所提供方法中之其他PD-1軸拮抗劑為業內已知，例如闡述於美國專利申請案第US20140294898號、第US2014022021號及第US20110008369號中，其皆係以引用方式併入本文中。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抗PD-1抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)。在一些實施例中，抗PD-1抗體選自由以下組成之群：尼沃魯單抗(nivolumab)、派姆單抗及CT-011。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係免疫黏附素(例如，免疫黏附素，其包含融合至恆定區(例如，免疫球蛋白序列之Fc區)之PDL1或PDL2之細胞外或PD-1結合部分)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係AMP-224。尼沃魯單抗亦稱為MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO^® ，係WO2006/121168中所述之抗PD-1抗體。派姆單抗亦稱為MK-3475、Merck 3475、蘭布魯珠單抗、KEYTRUDA^® 及SCH-900475，係WO2009/114335中所述之抗PD-1抗體。CT-011亦稱為hBAT或hBAT-1，係WO2009/101611中所述之抗PD-1抗體。AMP-224亦稱為B7-DCIg，係WO2010/027827及WO2011/066342中所述之PDL2-Fc融合可溶受體。本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點係細胞毒性T-淋巴球相關蛋白4 (CTLA-4)，亦稱為CD152。人類CTLA-4之完整cDNA序列具有基因庫登錄號L15006。CTLA-4發現於T細胞表面上且在結合至抗原呈遞細胞表面上之CD80或CD86時用作「關閉」開關。CTLA4係在輔助T細胞表面上表現之免疫球蛋白超家族之成員且將抑制信號傳遞至T細胞。CTLA4類似於T細胞共刺激蛋白CD28，且兩種分子皆結合至抗原呈遞細胞上之CD80及CD86 (分別亦稱為B7-1及B7-2)。CTLA4將抑制信號傳遞至T細胞，而CD28傳遞刺激信號。細胞內CTLA4亦發現於調節T細胞中且可對其功能很重要。經由T細胞受體及CD28之T細胞活化導致CTLA-4 (B7分子之抑制性受體)之表現增加。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。適用於本發明方法之抗人類-CTLA-4抗體(或自其衍生之VH及/或VL結構域)可使用業內熟知之方法生成。或者，可使用業內公認之抗CTLA-4抗體。舉例而言，在本文所揭示方法中可使用以下文獻中揭示之抗CTLA-4抗體：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504 (CP675,206亦稱為曲美目單抗(tremelimumab)；之前稱為替西木單抗(ticilimumab))、美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071；Camacho等人(2004) J Clin Oncology 22(145)：文摘號2505 (抗體CP-675206)；及Mokyr等人(1998) Cancer Res 58:5301-5304。上文所提及之出版物各自之教示係以引用方式併入本文中。亦可使用與該等業內公認抗體之任一者競爭結合至CTLA-4之抗體。舉例而言，人類化CTLA-4抗體闡述於國際專利申請案第WO2001014424號、第WO2000037504號及美國專利第US8017114號中；其皆係以引用方式併入本文中。實例性抗CTLA-4抗體係伊匹單抗(ipilimumab，亦稱為10D1、MDX-010、MDX-101及Yervoy®)或其抗原結合片段及變體(例如，參見WOO 1/14424)。在其他實施例中，抗體包含伊匹單抗之重鏈及輕鏈CDR或VR。因此，在一個實施例中，抗體包含伊匹單抗VH區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，及伊匹單抗VL區之CDR1、CDR2及CDR3結構域。在另一實施例中，抗體競爭結合及/或結合至與上文所提及之抗體相同之CTLA-4上之表位。在另一實施例中，抗體與上文所提及之抗體具有至少約90%可變區胺基酸序列一致性(例如，與伊匹單抗之至少約90%、95%或99%可變區一致性)。用於調節CTLA-4之其他分子包括例如美國專利第US5844905號、第US5885796號及國際專利申請案第WO1995001994號及第WO1998042752號(其皆以引用方式併入本文中)中所述之CTLA-4配體及受體；以及例如以引用方式併入本文中之美國專利第US8329867號中所述之免疫黏附素。4. 手術約60%癌症患者將經歷某種類型之手術，包括預防性、診斷性或分期、治癒性及姑息性手術。治癒性手術包括切除術，其中物理移除、切除及/或破壞全部或部分癌組織且可結合其他療法使用，例如本發明實施例之治療、化學療法, 放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或另類療法。腫瘤切除術係指物理移除至少部分腫瘤。除了腫瘤切除術以外，手術治療包括雷射手術、低溫手術、電手術及顯微控制手術(莫氏手術(Mohs’ surgery))。在切除部分或全部癌細胞、組織或腫瘤後，可在體內形成空腔。治療可藉由用額外抗癌症療法對該區域進行灌注、直接注射或局部施加來完成。該治療可例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4及5週或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月重複進行。該等治療亦可使用變化劑量。5. 其他藥劑 預期其他藥劑可與本發明實施例之某些態樣組合用於改良治療之治療效能。該等額外藥劑包括影響細胞表面受體及隙型連結之上調之藥劑、細胞生長抑制及分化劑、細胞黏著抑制劑、增加過度增殖細胞對細胞凋亡誘導物之敏感性之藥劑或其他生物藥劑。藉由增加隙型連結數來增加細胞間信號傳導會提高對相鄰過度增殖細胞群之抗過度增殖效應。在其他實施例中，細胞生長抑制或分化劑可與本發明實施例之某些態樣組合用於改良治療之抗過度增殖效能。預期細胞黏著抑制劑可改良本發明實施例之效能。細胞黏著抑制劑之實例係點狀黏著激酶(FAK)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。進一步預期，增加過度增殖細胞對細胞凋亡之敏感性之其他藥劑(例如抗體c225)可與本發明實施例之某些態樣組合用於改良治療效能。IV. 製品或套組 本文中亦提供製品或套組，其包含表現膜錨定IL-12及/或NKG2D之T細胞。製品或套組可進一步包含包裝插頁，其包含使用過繼性T細胞視情況結合額外治療劑(例如，多柔比星)治療個體之癌症或延遲其進展或增強患有癌症之個體之免疫功能之說明書。本文所述過繼性T細胞及/或額外治療劑中任一者可包括於製品或套組中。在一些實施例中，過繼性T細胞及額外治療劑處於同一容器或分開容器中。適宜容器包括例如瓶子、小瓶、包及注射器。容器可自多種材料形成，例如玻璃、塑膠(例如聚氯乙烯或聚烯烴)或金屬合金(例如不銹鋼或哈氏合金(hastelloy))。在一些實施例中，容器容納調配物，且容器上或與容器連接之標記可指示使用指導。製品或套組可進一步包括自商業及使用者立場可期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明之包裝插頁。在一些實施例中，製品進一步包括一或多種另一藥劑(例如，化學治療劑及抗腫瘤劑)。適用於一或多種藥劑之容器包括例如瓶子、小瓶、包及注射器。V. 實例本發明包括以下實例來顯示本發明之較佳實施例。彼等熟習此項技術者應瞭解，下文實例中揭示之技術代表本發明者發現在本發明實踐中作用良好之技術，且因此可視為構成本發明實踐之較佳模式。然而，彼等熟習此項技術者根據本揭示內容應瞭解，可在不背離本發明之精神及範圍之情況下對所揭示具體實施例作出多種改變，且仍獲得相似或類似結果。實例 1 - T 細胞膜上 IL-12 之表現促進 T 細胞浸潤至實體腫瘤中 為達成IL12之T細胞膜表現，生成IL-12膜錨定蛋白融合基因。具體而言，p35經膜錨定序列(加下劃線)修飾。PCMV-hP35-TM-pA之構築體後係標準p40表現單元。p35融合蛋白序列具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:1)： MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQEREL p40蛋白具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:4)：P40 亞單元 MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS attIL12 T細胞係藉由經由電穿孔使用電穿孔器將IL12-膜錨定蛋白融合基因質體轉染至CD8⁺ T細胞中來獲得。在電穿孔後attIL12之表現持續時間係在4-6小時檢測且在24小時中達到峰值，但小部分attIL12-T細胞可持續超過4天(表1)。轉染後24小時，T細胞上attIL12之表現。使經轉染T細胞在載玻片上旋轉，固定並針對細胞膜上之IL-12 p40染色。觀察到7%之CD8⁺ T細胞表現膜attIL-12 (圖3)。基於多個獨立轉染研究，轉染效率在3-10%之間之範圍內變化。表1：attIL-12質體之轉染效率。隨後，實施研究以表徵attIL12 T細胞。將T細胞(2.5 × 10⁶ )用2 µg質體轉染且在1 ml RPMI/Click培養基中培育4或24小時。收集培養基並使用ELISA分析IL12及IFN-γ之存在。在wtIL-12轉染後於培養基中檢測到高IL-12含量，但在4h及24h兩個時間點藉由attIL-12轉染不可檢測。WtIL-12轉染之T細胞亦產生與attIL-12轉染之T細胞相比略高之IFNγ含量(圖4)。在 attIL-12-T 細胞輸注前用多柔比星治療增強抗腫瘤治療效能： 將NSG小鼠用5×10⁶ 個A549細胞皮下接種，且在接種後第12天經歷第一次治療，之後在第37天及第58天經歷另外兩次治療。所有小鼠皆接受在用對照DNA (ctrlDNA)、野生型IL12 (wtIL12)或膜錨定IL12 (attIL12)修飾後之T細胞治療(每次輸注投與2.5×10⁶ 個T細胞)。多柔比星(Dox)係在T細胞投與前一天投與。每週兩次量測腫瘤體積。結果顯示，attIL-12-T細胞轉移加Dox治療有效抑制腫瘤發展且延長存活時間。重要的是，在無或有Dox治療之情況下，attIL12 T細胞療法皆顯著勝過wtIL12 T細胞療法(圖6)。自腫瘤邊緣3-5 mm收集A549腫瘤切片，使其經歷抗人類CD3及AF488抗兔抗體染色。該等影像表示各切片之中心。T細胞滲透發現於經Dox之後輸注經擴增T細胞(Dox+T)、輸注attIL-12-T細胞(attIL-12-T)及輸注attIL-12加事先Dox處理(attIL-12-T+Dox)治療之腫瘤中。僅輸注對照T細胞(pCtrl-T)或野生型IL-12修飾T細胞(wtIL-12-T)未產生任何可檢測T細胞滲透(圖1)。遠離腫瘤邊緣且朝向腫瘤中心超過5 mm收集之A549腫瘤切片經歷T細胞染色。僅attIL-12-T細胞轉移加事先多柔比星處理顯示所輸注T細胞之深度腫瘤浸潤(圖2)。AttIL-12-T 細胞輸注可減少 wtIL-12 誘導之細胞毒性細胞介素： 在T細胞轉移後量測血清中之發炎性細胞介素。在第二次治療後4天收集血液，且使用ELISA測試血清中之IL-6、TNFα及IFNγ含量。IL-6及TNFα在任一治療組中皆無法檢測。然而，與attIL-12-T或attIL-12-T加多柔比星相比，wtIL-12-T細胞轉移誘導血液中顯著較高之IFNγ含量。因此，attIL-12亦降低細胞介素風暴(cytokine storm)之風險，此乃因attIL12 T細胞不誘導風暴觸發劑IFNγ。重要的是，IFNγ亦誘導抑制T細胞功能之PD-L1表現。在用對照或attIL-12-T加多柔比星治療後，測試A549腫瘤之T細胞吸引趨化介素之mRNA表現。attIL-12-T加多柔比星在腫瘤中顯著誘導CXCL9、CXCL10及CCL17 (圖9)。趨化介素誘導解釋T細胞滲透至實體腫瘤中。AttIL-12 T 細胞輸注加多柔比星導致大型 (6-8mm) 及侵襲性實體 PDX 腫瘤消退： 向裸小鼠皮下植入結腸癌PDX腫瘤，且其在腫瘤直徑為6-8 mm時經歷第一次治療，之後在第28天進行另一次治療。所有小鼠皆接受在用對照DNA (ctrlDNA)、野生型IL12 (wtIL12)或膜錨定IL-12 (attIL12)修飾後之T細胞治療。多柔比星(Dox)係在T細胞投與前一天投與。每週兩次量測腫瘤體積。結果顯示，attIL-12-T細胞轉移加Dox治療有效抑制腫瘤發展並延長存活時間(圖7)。觀察到在每次投與中需要最少3-20% attIL-12陽性T細胞以達成實體腫瘤滲透。AttIL-12-T 細胞輸注 (1×10⁷ 個細胞 ) 加多柔比星可穩定化超大 (16-18 mm) PDX 腫瘤： 超大(直徑16-18mm) PDX腫瘤經歷對照T細胞或attIL-12-T加多柔比星治療。與僅對照T細胞療法相比，attIL-12 T細胞加多柔比星治療穩定化腫瘤進展(圖8)。藉由誘導 CD28 及減少經浸潤 T 細胞上之 PD-1 來改良腫瘤微環境中 T 細胞性質： PDX腫瘤在對照T細胞或attIL-12-T加多柔比星治療後經歷流式細胞術以測試腫瘤浸潤之淋巴球上CD28及PD-1之表現。與對照T治療相比，attIL-12-T加多柔比星誘導共刺激受體CD28表現，且同時減少檢查點調節劑PD-1。另外，誘導細胞毒性T細胞配體及受體。因此，多柔比星上調T細胞吸引細胞介素。同樣，經滲透T細胞具有低程度之耗竭標記物Lag3表現，此與此標記物在對照組中之高表現程度相反。值得注意，NKG2D配體在第二次治療後亦較高。因此，顯示錨定在T細胞膜上之attIL-12 T細胞療法IL-12具有增強之抗腫瘤性質。另外發現，在投與attIL12 T細胞之前(例如，16-24小時)添加多柔比星(Dox)顯著加強attIL12 T細胞滲透至實體腫瘤中。多柔比星及attIL-12-T細胞之此依序投與容許避免T細胞死亡及腫瘤滲透二者(統稱為iTIL)，此乃因浸潤至腫瘤中之T細胞係藉由此治療而非藉由天然T細胞來誘導。實例 2 - 慢病毒 attIL-12 T 細胞之表徵 為進一步表徵attIL-12 T細胞之有效性，使用結腸腺癌小鼠模型。在NSG小鼠中經由皮下注射接種5×10⁶ 個HT29細胞。治療在腫瘤直徑達到1.0 cm時開始。3次投與多柔比星後，在第13/14天、第27/28天及第36/37天進行T細胞轉移。T細胞在T細胞輸注前24h經慢-對照或慢-attIL-12病毒感染。在輸注前6小時用attIL-12經由電穿孔轉染T細胞。pCtrl-T+Dox及0.5百萬attIL-12-T+Dox未能延遲腫瘤進展。與之相比，2.5百萬及1百萬慢病毒attIL-12感染之T細胞加多柔比星引起腫瘤消退(圖12)。對帶有大型HT29腫瘤之小鼠實施血液化學分析，包括以下之含量：白蛋白、鹼性磷酸酶、ALT、AST、BUN、肌酸酐、球蛋白及總蛋白(圖14及圖17)。儘管與正常基線值相比，attIL-12 T細胞治療之小鼠具有略微增加之AST及球蛋白，但對照T細胞治療之小鼠具有異常高之ALT、AST、BUN及肌酸酐含量，表明肝及腎損傷。然而，未觀察到attIL12 T細胞治療之小鼠具有異常升高含量，指示attIL-12 T細胞不引起肝或腎損傷。為測試輸注後T細胞分佈，使帶有HT29腫瘤之小鼠經歷假治療、慢-對照-T+Dox及慢-attIL-12-T+Dox之單一治療。在治療後1天、3天及7天將小鼠安樂死。attIL-12-T+Dox誘導腫瘤消退(圖15)，如在早期研究中觀察到者。T細胞分佈分析顯示，在第1天、第3天及第7天檢測到腫瘤中之CD4、CD8 T細胞以及NKG2D、CD28及CD39陽性T細胞及腫瘤細胞上之CD80表現。早在治療後1天，attIL-12-T+Dox即增強腫瘤中之CD28陽性T細胞累積。在第7天，attIL-12-T+Dox亦誘導腫瘤中顯著增加之CD8 T細胞累積以及NKG2D陽性T細胞。CD39在第3天在T細胞上上調，但在第7天下降至基線含量。有趣地，早在第1天，attIL-12-T+Dox即在腫瘤細胞上顯著誘導CD80 (圖16)。亦對帶有HT29腫瘤之小鼠實施免疫組織化學分析以測定不通器官中之T細胞分佈。經對照T細胞治療之小鼠之肺顯示T細胞之顯著累積。另一方面，觀察到經attIL-12 T細胞治療之小鼠在肺中僅累積少量T細胞(圖18及圖19)。實際上，在第7天在attIL-12 T細胞治療之小鼠之肺中未發現T細胞(圖18C)。因此，與對照慢病毒T細胞治療相比，在用慢病毒attIL-12 T細胞治療後，細胞介素釋放症候群(CRS)之風險下降。實例 3 - NKG2D+CD8+ T 細胞介導之抗腫瘤免疫監督之調節 CD8⁺ T 細胞中之 CD28 活化觸發增加之 NKG2D 表現：先前研究顯示，可藉由IL-12加多柔比星治療在來自帶有腫瘤之小鼠之脾CD8⁺ T細胞表面上誘導NKG2D表現(圖20A)。然而，在帶有相同腫瘤模型之CD28-/-小鼠中，相同治療未能增大NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞亞群體(圖20A)。該等觀察結果得出如下假設：CD28共刺激可在CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現的調節中具有關鍵作用。為測試此假設，將自C57BL/6及CD28-/-帶腫瘤小鼠分離之脾細胞用抗CD3微珠預處理且給予對照Fc或CD80-Fc重組蛋白(CD28之生理配體)處理24 h。發現藉由CD80活化CD28顯著增加NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞群體。然而，此在CD28- CD8⁺ T細胞中未能複現(圖20B)，表明CD28活化可調節CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現。小鼠NKG2D受體僅在少數經活化小鼠CD8⁺ T細胞上瞬時表現。因此，嘗試測定CD8⁺ T細胞上NKG2D表現之持續時間。將幼稚CD8⁺ T細胞用抗CD3微珠預刺激24 h，然後用對照Fc或CD80-Fc處理1、2、3、4及5 d。發現CD80誘導之NKG2D表現在第4天達到峰值。與之相比，對照Fc僅誘導CD8⁺ T細胞上之NKG2D之基線表現(圖20C)。此外，每週兩次將CD80-Fc投與帶有LLC腫瘤之小鼠達2週顯著增加脾CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現(圖28)。該等活體內結果進一步確認，CD28活化誘導CD8⁺ T細胞上之持續NKG2D表現。與在小鼠中不同，人類NKG2D在CD8⁺ T細胞上更常表現，NKG2D表現可在離體增殖期間喪失。為測定CD28刺激是否在促進CD8⁺ T細胞上之人類NKG2D表現中具有重要作用，自健康供體之PBMC分離人類T細胞，用抗CD3微珠預處理，隨後用對照Fc或人類CD80-Fc刺激。儘管人類CD8⁺ T細胞上之NKG2D受體之表現高，但用CD80-Fc處理仍顯著升高NKG2D表現(圖21A)，此與在小鼠中所觀察到的一致。有趣的是，在時程研究中，發現用抗CD3微珠預刺激引發CD8⁺ T細胞上之NKG2D之基線表現，但在CD28刺激不存在時，NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞群體自第1天至第4天快速減少(圖21B)。顯著不同地，用CD80-Fc處理誘導CD8⁺ T細胞上之持續NKG2D表現且在第5天達到峰值(圖21B)。該等結果支持如下假設：CD28之活化對CD8⁺ T細胞上之持續NKG2D表現具有決定性。在 CD8⁺ T 細胞中在 CD28 活化後藉由 Lck/ZAP70 酪胺酸激酶級聯磷酸化 STAT3 ：由於NK細胞上之NKG2D表現受pSTAT3調節，下一問題係，pSTAT3表現在CD8⁺ T細胞中是否係由CD28活化誘導。為解決此問題，在與對照IgG或CD80-Fc一起培育15及30 min以及1及2 h之後，在小鼠及人類CD8⁺ T細胞二者中經由細胞內流式細胞染色量測pSTAT3表現。有趣地，CD80-Fc早在15 min時即觸發STAT3磷酸化(Y705)，而對照Fc未能如此(圖22A及B)。慮及CD8⁺ T細胞中之CD28活化導致STAT3磷酸化，欲測定CD28如何活化CD8⁺ T細胞中之JAK/STAT3信號傳導。在該等細胞中，共刺激受體CD28經由持續活化酪胺酸激酶Lck加強TCR信號傳導，繼而招募並活化ZAP70。先前研究顯示，CD28在CD4C T細胞中經由Lck觸發JAK/STAT3信號傳導。因此，建立藥理學模型以測定Lck/ZAP70作為上游激酶級聯是否活化CD8⁺ T細胞中之STAT3。使小鼠及人類CD8⁺ T細胞經富集(圖29)且經抗CD3微珠刺激，並在藥理學抑制劑PP2、AG-490或JSI-124存在或不存在下與對照IgG或CD80-Fc一起培育1 h。採用PP2係由於其係對Lck活化之阻斷敏感之特異性Src家族激酶抑制劑。AG-490亦可抑制JAK/STAT3 信號傳導之活化。此外，JSI-124中斷JAK/STAT3活化及pSTAT3與DNA之結合。免疫印漬結果確認，STAT3在CD8⁺ T細胞中因應基於CD80-Fc之處理而活化，且用藥理學抑制劑處理完全消除STAT3之磷酸化。與之相比，使用不同處理時總STAT3表現程度保持相似(圖23)，顯示CD28誘導之Src家族酪胺酸激酶級聯活化在STAT3磷酸化中具有必要作用。值得注意，pSTAT3抑制劑亦可影響其他STAT成員之磷酸化。為驗證pSTAT3之決定性作用，亦評價pSTAT1及pSTAT5之表現。結果顯示，在1 h時，用CD80-Fc處理未能影響pSTAT1及pSTAT5表現。阻斷 STAT3 活化中斷 CD8⁺ T 細胞上 NKG2D 表現之誘導 ：若NKG2D表現係由基於CD80-Fc之處理經由pSTAT3誘導，則抑制STAT3之任何上游活化劑皆應消除NKG2D誘導。實施時程研究以評價藥理學抑制劑對小鼠及人類CD8⁺ T細胞之毒性。注意到，與媒劑對照相比，在用JSI-124處理後48 h，細胞存活率顯著下降(圖30)。因此，為測試該假設，使小鼠及人類CD8⁺ T細胞經富集且用對照Fc、CD80-Fc加對照媒劑或CD80-Fc加STAT3活化抑制劑(包括PP2、AG490及JSI-124)處理24 h。結合受損STAT3活化，用JAK/ STAT3抑制劑處理引起CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現顯著下降(圖24A及B)。總之，該等結果表明STAT3在經由TCR/ CD28及Lck/JAK酪胺酸激酶信號傳導之活化上調CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現中之生物學作用。CD28 活化刺激 NKG2D-NKG2D 配體相互作用介導之穿孔蛋白產生及抗腫瘤細胞毒性 ：顯示CD28活化誘導CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現。然而，仍需評估NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞之抗腫瘤細胞溶解活性。為評價所誘導CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現之功能，將用對照Fc、CD80-Fc加假治療或CD80-Fc加NKG2D阻斷抗體處理之小鼠CD8⁺ T細胞與NKG2D配體陽性小鼠LLC細胞共培育5 h。若所誘導NKG2D表現具有效應物功能，則CD8⁺ T細胞應在暴露於NKG2D配體陽性LLC腫瘤細胞後產生效應物分子穿孔蛋白。經由ELISA評價培養基中自CD8⁺ T細胞釋放之穿孔蛋白之濃度，其顯示，CD80刺激介導之CD28活化引起穿孔蛋白產生顯著增加(圖25A)。顯著不同地，阻斷NKG2D表現將穿孔蛋白產生降低回至基線程度，表明穿孔蛋白之表現增加係由於NKG2D-NKG2D配體相互作用所致。由於免疫細胞之穿孔蛋白表現增加通常指示抗腫瘤細胞溶解活性增強，在基於CD80-Fc之處理後量測小鼠CD8⁺ T細胞之細胞毒性T-淋巴球活性。將經富集小鼠CD8⁺ T細胞用對照Fc、CD80-Fc加對照IgG、CD80-Fc加抗NKG2D阻斷抗體或CD80-Fc加STAT3抑制劑JSI-124預處理24 h。同樣，LLC細胞經CFSE標記且用細胞表面上之NKG2D配體Rae-1表現來確認(圖6B)。隨後將LLC細胞與經預處理之CD8⁺ T細胞以5:1、10:1及25:1之E:T比率一起培育5 h。在培育後，將混合細胞用PI (1 mg/mL)染色。根據光散射參數及PI負性來鑑別活靶細胞。將靶細胞之存活率測定為在與CD8⁺ T細胞一起培育後殘留之正規化靶細胞之百分比。對照IgG處理之CD8⁺ T細胞之細胞毒性未隨E:T比率增加而增加。與之相比，CD80-Fc處理之CD8⁺ T細胞展現較對照Fc處理之CD8⁺ T細胞顯著更高之殺死活性(圖25C)。與上述CD8⁺ T細胞中之穿孔蛋白產生一致，阻斷NKG2D表現消除CD8⁺ T細胞介導之細胞毒性(圖25C)。另外，藉由JSI-124抑制STAT3活化降低CD8⁺ T細胞之細胞溶解活性(圖25C)，指示NKG2D之表現與CD8⁺ T細胞之腫瘤殺死能力相關。以類似方式，在於CD28活化後之去粒化方面評價人類CD8⁺ T細胞之細胞溶解活性。因應暴露於靶腫瘤細胞藉由誘導細胞表面標記物CD107a評估CD8⁺ T細胞經歷去粒化之能力。自PBMC富集人類CD8⁺ T細胞，與抗CD3微珠一起培育，且用對照Fc或CD80-Fc在STAT3抑制劑JSI-124存在或不存在下處理24 h。在刺激後，使人類CD8⁺ T細胞以1:1比率暴露於CFSE標記之靶NKG2DL⁺ K562細胞並與抗CD107a抗體或同型對照抗體共培育4 h。隨後，將混合細胞用CD8⁺ 及NKG2D染色以供流式細胞分析。關於三個供體之CD8⁺ T細胞之匯總資料顯示，在不暴露於靶細胞之情況下，經刺激CD8⁺ T細胞具有增加之NKG2D表現但去粒化程度極低(CD107a)。在暴露於靶細胞後，增加之NKG2D表現與細胞毒性CD8⁺ T細胞之增強之去粒化能力相關(圖25D)。相反，用STAT3抑制劑JSI-124處理消除NKG2D表現，且因此，降低CD8⁺ T細胞之去粒化。慮及用抗CD3加CD80重組蛋白離體刺激導致CD8⁺ T細胞上之NKG2D誘導，此導致困惑於經預刺激之CD8⁺ T細胞之過繼性轉移是否可改良針對NKG2D配體陽性腫瘤之治療效應。為驗證此假設，自帶有Rae-1⁺ LLC腫瘤之小鼠分離脾CD8⁺ T細胞且用抗CD3加對照Fc或CD80重組蛋白在抗NKG2D抗體存在或不存在刺激48 h。每週測試經刺激CD8⁺ T細胞以確認NKG2D之誘導(圖26A)，隨後將其過繼性轉移至帶有LLC腫瘤之小鼠中。在腫瘤直徑達到1.5 cm時將小鼠安樂死。解離腫瘤且檢測腫瘤浸潤性NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞之百分比。與活體外結果一致，用CD80預刺激顯著增強LLC腫瘤中之NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞群體(圖26B)，而在CD8⁺ T細胞輸注前阻斷NKG2D降低腫瘤中之CD8⁺ T細胞累積。因此，與對照Fc處理之CD8⁺ T細胞療法相比，CD80刺激之CD8⁺ T細胞療法顯著延遲腫瘤進展(圖26C)，且阻斷CD8⁺ T細胞上之NKG2D完全消除抗腫瘤效應。隨著對腫瘤發展之抑制一起，CD80刺激之CD8⁺ T細胞轉移顯著延長帶腫瘤小鼠之存活時間(圖26C)，表明此策略可有益於治療NKG2D配體陽性腫瘤。實例 4 - 材料及方法 動物：6至8週齡C57BL/6小鼠及CD28-/-購自The Jackson Laboratory。小鼠照護及處置程序由德克薩斯大學MD Anderson癌症中心之研究所動物照護及使用委員會批准。為產生植入腫瘤小鼠模型，將Lewis肺癌(LLC)細胞(1.5 × 10⁵ 個/小鼠)接種至C57BL/6小鼠中。使帶有腫瘤之小鼠經歷對照DNA (10 mg/小鼠)、對照DNA加多柔比星(1 mg/kg)、IL-12編碼DNA (10 mg/小鼠)或IL-12編碼DNA加多柔比星，之後如先前所述進行電穿孔。腫瘤體積係藉由下式計算：V D (π/8) £x (a * b² )，其中V D係腫瘤體積(立方公分)，D係最大腫瘤直徑，且b=與a呈90°之直徑。細胞系 ：來自去標識正常血液供體之血沉棕黃層購自Gulf Coast Regional Blood Center，且其採集由MD Anderson機構審查委員會批准。外周血單核細胞(PBMC)係自血沉棕黃層樣品經由在Ficoll-Paque上離心來分離。人類CD8⁺ T細胞係自PBMC使用EasySep人類CD8⁺ T細胞分離套組(STEMCELL Technologies)來富集。將人類T細胞在45% RPMI 1640及含有10%胎牛血清之45% Click培養基中培養。小鼠CD8⁺ T細胞係自脾細胞使用EasySep套組來富集。將小鼠T細胞在補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素之RPMI 1640中培養。抗體及試劑 ：靶向小鼠及人類CD3、CD8⁺ 及NKG2D之單株抗體以及同位素對照抗體購自BioLegend。抗小鼠穿孔蛋白、人類CD107a及pSTAT3抗體購自eBioscience。抗人類及小鼠CD3微珠購自Thermo Fisher Scientific。靶向pSTAT3 (Tyr705)、pSTAT5 (Tyr694)及b-肌動蛋白之抗體購自Cell Signaling Technologies。靶向pSTAT1 (Ser727)及總STAT3之抗體購自Santa Cruz Biotechnology。藥理學抑制劑JSI-124、PP2及AG-490購自Selleck Chemicals。人類CD80-Fc重組蛋白、人類及小鼠Fc對照及人類IL-2購自R&D Systems。小鼠CD80-Fc (Asp37-Lys245-mIgG2a Fc)重組蛋白係由SYD Labs合成。免疫印漬 ：小鼠及人類CD8⁺ T細胞經RIPA緩衝液裂解。蛋白質提取物係自細胞碎屑經由在4℃下以最大速度離心20 min分離。經由10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離20微克總蛋白並使用iBlot凝膠轉移裝置(Invitrogen)轉移至硝化纖維素膜。用不同一級及二級抗體對膜進行印漬以檢測所關注蛋白質。流式細胞術 ：在4℃下將細胞連續與一級及二級抗體各自一起培育30 min。使用Attune聲聚焦細胞計數器(Applied Biosystems) 分析經染色細胞。使用FlowJo軟體程式(BD Biosciences)分析流式細胞術資料。去粒化分析： 用對照Fc或CD80-Fc (1 mg/mL)在0.1 mM JSI-124、1 nM PP2或50 mM AG-490存在或不存在處理人類CD8⁺ T細胞。然後將細胞與靶細胞以1:1 (E:T)之比率在37℃下共培育4 h，且在共培育期間將抗CD107a (LAMP1)或同型對照抗體添加至細胞混合物。將細胞用抗NKG2D抗體染色以供流式細胞分析。細胞毒性 T- 淋巴球分析 ：將LLC細胞用500 mM羧基螢光黃琥珀醯亞胺基酯(CFSE；Invitrogen)標記且在37℃下與純化小鼠CD8⁺ T細胞以5:1、10:1及25:1 (E:T)之比率一起培育5 h。在培育後，將細胞用碘化丙啶(PI；1 mg/mL [Sigma Aldrich])染色。根據光散射參數及PI負性鑑別活靶細胞。將靶細胞之存活率量測為在與CD8⁺ T細胞一起培育後保留之正規化靶細胞之百分比。ELISA ：使用來自BioSource之小鼠穿孔蛋白ELISA套組量測細胞培養基中小鼠穿孔蛋白之含量。統計分析 ：使用雙側Student t-測試分析直接量測之結果，以比較兩個治療組，或使用單因子ANOVA方差分析比較多於兩個治療組。每一比較之統計學顯著性係使用GraphPad Prism軟體程式(GraphPad Software)確定。小於0.05之p值指示統計學顯著性。*p ＜0.05；**p ＜0.01；***p ＜0.005；****p ＜0.001；ns，無統計學顯著性。 * * * 本文中所揭示及主張之所有方法皆可無需過度實驗即根據本發明揭示內容進行及執行。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可在不背離本發明之概念、精神及範圍的情況下對該等方法及本文所述方法之步驟或步驟之順序作出改變。更具體而言，應明瞭，可用化學及生理上均相關之某些試劑取代本文所述試劑，同時可達成相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似取代物及修改皆被視為在由隨附申請專利範圍所界定之本發明精神、範圍及概念內。參考文獻 以下參考文獻就其向本文所述詳情提供實例性程序或其他詳情而言，係以引用方式明確併入本文中。 Anderson,Science 256:808-813, 1992。 Austin-Ward及Villaseca,Revista Medica de Chile , 126(7):838-845, 1998。 Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology , Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994。 Besser等人，Clin Cancer Res . 16(9):2646-55, 2010。 Bukowski等人，Clinical Cancer Res ., 4(10):2337-2347, 1998。 Camacho等人，J Clin Oncology 22(145)：文摘號2505, 2004。 Carter等人Cancer J. 14(3):154-69, 2008。 Chothia等人，EMBO J . 7:3745, 1988。 Christodoulides等人，Microbiology , 144(Pt 11):3027-3037, 1998。 Cohen等人，J Immunol. 175:5799-5808, 2005。 Cutrera等人，Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy . 19(8):1468-77, 2011。 Czerkinsky等人，J. 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以下圖式形成本發明說明書之一部分且經包括以進一步顯示本發明之某些態樣。結合本文所呈現具體實施例之詳細說明，參照該等圖式中之一或多者，可更好地理解本發明。圖 1 ：經抗人類CD3及AF488抗兔抗體染色之A549腫瘤切片。該等影像表示各切片之中心。T細胞滲透可在以下三種治療後在此腫瘤區域中發現：(1) 多柔比星(Dox)治療，之後輸注經擴增T細胞(Dox+T)。(2) 輸注attIL-12-T細胞(attIL-12-T)。(3)輸注attIL-12加事先Dox處理(attIL-12-T+Dox)。在經輸注僅T細胞(pCtrl-T)或野生型IL-12修飾T細胞(wtIL-12-T)處理之腫瘤中，無可檢測T細胞滲透。圖 2 ：使遠離腫瘤邊緣大於5 mm且朝向腫瘤中心收集之A549腫瘤切片經歷T細胞染色。該等影像表示各切片之中心。僅attIL-12-T細胞轉移加事先多柔比星處理顯示所輸注T細胞之深度腫瘤浸潤。圖 3 ：轉染後24小時，T細胞上attIL-12之表現。使經轉染T細胞在載玻片上旋轉，固定並針對細胞膜上之IL-12 p40染色。觀察到7%之CD8⁺ T細胞具有膜attIL-12表現。基於多個獨立轉染研究，轉染效率在3-10%之間變化，但治療效能結果始終在此範圍內。圖 4 ：用2 µg質體轉染T細胞(2.5 × 10⁶ )且在1 ml RPMI/Click培養基中培育4或24h。收集培養基並使用ELISA分析IL12及IFN-γ之存在。在wtIL-12轉染後在培養基中檢測到高IL-12含量，但藉由attIL-12轉染在4h及24h兩個時間點無法檢測到高IL-12含量。與attIL-12轉染之T細胞相比，WtIL-12轉染之T細胞亦產生顯著較高含量之IFNγ。圖 5 ：在所指示T細胞轉移後，血清中之發炎性細胞介素。在第二次治療後4天收集血液，且使用ELISA測試血清中之IL-6、TNFα及IFNγ含量。IL-6及TNFα在任何治療組中皆無法檢測。然而，與attIL-12-T或attIL-12-T加多柔比星相比，wtIL-12-T細胞轉移誘導血液中顯著較高含量之IFNγ。圖 6 ：經A549細胞皮下接種，且在接種後第12天經歷第一次所述治療(見圖1)，之後在第37天及第58天經歷另外兩次治療之NSG小鼠之腫瘤體積。除非指定，否則所有小鼠皆接受在用對照DNA (ctrlDNA)、野生型IL12 (wtIL12)或膜錨定IL12 (attIL-12)修飾後之T細胞治療。圖 7 ：經結腸癌PDX腫瘤皮下植入，且在腫瘤直徑達到6-8 mm時經歷第一次所述治療，之後在第28天經歷另一次治療之裸小鼠之腫瘤體積。除非指定，否則所有小鼠皆在用對照DNA (ctrlDNA)、野生型IL12 (wtIL-12)或膜錨定IL12 (attIL-12)修飾後接受T細胞治療。圖 8 ：超大(直徑16-18 mm) PDX腫瘤經歷對照T細胞或attIL-12-T細胞加多柔比星。與單獨之對照T細胞療法相比，attIL-12-T細胞加多柔比星治療穩定化腫瘤進展。圖 9 ：在對照或attIL-12-T細胞加多柔比星治療後，針對吸引T細胞之趨化介素之mRNA表現測試A549腫瘤。attIL-12-T細胞加多柔比星在腫瘤中顯著誘導CXCL9、CXCL10及CCL17。趨化介素誘導解釋T細胞滲透至實體腫瘤中。圖 10 ：PDX腫瘤在ctrl-T細胞或attIL-12-T細胞加多柔比星後經歷流式細胞術以測試腫瘤浸潤之淋巴球上CD28及PD-1之表現。與ctrl-T細胞治療相比，attIL-12-T細胞加多柔比星誘導共刺激受體CD28表現，且同時減少檢查點調節劑PD-1，從而增加浸潤之淋巴球上共刺激/共抑制性受體之比率。圖 11 ：在兩次投與或不投與attIL-12-T細胞浸潤加多柔比星之情況下自腫瘤解離A549腫瘤細胞，且隨後經歷流式細胞術以測試腫瘤細胞膜上之NKG2D配體MICA、ULBP1及ULBP2之表現。該治療誘導腫瘤細胞上NKG2D配體之表現，其可增強NKG2D免疫監督。圖 12 ：在投與或不投與attIL-12 T細胞加多柔比星之情況下，經HT29細胞接種之NSG小鼠之腫瘤體積。多柔比星係在第13天、第27天及第36天投與3次，之後在次日(即，第14天、第28天及第37天)進行T細胞轉移。慢病毒attIL-12 T細胞加多柔比星治療產生對腫瘤體積之最高抑制。圖 13A-13C ：在細胞介素不存在下之離體培養期間的(A) T細胞數，(B) 存活率，(C) 及T細胞上之attIL-12 (T-870)表現。圖 14 ：經對照多柔比星或多柔比星加attIL-12 T細胞治療之帶有大HT29腫瘤之小鼠之血液化學。圖 15 ：經歷對照、對照病毒 + 多柔比星或慢病毒attIL-12 T細胞 + 多柔比星之單一治療之具有HT29腫瘤之小鼠之腫瘤體積。在治療後第1天、第3天及第7天將小鼠安樂死以測試T細胞分佈。圖 16 ：在第1天、第3天及第7天檢測腫瘤中之CD4 T細胞、CD8 T細胞、NKG2D T細胞、CD28 T細胞、CD39 T細胞及CD80表現。attIL-12 T細胞加多柔比星治療在第7天顯示高百分比之CD8 T細胞以及在第3天及第7天顯示高百分比之NKG2D T細胞。圖 17A-17B ：(A-B) 經對照或attIL-12加多柔比星治療之具有HT29腫瘤之小鼠之血液化學。圖 18A-18C ：(A) 在帶有HT29腫瘤之小鼠中，投與後第1天之T細胞分佈。對照T細胞加多柔比星治療導致肺中T細胞之高累積。觀察到與對照T細胞及多柔比星相比，經attIL-12 T細胞及多柔比星治療之小鼠的肺中T細胞累積減少。(B) 在帶有HT29腫瘤之小鼠中，投與後第3天之T細胞分佈。在來自attIL-12 T細胞及多柔比星治療之小鼠之肺中僅發現少量T細胞。(C) 在帶有HT29腫瘤之小鼠中，投與後第3天之T細胞分佈。在來自attIL-12 T細胞及多柔比星治療之小鼠的肺中未發現T細胞，而在經對照T細胞加多柔比星治療之小鼠的肺中存在T細胞之陽性染色。圖 19 ：在經對照或attIL-12 T細胞治療後第1天、第3天及第7天，所指示器官中之T細胞分佈。圖 20A-20C ：CD80結合介導之CD28活化誘導小鼠CD8⁺ T細胞上NKG2D受體之持續表現。(A) CD28缺乏消除對CD8⁺ T細胞上NKG2D表現之誘導。帶有LLC腫瘤之C57bl/6小鼠(n=3)及CD28⁺ /⁺ 小鼠經歷IL-12 DNA (10 mg/小鼠)加多柔比星(1 mg/kg)之兩次投與(相隔10 d)。在第二次投與後4天，分別自C57bl/6及CD28-/-小鼠分離脾細胞，且用抗小鼠CD3、CD8+及NKG2D抗體染色以評估中位螢光強度(MFI)及表現NKG2D之CD8⁺ T細胞之百分比。經IL-12加多柔比星治療誘導野生型小鼠中之NKG2D表現，而在CD28-/-小鼠中未觀察到誘導。(B) 在CD80結合於CD28⁺ /⁺ CD8⁺ T細胞上而非CD28-/- CD8⁺ T細胞上時，對NKG2D表現之誘導。用抗CD3微珠及對照Fc或CD80-Fc (1 mg/mL)處理得自CD29⁺ /⁺ 或CD28-/-小鼠之脾細胞。在培育24 h後，用抗CD8⁺ 及抗NKG2D抗體對細胞染色，以評估MFI及表現NKG2D之CD8⁺ T細胞之百分比。(C) CD80結合所致CD28活化對CD8⁺ T細胞上持續NKG2D表現之誘導。用抗CD3微珠刺激得自CD28⁺ /⁺ C57BL/6小鼠之脾細胞且用對照Fc或CD80-Fc處理。在培育後1、2、3、4及5 d針對CD8⁺ 及NKG2D對CD8⁺ T細胞進行染色以供流式細胞分析。條形圖顯示平均值(±平均值之標準誤差[SEM])。資料代表三次重複實驗。圖 21A-21B ：CD80結合介導之CD28活化誘導CD8⁺ T細胞上之持續人類NKG2D受體表現。(A) 在CD28活化後對人類CD8⁺ T細胞上NKG2D表現之誘導。用抗CD3微珠刺激自健康供體分離之PBMC並用對照Fc或人類CD80-Fc (1 mg/mL)處理24 h。顯示CD8⁺ T細胞上NKG2D表現之中值(± SEM)。(B) CD80-Fc結合至CD28對CD8⁺ T細胞上持續NKG2D表現之誘導。如(A)中所述將得自健康供體之PBMC處理1、2、3、4及5 d，且針對CD8⁺ 及NKG2D染色以供流式細胞分析。條形圖顯示CD8⁺ T細胞(n=3)上NKG2D之平均MFI (± SEM)。結果表示5名不同健康供體之彼等結果。圖 22A-22B ：CD80結合介導之CD28活化上調小鼠及人類CD8⁺ T細胞上之pSTAT3表現。(A 、 B) 用抗CD3微珠刺激小鼠脾細胞(A) 及人類PBMC(B) ，用對照Fc或CD80-Fc處理15 min、30 min、1 h或2 h，且針對CD8⁺ 及細胞內pSTAT3染色以供流式細胞分析。顯示CD8⁺ T群體(n=3)之pSTAT3表現之中值(± SEM) MFI。資料代表三次重複實驗。圖 23 ：自CD80結合介導之CD28活化經由酪胺酸激酶Lck/JAK/STAT3信號傳導路徑所致之升高之STAT3磷酸化。根據免疫印漬分析，CD28活化及用藥理學抑制劑處理對pSTAT、總STAT及b-肌動蛋白之表現之效應。用抗CD3微珠刺激小鼠及人類CD8⁺ T細胞且用對照Fc或CD80-Fc在藥理學抑制劑JSI-124 (0.1 mM)、PP2 (1 nM)或AG-490 (50 mM)存在或不存在下處理24 h。包括媒劑對照。所示強度量化(Rae-1之強度/β-肌動蛋白之強度)表示三次重複實驗之平均強度。圖 24A-24B ：阻斷Lck/JAK/STAT3信號傳導消除CD28活化介導之對小鼠及人類CD8⁺ T細胞上NKG2D表現之誘導。(A、B) 用抗CD3微珠刺激小鼠(A) 及人類(B) CD8⁺ T細胞且用對照Fc或CD80-FC在藥理學抑制劑JSI-124、PP2或AG-490存在或不存在下處理24 h。CD80+媒劑具有NKG2D之最高表現。CD8⁺ T細胞表面上之NKG2D表現係使用流式細胞術量測。條形圖顯示NKG2D之中值(± SEM) MFI (n=3)。資料代表三次重複實驗。圖 25A-25D ：藉由用CD80-Fc處理增大CD8⁺ T細胞抗腫瘤細胞溶解活性。(A-C ) 在暴露於Rae-1⁺ LLC細胞後，小鼠CD8⁺ T細胞對抗腫瘤細胞溶解活性之誘導。在腫瘤細胞接種後第14天自帶有LLC之小鼠收集脾細胞。自脾細胞分離CD8⁺ T細胞且用對照Fc或CD80-Fc在抗NKG2D抗體或JSI-124存在或不存在下處理24 h。(A) 將CD8⁺ T細胞與CFSE標記之LLC細胞以25:1 (E:T)之比率共培育5 h。細胞培養基經歷穿孔蛋白之ELISA分析。條形圖顯示穿孔蛋白之中值(± SEM)正規化濃度(n=3)。(B) LLC腫瘤細胞上NKG2D配體Rae-1表現之流式細胞術分析。(C) 將CD8⁺ T細胞與CFSE標記之LLC細胞以5:1、10:1及25:1 (E:T)之比率共培育5 h。在培育後，將細胞用PI (1 mg/mL)染色。活靶細胞係根據光散射參數及PI負性來鑑別。靶細胞存活率係作為在與CD8⁺ T細胞一起培育後保留之正規化靶細胞之百分比來量測。資料代表三次重複實驗。(D) 在暴露於靶細胞後CD80-Fc結合對人類CD8⁺ T細胞去粒化之誘導。將人類CD8⁺ T細胞自PBMC富集，與抗CD3微珠一起培育，並用對照IgG或CD80-Fc在STAT3抑制劑JSI-124存在或不存在下處理24 h。在刺激後，使人類CD8⁺ T細胞以1:1之比率暴露於CFSE標記之靶K562細胞，且與抗CD107a 抗體或同型對照抗體共培育4 h。然後將細胞用CD8⁺ 及NKG2D染色以供流式細胞分析。條形圖顯示在暴露於靶細胞之前及之後，CD107a⁺ CD8⁺ T細胞之平均值(± SEM)百分比(n=3)。結果表示三個不同健康供體之彼等結果。圖 26A-26C ： CD80預處理CD8⁺ T細胞之過繼性轉移改良LLC腫瘤模型中之抗腫瘤治療效應。自帶有LLC腫瘤之小鼠之脾分離CD8⁺ T細胞，且用抗CD3加對照Fc (1 mg/mL)及對照IgG (10 mg/mL)、CD80 Fc (1 mg/mL)及對照IgG (10 mg/mL)、或CD80 Fc (1 mg/mL)及抗NKG2D抗體(10 mg/mL)刺激48 h。每週經由靜脈內注射將5×10⁶ 經刺激CD8⁺ T細胞過繼性轉移至帶有LLC腫瘤之小鼠(n=6)。(A ) 在用對照Fc加對照IgG、CD80 Fc加對照IgG、或CD80 Fc加NKG2D阻斷抗體48 h處理後，經分離CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現。CD80Fc+對照IgG具有最高NKG2D表現，其次係對照Fc+對照IgG、CD80Fc+抗NKG2D及同型對照。(B ) 解離腫瘤並用抗小鼠CD45、CD8⁺ 及NKG2D抗體染色，以評價腫瘤浸潤性CD8⁺ T細胞上之NKG2D表現。條形圖顯示中值(± SEM)。(C ) 每週兩次監測個別腫瘤體積(左圖)及存活時間(右圖)。資料代表三次重複實驗。對照IgG+CD80Fc T細胞治療導致最低腫瘤體積及最高存活百分比，其次係抗NKG2D+CD80Fc T細胞治療。圖 27 ：CD80-Fc誘導之CD8⁺ T細胞上持續NKG2D表現之示意圖。CD80-Fc結合至CD28可共刺激酪胺酸激酶受體Lck之持續活化，其觸發招募ZAP70以擴大活化Lck誘導信號之級聯。JAK/STAT3位於ZAP70之下游且由ZAP70活化，且pSTAT3易位至核以誘導NKG2D表現。圖 28 ：在活體內得自帶有LLC之C57BL/6小鼠之脾CD8+ T細胞上之CD80-Fc對NKG2D表現之誘導。兩週一次對患有LLC之小鼠(n = 3)給予對照Fc或CD80-Fc (10 μg)治療達2週。針對CD8及NKG2D對自帶有LLC腫瘤之小鼠分離之脾細胞染色，以評估MFI及表現NKG2D之CD8+ T細胞之百分比。條形圖顯示平均值(±平均值之標準誤差[SEM])。資料代表三次重複實驗。圖 29A-29B ：自小鼠脾細胞及人類PBMC富集CD8⁺ T細胞。經富集CD8⁺ T細胞經歷流式細胞術，分別經抗小鼠(A )或人類CD8 (B )抗體染色，以驗證純化效率。圖 30A-30B ：在JSI-124處理後之CD8⁺ T細胞存活率。將剛經富集之小鼠(A )及人類(B ) CD8⁺ T細胞用媒劑對照或JSI-124 (0.1 μM)處理1、2、3及4天。在7-AAD染色後經由流式細胞術評價細胞存活率。

Claims

一種膜錨定介白素12 (IL-12)異二聚體蛋白質，其包含： a) 第一多肽，其包含IL-12 α亞單元p35或與其至少90%相似之多肽； b) 第二多肽，其包含IL-12 β亞單元p40或與其至少90%相似之多肽；及 c) 跨膜結構域，其融合至該第一多肽及/或該第二多肽之末端。
如請求項1之蛋白質，其中該第一多肽融合至該跨膜結構域。
如請求項2之蛋白質，其中該跨膜結構域位於該第一多肽之C-末端。
如請求項1之蛋白質，其中該第一多肽位於該第二多肽之N-末端。
如請求項1之蛋白質，其中該第一多肽位於該第二多肽之C-末端。
如請求項1之蛋白質，其中該蛋白質自N-末端至C-末端包含該第一多肽、該跨膜結構域及該第二多肽。
如請求項1之蛋白質，其中該蛋白質自N-末端至C-末端包含該第二多肽、該跨膜結構域及該第一多肽。
如請求項1或2之蛋白質，其中該跨膜結構域包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列。
如請求項1之蛋白質，其中要素a)係IL-12 α亞單元p35或與其至少90%一致之多肽，且要素b)係IL-12 β亞單元p40或與其至少90%一致之多肽。
如請求項1之蛋白質，其進一步包含連接體。
如請求項10之蛋白質，其中該連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGSS (SEQ ID NO:5)、SGGGGSGGGGSS (SEQ ID NO:6)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:7)。
如請求項10之蛋白質，其中該連接體位於該IL-12 α亞單元p35與該跨膜結構域之間。
如請求項1之蛋白質，其中該第一多肽包含與SEQ ID NO:1至少90%相似之胺基酸序列。
如請求項1之蛋白質，其中該第一多肽包含與SEQ ID NO:1至少90%一致之胺基酸序列。
如請求項1之蛋白質，其中該第一多肽與SEQ ID NO:1至少91%、92%、93%、94%、95%或96%相似。
如請求項1之蛋白質，其中該第一多肽與SEQ ID NO:1至少91%、92%、93%、94%、95%或96%一致。
如請求項1之蛋白質，其中該第二多肽包含與SEQ ID NO:4至少90%相似之胺基酸序列。
如請求項1之蛋白質，其中該第二多肽包含與SEQ ID NO:4至少90%一致之胺基酸序列。
如請求項1之蛋白質，其中該第二多肽與SEQ ID NO:4至少91%、92%、93%、94%、95%或96%相似。
如請求項1之蛋白質，其中該第二多肽與SEQ ID NO:4至少91%、92%、93%、94%、95%或96%一致。
一種多核苷酸，其編碼如請求項1至20中任一項之蛋白質。
一種表現載體，其包含如請求項21之多核苷酸。
如請求項22之表現載體，其中該表現載體係病毒載體。
如請求項23之表現載體，其中該病毒載體進一步定義為慢病毒載體、反轉錄病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。
如請求項23之表現載體，其中該病毒載體進一步定義為慢病毒載體。
一種T細胞群體，該等T細胞經工程化以表現如請求項1至20中任一項之膜錨定IL-12。
如請求項26之群體，其中該等T細胞表現如請求項22至25中任一項之表現載體。
如請求項26之群體，其中該等T細胞係腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、CD8⁺ T細胞及/或CD4⁺ T細胞。
如請求項26之群體，其中該等T細胞係CD8⁺ T細胞。
如請求項26之群體，其中該等T細胞係腫瘤特異性T細胞。
如請求項26之群體，其中該等T細胞經進一步工程化以表現對腫瘤相關抗原具有抗原特異性之T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)。
如請求項31之群體，其中該(CAR)包含細胞內信號傳導結構域、跨膜結構域及包含腫瘤相關抗原結合區之細胞外結構域。
如請求項32之群體，其中該抗原結合區係F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。
如請求項32之群體，其中該細胞內信號傳導結構域係T-淋巴球活化結構域。
如請求項32之群體，其中該細胞內信號傳導結構域包含CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、細胞介素受體、CD40、類鐸(Toll-like)受體9或其組合。
如請求項32之群體，其中該跨膜結構域包含CD28跨膜結構域、IgG4Fc鉸鏈、Fc區、CD4跨膜結構域、CD3ξ跨膜結構域、半胱胺酸突變人類CD3ξ結構域、CD16跨膜結構域、CD8跨膜結構域或紅血球生成素受體跨膜結構域。
一種產生如請求項26至36中任一項之T細胞群體之方法，其包含獲得起始T細胞群體及引入表現膜錨定IL-12之載體，由此生成表現膜錨定IL-12之T細胞群體。
如請求項37之方法，其中該載體係包含如請求項21之多核苷酸之表現載體。
如請求項38之方法，其中該表現載體係病毒載體。
如請求項39之方法，其中該病毒載體進一步定義為慢病毒載體。
如請求項37之方法，其中膜錨定IL-12在兩個組成型啟動子之控制下。
如請求項41之方法，其中該組成型啟動子係巨細胞病毒(CMV)。
如請求項37之方法，其中引入包含實施電穿孔。
如請求項37之方法，其中引入包含實施病毒轉導。
如請求項37之方法，其進一步包含用抗CD3及CD80-Fc重組蛋白活化該等T細胞。
如請求項45之方法，其中活化進行約1-2天。
如請求項45之方法，其中活化增加該等T細胞上之NKG2D表現。
一種治療個體之癌症之方法，其包含將有效量之經工程化以表現膜錨定IL-12之T細胞投與該個體。
如請求項48之方法，其中該等T細胞係如請求項26至36中任一項之T細胞。
如請求項48之方法，其中該膜錨定IL-12係根據請求項1至20中之任一項。
如請求項48之方法，其中該個體係人類。
如請求項48之方法，其中該等T細胞係自體T細胞。
如請求項48之方法，其中該等T細胞藉由慢病毒轉導經工程化以表現膜錨定IL-12。
如請求項53之方法，其中在投與經工程化以表現膜錨定IL-12之該等T細胞後，在該個體之肺中存在低或基本上無T細胞累積。
如請求項53之方法，其中慢病毒轉導導致細胞介素反應症候群(CRS)之風險下降、全身性毒性減小及/或治療有效性增加。
如請求項48之方法，其進一步包含在投與該等T細胞之前對該個體進行淋巴清除。
如請求項56之方法，其中淋巴清除包含投與環磷醯胺及/或氟達拉濱(fludarabine)。
如請求項48之方法，其中該方法進一步包含投與至少一種額外治療劑。
如請求項58之方法，其中該至少一種額外治療劑係化學療法、免疫療法、手術、放射療法或生物療法。
如請求項59之方法，其中該化學療法選自由以下組成之群：環磷醯胺、胺甲喋呤、氟尿嘧啶、多柔比星(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)、異環磷醯胺、順鉑(cisplatin)、吉西他濱(gemcytabine)、白消安(busulfan)、ara-C及其組合。
如請求項59之方法，其中該化學療法係多柔比星或環磷醯胺。
如請求項59之方法，其中該化學療法係在該等T細胞之前投與。
如請求項59之方法，其中該化學療法係在該T細胞療法之前15至25小時投與。
如請求項58之方法，其中該等T細胞及/或至少一種額外治療劑係靜脈內、腹膜內、氣管內、腫瘤內、肌內、經內視鏡、病灶內、經皮、皮下、區域性、或藉由直接注射或灌注投與。
如請求項48之方法，其中該癌症係結腸癌或肺癌。
如請求項48之方法，其中與投與具有野生型IL-12之T細胞相比，投與表現膜錨定IL-12之該等T細胞不誘導IFNγ或誘導較低IFNγ含量。
如請求項66之方法，其中該IFNγ係在血清樣品中量測。
如請求項48之方法，其中投與該等T細胞誘導CXCL9、CXCL10及/或CCL17之表現。
如請求項48之方法，其中投與該等T細胞誘導NKG2D及/或NKG2D配體之表現。
如請求項48之方法，其中投與該等T細胞誘導共刺激受體CD28及/或CD80之表現。
如請求項48之方法，其中投與該等T細胞降低免疫檢查點抑制劑之表現。
如請求項71之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-1或PD-L1。
如請求項58之方法，其中該等T細胞及/或至少一種額外療法係投與多於一次。
如請求項58之方法，其中該等T細胞滲透至該個體體內之腫瘤中心或附近。
一種生成NKG2D陽性CD8⁺ T細胞之活體外方法，其包含： (a) 獲得起始T細胞群體；及 (b) 在抗CD3及CD80存在下將該起始T細胞群體培養足以誘導NKG2D表現之時間段，由此生成NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞。
如請求項75之方法，其中該培養進一步定義為(i) 預處理該起始T細胞群體至抗CD3及(ii) 用CD80處理該等T細胞。
如請求項75之方法，其中該起始T細胞群體係CD28陽性。
如請求項75之方法，其中該起始T細胞群體係TIL、CD8⁺ T細胞及/或CD4⁺ T細胞。
如請求項75之方法，其中該起始T細胞群體係CD8⁺ T細胞。
如請求項76之方法，其中用抗CD3預處理進行12-48小時。
如請求項76之方法，其中在CD80存在下培養1-5天。
如請求項75或76之方法，其中抗CD3進一步定義為抗CD3微珠。
如請求項75或76之方法，其中CD80進一步定義為CD80-Fc重組蛋白。
如請求項75之方法，其中用CD80處理導致STAT3磷酸化。
如請求項75之方法，其中該等T細胞經進一步工程化以表現對腫瘤相關抗原具有抗原特異性之TCR或CAR。
如請求項85之方法，其中該CAR包含細胞內信號傳導結構域、跨膜結構域及包含腫瘤相關抗原結合區之細胞外結構域。
如請求項86之方法，其中該抗原結合區係F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。
如請求項86之方法，其中該細胞內信號傳導結構域係T-淋巴球活化結構域。
如請求項86之方法，其中該細胞內信號傳導結構域包含CD3ξ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、細胞介素受體、CD40、類鐸受體9或其組合。
如請求項86之方法，其中該跨膜結構域包含CD28跨膜結構域、IgG4Fc鉸鏈、Fc區、CD4跨膜結構域、CD3ξ跨膜結構域、半胱胺酸突變人類CD3ξ結構域、CD16跨膜結構域、CD8跨膜結構域或紅血球生成素受體跨膜結構域。
一種治療個體之癌症之方法，其包含將有效量之如請求項75至90中任一項之NKG2D⁺ CD8⁺ T細胞投與該個體。
如請求項91之方法，其中該等T細胞表現如請求項1至20中任一項之膜錨定IL-12。
如請求項91之方法，其中該個體係人類。
如請求項91之方法，其中該等T細胞係自體T細胞。
如請求項91之方法，其中該方法進一步包含投與至少一種額外治療劑。
如請求項95之方法，其中該至少一種額外治療劑係化學療法、免疫療法、手術、放射療法或生物療法。
如請求項96之方法，其中該化學療法選自由以下組成之群：環磷醯胺、胺甲喋呤、氟尿嘧啶、多柔比星、長春新鹼、異環磷醯胺、順鉑、吉西他濱、白消安、ara-C及其組合。
如請求項97之方法，其中該化學療法係多柔比星或環磷醯胺。
如請求項97或98之方法，其中該化學療法係在該等T細胞之前投與。
如請求項99之方法，其中該化學療法係在該T細胞療法之前15至25小時投與。
如請求項95之方法，其中該等T細胞及/或至少一種額外治療劑係靜脈內、腹膜內、氣管內、腫瘤內、肌內、經內視鏡、病灶內、經皮、皮下、區域性、或藉由直接注射或灌注投與。
如請求項91之方法，其中該癌症係結腸癌或肺癌。